KR100214752B1 - 엔,오-황산화헤파로산,그를제조하는방법및그를함유하는제약학적조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 N, O-황산화 헤파로산 및 그의 제조방법, 상기 신규한 N, O-황산화 헤파로산을 함유하는 N, O-황산화 헤파로산 조성물 및 유효성분으로 신규한 N, O-항산화 헤파로산을 가진 제약학적 조성물에 관한 것으로, 1,500-15,000 Da의 분자질량의 사슬 또는 사슬의 혼합물로 구성되며 하기식(I) :

의 반복되는 이당류 구조를 가진 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염.

(상기식에서, -E는 상기 N, O-황산화 헤파로산의 0 내지 80%인 아세틸 그룹과 황산염 그룹 및 가능하게는 나머지 이당류 단위내 수소원자를 나타내고, -G는 수소원자 및 황산염 그룹을 나타낸다.)

Description

N, O-황산화 헤파로산, 그를 제조하는 방법 및 그를 함유하는 제약학적 조성물.

제1도는 실시예1의 배치A인 배제 크로마토그래피에 의한 용리 프로파일을 나타낸 도면.

제2도는 실시예4의 배치A1으로부터 헤파로산을 겔 여과시키기 전의 용리 프로파일을 나타낸 도면.

제3도는 실시예4의 배치A1으로부터 헤파로산을 겔 여과시킨 후 용리 프로파일을 나타낸 도면.

제4도는 실시예4의 배치A1를 황산화시킨 후 생성물의 용리 프로파일을 나타낸 도면.

제5도는 실시예6의 N, O-황산화 헤파로산의 용리 프로파일을 나타낸 도면.

본 발명은 신규의 N, O-황산화 헤파로산, 상기 신규의 N, O-황산 헤파로산을 함유하는 N, O-황산화 헤파로산을 함유하는 N, O-황산화 헤파로산 조성물 및 유효성분으로서 N, O-황산화 헤파로산을 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

글리코스아미노글리칸은 동물조직의 추출에 의해 얻어질 수 있는 제품으로 알려져 있으며 이들의 일부는 항응고성 및 항혈전성을 가지고 있으며 이러한 군의 전형적인 생성물은 헤파린 항산염 및 더마탄 황산염 뿐만 아니라 헤파린 그 단편 및 그 유도체이지만 그것들은 그 근원 때문에 아주 고가이라는 단점이 있다.

더마탄 황산염은 우론산기(이두로닐기 또는 글루쿠로닐기) 및 아세틸-4-설포갈락토스 아미닐기(H. W. 스톨사츠가 지은 1976년도판 The Methodology of Connective Tissue Research의 137-146 페이지 참조)로 구성된 반복 유니트로 구성되어 있으며 가변성 중합도를 가진 폴리머군이다. 천연의 더마탄 황산염은 20,000-40,000 Da의 분자질량을 가지고 있으며 이 생성물은 특히 항응고제 항혈전제(F. 페르난데스 외 다수가 지은 British Journal of Haematology, (1986), 64, 309-317 참조)로써의 이점이 있다.

또한 피응고는 그 메카니즘이 하기와 같이 도시될 수 있는 복합생리학적 현상으로 알려져 있다.(I. 브제르크 및 유린달이 저작하고 네델란드의 닥터, 더블유 전크 출판사가 발행한 분자 및 세포 생화학 참조)

접촉활성화 및 조직인자와 같은 어떤 자극이 피 플라즈마에 존재하는 일련의 응고인자의 계속적인 활성화를 유발시키며 이는 상기 다이아그램 상의 로마숫자로 확인되며 인덱스가 있는 것은 주어진 응고 인자의 활성화 형태를 나타내고 인덱스가 없는 것은 주어진 응고 인자의 비활성화 상태를 나타낸다.

자극의 성질에 관계없이 최종단계는 동일하며, 인자Xa는 인자Ⅱ(프로트롬빈으로도 알려짐)을 활성화시키며 프로트롬빈은 활성화된 형태(인자Ⅱa, 트롬빈으로도 알려짐)에서 응혈의 주성분인 비용해성의 피브린을 방출시키면서 용해성의 피브리노겐의 부분적 단백질 가수분해를 일으킨다.

정상의 생리적 상태에서는 안티트롬빈 Ⅱ(ATIII) 및 헤파린 조인자 Ⅱ(HCII)와 같은 조절 단백질이 플라즈마에 존재한다.

안티트롬빈Ⅲ은 상기 다이아그램에서 별표(*)로 나타낸 모든 응고 인자에 관하여 억제적 작용를 나타내며 이 억제적 작용은 헤파린 또는 헤파린 타입의 합성올리고 당류(D.H. 아타 외 다수가 지은 생화학, (1985), 24, 6723-6729 참조)의 존재하에서 아주 강하게 증폭된다.

헤파린 조인자Ⅱ는 응고에서 마지막 단계를 촉매화시키는 인자Ⅱa(트롬빈)에 관해서만 억제작용을 나타내며 이 억제작용은 헤파린 또는 더마탄 황산염(D. M. 톨레프센이 지은 J. Biol. chem, (1983), 258, 6713-6716 참조)의 존재하에 크게 증폭된다.

인자Xa 또는 인자 Ⅱa의 억제는 항응고적 작용 및 항혈전적 작용을 얻기 위한 바람직한 수단을 구성하는데 이는 이 두 인자가 유발 자극에 관계없는 응고의 마지막 두 단계에 참가하기 때문이다.

인자 Ⅱa 단독의 억제 작용을 얻기 위해서는 헤파린 조인자 Ⅱ의 특이성을 이용하고 그 억제적 작용을 이용하는 것이 특히 바람직한데 더마탄 황산염이 이런 타입의 가장 좋은 증폭작용을 가지는 공지된 생성물이다.

주 헤파린 체인의 형성이 두 단계로 일어나는 것도 공지되어있다. 최초에는 헤파린이 그 다당류 부분이 분자질량 379Da인 반복되는 β-D-글루쿠로닐-(1→4)-α-N-아세틸-α-D-글루코스아미닐-(1→4)-유니트로 구성되어 있고 가변성 중합도를 가진 폴리머군으로 구성된 프로테오글리칸 전구체로부터 생합성된다.

생합성의 이 첫단계는 생합성의 두 번째 단계가 이 단순한 골격(헤파린, 제조, 구조, 특성, 분석, J. P. 두클로스, (1984) 81-83 페이지, 마손 에디슨-프랑스 참조)의 큰 변형을 초래하기 때문에 순전히 다당류 유니트라고 말할 수 있는 그 포인트 만을 나타낸다.

실제상 생합성으로부터 얻어지는 천연 헤파린은 2위치에서 황산화되고 글루코스아민의 분자와 결합되며, 6위치에서 황산화되고 2위치의 아민상에서 황산화 또는 아세틸화되는 글루쿠론산 및 이두론산(우론산)의 분자로 구성된 다당류이다.

헤파린의 구조는 하기식(i)에 통계학적으로 나타낼 수 있다 :

상기식에서 A는 H 및 SO₃-를 나타내며 B는 SO₃- 및 COCH₃를 나타내고 n은 12,000에서 18,000 Da의 분자량에 해당하는 20-30사이의 정수이다(EP-A-O, 116, 801).

치환체 A 및 B로 각각 사용된 H 및 SO₃- 및 COCH₃의 표현은 상기 20-30 이당류 유니트에서 A는 어떤 경우는 수소이고 다른 경우는 SO₃-이며, 마찬가지로 B는 대부분의 경우 SO₃-이며 다른 경우는 아세틸기이다. 마찬가지로 결합은 상기의 20-30의 이당류 유니트에 있는 COO-기는 어떤 경우는 하기 형태(ii)

(D-글루쿠론산에 해당)

를 가지고 n유니트의 대부분에 있어서는 하기 형태(iii)

(L-이두론산에 해당)

를 가진다.

따라서, 헤파린 및 여러 탈중합방법에 의해 얻어지는 헤파린 단편들은 글루쿠론산 유니트 및 이두론산 유니트이다. 몇몇의 탈중합방법은 2,000-9,000 Da의 분자량과 헤파린 출발물질 황산화도 보다 20%이상 큰 황산화도를 가진 헤파린을 얻을 수 있게 해준다.

그러한 초황산화된헤파린은 특허출원 EP-A-0, 116, 801에 기재되어 있으며 우론산 유니트에 관하여 상기 언급된 두 구조(ii), (iii)를 가진다.

이. 콜라이 (Eschericheia coli)종의 몇몇 박테리아는 반복되는 β-d-글루쿠론닐-(1→4)-α-N-아세틸-D-글루코스아미닐-(1,4)-유니트(W. F. 반 외 다수가 지은 Eur. J. Bichem, (1981), 116, 359- 364 참조)로 구성된 폴리머군인 통상 K5 항원으로 언급되는 캡슐형 다당류를 생성한다.

헤파린의 프로테오글리칸 선구체의 다당류 부분과 같은 화학적 성질을 가진 이 다당류는 여기서는 N-아세틸-헤파로산으로 언급되며 이 생성물은 10⁵-2×10⁶Da의 분자량을 가지며 우론산유니트에 대하여 주로 D-글루쿠론산(W. F. 반 외 다수, Eur. J. Biochem., (1981), 116, 359-364 및 특허출원 EP-A-O, 333, 243 참조)으로 구성된 아주 규칙적인 구조를 가진다.

특허출원제 EP-A-O, 333, 243호에는 O-황산화 K5다당류 뿐만 아니라 역시 황산화된 각각 4, 6 또는 8 설탕 유니트로 구성된 그 단편중 일부가 기술되어 있으며 이들 생성물은 항응고성에 대해 바람직한 비율의 맥관형성 및 항종양 작용을 가진다.

상기 특허출원에는 각각 4, 6, 8 또 10 설탕유니트로 구성된 N-아세틸-헤파로산으로 단편도 기술되어 있다.

특허출원 EP-A-O, 333, 243에는 또한 전체의 화학적 합성에 의한 O-황산화 N-아세틸헤파로산 구조를 가진 오당류의 제조에 관한 내용도 기술되어 있다.

1,500-15,000 Da의 여러 분자량을 가진 N, O-황산화 헤파로산이 헤파린 조인자Ⅱ에 대해 항응고작용 및 아주 높은 항-Xa작용을 가진다는 것이 현재 밝혀졌다.

따라서 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산은 신규한 구조, 특히 황산화도(글루코스아민의 아민기상에서의 황산화도 포함) 및 제약학적 특성의 면에 있어서 문헌에 이미 기재된 다른 제품들과 구별된다. 그것들은 다른 제약학적 특성 중에서도 더마탄 황산염의 경우보다 헤파린 조인자 Ⅱ(HCII)에 관한 더 강한 항응고 작용를 가지며 아주 바람직한 제약학적 속도특성을 가진다.

실제로, 부분화학합성에 의해 얻어지는 생성물인 본 발명의 생성물은 치료용으로 통상 사용되는 글리코스아미노글리칸의 제약학적 작용을 가지며 응고조절용으로 유용하게 사용될 수 있으며 특히 항혈전용으로 유용하게 사용된다.

본 발명의 목적은 1,500-15,000 Da의 분자 질량을 가진 사슬 또는 사슬 혼합물로 구성되어 있으며 하기식(I)의 반복되는 이당류 구조를 가진 것을 특징으로 하는 N, O-황산화헤파로산을 제공하는 것이다.

상기식에서,

-E는 상기 N, O-황산화 헤파로산의 0-80%의 이당류 유니트에 있는 아세틸기, 황산염기 및 나머지 이당류에 있는 수소원자이고 ;

-G는 수소원자 및 황산염기, 및 상기 N, O-황산화 헤파로산의 제약학적으로 허용가능한 염을 나타낸다.

황산염/카르복실의 비로 나타낸 N, O-황산화 헤파로산의 황산화도는 바람직하기로는 1.5-3.0이다. 본 발명은 또한 본 발명의 주제이며 70질량% 이상의 상기 기술된 N, O-황산화 헤파로산의 함유하는 N, O-황산화 헤파로산 조성물, 바람직하기로는 90질량% 이상의 N, O-황산화 헤파로산을 함유하는 N, O-황산화 헤파로산 조성물에 관한 것이기도 하다.

본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산은 잘 한정된 분자 질량의 동일한 다당류로 구성될 수도 있으며 이 분자질량은 1,500-15,000 Da 범위에 있으며, 가변성 분자질량의 체인의 혼합물로 구성될 수 있으며 이 분자질량 1,500-15,000 Da 범위이고, 이 체인의 분자질량의 분산은 더 커질수도 작아질 수도 있다.

실제로, 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산은 많아야 약13,500 Da의 분자질량의 차이를 가진 체인으로 구성될 수도 있고 반대로 우론 구조(D-글루쿠론산 또는 그 유도체)또는 글루코스아민 구조의 한 유니트에 해당하는 약300 Da의 분자량의 차이를 가지는 체인만으로 구성될 수도 있다.

또한 각 N, O-황산화 헤파로산의 구성에 따라 가장 작은 분자질량 또는 가장 큰 분자질량을 가진 체인의 분자질량은 1,500-15,000 Da에 해당할 수 있다.

상기에서 사용된 G는 수소원자 및 황산염기를 나타낸다라는 표현은 이당류 유니트에 있는 G는 어떤 위치에 있어서는 수소원자를 나타내고 다른 남아있는 위치에 있어서는 황산염기를 나타내는 것을 의미한다.

마찬가지로 E는 어떤 이당류 유니트에 있는 아세틸기와 황산염기 또는 이 유니트의 나머지에 있는 수소원자를 나타낸다.

N, O-황산화 헤파로산의 이당류 유니트는 모두 동일한 것은 아니다. 일반식 (I)은 글루코스아민유니트 및 D-글루쿠론산 유니트를 나타낸다. 특히 일반식(Ⅰ)의 이당류 구조가 n번 반복되고, 4위치에서 하이드록실기를 가진 식(Ⅰ)에 나타낸 바와 같이 체인의 비환원 유니트가 황산화되거나 또는 다르게 되거나 한 글루코스아민 유니트가 또는 C4-C5위치에서 2중결합을 가지고 있으며 황산화되거나 또는 다르게 된 D-글루쿠론산이 될 수 있다고 간주될 수 있으며 상기 유니트는 역전될 수 있다.

