JP5830464B2 - Ｋ５ヘパロサン発酵および精製 - Google Patents

Description

関連出願との相互参照
本出願は、2009年9月1日に出願された米国特許仮出願第61/275,675号(その全体が参照により本明細書に組入れられるものとする)に対する優先権を主張する。

政府の許諾権
本発明は、米国立衛生研究所(National Institutes of Health)により与えられた認可番号GM38060およびHL096972の下で米国連邦政府の支援と共に為された。米国連邦政府は本発明において特定の権利を有する。

本発明は、K5ヘパロサン発酵および精製に関する。

ヘパリンおよび硫酸ヘパランは、血液抗凝固、ウイルスおよび細菌感染、血管形成、炎症、癌ならびに発生に関与する生物学的に重要な分子である(Linhardt (2003) “Heparin: structure and activity,” J Med Chem, 46: 2551-2554；Linhardt RJ, Toida T. (2004) “Role of glycosaminoglycans in cellular communication,” Acc Chem Res, 37: 431-438)。ヘパリンには、手術、心肺酸素供給および腎臓透析、深部静脈血栓症および急性冠不全症候群の治療などの幅広い適用がある(Linhardt “Heparin: an important drug enters its seventh decade.” Chem. Ind. 2, 45-50 (1991); Agnelliら、“Enoxaparin plus compression stockings compared with compression stockings alone in the prevention of venous thromboembolism after elective neurosurgery” N Engl J Med 339 (2), 80-5 (1998))。ヘパリンはまた、血管ならびに試験管およびレンタル透析装置などの医療機器の表面上にコーティングされており、抗凝固表面を形成する。

ヘパリンは現在、約100メートルトン／年の量で動物組織から調製されているが、そのようなヘパリンは他の生物学的製剤で汚染され得る(Linhardt Chem. Ind. 2, 45-50 (1991))。過硫酸化硫酸コンドロイチンで汚染されたヘパリンにより、2008年にはおよそ100人の米国人が死亡した(Guerriniら、“Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events.” Nature Biotechnology 26, 669-675 (2008))。

天然の真核生物のヘパリン生合成前駆体であるヘパロサンは、図1に示される反復二糖単位[→4)β-D-グルクロン酸(GlcA)(1→4)N-アセチル-α-D-グルコサミン(GlcNAc)(1→)]_nを有する多糖類である。

ヘパロサンはまた、大腸菌(Escherichia coli)K5およびパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)などの細菌中で多糖類莢膜として生合成される(Lindahl Uら(1998) “Regulated diversity of heparan sulfate” J Biol Chem 273(39):24979-24982)。K5ヘパロサン合成の開始は、伝えられるところによれば、2-ケト-3-デオキシオクツロソン酸を含む(Finke Aら(1991) “Biosynthesis of the Escherichia coli K5 polysaccharide, a representative of group II capsular polysaccharides: polymerization in vitro and characterization of the product” J Bacteriol 173(13):4088-94)。次いで、K5ヘパロサンは、成長している多糖類鎖の非還元末端にGlcNAcおよびGlcAを付加するグリコトランスフェラーゼKfiAおよびKfiCの交互作用により伸長される(Hodson N et al. (2000) “Identification that KfiA, a protein essential for the biosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide, is an alpha -UDP-GlcNAc glycosyltransferase. The formation of a membrane-associated K5 biosynthetic complex requires KfiA, KfiB, and KfiC.” J Biol Chem 275(35):27311-5)。一度合成されたら、ヘパロサン鎖は、6種のタンパク質：KpsC、KpsD、KpsE、KpsM、KpsSおよびKpsTからなる経路を介して細胞表面上に輸送される(McNulty C et al (2006) “The cell surface expression of group 2 capsular polysaccharides in Escherichia coli: the role of KpsD, RhsA and a multi-protein complex at the pole of the cell” Mol Microbiol 59(3):907-22)。K5ヘパロサン鎖は、多糖類の還元末端での脂質置換を介して、細胞表面上で大腸菌の外膜中のホスファチジン酸分子に固定されると考えられる(Jann B, Jann K. (1990) “Structure and biosynthesis of the capsular antigens of Escherichia coli” Curr Top Microbiol Immunol 150:19-42)。ヘパロサン多糖類の一部を、β脱離機構を介してヘパロサン鎖を切断するバクテリオファージを起源とする酵素であるK5ヘパロサンリアーゼの作用を介して大腸菌K5から除去することができる(Manzoni Mら(1996) “Production of K5 polysaccharides of different molecular weight by Escherichia coli” Journal of Bioactive and Compatible Polymers 11(4):301-311；Manzoni Mら(2000) “Influence of the culture conditions on extracellular lyase activity related to K5 polysaccharide.” Biotechnology Letters 22(1):81-85)。K5リアーゼをコードする遺伝子を大腸菌K5のDNAに組込み、その発現は誘導性であってよい(Manzoni Mら(2000). Biotechnology Letters 22(1):81-85)。K5リアーゼの活性は、培養培地中に放出されるヘパロサンの量ならびに細胞に結合したヘパロサンと放出されるヘパロサンの両方の構造および分子量特性に影響し得る(図1B)。K5ヘパロサンは、M_w 20,000を有すると見積もられており、M_w 16,000と1,500を有する2つの主要なサブ成分から構成される。2つのサブ成分の比率は、全体のM_wに対応し、K5リアーゼの活性により影響される(Vann WFら(1981) “The structure of the capsular Polysaccharide (K5 Antigen) of Urinary-Tract-Infective Escherichia-Coli 010-K5-H4 - a Polymer Similar to Desulfo-Heparin” European Journal of Biochemistry 116(2):359-364; Manzoni (2000) Biotechnology Letters 22(1):81-85)。

実験室規模の研究により、大腸菌K5株から得られる、10,000を超える重量平均分子量(M_w)を有するヘパロサンを、ヘパリンに類似する抗凝固多糖類に酵素的に変換することができることが示された(Lindahlら(2005) “Generation of “Neoheparin” from E coli K5 capsular polysaccharide” J Med Chem 48(2):349-352; Zhangら(2008) “Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors” Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007)。また、ヘパロサンを様々な用途において用いることもできる(WO 2009/014559)。

本発明は、ヘパロサンの工業生産に適した高収率のヘパロサンと高純度のヘパロサンの効率的回収を含む大腸菌K5の発酵プロセスを記載する。

本発明は、大腸菌K5の発酵によるヘパロサンの生産、K5多糖類の単離、および精製のための改良された方法に関する。

一実施形態においては、前記方法は、(a)主要炭素源としてグルコースを含む規定の培地中で大腸菌K5を培養すること；(b)ヘパロサンを固相に結合させた後、溶出させること；および(c)溶出液からヘパロサンを沈降(沈殿)させることを含む。前記方法は、少なくとも90％純粋である、実質的に純粋なヘパロサンの生産にとって好適である。

関連する実施形態においては、前記方法は、2段階の培養、すなわち、バッチ式増殖段階およびフェドバッチ式増殖段階を含み、(a)バッチ式増殖段階において用いられる培地が、(1リットルあたり)約20 gのグルコース、10〜300 mgのチアミン、約13.5 gのKH₂PO₄；約4.0 gの(NH₄)₂HPO₄、約1.4 gのMgSO₄・7H₂O、約1.7 gのクエン酸、および約10.0 mLの微量金属溶液(1リットルあたり)を含み；微量金属溶液が(1リットルの5M HClあたり)10.0 gのFeSO₄・7H₂O、2.0 gのCaCl₂、2.2 gのZnSO₄・7H₂O、0.5 gのMnSO₄・4H₂O、1.0 gのCuSO₄・5H₂O、0.1 gの(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、および0.02 gのNa₂B₄O₇・10H₂Oから本質的になり、ならびに(b)フェドバッチ式増殖段階において用いられる供給溶液が(1リットルあたり)250〜1000 gのグルコース、約20 gのMgSO₄・7H₂Oおよび0.15〜0.5 gのチアミン、ならびに必要に応じて約47 gのKH₂PO₄からなる。

関連する実施形態においては、分散空気により酸素を提供する。空気に酸素を補給してもよい。好ましくは、溶存酸素を約20％に維持する。いくつかの実施形態においては、純粋な酸素を用いる。

さらに関連する実施形態においては、前記条件は約37℃に維持された温度を含み、pHを約7に維持する。アンモニア溶液、またはアンモニアガスの添加により、pHを維持してもよい。いくつかの実施形態においては、アンモニア溶液は約25〜35％、例えば、29％などの約30％である。

