KR101515892B1

KR101515892B1 - Ｋ5 헤파로산 발효 및 정제

Info

Publication number: KR101515892B1
Application number: KR1020127004862A
Authority: KR
Inventors: 젠유 왕; 로버트 제이. 린하르트; 조나단 에스. 도르딕; 우즈왈 바스카르
Original assignee: 렌슬러 폴리테크닉 인스티튜트
Priority date: 2009-09-01
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2015-05-04
Also published as: JP2013503606A; RU2564566C2; EP2473614A4; EP2473614A2; BR112012008053B1; BR112012008053A2; US20120157669A1; KR20120090948A; WO2011028668A4; RU2012105621A; CN102712942A; BR112012008053B8; JP5830464B2; WO2011028668A2; TWI485251B; TW201114900A; US8883452B2; CN102712942B; WO2011028668A3; MY163367A

Abstract

본 발명은, 우수한 수율 및 순도, 보다 적은 배양 부피, 보다 신속한 성장, 및 보다 낮은 비용을 나타내는, 산업적 제조에 적합한 이. 콜라이 K5의 발효 배양으로부터의 헤파로산의 제조 방법을 제공한다.

Description

Ｋ5 헤파로산 발효 및 정제 {K5 HEPAROSAN FERMENTATION AND PURIFICATION}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2009년 9월 1일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/275,675호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

정부 면허권

본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 권리 GM38060 및 HL096972 하에서 미국 연방 정부 보조로 이루어졌다. 미국 연방 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

헤파린 및 헤파란 술페이트는 혈액 항응고, 바이러스 및 박테리아 감염, 혈관신생, 염증, 암 및 발달에 관여하는 생물학적으로 중요한 분자이다. 문헌 [Linhardt (2003) "Heparin: structure and activity," J Med Chem, 46: 2551-2554]; [Linhardt RJ, Toida T. (2004) "Role of glycosaminoglycans in cellular communication," Acc Chem Res, 37: 431-438] 참조. 헤파린은 수술, 심장-폐 산소화 및 신장 투석, 심부 정맥 혈전증 및 급성 관상동맥 증후군의 치료를 비롯한 광범위한 용도를 발견한다. 문헌 [Linhardt "Heparin: an important drug enters its seventh decade." Chem. Ind. 2, 45-50 (1991)]; [Agnelli et al. "Enoxaparin plus compression stockings compared with compression stockings alone in the prevention of venous thromboembolism after elective neurosurgery" N Engl J Med 339 (2), 80-5 (1998)] 참조. 헤파린은 또한 혈관 및 의료 장치, 예컨대 시험관 및 임대 투석 기계의 표면 상에 코팅되어 항응고성 표면을 형성한다.

헤파린은 현재 동물 조직으로부터 대략 100 메트릭 톤(metric tons)/년의 양으로 제조되지만, 이러한 헤파린은 다른 생물학적 생성물로 오염될 수 있다. 문헌 [Linhardt Chem. Ind. 2, 45-50 (1991)] 참조. 과술페이트화 콘드로이틴 술페이트로 오염된 헤파린은 2008년에 거의 100명의 미국인을 사망에 이르게 하였다. 문헌 [Guerrini, et al. "Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events." Nature Biotechnology 26, 669-675 (2008)] 참조.

천연의 진핵생물 헤파린 생합성 전구체인 헤파로산은 도 1에 도시된 바와 같이 반복 이당류 단위 [→4) β-D-글루쿠론산 (GlcA) (1→4) N-아세틸-α-D-글루코사민 (GlcNAc) (1→]_n를 갖는 다당류이다.

헤파로산은 또한 에쉐리히라 콜라이(Escherichia coli) K5 및 파스튜렐라 멀티시다(Pasteurella multicida)를 비롯한 박테리아에서 다당류 캡슐로서 생합성된다. 문헌 [Lindahl U et al. (1998) "Regulated diversity of heparan sulfate" J Biol Chem 273(39):24979-24982] 참조. K5 헤파로산 합성의 개시는 보고된 바와 같이 2-케토-3-데옥시옥툴로손산을 포함한다. 문헌 [Finke A et al. (1991) "Biosynthesis of the Escherichia coli K5 polysaccharide, a representative of group II capsular polysaccharides: polymerization in vitro and characterization of the product" J Bacteriol 173(13):4088-94] 참조. 이어서, K5 헤파로산은 성장하는 다당류 쇄의 비환원 말단에 GlcNAc 및 GlcA를 부가하는 글리코트랜스퍼라제 KfiA 및 KfiC의 교대 작용을 통해 신장된다. 문헌 [Hodson N et al. (2000) "Identification that KfiA, a protein essential for the biosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide, is an alpha-UDP-GlcNAc glycosyltransferase. The formation of a membrane-associated K5 biosynthetic complex requires KfiA, KfiB, and KfiC." J Biol Chem 275(35):27311-5] 참조. 일단 합성되면, 헤파로산 쇄는 6개의 단백질 KpsC, KpsD, KpsE, KpsM, KpsS 및 KpsT로 이루어진 경로를 통해 세포 표면 상으로 수송된다. 문헌 [McNulty C et al (2006) "The cell surface expression of group 2 capsular polysaccharides in Escherichia coli: the role of KpsD, RhsA and a multi-protein complex at the pole of the cell" Mol Microbiol 59(3):907-22] 참조. K5 헤파로산 쇄는 이. 콜라이의 외부막에서 다당류의 환원 말단에서의 포스파티드산 분자로의 지질 치환을 통해 세포 표면에 고정되는 것으로 생각된다. 문헌 [Jann B, Jann K. (1990) "Structure and biosynthesis of the capsular antigens of Escherichia coli" Curr Top Microbiol Immunol 150:19-42] 참조. 헤파로산 다당류의 부분들은, 헤파로산 쇄를 β-제거 기작을 통해 절단하는 박테리아 파지 기원 효소인 K5 헤파로산 리아제의 작용을 통해 이. 콜라이 K5로부터 탈락될 수 있다. 문헌 [Manzoni M et al. (1996) "Production of K5 polysaccharides of different molecular weight by Escherichia coli" Journal of Bioactive and Compatible Polymers 11(4):301-311]; [Manzoni M, et al. (2000) "Influence of the culture conditions on extracellular lyase activity related to K5 polysaccharide." Biotechnology Letters 22(1):81-85] 참조. K5 리아제를 코딩하는 유전자는 이. 콜라이 K5 DNA에 통합되어 그의 발현이 유도가능할 수 있다. 문헌 [Manzoni M, et al. (2000). Biotechnology Letters 22(1):81-85] 참조. K5 리아제의 활성은 배양 배지로 방출되는 헤파로산의 양 뿐만 아니라 세포 관련 및 방출된 헤파로산 모두의 구조 및 분자량 특성에 영향을 미칠 수 있다 (도 1B). K5 헤파로산은 M_w이 20,000인 것으로 평가되었고, M_w이 16,000 및 1,500인 2개의 주요 하위성분으로 구성되었다. 2개의 하위성분의 비는 전체 M_w에 대응하고 K5 리아제의 활성에 의해 영향받는다. 문헌 [Vann WF et al (1981) "The structure of the capsular Polysaccharide (K5 Antigen) of Urinary-Tract-Infective Escherichia-Coli 010-K5-H4 - a Polymer Similar to Desulfo-Heparin" European Journal of Biochemistry 116(2):359-364]; [Manzoni (2000) Biotechnology Letters 22(1):81-85] 참조.

실험실-규모의 연구는 이. 콜라이 K5 균주로부터 얻은, 중량평균 분자량 (M_w)이 10,000 초과인 헤파로산이 헤파린에 유사한 항응고성 다당류로 효소적으로 전환될 수 있음을 보여주었다. 문헌 [Lindahl et al. (2005) "Generation of "Neoheparin" from E coli K5 capsular polysaccharide" J Med Chem 48(2):349-352]; [Zhang et al. (2008) "Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors" Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007] 참조. 헤파로산은 또한 다양한 용도에 사용될 수 있다 (WO 2009/014559).

본 발명은 헤파로산의 산업적 제조에 적합한 고수율의 헤파로산 및 고순도 헤파로산의 효율적 회수율을 갖는 이. 콜라이 K5 발효 방법을 기재한다.

본 발명은 이. 콜라이 K5의 발효, K5 다당류의 단리, 및 정제에 의한 개선된 헤파로산 제조 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 주요 탄소 공급원으로서 글루코스를 갖는 한정 배지에서 이. 콜라이 K5를 배양하는 단계; (b) 헤파로산을 고체상에 결합시킨 이후 용리시키는 단계; 및 (c) 용리액으로부터 헤파로산을 침전시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 실질적으로 순수한, 즉 90％ 이상 순수한 헤파로산의 제조에 적합하다.

관련 실시양태에서, 상기 방법은 배양의 두 단계, 즉 회분식 성장 단계 및 유가식 성장 단계를 포함하며, 여기서 (a) 회분식 성장 단계에 사용된 배지는 (L 당) 약 20 g 글루코스, 10-300 mg 티아민, 약 13.5 g KH₂PO₄; 약 4.0 g (NH₄)₂HPO₄, 약 1.4 g MgSO₄·7H₂O, 약 1.7 g 시트르산, 및 약 10.0 mL 미량 금속 용액 (L 당)을 포함하고; 여기서 미량 금속 용액은 본질적으로 (5 M HCl의 L 당) 10.0 g FeSO₄·7H₂O, 2.0 g CaCl₂, 2.2 g ZnSO₄·7H₂O, 0.5 g MnSO₄·4H₂O, 1.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 및 0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O로 이루어지고; (b) 유가식 성장 단계에 사용된 공급 용액은 (L 당) 250-1000 g 글루코스, 약 20 g MgSO₄·7H₂O 및 0.15-0.5 g 티아민, 및 임의로 약 47 g KH₂PO₄로 이루어진다.

관련 실시양태에서, 산소는 주입된(sparged) 공기에 의해 제공된다. 공기는 산소로 보충될 수 있다. 바람직하게는, 용존 산소가 약 20％로 유지된다. 일부 실시양태에서, 순수한 산소가 사용된다.

추가의 관련 실시양태에서, 조건은 약 37℃에서 유지되는 온도를 포함하고, pH는 약 7에서 유지된다. pH는 암모니아 용액 또는 암모니아 가스의 첨가에 의해 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암모니아 용액은 약 25-35％, 예를 들어 약 30％, 예컨대 29％이다.