환원유니트는 식(Ⅰ)에 나타난 바와 같이 아노미의 산소상의 수소로 치환된 D-글루쿠론산 또는 글루코스아민 또는 나이트로스 탈중합(2, 5-안하이드로-D-만노스)과 그후 임의적인 산화(2, 5-안하이드로-D-만논산) 또는 환원(2, 5-안하이드로-D-만니톨)에 의한 결과로 얻어지는 2, 5-안하이드로 만노구조로 될 수 있다.

바람직한 생성물은 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산의 사슬의 환원성 및 비환원성 두단부가 황산화 또는 다르게 된 우론 유니트 황산화되거나 또는 다르게 된 글루코스아민 유니트, 또는 2, 5-안하이드로 만노구조를 가진 유니트인 것들이다.

환원성 및 비환원성의 두단부가 황산화 또는 다르게 된 우론 유니트, 황산화 또는 다르게 된 글루코스아민유니트 및 황산화 또는 다르게 된 N-아세틸 글루코스아민 유니트인 의자형으로 구성된 N, O -황산화 헤파로산이 바람직하다. 본 발명의 목적은 70-100%의 N, O-황산화 헤파로산을 가진 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이기도 하며

-단계a : 이.콜라이(K5)균주를 배양하여 N-아세틸 헤파로산을 형성하는 단계

-단계b : 형성된 N-아세틸 헤파로산을 분리 및 정제하여 하기식(Ⅱ) :

의 반복되는 이당류 구조로 특징지어지는 1,500-15,000 Da의 분자질량의 사슬 또는 사슬의 혼합물로 구성된 70-100%의 N-아세틸 헤파로산을 함유하는 조성물을 얻는 단계

-단계 c : N-아세틸헤파로산의 상기 조성물은 부분적으로 탈아세틸화하여 1,500-15,000 Da의 분자질량의 사슬 또는 사슬의 혼합물로 구성된 70%-100%의 헤파로산을 함유하고 하기식(Ⅲ)의 반복되는 이당류로 특징지어지는 조성물을 얻는 단계 :

상기식에서 R'는 0-80%의 이당류 유니트에서는 아세틸기를 나타내며 나머지 이당류 유니트는 수소원자를 나타낸다.

-단계d : -헤파로산의 상기 조성물의 부분적 N, O-황산화

-또는 헤파로산의 상기 조성물의 부분적 N, O-황산화 및 그에 이은 전체적 N- 황산화 단계,

-또는 전체적 또는 부분적 N-황산화 및 그에 이은 전체적 또는 부분적 O-황산화 단계,

로 구성되며 임의적으로 단계 a, b, c 또는 d의 단부에서 형성된 분자질량의 하나이상의 분류 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 주제이며 본 발명에 따른 N, O-황산화 헤파로산을 70-100% 함유하는 조성물의 제조를 위해서는 이. 콜라이 균주 SEBR 3282는 바람직하기로는 이.콜라이(K5)균주로 사용되며 이균주는 균주 Bi 8337-41(010 : K5 : H4) ATCC 23506 균주 (D. S. 굽타 외 다수가 지은 FEMS Microbiology Letters, (1982), 14, 75-78 및 W. Wann Eur. J. Biochem., (1981), 116, 359-364에 기술되어 있음)로부터 유도된 균주이다.

이. 콜라이 균주 SEBR 3282는 비. 카이저의 다수의 방법(J. Clin. Microbiol., (1984), 19, 2, 264 -266)에 따른 K5-특정 단계 타이핑 시험에 명확히 반응하므로 그것은 확실히 이. 콜라이(K5)균주이다.

이 균주는 프랑스 파리에 있는 파스퇴르 연구소의 CNCM에 기탁번호 I-1013으로 기탁되어 있으며 예를 들어 균주 Bi-626-42(012 : KSiNM ATCC 23508)와 같은 다른 적합한 이. 콜라이(K5)균주 뿐만 아니라 자연발생 또는 유도된 이 균주의 돌연변이체를 사용하는 것도 가능하다.

사용된 배양배지는 예를 들어 이스트 추출물이 풍부한 배지 및 카제인 아수분해물이 풍부한 배지와 같이 질소성분이 풍부한 배지가 바람직하며 이는 대량의 아미노산을 공급하는 저렴한 수단이다.

이.콜라이(K5)균주의 배양은 바람직하기로는 생물량의 성장이 멈춘 후 적어도 두 시간 계속된다.

1,500-15,000 Da의 분자질량의 체인의 혼합물로 구성되고 식(Ⅱ)의 반복되는 이당류 구조를 가진 것으로 특징지어지는 N-아세틸 헤파로산올 70-100%함유하는 조성물을 얻기 위해 N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제는 적어도 한 단계의 침전단계와 한단계의 이온 교환 크로마토그래피로 구성된 방법에 수행되며 이 단계는 바람직하기로는 Q세파로스 칼럼 또는 그에 동등한 칼럼에 사용하여 수행된다.

침전은 적합한 유기용매 및 특히 알콜 특히, 에탄올에서 수행되며 이공정에서 N-아세틸 헤파로산은 염 형태 바람직하기로는, 나트륨 염 형태일 수 있다.

예로써 바람직한 분리 및 정제 공정은 다음과 같이 요약될 수 있다.

-단계a₁: 에탄올 침전,

-단계b₁: 투석,

-단계c₁: 에탄올 침전, 그에 이은 탈수 및 건조,

-단계d₁: 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제

-단계e₁: d₁단계에서 얻어진 용리액의 에탄올 침전, 탈수, 건조 및 연마

a₁, b₁, c₁단계에 관하여 그 단계들이 수행되는 순서는 중요하지 않으며 a₁단계 또는 c₁단계 중 한 단계가 생략될 수 있다.

e₁단계에서, 에탄올 침전은 필수적인 것이 아니며 예를 들어 d₁단계에서 얻어진 용리액의 진공하의 증발과 같은 다른 방법에 의하여 N-아세틸 헤파로산을 분리할 수 있다.

1,500-15,000 Da의 분자질량의 사슬의 혼합물로 구성된 N-아세틸 헤파로산을 70-100% 함유하는 조성물을 얻기 위한 N-아세틸 헤파로산의 의 분리 및 정제도 다음과 같은 방법으로 수행될 수 있다.

-단계 a'₁: 투석,

-단계 b'₁: 산 배지에서의 정제, pH가 3.5 및 1.8인 수용액에 비용해성인 불순물의 제거,

-단계 c'₁: 에탄올 침전, 그에 이은 탈수 및 건조,

-단계 d'₁: 알칼리 가수분해 및 투석,

-단계 e'₁: 음이온 교환 크로마토그래픽에 의한 정제,

-단계 f'₁: 배제 크로마토 그래피에 의한 정제

상기 분리 및 정제공정도 본 발명의 바람직한 공정이며 알칼리 가수분해는 30-80℃온도의 NaOH용액으로 수행된다.

분리 및 정제 공정을 수행하는데는 배양의 마지막과 다음 단계로 구성된 방법에 따라 수행된 사전정제에 의해 얻어지는 생성물로 출발물질로 사용할 수 있다 :

-단계 a''₁: 배양끝부분에 얻어지는 현탁액의 원심분리,

-단계 b''₁: 표면부유물을 알칼리 용액에 접촉시키고,

-단계 c''₁: 선여과 단계,

-단계 d''₁: 특정의 절단된 한계를 가진 막을 사용한 응축,

-단계 e''₁: 투석,

상기에서, e''₁단계는 필수적인 것이 아니며 알칼리 용액으로 0.1N NaOH용액이 사용될 수 있다.

바람직하기로는 배양 끝부분에서 얻어진 생성물의 사전 정제는 상기 기술된 방법에 따라 수행된다. 상기 기술된 사전정제 단계 뿐아니라 이.콜라이(K5)균주의 배양 및 분리 및 정제 공정은 1,500-15,000 Da의 분자질량 사슬의 혼합물로 구성된 N-아세틸 헤파로산을 70-100%함유하고 하기식(Ⅱ)

의 반복되는 이당류 구조를 가진 것을 특징으로 하는 N-아세틸 헤파로산의 조성물을 얻을 수 있게 해준다.

실제로, 상기 기술된 분리 및 정제 공정 및 선 정제 단계의 결과로, 1,500-15,00 Da의 분자질량 사슬의 혼합물로 구성된 N-아세틸 헤파로산을 적어도 80-100%를 함유하는 N-아세틸 헤파로산을 얻을 수 있다.

1,500-15,00 Da의 분자질량의 체인의 혼합물로 구성된 N-아세틸 헤파로산은 신규의 생성물이며 본 발명의 주제를 형성한다.

상기 기술된 방법에 의하고 상기 기술된 이. 콜라이 균주 SEBR 3282 또는 다른 적합한 균주를 사용하여 얻어진 신규의 N-아세틸 헤파로산의 환원성 및 비환원성 두단부는 우론 또는 N-아세틸글루코스아민 유니트이다.

체인의 대부분에서 비환원성 단부는 식(a) :

의 우론 유니트이다.

1,500-15,000Da의 분자질량의 체인의 혼합물로 구성되어 있고 식(Ⅱ)의 반복되는 이당류 구조를 가진 N-아세틸 헤파로산에 관하여 얻어진 조성물의 부유화는 여러 정도로 특히, N-아세틸 헤파로산의 분리점까지 수행될 수 있으며 상기 부유화는 겔 투과 크로마토그라피 및 초여과(A. A 호너가 지은 Biochem, J., (1989), 262, 953-958 ; 지. 파일러 외 다수가 지은 J. Biol. Chem. (1988). (1988), 263, 11, 5197-5201 ; 및 유. 린달 외 다수가 지은 J. Biol. Chem., (1984), 259, 20, 12368-12376)와 같은 종래의 분자질량 분류기술에 의해 수행되며 에탄올 분류방법(특허출원 EP-A-O, 287, 477 참조)을 사용할 수도 있는데 후자의 분류방법의 생각되어질 수 있는 다른 방법 중에서 특히 높게 평가되어진다.

상기 기술된 N-아세틸 헤파로산은 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산 및 다른 유도체의 제조에 중간체로 사용된다.

본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산을 제조하기 위하여 예를 들어 특허출원 EP-A-O, 333, 243에 기술된 바와 같은 모두 같은 수의 이당류 유니트를 가지고 있는 주로 다당류 사슬로 구성되고, 특히 6, 8 또는 10개의 슈거 유니트로 구성된 N-아세틸 헤파로산과 같은 다른 이미 공지된 N-아세틸 헤파로산 평균10개의 단당류 유니트(굽타의 다수가 지은 FEMS Microbiology Letters(1983), 16, 13-17 참조)상에 포함하고 있는 체인으로 구성된 N-아세틸 헤파로산 부분 또는 저분자량 헤파린의 제조에 사용되는 방법에 N-아세틸 헤파로산을 사용할 수도 있다.

실제로, 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산은 고분자질량을 가진 공지된 다당류(K5)로부터 다른 방법에 의해 제조될 수 있으며 이 경우 탈중합 단계가 필요하다.

이 탈중합은 고분자질량 N-아세틸 헤파로산의 탈중합 전에, 탈아세틸화 후에, N-황산화 또는 선택적으로 N, O-황산화 후에 수행될 수 있다.

상기 기술된 바와 같이 탈중합은 예를 들어 유리 라디칼로 과옥소산염에 의한 탈중합, 베타제거 또는 아질산 작용에 의하여 (특허출원 또는 특허EP-0, 040, 144, EP-0,037, 319, EP-0,121, 067 참조)에 의해 저분자량 헤파린을 제조하기 위한 문헌에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있으며 이들 방법은 예로 주어진 것이며 꼭 그것으로 국한되지 않으며 글리코스아미노글리칸의 어떤 다른 탈중합밥법도 사용될 수 있다.

N, O-황산화 헤파로산이 (앞에서 탈아세틸화되고 N-황산화된)고분자질량의 N-아세틸 헤파로산으로부터 탈중합하고 아질산의 작용을 거쳐 제조될 때 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산의 환원성 유니트는 2, 5-안하이드로 만노, 특히, 2, 4-안하이드로-D-만노스 구조를 가질 수 있다.

아질산 작용에 의한 탈중합은 N-탈아세틸화 또는 N-황산화 단계후에 수행될 수 있다.

이 단계에 이어 산화 또는 환원단계가 이루어지면, 환원 유니트에 각각 2, 5-안하이드로-D-만논산 또는 2, 5-안하이드로-D-만니톨 구조를 가진 N, O-황산화 헤파로산이 얻어진다.

1,500-15,000 Da의 분자질량의 체인의 혼합물로 구성된 헤파로산을 70-100% 및 심지어 80-100%를 함유하는 조성물을 제조하게 해주는 N-아세틸 헤파로산을 70-100%을 포함하고 상기식(Ⅲ)의 반복되는 이당류 구조를 가진 것을 특징으로 하는 조성물의 부분적 탈아세틸화는 탈아세틸화제로 처리함으로서 수행된다.

탈아세틸화제로써 포스포러스 펜타설파이드, 트리에틸옥소늄 플루오로 보레이트, 수산화 나트륨 또는 히드라진이 언급될 수 있으며 후자의 2개가 특히 높게 평가되며 또한 염산, 황산 등과 같은 강한 무기산을 사용할 수도 있다.

반응시간을 선택된 작업조건 특히, 반응배지에 있는 탈아세틸화제의 온도 및 농도에 좌우된다.

1,500-15,000 Da의 분자질량의 사슬 또는 사슬의 혼합물로 구성되고 식(Ⅲ)의 반복되는 이당류 구조를 가진 것으로 특징지어지는 헤파로산에 관한 헤파로산 조성물의 부유화는 상기 기술된 통상의 분자질량 분류 기술(겔 투과 크로마토그래피, 초여과 및 에탄올 분류)을 사용함으로써 수행될 수 있다.

이 경우 1,500-15,000 Da 분자질량의 혼합물로 구성된 헤파로산 90-100질량%를 포함하고 식(Ⅲ)의 반복된 이당류 구조를 가지는 조성물이 얻어진다.

1,500-15,000 Da 분자질량의 사슬의 혼합물로 구성된 헤파로산의 제조를 위하여 고분자량 N-아세틸 헤파로산을 사용할 수도 있다.

탈아세틸화 한 후에 얻어지는 고분자량 헤파로산은 저분자량 헤파린의 제조용으로 이미 설명되고 본 출원에서 이미 언급된 방법에 의해 탈중합화 될 수 있다.

그 다음 탈중합화 생성물은 본 발명의 바람직한 헤파로산을 얻기 위하여 분류될 수 있다.

