CN102712942A - K5肝素前体的发酵和纯化 - Google Patents

Abstract

一种适于工业生产的、从大肠杆菌K5的发酵培养物生产肝素前体的方法，所述方法表现出较高的产量和纯度、较小的培养物体积、较快的生长和较低的成本。

Description

K5肝素前体的发酵和纯化

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年9月1日提交的美国临时专利申请第61/275,675号的优先权，上述美国临时专利申请的全部内容在此通过引用并入本文。

政府许可权利

本发明是在国家卫生研究院颁发的基金GM38060和HL096972下，由美国联邦政府支持而做出的。美国联邦政府享有本发明的一些权利。

背景技术

肝素和硫酸乙酰肝素是与血液抗凝、病毒和细菌感染、血管生成、炎症、癌症和发育有关的生物学上的重要分子。Linhardt(2003)“Heparin：structureand activity，”J Med Chem，46：255 1-2554。Linhardt RJ，Toida T.(2004)“Role ofglycosaminoglycans in cellular communication，”Acc Chem Res，37：431-438。发现肝素具有广泛的应用，包括手术、心肺氧合以及肾透析、深部静脉血栓形成的治疗和急性冠状动脉综合症的治疗。Linhardt“Heparin：an important drugenters its seventh decade.”Chem.Ind.2，45-50(1991)；Agnelli等人“Enoxaparinplus compression stockings compared with compression stockings alone in theprevention of venous thromboembolism after elective neurosurgery”N Engl J Med339(2)，80-5(1998)。肝素还被涂覆在血管表面和医疗设备的表面以形成抗凝表面，所述医疗设备例如，试管和肾透析仪器。

目前，以大约100公吨/年的量通过动物组织来制备肝素，但是这类肝素可被其他生物产品污染。Linhardt Chem.Ind.2，45-50(1991)。2008年，被过硫化的硫酸软骨素污染的肝素导致几乎100位美国人死亡。Guerrini等人“Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated withadverse clinical events.”Nature Biotechnology 26，669-675(2008)。

天然真核的肝素生物合成前体(肝素前体(heparosan))是具有图1所示的重复的二糖单元[→4)β-D-葡糖醛酸(GlcA)(1→4)N-乙酰基-α-D-葡糖胺(GlcNAc)(1→]n的多糖。

肝素前体还被生物合成为细菌中的多肽荚膜，所述细菌包括大肠杆菌K5(Escherichia coli K5)和多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multicida)。Lindahl U等人(1998)“Regulated diversity of heparan sulfate”J Biol Chem273(39)：24979-24982。据报道，K5肝素前体合成的起始涉及2-酮-3-去氧辛酮糖酸。Finke A等人(1991)“Biosynthesis of the Escherichia coli K5 polysaccharide，a representative of group II capsular polysaccharides：polymerization in vitro andcharacterization of the product”J Bacteriol 173(13)：4088-94。然后，K5肝素前体通过葡萄糖基转移酶KfiA和KfiC的交替作用而伸长，所述葡萄糖基转移酶KfiA和KfiC的交替作用将GlcNAc和GlcA加至正在生长的多糖链的非还原性末端。Hodson N等人(2000)“Identification that KfiA，a protein essential for thebiosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide，is an alpha-UDP-GlcNAc glycosyltransferase.The formation of a membrane-associated K5biosynthetic complex requires KfiA，KfiB，and KfiC.”J Biol Chem275(35)：27311-5。一旦被合成，肝素前体链通过由六种蛋白质(KpsC，KpsD，KpsE，KpsM，KpsS和KpsT)构成的途径运输至细胞表面上。McNulty C等人(2006)“The cell surface expression of group 2 capsular polysaccharides inEscherichia coli：the role of KpsD，RhsA and a multi-protein complex at the poleofthe cell”Mol Microbiol 59(3)：907-22。人们认为K5肝素前体链通过在多糖的还原性末端处对大肠杆菌外膜中的磷脂酸分子进行脂质取代而锚定在细胞表面上。Jann B，Jann K.(1990)“Structure and biosynthesis of the capsular antigensof Escherichia coli”Curr Top Microbiol Immunol 150：19-42。一部分肝素前体多糖可通过K5肝素前体裂解酶(从通过β-消除机制裂解肝素前体链的细菌噬菌体中产生的酶)的作用从大肠杆菌K5中脱落。Manzoni M等人(1996)“Production of K5 polysaccharides of different molecular weight by Escherichiacoli”Journal of Bioactive and Compatible Polymers 11(4)：301-311。Manzoni M等人(2000)“Influence of the culture conditions on extracellular lyase activityrelated to K5 polysaccharide.”Biotechnology Letters 22(1)：81-85。编码K5裂解酶的基因被整合至大肠杆菌K5DNA中并且所述基因的表达可为可诱导的。Manzoni M等人(2000).Biotechnology Letters 22(1)：81-85。K5裂解酶的活性可影响释放到培养基中的肝素前体的量并且可影响细胞相关的肝素前体的结构和分子量性质以及细胞释放的肝素前体的结构和分子量性质(图1B)。已估算了K5肝素前体的M_w为20,000并且K5肝素前体由M_w为16,000和1,500的两个主要亚成分构成。这两个亚成分的比例对应于总M_w并且受K5裂解酶的活性的影响。Vann WF等人(1981)“The structure of the capsular Polysaccharide(K5Antigen)of Urinary-Tract-Infective Escherichia-Coli 010-K5-H4-a PolymerSimilar to Desulfo-Heparin”European Journal of Biochemistry 116(2)：359-364；Manzoni(2000)Biotechnology Letters 22(1)：81-85。

实验室规模的研究已表明由大肠杆菌K5菌株得到的重均分子量(M_w)＞10,000的肝素前体可通过酶的方式转化为与肝素类似的抗凝多糖。Lindahl等人(2005)“Generation of“Neoheparin”from E coli K5 capsular polysaccharide”JMed Chem 48(2)：349-352；Zhang等人(2008)“Solution structures ofchemoenzymatically synthesized heparin and its precursors”Journal of theAmerican Chemical Society 130(39)：12998-13007。肝素前体还可用于多种应用中(WO 2009/014559)。

本发明描述了产量高的肝素前体的大肠杆菌K5的发酵方法以及适于工业生产肝素前体的有效回收高纯度的肝素前体的方法。

发明内容

本发明涉及通过大肠杆菌K5的发酵、K5多糖的分离和纯化生产肝素前体的改进的方法。

在一种实施方式中，所述方法包括(a)在具有作为初级碳源的葡萄糖的限定培养基中培养大肠杆菌K5；(b)将肝素前体与固相结合，并随后进行洗脱；以及(c)从洗出液中沉淀肝素前体。所述方法适于生产基本上纯的肝素前体，所述基本上纯的肝素前体的纯度为至少90％。

在相关实施方式中，所述方法包括两个培养阶段，即，分批生长阶段和补料分批生长阶段，其中，(a)在分批生长阶段使用的培养基包含：(每升)约20g葡萄糖、10mg至300mg硫胺、约13.5g KH₂PO₄、约4.0g(NH₄)₂HPO₄、约1.4g MgSO₄·7H₂O、约1.7g柠檬酸和约10.0mL微量金属溶液(每升)；其中，所述微量金属溶液基本上由(每升5M HCl)10.0g FeSO₄·7H₂O、2.0gCaCl₂、2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1.0g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O构成；并且，其中，(b)在补料分批生长阶段使用的饲养溶液由(每升)250g至1000g葡萄糖、约20gMgSO₄·7H₂O和0.15g至0.5g硫胺以及任选的约47g KH₂PO₄构成。

在相关实施方式中，通过喷入的空气提供氧。所述空气可补充了氧。优选地，溶解的氧保持在约20％。在一些实施方式中，使用纯氧。

在进一步相关的实施方式中，条件包括温度保持在约37℃以及pH保持在约7。pH可通过加入氨溶液或氨气来保持。在一些实施方式中，氨溶液为约25％至35％，包括约30％，例如29％。

在具体的实施方式中，在补料分批阶段使用的饲养培养基以由下述公式确定的速度供给：

$\mathrm{Ms}\left(t\right)=F\left(t\right)S_{F\left(t\right)}=(\frac{\mathrm{\μ}}{Y_{\frac{x}{g}}}+m)X\left(t_0\right)V\left(t_0\right)\exp \left[\mathrm{\μ}(t-t_0)\right]$

