CN114667343A

CN114667343A - 大肠杆菌组合物及其方法

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Publication number: CN114667343A
Application number: CN202080076411.2A
Authority: CN
Inventors: A·S·安德森; 陈伟; L·O·乔罗; 朱晓临; R·G·K·唐纳德; M·C·格里弗; 顾建新; 管泽强; 金进焕; S·柯达里; S·E·隆伯克; J·A·洛特文; N·麦钱特; J·K·莫兰; R·潘; A·K·普拉萨德; M·E·鲁彭; S·辛格; D·R·斯特德; K·K·高根
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2022-06-24
Also published as: KR20220092572A; JP2021087420A; MX2022005252A; CA3159573A1; AU2020375214B2; WO2021084429A1; US20230000966A1; EP4051696A1; AU2020375214A1; IL292494A

Abstract

一方面，本发明涉及源自大肠杆菌的多肽及其片段，包括其组合物和方法。本文还公开了包含源自大肠杆菌的多肽及其片段的组合物；和源自大肠杆菌脂多糖的经修饰的O‑多糖分子及其缀合物。在又一方面，本文公开了哺乳动物宿主细胞，其包含一种或多种编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列。

Description

大肠杆菌组合物及其方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年11月1日提交的美国临时申请第62/929,505号、2020年6月26日提交的美国临时申请第63/045,038号和2020年9月22日提交的美国临时申请第63/081,629号的权益。每项前述申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表的引用

本申请通过EFS网站以电子方式提交，包括以电子方式提交的呈.txt格式的序列表。所述.txt文件包含标题为“PC072517_03_SEQ_List_ST25.txt”的序列表，创建于2020年9月18日，大小为152KB。此.txt文件中包含的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌(Escherichia coli)组合物及其方法。

背景技术

细菌菌毛粘附素FimH和FmlH允许大肠杆菌通过识别特定宿主细胞糖蛋白来利用不同的泌尿道微环境。FimH与尿路上皮中的甘露糖基化尿溶蛋白(uroplakin)受体结合，而FmlH与肾和发炎膀胱中的上皮表面蛋白上的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺O-聚糖结合。FimH菌毛还通过与肠上皮细胞上的高甘露糖基化的蛋白结合，在肠产毒性大肠杆菌(ETEC)和耐多药侵袭性大肠杆菌在肠中的定殖中发挥作用。

全长FimH由两个结构域组成：N-末端凝集素结构域和C-末端菌毛蛋白结构域，所述结构域通过短接头连接。FimH的凝集素结构域包含碳水化合物识别结构域，其负责与尿路上皮细胞表面上的甘露糖基化尿溶蛋白1a结合。菌毛蛋白结构域通过随后的FimG亚单位的供体链锚定到菌毛的核心，这是一个称为供体链互补的过程。

FimH的凝集素结构域的构象和配体结合特性受FimH的菌毛蛋白结构域的变构控制。在静态条件下，全长FimH的两个结构域的相互作用将凝集素结构域稳定在对单甘露糖的低亲和力(例如K_d～300μM)状态，其特征在于浅结合口袋。与甘露糖苷配体的结合诱导构象变化，导致中等亲和力状态，其中凝集素与菌毛蛋白结构域保持紧密接触。然而，在剪切应力下，凝集素与菌毛蛋白结构域分离，从而诱导高亲和力状态(例如K_d<1.2μM)。

由于缺乏由菌毛蛋白结构域施加的负变构调节，FimH的分离的凝集素结构域被锁定在高亲和力状态。锁定在高亲和力状态的分离的重组凝集素结构域表现出高稳定性。然而，将粘附素锁定在低结合构象会诱导粘附抑制抗体的产生。因此，人们对稳定处于低亲和力状态的凝集素结构域感兴趣。

对以足以用于产品开发的高产量表达FimH的方法还有额外的兴趣。开发包含FimH的组合物的障碍是FimH以其天然状态在大肠杆菌周质中表达时所达到的产量低。实验室规模报道的纯化FimCH复合物的典型产量为3-5mg/L，FimH(LD)的典型产量为4-10mg/L，低于临床试验材料生产的可放大水平。FimH的体内构象不同于通过所述蛋白的纯化重组形式获得的构象。一般来说，FimH具有天然构象，所述天然构象至少部分是由FimH与其周质伴侣蛋白(称为FimC)的体内相互作用决定的。

FimH的重组生产仍然具有挑战性。蛋白质的表达和纯化不是常规过程。

发明概述

为了满足这些和其它需要，本发明涉及用于生产重组粘附素蛋白和用于引发针对大肠杆菌血清型的免疫反应的组合物及其使用方法。

一方面，本发明涉及重组哺乳动物细胞，包括编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码源自大肠杆菌菌毛H(fimH)多肽或其片段的多肽。在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段在多肽的N-末端包含苯丙氨酸残基。

一方面，本发明涉及在重组哺乳动物细胞中生产源自大肠杆菌的多肽或其片段的方法。所述方法包括在合适的条件下培养重组哺乳动物细胞，从而表达所述多肽或其片段；以及收获所述多肽或其片段。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化所述多肽或其片段。在一些实施方案中，多肽的产量至少为0.05g/L。在一些实施方案中，多肽的产量至少为0.10g/L。

一方面，本发明涉及组合物，其包含与以下序列具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29或其任意组合。

在另一方面，本发明涉及组合物，其包含具有来自以下序列中的任一个的至少n个连续氨基酸：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:20,SEQID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，其中n为7或更大(例如8,10,12,14,16,18,20或更大)。在一些实施方案中，所述组合物还包含选自表1中的任一式(优选式O1A、式O1B、式O2、式O6和式O25B)的糖，其中n为1至100，优选31至100的整数。

附图说明

图1A-图1H–描述了氨基酸序列，包括源自大肠杆菌的示例性多肽或其片段的氨基酸序列；以及示例性wzzB序列的氨基酸序列。

图2A-图2T–描述了示例性表达载体的图谱。

图3–描述了表达和纯化的结果。

图4–描述了表达和纯化的结果。

图5–描述表达的结果。

图6A-图6C–描述了pSB02083和pSB02158 SEC池及亲和力；包括产量。

图7–描述了pSB2198 FimH dscG锁突变体构建体表达的结果。

图8–描述了pSB2307 FimH dscG野生型表达的结果。

图9A-图9C–描述了通过聚合酶依赖性途径合成的O-抗原的结构，所述O-抗原在主链中具有四个或更少的残基。

图10A-图10B–图10A描述了通过聚合酶依赖性途径合成的O-抗原的结构，所述O-抗原在主链中具有五个或六个残基；图10B描述了被认为是由ABC转运蛋白依赖性途径合成的O-抗原。

图11–描述了Phe1与具有脂肪族疏水侧链的其它氨基酸(例如Ile、Leu和Val)的计算诱变扫描，所述氨基酸可以稳定FimH蛋白并容纳甘露糖结合。

图12A-图12B–描述了质粒：pUC复制子质粒，每个细胞500-700x拷贝，链长调节剂(图12A)；和P15a复制子质粒，每个细胞10-12x拷贝，O-抗原操纵子(图12B)。

图13A-图13B–描述了通过异源wzzB和fepE链长调节剂的基于质粒的表达对血清型O25a和O25b菌株中O-抗原链长的调节。显示了wzzB敲除菌株O25K5H1(O25a)和GAR2401(O25b)的质粒转化体中LPS表达的遗传互补。在图13A的左边，显示了O25a O25K5HΔwzzB的质粒转化体的LPS图谱；右边是O25b GAR2401ΔwzzB转化体的类似图谱。用O25特异性血清(Statens Serum Institut)探测的复制凝胶的免疫印迹如图13B所示。与泳道1-7相关的O25aΔwxxB(敲除)背景；与8-15泳道相关的O25b 2401ΔwzzB(敲除)背景。

图14–描述了大肠杆菌和沙门氏菌属(Salmonella)fepE质粒在宿主O25K5H1ΔwzzB中赋予的长链O-抗原表达。

图15–描述了沙门氏菌属fepE表达在各种临床分离株中产生长O-抗原LPS。

图16A-图16B–描述了O25b长O-抗原LPS在O25b O-抗原敲除宿主菌株中的质粒介导的阿拉伯糖诱导型表达。SPS PAGE的结果如图16A所示，O25免疫印迹的结果如图16B所示，其中在图16A和图16B中，泳道1来自克隆1，无阿拉伯糖；泳道2来自克隆1，0.2％阿拉伯糖；泳道3来自克隆9，无阿拉伯糖；泳道4来自克隆9，0.2％阿拉伯糖；泳道5来自O55大肠杆菌LPS标准品；泳道6来自O111大肠杆菌LPS标准品。

图17–描述了常见宿主菌株中长O抗原LPS的质粒介导的阿拉伯糖诱导型表达。

图18–描述了O25 O-抗原LPS在探索性生物工艺菌株中的表达。

图19A-图19B–描述了从菌株GAR2831和‘2401ΔwzzB/fepE纯化的短O25b O-抗原(图19A，菌株1O25b wt 2831)和长O25b O-抗原(图19B，菌株2O25b 2401ΔwzzB/LT2 FepE)的SEC特征。

图20A-图20B–描述了兔子的疫苗接种时间表：(图20A)关于兔研究1VAC-2017-PRL-EC-0723的疫苗接种时间表的信息；(图20B)兔子研究2VAC-2018-PRL-EC-077的疫苗接种时间表。

图21A-图21C–描述了O25b糖缀合物IgG反应，其中-●-代表放血前的结果；-■-第1次放血(6周)；-▲-第2次放血(8周)；-◆-第3次放血(12周)。图21A描述了来自兔子1-3(培养基活化)的结果；图21B描述了来自兔子2-3的结果(低度活化)；图21C描述了来自兔子3-1(高度活化)的结果。

图22A-图22F–描述了对O25b长O-抗原糖缀合物，即低度活化O25b-CRM₁₉₇缀合物(图22D-图22F，其中-●-代表来自兔子2-1的放血前的结果、-■-代表兔子2-1的第12周抗血清的结果)对比未缀合的多糖，即游离O25b多糖(图22A-图22C，其中-●-代表来自兔子A-1的放血前的结果、-■-代表兔子A-1的第6周抗血清的结果、-▲-代表兔子A-1的第8周抗血清的结果)的IgG反应。注意，MFI以对数标度绘制，以强调免疫前和免疫抗体之间在<1000MFI范围内的差异。图22A描述了来自兔子A-1(未缀合的多糖)的结果；图22B描述了来自兔子A-3(未缀合的多糖)的结果；图22C描述了来自兔子A-4(未缀合的多糖)的结果；图22D描述了来自兔子2-1(低度活化)的结果；图22E描述了兔子2-2(低度活化)的结果；和图22F描述了来自兔子2-3(低度活化)的结果。

图23A-图23C-描述了用O25b抗血清检测的天然对比长O25b O-抗原的表面表达。图23A描述了结果，其中-●-代表来自O25b 2831对比PD3抗血清的结果；-■-代表O25b2831wt对比放血前的结果；-▲-代表O25b 2831/fepE对比PD3抗血清的结果；

代表O25b2831/fepE对比放血有的结果。图23B描述了结果，其中-●-代表来自O25b 2401对比PD3抗血清的结果；-■-代表O25b 2401对比放血前的结果；-▲-代表O25b 2401/fepE对比PD3抗血清的结果；

代表O25b 2401/fepE对比放血前的结果。图23C描述了结果，其中-●-代表源自大肠杆菌K12对比PD3抗血清的结果；以及-■-代表大肠杆菌K12对比放血前的结果。

图24-描述了五种已知化学型的外核寡糖的碳水化合物主链的一般结构。除非另有说明，否则所有的糖都是α-异头构型。其产物催化每个键联形成的基因用虚线箭头指示。星号表示发生O-抗原附接的核心寡糖的残基。

图25-描述了未缀合的游离O25b多糖没有免疫原性(dLIA)，其中-●-代表来自4-1的第18周(1wk＝PD4)抗血清的结果；代表-■-代表来自4-2的第18周(1wk＝PD4)抗血清的结果；-▲-代表来自5-1的第18周(1wk＝PD4)抗血清的结果；

代表来自5-2的第18周(1wk＝PD4)抗血清的结果；

代表来自6-1的第18周(1wk＝PD4)抗血清的结果；

代表来自6-2的第18周(1wk＝PD4)抗血清的结果。

图26A-图26C–描述了说明BRC兔O25b RAC缀合物免疫血清OPA滴度的特异性的图。图26A显示了兔子2-3免疫前血清(-●-)和第13周免疫后血清(-■-)的OPA滴度。图26B显示了兔子1-2免疫前血清(-●-)和第19周免疫后血清(-■-)的OPA滴度。图26C显示了兔子1-2第19周的OPA滴度特异性，其中兔子1-2免疫血清的OPA活性被用100μg/mL的纯化的未缀合的O25b长O-抗原多糖预孵育阻断，其中-■-代表兔子1-2免疫血清第19周的结果；

代表兔子1-2第19周/R1长-OAg的结果。

图27A-图27C–图27A描述了示例性施用时间表的图示。图27B和图27C显示了描述由未缀合的O25b长O-抗原多糖(图27B，O25b游离多糖(2μg))和衍生的O25b RAC/DMSO长O-抗原糖缀合物(图27C，O25b-CRM₁₉₇ RAC长(2μg))引发的O-抗原O25b IgG水平的图，其中-...-(虚线)代表原初CD1 O25b IgG水平。

图28A-图28B–描述了显示第2次给药后(图28A)和第3次给药后(图28B)RAC、eTECO25b长糖缀合物和单端糖缀合物的OPA免疫原性的图，其中-○-代表来自单端短路2μg的结果；-●-代表单端长2μg的结果；-▲-代表RAC/DMSO长2μg的结果；

代表eTEC长2μg的结果；*本底对照(n＝20)。

应答者比率为具有>2倍的未接种基线的滴度的小鼠％。

图29–描述了显示eTEC化学物质的OPA免疫原性和多糖活化的改变水平的图。

应答者比率为具有>2倍的未接种基线的滴度的小鼠％。

图30A-图30B–描述了示例性施用时间表的图解(图30A)；和描述用多剂大肠杆菌eTEC缀合物免疫的小鼠免受O25b分离物致死性攻击的保护(图30B)，其中-◇-代表eTEC长链17％活化；-△-eTEC代表长链10％活化；

代表eTEC长链4％活化；-□-代表O25b多糖；-○-代表未接种的对照。

图31–描述了说明单端缀合物的示例性制备的示意图，其中缀合过程包括在暴露硫醇官能团时，用二硫化胺接头选择性活化2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)。然后将KDO与溴活化的CRM₁₉₇蛋白缀合，如图31(单端缀合物的制备)所示。

图32A-图32B–描述了用于制备与CRM₁₉₇的大肠杆菌糖缀合物的活化(图32A)和缀合(图32B)的示例性过程流程图。

序列标识符

SEQ ID NO:1给出了野生型1型菌毛D-甘露糖特异性粘附素[大肠杆菌FimH J96]的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2给出了FimH片段的氨基酸序列，对应于SEQ ID NO:1的aa残基22-300(成熟FimH蛋白)。

SEQ ID NO:3给出了FimH凝集素结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4给出了FimH菌毛蛋白结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5给出了源自大肠杆菌FimH的多肽的氨基酸序列(pSB02198-pcDNA3.1(+)中的FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AA接头/FimG A1..K14/GGHis8)

SEQ ID NO:6给出了源自大肠杆菌FimH的多肽的氨基酸序列(pSB02307-pcDNA3.1(+)中的FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96FimH N28S N91S N249Q/His8)

SEQ ID NO:7给出了源自大肠杆菌FimH的多肽片段的氨基酸序列(pSB02083 FimH凝集素结构域野生型构建体)

SEQ ID NO:8给出了源自大肠杆菌FimH的多肽片段的氨基酸序列(pSB02158 FimH凝集素结构域锁突变体)

SEQ ID NO:9给出了源自大肠杆菌FimG的多肽片段的氨基酸序列(FimG A1..K14)

SEQ ID NO:10给出了源自大肠杆菌FimC的多肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11给出了4aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12给出了5aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13给出了6aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14给出了7aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15给出了8aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16给出了9aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17给出了10aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18给出了FimH J96信号序列的氨基酸序列

SEQ ID NO:19给出了SEQ ID NO:5(pSB02198-pcDNA3.1(+)中的FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AA接头/FimG A1..K14/GGHis8)的信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20给出了根据SEQ ID NO:5(pSB02198的成熟蛋白-pcDNA3.1(+)中的FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AA接头/FimGA1..K14/GGHis8)。

SEQ ID NO:21给出了源自大肠杆菌FimG的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22给出了SEQ ID NO:6的信号肽的氨基酸序列(pSB02307-pcDNA3.1(+)中的FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96FimH N28S N91S N249Q/His8)。

SEQ ID NO:23给出了根据SEQ ID NO:6的源自大肠杆菌FimH的多肽的氨基酸序列(pcDNA3.1(+)的FimH mIgK信号肽/F22..Q300J96 FimH N28S N91S N249Q/His8的成熟蛋白)。

SEQ ID NO:24给出了根据SEQ ID NO:7的源自大肠杆菌的FimH的多肽的氨基酸序列(pSB02083 FimH凝集素结构域野生型构建体的成熟蛋白)。

SEQ ID NO:25给出了His标签的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26给出了根据SEQ ID NO:8的源自大肠杆菌FimH的多肽的氨基酸序列(pSB02158 FimH凝集素结构域锁突变体的成熟蛋白)

SEQ ID NO:27给出了源自大肠杆菌FimH(pSB01878)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28给出了源自大肠杆菌FimH(K12)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29给出了源自大肠杆菌FimH(UTI89)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:30给出了O25b 2401WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:31给出了O25a:K5:H1 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:32给出了O25a ETEC ATCC WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:33给出了K12 W3110 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:34给出了沙门氏菌属LT2 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:35给出了O25b 2401FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:36给出了O25a:K5:H1 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:37给出了O25a ETEC ATCC FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:38给出了O157 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:39给出了沙门氏菌属LT2 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:40给出了LT2wzzB_S的引物序列。

SEQ ID NO:41给出了LT2wzzB_AS的引物序列。

SEQ ID NO:42给出了O25bFepE_S的引物序列。

SEQ ID NO:43给出了O25bFepE_A的引物序列。

SEQ ID NO:44给出了wzzB P1_S的引物序列。

SEQ ID NO:45给出了wzzB P2_AS的引物序列。

SEQ ID NO:46给出了wzzB P3_S的引物序列。

SEQ ID NO:47给出了wzzB P4_AS的引物序列。

SEQ ID NO:48给出了O157 FepE_S的引物序列。

SEQ ID NO:49给出了O157 FepE_AS的引物序列。

SEQ ID NO:50给出了pBAD33_adaptor_S的引物序列。

SEQ ID NO:51给出了pBAD33_adaptor_AS的引物序列。

SEQ ID NO:52给出了JUMPSTART_r的引物序列。

SEQ ID NO:53给出了gnd_f的引物序列。

SEQ ID NO:54给出了小鼠IgK信号序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO:55给出了人IgG受体FcRn大亚基p51信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:56给出了人IL10蛋白信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:57给出了甲型人呼吸道合胞病毒(A2株)融合糖蛋白F0信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:58给出了甲型流感血凝素信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:59-101给出了纳米结构相关多肽或其片段的氨基酸和核酸序列。

SEQ ID NO:102-109给出了用于信号肽预测的各种物种的SignalP 4.1(DTUBioinformatics)序列。

发明内容

本发明人通过使用哺乳动物细胞进行表达，克服了生产源自大肠杆菌粘附素蛋白的多肽的挑战。如本公开全文和实施例部分中所举例说明的，发现与在大肠杆菌中多肽的表达相比，重组多肽的哺乳动物细胞表达始终获得高产量。另外，本发明人令人惊讶地鉴定了突变和表达构建体，以将重组多肽及其片段稳定在期望的构象中。

阻断感染的初级阶段(即细菌至宿主细胞受体的附着和粘膜表面的定殖)，对于预防、治疗和/或降低细菌感染的可能性是重要的。细菌附着可能涉及称为粘附素的细菌表面蛋白与宿主细胞受体之间的相互作用。先前对FimH粘附素(源自尿道致病性大肠杆菌)的临床前研究已证实，可引发针对粘附素的抗体。为了防止从中耳炎和龋齿到肺炎和败血症的感染，需要在粘附素的鉴定、表征和分离方面取得进展。

为了以商业规模生产粘附素蛋白诸如FimH及其片段，需要鉴定合适的构建体和合适的宿主，使得多肽及其片段可以在持续的时间段内以足够的量和优选的构象表达。例如，在一些实施方案中，重组多肽的优选构象表现出对单甘露糖的低亲和力(例如K_d～300μM)。在一些实施方案中，优选构象表现出对单甘露糖的高亲和力(例如K_d<1.2μM)。

源自大肠杆菌的粘附素蛋白已经在大肠杆菌细胞中重组表达。然而，产量一直低于10mg/L。当在大肠杆菌中产生时，纯化大量的菌毛相关粘附素可能具有挑战性。不受理论或机理的束缚，有人认为在大肠杆菌中表达的产物可能表现出对引发哺乳动物的有效免疫反应不是最佳的构象。

一方面，本发明包括重组哺乳动物细胞，所述细胞包含编码源自细菌粘附素蛋白的多肽或其片段的多核苷酸序列。

另一方面，本发明包括用于在哺乳动物细胞中生产多肽或其片段的方法，其包括：(i)在合适的条件下培养哺乳动物细胞，从而表达所述多肽或其片段；和(ii)从培养物中收获所述多肽或其片段。所述方法还可包括纯化多肽或其片段。本文还公开了通过所述方法产生的多肽或其片段。

另一方面，本发明包括含有本文所述多肽或其片段的组合物。所述组合物可包含适于体内施用的多肽或其片段。例如，这样的组合物中的多肽或其片段可以具有按质量计至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％的纯度。所述组合物还可包含佐剂。

另一方面，本发明包括用于诱导针对大肠杆菌的免疫反应的组合物。还公开了本文所述组合物用于诱导针对大肠杆菌的免疫反应的用途，以及本文所述组合物在制备用于诱导针对大肠杆菌的免疫反应的药物中的用途。

I.源自大肠杆菌的多肽及其片段

一方面，本文公开了包含编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的多核苷酸的哺乳动物细胞。如本文中所用，术语“源自”是指包含本文所述的FimH多肽或FimCH多肽复合物或其片段的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列已经通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而被改变。优选地，源自大肠杆菌的多肽或其片段包括与相应的野生型大肠杆菌FimH多肽或其片段的序列具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的序列。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段具有与相应的野生型FimH多肽或FimCH多肽复合物或其片段相同的氨基酸总长度。

所述片段应该包括来自所述序列的至少n个连续氨基酸，并且取决于特定的序列，n是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20或更多)。优选地，所述片段包括来自所述序列的表位。在一些实施方案中，所述片段包括源自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。

在一些实施方案中，与相应的野生型大肠杆菌FimH多肽或片段相比，源自大肠杆菌的多肽或其片段包含一个或多个非经典氨基酸。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段具有与相应的野生型FimH多肽或其片段相似或相同的功能。

在优选实施方案中，分离或纯化了本发明的多肽或多肽复合物或其片段。

在一些实施方案中，将编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的多核苷酸整合到哺乳动物细胞的基因组DNA中，并且当在合适的条件下培养时，所述源自大肠杆菌的多肽或其片段由哺乳动物细胞表达。

在优选实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段是可溶的。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段是从哺乳动物宿主细胞分泌的。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可包含额外的氨基酸残基，诸如N末端或C末端延伸。此类延伸可以包含一个或多个标签，所述标签可以促进多肽或其片段的检测(例如用于通过单克隆抗体检测的表位标签)和/或纯化(例如允许在镍螯合树脂上纯化的聚组氨酸标签)。在一些实施方案中，所述标签包括选自SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:25中的任一个的氨基酸序列。此类亲和纯化标签是本领域已知的。亲和纯化标签的实例包括例如His标签(六组氨酸，其可以例如与金属离子结合)、麦芽糖结合蛋白(MBP)(其可以例如与直链淀粉结合)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(其可以例如与谷胱甘肽结合)、flag标签(其可以例如与抗FLAG抗体结合)、Strep标签(其可以例如与链霉抗生物素蛋白或其衍生物结合)。在优选实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段不包括额外的氨基酸残基，例如N-末端或C-末端延伸。在一些实施方案中，本文所述的源自大肠杆菌的多肽或其片段不包含外源标签序列。

尽管本文可能涉及大肠杆菌的特定菌株，但应当理解，除非另有说明，否则源自大肠杆菌的多肽或其片段不限于特定菌株。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段在多肽的N-末端包含苯丙氨酸残基。在一些实施方案中，源自FimH的多肽或其片段在N-末端的前20个残基位置内包含苯丙氨酸残基。优选地，苯丙氨酸残基位于多肽的位置1。例如，在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段在源自大肠杆菌FimH或其片段的多肽的N-末端不包含额外的甘氨酸残基。