1,500-15,000 Da의 분자질량의 사슬의 혼합물로 구성되고 식(Ⅲ) :

의 반복된 이당류 구조를 가진 것을 특징으로 하는 헤파로산은 신규의 생성물이며 따라서 본 발명의 부분을 형성한다.

(상기식에서 R'은 0-80%의 이당류 유니트에 있는 아세틸기 및 나머지 이당류 유니트에 있는 수소원자를 나타낸다.)

본 발명의 바람직한 헤파로산은 1,500-15,000 Da의 분자질량 사슬의 혼합물로 구성되고 아세틸기(R')가 함량면에서 60%를 넘지 않는 식(Ⅲ)의 반복되는 이당류 구조를 가진 것을 특징으로 하는 헤파로산이다.

상기 기술된 것과 같은 헤파로산을 적어도 70질량% 포함하는 헤파로산의 조성물도 본 발명의 일부를 형성한다.

이들 헤파로산 및 헤파로산의 조성물은 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산의 제조를 위하여 유용한 중간체로 유용하며 예를 들어 D-글루쿠론산 유니트에서 이어서 에피화(epimerization)를 겪는 생성물과 같은 다른 생성물의 제조용으로도 사용될 수 있다.

부분적 N, O-황산화의 단계전에 헤파로산이 유기 염기의 염 또는 4가 암모늄염으로 전환될 수 있으며 헤파로산의 4가 암모늄염의 형성을 위하여 테트라부틸암모늄이 바람직하게 사용된다.

1987년 10월 11일자 프랑스 특허 제2, 584, 728호 (출원번호는 FR-85/10787임)에 기술된 방법에 따라 수행된 부분적 N, O-황산화 단계는 예를 들어 테트라메틸아민, 트리메틸아민 또는 피리딘과 같은 유기염기를 가진 황산무수물(삼산화황 : SO3)의 복합체를 이용하여 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 헥사메틸포스포르아미드 또는 아크릴로니트릴 또는 이들의 혼합물과 같은 극성 중성용매에서 수행된다.

상기 단계는 또한 피리딘에 용해된 클로로설폰산으로 수행될 수 있으며 삼산화황/피리딘 본합체가 바람직하게 사용된다.

또한 다른 황산화제 특히 Chemical Review, (1962), 62, 549-589에서 이.이.길버트에 의해 보고된 것들을 사용할 수 있다.

N, O-황산화 반응은 일반적으로 0-100℃의 온도, 바람직하기로는 10-50℃의 온도에서 6-14시간 동안 행해진다.

제조공정동안 부분적 N, O-황산화 반응의 끝에서, 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산 70-100%을 포함하는 N, O-황산화 헤파로산의 조성물이 염화나트륨 0.33M의 용액이 얻어질 때까지 염화 나트륨을 가하고 이어서 적합한 양의 에탄올을 가하여 침전된다.

형성된 침전물을 0.5M염화 나트륨용에 넣어 중화시키고, 적당량의 에탄올을 첨가한 후 형성된 침전물을 분리하고, 초 정제된 물에 넣어 후자에 대해 투석하고 동일 건조하였다.

상기 기술된 N, O-황산화 헤파로산의 조성물의 정제단계뿐 아니라 N, O-황산화 단계는 한번이상 반복될 수 있으며 정제공정은 예로서 주어진 것이며 동등한 공정을 베제하는 것은 아니다.

N, O-황산화 단계에 이어서 예를 들어 트리메틸아민과 같은 유기 염기를 가진 황무수물의 복합체와 같은 황산화제로 바람직하기로는 염기성 pH의 수용액에서 일반적으로 수행되는 전체적 N-황산화의 단계가 행해진다.

전체적 N-황산화 단계 끝에서 염화 나트륨 0.5M의 용액이 얻어질 때까지 염화나트륨을 가하고 이어서 에탄올을 가하여 N, O-황산화 헤파로산의 조성물이 침전된다.

형성된 침전물은 0.5M 염화나트륨용액에서 재용해되고 에탄올로 재침전되고 초 정제된 물에 넣어져 후자에 대해 투석되고 동결건조된다.

N, O-황산화 헤파로산에 대하여 N, O-황산화 헤파로산의 조성물의 부유화는 이미 언급된 종래의 분자질량 분류기술을 사용함으로써 수행되며 이 부유화를 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산 및 본 발명의 주제인 신규의 N, O-황산화 헤파로산을 적어도 70% 함유한 N, O-황산화 헤파로산 조성물은 최종 N-황산화 반응을 수반하는 방법에 의해 바람직하게 얻어진다.

식(Ⅰ)에 있는 반복된 구조에서 E는 아세틸기 및 황산염기를 나타낸다. 첫 번째 N-황산화 그에 이은 O-황산화를 수행함으로써 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산을 얻을 수도 있으며 이 공정 변화가 바람직하게 사용된다.

N-황산화는 트리메틸아민, 트리에틸아민 또는 피리딘과 같은 유기염기를 가진 삼산화 황의 복합체를 사용하여 수행되며 피리딘에 용해된 염화 설폰산으로 수행될 수도 있다.

트리메틸아민을 가진 삼산화황의 복합물이 바람직하게 사용되며 N-황산화 반응은 알칼리 수용액 배지에서 20-80℃의 온도에서 수행된다.

N-황산화 반응의 끝에서 얻어진 생성물이 적당량 에탄올이 첨가되어 침전되며 형성된 침전물을 초 정제된 물에 넣어 후자에 대해 투석하고 동결건조 하였다.

정제 공정은 예로 주어진 것이며 동등한 공정을 배제 하는 것은 아니다. 정제 공정은 여러번 반복될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 O-황산화 단계전에 N-황산화 헤파로산이 바람직하기로는 유기 염기 또는 4가의 암모늄 염으로 전환되며 4가의 암모늄염의 형성을 위해서는 바람직하기로는 테트라부틸암모늄이 사용된다.

O-황산화 반응은 예를 들어 트리메틸아민, 트리에틸아민 또는 피리딘과 같은 유기 염기와 삼산화 황의 복합물을 사용하여 포름아미드 또는 다른 화학적 으로 동등한 용매에서 수행되며 바람직하기로는 삼산화황/피리딘 복합물이 사용되며 O-황산화 반응은 일반적으로 10-50℃의 온도에서 수행된다.

그 다음 N, O-황산화 헤파로산은 N, O-황산화 경우에서처럼 NaCl에 대해 0.33M인 용액이 얻어질 때까지 반응에 염화나트륨을 가하고 이어서 적당량의 에탄올을 가해 침전된다.

그 다음, N, O-황산화와 헤파로산의 조성물의 정제가 수행되며 여러단계 (에탄올 침전, 투석 등)는 이미 위에서 상세히 설명되었다.

본 발명에 따르면 바람직한 N, O-황산화 헤파로산은 11,000 Da 미만의 분자질량의 체인을 적어도 90질량% 포함하며 이 N, O-황산화 헤파로산은 0.2㎛ol/mg미만의 아미노기(NH₂)를 포함하고 있어야 하는 것이 바람직하다.

아세틸기는 바람직하기로는 함량에서 60%를 초과하지 않아야 하며 황산염/카르복실 비로 나타낸 황산화도는 1.5-3.0인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 생성물은 5,000-7,000 Da의 분자질량의 체인을 적어도 70질량% 함유하고 1.8-2.5의 황산화도를 가진 약80% N-탈아세틸화된 N, O-황산화 헤파로산(아세틸기를 약20% 함유), 또는 10,000-12,000 Da의 분자질량의 체인을 적어도 70질량%로 구성되고 1.8-2.5의 황산화도를 가진 약80% N-탈아세틸화된 N, O-황산화 헤파로산(아세틸기를 20% 함유) 또는 6,000-8,000 Da의 분자질량의 체인을 적어도 70질량% 포함하고 2.0-2.8의 황산화도를 가지는 약40% N-탈아세틸화된 N, O-황산화 헤파로산(아세틸기를 약 60% 함유)뿐만 아니라 4,000-7,000 Da의 평균 분자질량을 황산염/ 카르복실 비로 나타낸 1.7-3의 황산화도를 가진 체인으로 구성된 N, O-황산화 헤파로산이다.

본 발명의 바람직한 N-황산화 헤파로산은 특히,

-2,300-7,200 Da의 분자 질량의 체인이 적어도 80질량%로 구성되어 있고 1.8-2.5의 황산화도를 가진 약80% N-탈아세틸화된 N,O-황산화 헤파로산 (아세틸기를 약20% 함유),

-3,300-7,700 Da의 분자질량의 체인이 적어도 80질량%로 구성되어 있으며 1.8-2.5 의 황산화도를 가진 약80% N-탈아세틸화된 N, O-황산화 헤파로산(아세틸기를 약20% 함유),

-6,900 Da -13,500 Da의 분자질량의 체인이 적어도 70질량%로 구성되어 있으며 1.8-2.5의 황산화도를 가진 약80% N-탈아세틸화된 N, O-황산화 헤파로산(아세틸기를 약20% 함유),

-4,000 Da-10,300 Da 의 분자질량의 체인이 적어도 80질량%로 구성되어 있으며 2.0-2.8의 황산화도를 가진 약 40% N-탈아세틸화된 N, O-황산화 헤파로산(아세틸기를 약60% 함유)

N, O-황산화 헤파로산의 염으로서 모든 제약학적으로 허용가능한 염을 들 수 있으며 이러한 염은 특히 헤파린 염의 제조(미국 특허 제4,168,377호 참조)를 위해 상기 기술된 통상의 방법으로 얻어진다.

정제 방법과 함께 N, O-황산화 헤파로산을 얻기 위한 상기 기술된 방법은 N, O-황산화 헤파로산을 나트륨의 형태로 얻을 수 있게 해준다. 이러한 염으로부터 여러 가지 헤파린 염 또는 비염화된 헤파린(헤파린, 제조, 구조, 특성, 분석, J.P.duclose, (1984) pp81-83, Masson Ed. 프랑스)을 제조하기 위하여 사용된 방법을 적용하여 N, O-황산화 헤파로산의 다른 염 또는 비염화된 N, O-황산화 헤파로산을 얻을 수 있다.

본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산은 종전 기술에 비해 아주 놀라운 바람직한 제약학적 및 생화학적 특성을 가지고 있다.

특히 항응고 특성에 대하여 바람직한 비율을 유지한 항맥관 형성 및 항종양 작용을 가진 특허 EP-A-0,333,243호에 기재된 K5 항원의 황산화 생성물에 비하여, 본 발명의 N, O-황산화 헤파로산은 우수한 응고조절 작용을 가지며 이 작용은 여러 응고 변수에 있어서 더마탄 황산염의 경우보다 훨씬 더 높으며 헤파린의 경우에 비유될 수 있다.

특히 본 발명의 대표적인 생성물의 ATIII- 또는 HCII-에 의존하는 항Ⅱa 작용은 헤파린 조인자에 대해서 혈전증 및 지형제, (1988), 60, 2, 236-239,에서 디. 두포우이에 의해 또한 항트롬빈(ATIII)에 대해서 혈전증 연구, (1978), 13, 2, 285-288에서 M. L. 라르센 외 다수에 의해 기술된 방법에 의해 결정되어진다.

상기 두 경우에 테스트는 색원체 기체에 대해 트롬빈의 아미돌리틱 작용의 평가분석에서 정제된 HCII 또는 정제된 ATIII 존재하에 정제된 트롬빈(인자Ⅱa)상에서 시험 생성물의 금지효과를 시험관 내에서 측정하게 된다.

그것은 가장 강한 HCII에 의존하는 항IIa작용을 가지기 때문에 The Methodology of Connective Tissue Research(1976) 137-146에서 H. W. 스톨사츠외 다수에 의해 기술된 방법에 따라 제조된 더마탄 황산염은 이 작용의 측정 시험에서 참조물질로 사용되며 결과를 시험 생성물 1mg에 대해 작용이 동일한 더마탄 황산염(DS)의 mg(mg DS equiv/mg)으로 나타내었다.

본 발명의 상기 대표적인 생성물의 항Xa작용(인-웨슬러 타이트러)은 J. Lab. Clim. Med. (1973), 81, 2, 198-310에서 이.티. 인외 다수에 의해 기술된 방법에 의해 측정되었으며 그들의 전체적인 항응고 작용은 Am. J. Clim. Path. (1961), 36, 212-291에서 R. R. 프록터 외 다수에 의해 기술된 APTT 테스트에 의해 측정되었다.

시험한 모든 생성물은 더마탄 황산염 경우보다 훨씬 더 높은 HCII에 의존하는 항Ⅱa작용을 나타내었다.

ATIII에 의존하는 IIa 작용 및 인-웨슬러 타이트르는 헤파린의 그것보다는 낮지만 더마탄 황산염의 경우보다 더 높게 입증되었다.

그들의 APTT 타이트르는 더마탄 황산염의 그것보다 2-20배 더 높으며 헤파린의 경우의 60%까지 얻어질 수 있다.

따라서 본 발명의 N, O-황산화 헤파로산은 특히 바람직한 작용의 특이성 및 항응고 특성을 나타낸다.

또한 이들 생성물의 저분자 질량은 역시 아주 바람직한 제약학 속도 특성을 부여한다.

본 발명의 N, O-황산화 헤파로산은 독성이 아주 낮고 그 독성은 의약 생성물로써의 용도를 충분히 만족시킨다. 따라서 본 발명은 유효성분으로서 본 발명의 주제인 N, O-황산화 헤파로산, 그 염들 중의 하나를 포함하는 제약학적 조성물 또는 하나 이상의 제약학적으로 적합한 부형제와 결합하여 적어도 70%의 N, O-황산화 헤파로산 또는 그 염들의 하나를 포함하는 N, O-황산화 헤파로산의 조성물에도 관한 것이다.

이들 제약학적 조성물은 특히 동맥경화증과 같은 혈관벽의 병 및 예를 들어 외과수술, 종양의 발달 또는 박테리아, 바이러스, 효소적 활성제에 기인한 응고 장애에 이어 관찰되는 과응고 상태의 예방 또는 치료적 처치에 유용하다.

투여량은 투여루트뿐 아니라 환자의 나이, 체중, 건강상태 및 상태의 성질 및 시각도에 따라 크게 변할 수 있다. 이 투여 방법은 하루에 1mg-1g양으로 한번 이상의 투여, 바람직하기로는 하루에 5㎎-500㎎, 예를 들면 하루에 200㎎정도의 투여량으로 정맥 또는 피하주사로 불연속적 또는 일정간격으로 투여될 수도 있고 하루에 200㎎-1000㎎ 양으로 경구 투여될 수도 있다.