특정 실시양태에서, 유가식 단계에 사용된 공급 배지는 하기 식에 의해 결정된 속도로 공급된다:

상기 식에서, Ms는 탄소 공급원의 질량 유속 (g/h)이고; F는 공급 유속 (L/h)이고; S_F는 공급물 중 탄소 기질 농도 (g/L)이고; X는 세포 농도 (g/L dcw)이고; m은 특정 유지 계수 (g/g dcw/h)이고; V는 배양 부피 (L)이고; t₀은 공급 시작 시간이고; t는 처리 시간이고; μ는 특정 성장 속도 (h^-1)이고; Y_x _/s는 탄소 기질에 대한 세포 수율 (g/g)이다.

상기 방법은 또한 헤파로산의 결합 및 배양 배지로부터의 용리를 포함한다. 한 실시양태에서, 헤파로산은 세포-무함유 상청액으로부터 수득된다. 또다른 실시양태에서, 헤파로산은 교반하면서 SDS (예를 들어, 1％ SDS)와 같은 세제 용액으로 세척하여 세포로부터 수득된다.

세포의 제거 후, 결합 및 용리는 음이온 교환 수지와 배양 상청액의 혼합 및 상청액의 제거, pH 4의 아세트산나트륨 완충액 중 50 mM 염화나트륨에 의한 수지의 세척, pH 4의 아세트산나트륨 완충액 중 1 M 염화나트륨에 의한 용리를 포함할 수 있다.

별법으로, 결합 및 용리는 키토산에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 배양 상청액을 키토산 용액과 혼합시켜 침전시킨다. 침전물을 단리하고, 물 또는 다른 묽은 완충액으로 세척하고, 약 1 M NaOH와 같은 강염기로 용리시킨다. 키토산에 의한 결합 및 용리는 음이온 교환에 더하여 수행될 수 있다.

결합 및 용리 후, 헤파로산을 예컨대 에탄올 또는 메탄올을 이용하여 용리액으로부터 침전시킨다. 한 실시양태에서, 3 부피의 에탄올을 사용한다. 생성된 침전물을 전형적으로 세척하고 건조시킨다.

상기 방법은 또한, 예컨대 과산화수소의 사용을 포함하는 산화에 의한 임의적 파이로젠 제거 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 단기간에 적은 배양 부피로 고순도 및 소량의 오염물을 갖는 고수율의 헤파로산을 수득한다. 따라서, 본 발명은 헤파로산의 산업적 제조에 적합하다. 헤파로산의 수율은 출발 배양물의 성장을 포함하지 않으면서, 60 시간 미만, 48시간 미만, 및 40시간 미만의 발효로 수득될 수 있다. 다른 실시양태에서, 초기 배양 부피는 회분식 단계에서 3 L이고, 공급 단계에서 7 L로 작업하며, 유사한 비이다. 따라서, 관련 실시양태에서, 배양은 10 g/L 이상, 11g/L 이상, 12 g/L 이상, 13 g/L 이상, 14 g/L 이상, 및 15 g/L 이상의 헤파로산을 생성한다. 실질적으로 순수한 헤파로산은 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 또는 99％ 이상 순수하다. 관련 실시양태에서, 헤파로산은 1％ 미만의 DNA 및 2％ 미만의 단백질이다. 헤파로산은 헤파린으로 가공하기에 적합하다. 한 실시양태에서, 헤파로산의 수평균 분자량은 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60 kDa 이상, 예컨대 약 58 kDa이고; 중량평균 분자량은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 kDa 이상, 예컨대 약 84 kDa이고, 다분산 지수 (PDI)는 2.0 미만, 예를 들어 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 또는 1.3 미만, 예컨대 약 1.4이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 제약 제제, 예컨대 의료 장치의 코팅에서 상기 방법에 의해 제조된 헤파로산의 용도를 포함한다. 관련 실시양태에서, 헤파로산은 헤파린의 제조에 사용된다. 이와 관련하여, 본 발명은 의약의 제조에 있어서 상기 방법에 의해 제조된 헤파로산 또는 헤파린의 사용 방법이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 90％ 이상의 순도, 95％ 이상의 순도 및 이를 초과하는 순도를 갖는 헤파로산을 비롯한, 상기 방법에 의해 제조된 헤파로산이다. 관련 실시양태에서, 본 발명은 상기 헤파로산으로부터 제조된 헤파린이다.

도 1. 헤파로산의 구조. A. 헤파로산의 반복 이당류 단위. B. 헤파로산 K5 리아제의 작용으로부터 생성된 헤파로산 쇄의 구조.
도 2. 진탕 플라스크 배양으로 제조된 헤파로산의 ¹H-NMR 스펙트럼 (600 MHz). A. 1. LB 배지, 2. MW_Avg > 3,000인 LB 배지, 3. MW_Avg < 3,000인 LB 배지로부터 회수된 헤파로산의 스택 플롯(stack plot), 및 샘플 1, 2 및 3의 PAGE 분석을 보여주는 삽입물. B. M9 배지로부터 회수된 헤파로산. C. 글리세롤 한정 배지로부터 회수된 헤파로산. D. 글루코스 한정 배지로부터 회수된 헤파로산.
도 3. 7 L 발효기에서의 헤파로산의 제조. 패널 A는 발효 시간 (h)의 함수로서 글루코스 공급 곡선 (흑색), pH 곡선 (청색) 및 용존 산소 (％ DO) 곡선 (적색)을 보여준다. 패널 B는 발효 시간 (h)의 함수로서 세포 성장 곡선 (총 DCW g, ▲) 및 헤파로산 제조 (g, ■)를 보여준다.
도 4. 7 L 발효의 상청액으로부터 정제된 헤파로산의 특징분석. A. 헤파로산의 ¹H-NMR (600 MHz). B. ¹³C 글루코스 및 ¹⁵N 암모니아 술페이트를 함유하는 M9 배지 상에서 제조된 헤파로산의 ¹³C-NMR. C. 분취용 PAGE에 의해 정제된 평균 분자량 4551.81 (중합도 = 24)의 헤파로산 쇄의 FT-MS (Ly et al., 2010).
도 5. 알시안 블루 착색제를 이용한 헤파로산의 MW 분석에 사용된 PAGE. A. 구배 겔의 범위에 걸친 분자 표준물. 레인 1은 HA 분자 마커 (30 kD-310 kD), 레인 2는 헤파로산 분자 마커 (6.4 kD-14.1 kD)를 함유한다. B. 진탕 플라스크 내 상이한 배지에서 제조된 헤파로산. 레인 1은 M9 배지로부터의 헤파로산, 레인 2는 글리세롤 합성 배지로부터의 헤파로산, 레인 3은 글루코스 합성 배지로부터의 헤파로산, 및 레인 4는 LB 배지로부터의 헤파로산을 함유한다. C. 상이한 시간에 샘플링된, 7 L 발효기에서 제조된 헤파로산. 레인 1-6은 발효 시작 후 4.5 시간; 12.6 시간; 14.5 시간; 20 시간; 32.9 시간; 및 37.6 시간에 발효기로부터 샘플링된 헤파로산을 함유한다.
도 6. 7 L 발효기에서 제조된 헤파로산의 시간 경과에 따른 분자량 특성. M_N (

), M_W (

) 및 PDI (

)의 경향을 보여준다.
도 7. 20 L 발효기에서 발효 시간 (h)의 함수로서 pH 곡선 (

) 및 용존 산소 (％ DO) 곡선 (

).
도 8. 20 L 발효기에서 시간 경과에 따른 세포 성장 곡선 (DCW g/L, (

)) 및 발효 상청액 중의 헤파로산 농도 (g/L, (

)).
도 9. 정제된 헤파로산 샘플의 ¹H-NMR 스펙트럼.
도 10. 1 mg/ml 순수 헤파로산 용액 10 ml로부터 다양한 양의 키토산을 사용하여 침전시킨 후의 상청액 중 헤파로산 농도.
도 11. 1 mg/ml 순수 헤파로산 용액 10 ml로부터 다양한 양의 키토산을 사용한 회수율 (％).
도 12. 5배 희석된 발효액 샘플 10 ml로부터 다양한 양의 키토산을 사용한 회수율 (％).

정의

헤파로산은 반복 이당류 단위 [GlcAα-(1-4)GlcNAcR(1-4)]_n을 갖는 다당류이다. K5 세포외다당류는 본 발명자들이 단리하고 정제한 헤파로산으로부터 제조되기 때문에, 특정 문맥에서 "헤파로산"은 배양 배지에 존재하는, 그리고 단리 및 정제 동안, 박테리아와 관련된 헤파로산을 지칭할 수 있다. 헤파로산의 의미는 관련 문맥에서 당업자에 의해 이해될 것이다.

에쉐리히아 콜라이 K5는 K5 세포외다당류를 생성하는 이. 콜라이의 변이체를 나타낸다. 적합한 이. 콜라이 K5 균주는 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, 미국)와 같은 공공 수집물, 예컨대 이. 콜라이 균주 ATCC23506으로부터 얻을 수 있다. 에쉐리히아 콜라이 K5 균주는 또한 임상 공급원으로부터 단리될 수 있고/거나 유전적으로 변형될 수 있다.

본원에 사용된 "발효"는 세포외다당류, 특히 K5 세포외다당류의 박테리아 성장 및 제조를 지칭한다.

본원에 사용된 "단리된"은 헤파로산이 배양 배지 및 박테리아 세포로부터 분리되어 그의 확인 또는 사용이 가능하도록 충분한 양으로 존재하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 헤파로산이 그의 의도된 용도에 적절하고 실제적인 정도로 다른 물질을 본질적으로 함유하지 않음을 의미한다. 실질적으로 순수한 헤파로산은 90％ 이상 순수하다. 바람직하게, 그 물질은 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 초과, 또는 심지어 99％ 초과가 오염물을 함유하지 않는다. 순도의 정도는 당업계에 공지된 수단에 의해 평가될 수 있다.

본원에 사용된 "부정관사(a/an)"는 구체적으로 단지 1개임을 의미한다고 나타내지 않는 한 1개 이상을 의미한다.

용어 "약"은 "약"이 기재된 용어를 변형시키는 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 사용된다. 수치 값의 경우, "약"은 기재된 값 근처의 10％ 변화를 포함하는 것으로 고려될 수 있다.

헤파로산의 제조를 위한 이. 콜라이 K5의 발효

발효를 위한 적절한 조건의 확인시 다수의 인자가 고려되어야 한다.

