BR112012008053B1 - método de produção de heparosano substancialmente puro a partir de e. coli k5 - Google Patents

Abstract

FERMENTAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE HEPAROSANO K5. Um método para a produção de heparosano da cultura de fermentação de E. coli K5 adequado para a produção industrial, exibindo rendimento e pureza superiores, volumes de cultura menores, crescimento mais rápido e custos mais baixos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório US No. 61/275.675, depositado em 01 de setembro de 2009, que é inteiramente incorporado por referência neste documento.

DIREITOS DE LICENÇA DO GOVERNO

[002]Esta invenção foi feita com o apoio do Governo Federal dos Estados Unidos mediante as conceções de GM38060 e HL096972 cedidas pelo National Institutes of Health. O Governo Federal dos Esatdos Unidos tem certos direitos na invenção.

FUNDAMENTOS

[003]Sulfato de heparano e heparina são moléculas biologicamente importantes envolvidas na anticoagulação do sangue, infecções virais e bacterianas, angiogênese inflamação, e desenvolvimento de câncer. Linhardt (2003) "Heparin: structure and activity,"J Med Chem, 46: 25512554. Linhardt RJ, Toida T. (2004) "Role of glycosaminoglycans in cellular communication,"Acc Chem Res, 37: 431-438. A Heparina encontra um amplo espectro de aplicações, incluindo cirurgia, oxigenação do coração- pulmão e diálise renal, tratamento da trombose venosa profunda e síndrome coronariana aguda. Linhardt Linhardt "Heparin: an important drug enters its seventh decade." Chem. Ind. 2, 45-50 (1991); Agnelli et al. "Enoxaparin plus compression stockings compared with compression stockings alone in the prevention of venous thromboembolism after elective neurosurgery"N Engl J Med 339 (2), 80-5 (1998). A heparina também é revestida na superfície dos vasos sanguíneos e dos dispositivos médicos, tais como tubos de ensaio e máquinas de diálise de aluguel, para formar uma superfície anticoagulante.

[004]A heparina é atualmente preparada a partir de tecidos animais, em quantidades de aproximadamente 100 toneladas métricas/ano, mas tal heparina pode estar contaminada com outros produtos biológicos. Linhardt Chem. Ind. 2, 45-50 (1991). A heparina contaminada com sulfato de condroitina supersulfatado levou à morte de quase 100 Americanos em 2008. Guerrini, et al. "Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events." Nature Biotechnology 26, 669-675 (2008).

[005]O precursor de biossíntese de heparina eucariótica natural, heparosano, é um polissacarídeo com a unidade de diassacarídeo de repetição [^ 4) e-D-ácido glucurônico (GlcA) (1 ^ 4) N-acetil-α-D-glucosamina (GlcNAc) ( l^] n, mostrada na Fig. 1.

[006]O heparosano também é biossintetizado como uma cápsula de polissacarídeo em bactérias, incluindo Escherichia coli K5 e Pasteurella multicida. Lindahl U et al. (1998) "Regulated diversity of heparan sulfate"J Biol Chem 273(39):24979-24982. A iniciação de síntese de heparosano K5 reportadamente envolve ácido 2-ceto-3- deoxioctulosônico. Finke A et al. (1991) "Biosynthesis of the Escherichia coli K5 polissacarídeo, a representative of group II capsular polissacarídeos: polymerization in vitro and characterization of the product"J Bacteriol 173(13):4088-94. O heparosano K5 é então alongado através da ação alternativa de glicotransferases KfiA e KfiC que adicionam GlcNAc e GlcA à extremidade não redutora da cadeia de polissacarídeo em crescimento. Hodson N et al. (2000) "Identification that KfiA, a protein essential for the biosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polissacarídeo, is an alpha-UDP-GlcNAc glycosyltransferase. The formation of a membrane-associated K5 biosynthetic complex requires KfiA, KfiB, and KfiC."J Biol Chem 275(35):27311-5. Uma vez sintetizada, a cadeia de heparosano é transportada para a superfície celular através de uma via que consiste em seis proteínas: KpsC, KpsD, KpsE, KpsM, KPsS e KpsT. McNulty C et al. (2006) "The cell surface expression of group 2 capsular polissacarídeos in Escherichia coli: the role of KpsD, RhsA and a multi protein complex at the pole of the cell"Mol Microbiol 59(3):907-22. Acredita-se que a cadeia de heparosano K5 é ancorada na superfície da célula por meio da substituição de lipídeos na extremidade de redução do polissacarídeo para uma molécula de ácido fosfatídico na membrana externa da E. coli. Jann B, Jann K. (1990) "Structure and biosynthesis of the capsular antigens of Escherichia coli"Curr Top Microbiol Immunol 150: 19-42. Porções de polissacarídeo heparosano podem ser derramadas a partir de E. coli K5 através da ação de heparosano-liase de K5, uma enzima originária de um fago bacteriano que cliva a cadeia de heparosano por meio de mecanismo de e-eliminação. Manzoni M et al. (1996) "Production of K5 polissacarídeos of different molecular weight by Escherichia coli" Journal of Bioactive and Compatible Polymers 11(4):301-311. Manzoni M, et al. (2000) "Influence of the culture conditions on extracellular lyase activity related to K5 polissacarídeo."Biotechnology Letters 22(l):81-85. O gene que codifica liase K5 é integrado no DNA de E. coli K5 e sua expressão pode ser induzida. Manzoni M, et al. (2000). Biotechnology Letters 22(l):81-85. A atividade de liase K5 pode afetar a quantidade de heparosano liberada no meio de cultura assim como as propriedades de peso molecular e de estrutura tanto de heparosano liberado quanto associado a células (Figura 1B). O heparosano K5 foi estimado ter um 20.000 de Mw (peso molecular) e constituído por dois subcomponentes importantes, com 16.000 e 1.500 de Mw. A razão dos dois subcomponentes corresponde ao Mw global e é influenciada pela atividade de liase K5, Vann WF et al. (1981) "The structure of the capsular Polissacarídeo (K5 Antigen) of Urinary-Tract-Infective Escherichia-Coli 010-K5- H4 - a Polymer Similar to Desulfo-Heparin"European Journal of Biochemistry 116(2):359- 364; Manzoni (2000) Biotechnology Letters 22(l):81-85.

[007]Estudos em escala de laboratório têm mostrado que heparosano com um peso molecular médio (Mw)> 10.000, obtido a partir de cepa de E. coli K5 pode ser enzimaticamente convertido para um polissacarídeo anticoagulante semelhante à heparina. Lindahl et al. (2005) "Generation of "Neoheparin" from E coli K5 capsular polissacarídeo"J Med Chem 48(2):349-352; Zhang et al. (2008) "Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors"Journal of the American Chemical Society 130(39): 12998-13007. Heparosano também pode ser usado em uma variedade de aplicações (WO 2009/014559).

[008]A presente invenção descreve um processo de fermentação de E. coli K5 com um elevado rendimento de heparosano e recuperação eficiente de heparosano de elevada pureza adequado para a produção industrial de heparosano.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009]A presente invenção diz respeito a métodos melhorados para a produção de heparosano por fermentação de E. coli K5, isolamento do polissacarídeo K5 e purificação.

[0010]Em uma modalidade, o método compreende (a) cultivar E.coli K5 em meio definido com glicose como fonte de carbono principal; (b) ligar heparosano a uma fase sólida com eluição subsequente; e (c) precipitar heparosano a partir do eluato. O método é adequado para a produção de heparosano substancialmente puro, que é pelo menos 90% puro.

[0011]Em modalidades relacionadas, o método compreende duas fases de cultivo, a saber, uma fase de crescimento de batelada e um estágio de crescimento de batelada alimentada, em que (a) o meio usado no estágio de crescimento de batelada compreende (por litro), cerca de 20 g de glicose, 10-300 mg de tiamina, cerca de 13,5 g de KH2PO4; cerca de 4,0 g (NH4)2HPO4, cerca de 1,4 g MgSO4 .7H2O, cerca de 1,7 g de ácido cítrico, e cerca de 10,0 mL de solução de metais traços (por litro); em que a solução de metais traços consiste essencialmente em (por L de HCl 5 M) 10,0 g de FeSO4 . 7H2O, 2,0 g de CaCl2, 2,2 g de ZnSO4 . 7H2O, 0,5 g de MnSO4. 4H2O, 1,0 g de CuSO4 . 5H2O, 0,1 g (NH4)6Mo7O24 . 4 H2O, e 0,02 g de Na2B4O7 . 10H2O e em que; (b) a solução de alimentação usada no estágio de crescimento de batelada alimentada consiste em (por L): 250-1000 g de glicose, cerca de 20 g de MgSO4 . 7H2O e 0,15-0,5 g de tiamina e, opcionalmente, cerca de 47 g KH2PO4.

[0012]Em modalidades relacionadas, o oxigênio é fornecido pelo ar aspergido. O ar pode ser suplementado com o oxigênio. Preferencialmente, o oxigênio dissolvido é mantido a cerca de 20%. Em algumas modalidades, o oxigênio puro é usado.

[0013]Em outras modalidades relacionadas, as condições incluem a temperatura mantida a cerca de 37°C, e o pH é mantido a cerca de 7. O pH pode ser mantido pela adição de uma solução de amônia, ou de gás de amônia. Em algumas modalidades, a solução de amônia é de cerca de 25-35%, incluindo cerca de 30%, tal como 29%.

