CN103228781B - 软骨素的生物技术制备 - Google Patents
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Abstract
通过培养重组微生物制备软骨素，所述重组微生物通过使产生软骨素的果糖基化衍生物的微生物中编码负责将果糖残基加至线性软骨素多糖的酶的基因失活而获得。
Description
发明目的
本发明涉及一种产生软骨素的新的重组微生物以及软骨素的生物技术制备方法。
在本发明中，术语软骨素指定义为线性糖胺聚糖的线性多糖，其由通过β1-3(GlcUA→GalNAc)键和β1-4(GalNAc→GlcUA)键连接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替残基构成。
发明背景
硫酸软骨素为糖胺聚糖，其中糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)经β1-3键和β1-4键分别地线性和交替连接，以形成在其GalNAc残基中进行不同程度的硫酸化的线性多糖链。
其存在于动物中，在软骨和结缔组织中，在细胞黏着、组织再生、神经延伸等中起到重要作用。
从非动物源制备软骨素是通向非动物来源的硫酸软骨素制备的重要且期望的步骤。
已有的专利文献描述了几种制备非动物来源的软骨素的方法。
此外，已经克隆并测序了来自动物和微生物的几种软骨素合酶基因。
已经提供了使用导入来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的软骨素合酶基因的重组革兰氏阳性芽孢杆菌制备软骨素的方法(US2007/0281342A1)。
另一发明描述了通过将来自大肠杆菌O5:K4:H4(Escherichia coliO5:K4:H4A)的kfoC和kfoA基因导入产生UDP-糖醛酸的细菌中制备软骨素的方法(WO2008/133350)。
另一发明描述了包括大肠杆菌O5:K4:H4软骨素合酶和前体反应的酶体系中的体外软骨素合成(US2009/0263867A1)。
已知大肠杆菌O5:K4:H4能够产生与软骨素具有相同主链结构的荚膜多糖(K4多糖)，果糖残基连接于其上的GlcUA残基(参见，例如N.Volpi，Glycoconj.J.,25:451-457(2008))。因此，K4多糖由重复的三糖单元组成，所述三糖单元包括经β1-3(GlcUA→GalNAc)连接的D-糖醛酸(GlcUA)部分和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)部分以及结合于所述GlcUA残基的C3-羟基的果糖残基。因此，果糖残基构成所得线性多糖的分支。
通过酸性条件中的水解处理已经实现果糖残基的去除(N.Volpi，Electrophoresis25，692-696(2004))。
尽管已经广泛研究了大肠杆菌O5:K4:H4荚膜抗原基因簇以及产生组成K4线性多糖的糖的代谢途径，迄今为止，还没有发现负责将果糖部分加至线性多糖得到K4多糖的糖基转移酶活性。
本发明的新特征为通过失活基因获得的重组微生物直接制备高分子量软骨素，所述基因编码负责将果糖残基加至软骨素主链的酶，从而消除了将K4多糖进行结合于GlcUA部分的果糖残基的水解去除来获得软骨素的需要。
发明详述
本发明的目的为提供产生软骨素的重组微生物，所述软骨素定义为分别由通过β1-3键和β1-4键连接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替残基组成的线性糖胺聚糖，其特征在于，在所述微生物中编码负责将果糖残基加至软骨素主链的酶的基因被失活。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种产生软骨素的重组微生物，其特征在于，所述微生物通过将原始存在于其中的基因进行失活而获得，所述基因编码负责将果糖残基加至线性软骨素主链的蛋白质，所述失活包括全部或部分缺失或取代所述基因或通过插入另外的核苷酸序列进行干扰。
根据本发明的一个优选方面，通过失活编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的基因获得的本发明的重组微生物来自属于大肠杆菌种的细菌、优选地属于包括公知的血清型如K1、K5、K7、K12的2类K抗原。
