SK280642B6

SK280642B6 - N,o-sulfátované heparosany, spôsob ich prípravy a

Info

Publication number: SK280642B6
Application number: SK3668-91A
Authority: SK
Inventors: Jean Claude Lormeau; Bruno Chevallier; Marc Louis Victor Salome; D'estais Guy Etienne Marie Tenaille
Original assignee: Sanofi
Priority date: 1990-12-03
Filing date: 1991-12-03
Publication date: 2000-05-16
Also published as: RU2099353C1; NO914751D0; NZ240838A; GR3023541T3; NO300277B1; HU214986B; CS366891A3; CA2056878A1; BG95567A; DE69125109T2; FI915697A; AR248429A1; AU646112B2; MY109669A; JPH051101A; PL167668B1; US5550116A; FR2669932B1; ES2099145T3; FR2669932A1

Description

Opisujú sa Ν,Ο-sulfátované heparosany tvorené reťazcami alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15000 Da, ktoré majú opakovanú disacharidovú štruktúru všeobecného vzorca (I), v ktorom E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotiek uvedeného Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu acetylovú skupinu a vo zvyšných disacharidových jednotkách sulfátovú skupinu a pripadne atóm vodíka a G znamená atóm vodíka a sulfátovú skupinu, a farmaceutický prijateľných solí uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov. Uvedené heparosany môžu byť použité ako liečivá.

SK 280642 Β6

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových Ν,Ο-sulfátovaných hcparosanov, Ν,Ο-sulfátovaných heparosanových kompozícií obsahujúcich tieto nové Ν,Ο-sulfátované heparosany, spôsobu ich prípravy a farmaceutických kompozícií, ktoré tieto nové Ν,Ο-sulfátované heparosany obsahujú ako účinnú látku.

Doterajší stav techniky

Je známe, že glykozaminoglykány sú produkty, ktoré môžu byť získané extrakciou živočíšnych tkanív. Niektoré z týchto glykozaminoglykánov majú veľmi zaujímavé antikoagulačné a antitrombotické vlastnosti. Typickými produktmi tejto skupiny látok sú heparín, jeho fragmenty a ich deriváty, ako i heparínsulfát a dermatansulfát. Tieto produkty však majú nevýhodu spočívajúcu v tom, že sú vzhľadom na spôsob ich získavania veľmi drahé.

Je známe, že dermatansulfát je tvorený skupinou polymérov s premenným stupňom polymerizácie, tvorenými opakujúcimi sa štruktúrnymi jednotkami pozostávajúcimi zo skupiny kyseliny uránovej (iduronyl alebo glukuronyl) a z acetylsulfo-4-galaktózaminylovej skupiny (H. W. Stuhlsatz „The Methodology of Connective Tissue Research“, (1976), 137-146). Prírodný dermatansulfát má molekulovú hmotnosť medzi 20 000 a 40 000 Da. Tento produkt je obzvlášť zaujímavý' ako antikoagulačne a antitromboticky účinná látka (F. Femandez a kol., British Joumal of Haematology, (1986), 64, 309 - 317).

Okrem toho je známe (I. Bjôrk a U. Lindahl, „Molecular and Cellular Biochemistry“ (1982), Dr. W. Junk Publishers, Holandsko), že krvná koagulácia je komplexným fyziologickým javom, ktorého mechanizmus môže byť schematicky znázornený nasledujúcim spôsobom:

Kontaktná aktivácia

Faktor XII--------- Faktor Xlla

I

Faktor XI -------- Faktora Xla

I

Faktor IX -------- Faktor IXa*

Tkanivový faktor Vila

Faktor X ----- Faktor Xa* — —*· Faktor X

I

Protrombin II-----Trombín* Ila

I

Fibrinogén -------- Fibrín

Xllla

Niektoré stimuly, ako kontaktná aktivácia a tkanivové faktory, spúšťajú následnú aktiváciu série koagulačných faktorov prítomných v krvnej plazme, pričom tieto faktory sú v uvedenej schéme definované rímskymi číslicami a prítomnosť indexu symbolizuje aktivovanú formu, zatiaľ čo neprítomnosť symbolu symbolizuje neaktivovanú formu daného koagulačného faktora.

Nech je charakter stimulu akýkoľvek, finálne etapy sú vždy identické: faktor Xa aktivuje faktor Π (tento faktor je rovnako nazývaný protrombin), ktorého aktívna forma (faktor Π, ktorý je rovnako nazývaný trombín) vyvoláva parciálnu proteolýzu rozpustného fibrinogénu za vzniku nerozpustného fibrínu, ktorý je základnou zložkou krvného koláča.

Za normálnych fyziologických podmienok sú v plazme rovnako prítomné regulačné proteiny, akými sú antitrombín III (ATIII) a kofaktor II heparínu (HCII).

Antitrombín TTT má inhibičnú účinnosť proti množine koagulačných faktorov označených v uvedenej schéme krížikom. Tento inhibičný účinok je veľmi výrazne zosilnený prítomnosťou heparínu alebo syntetických oligosacharidov heparínového typu (D. H. Atha a kol., Biochemistry (1985), 24,6723 - 6729).

Kofaktor II heparínu má inhibičnú účinnosť iba proti faktoru Ila (trombín), ktorý katalyzuje poslednú etapu koagulácie krvi. Táto inhibičná účinnosť je zosilnená výrazným spôsobom v prítomnosti heparínu alebo dermatansulfátu (D. M. Tollefsen, J. Biol. Chem. (1983), 258, 6713 až 6716).

Inhibícia faktora Xa alebo faktora Ha predstavuje prednostný prostriedok, pomocou ktorého možno dosiahnuť antikoagulačné a antitrombotické účinnosti, pretože tieto dva faktory zasahujú do posledných dvoch etáp systému krvnej koagulácie, ktoré sú nezávislé od charakteru stimulu spúšťajúceho proces zrážania krvi.

Pri inhibícii samotného faktora Ila spočíva zaujímavá možnosť vo využití špecifičnosti kofaktora Π heparínu a v zosilnení jeho inhibičnej účinnosti. Dermatansulfát je známym produktom, ktorý má najmocnejšiu zosilňujúcu účinnosť tohto typu.

Rovnako je známe, že stavba heparínového reťazca prebieha v dvoch etapách. Najskôr sa heparín biosyntetizuje z proteoglykánového prekurzoru, ktorého polysacharidová časť je tvorená skupinou polymérov s rôznym stupňom polymerizácie tvorených opakujúcimi sa β-D-glukuronyl-1,4-a-N-acetyl-D-glukózamyl-(l,4)-ovými jednotkami (disacharidové jednotky) s molekulovou hmotnosťou 379 Da. Táto polysacharidová časť je obvykle nazývaná N-acetylheparosan (J. Navia, Anál. Biochem., (1983), 135, 134 - 140). Táto prvá etapa biosyntézy, je jedinou etapou, keď možno naozaj hovoriť o „disacharidových štruktúrnych jednotkách“, lebo druhá etapa biosyntézy výrazným spôsobom modifikuje tento jednoduchý skelet („Heparín, fabrication structure, propriétés, analyses“ J. P. Duclos, (1984), str. 81 - 83, MassonEd., Francúzsko).

V skutočnosti je biosyntézou vytvorený prírodný heparín polysacharidom tvoreným molekulami kyseliny glukurónovej a kyseliny idurónovej (uránovej kyseliny) prípadne sulfátovanými v polohe 2 a pripojenými k molekulám glukozamínu, prípadne sulfátovaným v polohe 6 a sulfátovaným alebo acetylovaným v polohe 2.

Štruktúra heparínu môže byť štatisticky znázornená nasledujúcim všeobecným vzorcom (i):

0X MHB v ktorom

A znamená atóm vodíka a skupinu SO₃‘, B znamená skupinu SO₃‘ a COCH₃ a n je celé číslo medzi 20 a 30, čo zodpovedá molekulovej hmotnosti 12000 až 18000 Da (EP-A-0116801).

Výrazy „atóm vodíka a skupina SO₃‘“ a „skupina SO₃‘ a COCH₃“, použité vo významoch všeobecných substituentov A a B, znamenajú, že v 20 až 30 uvedených disacharidových jednotkách A v niektorých prípadoch znamená atóm vodíka a v iných prípadoch znamená skupinu SO₃‘, analogicky B vo väčšine prípadov znamená skupinu SO₃‘ a v ostatných prípadoch znamená acetylovú skupinu.

SK 280642 Β6

Rovnako tak vlnovková väzba znamená, že skupina COO' v 20 až 30 uvedených disacharidových jednotkách má v niektorých prípadoch konfiguráciu vzorca (Π):

COOH

(ide o kyselinu D-glukurónovú) a vo väčšine z n jednotiek má konfiguráciu vzorca (III):

(ide o kyselinu L-idurónovú).

Ileparín a fragmenty heparínu, ktoré sa najmä získajú rôznymi polymerizačnými postupmi, sú teda makromolekuly obsahujúce tak jednotky kyseliny glukurónovej, ako i jednotky kyseliny idurónovej.

Niektoré depolymerizačné metódy umožňujú získať fragmenty heparínu, majúce molekulovú hmotnosť 2000 až 9000 Da a stupeň sulfatácie, ktorý je aspoň o 20 % vyšší ako stupeň sulfatácie východiskového heparínu. Takéto „supersulfátované“ heparíny sú opísané v patentovej prihláške EP-A-0 116 801 a majú v prípade uránových jednotiek obe uvedené štruktúry vzorcov (ii) a (iii).

Rovnako je známe, že niektoré baktérie rodu Escherichia coli produkujú tobolkovitý polysacharid, ktorý sa obvykle označuje ako antigén K5 a ktorý je tvorený skupinou polymérov tvorených opakujúcimi sa štruktúrnymi β-D-glukuronyl-1,4-a-N-acetyl-D-glukózamyl-( 1,4)-o vými jednotkami (W. F. Vann a kol., Eur. J. Biochem (1981), 116,359 - 364).

Tento polysacharid, ktorý má rovnakú chemickú povahu ako polysacharidová časť proteoglykánového prekurzoru heparínu, tu bude nazývaný N-acetylheparosanoin. Tento produkt má molekulovú hmotnosť 10⁵ až 2.10^s Da a na úrovni jednotiek „kyselina uránová“ má veľmi pravidelnú štruktúru tvorenú výlučne kyselinou D-glukurónovou (W. F. Vann a kol., Eur. J. Biochem., (1980), 116, 359 - 364; patentová prihláška EP-A-0 333 243).

Patentová prihláška EP-A-0 333 243 opisuje O-sulfátovaný polysacharid K5, ako i niektoré z jeho fragmentov tvorených 4, 6 alebo 8 „cukrovými“ jednotkami, ktoré sú rovnako O-sulfátované. Tieto produkty majú antiangiogénnu a protinádorovú účinnosť s priaznivým pomerom týchto účinností vzhľadom na antikoagulačné vlastnosti. Tento dokument rovnako opisuje N-acetylheparosanové fragmenty tvorené 4,6, 8 alebo 10 „cukrovými“ jednotkami.

Patentová prihláška EP-A-0 333 243 rovnako opisuje prípravu pentasacharidu majúceho štruktúru N-acctylhcparosanu, ktorý je O-sulfátovaný, celkovou chemickou syntézou.

Podstata vynálezu

Teraz bolo zistené, že N,O-sulfátované heparosany s premennou molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da majú antikoagulačnú účinnosť proti heparínovému kofaktoru H a veľmi zvýšenú anti-Xa-účinnosť.

N,O-sulfátované heparosany, ktoré sú predmetom vynálezu, sa teda líšia od ostatných produktov, ktorá už boli opísané v literatúre, ich originálnou štruktúrou, najmä ich stupňom sulfatácie (sulfatácia tiež na amínovej skupine glukózamínu) a ich farmakologickými vlastnosťami. Vedľa iných farmakologických vlastností majú antikoagulačnú účinnosť proti heparínovému kofaktoru Π (HCH) silnejšiu, ako je rovnaká účinnosť dermatansulfátu a sú veľmi zaujímavými farmakokinetikami. Produkty podľa vynálezu, ktoré sú produktmi získanými chemickou polosyntézou, majú farmakologické účinky glykozaminoglykánov bežne terapeuticky používaných, najmä farmakologické účinky heparínu, a môžu byť preto použité na reguláciu krvnej koagulácie, pričom môžu nájsť použitie najmä ako antitrombotiká.

Predmetom vynálezu sú Ν,Ο-sulfátované heparosany tvorené reťazcami alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15000 Da, charakterizovanými opakovanou disacharidovou štruktúrou všeobecného vzorca (I)

v ktorom

E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotiek uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanoch acetylovú skupinu a vo zvyšných disacharidových jednotkách sulfátovú skupinu a prípadne atóm vodíka a

G znamená atóm vodíka a sulfátovú skupinu, a farmaceutický prijateľné soli uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov.

Stupeň sulfatácie Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, je výhodne rovnajúci sa

1,5 až 3,0.

Predmetom vynálezu je tiež Ν,Ο-sulfátoheparosanová kompozícia obsahujúca aspoň 70 % hmotnosti Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu, ktorý bol opísaný, pričom táto kompozícia výhodne obsahuje aspoň 90 % hmotnosti N,O-sulfátovaných heparosanov podľa vynálezu.

Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa vynálezu môžu byť tvorené polysacharidovými reťazcami s identickou, dobre definovanou molekulovou hmotnosťou, pričom táto molekulová hmotnosť leží v intervale 1500 až 15000 Da. Uvedené Ν,Ο-sulfátované heparosany môžu byť tiež tvorené zmesou reťazcov s rôznou molekulovou hmotnosťou, pričom tieto molekulové hmotnosti ležia v rozmedzí medzi 1500 a 15000 Da. Rozptyl molekulových hmotností týchto reťazcov môže byť väčší alebo menší. V skutočnosti sulfátované heparosany podľa vynálezu môžu byť tvorené reťazcami, ktorých vzájomné molekulové hmotnosti sa líšia najviac o 13500 Da, alebo naopak reťazcami, ktorých vzájomné molekulové hmotnosti sa líšia o asi 300 Da, čo zodpovedá jednotke uránovej štruktúry (kyselina D-glukurónová alebo jej deriváty) alebo glukózamínovej štruktúry. Rovnako je zrejmé, že v závislosti od konštitúcie každého Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu môže molekulová hmotnosť reťazcov majúcich buď najnižšiu alebo najvyššiu molekulovú hmotnosť zodpovedať ľubovoľnej hodnote medzi 1500 a 15000 Da.

Uvedený výraz „G znamená atóm vodíka a sulfátovú skupinu“ a znamená, že G v disacharidovej jednotke znamená pre niektoré polohy atóm vodíka a pre zvyšné polohy sulfátovú skupinu. Rovnakým spôsobom E znamená v niektorých disacharidových jednotkách acetylovú skupinu a vo zvyšných jednotkách sulfátovú skupinu alebo prípadne atóm vodíka. Disacharidové jednotky Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov nie sú teda všetky identické.

Vzorec (I) zahrnuje opakovanú disacharidovú štruktúru tvorenú glukózamínovou jednotkou a jednotkou kyseliny D-glukurónovej. Uvedené jednotky môžu byť invertované, najmä ak sa berie do úvahy, že disacharidová štruktúra všeobecného vzorca (I) sa opakuje n-krát a že neredukčnou jednotkou reťazcov môže byť buď glukózamínová jednot

SK 280642 Β6 ka, akou je jednotka uvedená vo všeobecnom vzorci (I) s hydroxylovou skupinou v polohe 4, pričom táto glukózamínová jednotka je alebo nie je sulfátovaná alebo kyselina D-glukuronová, ktorá prípadne obsahuje dvojitú väzbu v polohe C4-C5 a je alebo nie je sulfátovaná. Redukčnou jednotkou môže byť buď kyselina D-glukurónová, akou je jednotka uvedená vo všeobecnom vzorci (I), substituovaná vodíkom na anomémom atóme kyslíka, alebo glukózamín alebo 2,5-anhydromano-štruktúra, akou je štruktúra získaná dusitou depolymeiizáciou (2,5-anhydro-D-manóza) a prípadnou následnou oxidáciou (kyselina 2,5-anhydro-D-manonová) alebo redukciou (2,5-anhydro-D-manitol).