[0014]Em modalidades particulares, o meio de alimentação usado no estágio de batelada alimentada é alimentado a uma taxa determinada por:

em que MS é a taxa de fluxo de massa da fonte de carbono (g/h); F é taxa de fluxo de alimentação (L/h); SF é a concentração de substrato de carbono na alimentação (g/l); X é a concentração de células (g/l dcw); m é o coeficiente de manutenção específica (g/g dcw/h); V é o volume de cultura (L); t0 é o tempo de início de alimentação; t é o tempo de processo; μ é a taxa de crescimento específico (h-1); e Yx/S é o rendimento de células no substrato de carbono (g/g).

[0015]O método também abrange a ligação e eluição de heparosano a partir do meio de cultura. Em uma modalidade, o heparosano é obtido a partir do sobrenadante isento de células. Em outra modalidade, o heparosano é obtido a partir de células por lavagem com uma solução de detergente, tal como SDS (por exemplo, SDS a 1%), com agitação.

[0016]Após a remoção das células, a ligação e eluição pode incluir a mistura de uma resina de troca aniônica com o sobrenadante de cultura e remoção do sobrenadante, lavagem da resina com cloreto de sódio 50 mM em tampão de acetato de sódio a pH 4, eluição com cloreto de sódio 1 M em tampão de acetato de sódio a pH 4.

[0017]Alternativamente, a ligação e eluição podem ser alcançadas com quitosana. Em uma modalidade, o sobrenadante da cultura é misturado com uma solução de quitosana que é deixada precipitar. O precipitado é isolado, lavado, tais como com água ou outro tampão diluído, e eluída com base forte, tal como cerca de 1M de NaOH. A ligação e eluição com quitosana pode ser realizada além de troca aniônica.

[0018]Após a ligação e eluição, o heparosano é precipitado a partir do eluato, tal como com etanol ou metanol. Em uma modalidade, 3 volumes de etanol são usados. O precipitado resultante é tipicamente lavado e seco.

[0019]O método também abrange uma etapa opcional de despirogenação, tal como por oxidação, incluindo com peróxido de hidrogênio.

[0020]O método da invenção obtém elevados rendimentos de heparosano, com elevado grau de pureza, em pequenos volumes de cultura, em um curto período de tempo, e com baixas quantidades de contaminantes. Assim, a invenção é adequada para a produção industrial de heparosano. O rendimento de heparosano pode ser obtido em uma fermentação de menos de 60 horas, menos de 48 horas, e menos de 40 horas, não incluindo o crescimento da cultura iniciadora. Em outras modalidades, o volume de cultura inicial é de 3 L na fase de batelada, trabalhando a 7L na fase alimentada, e razões semelhantes. Em modalidades relacionadas, portanto, a cultura produz, pelo menos, l0g/l, pelo menos 1lg/l, pelo menos 12g/l, pelo menos 13g/l, pelo menos 14g/l, e pelo menos 15g/l de heparosano. O heparosano substancialmente puro é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou, pelo menos 99% puro. Em modalidades relacionadas, o heparosano tem menos que 1% de DNA e menos que 2% de proteína. O heparosano é adequado para processamento em heparina. Em uma modalidade, o heparosano tem um peso molecular médio numérico de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 kDa, tal como cerca de 58 kDa; um peso molecular médio ponderal de pelo menos 20, 30, 40, 50 , 60, 70, 80 ou 90 kDa, tal como cerca de 84 kDa, e índice de polidispersão (PDI) de menos que 2,0, incluindo menos que 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, ou 1,3, incluindo cerca de 1,4.

[0021]Em modalidades adicionais, a invenção inclui o uso do heparosano produzido pelos métodos acima em uma preparação farmacêutica, tal como um revestimento de um dispositivo médico. Em modalidades relacionadas, o heparosano é usado para a produção de heparina. De um modo semelhante, a invenção é um método de uso do heparosano ou heparina produzido pelo método anterior para a fabricação de um medicamento.

[0022]Em outras modalidades, a invenção é heparosano produzido pelo método anterior, incluindo heparosano com uma pureza de pelo menos 90%, pelo menos 95%, e mais. Em modalidades relacionadas, a invenção é heparina produzida a partir de referido heparosano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023]Figura 1. Estrutura de heparosano. A. unidade de dissacarídeo de repetição de heparosano B. estrutura de cadeia de heparosano resultante da ação de liase K5 heparosano.

[0024]Figura 2. 1H-RMN (600 MHz) de heparosano preparado em cultura em frasco de agitação. A. Plotagem da pilha de heparosano recuperado a partir de: 1. Meio LB, 2. meio LB tendo em MWAvg > 3000, 3. meio LB tendo em MWAvg < 3000, e inserção mostrando análise de PAGE das amostras 1, 2 e 3. B. heparosano recuperado a partir de meio M9. C. heparosano recuperado do meio definido de glicerol. D. heparosano recuperado do meio de definido de glicose.

[0025]Figura 3. Produção de heparosano em um fermentador de 7L. O painel A mostra a curva de alimentação de glicose (preto), a curva de pH (azul) e a curva do oxigênio dissolvido (OD%) (vermelho) como uma função do tempo de fermentação (h). O painel B mostra a curva de crescimento celular (total DCW g, ▲) e produção de heparosano (g, ■) como uma função do tempo de fermentação (h).

[0026]Figura 4. Caracterização de heparosano purificado a partir do sobrenadante de uma fermentação de 7L. A. 1H- RMN (600 MHz) de heparosano. B. 13C-RMN de heparosano preparado em meio M9 contendo glicose 13C e sulfato de amônia 15N. C. FT-MS de uma cadeia de heparosano de peso molecular médio 4551,81 (grau de polimerização = 24) purificado por PAGE preparativa (Ly et al., 2010).

[0027]Figura 5. PAGE usado para análise de MW de heparosanos com corante Alcian blue. A. padrões moleculares abrangendo a faixa do gel de gradiente. Raias contêm: 1. Marcadores moleculares de HA (30 kD-310 kD), 2. marcadores moleculares de heparosano (6,4 kD-14,1 kD). B. heparosanos preparados em frascos de agitação em diferentes meios. Raias contêm: 1. heparosano a partir de meio M9, 2. heparosano a partir de meio sintético de glicerol, 3. heparosano a partir de meio sintético de glicose, e 4. heparosano a partir de meio LB. C. heparosanos preparados em um fermentador de 7L amostrado em tempos diferentes. Raias contêm: 1-6. heparosano amostrado a partir do fermentador em 4,5 h; 12,6 h; 14,5 h; 20 h; 32,9 h, e 37,6 h após o início da fermentação.

[0028]Figura 6. Curso de tempo de propriedades de peso molecular de heparosano produzido em fermentador de 7 L. São mostradas as tendências de:

[0029]Figura 7. A curva de pH (#) dissolvido (%OD) (◊) como uma função do tempo de fermentação (h) no fermentador de 20L.

[0030]Figura 8. A curva de crescimento celular (DCW (#)) e concentração de heparosano no curso de tempo de sobrenadante de fermentação (g/l, (◊)) no fermentador de 20L.

[0031]Figura 9. Espectros de 1H-RMN das amostras de heparosano purificadas.

[0032]Figura 10. Concentração de heparosano na pós- precipitação de sobrenadante usando quantidades variáveis de quitosana a partir de 10 ml de 1 mg/ml de solução de heparosano pura.

[0033]Figura 11. Recuperação percentual usando quantidades variáveis de quitosana a partir de 10 ml de 1 mg/ml de solução de heparosano pura.

[0034]Figura 12. Recuperação percentual usando quantidades variáveis de quitosana a partir de 10 ml de amostras de caldo de fermentação diluído 5x.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0035]Heparosano é um polissacarídeo com a unidade de dissacarídeo de repetição [GlcAα-(l-4)GlcNAcR(l-4)]n. Devido ao exopolissacarídeo K5 ser feito a partir de heparosano, que os presentes inventores isolaram e purificaram, "heparosano" em certos contextos pode referir- se a heparosano associado com bactérias presentes no meio de cultura, e durante o isolamento e purificação. O significado de heparosano será compreendido pela pessoa versada na técnica no contexto relevante.

[0036]Escherichia coli K5 descreve variantes de E. coli que produzem o exopolissacarídeo K5. Cepas de E. Coli K5 adequadas podem ser obtidas a partir de colecções públicas, tais como ATCC (American Type Culture Collection, EUA), tais como a cepa de E. coli ATCC23506. As cepas de Escherichia coli K5 podem também ser isoladas a partir de fontes clínicas, e/ou geneticamente modificadas.

[0037]Tal como usado neste documento "fermentação"refere-se ao crescimento bacteriano e a produção de exopolissacarídeo, em particular, exopolissacarídeo K5.

[0038]Tal como usado neste documento "isolado" significa o heparosano que é separado do meio de cultura e células bacterianas e presente em quantidade suficiente para permitir a sua identificação ou uso.

[0039]Tal como usado neste documento "substancialmente puro" significa que o heparosano é essencialmente isento de outras substâncias para uma extensão prática e apropriada para o seu uso pretendido. Um heparosano substancialmente puro é pelo menos 90% puro. Preferencialmente, o material é mais que 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou mesmo mais que 99% isento de contaminantes. O grau de pureza pode ser avaliado por meios conhecidos na técnica.

[0040]Como aqui usado "um" ou "uma" significa um ou mais, a menos que especificamente indicado para significar apenas um.

[0041]O termo "cerca de"é usado como entendido pela pessoa versada na técnica, no contexto em que "cerca de" modifica o termo estabelecido. Para um valor numérico, "cerca de" pode ser considerado para abranger uma variação de 10% em torno do valor indicado.