尽管根据本发明的代表性实施方案，具有产生软骨素能力的重组微生物来自大肠杆菌O5:K4:H4，可以使用任何属于K抗原类的微生物，不管其与大肠杆菌O5:K4:H4是否共享任何基因同源性。所述微生物的实例包括属于嗜血杆菌属的细菌，如流感嗜血杆菌(H.influenzae)(Branefors-Helander P.,Carbohydr.Res.,Vol.88，Jan15，1981)，弯曲杆菌属的细菌，如空肠弯曲杆菌(C.jejuni)(McNally DJ，Jarrell HC，LiJ，KhieuNH，Vinogradov E，Szymanski CM，Brisson JR,FEBS J.,Vol.272，No17，4407-4422，Sept.2005)，粘球藻属的细菌，如胶质粘球藻(G.gelatinosa)(Raungsomboon S，Chidthaisong A,Bunnag B，Inthorn D，Harvey NW，Water Res.,Vol.4，No2，3759-3766，Dec.2006)和弧菌属的细菌，如霍乱弧菌(V.cholerae)(Knirel YA,Widmalm G，Senchenkova SN，Jansson PE，WeintraubA,Eur.J.Biochem.,Vol.247，402-410，July1997)。
更优选地，产生软骨素的本发明的重组微生物所来自的细菌为大肠杆菌血清型O5:K4:H4，其含有编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的kfoE基因。
已知kfoE位于大肠杆菌（E.coli）K4抗原基因簇(GenBank AB079602)内，该基因簇含有本发明人发现的基因，与来自其它微生物的、可能参与细菌荚膜产生的基因具有显著同源性(T.Ninomiya，N.Sugiura，A.Tawada，K.Sugimoto,H.Watanabe and K.Kimata，J.Boil.Chem.,Vol.277，No24，21567-75，June14，2002)。
最优选用于获得本发明的重组微生物的细菌为大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41可由ATCC(美国典型培养物保藏中心,Manassas,Virginia,US)获得，保藏号ATCC23502。
根据本发明的代表性实施方案，所述重组微生物为产生软骨素的微生物，其中进行失活的基因为编码选自以下(A)、(B)和(C)的蛋白质的基因：
(A)包含SEQ ID N°2的氨基酸序列的蛋白质
(B)包含经缺失、取代或插入一个或多个氨基酸修饰的SEQ ID N°2的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质。
(C)包含与SEQ ID N°2的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质。
根据本发明的微生物为其中失活的基因为kfoE基因或选自以下(a)、(b)和(c)的DNA的微生物：
(a)包含SEQ ID N°1的核苷酸序列的DNA
(b)与包含互补于SEQ ID N°1的核苷酸序列的DNA杂交且编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的DNA，和
(c)包含与SEQ ID N°1的核苷酸序列具有至少50%同源性的核苷酸序列且编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
本发明的一个目的为一种产生软骨素的微生物，其中通过修饰kfoE的核苷酸序列获得kfoE失活，例如，通过全部或部分缺失或取代以上(a)、(b)或(c)所述的核苷酸序列。
本发明的另一目的为一种微生物，其中通过将一个或多个核苷酸插入以上(a)、(b)或(c)所述的核苷酸序列获得kfoE失活。
根据本发明最优选的方面，通过核苷酸缺失来失活编码假定的果糖基转移酶的kfoE基因，获得大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41(从此称为大肠杆菌K4)的重组衍生物。
本发明公开kfoE基因的破坏如何导致直接产生缺少果糖残基的K4多糖，即软骨素。
根据本发明另一优选的方面，通过使用破坏染色体基因的方法来获得本发明的重组大肠杆菌K4，在所述方法中PCR引物提供与靶向基因的同源性(Datsenko and Wanner，PNAS，Vol.97，No12，6640-6645，June6，2000)。