상기 투여는 관찰결과 및 사전 수행된 피분석에 따라 각 환자에 대해 당연이 조절될 수가 있다. 본 발명은 하기 실시예로 더 상세히 설명된다.

[N-아세틸 헤파로산]

[실시예1]

저분자 질량이 더 많은 N-아세틸 헤파로산의 제조(방법Ⅰ)

1) 이.콜라이(K5) 박테리아 균주의 배양 및 N-아세틸 헤파로산을 함유하는 여과액의 분리.

하기 표Ⅰ에 명시된 조성물로 된 배지 B 400㎖가 이. 콜라이 균주 SEBR 3282(프랑스 파리에 소재하는 파스퇴르 연구소의 CNCM에 기탁번호 I-1013으로 기탁되었음)으로 접종되고 그 현탁액을 37℃에서 2시간 동안 교반하에 배양하였다. 얻어진 사건 배양 물을 하기 표1에 명시된 조성물로 된 배지 A 11리터를 함유하는 18.5리터의 발효기로 이동시키고 그 현탁액을 37℃의 온도 및 7.4의pH하에 4시간 동안 배양하고 산소의 분압을 공기 주입의 조절(20리터/분 까지) 및 교반을 조절하여 40㎜Hg로 유지하고 그 다음 250㎖/h의 속도로 8시간 이상 연속적으로 600g/ℓ의 글루코스를 포함하는 살균용액을 주입함으로써 글루코스를 주입하였다. 글루코스 주입 완료후 10시간동안 온도, pH 및 산소 분압을 같은 조건으로 하여 배양을 계속하였다.

배양배지의 0D (X-600㎚)를 관찰함으로서 지난 12시간 배양동안에 종생물량의 성장이 없었다는 것을 알 수 있었다.

배양액을 25℃로 냉각한 후 0.22㎛의 다공성을 가진 막을 통하여 여과하여 N-아세틸 헤파로산을 함유하는 여과액 약 12리터를 얻었다.

[표1]

배지A 및 배지B의 조성물 및 제조배지 A

배지A는 하기 세가지 무균용액을 화합시켜서 제조된다.

[용액 제1호]

하기 물질이 초 고순도 물700㎖에서 차례로 용해된다.

착 생성제 :

N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신 (Fluka^R시판 트리신) 360㎎

FeSO₄·7H₂O………………………………………………280㎎

CaCl₂·2H₂O…………………………………………………6.7㎎

MgCl₂·6H₂O………………………………………………1,270㎎

K₂SO₄…………………………………………………………500㎎

KCl…………………………………………………………5,000㎎

카제인 가수분해물(아미노산의 주원) HY CASE SF(세필드^R사 시판)…………25,000㎎

이스트 추출물(디프코^R사 시판)…………………………18,000㎎

미량원소용액(하기 표II를 보라)………………………………1㎖

포지제 스트룩톨 J673(Schill 및 Seilacher사 시판) : 파스퇴르 피펫을 사용하여 몇방울 가함

pH는 KOH용액으로 7.4로 맞추고 부피를 초고순도 물로 850㎖로 만든다.

배지는 120℃에서 45분 동안 오토클레이브된다.

[용액 제2호]

5g K₂HPO₄가 초고순도물 40㎖내 용해되고 부피가 동일한 용매로 50㎖로 조정된다.

얻어진 용액은 다공성 0.2㎛여과물을 통해 여과된다.

[용액 제3호]

20.7g 글루코스가 초고순도 물의 적절한 양내에 용해되고 부피가 동일한 용매로 50㎖로 조정된다. 용액은 30분동안 110℃에서 오토클레이브된다.

배지B

배지B제조는 부가적으로 pH7.2의 완충제(3-모르폴리노프로판설폰산)20g을 포지제에 첨가한 후 첨가되어야만 한다는 사실을 제외하고 배지A의 제조와 동일하다.

[표2]

배지 A 및 배지 B의 제조에 사용되는 미량원소 용액제조 하기 물질이 초고순도 물 800㎖에 (차례로) 용해된다.

H₃BO₃………………………………………………………500㎎

Na₂MOO₄·2H₂O……………………………………… 1,930㎎

CoCl₂·6H₂O…………………………………………11,850㎎

CuSO₄·5H₂O………………………………………………25㎎

ZnSO₄·7H₂O……………………………………………2,000㎎

AlCl₃·6H₂O……………………………………………2,410㎎

농도 1.19인 염산 100㎖가 첨가되고 부피가 초고순도 물로 1000㎖로 조정한다.

2)극히 저분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리와 정제

단계a-에탄올 침전 :

대략 48ℓ의 95% 에탄올(V/V)이 여과액에 첨가되고 혼합물이 침전물에 남겨지며 8시간 동안 4℃에서 침전시킨다.

상층액을 펌핑시키고 나서 원심분리에 의해 제거시키고 원심 펠릿이 대략 1ℓ의 초고순도물에 흡수된다.

[단계b-투석]:

이전 단계에서 얻어진 다공성 24Å 셀룰로오스를 베이스로 하는 막이 장치된 NOJAX40 색내에 놓인 용액이 초고순도 물에 대해 24시간 동안 투석된다.(부피1용액/부피6몰, 2시간, 8시간 그리고 16시간후 반복됨)

상기 조작은 염, 설탕, 아미노산, 올리고 뉴클레오티드 및 올리고 펩티트와 같은 배양배지에 나타나 있는 작은 분자들이 제거될 수 있게 한다.

[단계c-침전, 탈수 및 건조]

0.5MaCl 및 4부피의 에탄올을 투석액 1부피에 첨가한다.

침전물이 실온에서 5분동안 형성되도록 남겨진다.

혼합물 5000g을 20분동안 원심분리기에 건다.

원심펠릿이 에탄올에 흡수되고 얻어진 현탁액이 교반되면 실온에서 1시간 동안 유지된다.

원심분리와 현탁 조작이 반복된다.

혼합물이 20분동안 5000g으로 원심분리기에 걸린다.

얻어진 원심분리 펠릿이 24시간 동안 40℃에서 진공하에 오븐에서 건조된다.

[단계d-분말분쇄]

건조원심펠릿이 무수조건하에서 모르타르를 사용해서 분쇄된다.

단계e-음이온 교환 크로마토그래피 분쇄된 원심펠릿이 100㎖/g 비로 20mM 트리스-HCl pH 7.5조성물인 완충액 D로 언급되는 완충액 내에 흡수된다.

얻어진 용액은 분말 g당겔 50㎖비로 완충액 D로 미리 평형을 이루게 하고 테트라 암모늄 그룹(Pharmacia R Q 세파로스 빠른 흐름)을 가진 가교된 아가로스 메트릭스를 함유하는 강 음이온 교환 칼럼상에 크로마토그래프된다.

겔은 214㎚에서 UV탐지의 기전까지 회수하기 위하여 충분한 양의 완충액D로 세척되고 나서 pH가 3.5로 조종된 25mM 피페라진 용액으로 세척된다.

칼럼은 0.5M NaCl 및 25mM 피페라진 조성물을 가진 pH3.5 용액으로 용리된다.

용리제는 5N NaOH용액을 사용해서 중화된다.

[단계f-침전, 탈수, 건조 및 분쇄] :

상기 단계c 및 d에 기술된 조작은 염화나트륨을 첨가하지 않고 반복된다.

단계f의 말기에 얻어진 N-아세틸 헤파로산은 배치A로 언급된다.

정제 공정의 변형은 연속적으로 단계 a, c, b, d ,e 및 f를 수행하는 것이다. 그 결과 얻어진 N-아세틸 헤파로산은 배치 B로 언급된다.

3) 다양한 정제 단계의 말기에 얻어진 N-아세틸 헤파로산의 특징 :

[핵 자기공명(NMR)스펙트럼]

양성자와 탄소₁₃NMR스펙트라는 W. E. Vann(Eur. J. 생화학., (1981), 116, 59-364)에 의해 설명된 N-아세틸 헤파로산의 것들과 비교된다.

배치 A와 배치 B의 N-아세틸 헤파로산으로 얻어진 스펙트라의 연구는 W. F. Vann에 의해 설명된 N-아세틸-헤파로산을 가진 생성물의 화학적 동일성을 확증한다.

반복되는 β-D-글루쿠로닐-(1→4)-α-N-아세틸-D-글루코사미닐-(1→4)-구조로 이루어진 중합체 사슬로 구성된다.

[배제 크로마토그래피에 의한 분자량 분포결정]

분자량 분포는 하기 조건하에 배제 HPLC에 의해 결정된다.

* 직경이 10㎛이고 다공성 250Å인 실리카 비이드로 구성된 컬럼

* 용리제 : 0.5M 황산나트륨 수용액

* 유동율 : 1㎖/분

* 入=205㎚에서의 UN탐지

*검량선의 작성은 하기 분자량을 가진 헤파린으로부터 유도된 일련의 올리고사카리드를 사용해서 수행된다.

이러한 일련의 기준의 견지에서, 934 Da-56703Da 사이의 분자량만이 고려된다.

탐지되는 광학도가 N-아세틸 헤파로산 양에 비례한다.

그러나, 상기 방법의 정확도는 고분자량 특히 20,000 Da 초과되는 것들에 대해 지수로 감소한다.

배치 A의 배제 크로마토그래피의 용리 프로파일이 제1도에 나타난다. 분포는 다-분산되고 대략4,700 Da에서 압도적인 피이크를 나타낸다는 것이 제1도의 고찰에서 관찰된다.

배치A의 적어도 70%에 해당하는 중량율이 적어도 1,700-8,000 Da 질량을 갖는다.

매우 유사한 크로마토그램이 배치 B분석에서 얻어진다.

분포의 유세한 피이크는 대략 5,000 Da이다. 배치 B의 적어도 70%에 해당하는 중량율은 1,500 -8,000 Da 분자량을 가진다.

[폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분자량 분포의 검사]

브롬페놀 청으로 구성된 이동 말단-표식과 함께 분석되는 상기 샘플들은 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌 비스-아크릴 아미드 29 : 1 혼합물을 중합화시킴에 의해 얻어진 15% 폴리아크릴아미드 겔내 트리스-브레이트 완충액 내에서 전기영동을 가한다.

이동 말단-표식이 나타날 때까지 18㎝길이로 겔상에서 대략 4시간 동안 40mA하에서 이동된다.

겔은 알시안청으로 채색되고 나서 산 다당류에 대해 특이한 S. Pelkonen et al 기술(J. Bact. , (1983), 170, 6, 2646)에 따라 은으로 그후 채색된다.

전기영동에 의한 상기와 같은 분석은 단계a의 말기에 얻어진 부분적으로 정제된 생성물상에서 수행되고 정제시 N-아세틸 헤파로산 분자량 분포가 실질적으로 변경되는 것을 없애기 위하여 배치A 또는 배치B의 정제된 생성물이 최종단계로부터 발산된다.

단계a의 말기에 얻어진 부분적으로 정제된 생성물과 최종단계(배치A 또는 배치B)에서 정제된 생성물에 대해 얻어지는 프로파일의 관찰은 실질적인 차이(동일한 이동 거리에서 비교 강도의 피 존재)를 나타내지 않는다.

그 결과 그의 정제시 N-아세틸 헤파로산 분자량 분포의 어떠한 실질적인 변경도 없다.

[우론산 평가분석]

최종단계의 말기에 얻어진 정제된 생성물(배치A 또는 배치B)의 단위 질량당 우론산 양은 T. 비터(분석 화학, (1962), 4, 330-334)에 의해 설명된 방법에 따라 비색정량에 의해 측정된다.

이러한 평가분석 방법은 가열된 상태의 산 배지에서 카르바졸과 글루코스 아미노글리칸을 반응시키는 것을 기초로 하며 유리된 우론산양에 비례한 분홍색 채색을 만든다.

배치A에 대해, 단계d의 말기에 얻어진 부분적으로 정제된 생성물과 최종단계f의 말기에 얻어진 정제 생성물은 각기 1.3과 2.1 ㎛ol/mg의 우론산 함량을 갖는다.

배치B에 대해, 최종단계의 말기에 정제 생성물은 또한 2.1㎛ol/mg 우론산 함량을 갖는다.

[자외선과 가시광선 영역의 분광 광도계]

정제 생성물(배치A)가 초고순도 물에 용해되고 얻어진 용액(C=1㎎/㎖)은 1㎝광학경 로 셀내에 놓인다.

그의 흡수 스펙트럼은 200-600㎚사이에서 기록된다.

얻어진 스펙트럼으로부터, 배치 A가 1% 이하의 DNA를 함유하는 것을 256㎚에서 흡수를 기초로 하여 명백히 하는 것이 가능하다.

[총 단백질 평가분석]

BIORAD에 의해 시판된 단백질 평가분석도구는 총단백질을 평가분석한다. 평가분석 방법은 Coomassie Brilliant Blue G-250 산용액 최대 흡수 파장이 단백질이 거기에 결합될 때 465-595㎚에서 나타난다.(Reisner et al., Anal Biochem, (1975), 64, 509)는 사실을 기초로 한다.

배치 A의 총단백질 함량은 1.5%이하이다.

[유리 아미노(NH₂) 평가분석]

Biochemica et Biophysica Acta. (1967), 141, 358-365에서 젠사쿠 요시자와에 의해 설명된 방법에 따라 수행된다.

NH₂함량변수(㎛ol/mg으로 표시됨)는 탈아세틸화된 β-D-글루쿠로닐-(1→4)-α-N-아세틸-D-글루코스아미닐-(1→4)-단위 및 유리아미노 그룹을 함유하는 오염물질 양의 표시기이다.

배치 A 및 B 각각은 NH₂함량0.05㎛ol/mg이다.

NH₂/글루쿠론산 비=0.05/2.1은 2.5%이하이다.

100 β-D-글루쿠로닐-(1→4)-α-N-아세틸-글루코스아미닐-(1→4)-단위마다, 그 결과 탈아세틸화된 이러한 형태의 2.5 이당류 단위(mol)가 더 적다.

[실리예2]

극히 작은 분자량의 N-아세틸 헤파로산 제조(공정II)

이. 콜라이(K5) 균주의 배양과 N-아세틸 헤파로산을 함유하는 여과액의 분리

이. 콜라이 균주 SEBR 3282의 배양 및 N-아세틸-헤파로산을 함유하는 여액의 분리가 실시예1에 기술된 방법에 따라 수행된다.