在一些实施方案中，野生型成熟大肠杆菌FimH的位置1处的苯丙氨酸残基被脂肪族疏水氨基酸(例如Ile、Leu和Val残基中的任一个)替代。

在一些实施方案中，信号肽可用于表达源自大肠杆菌的多肽或其片段。用于生产蛋白质的信号序列和表达盒是本领域已知的。通常，前导肽的长度为5-30个氨基酸，并且通常存在于新合成多肽的N-末端。信号肽通常包含一长段倾向于形成单个α-螺旋的疏水性氨基酸。另外，许多信号肽始于一小段带正电荷的氨基酸，其可有助于在易位过程中加强多肽的正确拓扑结构。在信号肽的末端，通常有一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位过程中或易位完成后切割，生成游离信号肽和成熟蛋白质。在一些实施方案中，信号肽包括与以下序列中的任一个具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.9％或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:9,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22。

在一些实施方案中，本文所述的源自大肠杆菌的多肽或其片段可以包含可切割的接头。此类接头允许例如通过添加能够切割所述接头的试剂将标签从纯化的复合物中分离出来。可切割的接头是本领域已知的。此类接头可以例如通过光不稳定键的辐照或酸催化水解来切割。可切割的接头的另一个实例包括多肽接头，其整合了蛋白酶识别位点，并且可以通过加入合适的蛋白酶来切割。

在一些实施方案中，与相应的野生型大肠杆菌FimH多肽或片段相比，源自大肠杆菌的多肽或其片段包含修饰。所述修饰可以包括分子与多肽的共价附接。例如，此类修饰可以包括糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的键联等。在一些实施方案中，与相应的野生型大肠杆菌FimH多肽或片段相比，源自大肠杆菌的多肽或其片段可以包含修饰，诸如通过使用本领域技术人员已知的技术进行的化学修饰，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。在另一个实施方案中，所述修饰可以包括脂质分子与多肽的共价附接。在一些实施方案中，与相应的野生型大肠杆菌FimH多肽或其片段相比，多肽不包含与所述多肽的分子共价连接。

例如，细胞培养物中产生的蛋白质和多肽可以是糖蛋白，其含有共价连接的包括寡糖链在内的碳水化合物结构。这些寡糖链通过N-键联或O-键联与蛋白质连接。寡糖链可以占糖蛋白质量的相当大部分。通常，N-连接的寡糖被加到Asn-X-Ser/Thr的靶共有序列内天冬酰胺残基侧链的氨基上，其中X可以是除脯氨酸外的任意氨基酸。在一些实施方案中，糖基化位点包括选自以下序列中的任一个的氨基酸序列：天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸(NGT)、天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)。哺乳动物细胞中产生的源自大肠杆菌的多肽或其片段可以被糖基化。糖基化可以发生在源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列中的N-连接的糖基化信号Asn-Xaa-Ser/Thr处。“N-连接的糖基化”是指碳水化合物部分通过GIcNAc附接至多肽链中的天冬酰胺残基。N-连接的碳水化合物含有常见的Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R核心结构，其中R代表产生的源自大肠杆菌的多肽或其片段的天冬酰胺残基。

在一些实施方案中，通过源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列内的突变去除所述源自大肠杆菌的多肽或其片段中的糖基化位点。例如，在一些实施方案中，可以优选通过取代突变糖基化基序(Asn-Xaa-Ser/Thr)的Asn残基。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一种。

在一些实施方案中，糖基化基序的Ser残基可被突变，优选通过取代突变。在一些实施方案中，残基取代选自Asp、Thr和Gln中的任一种。

在一些实施方案中，可以优选通过取代突变糖基化基序的Thr残基。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp和Gln中的任一种。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段中的糖基化位点(诸如Asn-Xaa-Ser/Thr)未被去除或修饰。在一些实施方案中，可将减少或抑制糖基化的化合物添加到细胞培养基中。在此类实施方案中，所述多肽或蛋白质与在其它方面相同的条件下但在糖基化抑制化合物不存在的情况下由细胞产生的在其它方面相同的多肽或蛋白质相比，包含多出至少一个非糖基化(即，无糖基化)位点(即，没有碳水化合物部分附接至其的完全未被占据的聚糖位点)，或者在相同的潜在糖基化位置包含少至少一个碳水化合物部分。这些化合物是本领域已知的，可以包括但不限于衣霉素、衣霉素同系物、链病毒菌素、杀枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、杆菌肽、棒杆菌毒素、焦土霉素、杜伊霉素(duimycin)、1-脱氧甘露野尻霉素(1-deoxymannonojirimycin)、脱氧野尻霉素、N-甲基-1-脱氧甘露甘露野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖和甘露糖类似物、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧葡萄糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖、1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-甘露醇(DIM)、氟葡萄糖、氟甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、羟甲基戊二酰基-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆固醇、羟基胆固醇、苦马豆碱、环己酰亚胺、嘌呤霉素、放线菌素D、莫能菌素、间氯羰基氰苯腙(CCCP)、康帕丁、多萜基-磷酰基-2-脱氧葡萄糖(dolichyl-phosphoryl^-deoxyglucose)、N-乙酰基-D-葡糖胺、异黄嘌呤(hygoxanthine)、胸苷、胆固醇、葡糖氨、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴康杜糖醇、康杜糖醇环氧化物和康杜糖醇衍生物、糖基甲基-对硝基苯基三氮烯、β-羟基正缬氨酸、苏-β-氟天冬酰胺、D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、磷酸二(2-乙基己基)酯、磷酸三丁酯、磷酸十二烷基酯、(二苯基甲基)-磷酸的2-二甲基氨基乙酯、[2-(二苯基膦酰氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸盐和/或氟乙酸盐。本领域普通技术人员将容易识别或者能够确定可根据本发明的方法和组合物使用的糖基化抑制物质，而无需过多的实验。在此类实施方案中，可以控制多肽或其片段的糖基化，而无需在多肽或其片段中引入氨基酸突变。

在一些实施方案中，由哺乳动物细胞产生的多肽或其片段的糖基化水平(例如在多肽或其片段上被占据的聚糖位点的数量、该位点糖型的大小和/或复杂性等)低于在缺乏这种糖酵解抑制化合物和/或突变的原本相同的培养基中在原本相同的条件下产生的多肽或其片段的糖基化水平。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列不包括N-连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列不包括至少一个N-连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列不包括任何N-连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列包括N-连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列包含至多1个N-连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列包含至多2个N-连接的蛋白质糖基化位点。

不同细胞系或转基因动物中表达的源自大肠杆菌的多肽或其片段彼此相比可具有不同的聚糖位点占有率、糖型和/或糖基化模式。在一些实施方案中，本发明涵盖源自大肠杆菌的多肽或其片段，而不管哺乳动物细胞中产生的源自大肠杆菌的多肽或其片段的糖基化、聚糖占有率或糖型模式。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可以源自大肠杆菌FimH多肽，其中多肽的位置1处的氨基酸残基是苯丙氨酸，而不是甲硫氨酸，例如，具有氨基酸序列SEQID NO:2的多肽。优选地，源自大肠杆菌FimH的多肽在源自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的位置1处包含苯丙氨酸。在另一个优选实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，优选地其中源自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的位置1处的残基是苯丙氨酸。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可以包括氨基酸序列SEQ ID NO:4，其可源自大肠杆菌FimH多肽。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段包括与以下序列中的任一个具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.9％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可源自大肠杆菌FimG多肽，例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可源自大肠杆菌FimC多肽，例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO:10。

A.源自大肠杆菌FimH的多肽及其片段

在优选实施方案中，所述多肽或其片段源自大肠杆菌FimH。在一些实施方案中，所述多肽或其片段包括全长大肠杆菌FimH。全长FimH包括两个结构域：N-末端凝集素结构域和C-末端菌毛蛋白结构域，它们由短接头连接。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH的全长包括279个氨基酸，其包括大肠杆菌FimH的成熟蛋白的全长。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH的全长包括300个氨基酸，其包括大肠杆菌FimH的成熟蛋白的全长和长度为21个氨基酸的信号肽序列。300个氨基酸长的野生型FimH的一级结构在大肠杆菌菌株间高度保守。

全长大肠杆菌FimH的示例性序列是SEQ ID NO:1。全长FimH序列包括凝集素结构域的序列和菌毛蛋白结构域的序列。FimH的凝集素结构域包含碳水化合物识别结构域，其负责与尿路上皮细胞表面上的甘露糖基化尿溶蛋白1a结合。菌毛蛋白结构域通过随后的FimG亚单位的供体链锚定到菌毛的核心，这是一个称为供体链互补的过程。

从N-末端开始，全长FimH的每个结构域的名称和括号中的示例性氨基酸序列如下：FimH凝集素(SEQ ID NO:2)和FimH菌毛蛋白(SEQ ID NO:3)。

源自大肠杆菌FimH的其它合适的多肽及其片段包括与以下序列中的任一个具有不同程度同一性的变体：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，诸如与以下序列中的任一个具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29。在某些实施方案中，FimH变体蛋白：(i)形成FimH-FimC的一部分；(ii)包含至少一个来自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的表位；并且/或者(iii)可在体内引发与大肠杆菌FimH免疫交叉反应的抗体。

在一些实施方案中，组合物包含具有来自以下序列中的任一个的至少n个连续氨基酸的多肽：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:20,SEQID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，其中n为7或更大(例如8,10,12,14,16,18,20或更大)。优选地，所述片段包括来自所述序列的表位。在一些实施方案中，组合物包含具有以下序列中的任一个的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。

在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:1具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:2具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:3具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:4具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:20具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:23具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:24具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:26具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:28具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQID NO:30具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。

本文所述的源自大肠杆菌FimH的合适多肽及其片段的另一个实例如SEQ ID NO:2所示，其缺乏野生型N-末端信号序列，并且对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-300。FimH片段的另一个实例包含完整的N-末端信号序列和成熟蛋白，诸如SEQ ID NO:1中所示的。

在一些实施方案中，通过源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列中的突变去除源自大肠杆菌的多肽或其片段中的糖基化位点。例如，在一些实施方案中，可以优选通过取代对成熟大肠杆菌FimH多肽的位置7处(例如根据SEQ ID NO:2的编号)的Asn残基进行突变。在一些实施方案中，可以优选通过取代对大肠杆菌FimH多肽的凝集素结构域的位置7处(例如根据SEQ ID NO:3的编号)的Asn残基进行突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一种。

在一些实施方案中，可以优选通过取代对成熟大肠杆菌FimH多肽的位置10处(例如根据SEQ ID NO:2的编号)的Thr残基进行突变。在一些实施方案中，可以优选通过取代对大肠杆菌FimH多肽的凝集素结构域的位置7处(例如根据SEQ ID NO:3的编号)的Thr残基进行突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp和Gln中的任一种。

在一些实施方案中，可以优选通过取代对成熟大肠杆菌FimH多肽的位置N235处(例如根据SEQ ID NO:2的编号)的Asn残基进行突变。在一些实施方案中，可以优选通过取代对成熟大肠杆菌FimH多肽的位置N228处(例如根据SEQ ID NO:2的编号)的Asn残基进行突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一种。

在一些实施方案中，可以优选通过取代对成熟大肠杆菌FimH多肽的位置70处(例如根据SEQ ID NO:2的编号)的Asn残基进行突变。在一些实施方案中，可以优选通过取代对大肠杆菌FimH多肽的凝集素结构域的位置70处(例如根据SEQ ID NO:3的编号)的Asn残基进行突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一种。

在一些实施方案中，可以优选通过取代对成熟大肠杆菌FimH多肽的位置72处(例如根据SEQ ID NO:2的编号)的Ser残基进行突变。在一些实施方案中，可以优选通过取代对大肠杆菌FimH多肽的凝集素结构域的位置72处(例如根据SEQ ID NO:3的编号)的Ser残基进行突变。在一些实施方案中，残基取代选自Asp、Thr和Gln中的任一种。

如本文中所用，术语“片段”是指多肽，并且被定义为给定多肽的任何离散部分，所述离散部分对于该多肽是独特的或具有该多肽的特征。如本文中所用，术语还指给定多肽的任何离散部分，所述离散部分保留了全长多肽活性的至少一部分。在某些实施方案中，保留的活性部分是全长多肽的活性的至少10％。在某些实施方案中，保留的活性部分为全长多肽的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，保留的活性部分为全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，保留的活性部分是全长多肽的活性的100％或更多。在一些实施方案中，片段包括全长多肽的至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个连续氨基酸。

B.FimH、FimC及其片段的复合物

在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段与源自大肠杆菌FimC的多肽或其片段存在于复合物中。在优选实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段和源自大肠杆菌FimC的多肽或其片段存在于复合物中，优选以1:1的比例存在于复合物中。不受理论或机制的束缚，全长FimH可以通过周质伴侣(periplasmic chaperone)FimC稳定在活性构象中，从而使得纯化全长FimH蛋白成为可能。因此，在一些实施方案中，所述多肽或其片段包括全长FimH和全长FimC。

在一些实施方案中，所述多肽或其片段包括FimH的片段和FimC的片段。在一些实施方案中，所述多肽或其片段包括全长FimH和FimC的片段。大肠杆菌FimC的示例性序列示于SEQ ID NO:10中。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段包含FimH的复合物形成片段。

FimH的复合物形成片段可以是保留了与FimC或其片段形成复合物的能力的FimH蛋白的任何部分或一部分。FimH的合适的复合物形成片段也可以通过本领域已知的标准测定诸如免疫共沉淀测定、交联或荧光染色共定位等来获得或确定，也可以使用SDS-PAGE或蛋白质印迹(例如通过显示FimH片段和FimC或其片段在复合物中，如通过凝胶电泳证明的)。在某些实施方案中，FimH的复合物形成片段(i)形成FimH-FimC复合物的部分；(ii)包含至少一个来自以下序列的表位：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；并且/或者(iii)可在体内引发与大肠杆菌FimH免疫交叉反应的抗体。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段包括全长FimH，其中FimH不与FimC复合。在又一实施方案中，多肽或其片段包括FimH的片段，其中所述片段不与FimC复合。在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimC的多肽或其片段包括SEQ ID NO:10中所示的。在一些实施方案中，所述复合物可以由相同的质粒表达，优选在每种多肽或其片段的独立启动子的控制下表达。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段与源自大肠杆菌FimC的多肽或其片段结合，后者可被工程改造成源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段的结构。在复合物中与FimH结合的FimC分子的一部分称为“供体链”，使用FimC中与FimCH复合物中的FimH结合的链形成天然FimH结构的机制称为“供体链互补”。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段可由FimH的合适供体链互补形式表达，其中在FimCH复合物中与FimH相互作用的FimC的氨基酸序列本身在FimH的C-末端处被工程改造以提供天然构象，而不需要存在FimC分子的其余部分。在一些实施方案中，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段可以以复合物的形式表达，所述复合物包括其分离的结构域，诸如凝集素结合结构域和菌毛蛋白结构域，并且此类结构域可以共价或非共价地连接在一起。例如，在一些实施方案中，连接区段可以包括氨基酸序列或其它寡聚体结构，包括简单的多聚合体结构。

本发明的方法和组合物可以包括本文所述的复合物，其中源自大肠杆菌的所述多肽或其片段共表达或以组合状态形成。

C.凝集素结构域、菌毛蛋白结构域及其变体

FimH的凝集素结构域的构象和配体结合特性可能受FimH的菌毛蛋白结构域的变构控制。在静态条件下，全长FimH的两个结构域的相互作用将凝集素结构域稳定在对单甘露糖的低亲和力状态(例如K_d～300μM)，其特征在于浅结合口袋。与甘露糖苷配体的结合可诱导构象变化，导致中等亲和力状态，其中凝集素和菌毛蛋白结构域保持紧密接触。然而，在剪切应力下，凝集素和菌毛蛋白结构域可以分离并诱导高亲和力状态(例如K_d<1.2μM)。

由于缺乏由菌毛蛋白结构域产生的负变构调节，FimH的分离的凝集素结构域被锁定在高亲和力状态(例如K_d<1.2μM)。分离的重组凝集素结构域，其被锁定在高亲和力状态。然而，将粘附素锁定在低亲和力构象(例如K_d～300μM)会诱导粘附抑制抗体的产生。因此，人们对稳定处于低亲和力状态的凝集素结构域感兴趣。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段包括大肠杆菌FimH的凝集素结构域。凝集素结构域的示例性序列包括SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:26中的任一个。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH的凝集素结构域包括半胱氨酸取代。在优选实施方案中，大肠杆菌FimH的凝集素结构域包括凝集素结构域的前50个氨基酸残基内的半胱氨酸取代。在一些实施方案中，凝集素结构域可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个半胱氨酸取代。优选地，凝集素结构域包含2个半胱氨酸取代。例如，参见pSB02158和pSB02198。

源自大肠杆菌FimH的其它合适的多肽及其片段包括变体，所述变体与SEQ ID NO:3具有不同程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:3中所述的序列具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:3具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段包括大肠杆菌FimH的菌毛蛋白结构域。源自大肠杆菌FimH的其它合适的多肽及其片段包括FimH菌毛蛋白结构域变体，所述变体与SEQ IDNO:7具有不同程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:7中所述的序列具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:4具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。源自大肠杆菌FimH的其它合适的多肽及其片段包括FimH凝集素结构域变体，所述变体与SEQ IDNO:8具有不同程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:8中所述的序列具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:8具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段包括大肠杆菌FimH的菌毛蛋白结构域。源自大肠杆菌FimH的其它合适的多肽及其片段包括FimH菌毛蛋白结构域变体，所述变体与SEQ IDNO:24具有不同程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:24具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:24具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。源自大肠杆菌FimH的其它合适的多肽及其片段包括FimH凝集素结构域变体，所述变体与SEQ ID NO:26具有不同程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:26具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，所述组合物包含与SEQ ID NO:26具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或99.9％同一性的多肽。

在一些实施方案中，组合物包含具有来自以下序列中的任一个的至少n个连续氨基酸的多肽：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26，其中n为7或更大(例如8,10,12,14,16,18,20或更大)。优选地，所述片段包括来自所述序列的表位。在一些实施方案中，组合物包含多肽，所述多肽具有以下序列中的任一个的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:26。

大肠杆菌FimH或其同源物或变体的凝集素结构域的位置和长度可以基于其序列与以下序列中的任一个的配对比对(例如通过将FimH的氨基酸序列与SEQ ID NO:1比对，并鉴定与SEQ ID NO:1的残基22-179对齐的序列)来预测：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26。

D.野生型N-末端信号序列

在一些实施方案中，全长FimH的N末端野生型信号序列在宿主细胞中被切割以产生成熟的FimH多肽。因此，宿主细胞表达的FimH可能缺少N-末端信号序列。在优选实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可以由缺少野生型N-末端信号序列的编码序列的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段包含FimH的FimH-FimC复合物形成片段、N-末端信号序列(诸如，SEQ ID NO:1的残基1-21)或其组合。FimH的复合物形成片段可以是FimH蛋白的保留了与FimC形成复合物的能力的任何部分或一部分。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可在全长FimH多肽的N-末端和/或C-末端缺少1至21个氨基酸残基(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个氨基酸残基，或缺少1-21个残基、1-20个残基、1-15个残基、1-10个残基、2-20个残基、2-15个残基、2-10个残基、5-20个残基、5-15个残基或5-10个残基)，其可包括信号序列、凝集素结构域和菌毛蛋白结构域。

II.核酸

一方面，公开了编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的核酸。编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的一种或多种核酸构建体可用于基因组整合和随后源自大肠杆菌的多肽或其片段的表达。例如，可以将编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的单种核酸构建体引入宿主细胞。或者，源自大肠杆菌的多肽或其片段的编码序列可由两种或更多种核酸构建体携带，然后将它们同时或依次引入宿主细胞。

例如，在一个示例性实施方案中，单种核酸构建体编码大肠杆菌FimH的凝集素结构域和菌毛蛋白结构域。在另一个示例性实施方案中，一种核酸构建体编码凝集素结构域，并且第二核酸构建体编码大肠杆菌FimH的菌毛蛋白结构域。在一些实施方案中，实现了基因组整合。

核酸构建体可以包含含有一个或多个内含子或cDNA的基因组DNA。当内含子存在时，一些基因的表达效率更高。在一些实施方案中，核酸序列适于在所述哺乳动物细胞中表达外源多肽。

在一些实施方案中，编码多肽或其片段的核酸被密码子优化以升高在任何特定细胞中的表达水平。

在一些实施方案中，核酸构建体包括编码肽的信号序列，所述肽指导源自大肠杆菌的多肽或其片段的分泌。在一些实施方案中，核酸包括源自大肠杆菌FimH的多肽的天然信号序列。在一些其中源自大肠杆菌的多肽或其片段包括内源信号序列的实施方案中，编码所述信号序列的核酸序列可以被密码子优化以升高所述蛋白质在宿主细胞中的表达水平。

在一些实施方案中，所述信号序列是以下长度中的任一种：15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个和30个氨基酸长。在一些实施方案中，信号序列的长度为20个氨基酸。在一些实施方案中，信号序列的长度为21个氨基酸。

在一些实施方案中，当多肽或其片段包括信号序列时，与多肽天然相关的内源信号序列可以被与野生型多肽不相关的信号序列替代，以提高培养细胞中多肽或其片段的表达水平。因此，在一些实施方案中，核酸不包括源自大肠杆菌的多肽或其片段的天然信号序列。在一些实施方案中，核酸不包括源自大肠杆菌FimH的多肽的天然信号序列。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可与异源肽一起表达，所述异源肽优选是信号序列或在源自大肠杆菌的成熟蛋白或多肽或其片段的N末端具有特异性切割位点的其它肽。例如，源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段可以与异源肽(例如IgK信号序列)一起表达，所述异源肽优选为信号序列或在成熟大肠杆菌FimH蛋白的N末端具有特异性切割位点的其它肽。在优选实施方案中，成熟蛋白大肠杆菌FimH N-末端的特异性切割位点刚好出现在成熟大肠杆菌FimH蛋白的起始苯丙氨酸残基之前。所选择的异源序列优选为被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的序列。

在优选实施方案中，信号序列是IgK信号序列。在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，所述核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:22。在优选实施方案中，信号序列是小鼠IgK信号序列。

用于产生源自大肠杆菌的多肽或其片段的合适的哺乳动物表达载体是本领域已知的，并且可以是商购可得的，诸如Invitrogen^TM的pSecTag2表达载体。示例性小鼠IgKappa信号肽序列包括序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:54)。在一些实施方案中，所述载体包括来自Thermo Fisher的pBudCE4.1哺乳动物表达载体。其它示例性和合适的载体包括pcDNA^TM3.1哺乳动物表达载体(Thermo Fisher)。

在一些实施方案中，信号序列不包括血凝素信号序列。

在一些实施方案中，所述核酸包含源自大肠杆菌的多肽或其片段的天然信号序列。在一些实施方案中，信号序列不是IgK信号序列。在一些实施方案中，信号序列包括血凝素信号序列。

一方面，本文公开了包含源自大肠杆菌的多肽或其片段的编码序列的载体。示例性载体包括能够自主复制或能够在哺乳动物细胞中复制的质粒。典型的表达载体含有合适的启动子、增强子和终止子，它们可用于调节表达构建体中一个或多个编码序列的表达。载体还可以包含选择标记，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状(诸如赋予对诸如氨苄青霉素或新霉素等抗生素的抗性)。

合适的启动子是本领域已知的。示例性启动子包括例如CMV启动子、腺病毒启动子、EF1 a启动子、GAPDH金属硫蛋白启动子、SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子等。启动子可以是组成型的或诱导型的。可以使用一种或多种载体(例如编码其所有亚单位或结构域或片段的一种载体，或者一起编码其亚单位或结构域或片段的多种载体)。

也可以使用内部核糖体进入位点(IRES)和2A肽序列。IRES和2A肽提供了用于多序列共表达的替代方法。IRES是一种核苷酸序列，其允许在信使RNA(mRNA)序列中间开始翻译，作为蛋白质合成的更大过程的一部分。通常，在真核生物中，翻译只能从mRNA分子的5’端开始。IRES元件允许在一个转录物中表达多个基因。基于IRES的多顺反子载体从一个转录物中表达多种蛋白质，可以减少非表达克隆从选择中逃脱。2A肽允许将单个开放阅读框中的多种蛋白质翻译成多蛋白(polyprotein)，所述多蛋白随后通过核糖体跳跃机制被切割成单个蛋白质。2A肽可以提供多种蛋白产物更平衡的表达。示例性IRES序列包括，例如，EV71 IRES、EMCV IRES、HCV IRES。对于基因组整合，整合可以是位点特异性的或随机的。位点特异性重组可通过将一种或多种同源序列引入本文所述的核酸构建体来实现。这种同源序列基本上与宿主基因组中特定靶位点的内源序列相匹配。或者，可以使用随机整合。有时，蛋白质的表达水平可能因整合位点而异。因此，可能需要根据重组蛋白表达水平选择多种克隆，以鉴定达到所需表达水平的克隆。