其中，MS为碳源的质量流速(g/h)，F为饲料流速(L/h)，S_F为饲料中的碳基质浓度(g/L)，X为细胞浓度(g/L dcw)，m为特定维持系数(g/g dcw/h)，V为培养物体积(L)，t₀为进料开始时间，t为加工时间，μ为特定生长速度(h^-1)以及Y_X/S为碳基质上的细胞产量(g/g)。

所述方法还包括结合和从培养基中洗脱肝素前体。在一种实施方式中，肝素前体从无细胞的上清液中获得。在另一实施方式中，肝素前体通过用诸如SDS(例如，1％SDS)之类的洗涤剂溶液洗涤并伴随搅拌从细胞中获得。

除去细胞之后，结合和洗脱可包括将阴离子交换树脂与培养物上清液混合以及除去上清液，用pH为4的50mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗涤树脂，用pH为4的1M氯化钠的醋酸钠缓冲液进行洗脱。

可选地，可用壳聚糖完成结合和洗脱。在一种实施方式中，所述培养物上清液与壳聚糖溶液混合，从而产生沉淀。将所述沉淀分离，用例如水或其他稀缓冲液洗涤并且用诸如约1M NaOH之类的强碱进行洗脱。除了进行阴离子交换之外，还可进行与壳聚糖的结合以及进行洗脱。

在结合和洗脱之后，用例如乙醇或甲醇从洗出液中沉淀肝素前体。在一种实施方式中，使用三体积的乙醇。通常洗涤得到的沉淀物并进行干燥。

所述方法还包括任选的去除热原的步骤，例如通过氧化进行，包括使用过氧化氢进行氧化。

本发明的方法在小体积的培养物中、在短时间段内获得具有高纯度和少量污染物的高产量的肝素前体。因此，本发明适于工业生产肝素前体。所述高产量的肝素前体可在少于60小时、少于48小时以及少于40小时(不包括发酵剂培养物的生长)的发酵过程中获得。在其他实施方式中，在分批阶段，起始培养物的体积为3L，在补料阶段操作体积为7L以及类似的比例。因此，在相关实施方式中，培养物产生至少10g/L、至少11g/L、至少12g/L、至少13g/L、至少14g/以及至少15g/L的肝素前体。基本上纯的肝素前体的纯度为至少90％、至少95％、至少97％或至少99％。在相关实施方式中，肝素前体含有小于1％DNA并且小于2％蛋白质。肝素前体适于加工成肝素。在一种实施方式中，肝素前体的数均分子量为至少10kDa、至少20kDa、至少30kDa、至少40kDa、至少50kDa或至少60kDa(例如约58kDa)；重均分子量为至少20kDa、至少30kDa、至少40kDa、至少50kDa、至少60kDa、至少70kDa、至少80kDa或至少90kDa(例如约84kDa)且多分散性指数(PDI)小于2.0，所述多分散性指数包括小于1.9、小于1.8、小于1.7、小于1.6、小于1.5、小于1.4或小于1.3，包括约1.4。

在进一步的实施方式中，本发明包括通过上述方法生产的肝素前体在药物制剂中的应用，例如医疗设备的涂层。在相关实施方式中，肝素前体用于生产肝素。相关地，本发明涉及使用通过上述方法生产的肝素前体或肝素生产药物的方法。

在进一步的实施方式中，本发明涉及由上述方法生产的肝素前体，所述肝素前体包括纯度为至少90％、至少95％以及更高的肝素前体。在相关实施方式中，本发明涉及从所述肝素前体生产的肝素。

附图说明

图1。肝素前体的结构。A.肝素前体的重复的二糖单元；B.由肝素前体K5裂解酶的作用产生的肝素前体链的结构。

图2。在摇瓶培养中制备的肝素前体的¹H-NMR光谱(600MHz)。A.从下列培养基中回收的肝素前体的堆叠曲线：1.LB培养基，2.MW_Avg＞3,000的LB培养基，3.MW_Avg＜3,000的LB培养基，并且插入图表示样品1、2、3的PAGE分析。B.从M9培养基回收的肝素前体。C.从甘油限定培养基中回收的肝素前体。D.从葡萄糖限定培养基中回收的肝素前体。

图3。在7L发酵桶中生产肝素前体。插图A显示了作为发酵时间(小时)的函数的葡萄糖进料曲线(黑色)、pH曲线(蓝色)以及溶解的氧(％DO)的曲线(红色)。插图B显示了作为发酵时间(小时)的函数的细胞生长曲线(总DCW g，▲)和肝素前体的产量(g，■)。

图4。从7L发酵上清液中纯化的肝素前体的表征。A.肝素前体的¹H-NMR(600MHz)。B.在含有¹³C葡萄糖和¹⁵N硫酸氨的M9培养基上制备的肝素前体的¹³C-NMR。C.通过制备性PAGE纯化的平均分子量为4551.81(聚合度＝24)的肝素前体链的FT-MS(Ly等人，2010)。

图5。由阿尔新(Alcian)蓝染色的用于肝素前体的MW分析的PAGE。A.覆盖梯度凝胶的范围的分子标准。泳道包含：1.HA分子标记物(30kD至310kD)，2.肝素前体分子标记物(6.4kD至14.1kD)。B.在不同培养基的摇瓶中制备的肝素前体。泳道包括：1.M9培养基中的肝素前体，2.甘油合成的培养基中的肝素前体，3.葡萄糖合成的培养基中的肝素前体，以及4.LB培养基中的肝素前体。C.在不同时间抽样的7L发酵桶中制备的肝素前体。泳道包括：在发酵开始之后4.5小时、12.6小时、14.5小时、20小时、32.9小时和37.6小时从发酵桶中抽样的1至6号肝素前体。

图6。在7L发酵桶中生成的肝素前体的分子量性质的时间过程。显示了M_N(■)、M_W(●)和PDI(◆)的趋势。

图7。在20L发酵桶中的作为发酵时间(h)的函数的溶解的氧(％DO)的曲线(◆)和pH的曲线(■)。

图8。在20L发酵桶中，细胞生长曲线(DCW g/L，(■))和发酵上清液中的肝素前体浓度(g/L，(◆))的时间过程。

图9。纯化的肝素前体样品的¹H-NMR光谱。

图10。使用不同量的壳聚糖从10ml的1mg/ml纯肝素前体溶液中沉淀后的上清液中的肝素前体的浓度。

图11。使用不同量的壳聚糖从10ml的1mg/ml纯肝素前体溶液中回收的百分数。

图12。使用不同量的壳聚糖从10ml的5倍稀释的发酵肉汤样品中回收的百分数。

具体实施方式

定义

肝素前体是具有重复的二糖单元[GlcAα-(1-4)GlcNAcR(1-4)]_n的多糖。因为K5表多糖由肝素前体生成，本发明的发明人分离并纯化所述肝素前体，所以“肝素前体”在一定程度上可指与细菌有关的、存在于培养基中的以及分离和纯化过程中的肝素前体。肝素前体的含义可被相关领域的普通技术人员所理解。

大肠杆菌K5表示产生K5表多糖的大肠杆菌变体。合适的大肠杆菌K5菌株可从诸如ATCC(美国典型培养物保藏中心，USA)之类的公共保藏中心获得，例如，大肠杆菌菌株ATCC23506。大肠杆菌K5菌株还可从临床来源中分离和/或从基因方面进行修饰。

本文使用的“发酵”是指细菌生长和表多糖的产生，具体而言是K5表多糖的产生。

本文使用的“分离的”是指从培养基和细菌细胞中分离肝素前体，并且肝素前体以足以使其得以识别或使用的量存在。

本文使用的“基本上纯的”是指肝素前体以在其期望的用途中实用以及适于其期望的用途的程度上基本上不含其它物质。基本上纯的肝素前体的纯度为至少90％。优选地，大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或甚至大于99％的该材料不含污染物。纯度可通过本领域已知的方式来评估。

本文使用的不指明具体数目的“a”或“an”是指一个(一种)或一个(一种)以上，除非特别指明是指仅仅一个(一种)。

术语“约”如本领域技术人员所理解的在上下文中使用，在上下文中术语“约”修饰所指明的术语。对于数值而言，“约”可被认为包括所述值正负10％的变量。

对大肠杆菌K5进行发酵用于生产肝素前体

在确定合适的发酵条件方面，必须考虑许多因素。

总体而言，大肠杆菌可在多种培养基中以及在一系列pH、温度、O₂和其他条件下生长。然而，不像实验室改良菌株那样，已不对大肠杆菌K5进行遗传学、生长以及功能方面的广泛研究。

