JP6478115B2 - タンパク質の血中滞留性の増強方法 - Google Patents

タンパク質の血中滞留性の増強方法 Download PDF

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Description

本発明は、タンパク質の血中滞留性を増強する技術に関する。
コンドロイチンは、グリコサミノグリカンの1種であり、グルクロン酸(GlcUA)とN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)の二糖構造[→4)-β-GlcUA-(1→3)-β-GalNAc-(1→]の繰り返しを基本骨格とする糖鎖である。コンドロイチンは、動物の体内では主に構成糖の水酸基の一部が硫酸化されたコンドロイチン硫酸として存在し、例えば、GalNAc残基の4位の水酸基が硫酸化されたコンドロイチン(コンドロイチン4硫酸)はコンドロイチン硫酸Aと呼ばれ、GalNAc残基の6位の水酸基が硫酸化されたコンドロイチン(コンドロイチン6硫酸)はコンドロイチン硫酸Cと呼ばれている。
特許文献1には、コンドロイチンが共有結合したタンパク質が記載されており、また、同タンパク質は、非修飾物質に比較して生体内減成に対する安定性が増大している旨が記載されている。しかし、特許文献1において、この「コンドロイチン」の語は、コンドロイチン4硫酸やコンドロイチン6硫酸等の「コンドロイチン硫酸」を意味するものとして用いられている(同文献第4頁左上欄参照)。
特許文献2には、生理的に活性なヒト トロンボモジュリン ポリペプチドであって、そのペプチド鎖にコンドロイチン及び/又はコンドロイチン硫酸を含む糖鎖を有する単離されたポリペプチド(タイプIIトロンボモジュリン ポリペプチド)が記載されている。また、特許文献2には、このポリペプチドは、コンドロイチン及び/又はコンドロイチン硫酸を含む糖鎖を実質的に有しないポリペプチド(タイプIトロンボモジュリン ポリペプチド)に比較してより高い活性を有していることを知見した旨、記載されている。
特許文献3には、グリコサミノグリカンにより修飾されたタンパク質が記載されており、また、同タンパク質は、未修飾タンパク質と比較して、生体内での安定性に優れ、且つ、生理活性を持続的に発現し得る旨が記載されている。また、特許文献4には、共有結合によりタンパク質に結合したグリコサミノグリカンを含む共有結合体が記載されており、また、グリコサミノグリカンの結合による薬物動態学的特性の改良について記載されている。特許文献3や4においては、コンドロイチンについて言及しているものの、コンドロイチンは、他の多くのグリコサミノグリカン(すなわち、コロミン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、テイクロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラト硫酸、ケラトポリ硫酸、およびこれらの誘導体)と同列の素材として例示されているにとどまる。実際、グリコサミノグリカンの種類によってタンパク質に結合させた場合の当該タンパク質の安定性が異なるか否かの開示や示唆はない。
また、これらの文献には、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンやコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンを利用することについての開示や示唆もない。
コンドロイチンは、自然界には線虫、ウシの眼の角膜、スルメイカやマダコの皮などに存在するとされているものの、その存在量が少なく、これらに由来するコンドロイチンを工業的規模で製造するのは非現実的である。そこで、コンドロイチンは、一般にコンドロイチン硫酸を脱硫酸化することによって製造されており、これが一般的にコンドロイチンとして利用されている。
近年、コンドロイチンを微生物に生産させる技術が報告されており、特許文献5〜7には、コンドロイチン生産能を有するエシェリヒア(Escherichia)属に属する細菌や、これらの細菌によって生産されたコンドロイチンが記載されている。また、特許文献8や9には、コンドロイチン合成酵素を利用してin vitroでコンドロイチンを合成する方法が開示されている。しかし、これらの文献には、細菌等の微生物によって生産されたコンドロイチンやコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンをタンパク質の血中滞留性の増強に利用することについての開示や示唆はない。
さらに、特許文献1〜9には、グリコサミノグリカンの種類や由来によってグリコサミノグリカンそのものの血中滞留性が異なることについての開示や示唆はなく、また、微生物によって生産されたコンドロイチンや酵素によって合成されたコンドロイチンが、他のグリコサミノグリカンに比して著しく長い血中滞留性を有することについての開示や示唆もない。そして、特許文献1〜9には、微生物によって生産されたコンドロイチンや酵素によって合成されたコンドロイチンをタンパク質に結合させた複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンや他のグリコサミノグリカンをタンパク質に結合させた複合体に比して著しく長い血中滞留性を有することについての開示や示唆もない。
特開昭62−255435号公報 国際公開第1991/4276号 特開平3−284698号公報 特表2000−501082号公報 特開2008−295450号公報 特表2010−524431号公報 特表2013−520995号公報 特許第4101548号公報 特許第5081629号公報
本発明は、タンパク質の血中滞留性を増強する技術を提供することを課題とする。
本発明者は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンは、他のグリコサミノグリカンに比して、著しく長い血中滞留性を有することを見出した。また、本発明者は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンをタンパク質に結合させて複合体を形成させることにより、他のグリコサミノグリカンをタンパク質に結合させた場合に比して、当該タンパク質の血中滞留性を著しく増強できることを見出した。さらに驚くべきことに、本発明者は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンは、コンドロイチン硫酸の脱硫酸化により生産されたコンドロイチンと比して、タンパク質と複合体を形成させた場合に当該タンパク質の血中滞留性を顕著に増強することも見出し、本発明を完成させた。
すなわち前記課題は、以下に例示する本発明によって解決される。
[1]
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび/またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンを有効成分として含有する、タンパク質の血中滞留性増強剤。
[2]
前記微生物が、細菌である、前記増強剤。
[3]
前記細菌が、エシェリヒア(Escherichia)属に属する細菌である、前記増強剤。
[4]
前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、前記増強剤。
[5]
前記コンドロイチン合成酵素が、コンドロイチンポリメラーゼである、前記増強剤。
[6]
前記コンドロイチンが、側鎖を有しないコンドロイチンである、前記増強剤。
[7]
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび/またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンと、タンパク質との複合体。
[8]
前記コンドロイチンと前記タンパク質とが共有結合によって複合体を形成している、前記複合体。
[9]
前記複合体を含有する、医薬組成物。
[10]
前記複合体を含有する、血中滞留性が増強されたタンパク質製剤。
[11]
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび/またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンと、タンパク質との複合体を形成させるステップを含む、タンパク質の血中滞留性の増強方法。
[12]
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび/またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンと、タンパク質との複合体を形成させるステップを含む、血中滞留性が増強されたタンパク質の製造方法。
[13]
複合体の形成が、共有結合の形成によって行われる、前記方法。
各種グリコサミノグリカンおよび微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質(アスパラギナーゼ)の血中滞留性を比較した図。 各種グリコサミノグリカンおよび微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質(インターフェロン)の血中滞留性を比較した図。 コンドロイチン硫酸を脱硫酸することによって製造したコンドロイチンおよび微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質(アスパラギナーゼ)の血中滞留性を比較した図。 各種グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化することによって製造したコンドロイチン、および微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質(オボアルブミン)の血中滞留性を比較した図。 微生物によって生産されたコンドロイチンと複合体を形成した場合の、タンパク質(成長ホルモン)の血中滞留性を示した図。 微生物によって生産されたコンドロイチンの血中滞留性を示した図。
[1]本発明で用いられるコンドロイチン
本発明で用いられるコンドロイチン(以下、「本発明のコンドロイチン」ともいう)は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび/またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンである。以下、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンを、「微生物由来コンドロイチン」ともいう。また、以下、コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンを、「酵素合成コンドロイチン」ともいう。この「微生物由来コンドロイチン」は、具体的には、例えば、コンドロイチン生産能を有する微生物を培養することにより生産されたコンドロイチンである。また、この「酵素合成コンドロイチン」は、具体的には、例えば、in vitroまたは無細胞系でコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンである。