FERMENTAÇÃO DE E. coli K5 PARA A PRODUÇÃO DE HEPAROSANO

[0042]Muitos fatores devem ser considerados na identificação de condições adequadas para a fermentação.

[0043]E. coli, em geral, pode crescer em uma grande variedade de meios e uma faixa de pH, temperatura, O2 e outra condição. Ao contrário de cepas adaptadas em laboratório, no entanto, a E. coli K5 não foi submetida a estudo extenso da genética, crescimento e função.

[0044]As variações nas condições de crescimento podem afetar (a) a taxa de crescimento bacteriano, (b) a densidade de células máxima, (c) a produção de cápsula de exopolissacarídeo K5, (d) o grau de modificação da cápsula de K5 por E. coli K5, bacteriófago residente dentro de E. coli K5, e outros fatores, (e) a liberação da cápsula de exopolissacarídeo K5 no meio, (f) se o polissacarídeo heparosano produzido é de uma faixa de tamanho adequada para processamento em heparina, e (g) a quantidade e o tipo de contaminantes. Por exemplo, as condições que promovem a lise das células podem aumentar o rendimento do exopolissacarídeo K5 no sobrenadante da cultura, mas também podem aumentar a degradação da cápsula de exopolissacarídeo K5 e o número e a quantidade de contaminantes no sobrenadante.

[0045]A importância de qualquer contaminante um está relacionada com a facilidade com a qual ele pode ser removido por etapas subsequentes de purificação e de processamento, se o contaminante interfere no processamento subsequente de heparosano em heparina, e se o contaminante é um perigo para humanos ou animais. E. coli K5 é um patógeno conhecido e, assim, toxinas e outros fatores relacionados com a virulência devem ser removidos. Lipolissacarídeo (LPS) é um contaminante comum de extratos bacterianos Gram negativos, e é conhecido por ser um imunoestimulante e toxina potente. Os ácidos nucleicos podem também ser imunoestimulantes. Ambos os LPS e ácidos nucleicos têm núcleos polissacarídicos e, assim, podem se co-purificar com heparosano. Outros contaminantes podem incluir polissacarídeos não heparosanos ou derivados de heparosano.

[0046]Para a produção de produtos farmacêuticos e médicos, a fonte e a natureza do meio de crescimento podem ser importantes. Por exemplo, o meio complexo, obtido por hidrólise de proteínas de origem animal ou vegetal é excelente para o crescimento e produção de E. coli K5, mas mostra uma variação entre bateladas e podem conter antigênicos e outros contaminantes.

[0047]Fatores adicionais devem ser considerados para a produção de heparosano a uma escala industrial, incluindo volume de cultura, tempo e temperatura de fermentação. Volumes menores do meio e condições de crescimento mais rápidas são, portanto, desejáveis. Também é relevante a identificação de um meio de crescimento que usa materiais de partida amplamente disponíveis, padronizados e baratos.

[0048]As condições de crescimento devem também ser demonstradas escaláveis. Assim, a identificação de uma condição ótima em uma cultura de 5 ml deve ser também demonstrada em escalas maiores, tais como 5 L, 20 L, 100 L, e mais. De um modo semelhante, o processo deve ser robusto e reprodutível e, portanto, não suscetível a pequenas mudanças nas condições.

[0049]Em vista do exposto, a identificação de condições adequadas para a produção industrial de heparosano não é trivial. Os presentes inventores identificaram condições de cultura e de crescimento adequadas para E. coli K5 para facilitar a produção, o isolamento e a purificação de heparosano, que são adaptáveis à produção industrial.

[0050]Os meios são meios definidos com glicose como fonte de carbono, que é variado dependendo da fase de crescimento. A composição do meio para o crescimento da batelada é como a seguir por litro: cerca de 20 g de glicose, 10-300 mg de tiamina, cerca de 13,5 g de KH2PO4; cerca de 4,0 g de (NH4)2HP04, cerca de 1,4 g de MgSO4 . 7H2O, cerca de 1,7 g de ácido cítrico, e cerca de 10,0 mL de solução de metais traços. A solução de metais traços consistiu em (por L de HCl 5M) 10,0 g FeSO4 . 7H2O, 2,0 g de CaCl2, 2,2 g de ZnSO4 . 7H2O, 0,5 g de MnSO4 . 4H2O, 1,0 g de CuSO4 . 5H2O, 0,1 g de (NH4)Mo7O24 . 4H2O, e 0,02 g de Na2B4O7 . 10H2O. A solução de alimentação durante as culturas de batelada alimentada consistiu em (por L): 250-1000 g de glicose, 20 g de MgSO4 . 7H2O e 0,15 - 0,5 g de tiamina, e podem ser ainda suplementadas com 47g de KH2PO4. Em algumas modalidades, a solução de alimentação foi de 700 g de glicose, 20 g de MgSO4 . 7H2O e 0,2 g de tiamina. Em uma outra modalidade, a solução de alimentação foi de 700 g de glicose, 20 g de MgSO4 . 7H2O, 47g de KH2PO4 e 0,4 g de tiamina.

[0051]Uma cultura de sementes foi preparada através do crescimento de cepa de E. coli K5 durante a noite a 37°C em um balão de Erlenmeyer. A cultura de semente é então inoculada em um fermentador. A fermentação no fermentador consiste em dois estágios: uma fase de crescimento de batelada, e uma fase que usa uma combinação de alimentação exponencial e estratégias de alimentação de DO-stat. A fase de crescimento da batelada iniciada após a cultura da semente é inoculada no fermentador. A temperatura é mantida a cerca de 37°C, pH e é mantido entre 6 e 8 por adição de NH4OH na medida em que o pH diminui.

[0052]A segunda fase de fermentação se inicia depois que o oxigênio dissolvido mostra um aumento acentuado e a glicose no meio é depletada. A taxa de alimentação da glicose é calculada geralmente de acordo com a equação, mas

com flexibilidade: onde: Ms é a taxa de fluxo de massa da fonte de carbono (g/h); F é a taxa de fluxo de alimentação (l/h); SF é a concentração de substrato de carbono na alimentação (g/l) X concentração de células (g/l dcw); m é o coeficiente de manutenção específica (g/g dcw/h); V é volume de cultura (l); t0 é o tempo de início de alimentação, t é o tempo de processo; μ é a taxa de crescimento específico (1/h); YX/S é o rendimento das células no substrato de carbono (g/g).

[0053]Durante todo o processo de alimentação, μ é definido entre 0,1-0,4.

[0054]Em algumas modalidades, pode have pausas durante a alimentação como pontos de verificação para assegurar que a glicose não é superalimentada e a substância tóxica, tal como acetato no meio de cultura é baixa. Nestes pontos de verificação, a alimentação é retomada após um nítido aumento da concentração de oxigênio dissolvido ser observado, o que indica a depleção da glicose no meio de cultura. Em maior escala, tais observações são feitas continuamente com sondas, ou com a amostragem e análise automática durante a fermentação.

[0055]Tipicamente, a fermentação continua até que nenhum aumento na densidade das células é observado. A alimentação é então interrompida e o agitador do fermentador é deixado ligado durante mais 30-60 minutos para o cisalhamento de mais polissacarídeo K5 de cápsula para fora da superfície da célula e para o meio.

PURIFICAÇÃO DE HEPAROSANO DA CULTURA DE FERMENTAÇÃO

[0056]Em uma modalidade exemplar, a purificação de heparosano pode compreender (a) uma etapa para preparar um filtrado ou sobrenadante de cultura, (b) ligar o heparosano a uma fase sólida, tal como uma resina, e eluição de heparosano do mesmo, (c) precipitar com álcool e (d) despirogenar. As etapas de ligação, precipitação e despirogenação adicional podem ser adicionadas.

[0057]Na etapa (a), a cultura é centrifugada ou filtrada para separar o sobrenadante do pélete celular. A formalina ou outros agentes podem ser adicionados à cultura para inativar as células de bactérias. Tipicamente, o heparosano é recuperado a partir do sobrenadante, mas também pode ser recuperado por lavagem das células, incluindo com um detergente tal como dodecil sulfato de sódio e agitação mecânica, seguido por peletização e extração de heparosano a partir do sobrenadante.

[0058]Na etapa (b) o heparosano está ligado a uma fase sólida que preferencialmente se liga a heparosano. Por exemplo, uma resina, tal como uma resina de troca aniônica, é adicionada ao sobrenadante da etapa (a). A mistura é agitada para se ligar a heparosano no sobrenadante sobre a resina. A mistura é então filtrada para separar a resina a partir da solução. O sólido separado é então lavado para rinsar os contaminantes não ligados e eluído.

[0059]Para as resinas de troca aniônica, isto incluiria lavagem com uma solução de baixa concentração de sal para rinsar contaminantes não ligados, e eluição com solução de cloreto de sódio 1-2 M. A quitosana pode também ser usada para ligar heparosano. Embora quitosana possa ser adicionada como uma solução, e não estar, portanto, em "fase sólida", a mesma precipita e, assim, carrega heparosano a partir do sobrenadante. Do mesmo modo, o heparosano pode ser executado através de uma coluna apropriada contendo uma fase sólida, lavado e eluído.

[0060]Na etapa (c), o eluato de heparosano resultante da etapa (b) é precipitado, tal como pela adição de 1 - 5 partes por volume de etanol ou metanol. Esta etapa não só concentra o heparosano, mas seletivamente remove os contaminantes. O precipitado é então separado por centrifugação e lavado com álcool 50-80%.