Výhodnými produktmi sú tie produkty, ktorých oba konce, redukčné i neredukčné, reťazcov N,O-sulfátovaných heparosanov podľa vynálezu sú tvorené sulfátovanými alebo nesulfátovanými uránovými jednotkami, sulfátovaným alebo nesulfátovaným glukózamínom, N-acetylglukózamínom, ktorý je alebo nie je sulfátovaný, alebo jednotkami majúcimi 2,5-anhydromano-štruktúru.

Výhodné sú Ν,Ο-sulfátované heparosany tvorené reťazcami, ktorých oba konce, redukčné i neredukčné, sú tvorené sulfátovanými alebo nesulfátovanými uránovými jednotkami, sulfátovaným alebo nesulfátovaným glukózamínom a sulfátovaným alebo nesulfátovaným N-acetylglukózamínom.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy kompozície obsahujúci 70 až 100 % Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu podľa vynálezu, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje sekvenciu nasledujúcich stupňov.

stupeň a: kultivácia kmeňa Escherichia coli (K5) s cieľom vytvoriť N-acetylheparosan, stupeň b: izolácia a čistenie vytvoreného N-acetylheparosanu s cieľom získať kompozíciu obsahujúcu 70 až 100 % N-acetylheparosanu tvoreného reťazcom alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da, charakterizovanými opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (II)

stupeň c: parciálna dcacctylácia tejto kompozície N-acctylheparosanu s cieľom získať kompozíciu obsahujúcu 70 až 100 % heparosanu tvoreného reťazcom alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da, charakterizovanými opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (Hl):

NHR' OH v ktorom R' znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotkách acetylovú skupinu a vo zvyšných disacharidových jednotkách atóm vodíka, stupeň d:

- buď parciálna Ν,Ο-sulfatácia tejto heparosanovej kompozície,

- alebo parciálna Ν,Ο-sulfatácia tejto heparosanovej kompozície a následný stupeň celkovej N-sulfatácie,

- alebo celková alebo parciálna N-sulfatácia a následný stupeň celkovej alebo parciálnej O-sulfatácie, pričom uvedený spôsob zahrnuje prípadne jeden alebo niekoľko stupňov fŕakcionácie molekulových hmotností, uskutočnených po ukončení stupňov a, b, c alebo d.

Na prípravu kompozície obsahujúcej 70 až 100 % N,O-sulfátovaného heparosanu podľa vynálezu spôsobom pod ľa vynálezu sa ako kmeň Escherichia coli (K5) výhodne použije kmeň Escherichia coli SEBR 3282. Tento kmeň je odvodený od kmeňa Bi 8337 - 41 (010:K5:H4)ATCC 23506 (opísaný najmä D.S.Gupta a kol., FEMS Microbiology Letters, (1982), 14, 75 - 78 a W. Vann-om v Eur. 1. Biochem., (1981), 116, 359 - 364).

Tento kmeň Escherichia coli SEBR 3282 má pozitívnu odozvu pri typovom teste fágom K5, uskutočnený postupom, opísaným B. Kaiser-om a kol., (J. Clin. Microbiol., (1984), 19,2, 264 - 266). Ide teda naozaj o kmeň Escherichia coli (K5). Tento kmeň bol uložený v CNCM Pasteurového ústavu v Paríži pod číslom 1-1013. Rovnako je možné použiť mutant, a to buď spontánny alebo indukovaný, tohto kmeňa, rovnako ako ďalšie vhodné kmene Escherichia coli (K5), napríklad kmeň Bi 626-42 (012:K5:NM) ATCC 23508.

Použité kultivačné prostredie je výhodne bohaté na dusíkatý materiál a môže byť napríklad tvorené kultivačným prostredím s podstatným obsahom kvasničného extraktu a kazeínového hydrolyzátu, čo je menej nákladný prostriedok obsahujúci významné množstvo aminokyselín.

V kultivácii kmeňa Escherichia coli (K5) sa výhodne pokračuje ešte aspoň dve hodiny po ukončení nárastu biomasy.

Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu s cieľom získať kompozíciu obsahujúcu 70 až 100 % Ν-acetylheparosanu tvoreného zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (H), sa uskutočňujú spôsobom zahrnujúcim aspoň jeden zrážací stupeň a iónomeničový chromatografický stupeň. Tento stupeň sa výhodne uskutoční na stĺpci Q-Sepharosy alebo na ekvivalentnom stĺpci. Zrážanie sa uskutočňuje s použitím vhodného organického rozpúšťadla, najmä alkoholu, výhodne etanolu. Pri tomto spôsobe môže byť N-acetylheparosan vo forme soli, výhodne vo forme sodnej soli.

Ako príklad je možné uviesť nasledujúcu výhodnú schému izolačného a čistiaceho procesu:

- stupeň ag zrážanie etanolom,

- stupeň bg dialýza,

- stupeň Cp zrážanie etanolom, potom dehydratácia a vysušenie,

- stupeň d_t: čistenie iónomeničovou chromatografiou a

- stupeň ef zrážanie eluátu získaného v stupni d, etanolom, dehydratácia, vysušenie a mletie.

Pokiaľ ide o stupne a_b b! a c_1: nie je dôležité v akom poradí sa tieto stupne uskutočňujú. Jeden zo stupňov aj alebo C! môže byť vypustený.

Stupeň ej zahrnujúci zrážanie etanolom nie je nevyhnutný. N-Acetylheparosan môže byť izolovaný i inými postupmi, napríklad odparením vo vákuu eluátu získaného v stupni dp

Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu s cieľom získať kompozíciu obsahujúcu 70 až 100 % N-acetylheparosanu tvoreného zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15000 Da môžu byť rovnako uskutočnené nasledujúcim spôsobom:

- stupeň a'p dialýza,

- stupeň b'p čistenie v kyslom prostredí, odstránenie nerozpustných nečistôt vo vodných roztokoch s pH 3,5 a pH

1,8,

- stupeň c'p zrážanie etanolom, potom dehydratácia a vysušenie,

- stupeň d'p alkalická hydrolýza a dialýza,

- stupeň e p čistenie iónomeničovou chromatografiou a

- stupeň f p čistenie exklúznou chromatografiou.

SK 280642 Β6

Tento spôsob izolácie je tiež výhodným uskutočnením spôsobu podľa vynálezu.

Alkalická hydrolýza sa uskutočňuje pomocou použitia roztoku hydroxidu sodného pri teplote 30 až 80 °C.

V prípade použitia uvedených izolačných a čistiacich postupov je možné ako východiskový produkt použiť suspenziu získanú po ukončení kultivácie, pričom v tomto prípade je nevyhnutná predbežná filtrácia, alebo produkt ktorý sa ešte podrobí predbežnému čisteniu uskutočneného postupom, ktorý zahrnuje nasledujúce stupne:

- stupeň a“_1: odstredenie suspenzie získanej po kultivácii,

- stupeň b“ p uvedenie supematantu do styku s alkalickým roztokom,

- stupeň c“_t: predbežná filtrácia,

- stupeň ď‘i: koncentrácia na membráne so stanoveným separačným prahom, umožňujúca rozdelenie podľa molekulových hmotností a

- stupeň e“ p dialýza .

Stupeň e“! zahrnujúci dialýzu nie je nevyhnutný.

Ako alkalický roztok možno použiť 0,1 N roztok hydroxidu sodného.

Výhodne sa predbežné čistenie získaného produktu uskutoční opísaným postupom po ukončení kultivácie.

Kultivácia kmeňov Escherichia coli (K5) a uvedené izolačné a čistiace postupy, ako i zmienené predbežné čistenia umožňujú získať N-acetylheparosanové kompozície obsahujúce 70 až 100 % N-acetylheparosanu tvoreného zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (Π)

CHjOH COOH

NHCOCHj θ^Η

V skutočnosti je vďaka opísaným postupom izolácie, čistenia a predbežného čistenia možné získať N-acetylheparosanové kompozície obsahujúce aspoň 80 až 100 % N-acetylheparosanu tvoreného zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da.

N-Acetylheparosany tvorené zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou 1500 až 15 000 Da sú novými produktmi a tvoria rovnako predmet vynálezu.

Oba konce, redukčné i neredukčné, nových N-acetylheparosanov získaných opísaným spôsobom, pri ktorom je použitý kmeň Escherichia coli SEBR 3282 alebo iný vhodný kmeň, ako už bolo zmienené, sú uránovými jednotkami alebo N-acetylglukózamínom.

Vo väčšine reťazcov je neredukčný koniec tvorený urónovou jednotkou vzorca (a):

Prípadné obohatenie získanej kompozície N-acetylheparosanom, tvoreným zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou 1500 až 15000 Da, majúcich opakovanú disacharidovú štruktúru vzorca (II), môže byť uskutočnené do rôznych stupňov a najmä až na dosiahnutie izolácie uvedeného N-acetylheparosanu. Toto obohatenie sa uskutoční použitím klasických postupov frakcionácie molekulových hmotností, akými sú najmä permeačná gélová chromatografia a ultrafiltrácia (A. A. Homér, Biochem. J., (1989), 953 - 958; G.Pyler a kol., J. Biol. Chem. (1988), 263, 11, 5197 až 5201 a U. Lindahl a kol., J. Biol. Chem., (1984), 259, 20, 12368 - 12376). Rovnako je možné použiť metódu etanolovej frakcionácie (patentová prihláška EP-A-0 287 477). Táto naposledy uvedená frakcionačná metóda je zo všetkých prípadne použitých metód obzvlášť výhodná.

Opísané N-acetylheparosany sú použité ako medziprodukty na prípravu N,O-sulfátovaných heparosanov podľa vynálezu, ale tiež na prípravu iných derivátov. Na prípravu Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov podľa vynálezu možno tiež použiť iné známe N-acetylheparosany, akými sú napríklad N-acetylheparosany tvorené hlavne polysacharidovými reťazcami, ktoré všetky majú rovnaký počet disacharidových jednotiek, ktoré sú opísané v patentovej prihláške EP-A-0 333 243, a ktoré sú najmä tvorené 6, 8 alebo 10 „cukrovými“ jednotkami, frakcie N-acetylheparosanov tvorených reťazcami obsahujúcimi priemerne 10 monosacharidových jednotiek (Gupta a kol. FEMS Microbiology Letters (1983), 16, 13 - 17) alebo N-acetylheparosany s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktoré môžu byť potom depolymerizované s použitím postupov, ktoré sa používajú na prípravu heparínov s nízkou molekulovou hmotnosťou.

V skutočnosti môžu byť Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa vynálezu pripravené ďalšími postupmi zo známeho polysacharidu (K5) majúceho vysokú molekulovú hmotnosť. V tomto prípade je nevyhnutné zaradiť depolymerizačný stupeň.

Táto depolymerizácia môže byť uskutočnená pred deacetyláciou N-acetylheparosanu s vysokou molekulovou hmotnosťou, po tejto dcacctylácii, po N-sulfatácii alebo tiež po N,O-sulfatácii.

Ako už bolo skôr zmienené, môže byť depolymerizácia uskutočnená postupmi, ktoré sú v odbornej literatúre opísané na prípravu heparínov s nízkou molekulovou hmotnosťou, napríklad depolymerizáciou jodistanom, voľnými radikálmi, β-elimináciou alebo pôsobením kyseliny dusitej (patentové prihlášky alebo patenty EP-0 040 144, EP-0 037 319, EP-0 121 067). Tieto metódy sú tu uvedené iba ako príklady použiteľných metód a tento výpočet teda nemá obmedzujúci účinok. S týmto cieľom je možné použiť ľubovoľnú inú metódu depolymerizácie glukózamínoglykánov.

Keď sa Ν,Ο-sulfátované heparosany pripravia depolymerizáciou z N-acetylheparosanu s vysokou molekulovou hmotnosťou (predbežne deacetylovaného a prípadne N-sulfátovaného) jeho vystavením účinku kyseliny dusitej, môže mať redukčná jednotka Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov podľa vynálezu 2,5-anhydromanoštruktúru a najmä štruktúru 2,5-anhydromanózy. Depolymerizácia účinkom kyseliny dusitej môže byť uskutočnená po stupni N-deacetylácie alebo N-sulfatácie. V prípade, že tento stupeň je nasledovaný oxidáciou alebo redukciou, potom sa získajú Ν,Ο-sulfátované heparosany majúce redukčnú jednotku tvorenú štruktúrou kyseliny 2,5-anhydro-D-manónovej alebo 1,5-anhydro-D-manitolom.

Parciálna deacetylácia kompozícií obsahujúcich 70 až 100 % N-acetylheparosanu, ktorá vedie k získaniu kompozícií obsahujúcich 70 až 100 % a dokonca 80 až 100 % heparosanu tvoreného zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou 1500 až 15000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (Hl), ktorý bol uvedený, sa uskutočňuje pôsobením deacetylačného činidla.

Ako deacetylačné činidlá môžu byť sulfid fosforečný, trietoxyoxóniumfluórboritan, hydroxid sodný alebo hydrazín, pričom dve naposledy uvedené činidlá sú obzvlášť výhodné. Rovnako je možné použiť silné minerálne kyseliny, akými sú kyselina chlorovodíková, kyselina sírová a podobne. Čas trvania tejto reakcie bude závisieť od zvolených reakčných podmienok a najmä od teploty a koncentrácie deacetylačného činidla v reakčnej zmesi.

SK 280642 Β6

Obohatenie heparosanovej kompozície heparosanom tvoreným reťazcom alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou 1500 až 15 000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (III), sa uskutočňuje použitím klasických postupov fŕakcionácie molekulových hmotností, ktoré už boli zmienené (permeačná gélová chromatografia, ultrafiltrácia a etanolová frakcionácia). V tomto prípade sa získajú kompozície obsahujúce 90 až 100 % hmotnosti heparosanu tvoreného zmesou reťazcov s molekulovými hmotnosťami medzi 1500 a 15 000 Da, majúcich opakovanú disacharidovú štruktúru vzorca (ΙΠ).

Na prípravu heparosanu tvoreného zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou 1500 až 15 000 Da je rovnako možné použiť N-acetylheparosany s vysokou molekulovou hmotnosťou. Získané heparosany s vysokou molekulovou hmotnosťou môžu byť po deacetylácii depolymerizované postupmi, ktoré už boli opísané na prípravu heparínov s nízkou molekulovou hmotnosťou a ktoré už boli zmienené. Depolymerizačné produkty môžu byť potom podrobené frakcionácii s cieľom získať výhodné heparosany podľa vynálezu.

Heparosany tvorené zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou 1500 až 15 000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (ΠΙ):

ch₂o:-: cooh

NKH· ^oií v ktorom R znamená v 0 až 80 % disachaiidových jednotkách acetylovú skupinu a vo zvyšných disacharidových jednotkách atóm vodíka, sú novými produktmi a vzhľadom na to sú rovnako predmetom vynálezu.

Výhodné heparosany podľa vynálezu sú heparosany tvorené zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou 1500 až 15 000 Da, charakterizovaných opakovanou disacharidovou štruktúrou vzorca (III), v ktorom je acetylová skupina (R') prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 60 %.

Heparosanové kompozície, ktoré obsahujú aspoň 70 % hmotnosti opísaného heparosanu, tvoria rovnako podstatu vynálezu. Tieto heparosany a heparosanové kompozície sú rovnako medziproduktmi použiteľnými na prípravu N,O-sulfátovaných heparosanov podľa vynálezu, ale môžu byť rovnako použité na prípravu iných produktov, napríklad produktov, ktoré sa následne epimerujú na úrovni jednotky kyseliny D-glukurónovej.

Pred stupňom parciálnej Ν,Ο-sulfatácie môžu byť heparosany prevedené na soľ s organickou bázou alebo na kvartému amóniovú soľ. S cieľom získať kvartému amóniovú soľ uvedených heparosanov sa výhodne použije tetrabutylamónium.

Stupeň parciálnej Ν,Ο-sulfatácie realizovaný postupom, opísaným vo francúzskom patente 2 584 728 zo dňa 10. 11. 1987 (zodpovedajúcim patentovej prihláške FR-85.10787), sa uskutočňuje v aprotickom polárnom rozpúšťadle, akým je dimetylformamid, dimetylsulfoxid, hexametylfosforamid alebo acetonitril alebo ľubovoľná zmes týchto rozpúšťadiel, pomocou napríklad komplexu oxidu sírového (SO₃) s organickou bázou, akou je trimetylamín alebo pyridín. Táto parciálna Ν,Ο-sulfatácia môže byť rovnako uskutočnená roztokom kyseliny chlórsulfónovej v pyridíne. Výhodne sa používa komplex oxidu sírového s pyridínom.