「コンドロイチン」とは、グルクロン酸(GlcUA)とN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)の二糖構造[→4)-β-GlcUA-(1→3)-β-GalNAc-(1→]の繰り返しを基本骨格とする糖鎖をいう。同基本骨格を「コンドロイチン骨格」ともいう。コンドロイチンは、側鎖を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、コンドロイチンは、具体的には、コンドロイチン骨格に側鎖を有する糖鎖(以下、「側鎖を有するコンドロイチン」ともいう)であってもよく、コンドロイチン骨格に側鎖を有しない糖鎖(以下、「側鎖を有しないコンドロイチン」ともいう)であってもよい。側鎖としては、フルクトース(Fru)等の糖残基が挙げられる。側鎖を有するコンドロイチンとしては、GalNAc、GlcUA、およびFruからなる三糖構造[→4)(β-Fru-(2→3))-β-GlcUA-(1→3)-β-GalNAc-(1→]が繰り返し重合して構成された糖鎖であるK4多糖(フルクトシル化コンドロイチン)が挙げられる。K4多糖としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K4株が生産する多糖が挙げられる。側鎖を有しないコンドロイチンとしては、本来的に側鎖を有しないコンドロイチン(側鎖を有しない形態で生産されたコンドロイチン)や側鎖を除去したコンドロイチンが挙げられる。側鎖を除去したコンドロイチンとしては、フルクトース残基を除去したK4多糖(脱フルクトシル化K4多糖)が挙げられる。側鎖は、例えば、酸加水分解反応により除去することができる(Lidholt K, Fjelstad M., J Biol Chem. 1997 Jan 31; 272(5): 2682-7.)。なお、「側鎖を有しないコンドロイチン」には、側鎖を全く有しないコンドロイチンに限られず、側鎖を実質的に有しないコンドロイチンも含まれるものとする。「側鎖を実質的に有しないコンドロイチン」とは、コンドロイチン骨格を構成する糖残基の総数に対する側鎖を有する糖残基の数の比率が5%以下であるコンドロイチンをいい、コンドロイチン骨格を構成する糖残基の総数に対する側鎖を有する糖残基の数の比率が3%以下、1%以下、または0.5%以下であるコンドロイチンであってもよい。
コンドロイチンは、側鎖を有しないコンドロイチンであることが好ましい。よって、本発明の一態様においては、K4多糖等の側鎖を有するコンドロイチンは、「コンドロイチン」に含まれなくてもよい。また、コンドロイチンは、本来的に側鎖を有しないコンドロイチンであることも好ましい。よって、本発明の一態様においては、脱フルクトシル化K4多糖等の側鎖を除去したコンドロイチンも、「コンドロイチン」に含まれなくてもよい。
本発明において、「コンドロイチン」には、コンドロイチン硫酸は含まれないものとする。また、「本発明のコンドロイチン」には、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンは含まれないものとする。
本発明のコンドロイチンの分子量は、タンパク質と複合体を形成することによりタンパク質の血中滞留性を増強することができる限り、特に制限されない。本発明のコンドロイチンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、6×102〜1×106、3×103〜1×106、3×103〜1×105、または3×103〜5×104であってよい。また、本発明のコンドロイチンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、1×104以上であってよい。なお、ここでいう「重量平均分子量」は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量である。
<微生物由来コンドロイチン>
「コンドロイチン生産能を有する微生物」とは、本発明のコンドロイチンを生産する能力を有する微生物をいう。「本発明のコンドロイチンを生産する能力」とは、例えば、本発明のコンドロイチンそのものを生産する能力であってもよく、修飾されたコンドロイチンを生産する能力であってもよい。「修飾されたコンドロイチン」とは、本発明のコンドロイチンを製造する為の素材として用いることが可能な、コンドロイチン骨格を有する糖鎖をいう。「修飾されたコンドロイチン」としては、本発明のコンドロイチンに他の糖が結合してなる糖鎖が挙げられる。すなわち、「修飾されたコンドロイチン」としては、本発明のコンドロイチンが側鎖を除去したコンドロイチンである場合における、側鎖を有するコンドロイチンが挙げられる。例えば、K4多糖が微生物により生産される場合、K4多糖は、そのまま、あるいは好ましくは脱フルクトシル化して、本発明のコンドロイチンとして用いることができる。よって、K4多糖を生産する能力を有する微生物は、「コンドロイチン生産能を有する微生物」に含まれてよい。また、微生物によって生産されたK4多糖、およびそれを脱フルクトシル化して得られた脱フルクトシル化K4多糖は、いずれも、「微生物由来コンドロイチン」に含まれてよい。
「本発明のコンドロイチンを生産する能力」は、本発明のコンドロイチンそのものを生産する能力であるのが好ましい。よって、本発明の一態様においては、「コンドロイチン生産能を有する微生物」には、修飾されたコンドロイチンを生産する微生物は含まれなくてもよい。すなわち、例えば、本発明のコンドロイチンに他の糖が結合してなる糖鎖を生産する微生物は、生産された糖鎖から他の糖を除去しなければ本発明のコンドロイチンを取得することができないので、本発明における「コンドロイチン生産能を有する微生物」に含まれなくてもよい。具体的には、例えば、K4多糖等の側鎖を有するコンドロイチンを生産する微生物は、「コンドロイチン生産能を有する微生物」に含まれなくてもよい。
コンドロイチン生産能を有する微生物は、例えば、細胞内にコンドロイチンを生産する微生物であってもよく、培地中にコンドロイチンを生産する微生物であってもよく、菌体表層(例えば、細胞膜上や細胞壁上)にコンドロイチンを生産する微生物であってもよい。菌体表層にコンドロイチンを生産する微生物としては、莢膜多糖としてコンドロイチンを生産する微生物が挙げられる。
微生物の種類は特に限定されない。微生物としては、例えば、細菌や酵母が挙げられる。微生物としては、コンドロイチンの生産性や取り扱いの容易性などの点から、細菌が好ましい。
細菌の種類は特に限定されない。細菌としては、特許文献6に開示されているグルコノアセトバクター・ハンセニー(Gluconacetobacter hansenii)やグルコノアセトバクター・キシリナス(Gluconacetobacter xylinus)等のグルコノアセトバクター属細菌、リゾビウム・メフロティ(Rhizobium meffloti)等のリゾビウム属細菌、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum)等のアセトバクター属細菌、エルヴィニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)等のエルヴィニア属細菌、チオバチルス・フェロキシダンス(Thiobacillus ferrooxidans)等のチオバチルス属細菌、ザイレラ・ファスチジオーサ(Xylella fastidiosa)等のザイレラ属細菌、シノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium meliloti)等のシノリゾビウム属細菌、ロドコッカス・ロドクラス(Rhodococcus rhodochrous)等のロドコッカス属細菌、クレブシエラ・アエロゲネス(Klebsiella aerogenes)等のクレブシエラ属細菌、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等のエンテロバクター属細菌、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエシェリヒア属細菌が例示される。また、細菌としては、特許文献7に開示されているシュードモナス(Pseudomonas)属細菌、キサントモナス(Xanthomonas)属細菌、メチロモナス(Methylomonas)属細菌、アシネトバクター(Acinetobacter)属細菌、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属細菌などの非病原性生物も例示できる。また、細菌としては、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)も挙げられる。
細菌としては、コンドロイチンの生産性や、汎用性、取り扱いの容易性などの点で、エシェリヒア(Escherichia)属に属する細菌が好ましい。なかでも、特に汎用されており取り扱いが容易な、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が好ましい。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株(ATCC 27325)やMG1655株(ATCC 47076)等のエシェリヒア・コリK−12株;NCDC U1−41株(ATCC 23502)等のエシェリヒア・コリK4株;NCDC Bi 8337−41株(ATCC 23506)等のエシェリヒア・コリK5株;BL21株等のエシェリヒア・コリB株;およびそれらの派生株が挙げられる。これらの株は、例えば、American Type Culture Collection(ATCC)(P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 United States of America)やThe International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO), Statens Serum Institut(Building 37K, Room 125c Artillerivej 5 DK-2300 Copenhagen S Denmark)のカタログ又はホームページから入手可能である。
コンドロイチン生産能を有する微生物は、本来的に本発明のコンドロイチンを生産する能力を有する微生物であってもよく、本発明のコンドロイチンを生産する能力を有するように改変された微生物であってもよい。コンドロイチン生産能を有する微生物は、例えば、上記のような微生物にコンドロイチン生産能を付与することにより取得できる。
本来的に本発明のコンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリK4株やパスツレラ・ムルトシダ タイプFが挙げられる。エシェリヒア・コリK4株は、フルクトース残基を側鎖として有するコンドロイチン(K4多糖)を生産する。よって、エシェリヒア・コリK4株は、例えば、そのまま「コンドロイチン生産能を有する微生物」として用いられてもよいし、生産するコンドロイチン(K4多糖)がフルクトース残基を側鎖として有しないように改変され「コンドロイチン生産能を有する微生物」として用いられてもよい。そのようなエシェリヒア・コリK4株の改変株(生産するコンドロイチン(K4多糖)がフルクトース残基を側鎖として有しないように改変された株)は、例えば、エシェリヒア・コリK4株のkfoE遺伝子を不活性化して得ることができる。エシェリヒア・コリK4株のkfoE遺伝子の不活性化は、例えば、公知の文献(特表2013−531995)に記載された方法で行うことができる。