이. 콜라이는 일반적으로 폭넓게 다양한 배지 및 pH, 온도, O₂ 및 다른 조건의 범위에서 성장할 수 있다. 그러나, 실험실에 적응된 균주와 달리, 이. 콜라이 K5는 유전학, 성장 및 기능의 광범위한 연구에 제공되지 않았다.

성장 조건의 변화는 (a) 박테리아 성장 속도, (b) 최대 세포 밀도, (c) K5 세포외다당류 캡슐의 제조, (d) 이. 콜라이 K5, 이. 콜라이 K5 내에 거주하는 박테리오파지 및 다른 인자에 의한 K5 캡슐의 변형 정도, (e) K5 세포외다당류 캡슐의 배지 내로의 방출, (f) 생성된 헤파로산 다당류가 헤파린으로 가공되기에 적합한 크기 범위인지 여부, 및 (g) 오염물의 양 및 유형에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 세포 용해를 촉진시키는 조건은 배양 상청액 중 K5 세포외다당류의 수율을 증가시킬 수 있지만, 또한 K5 세포외다당류 캡슐의 분해 및 상청액 중 오염물의 수 및 양을 증가시킬 수도 있다.

임의의 하나의 오염물의 중요성은 오염물이 후속 정제 및 가공 단계에 의해 제거될 수 있는 용이성, 오염물이 헤파로산에서 헤파린으로의 후속 가공을 방해하는지 여부, 및 오염물이 인간 또는 동물에게 위험을 부과하는지 여부와 관련된다. 이. 콜라이 K5는 공지의 병원체이므로, 독소 및 다른 독성-관련 인자가 제거되어야 한다. 지질다당류 (LPS)는 그람 음성 박테리아 추출물의 통상적인 오염물이며, 효능있는 면역증강제 및 독소인 것으로 공지되어 있다. 또한, 핵산도 면역증강성일 수 있다. LPS 및 핵산 모두 다당류 코어(core)를 가지며, 헤파로산과 함께 공동-정제할 수 있다. 다른 오염물은 비-헤파로산 다당류 또는 헤파로산의 유도체를 포함할 수 있다.

제약 및 의료 제품의 제조를 위해, 성장 배지의 공급원 및 성질이 중요할 수 있다. 예를 들어, 동물 또는 식물 단백질의 가수분해에 의해 수득한 복합 배지는 이. 콜라이 K5의 성장 및 제조에 탁월하지만, 배치 간 변화를 나타내며 항원성 오염물 및 다른 오염물을 함유할 수 있다.

산업적 규모의 헤파로산의 제조를 위해 배양 부피, 시간, 및 발효 온도를 비롯한 추가의 인자가 고려되어야 한다. 따라서, 보다 적은 부피의 배지 및 보다 빠른 성장 조건이 바람직하다. 또한, 폭넓게 이용가능하고 표준화되어 있으며 저렴한 출발 물질을 사용하는 성장 배지의 확인이 또한 타당하다.

성장 조건은 또한 규모 확대 가능(scalable)하다고 입증되어야 한다. 따라서, 5 mL 배양물에서의 최적 조건의 확인은 또한 보다 큰 규모, 예컨대 5 L, 20 L, 100 L 이상에서도 입증되어야 한다. 이와 관련하여, 방법은 확고하고 재현가능하여야 하며, 따라서 조건의 작은 변화에 민감하지 않아야 한다.

상기에 비추어, 헤파로산의 산업적 제조에 적합한 조건의 확인은 사소한 것이 아니다. 본 발명자들은 산업적 제조에 적용가능한 헤파로산의 제조, 단리 및 정제를 용이하게 하기 위하여 이. 콜라이 K5에 대한 적합한 성장 및 배양 조건을 확인하였다.

배지는 탄소 공급원으로서 글루코스를 갖는 한정 배지이며, 성장 단계에 따라 변한다. 회분식 성장을 위한 배지의 조성은 L 당 약 20 g 글루코스, 10-300 mg 티아민, 약 13.5 g KH₂PO₄; 약 4.0 g (NH₄)₂HPO₄, 약 1.4 g MgSO₄·7H₂O, 약 1.7 g 시트르산, 및 약 10.0 mL 미량 금속 용액이다. 미량 금속 용액은 (5 M HCl의 L 당) 10.0 g FeSO₄·7H₂O, 2.0 g CaCl₂, 2.2 g ZnSO₄·7H₂O, 0.5 g MnSO₄·4H₂O, 1.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 및 0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O로 이루어졌다. 유가식 배양 동안 공급 용액은 (L 당) 250-1000 g 글루코스, 20 g MgSO₄·7H₂O 및 0.15-0.5 g 티아민으로 이루어졌으며, 추가로 47 g KH₂PO₄로 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공급 용액은 700 g 글루코스, 20 g MgSO₄·7H₂O 및 0.2 g 티아민이었다. 또다른 실시양태에서, 공급 용액은 700 g 글루코스, 20 g MgSO₄·7H₂O, 47 g KH₂PO₄ 및 0.4 g 티아민이었다.

시드 배양물은 원뿔형 플라스크 내 37℃에서 밤새 이. 콜라이 K5 균주를 성장시켜 제조하였다. 이어서, 시드 배양물을 발효기 내로 접종한다. 발효기에서의 발효는 두 단계, 즉 회분식 성장 단계, 및 기하급수적 공급과 DO-스태트(DO-stat) 공급 전략의 조합을 이용하는 단계로 이루어진다. 회분식 성장 단계는 시드 배양물을 발효기에 접종한 후에 시작된다. 온도는 약 37℃에서 유지되고, pH는 pH가 내려갈 때 NH₄OH를 첨가함으로써 6 내지 8로 유지된다.

제2 발효 단계는 용존 산소가 급격한 증가를 나타내고 배지 내 글루코스가 소모된 후에 시작된다. 글루코스의 공급 속도는 일반적으로 하기 식에 따라, 그러나 융통성을 갖고 계산된다.

상기 식에서, Ms는 탄소 공급원의 질량 유속 (g/h)이고; F는 공급 유속 (l/h)이고; S_F는 공급물 중 탄소 기질 농도 (g/l)이고; X는 세포 농도 (g/l dcw)이고; m은 특정 유지 계수 (g/g dcw/h)이고; V는 배양 부피 (l)이고; t₀은 공급 시작 시간이고; t는 처리 시간이고; μ는 특정 성장 속도 (l/h)이고; Y_x _/s는 탄소 기질에 대한 세포 수율 (g/g)이다.

전체 공급 과정 동안, μ는 0.1 내지 0.4이다.

일부 실시양태에서, 글루코스가 과-공급되지 않으며 배양 배지 내 아세테이트와 같은 독성 물질이 소량이도록 보장하기 위한 검사점으로서 공급 동안 중단이 있을 수 있다. 이들 검사점에서, 배양 배지 내 글루코스의 소모를 나타내는 용존 산소 농도의 급격한 증가가 관찰된 후 공급이 재개된다. 보다 큰 규모에서, 상기 관찰은 프로브, 또는 발효 동안의 자동 샘플링 및 분석에 의해 연속적으로 이루어진다.

전형적으로, 세포 밀도의 증가가 관찰되지 않을 때까지 발효가 계속된다. 이어서, 공급이 중단되고, 발효기의 교반기는 30-60분 이상 동안 방치되어 보다 많은 캡슐 K5 다당류를 세포 표면 밖으로 및 배지 안으로 전단한다.

발효 배양으로부터 헤파로산의 정제

하나의 예시적 실시양태에서, 헤파로산 정제는 (a) 배양 상청액 또는 여과액을 제조하는 단계, (b) 헤파로산을 수지와 같은 고체상에 결합시키고 이로부터 헤파로산을 용리하는 단계, (c) 알콜로 침전시키는 단계, 및 (d) 파이로젠 제거 단계를 포함할 수 있다. 추가의 결합, 침전 및 파이로젠 제거 단계가 추가될 수 있다.

단계 (a)에서, 배양물은 원심분리 또는 여과되어 세포 펠렛으로부터 상청액을 분리시킨다. 포르말린 또는 다른 작용제가 배양물에 첨가되어 박테리아 세포를 불활성화시킬 수 있다. 전형적으로, 헤파로산은 상청액으로부터 회수되지만, 또한 세포를 예를 들어 나트륨 도데실 술페이트와 같은 세제로 세척하고 기계적으로 교반한 후 상청액으로부터 헤파로산을 펠렛화 및 추출함으로써 회수될 수 있다.

단계 (b)에서, 헤파로산은 헤파로산에 우선적으로 결합하는 고체상에 결합한다. 예를 들어, 음이온 교환 수지와 같은 수지를 단계 (a)로부터의 상청액에 첨가한다. 혼합물을 교반하여 상청액 중의 헤파로산을 수지 상에 결합시킨다. 이어서, 혼합물을 여과하여 수지를 용액으로부터 분리시킨다. 이어서, 분리된 고체를 세척하여 비결합 오염물을 세정하고 용리시킨다.

음이온 교환 수지의 경우, 이는 비결합 오염물을 세정하기 위한 저 염 농도 용액으로의 세척 및 1 내지 2 M 염화나트륨 용액으로의 용리를 포함할 것이다. 키토산이 또한 헤파로산을 결합시키는데 사용될 수 있다. 키토산이 용액으로서 첨가될 수 있어 "고체상"으로 존재하지 않는 경우, 침전됨으로써 상청액으로부터 헤파로산을 운반한다. 유사하게, 헤파로산은 고체상을 함유하는 적절한 컬럼을 관통하고 세척되고 용리될 수 있다.

단계 (c)에서, 단계 (b)로부터의 생성된 헤파로산 용리액을 예컨대 1 내지 5 부피부의 에탄올 또는 메탄올을 첨가함으로써 침전시킨다. 이 단계는 헤파로산을 농축시킬 뿐만 아니라 오염물을 선택적으로 제거한다. 이어서, 침전물을 원심분리에 의해 분리시키고, 50 내지 80％ 알콜로 세척한다.

단계 (d)에서, 침전물을 물 중에 용해시키고, 파이로젠 제거 단계에 제공하여 남아있는 지질다당류 및 다른 오염물을 불활성화시킨다. 전형적으로, 이는 과산화수소와 같은 산화제로 수행되지만, 다른 과산화물 또는 표백제가 공지되어 있다. 생성된 헤파로산은 상기한 바와 같이 다시 침전시키고, 건조시킨다.

분석

생성된 헤파로산을 분석하여 추가 처리를 위한 수율, 순도 및 적합성을 결정한다. 여러 분석 도구가 사용될 수 있다.