首先以外源卡那霉素抗性基因取代kfoE基因的核苷酸序列的大部分(“第一遗传修饰”)、然后使用FLP重组酶表达载体去除插入的基因(“第二遗传修饰”)，已将本发明的重组大肠杆菌K4菌株进行染色体kfoE基因的失活。
在所述第一遗传修饰后获得的称为大肠杆菌K4(ΔkfoE/kanR)的重组大肠杆菌K4菌株已根据布达佩斯条约于2010年4月30日保藏于德意志微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig,Germany)，保藏号DSM23578。
在所述第二遗传修饰后获得的称为大肠杆菌K4(ΔkfoE)的重组大肠杆菌K4菌株已根据布达佩斯条约于2010年5月26日保藏于德意志微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig,Germany)，保藏号为DSM23644。
kfoE基因的失活通过3个连续的细菌转化实现：第一，以Red重组酶表达质粒(pKD46)进行转化；第二，以来自适宜地修饰以提供与kfoE基因的同源性的模板质粒(pDK4)的DNA片段进行转化；第三，以表达酶FLP重组酶的辅助质粒(pCP20)进行转化。
为了获得大肠杆菌K4的第一遗传修饰，使用了pKD46质粒(GenBank:AY048746)和线性DNA片段。
在大肠杆菌K4转化的第一步骤中使用的pKD46质粒由来自噬菌体λ的2154个核苷酸和编码氨苄青霉素抗性的基因组成。当使用线性DNA片段时，该质粒促进提高速率的重组。
通过使用几对引物的PCR获得了在大肠杆菌K4的后续转化中所用的线性DNA片段，所述引物包含对于kfoE基因和携带卡那霉素抗性盒(GenBank:AY048743)的模板质粒pDK4的同源延伸。
该过程能够产生携带卡那霉素抗性盒的线性DNA片段，在其末端具有kfoE5’和3’同源末端。
在本发明的一个实施方案中，通过电穿孔实现细菌转化，选择电穿孔是由于其容易地产生双转化体的能力，所述双转化体可以从含有氨苄青霉素和卡那霉素的平板上回收。
然而，尽管电穿孔为优选的技术，该结果可以通过任何已知的转化方法实现，例如，氯化钙转化或葡聚糖-DEAE转化。
旨在证实大肠杆菌K4转化体(ΔkfoE/kanR)中以卡那霉素抗性盒取代原始DNA序列的正确位置，使用两个临近的位点特异性引物对进行了数个PCR扩增：第一引物对能够证明kfoE剩余5’末端与插入的kan基因之间新的连接的形成，而第二引物对能够证明插入的kan基因与kfoE剩余3’末端之间新的连接的形成。
用于除去卡那霉素抗性盒(“第二遗传修饰”)的辅助质粒为携带酵母FLP重组酶基因和氨苄青霉素抗性基因的质粒pCP20。pKD46和pCP20质粒均为温度敏感性载体，其在43℃生长后在后续从大肠杆菌K4的转化体菌株除去。
对大肠杆菌K4(ΔkfoE/kanR)进行测序分析，以证实卡那霉素抗性盒对kfoE基因的全部或部分取代。类似地，对大肠杆菌K4(ΔkfoE)进行了测序分析，以证实卡那霉素抗性盒的后续缺失，导致最终产生kfoE-破坏型菌株。
用于成功构建能够产生天然糖胺聚糖的非糖基化变体的重组大肠杆菌K4的方法应用广泛，可有利地应用于需要防止所述糖基化的其它糖基化产品。总之，开发了一种获得能够产生天然糖胺聚糖的非糖基化变体的微生物的一般性方法。
本发明的另一目的为提供用于软骨素的生物技术制备的方法，其包括以下步骤：
(1)在适宜的培养基中培养重组微生物，和
(2)从其肉汤培养物回收产生的软骨素。
在培养步骤中可以使用能够产生根据上述失活编码负责将果糖残基加至软骨素的酶的基因的方法获得的软骨素的任何重组微生物。
根据本发明的优选实施方案，从大肠杆菌K4获得的重组细菌例如大肠杆菌DSM23644用作具有直接产生软骨素的能力的重组微生物。
用于培养细菌大肠杆菌DSM23644的方法是可用于培养埃希氏菌属成员的一般性方法。所述方法基于优选地但不专一地使用含有以下(每升)的培养基：K2HPO43H2O9.7g、KH2PO48g、柠檬酸钠5H2O0.5g、MgCl27H2O0.2g、酪蛋白氨基酸20g、(NH4)2SO420g、葡萄糖2g、酵母提取物10g。高水平的软骨素制备可以通过适当调整基础培养基的组成和/或通过底物饲喂向所述培养物提供进一步的营养物实现。
设置培养条件，以使细菌生长和软骨素制备最大化。一般地，在25℃至40℃之间的温度进行培养8h至72h。
优选地，通过离心收集上清液并用于后续的纯化以及制备的软骨素的定性。