コンドロイチン生産能は、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより、付与できる。
コンドロイチン生産能が側鎖を有するコンドロイチンの生産能である場合、コンドロイチン生産能は、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、側鎖を付加する微生物に発現可能に導入することにより、付与できる。「側鎖を付加する微生物」は、例えば、側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。「側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物」は、該遺伝子を本来的に有する微生物であってもよく、該遺伝子を発現可能に導入した微生物であってもよい。
コンドロイチン生産能が側鎖を有しないコンドロイチンの生産能である場合、コンドロイチン生産能は、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、側鎖を付加しない微生物に発現可能に導入することにより、付与できる。「側鎖を付加しない微生物」は、例えば、側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有しない微生物である。「側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有しない微生物」は、該遺伝子を本来的に有しない微生物であってもよく、該遺伝子を欠失または不活性化させた微生物であってもよい。
コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, pmCS遺伝子が挙げられる。kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子としては、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)由来のpmCS遺伝子が挙げられる。側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子としては、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の塩基配列、及びこれらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等の公用データベースから取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。遺伝子は、1コピーのみ導入されてもよく、2コピーまたはそれ以上導入されてもよい。本発明においては、1種の遺伝子を導入してもよく、2種またはそれ以上の遺伝子を導入してもよい。
導入する遺伝子は、用いる微生物の種類等に応じて適宜選択できる。例えば、エシェリヒア・コリK5株は、グリコサミノグリカンの1種であるヘパロサンの生産能を有し、コンドロイチンの生産能を有さないが、kfoAおよびkfoC遺伝子を導入することにより、エシェリヒア・コリK5株にコンドロイチン生産能を付与することができる。また、例えば、エシェリヒア・コリK−12株は、コンドロイチンの生産能を有さないが、kfo遺伝子群(kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG)およびkps遺伝子群(kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT)を導入することにより、エシェリヒア・コリK−12株にコンドロイチン生産能を付与することができる。これらのコンドロイチン生産能を付与された株により、例えば、コンドロイチンを莢膜多糖として生産させることができる。莢膜多糖として生産されたコンドロイチンは、例えば、そのまま本発明のコンドロイチンとして用いてもよく、塩酸等の酸と接触させて処理し本発明のコンドロイチンとして用いてもよい。
また、コンドロイチン生産能を有する微生物は、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子の内、同微生物がもともと有する遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。例えば、エシェリヒア・コリK4株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリK5株に、kfoAおよびkfoC遺伝子に加えて、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子をさらに導入してもよい。なお、「微生物がもともと有する遺伝子」は、当該微生物由来の遺伝子であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、例えば、エシェリヒア・コリK4株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリK4株由来の遺伝子を導入してもよく、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリK4株以外の生物由来の遺伝子を導入してもよい。
コンドロイチン生産能を有する微生物としては、例えば、特許文献6または7に開示されているコンドロイチン生産能を有する細菌が挙げられる。
コンドロイチン生産能を有する微生物としては、特許文献6に記載されている「エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。また、コンドロイチン生産能が側鎖を有しないコンドロイチンの生産能である場合は、コンドロイチン生産能を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される1〜3または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリK5株が好ましい。エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子やkfoC遺伝子の導入は、例えば、特許文献6に記載された方法で行うことができる。
また、コンドロイチン生産能を有する微生物としては、特許文献7に記載されている「エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来のxylS遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。また、コンドロイチン生産能が側鎖を有しないコンドロイチンの生産能である場合は、コンドロイチン生産能を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来のxylS遺伝子が導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される1〜3または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG遺伝子を各4コピー、エシェリヒア・コリK4株由来のkpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子を各1コピー、及びシュードモナス・プチダ由来のxylS遺伝子を1コピー導入したエシェリヒア・コリが好ましい。なかでも、これらの遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリK−12株が好ましい。エシェリヒア・コリK−12株としては、エシェリヒア・コリK−12 W3110株を好ましく例示することができる。エシェリヒア・コリK−12 W3110株にこれらの遺伝子が導入された細菌株は、特許文献7において「MSC702株」として開示されている。これらの遺伝子の導入は、例えば、特許文献7に記載された方法で行うことができる。
なお、コンドロイチン生産能の付与等の微生物の改変に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知の遺伝子の塩基配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「相同性」とは、「同一性」を意味してよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、1箇所にまとまって若しくは数箇所に分散して、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。「1又は数個」とは、例えば、1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個であってよい。アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。微生物の改変に使用される遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドン(同じアミノ酸をコードする別のコドン)に置換したものであってもよい。例えば、微生物の改変に使用される遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度(宿主が発現するタンパク質をコードする核酸においてコドンとして使用される頻度)に応じて最適なコドンを有するように改変されていてもよい。
「微生物由来コンドロイチン」は、例えば、上記例示したようなコンドロイチン生産能を有する微生物を培養することで生産できる。培養条件は、コンドロイチン生産能を有する微生物が生育でき、コンドロイチンが生産される限り、特に制限されない。コンドロイチン生産能を有する微生物は、例えば、細菌や酵母等の微生物を培養する通常の条件で培養することができる。培養条件としては、例えば、特許文献5〜7に記載されている培養条件を参照できる。
培養後、公知の方法で培養物からコンドロイチンを単離し精製することができる。具体的には、例えば、コンドロイチンは、エタノール等の溶媒を利用して沈殿させ、回収することができる。また、コンドロイチンは、この沈殿物の再溶解と沈殿の繰り返しや、陰イオン交換その他のクロマトグラフィーなどによってさらに精製してもよい。
<酵素合成コンドロイチン>