生长条件的改变可影响(a)细菌生长的速度，(b)最大细胞密度，(c)K5表多糖荚膜的生成，(d)大肠杆菌K5、存留在大肠杆菌K5中的噬菌体以及其他因子对K5荚膜的修饰程度，(e)K5表多糖荚膜向培养基中的释放，(f)生成的肝素前体多糖的尺寸范围是否为适于加工成肝素，以及(g)污染物的量和类型。例如，促进细胞裂解的条件可增加培养物上清液中的K5表多糖的产量，但是还可增加K5表多糖荚膜的降解以及上清液中的污染物的数量。

任何一种污染物的重要性与通过随后的纯化和加工步骤除去所述污染物的难易程度相关，不论所述污染物是否干扰随后将肝素前体加工成肝素以及所述污染物是否对人体或动物体造成危害。大肠杆菌K5是一种已知的病原体，因此，必须除去毒素和其他毒性相关因子。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌提取物的常见污染物并且已知脂多糖是强效的免疫刺激剂和毒素。核酸也可为免疫刺激的。LPS和核酸这两者均具有多糖核心，因此，可与肝素前体共纯化。其他污染物可包括非肝素前体多糖或肝素前体的衍生物。

对于生产药物和医疗产品而言，生长培养基的来源和性质可以是重要的。例如，通过动物蛋白或植物蛋白的水解得到的复合培养基对于大肠杆菌K5的生长和生产而言是非常好的，但是在批次之间表现出变化并且可含有抗原和其他污染物。

对于以工业规模生产肝素前体而言，必须考虑额外的因素，包括发酵的培养物体积、发酵时间和发酵温度。因此，较小体积的培养基和较快的生长条件是理想的。同样，生长培养基的确认也是有关系的，所述生长培养基使用广泛易获得的、标准的且廉价的起始原料。

生长条件也必须被证明是规模可改变的。因此，5ml培养物中的最优条件的确认也必须在较大的规模中予以证实，例如5L、20L、100L以及更大规模。相关地，加工应当是稳固的且可重复的，因此，所述加工不易受条件的细微变化的影响。

根据上述内容，适于肝素前体的工业生产条件的确认是非常重要的。本发明的发明人已确认了大肠杆菌K5的合适的生长条件和培养条件以促进肝素前体的生产、分离和纯化，所述生长条件和培养条件适于工业生产。

培养基为具有作为碳源的葡萄糖的限定培养基，所述培养基随生长阶段而变化。用于分批生长的培养基的组成如下：(每升)约20g葡萄糖、10mg至300mg硫胺、约13.5g KH₂PO₄、约4.0g(NH₄)₂HPO₄、约1.4g MgSO₄·7H₂O、约1.7g柠檬酸以及约10.0mL微量金属溶液。所述微量金属溶液由(每升5MHCl)10.0g FeSO₄·7H₂O、2.0g CaCl₂、2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1.0g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O以及0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O构成。在补料分批培养的过程中的饲养溶液由(每L)250g至1000g葡萄糖、20gMgSO₄·7H₂O和0.15g至0.5g硫胺构成，并且可进一步补充47g KH₂PO₄。在一些实施方式中，所述饲养溶液为700g葡萄糖、20g MgSO₄·7H₂O和0.2g硫胺。在另一实施方式中，所述饲养溶液为700g葡萄糖、20g MgSO₄·7H₂O、47gKH₂PO₄和0.4g硫胺。

种子培养物由37℃下在锥形瓶中过夜生长的大肠杆菌K5菌株来制备。然后，将所述种子培养物接种至发酵桶中。在发酵桶中的发酵由下述两个阶段构成：分批生长阶段和利用指数补料和DO-stat补料策略的组合的阶段。所述分批生长阶段在将种子培养物接种至发酵桶中之后开始。温度保持在约37℃并且当pH下降时，通过加入NH₄OH使pH保持在6至8。

第二发酵阶段在溶解的氧表现出急剧增加并且培养基中的葡萄糖被耗尽之后开始。葡萄糖的进料速度通常根据下述公式来计算，但具有灵活性。

$M_s\left(t\right)=F\left(t\right)S_F\left(t\right)=(\frac{\mathrm{\μ}}{Y_{X/S}}+m)X\left(t\right)V\left(t\right)=(\frac{\mathrm{\μ}}{Y_{X/S}}+m)X\left(t_0\right)V\left(t_0\right)\exp \left[\mathrm{\μ}(t-t_0)\right]$

其中：Ms为碳源的质量流速(g/h)，F为饲料流速(l/h)，SF为饲料中的碳基质浓度(g/l)，X为细胞浓度(g/l dcw)，m为特定维持系数(g/g dcw/h)，V为培养物体积(l)，t₀为进料开始时间，t为加工时间，μ为特定生长速度(l/h)以及YX/S为碳基质上的细胞产量(g/g)。

在整个进料过程中，μ设定为0.1至0.4。

在一些实施方式中，在进料过程中可具有暂停点作为检查点以确保葡萄糖没有过量供给以及培养基中的诸如醋酸盐之类的有毒物质较少。在这些检查点中，在观察到溶解的氧的浓度急剧增加之后重新开始进料，溶解的氧的浓度急剧增加表示培养基中的葡萄糖耗尽。在较大规模生产中，这些观察结果通过探针连续产生或通过在发酵过程中进行自动采样和分析而连续产生。

发酵通常是连续的直至观察到细胞密度不增加。然后停止进料并且持续搅拌发酵桶30分钟至60分钟或更长时间以从细胞表面剪切更多的荚膜K5多糖进入培养基中。

从发酵培养物中获得的肝素前体的纯化

在一种示例性的实施方式中，肝素前体的纯化可包括(a)制备培养物上清液或滤液的步骤，(b)将肝素前体与固相(例如树脂)结合以及从所述固相上洗脱肝素前体，(c)用乙醇沉淀，以及(d)去除热原。可加入额外的结合、沉淀和去除热原步骤。

在步骤(a)中，对培养物进行离心或过滤以将细胞小粒与上清液分离。福尔马林或其他药剂可加入培养物中以灭活细菌细胞。通常从上清液中回收肝素前体，但是还可通过洗涤细胞，随后进行颗粒化并从上清液中提取肝素前体来回收肝素前体，所述洗涤包括用诸如十二烷基硫酸钠之类的洗涤剂进行洗涤以及通过机械搅拌来进行洗涤。

在步骤(b)中，肝素前体与固相结合，所述固相优先结合肝素前体。例如，将诸如阴离子交换树脂之类的树脂加至通过步骤(a)得到的上清液中。搅拌混合物以使上清液中的肝素前体结合至树脂上。然后，过滤所述混合物，从而将树脂与溶液分离。然后，洗涤分离的固体以冲洗掉未结合的污染物，并进行洗脱。

对于阴离子交换树脂而言，这可包括用低盐浓度溶液洗涤以冲洗掉未结合的污染物，并用1M至2M的氯化钠溶液进行洗脱。还可用壳聚糖来结合肝素前体。而壳聚糖可作为溶液加入，因此，没有“固相”，所述壳聚糖沉淀出来，从而将肝素前体从上清液中带出。类似地，肝素前体可流过合适的含有固相的柱，并进行洗涤和洗脱。

在步骤(c)中，通过步骤(b)得到的肝素前体洗出液例如通过加入1体积至5体积的乙醇或甲醇而被沉淀。该步骤不仅仅浓缩肝素前体，还选择性地除去污染物。然后，通过离心和用50％至80％的乙醇洗涤来分离沉淀物。

在步骤(d)中，将沉淀物溶于水中，并且进行去除热原步骤以对剩余的脂多糖和其他污染物进行灭活。这通常通过诸如过氧化氢之类的氧化剂来进行，但是其他过氧化物或漂白剂是已知的。如上所述，再次沉淀得到的肝素前体并进行干燥。

分析

对得到的肝素前体进行分析以确定产量、纯度和进行进一步加工的适合性。可使用多种分析工具。

二糖组合物可在肝素前体部分消化之后用高效液相色谱(HPLC)-电喷雾电离(ESI)-质谱(MS)来分析。Bhattacharyya S等人(2010)“Cell-bound IL-8increases in bronchial epithelial cells after arylsulfatase B silencing due tosequestration with chondroitin-4-sulfate，”Am J Respir Cell and Molec Biol 42，51-61。¹H-NMR和¹³C-NMR也可用于未消化的肝素前体并且适于测定肝素前体的浓度和纯度。Wang Z，Zhang Z，McCallum SA，Linhardt RJ.2009.Nuclearmagnetic resonance quantification for monitoring heparosan K5 capsularpolysaccharide production.Anal Biochem.398(2)：275-7。肝素前体还可用如Bitter T，Muir HM(1962)在Analytical Biochemistry 4(4)：330中发表的“AModified Uronic Acid Carbazole Reaction”中所报道的咔唑分析来测定。