特定の実施形態においては、フェドバッチ式段階において用いられる供給培地を、式：

(式中、MSは炭素源の質量流量(g/h)であり；Fは供給流速(L/h)であり；S_Fは供給物中の炭素基質濃度(g/L)であり；Xは細胞濃度(g/L dcw)であり；mは比維持係数(g/g dcw/h)であり；Vは培養容量(L)であり；t₀は供給開始時間であり；tはプロセス時間であり；μは比増殖速度(h^-1)であり；およびY_X/Sは炭素基質上での細胞収量(g/g)である)
により決定される速度で供給する。

前記方法はまた、培養培地からのヘパロサンの結合および溶出を包含する。一実施形態においては、ヘパロサンを無細胞上清から取得する。別の実施形態においては、攪拌しながら、SDS(例えば、1％SDS)などの界面活性剤(洗剤)溶液を用いて洗浄することにより、ヘパロサンを細胞から取得する。

細胞の除去後、結合および溶出は、陰イオン交換樹脂と培養上清との混合および上清の除去、pH 4の酢酸ナトリウムバッファー中の50 mM塩化ナトリウムを用いる前記樹脂の洗浄、pH 4の酢酸ナトリウムバッファー中の1M塩化ナトリウムを用いる溶出を含んでもよい。

あるいは、結合および溶出を、キトサンを用いて達成することもできる。一実施形態においては、培養上清をキトサン溶液と混合して、沈降(沈殿)させる。沈降物(沈殿物)を単離し、水または他の希釈バッファーなどで洗浄し、約1MのNaOHなどの強塩基で溶出させる。キトサンを用いる結合および溶出を、陰イオン交換に加えて実施してもよい。

結合および溶出の後、ヘパロサンを、エタノールまたはメタノールなどを用いて溶出液から沈降(沈殿)させる。一実施形態においては、3倍量のエタノールを用いる。典型的には、得られる沈降物を洗浄し、乾燥させる。

前記方法はまた、過酸化水素などを用いる酸化によるものなどの任意的な発熱物質除去工程も包含する。

本発明の方法は、少ない培養容量、短時間で、少量の夾雑物を含む高純度で高収量(高収率）のヘパロサンを得る。かくして、本発明は、ヘパロサンの工業生産にとって好適である。ヘパロサンの収率を、出発培養物の増殖を含まず、60時間未満、48時間未満、および40時間未満の発酵において得ることができる。他の実施形態においては、初期培養容量は、バッチ段階で3Lであり、フェド段階で7L、および同様の比率で行う。従って、関連する実施形態においては、培養物は少なくとも10 g/L、少なくとも11 g/L、少なくとも12 g/L、少なくとも13 g/L、少なくとも14 g/L、および少なくとも15 g/Lのヘパロサンを産生する。実質的に純粋なヘパロサンは、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％純粋である。関連する実施形態においては、ヘパロサンは1％未満のDNAと2％未満のタンパク質である。ヘパロサンは、ヘパリンへの加工にとって好適である。一実施形態においては、ヘパロサンは、少なくとも10、20、30、40、50、または60 kDa、例えば、約58 kDaの数平均分子量；少なくとも20、30、40、50、60、70、80または90 kDa、例えば、約84 kDaの重量平均分子量、および2.0未満、例えば、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、または1.3未満、例えば、約1.4の多分散性指数(PDI)を有する。

さらなる実施形態においては、本発明は、医療機器のコーティングなどの医薬調製物における上記方法により製造されたヘパロサンの使用を含む。関連する実施形態においては、ヘパロサンをヘパリンの製造のために用いる。関連して、本発明は、医薬の製造のための前記方法により製造されたヘパロサンまたはヘパリンの使用方法である。

さらなる実施形態においては、本発明は、少なくとも90％、少なくとも95％以上の純度を有するヘパロサンなどの前記方法により製造されたヘパロサンである。関連する実施形態においては、本発明は、前記ヘパロサンから製造されたヘパリンである。

ヘパロサンの構造である。(A)ヘパロサンの反復二糖単位。(B)ヘパロサンK5リアーゼの作用から得られるヘパロサン鎖の構造。 振とうフラスコ培養中で調製されたヘパロサンの¹H-NMRスペクトル(600 MHz)である。(A)1. LB培地、2. 3,000を超えるMW_Avgを有するLB培地、3. 3,000未満のMW_Avgを有するLB培地から回収されたヘパロサンのスタックプロットと、サンプル1、2および3のPAGE分析を示す差込み図。(B)M9培地から回収されたヘパロサン。(C)グリセロール規定培地から回収されたヘパロサン。(D)グルコース規定培地から回収されたヘパロサン。 7Lの発酵器中でのヘパロサンの産生を示す。パネルAは、発酵時間(h)の関数としてのグルコース供給曲線(黒色)、pH曲線(青色)および溶存酸素(％DO)曲線(赤色)を示す。パネルBは、発酵時間(h)の関数としての細胞増殖曲線(総DCW g、▲)およびヘパロサン産生(g、■)を示す。 7Lの発酵の上清から精製されたヘパロサンの特性評価を示す。(A)ヘパロサンの¹H-NMR(600 MHz)。(B)¹³Cグルコースおよび¹⁵N硫酸アンモニアを含有するM9培地上で調製されたヘパロサンの¹³C-NMR。(C)分取PAGE(Lyら、2010)により精製された平均分子量4551.81のヘパロサン鎖(重合度＝24)のFT-MS。 アルシアンブルー染色を用いるヘパロサンのMW分析に用いられたPAGEを示す。(A)勾配ゲルの範囲に広がる分子標準を示す。レーンは、1. HA分子マーカー(30 kD〜310 kD)、2. ヘパロサン分子マーカー(6.4 kD〜14.1 kD)を含む。(B)異なる培地中、振とうフラスコ中で調製されたヘパロサンを示す。レーンは、1. M9培地に由来するヘパロサン、2. グリセロール合成培地に由来するヘパロサン、3. グルコース合成培地に由来するヘパロサン、および4. LB培地に由来するヘパロサンを含む。(C)様々な時間にサンプリングされた7L発酵器中で調製されたヘパロサンを示す。レーンは、1〜6. 発酵の開始後、4.5時間、12.6時間、14.5時間、20時間、32.9時間および37.6時間で発酵器からサンプリングされたヘパロサンを含む。 7L発酵器中で産生されたヘパロサンの分子量特性の経時変化を示す。M_N(■)、M_W(黒塗り丸)およびPDI(◆)の傾向を示す。 20 L発酵器中での発酵時間(h)の関数としてのpH曲線(■)および溶存酸素(％DO)曲線(◆)を示す。 20 L発酵器中での時間経過に対する細胞増殖曲線(DCW g/L、(■))および発酵上清中のヘパロサン濃度(g/L、(◆))を示す。 精製されたヘパロサンサンプルの¹H-NMRスペクトルを示す。 1 mg/mlの純粋なヘパロサン溶液10 mlからの様々な量のキトサンを用いる沈降後の上清中のヘパロサン濃度を示す。 1 mg/mlの純粋なヘパロサン溶液10 mlからの様々な量のキトサンを用いた回収率(％)を示す。 5倍希釈された発酵培地サンプル10 mlからの様々な量のキトサンを用いた回収率(％)を示す。

定義
ヘパロサンは、反復二糖単位[GlcAα-(1-4)GlcNAcR(1-4)]_nを有する多糖類である。K5菌体外多糖は、本発明者らが単離および精製するヘパロサンから作られるため、特定の背景における「ヘパロサン」は、培養培地中、ならびに単離および精製の間に存在する細菌と結合したヘパロサンを指してもよい。当業者であれば、ヘパロサンの意味を、関連する文脈で理解できるであろう。

大腸菌K5は、K5菌体外多糖を産生する大腸菌の変異体を記載する。大腸菌株ATCC23506などの、好適な大腸菌K5株を、ATCC(American Type Culture Collection, USA)などの公共収集物から取得することができる。また、大腸菌K5株を臨床起源から単離し、および／または遺伝的に改変することもできる。

本明細書で用いられる「発酵」とは、細菌増殖および菌体外多糖、特に、K5菌体外多糖の産生を指す。

本明細書で用いられる「単離された」とは、ヘパロサンが培養培地および細菌細胞から分離され、その同定または使用を可能にするのに十分な量で存在することを意味する。

本明細書で用いられる「実質的に純粋な」とは、ヘパロサンがその意図される使用にとって実用的かつ好適な程度まで他の物質を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なヘパロサンは少なくとも90％純粋である。好ましくは、この材料は91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、またはさらには99％より高く夾雑物を含まない。純度を当業界で公知の手段により評価することができる。

本明細書で用いられる「a」または「an」とは、1のみを意味すると具体的に指摘されない限り、1以上を意味する。

用語「約」は、「約」が記述された用語を修正する文脈で当業者により理解されるように用いられる。数値について、「約」は記述される値の周辺の10％の変動を包含すると考えられる。