이당류 조성은 헤파로산의 부분 소화 후 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)-전자분무 이온화 (ESI)-질량 분광법 (MS)을 이용하여 분석할 수 있다. 문헌 [Bhattacharyya S et al. (2010) "Cell-bound IL-8 increases in bronchial epithelial cells after arylsulfatase B silencing due to sequestration with chondroitin-4-sulfate," Am J Respir Cell and Molec Biol 42, 51-61] 참조. 또한, ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR은 비소화 헤파로산에 대해 사용될 수 있으며, 헤파로산의 농도 및 순도를 결정하는데 적합하다. 문헌 [Wang Z, Zhang Z, McCallum SA, Linhardt RJ. 2009] 참조. 헤파로산 K5 캡슐 다당류 제조를 모니터링하기 위한 핵 자기 공명 정량화. 문헌 [Anal Biochem. 398(2):275-7] 참조. 헤파로산은 또한 문헌 [Bitter T, Muir HM. (1962) "A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction." Analytical Biochemistry 4(4):330]에 보고된 바와 같이 카르바졸 분석으로 결정할 수 있다.

DNA 함량은 UV 흡광도에 의해 결정할 수 있다. 단백질 함량은 널리 공지된 키트, 예컨대 마이크로 BCA 단백질 검정 키트를 이용하여 제조자 설명서에 따라 결정할 수 있다.

정제된 헤파로산의 분자량 프로파일은 헤파로산 또는 히알루론산의 공지된 분자량 래더(ladder)를 비교하여 결정되어 분자량 평균, 수 및 분포를 계산하는데 사용된다.

파이로젠 함량은 투구게 변형세포 용해액 (limulus amoebocyte lysate, LAL) 검정으로 결정할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 더 이해될 수 있으며, 하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 예시하기 위해 제공된 것이고 이들로 제한됨을 의도하지 않는다. 당업자는 본 발명의 취지에서 벗어남 없이 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

실시예

실시예 1

물질

애플리콘 (Applikon) (네덜란드 스키담)사의 고압멸균가능한 7-L 유리 생물반응기를 발효기로서 사용하였다. 바이오엑스퍼트 (BioXpert) V1.5 소프트웨어를 사용하여 발효기의 작동을 조절하고 데이타를 수집하였다. BD (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스) 사로부터 디프코(Difco)^TM LB 브로스 분말을 구매하였다. 합성 배지를 제조하는데 사용된 화학물질의 대부분은 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트 루이스) 사의 것이었다. 안티폼 (Antifoam) 204도 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스) 사의 것이었다. 배플형 (baffled) 진탕 플라스크는 코닝 (Corning) (미국 뉴욕주 코닝) 사의 것이었다. 헤파로산의 정제를 위해서는 지이 헬스케어 (GE Healthcare) (미국 뉴저지주 피스카타웨이) 사의 DEAE 세파로스 패스트 플로우 (Sepharose Fast Flow)를 사용하였다. 비바퓨어 디 미니 에이치 (Vivapure D Mini H) 스핀 컬럼은 사토리우스 스테딤 바이오테크 (Sartorius Stedim Biotech) (프랑스 오바뉴) 사의 것이었다. 마이크로 BCA 단백질 검정 키트 (Micro BCA Protein Assay Kit)는 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific) (미국 일리노이주 록포드) 사의 것이었다. 이당류 분석을 위해 헤파로산을 절단하는데 사용된 효소는 문헌 [Han et al.(2009) "Structural snapshots of heparin depolymerization by heparin lyase I" J Biol Chem 284(49):34019-27]에 기재된 바와 같이 하여 본 발명자들의 실험실에서 발현 및 정제하였다. HPLC-MS는 애질런트 (Agilent) 1100 기구 (미국 캘리포니아주 산타 클라라) 상에서 실시하였다. TLC 실리카 겔 플레이트는 EMD (미국 뉴저지주 깁스타운) 사의 것이었다. 헤파로산 MW 래더를 제조하고 헤파로산 M_w를 결정함에 있어서의 물질은 문헌 [Ly M, et al (2010) "Analysis of E. coli K5 capsular polysaccharide heparosan" Anal Bioanal Chem (DOI: 10.1007/s00216-010-3679-7)]에 상세히 기재되었다. 히알루로난 분자 마커 세트인 셀렉트(Select)_HA^TM 로래더 (LoLadder)는 히알로스 (Hyalose) (미국 오클라호마주 오클라호마 시티) 사로부터 수득하였다.

2.8 L 진탕 플라스크에서의 이. 콜라이 K5 의 성장

아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터의 이. 콜라이 K5 (ATCC #23506)를 25％ 글리세롤을 함유한 1 mL의 M9, LB, 글리세롤 및 글루코스 배지 중에서 냉동 상태로 저장하였다. 상기 동일 배지 25 mL가 담긴 250 mL 진탕 플라스크에 해동한 이. 콜라이 0.5 mL를 접종하였다. 후기 지수 성장기에서 배양물을 수거하였는데, M9 배지 배양의 경우 대략 1.1 g 건조 세포 중량 (DCW)/L로, 글리세롤 합성 배지의 경우 5.4 g DCW/L로, 글루코스 합성 배지의 경우 5.6 g DCW/L로, 및 LB 배지의 경우 1.9 g DCW/L로 수거되었다. 그런 다음, 이. 콜라이 K5 배양물 (300 mL)을, 후기 지수 성장기 중의 5 부피％의 세포로 접종된 2.8 L 진탕 플라스크 중에서 성장시켰다. 성장이 정지 단계에 이른 후 1-4시간이 될 때까지 배양물을 220 RPM 및 37℃에서 진탕한 후, 헤파로산의 회수를 위해 수거하였다. 2.8 L 진탕 플라스크 발효에 사용된 배지는 이하를 포함하였다: 1. LB 배지: 디프코^TM LB 브로스, 레녹스 (Lennox), 20 g/L. 2. M9 배지: 2 g/L 글루코스, 0.12 g/L MgSO₄, 0.011 g/L CaCl₂, 0.337 g/L 티아민-HCl, 6 g/L Na₂HPO₄, 3 g/L KH₂PO₄, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH₄Cl. 3. 글리세롤 한정 배지: 20 g/L 글리세롤, 20 mg/L 티아민, 13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄, 1.4 g MgSO₄·7H₂O, 1.7 g 시트르산, 및 10.0 mL 미량 금속 용액. 미량 금속 용액은 (5 M HCl의 L 당) 10.0 g FeSO₄·7H₂O, 2.0 g CaCl₂, 2.2 g ZnSO₄·7H₂O, 0.5 g MnSO₄·4H₂O, 1.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 및 0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O로 이루어졌다 (문헌 [Wang FL, Lee SY (1998) "High cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli for the production of poly(3-hydroxybutyrate) in a defined medium" Biotechnology and Bioengineering 58(2-3):325-328]). 4. 글루코스 한정 배지: L 당 20 g 글루코스, 20 mg 티아민, 13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄, 1.4 g MgSO₄·7H₂O, 1.7 g 시트르산, 및 10.0 mL 미량 금속 용액. 미량 금속 용액은 (5 M HCl의 L 당) 10.0 g FeSO₄·7H₂O, 2.0 g CaCl₂, 2.2 g ZnSO₄·7H₂O, 0.5 g MnSO₄·4H₂O, 1.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 및 0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O로 이루어졌다 (Wang and Lee (1998), 상기와 동일).

7 L 발효기에서의 이. 콜라이 K5 의 성장

이 발효는 회분식 성장 단계 및 유가식 성장 단계로 이루어진다. 이 발효에서 회분식 성장을 위한 배지의 조성은 이하와 같았다: (L 당) 20 g 글루코스, 20 mg 티아민, 13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄, 1.4 g MgSO₄·7H₂O, 1.7 g 시트르산, 및 10.0 mL 미량 금속 용액. 미량 금속 용액은 (5 M HCl의 L 당) 10.0 g FeSO₄·7H₂O, 2.0 g CaCl₂, 2.2 g ZnSO₄·7H₂O, 0.5 g MnSO₄·4H₂O, 1.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 및 0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O로 이루어졌다. 유가식 단계에서 사용된 공급 용액은 이하로 이루어졌다 (L 당): 700 g 글루코스, 20 g MgSO₄·7H₂O 및 0.2 g 티아민. (Wang and Lee (1998), 상기와 동일).

회분식 성장 단계는 후기 지수 성장기 중의 진탕 플라스크로부터 수득한 시드 배양물 (300 mL의 5.6 g/L DCW)의 접종에 의해 시작되었다. 온도는 대략 37℃로 유지되었고, pH는 (29％ 암모니아 용액을 첨가함으로써) 대략 7에서 유지되었다. 발효기 내로 공기를 주입하여 산소를 공급하였고, 교반기 속도는 520 RPM으로 설정되었다.

회분식 성장 배지 중의 글루코스가 고갈되고 용존 산소가 급격한 증가를 보인 후에 제2 단계의 발효가 시작되었다. 그 후, 공급 용액을 이하의 방정식 1에 따라 지수적으로 공급하였다.