2) 극히 작은 분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제

[단계a-투석]

375㎖ 여과액을 단계b, 실시예1(2)극히 작은 분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제에 기술된 공정에 따라 투석시킨다.

투석후, 대략 1020㎖의 정제액이 얻어진다.

[단계b-산 배지에서 정제]

적절한 양의 5N HCl 용액을 3.5에 해당하는 pH를 얻기 위해 투석된 용액에 첨가한다.

형성된 침전물은 원심분리에 의해 제거되고 나서 용액은 1.8에 해당하는 pH를 이루기 위해 동일한 산 (5N HCl)로 산성화시킨다.

침전물은 형성될 수 있고 원심분리에 의해 제거된다.

상기 용액은 그리고 나서 5N NaOH용액을 사용해서 중화된다.

[단계c-침전, 탈수 및 건조]

NaCl과 관련하여 0.5M인 용액이 되도록 적합한 양의 염화나트륨을 중성화된 용액에 첨가시키고 나서, 4부피의 에탄올이 첨가된다.

침전물은 실온에서 5분동안 형성될 수 있다.

혼합물은 20분동안 5000g으로 원심분리된다.

원심분리 펠릿은 에탄올에 흡수되고 얻어진 현탁액이 교반되고 실온에서 1시간동안 남겨진다.

원심분리 및 현탁 조작이 반복되고 혼합물은 20분동안 5000g으로 다시 원심분리된다.

얻어진 원심분리 펠릿은 24시간동안 40℃에서 진동하에 오븐에서 건조된다.

[단계d]-알칼리 가수분해 및 투석 이전의 단계에 건조후 얻어진 생성물은 0.25N NaOH 용액에 2.5%(W/V)농도로 용해된다.

그 결과 얻어진 용액은 50℃에서 2시간동안 유지된다.

그리고 나서 5N NC1용액을 사용해서 중화되고 다당류가 그후 실시예1 [2)단계 b, 극히 작은 분자량의 N-아세틸 헤파로산의 분리와 정제]에 기술된 공정에 따라 투석된다.

투석후, 대략990㎖이 얻어진다.

[단계e]-음이온 교환 크로마토그래피 적절한 양의 피페라진, EDTA 및 트리톤 X-100(Prolabo^R)을 각기 피페라진 25mM EDTA 2mM 및 트리톤 X-100 0.2%(V/V) 농도를 가지도록 투석액에 첨가한다.

pH는 5N HC1용액을 사용해서 3.5로 맞추어진다.

25mM 피페라진, 2mM EDTA 및 0.2mM 트리톤 X-100(pH 3.5)을 함유하는 피페라진 완충액에서 완충평형되는 400㎖ Q 세파로스 유속 컬럼상에 상기 용액이 놓인다.

칼럼은 피페라진 완충액으로 세척되고 0.5M NaC1 용액으로 용리되며 생성물은 그후 4부피 에탄올로 침전된다.

40℃에서 진공하에 건조된다.

대략 9.85g N-아세틸 헤파로산이 그 결과 얻어진다.

[단계f-배제 크로마토그래피]

이전 단계에서 얻어진 생성물 4g이 20mM 트리스-pH 7.5 HC1 조성물과 1M NaCl 완충액 60㎖내 용해되고 나서 동일한 완충액으로 미리 평형이 된 20㎖옥틸-세파로스^R에 전달된다.

4부피 에탄올을 비-보유부분에 첨가한다.

형성된 침전물이 세척되고 진공하에 40℃로 건조된다.

3.90g N- 아세틸 헤파로산이 그 결과 얻어진다.

3) 다양한 정제 단계의 말기에 얻어진 N-아세틸 헤파론산의 특성짓기

[핵자기 공명(NMR)스펙트럼]

상기 N-아세틸헤파로산으로 얻어진 양성자와 탄소¹³C NMR 스펙트라연구는 W.F.Vann(Eur. J. Biochem. (1981)116, 59-364)에 의해 기술된 N-아세틸-헤파로산과 생성물의 화학적 동일성을 확증한다.

[배제 크로마토그래피에 의한 분자량 분포결정]

분자량 분포는 실시예1에 기술된 N-아세틸 헤파론산 분자량 분포결정에 사용되는 방법에 따른 배제 HPLC에 의해 결정도 측정된다.

실시예2로부터 발산되는 배치를 구성하는 적어도 86%의 사슬에 해당하는 증량율은 1500-15000 Da 분자량을 가진다.

[우론산 평가분석]

단계 e로부터 발산되는 N-아세틸 헤파론산은 1.94㎛ol/㎎우론산 함량을 가진다.

[자외선과 가시광선 영역에서 분광광도법]

얻어진 스펙트럼으로부터, 얻어진 N-아세틸 헤파로산이 1%이하 DNA를 함유하는 것을 단언하는 것이 가능하다.

[총 단백질 평가분석]

N-아세틸 헤파로산 배치의 총단백질 함량은 1%이하이다.

[유리 아미노그룹(NH₂) 평가분석]

NH₂함량은 0.1㎛ol/mg이하이다.

[실시예3]

극히 작은 분자량인 N-아세틸 헤파로산 제조(공정III)

1) 이. 콜라이(K5)균주 배양

이. 콜라이 균주 SEBR 3282 배양이 실시예1에 기술된 방법에 따라 수행된다.

N-아세틸 헤파로산을 함유하는 12ℓ배양액이 얻어진다.

2)예비 정제

[단계a-원심분리]

배양의 말기에, 얻어진 현탁액(12ℓ, 은 20분 동안 8000rpm(즉, 11,000-14,000g)에서 원심분리된다.

[단계b]-알칼리 용액과 배지를 접촉시킴. 원심분리후, 펠릿이 제거되고 상층액을 대략 1시간 동안 0.1N NaOH 용액과 접촉시킨다.

[단계c-선여과]

이전 단계에서 얻어진 용액은 3MR 시리즈 300프로필렌 여과기를 통해 미리 여과된다.

[단계d-명시된 절단 한계 막을 사용하는 농도]

단계c에서 얻어진 여과액은 1000 Da의 절단 한계를 가진 아미콘^R중공-섬유 카트리지나 그와 동일한 것을 사용해서 농축된다.

저분자량 N-아세틸 헤파로산에 관하여 농축된 용액이 그 결과 얻어진다.

[단계e-투석]

저분자량 N-아세틸-헤파로산에 관하여 농축된 용액이 초고순도물에 대해 투석되고 매우 고 희석율(10,000)로 아미콘^R시스템을 사용해서 다시 한번 투석된다.

3) 극히 저 분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리와 정제

사용된 절차는 실시예1 [2)극히 저분자량인 N-아세틸 헤파론산의 분리와 정, 단계c-단계f]에 기술되고, 배치 A의 것들과 유사한 특징을 가진 N-아세틸 헤파로산이 얻어지는 것이거나 실시예2 [2)극히 저분자량인 N-아세틸-헤파로산의 분리아 정제, 단계a-단계f]에 기술된 것이다.

[N, O-황산화 헤파로산]

[실시예4]

실시예1로부터 나오는 극히 저분자량인 N-아세틸 헤파로산의 화학적 변경

1) 배치B의 화학적 변경

[단계a-부분적인 탈아세틸화] :

배치B 500mg의 1N NaOH용액 10㎖에 용해된다.

용액은 50℃가 되고 교난시키면서 8시간 동안 상기 온도에서 반응되도록 한다.

용액은 그후 2N HC1용액으로 중화되고 초 고순도 물에대해 투석되고 나서 친액화된다.

[단계b-테트라 부틸 암모늄 염 형성] :

상기 친액화물이 20㎖초고순도 물 20㎖내 흡수된다.

얻어진 용액이 산형태의 생성물을 재생시키기 위하여 산 배지 내에 미리 조건 지어진 디비닐 벤젠(다우 케미칼^RDowex 50 w 8)으로 가교된 폴리스티렌을 베이스로 하여 이온 교환컬럼에 전달된다.

용액은 그후 40% 테트라부틸암모늄 용액 0.4㎖로 혼합되고 친액화된다.

[단계c-부분적인 N, O-황산화] :

이전단계에서 얻어진 염421㎎이 디메틸포름아미드 35㎖에 용해되고 황삼산화물/피리딘 착화합물(ref S755-6 하에 Aldrich^R로시판)이 첨가된다.

혼합물을 실온하 6시간동안 교반시키면서 반응시킨다.

반응 배지 1부피에, 염화 나트륨을 염화나트륨 0.33M농도 용액이 얻어질 때까지 첨가시키고 나서 에탄올 2부피에 의해 계속된다.

침전물이 원심분리되고 상층액이 제거된다.

원심분리 펠릿이 0.5M NaCl용액에 흡수되고 중화된다.

2부피 에탄올이 그 후 첨가된다.

여과액이 형성되게 되고 혼합물은 원심분리되며 원심분리 펠릿은 초고순도물로 흡수된다.

혼합물은 초고순도 물에 대해 투석되고 친액화된다.

상기에 기술된 일련의 조작이 반복된다.

얻어진 친액화물은 하기와 같은 특징을 갖는다.

* 우론산 함량 : 1.11 ㎛ol/㎎

* 유리 NH₂함량 : 0.01 ㎛ol/㎎

* 황산화도 : 이당류 단위당 2.64 우론산과 NH₂함량이 실시예1에 기술된 바와 같이 측정된다. 또한 황산화물/카르복실비로 언급되는 황산화도는 카르복실 그룹당 황산화기 평균수이다 ; 카르보히드레이트 연구, (1975), 39, 168-176에서 B.

Casu et al에 의해 기술된 황산화 그룹과 카르복실 그룹의 평가분석의 전도도방법에 의해 측정된다.

2) 배치A의 화학적 변경

배치A는 배치A1, 배치A2, 및 배치 A3로 언급되는 세가지 정제수로 나누어진다.

[단계a-부분 탈아세틸화 및 겔 여과] :

배치A1만이 투석되고 친액화된다는 사실을 별개로 하여, 배치A1, A2 및 A3가 상기 배치B에 대한 단계a에 기술된 바와 같이 처리된다.

배치 A1, A2 및 A3가 하기 조건하에 (또한 겔 투과 크로마토그래피 또는 배제 크로마토그래피로 언급됨)겔여과에 의해 그후 분류된다 :

N, N'-메틸렌 비스아크릴 아미드로 가교된 알릴덱스트란을 베이스로 하여 직경 25-75㎛비이드의 지지체.

사용되는 용리제 : 0.5M MaCl용액.

혼합물은 배치 A1으로부터 나오는 헤파로산에 대해 0.46 내지 1, 배치 A2로부터 나오는 헤파로산에 대해 0.43 내지 1이고 배치 A3으로부터 나오는 헤파로산에 대해 0.43 내지 0.64의 Kav에 대응하는 부분으로 이루어져 있다. 상기 부분들은 겔-여과된 헤파로산으로 하기에 언급된다.

Kav는 배제 크로마토그래피에서 관례적으로 사용되는 계수이고 배제 크로마토그래피에 의해 분류화가 재생될 수 있게 한다. 하기 일반식에 의해 정의된다 :

여기에서, Ve = 고려되는 부분의 용리부피

Vo = 배제부피

Vt = 총 겔 부피

부분 탈아세틸화 후 직접 배치 A1으로부터 나오는 헤파로산 분자량 분포, 뿐만 아니라 배치 A1, A2 및 A3로부터 나오는 겔-여과 헤파로산은 실시예1에 기술된 바에 따라 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다.

각기 제2도와 제3도에는 배치 A1에서 나오는 헤파로산에 대한 겔 여과 전과후에 얻어지는 용리 프로파일이 나타나 있다.

용리 프로파일에서 나온 결과는 하기 표Ⅲ에 대조되고, 여기에서 MW₀는 생성물 중량율1%가 MW₀이하의 분자량을 가지는 분자량이고 MW₃는 생성물 중량을 10%가 분자량 MW₃이하의 분자량을 가지는 분자량이며 MW₂는 흡수 최대치에 대응되는 분자량을 나타낸다_.

겔여과가 헤파로산의 덜 풍부하고 고분자량인 부분을 제거할 수 있게 하는 것이 제2도와 제3도를 비교함에 의해 관찰된다.

상기 결과는 표Ⅲ에 명백히 나타나 있으며, 여기에서 겔 여과 조작후 MW가 크게 감소되는 것이 관찰된다.

각각 배치의 헤파로산은 7000 Da이하 분자량인 사슬 질량으로 적어도 90%가 구성된다.

배치 A1과 A2에서 나오는 겔-여과된 헤파로산이 그후 실시예1 [2)극히 저분자량인 N-아세틸-헤파로산의 분리와 정제, 단계 C]에 기술된 바와 같이 처리된다.

배치 A3에서 나오는 겔-여과된 헤파로산은 침전되지 않지만 초 고순도물에 대해 투석된다. 우론산과 유리아미노 그룹 함량이 실시예1에 기술된 바와 같이 측정된다.

얻어진 결과가 하기 표Ⅳ에 대조된다. 잔류 아세틸 함량이 동등한 수의 글루쿠로닐과 글루코스아밀 그룹이 있다는 것을 고려함에 의해 값이 구해진다.

탈아세틸화도는 유리 아미노그룹 함량에 우론산 함량비와 같이 계산된다.

[핵자기 공명 스펙트럼]

배치 A3에서 나오는 겔-여과된 헤파로산으로 얻어진 양성자 핵자기 공명 스펙트럼 연구로부터 생성물이 예상된 구조를 가진다고 결론짓는 것이 가능하다.

적분으로 계산된 탈아세틸화도는 44%인 것으로 나타난다. 이 값은 유리 아미노 그룹대 우론산 함량비(41%)를 사용해서 계산된 것과 근사하다.

[단계b-부분적인 N, O-황산화] :

첫 번째 문장에 기술된 조작이 반복되지 않는다는 사실과는 별개로, 배치 B(단계C, 부분적인 N, O-황산화)에 대한 상기 기술된 방법으로 탈아세틸화된 배치A1, A2 및 A3로부터 나오는 겔-여과된 헤파로산이 처리된다. 첫 번째 침전후, 배치A3로부터 나오는 헤파로산에 대해 펠릿이 초고순도물에 흡수되고 초고순도 물에 대해 투석되며 용액에 남겨진다.

N, O-황산화된 생성물의 특성이 하기 표V에 대조된다.