Rovnako je možné použiť i ďalšie sulíatačné činidlá, najmä tie sulfatačné činidlá, ktoré sú opísané E. E. Gilbertom v Chemical Rewiew (1962), 62, 549 - 589. N,O-sulfa tačné reakcie sa všeobecne uskutočňujú pri teplote 0 až 100 °C, výhodne pri teplote 10 až 50 °C, počas 6 až 14 hodín.

Pri spôsobe prípravy sa po ukončení čiastočnej N,O-sulfatačnej reakcie Ν,Ο-sulľátovaná heparosanová kompozícia obsahujúca 70 až 100 % Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu podľa vynálezu vyzráža pridaním chloridu sodného až k dosiahnutiu 0,33 M roztoku chloridu sodného a potom pridaním adekvátneho množstva etanolu. Vylúčená zrazenina sa vyberie 0,5 M roztokom chloridu sodného. Tento roztok sa potom neutralizuje. Po pridaní adekvátneho množstva etanolu sa vylúčená zrazenina izoluje, vyberie ultračistou vodou, dialyzuje proti tejto vode, lyofilizuje a vysuší.

Tak Ν,Ο-sulfatačný stupeň, ako i stupne čistenia kompozície Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu, opísané v predchádzajúcom odseku, môžu byť opakované raz alebo niekoľkokrát. Uvedený spôsob čistenia je iba príkladom použiteľného čistiaceho postupu, ktorý nevylučuje použitie ekvivalentných čistiacich postupov.

Po tomto Ν,Ο-sulfatačnom stupni výhodne nasleduje stupeň celkovej N-sulfatácie, ktorý sa všeobecne realizuje vo vodnom rozpúšťadle, výhodne pri alkalickom pH, pôsobením sulfatačného činidla, akým je komplex oxidu sírového s organickou bázou, napríklad s trimetylamínom.

Po ukončení stupňa celkovej N-sulfatácie sa N,O-sulfátovaná heparosanová kompozícia vyzráža pridaním chloridu sodného až k získaniu 0,5 M roztoku chloridu sodného a etanolu. Vylúčená zrazenina sa potom vyberie 0,5 M roztokom chloridu sodného, vyzráža etanolom, vyberie ultračistou vodou, dialyzuje proti ultračistej vode, lyofilizuje a vysuší.

Obohatenie kompozície Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu Ν,Ο-sulfátovaným heparosanom sa uskutočňuje použitím klasických postupov fŕakcionácie molekulových hmotností, ktoré už boli zmienené. Je výhodné uskutočniť toto obohatenie.

Ν,Ο-sulfátovanej heparosany podľa vynálezu a kompozície Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu obsahujúce aspoň 70 % nového Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu podľa vynálezu sa výhodne získajú spôsobom zahrnujúcim finálnu N-sulfatačnú reakciu. E teda v opakovaných štruktúrach vzorca (I) znamená acetylovú skupinu a sulfátovú skupinu.

Rovnako je možné získať Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa vynálezu tak, že sa najskôr uskutoční N-sulfatácia, po ktorej nasleduje O-sulfatácia. Tento variant spôsobu podľa vynálezu prestavuje výhodný variant.

N-Sulfatácia sa uskutoční pomocou komplexu oxidu sírového s organickou bázou, akou je trimetylamín, trietylamín alebo pyridín. N-sulfatácia môže byť rovnako uskutočnená roztokom kyseliny chlórsulfónovej v pyridíne. Výhodne sa použije komplex oxidu sírového s trimetylamínom a N-sulfatačná reakcia sa uskutoční pri teplote 20 až 80 °C vo vodnom alkalickom prostredí. Po ukončení N-sulfatačnej reakcie sa takto získaný produkt vyzráža pridaním adekvátneho množstva etanolu. Vylúčená zrazenina sa vyberie ultračistou vodou, dialyzuje proti tejto vode, lyofilizuje a vysuší. Tento čistiaci postup je tu uvedený iba ako príldad použiteľného čistiaceho postupu, ktorý nevylučuje použitie iných ekvivalentných čistiacich postupov. Čistiace stupne môžu byť opakované niekoľkokrát.

V rámci spôsobu podľa vynálezu sa N-sulfátovaný heparosan pred O-sulfatáciou výhodne prevedie na soľ s organickou bázou alebo na kvartému amóniovú soľ. S cieľom získať kvartému amóniovú soľ sa výhodne použije tetrabutylamónium.

O-Sulfatačná reakcia sa uskutočňuje vo formaldehyde alebo v inom chemicky ekvivalentnom rozpúšťadle pomo

SK 280642 Β6 cou napríklad komplexu oxidu sírového s organickou bázou, akou je trimetylamín, trietylamín alebo pyridín. Výhodne sa použije komplex oxidu sírového s pyridínom. Ó-Sulfatačná reakcia sa všeobecne uskutočňuje pri teplote 10 až 50 °C.

Ν,Ο-Sulfátovaný heparosan sa potom vyzráža tým, že sa do reakčnej zmesi pridá chlorid sodný až k získaniu 0,33 M roztoku chloridu sodného a potom adekvátne množstvo etanolu, rovnako ako v prípade N,O-sulfatácie. Potom sa uskutoční čistenie kompozície Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu. Jednotlivé čistiace stupne už boli detailne opísané v predchádzajúcom texte (zrážanie etanolom, dialýza atď.).

Ν,Ο-Sulfátovaný heparosan podľa vynálezu výhodne obsahuje aspoň 90 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 11000 Da. Je zistené, že tento N,O-sulfátovaný heparosan obsahuje menej ako 0,2 pmol/mg amínovej skupiny (NH₂).

Acetylová skupina je výhodne prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 60 %, pričom stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl leží v rozmedzí od 1,5 do 3,0.

Výhodnými produktmi podľa vynálezu sú Ν,Ο-sulfátované heparosany tvorené reťazcami majúcimi strednú molekulovú hmotnosť asi 4000 až 7000 Da a stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa

1,7 až 3, ako i Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množstvo prítomnej acetylovej skupiny sa rovná asi 20 %) a tvorené aspoň 70 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou 5000 až 7000 Da a majúci stupeň sulfatácie rovnajúci sa 1,8 až 2,5, alebo tiež N,O-sulfátované heparosany tvorené aspoň 70 % hmotnosti reťazcov s molekulovými hmotnosťami 10 000 až 12 000 Da, N-deacetylované z asi 80 % (množstvo prítomnej acetylovej skupiny sa rovná asi 20 %) a majúci stupeň sulfatácie rovnajúci sa 1,8 až 2,5, alebo konečne Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacylované zo 40 % (množstvo prítomnej acetylovej skupiny sa rovná asi 60 %) a tvorené aspoň 70 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou 6000 až 8000 Da a majúcimi stupeň sulfatácie 2,0 až 2,8.

Výhodnými Ν,Ο-sulfátovanými heparosanmi podľa vynálezu sú najmä:

- Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množstvo prítomnej acetylovej skupiny sa rovná asi 20 %), ktoré sú tvorené aspoň 80 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou 2300 až 7200 Da a ktoré majú stupeň sulfatácie 1,8 až 2,5,

- Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množstvo prítomnej acetylovej skupiny sa rovná asi 20 %), ktoré sú tvorené aspoň 80 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou 3300 až 7700 Da a ktoré majú stupeň sulfatácie 1,8 až 2,5,

- Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 80 % (množstvo prítomnej acetylovej skupiny sa rovná asi 20 %), ktoré sú tvorené aspoň 70 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou 6900 až 13 500 Da a ktoré majú stupeň sulfatácie 1,8 až 2,5 a

- Ν,Ο-sulfátované heparosany, N-deacetylované z asi 40 % (množstvo prítomnej acetylovej skupiny sa rovná asi 60 %), ktoré sú tvorené aspoň 80 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou 4000 až 10 300 Da a ktoré majú stupeň sulfatácie 2,0 až 2,8.

Pod pojmom soli Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov sa rozumejú všetky farmaceutický prijateľné soli. Tieto soli sa získajú klasickými postupmi, ktoré sú najmä opísané na prípravu solí heparínu (patent US 4.168.377).

Uvedený spôsob získania Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov, ako i uvedené čistiace postupy umožňujú získanie Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov vo forme sodnej soli. Z týchto solí môžu byť zase použitím metód na prípravu rôznych solí heparínu alebo heparínu, ktorý nie je vo forme soli („Ľhéparine, fabrication, structure, propriétés, analyses“, J. P. Duclos, (1984), str. 81-83, Masson Ed, Francúzsko) získané ďalšie soli Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov alebo Ν,Ο-sulfátované heparosany, ktoré nie sú vo forme solí.

Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa vynálezu majú zaujímavé farmakologické a biochemické vlastnosti, pričom tieto vlastnosti sú v prekvapivom rozpore s tým, čo bolo doteraz tvrdené v rámci doterajšieho stavu techniky.

Najmä na rozdiel od sulfátovaných produktov antigénu K5 opísaných v patente EP-A-0 333 243, ktoré majú antiangiogénnu a protinádorovú účinnosť s priaznivým pomerom týchto účinností vzhľadom na antikoagulačné vlastnosti, majú Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa vynálezu dobrú regulačnú účinnosť krvnej koagulácie. Táto účinnosť je vyššia ako rovnaká účinnosť dermatansulfátu vzhľadom na rôzne parametre koagulácie a môže byť skôr porovnaná s účinnosťou heparínu.

Inhibičné účinnosti proti faktoru Ila a stimulujúca účinnosť proti antitrombínu ΙΠ (ATIII) a heparínovému kofaktoru U (HCH) reprezentatívnych produktov podľa vynálezu boli stanovené metódami, opísanými D.Dupouy-om a kol. vThrombosis a Haemostasis, (1988), 60, 2, 236 - 239 pre heparinový kofaktor II a M. L. Larsenom a kol. v Thrombosis Research, (1978), 13,2,285 - 288 pre antitrombín.

V oboch prípadoch test spočíva v tom, že sa meria in vitro inhibičný účinok študovaného produktu na prečistený trombín (faktor Ila) v prítomnosti HCH alebo ATIII (prečistený), pričom sa stanovuje amidolytická účinnosť trombínu proti chromogénnemu substrátu. Vzhľadom na to, že dermatansulfát, pripravený postupom, opísaným H. W. Stuhlsatz-om a kol. v „Ihe Methodology of connective Tissue Research“ (1976) 137 - 146, má najsilnejšiu stimulačnú účinnosť na inhibičný účinok HCĽ proti faktoru Ila, je tento dermatansulfát použitý ako referenčný produkt pri meraní tejto účinnosti, pričom výsledok testu je vyjadrený v mg dermatansulfátu (DS) ekvivalentných účinností 1 mg študovaného produktu (mg DE ekviv./mg).

Anti-Xa-účinnosť (Yin-Wesslerov titer) uvedených reprezentatívnych produktov podľa vynálezu bol meraný metódou, opísanou E. T. Yin-om a kol. v J. Lab. Clin. Med. (1973), 81,2,298 - 310, zatiaľ čo ich globálna antikoagulačná účinnosť bola meraná testom APTT, opísaným R.R.Proctorakol. v Am. J. Clin. Path. (1961), 36,212 - 219.

Pri všetkých testovaných produktoch bola stanovená anti-IIa-HCII-dependentná účinnosť vyššia ako účinnosť rovnakého typu vykazovaná dermatansulfátom. Anti-IIaΑΤΙΠ-dependentná účinnosť a Yin-Wesslerov titer testovaných produktov sú síce nižšie ako zodpovedajúce charakteristiky heparínov, ale vyššie ako rovnaké charakteristiky dermatansulfátu. Ich APTT-titer je asi 2 až 20-krát vyšší ako APTT-titer dermatansulfátu a môže byť až 60 % APTT-titru heparínu.

Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa vynálezu majú teda veľmi zaujímavú špecifičnosť účinku a antikoagulačnú účinnosť. Nízka molekulová hmotnosť týchto produktov im inak dáva tiež veľmi zaujímavé farmakokinetické vlastnosti.

Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa vynálezu sú veľmi málo toxické; ich toxicita je dokonale zlučiteľná s ich použitím vo funkcii liečiv.

SK 280642 Β6

Predmetom vynálezu sú teda i farmaceutické kompozície, ktoré ako účinnú látku obsahujú Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa vynálezu, niektorú z ich solí alebo kompozícií Ν,Ο-sulľátovaného heparosanu obsahujúceho aspoň 70 % tohto Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu alebo niektoré z jeho solí v kombinácii s jedným alebo niekoľkými farmaceutický vhodnými vehikulami.

Tieto farmaceutické kompozície sú najmä použiteľné na preventívne alebo symptomatické liečenie porúch vaskulámej steny, akými sú ateroskleróza a artérioskleróza, ako i hyperkoagulačné stavy pozorovateľné napríklad po chirurgických zákrokoch, nádorového rastu alebo anomálií krvnej zrážanlivosti indukovaných bakteriálnymi, vírovými alebo enzymatickými aktivátormi.

Dávkovanie týchto produktov sa bude v širokej miere meniť v závislosti od veku, hmotnosti a zdravotného stavu pacienta, od druhu a závažnosti liečeného ochorenia alebo stavu a od spôsobu podania.

Toto dávkovanie zahrnuje podanie jednej alebo niekoľkých dávok asi 1 mg až 1 g denne, výhodne asi 5 mg až 500 mg denne, napríklad asi 200 mg derme, intravenóznou alebo subkutánnou cestou, pričom toto podanie je diskontinuálne alebo sa uskutočňuje v pravidelných intervaloch, alebo podaniejednej dennej dávky asi 200 až 1000 mg perorálnou cestou.

Tieto dávky môžu byť samozrejme upravené pre každého pacienta v závislosti od pozorovaných výsledkov a skôr uskutočnených krvných analýz.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciami patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

N-Acetylheparosany

Príklad 1

Príprava N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť (spôsob I)

1. Kultivácia bakteriálneho kmeňa Escherichia coli (K5) a separácia filtrátu obsahujúceho N-acetylheparosan

400 ml kultivačného prostredia B, ktorého zloženie je presne uvedené v nasledujúcej tabuľke I, sa naočkuje kmeňom Escherichia coli SEBR 3282 (uloženého vCNCM Pasteurového ústavu v Paríži pod depozitným číslom 1-1013) a inkubuje počas 2 hodín pri teplote 37 °C.

Získaná predkultúra sa potom prevedie do fermentora s obsahom 18,5 litra, obsahujúceho 11 litrov kultivačného prostredia A, ktorého zloženie je presne uvedené v nasledujúcej tabuľke I a kultivačná zmes sa inkubuje počas 4 hodín pri teplote 37 °C a pH rovnajúcom sa 7,4, pričom sa udržuje parciálny tlak kyslíka 5,32 kPa reguláciou vháňania kyslíka (až 20 1/min.) a miešania. Potom sa pridá glukóza kontinuálnym privádzaním sterilného roztoku, obsahujúceho 600 g/1 glukózy, v množstve 250 ml/h počas 8 hodín.

Po zastavení prívodu glukózy sa v kultivácii pokračuje pri rovnakej teplote, rovnakej hodnote pH a rovnakom parciálnom tlaku kyslíka počas 10 hodín. Sledovanie DO (vlnová dĺžka 600 nm) kultivačného prostredia umožňuje určiť, že v priebehu posledných 12 hodín kultivácie nedochádza k nárastu biomasy.

Kultivačná masa sa ochladí na teplotu 25 °C, načo sa prefiltruje cez membránu s veľkosťou pórov 0,22 mikro metrov. Týmto spôsobom sa získa asi 12 1 filtrátu obsahujúceho N-acetylheparosan.

Tabuľka I

Zloženie a príprava kultivačných prostredí A a B

Kultivačné prostredie A

Kultivačné prostredie A sa pripraví zliatím troch ďalej uvedených sterilných roztokov:

Roztok č. 1

V 700 ml ultračistej vody sa rozpustí v nasledujúcom

komplexotvomé činidlo: N'-/tris-(hydroxymetyl)metylglycín (Tricine komerčne dostupný vo firme Fluka)	360 mg
FeSO₄.7H₂O	280 mg
CaCl₂.2H₂O	6,7 mg
MgCl₂.6H₂O	1270 mg
K₂SO₄	500 mg
KC1	5000 mg
kazeínový hydrolyzát (hlavný zdroj aminokyselín) HY ČASE SF (komerčne dostupný vo firme Sheffield)	25000 mg
kvasničný extrakt (komerčne dostupný vo firme Difco)	18000 mg
roztok oligo-prvkov (pozri nasledujúca tabuľka Ľ)	1 ml
prísada proti tvorbe peny Struktol J673 (komerčne dostupná vo firme Schill a Seilacher) v množstve niekoľkých kvapiek uvoľnených Pasteurovou pipetou.