「コンドロイチン合成酵素」とは、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基およびグルクロン酸(GlcUA)残基を糖鎖非還元末端に交互に付加し、コンドロイチン鎖を伸長する反応を触媒するタンパク質をいう。コンドロイチン合成酵素は、GalNAc残基の付加およびGlcUA残基の付加の両方を単独で触媒するタンパク質であってもよく、GalNAc残基の付加を触媒するタンパク質とGlcUA残基の付加を触媒するタンパク質の組み合わせであってもよい。コンドロイチン合成酵素としては、コンドロイチンポリメラーゼが挙げられる。コンドロイチンポリメラーゼは、GalNAc残基の付加およびGlcUA残基の付加の両方を単独で触媒する。コンドロイチンポリメラーゼとしては、kfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質やpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質が挙げられる。kfoC遺伝子としては、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoC遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)由来のpmCS遺伝子が挙げられる。コンドロイチン合成酵素としては、例えば、微生物由来のコンドロイチン合成酵素が好ましい。微生物由来のコンドロイチン合成酵素としては、具体的には、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質(K4CP)やパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)のpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質等の微生物が本来的に有するコンドロイチン合成酵素が好ましく例示される。中でも、KfoCタンパク質(K4CP)が好ましい。コンドロイチン合成酵素としては、1種のコンドロイチン合成酵素を用いてもよく、2種またはそれ以上のコンドロイチン合成酵素を用いてもよい。
コンドロイチン合成酵素としては、例えば、コンドロイチン合成酵素を産生する微生物の培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、該菌体の処理物、それらから分離したコンドロイチン合成酵素が挙げられる。すなわち、コンドロイチン合成酵素は、コンドロイチン合成酵素以外の成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。また、コンドロイチン合成酵素は、所望の程度に精製されていてよい。コンドロイチン合成酵素を産生する微生物は、本来的にコンドロイチン合成酵素を産生するものであってもよく、コンドロイチン合成酵素を産生するように改変されたものであってもよい。コンドロイチン合成酵素を産生する微生物は、例えば、コンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。
コンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。コンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子のバリアントについては、上述したコンドロイチン生産能の付与等の微生物の改変に使用される遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。
「酵素合成コンドロイチン」は、例えば、上記に例示したようなコンドロイチン合成酵素を、GlcUA供与体、GalNAc供与体、および糖受容体と、適当な反応系において共存させることにより合成できる。反応条件は、コンドロイチンが合成される限り、特に制限されない。反応条件は、コンドロイチン合成酵素の由来や態様、およびコンドロイチンの所望の重合度等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応条件としては、例えば、特許文献8または9に記載の条件を参照できる。
「GlcUA供与体」とは、コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン合成反応においてGlcUA残基を供給する分子をいう。GlcUA供与体の種類は、コンドロイチン合成反応に利用可能である限り特に限定されない。GlcUA供与体としては、GlcUAヌクレオチドが挙げられる。GlcUAヌクレオチドとしては、UDP−GlcUA(ウリジン5’−ジホスホ−グルクロン酸)が挙げられる。GlcUA供与体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。GlcUA供与体は、例えば、公知の手法により合成することができる。
「GalNAc供与体」とは、コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン合成反応においてGalNAc残基を供給する分子をいう。GalNAc供与体の種類は、コンドロイチン合成反応に利用可能である限り特に限定されない。GalNAc供与体としては、GalNAcヌクレオチドが挙げられる。GalNAcヌクレオチドとしては、UDP−GalNAc(ウリジン5’−ジホスホ−N−アセチルガラクトサミン)が挙げられる。GalNAc供与体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。GalNAc供与体は、例えば、公知の手法により合成することができる。
UDP−GalNAcは、例えば、UDP−Glc−4−エピメラーゼの作用により、UDP−GlcNAc(ウリジン5’−ジホスホ−N−アセチルグルコサミン)を変換して得ることができる。また、UDP−GlcUAは、例えば、UDP−Glcデヒドロゲナーゼの作用により、UDP−Glc(ウリジン5’−ジホスホ−グルコース)を変換して得ることができる。よって、UDP−Glc−4−エピメラーゼおよび/またはUDP−Glcデヒドロゲナーゼを利用することにより、UDP−GlcNAcおよび/またはUDP−GlcをGalNAc供与体および/またはGlcUA供与体として用いてコンドロイチンを合成することもできる。UDP−Glc−4−エピメラーゼとしては、kfoA遺伝子にコードされるKfoAタンパク質が挙げられる。UDP−Glcデヒドロゲナーゼとしては、kfoF遺伝子にコードされるKfoFタンパク質が挙げられる。kfoA遺伝子およびkfoF遺伝子としては、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子およびkfoF遺伝子が挙げられる。
「糖受容体」とは、コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン合成反応において、その非還元末端にGlcUA残基またはGalNAc残基が付加されることによりコンドロイチン鎖の伸長が開始される糖鎖(アクセプター)をいう。
糖受容体としては、下記一般式(I)または(II)で示される糖鎖が挙げられる。
GlcUA−R1 ・・・・(I)
GalNAc−R2 ・・・・(II)
(各式中、「R1」及び「R2」はそれぞれ任意の基を示す。)
「R1」及び「R2」としては、水酸基や1またはそれ以上の残基数の糖鎖が挙げられる。「R1」及び「R2」がそれぞれ糖鎖である場合、各式中、「−」はグリコシド結合を示す。糖鎖としては、コンドロイチン鎖、ヘパロサン鎖、ヒアルロン酸鎖が挙げられる。コンドロイチン鎖としては、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンや微生物由来コンドロイチンが挙げられる。また、糖鎖としては、これら糖鎖の誘導体も挙げられる。「糖鎖の誘導体」とは、原子、官能基、化合物等の構成要素が導入、置換、および/または除去された糖鎖をいう。糖鎖の誘導体としては、硫酸化された糖鎖や任意の糖が付加された糖鎖が挙げられる。すなわち、酵素合成コンドロイチンの糖受容体部分は、本発明のコンドロイチンに該当する構造を有していてもよいし、本発明のコンドロイチンに該当しない構造を有していてもよい。
一般式(I)において、非還元末端のGlcUA残基はβ構造であるのが好ましい。また、一般式(I)において、「R1」がGlcNAcやGalNAc等の糖残基を含み、非還元末端のGlcUA残基が「R1」の該糖残基と結合している場合、その結合はβ−1,3−グリコシド結合またはβ−1,4−グリコシド結合であるのが好ましい。
一般式(II)において、非還元末端のGalNAc残基はβ構造であるのが好ましい。また、一般式(II)において、「R2」がGlcUA等の糖残基を含み、非還元末端のGalNAc残基が「R2」の該糖残基と結合している場合、その結合はβ−1,4−グリコシド結合であるのが好ましい。
糖受容体の糖鎖の残基数は、コンドロイチンが合成される限り特に制限されない。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上であってよく、6以上であるのが好ましい。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、50以下、40以下、30以下、または20以下であってよい。
糖受容体としては、コンドロイチン鎖が好ましい。コンドロイチン鎖としては、本発明のコンドロイチンが好ましい。本発明のコンドロイチンとしては、微生物由来コンドロイチンが挙げられる。糖受容体としては、具体的には、例えば、6残基以上のコンドロイチン鎖を好適に用いることができる。
糖受容体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。糖受容体は、例えば、公知の手法により調製することができる。
また、反応系には、界面活性剤を共存させてよい。また、反応系には、有機溶媒を共存させてよい。界面活性剤や有機溶媒としては、特許文献9に記載されたものが挙げられる。
反応温度は、例えば、10〜50℃、20〜40℃、または25〜37℃であってよい。反応時間は、例えば、1時間〜10日間、10〜30時間、または15〜24時間であってよい。
上記のように反応を行うことにより、酵素合成コンドロイチンが合成される。酵素合成コンドロイチンは、上述した微生物由来コンドロイチンと同様にして、単離および精製することができる。
このようにして得られる「酵素合成コンドロイチン」は、コンドロイチン生産能を有する微生物が細胞内で行う反応を、微生物の培養以外の方法、例えば、in vitroまたは無細胞系で再現して得られるコンドロイチンである。すなわち、「酵素合成コンドロイチン」は「微生物由来コンドロイチン」と実質的に同一の反応を経て得られるコンドロイチンである。よって、両者は血中滞留性等において同質のコンドロイチンである。
[2]本発明の増強剤
本発明の増強剤は、本発明のコンドロイチンを有効成分として含有する、タンパク質の血中滞留性増強剤である。本発明の増強剤は、微生物由来コンドロイチン及び酵素合成コンドロイチンのいずれか一方のみを有効成分として含有していてもよく、これらの両者を有効成分として含有していてもよい。また、本発明の増強剤は、本発明のコンドロイチンからなるものであってもよく、その他の成分を含むものであってもよい。「その他の成分」は、本発明の増強剤の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の効果を損なわず、且つ薬理学的に許容される成分が挙げられる。
本発明の増強剤は、例えば、任意の剤形で製剤化されていてよい。剤形は、本発明の増強剤の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。製剤化は、公知の手法により行うことができる。
本発明の増強剤における本発明のコンドロイチンの濃度は、本発明の増強剤によりタンパク質の血中滞留性を増強できる限り、特に制限されない。本発明の増強剤における本発明のコンドロイチンの濃度は、本発明の増強剤の剤型、対象のタンパク質の種類、所望の血中滞留性等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の増強剤における本発明のコンドロイチンの濃度は、例えば、0.001〜100%(w/w)であってよい。