ヘパロサンの生産のための大腸菌K5の発酵
発酵のための好適な条件の同定においては、多くの因子を考慮しなければならない。

大腸菌は、一般的には、様々な培地およびpH範囲、温度、O₂および他の条件で増殖することができる。しかしながら、実験室に適合された株と違って、大腸菌K5は遺伝学、増殖、および機能に関する広範囲に及ぶ研究にかけられていない。

増殖条件の変化は、(a)細菌増殖の速度、(b)最大細胞密度、(c)K5菌体外多糖莢膜の産生、(d)大腸菌K5、大腸菌K5内に常在するバクテリオファージ、および他の因子によるK5莢膜の改変の程度、(e)K5菌体外多糖莢膜の培地中への放出、(f)産生されるヘパロサン多糖がヘパリンへの加工にとって好適なサイズ範囲のものであるかどうか、ならびに(g)夾雑物の量および型に影響し得る。例えば、細胞溶解を促進する条件は、培養上清中のK5菌体外多糖の収量を増加させ得るが、上清中のK5菌体外多糖莢膜の分解ならびに夾雑物の数および量も増加させ得る。

いずれか1つの夾雑物の重要性は、それをその後の精製および加工工程によって除去することができる容易性、夾雑物がヘパロサンからヘパリンへのその後の加工を阻害するかどうか、ならびに夾雑物がヒトまたは動物に対して危険をもたらすかどうかに関連する。大腸菌K5は既知の病原体であり、かくして毒素および他のビルレンス関連因子を除去しなければならない。リポ多糖(LPS)はグラム陰性細菌抽出物の一般的な夾雑物であり、強力な免疫刺激剤および毒素であることが知られている。核酸もまた免疫刺激性であり得る。LPSも核酸も多糖コアを有し、従ってヘパロサンと共に同時に精製され得る。他の夾雑物は非ヘパロサン多糖またはヘパロサンの誘導体を含み得る。

医薬品および医療用品の製造のためには、増殖培地の起源および性質が重要となり得る。例えば、動物または植物タンパク質の加水分解により得られる複合培地は、大腸菌K5の増殖および産生にとって優れているが、バッチ間で変動を示し、抗原性夾雑物および他の夾雑物を含み得る。

発酵の培養容量、時間、および温度などの工業規模でのヘパロサンの製造のためには、さらなる因子を考慮する必要がある。従って、より少量の培地、およびより速い増殖条件が望ましい。また、広く入手可能であり、標準化されており、安価な出発材料を用いる増殖培地の同定も関連する。

また、増殖条件が拡張性であることも証明しなければならない。かくして、5 ml培養物中での最適条件の同定は、より大きい規模、例えば、5 L、20 L、100 L以上で証明しなければならない。それと関連して、前記プロセスは強固かつ再現性のあるものであるべきであり、従って、条件の小さい変化の影響を受けやすいものではないべきである。

前記の観点から、ヘパロサンの工業生産にとって好適な条件の同定は、自明ではない。本発明者らは、工業生産に適用可能であるヘパロサンの製造、単離および精製を容易にする大腸菌K5のための好適な増殖および培養条件を同定した。

前記培地は、炭素源としてのグルコースを含む規定培地であり、増殖段階に応じて変化する。バッチ式増殖のための培地の組成は、1リットルあたり以下の通りである：約20 gのグルコース、10〜300 mgのチアミン、約13.5 gのKH₂PO₄；約4.0 gの(NH₄)₂HPO₄、約1.4 gのMgSO₄・7H₂O、約1.7 gのクエン酸、および約10.0 mLの微量金属溶液。微量金属溶液は、(1Lの5M HClあたり)10.0 gのFeSO₄・7H₂O、2.0 gのCaCl₂、2.2 gのZnSO₄・7H₂O、0.5 gのMnSO₄・4H₂O、1.0 gのCuSO₄・5H₂O、0.1 gの(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、および0.02 gのNa₂B₄O₇・10H₂Oからなっていた。フェドバッチ式培養中の供給溶液は、(1Lあたり)250〜1000 gのグルコース、20 gのMgSO₄・7H₂Oおよび0.15〜0.5 gのチアミンからなっていたが、これに47 gのKH₂PO₄をさらに補給してもよい。いくつかの実施形態においては、供給溶液は700 gのグルコース、20 gのMgSO₄・7H₂Oおよび0.2 gのチアミンであった。別の実施形態においては、供給溶液は700 gのグルコース、20 gのMgSO₄・7H₂O、47 gのKH₂PO₄および0.4 gのチアミンであった。

円錐フラスコ中、37℃で一晩、大腸菌K5株を増殖させることにより、種培養物を調製した。次いで、種培養物を発酵器中に接種する。発酵器中での発酵は2つの段階：バッチ増殖段階、および指数的供給戦略とDO-スタット供給戦略の組合せを用いる段階からなる。バッチ増殖段階は、種培養物を発酵器に接種した後に始まる。温度を37℃近辺に保持し、pHが低下するにつれてNH₄OHを添加することにより、pHを6〜8に保持する。

第2の発酵段階は、溶存酸素が鋭い増加を示し、培地中のグルコースが枯渇した後に始まる。一般的には、グルコースの供給速度は下記式：

(式中、Msは炭素源の質量流量(g/h)であり；Fは供給流量(l/h)であり；SFは供給物中の炭素基質濃度(g/l)であり；Xは細胞濃度(g/l dcw)であり；mは比維持係数(g/g dcw/h)であり；Vは培養容量(l)であり；t0は供給開示時間であり；tはプロセス時間であり；μは比増殖速度(l/h)であり；YX/Sは炭素基質上での細胞収量(g/g)である)
に従って算出されるが、ある程度の柔軟性を持ってもよい。

全供給プロセスの間に、μを0.1〜0.4に設定する。

いくつかの実施形態においては、グルコースが過剰供給されておらず、培養培地中の酢酸塩などの毒性基質が低いことを確保するためのチェックポイントとして、供給の間に中断があってもよい。これらのチェックポイントにおいては、培養培地中のグルコースの枯渇を示す溶存酸素濃度の鋭い増加が観察された後に供給を再開する。大規模においては、そのような観察を、プローブを用いて、または発酵の間に自動サンプリングおよび分析を用いて連続的に行う。

典型的には、細胞密度の増加が観察されなくなるまで発酵を継続する。次いで、供給を停止し、発酵器の攪拌装置をさらに30〜60分間放置して、細胞表面からより多くの莢膜K5多糖を培地中へと剥ぎ取る。

発酵培養物からのヘパロサンの精製
1つの例示的な実施形態においては、ヘパロサンの精製は、(a)培養上清または濾液を調製する工程、(b)樹脂などの固相へのヘパロサンの結合、およびそこからのヘパロサンの溶出、(c)アルコールを用いる沈降(沈殿)ならびに(d)発熱物質除去を含んでもよい。追加の結合、沈降および発熱物質除去工程を加えてもよい。

工程(a)においては、培養物を遠心分離または濾過して、細胞ペレットから上清を分離する。ホルマリンまたは他の薬剤を培養物に添加して、細菌細胞を不活化することができる。典型的には、ヘパロサンを上清から回収するが、ドデシル硫酸ナトリウムなどの洗剤などを用いて細胞を洗浄し、機械的に攪拌した後、上清からヘパロサンを沈降させ、抽出することにより回収することもできる。

工程(b)においては、ヘパロサンを、ヘパロサンに選択的に結合する固相に結合させる。例えば、陰イオン交換樹脂などの樹脂を、工程(a)に由来する上清に添加する。混合物を攪拌して、上清中のヘパロサンを樹脂上に結合させる。次いで、混合物を濾過して、溶液から樹脂を分離する。次いで、分離された固体を洗浄して未結合の夾雑物を洗い流し、溶出させる。

陰イオン交換樹脂について、これは、低濃度の塩溶液を用いて未結合の夾雑物を洗い流すこと、および1〜2Mの塩化ナトリウム溶液を用いて溶出することを含むであろう。また、キトサンを用いてヘパロサンを結合させることもできる。キトサンを溶液として添加することもでき、従ってそれは「固相」にはないが、それは沈降し、それによって上清からヘパロサンを運搬する。同様に、ヘパロサンを、固相を含有する好適なカラムを通過させ、洗浄し、および溶出させることができる。

工程(c)においては、工程(b)から得られるヘパロサン溶出液を、1〜5容量部のエタノールまたはメタノールを添加することなどにより沈降させる。この工程は、ヘパロサンを濃縮するだけでなく、夾雑物を選択的に除去する。次いで、沈降物を遠心分離により分離し、50〜80％のアルコールで洗浄する。