[표 5]

부분적인 N, O-황산화 반응되고 나서 배치 A1, A2 및 A3에서 나오는 N, O-황산화된 헤파로산의 특징

N, O-황산화 반응후, 잔류NH2 함량(0.10㎛ol/㎎)이 정제된 N-아세틸 헤파로산의 함량(0.05㎛ol/㎎)보다 더 크다는 것이 주목되고 황산화는 그 결과 질소원자상에서 완결되지 않는다.

[단계c-총N-황산화] :

N, O-황산화 생성물1 중량부, 나트륨 비카르보네이트 1 중량부와 황삼산화물/트리메틸아민 착화합물 1 중량부가 도입된 N, O-황산화된 생성물 그램당 초고순도 물20㎖부피 내에 혼합되고, 혼합물이 20시간 동안 교반되면서 55℃에서 반응된다.

반응혼합물이 그리고 나서 희석되고(희석율10), 그리고 얻어진 용액 전도도는 그 후 0.5M 염화나트륨 용액 전도도까지 조정된다.

그 후 2 부피 에탄올을 첨가시켜 침전을 수행하고 원심분리후 0.5M NaCl용액으로 원심분리 펠릿을 흡수시키고 나서 2부피 에탄올을 첨가해서 두 번째로 침전시킨다.

초고순도 물에 흡수되고 초고순도 물에 대해 투석되고 난후, 생성물이 친액화되고 진공하 40℃에서 건조된다.

[핵자기 공명 스펙트럼]

배치 A3에서 나오는 N, O-황산화된 헤파로산의¹³C NMR 스펙트럼 연구는 상기 화합물에 대해 글루코스아미닐 그룹의 위치 6에서 알콜이 완전히 황에스테르 형태이다.

상기 기술된 방법에 따라 측정된 얻어진 N, O-황산화된 헤파로산의 몇가지 특징이 하기 표VI에 대조된다.

잔류 NH₂함량 (0.02㎛ol/㎎)이 낮고 정제 N-아세틸 헤파로산(배치 A와 배치 B에 대해 0.05㎛ol/㎎) 함량보다 더 적고 또한 부분적인 N, O-황산화(표V에 명시됨)의 함량보다 더 적다는 것이 관찰된다.

이것은 N-황산화 반응의 전체 성질을 나타낸다. N-황산화 후 얻어진 생성물 분자량 분포가 실시예1에 기술된 기술에 의해 분석된다.

배치 A1에서 나오는 생성물에 대해 얻어진 용리 프로파일이 제4도에 나타나 있다.

매우 유사한 용리 프로파일이 배치 A2와 A3에서 나오는 생성물에 대해 얻어진다. 용리 프로파일에서 연역되는 몇 가지 결과가 표Ⅶ에 대조된다.

MW₀, MW₁, MW₂및 MW₃정의는 표III에 정의된 것과 동일하다.

각각 배치의 N, O-황산화된 헤파로산은 10000Da 이하의 분자량 사슬질량의 적어도 90%를 함유한다.

사실, 배치 A1, A2 및 A3는 각각 2600Da-9000Da, 3400-10000 Da 및 1800-7600Da사이의 분자량 사슬의 80%를 함유한다.

[실시예5]

실시예2에서 나오는 극히 저분자량인 N-아세틸 헤파로산의 화학적 변경

N, O-황산화된 헤파로산 제조 : 80% N-탈아세틸화 유도체

사용된 N-아세틸헤파로산이 실시예2에 기술된 방법에 따라 제조된다.

상기 생성물의 우론산 함량은 2.12㎛ol/㎎이다.

분자량 분포 측정은 실시예1에 기술된 방법에 따른 배제 크로마토그래피에 의해 수행된다.

적어도 87.5%에 해당하는 중량율은 1500-15000 Da 사이의 분자량 사슬을 가진다.

분포의 우세한 피이크는 대략 4,900Da이다.

N-아세틸 헤파로산의 상기 배치는 배치c로 언급된다.

[단계a]-부분적인 탈아세틸화 배치C 2.5g이 이 2N NaOH 용액 50㎖ 내 용해된다. 용액은 50℃가 되고 교반하면서 8시간 동안 상기 온도에서 반응된다.

pH는 2N HCl용액을 사용해서 8로 조정되고 용액은 초고순도물에 대해 투석되고 나서 친액화된다.

생성물 1.96g이 그 결과 얻어진다.

[N-탈아세틸화도]

유리아미노 그룹(NH2)평가분석은 N-아세틸 헤파로산이 80% N-탈아세틸화되는 것을 나타낸다.

[단계b-N-황산화]

상기 친액화물은 70㎖ 물과 2.5g Na₂CO₃내에 흡수되고 2.5g 황삼산화물/트리메틸아민 착화합물이 첨가된다.

혼합물은 55℃에서 20시간 동안 반응된다.

반응용액의 전도도는 탈광물화된 물을 첨가시켜서 0.5M NaCl 용액 전도도로 만든다.

침전이 4부피 에탄올로 야기된다.

혼합물은 원심분리된다.

침전물은 0.5M NaCl용액 내애서 다시 용해된다.

침전은 에탄올 4부피로 야기된다.

혼합물이 원심분리 된다.

원심분리 펠릿이 초고순도 물로 흡수되고 상기 용액은 이미 기술된 공정 (실시예1)에 따라 투석되고 친액화된다.

대략 2g 생성물이 얻어진다.

[단계c-테트라부틸암모늄 염 형성]

이전 단계에서 얻어진 친액화물은 실시예4 [1) 배치 B의 화학적 변경, 단계b]에 기술된 공정에 따라 테트라부틸암모늄 염으로 전환된다.

염 2.7g이 얻어진다.

[단계d-0-황산화]

이전 단계에서 얻어진 염 2.680g이 196㎖포름아미드에 용해되고 11.27g 황삼산화물/피리딘 착화합물이 첨가된다.

혼합물을 30℃에서 6시간 동안 교반시키면서 반응시킨다.

반응용액 5부피당 2M NaCl 용액 1부피가 첨가되고 pH는 NaOH 용액을 사용해서 7로 맞추어진다.

재침전이 2부피 에탄올로 야기되고, 혼합물이 원심분리되며 펠릿이 0.5M NaCl용액내 재용해된다.

그 후 에탄올 2부피가 첨가된다.

침전물이 형성되게 하고 혼합물이 원심분리되며 원심분리 펠릿이 80㎖ 초고순도 물로 흡수된다.

2M NaCl 용액 20㎖가 첨가되고 나서 4부피 에탄올이 첨가된다.

침전물이 형성되고 혼합물이 원심분리된다.

[단계e-겔 여과]

단계d에서 얻어진 생성물은 초고순도 물로 흡수되고 나서 실시예4 [2)배치 A의 화학적 변경, 단계 a]에 기술된 조건에 따른 겔 여과에 의해 분류된다.

N, O-황산화 헤파로산 조성물릉 구성하는 사슬 분자량은 실시예1에 기술된 방법에 따라 배제 크로마토그래프에 의해 측정된다.

1500-12000 Da분자량을 가진 사슬을 함유하는 부분[용액C(A)]은 한편으로 결합되고 2,000-30,000 Da 분자량 사슬로 구성된 N, O-황산화 헤파로산을 함유하는 부분[용액C(M)]은 달리 결합된다.

용액 C(A)에, 4부피 에탄올이 첨가된다.

침전물이 형성된다 ; 혼합물이 원심분리되고 원심분리 펠릿은 초고순도물로 흡수된다.

혼합물은 초고순도 물에 대해 투석되고 친액화된다.

1.8g생성물이 얻어진다.

그 결과 얻어진 N, O-황산화 헤파로산은 배치 C1으로 언급된다.

상기 기술된 방법에 따라 측정된 이러한 N, O-황산화 헤파로산의 몇가지 특징이 하기 표VIII에 대조된다.

생성물 분자량 분포는 실시예1에 기술된 기술에 의해 계산된다.

용리 프로파일로부터 유도된 몇가지 결과가 표IX에 대조된다.

MW₀, MW₁, MW₂및 MW₃정의는 표III에 주어진 정의와 동일하다.

배치 C1의 N, O황산화 헤파로산은 1,500-15,000 Da 사슬질량 95%를 함유한다.

[핵 자기공명(NMR) 스펙트럼]

양성자 및 탄소¹³C NMR 스펙트라가 배치 C1의 N, O-황산화 헤파로산(AMX 500으로 스펙트라 작동, 용매 D₂O)으로 얻어진다.

양성자와 탄소¹³C NMR 스펙트라는 생성물의 예상된 구조를 확증하게 한다.

후자는 실제로 N, O-황산화 헤파로산이다.

양성자 스펙트럼에서 설탕 양성자 강도 대 아세틸 양성자 비 연구는 가정된 탈아세틸화도 84%로 이끈다. 이값은 유리 아미노 그룹대 우론산 함량의 비(80%)를 사용해서 계산된 값과 유사하다.

탄소¹³C NMR스펙트럼은 특히 글루코스아민이 거의 전체가 N-설페이트화된다는 것을 확증한다.

D-글루쿠론산은 위치2와 3에서 황산화되지 않는다.

[단계f-겔 여과]

4부피 에탄올을 용액C(M)에 첨가한다.

침전물이 형성되고 혼합물이 원심분리되면, 펠릿이 초고순도 물로 흡수되고 혼합물이 투석되고 친액화된다.

친액화물이 그 후 0.5M NaCl용액에 용해되고 단계 e에 정의된조건에 따라 겔 여과에 의해 분류된다.

1,300-21,000 Da 분자량을 가진 사슬을 함유하는 부분[용액C(B)]가 한편에서 결합되고 1,400- 37000Da[용액C(C)]분자량을 가진 사슬을 함유하는 부분은 다른 편에서 결합된다.

상기 두 개의 용액은 용액 C(A)에 대해 상기 기술된 바와 같이 처리되고 친액화 후, 배치 C2가 용액 C(B)로부터 얻어지고 배치C3는 용액 C(C)로부터 얻어진다.

표X는 배치 C2와 배치 C3생성물에 대한 용리 프로파일로부터 유도된 몇 가지 결과를 나타낸다.

MW₀, MW₁, MW₂와 MW₃의 정의는 표III에 명시된 것과 동일하다.

배치 C2에 대응하는 N, O-황산화 헤파로산은 1,500-15,000 Da분자량인 사슬질량을 대략 99%로 함유하고 배치 C3에 대응하는 N, O-황산화 헤파로산은 분자량이 1,500-15,000 Da인 사슬질량을 대략 73% 함유한다.

[실시예6]

실시예2로부터 나오는 극히 저분자량인 N-아세틸 헤파로산의 화학적 변경

N, O-황산화 헤파로산 제조 : 황산화도 2.6을 가진 40% N-탈아세틸화 유도체

개시제로 사용된 N-아세틸 헤파로산은 실시예2의 공정에 따라 제조된다.

상기 화합물 우론산 함량은 1.96㎛ol/㎎이다.

상기 배치는 배치 D로 언급된다.

[단계a-부분적인 탈아세틸화 ]

배치 D 3.7g은 1N NaOH 74㎖에 용해되고 혼합물은 실시예5에 기술된 공정(단계a)에 따라 처리된다.

탈아세틸화는 질소하에 수행된다.

친액화후, 생성물 2.91g이 얻어진다.

[N-탈아세틸화도]

친액화후 얻어진 생성물의 유리아미노 그룹(NH₂)평가분석은 N-아세틸 헤파로산이 40% N-탈아세틸화된다는 것을 나타낸다.

[단계b -N-황산화]

이전 단계에서 얻어진 생성물이 3.7g Na₂CO₃존재하에 실시예5에 기술된 공정(단계b)에 따라 황삼산화물/매틸아민 착화합물 3.7g으로 처리된다.

대략 N-황산화 헤파로산 3g이 그 결과 얻어진다.

[단계c-테트라 부틸 암모늄 염형성]

이전 단계에서 얻어진 대략2g의 N-황산화 헤파로산이 테트라 부틸 암모늄에 실시예 5에 기술된 방법(단계C)에 따라 전환된다.

2.99g 친액화물이 얻어진다.

[단계d-0-황산화]

이전 단계에서 얻어진 염 2.98g이 실시예5에 기술된 방법에 따라서 황삼산화물/트리메틸아민 착화합물 14g과 반응되고 상기 동일한 실시에 5에 기술된 침전과 정제(단계d)가 그 후 수행된다. 2.8g생성물이 얻어진다.

[단계 e- 겔 여과]

이전 단계에서는 얻어진 생성물은 실시예4 [2]배치 A의 화학적 변경,

단계a에 기술된 방법과 장치를 사용해서 겔 여과에 의해 분류된다.

N, O-황산화 헤파로산 부분의 분자량 분포는 실시예1에 기술된 기술에 따라서 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다. N, O-황산화 헤파로산으로 구성된 부분이 분리되면 사슬의 대다수는 1500-15000 Da분자량을 갖는다.

상기 분류물을 그리고 나서 농축되고 초고순도물에 대해 투석된다.

5부피 에탄올을 첨가해서 침전이 수행되고 혼합물이 원심분리되며 침전물이 0.5M NaCl용액내 용해되고 침전 조작이 반복된다.

그 결과 얻어진 정제 생성물은 상기 단계 개시시에 언급된 기록을 사용해서 두 번째 분류된다.

부분의 분자량 또는 이미 기술된 방법에 따라서 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다.

4,000-8,000 Da 분자량을 가진 생성물을 함유하는 부분이 모아진다.

상기 부분은 투석되고 생성물은 그 후 에탄올을 첨가함에 의해 침전된다.

침전물은 회수되고 0.5M NaCl용액에 용해된다.

그 결과 얻어진 용액이 초고순도 물에 대해 투석되고 나서 친액화된다.

배치 D1으로 언급되는 대략1g의 N, O-황산하 헤파로산이 그 결과 얻어진다.

상기 N, O-황산화 헤파로산 분자량의 특징과 특색이 표XI와 XII에 나타나 있다.

MW₀, MW₁, MW₂및 MW₃정의는 표III에 명시된 것과 동일하다.

배치 D1의 N, O-황산화 헤파로산은 4047-10305 Da 사슬질량을 80% 함유하고 대략 상기 사슬질량의 98.5%는 1,500-14,600 Da 분자량을 가진다.

제5도는 상기 N, O-황산화 헤파로산에 대해 얻어진 용리 프로파일을 나타낸다.