本発明の増強剤は、その有効成分である本発明のコンドロイチンと血中滞留性を増強させたいタンパク質とが複合体を形成するように用いられる。本発明の増強剤は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水、生理食塩水、または緩衝液等の薬理学的に許容される溶媒を用いて希釈、分散、又は溶解し、タンパク質の血中滞留性増強に用いてよい。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明の増強剤の範囲に含まれることは言うまでもない。
本発明の増強剤を適用するタンパク質は、血中滞留性の増強を所望するタンパク質であれば特に限定されない。タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体(multimer)タンパク質であってもよい。なお、「タンパク質」には、ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドと呼ばれる態様も含む。タンパク質としては、医薬として用いられるタンパク質(例えば、アスパラギナーゼ、インターフェロン、成長ホルモンなど)を例示することができる。また、タンパク質としては、試薬や動物試験に用いられるタンパク質(例えば、オボアルブミンなど)を例示することもできる。
本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成する方法は、両者が接触し、両者の複合体が形成される限り、特に制限されない。本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成する方法としては、例えば、グリコサミノグリカンとタンパク質との複合体を形成する公知の方法を用いることができる。
複合体における両者の結合様式は、複合体が維持される限り特に限定されない。複合体における両者の結合様式は、形成された複合体の安定性の点から、共有結合であるのが好ましい。本発明のコンドロイチンとタンパク質とを共有結合させる方法としては、例えば、グリコサミノグリカンとタンパク質とを共有結合させる公知の方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、特許文献1、3、4に記載された方法を例示できる。具体的には、例えば、本発明のコンドロイチンにアルデヒド基を導入し、当該アルデヒド基とタンパク質側鎖のアミノ基とを反応させることにより、本発明のコンドロイチンとタンパク質とを共有結合させることができる。
複合体における両者の比率は、タンパク質の血中滞留性を増強できる限り、特に制限されない。複合体における両者の比率は、例えば、タンパク質に対する本発明のコンドロイチンの重量比(本発明のコンドロイチンの重量/タンパク質の重量)が、0.01〜500または0.05〜200となるような比率であってよい。
本発明の増強剤の有効成分である本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させることで、本発明のコンドロイチンとの複合体を形成していない当該タンパク質に比して、当該タンパク質の血中滞留性が増強される。
[3]本発明の複合体
本発明の複合体は、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体である。
本発明の複合体を構成する本発明のコンドロイチンおよびタンパク質、本発明の複合体の形成方法、本発明の複合体におけるコンドロイチンおよびタンパク質の結合様式などは、「本発明の増強剤」において上述した通りである。したがって、例えば、本発明の複合体においても、本発明のコンドロイチンとタンパク質とが共有結合によって複合体を形成していることが好ましい。
本発明の複合体におけるタンパク質は、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、血中滞留性が増強されている。
[4]本発明の組成物
本発明の組成物は、本発明の複合体を含有する、医薬組成物である。本発明の複合体については、上述した通りである。なお、本発明の組成物は医薬組成物であるので、本発明の組成物に含有される本発明の複合体の構成成分であるタンパク質としては、上述したような「医薬として用いられるタンパク質」(例えば、アスパラギナーゼ、インターフェロン、成長ホルモンなど)が好ましく例示できる。
本発明の組成物は、本発明の複合体からなるものであってもよく、その他の成分を含むものであってもよい。「その他の成分」は、本発明の組成物の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の組成物の効果を損なわず、且つ薬理学的に許容される成分が挙げられる。
本発明の組成物は、例えば、任意の剤形で製剤化されていてよい。剤形は、本発明の組成物の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、本発明の組成物を血液中への投与(例えば、血管(動脈や静脈)内への投与)や皮下投与に用いる場合には、本発明の組成物は、注射剤(例えば、溶液形態、用時溶解用の乾燥形態など)の形態で提供することができる。製剤化は、公知の手法により行うことができる。
本発明の組成物における本発明の複合体の濃度は、本発明の組成物の投与により所望の効果が達成される限り、特に制限されない。本発明の組成物における本発明の複合体の濃度は、本発明の組成物の剤型、本発明の組成物に含まれるタンパク質の種類、本発明の組成物の投与目的等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の組成物における本発明の複合体の濃度は、例えば、0.001〜100%(w/w)であってよい。
本発明の組成物は、医薬組成物として、疾病の予防および治療等の医療的処置のために、対象に投与することができる。投与の対象は、疾病の予防および治療等の医療的処置が必要な動物である限り、特に限定されない。投与の対象としては、例えば、哺乳類が好ましく、なかでもヒトが好ましい。
本発明の組成物の投与方法は、本発明の組成物の剤型、本発明の組成物に含まれるタンパク質の種類、本発明の組成物の投与目的等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、本発明の組成物は、本発明の組成物に含まれるタンパク質が医薬として用いられる際に通常採用される方法で投与されてよい。投与方法として、具体的には、例えば、血液中への投与(例えば、血管(動脈や静脈)内への投与)や皮下投与を例示することができるが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水、生理食塩水、または緩衝液等の薬理学的に許容される溶媒を用いて希釈、分散、又は溶解し、対象に投与してよい。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明の組成物の範囲に含まれることは言うまでもない。
本発明の組成物に含有される本発明の複合体におけるタンパク質は、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、血中滞留性が増強されている。
[5]本発明の製剤
本発明の製剤は、本発明の複合体を含有する、血中滞留性が増強されたタンパク質製剤である。本発明の複合体については、上述した通りである。なお、本発明の製剤は、ヒト等の動物用の医薬製剤に加えて、試薬や動物試験用の製剤なども含む概念である。したがって、本発明の製剤に含有される本発明の複合体の構成成分であるタンパク質としては、上述したような「医薬として用いられるタンパク質」(例えば、アスパラギナーゼ、インターフェロン、成長ホルモンなど)や「試薬や動物試験に用いられるタンパク質」(例えば、オボアルブミンなど)が好ましく例示できる。
本発明の製剤については、上述した本発明の組成物に関する説明を準用できる。
本発明の製剤に含有される本発明の複合体におけるタンパク質は、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、血中滞留性が増強されている。
[6]本発明の増強方法
本発明の増強方法は、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、タンパク質の血中滞留性の増強方法である。また、本発明の増強方法は、言い換えると、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、血中滞留性が増強されたタンパク質の製造方法である。
本発明のコンドロイチン、タンパク質、複合体の形成方法、複合体における両分子間の結合様式などは、「本発明の増強剤」において上述した通りである。したがって、例えば、本発明の増強方法においても、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体形成は、共有結合の形成によって行われることが好ましい。
本発明の増強方法により、タンパク質の血中滞留性を、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、増強することができる。
なお、本発明において、「血中滞留性増強」およびこれに類する語は、血中滞留性付与、血中滞留性改善、血中滞留性向上、血中持続性付与、血中持続性増強、血中持続性改善、血中持続性向上、血中におけるタンパク質の活性維持などの思想を包含する。
また、本発明には、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、本発明の複合体の製造方法、本発明の組成物の製造方法、本発明の製剤の製造方法も包含される。これら製造方法については、前記の本発明の増強剤、本発明の複合体、本発明の組成物、本発明の製剤についての記載を準用できる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。しかしながら、実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
また、本実施例において、「分子量」とは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量を意味する。
<実施例1>本発明の複合体、組成物、および製剤の製造
(1)微生物由来コンドロイチンの製造
微生物由来コンドロイチンは、公知の方法に基づき、以下の手順で製造した。
まず、特許文献7に記載の方法に基づき、エシェリヒア・コリK−12 W3110株(ATCC 27325)に、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG遺伝子を各4コピー、エシェリヒア・コリK4株由来のkpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT遺伝子を各1コピー、及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来のxylS遺伝子を1コピー導入し、コンドロイチン生産能を有するエシェリヒア・コリK−12 MSC702株を構築した。