[0061]Na etapa (d), o precipitado é dissolvido em água, e submetido a uma etapa de despirogenação para inativar o lipopolissacarídeo restante e outros contaminantes. Tipicamente, isto é realizado com um agente oxidante tal como peróxido de hidrogênio, mas outros peróxidos ou agentes de branqueamento são conhecidos. O heparosano resultante é precipitado de novo, como acima, e seco.

ANÁLISE

[0062]O heparosano resultante é analisado para determinar o rendimento, pureza e aptidão para processamento adicional. Várias ferramentas analíticas podem ser usadas.

[0063]A composição de dissacarídeo pode ser analisada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)- ionização por eletrospray (ESI)-espectrometria de massa (MS) após digestão parcial de heparosano. Bhattacharyya S et al. (2010) "Cell-bound IL-8 increases in bronchial epithelial cells after arylsulfatase B silencing due to sequestration with chondroitin-4-sulfate,"Am J Respir Cell and Molec Biol 42, 51-61. 1H-RMN e 13C-RMN podem também ser usados em heparosano não digerido e são adequados para a determinação da concentração e pureza de heparosano. Wang Z, Zhang Z, McCallum SA, Linhardt RJ. 2009. Nuclear magnetic resonance quantification for monitoring heparosan K5 capsular polysaccharide production. Anal Biochem. 398(2):275-7. Heparosano também pode ser determinado com a análise de carbazol como relatado por Bitter T, Muir HM. (1962) "A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction."Analytical Biochemistry 4(4):330.

[0064]O teor de DNA pode ser determinado por absorvância de UV. O teor de proteína pode ser determinado com, kits bem conhecidos, tal como o Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA seguindo as instruções do fabricante.

[0065]O perfil de peso molecular de heparosano purificado é determinado por comparação com uma escada de pesos moleculares conhecidos de heparosano ou ácido hilurônico, e usada para calcular o peso molecular médio, número e distribuição.

[0066]O teor de pirogênio pode ser determinado com o ensaio de lisado de amebócitos de Limulus (LAL).

[0067]A invenção pode ser ainda entendida por referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos para ilustrar certas modalidades da invenção e que não são destinados a serem limitantes. A pessoa versada na técnica vai entender que variações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Materiais

[0068]Um bioreator tipo autoclavável de vidro de 7-L a partir de Applikon (Schiedam, Holanda) foi usado como o fermentador. Software BioXpert V1.5 foi usado para controlar a operação do fermentador e coletar dados. Pó de caldo da DifcoTM LB foi adquirido a partir de BD (Franklin Lakes, NJ). A maioria dos produtos químicos usada para a preparação dos meios sintéticos foi da Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Antiespuma 204 foi da Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Os frascos de agitação com chicanas são de Corning (Corning, NY). DEAE Sepharose Fast Flow da GE Healthcare (Piscataway, NJ) foi usada para a purificação de heparosano. As colunas de spin Vivapure D Mini H foram de Sartorius Stedim Biotech (Aubagne, França). Kit de ensaio de Proteína Micro BCA foi de Thermo Scientific (Rockford, IL). As enzimas usadas para digerir o heparosano para a análise de dissacarídeo foram expressas e purificadas no nosso laboratório, tal como descrito em Han et al.(2009) "Structural snapshots of heparin depolymerization by heparin lyase I"J Biol Chem 284(49):34019-27. HPLC-MS foi realizada em um instrumento de Agilent 1100 (Santa Clara, Califórnia). Placas de sílica gel de TLC foram de EMD (Gibbstown, NJ). Os materiais para a preparação de escada de heparosano MW e determinação de heparosano Mw foram descritos em detalhe em Ly M, et al. (2010) "Analysis of E. coli K5 capsular polysaccharide heparosan"Anal Bioanal Chem (DOI: 10.1007/s00216-010-3679-7). Select HATM LoLadder, um conjunto de marcadores moleculares de hialuronano, foram obtidos de Hialose (Oklahoma City, OK). Crescimento E. coli K5 em frascos de agitação de 2,8 L

[0069]E. coli K5 da American Culture Collection Tipo (ATCC # 23506) foi armazenado congelado em 1 mL de meios M9, LB, glicerol e glicose, com glicerol a 25%. Um frasco de agitação de 250 mL contendo 25 mL do mesmo meio foi inoculado com 0,5 mL de E. coli descongelada. A cultura foi colhida em crescimento exponencial tardio em aproximadamente 1,1 g de peso celular seco (DCW)/L para o meio de cultura M9, 5,4 g de DCW/L para o meio de glicerol sintético, 5,6 g de DCW/L para o meio de glicose sintética, e 1,9 g de DCW/L de meio de LB. A cultura de E. coli K5 (300 mL) foi, em seguida, cultivada em frascos de agitação de 2,8 L inoculados com 5% em volume de células em crescimento exponencial tardio. A cultura foi agitada a 220 RPM e 37°C até 1-4 h depois que o crescimento atingiu a fase estacionária e então foi colhida para a recuperação de heparosano. Os meios usados para fermentação em frasco de agitação de 2,8 L incluíram: 1. Meio LB: caldo LB de DifcoTM (TM), Lennox, 20 g/l. 2. Meio M9: 2 g/l de glicose, 0,12 g/l de MgSO4, 0,011 g/l de CaCl2, 0,337 g/l de tiamina-HCl, 6 g/l de Na2HP04, 3g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4C1. 3. Meio definido de glicerol: 20 g/l de glicerol, 20 mg/l de tiamina, 13,5 g KH2PO4; 4,0 g de (NH4)2HPO4, 1,4 g de MgSO4 . 7H2O, 1,7 g de ácido cítrico, e 10,0 mL de solução de metais traços. A solução de metais traços consistiu em (por L de HC1 5 M) 10,0 g FeSO4 . 7H2O, 2,0 g de CaCl2, 2,2 g de ZnSO4 . 7H2O, 0,5 g de MnSO4 . 4H2O, 1,0 g CuSO4 . 5H2O, 0,1 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O, e 0,02 g de Na2B4O7 . 10H2O Wang FL, Lee SY (1998) "High cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli for the production of poly(3-hydroxybutyrate) in a defined medium" Biotechnology and Bio engineering 58(2-3):325-328. 4. Meio definido de glicose: por litro, 20 g de glicose, 20 mg de tiamina, 13,5 g KH2PO4; 4,0 g (NH4)2HPO4, 1,4 g de MgSO4 . 7H2O, 1,7 g de ácido cítrico, e 10,0 mL de solução de metais traços. A solução de metais traços consistiu em (por L de HCl 5 M) 10,0 g de FeSO4 .7H2O, 2,0 g de CaCl2, 2,2 g ZnSO4.7H2O, 0,5 g de MnSO4.4H2O, 1,0 g de CuSO4.5H2O, 0,1 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O, e 0,02 g de Na2B4O7.10H2O Wang e Lee (1998), id.

Crescimento de E. coli K5 em um fermentador de 7L

[0070]Esta fermentação consiste em um estágio de crescimento de batelada e um estágio de crescimento de batelada alimentada. A composição do meio para o crescimento da batelada na fermentação foi de: (por litro) 20 g de glicose, 20 mg de tiamina, 13,5 g de KH2PO4; 4,0 g de (NH4)2HPO4, 1,4 g de MgSO4 . 7H2O, 1,7 g de ácido cítrico, e 10,0 mL de solução de metais traço. A solução de metais traços consistiu em (por L de HCl 5 M) 10,0 g de FeSO4 . 7H2O, 2,0 g de CaCl2, 2,2 g de ZnSO4.7H2O, 0,5 g de MnSO4.4H2O, 1,0 g de CuSO4 . 5H2O, 0,1 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O, e 0,02 g de Na2B4O7 10H2O. A solução de alimentação usada na fase de batelada alimentada consistiu em (por L): 700 g de glicose, 20 g de MgSO4.7H2O e 0,2 g de tiamina. Wang e Lee (1998), id.

[0071]O estágio de crescimento de batelada começou com a inoculação da cultura de sementes (300 mL de 5,6 g/l DCW) obtida a partir de um frasco de agitação em crescimento exponencial tardio. A temperatura foi mantida a ~ 37°C, e o pH foi mantido a cerca de 7 (por adição de solução de amônia a 29%). O ar foi aspergido no fermentador para fornecer oxigênio, e a velocidade do agitador foi ajustada para 520 rpm.