[핵자기 공명(NMR)스펙트럼]

양성자와 탄소¹³C NMR스텍트라는 배치 D1의 N, O-황산화 헤파로산으로 얻어진다.(AMX 500에서 스펙트라 작동. 용매 D₂O)

[핵자기 공명(NMR) 스펙트럼]

양성자와 탄소¹³NMR 스펙트라가 배치 D1의 N, O-황산화 헤파로산으로 얻어진다(AMX 500에서 스펙트라 작동, 용매 D₂O)

양성자와 탄소¹³C NMR스펙트라 연구는 생성물의 예상된 구조를 확증하고 후자는 실제로 N, O-황산화 헤파로산이다.

특히 탄소¹³C NMR 스펙트럼은 글루코스아민 단위의 아미노 그룹이 유리

아미노(NH₂)형태라는 것을 확실히 한다.

글루코스아민은 C6위치에서 완전히 황산화 된다 ; 대조적으로, 글루쿠론산의 히드록실 그룹모두는 황산화되지 않는다.

[실시예7]

실시예2에서 나오는 극히 저분자량 N-아세틸 헤파로산의 화학적 변경 :

황산화도 3을 가진 N-탈아세틸화 유도체 40%

개시제로서, 실시예2에 기술된 방법에 따라 제조된 N-아세틸-헤파로산배치가 사용된다.

상기 배치는 배치E로 언급되고 우론산 함량 2㎛ol/㎎을 가진다.

상기 N-아세틸 헤파로산 분자량 분포가 실시예1에 기술된 기술에 의해 계산된다.

상기 N-아세틸 헤파로산은 1,500-15,000 Da 사슬질량을 대략 75%함유하고 상기 사슬의 평균 질량은 대략 10,900 Da이다.

우세한 종의 분자량은 5.135 Da 이다.

[단계a-부분적인 탈아세틸화]

N-아세틸 헤파로산은 실시예6에 언급된 기록(단계a)에 따라 40% N-탈아세틸화된다.

상기 N-아세틸화를 수행하기 위해 2.5g개시제가 사용되며 1N NaOH 50㎖에 용해된다.

상기 반응의 말기에, 반응배지의 pH는 HC1을 사용해서 6으로 조정되고 배지는 그 후 농축된다.

[N-탈아세틸화도]

유리 아미노 그룹(NH₂)평가분석은 N-아세틸 헤파로산이 40%-탈아세틸화된다는 것을 나타낸다.

[단계b-겔 여과]

0.5M NaC1로 평형이 맞추어진 세파크릴 S-300 HR 칼럼(5㎝×100㎝)가 사용된다.

다양한 율로 함유된 헤파로산 분자량 분포가 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다.

6,000-20,000 Da분자량을 가진 사슬을 함유하는 부분이 결합되고, 혼합물은 회전 증발기로 농축되며, 4부피 에탄올로 침전이 야기되며 형성된 침전은 건조된다.

그 결과 대략 1g의 생성물이 얻어진다.

[단계c-테트부틸암모늄 염 형성과 부분적인 N, O-황산화]

테트라부틸암모늄 염을 형성하기 위해서 이전 단계에서 얻어진 생성물 300mg이 사용되고 실시예4 [1)배치 B의 화학적 변경, 단계b]에 기술된 공정이 적용된다.

염 490mg이 얻어지며, 염은 30㎖포름아미드에 용해된다.

부분적인 N, O-황산화는 그후 실시예 4 [1)배치 B의 화학적 변경, 단계C-첫번째 문장]에 기술된 공정에 따라 기술된다.

황 삼산화물/피리딘 착화합물 2.25g과 반응하는 염 490㎎으로부터, N, O-황산화 헤파로산 406㎎이 얻어진다.

[단계d-총N-황산화의 겔 여과]

상기 단계에서 얻어진 생성물 372㎎이 5% Na₂CO₃용액 15㎖에 용해되고 실시예4 [2)배치 A의 화학적 변경, 단계c]에 기술된 방법에 따라 황삼산화물/트리메틸아민 착화합물 372㎎으로 처리된다.

총 N-황산화 후 얻어진 생성물은 세파크릴 S-300HR 칼럼(2.5㎝×100㎝)를 사용하고 이미 기술된 기록을 적용해서 겔 여과에 의해 그후 분류된다.

6,000-20,000 Da 분자량을 가진 부분이 결합되고 회전 증발기 내에서 농축되며 차가운 초 고순도물에 대해 광범위하게 투석되고 친액화된다.

배치 E1으로 언급되는 260㎎ N, O-황산화 헤파로산이 그 결과 얻어진다.

상기 생성물 특징이 표 XIII에 대조된다.

표 XIV는 배치 E1을 구성하는 분자량 분포를 나타낸다.

상기 N, O-황산화 헤파로산은 1,500-15,000 Da 분자량 사슬질량이 대략 75%를 함유하고 7,700- 15,000 Da 분자량을 가진 사슬질량이 대략 65%를 함유한다.

MW₀, MW₁, MW₂및 MW₃의 정의는 표 III에 명시된 것과 동일하다.

[실시예8]

N, O-황산화 페파로산의 두 개의 배치 제조 : 황산화도 2.25 및 2.4를 가진 80% N-탈아세틸화 유도체

사용된 개시제, 배치 F는 실시예2에 기술된 방법에 따라 제조된 N-아세틸 헤파로산 배치이다.

상기 화합물을 구성하는 사슬의 분자량 분포 측정을 실시예1에 기술된 방법에 따라 배제 크로마토그래피에 의해 수행된다.

프로파일 검사로부터, 배치F가 분자량이 1,500-15,000 Da인 사슬질량으로 92%를 함유하게 하는 것이 가능하다.

우세한 피크는 대략 4,800 Da에 놓이고 적어도 80%에 대응하는 배치F의 중량부분은 2,400-10,000 Da 분자량을 가진다.

상기 생성물의 우론산 함량은 2.4㎛ol/㎎이다.

[단계a-부분적인 탈아세틸화]

상기 절차는 배치 F2.5g과 2N NaOH 50㎖를 사용해서 실시예5(단계a)에 기술된 바와 같다.

80% N-탈아세틸화 생성물 1.6g이 얻어진다.

N-탈아세틸화 퍼센티지가 유리아미노 그룹 평가분석에 의해 측정된다.

[단계b 와 c-테트라부틸암모늄염의 N-황산화 및 형성]

상기 두 단계는 실시예5에 기술된 단계 b 및 c와 동일하다.

테트라부틸암모늄 염 4.7g이 얻어진다.

[단계b-0-황산화]

상기 얻어진 2.9g염이 포름아미드 290㎖에 용해되고 황삼산화물/피리딘 17.4g이 첨가된다.

상기 절차는 실시예5의 단계d에 기술된 바와 같다.

두 번째 원심분리후 얻어진 펠릿이 초고순도 물에 용해되고 혼합물은 그 후 초고순도 물에 대해 투석되고 친액화된다.

생성물 3.6g이 그 결과 얻어진다.

[단계e-겔 여과]

이전단계에서 얻어진 생성물이 0.5M NaCl용액에 용해되고 나서 0.5M NaCl로 평형이 맞추어진 세파크릴 S-300 HR 칼럼에 놓인다.

용리제는 분류 수집기를 사용해서 수집된다.

1,400-10,000 Da 분자량을 가진 부분이 결합되고 회전 증발기에서 농축된다.

에탄올 4부피로 침전이 야기되고, 혼합물이 원심분리되며 침전물은 초고순도물로 흡수되며, 그 결과 얻어진 용액이 초고순도 물에 대해 광범위하게 투석되고 친액화되며 생성물이 건조된다.

배치 F1으로 언급되는 N, O-황산화 헤파로산 1.6g이 그 결과 얻어진다.

5,000 Da-35,000 Da 분자량에 대응하는 부분이 결합되고 회전 증발기에서 농축되며 에탄올 4부피가 그 결과 얻어진 용액에 첨가되고 혼합물이 원심분리되며 침전물이 물로 흡수되는 결과 얻어진 용액이 초고순도 물에 대해 투석되고 친액화된다.

친액화물이 상기 단계의 개시시에 기술된 방법에 따라 또 한차례의 분류가 이루어진다.

다양한 부분의 분자량 분포가 실시예1에 기술된 방법에 따라 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다.

2,000-26,000 Da 분자량을 가진 N, O-황산화 헤파로산을 함유하는 부분이 결합된다.

침전이 4부피 에탄올로 야기되고, 혼합물은 원심분리되어 펠릿이 증류수에 다시 용해되고 친액화된다.

배치 F2로 언급되는 N, O-황산화 헤파로산 0.6g이 그 결과 얻어진다.

배치 F1과 F2 특징이 표XV에 나타난다.

용리 프로파일에서 연역된 결과가 표XVI에 대조된다.

MW₀, MW₁, MW₂및 MW₃정의는 표 III에 명시된 것과 동일하다.

배치 F1의 N, O-황산화 헤파로산은 1500-15000Da 분자량을 가진 사슬질량으로 대략99%를 함유한다.

배치F2의 N, O-황산화 헤파로산은 1500-15000Da분자량을 가진 사슬질량으로 대략 84.6%를 함유하며 6900-13500 Da 분자량을 가진 사슬 질량으로 대략 70%를 함유한다.

[핵자기 공명(NMR) 스펙트럼]

양성자 및 탄소¹³C NMR 스펙트라가 배치 F1의 N, O-황산화 헤파로산으로 얻어진다(AMX 500에서 스펙트라 작동, 용매 D₂O).

양성자 스펙트럼 연구와 특히 설탕 양성자 강도대 아미노 탈아세틸화 양성자 강도비의 연구는 20% N-아세틸화 글루코스아민 단위의 제안된 값으로 이끈다.

13C 스펙트럼 연구는 글루코스아민 단위가 실제로 N-황산화 된다는 것을 확증한다.

대부분의 이당류 구조에서 글루쿠론 산은 위치2와 3에서 0-황산화 되지 않는다.

[제법]

[제법A]

극히 고분자량인 N-아세틸 헤파로산의 제조(공정I)

1) 이. 콜라이(K5)의 균주 배양과 N-아세틸-헤파로산을 함유하는 여과액 분리

하기 표XVII에 명시된 조성물

배지 D의 400㎖가 이. 콜라이 균주 SEBR 3282에 접종되고 현탁액은 37℃에서 2시간 동안 진탕시키면서 배양된다.

얻어진 선배양은 그후 11ℓ의 배지 C, 하기 표XVII에 명시된 조성물을 함유하는 18.5ℓ효소자로 전달되고 현탁액은 6시간 30분동안 37℃에서 pH7.2로 공기주입(20ℓ/분까지 )을 조절함에 의해 산소 부분압을 40 mmHg로 유지되도록 하고 진탕시키면서 배양된다. 글리세롤은 16-17시간 넘게 18g/시간 속도로 계속되는 경향으로 글리세롤 500g/ℓ를 함유하는 무균용액을 도입시킴에 의해 첨가된다. 실제로 모든 글리세롤이 소모될 때까지 온도, pH 및 산소 부분압의 동일 조건하에 배양이 계속된다.

글리세롤 첨가가 완결된 후 배양 현탁액의 0D(入=600㎚)를 검사하는 것은 정류 상류나 효소자에서 28-30시간의 연령으로 배양 종결 시간까지 약간의 용해 상태를 완전히 나타낸다.

배양 육즙은 그리고 나서 25℃까지 냉각되고 0.22㎛ 다공성 막을 통해 그 후 여과된다.

극히 고분자량인 N-아세틸 헤파로산을 함유하는 여과액 대략 12ℓ가 그 결과 얻어진다.

[표17]

배지 C 및 배지 D의 조성물과 제법 배지 C

하기 성분이 900㎖ 초 고순도 물에 차례로 용해된다 :

NTA(니트릴로트리 아세트산)………………1000㎎

K₂HPO₄…………………………………………790㎎

글루탐산………………………………………11,000㎎

MgCl₂·6H₂O……………………………………500㎎

K₂SO₄………………………………………………450㎎

FeSO₄·7H₂O………………………………………18㎎

CaCl₂·2H₂O…………………………………………2㎎

NaCl…………………………………………………500㎎

KC1…………………………………………………5000㎎

미량원소 용액(표II를 보라, 실시예1)………………1㎎

글리세롤…………………………………………10,000㎎

pH는 농도1.38인 농축된 수산화 칼륨으로 7.2로 조정되고 부피가 초고순도 물로 1000㎖로 맞추어진다.

무균화 여과는 1.2㎛막을 통해 수행된다.

[글리세롤 용액]

50g 글리세롤이 초 고순도 물의 적정량 내에 용해되고 부피가 동일한 용매로 1000㎖로 조정된다.

0.2㎛막을 통해 무균화 여과가 수행된다.

발효시 채택된 포지제는 스트록톨 J 673(Schill 및 Sellacher^R)

[배지 D]

배지 D의 제법은 부가적으로 완충액(pH7.2) 3-모르폴리노프로판슐폰산이 포지제를 첨가한 후 첨가되어야만 한다는 사실과는 별개로 하고 배지 C의 제법과 동일하다.

2) 극히 고분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제

극히 고 분자량인 N-아세틸 헤파로산이 실시예2[2)극히 저 분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제, 단계a-단계f]에 기술된 공정에 따라 분리되고 정제된다.

3)얻어진 N-아세틸 헤파로산의 특징

배제 크로마토그래피에 의한 분자량 분포측정

현재 사용된 표준의 견지에서, 분자량 분포가 대략 평가된다.

상기 제법에 대해 얻어진 N-아세틸 헤파로산은 20,000 Da-500,000 Da

분자량 사슬로 구성되어 있고 평균 질량은 대략 100,000-200,000 Da이다.

[우론산 평가분석]

최종 단계의 말기에 정제 생성물의 우론산 함량은 2.2㎛ol/㎎이다.

[자외선과 가시광선 영역에서 분광광도법]

얻어진 스펙트럼으로부터, 이 배치가 0.5%이하의 DNA를 함유한다고 단언하는 것이 가능하다.

[총 단백질 평가분석]

총 단백질 함량은 0.5%이하이다.

[유리아미노 그룹(NH₂)평가분석]

NH₂0.1㎛ol/㎎ 이하이다.

[제법B]

극히 고분자량인 N-아세틸헤파로산제

(공정II)

1) 이. 콜라이(K5) 균주 배양 이. 콜라이 균주 SEBR 3282 배양은 제법A에 기술된 방법에 따라 수행된다.

극히 고분자량인 N-아세틸 헤파로산을 함유하는 배양엑 12ℓ가 얻어진다.