DNA含量可通过UV吸光度测定。蛋白质含量可根据厂商的说明，用已知的试剂盒(例如Micro BCA蛋白质分析试剂盒)进行测定。

纯化的肝素前体的分子量曲线通过与肝素前体或透明质酸的已知的分子量阶梯比较来测定并且所述纯化的肝素前体的分子量曲线用于计算平均分子量、数均分子量和分子量分布。

热原含量可通过鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)分析进行测定。

本发明可通过参考下列实施例来进一步理解，提供所述实施例来举例说明本发明的一些实施方式，但是无意限定本发明。本领域普通技术人员可理解的是，可对本发明作出改变但不背离本发明的实质。

实施例

实施例1

原料

从Applikon(斯希丹，荷兰)得到的7L玻璃可加热加压生物反应器被用作发酵桶。BioXpert V1.5软件用于控制发酵桶运转以及收集数据。Difco^TM LB肉汤粉末购于BD(Franklin Lakes，NJ)。用于制备合成的培养基的大多数化学品来自Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)。阻沫204来自Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)。振荡培养瓶来自Corning(Corning，NY)。来自GE Healthcare(Piscataway，NJ)的DEAE琼脂糖快速流动(Sepharose Fast Flow)用于纯化肝素前体。Vivapure D Mini H离心柱来自Sartorius Stedim Biotech(Aubagne，法国)。Micro BCA蛋白质分析试剂盒来自Thermo Scientific(罗克福德，IL)。用于消化肝素前体以进行二糖分析的酶如Han等人(2009)在J Biol Chem284(49)：34019-27中发表的“Structural snapshots of heparin depolymerization byheparin lyase I”中所描述的在我们的实验室中进行表达和纯化。HPLC-MS在Agilent 1100仪器(Santa Clara，加利福尼亚)上进行。TLC硅胶板来自EMD(Gibbstown，NJ)。用于制备肝素前体MW阶梯和测定肝素前体的M_w的原料在Ly M等人(2010)在Anal Bioanal Chem(DOI：10.1007/s00216-010-3679-7)中发表的“Analysis of E.coli K5 capsular polysaccharide heparosan”中详细描述。Select_HA^TM LoLadder(一系列透明质烷分子标记物)从Hyalose(俄克拉荷马市，OK)获得。

2.8L摇瓶中大肠杆菌K5的生长

来自美国典型培养物保藏中心的大肠杆菌K5(ATCC#23506)与25％甘油一同冷冻存放于1mL M9培养基、LB培养基、甘油培养基和葡萄糖培养基中，将0.5mL解冻的大肠杆菌接种于含有25mL相同培养基的250mL摇瓶中。在指数生长晚期，在约1.1g干细胞重量(DCW)/L M9培养基培养物、5.4gDCW/L甘油合成培养基、5.6g DCW/L葡萄糖合成培养基以及1.9g DCW/LLB培养基的条件下收获培养物。接着，使大肠杆菌K5培养物(300mL)在2.8L摇瓶中生长，所述摇瓶接种了5vol％指数生长晚期的细胞。所述大肠杆菌K5培养物在220RPM和37℃的条件下振荡直至生长达到静止期后1小时至4小时，然后，收获培养物用于回收肝素前体。在2.8L摇瓶发酵中使用的培养基包括：1.LB培养基：Difco^TM LB肉汤(Lennox)20g/L。2.M9培养基：2g/L葡萄糖、0.12g/L MgSO₄、0.011g/L CaCl₂、0.337g/L硫胺-HCl、6g/L Na₂HPO₄、3g/LKH₂PO₄、0.5g/L NaCl、1g/L NH₄Cl。3.甘油限定培养基：20g/L甘油、20mg/L硫胺、13.5g KH₂PO₄、4.0g(NH₄)₂HPO₄、1.4g MgSO₄·7H₂O、1.7g柠檬酸和10.0mL微量金属溶液。微量金属溶液由(每升5M HCl)10.0g FeSO₄·7H₂O、2.0g CaCl₂，2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1.0g CuSO₄·5H₂O，0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O以及0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O构成(Wang FL，Lee SY(1998)“High cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli for theproduction of poly(3-hydroxybutyrate)in a defined medium”Biotechnology andBioengineering 58(2-3)：325-328)。4.葡萄糖限定培养基：每升20g葡萄糖、20mg硫胺、13.5g KH₂PO₄、4.0g(NH₄)₂HPO₄、1.4g MgSO₄·7H₂O、1.7g柠檬酸和10.0mL微量金属溶液。微量金属溶液由(每升5M HCl)10.0gFeSO₄·7H₂O、2.0g CaCl₂，2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1.0gCuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O以及0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O构成(同上，Wang和Lee(1998))。

7L发酵桶中大肠杆菌K5的生长

该发酵由分批生长阶段和补料分批生长阶段构成。用于发酵中的分批生长的培养基的组成为：(每升)20g葡萄糖、20mg硫胺、13.5g KH₂PO₄、4.0g(NH₄)₂HPO₄、1.4g MgSO₄·7H₂O、1.7g柠檬酸和10.0mL微量金属溶液。微量金属溶液由(每升5M HCl)10.0g FeSO₄·7H₂O、2.0g CaCl₂、2.2gZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1.0g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O以及0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O构成。在补料分批阶段使用的饲养溶液由(每升)700g葡萄糖、20g MgSO₄·7H₂O和0.2g硫胺构成。同上，Wang和Lee(1998)。

分批生长阶段以接种指数生长晚期从摇瓶中获得的种子培养物(300mL，5.6g/L DCW)开始。温度保持在约37℃并且pH保持在约7(通过加入29％氨溶液)。使空气喷入发酵桶中以提供氧并且将搅拌速度设定为520RPM。

发酵的第二阶段在分批生长培养基中的葡萄糖已被耗尽并且溶解的氧表现出急剧增加之后开始。然后根据下面方程1以指数的方式供给饲养溶液：

$\mathrm{Ms}\left(t\right)=F\left(t\right)S_{F\left(t\right)}=(\frac{\mathrm{\μ}}{Y_{\frac{x}{g}}}+m)X\left(t_0\right)V\left(t_0\right)\exp \left[\mathrm{\μ}(t-t_0)\right]---\left(1\right)$

Ms为碳源的质量流速(g/h)，F为饲料流速(L/h)，S_F为饲料中的碳基质浓度(g/L)，X为细胞浓度(g/L dcw)，m为特定维持系数(g/g dcw/h)，V为培养物体积(L)，t₀为进料开始时间，t为加工时间，μ为特定生长速度(h^-1)以及Y_X/S为碳基质上的细胞产量(g/g)(Lee SY.1996.“High cell-densityculture of Escherichia coli”.Trends Biotechnol 14(3)：98-105)。0.10h^-1至0.15h^-1的μ值被用于该研究中以使得足够的细胞得以繁殖同时避免由于较高的生长速度而引起的毒性副产物的累积。连接至发酵桶的“酸泵”用于实现葡萄糖进料功能而不是添加真正的酸，并且碱泵用于添加29％的氨溶液以维持稳定的pH并且向培养物提供氮源。当泡沫超过了由反馈回路通过发酵桶的数字控制单元控制的设定水平时，第三泵用于将阻沫204试剂添加至培养物中。葡萄糖进料速度通过对一分钟内的“酸泵”开关时间进行编程来实现。在经过7小时至24小时的发酵时间条件下，使用公式T_on＝0.72*exp[0.0023*(t-420)]，其中，T_on为“酸泵”在一分钟的时间段内开启1秒的时间。一旦观察到氧限度，就在24小时后降低葡萄糖进料速度。pH控制通过手动使用碱泵添加29％的氢氧化铵溶液来实现。pH通过使用写入BioXpert V1.5软件中的定制程序被更加严格地控制。当溶解的氧降低至低于20％空气饱和度时，增加搅拌速度和/或气流速度。将纯氧与空气混合以在24小时的发酵时间之后提供足够的溶解氧。葡萄糖进料被定期地暂停以确保细胞消耗了全部葡萄糖并且在培养基中没有合成毒性副产物(例如醋酸盐)。在观察到溶解的氧的峰值(spike)之后重新开始进料，观察到溶解的氧的峰值说明葡萄糖被耗尽并且形成了毒性副产物。Johnston WA等人(2003)“Tracking the acetate threshold using DO-transientcontrol during medium and high cell density cultivation of recombinantEscherichia coli in complex media”Biotechnol Bioeng 84(3)：314-23。定期从发酵桶中收集样品。使采集的样品以12,000x g的速度离心30分钟，从而将大肠杆菌细胞与上清液分离。