<방정식 1>

Ms는 탄소 공급원의 질량 유속 (g/h)이고; F는 공급 유속 (L/h)이고; S_F는 공급물 중 탄소 기질 농도 (g/L)이고; X는 세포 농도 (g/L dcw)이고; m은 특정 유지 계수 (g/g dcw/h)이고; V는 배양 부피 (L)이고; t₀은 공급 시작 시간이고; t는 처리 시간이고; μ는 특정 성장 속도 (h^-1)이고; Y_x _/s는 탄소 기질에 대한 세포 수율 (g/g)이다 (문헌 [Lee SY. 1996. "High cell-density culture of Escherichia coli". Trends Biotechnol 14(3):98-105]). 본 연구에서는 충분한 세포 증식을 가능하게 하면서도 보다 높은 성장 속도로 인한 독성의 부 생성물의 축적을 피하기 위해 0.10 내지 0.15 h^-1의 μ값이 사용되었다. 발효기에 부착된 "산 펌프(acid pump)"는 실제 산을 첨가하는 대신 글루코스 공급 기능을 수행하기 위해 사용되었으며, 염기 펌프는 29％ 암모니아 용액을 첨가하여 안정한 pH를 유지하고 배양물에 질소 공급원을 제공하기 위해 사용되었다. 발포가 발효기의 디지털 제어 장치를 통한 피드백 루프에 의해 제어되는 설정된 수준을 초과했을 때 안티폼 204 시약을 배양물 내로 첨가하기 위해 제3의 펌프가 사용되었다. 1분 동안의 "산 펌프" 온-오프 시간을 프로그래밍하여 글루코스-공급 속도를 달성하였다. 7시간 내지 24시간의 발효 경과 시간에는 T_on=0.72* exp[0.0023*(t - 420)]의 방정식이 사용되었는데, 여기서 T_on은 상기 1분 기간 동안 "산 펌프"가 1초 동안 켜진 시간이다. 산소 제한이 관찰되면 24시간 후에 글루코스-공급 속도를 감소시켰다. pH 조절은 염기 펌프를 사용하여 29％ 수산화암모늄 용액을 첨가하여 수동으로 달성하였다. pH는 바이오엑스퍼트 V1.5 소프트웨어 내에 입력된 맞춤형 프로그램을 이용하여 더욱 세밀히 조절되었다. 용존 산소의 공기 포화도가 20％ 미만으로 떨어졌을 때 교반기 속도 및/또는 공기 유속을 증가시켰다. 24시간의 발효 시간 후에 충분한 용존 산소를 제공하기 위해 순수한 산소를 공기에 혼합시켰다. 세포가 글루코스를 전부 소비하도록 하고 독성의 부산물 (예컨대, 아세테이트)이 배지 내에 쌓이지 않도록 보장하기 위해 글루코스 공급을 주기적으로 중단하였다. 용존 산소 스파이크 (spike)가 관찰된 후에는 공급을 재개하였는데, 이는 글루코스의 고갈 및 독성의 부산물의 형성을 시사한다. 문헌 [Johnston WA, et al. (2003) "Tracking the acetate threshold using DO-transient control during medium and high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli in complex media" Biotechnol Bioeng 84(3):314-23]. 발효기로부터 주기적으로 샘플을 수집하였다. 취해진 샘플을 12,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 상청액과 이. 콜라이 세포를 분리시켰다.

발효 상청액 중의 헤파로산 농도의 측정

발효 상청액 중의 헤파로산 농도는 카르바졸 분석 및 NMR 분석 둘 모두를 이용하여 측정되었다. 헤파로산에 대한 카르바졸 검정에서, 원심분리에 의해 회수된 발효 상청액 0.5 mL를 밀리포어 (Millipore) YM-3 탈염 스핀 컬럼 (1200 x g)에 적용하여 염 및 소분자를 제거하였다. 조 헤파로산을 함유한 잔류물을 회수하고, 동결건조하였다. 건조된 조 헤파로산을 0.5 mL의 증류수로 재구성하고, 카르바졸 검정에 적용시켰다. 순수한 헤파로산을 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 헤파로산의 농도를 산출하였다. NMR 검정에서는, 배양 상청액으로부터 유사하게 회수된 헤파로산 (1 mL)을 동결건조시키고, 이어서 이를 71 μg의 테레프탈산 나트륨을 함유한 400 μL의 D₂O (내부 표준물)에 용해시킨 후, 600 MH_Z에서의 ¹H-NMR을 위해 NMR 튜브로 옮겨 담았다. 헤파로산 중의 N-아세틸기의 적분 면적 및 내부 표준물의 적분 면적의 비로부터 헤파로산의 농도를 산출하였다.

분석을 위한 것으로서 발효 동안 헤파로산 샘플의 신속한 회수

헤파로산을 발효 상청액으로부터 신속하게 회수하고, 비바퓨어 디 미니 에이치 스핀 컬럼을 이용하여 부분적으로 정제하였다. 세포로부터 원심분리 (12,000 x g)에 의해 회수한 상청액 (1 mL)을 1 mL의 완충액 A (50 mM 염화나트륨, 20 mM 아세트산나트륨, pH 4)와 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 pH 4로 조정하고, 사전-평형화한 비바퓨어 디 미니 에이치 컬럼 상에 로딩하였다. 그런 다음, 상기 컬럼을 완충액 A로 세척하고, 완충액 B (1 M 염화나트륨, 20 mM 아세트산나트륨, pH 4)로 용리시켰다. 이어서, 용리된 샘플을 3배 부피의 에탄올을 이용하여 침전시키고, (방폭 냉동기에서) -20℃에서 밤새 방치하고, 생성된 침전물을 75％ 에탄올로 세척하고, 물에 용해시키고, 동결건조하였다. 그런 다음, 회수된 샘플의 순도를 ¹H-NMR로 조사하였다.

헤파로산의 정제

진탕 플라스크 또는 7-L 발효기 중 하나에서의 발효 완료시에 배양물을 12,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 헤파로산을 회수하였다. 수득한 상청액에 빙초산을 첨가하여 이의 pH를 4로 조정한 후, 소결유리 디스크(fritted disc)가 구비된 파이렉스 (Pyrex) 흡인 여과기 (Buchner funnel) (공극 크기 40-60 μm)를 통해 여과시켰다. DEAE-세파로스 패스트 플로우 수지를 적절한 크기의 컬럼 내로 채워넣었다 (20 mg 미만의 헤파로산 / mL (팽창된 수지)). 상기 컬럼을 먼저 pH 4의 20 mM 아세트산나트륨 완충액 중의 50 mM 염화나트륨으로 평형화하였다. 이어서, 상기 컬럼에 상기 발효 상청액을 로딩하고, 컬럼을 3배 부피의 pH 4의 20 mM 아세트산나트륨 완충액 중의 50 mM 염화나트륨으로 세척하였다. 그 후, pH 4의 20 mM 아세트산나트륨 완충액 중의 1 M 염화나트륨을 이용하여 헤파로산을 컬럼으로부터 용리시켰다. 3배 부피의 에탄올을 첨가하고 이 용액을 방폭 냉동기에서 -20℃에서 밤새 저장함으로써 상기 컬럼으로부터 용리된 헤파로산을 침전시켰다. 12,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 펠렛을 75％ 에탄올로 세척하고, 다시 원심분리하고, 수득한 펠렛을 저장을 위해 동결건조하거나 또는 표백 단계에 바로 사용하였다. 또한, 0.02％ SDS를 첨가한 후, 격렬히 교반하고, 원심분리 및 DEAE 크로마토그래피하여 헤파로산을 세포 펠렛으로부터 정제할 수 있었다.

표백 단계에서는, 헤파로산을 먼저 1 M 염화나트륨에 대략 15 g/L의 농도로 용해시켰다. 1 M NaOH를 이용하여 상기 용액의 pH를 9.5로 조정하고, 과산화수소 (30％)를 첨가하여, 1.5％의 최종 농도를 수득하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션한 후, 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 헤파로산을 침전시키고, (방폭 냉동기에서) -20℃에서 밤새 방치하였다. 생성된 펠렛을 75％ 에탄올로 세척하고, 물에 용해시키고, 건조시켰다.

헤파로산에 대한 이당류 분석

헤파로산 (10 mg/mL)을 pH 7의 200 mM 인산 나트륨 완충액에 용해시키고, 각각 1 mU의 헤파린 리아제 1, 2 및 3으로 30℃에서 밤새 처리하였다. 생성된 이당류 생성물을 애질런트 이온 트랩 (Ion trap) 기구 상에서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)-전기분무 이온화 (ESI)-질량 분광법 (MS)에 적용하고, 이당류 조성을 결정하였다. LC-MS 분석은 LC-MS 시스템 (LC/MSD 트랩 MS; 애질런트, 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 상에서 수행하였다. 고압 액체 크로마토그래피를 위한 용액 A 및 B는 각각 15％ 및 65％ 아세토니트릴로서, 이들은 동일 농도의 37.5 mM NH₄HCO₃ 및 11.25 mM 트리부틸아민을 함유하였다. C-18 컬럼 (애질런트) 상에서 용액 A를 이용하여 20분 동안, 이어서 20분에서 45분까지는 0-50％ 용액 B의 선형 구배를 이용하여 분리를 수행하였다. 컬럼 용출액은 MS에 의한 연속적 검출을 위해 전기분무 이온화 질량 분광법 (ESI-MS)의 공급원으로 들어갔다. 전기분무 계면은 400 V의 스키머 포텐셜 (skimmer potential), 240.0 V의 모세관 출구, 및 325℃의 온도의 공급원을 이용한 음이온화 모드로 설정되어, 전체 스캔 스펙트럼에서 최대 풍부도의 이온을 달성하였다 (150-1,500 Da, 10개의 전체 스캔물/s). 건조 (5 리터/분) 및 분무 기체 (20 psi)로서는 질소를 사용하였다. 문헌 [Bhattacharyya S, Am J Respir Cell and Molec Biol 42, 51-61].

헤파로산에 대한 NMR 분석

¹H-NMR 및 ¹³C-NMR은 브루커 (Bruker) 600 MHz NMR 분광기 상에서 실시되었다. D₂O 중에 2 mg/mL의 농도로 헤파로산 샘플을 준비하고 (99.99+ 원자 ％), 이를 동결-건조하여 교환가능한 양성자를 제거하고, D₂O에 다시 용해시키고, 표준 5 mm NMR 튜브로 옮겨 담았다. 탑스핀 (TOPSPIN) 2.0 소프트웨어를 이용하여 스펙트럼 획득을 실시하였다. 모든 스펙트럼은 298 K의 온도에서 획득되었다.

DNA 및 단백질 함량 검정

260 nm 및 320 nm에서 0.1 mg/mL 헤파로산 용액의 UV 흡광도를 측정하여 최종 헤파로산 생성물 중의 DNA 함량을 측정하였다. DNA 농도는 [농도 (μg/mL) = (A₂₆₀ 판독값 - A₃₂₀ 판독값) × 희석 배수 × 50 μg/mL]로서 산출되었다. 단백질 함량은 마이크로 BCA 단백질 검정 키트를 제조자 설명서에 따라 사용하여 분석되었다.

헤파로산의 분자량에 대한 분석

미니 프렙 셀 (Mini Prep Cell) (바이오래드(Biorad), 미국 캘리포니아주 허큘러스) 장치를 이용한 연속적 분취용 폴리아크릴아미드 전기영동을 이용하여, 표백된 K5 헤파로산 다당류로부터 공지의 분자 질량을 가진 헤파로산 표준물의 래더를 제조하였다 (Ly et al., 2010). 헤파로산 분획물을 푸리에 변환-질량 분광법 (FT-MS)으로 특징분석하고, 다시 혼합하여, 헤파로산의 분자량 특성의 측정을 위한 분자량 표준물의 래더를 제조하였다 (Ly et al., 2010). N-아세틸헤파로산과 동일한 전하 밀도를 가진 또 다른 선형 다당류인 히알루로난 (HA)의 분자 마커를, 보다 상위 범위의 샘플을 위한 표준물로 사용하였다.