NZアミンHD 160g、Tastone 154 4g、MgSO4・7H2O 8g、Na2SO4 24g、クエン酸ナトリウム 2.4g、CaCl2・2H2O 296mg、Dow 1520US消泡剤0.8mLを脱イオン水に溶解して6Lに調製し、オートクレーブ後にグリセリン 48g、KH2PO4 48g、チアミンHCl 320μg、微量金属溶液(27g/L FeCl3・6H2O、1.3g/L ZnCl2、2g/L CoCl2・6H2O、2g/L Na2MoO4・6H2O、2.5g/L CaCl2・2H2O、3.3g/L MnCl2・4H2O、0.5g/L H3BO3、33g/L クエン酸、を含有する)24mLを各々無菌的に添加して培地とした。
この培地に、MSC702株の前培養液(OD600=9.0)50mLを接種して培養した。培養開始4時間後に、終濃度2mMとなるようにm−トルイル酸を添加し、さらに82時間培養した。培養中、炭素源としてグリセリンを、培養液中のグリセリン濃度が1g/L未満で維持されるように添加した。また、培養中、窒素源として水酸化アンモニウム(アンモニア水)を、培養液中のアンモニア濃度が100mg/L未満で維持されるように添加した。その他の主な培養条件は次のとおりである。
温度:29.8〜30.2℃、pH:7.1〜7.3、撹拌:150〜480cps、溶存酸素:50%、気流:3.4〜6.4L/分、酸素流:0〜3.1L/分。
培養終了後の総液量は8.4L、OD600は69であった。培養液をオートクレーブ処理して遠心分離し、上清を回収した。この培養上清中のコンドロイチンの濃度は、8.3g/Lであった。
この培養上清1L(コンドロイチン含量8.3g)に1Lの脱イオン水を添加して遠心分離し、上清を得た。この上清に4倍容のエタノールを添加し、沈殿した粗コンドロイチン画分を回収した。回収した粗コンドロイチン画分を250mLの脱イオン水に溶解して遠心分離し、上清を回収した。この上清を、電気伝導率が5mS/cm以下になるまで脱イオン水で希釈した。
この希釈溶液を、脱イオン水で平衡化したDEAEセファロース(GEヘルスケア)カラム(500mL)に通した。このカラムを1Lの脱イオン水、次いで1Lの100mM塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、2.5Lの300mM塩化ナトリウム水溶液でコンドロイチンを溶出した。溶出液を分画し、各画分中のコンドロイチン含量をカルバゾール−硫酸法(BITTER T, MUIR HM., Anal Biochem. 1962 Oct; 4: 330-4.)で定量した。コンドロイチンを含有する画分を合わせて(1.6L)、減圧下で200mLに濃縮した。この濃縮液に4倍容のエタノールを添加し、コンドロイチンを沈殿として回収した。
この沈殿を200mLのアルカリ水溶液(pH10以上)に溶解し、液温を40℃とした。これにアルカリプロテアーゼ(エスペラーゼ(登録商標)、ノボザイム)を5g添加し、40℃で一晩酵素反応させた。反応後の溶液を中和した後、4倍容のエタノールを添加して、コンドロイチンを沈殿として回収した。この沈殿を電気伝導率が5mS/cm以下になるように脱イオン水で溶解し、DEAEセファロース(GEヘルスケア)カラム(500mL)に通した。このカラムを1Lの100mM塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで100mMから500mMの塩化ナトリウム水溶液のグラジエント勾配でコンドロイチンを溶出した。
溶出液を分画し、各画分中のコンドロイチン含量をカルバゾール−硫酸法で定量して、コンドロイチンを含有する画分(170mM塩化ナトリウム濃度付近の溶出画分)を回収した。この画分を減圧下で濃縮し、2倍容のエタノールを添加して、コンドロイチンの精製品を沈殿として得た。このコンドロイチンの精製品を脱イオン水に溶解し、pH7となるよう中和した後、凍結乾燥させた。凍結乾燥後のコンドロイチン(精製品)の重量は4.2gであった。
後の実施例で、一般に汎用されているコンドロイチン(コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られたコンドロイチン)や各種グリコサミノグリカンとなるべく分子量を揃えて試験するため、上記で得られた微生物由来コンドロイチン(精製品)の分子量を以下のとおり調整した。
上記で得られた微生物由来コンドロイチン(精製品)を、終濃度1g/Lとなるように蒸留水に溶解した。この溶液に終濃度0.5Mとなるように塩酸を添加して60℃で維持し、反応開始30分後に中和して反応を停止させた。この反応物を分画分子量(MWCO)1Kの透析膜を用いて10Lの脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥させた。この操作を2回繰り返し、分子量48×103、46×103の各々の微生物由来コンドロイチン(凍結乾燥品)を得た。
また、同様の操作で反応開始4.5時間後、5時間後に各々反応を停止させ、同様に透析し、凍結乾燥させることによって、分子量7×103、5×103の各々の微生物由来コンドロイチン(凍結乾燥品)を得た。
以下、これらの微生物由来コンドロイチンを総称して「rCH」ともいう。また、分子量48×103のrCHを「rCH48」、分子量46×103のrCHを「rCH46」、分子量7×103のrCHを「rCH7」、分子量5×103のrCHを「rCH5」とそれぞれ略記する。
(2)タンパク質の入手
タンパク質は、以下の市販のものを用いた。
・L−アスパラギナーゼ(以下「Asp」。)(協和発酵キリン、製品名「ロイナーゼ」(登録商標))
・インターフェロンα2b(以下「IFN」。)(PROSPEC)
・オボアルブミン(以下「OVA」。)(シグマアルドリッチ)
・成長ホルモン(以下「GH」。)(サンド、製品名「ソマトロピンBS皮下注」)
(3)微生物由来コンドロイチンとタンパク質(Asp、IFN、OVA)との複合体の製造(共有結合形成)
まず、タンパク質のアミノ基と反応させるため、次の方法で微生物由来コンドロイチンにアルデヒド基を導入した。
微生物由来コンドロイチンを濃度50mg/mLとなるよう水に溶解し、これに1/2容量の2mg/mL 水素化ホウ素ナトリウム水溶液を添加して、室温で一晩反応させた。その後、3%(w/v)となる量の酢酸ナトリウムを添加し、次いで2倍容のエタノールを添加して沈殿を得た。この沈殿を5mLのリン酸塩緩衝液(pH7)に溶解し、5モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムを添加して4℃で1時間反応させた。この反応物に1/30容量のエチレングリコールを添加して再び4℃で1時間反応させた後、3%(w/v)となる量の酢酸ナトリウムを添加し、次いで2倍容のエタノールを添加して沈殿を得た。この沈殿を水に溶解して透析し、凍結乾燥させて、アルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチン(凍結乾燥品)を得た。
次に、このアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチンを、還元剤としてトリメチルアミンボランを用いてタンパク質と共有結合させた。
すなわち、タンパク質1mgとアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチン15mgを、1mLの0.2Mのリン酸カリウム緩衝液(pH9)に溶解した。この溶液に1mgのトリメチルアミンボランを添加して、室温で24時間反応させた。その後、反応物に1mgのトリメチルアミンボランを添加して室温で24時間反応させる操作を3回繰り返した。反応後の溶液中の未反応物を疎水カラムクロマトグラフィーで除去し、溶出液を回収して限外ろ過により脱塩および濃縮して、微生物由来コンドロイチンとタンパク質との複合体を含有する画分を得た。
以下、このようにして製造された、rCHとAspとの複合体を「rCH−Asp」、rCHとIFNとの複合体を「rCH−IFN」、rCHとOVAとの複合体を「rCH−OVA」とそれぞれ略記する。
(4)微生物由来コンドロイチンとタンパク質(GH)との複合体の製造(共有結合形成)
タンパク質のアミノ基との共有結合を形成させるため、まず以下の方法で微生物由来コンドロイチンにアルデヒド基を導入した。
微生物由来コンドロイチンを20mg/mLとなるようリン酸塩緩衝液(pH7)に溶解し、これに2モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムを混合して4℃で24時間反応させた。この反応物に2モル当量のcis1,2−シクロヘキサンジオールを混合してさらに4℃で1時間反応させた後、水に対して透析し、凍結乾燥させて、アルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチンを得た。
次に、このアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチンとタンパク質を、還元剤としてナトリウムシアノボロハイドライドを用い、還元的アミノ化法により共有結合させた。
すなわち、タンパク質0.5mgとアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチン18.0mgを、0.2%プルロニックF68を含有する0.1Mビシン(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine)緩衝液(pH9)1mLに溶解し、この溶液に2.8mgのナトリウムシアノボロハイドライドを混合して、室温で24時間反応させた。反応後の溶液中の未反応物を疎水カラムクロマトグラフィーで除去し、溶出液を回収して限外ろ過により脱塩および濃縮して、微生物由来コンドロイチンとタンパク質との複合体を含有する画分を得た。
以下、このようにして製造されたrCHとGHとの複合体を「rCH−GH」と略記する。
(5)医薬組成物および製剤の製造
上記(3)で製造した、rCH−Asp、rCH−IFN、rCH−OVA、および上記(4)で製造したrCH−GHを、各々生理食塩水で所望の濃度に希釈して医薬組成物とした。さらに、これらの医薬組成物をそれぞれ注射用シリンジに充填して、血管内投与用または皮下投与用の製剤とし、後述の実施例2に用いた。
<参考例>比較対象物の製造
(1)各種グリコサミノグリカン
rCHの比較対象として、以下のヒアルロン酸(生化学工業株式会社製、またはLifecore Biomedical社製)、各種硫酸化グリコサミノグリカン(いずれも生化学工業株式会社製)、およびヘパロサンを用いた。これらは、前記実施例1の(1)に記載した方法で分子量を調整したものである。
・コンドロイチン硫酸A(以下「CSA」。クジラ軟骨由来。分子量6×103
・コンドロイチン硫酸C(以下「CSC」。サメ軟骨由来。分子量6×103および38×103
・コンドロイチン硫酸E(以下「CSE」。イカ軟骨由来。分子量9×103
・デルマタン硫酸(以下「DS」。鶏冠由来。分子量5×103
・ヒアルロン酸(以下「HA」。鶏冠由来。分子量5×103および47×103。生化学工業株式会社製)
・ヒアルロン酸(以下「HA」。微生物由来。分子量66×103。Lifecore Biomedical社製)
・ヘパロサン(以下「HPN」。エシェリヒア・コリK5株由来。分子量5×103および36×103
・ヘパリン(以下「HP」。ブタ腸由来。分子量9×103
・ヘパラン硫酸(以下「HS」。ブタ腎臓由来。分子量14×103