发酵上清液中的肝素前体浓度的测定

发酵上清液中的肝素前体的浓度通过咔唑分析和NMR分析来测定。在肝素前体的咔唑分析中，将通过离心回收的0.5mL发酵上清液施加于MilliporeYM-3脱盐离心柱(1200x g)上以除去盐和小分子。回收并冷冻干燥含有粗肝素前体的保留物。将干燥的粗肝素前体复溶于0.5mL蒸馏水中并且进行咔唑分析。肝素前体的浓度通过使用纯肝素前体绘制的标准曲线来计算。在NMR分析中，类似地，将从培养物上清液中回收的肝素前体(1mL)冷冻干燥，然后溶解于400μL含有71μg对苯二甲酸钠(内标)的D₂O中，然后转移至NMR管中以在600MHz进行¹H-NMR。肝素前体的浓度通过肝素前体中N-乙酰基基团的积分区域与内标的积分区域的比值进行计算。

在发酵过程中快速回收肝素前体样品用于分析

从发酵上清液中快速回收肝素前体并使用Vivapure D Mini H离心柱进行部分纯化。将通过离心(12,000x g)从细胞回收的上清液(1mL)与1mL缓冲液A(50mM氯化钠、20mM醋酸钠，pH为4)混合。然后将混合物调节至pH为4并上样至预平衡的Vivapure D Mini H柱上。然后，用缓冲液A洗涤所述柱并用缓冲液B(1M氯化钠、20mM醋酸钠、pH为4)洗脱所述柱。然后用3体积的乙醇沉淀洗脱的样品，在-20℃(在防爆冰箱中)过夜保持，并且用75％乙醇洗涤得到的沉淀，将洗涤后的沉淀溶于水并冷冻干燥。然后通过¹H-NMR检测回收的样品的纯度。

肝素前体的纯化

在发酵(在摇瓶中或在7L发酵桶中)完成时，通过以12,000x g的速度对培养物进行离心持续30分钟回收肝素前体。获得的上清液通过加入冰醋酸调节至pH为4，然后通过具有多孔圆盘(孔径40μm至60μm)的Pyrex布氏漏斗过滤。将DEAE-琼脂糖快速流动树脂装入合适尺寸(＜20mg肝素前体/mL膨胀的树脂)的柱中。首先用pH为4的50mM氯化钠-20mM醋酸钠缓冲液使所述柱平衡。然后，将发酵上清液上样至所述柱上并用3体积pH为4的、50mM氯化钠-20mM醋酸钠缓冲液洗涤所述柱。然后用pH为4的、1M氯化钠-20mM醋酸钠缓冲液从所述柱上洗脱肝素前体。从所述柱上洗脱的肝素前体通过加入3体积的乙醇并过夜储存于-20℃下的防爆冰箱中进行沉淀。沉淀物通过以12,000g的速度离心30分钟回收。用75％乙醇洗涤小粒，再次对小粒进行离心并且将所获得的小粒冷冻干燥用于储存或将小粒直接用于漂白步骤。肝素前体还可通过添加0.02％SDS，接着强力搅拌、离心并且进行DEAE层析从细胞小粒中纯化。

在漂白步骤中，首先以约15g/L的浓度将肝素前体溶于1M氯化钠中。用1M NaOH将溶液的pH调节至9.5并且添加过氧化氢(30％)以获得1.5％的最终浓度。在室温下孵育混合物过夜，过夜孵育之后，通过加入3体积的乙醇沉淀肝素前体，并在-20℃(在防爆冰箱中)过夜。用75％乙醇洗涤得到的小粒，将小粒溶于水并干燥。

肝素前体的二糖分析

将肝素前体(10mg/mL)溶于pH为7的200mM磷酸钠缓冲液中并且用1mU的肝素裂解酶1、2、3中的每一个在30℃条件下过夜处理。在Agilent离子阱仪器上对得到的二糖产物进行高效液相色谱(HPLC)-电喷雾电离(ESI)-质谱(MS)分析，并且测定二糖的组成。LC-MS分析在LC-MS系统(LC/MSD阱MS；Agilent，圣克拉拉，CA)上进行。用于高压液相色谱的溶液A和溶液B分别为15％的乙腈和65％的乙腈，所述溶液A和溶液B均含有浓度为37.5mM的NH₄HCO₃和浓度为11.25mM的三丁基胺。在C-18柱(Agilent)上如下进行分离：使用溶液A持续20分钟，然后从20分钟至45分钟使用线性梯度为0％至50％的溶液B进行分离。所述柱的流出物进入电喷雾电离质谱(ESI-MS)源，用于通过MS进行连续检测。电喷雾界面被设置为撇取器电压为400V、毛细管出口为240.0V并且源温度为325℃的负离子化模式以在全扫描谱(150Da至1,500Da，10全扫描/s)中获得最大离子丰度。氮被用作干燥气体(5升/分钟)和喷雾气体(20psi)。Bhattacharyya S，Am JRespir Cell and Molec Biol 42，51-61。

肝素前体的NMR分析

在Bruker 600MHz NMR光谱仪上进行¹H-NMR和¹³C-NMR。将肝素前体样品制备成在D₂O(99.99+原子％)中的浓度为2mg/mL，进行冷冻干燥以除去可交换的质子并再次溶于D₂O中且转移至标准5mm NMR管中。光谱的获得使用TOPSPIN 2.0软件实现。所有光谱在温度为298K条件下获得。

DNA和蛋白质含量的分析

最终肝素前体产物中的DNA含量通过测量0.1mg/mL肝素前体溶液在260nm和320nm处的UV吸光度来测定。DNA浓度通过浓度(μg/mL)＝(A₂₆₀读数-A₃₂₀读数)×稀释因子×50μg/mL来计算。蛋白质含量使用Micro BCA蛋白质分析试剂盒，根据厂商的说明来测定。

肝素前体的分子量的分析

已知分子量的肝素前体标准的阶梯使用Mini Prep Cell(Biorad，Hercules，CA)设备，通过连续制备性聚丙烯酰胺电泳从漂白的K5肝素前体多糖中制备(Ly等人，2010)。肝素前体片段由傅里叶变换质谱(FT-MS)表征并被重新混合以制备分子量标准阶梯用于测定肝素前体的分子量性质(Ly等人，2010)。透明质烷(HA)的分子标记物用作样品的上限范围的标准，所述分子标记物也是具有与N-乙酰基肝素前体相同的电荷密度的线性多糖。

HA和肝素前体分子标记物均用作肝素前体的分子量分析的一系列标准，所述肝素前体在不同的发酵时间点和不同的培养基中制备。尺寸为0.75mm x6.8cm x 8.6cm的梯度聚丙烯酰胺凝胶(4％至15％)用于肝素前体分子量分析。将肝素前体样品(25μg)上样至凝胶上，然后进行电泳(200V持续20分钟)并且用阿尔新蓝染色1小时，接着用25％乙醇/10％醋酸进行脱色(Ly等人，2010)。对所述凝胶进行扫描并且使用电脑软件UN-SCANIT对数码图像进行分析。获得作为迁移距离的函数的图像密度图。根据这些数据，从获得的标准曲线表征肝素前体样品的分子量性质。

结果

在摇瓶中进行大肠杆菌K5发酵用于制备肝素前体

大肠杆菌K5在摇瓶中生长直至达到静止期之后1小时至4小时。发酵被延长超过静止期，从而在培养基中积累最大量的肝素前体，这与所报道(ManzoniM等人(1993)Journal of Bioactive and Compatible Polymers 8(3)：251-257)的培养基中肝素前体的出现落后于细胞生长一致。摇瓶培养物中的肝素前体的产量为70mg/L至500mg/L。如通过NMR估算的，从摇瓶培养物中回收的肝素前体的纯度在所有情况下＞85％(Wang Z等人(2009)Anal Biochem.398(2)：275-7.Zhang ZQ等人(2008)“Solution structures of chemoenzymatically synthesizedheparin and its precursors”Journal of the American Chemical Society130(39)：12998-13007)。从包括M9培养基、葡萄糖培养基和甘油培养基在内的合成的培养基中回收的肝素前体表现出比从LB培养基中回收的肝素前体更高的纯度水平(＞95％)，从LB培养基中回收的肝素前体在NMR中表现出额外的峰，与纯度为约85％一致(图2)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对来源于LB培养基的肝素前体的进一步分析显示出低Mw条带，这对应于与肝素前体共纯化的培养基成分。该杂质可使用3K截留分子量(MWCO)离心柱除去(图2A)。

