CN112791186A - 一种多糖纳米复合材料及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多糖纳米复合材料及其制备与应用,属于抗肿瘤纳米材料开发及利用领域,本发明提供的两性自组装纳米胶束包载光敏剂酞菁锌克服了酞菁锌不溶于水的缺陷,通过纳米材料本身的EPR效应进行靶向,提高了酞菁锌的肿瘤靶向性,本发明突破了酞菁锌应用于传统光疗法的限制,对B16细胞具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤纳米材料开发及利用领域,尤其涉及一种多糖纳米复合材料及其制备与应用。
背景技术
纳米材料是新兴的材料,是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料在电子设备、机械工程、环境治理、化妆品、涂料、成像以及生物医药等诸多领域得到了广泛应用。纳米材可通过被动靶向和主动靶向两种方式到达肿瘤组织。肿瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差、淋巴回流缺乏,具有渗透滞留效应,导致100 nm-2 μm的纳米粒子能穿透肿瘤的毛细血管壁(正常组织毛细管壁2-6nm),源源不断进入肿瘤组织。肿瘤细胞通过被动扩散、细胞内吞和膜蛋白等方式摄取纳米粒子,该方式为被动靶向。主动靶向是由于某些材料,如透明质酸、叶酸等具有结合细胞表面受体的能力,相较于正常组织,纳米粒子对肿瘤组织的选择性更强。
天然生物大分子材料中的肝素前体(Heparosan,HP),是大肠杆菌K5(E.coli K5)的荚膜多糖主要成分,由GlcUA与GlcNAc通过β-1,4糖苷键连接形成二糖单元,二糖单元间通过α-1,4糖苷键连接而成。目前,HP有以下几个方面的用途。第一,因HP结构类似于动物体内的肝素或硫酸乙酰肝素,通过单位点或多位点对HP进行硫酸化,制备抗凝血肝素类似物或抗炎、抗肿瘤化合物。第二,HP带负电荷且生物相容性好,是制备纳米载体不错的选择,已被广泛研究。
熊果酸是一种有机化合物,是天然三萜羧酸化合物,具有预防和抗癌活性,可作为药物、食品的乳化剂。同时熊果酸是一个较强的抗氧化剂。有实验表明熊果酸能抑制花生四烯酸代谢过程中5-脂氧化酶、环氧化酶活性,阻止前列腺素与白三烯生成,这可能是熊果酸抑制炎症反应、抑制脂质过氧化物的原因。
黑色素瘤(Melanoma)是恶性程度极高的肿瘤,具有易隐匿、进展快、易转移,病死率较高,临床预后差,生存率低等特点,曾一度被称为“癌王”。临床上通常采用手术治疗、化疗、生物治疗等方法,但均很难实现完全治愈。临床研究发现,光疗与免疫疗法、化疗、 手术切除结合治疗黑色素瘤,能达到很好的治疗效果。光疗不仅能局部靶向治疗,而且具有安全性高,病人依从性高等优点。光敏剂在光疗中至关重要。病人局部或全身给予光敏剂后,经特定波长光照射,产生单线态氧,能引起病灶部位细胞膜及细胞器膜脂质氧化,产生ROS,从而杀死肿瘤细胞。酞菁锌(ZnPc)是光敏剂的一种,其最大吸收波长位于红外区,对400-600nm的光没有强吸收,但其不溶于水,且不具有靶向性,导致在光疗中的应用受限。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中光疗法治疗肿瘤光敏反应大、靶向性弱、水溶性差等技术问题,提供一种光敏反应小、靶向性好、水溶性好的多糖纳米复合材料及其制备与应用。
本发明提供的技术方案如下:
一种多糖纳米复合材料,其特征在于,其为自组装纳米胶束(HUA)包载光敏剂得到的纳米复合材料。
优选的,所述光敏剂为酞菁锌(ZnPc)。
优选的,所述多糖纳米复合材料(HUA@ZnPc)粒径范围为100 nm-200 nm,所述ZnPc的包载率和包封率分别为0.5%-2%和40%-96%。
优选的,所述自组装纳米胶束同时具备亲水端和疏水端。
优选的,所述自组装纳米胶束原料包括多糖和熊果酸;
所述多糖为大肠杆菌E.coliK5 ATCC 23506发酵产生的肝素前体(Heparosan,HP);
所述肝素前体分子量为2 kDa -100 kDa;
所述肝素前体的结构为:L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸与D-乙酰氨基葡萄糖通过1→4糖苷键重复连接形成线性多糖骨架。
优选的,所述大肠杆菌发酵培养基的成分如下:
葡萄糖20 g、硫胺素10-300 mg、KH2PO4 13.5 g;(NH4)2HPO4,4.0 g,MgSO4•7H2O1.4 g、柠檬酸1.7 g、10.0 mL微量金属溶液;
所述微量金属溶液包括如下含量成分:FeSO4•7H2O 10.0 g,CaCl2 2.0 g,ZnSO4•7H2O 2.2 g,MnSO4•4H2O 0.5 g,CuSO4•5H2O 1.0g ,(NH 4)6Mo7O24•4H2O 0.1 g,和Na2B4O7•10H2O 0.02 g,以上含量为每升5 M盐酸中的含量;
所述培养基pH=6.8-7.0,115℃灭菌30 min。
优选的,所述肝素前体纯化方法为:
减压浓缩、截留分子量为2 kDa -100 kDa的透析、1.0%-2.0%双氧水脱色和终体积为80%乙醇醇沉;最后用阴离子交换树脂DEAE sepharose Fast Flow纯化。
优选的,所述自组装纳米胶束的制备方法包括如下步骤:熊果酸与去乙酰化后肝素前体的2位氨基酰化反应制备得到。
一种多糖纳米复合材料的制备方法,包括如下步骤:于1.5-3.5mg/mL的所述自组装纳米胶束(HUA)DMSO溶液中,加入ZnPc DMSO溶液,使得ZnPc终浓度为3-7 mg/mL,搅拌后置于3500 Da透析袋中,水透析3天,冻干即可得到目标多糖纳米复合材料(HUA@ ZnPc)。
一种多糖纳米复合材料在抗B16细胞的应用。
通过采用上述技术方案,达到的技术效果如下:
本发明提供的自组装纳米胶束包括乙酰化肝素多糖(亲水端)和熊果酸(疏水端),具有包载光敏剂ZnPc的能力,使用两性胶束包载光敏剂ZnPc,克服了酞菁锌不溶于水的缺陷,通过纳米材料本身的EPR效应进行靶向,提高了ZnPc的肿瘤靶向性,本发明突破了ZnPc应用于传统光疗法的限制,对B16细胞具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖。
附图说明
图1是Heparosan分子量测定图;
图2是Heparosan单糖组成测定HPLC图;
图3是Heparosan红外光谱测定图;
图4A是Heparosan核磁共振光谱分析1H-NMR图谱;
图4B是Heparosan核磁共振光谱分析13C-NMR图谱;
图5是HUA@ZnPc透射电镜图;
图6是HUA@ZnPc粒径测定图;
图7是HUA@ZnPc对B16细胞毒性实验结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明,应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
实施例1
大肠杆菌E.coli K5荚膜多糖Heparosan的发酵、提取、纯化以及结构鉴定。
1、E.coli K5的培养发酵
将保存的E.coli K5菌种接种至种子培养基(LB液体培养基),振荡活化过夜(37 °C,200 rpm,16-20 h)。将葡萄糖液体培养基以100 mL/瓶的体积分装至500 mL已灭菌锥形瓶中,将种子液接种至葡萄糖液体培养基中,每瓶接种1 mL。在37 °C,240 rpm条件下振荡发酵40 h,获得发酵液。
2、Heparosan的粗分离
(1)透析:收集发酵液并于4000 g离心20 min去除菌体,得到发酵液上清。将发酵液上清旋蒸浓缩至适当体积,得到浓缩液。将浓缩液装入截留分子量3500 Da的透析袋内透析24 h,去除无机盐和小分子杂质,得到粗糖溶液。
(2)过氧化氢法脱色:收集透析后的粗糖溶液并适当蒸发浓缩,用氢氧化钠溶液调整粗糖溶液的pH至9.0。然后加入30%的过氧化氢至终浓度为1.0%-2.0%,搅拌反应至溶液变为浅黄色。加入无水乙醇至终浓度为80%,4°C静置过夜,使多糖沉淀析出。
(3)三氯乙酸法除蛋白:将得到的粗糖沉淀溶于适量水中,加入三氯乙酸至终浓度为3%,并搅拌反应20 min,使蛋白质发生变性且沉淀析出。将反应液于12000 g离心30 min,保留上清并用氢氧化钠溶液调整pH至7.0。纯水透析48 h,冻干。得到淡黄色絮状粗多糖固体。
3、阴离子交换法纯化Heparosan
(1)装柱:将层析柱(5×25 cm)清洗干净,安装在铁架台上。用去离子水润洗层析柱并在柱内加入适量去离子水。将保存在20%乙醇中的DEAE Sepharose FF树脂用大量去离子水清洗,抽滤,以除尽乙醇。用去离子水重悬树脂,将树脂混悬液沿玻璃棒轻缓倒入层析柱内,打开层析柱下端开关,让液体流出,使树脂在柱内均匀、紧密的沉降。连接恒流泵控制流速,用5倍柱体积去离子水低速洗柱,再用5-10倍柱体积Buffer A平衡柱子。