상이한 배양 배지 및 상이한 발효 시점에서 제조된 헤파로산에 대한 분자량 분석을 위한 표준물 집합으로서 HA 및 헤파로산 분자 마커 둘 모두를 사용하였다. 0.75 mm x 6.8 cm x 8.6 cm 크기의 구배 폴리아크릴아미드 겔 (4-15％)을 헤파로산 분자량 분석에 사용하였다. 헤파로산 샘플 (25 μg)을 겔 상에 로딩하고, 이어서 전기영동 (200 V로 20분 동안)에 적용하고, 1시간 동안 알시안 블루로 착색한 후, 25％ 에탄올/10％ 아세트산으로 탈색하였다 (Ly et al., 2010). 겔을 스캔하고, 이들의 디지털 화상을 컴퓨터 소프트웨어 UN-SCANIT를 이용하여 분석하였다. 이동 거리의 함수로서 화상 밀도의 곡선을 획득하였다. 이 데이타로부터, 헤파로산 샘플의 분자량 특성을 상기 수득한 표준 곡선으로부터 특징분석하였다.

결과

헤파로산의 제조를 위한 진탕 플라스크에서의 이. 콜라이 K5 발효

이. 콜라이 K5를 진탕 플라스크에서 정지 단계에 도달한 후 1-4시간까지 성장시켰다. 발효를 정지 단계 이후까지 연장시켜, 배지 중에 최대량의 헤파로산이 축적되게 하였는데, 이는 배지 중의 헤파로산의 출현이 세포 성장을 지체시킨다는 보고에 따른 것이다 (문헌 [Manzoni M et al. (1993) Journal of Bioactive and Compatible Polymers 8(3):251-257]). 플라스크 배양물로부터의 헤파로산의 수율은 70 - 500 mg/L 범위였다. 플라스크 배양물로부터 회수된 헤파로산의 순도는 NMR로 추정한 바 모든 경우에 85％ 초과였다 (문헌 [Wang Z et al (2009) Anal Biochem. 398(2):275-7]; [Zhang ZQ et al (2008) "Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors" Journal of the American Chemical Society 130(39):12998-13007]). M9 배지, 글루코스 배지 및 글리세롤 배지를 비롯한 합성 배지로부터 회수된 헤파로산은 LB 배지로부터 회수된 헤파로산보다 더 높은 순도 수준 (> 95％)을 나타내었으며, LB 배지로부터 회수된 헤파로산은 NMR에서 추가적인 피크를 나타내었는데, 이는 대략 85％ 순도와 일치하였다 (도 2). LB 배지 유래의 헤파로산에 대한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의한 추가 분석에서는 낮은 M_W의 밴드가 나타났는데, 이는 헤파로산과 함께 정제되는 배지 성분에 해당하였다. 이 불순물은 3K 분자량 컷-오프 (MWCO) 스핀 컬럼을 이용하여 제거할 수 있다 (도 2A).

헤파린 리아제 1, 2 및 3을 이용한 최대한의 절단 후에 HPLC-MS로 헤파로산의 이당류 조성을 측정하였으며 (제시되지 않음), 그 결과 단일 이당류 (m/z 378.2)의 존재가 나타났다. 이 이당류는 ΔUA(1→4)-α-D-GlcNAc에 상응하며, 헤파로산의 획일적인 반복 구조인 → 4)-β-D-GlcA (1→4)-α-D-GlcNAc (1→ 와 일치한다. 이 구조를 확증하기 위해, 균일하게 표지된 ¹³C-글루코스 및 ¹⁵N-염화암모늄을 함유한 M9 배지 중에서 이. 콜라이 K5를 배양하여 ¹³C^' 및 ¹⁵N^' 표지된 헤파로산을 제조하였다. 헤파린 리아제 1, 2 및 3을 이용한 최대한의 절단, 및 그 후의 HPLC-MS를 이용하여 상기 회수된 균일하게 표지된 ¹³C-, ¹⁵N-헤파로산의 구조를 확인하였는데, 단일 이당류 (m/z 392.9)가 나타났다. m/z 378.2 및 392.9 간의 15 amu의 차이는 헤파로산의 전체 ¹³C 및 ¹⁵N 동위원소 농축과 일치하며, 이는 헤파로산 반복 구조를 확증해 준다.

7 L 발효기에서의 이. 콜라이 K5 발효

이. 콜라이의 지수적 성장을 계속적으로 유지시키기 위해 공급 속도를 지수적으로 증가시켰다. 배지 중의 글루코스 증강 (이는 아세테이트 축적을 초래하여 이. 콜라이 성장을 억제할 수 있음)이 없도록 하기 위해 공급 단계 중에 여러 번의 중단을 실시하였다. 글루코스의 고갈을 확인시켜 주는 용존 산소의 증가가 관찰된 후에만 공급을 재개하였다 (도 3). 후기 단계의 발효 (22시간 후)에서, 용존 산소는 제한적으로 되었다. 배양물 중의 용존 산소 농도를 최대화하기 위해 교반을 증가시키고 순수한 산소를 도입하였다. 이러한 노력에도 불구하고 31시간 후에 용존 산소 수준은 여전히 상당히 낮게 잔존하였다. 산소가 제한 영양소가 되었을 때 글루코스-공급 속도를 감소시켰다. 발효 전체 기간 동안, NH₄OH를 첨가하여 pH를 6 내지 8로 유지시켰다. 37.5시간 발효 후, 85 g DCW/L의 세포 밀도에 도달하였으며, 발효 상청액 중의 헤파로산 농도는 15 g/L인 것으로 측정되었다. 전체 성장 속도는 0.12 h^-1로 계산되었으며, 전체 생산 속도는 1.2 g/h였고, 체적 생산 속도는 0.4 g/L.h였다. 상기 발효액으로부터 정제한 헤파로산은 고순도였으며, 이는 ¹H-NMR 스펙트럼으로부터 판단한 것이다 (도 4A). 부가적으로, DNA 및 BCA 단백질 검정 결과, 1％ 미만의 DNA 및 2％ 미만의 단백질이 최종 헤파로산 물질 중에 존재한 것으로 나타났다.

헤파로산의 구조 특징분석

¹H-NMR, ¹³C-NMR, HPLC-MS 및 푸리에 변환 (FT)-MS (도 4) 모두 헤파로산의 일반적 구조를 → 4)-β-D-GlcA (1→4)-α-D-GlcNAc (1→ 로서 확증한다 (도 1A). 분취용 전기영동을 이용하여 수득한, 24의 중합도 (dp)를 갖는 헤파로산 분획물에 대한 FT-MS가 도 4C에 제시되어 있다. 이 스펙트럼 역시 다당류 쇄 중 일부의 비환원 말단에서 불포화 우로네이트 ΔUA 잔기가 존재함을 나타낸다 (도 1B). 말단 ΔUA 잔기의 존재는 이. 콜라이 균주 K5에도 또한 존재하는 K5 헤파로산 리아제의 작용과 부합한다. FT-MS 분석은 발효 상청액으로부터 회수된 헤파로산에 말단이 ΔUA 잔기인 헤파로산 및 말단이 GlcA 잔기인 헤파로산의 혼합물이 함유되어 있다는 것을 시사한다. 이 결과는 배지 중의 일부 헤파로산이 전단력에 의해 세포 표면으로부터 탈락되고 일부는 헤파로산 리아제 절단에 의해 배지 내로 방출된다는 것과 일치한다. 상청액으로부터 단리된 헤파로산을, 헤파로산 쇄의 비환원 말단으로부터 DUA는 제거하지 않으면서 GlcA를 제거할 수 있는 외부용해성 (exolytic) 효소인 β-글루쿠로니다제로 처리하였다. 방출된 GlcA를 박층 크로마토그래피를 이용하여 관찰하면 (데이타는 제시되지 않음), 상청액 내로 탈락된 헤파로산 쇄의 일부가 GlcA의 말단을 가진 것이 확인된다.

헤파로산의 MW 특징분석

진탕 플라스크 중에서 성장시킨 이. 콜라이 K5로부터 회수된 헤파로산을 정제된 헤파로산 표준물의 래더와 대비하여 PAGE로 분석하였다 (도 5 및 표 1). M9 배지, 글리세롤 합성 배지, LB 복합 배지 상에서 성장시킨 플라스크 배양물 중의 상청액으로부터 회수된 헤파로산은 M_n 또는 M_w에서 거의 차이를 나타내지 않았다. 글루코스 합성 배지 중의 상청액으로부터 회수된 헤파로산은 M_n 및 M_w가 가장 낮았다. 펠렛으로부터 회수된 헤파로산은 발효 상청액으로부터 회수된 헤파로산보다 더 높은 M_w를 나타내었다 (데이타는 제시되지 않음).

다음으로, 발효 전체에 걸쳐 다양한 시점에서 발효기로부터 샘플을 취하고, 비바퓨어 디 미니 에이치 스핀 컬럼으로 헤파로산을 정제하였다. 생성된 샘플의 순도는 ¹H-NMR에 의해 발효 상청액으로부터 85％를 초과하는 것으로 확인되었다. PAGE 분석 (도 5B) 결과, 헤파로산 분자량에 있어 초기 증가가 있었으나, 발효 시간 증가에 따른 추가적인 분자량 변화는 나타나지 않았다 (도 6). 헤파로산 다분산 지수 (PDI=M_w/M_n)는 발효 전체에 걸쳐 거의 변하지 않았다.

토의

본 연구에서, 글루코스를 함유한 한정 배지 상에서 성장시킨 유가식 발효기 배양물에서 발효 상청액 중의 고 헤파로산 수율 (15 g/L)이 달성되었다. 이는 최근 보고된 글리세롤을 함유한 한정 배지 상에서 성장시킨 동일 유기체로부터의 10.2 g/L 헤파로산의 수율 (US 특허 출원 공개 번호 제2008/0032349호)에 비해 더 유리하다. 또한, 체적 생산 속도도 상기 이전의 보고에 비해 증가하였다. 나아가, 글리세롤보다 더 저렴한 탄소 공급원인 글루코스는 이 발효 공정을 더욱 경제적이게 한다. 3-L 규모로 개발된 유가식 발효 공정은 궁극적으로는 산업적 헤파로산 제조로 이어질 수 있는 더욱 큰 실험실-규모 발효를 위한 프로토타입으로서 소용될 수 있다. 공정 규모 확대 연구는 본 발명자들의 실험실에서 현재 3 L에서 750 L 작업 부피로 진행중이었고, 이는 생체공학적 헤파린 합성을 위한 출발 물질로서 공급되는 대규모 (100 메트릭 톤) 헤파로산 제조에 필요한 대략 100,000 L 작업 부피까지로의 규모 확대를 위한 기초를 제공할 것이다. 헤파로산의 생산 속도를 증가시키기 위해 발효 중의 더욱 빠른 글루코스 공급 속도 및 발효기 중의 더욱 높은 산소 수준을 사용할 수 있는 가능성에 대해 조사가 이루어지고 있다.