[0072]O segundo estágio da fermentação começou depois que a glicose no meio de crescimento de batelada tinha sido depletada e o oxigênio dissolvido mostrou um aumento acentuado. A solução de alimentação foi então alimentada

exponencialmente seguindo a Eq. 1:

[0073]MS é a taxa de fluxo de massa da fonte de carbono (g/h); F é taxa de fluxo de alimentação (L/h); SF é a concentração de substrato de carbono na alimentação (g/l); X é a concentração de células (g/l dcw); m é o coeficiente de manutenção específica (g/g dcw/h); V é o volume de cultura (L); t0 é o tempo de início de alimentação; t é o tempo de processo; μ é a taxa de crescimento específico (h- 1); e Yx/s é rendimento de células no substrato de carbono (g/g) Lee SY. 1996. "High cell-density culture of Escherichia coli". Trends Biotechnol 14(3):98-105. Um valor de μ entre 0,10-0,15 h-1 foi usado neste estudo para permitir a propagação de células suficiente, evitando a acumulação de produtos secundários tóxicos devido a maiores taxas de crescimento. A "bomba de ácido"fixa ao fermentador foi usada para realizar a função de alimentação de glicose em vez de adição de ácido real, e a bomba de base foi usada para adicionar solução de amônia a 29% para manter o pH estável e fornecer a cultura com uma fonte de nitrogênio. Uma terceira bomba foi usada para adicionar o reagente Antiespuma 204 na cultura ao espumar ultrapassado um nível definido controlado pelo loop de feedbackatravés da unidade de controle digital do fermentador. A taxa de alimentação de glicose foi alcançada através da programação do tempo de liga-desliga da "bomba de ácido" por um minuto. Uma equação de Tliga = 0,72*exp[0,0023*(t - 420)] foi usada entre 7 h e 24 h do tempo de fermentação decorrido, onde Tliga é o tempo que a "bomba de ácido"foi ativada por um segundo durante o período de um minuto. A taxa de alimentação de glicose foi diminuída após 24 h, uma vez que a limitação de oxigênio foi observada. O controle de pH foi alcançado manualmente usando uma bomba de base para adicionar solução de hidróxido de amônio a 29%. O pH foi mais estreitamente controlado usando um programa customizado escrito no software BioXpert V1.5. A velocidade de agitação e/ou a taxa de fluxo de ar foi aumentada quando o oxigênio dissolvido caiu abaixo da saturação do ar de 20%. O oxigênio puro foi misturado com o ar para produzir oxigênio dissolvido suficiente após 24 h de tempo de fermentação. Alimentação de glicose foi interrompida periodicamente para assegurar que as células consumiram toda a glicose, e que os subprodutos tóxicos (como acetato) não se acumularam no meio. A alimentação foi retomada depois que um pico de oxigênio dissolvido foi observado, indicando a depleção da glicose e a formação de subprodutos tóxicos. Johnston WA, et al. (2003) "Tracking the acetate threshold using DO-transient control during medium and high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli in complex media" Biotechnol Bioeng 84(3:314-23. As amostras foram coletadas a partir do fermentador periodicamente. As amostras tomadas foram centrifugadas a 12.000 x g por 30 min. para separar o sobrenadante das células de E. coli.

Determinação da concentração de heparosano no sobrenadante de fermentação

[0074]A concentração heparosano no sobrenadante da fermentação foi medida por análise de carbazol e análise de RMN. No ensaio de carbazol de heparosano, 0,5 mL de sobrenadante de fermentação recuperado por centrifugação foi aplicado a uma coluna de spin de dessalinização tipo YM-3 Millipore (1200 x g) para remover os sais e pequenas moléculas. O retentado contendo heparosano bruto foi recuperado e liofilizado. O heparosano bruto seco foi reconstituído com 0,5 mL de água destilada e submetido ao ensaio de carbazol. A concentração de heparosano foi calculada a partir de uma curva padrão preparada com heparosano puro. No ensaio de RMN, o heparosano (1 mL), de forma semelhante recuperado a partir de sobrenadante de cultura, foi liofilizado e, em seguida, dissolvido em 400 μL de D2O contendo 71 μg de tereftalato de sódio (padrão interno), em seguida, transferido para um tubo de RMN para 1H-RMN a 600 MHz. A concentração de heparosano foi calculada a partir da razão da área integrada do grupo N- acetil em heparosano e a do padrão interno.

Recuperação rápida de amostras heparosano durante a fermentação para análise

[0075]Heparosano foi rapidamente recuperado a partir do sobrenadante da fermentação e parcialmente purificado usando uma coluna de spin Vivapure D Mini H. O sobrenadante (1 mL), recuperada a partir de células por centrifugação (12.000 x g), foi misturado com 1 mL de tampão A. (cloreto de sódio 50 mM, acetato de sódio 20 mM, pH 4) A mistura foi então ajustada para pH 4 e carregada em uma coluna Vivapure D Mini H pré-equilibrada. A coluna foi então lavada com tampão A e eluída com tampão B (cloreto de sódio 1 M, acetato de sódio 20 mM, pH 4). As amostras eluídas foram então precipitadas com 3 volumes de etanol deixadas durante a noite a -20°C (em um congelador à prova de explosão) e o precipitado resultante foi lavado com etanol a 75%, dissolvido em água e liofilizado. A pureza das amostras recuperadas foi então examinada por 1H-RMN.

Purificação do heparosano

[0076]Heparosano foi recuperado na conclusão da fermentação em um frasco de agitação ou fermentador de 7-L por centrifugação da cultura a 12.000 x g durante 30 min. O sobrenadante obtido foi ajustado para pH 4 por adição de ácido acético glacial e, em seguida, filtrado através de um funil de Buchner tipo Pyrex com um disco sinterizado (tamanho de poro 40-60 μm). A resina de fluxo rápido de DEAE-Sepharose foi empacotada em uma coluna de tamanho apropriado (< 20 mg de heparosano/mL de resina intumescida). A coluna foi primeiro equilibrada com cloreto de sódio 50 mM em tampão de acetato de sódio 20 mM a pH 4. O sobrenadante de fermentação foi então carregado na coluna e a coluna foi lavada com 3-volumes de cloreto de sódio 50 mM em tampão de acetato de sódio 20 mM a pH 4. O heparosano foi então eluído da coluna com cloreto de sódio 1 M em tampão de acetato de sódio 20 mM a pH 4. O heparosano que eluiu da coluna foi precipitado por adição de 3-volumes de etanol e armazenamento desta solução durante a noite a - 20°C em um congelador à prova de explosão. O precipitado foi recuperado por centrifugação a 12.000 g durante 30 min. O pélete foi lavado com etanol a 75%, centrifugado novamente e o pélete obtido foi liofilizado para armazenamento ou usado diretamente para a etapa de branqueamento. O heparosano poderia também ser purificado a partir do pélete de células por adição de SDS a 0,02%, seguido por agitação vigorosa, centrifugação e cromatografia por DEAE.

[0077]Na etapa de branqueamento, o heparosano foi primeiro dissolvido em cloreto de sódio 1 M a uma concentração de ~ 15 g/l. O pH da solução foi ajustado para 9,5 com NaOH 1 M e peróxido de hidrogênio (30%) foi adicionado para se obter uma concentração final de 1,5%. A mistura foi incubada durante a noite à temperatura ambiente, após o que o heparosano foi precipitado por adição de 3-volumes de etanol e deixado durante a noite a - 20°C (em um congelador à prova de explosão). O pélete resultante foi lavado com etanol a 75%, dissolvido em água e seco.

Análise de dissacarídeo de heparosano

[0078]O heparosano (10 mg/ml) foi dissolvido em tampão de fosfato de sódio 200 mM a pH 7 e tratado com 1 mU cada liase de heparina 1, 2 e 3 a 30°C durante a noite. O produto de dissacarídeo resultante foi submetido à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) - ionização por eletrospray (ESI) - espectrometria de massa (MS) em um instrumento de captura de íons da Agilant e a composição de dissacarídeo foi determinada. A análise de LC-MS foi realizada em um sistema de LC-MS (MS com captura LC/MSD; Agilent, Santa Clara, CA). As soluções A e B para a cromatografia líquida de alta pressão foram de 15% e a 65% de acetonitrila, respectivamente, contendo a mesma concentração de NH4HCO3 37,5 mM e tributilamina 11,25 mM. A separação foi realizada em uma coluna C-18 (Agilent), usando-se a solução A por 20 min, seguido por um gradiente linear de 20 a 45 min de solução B de 0-50%. O efluente da coluna entrou na fonte da espectrometria de massa com ionização por eletrospray (ESI-MS), para a detecção contínua por MS. A interface de eletrospray foi ajustada no modo de ionização negativa com potencial de filtro pressurizado (skimmer) de 400 V, saída de capilar de 240,0 V, e uma fonte de temperatura de 325°C, para se obter abundância máxima de íons de um espectro de varrimento completo (150-1.500 Da, 10 varrimentos completos/s). O nitrogênio foi usado como um gás de secagem (5 litros/min) e nebulização (20 psi). Bhattacharyya S, Am J Respir Cell e Molec Biol 42, 51-61.

Análise por RMN de heparosano

[0079]1H-RMN e 13C-RMN foram realizadas em um espectrômetro de RMN Bruker 600 MHz. As amostras de heparosano foram preparadas a uma concentração de 2 mg/ml em D2O (99,99% + % de átomo), liofilizadas para remover prótons permutáveis e re-dissolvidas em D2O e transferidas para tubos de RMN padrões de 5 mm. Aquisição de espectros foi realizada usando software TOPSPIN 2.0. Todos os espectros foram adquiridos à temperatura de 298 K.

Ensaio de teor de DNA e proteína

[0080]O teor de DNA no produto de heparosano final foi determinado por medição da absorvância de UV de 0,1 mg/ml de solução de heparosano a 260 nm e 320 nm. A concentração de DNA foi calculada como a concentração (μg/mL) = (leitura A260 - leitura A320) x fator de diluição x 50 μg/mL. O teor de proteína foi testado usando o Kit de ensaio de proteína Micro BCA seguindo as instruções do fabricante.

Análise do peso molecular de heparosano

[0081]Uma escada de padrões de heparosano massas moleculares conhecidas foi preparada a partir de polissacarídeo de heparosano K5 branqueado por eletroforese de poliacrilamida preparativa contínua usando um aparelho de Mini Prep Cel (BioRad, Hercules, CA) (Ly et al, 2010). Frações de heparosano foram caracterizadas por espectrometria de massa por transformada de Fourier (FT-MS) e misturadas novamente para preparar uma escada de padrões de peso molecular para a determinação das propriedades de peso molecular do heparosano (Ly et al., 2010). Marcadores moleculares de hialuronano (HA), que também é um polissacarídeo linear com a mesma densidade de carga que N- acetil-heparosano, foram usados como padrões para a faixa superior das amostras.