在肝素裂解酶1、2和3完全消化之后，通过HPLC-MS(未显示)测定肝素前体的二糖组成并且肝素前体的二糖组成显示出存在m/z为378.2的单个二糖。该二糖对应于ΔUA(1→4)-α-D-GlcNAc，这与肝素前体的统一的重复结构(→4)-β-D-GlcA(1→4)-α-D-GlcNAc(1→)一致。为了证实该结构，¹³C和¹⁵N标记的肝素前体通过在含有统一标记的¹³C葡萄糖和¹⁵N氯化铵的M9培养基中培养大肠杆菌K5来制备。回收的统一标记¹³C和¹⁵N的肝素前体的结构通过用肝素裂解酶1、2和3完全消化，接着进行HPLC-MS来确认，所述结构显示出m/z为392.9的单个二糖。m/z 378.2与392.9之间15amu的差异与肝素前体的全部¹³C和¹⁵N同位素浓缩一致并且证实了肝素前体的重复结构。

在7L发酵桶中进行大肠杆菌K5发酵

使进料速度成指数地增加，从而与大肠杆菌的指数生长保持一致。在进料阶段作出几次暂停以确保在培养基中没有产生葡萄糖，所述葡萄糖可导致醋酸盐积累并抑制大肠杆菌生长。所述进料仅仅在观察到溶解的氧增加之后重新开始，观察到溶解的氧增加证实葡萄糖耗尽(图3)。在发酵的晚期阶段(22小时之后)，溶解的氧变为限制性的。增强搅拌和引入纯氧用于使培养物中的溶解的氧的浓度最大化。虽然进行了这些努力，但是31小时之后溶解的氧的水平仍然保持在相当低的水平。当氧变为限制性营养物时，葡萄糖的进料速度降低。在整个发酵过程中，pH通过加入NH₄OH保持在6至8。发酵37.5小时之后，细胞密度达到85g DCW/L，并且发酵上清液中的肝素前体浓度测定为15g/L。总生长速度计算为0.12h^-1，总生成速度为1.2g/h，并且体积生成速度为0.4g/L.h。从发酵中纯化的肝素前体具有高纯度，这是通过¹H-NMR光谱(图4A)判断的。此外，DNA和BCA蛋白质分析表明＜1％DNA和＜2％蛋白质存在于最终肝素前体原料中。

肝素前体的结构表征

¹H-NMR、¹³C-NMR、HPLC-MS和傅里叶变换(FT)-MS(图4)均确认了肝素前体的大体结构为→4)-β-D-GlcA(1→4)-α-D-GlcNAc(1→(图1A)。使用制备性电泳获得的聚合度(dp)为24的肝素前体片段的FT-MS在图4C中显示。该光谱也说明了在一些多糖链的非还原性末端存在不饱和的糖醛酸酯ΔUA残基(图1B)。末端ΔUA残基的存在与也存在于大肠杆菌菌株K5中的K5肝素前体裂解酶的作用一致，FT-MS分析说明从发酵上清液中回收的肝素前体含有末端为ΔUA残基的肝素前体和末端为GlcA残基的肝素前体的混合物。该结果与下述内容一致：培养基中的一些肝素前体通过剪切作用力从细胞表面脱落以及一些肝素前体通过肝素前体裂解酶消化作用被释放进入培养基中。从上清液中分离的肝素前体用β-葡萄糖苷酸酶处理，该β-葡萄糖苷酸酶为一种能够从肝素前体链的非还原性末端除去GlcA但不除去DUA的外溶解(exolytic)酶。使用薄层层析法(数据未显示)观察到释放的GlcA证实了脱落进入上清液中的一些肝素前体链的末端为GlcA。

肝素前体的MW表征

从在摇瓶中生长的大肠杆菌K5中回收的肝素前体通过与纯化的肝素前体标准的阶梯比较的PAGE进行分析(图5和表1)。从在M9培养基、甘油合成培养基、LB复合培养基上生长的摇瓶培养物的上清液中回收的肝素前体在M_n或M_w上表现出非常微小的差异。从葡萄糖合成培养基的上清液中回收的肝素前体的M_n和M_w最低。从小粒中回收的肝素前体表现出M_w比从发酵上清液中回收的肝素前体的M_w更大(数据未显示)。

接下来，在整个发酵过程中，在不同时间点从发酵桶中采集样品并且通过Vivapure D Mini H离心柱纯化肝素前体。从发酵上清液得到的样品的纯度通过¹H-NMR确认为＞85％。PAGE分析(图5B)显示出肝素前体分子量的初步增加，接着随发酵时间的增加分子量不发生进一步变化(图6)。肝素前体的多分散性指数(PDI＝M_w/M_n)在整个发酵过程中变化非常小。

讨论

在该研究中，发酵上清液中的肝素前体的高产量(15g/L)在含有葡萄糖的限定培养基上生长的补料分批发酵桶培养物中实现。这很好地与最近报道的在含有甘油的限定培养基上生长的相同生物体中得到10.2g/L肝素前体的产量进行比较(美国专利申请公开第2008/0032349号)。与该在先报道相比较，体积生成速度也得以增加。而且，作为比甘油更便宜的碳源的葡萄糖使得这种发酵加工更加经济。在3L规模条件下发展的补料分批发酵加工可用作较大的实验室规模发酵的原型，最终产生工业生产肝素前体。目前在我们的实验室中工艺放大的研究正从3L发展至750L操作体积，该工艺放大的研究将为大规模(100公吨)生产肝素前体所需的放大至约100,000L操作体积提供基础，从而提供作为生物工程合成肝素的起始原料。正在研究在发酵中使用较快的葡萄糖进料速度以及在发酵桶中使用较高的氧水平的可能性，从而增加肝素前体的生成速度。

含有作为碳源的葡萄糖的限定培养基的使用具有降低的发酵成本和减少的培养基复杂性，这使得纯化过程更加容易。从复合LB培养基中纯化的肝素前体的纯度比从含有葡萄糖的限定培养基中纯化的肝素前体的纯度低，这是由于复合培养基的成分和所需的额外的纯化步骤。

从培养物上清液中分离的肝素前体可能通过K5裂解酶和剪切作用力的联合作用在发酵过程中脱落进入培养基中而产生。脱落进入培养基中的肝素前体的增加提高了上清液中的肝素前体的产量，降低了下游纯化加工的成本。

K5裂解酶的存在有助于肝素前体荚膜理想地释放进入培养基中，增加肝素前体的产量。同时，K5肝素前体裂解酶的存在导致在链的非还原性末端产生非天然糖类残基(ΔUA)，所述链可需要进行后续处理。K5肝素前体裂解酶还增大了肝素前体的多分散性指数，这可使随后的加工成为肝素复杂化。生物工程合成的肝素的分子量性质与肝素前体的分子量性质密切相关。本发明的方法制备了具有适于加工成肝素的性质的肝素前体。因此，本发明的发明人已说明了在存在裂解酶的条件下，通过准确控制发酵条件和发酵加工时间制备具有期望的分子量性质的肝素前体还是可能的。

未来对K5裂解酶的活性的控制可提供很好地控制肝素前体对照的方法。

表1，从2.8L摇瓶中的不同培养基中回收的肝素前体的数均分子量(M_N)、重均分子量(Mw)和多分散性指数(PDI)。

培养基	MN	MW	PDI
				M9	54,000	82,000	1.5
甘油	50,000	79,000	1.6
				葡萄糖	25,000	44,000	1.8
LB	54,000	68,000	1.3

实施例2：20L发酵报道(pH stat补料分批发酵)

培养基

葡萄糖限定培养基：(每升)20g葡萄糖、20mg硫胺、13.5g KH₂PO₄、4.0g(NH₄)₂HPO₄、1.4g MgSO₄·7H₂O、1.7g柠檬酸和10.0mL微量金属溶液。微量金属溶液由(每升5M HCl)10.0g FeSO₄·7H₂O、2.0g CaCl₂、2.2gZnSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·4H₂O、1.0g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02g Na₂B₄O₇·10H₂O构成。在补料分批阶段使用的饲养溶液由(每升)700g葡萄糖、20g MgSO₄·7H₂O、47g KH₂PO₄和0.4g硫胺构成。R培养基(在所进行的发酵中使用的含葡萄糖的培养基)如下制备：

R培养基的A部分：将(NH₄)₂HPO₄、KH₂PO₄和柠檬酸加至约8升的水中，同时伴随磁力搅拌，加入微量金属溶液(100倍原液)，调节pH至6.80，然后加入水至9L。在121℃下，在发酵桶中对A部分进行灭菌持续45分钟。