工程(d)においては、沈降物を水に溶解し、発熱物質除去工程に供し、残存するリポ多糖および他の夾雑物を不活化する。典型的には、これを過酸化水素などの酸化剤を用いて実施するが、他の過酸化物または漂白剤が公知である。得られるヘパロサンを上記のように再度沈降させ、乾燥させる。

分析
得られるヘパロサンを分析して、収率、純度およびさらなる加工のための好適性を決定する。いくつかの分析ツールを用いることができる。

ヘパロサンの部分的消化の後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-電子スプレーイオン化(ESI)-質量分析(MS)を用いて、二糖組成を分析することができる(Bhattacharyya Sら(2010) “Cell-bound IL-8 increases in bronchial epithelial cells after arylsulfatase B silencing due to sequestration with chondroitin-4-sulfate,” Am J Respir Cell and Molec Biol 42, 51-61)。¹H-NMRおよび¹³C-NMRを未消化のヘパロサンに対して用いることもできるが、これはヘパロサンの濃度および純度を決定するのに好適である(Wang Z, Zhang Z, McCallum SA, Linhardt RJ. 2009. Nuclear magnetic resonance quantification for monitoring heparosan K5 capsular polysaccharide production. Anal Biochem. 398(2):275-7)。また、ヘパロサンを、Bitter T, Muir HM. (1962) “A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction.” Analytical Biochemistry 4(4):330により報告されたようなカルバゾール分析を用いて決定することもできる。

UV吸収によりDNA含量を決定することができる。製造業者の説明書に従ってMicro BCA Protein Assay Kitなどのよく知られたキットを用いて、タンパク質含量を決定することができる。

精製されたヘパロサンの分子量プロフィールを、ヘパロサンまたはヒアルロン酸の既知の分子量のラダーとの比較により決定し、これを用いて分子量平均、数、および分布を算出する。

発熱物質含量を、カブトガニアメーバ細胞(limulus amoebocyte)溶解物(LAL)アッセイを用いて決定することができる。

(実施例)
本発明を、以下の実施例を参照することによりさらに理解することができるが、これは本発明の特定の実施形態を例示するために提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明の精神を逸脱することなく変更を行うことができることを理解するであろう。

材料
Applikon社(Schiedam, Netherlands)製の7Lガラスオートクレーブ可能バイオリアクターを発酵器として用いた。BioXpert V1.5ソフトウェアを用いて、発酵器の運転を制御し、データを収集した。Difco(商標)LBブロス粉末を、BD社(Franklin Lakes, NJ)から購入した。合成培地を調製するのに用いた化合物の多くは、Sigma-Aldrich社(St Louis, MO)製であった。消泡剤204はSigma-Aldrich社(St Louis, MO)製であった。バッフル付き(Baffled)振とうフラスコはCorning社(Corning, NY)製であった。GE Healthcare社(Piscataway, NJ)製のDEAE Sepharose Fast Flowを、ヘパロサンの精製に用いた。Vipapure D Mini HスピンカラムはSartorius Stedim Biotech社(Aubagne, France)製であった。Micro BCA Protein Assay KitはThermo Scientific社(Rockford, IL)製であった。二糖分析のためにヘパロサンを消化するのに用いた酵素を、Hanら(2009) “Structural snapshots of heparin depolymerization by heparin lyase I” J Biol Chem 284(49):34019-27に記載のように、本発明者らの実験室で発現させ、精製した。HPLC-MSを、Agilent 1100装置(Santa Clara, California)上で実施した。TLCシリカゲルプレートはEMD社(Gibbstown, NJ)製であった。ヘパロサン分子量ラダーを調製し、ヘパロサンのM_wを決定するための材料は、Ly Mら(2010) “Analysis of E. coli K5 capsular polysaccharide heparosan” Anal Bioanal Chem (DOI: 10.1007/s00216-010-3679-7)に詳細に記載されている。ヒアルロナン分子マーカーのセットであるSelect_HA(商標)LoLadderを、Hyalose社(Oklahoma City, OK)から取得した。

2.8L振とうフラスコ中での大腸菌K5の増殖
American Type Culture Collectionに由来する大腸菌K5(ATCC #23506)を、25％のグリセロールを含む、1 mLのM9、LB、グリセロールおよびグルコース培地中で凍結保存した。25 mLの同じ培地を含有する250 mLの振とうフラスコに、0.5 mLの解凍した大腸菌を接種した。培養物を、M9培地培養物については約1.1 gの乾燥細胞重量(DCW)/L、グリセロール合成培地については5.4 g DCW/L、グルコース合成培地については5.6 g DCW/L、およびLB培地については1.9 g DCW/Lで後期指数増殖期に収穫した。次に、大腸菌K5培養物(300 mL)を、後期指数増殖期に5 vol％細胞を接種した2.8 Lの振とうフラスコ中で増殖させた。増殖が定常期に達した後1〜4時間まで培養物を220 RPMおよび37℃で振とうした後、ヘパロサンの回収のために収穫した。2.8 Lの振とうフラスコ中での発酵において用いられた培地は、1. LB培地: Difco(商標)LBブロス、Lennox, 20 g/L；2. M9培地: 2 g/Lグルコース、0.12 g/L MgSO₄、0.011 g/L CaCl₂、0.337 g/L チアミン-HCl、6 g/L Na₂HPO₄、3g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl；3. グリセロール規定培地: 20 g/Lグリセロール、20 mg/Lチアミン、13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄、1.4 g MgSO₄・7H₂O、1.7 gクエン酸、および10.0 mL微量金属溶液(微量金属溶液は、(1Lの5 M HClあたり) 10.0 g FeSO₄・7H₂O、2.0 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄・7H₂O、0.5 g MnSO₄・4H₂O、1.0 g CuSO₄・5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、および0.02 g Na₂B₄O₇・10H₂Oから成っていた(Wang FL、Lee SY (1998) “High cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli for the production of poly(3-hydroxybutyrate) in a defined medium” Biotechnology and Bioengineering 58(2-3):325-328))；4. グルコース規定培地: 1リットルあたり、20 gグルコース、20 mgチアミン、13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄、1.4 g MgSO₄・7H₂O、1.7 gクエン酸、および10.0 mL微量金属溶液(微量金属溶液は、(1Lの5 M HClあたり) 10.0 g FeSO₄・7H₂O、2.0 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄・7H₂O、0.5 g MnSO₄・4H₂O、1.0 g CuSO₄・5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、および0.02 g Na₂B₄O₇・10H₂Oから成っていた(WangおよびLee(1998)、上掲))を含んでいた。

7Lの発酵器中での大腸菌K5の増殖
この発酵は、バッチ増殖段階とフェドバッチ増殖段階とからなる。発酵におけるバッチ増殖のための培地の組成は、(1リットルあたり) 20 gグルコース、20 mgチアミン、13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄、1.4 g MgSO₄・7H₂O、1.7 gクエン酸、および10.0 mL微量金属溶液であった。微量金属溶液は(1Lの5 M HClあたり) 10.0 g FeSO₄・7H₂O、2.0 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄・7H₂O、0.5 g MnSO₄・4H₂O、1.0 g CuSO₄・5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、および0.02 g Na₂B₄O₇・10H₂Oからなっていた。フェドバッチ段階において用いられる供給溶液は、(1リットルあたり) 700 g グルコース、20 g MgSO₄・7H₂Oおよび0.2 gチアミン(WangおよびLee (1998)、上掲)からなっていた。

バッチ増殖段階は、後期指数増殖期にある振とうフラスコから得られた種培養物(5.6 g/L DCWの300 mL)の接種から始まった。温度を約37℃に維持し、pHを約7に維持した(29％アンモニア溶液を添加することによる)。空気を発酵器中に散布して酸素を供給し、攪拌速度を520 RPMに設定した。