(2)上样与洗脱:上样前让柱内液面与凝胶面相切,关掉开关使洗脱液停止流动。取Heparosan粗品,用去离子水配制成20 mg/mL的溶液,将溶液沿柱内壁缓缓加入。上样完成后用少量缓冲液冲洗层析柱内壁,打开恒流泵让样品溶液进入树脂内部。用Buffer A以1mL/min流速洗脱5个柱体积,将没有和凝胶结合的各种杂质除去。换用Buffer B以0.5 mL/min的流速洗脱,用部份收集器收集流出液,5 mL/管,收集100管。采用硫酸-咔唑法检测多糖。
4、Heparosan结构鉴定
(1)高效凝胶渗透色谱法测定Heparosan分子量:色谱条件为岛津LC-20A液相色谱系统;色谱柱:Shodex OHpak SB-802 HQ- OHpak SB-805 HQ;流动相:NaNO3溶液(0.1 mol/L);柱温:40 °C;流速:0.35 mL/min。结果见附图1。
(2)Heparosan单糖组成分析:采取PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化的方法测定纯化产物的单糖组成。将多糖完全酸水解成单糖,然后用PMP衍生化使单糖带有紫外吸收集团并进行HPLC分析,根据标准品的出峰时间和峰面积确定样品的单糖组成和比例。色谱条件:安捷伦1260液相色谱系统;色谱柱:Eclipse XDB-C8;流动相:磷酸盐缓冲液—乙腈(83:17);柱温:30℃;流速:1 mL/min;进样量:10 μL;检测器:紫外检测器。结果见附图2,其中图2A为对照品,图2B为样品。
(3)红外光谱分析(FT-IR):取2 mg干燥的Heparosan样品,与干燥的KBr粉末混匀,研磨压片,用傅里叶红外光谱仪在4000-400 cm-1范围内进行红外光谱扫描,记录红外光谱图。结果见附图3。
(4)核磁共振光谱分析(NMR):取20 mg干燥的Heparosan样品,用0.5 mL 重水溶解于核磁管中,用核磁共振波谱仪进行扫描,并记录1H-NMR图谱和13C-NMR图谱。结果见附图4,其中图4A为1H-NMR图谱,图4B为13C-NMR图谱。
实施例2
去乙酰化Heparosan的制备
称取1 g Heparosan 溶于100 mL 2 mol/L NaOH 中,60℃反应24 h;结束后冷却至室温,用2 mol/L HCL 调pH至7.0,用截留分子量为3500Da的透析袋透析48 h,冻干即可。
实施例3
熊果酸接枝去乙酰化Heparosan,形成组装纳米胶束HUA。
称取200 mg去乙酰化Heparosan溶于于50 mM MES 缓冲溶液中,终浓度为5 mg/mL,加入5倍酰化试剂EDCI及NHS,室温下避光搅拌60 min 之后,调节pH至7.0,加入熊果酸继续反应24 h。反应结束后,置透析袋中透析3天,冻干得HUA。
实施例4
HUA包载ZnPc,形成纳米材料HUA@ZnPc。
取200 mg HUA置于DMSO中,至终浓度2.5 mg/mL,搅拌8 h至充分溶解分散,按照重量计算,加入ZnPc DMSO溶液,使得ZnPc终浓度为5 mg/mL,继续搅拌,后置于3500 Da透析袋中,水透析3天,冻干即可得到HUA@ZnPc。HUA@ZnPc透射电镜见图5,粒径测定见图6,粒径均在200 nm左右。
实施例5
HUA包载ZnPc,形成纳米材料HUA@ZnPc。
取200 mg HUA置于DMSO中,至终浓度1.5 mg/mL,搅拌8 h至充分溶解分散,按照重量计算,加入ZnPc DMSO溶液,使得ZnPc终浓度为3 mg/mL,继续搅拌,后置于3500 Da透析袋中,水透析3天,冻干即可得到HUA@ZnPc。结果与实施例4一致,此处不再赘述。
实施例6
HUA包载ZnPc,形成纳米材料HUA@ZnPc。
取200 mg HUA置于DMSO中,至终浓度3.5mg/mL,搅拌8 h至充分溶解分散,按照重量计算,加入ZnPc DMSO溶液,使得ZnPc终浓度为7 mg/mL,继续搅拌,后置于3500 Da透析袋中,水透析3天,冻干即可得到HUA@ZnPc。结果与实施例4一致,此处不再赘述。
实施例7
MTT方法考察HUA@ZnPc对B16细胞毒性
(1)将处于对数生长期的B16细胞从细胞培养箱中取出,用2 mL胰酶消化3min,加2mL1640培养液,滴管将贴壁细胞吹打下来,1000rpm离心5 min,弃去上清,用5mL培养基重悬细胞。
(2)在显微镜下用血球计数板计数,用培养基将细胞稀释到一定溶度,180 μL/孔接种96孔板,37℃培养。