示例性核酸构建体在附图诸如图2A-图2T中的任一个中有进一步的描述。

一方面，所述核酸序列编码与以下序列中的任一个具有至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.9％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:20,SEQID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。

III.宿主细胞

一方面，本发明涉及细胞，其中编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的序列在哺乳动物宿主细胞中表达。在一个实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段在宿主细胞中瞬时表达。在另一个实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段被稳定整合到宿主细胞的基因组中，并且当在合适的条件下培养时，表达源自大肠杆菌的多肽或其片段。在优选实施方案中，多核苷酸序列以高效率和基因组稳定性表达。

合适的哺乳动物宿主细胞是本领域已知的。优选地，宿主细胞适于以工业生产规模生产蛋白质。示例性哺乳动物宿主细胞包括下列任一种及其衍生物：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞(源自猴肾(非洲绿猴)的细胞系)、Vero细胞、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞、NSO细胞(鼠骨髓瘤细胞系)和C127细胞(非致瘤性小鼠细胞系)。其它示例性哺乳动物宿主细胞包括小鼠Sertoli(TM4)、水牛大鼠肝脏(BRL 3A)、小鼠乳腺肿瘤(MMT)、大鼠肝瘤(HTC)、小鼠骨髓瘤(NSO)、鼠杂交瘤(Sp2/0)、小鼠胸腺瘤(EL4)、中国仓鼠卵巢(CHO)和CHO细胞衍生物、鼠胚胎(NIH/3T3、3T3 Li)、大鼠心肌(H9c2)、小鼠成肌细胞(C2C12)和小鼠肾脏(miMCD-3)。哺乳动物细胞系的其它实例包括NS0/1,Sp2/0,Hep G2,PER.C6,COS-7,TM4,CV1,VERO-76,MDCK,BRL3A,W138,MMT 060562,TR1,MRC5和FS4。

根据本发明，可以根据本发明利用对细胞培养易感的任何细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l,ECACC号：85110503)；人类成视网膜细胞(PER.C6,CruCell,Leiden,The Netherlands)；SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(经亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J.GenVirol.,36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝瘤细胞系(Hep G2)。在一些优选实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在一些优选实施方案中，所述细胞是GS细胞。

另外，根据本发明，可以使用任何数量的商业和非商业可获得的杂交瘤细胞系。如本文中所用，术语“杂交瘤”是指由永生化细胞与抗体产生细胞融合产生的细胞或细胞后代。这样的所得杂交瘤是产生抗体的永生化细胞。用于产生杂交瘤的单个细胞可以来自任何哺乳动物来源，包括但不限于大鼠、猪、兔、绵羊、猪、山羊和人。在一些实施方案中，杂交瘤是三源杂交瘤细胞系，其是当异源杂交骨髓瘤融合的子代随后与浆细胞融合时产生的，所述杂交瘤是人细胞与鼠骨髓瘤细胞系融合的产物。在一些实施方案中，杂交瘤是产生抗体的任何永生化杂交细胞系，例如，四源杂交瘤(参见，例如，Milstein等人，Nature,537:3053,1983)。本领域技术人员将理解杂交瘤细胞系可能具有不同的营养需求并且/或者可能需要不同的培养条件以获得最佳生长，并且将能够根据需要改变条件。

在一些实施方案中，所述细胞包含第一目的基因，其中第一目的基因是染色体整合的。在一些实施方案中，第一目的基因包含报道基因、选择基因、目的基因(例如编码源自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，治疗目的基因包含编码难以表达(DtE)的蛋白质的基因。

在一些实施方案中，第一个目的基因位于位点特异性整合(SSI)哺乳动物细胞中两个不同的重组靶位点(RTS)之间，其中两个RTS被染色体整合在NL1基因座或NL2基因座内。关于NL1基因座、NL2基因座、NL3基因座、NL4基因座、NL5基因座和NL6基因座的描述，参见例如美国专利申请公布第20200002727号。在一些实施方案中，第一个目的基因位于NL1基因座内。在一些实施方案中，所述细胞包含第二目的基因，其中第二目的基因是染色体整合的。在一些实施方案中，第二目的基因包括报道基因、选择基因、治疗目的基因(诸如源自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，治疗目的基因包含编码DtE蛋白的基因。在一些实施方案中，第二目的基因位于两个RTS之间。在一些实施方案中，第二目的基因位于NL1基因座或NL2基因座内。在一些实施方案中，第一目的基因位于NL1基因座内，第二目的基因位于NL2基因座内。在一些实施方案中，所述细胞包含第三目的基因，其中第三目的基因是染色体整合的。在一些实施方案中，第三目的基因包含报道基因、选择基因、治疗目的基因(诸如源自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，治疗目的基因包含编码DtE蛋白的基因。在一些实施方案中，第三目的基因位于两个RTS之间。在一些实施方案中，第三目的基因位于NL1基因座或NL2基因座内。在一些实施方案中，第三目的基因位于不同于NL1基因座和NL2基因座的基因座内。在一些实施方案中，第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因位于三个独立的基因座内。在一些实施方案中，第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因中的至少一个在NL1基因座内，并且第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因中的至少一个在NL2基因座内。在一些实施方案中，所述细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些实施方案中，位点特异性重组酶基因是染色体整合的。

在一些实施方案中，本公开提供了包含至少四个不同RTS的哺乳动物细胞，其中所述细胞包含(a)至少两个不同RTS被染色体整合在NL1基因座或NL2基因座内；(b)第一目的基因整合在(a)的至少两个RTS之间，其中第一目的基因包含报道基因、编码DtE蛋白的基因、辅助基因或其组合；(c)以及将第二目的基因整合到不同于(a)的基因座的第二染色体基因座中，其中第二目的基因包含报道基因、编码DtE蛋白(诸如源自大肠杆菌的多肽或其片段)的基因、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，本公开提供了包含至少四个不同RTS的哺乳动物细胞，其中所述细胞包含(a)至少两个不同RTS被染色体整合在Fer1L4基因座内；(b)至少两个不同的RTS被染色体整合在NL1基因座或NL2基因座内；(c)第一目的基因被染色体整合在Fer1L4基因座内，其中第一目的基因包含报道基因、编码DtE蛋白的基因、辅助基因或其组合；以及(d)第二目的基因被染色体整合在(b)的NL1基因座或NL2基因座内，其中第二目的基因包含报道基因、编码DtE蛋白(例如源自大肠杆菌的多肽或其片段)的基因、辅助基因或其组合。

在一些实施方案中，本公开提供了包含至少六个不同RTS的哺乳动物细胞，其中所述细胞包括(a)至少两个不同RTS和第一目的基因被染色体整合在Fer1L4基因座内；(b)至少两个不同的RTS和第二目的基因被染色体整合在NL1基因座内；以及(c)至少两个不同的RTS和第三目的基因被染色体整合在NL2基因座内。

如本文中所述，术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指以使得能够指导给定基因转录和/或所需蛋白质分子合成的核酸分子得以产生的方式进行的核酸序列的键联。所述术语还指氨基酸序列以使得产生功能性蛋白质的方式进行的氨基酸序列的键联。在一些实施方案中，目的基因与启动子可操作地连接，其中目的基因被染色体整合到宿主细胞中。在一些实施方案中，目的基因与异源启动子可操作地连接；其中目的基因被染色体整合到宿主细胞中。在一些实施方案中，辅助基因与启动子可操作地连接，其中辅助基因被染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，辅助基因与异源启动子可操作地连接；其中辅助基因被染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，编码DtE蛋白的基因与启动子可操作地连接，其中编码DtE蛋白的基因被染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，编码DtE蛋白的基因与异源启动子可操作地连接，其中编码DtE蛋白的基因被染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，重组酶基因与启动子可操作地连接，其中重组酶基因被染色体整合到宿主细胞中。在一些实施方案中，重组酶基因与启动子可操作地连接，其中重组酶基因不整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，重组酶基因与异源启动子可操作地连接，其中重组酶基因未被染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，重组酶基因与异源启动子可操作地连接，其中重组酶基因未被染色体整合到宿主细胞基因组中。

如本文所述，术语“染色体整合的”或“染色体整合”指核酸序列稳定掺入宿主细胞(例如哺乳动物细胞)的染色体中，即被染色体整合到宿主细胞(例如哺乳动物细胞)的基因组DNA(gDNA)中的核酸序列。在一些实施方案中，被染色体整合的核酸序列是稳定的。在一些实施方案中，被染色体整合的核酸序列不位于质粒或载体上。在一些实施方案中，被染色体整合的核酸序列不被切除。在一些实施方案中，染色体整合由成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)基因编辑系统(CRISPR/CAS)介导。

在一些实施方案中，宿主细胞适合在悬浮培养物中生长。悬浮感受态宿主细胞通常是单分散的，或者以松散的聚集体生长，而没有明显的聚集。悬浮感受态宿主细胞包括无需适应或操作就适于悬浮培养的细胞(例如造血细胞、淋巴样细胞)和通过修饰或适应附着依赖性细胞而成为悬浮感受态的细胞(例如上皮细胞、成纤维细胞)。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的表达水平或活性，与源自大肠杆菌的多肽或其片段在细菌细胞(例如,大肠杆菌宿主细胞)中的表达相比，增加了至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍。

本文所述的宿主细胞适于大规模培养。例如，细胞培养物可以是10L,30L,50L,100L,150L,200L,300L,500L,1000L,2000L,3000L,4000L,5000L,10,000L或更大。在一些实施方案中，细胞培养物规模的范围可为10L至5000L,10L至10,000L,10L,至20,000L,10I,至50,000L,40I,至50,000L,100L至50,000L,500L至50,000L,1000L至50,000L,2000L至50,000L,3000I,至50,000L,4000L至50,000L,4500L至50,000L,1000L至10,000L,1000L至20,000L,1000L至25,000L,1000L至30,000L,15L至2000L,40L至1000L,100L至500L,200L至400L，或其间的任意整数。用于细胞培养的培养基成分是本领域已知的，并且可以包括例如缓冲液、氨基酸成分、维生素成分、盐成分、矿物质成分、血清成分、碳源成分、脂质成分、核酸成分、激素成分、微量元素成分、氨成分、辅因子成分、指示剂成分、小分子成分、水解产物成分和酶调节剂成分。

如本文中所用，术语“培养基(medium)”、“细胞培养基(cell culture medium)”和“培养基(culture medium)”是指含有营养生长中的哺乳动物细胞的营养物的溶液。通常，此类溶液提供细胞最低生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。这种溶液还可以包含在最小速率以上增强生长和/或存活的补充成分，包括但不限于激素和/或其它生长因子、特定离子(诸如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、以高的终浓度存在的无机化合物(例如铁)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量源。在一些实施方案中，培养基被有利地配制成对细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。在一些实施方案中，培养基是在细胞培养开始后添加的补料培养基。

在一些实施方案中，细胞可以在多种化学成分明确的培养基之一中生长，其中所述培养基的组分是已知的和受控的。在一些实施方案中，细胞可以在复杂培养基中生长，其中并非培养基的所有成分都是已知的和/或可控的。在过去的数十年里，用于哺乳动物细胞培养的化学成分确定的生长培养基得到了广泛的发展和公布。成分明确的培养基的所有组分都得到很好的表征，因此成分明确的培养基不含复杂的添加剂，诸如血清或水解产物。早期培养基制剂被开发来允许细胞生长和维持活力，而几乎不关心或不关心蛋白质产生。近来，已经开发了培养基制剂，其明确目的是支持高产重组蛋白生产细胞培养物。此类培养基优选用于本发明的方法。此类培养基通常包含大量的营养物质，特别是氨基酸，以支持细胞以高密度生长和/或维持。如果需要，被技术人员可以修改这些培养基以用于本发明的方法。例如，技术人员可以减少这些培养基中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和/或甲硫氨酸的量，以便其在本文公开的方法中用作基础培养基或补料培养基。

并非复合培养基的所有组分都得到很好的表征，因此复合培养基可能包含添加剂，诸如简单和/或复合碳源、简单和/或复合氮源以及血清等等。在一些实施方案中，适用于本发明的复合培养基除了本文所述的成分明确的培养基的其它组分之外，还包含诸如水解产物等添加剂。在一些实施方案中，成分明确的培养基通常包括在水中浓度已知的大约五十种化学实体。其中的大多数还含有一种或多种特征明确的蛋白质，诸如胰岛素、IGF-1、转铁蛋白或BSA，但其它培养基不需要蛋白质成分，因此被称为不含蛋白质的成分明确的培养基。培养基的典型化学组分分为五大类：氨基酸、维生素、无机盐、微量元素和难以简单分类的杂项。

细胞培养基可以任选地补充有补充组分。如本文中所用，术语“补充组分”是指以高于最小速率增强生长和/或存活的组分，包括但不限于激素和/或其它生长因子、特定离子(诸如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能量源。在一些实施方案中，可以向初始细胞培养物中添加补充组分。在一些实施方案中，可以在细胞培养开始后添加补充成分。通常地，微量元素是指以微摩尔或更低水平包含的各种无机盐。例如，通常包含的微量元素有锌、硒、铜等。在一些实施方案中，铁(亚铁盐或铁盐)可以以微摩尔浓度作为微量元素包含在初始细胞培养基中。锰也经常作为二价阳离子MnCl₂或MnSO₄)包含在微量元素中，浓度范围为纳摩尔到微摩尔。许多不常见的微量元素通常以纳摩尔浓度添加。

在一些实施方案中，本发明方法中使用的培养基是适于在细胞培养中支持高细胞密度(例如1x10⁶个细胞/mL,5x10⁶个细胞/mL,1x10⁷个细胞/mL,5x10⁷个细胞/mL,1x10⁸个细胞/mL或5x10⁸个细胞/mL)的培养基。在一些实施方案中，细胞培养是哺乳动物细胞补料分批培养，优选CHO细胞补料分批培养。

在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的酪氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的色氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的甲硫氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的亮氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的丝氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苏氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的甘氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的两种。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸和酪氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的酪氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的酪氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的色氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的三种。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的四种。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和蛋氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的五种。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的六种。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1和2mM之间、在0.1和1mM之间、在0.5和1.5mM之间或在0.5和1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的七种。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度低于2mM、低于1mM、在0.1和2mM之间、在0.1和1mM之间、在0.5和1.5mM之间或在0.5和1mM之间的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基还包含浓度高于2mM,3mM,4mM,5mM,10mM,15mM,优选为2mM的甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少1种,2种,3种,4种,5种,6种,7种,8种,9种,10种,11种,12种或13种。在一些实施方案中，细胞培养基还包含浓度高于2mM,3mM,4mM,5mM,10mM,15mM,优选为2mM的甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少5种。在一些实施方案中，细胞培养基还包含浓度高于2mM,3mM,4mM,5mM,10mM,15mM,优选为2mM的甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺。在一些实施方案中，细胞培养基还包含浓度高于2mM,3mM,4mM,5mM,10mM,15mM，或优选为2mM的缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种。在一些实施方案中，细胞培养基还包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少5种。在一些实施方案中，细胞培养基还包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM,5mM,7mM,10mM,15mM或20mM，优选为10mM的丝氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM,5mM,7mM,10mM,15mM或20mM，优选为10mM的缬氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM,5mM,7mM,10mM,15mM或20mM，优选为10mM的半胱氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM,5mM,7mM,10mM,15mM或20mM，优选为10mM的异亮氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM,5mM,7mM,10mM,15mM或20mM，优选为10mM的亮氨酸。在一些实施方案中，上述细胞培养基用于本文公开的方法中。在一些实施方案中，上述细胞培养基在本文公开的方法中用作基础培养基。在一些实施方案中，上述细胞培养基在本文公开的方法中用作补料培养基。

IV.生产方法

一方面，本发明包括生产源自大肠杆菌的多肽或其片段的方法。所述方法包括在合适的条件下培养哺乳动物细胞，从而表达源自大肠杆菌的多肽或其片段。所述方法还可包括从培养物中收获源自大肠杆菌的多肽或其片段。所述方法还可包括纯化源自大肠杆菌的多肽或其片段。

在一些实施方案中，所述方法以0.1g/L至0.5g/L的产量生产多肽或其片段。

在一些实施方案中，所述细胞可以在分批或补料分批培养中生长，其中在多肽充分表达后终止培养，之后收获表达的多肽并任选进行纯化。在一些实施方案中，细胞可以在灌注培养物中生长，其中不终止培养，并且周期性地或连续地向培养物中添加新的营养物和其它组分，在此期间周期性地或连续地收获表达的多肽。

在一些实施方案中，细胞可以在体积从数毫升至几数的小规模反应容器中生长。在一些实施方案中，细胞可以在大规模商业生物反应器中生长，所述生物反应器的体积范围为大约1升至10升,100升,250升,500升,1000升,2500升,5000升,8000升,10000升,12000升或更多，或者介于两者之间的任何体积。

细胞培养物的温度将主要基于细胞培养物在其下保持活力的温度范围、在其下产生高水平多肽的温度范围、在其下产生或积累的代谢废物最少的温度范围和/或这些因素或实施者认为重要的其它因素的任意组合来选择。作为一个非限制性实例，CHO细胞在约37℃下生长良好并产生高水平的蛋白质或多肽。一般而言，大多数哺乳动物细胞在约25℃至42℃的范围内生长良好并且/或者可以产生高水平的蛋白质或多肽，尽管本公开教导的方法不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在约35℃至40℃的范围内生长良好并且/或者可产生高水平的蛋白质或多肽。在某些实施方案中，在细胞培养过程中的一个或多个时间，在20℃,21℃,22℃,23℃,24℃,25℃,26℃,27℃,28℃,29℃,30℃,31℃,32℃,33℃,34℃,35℃,36℃,37℃,38℃,39℃,40℃,41℃,42℃,43℃,44℃或45℃的温度下生长所述细胞培养物。

如本文中所用，术语“培养物”和“细胞培养物”是指在适合细胞群生存和/或生长的条件下悬浮在培养基中的细胞群。对于本领域普通技术人员来说很明了的是，在一些实施方案中，本文所用的这些术语是指包含细胞群和所述细胞群悬浮于其中的培养基的组合。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞包括哺乳动物细胞。

本发明可以与任何适于所需过程(例如重组蛋白(例如抗体)的产生)的细胞培养方法一起使用。作为非限制性实例，可将细胞以分批或补料分批培养方式生长，其中在重组蛋白(例如抗体)充分表达后终止培养，之后收获表达的蛋白(例如抗体)。或者，作为另一个非限制性实例，可将细胞以分批再补料方式生长，其中不终止培养，并且周期性地或连续地向培养物中添加新的营养物和其它成分，在此期间周期性地或连续地收获表达的重组蛋白(例如抗体)。其它合适的方法(例如离心管培养)是本领域已知的，并且可用于实施本发明。

在一些实施方案中，适用于本发明的细胞培养是补料分批培养。如本文中所用，术语“补料分批培养”是其中在培养过程开始后的一个或多个时间向培养物中提供另外的组分的培养细胞的方法。此类提供的组分通常包含在培养过程中已经耗尽的细胞的营养成分。补料分批培养通常在某一点停止，并收获培养基中的细胞和/或组分以及任选地进行纯化。在一些实施方案中，补料分批培养包括补充有补料培养基的基础培养基。

细胞可以在实施者选择的任何方便的体积中生长。例如，细胞可以在体积为数毫升至数升的小规模反应容器中生长。或者，细胞可以在大规模商业生物反应器中生长，所述生物反应器的体积范围为大约至少1升至10升,50升,100升,250升,500升,1000升,2500升,5000升,8000升,10,000升,12,000,15000升,20000升或25000升或更大，或者其间的任何体积。

细胞培养物的温度将主要基于细胞培养物在其下保持活力的温度范围和在其中产生高水平所需产物(例如重组蛋白)的温度范围来选择。一般来说，大多数哺乳动物细胞在约25℃至42℃的范围内生长良好并能产生所需的产物(例如重组蛋白)，尽管本公开教导的方法不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在约35℃至40℃的范围内生长良好并且能够产生所需的产物(例如重组蛋白或抗体)。在某些实施方案中，在细胞培养过程中的一个或多个时间在20℃,21℃,22℃,23℃,24℃,25℃,26℃,27℃,28℃,29℃,30℃,31℃,32℃,33℃,34℃,35℃,36℃,37℃,38℃,39℃,40℃,41℃,42℃,43℃,44℃或45℃的温度下培养细胞培养物。本领域普通技术人员将能够根据细胞的特定需要和实施者的特定生产要求，选择一个或多个合适的生长细胞的温度。细胞可以生长任意长的时间，这取决于实施者的需要和细胞本身的要求。在一些实施方案中，使细胞在37℃生长。在一些实施方案中，将细胞在36.5℃生长。

在一些实施方案中，细胞可以在初始生长期(或生长期)期间生长更长或更短的时间，这取决于实施者的需要和细胞本身的要求。在一些实施方案中，使细胞生长足以达到预定的细胞密度的一段时间。在一些实施方案中，使细胞生长足以达到细胞密度的一段时间，所述细胞密度是如果允许不受干扰地生长，细胞最终将达到的最大细胞密度的给定百分比。例如，细胞可以生长一段时间，该时间足以达到最大细胞密度的1％,5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％的所需活细胞密度。在一些实施方案中，使细胞生长直至细胞密度每天培养增加不超过15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％或1％。在一些实施方案中，使细胞生长直至细胞密度每天培养增加不超过5％。

在一些实施方案中，使细胞生长一段确定的时间。例如，取决于细胞培养物的起始浓度、细胞生长时的温度和细胞的固有生长速率，可使细胞生长0天,1天,2天,3天,4天,5天,6天,7天,8天,9天,10天,11天,12天,13天,14天,15天,16天,17天,18天,19天,20天或更多天，优选4至10天。在一些情况下，可使细胞生长一个月或更长时间。本发明的实施者将能够根据蛋白质生产要求和细胞本身的需要来选择初始生长期的持续时间。

在初始培养期，可以搅动或摇动细胞培养物，以增加细胞的氧合作用和营养物向细胞的分散。根据本发明，本领域普通技术人员将理解，在初始生长期控制或调节生物反应器的某些内部条件可能是有益的，所述条件包括但不限于pH、温度、氧合等。

在初始生长期结束时，可以变换至少一种培养条件，使得能够应用第二组培养条件，并且在培养物中发生代谢转变。代谢转变可通过例如改变细胞培养物的温度、pH、重量摩尔渗透压浓度或化学诱导剂水平来实现。在一个非限制性实施方案中，通过变换培养物的温度来变换培养条件。然而，如本领域所知，变换温度不是实现适当代谢转变的唯一机制。例如，这种代谢转变也可以通过变换其它培养条件来实现，包括但不限于pH、重量摩尔渗透压浓度和丁酸钠水平。培养转变的时间安排将由本发明的实施者根据蛋白质生产要求或细胞本身的需要来确定。

当变换培养物的温度时，温度变换可以是相对渐进的。例如，完成温度变换可能需要花费数小时或数天。或者，温度变换可以相对突然。例如，温度变换可以在不到数小时内完成。给定适当的生产和控制设备，诸如多肽或蛋白质的商业大规模生产中的标准设备，温度变换甚至可以在不到一小时内完成。

在一些实施方案中，一旦如上所述变换了细胞培养物的条件，就可在第二组培养条件下将细胞培养物维持用于随后的生产期，所述第二组培养条件有助于细胞培养物的存活和活力并且适合于以商业上适当的水平表达所需的多肽或蛋白质。

如上所述，可以通过变换许多培养条件中的一个或多个来转变培养，所述培养条件包括但不限于温度、pH、重量摩尔渗透压浓度和丁酸钠水平。在一些实施方案中，变换培养物的温度。根据该实施方案，在随后的生产期中，使培养物保持在低于初始生长期的温度或温度范围的温度或温度范围。如上所述，可以采用多次不连续的温度变换来增加细胞密度或活力，或者增加重组蛋白的表达。

在一些实施方案中，可将细胞维持在随后的生产期，直至达到期望的细胞密度或生产滴度。在本发明的另一个实施方案中，使细胞在随后的生产期期间生长确定的一段时间。例如，取决于随后生长期开始时细胞培养物的浓度、细胞生长时的温度和细胞的固有生长速率，可使细胞生长1天,2天,3天,4天,5天,6天,7天,8天,9天,10天,11天,12天,13天,14天,15天,16天,17天,18天,19天,20天或更多天。在一些情况下，可使细胞生长一个月或更长时间。本发明的实施者将能够根据多肽或蛋白质生产要求和细胞本身的需要来选择后续生产期的持续时间。