根据采用Rodriguez和Jann(Eur.J.Biochem.,Vol.117，117-124，October1988)所述的方法实现软骨素纯化。
简言之，用于纯化软骨素的方法是基于沉淀的几个步骤，始于培养物上清液，最后在真空下干燥。
回收产物的同一性可以通过很多方法证实，优选通过提供多糖链结构证据和不存在果糖残基的证据的方法的组合进行证实。
纯化样品不存在果糖可以有利地通过在已知从天然K4多糖释放果糖的条件下对产物进行酸水解、然后对任何释放的果糖进行特定测定来进行验证。该测试恒定地显示从细菌大肠杆菌DSM23644的培养物回收的多糖不含果糖，与从大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41获得的天然K4多糖相反，所述大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41恒定地产生多糖，所述多糖含有从K4多糖的结构式预计的量的果糖。
进一步的证实从细菌大肠杆菌DSM23644的培养物回收的产物的同一性通过将产物以酶软骨素酶ABC消化而获得，已知软骨素酶ABC将无果糖软骨素多糖而不是天然K4多糖完全降解为二糖。
换言之，软骨素酶ABC不能消化天然K4多糖。从细菌大肠杆菌DSM23644的培养物回收的产物的软骨素酶ABC消化实验产生从完全消化所预计的二糖产物的量，从而证实了多糖主链的性质、特别是不存在果糖残基。
根据本发明的一个实施方案，为了证实kfoE的功能为编码K4糖基转移酶活性的基因，构建了携带野生型kfoE核苷酸序列的重组质粒，并将其导入大肠杆菌K4菌株(ΔkfoE)，以介导丧失功能的互补。
简言之，扩增kfoE基因并在NcoI和BamHI限制性位点内克隆到pTrcHis质粒(Invitrogen Corporation,5791Van Allen Way PO B ox6482Carlsbad,California)。使用构建体pTrcHis-kfoE通过电穿孔转化重组大肠杆菌(ΔkfoE)，在含有100μg/mL氨苄青霉素的平板上于37℃选择转化体。
根据Rodriguez和Jann(Eur.J.Biochem.,Vol117，117-124，October1988)培养携带构建体pTrcHis-kfoE的大肠杆菌(ΔkfoE)转化体并纯化K4多糖，为了量化回收的产物中存在的多糖，在于99℃以0.2M三氟乙酸水解1h之前及其后测定游离果糖。在水解前后测定的游离果糖已作为结合于起始K4分子的果糖。
从以pTrcHis-kfoE转化的大肠杆菌DSM23644的培养物回收的产物显示存在结合的果糖，证实该菌株中缺失的果糖基转移酶活性由质粒互补。
附图说明
图1示意性地显示对大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41进行遗传修饰，从而构建大肠杆菌K4(ΔkfoE/kanR)和大肠杆菌K4(ΔkfoE):
a)携带卡那霉素抗性盒(卡那霉素)的DNA片段被两个FRT(翻转酶识别靶)重组序列侧接;卡那霉素抗性基因通过使用P1和P2引发位点来自pKD4质粒模板。
b)大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41的K抗原基因簇的详细结构，其中kfoD和kfoF为kfoE的侧翼基因。
c)大肠杆菌K4(ΔkfoE/kanR)染色体DNA显示通过以卡那霉素抗性基因(卡那霉素)取代原始DNA的片段而破坏kfoE基因。
d)大肠杆菌K4(ΔkfoE)染色体DNA显示最终缺失kfoE基因的大部分。
图2显示在3个大肠杆菌K4(ΔkfoE/kanR)转化体上进行PCR扩增的结果，以证实3’和5’kfoE剩余侧翼区的序列：
泳道1和10显示分子量标记(1Kb梯度);
泳道2-4:3个转化体的剩余kfoE3’末端的PCR产物；
泳道6-8:3个转化体的剩余kfoE5’末端的PCR产物；
泳道5和9:分别使用3’和5’引物对获得的大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41的PCR产物。
图3显示大肠杆菌DSM23644产生的多糖的层析谱，在用软骨素酶ABC消化后通过毛细管电泳进行分析，其中显示典型的以软骨素酶ABC进行软骨素消化的不饱和Δ-二糖(Δdi-0S)(峰8)。
图4显示根据实施例3获得的大肠杆菌DSM23644产生的软骨素的13C-NMR谱。
实施例
实施例1:
构建大肠杆菌K4(ΔkfoE/kanR)菌株