R培养基的B部分：将MgSO₄和葡萄糖溶液制备成10倍原液并且在110℃下通过高压锅分别灭菌持续20分钟(也可过滤灭菌)。

饲养溶液：将葡萄糖、MgSO₄·7H₂O和47g KH₂PO₄溶于1升水中，同时伴随加热和搅拌，并且在115℃下通过高压锅灭菌20分钟。将硫胺溶于水中然后过滤灭菌。

操作步骤

第1天：

早晨，将四个装有K5大肠杆菌菌株(储存于-80℃的冰箱中)的5ml的培养管接种在上述葡萄糖合成的培养基(R培养基)中，在37℃下，在孵育器中生长10小时，同时伴随以220rpm的速度振荡。晚上，将四种培养物转移至2.8L带挡板的摇瓶中的500ml培养基中并且在37℃下生长10小时，同时伴随以220rpm的速度振荡。

第2天：对发酵桶pH探针和DO探针进行灭菌并且在生长温度(37℃)下对pH探针和DO探针进行校准。对三个泵进行设置：1号泵-用于调节pH的NH₄OH、2号泵-饲养溶液、3号泵-阻沫。

将R培养基的B部分加至发酵桶中，从而与A部分混合，并且接种500ml种子培养物。通过泵送NH₄OH将pH维持在6.8。当观察到pH峰值和DO峰值时，开始泵送饲养溶液。进料泵被设计为当pH＞6.8时供给100％输出(约6.7g葡萄糖脉冲)。增加搅拌速度和/或空气流速以保持DO高于20％。当通过改变搅拌速度和气流无法将DO保持在高于20％时，加入纯氧气流。

第3天：当培养物OD⁶⁰⁰值开始下降时，停止发酵。收获培养物并进行离心。从上清液中回收肝素前体。

图7中的蓝色曲线为DO趋势(培养物中溶解的氧)。由于高密度的细胞非常快速地消耗氧，在收获前几个小时，DO趋于接近0，同时仍然保持纯氧气流。当OD600(在600nm光波长处的培养物的光密度)开始下降之后几个小时，停止发酵。通过关闭氧气流，停止搅拌，然后开始收获来停止发酵，。

采样：采集约40ml以测量600nm处的光密度，然后以12,000x g的速度离心30分钟，从而将大肠杆菌细胞与上清液分离。将上清液和细胞小粒分别冷冻。

发酵样品分析：通过对一定规模的干细胞小粒进行称重来测量干细胞重量(DCW)。用乙醇沉淀之后，上清液中的肝素前体的浓度通过NMR定量法或咔唑分析来测量(Song J-M等人(2009)“A simple method for hyaluronic acidquantification in culture broth”Carbohydrate Polymers 78(2009)633-634.Wang Z等人(2009)Anal Biochem.398(2)：275-7)。

结果在图7、图8和图9中显示。

在该发酵阶段生成的肝素前体具有约58,000Da的数均分子量、约84,000Da的重均分子量和约1.4的多分散性指数(PDI)。纯度为约95％或以上。

实施例3：用壳聚糖层析法纯化肝素前体

壳聚糖是由随机分布的β-(1-4)连接的D-葡糖胺构成的线性多糖并且N-乙酰基-D葡糖胺为用于肝素前体的层析纯化的阴离子交换树脂提供了一种选择。壳聚糖中的氨基基团(pKa约为6.5)使其带正电并且在酸性条件下可溶，因此适于带负电的肝素前体的基于亲和性的纯化。基于壳聚糖的肝素前体的纯化可容易地根据壳聚糖的浓度和起始pH来控制。而且，壳聚糖很便宜，可得到充足的供应并且是可生物降解的。该实施例描述了基于可溶壳聚糖的、用于直接从发酵肉汤中有效回收肝素前体的分离方法。使用壳聚糖的这种基于电荷中和的分离方法可潜在地用于从复合发酵混合物中纯化其他带负电的大分子。

以7000rpm的速度对7L大肠杆菌K5发酵中的发酵肉汤进行离心持续30分钟以除去细胞。

1.基于NMR对上清液中的肝素前体的含量进行定量。

2.使用HCl溶液将上清液的pH调节至4.0，接着以7000rpm的速度离心1小时以除去任何沉淀出来的杂质。

3.在这之后，使用pH为4.0的DI水将上清液稀释5倍。

4.通过将壳聚糖溶于1％醋酸溶液中制备10mg/ml壳聚糖溶液。对于每10mg肝素前体而言，使用10mg/ml壳聚糖溶液将2.5mg壳聚糖加至上清液中。

5.然后在室温下搅拌混合物10分钟以确保得到的溶液被适当地混合。在这之后，在4℃下孵育混合物过夜。

6.壳聚糖-肝素前体聚电解质复合物形成沉淀，所述沉淀沉降下来并且以8000rpm的速度离心1小时回收沉淀。

7.随后用pH为4.0的DI水洗涤沉淀并且以8000rpm的速度再次离心1小时。

8.在碱性条件下壳聚糖失去其阳离子性质，这导致静电复合物分离，使得游离的肝素前体溶于溶液中并且产生不可溶的壳聚糖。将洗涤过的小粒放入1M NaOH溶液中并且孵育过夜以回收溶液中的肝素前体。不可溶的壳聚糖通过过滤或以10000rpm的速度离心2小时除去。该步骤可与阳离子交换步骤或阴离子交换步骤结合，从而除去其他加工杂质，这使得回收的肝素前体进一步纯化。

实施例3A

根据上述步骤，以柱模式使用DEAE琼脂糖快速流动树脂，接着使用四体积的乙醇进行沉淀从发酵肉汤中纯化肝素前体。然后，使用3500MWCO膜使回收的肝素前体相对于DI水进行透析。然后，在使用旋转蒸发器减小体积之后，将透析的溶液冷冻干燥。

然后，通过将纯化的肝素前体溶于pH为4.0的去离子水中制备1mg/ml该纯化的肝素前体的溶液。六种不同的样品通过使用10ml的1mg/ml的溶液并使用10mg/ml壳聚糖的1％醋酸溶液而添加2mg至6mg不同量的壳聚糖来制备。将样品在4℃下孵育过夜。沉淀的聚电解质复合物通过以8000rpm的速度对这些样品进行离心1小时来回收。然后，将1M NaOH溶液加至未用pH为4.0的DI水洗涤而获得的小粒中。不可溶的壳聚糖通过以10000rpm的速度离心2小时而除去。然后，使用咔唑分析对回收的样品和上清液中存在的肝素前体进行分析。

根据咔唑分析，在pH为4.0的条件下，通过将4mg壳聚糖加至10ml的1mg/ml肝素前体溶液中实现100％回收肝素前体。

实施例3B

在额外的实验中，通过加入盐酸调节发酵后进行离心之后获得的上清液至pH为4.0。接着，以8000rpm的速度进行离心1小时以除去沉淀下来的杂质。然后，使用1M NaOH溶液将上清液调回至pH为4.0。该调节了pH的样品的NMR定量说明这些样品中的肝素前体没有损失。

然后，使用pH为4.0的DI水将这些样品稀释五倍。接着，六个10ml样品中的每一个通过使用10mg/ml壳聚糖的1％醋酸溶液而添加2mg至8mg/样品的壳聚糖来制备。所述样品在4℃下孵育过夜。沉淀的聚电解质复合物通过以8000rpm的速度对这些样品进行离心1小时来回收。然后，将1M NaOH溶液加至未用pH为4.0的DI水洗涤而获得的小粒中。不可溶的壳聚糖通过以10000rpm的速度离心2小时而除去。然后，使用咔唑分析对回收的样品和上清液中存在的肝素前体进行分析。样品的咔唑分析显示发酵肉汤中的肝素前体约70％纯化。

本发明提供了用于从发酵肉汤中回收肝素前体的有效纯化方法。在该方法中使用的壳聚糖非常便宜、易于获得、是生物相容的并且是可生物降解的。这些性质使得壳聚糖可理想地用作纯化肝素前体的沉淀剂，所述肝素前体可通过酶的作用被修饰为可静脉内递送的肝素。本发明还提供了重要的浓缩步骤，从而与常用的乙醇沉淀步骤相比，该方法中所涉及的操作体积得以减小。例如，用于乙醇沉淀的操作体积在一些情况下超过了发酵体积。壳聚糖的生物相容性和可生物降解的性质使其相对于其他聚阳离子而言为更加有利的，像氯化十六烷基吡啶(CPC)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)这样的聚阳离子本身是有毒的。此外，该方法在纯化其他这类多糖(例如，透明质酸和酸性蛋白质)和DNA方面具有潜力。