Hodnota pH tohto roztoku sa nastaví na 7,4 roztokom hydroxidu draselného (d = 1,38) a roztok sa doplní na objem 850 ml ultračistou vodou, načo sa prechováva v autokláve počas 45 minút pri teplote 120 °C.

Roztok č. 2

V asi 40 ml ultračistej vody sa rozpustí 5 g K₂HPO₄, načo sa objem získaného roztoku upraví rovnakým rozpúšťadlom na objem 50 ml. Získaný roztok sa potom prefiltruje cez filter s veľkosťou pórov 0,2 mikrometrov.

Roztok č. 3

V adekvátnom množstve ultračistej vody sa rozpusti

20,7 g glukózy a objem získaného roztoku sa upraví na 100 ml rovnakým rozpúšťadlom. Roztok sa potom prechováva v autokláve počas 30 minút pri teplote 110 °C.

Kultivačný prostriedok B

Príprava kultivačného prostredia B je rovnaká ako príprava kultivačného prostredia A s výnimkou spočívajúcou vtom, že sa po pridaní prísady proti tvorbe peny navyše pridá pufer pil = 7,2 (kyselina 3-morfolinopropánsulfónová) v množstve 20 g.

Tabuľka II - Príprava roztoku oligo-prvkov použitého pri príprave kultivačných prostredí A a B

V 800 ml ultračistej vody sa rozpusti v nasledujúcom poradí: _________________________________

HjBCh	500 mg
Na₂MoO₄.2H₂O	1930 mg
CoCl₂.6H₂O	11850 mg
CuSO₄.5H₂O	25 mg
ZnSO₄.7H₂O	2000 mg
A1C1₃.6H₂O	2410 mg

SK 280642 Β6

Potom sa pridá 100 ml kyseliny chlorovodíkovej s hustotou 1,19 a objem roztoku sa doplní ultračistou vodou na finálny objem 1000 ml.

2. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu, ktorý má prevažne nízku molekulovú hmotnosť

Stupeň a - Etanolové zrážanie

Do filtrátu sa pridá asi 48 1 etanolu (95 % hmotn./hmotn.), zmes sa nechá vyzrážať a zrazenina sa usadí pri teplote 4 “C počas 8 hodín. Supematant sa oddelí najskôr odsatím a potom odstredením, načo sa centrifúgačný koláč vyberie asi 11 ultračistej vody.

Stupeň b - Dialýza

Roztok získaný v predchádzajúcom stupni, zavedený do trubice NOJAX 40, obsahujúci membránu na báze celulózy s veľkosťou póru 2,4 nm, sa dialyzuje počas 24 hodín proti ultračistej vode (1 objem roztoku/6 objemov vody, obnovovaných po 2 hodinách, 8 hodinách a 16 hodinách). Táto operácia umožňuje odstrániť malé molekuly prítomné v kultivačnom prostredí, akými sú soli, cukry, aminokyseliny, oligonukleotidy a oligopeptidy.

Stupeň c - Zrážanie, dehydratácia a sušenie

Do 1 1 objemu dialyzovaného roztoku sa pridá 0,5 M chloridu sodného a 4 objemy etanolu. Zrazenina sa nechá vylúčiť počas 5 minút pri teplote okolia. Zmes sa potom odstred’uje pri 5000 g počas 20 minút. Centrifugačný koláč sa vyberie etanolom, získaná suspenzia sa rozmieša, načo sa nechá usadiť v priebehu jednej hodiny pri teplote okolia. Odstredenie a resuspendovanie centrifúgačného koláča sa zopakuje. Potom sa zmes odstred’uje pri 5000 g počas 20 minút. Centrifugačný koláč sa vysuší vo vákuu v sušiarni pri teplote 40 °C počas 24 hodín.

Stupeň d - Rozomletie na prášok

Vysušené centrifugačné koláče sa rozotrú na prášok v trecej miske v bezvodých podmienkach.

Stupeň e - Aniónomeničová chromatografia

Rozotrené centrifugačné koláče sa vyberú v pufri označenom ako pufer D (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) použitom v množstve 100 ml/g. Získaný roztok sa potom chromatografúje na stĺpci silného aniónomeniča, zahrnujúceho agarovú matricu zosieťovanú kvartémymi amóniovými skupinami („Q-Sepharose fast floxV’ od firmy Pharmacia), ktorý bol predbežne uvedený do rovnovážneho stavu s pufrom D, v množstve 50 mt gélu na 1 g prášku. Gél sa premyje dostatočným množstvom pufra D s cieľom návratu na základnú líniu detekcie ultrafialovým svetlom pri 214 nm a potom 25 mM roztokom piperazínu, ktorého pH bolo nastavené na 3,5. Ako elučné činidlo sa použije roztok s pH 3,5, ktorý má zloženie: 0,5 M NaCI a 25 mM piperazínu. Eluát sa potom neutralizuje 5 N roztokom chloridu sodného.

Stupeň f - Zrážanie, dehydratácia, sušenie, rozdrvenie

Opakuje sa postup, ktorý bol opísaný pre stupne c a d, ale bez pridania chloridu sodného.

N-Acetylheparosan získaný na výstupe zo stupňa f, je označený ako šarža A.

Alternatívny variant čistiaceho procesu spočíva vtom, že sa postupne prevedú stupne a, c, b, d, e a f. Takto získaný N-acetyíheparosan je označený ako šarža B.

3. Charakterizácia N-acetylheparosanu získaného na výstupe z rôznych stupňov čistenia

Nukleárne magnetickorezonančné spektrum (NMR)

Protónové a ¹³C-nukleáme magnetickorezonančné spektrum sú porovnané so zodpovedajúcimi spektrami N-acetylheparosanu, opísanými W. E. Vann-om (Eur. J. Biochem., (1981), 116, 359-364).

Štúdium spektier získaných pre šaržu A a šaržu B N-acetylheparosanu potvrdzuje chemickú totožnosť získaného produktu s N-acetylheparosanom, opísaným W. F. Vannom. Ide o polyméme reťazce tvorené opakovanými β-D-glukuronyl-1,4-a-N-acetyl-D-glukózaminyl-( 1,4)-ovými štruktúrami.

Stanovenie rozdelenia molekulových hmotností distribučnou chromatografiou

Rozdelenie molekulových hmotností sa stanoví vysokotlakovou distribučnou kvapalinovou chromatografiou za nasledujúcich podmienok:

- stĺpec tvorený guľôčkami silikagélu s priemerom 10 pm a porozitou 25 nm,

- elučné činidlo: 0,5 M vodný roztok síranu sodného, prietok: 1 ml/min.,

- detekcia ultrafialovým svetlom s vlnovou dĺžkou 205 nm,

- kalibrácia sa uskutočňuje pomocou radu oligosacharidov odvodených od heparínu, ktoré majú nasledujúce molekulové hmotnosti: 1324, 1883, 2436, 3411, 3996, 4535, 4995, 5365, 6150, 6671, 7542, 8655, 10 088, 11 561, 12 950, 14 809,17 387 a 22 674 Da.

Vzhľadom na tento kalibračný rad sú vzaté do úvahy iba molekulové hmotnosti medzi 934 Da a 56703 Da. Pripúšťa sa, že detegovaná optická hustota je úmerná množstvu N-acetylheparosanu. Ale presnosť metódy exponenciálne klesá smerom k vysokým molekulovým hmotnostiam, najmä v prípade molekulových hmotností vyšších ako 20 000 Da.

Elučný profil distribučnej chromatografie šarže A je znázornený na pripojenom obrázku 1. Z obrázku 1 je zrejmé, že ide o polydisperznú distribúciu, pričom maximálny pík sa nachádza v blízkosti molekulovej hmotnosti 4700 Da. Hmotnostná frakcia sa aspoň rovná 70 % šarže A má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 1700 do 8000 Da.

Veľmi obdobný chromatogram sa získa pri distribučnej chromatografii šarže B. Majoritný pík sa v tomto prípade nachádza v blízkosti molekulovej hmotnosti 5000 Da. Hmotnostná frakcia sa aspoň rovná 70 % šarže B má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 1500 do 8000 Da.

Štúdium rozdelenia molekulových hmotností elektroforézou na polyakrylamidovom géli

Analyzované vzorky a činidlo značkujúce koncovú líniu migrácie obsahujúce brómfenolovú modrú sa podrobí elektroforéze v Tris-boritanovom pufri na 15 % polyakrylamidovom géli získanom polymerizáciou zmesi akrylamidu a Ν,Ν'-metylén-bis-akrylamidu v pomere 29/1. Migrácia sa uskutočňuje pri 40 mA počas asi 4 hodín na géli dlhom 18 cm, keď sa činidlo značkujúce koncovú líniu migrácie dostane na koniec gélu. Gél sa potom vyfarbí alciánovou modrou a potom striebrom technikou, opísanou S. Pelkonen-om a kol. v J. Bact., (1983), 170, 6,2646 a špecifickou pre kyslé polysacharidy.

Tejto elektroforéze bol podrobený čiastočne prečistený produkt, získaný na výstupe stupňa a vyčistený produkt tvorený šaržou A alebo šaržou B a získaný na výstupe z finálneho čistiaceho stupňa, s cieľom zistenia, či v priebehu čistenia nedochádza k výraznej modifikácii rozdelenia molekulových hmotností N-acetylheparosanu.

Porovnaním profilov získaných na čiastočne vyčistený produkt a na produkt z finálneho čistiaceho stupňa (šarže A alebo šarže B) možno dospieť k záveru, že v priebehu čis

SK 280642 Β6 tenia nedochádza k výrazným zmenám v rozdelení molekulových hmotností (v rovnakých migračných vzdialenostiach sú prítomné pásy porovnateľnej intenzity) N-acetylheparosanu.

Stanovenie uránových kyselín

Množstvo uránovej kyseliny v jednotke hmotnosti vyčisteného produktu (šarže A alebo šaiže B) získaného na výstupe z finálneho stupňa bolo stanovené kalorimetrický metódou, opísanou T. Bitter-om v Analytical Biochemistry (1962), 4, 330 - 334. Tento spôsob stanovenia je založený na reakcii glykozaminoglykánov skarbazolom v kyslom prostredí za tepla, pri ktorej dochádza k ružovému sfarbeniu, ktoré je priamo úmerné množstvu uvoľnenej kyseliny uránovej.

Pokiaľ ide o šaržu A, boli pre čiastočne vyčistený produkt, získaný na výstupe stupňa d, a pre vyčistený produkt, získaný na výstupe z finálneho stupňa f, stanovené množstvá kyseliny uránovej 1,3, resp. 2,1 μηιοΐ/mg.

Pokiaľ ide o šaržu B, bolo pre vyčistený produkt, získaný na výstupe z finálneho stupňa, stanovené množstvo kyseliny uránovej 2,1 pmol/mg.

Spektrofotometria v ultrafialovej oblasti a vo viditeľnej oblasti svetla

Vyčistený produkt (šarže A) sa rozpustí vultračistej vode a získaný roztok (c = 1 mg/ml) sa naleje do kyvety s 1 cm optickou dráhou. Zaznamená sa absorpčné spektrum roztoku v rozmedzí vlnových dĺžok 200 až 600 nm.

Zo získaného spektra možno urobiť záver a to najmä na báze absorpcie v oblasti vlnovej dĺžky 256 nm, že šarža A obsahuje menej ako 1 % ADN.

Stanovenie celkového množstva proteínov

S cieľom stanoviť celkové množstvo proteínov sa použije súprava „proteín. assay“, ktorá je komerčne dostupná u firmy Biorad. Tento spôsob stanovenia je založený na skutočnosti spočívajúcej vtom, že vlnová dĺžka maximálnej absorbancie kyslého roztoku brilantnej modrej Coomassie g-250 sa posunie u 465 nm na 595 bm v prípade, keď sa na nej vážia proteíny (Reisner a kol., Anál. Biochem, (1975), 64, 509).

Celkový obsah proteínov v šarži A je nižší ako 1,5 %.

Stanovenie voľných amínových skupín

Toto stanovenie bolo uskutočnené metódou, opísanou autormi Zensaku Yosizawa a kol. v Biochemica et Biophysica Acta (1967), 141,358-365.

Obsah amínových skupín (vyjadrený v pmol/mg) je ukazovateľom množstva deacetylovaných β-D-glukuronyl-l,4-u-N-acetyl-D-glukózaminyl-(l,4)-ových. jednotiek a nečistôt, ktoré obsahujú voľnú aminovú skupinu.

Tak šarža A, ako i šarža B obsahuje amínové skupiny v množstve 0,05 pmol/mg. Pomer NH₂/kyselina glukuránová (0,05/2,1) je nižší ako 2,5 %. Pripadá teda (v moloch) na 100 P-D-glukuronyl-l,4-a-N-acetyl-glukózaminyl-(l,4)-ových jednotiek menej ako 2,5 deacetylovanej jednotky tohto typu.

Príklad 2

Príprava N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť (spôsob 11)

Kultivácia kmeňa Escherichia coli SEBR 3282 a separácia filtrátu obsahujúceho N-acetylheparosan boli uskutočnené spôsobom opísaným v príklade 1.

2. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť

Stupeň a - Dialýza

375 ml filtrátu sa podrobí dialýze, uskutočnenej spôsobom, opísaným v príklade /2. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť, Stupeň b/. Po dialýze sa získa asi 1020 ml vyčisteného roztoku.

Stupeň b - Čistenie v kyslom prostredí

Do dialyzovaného roztoku sa pridá adekvátne množstvo 5 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej s cieľom nastaviť hodnotu pH 3,5. Vylúčená zrazenina sa oddelí odstredením, načo sa supematant okyslí rovnakou kyselinou (5 N HCI) s cieľom nastaviť pH na hodnotu 1,8. Môže sa vytvoriť zrazenina, ktorá sa odstráni odstredením. Supematant sa potom zneutralizuje 5N roztokom hydroxidu sodného.

Stupeň c - Zrážanie, dehydratácia a sušenie

Do neutralizovaného roztoku sa pridá adekvátne množstvo chloridu sodného s cieľom získať 0,5 M roztoku chloridu sodného, načo sa pridajú 4 objemy etanolu. Počas 5 minút sa nechá vylúčiť zrazenina pri teplote okolia. Zmes sa potom odstreďuje pri 5000 g počas 20 minút. Centrifúgačný koláč sa vyberie etanolom a získaná zmes sa rozmieša za vzniku homogénnej suspenzie, ktorá sa potom nechá v priebehu jednej hodiny pri teplote okolia usadiť. Odstredenie a suspendovanie sa zopakuje. Zmes sa potom znovu odstreďuje pri 5000 g počas 20 minút. Získaný centrifugačný koláč sa vysuší v sušiarni vo vákuu pri teplote 40 °C počas 24 hodín.

Stupeň d - Alkalická hydrolýza a dialýza

Produkt získaný v predchádzajúcom stupni po vysušení sa rozpustí v 0,25 N roztoku hydroxidu sodného v takom množstve, aby bol získaný 2,5 % (hmotn./obj.) roztok. Takto získaný roztok sa potom udržuje na teplote 50 °C počas 2 hodín. Roztok sa potom neutralizuje použitím 5N roztoku kyseliny chlorovodíkovej a roztok obsahujúci polysacharid sa potom dialyzuje postupom opísaným v príklade 1/2. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť, Stupeň b.

Po dialýze sa získa asi 990 ml roztoku.

Stupeň e - Chromatografia na aniónomeniči

Do dialyzovaného roztoku sa pridá adekvátne množstvo piperazínu, EDTA a tritonu X-100 (Prolabo) s cieľom získať tieto koncentrácie uvedených látok: 25 mM piperazínu, 2 mM EDTA a 0,2 % (obj./obj.) tritonu X-100. pH sa potom nastaví na hodnotu 3,5 pomocou 5N roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Tento roztok sa potom zavedie na stĺpec iónomeničovej živice Q-Sepharose Fast Flow (400 ml), ktorý bol uvedený do rovnováhy s piperazinovým pufrom obsahujúcim 25 mM piperazínu, 2 mM EDTA a 0,2 mM tritonu X-100 (pH = 3,5). Stĺpec sa premyje piperazinovým pufrom a eluuje 0,5 M roztokom hydroxidu sodného, načo sa prevedie vyzrážanie 4 objemami etanolu. Po vysušení vo vákuu pri teplote 40 °C sa získa asi 9,85 g N-acetylheparosanu.