発酵の第2段階は、バッチ増殖培地中のグルコースが枯渇し、溶存酸素が鋭い増加を示した後に始まった。次いで、供給溶液を式1：

(式中、Msは炭素源の質量流量(g/h)であり；Fは供給流量(l/h)であり；S_Fは供給物中の炭素基質濃度(g/L)であり；Xは細胞濃度(g/L dcw)であり；mは比維持係数(g/g dcw/h)であり；Vは培養容量(L)であり；t₀は供給開示時間であり；tはプロセス時間であり；μは比増殖速度(h^-1)であり；およびY_X/Sは炭素基質上での細胞収量(g/g)である)
に従って指数的に供給した(Lee SY. 1996. “High cell-density culture of Escherichia coli”. Trends Biotechnol 14(3):98-105)。この試験では0.10〜0.15 h^-1のμ値を用いて、より高い増殖速度に起因する毒性副産物の蓄積を回避しながら十分な細胞増殖を可能にした。発酵器に結合させた「酸ポンプ」を用いて、実際の酸を添加する代わりにグルコース供給機能を実行し、塩基ポンプを用いて29％アンモニア溶液を添加して、安定なpHを維持し、培養物に窒素源を提供した。気泡形成が、発酵器のデジタル制御ユニットを介してフィードバックループにより制御された設定レベルを超えた場合に、第3のポンプを用いて消泡剤204を培養物に添加した。「酸ポンプ」をオンオフする時間を1分間にプログラムすることにより、グルコース供給速度を達成した。経過した発酵時間の7時間〜24時間にT_on＝0.72^*exp[0.0023^*(t-420)]の式を用いた(ここで、T_onは「酸ポンプ」を1分の間に1秒間オンにした時間である)。一度、酸素の限界が観察された24時間後に、グルコース供給速度を低下させた。29％水酸化アンモニウム溶液を添加する塩基ポンプを用いて、手動でpH制御を達成した。BioXpert V1.5ソフトウェアに書かれた特別注文のプログラムを用いて、pHをより密接に制御した。溶存酸素が20％空気飽和以下に低下した場合、攪拌速度および／または空気流量速度を増加させた。純粋な酸素を空気と混合して、発酵時間の24時間後に十分な溶存酸素を得た。細胞が全てのグルコースを消費すること、および毒性副産物(酢酸塩など)が培地中で構築されないことを確保するために、グルコース供給を定期的に中断した。グルコースの枯渇および毒性副産物の形成を示す溶存酸素の急上昇が観察された後に供給を再開した(Johnston WAら(2003) “Tracking the acetate threshold using DO-transient control during medium and high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli in complex media” Biotechnol Bioeng 84(3):314-23)。サンプルを発酵器から定期的に収集した。取得したサンプルを12,000 x gで30分間遠心分離して、大腸菌細胞から上清を分離した。

発酵上清中のヘパロサン濃度の決定
発酵上清中のヘパロサン濃度を、カルバゾール分析とNMR分析の両方により測定した。ヘパロサンのカルバゾールアッセイにおいては、遠心分離により回収された0.5 mLの発酵上清をMillipore YM-3脱塩スピンカラム(1200 x g)に印加して、塩および小分子を除去した。粗ヘパロサンを含む残渣を回収し、凍結乾燥させた。乾燥された粗ヘパロサンを0.5 mLの蒸留水を用いて再構成させ、カルバゾールアッセイに供した。ヘパロサンの濃度を、純粋なヘパロサンを用いて調製された標準曲線から算出した。NMRアッセイにおいては、培養上清から同様に回収されたヘパロサン(1 mL)を凍結乾燥させた後、71μgのテレフタル酸ナトリウム(内部標準)を含有する400μLのD₂Oに溶解し、次いで600 MHzでの¹H-NMRのためにNMRチューブに移した。ヘパロサンの濃度を、ヘパロサン中のN-アセチル基の総面積と内部標準の総面積との比率から算出した。

分析のための発酵の間のヘパロサンサンプルの迅速な回収
発酵上清からヘパロサンを迅速に回収し、Vipapure D Mini Hスピンカラムを用いて部分的に精製した。遠心分離(12,000 x g)により細胞から回収された上清(1 mL)を、1 mLのバッファーA(50 mM塩化ナトリウム、20 mM酢酸ナトリウム、pH 4)と混合した。次いで、混合物をpH 4に調整し、予め平衡化させたVivapure D Mini Hカラム上に充填した。次いで、カラムをバッファーAで洗浄し、バッファーB(1M塩化ナトリウム、20 mM酢酸ナトリウム、pH 4)で溶出させた。次いで、溶出したサンプルを3倍量のエタノールを用いて、-20℃(防爆冷凍庫中)で一晩静置して沈降させ、得られた沈降物を75％エタノールで洗浄し、水に溶解し、凍結乾燥させた。次いで、回収されたサンプルの純度を¹H-NMRにより試験した。

ヘパロサンの精製
培養物を12,000 x gで30分間遠心分離することにより、振とうフラスコまたは7L発酵器中での発酵の完了時にヘパロサンを回収した。得られた上清を、氷酢酸を添加することによりpH 4に調整した後、フリットディスク(孔径40〜60μm)を備えたPyrex Buchner漏斗を通して濾過した。DEAE-Sepharose高速流動樹脂を、好適なサイズ(20 mg未満のヘパロサン／膨らんだ樹脂1 mL)のカラムに充填した。このカラムを、pH 4の20 mM酢酸ナトリウムバッファー中の50 mM塩化ナトリウムを用いて最初に平衡化させた。次いで、発酵上清をカラム上に充填し、カラムを3倍量のpH 4の20 mM酢酸ナトリウムバッファー中の50 mM塩化ナトリウムで洗浄した。次いで、pH 4の20 mM酢酸ナトリウムバッファー中の1M塩化ナトリウムを用いて、カラムからヘパロサンを溶出させた。カラムから溶出したヘパロサンを、3倍量のエタノールを添加し、この溶液を-20℃で一晩、防爆冷凍庫中で保存することにより沈降させた。12,000 gで30分間遠心分離することにより沈降物を回収した。ペレットを75％エタノールで洗浄し、再度遠心分離し、得られたペレットを保存のために凍結乾燥するか、または漂白工程のために直接用いた。また、0.02％SDSを添加した後、激しく攪拌し、遠心分離し、DEAEクロマトグラフィーに供することにより、細胞ペレットからヘパロサンを精製することもできた。

漂白工程においては、まずはヘパロサンを約15 g/Lの濃度で1M塩化ナトリウム中に溶解した。1M NaOHを用いて溶液のpHを9.5に調整し、過酸化水素(30％)を添加して1.5％の最終濃度を得た。混合物を室温で一晩インキュベートした後、3倍量のエタノールを添加し、-20℃で一晩静置(防爆冷凍庫中)することによりヘパロサンを沈降させた。得られたペレットを75％エタノールで洗浄し、水に溶解し、乾燥させた。

ヘパロサンの二糖分析
ヘパロサン(10 mg/mL)をpH7の200 mMリン酸ナトリウムバッファーに溶解し、30℃で一晩、それぞれ1 mUのヘパリンリアーゼ1、2および3で処理した。得られた二糖生成物を、Agilent Ion捕捉装置上での高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-電子スプレーイオン化(ESI)-質量分析(MS)に供し、二糖組成を決定した。LC-MS分析を、LC-MS系(LC/MSD捕捉MS；Agilent, Santa Clara, CA)上で実施した。高速液体クロマトグラフィーのための溶液AおよびBは、それぞれ、同じ濃度の37.5 mM NH₄HCO₃および11.25 mMトリブチルアミンを含有する15％および65％アセトニトリルであった。溶液Aを20分間、次いで、0〜50％の溶液Bの20〜45分間の線状勾配を用いて、C-18カラム(Agilent)上で分離を実施した。MSによる連続検出のために、カラム流出液は電子スプレーイオン化質量分析(ESI-MS)の供給源に進入した。電子スプレーインターフェースを、400 Vのスキマー電位、240.0 Vのキャピラリー出口、および325℃の熱源を用いる陰イオン化モードに設定して、フルスキャンスペクトル(150〜1,500 Da、10フルスキャン／秒)で最大量のイオンを得た。乾燥ガス(5リットル／分)および噴霧ガス(20 psi)として窒素を用いた(Bhattacharyya S, Am J Respir Cell and Molec Biol 42, 51-61)。

ヘパロサンのNMR分析
Bruker 600 MHz NMR分光計上で¹H-NMRおよび¹³C-NMRを行った。ヘパロサンサンプルを、D₂O中で2 mg/mLの濃度(99.99+アトム％)で調製し、凍結乾燥して交換可能なプロトンを除去し、D₂O中に再溶解し、標準的な5 mmのNMRチューブに移した。スペクトルの獲得を、TOPSPIN 2.0ソフトウェアを用いて実行した。全てのスペクトルを298Kの温度で獲得した。

DNAおよびタンパク質含量アッセイ
最終ヘパロサン産物中のDNA含量を、260 nmおよび320 nmで0.1 mg/mLのヘパロサン溶液のUV吸収を測定することにより決定した。DNA濃度を、濃度(μg/mL)＝(A₂₆₀読み取り-A₃₂₀読み取り)×希釈率×50μg/mLとして算出した。タンパク質含量を、Micro BCA Protein Assay Kitを用いて製造業者の説明書に従ってアッセイした。