本发明还提供在生物工程合成肝素的发展方面有潜在用途的、使用沉淀方法从发酵肉汤中低成本有效回收细菌荚膜多糖(K5肝素前体)的方法。所述方法使用生物相容的且可生物降解的天然衍生的聚阳离子，从而提供有效且安全的、用于静脉内递送的药物(例如肝素)的纯化技术。通过该方法获得的高产量使得该方法可理想地用作浓缩步骤，从而减小操作体积。该步骤回收的难易程度以及该步骤与在生物工程合成肝素的化学酶法合成中的附加步骤的相容性使该步骤可理想地用作纯化方法。该方法在除去来源于细菌发酵的其他阴离子多糖和蛋白质以及除去高度带负电荷的物种(例如DNA)方面具有潜力。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种由大肠杆菌K5生产基本上纯的肝素前体的方法，所述方法包括：

(a)在具有作为初级碳源的葡萄糖的限定培养基中培养大肠杆菌K5；

(b)将肝素前体与固相结合，并随后进行洗脱；以及

(c)从洗出液中沉淀肝素前体；

其中，所述基本上纯的肝素前体的纯度为至少90％。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养由分批生长阶段和补料分批生长阶段构成，其中：

(a)在分批生长阶段使用的培养基包含：(每升)约20g葡萄糖、10mg至300mg硫胺、约13.5g KH₂PO₄、约4.0g(NH₄)₂HPO₄、约1.4g MgSO₄·7H₂O、约1.7g柠檬酸以及约10.0mL微量金属溶液，其中，所述微量金属溶液基本上由(每升5M HCl)10.0g FeSO₄·7H₂O、2.0gCaCl₂、2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5gMnSO₄·4H₂O、1.0g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02gNa₂B₄O₇·10H₂O构成，并且，其中：

(b)在补料分批生长阶段使用的饲养培养基由(每升)250g至1000g葡萄糖、20g MgSO₄、0.15g至0.5g硫胺和任选地47g KH₂PO₄构成，以及

(c)其中氧通过喷入的空气提供，所述喷入的空气带有或不带有补充的氧。

3.如权利要求2所述的方法，其中，溶解的氧维持在约20％。

4.如权利要求2所述的方法，其中，温度维持在约37℃并且pH维持在约7。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述pH通过加入29％的氨溶液维持。

6.如权利要求2所述的方法，其中，在所述补料分批阶段使用的培养基以由下式确定的速度供给：

$\mathrm{Ms}\left(t\right)=F\left(t\right)S_{F\left(t\right)}=(\frac{\mathrm{\μ}}{Y_{\frac{x}{g}}}+m)X\left(t_0\right)V\left(t_0\right)\exp \left[\mathrm{\μ}(t-t_0)\right]$

其中，M_S为所述碳源的质量流速(g/h)，F为饲料流速(L/h)，S_F为所述饲料中的碳基质浓度(g/L)，X为细胞浓度(g/L dcw)，m为特定维持系数(g/g dcw/h)，V为培养物体积(L)，t₀为进料开始时间，t为加工时间，μ为特定生长速度(h^-1)以及Y_X/S为碳基质上的细胞产量(g/g)。

7.如权利要求2所述的方法，其中，获得大于12g肝素前体/L培养物上清液。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述发酵少于48小时，不包括发酵剂培养。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述结合和洗脱步骤包括：(i)除去细胞；(ii)使阴离子交换树脂与培养物上清液混合并除去所述上清液；(iii)用pH为4的50mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗涤所述树脂；(iv)用pH为4的1M氯化钠的醋酸钠缓冲液进行洗脱。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述结合和洗脱步骤包括：除去细胞；(i)将壳聚糖溶液与培养物上清液混合；(ii)将所述壳聚糖沉淀并分离沉淀物；(iii)洗涤所述壳聚糖；(iv)用约1M NaOH洗脱肝素前体。

11.如权利要求1所述的方法，其中，所述从洗出液中沉淀肝素前体包括乙醇沉淀。

12.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括用过氧化氢去除热原。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述肝素前体含有小于1％的DNA和小于2％的蛋白质。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述肝素前体的数均分子量为约58,000Da、重均分子量为约84,000Da并且多分散性指数PDI为约1.4。

15.如权利要求1所述的方法，其中，所述肝素前体的纯度为至少95％。

16.一种由权利要求1至15中任一项所述的方法生成的肝素前体。

17.一种由权利要求16所述的肝素前体制成的肝素。

18.由权利要求1至15中任一项所述的方法制成的肝素前体的用途。

Claims (18)

1.一种由大肠杆菌K5生产基本上纯的肝素前体的方法，所述方法包括：

(a)在具有作为初级碳源的葡萄糖的限定培养基中培养大肠杆菌K5；

(b)将肝素前体与固相结合，并随后进行洗脱；以及

(c)从洗出液中沉淀肝素前体；

其中，所述基本上纯的肝素前体的纯度为至少90％。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养由分批生长阶段和补料分批生长阶段构成，其中：

(a)在分批生长阶段使用的培养基包含：(每升)约20g葡萄糖、10mg至300mg硫胺、约13.5g KH₂PO₄、约4.0g(NH₄)₂HPO₄、约1.4g MgSO₄·7H₂O、约1.7g柠檬酸以及约10.0mL微量金属溶液，其中，所述微量金属溶液基本上由(每升5M HCl)10.0g FeSO₄·7H₂O、2.0gCaCl₂、2.2g ZnSO₄·7H₂O、0.5gMnSO₄·4H₂O、1.0g CuSO₄·5H₂O、0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02gNa₂B₄O₇·10H₂O构成，并且，其中：

(b)在补料分批生长阶段使用的饲养培养基由(每升)250g至1000g葡萄糖、20g MgSO₄、0.15g至0.5g硫胺和任选地47g KH₂PO₄构成，以及

(c)其中氧通过喷入的空气提供，所述喷入的空气带有或不带有补充的氧。

3.如权利要求2所述的方法，其中，溶解的氧维持在约20％。

4.如权利要求2所述的方法，其中，温度维持在约37℃并且pH维持在约7。

5.如权利要求3所述的方法，其中，所述pH通过加入29％的氨溶液维持。

6.如权利要求2所述的方法，其中，在所述补料分批阶段使用的培养基以由下式确定的速度供给：

$\mathrm{Ms}\left(t\right)=F\left(t\right)S_{F\left(t\right)}=(\frac{\mathrm{\μ}}{Y_{\frac{x}{g}}}+m)X\left(t_0\right)V\left(t_0\right)\exp \left[\mathrm{\μ}(t-t_0)\right]$

其中，M_S为所述碳源的质量流速(g/h)，F为饲料流速(L/h)，S_F为所述饲料中的碳基质浓度(g/L)，X为细胞浓度(g/L dcw)，m为特定维持系数(g/g dcw/h)，V为培养物体积(L)，t₀为进料开始时间，t为加工时间，μ为特定生长速度(h^-1)以及Y_X/S为碳基质上的细胞产量(g/g)。

7.如权利要求2所述的方法，其中，获得大于12g肝素前体/L培养物上清液。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述发酵少于48小时，不包括发酵剂培养。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述结合和洗脱步骤包括：(i)除去细胞；(ii)使阴离子交换树脂与培养物上清液混合并除去所述上清液；(iii)用pH为4的50mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗涤所述树脂；(iv)用pH为4的1M氯化钠的醋酸钠缓冲液进行洗脱。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述结合和洗脱步骤包括：除去细胞；(ii)将壳聚糖溶液与培养物上清液混合；(iii)将所述壳聚糖沉淀并分离沉淀物；(iii)洗涤所述壳聚糖；(iv)用约1M NaOH洗脱肝素前体。

11.如权利要求1所述的方法，其中，所述从洗出液中沉淀肝素前体包括乙醇沉淀。

12.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括用过氧化氢去除热原。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述肝素前体含有小于1％的DNA和小于2％的蛋白质。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述肝素前体的数均分子量为约58,000Da、重均分子量为约84,000Da并且多分散性指数PDI为约1.4。

15.如权利要求1所述的方法，其中，所述肝素前体的纯度为至少95％。

16.一种由权利要求1至15中任一项所述的方法生成的肝素前体。

17.一种由权利要求16所述的肝素前体制成的肝素。

18.由权利要求1至15中任一项所述的方法制成的肝素前体的用途。

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