Stupeň f - Distribučná chromatografia gramy produktu získaného v predchádzajúcom stupni sa rozpustia v 60 ml pufrového roztoku obsahujúceho 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 1 M NaCl a získaný roztok sa nechá pretiecť stĺpcom 200 ml oktyl-Sepharosy, ktorý bol predtým uvedený do rovnovážneho stavu s rovnakým puf rom. Do nezadržanej frakcie sa pridajú 4 objemy etanolu. Vylúčená zrazenina sa premyje a vysuší vo vákuu pri teplote 40 ’C.

Týmto spôsobom sa získa 3,90 g N-acetylheparosanu.

3. Charakterizácia N-acetylheparosanu získaného na výstupe z rôznych častiach stupňov

Nukleárne magnetickorezonančné spektrum (NMR)

Štúdium protónového a ¹³C-nukleámeho magnetickorezonančného spektra potvrdzuje chemickú identitu získaného produktu s N-acetylheparosanom, opísaným W. F. Vann-om(Eur. J. Biochem. (1981) 116, 359 - 364).

Stanovenie rozdelenia molekulových hmôt distribučnou chromatografiou

Rozdelenie molekulových hmotností sa stanoví vysokotlakovou kvapalinovou distribučnou chromatografiou uskutočnenou postupom na stanovenie rozdelenia molekulových hmotností N-acetylheparosanov, opísaným v príklade 1. Hmotnostná frakcia sa aspoň rovná 86 % reťazcov, ktoré tvoria šaržu na výstupe príkladu 2, má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da.

Stanovenie uránových kyselín

N-Acetylheparosan získaný v stupni e má obsah kyseliny uránovej 1,94 gmol/mg.

Spektrofotometria v oblasti ultrafialového a viditeľného svetla

Získané spektrum potvrdzuje, že N-acetylheparosan, ktorý bol získaný v tomto príklade, obsahuje menej ako 1 % ADN.

Stanovenie celkového obsahu proteínov

Celkový obsah proteínov v tejto šarži N-acetylheparosanu je nižší ako 1 %.

Stanovenie voľných amínových skupín (NH₂)

Obsah amínových skupín v tejto šarži N-acetylheparosanu je nižší ako 0,1 pmol/mg.

Príklad 3

Príprava N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť (spôsob HI)

1. Kultivácia kmeňa. Escheríchia coli (K5)

Kultivácia kmeňa Escheríchia coli SEBR 3282 bola uskutočnená postupom opísaným v príklade 1. Získa sa asi 12 litrov kultivačnej masy obsahujúcej Ν-acetylheparosan.

2. Predbežné čistenie

Stupeň a - Odstredenie

Po ukončení kultivácie sa získaná kultivačná masa (12 1) odstred’uje pri 8000 otáčkach za minútu (t. j. 11 000 až 14 000 g) počas 20 minút.

Stupeň b - Uvedenie do styku s alkalickým roztokom

Po odstredení sa centrifugačný koláč oddelí a supematant sa uvedie do styku počas jednej hodiny s 0,1 N roztokom hydroxidu sodného.

Stupeň c - Predbežná filtrácia

Roztok získaný v predchádzajúcom stupni sa predbežne prefiltruje cez filter 3M (z polypropylénu, séria 300).

Stupeň d - Koncentrácia na membráne so stanoveným separačným prahom

Filtrát získaný vstupní c sa koncentruje v patróne s náplňou dutých vlákien Amicon so separačným prahom 10000 Da alebo v inom ekvivalentnom prostriedku. Týmto spôsobom sa získa roztok obohatený N-acetylheparosanom s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Stupeň e - Dialýza

Roztok obohatený N-acetylheparosanom s nízkou molekulovou hmotnosťou sa dialyzuje proti ultračistej vode opäť s použitím systému Amicon pri veľmi vysokom zricd’ovacom faktore (vyšší ako 10 000).

3. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť

Postupuje sa rovnako, ako je uvedené v príklade 1/2 izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť, Stupeň c - Stupeň f/, pričom sa získa N-acetylheparosan majúci rovnaké charakteristiky ako šarža A, a ako je uvedené v príklade 2/2. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť, Stupeň a -Stupeň ΐ/.

Ν,Ο-Sulfátované heparosany Príklad 4

Chemické modifikácie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť a získaného v príklade 1

1. Chemická modifikácia šarže B

Stupeň a - Parciálna deacetylácia

500 mg šarže B sa rozpustí v 10 ml IN roztoku chloridu sodného. Získaný roztok sa zahreje na teplotu 50 °C a pri tejto teplote sa nechá za miešania reagovať počas 8 hodín. Roztok sa potom neutralizuje 2N roztokom kyseliny chlorovodíkovej, načo sa dialyzuje proti ultračistej vode a potom lyofilizuje.

Stupeň b - Tvorba tetrabutylamóniovej soli

Lyofilizát získaný v predchádzajúcom stupni sa vyberie 20 ml ultračistej vody. Získaný roztok sa zavedie na iónomeničovú kolónu, ktorej náplň je tvorená polystyrénom zosieťovaným divinylbenzénom (Dowex 50 W 8 komerčne dostupný vo firme Dow Chemical), ktorý bol predbežne kondicionovaný v kyslom prostredí, s cieľom regenerácie kyslej formy produktu. Získaný roztok sa potom zmieša s 0,4 ml 40 % roztoku tetrabutylamónia, načo sa uskutoční lyofilizácia.

Stupeň e - Parciálna N,O-sulfatácia

421 mg soli získanej v predchádzajúcom stupni sa rozpustí v 35 ml dimetylformamidu a k získanému roztoku sa pridá 3,71 g komplexu oxidu sírového a pyridínu (komerčne dostupného vo firme Aldrich pod označením S755-6).

Zmes sa nechá reagovať za miešania pri teplote okolia počas 6 hodín. Do jedného objemu reakčnej zmesi sa pridáva chlorid sodný až do okamihu, keď sa získa 0,33 M roztok chloridu sodného, načo sa pridajú dva objemy etanolu. Počká sa, až sa vytvorí zrazenina, načo sa zmes odstredí a supematant sa oddelí. Centrifugačný koláč sa potom vyberie 0,5 M roztokom chloridu sodného, ktorý sa neutralizuje. Potom sa pridajú dva objemy etanolu. Opäť sa nechá vylúčiť zrazenina, zmes sa odstredí a centrifugačný koláč sa vyberie ultračistou vodou, načo sa uskutoční dialýza proti ultračistej vode a lyofilizácii.

Zopakuje sa súbor operácii opísaných v uvedenom odseku.

Získaný lyofilizát má nasledujúce vlastnosti:

- obsah kyseliny uránovej: 1,11 pmol/mg,

- obsah voľných aminoskupín: 0,01 pmol/mg,

- stupeň sulfatácie: 2,64 na disacharidovú jednotku.

Obsah uránovej kyseliny a aminoskupín sa stanoví rovnako ako v príklade 1.

Stupeň sulfatácie, ktorý je rovnako označovaný ako pomer sulfát/karboxyl, vyjadruje stredný počet sulfátových skupín pripadajúcich na jednu karboxylovú skupinu; tento stupeň sulfatácie je meraný konduktometrickým stanovením sulfátovej skupiny a karboxylovej skupiny, opísaným B. Casu-om a kol. v Carbohydrate Research (1975), 39, 168-176.

2. Chemická modifikácia šarže A

Šaiža A sa rozdelí na tri alikvotné frakcie označené ako šaiža Al, šarža A2 a šarža A3.

Stupeň a - Parciálna deacetylácia a gélová filtrácia

Uvedené šarže Al, A2 a A3 sa spracujú postupom opísaným v stupni a pre uvedenú šaržu B s tým rozdielom, že iba šarža Al sa dialyzuje a lyofilizuje. Šaiža Al, A2 a A3 sa potom frakcionujú gélovou filtráciou (ktorá je rovnako označovaná ako permeačná gélová chromatografia alebo exklúzna chromatografia) za nasledujúcich podmienok:

- náplň: guľôčky s priemerom 25 až 75 pm na báze alyldextránu zosieťovaného Ν,Ν'-metylén-bis-akrylamidom (Sephacryl S 300 HR komerčne dostupný vo firme Pharmacia);

- elučné činidlo: 0,5 M roztok chloridu sodného.

Pripravia sa zmesi frakcií zodpovedajúcich Kav 0,46 až 1 pre heparosan šarže Al, 0,43 až 1 pre heparosan šarže A2 a 0,43 až 0,64 pre heparosan šarže A3. Tieto frakcie sú ďalej označované ako „gélovo filtrované heparosany“.

Kav je koeficient, ktorý sa obvykle používa v exklúznej chromatografii a ktorý umožňuje reprodukovať frakcionáciu exklúznej chromatografie. Tento koeficient je definovaný vzorcom:

Kav=^, Vo-Vt v ktorom:

Ve znamená elučný objem uvažovanej frakcie,

Vo znamená exklúzny objem a Vt znamená celkový objem gélu.

Rozdelenie molekulových hmotností heparosanu zo šarže Al bezprostredne po parciálnej deacetylácii, ako i gélovo filtrovaných heparosanov zo šarží Al, A2 a A3 sa stanoví exklúznou chromatografiou uskutočnenou technikou opísanou v príklade 1.

Elučné profily pred gélovou filtráciou a po gélovej filtrácii pre heparosan zo šarže Al sú znázornené na obrázkoch 2 a 3. Niektoré výsledky uvedených elučných profilov sú uvedené v nasledujúcej tabuľke HL, v ktorej PMo znamená takú molekulovú hmotnosť, že iba 1 % hmotnostné frakcie produktu má molekulovú hmotnosť vyššiu ako je molekulová hmotnosť PMo, PM] znamená takú molekulovú hmotnosť, že iba 10 % hmotnostnej frakcie produktu má vyššiu molekulovú hmotnosť ako je molekulová hmotnosť PM_t, PM₃ znamená takú molekulovú hmotnosť, že iba 10 % hmotnostné frakcie produktu má molekulovú hmotnosť menšiu ako je molekulová hmotnosť PM₃ a PM₂ je molekulová hmotnosť zodpovedajúca maximálnej absorpcii.

Tabuľka Hl - Rozdelenie molekulových hmotností heparosanu zo šarže Al (gélovo nefiltrovaný) a heparosanu gélovo filtrovaných zo šarží Al, A2 a A3

	PMo	PM!	pm₂	pm₃
Gélovo nefiltrovaný heparosan zo šarže Al	41 400	9600	4400	1400

Gélovo filtrovaný heparosan zo šarže Al	10 700	6900	4400	1600
Gélovo filtrovaný heparosan zo šarže A2	12 700	7000	4500	1500
Gélovo filtrovaný heparosan zo šarže A3	10 300	6900	4500	1500

Z uvedených výsledkov a z porovnaní obrázkov 2 a 3 vyplýva, že gélová filtrácia umožňuje eliminovať minoritnú frakciu heparosanu s vysokou molekulovou hmotnosťou. V tabuľke ΠΤ je táto skutočnosť zrejmá z toho, že po gélovej filtrácii došlo k výraznému poklesu molekulovej hmotnosti PMo. Heparosan z každej šarže obsahuje aspoň 90 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 7000 Da.

Gélovo filtrované heparosany zo šarží Al a A2 sa potom spracujú postupom uvedeným v príklade 1/2. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť, Stupeň c/.

Gélovo filtrovaný heparosan zo šarže A3 nie je zrazený, ale dialyzovaný proti ultračistej vode.

Obsahy kyseliny uránovej a voľných amínových skupín sa merajú postupmi uvedenými v príklade 1.

Získané výsledky sú zhrnuté v ďalej zaradenej tabuľke IV. Obsah zvyšných acetylových skupín bol vyhodnotený za predpokladu, že existuje rovnaký počet glukuronylových a glukózaminylových skupín.

Stupeň deacetylácie sa rovná pomeru obsahu voľných amínových skupín k obsahu kyseliny uránovej.

Nukleárne magnetickorezonančné spektrum

Štúdium protónového nukleárneho magnetickorezonančného spektra gélovo filtrovaného heparosanu zo šarže A3 vedie k záveru, že získaný produkt má požadovanú štruktúru.

Stupeň deacetylácie vypočítaný integráciou sa rovná 44 %. Táto hodnota je blízka hodnote stupňa deacetylácie vypočítanej s použitím uvedeného pomeru obsahu voľných amínových skupín k obsahu kyseliny uránovej (41 %).

Tabuľka ľV - Charakteristiky gélovo filtrovaných heparosanov zo šarží Al, A2 a A3

	Stanovený obsah kyseliny uránovej (μπιοΐ/mg)	Stanovený obsah NHz (pmol/mg)	Vypočítaný obsah zvyšných acetylových skupín (umoĽrig)	Stupeň deacetylácie (%)
Gélovo filtrovaný heparosan zo šarže A1	2,3	1.10	1,20	48
Gélovo filtrovaný heparosan zo šarže A2	2,4	1,00	1,40	42
Gélovo filtrovaný heparosan zo šarže A3	2,6	1,05	1,55	41

Stupeň b - Parciálna N,O-sulfatácia

Gélovo filtrované heparosany z deacetylovaných šarží Al, A2 a A3 sa spracujú spôsobom, ktorý bol opísaný pre šaržu B (Stupeň c - parciálna Ν,Ο-sulfatácia), s tým rozdielom, že sa neopakujú operácie opísané v prvom odseku.

V prípade heparosanu zo šarže A3 sa koláč po prvom zrazení vyberie ultračistou vodou, dialyzuje proti ultračistej vode a nechá v roztoku.

Charakteristiky Ν,Ο-sulfátovaných produktov sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke V.

Tabuľka V - Charakteristiky Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov zo šarži Al, A2 a A3 po uskutočnení parciálnej N,O-sulfatácie

	Obsah NH2 (pmol/mg)	Stupeň sulfatácie (pomer sulfat/karboxyl)
Ν,Ο-sulfátovaný heparosan zo šarže Al	0,10	1,9
Ν,Ο-sulfátovaný heparosan zo šarže A2	0,1	1,9
Ν,Ο-sulfátovaný heparosan zo šarže A3	0,10	1,8

Z uvedených výsledkov je zrejmé, že po N,O-sulfatačnej reakcii je obsah zvyšných skupín NH₂ (0,10 pmol/mg) vyšší ako obsah skupín NH₂ prečistených N-acetylheparosanov (0,05 pmol/mg). Sulfatácia teda nie je na atóm dusíka úplná.

Stupeň c - Celková N-sulfatácia

V objeme 20 ml ultračistej vody na gram použitého Ν,Ο-sulfátovaného produktu sa zmieša 1 hmotnostný diel Ν,Ο-sulfátovaného produktu, 1 hmotnostný diel hydrogenuhličitanu sodného, 1 hmotnostný diel komplexu oxidu sírového a trimetylamínu a získaná zmes sa mieša pri teplote 55 °C počas 20 hodin. Reakčná zmes sa potom zriedi (zried’ovací faktor 10), načo sa vodivosť roztoku získaného roztoku nastaví na vodivosť 0,5 M roztoku chloridu sodného. Potom sa uskutoční vyzrážanie pridaním 2 objemov etanolu, odstredenie a vybratie centrifugačného koláča 0,5 M roztokom chloridu sodného a následné vyzrážanie 2 objemami etanolu. Po vybratí ultračistou vodou a dialýze proti ultračistej vode sa produkty lyofilizujú a vysušia vo vákuu pri teplote 40 °C.

Nukleárne magnetickorezonančné spektrum

Štúdium ¹³C-nukleámeho magnetickorezonančného spektra Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu zo šarže A3 ukazuje, že v prípade tejto zlúčeniny je alkoholová funkcia v polohe 6 glukózaminylovej skupiny celkom vo forme esteru kyseliny sírovej.

Niektoré charakteristiky získaných Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov, stanovené opísanými metódami sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke VI.