ヘパロサンの分子量の分析
既知の分子質量のヘパロサン標準ラダーを、Mini Prep Cell (Biorad, Hercules, CA)装置を用いる連続分取ポリアクリルアミド電気泳動により、漂白されたK5ヘパロサン多糖から調製した(Lyら、2010)。ヘパロサン画分を、フーリエ変換-質量分析(FT-MS)により特性評価し、再混合して、ヘパロサンの分子量特性の決定のための分子量標準ラダーを調製した(Lyら、2010)。N-アセチルヘパロサンと同じ電荷密度を有する線状多糖でもあるヒアルロナン(HA)の分子マーカーを、サンプルの上限のための標準として用いた。

HAおよびヘパロサンの両方の分子マーカーを、様々な培養培地中で、および様々な発酵時点で調製されたヘパロサンの分子量分析のための標準セットとして用いた。寸法0.75 mm x 6.8 cm x 8.6 cmの勾配ポリアクリルアミドゲル(4〜15％)を、ヘパロサン分子量分析において用いた。ヘパロサンサンプル(25μg)をゲル上に載せ、次いで、電気泳動(200Vで20分間)に供し、アルシアンブルーで1時間染色した後、25％エタノール／10％酢酸で脱染色した(Lyら、2010)。ゲルを走査し、これらのデジタル画像をコンピューターソフトウェアUN-SCANITを用いて分析した。移動距離の関数としての画像密度のプロットを獲得した。これらのデータから、ヘパロサンサンプルの分子量特性を、得られた標準曲線から特性評価した。

結果
ヘパロサンの調製のための振とうフラスコ中での大腸菌K5の発酵
定常期に達した後1〜4時間まで、大腸菌K5を振とうフラスコ中で増殖させた。定常期を超えて発酵を延長して、培地中に最大量のヘパロサンを蓄積させたところ、培地中へのヘパロサン出現が細胞増殖を遅延させるという報告と一致していた(Manzoni Mら(1993) Journal of Bioactive and Compatible Polymers 8(3):251-257)。フラスコ培養物に由来するヘパロサンの収量は70〜500 mg/Lの範囲であった。フラスコ培養物から回収されたヘパロサンの純度は、全ての事例において、NMRにより見積もられたように85％を超えていた(Wang Zら(2009) Anal Biochem. 398(2):275-7；Zhang ZQら(2008) “Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors” Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007)。M9培地、グルコース培地およびグリセロール培地などの合成培地から回収されたヘパロサンは、NMRにおいて追加のピークを示したLB培地から回収されたヘパロサンよりも高い純度レベル(95％を超える)を示し、これは約85％の純度と一致していた(図2)。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によるLB培地由来ヘパロサンのさらなる分析により、ヘパロサンと共に同時精製される培地成分に対応する低いM_wバンドが示された。この不純物を、3K分子量カットオフ(MWCO)スピンカラムを用いて除去することができる(図2A)。

ヘパロサンの二糖組成を、ヘパリンリアーゼ1、2および3を用いる完全な消化後にHPLC-MS(示さず)により決定したところ、単一の二糖m/z 378.2の存在が示された。この二糖は、ΔUA(1→4)-α-D-GlcNAc(ヘパロサンの均一な反復構造と一致する)、→4)-β-D-GlcA(1→4)-α-D-GlcNAc(1→に対応する。この構造を確認するために、¹³Cおよび¹⁵N標識されたヘパロサンを、均一に標識された¹³C-グルコースおよび¹⁵N-塩化アンモニウムを含有するM9培地中で大腸菌K5を培養することにより調製した。回収された均一に標識された¹³C-、¹⁵N-ヘパロサンの構造を、ヘパリンリアーゼ1、2、および3を用いる完全な消化、次いでHPLC-MSにより確認したところ、単一の二糖m/z 392.9が示された。m/z 378.2と392.9の間の15 amuの差異は、ヘパロサンの完全な¹³Cおよび¹⁵Nアイソトープ富化と一致し、ヘパロサン反復構造を確認するものである。

7L発酵器中での大腸菌K5の発酵
大腸菌の指数的増殖についていくために、供給速度を指数的に増加させた。供給段階中に数回の中断を行って、酢酸塩の蓄積をもたらし、大腸菌の増殖を阻害し得る培地中でのグルコースの構築がないことを確保した。グルコースの枯渇を確認する溶存酸素の増加が観察された後にのみ、供給を再開した(図3)。発酵の後期段階(22時間後)には、溶存酸素が限界になった。攪拌の増加および純粋な酸素の導入を用いて、培養物中の溶存酸素濃度を最大化した。これらの努力にも拘わらず、溶存酸素レベルは、31時間後にも依然として全く低いままであった。酸素が制限栄養素になった時にグルコース供給速度を低下させた。発酵を通じて、NH₄OHを添加することによりpHを6〜8に維持した。37.5時間の発酵後、85 g DCW/Lの細胞密度に達し、発酵上清中のヘパロサン濃度は15 g/Lであると決定された。全体の増殖速度は0.12 h^-1であると算出され、全体の産生速度は1.2 g/hであり、容量産生速度は0.4 g/L.hであった。発酵物から精製されたヘパロサンは、¹H-NMRスペクトルから判断して、高純度のものであった(図4A)。さらに、DNAおよびBCAタンパク質アッセイにより、1％未満のDNAと2％未満のタンパク質が最終ヘパロサン材料中に存在することが示された。

ヘパロサンの構造特性評価
¹H-NMR、¹³C-NMR、HPLC-MSおよびフーリエ変換(FT)-MS(図4)は全て、ヘパロサンの一般構造を→4)-β-D-GlcA(1→4)-α-D-GlcNAc(1→と確認する(図1A)。分取電気泳動を用いて得られた、24の重合度(dp)を有するヘパロサン画分のFT-MSを図4Cに示す。このスペクトルはまた、いくつかの多糖鎖の非還元末端に不飽和のウロン酸ΔUA残基(図1B)が存在することを示している。末端ΔUA残基の存在は、大腸菌K5にも存在するK5ヘパロサンリアーゼの作用と一致している。FT-MS分析は、発酵上清から回収されたヘパロサンが、ΔUA残基およびGlcA残基で終結するヘパロサンの混合物を含むことを示唆している。この結果は、培地中のいくらかのヘパロサンが剪断力により細胞表面から脱離し、いくらかはヘパロサンリアーゼ消化により培地中に放出されることと一致している。上清から単離されたヘパロサンを、ヘパロサン鎖の非還元末端から、DUAではなくGlcAを除去することができるエキソ分解酵素であるβ-グルクロニダーゼを用いて処理した。薄層クロマトグラフィーを用いる放出されたGlcAの観察(データは示さず)により、上清中に脱離したヘパロサン鎖のいくらかがGlcAで終結することが確認される。

ヘパロサンのMW特性評価
振とうフラスコ中で増殖させた大腸菌K5から回収されたヘパロサンを、精製されたヘパロサン標準物のラダーに対してPAGEにより分析した(図5および表1)。M9培地、グリセロール合成培地、LB複合培地上で増殖させたフラスコ培養物中の上清から回収されたヘパロサンは、M_nまたはM_wのわずかな差異を示した。グルコース合成培地中の上清から回収されたヘパロサンは、最も低いM_nおよびM_wを有していた。ペレットから回収されたヘパロサンは、発酵上清から回収されたヘパロサンよりも高いM_wを示した(データは示さず)。

次に、発酵を通じて、様々な時点で発酵器からサンプルを取得し、ヘパロサンをVivapure D Mini Hスピンカラムにより精製した。得られたサンプルの純度は、¹H-NMRにより発酵上清から85％を超えると確認された。PAGE分析(図5B)により、ヘパロサンの分子量は最初に増加した後、発酵時間が増加するにつれて、分子量がさらに変化しないことが示された(図6)。ヘパロサン多分散性指数(PDI＝M_w/M_n)は、発酵を通じてほとんど変化しなかった。

考察
本研究では、グルコースを含有する規定培地上で増殖させたフェドバッチ式発酵器培養物中で、発酵上清中の高いヘパロサン収量(15 g/L)が達成された。これは、グリセロールを含有する規定培地上で増殖させた同じ生物に由来する最近報告された10.2 g/Lのヘパロサンの収量(米国特許出願公開第2008/0032349号)と都合良く比較される。容量産生速度も、この以前の報告と比較して増加した。さらに、グリセロールよりも高価でない炭素源であるグルコースは、この発酵プロセスをより経済的なものにする。3L規模で開発されたフェドバッチ式発酵プロセスは、より大きい実験室規模の発酵のための原型として役立ち、究極的には工業的ヘパロサン生産をもたらすことができる。3Lから750Lの実働容量に動かす、プロセスのスケールアップ研究が現在本発明者らの実験室で行われており、これは生物工学的ヘパリン合成のための出発材料として供給するための大規模(100メートルトン)ヘパロサン生産にとって必要とされる約100,000 Lの実働容量にスケールアップするための基礎を提供するであろう。ヘパロサンの産生速度を増加させるために、発酵中のより速いグルコース供給速度および発酵器中のより高い酸素レベルを使用する可能性を調査するところである。