在随后的生产期，可以搅动或摇动细胞培养物，以增加氧合作用和营养物向细胞扩散。根据本发明，本领域普通技术人员将理解，在随后的生长期期间控制或调节生物反应器的某些内部条件可以是有益的，所述条件包括但不限于pH、温度、氧合作用等。

在一些实施方案中，细胞表达重组蛋白，并且本发明的细胞培养方法包括生长期和生产期。

在一些实施方案中，在整个细胞培养方法期间应用本文公开的任何方法的步骤(ii)。在一些实施方案中，在细胞培养方法的一部分期间应用本文公开的任何方法的步骤(ii)。在一些实施方案中，应用步骤(ii)直至获得预定的活细胞密度。

在一些实施方案中，本发明的细胞培养方法包括生长期和生产期，并且在生长期期间应用步骤(ii)。在一些实施方案中，本发明的细胞培养方法包括生长期和生产期，并且在生长期的一部分期间应用步骤(ii)。在一些实施方案中，本发明的细胞培养方法包括生长期和生产期，并且在生长期和生产期期间应用步骤(ii)。

在本文公开的任何方法的步骤(ii)中，术语“维持”可指在整个培养过程中(直至收获)或在部分培养过程中(例如生长期、部分生长期或直至获得预定的细胞密度时)维持氨基酸或代谢物的浓度低于C1或C2。

在上述方法中的任一方法的一些实施方案中，与对照培养相比，细胞生长和/或生产率增加，所述对照培养除了其不包括步骤(ii)之外是相同的。

在上述方法中的任一方法的一些实施方案中，本发明的方法是用于改善细胞生长的方法。在一些实施方案中，本发明的方法是用于在高细胞密度下改善高密度细胞培养中的细胞生长的方法。

本文所用的高细胞密度是指高于1x10⁶个细胞/mL,5x10⁶个细胞/mL,1x10⁷个细胞/mL,5x10⁷个细胞/mL,1x10⁸个细胞/mL或5x10⁸个细胞/mL，优选高于1x10⁷个细胞/mL，更优选高于5x10⁷个细胞/mL的细胞密度。

在一些实施方案中，本发明的方法是用于改善细胞培养物中细胞生长的方法，其中细胞密度高于1x10⁶个细胞/mL,5x10⁶个细胞/mL,1x10⁷个细胞/mL,5x10⁷个细胞/mL,1x10⁸个细胞/mL或5x10⁸个细胞/mL。在一些实施方案中，本发明的方法是用于改善细胞培养物中细胞生长的方法，其中最大细胞密度高于1x10⁶个细胞/mL,5x10⁶个细胞/mL,1x10⁷个细胞/mL,5x10⁷个细胞/mL,1x10⁸个细胞/mL或5x10⁸个细胞/mL。

在一些实施方案中，细胞生长由活细胞密度(VCD)、最大活细胞密度或综合活细胞计数(Integrated viable cell count)(IVCC)决定。在一些实施方案中，细胞生长由最大活细胞密度决定。

如本文中所用，术语“活细胞密度”是指给定体积的培养基中存在的细胞数量。活细胞密度可以通过技术人员已知的任何方法来测量。优选地，使用自动细胞计数器诸如Bioprofile

测量活细胞密度。如本文中所用，术语最大细胞密度是指细胞培养期间达到的最大细胞密度。如本文中所用，术语“细胞活力”是指培养中的细胞在一组给定的培养条件或实验变化下存活的能力。本领域普通技术人员将会理解，本发明涵盖许多用于测定细胞活力的方法中的一种。例如，可以使用染料(例如台盼蓝)来测定细胞活力，所述染料不穿过活细胞的膜，但可以穿过死亡或濒死细胞的破裂的膜。

如本文中所用，术语“综合活细胞计数(IVCC)”是指活细胞密度(VCD)曲线下面积。IVCC可以使用以下公式计算：IVCC_t+1＝IVCC_t+(VCD_t+VCD_t+1)*(Δt)/2，其中Δt为t时间点与t+1时间点之间的时间差。可以假设IVCC_t＝0可以忽略不计。VCD_t和VCD_t+1是t和t+1时间点的活细胞密度。

如本文中所用，例如，术语“滴度”是指在给定量的培养基体积中，由细胞培养物产生的重组表达的蛋白质的总量。滴度通常以每升培养基中蛋白质的克数为单位来表示。

在一些实施方案中，与对照培养物相比，细胞生长增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，与对照培养物相比，细胞生长增加了至少10％。在一些实施方案中，与对照培养物相比，细胞生长增加了至少20％。

在一些实施方案中，生产率由滴度和/或体积生产率决定。

如本文中所用，例如术语“滴度”是指在给定量的培养基体积中，由细胞培养物产生的重组表达的蛋白质的总量。滴度通常以每升培养基中蛋白质的克数为单位来表示。

在一些实施方案中，生产率由滴度决定。在一些实施方案中，与对照培养物相比，生产率提高了至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，与对照培养物相比，生产率增加了至少10％。在一些实施方案中，与对照培养物相比，生产率增加了至少20％。

在一些实施方案中，细胞培养物的最大细胞密度大于1x10⁶个细胞/mL,5x10⁶个细胞/mL,1x10⁷个细胞/mL,5x10⁷个细胞/mL,1x10⁸个细胞/mL或5x10⁸个细胞/mL。在一些实施方案中，细胞培养物的最大细胞密度大于5x10⁶个细胞/mL。在一些实施方案中，细胞培养物的最大细胞密度大于1x10⁸个细胞/mL。

V.纯化

在一些实施方案中，用于产生源自大肠杆菌的多肽或其片段的方法包括分离并且/或者纯化源自大肠杆菌的多肽或其片段。在一些实施方案中，源自大肠杆菌的表达多肽或其片段被分泌到培养基中，因此可以通过离心和/或过滤除去细胞和其它固体。

可从宿主细胞中收获根据本文所述方法产生的源自大肠杆菌的多肽或其片段，并使用任何合适的方法进行纯化。用于纯化多肽或其片段的合适方法包括沉淀和各种类型的色谱(诸如疏水相互作用、离子交换、亲和、螯合和大小排阻)，所有这些都是本领域已知的。合适的纯化方案可以包括两种或更多种这些或其它合适的方法。在一些实施方案中，一种或多种源自大肠杆菌的多肽或其片段可以包含促进纯化的“标签”，诸如表位标签或HIS标签、Strep标签。可以通过螯合色谱或亲和色谱，例如从条件培养基中方便地纯化出此类标记的多肽。任选地，可以在纯化后切割标签序列。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段可包括用于亲和纯化的标签。亲和纯化标签是本领域已知的。实例包括例如His标签(结合金属离子)、抗体、麦芽糖结合蛋白(MBP)(结合直链淀粉)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(结合谷胱甘肽)、FLAG标签、Strep标签(结合链霉抗生物素蛋白或其衍生物)。

在优选实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段不包含纯化标签。

在一些实施方案中，源自大肠杆菌的多肽或其片段的产量为至少约1mg/L,至少约2mg/L,至少约3mg/L,至少约4mg/L,至少约5mg/L,至少约6mg/L,至少约7mg/L,至少约8mg/L,至少约9mg/L,至少约10mg/L,至少约11mg/L,至少约12mg/L,至少约13mg/L,至少约14mg/L,至少约15mg/L,至少约16mg/L,至少约17mg/L,至少约18mg/L,至少约19mg/L,至少约20mg/L,至少约25mg/L,至少约30mg/L,至少约35mg/L,至少约40mg/L,至少约45mg/L,至少约50mg/L,至少约55mg/L,至少约60mg/L,至少约65mg/L,至少约70mg/L,至少约75mg/L,至少约80mg/L,至少约85mg/L,至少约90mg/L,至少约95mg/L或,至少约100mg/L。

在一些实施方案中，培养物规模为至少约10升，例如，体积为至少约10L,至少约20L,至少约30L,至少约40L,至少约50L,至少约60L,至少约70L,至少约80L,至少约90L,至少约100L,至少约150L,至少约200L,至少约250L,至少约300L,至少约400L,至少约500L,至少约600L,至少约700L,至少约800L,至少约900L,至少约1000L,至少约2000L,至少约3000L,至少约4000L,至少约5000L,至少约6000L,至少约10,000L,至少约15,000L,至少约20,000L,至少约25,000L,至少约30,000L,至少约35,000L,至少约40,000L,至少约45,000L,至少约50,000L,至少约55,000L,至少约60,000L,至少约65,000L,至少约70,000L,至少约75,000L,至少约80,000L,至少约85,000L,至少约90,000L,至少约95,000L,至少约100,000L等。

VI.组合物和制剂

一方面，本发明包括含有源自大肠杆菌的多肽或其片段的组合物。在一些实施方案中，所述组合物引发免疫反应，包括抗体，所述免疫反应可赋予对大肠杆菌致病物种的免疫。

在一些实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段作为唯一抗原。在一些实施方案中，所述组合物不包含缀合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段以及附加的抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段以及附加的大肠杆菌抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段以及来自大肠杆菌的糖缀合物。

在一些实施方案中，所述多肽或其片段源自大肠杆菌FimH。

在一些实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌FimC的多肽或其片段。

在一些实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；和源自大肠杆菌FimC的多肽或其片段。

一方面，本发明包括组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；和包含选自以下的任一种的结构的糖：式O1(例如式O1A,式O1B和式O1C),式O2,式O3,式O4(例如式O4:K52和式O4:K6),式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3)株),式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54),式O7,式O8,式O9,式O10,式O11,式O12,式O13,式O14,式O15,式O16,式O17,式O18(例如式O18A,式O18ac,式O18A1,式O18B和式O18B1),式O19,式O20,式O21,式O22,式O23(例如式O23A),式O24,式O25(例如式O25a和式O25b),式O26,式O27,式O28,式O29,式O30,式O32,式O33,式O34,式O35,式O36,式O37,式O38,式O39,式O40,式O41,式O42,式O43,式O44,式O45(例如式O45和式O45rel),式O46,式O48,式O49,式O50,式O51,式O52,式O53,式O54,式O55,式O56,式O57,式O58,式O59,式O60,式O61,式O62,式62D1,式O63,式O64,式O65,式O66,式O68,式O69,式O70,式O71,式O73(例如式O73(73-1株)),式O74,式O75,式O76,式O77,式O78,式O79,式O80,式O81,式O82,式O83,式O84,式O85,式O86,式O87,式O88,式O89,式O90,式O91,式O92,式O93,式O95,式O96,式O97,式O98,式O99,式O100,式O101,式O102,式O103,式O104,式O105,式O106,式O107,式O108,式O109,式O110,式0111,式O112,式O113,式O114,式O115,式O116,式O117,式O118,式O119,式O120,式O121,式O123,式O124,式O125,式O126,式O127,式O128,式O129,式O130,式O131,式O132,式O133,式O134,式O135,式O136,式O137,式O138,式O139,式O140,式O141,式O142,式O143,式O144,式O145,式O146,式O147,式O148,式O149,式O150,式O151,式O152,式O153,式O154,式O155,式O156,式O157,式O158,式O159,式O160,式O161,式O162,式O163,式O164,式O165,式O166,式O167,式O168,式O169,式O170,式O171,式O172,式O173,式O174,式O175,式O176,式O177,式O178,式O179,式O180,式O181,式O182,式O183,式O184,式O185,式O186和式O187，其中n为1至100的整数。

在一些实施方案中，所述组合物包含本文公开的任一种糖。在优选实施方案中，所述组合物包含本文公开的任一种缀合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O25，优选血清型O25b的糖缀合物。在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O1，优选血清型O1a的糖缀合物。在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O2的糖缀合物。在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O6的糖缀合物。

在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种选自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6中的任一种的糖缀合物，优选为O25b、O1a、O2和O6。在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种选自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6中的任一种的糖缀合物，优选为O25b、O1a、O2和O6。在一个实施方案中，所述组合物包含至少三种选自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6中的任一种的糖缀合物，优选为O25b、O1a、O2和O6。在一个实施方案中，所述组合物包含来自以下大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6中的每一种的糖缀合物，优选为O25b、O1a、O2和O6。

在优选实施方案中，任何上述组合物的糖缀合物单独与CRM₁₉₇缀合。

因此，在一些实施方案中，所述组合物包括源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自至少一种大肠杆菌血清型的O-抗原。在优选实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自不止一种大肠杆菌血清型的O-抗原。例如，所述组合物可以包含来自两种不同大肠杆菌血清型(或“v”，效价)至12种不同血清型(12v)的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自3种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自4种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自6种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自7种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自8种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自9种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自10种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自11种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自12种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自13种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自14种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自15种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自16种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自17种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自18种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自19种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自20种不同血清型的O-抗原。

优选地，大肠杆菌糖的数量可以在1种血清型(或“v”，效价)至26种不同血清型(26v)的范围内。在一个实施方案中，有一种血清型。在一个实施方案中，有2种不同的血清型。在一个实施方案中，有3种不同的血清型。在一个实施方案中，有4种不同的血清型。在一个实施方案中，有5种不同的血清型。在一个实施方案中，有6种不同的血清型。在一个实施方案中，有7种不同的血清型。在一个实施方案中，有8种不同的血清型。在一个实施方案中，有9种不同的血清型。在一个实施方案中，有10种不同的血清型。在一个实施方案中，有11种不同的血清型。在一个实施方案中，有12种不同的血清型。在一个实施方案中，有13种不同的血清型。在一个实施方案中，有14种不同的血清型。在一个实施方案中，有15种不同的血清型。在一个实施方案中，有16种不同的血清型。在一个实施方案中，有17种不同的血清型。在一个实施方案中，有18种不同的血清型。在一个实施方案中，有19种不同的血清型。在一个实施方案中，有20种不同的血清型。在一个实施方案中，有21种不同的血清型。在一个实施方案中，有22种不同的血清型。在一个实施方案中，有23种不同的血清型。在一个实施方案中，有24种不同的血清型。在一个实施方案中，有25种不同的血清型。在一个实施方案中，有26种不同的血清型。糖与载体蛋白偶联形成本文所述的糖缀合物。

一方面，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包含来自至少一种大肠杆菌血清群的O-抗原的糖缀合物，其中O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自不止一种大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自2种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自3种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自4种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自5种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自6种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自7种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自8种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自9种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，所述组合物包含来自源自大肠杆菌多肽或其片段的O-抗原；和10种不同的大肠杆菌血清型，其中每种O-抗原与一种运载体蛋白结合。在一个实施方案中，所述组合物包含来自源自大肠杆菌多肽或其片段的O-抗原；和11种不同的大肠杆菌血清型，其中每种O-抗原与一种运载体蛋白结合。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自12种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自13种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自14种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自15种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自16种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自17种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自18种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自19种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自20种不同血清型的O-抗原，其中每种O-抗原与运载体蛋白缀合。

另一方面，所述组合物包含来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个优选实施方案中，组合物包含来自不止一种大肠杆菌血清型的O-多糖。例如，所述组合物可以包含来自两种不同大肠杆菌血清型至12种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自12种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自13种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自14种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自15种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自16种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自17种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自18种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自19种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自20种不同血清型的O-多糖。

在优选实施方案中，组合物包含来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中O-多糖与运载体蛋白缀合。在优选实施方案中，组合物包含来自不止一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。例如，组合物可包含来自两种不同大肠杆菌血清型至12种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合。

在最优选实施方案中，组合物包含来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包含O-抗原和核心糖。在优选实施方案中，组合物包含来自不止一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。例如，所述组合物可以包括来自两种不同大肠杆菌血清型至12种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自12种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自13种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自14种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自15种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自16种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自17种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自18种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自19种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，组合物包含来自20种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与运载体蛋白缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在优选实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇。

在另一个优选实施方案中，组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O25a和核心糖，其中n至少为40。在优选实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O25b和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O1a和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O2和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O6和核心糖，其中n至少为40。

在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O17和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O15和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O18A和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O75和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O4和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O16和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O13和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，所述组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O7和核心糖，其中n至少为40。

在另一个实施方案中，所述组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O8和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，O-多糖包括式O8，其中n为1-20，优选为2-5，更优选为3。例如，式O8如图10B所示。在另一个实施方案中，所述组合物还包含与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O9和核心糖，其中n至少为40。在另一个实施方案中，O-多糖包括式O9，其中n为1-20，优选为4-8，更优选为5。例如，式O9如图10B所示。在另一个实施方案中，O-多糖包括式O9a，其中n为1-20，优选为4-8，更优选为5。例如，式O9a如图10B所示。

在一些实施方案中，O-多糖包括选自式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101中的任一种的O-多糖，其中n为1-20，优选为4-8，更优选为5。参见，例如，图10B。

如上所述，所述组合物可以包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和缀合的O-多糖(抗原)的任意组合。在一个示例性实施方案中，所述组合物包含包括式O25b的多糖、包含式O1A的多糖、包含式O2的多糖和包括式O6的多糖。更具体地，诸如包含以下物质的组合物：(i)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O25b和核心糖，其中n至少为40；(ii)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O1a和核心糖，其中n至少为40；(iii)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O2和核心糖，其中n至少为40；和(iv)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O6和核心糖，其中n至少为40。

在一个实施方案中，所述组合物包括源自大肠杆菌的多肽或其片段；和至少一种源自任何大肠杆菌血清型的O-多糖，其中血清型不是O25a。例如，在一个实施方案中，所述组合物不包含包括式O25a的糖。这种组合物可包含例如包括式O25b的O-多糖、包括式O1A的O-多糖、包括式O2的O-多糖和包括式O6的O-多糖。

在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自2种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自12种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自13种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自14种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自15种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自16种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自17种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自18种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自19种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和来自20种不同血清型的O-多糖，其中每种O-多糖与CRM₁₉₇缀合，并且其中O-多糖包括O-抗原和核心糖。

一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包含与运载体蛋白共价结合的糖的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n为15±2。一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包含与运载体蛋白共价结合的糖的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n为17±2。一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n为55±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包括含自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n为51±2。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在另一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌K12核心糖部分。在另一个实施方案中，所述糖还包括KDO部分。优选地，运载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，优选在DMSO缓冲液中通过还原胺化化学制备所述缀合物。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合。优选地，所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体内引发IgG抗体，所述抗体能够以如通过ELISA测定法所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O25B多糖。因此，可以将免疫前和免疫后血清与本发明的免疫原性组合物的OPA活性进行对比，并对比它们对血清型O25B的反应，以评估应答者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体中引发IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O25B，如通过体外调理吞噬测定法所测定的。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬测定法所测定的，免疫原性组合物在人体中引发功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O25B。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加了针对大肠杆菌血清型O25B的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，免疫原性组合物在至少50％的受试者中引发至少1:8的针对大肠杆菌血清型O25B的效价。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中引发针对大肠杆菌血清型O25B的至少1:8的效价。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了针对大肠杆菌血清型O25B的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了人受试者的针对大肠杆菌血清型O25B的OPA效价。

一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O1a，其中n为39±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O1a，其中n为13±2。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖还包括KDO部分。优选地，运载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，优选在DMSO缓冲液中通过还原胺化化学制备所述缀合物。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合。优选地，所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体中引发IgG抗体，所述抗体能够以如通过ELISA测定法所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O1A多糖。可将免疫前和免疫后血清与本发明的免疫原性组合物的OPA活性进行对比，并对比它们对血清型O1A的反应，以评估应答者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体中引发IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O1A，如通过体外调理吞噬测定法所测定的。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬测定法所测定的，免疫原性组合物在人体中引发功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O1A。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加了针对大肠杆菌血清型O1A的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，免疫原性组合物在至少50％的受试者中引发至少1:8的针对大肠杆菌血清型O1A的效价。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中引发针对大肠杆菌血清型O1A的至少1:8的效价。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了针对大肠杆菌血清型O1A的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了人受试者的针对大肠杆菌血清型O1A的OPA效价。

一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O2，其中n为43±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O2，其中n为47±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O2，其中n为17±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O2，其中n为18±2。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在另一个实施方案中，糖还包括大肠杆菌R4核心糖部分。在另一个实施方案中，所述糖还包括KDO部分。优选地，运载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，优选在DMSO缓冲液中通过还原胺化化学制备所述缀合物。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合。优选地，所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体中引发IgG抗体，所述抗体能够以如通过ELISA测定法所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O2多糖。因此，可将免疫前和免疫后血清与本发明的免疫原性组合物的OPA活性进行对比，并对比它们对血清型O2的反应，以评估应答者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体中引发IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O2，如通过体外调理吞噬测定法所测定的。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬测定法所测定的，免疫原性组合物在人体中引发功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O2。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加了针对大肠杆菌血清型O2的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，免疫原性组合物在至少50％的受试者中引发至少1:8的针对大肠杆菌血清型O2的效价。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中引发针对大肠杆菌血清型O2的至少1:8的效价。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了针对大肠杆菌血清型O2的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了人受试者的针对大肠杆菌血清型O2的OPA效价。

一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O6，其中n为42±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；和包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O6，其中n为50±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O6，其中n为17±2。另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含包括共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O6，其中n为18±2。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖还包括KDO部分。优选地，运载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，优选在DMSO缓冲液中通过还原胺化化学制备所述缀合物。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合。优选地，所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体中引发IgG抗体，所述抗体能够以如通过ELISA测定法所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml的浓度结合大肠杆菌血清型O6多糖。因此，可将免疫前和免疫后血清与本发明的免疫原性组合物的OPA活性进行对比，并对比它们对血清型O6的反应，以评估应答者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人体中引发IgG抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O6，如通过体外调理吞噬测定法所确定的。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬测定法所确定的，免疫原性组合物在人体中引发功能性抗体，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O6。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物增加了针对大肠杆菌血清型O6的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，免疫原性组合物在至少50％的受试者中引发至少1:8的针对大肠杆菌血清型O6的效价。在一个实施方案中，如通过体外调理吞噬杀伤测定所确定的，本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中引发针对大肠杆菌血清型O6的至少1:8的效价。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了针对大肠杆菌血清型O6的应答者(即，具有拥有如通过体外OPA所测定的至少1:8的效价的血清的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫前群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加了人受试者的针对大肠杆菌血清型O6的OPA效价。

一方面，所述组合物包含源自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包含与运载体蛋白共价结合的糖的缀合物，其中所述糖包括选自以下的任一种的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3株))、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如式O23A)、式O24、式O25(例如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如式O73(73-1株))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是从1至100的整数。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R2核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R3核心糖部分。在另一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R4核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌K12核心糖部分。在另一个实施方案中，所述糖还包括KDO部分。优选地，运载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，优选在DMSO缓冲液中通过还原胺化化学制备所述缀合物。在一个实施方案中，糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合。优选地，所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂。在一个实施方案中，所述组合物还包含至少1种,2种,3种,4种,5种,6种,7种,8种,9种,10种,11种,12种,13种,14种,15种,16种,17种,18种,19种,20种,21种,22种,23种,24种,25种,26种,27种,28种,29种另外的缀合物至至多30种另外的缀合物，每种缀合物包含与运载体蛋白共价结合的糖，其中所述糖包括选自所述式的任一种的结构。

A.糖类

在一个实施方案中，通过表达(不一定是过表达)不同的Wzz蛋白(例如WzzB)来控制糖的大小，从而产生糖。

如本文中所用，术语“糖”是指单个糖部分或单糖单元，以及共价连接形成二糖、寡糖和多糖的两个或更多个单个糖部分或单糖单元的组合。糖可以是直链或支链。

在一个实施方案中，糖在重组革兰阴性细菌中产生。在一个实施方案中，糖在重组大肠杆菌细胞中产生。在一个实施方案中，糖在重组沙门氏菌属细胞中产生。示例性细菌包括大肠杆菌O25K5H1、大肠杆菌BD559、大肠杆菌GAR2831、大肠杆菌GAR865、大肠杆菌GAR868、大肠杆菌GAR869、大肠杆菌GAR872、大肠杆菌GAR878、大肠杆菌GAR896、大肠杆菌GAR1902、大肠杆菌O25a ETC NR-5、大肠杆菌O157:H7:K-、肠道沙门氏菌血清型鼠伤寒LT2株、大肠杆菌GAR2401、肠道沙门氏菌血清型鼠伤寒CVD 1943、肠道沙门氏菌血清型鼠伤寒CVD 1925、肠道沙门氏菌血清型甲型副伤寒CVD 1902和福氏志贺氏菌CVD 1208S。在一个实施方案中，细菌不是大肠杆菌GAR2401。这种生产糖类的遗传方法允许高效生产O-多糖和O-抗原分子作为疫苗组分。