Tabuľka VI - Charakteristiky produktov získaných po celkovej N-sulfatácii pre šarže Al, A2 a A3

	Obsah kyseliny urónovej (ymol/mg)	Obsah nh₂ÍHmol/mg)	Stupeň deacetylácie (%)	Stupeň sulfatácie (pomer sulfát karboxyl)
Ν,Οsulfátovaný heparosan zo šarže Al	1,20	0,02	48	2,2
N,Osulfatovaný heparosan zo šarže A2	1,30	0,02	42	2,2
N,Osulíatovaný heparosan zo šarže A3	1,35	0,02	41	2,1

Z uvedených výsledkov je zrejmé, že obsah zvyšných skupín NH₂ (0,02 pmol/mg) je nízky a nižší ako rovnaký obsah vyčisteného N-acetylheparosanu (0,05 pmol/mg pre šaržu A a šaržu B) a ako rovnaký obsah Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu získaného po parciálnej Ν,Ο-sulfatácii (uvedený v tabuľke V). To dokazuje úplný priebeh N-sulfatačnej reakcie.

Rozdelenie molekulových hmotností produktov získaných po N-sulfatácii je stanovené postupom opísaným v príklade 1.

Elučný profil získaný pre produkt zo šatže Al je znázornený na obrázku 4. Veľmi podobne elučné profily sa získajú pre produkty zo šarži A2 a A3.

Niektoré výsledky uvedených elučných profilov sú uvedené v nasledujúcej tabuľke VII. Definície symbolov PMo, PMj, PM₂ a PM₃ sú rovnaké ako v prípade tabuľky m.

Tabuľka VH - Rozdelenie molekulových hmotností produktov získaných po celkovej N-sufatácii pre šarže Al, A2 aA3

	PMo	PM!	pm₂	pm₃
Šarža Al	14700	9000	5700	2600
Šarža A2	17500	10000	5800	3400
Šarža A3	11600	7600	5000	1800

Ν,Ο-sulfátovaný heparosan každej zo šarži obsahuje aspoň 90 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 10 000 Da. V skutočnosti šarža Al, A2 a A3 obsahujú 80 % reťazcov v rozmedzí 2600 až 9000 Da, 3400 až 10 000 Da a 1800 až 7600 Da.

Príklad 5

Chemické modifikácie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť z príkladu 2. Príprava 80 % N-deacetylovaných derivátov Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov

Použitý N-acetylheparosan bol pripravený postupom opísaným v príklade 2. Obsah kyseliny urónovej v tomto produkte sa rovná 2,12 μιηοΐ/rng. Stanovenie rozdelenia molekulových hmotností bolo vykonané exklúznou chromatografiou, uskutočnené metódou opísanou v príklade 1. Hmotnostná frakcia sa aspoň rovná 87,5 % má reťazce s molekulovou hmotnosťou v rozmedzí 1500 až 1 000 Da. Majoritný pík rozdelenia molekulových hmotností sa nachádza v oblasti 4900 Da. Táto šarža N-acetylheparosanu je označená ako šarža C.

Stupeň a - Parciálna deacetylácia

2,5 g šarže C sa rozpustí v 50 ml 2N roztoku hydroxidu sodného. Roztok sa zahreje na teplotu 50 °C a nechá sa reagovať pri tejto teplote za miešania počas 8 hodín. pH roztoku sa nastaví na hodnotu 8 pomocou 2N roztoku kyseliny chlorovodíkovej, načo sa roztok dialyzuje proti ultračistej vode a potom lyofilizuje.

Týmto spôsobom sa získa 1,96 g produktu.

Stupeň N-deacetylácie

Výsledok stanovenia obsahu voľných amínových skupín (NH₂) ukazuje, že N-acetylheparosan bol N-deacetylovaný z 80 %.

Stupeň b - N-sulfatácia

Lyofilizát získaný v predchádzajúcom stupni sa vyberie 70 ml vody a po pridaní 2,5 g uhličitanu sodného a 2,5 g komplexu oxidu sírového a trimetylamínu sa zmes nechá reagovať pri teplote 55 °C počas 20 hodín.

Vodivosť reakčného roztoku sa upraví na vodivosť 0,5 M roztoku chloridu sodného pridaním demineralizovanej vody. Vyzrážame sa uskutoční pridaním 4 objemov etanolu. Zrazenina sa odstredí a znovu rozpustí 0,5 M roztoku chloridu sodného. Po vyzrážaní 4 objemami etanolu sa zrazenina odstredí a centrifugačný koláč sa vyberie ultračistou vodou, načo sa získaný roztok dialyzuje postupom,

SK 280642 Β6 ktorý bol už opísaný v príklade 1 a lyofilizuje. Týmto spôsobom sa získajú 2 g produktu.

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamóniovej soli

Lyofilizát získaný v predchádzajúcom stupni sa prevedie na tetrabutylamóniovú soľ postupom opísaným v príklade 4/1. Chemické modifikácie šarže B, Stupeň b/. Získa sa 2,7 g soli.

Stupeň d - O-sulfatácia

2,680 g soli získanej v predchádzajúcom stupni sa rozpusti v 196 ml formamidu, načo sa do získaného roztoku pridá 11,27 g komplexu oxidu sírového a pyridínu. Zmes sa nechá reagovať za miešania pri teplote 30 °C počas 6 hodín. Potom sa na 5 objemov reakčného roztoku pridá 1 objem 2M roztoku chloridu sodného a pH roztoku sa nastaví na hodnotu 7 pomocou roztoku hydroxidu sodného. Roztok sa opätovne vyzráža 2 objemami etanolu, zrazenina sa oddelí odstredením a centrifugačný koláč sa opäť rozpustí v 0,5 M roztoku chloridu sodného. Potom sa pridajú 2 objemy etanolu. Nechá sa vylúčiť zrazenina, ktorá sa odstredí a opätovne vyberie 80 ml ultračistej vody. Pridá sa 20 ml 2M roztoku chloridu sodného a 4 objemy etanolu. Nechá sa vylúčiť zrazenina, ktorá sa oddelí odstredením.

Stupeň e - Gélová filtrácia

Produkt získaný v stupni d sa vyberie ultračistou vodou a potom frakcionuje gélovou filtráciou za podmienok opísaných v príklade 4/2, Chemické modifikácie šaiže A, Stupeň a/. Molekulové hmotnosti reťazcov, ktoré tvoria N,O-sulfátovaný heparosan, sa stanovia exklúznou chromatografiou uskutočnenou postupom, opísaným v príklade 1. Zlúčia sa jednak obsahujúce reťazce majúce molekulovú hmotnosť medzi 1500 a 12 000 Da (roztok C(A)) a jednak frakcie obsahujúce Ν,Ο-sulfátované heparosany tvorené reťazcami s molekulovými hmotnosťami medzi 2000 a 30 000 Da /roztok C(M)/,

Do roztoku C(A) sa pridajú 4 objemy etanolu. Nechá sa vylúčiť zrazenina, ktorá sa odstredí a vyberie ultračistou vodou, načo sa uskutoční dialýza proti ultračistej vode a lyofilizácia. Týmto spôsobom sa získa 1,8 g produktu.

Takto získaný Ν,Ο-sulfátovaný heparosan je označený ako šarža Cl.

Niektoré charakteristiky tohto Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu, stanovené uvedenými postupmi, sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke VIII.

Tabuľka VIH - Charakteristiky produktu zodpovedajúcej šarži Cl

	Obsah kyseliny urónovej (umol/mg)	Obsah Nll₂(pmol/mg)	Stupeň deacctylácie (%)	Stupeň sulfatácie (pomer sulfát/ karboxyl)
Šarža Cl	1,6	0,013	80	1,9

Rozdelenie molekulových hmotností bolo stanovené metódou opísanou v príklade 1. Niektoré výsledky odvodené z elučného profilu sú zhrnuté v tabuľke IX.

Tabuľka K - Rozdelenie molekulových hmotností produktu zodpovedajúceho šarži Cl_________________

	PMo	PM,	pm₂	pm₃
Šarža Cl	9600	7200	5621	2367

Definície symbolov PMo, PM_b PM₂ a PM₃ sú rovnaké ako v prípade tabuľky ΙΠ.

Ν,Ο-sulfátovaný heparosan šarže Cl obsahuje 95 % hmotnosti reťazcov s molekulovými hmotnosťami v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da.

Nukleárne magnetickorezonančné spektrum (NMR)

Protónové a ¹³C-nukleáme magnetickorezonančné spektrum Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu sa získajú s použitím spektroskopu AMX 500 a D₂O ako rozpúšťadla Štúdium takto získaného protónového a ¹³C-nukleámeho magnetickorezonančného spektra potvrdzuje, že získaný produkt má požadovanú štruktúru. Ide teda o Ν,Ο-sulfátovaný heparosan.

Štúdium pomeru intenzít protónov cukrov a protónov acetylových skupín v protónovom spektre vedie ku stupňu deacetylácie rovnajúcemu sa 84 %. Táto hodnota je veľmi blízka hodnote stupňa deacetylácie vypočítanej s použitím pomeru obsahu voľných amínových skupín k obsahu kyseliny urónovej (80 %).

¹³C-nukleáme magnetickorezonančné spektrum najmä potvrdzuje, že glukózamín je takmer úplne N-sulfátovaný. Kyselina glukurónová nie je sulfátovaná v polohe 2 a 3.

Stupeň f - Gélová filtrácia

Do roztoku C(M) sa pridajú 4 objemy etanolu. Nechá sa vylúčiť zrazenina, ktorá sa odstredí, vyberie ultračistou vodou, dialyzuje a lyofilizuje.

Získaný lyofilizát sa potom rozpustí v 0,5 M roztoku chloridu sodného a frakcionuje gélovou filtráciou za podmienok definovaných v stupni e.

Zlúči sa jednak frakcia obsahujúca reťazce, ktoré majú molekulové hmotnosti medzi 1300 a 21 000 Da (roztok C(B)) a jednak frakcia obsahujúca reťazce s molekulovou hmotnosťou medzi 14000 a 37 000 Da (roztok C(C)).

Oba tieto roztoky sa spracujú postupom uvedeným pre roztok C(A), pričom sa po lyofilizácii v prípade roztoku C(B) získa šarža C2, zatiaľ čo po lyofilizácii v prípade roztoku C(C) sa získa šaiža C3.

V nasledujúcej tabuľke X sú uvedené niektoré výsledky odvodené z elučných profilov získaných pre produkty šarže C2 a šarže C3.

Tabuľka X - Rozdelenie molekulových hmotností produktov zodpovedajúcich šaržiam C2 a C3

	PMo	PMj	pm₂	pm₃
Šarža	14 600	9600	7597	5950
Šarža C3	28 656	17 320	10 512	7975

Definícia symbolov PMo, PM_b PM₂ a PM₃ sú rovnaké ako v prípade tabuľky m.

Ν,Ο-sulfátovaný heparosan zodpovedajúci šarži C2 obsahuje asi 99 % hmotnosti reťazcov, ktorých molekulová hmotnosť leží v rozmedzí od 1500 až 15 000 Da, zatiaľ čo Ν,Ο-sulfátovaný heparosan zodpovedajúci šarži C3 obsahuje asi 73 % hmotnosti reťazcov, ktorých molekulová hmotnosť leží v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da.

Príklad 6

Chemické modifikácie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť z príkladu 2. Príprava 40 % deacetylovaného derivátu Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu majúceho stupeň sulfatácie 2,6

N-Acetylheparosan použitý ako východiskový produkt bol pripravený postupom opísaným v príklade 2. Obsah kyseliny urónovej v tomto produkte sa rovná 1,96 pmol/mg. Táto šarža sa nazýva šarža D.

Stupeň a - Parciálna deacetylácia

3,7 g šarže D sa rozpusti v 74 ml IN roztoku hydroxidu sodného a získaný roztok sa spracuje postupom opísaným v príklade 5 (stupeň a). Deacetylácia sa vykoná pod atmosférou dusíka. Po lyofilizácii sa získa 2,91 produktu.

Stupeň N-deacetylácia

Stanovenie obsahu voľných amínových skupín (NH₂) v produkte získanom po lyofilizácii ukazuje, že N-acetylhcparosan bol deacetylovaný zo 40 %.

Stupeň b - N-sulfatácia

Produkt získaný v predchádzajúcom stupni bol spracovaný po pridaní 3,7 g komplexu oxidu sírového a trimetylamínu v prítomnosti 3,7 g uhličitanu sodného postupom opísaným v príklade 5 (stupeň b). Týmto spôsobom sa získajú 3 g N-sulfátovaného heparosanu.

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamóniovej soli

Asi 2 g N-sulfátovaného heparosanu získaného v predchádzajúcom stupni sa prevedú postupom opísaným v príklade 5 (stupeň c) na tetrabutylamóniovú soľ. Získa sa 2,99 g lyofilizátu.

Stupeň d - O-sulfatácia

2,98 g soli získanej v predchádzajúcom stupni sa uvedie do reakcie so 14 g komplexu oxidu sírového a trimetylaminu postupom opísaným v príklade 5 (stupeň d), načo sa uskutočnia vyzrážania a čistenia opísané v tom istom príklade 5 (stupeň d). Získa sa 2,8 g produktu.

Stupeň e - Gélová filtrácia

Produkt získaný v predchádzajúcom stupni sa frakcionuje gélovou filtráciou s použitím metódy a materiálu opísaných v príklade 4/2, Chemické modifikácie šaiže A, stupeň a/.

Rozdelenie molekulových hmotností frakcií N,O-sulfátovaného heparosanu sa stanoví exklúznou chromatografiou uskutočnenou postupom opísaným v príklade 1. Izolujú sa frakcie tvorené Ν,Ο-sulfátovanými heparosanmi, ktorých prevažná väčšina reťazcov má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da.

Tieto frakcie sa potom zahustia a podrobia dialýze proti ultračistej vode. Vykoná sa následné vyzrážanie pridaním 5 objemov etanolu, vylúčená zrazenina sa odstredí, rozpustí v 0,5 M roztoku chloridu sodného, načo sa zopakuje zrážacia operácia.

Takto prečistený produkt sa podrobí druhej frakcionácii s použitím metodiky zmienenej na začiatku tohto stupňa. Rozdelenie molekulových hmotností frakcii sa stanoví exklúznou chromatografíou postupom, ktorý bol už opísaný. Izolujú sa frakcie obsahujúce produkty majúce molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 4000 do 8000 Da.

Získané frakcie sa podrobia dialýze a vyzrážanie pridaním alkoholu. Zrazenina sa izoluje a rozpustí v 0,5 M roztoku chloridu sodného. Takto získaný roztok sa dialyzuje proti ultračistej vode a potom lyofilizuje. Týmto spôsobom sa získa asi 1 gram Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu označeného ako šarža Dl.

Niektoré charakteristiky a rozdelenia molekulových hmotností tohto Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách XI a XH.

Tabuľka XI - Charakteristiky produktu zodpovedajúceho šarži Dl

	Obsah kyseliny uránovej (pmol/mg)	Obsah nh₂(pmol/m g)	Stupeň deacetylácie (%)	Stupeň sulfatácie (pomer sulfát/ karboxyl)
Šarža Dl	1,53	0,01	40	2,60

Tabuľka XII - Rozdelenie molekulových hmotností produktu zodpovedajúceho šarži Dl

	PMo	PM,	pm₂	pm₃
Šarža Dl	15430	10305	6850	4047

Definícia symbolov PMo, PM_b PM₂ a PM₃ sú rovnaké ako v prípade tabuľky ΙΠ.

Ν,Ο-sulfátovaný heparosan šarže Dl obsahuje 80 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou v rozmedzí od 4047 do 10 305 Da a asi 98,5 hmotnosti reťazcov má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 1500 do 14 600 Da. Obrázok 5 predstavuje elučný profil získaný pre N,O-sulfátovaný heparosan.

Nukleárne magnetickorezonančné spektrum (NMR)

Protónové a ¹³C-nukleáme magnetickorezonančné spektrum Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu šarže Dl sa získajú s použitím spektrometra AMX 500, pričom sa ako rozpúšťadlo použije D₂O.

Štúdium protónového a ¹³C-nukleámeho magnetickorezonančného spektra potvrdzuje požadovanú štruktúru produktu. Ide teda skutočne o Ν,Ο-sulfátovaný heparosan.