(3)细胞贴壁后,加入20μL 不同浓度HUA@ZnPc(终浓度分别为0 μg/mL,2 μg/mL,20 μg/mL,200 μg/mL),每个浓度设置三个复孔,给药作用48 h。应用808 nm光源照射细胞40 min,照射距离10 cm,同时设置ZnPc(终浓度分别为5 μg/mL,0.5 μg/mL,0.05 μg/mL)作为阳性对照,不光照组作为阴性对照。
(4)实验组每孔加入20 μL,5 mg/mL 的MTT,于37℃、5% CO2 条件下孵育4 h,吸弃上清,每组加入150 μl DMSO,震荡10 min,充分溶解甲瓒酶标仪570 nm 波长处测其OD 值,并计算细胞抑制率。结果见附图7,实验结果显示,2 μg/mL、20 μg/mL和200 μg/mL的HUA@ZnPc存在下,细胞存活率分别为92.7%、73.2%和34.5%,可见HUA@ZnPc对B16细胞有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性,2 μg/mL、20 μg/mL和200 μg/mL的HUA@ZnPc对B16细胞的抑制率分别为:7.3%、26.8%和65.5%。
上述细胞数量通过MTT法进行检测,MTT原理:MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜,用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (9)
1.一种多糖纳米复合材料,其特征在于,其为自组装纳米胶束包载光敏剂得到的纳米复合材料,所述自组装纳米胶束通过熊果酸与去乙酰化后肝素前体的2位氨基酰化反应制备得到。
2.根据权利要求1所述的多糖纳米复合材料,其特征在于,所述光敏剂为酞菁锌。
3.根据权利要求2所述的多糖纳米复合材料,其特征在于,所述多糖纳米复合材料粒径范围为100nm-200nm,所述酞菁锌的包载率和包封率分别为0.5%-2%和40%-96%。
4.根据权利要求1所述的其特征在于,所述自组装纳米胶束同时具备亲水端和疏水端。
5.根据权利要求1所述的多糖纳米复合材料,其特征在于,所述自组装纳米胶束原料包括多糖和熊果酸;
所述多糖为大肠杆菌E.coli K5 ATCC 23506发酵产生的肝素前体;
所述肝素前体分子量为2 kDa -100 kDa;
所述肝素前体的结构为:L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸与D-乙酰氨基葡萄糖通过1→4糖苷键重复连接形成线性多糖骨架。
6.根据权利要求6所述的多糖纳米复合材料,其特征在于,所述大肠杆菌发酵培养基的成分如下:
葡萄糖20 g、硫胺素10-300 mg、KH2PO4 13.5g; (NH4)2HPO4,4.0 g,MgSO4•7H2O 1.4 g、柠檬酸1.7 g、10.0 mL微量金属溶液;
所述微量金属溶液包括如下含量成分:FeSO4•7H2O 10.0 g,CaCl2 2.0g,ZnSO4•7H2O2.2g,MnSO4•4H2O 0.5g,CuSO4•5H2O 1.0g,(NH 4)6Mo7O24•4H2O 0.1g,和Na2B4O7•10H2O 0.02g,以上含量为每升5M盐酸中的含量;
所述培养基pH=6.8-7.0,115℃灭菌30 min。
7.根据权利要求6所述的多糖纳米复合材料,其特征在于,所述肝素前体纯化方法为:
减压浓缩、截留分子量为2 kDa -100 kDa的透析、1.0%-2.0%双氧水脱色和终体积为80%乙醇醇沉;最后用阴离子交换树脂DEAE sepharose Fast Flow纯化。
8.根据权利要求1-7任意一项权利要求所述的多糖纳米复合材料的制备方法,包括如下步骤:于1.5-3.5 mg/mL的所述自组装纳米胶束DMSO溶液中,加入酞菁锌DMSO溶液,使得酞菁锌终浓度为3-7 mg/mL,搅拌后置于3500 Da透析袋中,水透析3天,冻干即可得到目标多糖纳米复合材料。
9.根据权利要求1-7任意一项权利要求所述多糖纳米复合材料在抗B16细胞的应用。
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- 2021-04-14 CN CN202110397415.7A patent/CN112791186A/zh active Pending
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