如本文中所用，术语“wzz蛋白”是指链长决定多肽(chain length determinantpolypeptide)，例如wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzzl和wzz2。示例性wzz基因序列的GenBank登录号为AF011910(对于E4991/76)、AF011911(对于F186)、AF011912(对于M70/1-1)、AF011913(对于79/311)、AF011914(对于Bi7509-41)、AF011915(对于C664-1992)、AF011916(对于C258-94)、AF011917(对于C722-89)和AF011919(对于EDL933)。G7和Bi316-41wzz基因序列的GenBank登录号分别为U39305和U39306。示例性wzz基因序列的其它GenBank登录号为NP_459581(对于肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型LT2FepE株)、AIG66859(对于大肠杆菌O157:H7 EDL933 FepE株)、NP_461024(对于肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型LT2 WzzB株)。Np_416531(对于大肠杆菌K-12亚株MG1655 WzzB)、NP_415119(对于大肠杆菌K-12亚株MG1655 FepE)。在优选实施方案中，wzz家族蛋白是wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2中的任一种，最优选为wzzB，更优选为fepE。

示例性wzzB序列包括SEQ ID No:30-34中所示的序列。示例性FepE序列包括SEQID No:35-39中所示的序列。

在一些实施方案中，可通过在革兰阴性菌中表达(不必过表达)来自革兰阴性菌的wzz家族蛋白(例如fepE)并且/或者通过关闭(即抑制、删除、去除)第二wzz基因(例如wzzB)以产生含有中等长度的O-抗原链或长O-抗原链的高分子量糖(例如脂多糖)来产生经修饰的糖(与相应的野生型糖相比被修饰的)。例如，经修饰的糖可以通过表达(不一定过表达)wzz2并关闭wzz1来产生。或者，在替代方案中，可通过表达(不一定过表达)wzzfepE并关闭wzzB来产生经修饰的糖。在另一个实施方案中，经修饰的糖可以通过表达(不一定过表达)wzzB但关闭wzzfepE来产生。在另一个实施方案中，经修饰的糖可以通过表达fepE来产生。优选地，wzz家族蛋白源自与宿主细胞异源的菌株。

在一些实施方案中，通过表达wzz家族蛋白产生糖，所述wzz家族蛋白具有与以下序列中的任一个具有至少30％,50％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:39。在一个实施方案中，wzz家族蛋白包括选自以下序列中的任一个序列：SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。优选地，wzz家族蛋白与以下序列具有至少30％,50％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％序列同一性：SEQID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，通过表达具有与fepE蛋白质具有至少30％,50％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％,99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质来产生糖。

一方面，本发明涉及通过在革兰阴性细菌中表达wzz家族蛋白(优选为fepE)以产生含有中等长度的O-抗原链或长O-抗原链的高分子量糖而产生的糖，与相应的野生型O-多糖相比，所述糖具有至少1、2、3、4或5个重复单元的增加。一方面，本发明涉及由培养的革兰阴性细菌产生的糖，所述细菌表达(不一定过表达)来自革兰阴性细菌的wzz家族蛋白(例如wzzB)以产生含有中等长度的O-抗原链或长O-抗原链的高分子量糖，与相应的野生型O-抗原相比，所述糖具有至少1、2、3、4或5个重复单元的增加。关于与相应的野生型糖相比，重复单元数增加的其它示例性糖，参见下文对O-多糖和O-抗原的描述。期望的链长是在给定的疫苗构建体背景中产生改善的或最大的免疫原性的链长。

在另一个实施方案中，所述糖包括选自表1的任一个式，其中所述糖中重复单元的数目n比相应野生型O-多糖中重复单元的数目多1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个,50个,51个,52个,53个,54个,55个,56个,57个,58个,59个,60个,61个,62个,63个,64个,65个,66个,67个,68个,69个,70个,71个,72个,73个,74个,75个,76个,77个,78个,79个,80个,81个,82个,83个,84个,85个,86个,87个,88个,89个,90个,91个,92个,93个,94个,95个,96个,97个,98个,99个,100个或更多个重复单元。优选地，与相应的野生型O-多糖相比，所述糖包括至少20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个或50个重复单元的增加。参见，例如表24。测定糖长度的方法是本领域已知的。这些方法包括核磁共振、质谱和尺寸排阻色谱，如实施例13中所述的。

在优选实施方案中，本发明涉及在重组大肠杆菌宿主细胞中产生的糖，其中内源wzz O-抗原长度调节剂(例如wzzB)的基因被删除，并被来自与重组大肠杆菌宿主细胞异源的革兰阴性细菌的(第二个)wzz基因(例如沙门氏菌属fepE)取代，以产生含有中等长度的O-抗原链或长O-抗原链的高分子量糖，诸如脂多糖。在一些实施方案中，重组大肠杆菌宿主细胞包括来自沙门氏菌属，优选来自肠道沙门氏菌的wzz基因。

在一个实施方案中，宿主细胞以稳定维持的质粒载体形式包含wzz家族蛋白的异源基因。在另一个实施方案中，宿主细胞以宿主细胞染色体DNA中的整合基因的形式包含括wzz家族蛋白的异源基因。在大肠杆菌宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法和将异源基因整合到大肠杆菌宿主细胞的染色体中的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，宿主细胞以稳定维持的质粒载体形式包含O-抗原的异源基因。在另一个实施方案中，宿主细胞以宿主细胞染色体DNA中的整合基因的形式包含O-抗原的异源基因。在大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌属宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法是本领域已知的。将异源基因整合到大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌属宿主细胞的染色体中的方法是本领域已知的。

一方面，在包含碳源的培养基中培养重组宿主细胞。用于培养大肠杆菌的碳源是本领域已知的。示例性碳源包括糖醇、多元醇、羟醛糖或酮糖，包括但不限于阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸、琥珀酸和甲胺。在优选实施方案中，培养基包含葡萄糖。在一些实施方案中，培养基包含多元醇或羟醛糖，例如甘露醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨醇、乳糖和阿拉伯糖作为碳源。可在培养开始之前将所有碳源加入到培养基中，或者可以在培养期间逐步或连续加入所有碳源。

用于重组宿主细胞的示例性培养基包括选自KH₂PO₄,K₂HPO₄,(NH₄)₂SO₄,柠檬酸钠,Na₂SO₄,天冬氨酸,葡萄糖,MgSO₄,FeSO₄-7H₂O,Na₂MoO₄-2H₂O,H₃BO₃,CoCl₂-6H₂O,CuCl₂-2H₂O,MnCl₂-4H₂O,ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O中的任一种的成分。优选地，培养基包含KH₂PO₄,K₂HPO₄,(NH₄)₂SO₄,柠檬酸钠,Na₂SO₄,天冬氨酸,葡萄糖,MgSO₄,FeSO₄-7H₂O,Na₂MoO₄-2H₂O,H₃BO₃,CoCl₂-6H₂O,CuCl₂-2H₂O,MnCl₂-4H₂O,ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

本文使用的培养基可以是固体或液体、合成的(即人造的)或天然的，并且可以包含用于培养重组宿主细胞的足够的营养物。优选地，培养基是液体培养基。

在一些实施方案中，培养基还可包含合适的无机盐。在一些实施方案中，培养基还可包含微量营养物。在一些实施方案中，培养基还可包含生长因子。在一些实施方案中，培养基还可包含附加的碳源。在一些实施方案中，培养基还可包含合适的无机盐、微量营养物、生长因子和补充碳源。适用于培养大肠杆菌的无机盐、微量营养物、生长因子和补充碳源是本领域已知的。

在一些实施方案中，培养基可以视情况而定包含附加的组分，诸如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解物、附加的酵母提取物、麦芽提取物、补充碳源和各种维生素。在一些实施方案中，培养基不包含此类附加的组分，诸如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解物、附加的酵母提取物、麦芽提取物、补充碳源和各种维生素。

合适的补充碳源的说明性实例包括但不限于其它碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉或淀粉水解产物、纤维素水解产物和糖蜜；有机酸，诸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸和富马酸；和醇类，诸如甘油、肌醇、甘露醇和山梨醇。

在一些实施方案中，培养基还包含氮源。适用于培养大肠杆菌的氮源是本领域已知的。合适的氮源的说明性实例包括但不限于氨，包括氨气和氨水；无机酸或有机酸的铵盐，诸如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵；尿素；硝酸盐或亚硝酸盐以及其它含氮物质，包括纯的或粗制的氨基酸制剂、肉提取物、蛋白胨、鱼粉、鱼水解产物、玉米浆、酪蛋白水解产物、豆饼水解产物、酵母提取物、干酵母、乙醇-酵母馏出物、大豆粉、棉籽粉等。

在一些实施方案中，培养基包含无机盐。合适的无机盐的说明性实例包括但不限于钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、锰盐、铁盐、钴盐、锌盐、铜盐、钼盐、钨盐以及其它微量元素和磷酸的盐。

在一些实施方案中，培养基包括适当的生长因子。合适的微量营养物、生长因子等的说明性实例包括但不限于以纯的或部分纯化的化合物形式存在的或存在于天然材料中的辅酶A、泛酸、盐酸吡哆醇、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、叶酸、维生素B₁₂、其它维生素、氨基酸诸如半胱氨酸和羟脯氨酸、碱诸如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶、硫代硫酸钠、对-或r-氨基苯甲酸、烟酰胺、次氮基乙酸酯等。所述量可由本领域技术人员根据本领域已知的方法和技术凭经验确定

在另一个实施方案中，本文所述的经修饰的糖(与相应的野生型糖相比)是例如在体外合成产生的。糖类的合成生产或合成可以有助于避免成本和时间密集的生产过程。在一个实施方案中，糖是例如通过使用顺序糖基化策略或顺序糖基化和[3+2]阻断合成策略的组合，从适当保护的单糖中间体合成地合成的。例如，硫代糖苷和糖基三氯乙酰亚胺酯衍生物可以用作糖基化中的糖基供体。在一个实施方案中，体外合成地合成的糖与通过重组手段，诸如通过上述wzz家族蛋白的操作产生的糖具有相同的结构。

产生的糖(通过重组或合成手段)包括源自包括例如以下大肠杆菌血清型中的任一种在内的任何大肠杆菌血清型的结构：O1(例如O1A、O1B和O1C)、O2、O3、O4(例如O4:K52和O4:K6)、O5(例如O5ab和O5ac(180/C3株))、O6(例如O6:K2；K13；K15和O6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18(例如O18A、O18ac、O18A1、O18B和O18B1)、O19、O20、O21、O22、O23(例如O23A)、O24、O25(例如O25a和O25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45(例如O45和O45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D1、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73(例如O73(73-1株))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186和O187。

通常通过本领域已知的方法纯化(就多糖-蛋白质缀合物的量而言是富集的)单独的多糖，所述方法为例如透析、浓缩操作、渗滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深度过滤和/或柱色谱(离子交换色谱、多峰离子交换色谱、DEAE和疏水相互作用色谱)。优选地，多糖通过包括切向流过滤的方法纯化。

如本文进一步所述，可以活化(例如化学活化)纯化的多糖以使它们能够反应(例如直接与运载体蛋白反应或通过接头诸如eTEC间隔子反应),然后掺入本发明的糖缀合物中，如本文进一步所述。

在一个优选实施方案中，本发明的糖源自大肠杆菌血清型，其中所述血清型是O25a。在另一个优选实施方案中，血清型是O25b。在另一个优选实施方案中，血清型是O1A。在另一个优选实施方案中，血清型是O2。在另一个优选实施方案中，血清型是O6。在另一个优选实施方案中，血清型是O17。在另一个优选实施方案中，血清型是O15。在另一个优选实施方案中，血清型是O18A。在另一个优选实施方案中，血清型是O75。在另一个优选实施方案中，血清型是O4。在另一个优选实施方案中，血清型是O16。在另一个优选实施方案中，血清型是O13。在另一个优选实施方案中，血清型是O7。在另一个优选实施方案中，血清型是O8。在另一个优选实施方案中，血清型是O9。

如本文中所用，上面列出的任何血清型是指涵盖本领域已知的重复单元结构(O-单位，如下所述)，并且是相应血清型所独有的的血清型。例如，术语“O25a”血清型(在本领域中也称为血清型“O25”)是指涵盖表1所示的式O25的血清型。作为另一个实例，术语“O25b”血清型是指涵盖表1所示的式O25b的血清型。

如本文中所用，除非另有说明，否则血清型在本文中是泛指的，使得例如术语式“O18”泛指涵盖式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B和式O18B1。

如本文中所用，术语“O1”泛指涵盖在根据表1的式名称中包括通称“O1”的式的种类，诸如式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C中的任一种，其每一种都示于表1中。因此，“O1血清型”泛指涵盖式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C中的任一种的血清型。

如本文中所用，术语“O6”泛指在根据表1的式名称中包括通称“O6”的式的种类，诸如式O6:K2、K13、K15和O6:K54中的任一种，其每一种都示于表1中。因此,“O6血清型”泛指涵盖式O6:K2、K13、K15和O6:K54中的任一种的血清型。

泛指在根据表1的式名称中包括通称的式的种类的术语的其它实例包括：“O4”、“O5”、“O18”和“O45”。

如本文中所用，术语“O2”是指表1中所示的式O2。术语“O2 O-抗原”是指涵盖表1所示的式O2的糖。

如本文中所用，来自上文所列血清型的O-抗原是指涵盖用相应血清型名称标记的式的糖。例如，术语“O25B O-抗原”是指涵盖表1中所示的式O25B的糖。

作为另一个实例，术语“O1 O-抗原”泛指涵盖包括术语“O1”在内的式(诸如式O1A，式O1A1，式O1B和式O1C，其每一种都示于表1中)的糖。

作为另一个实例，术语“O6 O-抗原”泛指涵盖包括术语“O6”在内的式(诸如式O6:K2；式O6:K13；式O6:K15和式O6:K54在内的式，其每一种示于表1中)的糖。

B.O-多糖

如本文中所用，术语“O-多糖”是指包括O-抗原的任何结构，只要所述结构不包括完整细胞或脂质A。例如，在一个实施方案中，O-多糖包括脂多糖，其中脂质A未被结合。去除脂质A的步骤是本领域已知的，例如包括添加酸的热处理。示例性方法包括在100℃用1％的乙酸处理90分钟。该过程与分离去除的脂质A的过程相组合。分离脂质A的示例性方法包括超速离心。

在一个实施方案中，O-多糖指由O-抗原组成的结构，在这种情况下，O-多糖与术语O-抗原同义。在一个优选实施方案中，O-多糖是指包含O-抗原的重复单元，没有核心糖的结构。因此，在一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌K12核心部分。在另一个优选的实施方案中，O-多糖是指包括O-抗原和核心糖的结构。在另一个实施方案中，O-多糖是指包括O-抗原、核心糖和KDO部分的结构。

从LPS中纯化包括核心寡糖的O-多糖的方法是本领域已知的。例如，在纯化LPS后，可以通过在1％(v/v)乙酸中在100摄氏度下加热90分钟来水解纯化的LPS，然后在4摄氏度下以142,000x g超速离心5小时。将含有O-多糖的上清液冷冻干燥并于4摄氏度储存。在某些实施方案中，描述了荚膜合成基因的缺失实现O-多糖的简单纯化。

O-多糖可以通过包括但不限于温和酸水解以从LPS中除去脂质A的方法来分离。其它实施方案可以包括使用肼作为用于O-多糖制备的剂。LPS的制备可以通过本领域已知的方法来实现。

在某些实施方案中，提供了从表达(不一定过表达)Wzz蛋白(例如wzzB)的野生型、改良的或减毒的革兰阴性细菌菌株中纯化的O-多糖用于结合疫苗。在优选实施方案中，从表达(不一定过表达)wzz蛋白的革兰阴性细菌菌株中纯化出O-多糖链，以用作疫苗抗原(作为结合疫苗或复合疫苗)。

在一个实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，所述O-多糖的分子量增加了约1倍,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,16倍,17倍,18倍,19倍,20倍,21倍,22倍,23倍,24倍,25倍,26倍,27倍,28倍,29倍,30倍,31倍,32倍,33倍,34倍,35倍,36倍,37倍,38倍,39倍,40倍,41倍,42倍,43倍,44倍,45倍,46倍,47倍,48倍,49倍,50倍,51倍,52倍,53倍,54倍,55倍,56倍,57倍,58倍,59倍,60倍,61倍,62倍,63倍,64倍,65倍,66倍,67倍,68倍,69倍,70倍,71倍,72倍,73倍,74倍,75倍,76倍,77倍,78倍,79倍,80倍,81倍,82倍,83倍,84倍,85倍,86倍,87倍,88倍,89倍,90倍,91倍,92倍,93倍,94倍,95倍,96倍,97倍,98倍,99倍,100倍或更多倍。在优选实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，所述O-多糖的分子量增加了至少1倍和至多5倍。在另一个实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，所述O-多糖的分子量增加了至少2倍和至多4倍。与相应的野生型O-多糖相比，所述O-多糖分子量的增加优选与O-抗原重复单元数量的增加相关联。在一个实施方案中，所述O-多糖分子量的增加归因于wzz家族蛋白。

在一个实施方案中，与相应的野生型O-多肽相比，所述O-多糖的分子量增加了约1kDa,2kDa,3kDa,4kDa,5kDa,6kDa,7kDa,8kDa,9kDa,10kDa,11kDa,12kDa,13kDa,14kDa,15kDa,16kDa,17kDa,18kDa,19kDa,20kDa,21kDa,22kDa,23kDa,24kDa,25kDa,26kDa,27kDa,28kDa,29kDa,30kDa,31kDa,32kDa,33kDa,34kDa,35kDa,36kDa,37kDa,38kDa,39kDa,40kDa,41kDa,42kDa,43kDa,44kDa,45kDa,46kDa,47kDa,48kDa,49kDa,50kDa,51kDa,52kDa,53kDa,54kDa,55kDa,56kDa,57kDa,58kDa,59kDa,60kDa,61kDa,62kDa,63kDa,64kDa,65kDa,66kDa,67kDa,68kDa,69kDa,70kDa,71kDa,72kDa,73kDa,74kDa,75kDa,76kDa,77kDa,78kDa,79kDa,80kDa,81kDa,82kDa,83kDa,84kDa,85kDa,86kDa,87kDa,88kDa,89kDa,90kDa,91kDa,92kDa,93kDa,94kDa,95kDa,96kDa,97kDa,98kDa,99kDa,100kDa或更多。在一个实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，本发明的O-多糖的分子量增加了至少1kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少5kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少12kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少15kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少18kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少21kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少22kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少30kDa和至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少1kDa和至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少5kDa和至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10kDa和至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少12kDa和至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少15kDa和至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20kDa和至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少1kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少5kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少12kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少15kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少18kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少30kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kDa和至多90kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少12kDa和至多85kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10kDa和至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kDa和至多70kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kDa和至多60kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kDa和至多50kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kda和至多49kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kda和至多48kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kda和至多47kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少10kda和至多46kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20kda和至多45kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20kda和至多44kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20kda和至多43kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20kda和至多42kDa。在一个实施方案中，分子量增加了至少20kda和至多41kDa。与相应的野生型O-多糖相比，O-多糖分子量的这种增加优选与O-抗原重复单元数量的增加相关联。在一个实施方案中，O-多糖分子量的增加归因于wzz家族蛋白。参见，例如，表21。

在另一个实施方案中，所述O-多糖包括选自表1的任一个式，其中所述O-多糖中重复单元的数目n比相应的野生型O-多糖中重复单元的数目多1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个,50个,51个,52个,53个,54个,55个,56个,57个,58个,59个,60个,61个,62个,63个,64个,65个,66个,67个,68个,69个,70个,71个,72个,73个,74个,75个,76个,77个,78个,79个,80个,81个,82个,83个,84个,85个,86个,87个,88个,89个,90个,91个,92个,93个,94个,95个,96个,97个,98个,99个,100个或更多个重复单元。优选地，与相应的野生型O-多糖相比，所述糖包括至少20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个或50个重复单元的增加。参见，例如，表21。

C.O-抗原

O-抗原是革兰阴性菌外膜中脂多糖(LPS)的一部分。O-抗原位于细胞表面上，并且是可变的细胞成分。O-抗原的可变性为革兰阴性菌的血清分型提供了基础。目前的大肠杆菌血清分型方案包括O-多糖1至181。

O-抗原包括寡糖重复单元(O-单元)，其野生型结构通常含有2-8个来自多种糖的残基。示例性大肠杆菌O-抗原的O-单元示于表1中，也参见图9A-图9C和图10A-图10B。

在一个实施方案中，本发明的糖可以是一个寡糖单元。在一个实施方案中，本发明的糖是相关血清型的一个重复寡糖单元。在此类实施方案中，所述糖可以包括选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101中的任一种的结构。

在一个实施方案中，本发明的糖可以是寡糖。寡糖具有少量的重复单元(通常为5-15个重复单元),并且通常通过合成或水解多糖来获得。在此类实施方案中，所述糖可以包括选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101中的任一种的结构。

优选地，本发明和本发明的免疫原性组合物中的所有糖都是多糖。由于抗原表面存在表位，所以高分子量多糖可诱导某些抗体免疫反应。高分子量多糖的分离和纯化优先考虑用于本发明的缀合物、组合物和方法。

在一些实施方案中，每个单独的O-抗原聚合物中重复O单元的数量(以及因此聚合物链的长度和分子量)取决于wzz链长调节剂(一种内膜蛋白质)。不同的wzz蛋白赋予不同范围的模态长度(4个至>100个重复单元)。术语“模态长度”是指重复O-单元的数量。革兰阴性细菌通常有两种不同的Wzz蛋白，其赋予两种不同的OAg模态链长度，一种较长，一种较短。wzz家族蛋白(例如wzzB)在革兰阴性细菌中的表达(不一定是过表达)可以允许操纵O-抗原的长度，以改变或偏向某些长度范围的O-抗原的细菌生产，并增强高产量大分子量脂多糖的生产。在一个实施方案中，如本文所用的“短”模态长度是指低重复O-单元数，例如1-20。在一个实施方案中，如本文所用的“长”模态长度是指超过20个且最多为40个的重复O-单元的数量。在一个实施方案中，如本文所用的“很长的”模态长度是指超过40个重复O-单元。

在一个实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，所产生的糖增加了至少10个重复单元、15个重复单元、20个重复单元、25个重复单元、30个重复单元、35个重复单元、40个重复单元、45个重复单元、50个重复单元、55个重复单元、60个重复单元、65个重复单元、70个重复单元、75个重复单元、80个重复单元、85个重复单元、90个重复单元、95个重复单元或100个重复单元。

在另一个实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，本发明的糖增加了1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个,50个,51个,52个,53个,54个,55个,56个,57个,58个,59个,60个,61个,62个,63个,64个,65个,66个,67个,68个,69个,70个,71个,72个,73个,74个,75个,76个,77个,78个,79个,80个,81个,82个,83个,84个,85个,86个,87个,88个,89个,90个,91个,92个,93个,94个,95个,96个,97个,98个,99个,100个或更多个重复单元。优选地，与相应的野生型O-多糖相比，所述糖包括至少20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个或50个重复单元的增加。参见，例如，表21。测定糖长度的方法是本领域已知的。这些方法包括核磁共振、质谱和尺寸排阻色谱，如实施例13中所述的。

确定糖中重复单元数量的方法也是本领域已知的。例如，重复单元的数目(或式中的“n”)可以通过将多糖的分子量(不包括核心糖或KDO残基的分子量)除以重复单元的分子量(即，相应式中结构(例如表1中所示的)的分子量，其可以理论上计算为式中每种单糖的分子量之和)来计算。式中每种单糖的分子量是本领域已知的。例如，式O25b的重复单元的分子量约为862Da。例如，式O1a的重复单元的分子量约为845Da。例如，式O2的重复单元的分子量约为829Da。例如，式O6的重复单元的分子量约为893Da。当确定缀合物中重复单元的数量时，运载体蛋白的分子量和蛋白:多糖的比例是计算的考虑因素。如本文中所定义的，“n”是指多糖分子中重复单元的数量(表1中的括号中所示的)。如本领域已知的，在生物大分子中，重复结构可以可以散布有不完美重复的区域，例如丢失的分支。另外，本领域已知从天然来源诸如细菌中分离和纯化的多糖在大小和分支上可能是异质的。在这种情况下，n可以代表群体中分子的n的平均值或中值。

在一个实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，所述O-多糖增加了至少一个O-抗原重复单位。O-抗原的重复单元示于表1中。在一个实施方案中，所述O-多糖包含1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个,50个,51个,52个,53个,54个,55个,56个,57个,58个,59个,60个,61个,62个,63个,64个,65个,66个,67个,68个,69个,70个,71个,72个,73个,74个,75个,76个,77个,78个,79个,80个,81个,82个,83个,84个,85个,86个,87个,88个,89个,90个,91个,92个,93个,94个,95个,96个,97个,98个,99个,100个或更多个总重复单元。优选地，所述糖具有总共至少3个至至多80个重复单元。在另一个实施方案中，与相应的野生型O-多糖相比，所述O-多糖增加了1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个,40个,41个,42个,43个,44个,45个,46个,47个,48个,49个,50个,51个,52个,53个,54个,55个,56个,57个,58个,59个,60个,61个,62个,63个,64个,65个,66个,67个,68个,69个,70个,71个,72个,73个,74个,75个,76个,77个,78个,79个,80个,81个,82个,83个,84个,85个,86个,87个,88个,89个,90个,91个,92个,93个,94个,95个,96个,97个,98个,99个,100个或更多个重复单元。