2) 예비정제

30,000 Da 나 동등한 잘린 한계를 가진 아미콘^R속이빈-섬유 카트리지를 단계d에서 사용해서 실시예3 [2)예비정제]에서 기술된 바와 절차는 같다.

3) 극히 고 분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리와 정제

절차는 실시예3 [3) 극히 저 분자량인 N-아세틸 헤파로산의 분리와 정제]에 기술된 바와 같다.

[제법C]

제법 A에서 나오는 극히 고분자량인 N-아세틸 헤파로산의 화학적 변경

다양한 화학적 변경에 대한 개시제로서 제법A에 기술된 공정에 따라 제조된 배치 G1으로 언급되는 N-아세틸 헤파로산이 사용된다.

상기 생성물의 우론산 함량은 2.41㎛ol/㎎이다.

[단계a-부분적인 탈아세틸화]

배치 G1 1.9g이 2N NaOH 38.5㎖에 용해된다.

용액은 50℃가 되고 질소하에 8시간 동안 상기 온도에서 반응되도록 유지된다.

pH는 그후 2N HC1을 첨가시켜서 8.25로 조정된다.

혼합물이 초 고순도물에 대해 투석되고 난 후 친액화된다.

생성물 1.6g이 그 결과 얻어진다.

[N-탈아세틸화도]

유리 아미노 그룹(NH₂) 평가분석은 N-아세틸 헤파로산이 80% N-탈아세틸화된다는 것을 나타낸다.

[단계b-N-황산화]

이전 단계에서 얻어진 생성물 1.3g이 57㎖ 초 고순도 물1.9g Na₂CO₃에 용해되고 1.9g 황 삼산화물/트리메틸아민 착화합물이 첨가되고 혼합물은 20시간 동안 55℃가 된다.

용액 전도도는 탈광물화된 물을 첨가시켜 0.5M NaC1 용액의 전도도를 맞추고 침전이 4부피 에탄올로 야기된다.

혼합물이 원심분리되고 펠릿은 0.5M NaCl용액에 흡수되며, 침전이 4부피 에탄올로 야기되고 혼합물은 원심분리된다.

펠릿은 초 고순도물에 용해되고 혼합물은 실시예1에 기술된 방법에 따라 초고순도물로 투석되고 나서 친액화된다.

1.809g N-황산화 헤파로산이 그 결과 얻어진다.

[단계C-테트라부틸 암모늄 염 형성]

이전 단계에서 제조된 생성물800㎎이 100㎖물에 용해된다.

상기 용액은 Dowex50 W8이온교환 칼럼에 놓이고 사용된 절차는 실시예4 [1) 배치B의 화학적 변경, 단계b]에 기술된 바와 같다.

친액화 후, 대략1.3g염이 얻어진다.

[단계d-0-황산화]

상기 얻어진 염이 포름아미드 80㎖에 용해되고 황 삼산화물/ 피리딘 착화합물5.6g이 첨가된다.

혼합물이 30℃에서 6시간 동안 반응되고 2M NaCl 16㎖가 그후 첨가된다.

혼합물이 pH7 이 되고 2부피 에탄올로 침전이 야기된다.

침전물이 0.5M NaCl으로 흡수되고, 재 침전이 2부피 에탄올로 야기되며 혼합물은 초 고순도물에 대해 투석되고 회전 증발기에서 농축된다.

[단계e-겔 여과]

이전 단계에서 얻어진 농축 용액이 세파크릴 S-300 HR컬럼과 용리제로서 0.5M NaCl용액을 사용해서 겔 여과에 의해 분류된다.

10,000-500,000 Da분자량에 대응하는 부분이 분리된다.

2부피 에탄올이 첨가되고 나서 혼합물이 농축된다.

전도도는 물을 첨가해서 그 후0.5M NaCl용액의 전도도로 조정된다.

[단계C-테트라부틸암모늄 염 형성]

이전 단계에서 제조된 생성물 800㎎이 100㎖물에 용해된다.

상기 용액이 Dowex 50 W8B 이온 교환 칼럼에 놓이고 사용된 절차는 실시예4 [1)배치B의 화학적 변경, 단계b]에 기술되어 있다.

친액화 후, 대략 염1.3g이 얻어진다.

[단계d-0-황산화]

상기 얻어진 염이 80㎖ 포름아미드에 용해되고 황 삼산화물/피리딘 착 화합물 5.6g이 얻어진다.

혼합물이 30℃에서 6시간 동안 반응되고 2M NaCl 16㎖가 그후 첨가된다.

혼합물은 pH7이 되고 침전이 2부피 에탄올로 야기된다.

침전물은 0.5M NaCl 용액에 흡수되고, 재 침전이 2부피 에탄올로 야기되며 초 고순도 물에 대해 투석되고 회전 증발기 내에서 농축된다.

[단계e-겔 여과]

이전 단계에서 얻어진 농축액은 세파크릴 S-300 HR 칼럼과 용리제로 0.5M NaCl용액을 사용해서 겔 여과에 의해 분류된다.

10,000-500,000 Da 분자량에 대응하는 부분이 분리된다.

에탄올 2부피가 첨가되고 혼합물은 그 후 농축된다.

전도도가 그후 물을 첨가함에 의해 0.5M NaCl 용액 전도도로 맞추어진다.

겔 여과에 의한 분류가 반복되고 100,000-200,000 Da 평균 분자량을 가진 사슬로 구성된 N, O-황산화 헤파로산을 함유하는 부분이, 또한 대략 50,000Da-12,000 Da 평균 분자량을 가진 사슬로 구성된 N, O-황산화 헤파로산을 함유하는 부분과 같이 수집된다.

각각의 상기 부분들에, 5부피 에탄올이 첨가되고, 상기 부분들이 초고순도물에 대해 투석되고 투석후 얻어진 용액이 친액화된다.

3배치의 N, O-황산화 헤파로산이 그 결과 얻어진다.

-배치G1은 100,000-200,000 Da 평균 분자량을 가진 사슬을 함유하는 N, O-황산화 헤파로산이다.

상기 배치 0.140g이 분리된다.

-배치 G2는 대략 50,000 Da분자량을 가진 사슬로 구성된 N, O-황산화 헤파로산 0.350g이 분리된다.

-배치 G3는 12000 Da 평균 분자량을 가진 사슬로 구성된 N, O-황산화 헤파로산이다.

상기 후자 배치의 0.100g이 분리된다.

상기 실시예에 기술된 N, O-황산화 헤파로산의 세가지 배치 특징이 표XVIII에 대조된다.

Claims (26)

1,500-15,000 Da의 분자질량의 사슬 또는 사슬의 혼합물로 구성되며 하기식(I)

의 반복되는 이당류 구조를 가진 것을 특징으로 하는 N-O-황산화 헤파로산 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염.

(상기식에서, -E는 상기 N, O-황산화 헤파로산의 0 내지 80%인 아세틸 그룹과 항산염 그룹 및 가능하게는 나머지 이당류 단위내 수소원자를 나타내고, -G는 수소 원자 및 황산염 그룹을 나타낸다.

제1항에 있어서, E가 아세틸 그룹 또는 황산염그룹을 나타내는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산

제1항 내지 2항중 어느 한 항에 있어서, 황산염/ 카르복실 비로 표현되는 황산화도는 1.5-3.0인 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 1,500-15,000 Da의 분자질량인 사슬 또는 사슬의 혼합물로 구성되며 하기식(I)

의 반복되는 이당류 구조를 가지고 황산염/카르복실 비로 표현되는 황산화도는 1.5 내지 3.0이며, 사이 N, O-황산화 헤파로산 사슬의 환원성 및 비-환원성 양단부는 황산화 또는 그와 달리된 우론 단위, 황산화 또는 그와 달리된 글루코스아민 단위, 황산화 또는 그와 달리된 N-아세틸 글루코스아민 단위인 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산 그의 제약학적으로 바람직한 염.

제1항에 있어서, 아세틸 그룹이 60%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 11,000 Da이하의 분자질량인 사슬 질량으로 적어도 90%를 함유하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 아미노 그룹(NH₂) 0.2㎛ol/㎎이하를 함유하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 대략 4,000 Da-7,000 Da평균 분자질량인 사슬로 구성되며 황산염/ 카르복실 비로 표현되는 황산화도가 1.7-3인 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 5,000-7,000 Da 분자질량인 사슬로 적어도 70질량%가 구성되고 황산염/카르복실비로 표현되는 황산화도는 1.8-2.5이며 아세틸 그룹이 20%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 10,000-12,000 Da 분자질량인 사슬로 적어도 70질량%가 구성되고 황산염/카르복실 비로 표현되는 황산화도는 1.8 내지 2.5이며 아세틸그룹이 20%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 6,000-8,000 Da 인 분자질량인 사슬로 적어도 70질량%가 구성되고, 황산염/카르복실비로 표현되는 황산화도는 2.0-2.8이며 아세틸 그룹이 60%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산 헤파로산.

제1항에 있어서, 2,300-7,200 Da 분자질량인 사슬로 적어도 80질량%가 구성되고, 황산염/카르복실비로 표현되는 황산화도는 1.8-2.5이며 아세틸 그룹이 20%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 3,300-7,700 Da 분자질량인 사슬로 적어도 80질량%가 구성되고, 황산염/카르복실비로 표현되는 황산화도는 1.8-2.5이며 아세틸 그룹이 20%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 6900-13500 Da 분자질량인 사슬로 적어도 70질량%가 구성되고, 황산염/ 카르복실비로 표현되는 황산화도는 1.8-2.5이며 아세틸 그룹이 20%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항에 있어서, 4,000-10,300 Da 분자질량인 사슬로 적어도 80질량%가 구성되고, 황산염/ 카르복실비로 표현되는 황산화도는 2.0-2.8이며 아세틸 그룹이 60%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산.

제1항의 N, O-황산화 헤파로산 70% 내지 100%를 함유하는 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 하기 일련의 단계들

-단계 a : 이. 콜라이(K5)균주의 배양,

-단계 b : 하기 일반식(Ⅱ)의 반복되는 이당류 구조에 의해 특징지어지는 1,500-15,000 Da 분자질량인 사슬 또는 사슬 혼합물로 구성된 N-아세틸 헤파로산 70-100%을 함유하는 조성물을 얻기 위해 형성되는 N-아세틸 헤파로산 70-100% 함유하는 조성물을 얻기 위해 형성되는 N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제-(예비 정제가 있거나 없음)

-단계c : 하기 일반식(Ⅲ)의 반복되는 이당류 구조에 의해 특징지어지는 1,500-15,000 Da 분자질량인 사슬 또는 사슬 혼합물로 구성된 헤파로산 70-100%를 함유하는 조성물을 얻기 위한 N-아세틸 헤파로산인 상기조성물의 부분적인 탈 아세틸화.

(상기식에서, R¹은 이당류 단위의 0 내지 80% 및 나머지 이당류 단위내 수소원자를 나타낸다.)

-단계 d : -헤파로산인 상기 조성물의 부분적인 N, O-황산화

-헤파로산인 상기 조성물의 부분적인 N, O-황산화 후 전체 N-황산화 단계,

-전체 또는 부분적인 N, 황산화 후 전체 또는 부분적인 O-황산화 단계 및 단계 a, b, c 또는 d의 말기에 형성되는 분자질량에 따른 한 단계 이상의 분류를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 N, O-황산화 헤파로산 70-100%를 함유하는 조성물의 제조하는 방법.

제16항에 있어서 이. 콜라이(K5)균주가 균주 SEBR 3282(제1-1013호, 프랑스 공화국 파리, 파스퇴르 연구소 CNCM에 기탁됨.) 또는 자생적이거나 야기된 상기 균주의 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 방법.

제16항에 있어서, 이. 콜라이(K5) 균주 배량이 생물자원의 선당이 종결된 후 적어도 두시간 동안 계속되는 것을 특징으로 하는 방법.

제16항에 있어서, N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제가 적어도 한 단계의 알콜침전과 적어도 한 단계의 이온 교환 크로마토 그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제16항에 있어서, N-아세틸-헤파로산의 분리 및 정제가 하기 일련의 단계들 ;

-단계 a₁: 에탄올 침전,

-단계 b₁: 투석,

-단계 c₁: 에탄올 침전 후 탈수 및 건조,

-단계 d₁: 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제,

-단계 e₁: 단계 d₁에서 얻어진 용리물의 에탄올 침전, 탈수, 건조 및 분쇄

(여기에서, 단계 a₁또는 c₁이 생략될 수 있다.)를 수반하는 방법을 사용해서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

제16항에 있어서, N-아세틸 헤파로산의 분리 및 정제가 하기 일련의 단계들 ;

-단계 a1' : 투석,

-단계 b1' : 산배지에서 정제, pH3.5 및 pH 1.8 수용액에 불용성이 불순물의 제거,

-단계 c1' : 에탄올 침전 후 탈수 및 건조,

-단계 d1' : 음이온 교환 크로마토 그래피에 의한 정제,

-단계 e1' : 배제 크로마토그래피에 의한 정제를 수반하는 방법을 사용해서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

제16항에 있어서, 분리 및 정제 전에 이. 콜라이(K5) 균주 배양으로부터 얻어지는 N-아세틸 헤파로산이 예비 정제가 가해지고, 하기 일련의 단계들 ;

-단계 a1'' : 배양의 말기에 얻어진 현탁액의 원심분리,

-단계 b1'' : 알카리용액과 상층액을 접촉시키고,

-단계 c1'' : 선여과,

-단계 d1'' : 명시된 잘린 한게막을 사용해서 농축,

-단계 e1'' : 투석,

(단계 e1은 생략될 수 있다)을 수반하는 방법을 사용해서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

제16에 있어서, 부분적인 N, O-황산화 단계후 염기pH인 수용성 용매내 유기 염기와 황 무수물의 착화합물로 수행되고 전체적으로 N-황산화 되는 것을 특징으로 하는 방법.

제16항에 있어서, 전체 N-황산화 단계후 분자질량에 따라 분류되는 것을 특징으로 하는 방법.

1,500-1,5000 Da 분자질량인 사슬 혼합물로 구성되고 하기 일반식 III의

반복되는 이당류 구조로 구성되는 것을 특징으로 하는 헤파로산.

(상기식에서, R¹은 이당류의 0 내지 80%인 아세틸 그룹 및 나머지 이당류 단위내 수소원자를 나타낸다.)

제25항에 있어서, 아세틸 그룹이 60%를 초과하지 않는 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 헤파론산.