¹³C-nukleáme magnetickorezonančné spektrum najmä potvrdzuje, že žiadna aminová skupina glukózamínovej jednotky nie je vo forme voľnej amínovej skupiny (NH₂). Glukózamín je v polohe C6 celkom sulfátovaný a naopak všetky hydroxyskupiny kyseliny glukurónovej nie sú sulfátované.

Príklad 7

Chemické modifikácie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť z príkladu 2. Príprava 40 % N-deacylovaného derivátu Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu majúceho stupeň sulfatácie rovnajúci sa 3

Ako východiskový produkt sa v tomto príklade použije šarža N-acetylheparosanu pripravená postupom opísaným v príklade 2. Táto šarža je označená ako šarža E a jej obsah kyseliny uránovej je 2 pmol/mg.

Rozdelenie molekulových hmotností tohto N-acetylheparosanu bolo stanovené technikou opísanou v príklade

1. Tento N-acetylheparosan obsahuje asi 75 % hmotnosti reťazcov majúcich molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da, pričom stredná molekulová hmotnosť týchto reťazcov je asi 10 900 Da. Molekulová hmotnosť majoritného heparosanu je 5135 Da.

Stupeň a - Parciálna deacetylácia

N-Acetylheparosan bol zo 40 % deacetylovaný s použitím metodiky opísanej v príklade 6 (stupeň a). S cieľom uskutočniť túto N-deacetyláciu sa použije 2,5 g východiskového produktu, ktorý sa rozpustí v 50 ml IN roztoku hydroxidu sodného. Po ukončení reakcie sa pH reakčnej zmesi nastaví na hodnotu 6 pomocou kyseliny chlorovodíkovej , načo sa zmes zahusti.

Stupeň N-deacetylácie

Výsledky stanovenia obsahu voľných amínových skupín (NH₂) ukazujú, že N-acetylheparosan bol N-deacetylovaný zo 40 %.

Stupeň b - Gélová filtrácia

Použije sa stĺpec Sephadecrylu S 300 HR (5 cm x 100 cm), ktorý bol uvedený do rovnovážneho stavu s 0,5 M roztokom chloridu sodného. Rozdelenie molekulových hmotností heparosanu obsiahnutého v rôznych frakciách bol stanovený exklúznou chromatografiou. Zlúčia sa frakcie obsahujúce reťazce majúce molekulovú hmotnosť 6000 až 20 000 Da, zahustia sa v zariadení Rotavapor (rotačná odparka) a vyzrážajú 4 objemami etanolu, načo sa vylúčená zrazenina izoluje a vysuší. Týmto spôsobom sa získa asi 1 g produktu.

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamóniovej soli a parciálna N,O-sulfatácia

S cieľom vytvoriť tetrabutylamóniovú soľ sa použije 300 mg produktu získaného v predchádzajúcom stupni a uskutoční sa postup opísaný v príklade 4/1, Chemické modifikácie šarže B, stupeň g). Získa sa 490 mg soli, ktorá sa rozpustí vo 30 ml formamidu. Potom sa uskutoční parciálna Ν,Ο-sulfatácia postupom opísaným v príklade 4/1, Chemické modifikácie šarže B, stupeň c, prvý odsek/,

Zo 490 mg soli, ktorá sa uvedie do reakcie s 2_25 g komplexu oxidu sírového a pyridínu sa získa 406 mg N,O-sulfátovaného heparosanu.

Stupeň d - Celková N-sulfatácia a gélová filtrácia

372 mg produktu získaného v uvedenom stupni sa rozpustí v 15 ml roztoku uhličitanu sodného (5 %) a získaný roztok sa po pridaní 372 mg komplexu oxidu sírového a trimetylamínu spracuje postupom opísaným v príklade 4/2, Chemické modifikácie šarže A, stupeň c/.

Produkt získaný po celkovej N-sulfatácii sa potom frakcionuje gélovou filtráciou s použitím stĺpca Sephacrylu S 300 HR (2,5 cm x 100 cm) a už opísanej metodiky. Frakcie majúce molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 6000 do 20 000 Da sa zlúčia, zahustia v rotačnej odparke Rotavapor, extenzívne dialyzujú proti ulfračistej studenej vode a lyofilizujú. Týmto spôsobom sa získa 260 mg N,O-sulfátovaného heparosanu označeného ako šarža EI. Charakteristiky tohto produktu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke XIII.

Tabuľka XIV uvádza rozdelenie molekulových hmotností reťazcov, ktoré tvoria šaržu EI.

Tento Ν,Ο-sulfátovaný heparosan obsahuje asi 75 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou od 1500 do 15 000 Da a asi 65 % hmotnosti reťazcov majúcich molekulové hmotnosti v rozmedzí od 7700 do 15 000 Da

Tabuľka XHI - Charakteristiky produktu zodpovedajúceho šarži EI

	Obsah kyseliny urónovej (pmol/mg)	Obsah NH₂(pmol/m g)	Stupeň deacetylácie (%)	Stupeň sulfatácie (pomer sulfát/ karboxyi)
Šarža EI	1,35	0,01	40	3

Tabuľka XIV - Rozdelenie molekulových hmotností produktuzodpovedajúceho šarži EI___________________

	PMo	PM_t	PM₂	pm₃
Šarža EI	31238	19671	12029	7748

Príklad 8

Príprava dvoch šarži 80 % N-deacetylovaných derivátov Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu majúcich stupeň sulfatácie

2,25 a 2,4

Použitou východiskovou látkou (šarže F) je šarža N-acetylheparosanu pripraveného postupom opísaným v príklade 2.

Stanovenie rozdelenia molekulových hmotnosti reťazcov, ktoré tvoria túto zlúčeninu, bolo uskutočnené exklúznou chromatografiou postupom opísaným v príklade 1.

Štúdium elučného profilu vedie k záveru, že šarža F obsahuje 92 % hmotnosti reťazcov, ich molekulová hmotnosť leží v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da. Majoritný pík sa nachádza v oblasti 4800 Da. Hmotnostná frakcia šarže F aspoň rovná 80 % má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 2400 do 10 000 Da.

Obsah kyseliny urónovej v tomto produkte sa rovná

2.4 pmol/mg.

Stupeň a - Parciálna deacetylácia

Postupuje sa rovnako ako v príklade 5 (stupeň a), pričom sa použije 2,5 g šarže F a 50 ml 2N roztoku NaOH. Týmto spôsobom sa získa 1,6 g produktu, ktorý je z 80 % N-deacetylovaný. Stupeň deacetylácie bol vypočítaný na základe stanovenia obsahu voľných amínových skupín.

Stupeň b a c - N-sulfatácia a tvorba tetrabutylamóniovej soli

Tieto dva stupne sú rovnako ako stupne b a c opísané v príklade 5. Získa sa 4,7 g tetrabutylamóniovej soli.

Stupeň d - O-sulfatácia

2,9 g soli získanej v predchádzajúcom stupni sa rozpustí v 290 ml formamidu a do získaného roztoku sa pridá

17.4 g komplexu oxidu sírového a pyridínu. Použije sa postup, ktorý bol opísaný v stupni d príkladu 5. Centrifugačný koláč získaný po druhom odstredení sa rozpustí v ultračistej vode, získaný roztok sa dialyzuje proti ultračistej vode alyofilizuje. Získa sa 3,68 g produktu.

Stupeň e - Gélová filtrácia

Produkt získaný v predchádzajúcom stupni sa rozpustí v 0,5 M roztoku chloridu sodného a získaný roztok sa zavedie na stĺpec Sephacrylu S 300 HR, ktorý bol uvedený do rovnováhy s 0,5 M roztokom chloridu sodného. Eluát opúšťajúci kolónu sa zachytáva do automatického zberača frakcií.

Frakcie majúce molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 1400 Da do 10 000 Da sa zlúčia a zahustia v rotačnej odparke Rotavapor. Pridajú sa 4 objemy etanolu, vylúčená zrazenina sa odstredí, vyberie ultračistou vodou a získaný roztok sa dialyzuje extenzívne proti ultračistej vode, lyofilizuje a vysuší. Získa sa 1,6 g Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu označeného ako šarža Fl.

Frakcie zodpovedajúce molekulovým hmotnostiam v rozmedzí od 5000 do 35 000 Da sa zlúčia, zahustia v rotačnej odparke Rotavapor a do takto získaného roztoku sa pridajú 4 objemy etanolu. Vylúčená zrazenina sa odstredí, vyberie vodou, dialyzuje proti ultračistej vode a lyofilizuje. Získaný lyofilizát sa potom podrobí novej frakcionácii sa použitia postupu uvedeného na začiatku tohto stupňa.

Rozdelenie molekulových hmotností jednotlivých frakcií sa stanoví exklúznou chromatografiou s použitím postupu, ktorý bol opísaný v príklade 1. Zlúčia sa frakcie tvoriace Ν,Ο-sulfátované heparosany a majúce molekulovú

SK 280642 Β6 hmotnosť v rozmedzí od 2000 do 26 000 Da. Vyzrážanie sa uskutoční pridaním 4 objemov etanolu. Vylúčená zrazenina sa odstredí a opäť rozpustí v destilovanej vode, načo sa získaný roztok dialyzuje a lyofilizuje. Týmto spôsobom sa získa 0,6 g Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu označeného ako šaržaF2.

Charakteristiky šarží F1 a F2 sú uvedené v nasledujúcej tabuľke XV. Výsledky odvodené zelučných profilov sú zhrnuté v tabuľke XVI.

Tabuľka XV - Charakteristiky Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov zodpovedajúcich šaržiamFl aF2

	Obsah kyseliny uránovej (pmol/mg)	Obsah nh₂(pmol/mg)	Stupeň deacetylácie (%)	Stupeň sulfatácie (pomer sulfát/ karboxyl)
Šarža F1	1,58	menší ako 0,01	80	2,4
Šarža F2	1,58	menší ako 0,01	80	2,25

Tabuľka XVI - Rozdelenie molekulových hmotností produktov zodpovedajúcich šaržiam F1 a F2 _______

	PMo	PM,	pm₂	pm₃
Šarža F1	10700	7700	5800	3300
Šarža F2	24400	16325	8600	6900

Definície PMo, PM_b PM₂ a PM₃ sú rovnaké ako v prípade tabuľky ΠΙ.

Ν,Ο-sulfátovaný heparosan šarže F1 obsahuje asi 99 % hmotnosti reťazcov majúcich molekulové hmotnosti v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da, zatiaľ čo N,0-sulfátovaný heparosan šarže F2 obsahuje asi 84,6 % hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou v rozmedzí od 1500 do 15 000 Da a asi 70 % hmotnosti reťazcov má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 6900 do 13 500 Da.

Nukleárne magnetickorezonančné spektrum (NMR)

Protónové a ^l3C-nuklcámc magnetickorezonančné spektrum Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu šarže F1 sa získa s použitím spektrometru AMX 500, pričom sa ako rozpúšťadlo použije D₂O. Štúdium protónového spektra a najmä pomeru intenzít protónov cukrov k protónom deacetylovaných jednotiek vedie k záveru, že asi 20 % glukózamínových jednotiek je N-acetylovaných.

Štúdium ¹³C-nukleámeho magnetickorezonančného spektra potvrdzuje, že glukózamínová jednotka je skutočne N-sulfátovaná. Kyselina glukurónová nie je vo väčšine štruktúrnych disacharidových jednotiek O-sulfátovaná v polohách 2 a 3.

Preparáty Preparát A Príprava N-acetylheparosanu majúceho prevažne vysokú molekulovú hmotnosť (spôsob I)

1. Kultivácia kmeňa Escherichia coli (K5) a separácia filtrátu obsahujúceho N-acetylheparosan

400 ml kultivačného prostredia D, ktorého presné zloženie je uvedené v ďalej uvedenej tabuľke XVII, sa naočkuje kmeňom Escherichia coli SEBR 3282 a naočkované kultivačné prostredie sa potom inkubuje za miešania pri teplote 37 °C počas 2 hodín.

Získaná predkultúra sa potom prevedie do fermentora s obsahom 18,5 1 obsahujúceho 11 litrov kultivačného prostredia C, ktorého presné zloženie je uvedené v nasledujúcej tabuľke XVH, a toto kultivačné prostredie sa potom inkubuje počas 6 hodín a 30 minút pri pH rovnajúcom sa

7,2 a za miešania, pričom sa udržuje parciálny tlak kyslíka

5,32 kPa regulovaním prítoku vzduchu (až 20 1/min). Potom sa pridá glycerol tak, že sa kontinuálne privádza sterilný roztok obsahujúci 500 g/1 glycerolu v množstve 18 g/h počas 16 až 17 hodín.

V kultivácii sa pokračuje pri rovnakej teplote, hodnote pH a parciálnom tlaku kyslíka až do okamihu, keď je takmer spotrebované všetko množstvo glycerolu. Sledovanie DO (vlnová dĺžka 600 nm) kultivačnej suspenzie po ukončení pridávania glycerolu ukazuje stacionárny stav alebo miernu lýziu až do prerušenia kultivácie po 28 až 30 hodinovom zotrvaní vo fermentore.

Kultivačná masa sa potom ochladí na teplotu 25 °C a potom sa prefiltruje cez membránu s veľkosťou pórov 0,22 pm. Týmto spôsobom sa získa asi 12 litrov filtrátu obsahujúceho N-acetylheparosan, ktorý má prevažne vysokú molekulovú hmotnosť.

Tabuľka XVII - Zloženie a príprava kultivačného prostredia C a D

Kultivačné prostredie C

V 900 ml ultračistej vody sa rozpustí v nasledujúcom

poradí:
NTA (kyselina nitrilotrioctová)	1000 mg
K₂HPO₄	700 mg
kyselina glutámová	11 000 mg
MgCl₂.6H₂O	500 mg
K₂SO₄	450 mg
FeSO₄.7H₂O	18 mg
CaCl₂.2H₂O	2 mg
NaCl	500 mg
KC1	5000 mg
roztok oligo-prvkov (pozri tabuľka Π, pr. 1) 1 ml
glycerol	10 000 mg.

Hodnota pH získanej zmesi sa nastaví na 7,2 koncentrovaným roztokom hydroxidu draselného (hustota 1,38), zmes sa doplní na objem 1000 ml ultračistou vodou a sterilizačne sa prefiltruje cez membránu s veľkosťou pórov 0,2 pm.

Roztok glycerolu g glycerolu sa rozpustí v adekvátnom množstve ultračistej vody, načo sa objem získaného roztoku nastaví rovnakým rozpúšťadlom na 1000 ml. Roztok sa sterilizačne prefiltruje cez membránu s veľkosťou pórov 0,2 pm. Prísadou proti tvorbe peny, ktorá bola použitá v priebehu fermentácie, je Strktol J 673 (komerčne dostupná vo firme Achill a Seilacher).

Kultivačné prostredie D

Príprava kultivačného prostredie D je rovnaká ako príprava kultivačného prostredia C stým rozdielom, že je vhodné po pridaní prísady proti tvorbe peny navyše pridať ešte pufer (pH 7,2) tvorený kyselinou 3-morfolinopropánsulfónovou.

2. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne vysokú molekulovú hmotnosť

N-Acetylheparosan majúci prevažne vysokú molekulovú hmotnosť bol izolovaný a vyčistený postupom opísaným v príklade 2/2, Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť, stupeň astupeň íl.

3. Charakterizácia získaného N-acetylheparosanu Stanovenie rozdelenia molekulových hmotností exklúznou chromatografiou

SK 280642 Β6

Vzhľadom na súčasne používané etanoly bolo stanovenie rozdelenia molekulových hmotností uskutočnené aproximatívne.

Získaný N-acetyľheparosan je tvorený reťazcami s molekulovou hmotnosťou medzi 20 000 a 50 0000 Da, pričom stredná molekulová hmotnosť sa nachádza v oblasti 100 000 až 200 000 Da.

Stanovenie uránových kyselín

Obsah kyseliny uránovej vyčisteného produktu získaného na výstupe z finálneho stupňaje 2,2 pmol/mg.

Spektrofotometria v ultrafialovej a viditeľnej oblasti svetla

Na základe získaného spektra možno tvrdiť, že táto šarža obsahuje aspoň 0,5 % ADN.

Stanovenie celkového obsahu proteínov

Celkový obsah proteínov v uvedenom produkte je nižší ako 0,5 %.

Stanovenie voľných amínových skupín (NH₂)

Obsah voľných amínových skupín v uvedenom produkte je nižší ako 0,1 pmol/mg.