글루코스를 탄소 공급원으로서 함유하는 한정 배지의 사용은 발효 비용을 감소시킬 뿐 아니라 배지 복잡성을 감소시키며, 그에 따라 정제 공정을 더욱 용이하게 한다. 복합 LB 배지로부터 정제된 헤파로산은 복합 배지 성분 및 필요한 추가적 정제 단계로 인해 글루코스-함유 한정 배지로부터 정제된 헤파로산보다 순도가 더 낮았다.

배양 상청액으로부터 단리된 헤파로산은 발효 도중 배지 내로의 탈락에 의해 발생하는데, 이는 아마도 K5 리아제 및 전단력의 복합적 작용을 통해서일 것이다. 배지 내로의 헤파로산 탈락 증가는 상청액 중의 헤파로산의 수율을 증가시켜, 이어지는 하류의 정제 공정의 비용을 감소시킨다.

K5 리아제의 존재는 배지 내로의 헤파로산 캡슐의 바람직한 방출에 기여하여, 헤파로산 수율을 증가시킨다. 동시에, K5 헤파로산 리아제가 존재할 경우 쇄의 비환원 말단에 후속적 처리를 요할 수 있는 비천연성 당 잔기인 ΔUA가 발생된다. 또한, K5 헤파로산 리아제는 헤파로산의 다분산 지수를 증가시키는데, 이는 이후의 헤파린으로의 가공을 복잡하게 할 수 있다. 생체공학적 헤파린의 분자량 특성은 헤파로산의 분자량 특성과 불가피하게 연결되어 있다. 본 발명의 방법은 헤파린으로 가공하기에 적합한 특성을 가진 헤파로산을 제조한다. 따라서, 본 발명자들은 발효 조건 및 발효 공정 시간을 주의깊게 조절함으로써 리아제의 존재 하에서도 바람직한 분자량 특성을 가진 헤파로산을 제조하는 것이 가능하다는 것을 제시하였다.

K5 리아제 활성에 대한 앞으로의 조절은 헤파로산 조절에 대한 세밀한 조절에 대한 접근법을 제공할 수 있다.

2.8 L 진탕 플라스크 중의 상이한 배지로부터 회수된 헤파로산의 수평균 분자량 (M_N), 중량평균 분자량 (M_W) 및 다분산 지수 (PDI).
배지	M _N	M _W	PDI
M9	54,000	82,000	1.5
글리세롤	50,000	79,000	1.6
글루코스	25,000	44,000	1.8
LB	54,000	68,000	1.3

실시예 2: 20L 발효 보고 (pH 조절 유가식 발효)

배지

글루코스 한정 배지: (L 당) 20 g 글루코스, 20 mg 티아민, 13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄, 1.4 g MgSO₄·7H₂O, 1.7 g 시트르산, 및 10.0 mL 미량 금속 용액. 미량 금속 용액은 (5 M HCl의 L 당) 10.0 g FeSO₄·7H₂O, 2.0 g CaCl₂, 2.2 g ZnSO₄·7H₂O, 0.5 g MnSO₄·4H₂O, 1.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 및 0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O로 이루어졌다. 유가식 단계에서 사용된 공급 용액은 (L 당): 700 g 글루코스, 20 g MgSO₄·7H₂O, 47 g KH₂PO₄ 및 0.4 g 티아민으로 이루어졌다. 본 실시된 발효에 사용된 글루코스-함유 배지인 R 배지는 이하와 같이 제조되었다:

R 배지 A 부분: (NH₄)₂HPO₄, KH₂PO₄, 및 시트르산을 자기 교반 중인 약 8 리터의 물에 첨가하고, 미량 금속 용액 (100X배 스탁)을 첨가하고, pH를 6.80으로 조정한 후, 물을 첨가하여 9 리터가 되게 하였다. A 부분을 발효기 내에서 121℃에서 45분 동안 멸균하였다.

R 배지 B 부분: MgSO₄ 용액 및 글루코스 용액을 10X 스탁으로 제조하고, 오토클레이브 (autoclave)를 이용하여 110℃에서 20분 동안 개별적으로 멸균하였다 (또한 여과 멸균도 가능함).

공급 용액: 글루코스, MgSO₄·7H₂O 및 47 g KH₂PO₄를 가열 및 교반하면서 1 리터의 물에 용해시키고, 오토클레이브를 이용하여 115℃에서 20분 동안 멸균하였다. 티아민을 물에 용해시킨 후, 여과 멸균하였다.

작업 절차

제1일:

아침에 4개의 5 ml 배양 튜브 내의 상기 기재한 글루코스 합성 배지 (R 배지)에 K5 이. 콜라이 균주 (-80 ℃ 냉동기에서 저장된 것)를 접종하고, 이를 인큐베이터에서 37℃에서 220 rpm으로 진탕하면서 10시간 동안 성장시켰다. 저녁에 상기 4개의 배양물을 2.8 L 배플형 진탕 플라스크 중의 500 ml 배지로 옮겨 담고, 37℃에서 220 rpm으로 진탕하면서 10시간 동안 성장시켰다.

제2일: 발효기 pH 프로브 및 DO 프로브를 멸균하고, 성장 온도 (37℃)에서 보정하였다. 3개의 펌프를 설정하였다: 펌프 1 - pH 조정용 NH₄OH; 펌프 2 - 공급 용액; 펌프 3 - 안티폼.

R 배지 B 부분을 발효기에 첨가하여 A 부분과 혼합시키고, 여기에 상기 500 ml 시드 배양물을 접종하였다. NH₄OH를 펌핑하여 pH를 6.8로 유지시켰다. 공급 용액의 펌핑은 pH 스파이크 및 DO 스파이크가 관찰되었을 때 실시하였다. 공급 펌프는 pH가 6.8을 초과할 때 100％ 출력 (약 6.7 g 글루코스 펄스)을 제공하도록 프로그래밍되었다. 교반 속도 및/또는 공기 유속을 증가시켜 DO가 20％ 초과로 계속 유지되게 하였다. 교반 속도 및 공기 흐름을 변화시켜도 DO가 20％ 초과로 유지될 수 없는 경우에는 순수한 산소 흐름을 첨가하였다.

제3일: 배양물의 OD⁶⁰⁰ 값이 감소하기 시작할 때 발효를 중지시켰다. 배양물을 수거하고 원심분리하였다. 상청액으로부터 헤파로산을 회수하였다.

도 7에서 청색 곡선은 DO 추세 (배양물 중의 용존 산소)이다. 고밀도의 세포들이 산소를 매우 신속히 소비했기 때문에, 순수한 산소 흐름을 계속 유지했음에도 불구하고, DO는 수거 몇 시간 전에 거의 0으로 되었다. OD 600 (600 nm 광 파장에서의 배양물의 광학 밀도)이 감소하기 시작한 시점으로부터 몇 시간 후에 발효를 중지시켰다. 발효는 산소 흐름을 정지시키고, 교반을 중지시킨 후, 수거를 개시함으로써 중지되었다.

샘플링: 대략 40 ml를 취하여 600 nm에서의 광학 밀도를 측정한 후, 12,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 상청액과 이. 콜라이 세포를 분리하였다. 상청액 및 세포 펠렛을 개별적으로 냉동시켰다.

발효 샘플 분석: 건조된 세포 펠렛의 중량을 일정 등급으로 측정하여 건조 세포 중량 (DCW)을 측정하였다. 상청액 중의 헤파로산 농도는 에탄올 침전 후 NMR 정량화 방법 또는 카르바졸 검정으로 측정하였다 (문헌 [Song J-M et al. (2009) "A simple method for hyaluronic acid quantification in culture broth" Carbohydrate Polymers 78 (2009) 633-634]; [Wang Z et al (2009) Anal Biochem. 398(2):275-7]).

결과는 도 7, 8 및 9에 제시되어 있다.

이 발효 단계에서 제조된 헤파로산은 수평균 분자량이 약 58,000 Da이었고, 중량평균 분자량이 약 84,000 Da이었고, 다분산 지수 (PDI)가 약 1.4였다. 순도는 95％ 이상인 것으로 추정된다.

실시예 3: 키토산 크로마토그래피를 이용한 헤파로산 정제.

키토산은 무작위 분포된 β-(1-4)-연결 D-글루코사민으로 구성된 선형 다당류이며, N-아세틸-D-글루코사민은 헤파로산의 크로마토그래피적 정제를 위한 음이온 교환 수지의 대용품을 제공한다. 키토산 내의 아미노기 (대략 pKa 6.5)는 키토산을 양으로 하전시키고 산성 조건 하에서 가용성이 되게 하여, 음으로 하전된 헤파로산에 대한 친화도 기반 정제에 적합하게 한다. 키토산을 기반으로 하는 헤파로산의 정제는 키토산 농도 및 초기 pH에 기초하여 용이하게 조절가능하다. 게다가, 키토산은 저렴하며, 공급이 풍부한 중에 입수가능하며, 생분해성이다. 본 실시예는 발효액으로부터 직접 헤파로산의 효율적인 회수를 위한 가용성 키토산에 기반한 분리 방법을 기재한다. 이러한 키토산을 이용한 전하 중화 기반 분리는 잠재적으로 복잡한 발효 혼합물로부터 여타의 음으로 하전된 거대분자를 정제하는 데에도 사용가능하다.

7 L 에쉐리히아 콜라이 K5 발효로부터의 발효액을 7000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 세포를 제거하였다.

1. 상청액 중의 헤파로산 함량에 대한 NMR 기반 정량화를 실시하였다.

2. HCl 용액을 사용하여 상청액의 pH를 4.0으로 조정한 후, 7000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 침전된 임의의 불순물을 제거하였다.

3. 그런 다음 pH 4.0의 탈이온수 (DI water)를 이용하여 상청액을 5배 희석하였다.

4. 키토산을 1％ 아세트산 용액에 용해시켜 10 mg/ml 키토산 용액을 제조하였다. 10 mg/ml 키토산 용액을 이용하여 매 10 mg의 헤파로산에 대해 2.5 mg의 키토산을 상청액에 첨가하였다.