在一个实施方案中，所述糖包括O-抗原，其中O-抗原式(例如表1中所示的式(另参见图9A-图图9C和图10A-图10B))中的任一个中的n是至少为1,2,3,4,5,10,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40并且至多为200,100,99,98,97,96,95,94,93,92,91,90,89,88,87,86,81,80,79,78,77,76,75,74,73,72,71,70,69,68,67,66,65,60,59,58,57,56,55,54,53,52,51或50的整数。任何最小值和任何最大值可以组合起来定义一个范围。示例性范围包括，例如，至少1至至多1000；至少10至至多500；和至少20至最多80，优选至多90。在一个优选实施方案中，n为至少31至至多90。在一个优选实施方案中，n为40至90，更优选60至85。

在一个实施方案中，所述糖包括O-抗原，其中O-抗原式中的任一个中的n至少为1且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为5且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为10且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为25且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为50且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为75且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为100且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为125且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为150且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为175且至多为200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为1且至多为100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为5且至多为100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为10且至多为100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为25且至多为100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为50且至多为100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为75且至多为100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为1且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为5且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为10且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为20且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为25且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为30且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为40且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为50且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为30且至多为90。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为85。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为70。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为60。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为50。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为49。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为48。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为47。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为35且至多为46。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为36且至多为45。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为37且至多为44。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为38且至多为43。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为39且至多为42。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n至少为39且至多为41。

例如，在一个实施方案中，糖中的n为31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89或90，最优选为40。在另一个实施方案中，n为至少35至至多60。例如，在一个实施方案中，n为35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59和60中的任一个，优选为50。在另一个优选实施方案中，n为至少55至至多75。例如，在一个实施方案中，n为55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68或69，最优选为60。

糖类结构可以通过本领域已知的方法和工具(例如NMR，包括1D、1H和/或13C、2DTOCSY、DQF-COSY、NOESY和/或HMQC)来确定

在一些实施方案中，缀合前纯化的多糖的分子量介于5kDa与400kDa之间。在其它此类实施方案中，糖的分子量介于10kDa与400kDa之间；介于5kDa与400kDa之间；介于5kDa与300kDa之间；介于5kDa与200kDa之间；介于5kDa与150kDa之间；介于10kDa与100kDa之间；介于10kDa与75kDa之间；介于10kDa与60kDa之间；介于10kDa与40kDa之间；介于10kDa与100kDa；介于10kDa与200kDa之间；介于15kDa与150kDa之间；介于12kDa与120kDa之间；介于12kDa与75kDa之间；介于12kDa与50kDa之间；介于12与60kDa之间；介于35kDa与75kDa之间；介于40kDa与60kDa之间；介于35kDa与60kDa之间；介于20kDa与60kDa之间；介于12kDa与20kDa；或介于20kDa与50kDa。在又一实施方案中，多糖的分子量介于7kDa与15kDa之间；8kDa与16kDa之间；9kDa与25kDa之间；10kDa与100之间；10kDa与60kDa之间；10kDa与70kDa之间；10kDa与160kDa之间；15kDa与600kDa之间；20kDa与1000kDa之间；20kDa与600kDa之间；20kDa与400kDa之间；30kDa与1,000KDa之间；30kDa与60kDa之间；30kDa与50kDa之间或5kDa与60kDa之间。任何上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。

如本文中所用，术语多糖或运载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”是指通过尺寸排阻色谱法(SEC)结合多角度激光散射检测器(MALLS)计算的分子量。

在正常的纯化过程中，多糖的大小会稍微减小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经受筛分技术。可以采用机械或化学筛分。化学水解可以使用乙酸进行。机械筛分可使用高压均质剪切来进行。上述分子量范围是指缀合前(例如活化前)纯化的多糖。

表1：大肠杆菌血清群/血清型和O-单元部分

β-D-6dmanHep2Ac是2-O-乙酰基-6-脱氧-β-D-甘露糖-吡喃庚糖基。

β-D-Xulf是β-D-苏-呋喃戊糖基。

D.核心寡糖

在野生型大肠杆菌LPS中，核心寡糖位于脂质A与O-抗原外部区域之间。更具体地说，核心寡糖是野生型大肠杆菌中包括O-抗原与脂质A之间的键的多糖的部分。该键包括最内部的3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO))残基的半缩酮官能团与脂质A的GlcNAc残基的羟基之间的酮苷键。核心寡糖区域在野生型大肠杆菌菌株间显示出高度的相似性。其通常包含有限数量的糖。核心寡糖包括内部核心区和外部核心区。

更具体地说，内核主要由L-甘油-D-甘露-庚糖(庚糖)和KDO残基组成。内核是高度保守的。KDO残基包括下式KDO：

核心寡糖的外部区域比内部核心区域显示出更多的变异，并且该区域的差异区分了大肠杆菌中的五种化学型：R1、R2、R3、R4和K-12。参见图24，其说明了五种已知化学型的外核寡糖的碳水化合物主链的一般结构。HepI I是内核寡糖的最后一个残基。虽然所有的外核寡糖都有结构主题，具有(己糖)₃碳水化合物主链和两个侧链残基，但是主链中己糖的顺序和侧链残基的性质、位置和连接都可以变化。R1和R4外核寡糖的结构高度相似，不同之处仅在于单个β-连接的残基。

在本领域中，野生型大肠杆菌的核心寡糖基于远端寡糖的结构分为五种不同的化学类型：大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12。

在优选实施方案中，本文所述的组合物包含糖缀合物，其中O-多糖包括与O-抗原结合的核心寡糖。在一个实施方案中，所述组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12中的至少任一种的免疫反应。在另一个实施方案中，所述组合物诱导针对至少两种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一个实施方案中，所述组合物诱导针对至少三种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一个实施方案中，所述组合物诱导针对至少四种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一个实施方案中，所述组合物诱导针对所有五种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。

在另一个优选实施方案中，本文所述的组合物包括糖缀合物，其中O-多糖不包括与O-抗原结合的核心寡糖。在一个实施方案中，尽管糖缀合物具有不包含核心寡糖的O-多糖，但这种组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12中的至少任一种的免疫反应。

大肠杆菌血清型可以根据五种化学型中的一种来表征。表2列出了根据化学型表征的典型血清型。粗体的血清型代表最常与所示核心化学型相关的血清型。因此，在优选实施方案中，所述组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12中的至少任一种的免疫反应，所述免疫反应包括针对各相应大肠杆菌血清型中的任一种的免疫反应。

表2:核心化学型和相关大肠杆菌血清型

在一些实施方案中，所述组合物包含含有源自具有R1化学型的血清型的结构的糖，例如，选自具有式O25a,式O6,式O2,式O1,式O75,式O4,式O16,式O8,式O18,式O9,式O13,式O20,式O21,式O91和式O163的糖，其中n为1至100。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌R1核心部分，例如，如图24中所示的。

在一些实施方案中，所述组合物包含含有源自具有R1化学型的血清型的结构的糖，例如，选自具有式O25a,式O6,式O2,式O1,式O75,式O4,式O16,式O18,式O13,式O20,式O21,式O91和式O163的糖，其中n为1至100，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括糖中的大肠杆菌R1核心部分。

在一些实施方案中，所述组合物包含含有源自具有R2化学型的血清型的结构的糖，例如，选自具有式O21、式O44、式O11、式O89、式O162和式O9的糖，其中n为1至100，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还步包括大肠杆菌R2核心部分，例如，如图24中所示的。

在一些实施方案中，所述组合物包含含有源自具有R3化学型的血清型的结构的糖，例如，选自具有式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86和式O93的糖，其中n为1至100，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌R3核心部分，例如，如图24中所示的。

在一些实施方案中，所述组合物包含含有源自具有R4化学型的血清型的结构的糖，例如，选自具有式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160和式O166的糖，其中n为1至100，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌R4核心部分，例如，如图24中所示的。

在一些实施方案中，所述组合物包含含有源自具有K-12化学型的血清型的结构的糖(例如选自具有式O25b的糖和具有式O16的糖)，其中n为1至1000，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌K-12核心部分，例如，如图24中所示的。

在一些实施方案中，所述糖包括核心糖。因此，在一个实施方案中，O-多糖还包括大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，所述O-多糖还包括大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖还包括大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖还包括大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖还包括大肠杆菌K12核心部分。

在一些实施方案中，糖不包括核心糖。因此，在一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌K12核心部分。

E.缀合的O-抗原

O-抗原或优选O-多糖与蛋白质运载体的化学键联可以提高O-抗原或O-多糖的免疫原性。然而，聚合物大小的可变性代表了生产的实际挑战。在商业应用中，糖的大小会影响与不同缀合合成策略的相容性、产物的均一性和缀合物的免疫原性。通过操纵O-抗原合成途径来控制Wzz家族蛋白链长度调节因子的表达，允许在包括大肠杆菌在内的多种革兰阴性细菌菌株中产生所需长度的O-抗原链。

在一个实施方案中，纯化的糖被化学活化以产生能够与运载体蛋白反应的活化的糖。一旦被活化，每种糖分别与运载体蛋白结合形成结合物，即糖结合物。如本文中所用，术语“糖缀合物”是指与运载体蛋白共价连接的糖。在一个实施方案中，糖与运载体蛋白直接连接。在另一个实施方案中，糖通过间隔子/接头与蛋白质连接。

缀合物可以通过在O-抗原的一个位点或沿着O-抗原的多个位点将运载体与O-抗原结合的方案来制备，或者通过活化核心寡糖的至少一个残基的方案来制备。

在一个实施方案中，每个糖与相同的运载体蛋白缀合。

如果组合物中的两种或更多种糖的蛋白质运载体相同，则所述糖可以与同一运载体蛋白质分子缀合(例如具有与其缀合的两种或更多种不同糖的运载体分子)。

在优选实施方案中，糖各自单独地与蛋白质载体的不同分子缀合(每个蛋白质运载体分子仅具有一种类型的与其结合的糖)。在所述实施方案中，所述糖被认为单独与运载体蛋白缀合。

糖的化学活化和随后与运载体蛋白的缀合可以通过本文公开的活化和缀合方法来实现。多糖与运载体蛋白结合后，通过多种技术纯化(就多糖-蛋白质缀合物的量而言是富集的)糖缀合物。这些技术包括浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤。纯化单种糖缀合物后，将它们复合以配制本发明的免疫原性组合物。

活化。本发明还涉及从本文所述的任何实施方案中产生的活化的多糖，其中所述多糖用化学试剂活化以产生用于与接头或运载体蛋白缀合的反应性基团。在一些实施方案中，将本发明的糖活化，然后与运载体蛋白缀合。在一些实施方案中，活化程度不会显著减小多糖的分子量。例如，在一些实施方案中，活化程度不会切割多糖主链。在一些实施方案中，活化程度不会显著影响缀合程度，如通过运载体蛋白(诸如CRM₁₉₇)中经修饰的赖氨酸残基的数量(如通过氨基酸分析确定的)所测量的。例如，在一些实施方案中，与具有相同活化程度的参照多糖的缀合物的运载体蛋白中经修饰的赖氨酸残基的数量相比，活化程度不会使运载体蛋白中经修饰的赖氨酸残基的数量(如通过氨基酸分析确定的)显著增加3倍。在一些实施方案中，活化程度不会升高未缀合的游离糖的水平。在一些实施方案中，活化程度不会降低最佳糖/蛋白比。

在一些实施方案中，活化的糖具有一定的活化百分比，其中活化的糖的每个糖重复单元的硫醇摩尔数介于1％与100％之间，例如介于2％与80％之间，介于2％与50％之间，介于3％与30％之间，以及介于4％与25％之间。活化程度至少为1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,≥20％,≥30％,≥40％,≥50％,≥60％,≥70％,≥80％或≥90％，或约100％。优选地，活化程度至多为50％，更优选至多为25％。在一个实施方案中，活化程度至多为20％。任何最小值和任何最大值可以组合起来定义一个范围。

在一个实施方案中，用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。然后将活化的多糖直接或通过间隔子(接头)基团偶联至运载体蛋白(优选CRM₁₉₇或破伤风类毒素)上的氨基。

例如，间隔子可以是胱胺或半胱胺，以产生硫醇化的多糖，所述多糖可以通过硫醚键联与运载体偶联，所述硫醚键联是在与马来酰亚胺活化的运载体蛋白(例如使用N-[Y-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS))或卤代乙酰化的运载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺、N-琥珀酰亚胺溴乙酸酯(SBA；SIB)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)或3-[溴乙酰氨基]丙酸琥珀酰亚胺酯(SBAP))反应后获得的。在一个实施方案中，将氰酸酯(任选由CDAP chemistry制造的)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，并且使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学通过蛋白质运载体上的羧基将氨基衍生糖与运载体蛋白质(例如CRM₁₉₇)缀合。

其它合适的缀合技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的游离羟基与CDI反应，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键联而形成。这可牵涉将异头端还原为伯羟基，任选地对伯羟基进行保护/去保护，使伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体，以及将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基偶联(CDI chemistry)。

分子量。在一些实施方案中，糖缀合物包含分子量介于10kDa与2,000kDa之间的糖。在其它实施方案中，糖的分子量介于50kDa与1,000kDa之间。在其它实施方案中，糖的分子量介于70kDa与900kDa之间。在其它实施方案中，糖的分子量介于100kDa与800kDa之间。在其它实施方案中，糖的分子量介于200kDa与600kDa之间。在进一步的实施方案中，所述糖的分子量为100kDa至1000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1,000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa。在一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过单端缀合产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过在水性缓冲液中制备的还原胺化化学(RAC)来生产。任何上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。

在一些实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量介于400kDa与15,000kDa之间；介于500kDa与10,000kDa之间；介于2,000kDa与10,000kDa之间；介于3,000kDa与8,000kDa之间；或者介于3,000kDa与5,000kDa之间。在其它实施方案中，糖缀合物的分子量介于500kDa与10,000kDa之间。在其它实施方案中，糖缀合物的分子量介于1,000kDa与8,000kDa之间。在其它实施方案中，糖缀合物的分子量介于2,000kDa与8,000kDa之间或介于3,000kDa与7,000kDa之间。在又一实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量介于200kDa与20,000kDa之间；介于200kDa与15,000kDa之间；介于200kDa与10,000kDa之间；介于200kDa与7,500kDa之间；介于200kDa与5,000kDa之间；介于200kDa与3,000kDa之间；介于200kDa与1,000kDa之间；介于500kDa与20,000kDa之间；介于500kDa与15,000kDa之间；介于500kDa与12,500kDa之间；介于500kDa与10,000kDa之间；介于500kDa与7,500kDa之间；介于500kDa与6,000kDa之间；介于500kDa与5,000kDa之间；介于500kDa与4,000kDa之间；介于500kDa与3,000kDa之间；介于500kDa与2,000kDa之间；介于500kDa与1,500kDa之间；介于500kDa与1,000kDa之间；介于750kDa与20,000kDa之间；介于750kDa与15,000kDa之间；介于750kDa与12,500kDa之间；介于750kDa与10,000kDa之间；介于750kDa与7,500kDa之间；介于750kDa与6,000kDa之间；介于750kDa与5,000kDa之间；介于750kDa与4,000kDa之间；介于750kDa与3,000kDa之间；介于750kDa与2,000kDa之间；介于750kDa与1,500kDa之间；介于1,000kDa与15,000kDa之间；介于1,000kDa与12,500kDa之间；介于1,000kDa与10,000kDa之间；介于1,000kDa与7,500kDa之间；介于1,000kDa与6,000kDa之间；介于1,000kDa与5,000kDa之间；介于1,000kDa与4,000kDa之间；介于1,000kDa与2,500kDa之间；介于2,000kDa与15,000kDa之间；介于2,000kDa与12,500kDa之间；介于2,000kDa与10,000kDa之间；介于2,000kDa与7,500kDa之间；介于2,000kDa与6,000kDa之间；介于2,000kDa与5,000kDa之间；介于2,000kDa与4,000kDa之间；或介于2,000kDa与3,000kDa之间。在一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过本文所述的eTEC缀合产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过还原胺化化学(RAC)产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过在DMSO中制备的还原性胺化化学(RAC)来生产。

在又一实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量介于1,000kDa与20,000kDa之间；介于1,000kDa与15,000kDa之间；介于2,000kDa与10,000kDa之间；介于2000kDa与7,500kDa之间；介于2,000kDa与5,000kDa之间；介于3,000kDa与20,000kDa之间；介于3,000kDa与15,000kDa之间；介于3,000kDa与12,500kDa之间；介于4,000kDa与10,000kDa之间；介于4,000kDa与7,500kDa之间；介于4,000kDa与6,000kDa之间；或介于5,000kDa与7,000kDa之间。在一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过还原胺化化学(RAC)产生。在另一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过在DMSO中制备的还原性胺化化学(RAC)来生产。在另一个实施方案中，具有这种分子量的糖缀合物通过本文所述的eTEC缀合来生产。

在又一实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量介于5,000kDa与20,000kDa之间；介于5,000kDa与15,000kDa之间；介于5,000kDa与10,000kDa之间；介于5,000kDa与7,500kDa之间；介于6,000kDa与20,000kDa之间；介于6,000kDa与15,000kDa之间；介于6,000kDa与12,500kDa之间；介于6,000kDa与10,000kDa之间或介于6,000kDa与7,500kDa之间。

糖缀合物的分子量可以通过SEC-MALLS测量。任何上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。本发明的糖缀合物也可以通过糖与运载体蛋白的比率(重量/重量)来表征。在一些实施方案中，糖缀合物中多糖与运载体蛋白的比率(w/w)介于0.5至3之间(例如约0.5,约0.6,约0.7,约0.8,约0.9,约1.0,约1.1,约1.2,约1.3,约1.4,约1.5,约1.6,约1.7,约1.8,约1.9,约2.0,约2.1,约2.2,约2.3,约2.4,约2.5,约2.6,约2.7,约2.8,约2.9或约3.0)。在其它实施方案中，糖与运载体蛋白的比率(w/w)介于0.5与2.0之间，介于0.5与1.5之间，介于0.8与1.2之间，介于0.5与1.0之间，介于1.0与1.5之间或介于1.0与2.0之间。在又一实施方案中，糖与运载体蛋白的比率(w/w)介于0.8与1.2之间。在优选实施方案中，缀合物中多糖与运载体蛋白的比率介于0.9与1.1之间。在一些此类实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇。

糖缀合物也可以通过它们的分子大小分布(K_d)来表征。尺寸排阻色谱介质(CL-4B)可用于测定缀合物的相对分子尺寸分布。在重力进料柱中使用尺寸排阻色谱法(SEC)来描绘缀合物的分子尺寸分布。从介质孔隙中排出的大分子比小分子洗脱得更快。级分收集器用于收集柱洗出液。通过糖类测定对级分进行比色法测试。为了测定Kd，校准色谱柱以确定分子被完全排除的分数(V₀)，(K_d＝0)，以及代表最大保留的分数(V_i)，(K_d＝1)。达到指定样品属性的分数(V_e)根据表达式K_d＝(V_e-V_o)/(V_i-V₀)与K_d相关。

游离糖。本发明的糖缀合物和免疫原性组合物可包含未与运载体蛋白共价缀合但仍存在于糖缀合物组合物中的游离糖。游离糖可以与糖缀合物非共价缔合(即与糖缀合物非共价结合、吸附至其或包封在其中或被其包封)。在优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含至多50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离多糖。在优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约25％的游离多糖。在优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含至多约20％的游离多糖。在优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含至多约15％的游离多糖。在另一个优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含至多约20％,19％,18％,17％,16％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％或1％的游离多糖。在优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约8％的游离多糖。在优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含至多约6％的游离多糖。在优选实施方案中，与多糖总量相比，糖缀合物包含至多约5％的游离多糖。参见，例如，表19,表20,表21,表22,表23,表24和表25。

共价键联。在其它实施方案中，对于每5至10个糖重复单元、每2至7个糖类重复单元、每3至8个糖类重复单元、每4至9个糖重复单元、每6至11个糖重复单元、每7至12个糖重复单元、每8至13个糖重复单元、每9至14个糖重复单元、每10至15个糖重复单元、每2至6个糖重复单元、每3至7个糖重复单元、每4至8个糖重复单元、每6至10个糖重复单元、每7至11个糖类重复单元、每8至12个糖重复单元、每9至13个糖重复单元、每10至14个糖重复单元、每10至20个糖重复单元、每4至25个糖重复单元或每2至25个糖重复单元，缀合物在运载体蛋白与糖之间包含至少一个共价键联。在常见的实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇。在另一个实施方案中，对于每2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个或25个多糖的重复单元，运载体蛋白与糖之间存在至少一个键联。在一个实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇。任何上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。

赖氨酸残基。表征本发明的糖缀合物的另一种方式是通过运载体蛋白(例如CRM₁₉₇)中与糖缀合的赖氨酸残基的数量，其可被表征为一系列缀合的赖氨酸(缀合程度)。由于与多糖的共价键联，载体蛋白的赖氨酸修饰的证据可以通过使用本领域技术人员已知的常规方法进行氨基酸分析来获得。与用于产生缀合物材料的运载体蛋白原料相比，缀合导致回收的赖氨酸残基数量减少。在优选实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度介于2与15之间,介于2与13之间,介于2与10之间,介于2与8之间,介于2与6之间,介于2与5之间,介于2与4之间,介于3与15之间,介于3与13之间,介于3与10之间,介于3与8之间,介于3与6之间,介于3与5之间,介于3与4之间,介于5与15之间,介于5与10之间,介于8与15之间,介于8与12之间,介于10与15之间或介于10与12之间。在一个实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度约为2,约为3,约为4,约为5,约为6,约为7,约为8,约为9,约为10,约为11,约为12,约为13,约为14或约为15。在优选实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度介于4与7之间。在一些此类实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇。

糖链与运载体蛋白上的赖氨酸的附接频率是表征本发明的糖缀合物的另一个参数。例如，在一些实施方案中，对于多糖的每4个糖重复单元，运载体蛋白与多糖之间至少有一个共价键联。在另一个实施方案中，在多糖的每10个糖重复单元中至少出现一次运载体蛋白与多糖之间的共价键联。在另一个实施方案中，在多糖的每15个糖重复单元中至少出现一次运载体蛋白与多糖之间的共价键联。在又一个实施方案中，运载体蛋白与多糖之间的共价键联在多糖的每25个糖重复单元中至少出现一次。

O-乙酰化。在一些实施方案中，本发明的糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，糖缀合物包含糖，所述糖的O-乙酰化度介于10％与100％之间，介于20％与100％之间，介于30％与100％之间，介于40％与100％之间，介于50％与100％之间，介于60％与100％之间，介于70％与100％之间，介于75％与100％之间，介于80％与100％之间，介于90％与100％之间，介于50％与90％之间，介于60％与90％之间，介于70％与90％之间或介于80％与90％之间。在其它实施方案中，O-乙酰化程度为≥10％,≥20％,≥30％,≥40％,≥50％,≥60％,≥70％,≥80％或≥90％或约为100％。O-乙酰化的百分比是指给定糖相对于100％的百分比(其中每个重复单元相对于其乙酰化结构是完全乙酰化的)。

在一些实施方案中，糖缀合物通过还原胺化来制备。在一些实施方案中，糖缀合物是单端连接的缀合糖，其中糖与运载体蛋白直接共价结合。在一些实施方案中，糖缀合物通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白共价结合。

还原胺化。在一个实施方案中，糖通过还原胺化(诸如美国专利申请公布第2006/0228380号,第2007/0231340号,第2007/0184071号和第2007/0184072第,WO 2006/110381,WO 2008/079653和WO2008/143709中所描述的)与运载体蛋白缀合。

还原性胺化包括(1)糖的氧化，(2)活化的糖与运载体蛋白的还原以形成缀合物。在氧化之前，任选地水解糖。可以采用机械或化学水解。化学水解可以使用乙酸进行。

氧化步骤可能涉及与高碘酸盐的反应。如本文中所用，术语“高碘酸盐”是指高碘酸盐和高碘酸。所述术语还包括偏高碘酸盐(IO₄ ^-)和正高碘酸盐(IO₆ ^5-)以及各种高碘酸盐(例如高碘酸钠和高碘酸钾)。在一个实施方案中，多糖在偏高碘酸盐存在的情况下，优选在高碘酸钠(NaIO₄)存在的情况下被氧化。在另一个实施方案中，多糖在正过碘酸存在的情况下，优选在高碘酸存在的情况下被氧化。