Preparát B

Príprava N-acetylheparosanu majúceho prevažne vysokú molekulovú hmotnosť (spôsob II)

1. Kultivácia kmene Escherichia coli (K5)

Kultivácia kmeňa Escherichia coli SEBR 3282 bola uskutočnená postupom opísaným v rámci preparátu A. Získa sa asi 12 1 kultivačného prostredia obsahujúceho N-acetylheparosan majúci prevažne vysokú molekulovú hmotnosť.

2. Predbežné čistenie

Postupuje sa rovnako ako v príklade 3/2, Predbežné čistenie/ a v stupni d sa použije patrón s dutými vláknami Amicon so separačným prahom 30 000 Da alebo iný ekvivalentný prostriedok.

3. Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne vysokú molekulovú hmotnosť

Postupuje sa rovnako ako v príklade 3/3, Izolácia a čistenie N-acetylheparosanu majúceho prevažne nízku molekulovú hmotnosť/.

Preparát C

Chemické modifikácie N-acetylheparosanu majúceho prevažne vysokú molekulovú hmotnosť získaného v rámci preparátu A

Ako východiskový produkt pre rôzne chemické modifikácie sa použije N-acetylheparosan označený ako šarža G1 a pripravený spôsobom opísaným v rámci preparátu A.

Obsah uránovej kyseliny v tomto produkte je 2,41 pmol/mg.

Stupeň a - Parciálna deacetylácia

1,9 g šarže G1 sa rozpustí v 38,5 ml 2N roztoku hydroxidu sodného. Roztok sa zahreje na teplotu 50 °C a pri tejto teplote sa nechá reagovať pod atmosférou dusíka počas 8 hodín. Potom sa pH roztoku nastaví na hodnotu 8,25 prídavkom nevyhnutného množstva 2N roztoku kyseliny chlorovodíkovej, načo sa roztok dialyzuje proti ultračistej vode a potom lyotilizuje. Získa sa 1,60 g produktu.

Stupeň N-deacetylácie

Stanovený obsah voľných aminových kyselín (NH₂) ukazuje, že N-acetylheparosan bol N-deacetylovaný z 80 %.

Stupeň b - N-Sulfatácia

1,3 g produktu získaného v predchádzajúcom stupni sa rozpustí v 57 ml ultračistej vody, načo sa do získaného roztoku pridá 1,9 g uhličitanu sodného a 1,9 g komplexu oxidu sírového a trimetylamínu a zmes sa potom zahrieva na teplotu 55 °C počas 20 hodín. Vodivosť roztoku sa potom nastaví na vodivosť 0,5 M roztoku chloridu sodného pridaním nevyhnutného množstva demineralizovanej vody a roztok sa vyzráža pridaním 4 objemov etanolu. Vylúčená zrazenina sa odstredí, opätovne vyberie 0,5 M roztokom chloridu sodného, znovu vyzráža pridaním 4 objemov etanolu a odstredí.

Centrifugačný koláč sa rozpustí v ultračistej vode a získaný roztok sa dialyzuje proti ultračistej vode postupom opísaným v príklade 1 a potom lyotilizuje. Týmto spôsobom sa získa 1,809 g N-sultatovaného heparosanu.

Stupeň c - Tvorba tetrabutylamóniovej soli

800 mg produktu pripraveného v predchádzajúcom stupni sa rozpustí v 100 ml vody. Tento roztok sa zavedie na stĺpec iónomeničovej živice Dowex 50 W 8 a ďalej sa postupuje rovnako ako v príklade 4/1, Chemické modifikácie šarže b, stupeň b/. Po lyofilizácii sa získa asi 1,3 g požadovanej soli.

Stupeň d - O-Sulfatácia

Uvedeným spôsobom získaná soľ sa rozpustí v 80 ml formamidu a do získaného roztoku sa potom pridá 5,6 g komplexu oxidu sírového a pyridinu. Zmes sa nechá reagovať počas 6 hodín pri teplote 30 °C, načo sa do nej pridá 16 ml 2M roztoku chloridu sodného. pH zmesi sa upraví na hodnotu 7 a pridajú sa 2 objemy etanolu. Vylúčená zrazenina sa vyberie 0,5 M roztokom chloridu sodného, opätovne sa vyzráža 2 objemami etanolu, dialyzuje proti ultračistej vode a zahustí v rotačnej odparke Rotavar.

Stupeň e - Gólová filtrácia

Koncentrovaný roztok získaný v predchádzajúcom stupni sa frakcionuje gólovou filtráciou na stĺpci Sephacrylu S 300 HR, pričom sa ako elučný roztok použije 0,5 M roztok chloridu sodného.

Izolujú sa frakcie, ktoré zodpovedajú molekulovým hmotnostiam v rozmedzí od 10 000 do 500 000 Da. Pridajú sa 2 objemy etanolu a uskutoční sa zahustenie. Vodivosť roztoku sa potom nastaví na vodivosť 0,5 M roztoku chloridu sodného pridaním potrebného množstva vody.

Zopakuje sa frakcionácia gólovou filtráciou a zachytávajú sa frakcie obsahujúce Ν,Ο-sulfátovaný heparosan tvorený reťazcami majúcimi stredné molekulové hmotnosti v rozmedzí od 100 Ô00 do 200 000 Da, ako i frakcie obsahujúce Ν,Ο-sulfátovaný heparosan tvorený reťazcami majúcimi stredné molekulové hmotnosti asi 50 000 až asi 12 000 Da.

Ku každej z týchto troch frakcií sa pridá 5 objemov etanolu, podrobí sa dialýze proti ultračistej vode a roztoky získané po dialýze sa lyofílizujú.

Týmto spôsobom sa získajú 3 šarže N,O-sulfátovaného heparosanu:

- šarža G1 je Ν,Ο-sulfátovaným heparosanom tvoreným reťazcami majúcimi strednú molekulovú hmotnosť od 100 000 do 200 000 Da; izoluje sa 0,140 g tejto šarže;

- šarža G2 je Ν,Ο-sulfátovaným heparosanom tvoreným reťazcami majúcimi strednú molekulovú hmotnosť asi 50 000 Da; izoluje sa 0,350 g tohto Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu;

SK 280642 Β6

- šarža G3 je Ν,Ο-sulfátovaným heparosanom tvoreným reťazcami majúcimi strednú molekulovú hmotnosť 12 000 Da; izoluje sa asi 0,100 g tejto poslednej šarže.

Charakteristiky týchto troch šarží Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu opísaných v tomto príklade sú zhrnuté v tabuľke XVHI.

Tabuľka XVIĽ - Charakteristiky Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov zodpovedajúcich šaržiam Gl, G2 a G3

	Obsah kyseliny uránovej (μιηοΐ/mg)	Obsah nh₂(μπιοΐ/mg)	Stupeň deacetylácie (%)	Stupeň sulfatácie (pomer sulfát/ karboxyl)
Šarža Gl	1,48	menší a- ko 0,01	80	2,6
Šarža G2	1,45	menší ako0,01	80	2,6
Šarža G3	1,45	menší a- ko 0,01	80	2,6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Ν,Ο-Sulfátované heparosany tvorené reťazcami alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da, ktoré majú opakovanú disacharidovú štruktúru všeobecného vzorca (I)

E znamená v 0 až 80 % disacharidových j ednotiek uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov acetylovú skupinu a vo zvyšných disacharidových jednotkách sulfátovú skupinu a prípadne atóm vodíka a

G znamená atóm vodíka a sulfátovú skupinu, a farmaceutický prijateľné soli uvedených N,O-sulfátovaných heparosanov.

2. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa nároku 1, v ktorých E znamená acetylovú skupinu a sulfátovú skupinu.

3. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa niektorého z nárokov 1 a 2, ktoré majú stupeň sulfatácie vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl 1,5 až 3,0.

4. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa nároku 1, tvorené reťazcami alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da, ktoré majú opakovanú disacharidovú štruktúru všeobecného vzorca (I)

c:-:₂og coos i-------o z— Aľ’ zz ζυ (0 z \--z ao- OG v ktorom

E znamená v 0 až 80 % disacharidových jednotiek uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov acetylovú skupinu a vo zvyšných disacharidových jednotkách sulfátovú skupinu a prípadne atóm vodíka, a

G znamená atóm vodíka a sulfátovú skupinu, pričom ich stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, sa rovná 1,5 až 3,0 a oba konce, redukčný a neredukčný, reťazcov uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov sú sulfátované alebo nesulfátované urónové jednotky, sulfátovaný alebo nesulfátovaný glukózamín alebo sulfátovaný alebo nesulfátovaný N-acetylglukózamín, a farmaceutický prijateľné soli uvedených Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov.

5. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa niektorého z nárokov 1 až 4, v ktorých je acetylová skupina prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 60 % hmotn.

6. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa niektorého z nárokov 1 až 5, ktoré obsahujú aspoň 90 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou nižšou ako llOOODa.

7. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa nároku 1, ktoré obsahujú menej ako 0,2 pmol/mg aminových skupín (NH₂).

8. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa niektorého z nárokov 1 až 5 tvorené reťazcami so strednou molekulovou hmotnosťou asi 4000 až 7000 Da a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 1,7 až 3.

9. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa nároku 1, tvorené aspoň 70 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 5000 a 7000 Da, a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 1,8 až 2,5, pričom acetylová skupina je prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 20 % hmotn.

10. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa nároku 1 tvorené aspoň 70 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 10 000 a 12 000 Da a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 1,8 až 2,5, pričom acetylová skupina je prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 20 % hmotn.

11. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa nároku 1, tvorené aspoň 70 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 6000 a 8000 Da, a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 2,0 až 2,8, pričom acetylová skupina je prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 60 % hmotn.

12. Ν,Ο-Sulfátované heparosany podľa nároku 1, tvorené aspoň 80 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 2300 a 7200 Da, a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 1,8 až 2,5, pričom acetylová skupina je prítomná v miere menšej alebo rovnajúcej sa 20 % hmotn.

13. Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa nároku 1, tvorené aspoň 80 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 3300 a 7700 Da, a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 1,8 až 2,5, pričom acetylová skupina je prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 20 % hmotn.

14. Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa nároku 1, tvorené aspoň 70 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 6900 a 13 500 Da, a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 1,8 až 2,5, pričom acetylová skupina je prítomná v miere menšej alebo rovnajúcej sa 20 % hmotn.

15. Ν,Ο-sulfátované heparosany podľa nároku 1, tvorené aspoň 80 % hmotn. hmotnosti reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 4000 a 10 300 Da, a ktoré majú stupeň sulfatácie, vyjadrený ako pomer sulfát/karboxyl, rovnajúci sa 2,0 až 2,8, pričom acetylová skupina je prítomná v miere nižšej alebo rovnajúcej sa 60 % hmotn.

16. KompozíciaΝ,Ο-sulfátovanéhoheparosanu, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň 70 % hmotn. hmotnosti Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu podľa niektorého z nárokov 1 až 15.

17. Spôsob prípravy Ν,Ο-sulfátovaných heparosanov podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje sled nasledujúcich stupňov:

- stupeň a: kultivácia kmeňa Escherichia coli (K5),

SK 280642 Β6

- stupeň b: izolácia a čistenie, ktorému prípadne predchádza predbežné čistenie vytvoreného N-acetylheparosanu s cieľom získať kompozíciu obsahujúcu 70 až 100 % hmotn. N-acetylheparosanu tvoreného reťazcami alebo zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da, ktoré majú opakovanú disachaiidovú štruktúru vzorca (Ľ):

NHCOCHj Or:

- stupeň c: parciálnou deacetyláciou tejto kompozície N-acetylheparosanu s cieľom získať kompozíciu obsahujúcu 70 až 100 % hmotn. heparosanu tvoreného reťazcami alebo zmesou s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15000 Da, ktoré majú opakovanú disachaiidovú štruktúru vzorca (ΠΙ)

CH₂0H COOH

.....

NHS' ^0H v ktorom R' znamená v 0 až 80 % hmotn. disacharidových jednotiek acetylovú skupinu a vo zvyšných disacharidových jednotkách atóm vodíka,

- stupeň d: - buď parciálna Ν,Ο-sulfatácia tejto heparosanovej kompozície,

- alebo parciálna sulfatácia tejto heparosanovej kompozície nasledovaná stupňom celkovej N-sulfatácie,

- alebo celková N-sulfatácia alebo parciálna N-sulfatácia nasledovaná stupňom celkovej alebo parciálnej O-sulfatácie, a zahrnuje prípadne jeden alebo niekoľko stupňov frakcionácie molekulových hmotností uskutočneného, prípadne uskutočnených po ukončení stupňov a, b, c alebo d.

18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že kmeňom Escherichia coli (K5) je kmeň SEBR 3282 uložený v CNCM Pasteurovho ústavu v Paríži pod číslom 1-1013 alebo jeho spontánny alebo indukovaný mutant.

19. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že v kultivácii kmeňa Escherichia coli sa pokračuje ešte aspoň dve hodiny po zastavení rastu biomasy.

20. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že izolácia a čistenie N-acetylheparosanu zahrnujú aspoň jeden stupeň zrážania alkoholom a aspoň jeden stupeň iónomeničovej chromatografie.

21. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že izolácia a čistenie N-acetylheparosanu sa uskutočňuje spôsobom, ktorý zahrnuje sled nasledujúcich stupňov:

- stupeň af zrážanie etanolom, stupeň b,: dialýza,

- stupeň cf zrážanie etanolom, potom dehydratácia a vysušenie,

- stupeň df čistenie aniónomeničovou chromatografiou,

- stupeň e,: zrážanie eluátu získaného v stupni di etanolom, dehydratácia, sušenie a drvenie, pričom stupne a] alebo Cj môžu byť vypustené.

22. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že izolácia a čistenie N-acetylheparosanu sa uskutočňuje spôsobom, ktorý zahrnuje sled nasledujúcich stupňov:

- stupeň a'_L: dialýza,

- stupeň b j: čistenie v kyslom prostredí, odstránenie nerozpustných nečistôt vo vodných roztokoch s pH 3,5 a pH

1,8,

- stupeň c'i: zrážanie etanolom, potom dehydratácia a sušenie,

- stupeň ďf alkalická hydrolýza a dialýza,

- stupeň ej: čistenie aniónomeničovou chromatografiou,

- stupeň f μ čistenie exklúznou chromatografiou.

23. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že sa N-acetylheparosan získaný kultiváciou kmeňa Escherichia coli (K5) ešte pred izoláciou a čistením podrobí predbežnému čisteniu, ktoré sa uskutočňuje spôsobom, ktorý zahrnuje sled nasledujúcich stupňov:

- stupeň a p odstredenie suspenzie získanej po ukončení kultivácie,

- stupeň bμ uvedenie do styku supernatantu s alkalickým roztokom,

- stupeň c_t: predbežná filtrácia,

- stupeň d f koncentrácia na membráne so stanoveným separačným prahom,

- stupeň ei: dialýza, pričom stupeň ei môže byť vypustený.

24. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že po stupni parciálnej Ν,Ο-sulfatácie sa uskutoční celková N-sulťatácia pôsobením komplexu oxidu sírového a organická báza vo vodnom rozpúšťadle s alkalickou hodnotou pH.

25. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že po stupni N-sulfatácie sa uskutoční frakcionácia molekulových hmotností.

26. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že ako účinnú látku obsahuje N,O-sulfátovaný heparosan podľa niektorého z nárokov 1 až 15 v spojení alebo v zmesi s farmaceutický prijateľnou inertnou pomocnou látkou.

27. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že ako účinnú látku obsahuje kompozíciu Ν,Ο-sulfátovaného heparosanu podľa nároku 16 v spojení alebo v zmesi s farmaceutický prijateľnou inertnou pomocnou látkou.

28. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26 alebo 27 použiteľná na reguláciu krvnej koagulácie.

29. Kmeň Escherichia coli (K5) SEBR 3282 uložený v CNCM Pasteurovho ústavu v Paríži pod číslom 1-1013.

30. N-Acetylheparosany tvorené zmesou reťazcov s molekulovou hmotnosťou medzi 1500 a 15 000 Da, ktoré majú opakovanú disacharidovú štruktúru vzorca (II) pričom oba konce, redukčný i neredukčný, uvedeného N-acetylheparosanu sú urónové jednotky alebo N-acetylglukózamín.

31. N-Acetylheparosan podľa nároku 30, v ktorom vo väčšine reťazcov je neredukčný koniec uránovou jednotkou vzorca (a):

cook