5. 그 후, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하여 상기 생성 용액이 적절히 혼합되게 하였다. 이어서, 혼합물을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

6. 키토산-헤파로산 고분자전해질 복합체는 침전물을 형성하는데, 이는 아래로 가라앉았으며, 이에 대해 8000 rpm에서 1시간 동안의 원심분리를 사용하여 회수하였다.

7. 이어서, 침전물을 pH 4.0의 탈이온수로 세척하고, 다시 8000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하였다.

8. 키토산은 염기성 조건 하에서 그의 양이온성 성질을 잃어버리며, 이는 정전기적 복합체의 붕괴를 초래하는데, 이는 용액 중의 유리 헤파로산과 불용성의 키토산을 일으킨다. 세척된 펠렛을 1M NaOH 용액에 넣고, 밤새 인큐베이션하여, 용액 중의 헤파로산을 회수하였다. 불용성 키토산은 여과 또는 10000 rpm에서 2시간 동안의 원심분리를 통해 제거하였다. 이 단계를 양이온 교환 단계 또는 음이온 교환 단계와 결합시켜 여타의 공정 불순물을 제거함으로써, 회수된 헤파로산에 대한 추가적 정제를 가져올 수 있다.

실시예 3A

상기 절차를 이용하여, 컬럼 모드의 DEAE 세파로스 패스트 플로우 수지, 및 이어서 4배 부피의 에탄올에 의한 침전을 이용하여 발효액으로부터 헤파로산을 정제하였다. 그런 다음, 회수된 헤파로산을 3500 MWCO 막을 이용하여 탈이온수에 대해 투석하였다. 이어서, 투석된 용액을 회전 증발기를 이용한 부피 감소 후에 동결-건조하였다.

그 후, 이를 pH 4.0의 탈이온수에 용해시켜 상기 정제된 헤파로산의 1 mg/ml 용액을 제조하였다. 1 mg/ml 용액 10 ml를 이용하고 1％ 아세트산 중의 10 mg/ml 키토산 용액을 이용하여 2-6 mg 범위의 다양한 양의 키토산을 첨가하여, 6개의 상이한 샘플을 제조하였다. 샘플들을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이들 샘플을 8000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 침전된 고분자전해질 복합체를 회수하였다. 그런 다음, 1M NaOH 용액을 pH 4.0의 탈이온수로 세척하지 않고 수득한 펠렛에 첨가하였다. 10000 rpm에서 2시간 동안 원심분리하여 불용성 키토산을 제거하였다. 그런 다음, 회수된 샘플 및 상청액을 카르바졸 검정을 이용하여 헤파로산의 존재 여부에 대해 분석하였다.

카르바졸 검정에 따르면, 1 mg/ml 헤파로산 용액 10 ml에 4 mg의 키토산을 첨가함으로써 pH 4.0에서 헤파로산에 대한 100％ 회수가 달성되었다.

실시예 3B

부가적인 실험에서, 발효후 원심분리 후에 수득한 상청액에 염산을 첨가하여 pH 4.0로 컨디셔닝하였다. 이어서, 8000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 침전된 불순물을 제거하였다. 그런 다음, 1 M NaOH 용액을 이용하여 상청액을 다시 pH 4.0로 조정하였다. 이 pH-조정된 샘플에 대한 NMR 정량화 결과, 이들 샘플에서 헤파로산의 손실이 없었던 것으로 나타났다.

이어서, pH 4.0의 탈이온수를 이용하여 이들 샘플을 5배 희석하였다. 그 후, 1％ 아세트산 중의 10 mg/ml 키토산 용액을 이용하여 샘플당 2-8 mg 범위의 키토산을 첨가하여 각각 10 ml의 6개 샘플을 제조하였다. 상기 샘플들을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이들 샘플을 8000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 침전된 고분자전해질 복합체를 회수하였다. 이어서, pH 4.0의 탈이온수로 세척하지 않고 수득한 펠렛에 1M NaOH 용액을 첨가하였다. 10000 rpm에서 2시간 동안 원심분리하여 불용성 키토산을 제거하였다. 그런 다음, 회수된 샘플 및 상청액을 카르바졸 검정을 이용하여 헤파로산의 존재 여부에 대해 분석하였다. 샘플들에 대한 카르바졸 검정 결과, 발효액으로부터 헤파로산이 대략 70％ 정제된 것으로 나타났다.

본 발명은 발효액으로부터 헤파로산을 회수하는 효율적인 정제 방법을 제공한다. 본 공정에 이용된 키토산은 저렴하며, 용이하게 입수가능하고, 생체적합성이며, 생분해성이다. 이러한 특성은, 키토산을, 효소적으로 변형되어 정맥내로 전달가능한 헤파린으로 될 수 있는 헤파로산의 정제를 위한 침전제로서 사용하기에 이상적이게 한다. 본 발명은 또한 중대한 농축 단계를 제공하는데, 그에 따라, 통상 이용되는 에탄올 침전 단계와 비교하여 본 공정에 관계된 작업 부피가 감소된다. 예를 들어, 에탄올 침전에서의 작업 부피는, 일부 경우에 발효 부피를 초과한다. 키토산의 생체적합성 및 생분해성 성질은 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC) 및 폴리(디알릴디메틸 염화암모늄)과 같은 천연에서 독성인 여타의 다양이온(polycation)에 비해 이를 훨씬 더 유리하게 만든다. 또한, 이 방법은 히알루론산과 같은 여타의 상기 다당류 및 산성 단백질 뿐만 아니라 DNA의 정제에서도 잠재성을 갖는다.

또한, 본 발명은, 생체공학적 헤파린의 개발에서 잠재적으로 사용될 수 있는 것으로서, 침전을 이용하여 발효액으로부터 박테리아 캡슐 다당류인 K5 헤파로산을 비용 효율적으로 회수하는 것을 제공한다. 본 방법은 생체적합성이고 생분해성인 천연 유래의 다양이온을 이용하여, 헤파린과 같은 정맥내로 전달되는 약물을 위한 효율적이고 안전한 정제 기술을 제공한다. 이 방법을 통해 수득되는 높은 수율은 이 방법을 농축 단계로서 이상적인 것이 되게하여 작업 부피를 감소시킨다. 이 단계의 회수 용이성 및 생체공학적 헤파린의 효소화학적 합성에서의 또 다른 단계들과의 양립가능성은 이를 정제 공정으로 사용하기에 이상적인 것으로 되게 한다. 이 방법은 박테리아 발효로부터 유래하는 여타의 음이온성 다당류 및 단백질 뿐만 아니라 DNA와 같은 고도 음전하성 화학종의 제거에 대한 잠재성을 갖는다.

Claims

(a) 주요 탄소 공급원으로서 글루코스를 갖는 한정 배지에서 이. 콜라이(E. coli) K5를 배양하는 단계;
(b) 헤파로산을 고체상에 결합시킨 이후 용리시키는 단계; 및
(c) 용리액으로부터 헤파로산을 침전시키는 단계
를 포함하는, 이. 콜라이 K5로부터 85％ 이상 순수한 헤파로산을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 배양이 회분식 성장 단계 및 유가식 성장 단계로 이루어지며, 여기서
(a) 회분식 성장 단계에 사용된 배지는 (L 당) 20 g 글루코스, 10-300 mg 티아민, 13.5 g KH₂PO₄; 4.0 g (NH₄)₂HPO₄, 1.4 g MgSO₄·7H₂O, 1.7 g 시트르산, 및 10.0 mL 미량 금속 용액을 포함하고; 여기서 미량 금속 용액은 본질적으로 (5 M HCl의 L 당) 10.0 g FeSO₄·7H₂O, 2.0 g CaCl₂, 2.2 g ZnSO₄·7H₂O, 0.5 g MnSO₄·4H₂O, 1.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 및 0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O로 이루어지고;
(b) 유가식 성장 단계에 사용된 공급 배지는 (L 당) 250-1000 g 글루코스, 20 g MgSO₄, 0.15-0.5 g 티아민, 및 임의로 47 g KH₂PO₄로 이루어지고;
(c) 보충 산소의 존재 또는 부재 하에 주입된 공기에 의해 산소가 제공되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 용존 산소가 20％로 유지되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 온도가 37℃에서 유지되고, pH가 7에서 유지되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 pH가 29％ 암모니아 용액의 첨가에 의해 유지되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 유가식 단계에서 사용된 배지가 하기 식에 의해 결정된 속도로 공급되는 것인 방법.

(상기 식에서, Ms는 탄소 공급원의 질량 유속 (g/h)이고; F는 공급 유속 (L/h)이고; S_F는 공급물 중 탄소 기질 농도 (g/L)이고; X는 세포 농도 (g/L dcw)이고; m은 특정 유지 계수 (g/g dcw/h)이고; V는 배양 부피 (L)이고; t₀은 공급 시작 시간이고; t는 처리 시간이고; μ는 특정 성장 속도 (h^-1)이고; Y_x/s는 탄소 기질에 대한 세포 수율 (g/g)임)
제2항에 있어서, 배양 상청액 L 당 12 g 초과의 헤파로산이 수득되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 헤파로산이 출발 배양물의 성장을 포함하지 않으면서 배양물 중에서 48시간 미만의 발효로 수득되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 결합 및 용리 단계가 (i) 세포의 제거; (ii) 음이온 교환 수지와 배양 상청액의 혼합 및 상청액의 제거; (iii) pH 4의 아세트산나트륨 완충액 중 50 mM 염화나트륨에 의한 수지의 세척; (iv) pH 4의 아세트산나트륨 완충액 중 1 M 염화나트륨에 의한 용리를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 결합 및 용리 단계가 세포의 제거; (i) 키토산 용액과 배양 상청액의 혼합; (ii) 키토산의 침전 및 침전물의 단리; (iii) 키토산의 세척; (iv) 1 M NaOH에 의한 헤파로산의 용리를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 용리액으로부터 헤파로산을 침전시키는 단계가 에탄올 침전을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 과산화수소에 의한 파이로젠 제거(depyrogenation) 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 수득된 헤파로산에 1％ 미만의 DNA 및 2％ 미만의 단백질이 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 헤파로산의 수평균 분자량이 58,000 Da이고, 중량평균 분자량이 84,000 Da이고, 다분산 지수 (PDI)가 1.4인 방법.
제1항에 있어서, 헤파로산이 95％ 이상 순수한 것인 방법.
제1항에 있어서, 헤파로산이 90％ 이상 순수한 것인 방법.
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