[0082]Ambos os marcadores moleculares HA e heparosano foram usados como um conjunto de padrões para a análise do peso molecular dos heparosanos preparados em diferentes meios de cultura e em pontos de tempo de fermentação diferentes. Um gel de poliacrilamida de gradiente (4-15%) de dimensões 0,75 mm x 6,8 cm x 8,6 cm foi usado nas análises de peso molecular de heparosano. As amostras de heparosano (25 μg) foram carregadas em géis e foram então submetidas à eletroforese (200 V por 20 min) e coradas com azul Alcian por 1 h, e então descoradas com ácido acético a 10%/ etanol a 25% (Ly et al., 2010). Os géis foram escaneados e as imagens digitais foram analisadas usando o software de computador UN-SCANIT. Uma plotagem de densidade de imagem como uma função da distância de migração foi adquirida. A partir destes dados, as propriedades de peso molecular das amostras de heparosano foram caracterizadas a partir da curva padrão obtida.

Resultados Fermentação de E. coli K5 em frasco de agitação para a preparação de heparosano

[0083]A E. coli K5 foi cultivada em frascos de agitação até 1-4 h após a fase estacionária ter sido atingida. A fermentação foi estendida para além da fase estacionária para acumular a quantidade máxima de heparosano no meio, consistente com os relatos de que a aparência de heparosano no meio retarda o crescimento celular Manzoni M et al. (1993) Journal of Bioactive and Compatible Polymers 8(3):251-257. O rendimento do heparosano a partir das culturas do frasco variou de 70 - 500 mg/l. A pureza do heparosano recuperado a partir de culturas do frasco foi em todos os casos > 85%, tal como estimado por RMN de Wang Z et al (2009) Anal Biochem. 398(2):275-7. Zhang ZQ et al (2008) "Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors" Journal of the American Chemical Society 130(39): 12998-13007. O heparosano recuperado a partir de meios sintéticos, incluindo meio M9, médio de glicose e meio de glicerol, mostrou níveis mais elevados de pureza (> 95%) do que heparosano recuperado a partir de meio LB, que mostrou picos adicionais na RMN, consistente com ~ 85% de pureza (Figura 2 ). A análise adicional do meio de LB derivado de heparosano por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) mostrou uma banda de Mw baixa, correspondendo a um componente de meio que se co-purifica com heparosano. Esta impureza pode ser removida usando uma coluna de spin de peso molecular de corte 3K (MWCO) de (Figura 2A).

[0084]A composição de dissacarídeo de heparosano foi determinada por HPLC-MS (não mostrado) após a digestão completa com a heparina liase 1, 2 e 3, e mostrou a presença de um dissacarídeo único m/z 378,2. Este dissacarídeo corresponde a ΔUA (1 ^ 4)-α-D-GlcNAc, é consistente com a estrutura de repetição uniforme de heparosano, -> 4)-β-D-GlcA (1^4)-α-D-GlcNAc (1^. Para confirmar esta estrutura heparosano marcado com 13C e 15N foi preparado através da cultura de E. coli K5 em meio M9 contendo 13C- glicose e 15N- cloreto de amônio uniformemente marcados. A estrutura de 15N-heparosano, 13C- marcado uniformemente recuperado, foi confirmada por digestão completa com a heparina liase 1, 2 e 3, seguido por HPLC- MS, que mostrou um dissacarídeo único m/z 392,9. A diferença 15 amu entre m/z 378,2 e 392,9 é consistente com o enriquecimento isotópico de 15N e 13C completo de heparosano e confirma a estrutura de repetição de heparosano.

Fermentação de E. coli K5 em um fermentador de 7 L

[0085]A taxa de alimentação foi aumentada exponencialmente para acompanhar o crescimento exponencial de E. coli. Várias pausas foram feitas no estágio de alimentação para assegurar que não havia nenhum acúmulo de glicose no meio, o que poderia resultar no acúmulo de acetato e inibir o crescimento E. coli. A alimentação foi retomada apenas depois que um aumento no oxigênio dissolvido foi observado confirmando a depleção de glicose (Figura 3). Nos estágios tardios da fermentação (após 22 h), o oxigênio dissolvido tornou-se limitante. A agitação aumentada e a introdução de oxigênio puro foram usadas para maximizar a concentração de oxigênio dissolvido na cultura. Apesar desses esforços os níveis de oxigênio dissolvido ainda permaneceram bastante baixos após 31 h. A taxa de alimentação de glicose foi diminuída quando o oxigênio tornou-se o nutriente limitante. Ao longo da fermentação, o pH foi mantido entre 6 e 8 por adição de NH4OH. Após fermentação de 37,5 h, uma densidade de células de 85 g DCW/L foi alcançada, e a concentração de heparosano no sobrenadante de fermentação foi determinada como sendo de 15 g/l. Uma taxa de crescimento global foi calculada para ser 0,12 h-1, a taxa de produção global foi de 1,2 g/h, e a taxa de produção volumétrica foi de 0,4 g/L.h. O heparosano purificado a partir da fermentação foi de elevada pureza, a julgar pelo espectro de 1H-RMN (Figura 4A). Além disso, os ensaios de proteína BCA e DNA indicaram que < 1% de DNA e < 2% de proteína estavam presentes no material de heparosano final.

Caracterização estrutural de heparosano

[0086]1H-RMN, 13C-RMN, HPLC-MS e (FT)-MS por Transformada de Fourier (Figura 4) todos confirmam a estrutura geral de heparosano como ^ 4)-β-D-GlcA (l^4)-α-D- GlcNAc (1 ^. (Figura 1A). FT-MS de uma fração de heparosano tendo um grau de polimerização (dp) de 24, obtida usando eletroforese preparativa é mostrado na Figura 4C. Este espectro também indica a presença de resíduo de ΔUA uronato insaturado (Figura 1B) na extremidade não redutora de algumas das cadeias de polissacarídeo. A presença de um resíduo ΔUA terminal é consistente com a ação de uma liase heparosano K5 também presente na cepa de E.coli K5. A análise de FT-MS sugere que o heparosano recuperado a partir do sobrenadante da fermentação contém uma mistura de heparosano terminada com resíduos de ΔUA e com resíduos de GlcA. Este resultado é consistente com alguns heparosanos no meio sendo derramados da superfície da célula pela força de cisalhamento e alguns sendo liberados no meio por digestão de liase heparosano. O heparosano isolado a partir do sobrenadante foi tratado com β-glucuronidase, uma enzima exolítica capaz de remover GlcA, mas não DUA a partir da extremidade não redutora de uma cadeia de heparosano. A observação de GlcA liberado usando cromatografia de camada fina (dados não mostrados) confirma que algumas das cadeias de heparosano que foram derramadas para o sobrenadante foram terminadas com GlcA.

Caracterização de MW de heparosano

[0087]Os heparosanos recuperados de E. coli K5 cultivados em frascos de agitação, foram analisadas por PAGE contra uma escada de padrões de heparosano purificados (Figura 5 e Tabela 1). Heparosano, recuperado a partir do sobrenadante em culturas de frascos crescidas no meio M9, médio de glicerol sintético, meio complexo de LB mostrou pouca diferença em Mn ou Mw. Heparosano recuperado a partir do sobrenadante em meio sintético de glicose teve o menor Mn e Mw. Heparosano recuperado a partir do pélete mostrou maior Mw do que heparosano recuperado a partir do sobrenadante da fermentação (dados não mostrados).

[0088]Em seguida, as amostras do fermentador foram tomadas em vários momentos ao longo da fermentação e o heparosano foi purificado por coluna de spin Vivapure D Mini H. A pureza das amostras resultante foi confirmada como sendo > 85% a partir dos sobrenadantes de fermentação por 1H-RMN. A análise de PAGE (Figura 5B) mostrou um aumento inicial no peso molecular de heparosano seguido por nenhuma mudança adicional no peso molecular na medida em que o tempo de fermentação aumenta (Figura 6). Índice de polidispersão de Heparosano (PDI = MW/Mn) mudou pouco ao longo da fermentação.

Discussão

[0089]Neste estudo, um rendimento elevado de heparosano no sobrenadante de fermentação (15 g/l) foi alcançado em uma cultura de fermentador de batelada alimentada cultivada em meio definido contendo glicose. Este se compara favoravelmente aos rendimentos recentemente relatados de 10,2 g/l de heparosano a partir do mesmo organismo crescido em meio definido contendo glicerol (Publicação de Pedido de Patente US No. 2008/0032349). A taxa de produção volumétrica foi também aumentada em comparação com este relato anterior. Além disso, a glicose, tal como uma fonte de carbono menos cara do que o glicerol, torna este processo de fermentação mais econômico. O processo de fermentação de batelada alimentada desenvolvido na escala de 3 L pode servir como protótipo para a maior fermentação em escala de laboratório, levando à produção de heparosano industrial. Estudos de processo ampliado estão em andamento em nosso laboratório passando de 3 L para 750 L volumes de trabalho, que irão fornecer a base para ampliar para os ~ 100.000 L de volumes de trabalho necessários para produção de heparosano em larga escala (100 toneladas métricas) para fornecimento como material de partida para a síntese de heparina bioprojetada. A possibilidade de usar uma taxa de alimentação de glicose mais rápida na fermentação e níveis mais altos de oxigênio no fermentador está sendo investigada para aumentar a taxa de produção de heparosano.