炭素源としてグルコースを含有する規定培地の使用は、発酵の費用を低下させ、また培地の複雑性を低下させ、精製プロセスをより容易なものにした。複合LB培地から精製されたヘパロサンは、複雑な培地成分に起因して純度が低く、グルコースを含有する規定培地から精製されたヘパロサンよりも追加の精製工程が必要であった。

培養上清から単離されたヘパロサンは、おそらくK5リアーゼの組合わせた作用と剪断力を介して発酵の間に培地中に脱離することから生じる。培地中に脱離するヘパロサンの増加は、上清中のヘパロサンの収量を増加させ、下流の精製プロセスの費用を低下させる。

K5リアーゼの存在は、培地中へのヘパロサン莢膜の望ましい放出に寄与し、ヘパロサン収量を増加させる。同時に、K5ヘパロサンリアーゼの存在は、その後の処理を必要とし得る鎖の非還元末端に、非天然糖残基ΔUAをもたらす。K5ヘパロサンリアーゼはまた、ヘパロサンの多分散性指数を増加させ、ヘパリンへのその後の加工を複雑にし得る。生物工学的に作られたヘパリンの分子量特性は、ヘパロサンのものと厳然と関連する。本発明の方法は、ヘパリンへの加工にとって好適な特性を有するヘパロサンを調製する。かくして、本発明者らは、リアーゼの存在下で、発酵条件および発酵プロセッシング時間を注意深く制御することにより、依然として所望の分子量特性を有するヘパロサンを調製することができることを示した。

K5リアーゼ活性のさらなる制御は、ヘパロサン制御の優れた制御のための手法を提供することができる。

20Lの発酵報告(pHスタットフェドバッチ式発酵)
培地
グルコース規定培地：(1リットルあたり)20 gグルコース、20 mgチアミン、13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄、1.4 g MgSO₄・7H₂O、1.7 gクエン酸、および10.0 mL微量金属溶液。微量金属溶液は、(1Lの5 M HClあたり) 10.0 g FeSO₄・7H₂O、2.0 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄・7H₂O、0.5 g MnSO₄・4H₂O、1.0 g CuSO₄・5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、および0.02 g Na₂B₄O₇・10H₂Oからなっていた。フェドバッチ段階において用いられた供給溶液は、(1Lあたり): 700 gグルコース、20 g MgSO₄・7H₂O、47g KH₂PO₄および0.4 gチアミンからなっていた。実施された発酵において用いられたグルコース含有培地であるR培地を、以下のように調製した。

R培地A部分：(NH₄)₂HPO₄、KH₂PO₄、およびクエン酸を、磁気攪拌しながら、約8リットルの水に添加し、微量金属溶液(100倍保存液)を添加し、pHを6.80に調整した後、水を添加して9リットルにした。A部分を121℃で45分間、発酵器中で滅菌した。

R培地B部分：MgSO₄およびグルコース溶液を10倍保存液として作製し、110℃で20分間、オートクレーブを用いて別々に滅菌した(濾過滅菌してもよい)。

供給溶液：グルコース、MgSO₄・7H₂Oおよび47 gのKH₂PO₄を、加熱、攪拌しながら、1リットルの水に溶解し、115℃で20分間、オートクレーブにより滅菌した。チアミンを水に溶解した後、濾過滅菌した。

運転手順
1日目：
4本の5 ml培養チューブに、朝に大腸菌K5株(-80℃の冷凍庫で保存)を含む上記のグルコース合成培地(R培地)を接種し、220 rpmで10時間、振とうしながら37℃でインキュベーター中で増殖させた。4本の培養物を、夕方、2.8 Lのバッフル付き振とうフラスコ中の500 mlの培地に移し、220 rpmで10時間、振とうしながら37℃で増殖させた。

2日目：
発酵器のpHプローブおよびDOプローブを滅菌し、増殖温度(37℃)に補正した。3個のポンプを設定した：ポンプ1、pH調整のためのNH₄OH；ポンプ2、供給溶液；ポンプ3、消泡剤。

R培地B部分を発酵器に添加して、A部分と混合し、500 mlの種培養物を接種した。NH₄OH中でポンプすることにより、pHを6.8に維持した。pH急上昇およびDO急上昇が観察された時に供給溶液のポンピングを行った。供給ポンプを、pHが6.8を超えた時に100％の出力(約6.7 gのグルコースパルス)を与えるようにプログラムした。DOを20％超に維持するために、攪拌速度および／または空気流速を増加させた。DOが20％超を維持できない場合に、攪拌速度および空気流を変化させることにより純粋な酸素流を添加した。

3日目：
培養物のOD⁶⁰⁰値が低下し始めた時に発酵を停止させた。培養物を収穫し、遠心分離した。ヘパロサンを上清から回収した。

図7の青色の曲線は、DO傾向(培養物中の溶存酸素)である。高密度の細胞は酸素を非常に早く消費するため、収穫の数時間前にはDOはほぼ0になったが、純粋な酸素流を依然として維持した。OD 600(600 nmの光波長での培養物の光学密度)が低下し始めた時の数時間後に発酵を停止させた。酸素流のスイッチを切り、攪拌を停止した後、収穫を開始することにより、発酵を停止させた。

サンプリング：約40 mlを取得して、600 nmでの光学密度を測定した後、12,000 x gで30分間遠心分離して、大腸菌細胞から上清を分離させた。上清および細胞ペレットを別々に凍結させた。

発酵サンプル分析：乾燥細胞重量(DCW)を、はかり上で乾燥細胞ペレットを重量計測することにより測定した。上清中のヘパロサン濃度を、エタノール沈降(沈殿)後にNMR定量方法またはカルバゾールアッセイにより測定した(Song J-Mら(2009) “A simple method for hyaluronic acid quantification in culture broth” Carbohydrate Polymers 78 (2009) 633-634；Wang Zら(2009) Anal Biochem. 398(2):275-7)。

結果を図7、8および9に示す。

この発酵段階において産生されたヘパロサンは、約58,000 Daの数平均分子量、約84,000 Daの重量平均分子量、および約1.4の多分散性指数(PDI)を有していた。純度は95％以上と見積もられる。

キトサンクロマトグラフィーを用いるヘパロサン精製
キトサンは、無作為に分布したβ-(1-4)結合D-グルコサミンおよびN-アセチル-D-グルコサミンから構成される線状多糖であり、ヘパロサンのクロマトグラフィー精製のための陰イオン交換樹脂に対する代替手段を提供する。キトサン中のアミノ基(pKa約6.5)は、酸性条件下でそれを正に荷電させ、可溶性にし、従って、負に荷電したヘパロサンの親和性に基づく精製にとって好適になる。キトサンに基づくヘパロサンの精製を、キトサン濃度および初期pHに基づいて容易に制御することができる。さらに、キトサンは安価であり、豊かに供給され、さらに生分解性である。本実施例は、発酵ブロスからヘパロサンを効率的に直接回収するための可溶性キトサンに基づく分離方法を記載する。キトサンを用いるこの電荷中和に基づく分離を、複雑な発酵混合物から他の負に荷電した大分子を精製するために用いることができる。

7 Lの大腸菌K5発酵に由来する発酵ブロスを、7000 rpmで30分間遠心分離して、細胞を除去した。

1. 上清中のヘパロサン含量のNMRに基づく定量を実施した。

2. 上清のpHを、HCl溶液を用いて4.0に調整した後、7000 rpmで1時間遠心分離して、沈降する不純物を除去した。

3. この後、上清をpH 4.0のDI水を用いて5倍に希釈した。

4. 1％酢酸溶液中にキトサンを溶解することにより、10 mg/mlのキトサン溶液を調製した。10 mg/mlのキトサン溶液を用いて、10 mgのヘパロサンにつき、2.5 mgのキトサンを上清に添加した。

5. 次いで、混合物を室温で10分間攪拌して、得られる溶液の適切な混合を確保した。この後、4℃で一晩、混合物をインキュベートした。

6. キトサン-ヘパロサン高分子電解質複合体は、沈降する沈降物を形成し、これを8000 rpmで1時間の遠心分離を用いて回収した。

7. 次いで、沈降物をpH 4.0のDI水で洗浄し、8000 rpmで1時間、それを再度遠心分離した。

8. キトサンは塩基性条件下でその陽イオン性を失い、静電複合体の分布を誘導し、溶液中の遊離ヘパロサンと不溶性キトサンを誘導する。洗浄したペレットを1M NaOH溶液中に入れ、一晩インキュベートして、溶液中のヘパロサンを回収した。不溶性キトサンを、濾過または10000 rpmで2時間の遠心分離により回収した。この工程を陽イオン交換工程または陰イオン交換工程と組合わせて、他のプロセス不純物を除去し、回収されたヘパロサンをさらに精製することができる。