携带kanR基因和kfoE同源末端的线性DNA片段(图1a)的构建通过PCR实现，所述PCR使用pKD4载体作为模板和以下PCR引物：
OL151:atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc(SEQ ID N°3)
OL152:tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcctta(SEQ ID N°4)
在各寡核苷酸序列中，起始40个核苷酸提供kfoE基因同源性，而剩余20个核苷酸提供pKD4模板质粒同源性(P1和P2引发位点)。
根据以下条件，对120ng模板DNA进行PCR：
94℃x3min，(94℃x1min,40℃x1min,68℃x2min)x5循环，(94℃x1min,59℃x1min,68℃x2min)x30循环，68℃x10min,4℃x10min。
凝胶纯化PCR产物并转化细菌。
根据Datsenko和Wanner(PNAS，Vol.97，No12，6640-6645，June6，2000)制备大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41(Fig.1b)并通过电穿孔以pKD46转化，然后铺板到含有氨苄青霉素的培养基上。
识别并分离氨苄青霉素抗性转化体。
通过质粒提取以及使用以下引物和条件的PCR验证两个转化体：
OL149:ccactcataaatcctcatagag(SEQ ID N°5)
OL150:ccaacttacttctgacaacgat(SEQ ID N°6)
以94℃x3min，(94℃x1min,43℃x1min,68℃x2.5min)x30循环，68℃x10min，4℃x10min
通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，鉴别大小为1799碱基对的产物，完全符合预计的产物大小。
两个pKD46转化体之一进行后续的电穿孔，使用携带卡那霉素抗性盒和kfoE同源末端的DNA片段进行。
使用含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基上的平板筛选来分离携带以卡那霉素抗性基因取代kfoE核苷酸序列的大部分的重组体。
通过使用合适的以下引物，PCR扩增kfoE3’和5’侧翼区证实了3个双转化体：
OL153:aatccgacggggactgtagatt(SEQ ID N°7)
OL142:aactgttcgccaggctcaag(SEQ ID N°8)
OL143:gcgttttcccttgtccagat(SEQ ID N°9)
OL154:gctaatgtatatgattgccaggt(SEQ ID N°10)
以95℃x5min,(94℃x1min,47℃x1min,68℃x2min)x30循环,68℃x10min,4℃x10min
通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，分别鉴定了kfoE基因的3’末端扩增大小为1773碱基对和kfoE基因的5’末端扩增大小为769碱基对的两个产物，与预计的产物大小完全相符(图2)。
为了验证卡那霉素抗性基因的方向并确保基因转录的正确方向，通过使用以下寡核苷酸、通过大肠杆菌K4(ΔkfoE/kanR)的序列分析(图1c)进行转化体的进一步分析：
OL153:aatccgacggggactgtagatt(SEQ ID N°7)
OL154:gctaatgtatatgattgccaggt(SEQ ID N°10)
所得到的核苷酸序列鉴定为SEQ ID N°14。
实施例2:
构建大肠杆菌K4(ΔkfoE)菌株
为了获得缺乏卡那霉素抗性盒并携带kfoE基因的大部分缺失附带丧失功能的大肠杆菌K4菌株(ΔkfoE)，以pCP20质粒进行进一步的大肠杆菌K4菌株(ΔkfoE/kanR)的转化。
电穿孔步骤后，于30℃在含有氨苄青霉素的培养基上筛选转化体，然后纯化集落。
于43℃在非选择性平板上培养假定的转化体，然后测试所有抗生素抗性的丧失。
使用以下寡核苷酸，通过测序kfoE侧翼3’和5’剩余末端(图1d)证实大肠杆菌K4菌株(ΔkfoE)转化体：
OL169:tgaggtgattgttggtaaaccttggtg(SEQ ID N°11)
OL166:tactgtttctgcttgcccccgagtt(SEQ ID N°12)