[0090]O uso de meios definidos contendo glicose como fonte de carbono diminuiu o custo de fermentação e reduziu a complexidade dos meios, tornando o processo de purificação mais fácil. O heparosano purificado a partir de meio de LB complexo foi menos puro devido aos componentes do meio complexo e a necessidade de etapas de purificação adicionais do que o heparosano purificado a partir de meio definido contendo glicose.

[0091]Heparosano, isolado a partir do sobrenadante de cultura surge a partir do derramamento no meio durante a fermentação provavelmente através das ações combinadas da liase K5 e força de cisalhamento. Um aumento de derramamento de heparosano no meio aumenta o rendimento de heparosano no sobrenadante, diminuindo o custo do processo de purificação a baixo vapor.

[0092]A presença de liase K5 contribui para a liberação desejável da cápsula de heparosano no meio, aumentando o rendimento de heparosano. Ao mesmo tempo, a presença de liase heparosano K5 resulta em um resíduo de sacarídeo não natural, ΔUA, na extremidade não redutora da cadeia que pode necessitar de tratamento subsequente. Liase heparosano-K5 também aumenta o índice de polidispersão de heparosano, o que pode complicar o processamento subsequente em heparina. As propriedades de peso molecular da heparina bioprojetada estão inexoravelmente ligadas às do heparosano. O presente método prepara heparosano com propriedades adequadas para o processamneto em heparina. Assim, os inventores demonstraram que, na presença de liase ainda é possível preparar heparosano com as propriedades de peso molecular desejadas controlando cuidadosamente as condições de fermentação e o tempo de processamento da fermentação.

[0093]O controle futuro da atividade de liase K5 pode oferecer uma abordagem para o controle fino de controles de heparosano.

[0094]Tabela 1. Peso molecular médio numérico (MN), peso molecular médio ponderal (MW) e índice de polidispersão (PDI) de heparosano recuperado a partir de diferentes meios em frascos de agitação de 2,8 L.

EXEMPLO 2: Relatório de fermentação de 20L (fermentação de batelada alimentada em pH inicial) Meio

[0095]Meio definido de Glicose: (por litro) 20 g de glicose, 20 mg de tiamina, 13,5 g de KH2PO4; 4,0 g de (NH4)2HPO4, 1,4 g de MgSO4 . 7H2O, 1,7 g de ácido cítrico, e 10,0 mL de solução de metais traços. A solução de metais traços consistiu em (por L de HCl 5 M) 10,0 g de FeSO4 . 7H2O, 2,0 g de CaCl2, 2,2 g de ZnSO4 de 7H2O, 0,5 g de MnSO4 . 4H2O, 1,0 g de CuSO4 . 5H2O, 0,1 g de (HH4)6Mo7O24 .4H2O e 0,02 g de Na2B4O7 . 10H2O. A solução de alimentação usada no estágio de batelada alimentada consistiu em (por L): 700 g de glicose, 20 g de MgSO4 . 7H2O, 47g de KH2PO4 e 0,4 g de tiamina. O meio de R, que é o meio contendo glicose usado nas fermentações realizadas, foi preparado como segue: Parte A do Meio R: (NH4)2HPO4, KH2PO4, e ácido cítrico foram adicionados a cerca de 8 litros de água com agitação magnética, solução de metais traços (estoque de 100X vezes) foi adicionada, o pH foi ajustado para 6,80, então a água foi adicionada para 9 litros. A Parte A foi esterilizada no fermentador a 121°C por 45 minutos. Parte B do Meio R: soluções de glicose e MgSO4 feitas como estoque de 10X e esterilizadas separadamente com autoclave a 110°C por 20 minutos (também pode ser esterilizado por filtração). Solução de alimentação: Glicose, MgSO4.7H2O e 47g de KH2PO4 foram dissolvidos em a 1 litro de água com calor e agitação, e esterilizados por autoclave a 115°C por 20 minutos. Tiamina foi dissolvida em água e, em seguida, esterilizada por filtração.

Procedimento Operacional Dia 1:

[0096]Quatro tubos de cultura de 5 ml foram inoculados em meio sintético de glicose descrito acima (meio R) com cepa de E. coli K5 (armazenada a -80°C no congelador) na manhã, crescida em incubadora a 37°C com agitação a 220 rpm por 10 horas. As quatro culturas foram transferidas para meio de 500ml em um frasco de agitação com chicanas de 2,8 L durante a noite e cultivadas a 37°C com agitação a 220 rpm por 10 horas.

Dia 2:

[0097]A sonda de pH do fermentador a sonda DO foram esterilizadas e calibradas na temperatura de crescimento (37°C). Três bombas foram definidas: bomba 1 - NH4OH para ajuste do pH; bomba 2 - solução de alimentação; bomba 3 - antiespumante.

[0098]A parte B do meio R foi adicionada ao fermentador para se misturar com a parte A e foi inoculada com a cultura de semente de 500 ml. O pH foi mantido a 6,8 por bombeamento em NH4OH. Bombeamento da solução de alimentação ocorreu quando um pH de pico e DO de pico foram observados. A bomba de alimentação foi programada para gerar 100% de saída (~ 6,7 g de pulso de glicose) quando o pH > 6,8. A velocidade de agitação e/ou a taxa de fluxo de ar foi aumentada para manter o DO acima de 20%. Um fluxo de oxigênio puro foi adicionado quando a DO não pôde ser mantido a acima de 20% pela mudança da velocidade de agitação e do fluxo de ar.

Dia 3:

[0099]A fermentação parou quando o valor de OD600 da cultura começou a diminuir. A cultura foi colhida e centrifugada. Heparosano foi recuperado a partir do sobrenadante.

[00100]A curva azul na figura 7 é a tendência de OD (oxigênio dissolvido na cultura). Devido à elevada densidade de células consumirem o oxigênio muito rapidamente, o DO foi para perto de 0 várias horas antes da colheita, enquanto que o fluxo de oxigênio puro foi ainda mantido. A fermentação foi parada algumas horas depois quando o OD 600 (densidade óptica da cultura a 600 nm de comprimento de onda de luz) começou a diminuir. A fermentação foi parada por interromper o fluxo de oxigênio, parando a agitação e, em seguida, o início da colheita.

[00101]Amostragem: aprox. 40 ml foram tomados para medir a densidade ótica a 600 nm, em seguida, centrifugados a 12.000 x g por 30 min. para separar o sobrenadante das células de E. coli. O sobrenadante e pélete celular foram congelados separadamente.

[00102]A análise de fermentação de amostra: o peso de células secas (DCW) foi medido por pesagem dos péletes de células secas sobre uma escala. A concentração de heparosano no sobrenadante foi medida por método de quantificação de RMN ou ensaio de carbazol após precipitação om etanol Song J-M et al. (2009) "A simple method for hyaluronic acid quantification in culture broth"Carbohydrate Polymers 78 (2009) 633-634. Wang Z et al (2009) Anal Biochem. 398(2):275-7.

[00103]Os resultados são mostrados nas Figuras 7, 8 e 9.

[00104]O heparosano produzido neste estágio de fermentação teve um peso molecular médio numérico de cerca de 58.000 Da, um peso molecular médio ponderal de cerca de 84.000 Da, e índice de polidispersão (PDI) de cerca de 1,4. A pureza é estimada em 95% ou acima.

EXEMPLO 3: Purificação de heparosano com cromatografia de quitosana.

[00105]A quitosana é um polissacarídeo linear composto de D-glucosamina ligada a β-(l-4)- e N-acetil-D-glucosamina distribuídas aleatoriamente como uma alternativa para a resina de troca aniônica para a purificação cromatográfica de heparosano. O grupo amino na quitosana (~ pKa 6,5) faz com que o mesmo seja carregado positivamente e solúvel sob condições ácidas e, portanto, apropriado para a purificação baseada em afinidade de heparosano carregado negativamente. A purificação do heparosano baseada em quitosana pode ser facilmente controlada com base na concentração de quitosana e no pH inicial. Além disso, a quitosana é barata, disponível com fornecimento abundante, e é biodegradável. Este exemplo descreve um método de separação baseado em quitosana solúvel para a recuperação eficiente de heparosano diretamente a partir do caldo de fermentação. Esta neutralização de carga baseada na separação usando quitosana potencialmente pode ser usada para a purificação de outras macromoléculas carregadas negativamente a partir de misturas de fermentação complexas.

[00106]O caldo de fermentação a partir da fermentação de 7 L de E. coli K5 foi centrifugado a 7000 rpm por 30 min para remover as células. 1. RMN baseado na quantificação do teor de heparosano no sobrenadante foi realizada. 2. O pH do sobrenadante foi ajustado para 4,0 usando solução de HCl seguido por centrifugação a 7000 rpm por 1 h para remover quaisquer impurezas que precipitam. 3. Após isso, o sobrenadante foi diluído 5 vezes usando água DI com pH 4,0. 4. 10 mg/ml de solução de quitosana foram preparados por dissolução de quitosana em solução de ácido acético a 1%. Para cada 10 mg de heparosano, 2,5 mg de quitosana foram adicionados ao sobrenadante usando a solução de 10 mg/ml de quitosana. 5. A mistura foi então agitada durante 10 min à temperatura ambiente para garantir uma mistura adequada da solução resultante. Isto foi seguido de incubação da mistura a 4°C durante a noite. 6. O complexo de polieletrólito de quitosana-heparosano formou um precipitado que decantou e foi recuperado usando centrifugação a 8000 rpm por 1 h. 7. Isto foi seguido por lavagem do precipitado com água DI em pH 4,0 e centrifugação novamente a 8000 rpm por 1 h. 8. A quitosana perde a sua natureza catiônica sob condição básica levando a ruptura do complexo eletrostático, levando ao heparosano livre em solução e quitosana insolúvel. O pélete lavado foi colocado em solução de NaOH 1M e incubado durante a noite para recuperar heparosano em solução. A quitosana insolúvel foi removida através de filtração ou centrifugação a 10.000 rpm por 2 h. Esta etapa pode ser acoplada com uma etapa de troca catiônica ou uma etapa de troca aniônica para remover as impurezas do processo que levam à purificação adicional do heparosano recuperado.