在一个实施方案中，氧化剂是稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物，诸如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物，在氧化剂存在的情况下选择性氧化伯羟基。在所述反应中，在催化循环中，实际的氧化剂是N-氧代铵盐。一方面，所述稳定硝酰基或氮氧自由基化合物是哌啶-N-氧基化合物或吡咯烷-N-氧基化合物。一方面，所述稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物带有TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基)或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分。一方面，所述稳定的硝酰基自由基化合物是TEMPO或其衍生物。一方面，所述氧化剂是带有N-卤素部分的分子。一方面，所述氧化剂选自N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺、二氯异氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二溴异氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二碘异氰尿酸和1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮。优选地，所述氧化剂是N-氯代琥珀酰亚胺。

在糖的氧化步骤之后，糖被认为被活化，在下文中称为“活化的”。活化的糖和运载体蛋白可以单独(离散式冷冻干燥)冷冻干燥(冻干)，也可以一起冷冻干燥(共冷冻干燥)。在一个实施方案中，将活化的糖和运载体蛋白共冻干。在另一个实施方案中，将活化的多糖和运载体蛋白单独地冷冻干燥。

在一个实施方案中，冷冻干燥在非还原糖存在的情况下进行，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、拉克替醇和palatinit。

缀合过程的下一步骤是使用还原剂还原活化的糖和运载体蛋白以形成缀合物(所谓的还原胺化)。合适的还原剂包括氰基硼氢化物(诸如在Bronsted或Lewis酸存在的情况下的氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠或硼氢化钠或硼氢化锌)、胺硼烷，诸如吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、叔丁硼烷-BH3(t-BuMe'PrN-BH3)、苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)、硼烷-吡啶或硼氢化物交换树脂。在一个实施方案中，还原剂是氰基硼氢化钠。

在一个实施方案中，还原反应在水性溶剂(例如选自PBS,MES,HEPES,Bis-tris,ADA,PIPES,MOPSO,BES,MOPS,DIPSO,MOBS,HEPPSO,POPSO,TEA,EPPS,N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)或HEPB，pH介于6.0与8.5之间、7.0与8.0之间或7.0与7.5之间)中进行，在另一个实施方案中，反应在非质子溶剂中进行。在一个实施方案中，还原反应在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。DMSO或DMF溶剂可用于复原已经冻干的活化的多糖和运载体蛋白。

在还原反应结束时，可能有未反应的醛基保留在缀合物中，可以用合适的封端剂对这些醛基进行封端。在一个实施方案中，该封端剂是硼氢化钠(NaBH₄)。在缀合(还原反应和任选的封端)之后，可以通过技术人员已知的各种技术纯化(就多糖-蛋白质缀合物的量而言是富集的)糖缀合物。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱色谱(DEAE或疏水相互作用色谱)和深度过滤。糖缀合物可以通过渗滤和/或离子交换层析和/或尺寸排阻色谱来进行纯化。在一个实施方案中，通过渗滤或离子交换色谱或尺寸排阻色谱纯化糖缀合物。在一个实施方案中，对糖缀合物进行无菌过滤。

在优选实施方案中，源自大肠杆菌血清型的糖缀合物选自O25B、O1、O2和O6中的任一种，通过还原胺化制备。在优选实施方案中，源自大肠杆菌血清型O25B、O1、O2和O6的糖缀合物通过还原胺化制备。

一方面，本发明涉及缀合物，其包括与式O25B的糖连接的运载体蛋白，例如CRM₁₉₇，由

表示，其中n是大于或等于1的任何整数。在优选实施方案中，n是至少31,32,33,34,35,36,37,38,39,40并且至多200,100,99,98,97,96,95,94,93,92,91,90,89,88,87,86,81,80,79,78,77,76,75,74,73,72,71,70,69,68,67,66,65,60,59,58,57,56,55,54,53,52,51或50的整数。任何最小值和任何最大值可以组合起来定义一个范围。示例性范围包括，例如，至少1至最多1000；至少10至至多500；以及至少20至最多80。在优选实施方案中，n为至少31至至多90，更优选40至90，最优选60至85。

在另一方面，本发明涉及缀合物，所述缀合物包括与具有表1中所示的下列结构中的任一种的糖连接的载体蛋白(例如CRM₁₉₇)(另参见图9A-图9C和图10A-图10B)，其中n是大于或等于1的整数。

不受理论或机制的束缚，在一些实施方案中，稳定的缀合物被认为需要一定水平的糖抗原修饰，所述修饰与保持抗原的关键免疫原性表位的结构完整性相平衡。

醛的活化和形成。在一些实施方案中，本发明的糖被活化并导致醛的形成。在其中糖被活化的此类实施方案中，活化的百分比(％)(或氧化程度(DO))(参见，例如，实施例31)是指每摩尔活化多糖的醛的糖重复单元的摩尔数。例如，在一些实施方案中，糖通过多糖重复单元上邻位二醇的高碘酸盐氧化而被活化，导致醛的形成。在氧化过程中，改变高碘酸钠相对于糖重复单元的摩尔当量(meq)和温度会导致氧化程度(DO)的变化。

糖和醛的浓度通常通过比色测定来确定。替代试剂是TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基游离基)-N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)组合，其导致从伯醇基团形成醛。

在一些实施方案中，活化的糖具有一定的氧化度，其中每摩尔活化的糖的醛的糖重复单元的摩尔数介于1与100之间，例如介于2与80之间，介于2与50之间，介于3与30之间以及介于4与25之间。活化程度至少为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,≥20,≥30,≥40,≥50,≥60,≥70,≥80或≥90或约100。优选地，氧化度(DO)为至少5且至多50，更优选至少10且至多25。在一个实施方案中，活化程度至少为10且至多为25。任何最小值和任何最大值可以组合起来定义一个范围。氧化程度值可以表示为活化的百分比(％)。例如，在一个实施方案中，为10的DO值是指活化的糖中总共10个糖重复单元中的一个活化的糖重复单元，在这种情况下，为10的DO值可表示为10％的活化。

在一些实施方案中，通过还原胺化化学制备的缀合物包括运载体蛋白和糖，其中糖包括选以下的任一种的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3株))、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如式O23A)、式O24、式O25(例如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如式O73(73-1株))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，缀合物中的糖包括式，其中n为1至1000、5至1000，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65的整数。

单端连接的缀合物。在一些实施方案中，缀合物是单端连接的缀合的糖，其中糖在糖的一端与运载体蛋白共价结合。在一些实施方案中，单端连接的缀合的多糖具有末端糖。例如，如果多糖的一个末端(末端糖残基)与载体蛋白共价结合，则缀合物是单端连接的。在一些实施方案中，如果多糖的末端糖残基通过接头与运载体蛋白共价结合，则缀合物是单端连接的。此类接头可以包括例如胱胺接头(A1)、3,3’-二硫代双(丙酸二酰肼)接头(A4)和2,2’-二硫代-N,N’-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(氨基氧基)乙酰胺)接头(A6)。

在一些实施方案中，糖通过3-脱氧-d-甘露糖-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与运载体蛋白缀合，形成单端连接的缀合物。参见，例如，实施例26、实施例27、实施例28和图17。

在一些实施方案中，缀合物优选不是生物缀合物。术语“生物缀合物”是指蛋白质(例如运载体蛋白)与抗原(例如在宿主细胞背景中制备的O抗原(例如O25B))之间的缀合物，其中宿主细胞机制将抗原与所述蛋白连接(例如N-连接)。糖缀合物包括生物缀合物，以及通过不需要在宿主细胞中制备缀合物的方式，例如，通过蛋白质与糖的化学键联进行的缀合制备的糖抗原(例如寡糖和多糖)-蛋白质缀合物。

硫醇活化的糖类。在一些实施方案中，本发明的糖是硫醇活化的。在其中糖被硫醇活化的实施方案中，活化的百分比(％)是指活化的多糖的每个糖重复单元中硫醇的摩尔数。糖和硫醇的浓度通常通过用于巯基定量的Ellman测定来确定。例如，在一些实施方案中，糖包括利用二硫化胺接头进行的2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)的活化。参见，例如，实施例10和图31。在一些实施方案中，糖通过二价异双功能接头(在本文中也称为“间隔子”)与运载体蛋白共价结合。接头优选在糖与运载体蛋白之间提供硫醚键，从而产生在本文中称为“硫醚糖缀合物”的糖缀合物。在一些实施方案中，接头还提供氨基甲酸酯和酰胺键，例如，(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)。参见，例如，实施例21。

在一些实施方案中，单端连接的缀合物包括运载体蛋白和糖，其中糖包括选自以下的任一种的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3株))、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如式O23A)、式O24、式O25(例如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如式O73(73-1株))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，缀合物中的糖包括式，其中n为1至1000、5至1000，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65的整数。

例如，在一个实施方案中，单端连接的缀合物包括运载体蛋白和具有选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101的结构的糖，其中n为1至10的整数。

F.eTEC缀合物

一方面，本发明总体上涉及糖缀合物，其包含通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白共价缀合的源自上述大肠杆菌的糖(如例如美国专利9517274和国际专利申请公布WO2014027302中所述，所述专利通过引用以其整体并入本文)，包括包含此类糖缀合物的免疫原性组合物，以及用于制备和使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。所述糖缀合物包含通过一个或多个eTEC间隔子与运载体蛋白共价缀合的糖，其中糖通过氨基甲酸酯键联与eTEC间隔子共价缀合，并且其中运载体蛋白通过酰胺键联与eTEC间隔子共价缀合。eTEC间隔子包含七个线性原子(即–C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-)，并在糖与运载体蛋白之间提供稳定的硫醚键和酰胺键。

本发明的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示：

其中构成eTEC间隔子的原子包含在中央框中。

在本发明的所述糖缀合物中，糖可以是多糖或寡糖。

掺入本发明的糖缀合物的运载体蛋白选自通常适用于此目的的运载体蛋白的组，如本文中进一步描述的或本领域技术人员已知的。在特定的实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇。

另一方面，本发明提供了制备糖缀合物的方法，所述糖缀合物包含通过eTEC间隔子与运载体蛋白缀合的本文所述的糖，所述方法包括以下步骤：a)使糖与碳酸衍生物在有机溶剂中反应以产生活化的糖；b)使所述活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应，以产生硫醇化糖；c)使所述硫醇化糖与还原剂反应，以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化糖；d)使所述活化的硫醇化糖与包含一个或多α-卤代乙酰胺基团的活化的运载体蛋白反应，以产生硫醇化糖-运载体蛋白缀合物；以及e)使所述硫醇化糖-运载体蛋白缀合物与(i)能够将活化的运载体蛋白的未缀合的α-卤代乙酰胺基团封端的第一封端试剂和/或(ii)能够将活化的硫醇化糖的未缀合的游离巯基残基封端的第二封端试剂反应；由此产生eTEC连接的糖缀合物。

在常见的实施方案中，碳酸衍生物是1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1’-羰基二咪唑(CDI)。优选地，碳酸衍生物是CDT，有机溶剂是极性非质子溶剂，诸如二甲亚砜(DMSO)。在优选实施方案中，通过活化的糖与双功能对称硫代烷基胺试剂、胱胺或其盐的反应产生硫醇化糖。或者，硫醇化糖可以通过活化的糖与半胱胺或其盐的反应形成。通过本发明的方法产生的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示。

在常见的实施方案中，第一封端剂是N-乙酰基-L-半胱氨酸，其与运载体蛋白的赖氨酸残基上的未缀合的α-卤代乙酰胺基团反应，形成通过硫醚键联与活化的赖氨酸残基共价连接的S-羧甲基半胱氨酸(CMC)残基。

在其它实施方案中，第二封端试剂是碘乙酰胺(IAA)，其与活化的硫醇化糖的未缀合的游离巯基反应以提供封端的硫代乙酰胺。通常，步骤e)包括用第一封闭剂和第二封闭剂两者进行封端。在某些实施方案中，步骤e)包括用N-乙酰基-L-半胱氨酸作为第一封端试剂以及IAA作为第二封端试剂进行封端。

在一些实施方案中，封闭步骤e)还包括在与第一和/或第二封端试剂反应之后，与还原剂例如DTT、TCEP或巯基乙醇的反应。

本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可包含游离巯基残基。在一些情况下，通过本文提供的方法形成的活化的巯基化糖将包括多个游离巯基残基，其中一些在缀合步骤期间可能不与运载体蛋白共价缀合。此类残留的游离巯基残基通过与硫醇反应性封端试剂例如碘乙酰胺(IAA)反应而被封端，以对潜在的反应性官能团进行封端。还设想了其它硫醇反应性封端试剂，例如含马来酰亚胺的试剂等。

另外，本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可以包含残余的未缀合的运载体蛋白，其可以包含在封端过程步骤中已经历修饰的活化的运载体蛋白。

在一些实施方案中，步骤d)还包括在使活化的硫醇化糖与活化的运载体蛋白反应之前，提供包含一个或多个α-卤代乙酰胺基团的活化的运载体蛋白。在常见的实施方案中，活化的载体蛋白包含一个或多个α-溴乙酰胺基团。

另一方面，本发明提供了eTEC连接的糖缀合物，其包含通过根据本文公开的任何方法产生的eTEC间隔子与运载体蛋白缀合的本文所述的糖。

在一些实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇，并且CRM₁₉₇与多糖之间经由eTEC间隔子的共价键联在多糖的每4个、10个、15个或25个糖重复单元中至少出现一次。

对于本发明的每个方面，在本文所述的方法和组合物的特定实施方案中，eTEC连接的糖缀合物包含本文所述的糖，诸如源自大肠杆菌的糖。

在另一方面，本发明提供了预防、治疗或改善受试者的细菌感染、疾病或疾患的方法，其包括向受试者施用免疫有效量的本发明免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物，所述糖缀合物包含本文所述的糖。在一些实施方案中，糖源自大肠杆菌。

在一些实施方案中，eTEC连接的糖缀合物包含运载体蛋白和糖，其中所述糖包括选自以下的任一种的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3株))、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如式O23A)、式O24、式O25(例如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如式O73(73-1株))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，缀合物中的糖包括式，其中n为1至1000、5至1000，优选为31至100，更优选为35至90，最优选为35至65的整数。

运载体蛋白中与糖缀合的赖氨酸残基的数量可以表征为一系列缀合的赖氨酸。例如，在免疫原性组合物的一些实施方案中，CRM₁₉₇可包含与糖共价连接的39个赖氨酸残基中的4至16个赖氨酸残基。表达该参数的另一种方式是约10％至约41％的CRM₁₉₇赖氨酸与糖共价连接。在其它实施方案中，CRM₁₉₇可包含与糖共价连接的39个赖氨酸残基中的2至20个赖氨酸残基。表达该参数的另一种方式是约5％至约50％的CRM₁₉₇赖氨酸与糖共价连接。

在常见的实施方案中，运载体蛋白是CRM₁₉₇，并且CRM₁₉₇与多糖之间通过eTEC间隔子的共价键联在多糖的每4个、10个、15个或25个糖重复单元中至少出现一次。

在其它实施方案中，对于每5至10个糖重复单元、每2至7个糖类重复单元、每3至8个糖类重复单元、每4至9个糖重复单元、每6至11个糖重复单元、每7至12个糖重复单元、每8至13个糖重复单元、每9至14个糖重复单元、每10至15个糖重复单元、每2至6个糖重复单元、每3至7个糖重复单元、每4至8个糖重复单元、每6至10个糖重复单元、每7至11个糖类重复单元、每8至12个糖重复单元、每9至13个糖重复单元、每10至14个糖重复单元、每10至20个糖重复单元或每4至25个糖重复单元，缀合物在运载体蛋白与糖之间包含至少一个共价键联。

在另一个实施方案中，对于多糖的每2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个或25个重复单元，运载体蛋白与糖之间存在至少一个键联。

G.运载体蛋白质

本发明的糖缀合物的一种组分是糖所缀合的运载体蛋白。术语“蛋白质运载体”或“运载体蛋白”或“运载体”在本文中可以互换使用。运载体蛋白应能适应标准的缀合程序。

缀合物的一个组分是与O-多糖缀合的运载体蛋白。在一个实施方案中，缀合物包含与O-多糖的核心寡糖缀合的运载体蛋白(参见图24)。在一个实施方案中，缀合物包含与O-多糖的O-抗原缀合的运载体蛋白。

术语“蛋白质运载体”或“运载体蛋白”或“运载体”在本文中可以互换使用。运载体蛋白应能适应标准的缀合程序。

在优选实施方案中，缀合物的运载体蛋白独立地选自TT、DT、DT突变体(诸如CRM₁₉₇)、流感嗜血杆菌蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(尤其是WO 01/98334和WO 03/54007中描述的那些)、解毒的肺炎链球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艰难梭菌的毒素A或B和PsaA中的任一种。在实施方案中，本发明的缀合物的运载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的缀合物的运载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的缀合物的运载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌蛋白D-参见，例如，EP 0 594610B)。在一些实施方案中，运载体蛋白包含聚(L-赖氨酸)(PLL)。

在优选实施方案中，糖与CRM₁₉₇蛋白缀合。CRM₁₉₇蛋白是白喉毒素的无毒形式，但在免疫学上与白喉毒素无法区分。CRM₁₉₇由感染了非产毒噬菌体β197tox-的白喉棒状杆菌(C.Diphtheriae)产生，所述非产毒噬菌体β197tox-是由产毒棒状杆菌β的亚硝基胍诱变产生的。CRM₁₉₇蛋白与白喉毒素具有相同的分子量，但与其相异在于结构基因中的单个碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)。这种单个碱基变化导致成熟蛋白质中的谷氨酸对甘氨酸的氨基酸取代,并消除白喉毒素的毒性特性。CRM₁₉₇蛋白是安全有效的T细胞依赖性糖运载体。

因此，在一些实施方案中，本发明的缀合物包括CRM₁₉₇作为运载体蛋白，其中糖与CRM₁₉₇共价连接。

在优选实施方案中，糖缀合物的运载体蛋白选自由以下组成的组：DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素)或TT的片段C、CRM₁₉₇(白喉毒素的无毒但抗原性相同的变体)、其它DT突变体(诸如CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida等人J.Biol.Chem.218；3838-3844,1973),CRM9,CRM45,CRM102,CRM103或CRM107；以及Nicholls和Youle在Genetically EngineeredToxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992中描述的其它突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala 158缺失或突变为Gly，以及US 4709017或US 4950740中公开的其它突变；Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534中的至少一个或多个残基的突变以及US5917017或US 6455673中公开的其它突变；或US 5843711中公开的片段)、肺炎球菌肺炎链球菌溶血素(Kuo等人(1995)Infect lmmun 63；2706-13)，包括以某种方式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO 04081515，PCT/EP2005/010258)或dPLY-甲醛、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列公开在WO 00/37105或WO 00/39299中)和Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E(WO 01/98334,WO 03/54007,WO2009/000826)、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常提取自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群B-EP0372501)、PorB(来自脑膜炎奈瑟氏菌)、PD(流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)蛋白D-参见，例如，EP 0 594 610B)或其免疫功能等同物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、包含来自各种病原体来源的抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等人(2001)Eur J Immunol 31；3816-3824)诸如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)Infect lmmun 72；4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、重组铜绿色假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A(特别是其无毒突变体(诸如在谷氨酸553处带有取代的外毒素A(Uchida Cameron DM,RJ Collier.1987.J.Bacteriol.169:4967-4971))。其它蛋白，诸如卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化的蛋白衍生物(PPD)也可用作运载体蛋白。其它合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，诸如霍乱类毒素(例如如国际专利申请第WO 2004/083251号中所述的)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A。

在一些实施方案中，运载体蛋白选自例如以下的任一种：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、鞭毛蛋白、金黄色葡萄球菌(S.Aureus)的解毒的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、霍乱毒素B亚单位(CTB)、肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素及其解毒的变体、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。在一个实施方案中，运载体蛋白是解毒的假单胞菌属外毒素(EPA)。在另一个实施方案中，运载体蛋白不是解毒的假单胞菌属外毒素(EPA)。在一个实施方案中，运载体蛋白是鞭毛蛋白。在另一个实施方案中，运载体蛋白不是鞭毛蛋白。

在优选实施方案中，糖缀合物的运载体蛋白独立地选自由以下组成的组：TT、DT、DT突变体(诸如CRM₁₉₇)、流感嗜血杆菌蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特别是WO 01/98334和WO 03/54007中描述的那些)、解毒的肺炎链球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艰难梭菌的毒素A或B和PsaA。在一个实施方案中，本发明的糖缀合物的运载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的糖缀合物的运载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的糖缀合物的运载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌蛋白D-参见，例如，EP 0 594 610B)。

在优选实施方案中，本发明的荚膜糖与CRM₁₉₇蛋白缀合。CRM₁₉₇蛋白是白喉毒素的无毒形式，但在免疫学上与白喉毒素无法区分。CRM₁₉₇由感染了非产毒噬菌体β197tox-的白喉棒状杆菌感染产生，所述噬菌体通过产毒棒状噬菌体β的亚硝基胍诱变产生(Uchida,T.等人1971,Nature New Biology 233:8-11)。CRM₁₉₇蛋白与白喉毒素具有相同的分子量，但与其相异在于结构基因中的单个碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)。这种单个碱基变化导致成熟蛋白质中的谷氨酸对甘氨酸的氨基酸取代,并消除白喉毒素的毒性特性。CRM₁₉₇蛋白是安全有效的T细胞依赖性糖运载体。关于CRM₁₉₇及其生产的更多细节可见于例如US 5,614,382中。

因此，在常见的实施方案中，本发明的糖缀合物包含CRM₁₉₇作为运载体蛋白，其中荚膜多糖与CRM₁₉₇共价连接。

H.组合物的剂量

可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应。例如，可以施用单剂量的源自大肠杆菌的多肽或其片段，可以随时间施用若干分开的剂量，或者可以如情况的紧急程度所指示的按比例减少或增加剂量。应当注意的是，剂量值可以随着待缓解的疾患的类型和严重程度而变化，并且可以包括单剂量或多剂量。还应理解的是，对于任何特定的受试者，具体的剂量方案应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，并不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。确定用于治疗性蛋白施用的适当剂量和方案在相关领域中是公知的，并且一旦提供了本文公开的教导，本领域技术人员将理解其包括在内。

在一些实施方案中，组合物中源自大肠杆菌的多肽或其片段的量可在每种蛋白抗原约10μg至约300μg的范围内。在一些实施方案中，组合物中源自大肠杆菌的多肽或其片段的量可在每种蛋白质抗原约20μg至约200μg的范围内。

每一剂量中一种或多种糖缀合物的量被选择为在典型疫苗中诱导免疫保护反应而没有显著的不利副作用的量。这种量将根据所用的特定免疫原及其呈递方式而变化。

免疫原性组合物中特定糖缀合物的量可基于该缀合物的总多糖(缀合的和未缀合的)来计算。例如，在100g多糖剂量中，具有20％游离多糖的糖缀合物将具有约80g缀合的多糖和约20g未缀合的多糖。糖缀合物的量可以根据大肠杆菌血清型而变化。糖浓度可以通过糖醛酸测定来确定。

免疫原性组合物中不同多糖组分的“免疫原性量”可以不同，每种可以包含约1.0g,约2.0g,约3.0g,约4.0g,约5.0g,约6.0g,约7.0g,约8.0g,约9.0g,约10.0g,约15.0g,约20.0g,约30.0g,约40.0pg,约50.0pg,约60.0pg,约70.0pg,约80.0pg,约90.0pg或约100.0g的任何特定多糖抗原。通常，对于给定的血清型，每个剂量将包含0.1g至100g多糖，特别是0.5g至20g，更特别是1g至10g，甚至更特别是2g至5g。任何上述范围内的任何整数都被认为是本发明的实施方案。在一个实施方案中，对于给定的血清型，每个剂量将包含1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g或20g多糖。

运载体蛋白量。通常，每个剂量将包含5g至150g运载体蛋白，特别是10g至100g运载体蛋白，更特别是15g至100g运载体蛋白，更特别是25至75g运载体蛋白，更特别是30g至70g运载体蛋白，更特别是30至60g运载体蛋白，更特别是30g至50g运载体蛋白，甚至更特别是40至60g运载体蛋白。在一个实施方案中，所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，每个剂量将包含约25g,约26g,约27g,约28g,约29g,约30g,约31g,约32g,约33g,约34g,约35g,约36g,约37g,约38g,约39g,约40g,约41g,约42g,约43g,约44g,约45g,约46g,约47g,约48g,约49g,约50g,约51g,约52g,约53g,约54g,约55g,约56g,约57g,约58g,约59g,约60g,约61g,约62g,约63g,约64g,约65g,约66g,约67g,68g,约69g,约70g,约71g,约72g,约73g,约74g或约75g运载体蛋白。在一个实施方案中，所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。

I.佐剂

在一些实施方案中，本文公开的免疫原性组合物还可包含至少一种、两种或三种佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。抗原可能主要作为递送系统，主要作为免疫调节剂或具有两者的强烈特征。合适的佐剂包括适用于包括人在内的哺乳动物的佐剂。