所得到的核苷酸序列鉴定为SEQ ID N°13
实施例3:
大肠杆菌DSM23644的培养和软骨素分析
根据Rodriguez和Jann(Eur.J.Biochem.Vol.117，117-124，October1988)进行大肠杆菌DSM23644的培养。
简言之，实现培养物的营养阶段，始于0.5ml解冻的培养物储液，温育含有20ml由以下(每升)组成的肉汤培养物的瓶：9.7g K2HPO43H2O、8g KH2PO4、0.5g柠檬酸钠5H2O、MgCl27H2O0.2g、酪蛋白氨基酸20g、硫酸铵20g、葡萄糖2g、酵母提取物10g，于37℃温育16h，伴随180rpm和2.5cm位移的震荡。
后续的培养阶段在肉汤培养物中进行，其在含有85ml如上所述的肉汤培养物的500ml-带平板的瓶中，以0.05%如上制备的营养培养物温育，并于37℃温育48h，伴随180rpm和25cm位移的震荡。
在温育的最后，通过离心收集培养物并将上清液纯化，以分离和定性制备的软骨素。
根据采用Rodriguez和Jann(Eur.J.Biochem.Vol.117，117-124，October1988)所述的方法实现软骨素纯化。
简言之，通过Cetavlon(烷基－三甲基溴化铵,CAS N°7192-88-3)从培养物上清液沉淀多糖，于3℃以NaOH0.5M提取，中和并随后通过3轮以80%乙醇沉淀进行纯化。
纯化的最后步骤以90%冷苯酚pH6.8进行，以沉淀污染性蛋白质，从而通过离心回收水相。通过以80%乙醇沉淀和真空干燥从水相回收纯化的软骨素。
使用几种分析方法来确定制备的软骨素的性质。
第一种方法是基于在以0.2M三氟乙酸于99℃水解1h后在从培养物回收的产物中存在或不存在果糖。
为了量化回收产物中存在的果糖，在水解前及其后测定游离果糖。使用BIOCONTROL(BioControl Systems Inc.12822SE32nd StreetBellevue,WA98005,United States)供应的EnzyPlusSucrose/D-Glucose/D-Fructose试剂盒，酶学测定果糖。
水解后存在的游离果糖与水解前存在的游离果糖的差作为结合于起始K4分子的果糖。
从大肠杆菌DSM23644的培养物回收的产物显示不存在结合的果糖，证实该菌株产生无果糖的多糖。
通过以软骨素酶ABC的酶解证实从如上所述的大肠杆菌DSM23644的培养物回收的多糖不存在结合的果糖。进一步表明当以软骨素酶ABC消化时，纯化的软骨素产生软骨素消化典型的不饱和Δ-二糖(Δdi-0S)，如使用胶囊电动层析(MECK)技术的毛细管电泳(CE)所证实(图3)。
通过使用合适的Δ-二糖参照标准(相当的电泳洗脱)获得Δdi-0S结构的证实。
通过外部校准曲线实现获得的Δdi-0S的定量测定。
最后，通过C13NMR定性由大肠杆菌DSM23644产生的纯化的软骨素多糖(图4)。
该技术表明目标产物与通过酸水解从天然K4多糖除去果糖后获得的产物惊人地相同。
实施例4:
kfoE功能的质粒介导的互补
为了证实kfoE作为编码K4果糖基转移酶活性的基因的功能，构建携带野生型kfoE核苷酸序列的重组质粒并导入大肠杆菌K4菌株(ΔkfoE)，以介导丧失功能的互补。
使用以下寡核苷酸扩增kfoE基因：
OL172:acaacatgttactaataatgtctggttcctatgttc(SEQ ID N°15)
OL173:actggatccttatcatactgcagcctcctta(SEQ ID N°16)
使用pTrcHis质粒(4400bp-Invitrogen Corporation,5791Van AllenWay PO Box6482Carlsbad,California)将扩增并凝胶纯化的kfoE基因(1569bp)导入合适的克隆位点。
于25℃对70ng经NcoI和BamHI限制性酶消化的pTrcHis载体和75ng具有相容性PciI/BamHI消化末端的kfoE基因进行连接反应15min。
然后以5μL连接混合物对50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(Invitrogen Corporation,5791Van Allen Way PO Box6482Carlsbad,California)进行电穿孔，在含有100μg/mL氨苄青霉素的平板上于37℃筛选5个转化体。
纯化集落后，提取构建的质粒pTrcHis-kfoE并通过Mfe I限制性酶消化，该酶能够切除插入的kfoE序列内的DNA构建体。