以下、rCHと同様に、各種グリコサミノグリカンについても、例えば、分子量6×103のCSCを「CSC6」、分子量38×103のCSCを「CSC38」、分子量36×103のHPNを「HPN36」という要領で略記する。
(2)ヘパロサン(HPN)の製造
HPNは、公知の文献(特開2004−018840号公報)に記載の方法に従って大腸菌K5株(Serotype O10:K5(L):H4, ATCC 23506)を培養し、培養上清を精製して製造した。
(3)一般に用いられているコンドロイチンの製造
コンドロイチンの工業的生産法として一般的な以下の方法により、一般に汎用されているコンドロイチン(コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチン)を製造した。
コンドロイチン硫酸の脱硫酸化は、J. Am. Chem. Soc., 1957, 79 (1), pp 152-153に記載の方法に準じて行った。
メタノール93mLに塩化アセチル7mLを滴下して、メタノール塩酸溶液を調製した。これにCSC(サメ軟骨由来。分子量は未調整。生化学工業株式会社製)10gを添加した。これを室温で20時間撹拌した後、30mLを分取し、遠心分離して沈殿を回収した。
回収した沈殿を30mLの蒸留水に溶解し、pHを中性付近に調整した。この溶液をMWCO12000〜14000の透析膜を用いて流水下で一晩透析した後、凍結乾燥させた。
この凍結乾燥物の1gを、50mLの0.1M水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、室温で一晩撹拌した。その後中和し、MWCO12000〜14000の透析膜を用いて流水下で一晩透析した。この透析後の溶液を凍結乾燥して、一般に汎用されているコンドロイチン(凍結乾燥品)を得た。このコンドロイチンの分子量は7×103であった。
以下、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得たコンドロイチンを「dCH」ともいう。また、分子量7×103のdCHを「dCH7」と略記する。
(4)各種グリコサミノグリカンやdCHとタンパク質との複合体の製造
実施例1の(3)と同じ方法で、上記の各種グリコサミノグリカンやdCHと、Asp、IFN、又はOVAとの複合体を製造した。
以下、rCHの場合と同様に、各種グリコサミノグリカンについても、例えば、CSAとAspとの複合体は「CSA−Asp」、dCHとOVAとの複合体は「dCH−OVA」という要領で略記する。
これらの複合体は、実施例1の(5)と同じ方法で製剤化し、後述の実施例2に用いた。
<実施例2>グリコサミノグリカンとタンパク質との複合体の血中滞留性の測定
(1)試験方法1(Asp)
タンパク質として「Asp」を含有する被験物質(Aspを含有する各種複合体や、Asp自体)を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を1mgタンパク質/kg体重の用量で雄のICRマウス(1群につき3匹)に尾静脈注射した。
投与後8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間の各時点で上記マウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
Aspの血中滞留性は、血漿中のAsp活性を指標として測定した。血漿中のAsp活性は、Aspがアスパラギンをアスパラギン酸に変換する際に発生するアンモニア量を指標として算出した。具体的には、200μLの2.55mg/mLアスパラギンを含有する0.1Mトリス緩衝液(pH8)に、10〜40倍希釈した血漿を10μL添加し、37℃で30分間インキュベートした。その後、反応物に10μLのトリクロロ酢酸を添加して遠心し、上清10μLにネスラー試薬を混合して、上清中に含まれるアンモニアと反応させた。その後450nmの吸光度をウェルリーダーSK603(生化学工業株式会社)で測定した。
(2)試験方法2(IFN)
タンパク質として「IFN」を含有する被験物質(IFNを含有する各種複合体や、IFN自体)を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を0.2mgタンパク質/kg体重の用量で雄のICRマウス(1群につき3匹)に皮下注射した。
投与後2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間の各時点で上記マウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
IFNの血中滞留性は、血漿中のIFN活性を指標として測定した。血漿中のIFN活性は、iLite alphabetaキット(Biomonitor Limited社)を用い、その説明書に記載の方法でルシフェラーゼ活性による発光を指標として測定した。発光強度は、マルチラベルリーダー2030 ARVO(パーキンエルマー社)で測定した。
(3)試験方法3(OVA)
タンパク質として「OVA」を含有する被験物質(OVAを含有する各種複合体や、OVA自体)を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を0.8mgタンパク質/kg体重の用量で雄のICRマウス(1群につき3匹)に尾静脈注射した。
投与後2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間の各時点で上記マウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
OVAの血中滞留性は、血漿中のOVA濃度を指標として測定した。血漿中のOVA濃度は、ITEA OVA ELISAキット(ITEA株式会社)を用い、その説明書に記載の方法で測定した。標準曲線の作成には、OVA自体を投与した個体の血漿についてはOVA自体を、OVAを含有する複合体を投与した個体の血漿については当該複合体を、それぞれスタンダードとして用いた。吸光度は、ウェルリーダーSK603(生化学工業株式会社)で測定した。
(4)試験方法4(GH)
タンパク質として「GH」を含有する被験物質(GHを含有する複合体や、GH自体)を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を0.1mgタンパク質/kg体重の用量でICR系雄性マウス(1群につき3匹)に尾静脈注射した。
GH自体を投与した場合は、投与後0.5時間、2時間、4時間、8時間の各時点で、また、GHとグリコサミノグリカンとの複合体を投与した場合は、投与後8時間、24時間、48時間、72時間の各時点でマウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
GHの血中滞留性は、血漿中のGH濃度を指標として測定した。血漿中のGH濃度は、hGH ELISAキット(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用い、その説明書に記載の方法で測定した。標準曲線の作成には、GH自体を投与した個体の血漿についてはGH自体を、GHを含有する複合体を投与した個体の血漿については当該複合体を、それぞれスタンダードとして用いた。吸光度は、ウェルリーダーSK603(生化学工業株式会社)で測定した。
(5)半減期の算出
上記によって得られた血中のAsp活性、IFN活性、OVA濃度、GH濃度それぞれの推移データに基づき、Phoenix WinNonlin(サターラ合同会社)を用いて、各個体の最終測定時点から3時点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、血中半減期(t1/2)を算出した。以下、血中半減期(t1/2)は、平均±標準誤差(SE)で表示する。
(6)rCHを用いた試験1(各種グリコサミノグリカンとの比較)
被験物質として「rCH7−Asp」と、「各種グリコサミノグリカンとAspとの複合体」を用い、前記(1)に示した試験方法で血中滞留性を試験した。
ここでは、糖鎖部分の分子量をrCH(7×103)となるべく揃えるため、「各種グリコサミノグリカンとAspとの複合体」として以下のものを用いた:
CSA6−Asp、CSC6−Asp、CSE9−Asp、DS5−Asp、HA5−Asp、HPN5−Asp、HP9−Asp、HS14−Asp。
また、対照物質として非修飾の「Asp」を用いた。結果を図1に示す。
図1から、rCHを用いてタンパク質と複合体を形成させると、他のいずれのグリコサミノグリカンを用いて複合体を形成させた場合よりも、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が高まることが示された。
また、このことは、次に示す「rCH7−Asp」と、次に良好であった「HPN5−Asp」との血中半減期(t1/2)の差からも示される。
rCH7−Asp:35.21±3.14時間
HPN5−Asp: 9.00±0.46時間
(7)rCHを用いた試験2(各種グリコサミノグリカンとの比較)
被験物質として「rCH46−IFN」と、「各種グリコサミノグリカンとIFNとの複合体」を用い、前記(2)に示した試験方法で血中滞留性を試験した。
ここでは、糖鎖部分の分子量をrCH(46×103)となるべく揃えるため、「各種グリコサミノグリカンとIFNとの複合体」として以下のものを用いた:
CSC38−IFN、HA47−IFN、HPN36−IFN。
また、対照物質として非修飾の「IFN」を用いた。結果を図2に示す。
図2からも、rCHを用いてタンパク質と複合体を形成させると、他のいずれのグリコサミノグリカンを用いて複合体を形成させた場合よりも、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が高まることが確認された。
また、このことは、次に示す「rCH46−IFN」と、他の複合体との血中半減期(t1/2)の差からも示される。
rCH46−IFN:18.22±2.56時間
CSC38−IFN: 1.28±0.10時間
HA47−IFN : 1.18±0.04時間
(8)rCHを用いた試験3(dCHとの比較)
被験物質として「rCH5−Asp」と「dCH7−Asp」を用い、前記(1)に示した試験方法で血中滞留性を試験した。結果を図3に示す。
図3から、rCHとdCHはいずれも一般的にはコンドロイチンと呼ばれるものであるものの、タンパク質と複合体を形成させた場合における当該タンパク質の血中滞留性の点では、驚くべきことに、dCHを用いた場合と比較して、rCHを用いた方が格段に高い血中滞留性を発揮させることができることを見出した。
(9)rCHを用いた試験4(各種グリコサミノグリカンおよびdCHとの比較)
被験物質として「rCH5−OVA」、「dCH7−OVA」、および「各種グリコサミノグリカンとOVAとの複合体」を用い、前記(3)に示した試験方法で血中滞留性を試験した。
ここでは、糖鎖部分の分子量をrCH(5×103)となるべく揃えるため、「各種グリコサミノグリカンとOVAとの複合体」として以下のものを用いた:
CSC6−OVA、HA5−OVA。
また、対照物質として非修飾の「OVA」を用いた。結果を図4に示す。