実施例3A
上記手順を用いて、カラムモードのDEAEセファロースファストフロー樹脂を用いて発酵ブロスからヘパロサンを精製した後、4倍量のエタノールを用いて沈降させた。次いで、回収されたヘパロサンを、DI水に対して3500 MWCO膜を用いて透析した。次いで、透析した溶液を、回転式蒸発装置を用いて容量を減少させた後、凍結乾燥した。

次いで、この精製されたヘパロサンの1 mg/ml溶液を、それをpH 4.0の脱イオン水に溶解することにより調製した。10 mlの1 mg/ml溶液を使用し、1％酢酸中の10 mg/mlのキトサン溶液を用いて2〜6 mgの範囲で変化する量のキトサンを添加することにより、6個の異なるサンプルを調製した。サンプルを4℃で一晩インキュベートした。8000 rpmで1時間、これらのサンプルを遠心分離することにより、沈降した高分子電解質複合体を回収した。次いで、1M NaOH溶液を、pH 4.0のDI水で洗浄することなく得られたペレットに添加した。10000 rpmで2時間遠心分離することにより、不溶性キトサンを除去した。次いで、回収されたサンプルおよび上清を、カルバゾールアッセイを用いてヘパロサンの存在について分析した。

カルバゾールアッセイに従って、4 mgのキトサンを10 mlの1 mg/mlヘパロサン溶液に添加することにより、pH 4.0でヘパロサンの100％の回収が達成された。

実施例3B
さらなる実験において、発酵後の遠心分離後に得られた上清を、pH 4.0まで塩酸を添加することにより馴らした。次いで、沈降する不純物を除去するために、8000 rpmで1時間遠心分離した。次いで、1M NaOH溶液を用いて、上清をpH 4.0に調整し戻した。このpHを調整したサンプルのNMR定量により、これらのサンプル中のヘパロサンが失われていないことが示された。

次いで、これらのサンプルを、pH 4.0のDI水を用いて5倍希釈した。この後、1％酢酸中の10 mg/mlキトサン溶液を用いて、サンプルあたり2〜8 mgの範囲のキトサンを添加することにより、それぞれ10 mlの6個のサンプルを調製した。サンプルを4℃で一晩インキュベートした。これらのサンプルを8000 rpmで1時間遠心分離することにより、沈降した高分子電解質複合体を回収した。次いで、それをpH 4.0のDI水で洗浄することなく得られたペレットに、1M NaOH溶液を添加した。10000 rpmで2時間遠心分離することにより、不溶性キトサンを除去した。次いで、回収されたサンプルおよび上清を、カルバゾールアッセイを用いてヘパロサンの存在について分析した。サンプルのカルバゾールアッセイにより、発酵ブロスからヘパロサンが約70％精製されたことが示された。

本発明は、発酵ブロスからヘパロサンを回収するための効率的な精製方法を提供する。このプロセスにおいて用いられるキトサンは安価であり、容易に入手可能であり、生体適合性であり、かつ生分解性である。これらの特性により、ヘパロサンの精製のための沈降剤としての使用にとってキトサンは理想的なものになり、これを静脈内送達可能なヘパリンに酵素的に改変することができる。本発明はまた、重要な濃縮工程を提供し、それによって、一般的に用いられるエタノール沈降工程と比較して、このプロセスに含まれる作業容量を減少させる。エタノール沈降のための作業容量は、例えば、いくつかの事例においては、発酵容量を超える。キトサンの生体適合性および生分解性により、それはセチルピリジニウムクロリド(CPC)およびポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)などの天然で毒性である他のポリカチオンと比較して非常により好ましいものになる。さらに、この方法は、ヒアルロン酸などの他のそのような多糖類および酸性タンパク質、ならびにDNAの精製のための可能性を有する。

本発明はまた、生体工学的に作られたヘパリンの開発における可能性のある使用のための沈降を用いる発酵ブロスからの細菌莢膜多糖であるK5ヘパロサンの費用効果的回収を提供する。この方法は、生体適合性かつ生分解性である天然由来ポリカチオンを使用し、それによって、ヘパリンなどの静脈内送達される薬剤のための効率的かつ安全な精製技術を提供する。この方法を通じて得られる高収率により、それは濃縮工程として理想的なものになり、それによって作業容量を減少させることができる。この回収工程の容易性および生体工学的に作られたヘパリンの化学酵素的合成におけるさらなる工程とのその適合性により、それは精製プロセスとしての使用にとって理想的なものになる。この方法は、細菌発酵に由来する他の陰イオン性多糖類およびタンパク質ならびにDNAなどの高度に荷電した陰性種の除去のための可能性を有する。

Claims (15)

1. 大腸菌K5から少なくとも85％の純度のヘパロサンを産生する方法であって、
   (a)主要炭素源としてグルコースを含む規定培地中で、温度を約37℃に維持しながら大腸菌K5を培養する工程であって、該培養がバッチ式増殖段階とフェドバッチ式増殖段階とからなり、
   (i)バッチ式増殖段階において用いられる培地が(1リットルあたり)約20 gのグルコース、10〜300 mgのチアミン、約13.5 gのKH₂PO₄、約4.0 gの(NH₄)₂HPO₄、約1.4 gのMgSO₄・7H₂O、約1.7 gのクエン酸、および約10.0 mLの微量金属溶液を含み、該微量金属溶液は(1リットルの5M HClあたり)10.0 gのFeSO₄・7H₂O、2.0 gのCaCl₂、2.2 gのZnSO₄・7H₂O、0.5 gのMnSO₄・4H₂O、1.0 gのCuSO₄・5H₂O、0.1 gの(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O、および0.02 gのNa₂B₄O₇・10H₂Oから本質的になり、ならびに、
   (ii)フェドバッチ式増殖段階において用いられる供給培地が(1Lあたり)250〜1000 gのグルコース、20 gのMgSO₄、0.15〜0.5 gのチアミン、および必要に応じて47 gのKH₂PO₄からなり、ならびに、
   (iii)補給酸素を含むか、または含まない散布空気により、酸素を供給する、工程;
   (b)ヘパロサンを固相に結合させた後、溶出させる工程；および、
   (c)溶出液からヘパロサンを沈降させる工程、
   を含み、前記ヘパロサンが少なくとも85％の純度である、前記方法。
2. 前記ヘパロサンが少なくとも90％の純度である、請求項１に記載の方法。
3. 溶存酸素を約20％に維持する、請求項１または２に記載の方法。
4. pHを約7に維持する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記pHを29％アンモニア溶液の添加により維持する、請求項４に記載の方法。
6. フェドバッチ式段階において用いられる培地を、式：
   

   

   
   (式中、Msは炭素源の質量流量(g/h)であり；Fは供給流速(L/h)であり；S_Fは供給物中の炭素基質濃度(g/L)であり；Xは細胞濃度(g/L dcw)であり；mは比維持係数(g/g dcw/h)であり；Vは培養容量(L)であり；t₀は供給開始時間であり；tはプロセス時間であり；μは比増殖速度(h^-1)であり；およびY_X/Sは炭素基質上での細胞収量(g/g)である)
   により決定される速度で供給する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 培養上清1 Lあたり12 gを超えるヘパロサンを取得する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記発酵が出発培養を含まずに48時間未満である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 結合および溶出工程が、(i)細胞の除去；(ii)陰イオン交換樹脂と培養上清との混合および上清の除去；(iii)pH 4の酢酸ナトリウムバッファー中の50 mM塩化ナトリウムを用いる樹脂の洗浄；ならびに(iv)pH 4の酢酸ナトリウムバッファー中の1 M塩化ナトリウムを用いる溶出を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記結合および溶出工程が、(i)細胞の除去；(ii)キトサン溶液と培養上清との混合；(iii)キトサンの沈降および沈降物の単離；(iv)キトサンの洗浄；ならびに(v)約1 M NaOHを用いるヘパロサンの溶出を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
11. 溶出液からの前記ヘパロサンの沈降化が、エタノール沈降を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
12. 過酸化水素を用いる発熱物質除去をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ヘパロサンが1％未満のDNAおよび2％未満のタンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. ヘパロサンが約58,000 Daの数平均分子量、約84,000 Daの重量平均分子量、および約1.4の多分散性指数(PDI)を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. ヘパロサンが少なくとも95％純粋である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

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