通过凝胶电泳分析，在Mfe I消化后，5个转化体中的3个显示预计的长度5887bp，且序列分析证实正确插入kfoE基因。
经证实的pTrcHis-kfoE构建体用于通过电穿孔转化重组大肠杆菌DSM23644，并在含有100μg/mL氨苄青霉素的平板上筛选转化体。
根据实施例3描述的条件培养筛选的转化体，并根据Rodriguez和Jann(Eur.J.Biochem.Vol117，117-124，October1988)纯化K4多糖。
为了量化回收产物中存在的果糖，在于99℃以0.2M三氟乙酸水解1h之前及其后测定游离果糖。使用EnzyPlusSucrose/D-Glucose/D-Fructose试剂盒酶法测定果糖。
水解后存在的游离果糖与水解前存在的游离果糖的差作为结合于起始K4分子的果糖。
从以pTrcHis-kfoE转化的大肠杆菌DSM23644的培养物回收的产物显示存在结合的果糖，证实该菌株中缺失的糖基转移酶活性由质粒互补。
Claims (11)
1.产生软骨素的重组微生物，所述软骨素定义为由经β1-3(GlcUA→GalNAc)键和β1-4(GalNAc→GlcUA)键连接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替残基组成的线性糖胺聚糖，其特征在于所述重组微生物来自大肠杆菌种的细菌，在所述重组微生物中编码负责将果糖残基加至线性软骨素主链的酶的原始存在于所述细菌中的kfoE基因被失活，所述失活通过全部或部分缺失或取代所述基因或者通过插入另外的核苷酸序列的干扰进行，其中所述kfoE基因编码选自以下的蛋白质：
(A)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白质；
(B)包含经缺失、取代或插入一个或多个氨基酸修饰的SEQ ID NO 2的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质；和
(C)包含与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少50％的同源性的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质，
其中所述重组微生物为大肠杆菌DSM23578或大肠杆菌DSM23644。
2.根据权利要求1的重组微生物，其中被失活的kfoE基因为选自以下的DNA：
(a)包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的DNA；
(b)与包含互补于SEQ ID NO 1的核苷酸序列的DNA杂交且编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；和
(c)包含与SEQ ID NO 1的核苷酸具有至少50％的同源性的核苷酸序列且编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。
3.根据权利要求1和2任一项的重组微生物，其来自属于2类K抗原的大肠杆菌种的血清型。
4.根据权利要求3的重组微生物，其来自大肠杆菌O5:K4:H4菌株U1-41。
5.根据权利要求1-4任一项的重组微生物，其中kfoE基因通过以卡那霉素抗性盒对其进行全部或部分取代而被失活，所述重组微生物为大肠杆菌DSM23578。
6.根据权利要求1-4任一项的重组微生物，其中kfoE基因通过以卡那霉素抗性盒对其进行全部或部分取代及其后续去除、得到全部或部分缺失kfoE基因而被失活，所述重组微生物为大肠杆菌DSM23644。
7.生物技术制备软骨素的方法，其中使用选自大肠杆菌DSM23578和大肠杆菌DSM23644的重组微生物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述重组微生物为大肠杆菌DSM23644。
9.生物技术制备软骨素的方法，其包括以下步骤：
a.在合适的培养基中培养权利要求1－6任一项的重组微生物
b.回收并纯化微生物培养物中存在的软骨素。
10.根据权利要求9的生物技术制备软骨素的方法，其中所述重组微生物为大肠杆菌DSM23578或大肠杆菌DSM23644。
11.根据权利要求10的方法，其中所述重组微生物为大肠杆菌DSM23644。
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