Exemplo 3A

[00107]Usando o procedimento acima, o heparosano foi purificado a partir do caldo de fermentação usando resina de fluxo rápido de DEAE-Sepharose no modo de coluna, seguido por precipitação com quatro volumes de etanol. O heparosano recuperado foi então dialisado usando membranas de 3500 MWCO contra água DI. A solução dialisada foi então liofilizada após redução de volume usando um evaporador rotativo.

[00108]Uma solução de 1 mg/ml deste heparosano purificado foi então preparada por dissolução da mesma em água desionizada com pH 4,0. Seis amostras diferentes são preparadas pelo uso de 10 ml de 1 mg/ml de solução e adição de quantidades variáveis de quitosana na faixa de 2-6 mg usando 10 mg/ml de solução de quitosana em ácido acético a 1%. As amostras foram incubadas a 4°C durante a noite. O complexo de polieletrólito precipitado foi recuperado por centrifugação destas amostras a 8000 rpm por 1 h. Uma solução de NaOH 1 M foi então adicionada aos péletes obtidos sem a lavagem com água DI com pH 4,0. Quitosana insolúvel foi removida por centrifugação a 10.000 rpm por 2 h. As amostras recuperadas e os sobrenadantes foram então analisados quanto à presença de heparosano usando o ensaio de carbazol.

[00109]De acordo com o ensaio de carbazol, 100% de recuperação de heparosano foi alcançada a pH 4,0 por adição de 4 mg de quitosana a 10 ml de 1 mg/ml de solução de heparosano.

Exemplo 3B

[00110]Em uma experiência adicional, o sobrenadante obtido após a centrifugação pós-fermentação foi condicionado por adição de ácido clorídrico para pH 4,0. Isto foi seguido por centrifugação a 8000 rpm por 1 h para a remoção de impurezas que precipitam. O sobrenadante foi então ajustado novamente para um pH de 4,0 usando solução de NaOH 1 M. A quantificação por RMN desta amostra com pH ajustado revelou que não houve perda de heparosano nestas amostras.

[00111]Estas amostras foram então diluídas cinco vezes, usando água desionizada com pH 4,0. Após isso, seis amostras de 10 ml cada, foram preparadas por adição de quitosana na faixa de 2-8 mg por amostra, usando 10 mg/ml de solução de quitosana em ácido acético a 1%. As amostras foram incubadas a 4°C durante a noite. O complexo de polieletrólito precipitado foi recuperado por centrifugação destas amostras a 8000 rpm por 1 h. Uma solução de NaOH 1M foi então adicionada aos péletes obtidos sem lavagem dos mesmos com água DI com pH 4,0. Quitosana insolúvel foi removida por centrifugação a 10.000 rpm por 2 h. As amostras recuperadas e os sobrenadantes foram então analisados quanto à presença de heparosano usando o ensaio de carbazol. Os ensaios de carbazol das amostras mostraram ~ 70% de purificação de heparosano a partir do caldo de fermentação.

[00112]A invenção fornece um método de purificação eficiente para a recuperação de heparosano a partir do caldo de fermentação. A quitosana empregada neste processo é barata, prontamente disponível, biocompatível e biodegradável. Estas propriedades tornam a mesma ideal para uso como um precipitante para a purificação de heparosano, que pode ser enzimaticamente modificado para heparina que pode ser distribuída por via intravenosa. A invenção também fornece uma etapa crítica de concentração, reduzindo assim o volume de trabalho envolvido neste processo, em comparação com as etapas de precipitação de etanol comumente empregadas. Os volumes de trabalho para a precipitação com etanol, por exemplo, em alguns casos excedem os volumes de fermentação. A natureza biocompatível e biodegradável de quitosana torna a mesma muito mais favorável em comparação com outros policátions que são tóxicos na natureza como, cloreto de cetilpiridínio (CPC) e poli(cloreto de dialildimetilamônio). Além disso, este método tem o potencial para a purificação de outros tais polissacarídeos como o ácido hialurônico e proteínas ácidas, bem como o DNA.

[00113]Esta invenção também fornece uma recuperação de custo eficaz de polissacarídeo capsular bacteriano, heparosano K5, a partir do caldo de fermentação usando precipitação para uso potencial para o desenvolvimento de heparina bioprojetada. O método emprega policátions naturalmente derivados, que são biocompatíveis e biodegradáveis, fornecendo, assim, uma tecnologia de purificação eficiente e segura para os fármacos distribuídos por via intravenosa tais como a heparina. Os altos rendimentos obtidos através deste método o tornam ideal como uma etapa de concentração, reduzindo, assim, o volume de trabalho. A facilidade de recuperação desta etapa e a sua compatibilidade com outras etapas na síntese quimioenzimática de heparina bioprojetada o torna ideal para uso como um processo de purificação. Este método tem um potencial para a remoção de outros polissacarídeos aniônicos e proteínas derivadas a partir da fermentação bacteriana, bem como espécies negativas altamente carregadas, tais como DNA.

Claims (14)

1. Método de produção de heparosano substancialmente puro a partir de E.coli K5, caracterizado por compreender: (a) cultivar E.coli K5 em meio definido com glicose como fonte principal de carbono em que a cultura consiste em uma fase de crescimento em batelada e um estágio de crescimento de batelada alimentada, em que (i) o meio usado no estágio de crescimento de batelada compreende (por litro), 18g a 22 g de glicose, 10-300 mg tiamina, 12,15g a 14,85g de KH2PO4; 3,6g a 4,4 g de(NH4)2HPO4, 1,26g a 1,54 g de MgSO4.7H2O, 1,53 g a 1,87 g ácido cítrico, e 9,0 mL a 11,0 mL de solução de metais traços; em que a solução de metais traços consiste em (por L de HCl 5 M) 10,0 g de FeSO4.7H2O, 2,0 g de CaCl2, 2,2 g de ZnSO4.7H2O, 0,5 g de MnSO4.4H2O, 1,0 g de CuSO4.5H2O, 0,1 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O, e 0,02 g de Na2B4O7.10H2O e em que; (ii) o meio de alimentação usado no estágio de crescimento de batelada alimentada consiste em (por L): 250-1000 g de glicose, 20 g de MgSO4, 0,15-0,5 g de tiamina e, opcionalmente, 47 g de KH2PO4, e (iii) em que o oxigênio é fornecido pelo ar aspergido com ou sem oxigênio suplementar (b) ligar heparosano a uma fase sólida com eluição subsequente; e (c) precipitar heparosano a partir do eluato; em que o referido heparosano substancialmente puro é pelo menos 90% puro.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que oxigênio dissolvido é mantido de 18 a 22%.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura é mantida de 33,3°C a 40,7°C, e o pH é mantido a 6,3 a 7,7.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido pH é mantido pela adição de solução de amônia a 29%.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio usado no estágio de batelada alimentada é alimentado a uma taxa determinada por

MS é a taxa de fluxo de massa da fonte de carbono (g/h); F é taxa de fluxo de alimentação (L/h); SF é a concentração de substrato de carbono na alimentação (g/l); X é a concentração de células (g/l dcw); m é o coeficiente de manutenção específica (g/g dcw/h); V é o volume de cultura (L); t0 é o tempo de início de alimentação; t é o tempo de processo; μ é a taxa de crescimento específico (h-1); e Yx/s é rendimento de células no substrato de carbono (g/g).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que mais de 12 g de heparosano por L do sobrenadante de cultura são obtidos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida fermentação é menos de 48 horas, não incluindo a cultura iniciadora.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de ligação e eluição compreende (i) remoção de células, (ii) mistura de uma resina de troca aniônica com a cultura de sobrenadante e a remoção do sobrenadante (iii) lavagem da resina com cloreto de sódio 50 mM em tampão de acetato de sódio a pH 4 (iv) eluição com cloreto de sódio 1 M em tampão acetato de sódio a pH 4.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida etapa de ligação e eluição compreende a remoção de células, (i) mistura de uma solução de quitosana com o sobrenadante de cultura (ii) precipitação da quitosana e isolamento do precipitado; (iii) lavagem da quitosana, (iv) eluição de heparosano com 0,9M a l,1M de NaOH.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida precipitação de heparosano a partir do eluato compreende a precipitação com etanol.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda despirogenação com peróxido de hidrogênio.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o heparosano tem menos que 1% de DNA e menos que 2% de proteína.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o heparosano tem um peso molecular médio numérico de 52.200 Da a 63.800 Da, um peso molecular médio ponderal de 75,600 Da a 92.400 Da, e índice de polidispersão (PDI) de 1,26 a 1,54.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o heparosano é pelo menos 95% puro.

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