図4からも、rCHを用いてタンパク質と複合体を形成させると、他のいずれのグリコサミノグリカンを用いて複合体を形成させた場合よりも、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が高まることが確認された。また、タンパク質と複合体を形成させた場合における当該タンパク質の血中滞留性の点で、dCHを用いた場合と比較して、rCHを用いた方が格段に高い血中滞留性を発揮させることができることも改めて確認された。
また、このことは、次に示す「rCH5−OVA」と、他の複合体との血中半減期(t1/2)の差からも示される。
rCH5−OVA:24.34±2.02時間
dCH7−OVA: 3.61±0.10時間
CSC6−OVA: 2.60±0.05時間
HA5−OVA : 2.64±0.05時間
(10)rCHを用いた試験5
被験物質として「rCH7−GH」を用い、前記(4)に示した方法で血中滞留性を測定した。
ここでは、対象物質として非修飾の「GH」を用いた。結果を図5に示す。
図5からも、rCHを用いてタンパク質と複合体を形成させると、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が増強されることが確認された。
また、このことは、次に示す「rCH7−GH」と、非修飾のGHとの血中半減期(t1/2)の差からも示される。
rCH7−GH: 9.90±1.37時間
非修飾のGH : 1.27±0.10時間
<実施例3>グリコサミノグリカンの血中滞留性の測定
(1)脱フルクトシル化K4多糖の製造
脱フルクトシル化K4多糖は、特許文献5に記載の方法に従って大腸菌K4株(Serotype O5:K4(L):H4)を培養し、培養上清を精製してK4多糖(フルクトシル化コンドロイチン)を製造した後、公知の文献(Lidholt K, Fjelstad M., J Biol Chem. 1997 Jan 31; 272(5): 2682-7.)に準じた以下の方法によって、K4多糖からフルクトース残基を酸加水分解反応により除去(脱フルクトシル化)して製造した。
313.9mgのK4多糖を30mLの蒸留水に溶解し、塩酸を混合してpH1.5に調整した後、80℃で30分間インキュベートして、酸加水分解反応によりフルクトース残基を除去した。この溶液を中和した後、水に対して透析し、凍結乾燥させて、196.1mgの脱フルクトシル化K4多糖を得た。この脱フルクトシル化K4多糖の分子量は38×103であった。
以下、脱フルクトシル化K4多糖を「dfCH」ともいう。また、分子量38×103のdfCHを「dfCH38」と略記する。
(2)グリコサミノグリカンの血中滞留性の測定
被験物質として「rCH48」、「dfCH38」、および「各種グリコサミノグリカン」を用い、以下の方法で血中滞留性を測定した。
ここでは、グリコサミノグリカンの分子量をrCH48(48×103)とできる限り揃えるため、「各種グリコサミノグリカン」として以下の被験物質を用いた:
CSC38、HA66。
グリコサミノグリカンを10mg/kgの用量でICR系雄性マウス(1群1時点につき3匹)に尾静脈注射した。
rCHまたはdfCHを投与した場合は、投与後4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間の各時点で、CSCを投与した場合は、投与後0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間の各時点で、また、HAを投与した場合は、投与後1時間、6時間、14時間、24時間、48時間、72時間の各時点でマウスから心臓採血し、遠心分離して血漿を得た。
グリコサミノグリカンの血漿中濃度は、HPLCポストカラム誘導体化法によって以下のとおり測定した。
血漿50μLに、0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)40μL、酵素溶液(5U/mL コンドロイチナーゼABC、0.5U/mL コンドロイチナーゼACII、0.1%BSAを含有する)25μL、蒸留水を混合して全量を200μLとし、37℃で2時間インキュベートした。その後、反応液を分画分子量(MWCO)10Kのスピンカラムを用いて限外ろ過し、ろ液を回収した。ろ液50μLを陰イオン交換カラムに通し、溶出された糖をポストカラム誘導体化法により検出して、グリコサミノグリカンの血漿中濃度を測定した。
イオン交換カラムはYMC−Pack PA−G(内径:4.6mm×長さ:150mm)(YMC社製)を用い、カラム温度は室温とした。移動相として溶媒A(5%エタノール)と溶媒B(200mM硫酸ナトリウム/5%エタノール)を用い、溶離は分析開始後から30分後までの間に溶媒Bの割合を0%から100%にするリニアグラジエントによって行った。流速は0.4mL/minとした。
カラムの溶出液と0.225mL/minで送液した誘導体化試薬(1% 2−シアノアセトアミド、50mM四ホウ酸ナトリウム(pH9.0)を含有する)を三方ジョイントに通して混合させた後、反応コイル(内径:0.5mm×長さ:10m)、蛍光検出器の順に通液させた。反応コイルは145℃に加温した状態で使用した。蛍光検出器は、励起波長を346nmに、蛍光波長を410nmに設定して使用した。また、反応コイルと蛍光検出器は、背圧コイルを介して接続した。
上記によって得られたグリコサミノグリカンの血漿中濃度の推移データに基づき、最終測定時点から3時点の平均値のデータを用いてPhoenix WinNonlinによるモデル非依存的解析を行い、血中半減期(t1/2)を算出した。
rCHとdfCHの血漿中濃度の推移を図6に示す。図6から、微生物由来コンドロイチンであるrCHとdfCHは、共に顕著に長い血中滞留性を有することが示された。また、rCHとdfCHは血漿中濃度の経時変化が同等であったことから、両者は血中滞留性において同質のコンドロイチンであることが示された。
また、以下に示す「rCH」、「dfCH」と、「他のグリコサミノグリカン」との血中半減期(t1/2)の差から、rCHとdfCHが他のグリコサミノグリカンと比較して顕著に長い血中滞留性を有することが示された。
rCH48 :32.2時間
dfCH38:38.0時間
CSC38 : 0.9時間
HA66 : 2.2時間
実施例2の(6)〜(10)に示した通り、微生物由来コンドロイチンはタンパク質との複合体を形成した際に、顕著に長い血中滞留性を発揮することができる。rCHとdfCH自体が顕著に長い血中滞留性を有することから、このような微生物由来コンドロイチンがタンパク質の血中滞留性を増強する効果は、微生物由来コンドロイチンそのものの性質によるものである、すなわち、タンパク質との複合体を形成した際に、この性質がタンパク質に付与されることによる効果である、と考えられる。よって、微生物由来コンドロイチンは、特定のタンパク質に限られず、任意のタンパク質に対する血中滞留性増強剤として適用することが可能である。また、例えば、rCHとdfCHは糖鎖そのものの血中滞留性において同質であることから、両者はタンパク質の血中滞留性を増強する効果等においても同質のコンドロイチンであると考えられる。よって、特定の微生物由来コンドロイチンに限られず、任意の微生物由来コンドロイチンを、タンパク質に対する血中滞留性増強剤として適用することが可能である。
本発明によれば、タンパク質の血中滞留性を顕著に増強させることができる。よって、本発明によれば、例えば、タンパク質を有効成分とする医薬や製剤の効果を長期間にわたり維持することができる。したがって、本発明は、臨床上および/または研究上、極めて有用である。
日本国特許出願第2013−204053号(出願日:2013年9月30日)の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (13)

  1. コンドロイチン(ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く)を有効成分として含有するタンパク質の血中滞留性増強剤であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され
    前記コンドロイチンと前記タンパク質との複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、血中滞留性増強剤。
  2. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項に記載の血中滞留性増強剤。
  3. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が3×10 〜1×10 である、請求項1又は2に記載の血中滞留性増強剤。
  4. コンドロイチン(ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く)とタンパク質との複合体であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され
    コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、複合体。
  5. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項4に記載の複合体。
  6. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が3×10 〜1×10 である、請求項4又は5に記載の複合体。
  7. 請求項4から6のいずれか1項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
  8. ンドロイチン(ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く)ンパク質との複合体を形成させるステップを含む、タンパク質の血中滞留性強方法であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され
    前記複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、血中滞留性増強方法
  9. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項8に記載の血中滞留性増強方法。
  10. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が3×10 〜1×10 である、請求項8又は9に記載の血中滞留性増強方法。
  11. ンドロイチン(ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く)ンパク質との複合体を形成させるステップを含む、血中滞留性が増強されたタンパク質の製造方法であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され
    前記複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、製造方法。
  12. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項11に記載の製造方法。
  13. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が3×10 〜1×10 である、請求項11又は12に記載の製造方法。
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