可用于人的已知合适的递送系统类型佐剂的实例包括但不限于明矾(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳剂，诸如MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween 80)、0.5％w/v脱水山梨醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳剂，诸如Montanide和聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒或纳米颗粒。

在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含铝盐(明矾)作为佐剂(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在优选实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含0.1mg/mL至1mg/mL或0.2mg/mL至0.3mg/mL的磷酸铝形式的元素铝。在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含约0.25mg/mL磷酸铝形式的元素铝。可用于人的已知合适的免疫调节型佐剂的实例包括但不限于，来自阿奎拉树(Aquilla tree)树皮的皂苷提取物(QS21，Quil A)、TLR4激动剂诸如MPL(单磷酰基脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰基MPL)或GLA-AQ、LT/CT突变体、细胞因子诸如各种白细胞介素(例如如IL-2、IL-12)或GM-CSF、AS01等。

可用于人的具有递送和免疫调节特征的已知合适的免疫调节型佐剂的实例包括但不限于ISCOMS(参见，例如，

等人(1998)J.Leukocyte Biol.64:713；WO 90/03184,WO 96/11711,WO 00/48630,WO 98/36772,WO 00/41720,WO 2006/134423和WO2007/026190)或GLA-EM(其为TLR4激动剂与水包油乳液的组合)。

对于包括但不限于动物实验在内的兽医应用，可以使用弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、Emulsigen、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，简称nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，简称MTP-PE)和RIBI，所述RIBI含有从细菌中提取的三种组分：于2％角鲨烯Tween 80乳液中的单磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。

增强本文公开的免疫原性组合物的效力的其它示例性佐剂包括但不限于(1)水包油乳液制剂(含有或不含其它特异性免疫刺激剂，诸如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组分)，例如(a)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％普朗尼克封闭聚合物L121和thr-MDP，其被微流化成亚微米乳液或被涡旋以产生更大粒度的乳液，和(b)RIBI^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.)，其含有2％角鲨烯、0.2％Tween 80和一种或多种细菌细胞壁组分，诸如单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)皂苷佐剂，诸如QS21,STIMULON^TM(CambridgeBioscience,Worcester,Mass.),

(Isconova,Sweden)或

(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)可被使用，或由其产生的颗粒，诸如ISCOM(免疫刺激复合物)，所述ISCOM可以不含附加的去垢剂(例如WO 00/07621)；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，诸如白细胞介素(例如IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-12(例如WO 99/44636))、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰基脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3dMPL)(参见，例如，GB2220211，EP0689454)(参见，例如，WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见，例如，EP0835318、EP0735898、EP 0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(参见，例如，WO 99/52549)；(8)与辛氧醇组合的聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂(例如WO 01/21207)，或与至少一种附加的非离子表面活性剂诸如辛氧醇组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(例如WO 01/21152)；(9)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(例如WO00/62800)；(10)免疫刺激剂和金属盐颗粒(参见，例如，WO 00/23105)；(11)皂苷和水包油乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选地+甾醇)(例如WO 98/57659)；(13)用作免疫刺激剂以增强组合物的功效的其它物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在本发明的实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含CpG寡核苷酸作为佐剂。本文所用的CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN),因此除非另有说明，否则这些术语可互换使用。免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸包含一个或多个免疫刺激性CpG基序，所述基序是未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，任选地在某些优选的碱基范围内。CpG免疫刺激性基序的甲基化状态通常指二核苷酸中的胞嘧啶残基。包含至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是一种寡核苷酸，其包含通过磷酸键与3’鸟嘌呤连接的5’未甲基化的胞嘧啶，并通过与Toll样受体9(TLR-9)结合激活免疫系统。在另一个实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一个或多个甲基化的CpG二核苷酸，其将通过TLR9激活免疫系统，但不如一个或多个CpG基序未甲基化时那么强。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一个或多个回文序列，所述回文序列又可以包含CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已经在许多授权的专利、公开的专利申请和其它出版物中描述，包括美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号和第6,339,068号。

在本发明的实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含WO2010/125480的第3页第22行至第12页第36行描述的任何CpG寡核苷酸。

已经鉴定了不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些寡核苷酸被称为A类、B类、C类和P类，并在WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行有更详细的描述。本发明的方法包括这些不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸的用途。

VI I.纳米颗粒

另一方面，本文公开了免疫原性复合物，其包括1)纳米结构；和2)至少一种菌毛多肽抗原或其片段。优选地，菌毛多肽或其片段源自大肠杆菌菌毛H(fimH)。在优选实施方案中，菌毛多肽选自上述任一种菌毛多肽。例如，菌毛多肽可包含选自SEQ ID NOs:1-10,18,20,21,23,24和26-29的任一种氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原与纳米结构外部融合或缀合，以刺激针对所展示的表位的适应性免疫反应的发生。在一些实施方案中，免疫原性复合物还包括附着于外部并且/或者包封在笼内部的佐剂或其它免疫调节化合物，以帮助定制针对每种病原体产生的免疫反应类型。

在一些实施方案中，纳米结构包含单个组件，所述组件包含多个相同的第一纳米结构相关多肽。

在替代实施方案中，纳米结构包含多个组件(其包含多个相同的第一纳米结构相关多肽)和多个第二组件，每个第二组件包含多个相同的第二纳米结构相关多肽。

各种纳米结构平台可用于产生本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所采用的纳米结构由多个拷贝的单个亚单元形成。在一些实施方案中，所采用的纳米结构由多个拷贝的多个不同亚单元形成。

纳米结构通常为球状，并且/或者具有旋转对称性(例如具有3-重轴和5-重轴)，例如，具有本文示例的二十面体结构。

在一些实施方案中，抗原呈现在自组装纳米颗粒诸如源自铁蛋白(FR)、E2p、Qβ和I3-01的自组装纳米结构上。E2p是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的二氢脂酰酰基转移酶的重新设计的变体。I 3-01是工程蛋白质，其可以自我组装成超稳定的纳米颗粒。这些蛋白质亚单位的序列是本领域已知的。在第一方面，本文公开了纳米结构相关多肽，其包含在其长度上与选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列具有至少75％同一性，并且在至少一个鉴定的界面位置处相同的氨基酸序列。纳米结构相关多肽可用于例如制备纳米结构。纳米结构相关多肽是根据它们成对自组装形成纳米结构(诸如二十面体纳米结构)的能力而设计的。

在一些实施方案中，纳米结构包括(a)多个第一组件，每个第一组件包括多个相同的第一纳米结构相关多肽，其中第一纳米结构相关多肽包含选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列；和(b)多个第二组件，每个第二组件包括多个相同的第二纳米结构相关多肽，其中第二纳米结构相关多肽包含选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列，并且其中第二纳米结构相关多肽不同于第一纳米结构相关多肽；其中所述多个第一组件与所述多个第二组件非共价相互作用以形成纳米结构；

纳米结构包括对称重复的、非天然的、非共价的多肽-多肽界面，所述界面将第一组件和第二组件定向成纳米结构，诸如具有二十面体对称性的纳米结构。

SEQ ID NOS:59-92提供了示例性纳米结构相关多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:59-92的示例性纳米结构相关多肽的界面残基数量范围为4-13个残基。在各种实施方案中，纳米结构相关多肽包含在其长度上与选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列具有至少75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性，并且在至少1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个或13个鉴定的界面位置(取决于给定纳米结构相关多肽的界面残基数量)处相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，纳米结构相关多肽包含在其长度上与选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列具有至少75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性，并且至少在20％,25％,33％,40％,50％,60％,70％,75％,80％,90％或100％的鉴定的界面位置处相同的氨基酸序列。在又一实施方案中，纳米结构相关多肽包括具有选自由SEQ ID NOS:59-98组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列的纳米结构相关多肽。

在一个非限制性实施方案中，可以修饰纳米结构相关多肽以促进与目的“货物”的共价键联。在一个非限制性实例中，可以诸如通过在确定的位置引入各种半胱氨酸残基(以促进与一种或多种目的抗原的键联)来修饰纳米结构相关多肽，使得纳米结构相关多肽的纳米结构将提供支架以提供大量抗原作为疫苗递送，从而产生改善的免疫反应。

在一些实施方案中，存在于纳米结构相关多肽中但不旨在用于缀合的一些或所有天然半胱氨酸残基可被突变为其它氨基酸，以促进在确定位置处的缀合。在另一个非限制性实施方案中，可以通过与部分键联(共价或非共价)来修饰纳米结构相关多肽，以帮助促进“内体逃逸”。对于涉及将目的分子递送至靶细胞的应用，诸如靶向递送，关键步骤可以是从内体(一种膜结合的细胞器，其为将媒介物递送到细胞中的入口点)逃逸。内体成熟为溶酶体，所述溶酶体降解其内容物。因此，如果递送媒介物在内体变成溶酶体之前没有以某种方式从内体中“逃逸”,其将被降解并且不能发挥其功能。有多种脂质或有机聚合物破坏内体并逃逸到胞质溶胶中。因此，在该实施方案中，可以例如通过引入半胱氨酸残基修饰纳米结构相关多肽，这将允许这种脂质或有机聚合物与单体或所得的组装表面化学缀合。在另一个非限制性实例中，可以例如通过引入半胱氨酸残基来修饰纳米结构相关多肽，这将允许荧光团或其它成像剂的化学缀合，从而允许纳米结构在体外或体内可视化。

纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可以被突变，以提高蛋白质亚单位或组装的纳米结构的稳定性或溶解性。如本领域技术人员所知，如果纳米结构相关多肽与现有蛋白家族具有显著的序列同源性，则来自该家族的其它蛋白的多序列比对可用于指导在非保守位置选择可增加蛋白稳定性和/或溶解性的氨基酸突变，该过程称为共有蛋白设计(9)。

纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可被突变为带正电荷(Arg，Lys)或带负电荷(Asp，Glu)的氨基酸，以赋予蛋白质表面整体正电荷或整体负电荷。在一个非限制性实施方案中，纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可以被突变，以赋予自组装纳米结构的内表面高净电荷。由于纳米结构内表面与货物分子之间的静电相互作用，这种纳米结构然后可以用于包装或封装具有相反净电荷的货物分子。在一个非限制性实施方案中，纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可主要突变为精氨酸或赖氨酸残基，以赋予自组装纳米结构的内表面净正电荷。然后可以在核酸货物分子诸如dsDNA,ssDNA,dsRNA,ssRNA,cDNA,miRNA,siRNA,shRNA,piRNA或其它核酸存在的情况下混合包含纳米结构相关多肽的溶液，以便将核酸包封在自组装纳米结构内部。这种纳米结构可用于例如保护、递送或浓缩核酸。

在一个实施方案中，纳米结构具有二十面体对称性。在该实施方案中，纳米结构可以包含60个拷贝的第一纳米结构相关多肽和60个拷贝的第二纳米结构相关多肽。在一个这样的实施方案中，每个第一组件中相同的第一纳米结构相关多肽的数量不同于每个第二组件中相同的第二纳米结构相关多肽的数量。例如，在一个实施方案中，纳米结构包含十二个第一组件和二十个第二组件；在该实施方案中，每个第一组件可以例如包含五个拷贝的相同的第一纳米结构相关多肽，而每个第二组件可以例如包含三个拷贝的相同的第二纳米结构相关多肽。在另一个实施方案中，纳米结构包含十二个第一组件和三十个第二组件；在该实施方案中，每个第一组件可以例如包含五个拷贝的相同的第一纳米结构相关多肽，每个第二组件可以例如包含两个拷贝的相同的第二纳米结构相关多肽。在又一实施方案中，纳米结构包含二十个第一组件和三十个第二组件；在该实施方案中，每个第一组件可以例如包含三个拷贝的相同的第一纳米结构相关多肽，每个第二组件可以例如包含两个拷贝的相同的第二纳米结构相关多肽。所有这些实施方案都能够形成具有规则二十面体对称性的合成纳米材料。

实施例

为了可以更好地理解本发明，给出以下实施例。这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不能被解释为以任何方式限制本发明的范围。以下实施例说明了本发明的一些实施方案。

实施例1：构建体概述

表3

所有研究的FimH构建体都是具有预期分子量的单体蛋白质。

表4

FimC-FimH复合物的预期分子量为53.1kDa；

FimC的预期分子量为24kDa。

实施例2：FimH凝集素结合结构域的哺乳动物表达

本发明非限制性实施例涉及在HEK细胞系中产生源自大肠杆菌的多肽或其片段。与在大肠杆菌宿主细胞中表达源自大肠杆菌的多肽或其片段相比，产率相对较高。

为了实现从哺乳动物细胞中产生FimH变体，使用SignalP预测算法来分析蛋白质和片段分泌的不同异源信号序列。还分析了野生型FimH前导序列。预测表明野生型FimH前导序列可能在哺乳动物细胞中对分泌FimH变体其作用，然而，预测分泌的变体在全长野生型FimH(参见SEQ ID NO:1)的W20残基处被切割，而不是在全长野生型FimH(参见SEQ IDNO:1)的F22残基处被切割。预测血凝素信号序列不起作用。预测鼠IgK信号序列产生SEQ IDNO:1的F22N末端，或成熟蛋白的F1残基。

基于这些分析，合成DNA并重组产生构建体以表达具有野生型FimH前导序列的FimH凝集素结合结构域。还制备了表达具有mIgK信号序列的FimH凝集素结合结构域的构建体。亲和纯化标签，诸如His标签，被引入到源自大肠杆菌的多肽或其片段的C-末端以促进纯化。

将表达质粒转染入HEK宿主细胞，即EXPI293哺乳动物细胞。

成功地表达了源自大肠杆菌的多肽或其片段。例如，通过MS证实了pSB01892FimHdscG构建体的使用与FimH的成熟起点在F22处融合的mIgK信号序列进行的优选N-末端加工。对于凝集素结构域构建体pSB01878，所述加工被认为是正确的，并且质谱数据支持这一点。

对于天然FimH前导肽，未显示优选N末端加工(即SEQ ID NO:1的F22处的加工)。

pSB01877和pSB01878构建体在pcDNA3.1(+)哺乳动物表达载体中。稀释细胞，随后用于20ml转染。每种构建体使用1ug/ml DNA，并使用Expifectamine方案转染125ml烧瓶中的细胞。72小时后，细胞活力仍然良好，因此允许表达持续到96小时。在72小时时取样，各取10μl在SDS PAGE凝胶上电泳以检查表达。

96小时后，收获条件培养基，在4℃于旋转的条件下，加入0.25ml Nickel Excel树脂和分批结合O/N(batch binding O/N)。在TrisCl pH8.0、NaCl、咪唑中洗脱。参见图4。

pSB01878的预期质量与N端F22一致。糖基化存在于1或2个位点上(N-D的每次脱酰胺作用+1个质量)。

构建糖基化突变体。参见，例如pSB02081、pSB02082、pSB02083、pSB02088和pSB02089。糖基化突变体表达目标多肽。结果参见图5。

还构建了FimH凝集素结构域锁突变体。参见，例如pSB02158。pSB02158构建体的表达结果如图6B所示。

使用0.5皮摩尔缀合有荧光素的氨基苯基-吡喃甘露糖苷(APMP)进行的荧光偏振测定。所述测定在室温下以300RPM进行64小时。结果如图6C所示。

实施例3：FimH/C复合物，pSB01879和pSB01880的哺乳动物表达

为了产生FimH/C复合物，制备了在EF1α启动子下的FimC和具有野生型或mIgK信号肽的FimH的双重表达构建体。将这些克隆到pBudCE4.1哺乳动物表达载体(ThermoFisher)中，并将C-末端His标签添加到FimC中。FimC变体被设计成使用mIgK信号肽进行分泌，因为其导致了基于SignalP分析的产生G37 FimC作为成熟蛋白的第一个残基的阳性预测。

更具体地说，这些构建体被设计成在载体pBudCE4.1中的EF1启动子下具有FimC片段，以及在同一载体中的CMV启动子下插入FimH片段。载体pBudCE4.1是来自Thermo Fisher的表达载体，其具有2个用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。FimC片段插入物(pSB01881插入物)通过用NotI和XhoI消化进行亚克隆，并在相同位点亚克隆到pBudCE4.1载体中。将这些铺在2xYT zeocin 50ug/ml平板上。将菌落接种到含有zeocin 50ug/ml的2xYT中，在37℃生长过夜并制备质粒。用NotI和XhoI消化这些质粒以检查插入物，所有菌落的插入物大小约为722bp。

用HindIII和BamHI消化pSB01881，并用HindIII和BamHI消化pSB01879插入物和pSB01880插入物DNA。将这些片段进行凝胶分离，亚克隆到pSB01881载体中，并铺在2xYTzeo50 ug/ml平板上。将来自每一种的菌落接种到2xYT zeo50ug/ml中，在37℃生长过夜，制备质粒，用NotI和XhoI消化以测试FimC插入物，用HindIII和BamHI消化以测试FimH插入物。所有克隆在两个克隆位点都有预期大小的插入物。pSB01879-1和pSB01880-1克隆随后被用于表达。

已经证明FimH/FimC复合物也在EXPI293细胞中表达。可以通过转换启动子，诸如EF1α,CAG,Ub,Tub或其它启动子来优化表达。

用于信号肽预测的SignalP 4.1(DTU Bioinformatics)的示例性结果如下所示。预计附加的信号肽在成熟FimH多肽或其片段的位置1处产生优选的Phe N-末端。以下仅是4个常见信号序列的代表性样本集。

预测下列信号肽序列在成熟FimH多肽或其片段的位置1处产生优选的Phe N-末端：

表5

没有预测到下列信号肽序列会在成熟FimH多肽或其片段的位置1处产生优选的Phe N-末端：

表6

表7用于预测的SignalP 4.1

实施例4：FimH与FimG肽的供体链互补融合物的哺乳动物表达

测试了几种接头长度。制备了利用这些接头的重组表达，所述接头在野生型FimH和与FimH的F22融合的mIgK信号肽中将FimH与N末端FimG肽融合。

也已显示了FimH供体链互补FimG构建体在EXPI293细胞中具有稳固的表达。

对于供体链互补构建体，寡核苷酸被设计成在pcDNA3.1(+)中产生含有各种接头和FimG肽的基本构建体。根据FimH的SEQ ID NO:1的编号，在G294 V295 T296残基处掺入了独特的BstEII位点。将相同的BstEII位点掺入接头中以产生基本构建体。

构建了pSB01882-01895的基本结构。引物用于用ACCUPRIME PFX DNA聚合酶(Thermo Fisher)PCR扩增pcDNA3.1(+)，用NdeI(在CMV启动子中)和BamHI消化PCR产物，并克隆到用NdeI和BamHI消化的pcDNA3.1(+)中，凝胶分离以除去片段。

用pSB01877,01878,01879,01880,01885和01892以及作为对照的EXPI293细胞进行另一次瞬时转染。

按照制造商的方案，将构建体pSB01882至pSB01895用于来自Thermo Fisher的EXPI293细胞的瞬时转染表达测试。参见图3，其显示了在20mL EXPI293细胞中表达72小时，加载10ul条件培养基后的结果；观察到高水平的表达；FimH/FimC复合物呈现来自pSB01879和pSB01880构建体的以下表达；将20ml条件培养基批次与Nickel Excel结合，40CV洗涤，在咪唑中洗脱。

制备另外的FimH-供体链互补构建体。参见，例如pSB02198,pSB02199,pSB02200,pSB02304,pSB02305,pSB02306,pSB02307,pSB02308构建体。pSB2198 FimH dscG锁突变体构建体的表达如图7所示。pSB2198 FimH dscG锁突变体从瞬时表达中产生12mg/L。

根据Vi-CELL XR 2.04(Beckman Coulter,Inc.)，观察到以下情况(用于表达的实际细胞类型是HEK细胞)：

表8

实施例5：分子量片段与处理过的信号肽

表9

pSB02083

分析	片段21-188	完整蛋白
			长度	168aa	188aa
分子量	18063.42	20290.02m.w.
			1微克＝	55.361皮摩尔	49.285皮摩尔
分子消光系数	24420	35800
			1A(280)准确至：	0.74mg/ml	0.57mg/ml
1mg/ml的A[280]	1.35AU	1.76AU
			等电点	6.81	6.29
pH 7下的电荷	-0.48	-2.47

pSB02198

pSB02307

实施例6：FimH成熟蛋白中的Phe1(根据SEQ ID NO:2的编号)的N-末端α-氨基为D-甘露糖提供关键的极性识别

不受理论或机理的束缚，有人提出刚好在FimH成熟蛋白的Phe1(根据SEQ ID NO:2的编号)之前的正确的信号肽切割对表达功能性FimH蛋白是重要的。N-末端α-氨基处的改变(诸如通过在FimH蛋白的Phe1之前的N-末端处添加氨基酸)可以消除与D-甘露糖的O2-、O5-和O6-原子的氢键相互作用，并引入与D-甘露糖的空间排斥，从而阻断甘露糖结合。我们的实验观察证实了这一点，即在SEQ ID NO:2的Phe1之前添加额外的Gly残基导致没有检测到甘露糖结合。

在分析与D-甘露糖结合的FimH的晶体结构后，观察到以下结果：根据SEQ ID NO:2的编号的FimH的Phe1的N-末端α-氨基以及Asp54的侧链和根据SEQ ID NO:2的编号的FimH的Gln133为D-甘露糖提供关键的极性识别基序，这些极性相互作用的突变和改变导致没有甘露糖结合。

实施例7：FimH中Phe1的侧链不与D-甘露糖直接相互作用，而是埋在FimH的内部，这表明Phe1可以被其它残基例如脂肪族疏水残基(Ile、Leu或Val)取代

与D-甘露糖及其类似物复合的FimH(例如PDB ID：1QUN)的晶体结构的分析表明Phe1(根据SEQ ID NO:2的编号)的侧链不与D-甘露糖直接相互作用，而是通过将其芳环与Val56、Tyr95、Gln133和Phe144(根据SEQ ID NO:2的编号)的侧链堆叠来稳定结合口袋。

代替Phe的替代N-末端残基可以稳定FimH蛋白，容纳甘露糖结合，并允许正确的信号肽切割。此类残基可以通过本领域已知的合适方法，诸如通过视觉检查FimH的晶体结构，或者使用计算蛋白质设计软件进行更加定量的选择来鉴定，所述软件是诸如BioLuminate^TM[BioLuminate,Schrodinger LLC,New York,2017],Discovery Studio^TM[DiscoveryStudio Modeling Environment,Dassault Systèmes,San Diego,2017],MOE^TM[MolecularOperating Environment,Chemical Computing Group Inc.,Montreal,2017]和Rosetta^TM[Rosetta,University of Washington,Seattle,2017]。说明性实例如图9A-图9C所示。替换氨基酸可以是脂肪族疏水氨基酸(例如Ile、Leu和Val)。图11描述了Phe1与具有脂族疏水侧链的其它氨基酸(例如Ile、Leu和Val)的计算诱变扫描，所述其它氨基酸可以稳定FimH蛋白并容纳甘露糖结合。

实施例8：FimH蛋白中根据SEQ ID NO:2编号的Asn7的突变可以去除推定的N-糖基化位点并防止脱酰胺作用，而不影响甘露糖、mAb21或mAb475的结合。

由哺乳动物细胞系过表达分泌的大肠杆菌FimH可在残基Asn7(根据SEQ ID NO:2的编号)处导致N-连接的糖基化。另外，残基Asn7暴露在溶剂中，随后是Gly残基，使其非常易于脱酰胺。

与D-甘露糖及其类似物复合的FimH(例如PDB ID:1QUN)的晶体结构的分析表明Asn7距离甘露糖结合位点超过

并且该位点处的突变不会影响甘露糖结合。因此，Asn7至其它氨基酸(例如Ser、Asp和Gln)的突变可以有效地去除推定的N-糖基化位点并防止脱酰胺作用。

实施例9：大肠杆菌和肠道沙门氏菌(S.enterica)菌株

临床菌株和衍生物列于表10中。其它参考菌株包括：O25K5H1，一种临床O25a血清型菌株；和鼠伤寒沙门氏菌(S.enterica serovar Typhimurium)LT2株。

在大肠杆菌菌株中构建基因敲除，去除靶向的开放阅读框，但留下短的scar序列。

为简单起见，随后将水解的O-抗原链和核心糖表示为O-多糖(OPS)。

实施例10：用于wzzB、fepE和O-抗原基因簇克隆的寡核苷酸引物

表11寡核苷酸引物

表11寡核苷酸引物

实施例11：质粒

质粒载体和亚克隆列于表12中。从纯化的基因组DNA中扩增含有各种大肠杆菌和沙门氏菌wzzB和fepE基因的PCR片段，并将其亚克隆到Invitrogen

Blunt cloning试剂盒中提供的高拷贝数质粒中，图12A-图12B。该质粒基于pUC复制子。引物P3和P4用于扩增具有其天然启动子的大肠杆菌wzzB基因，并且被设计成分别与编码UDP-葡萄糖-6-脱氢酶和磷酸核糖基腺嘌呤核苷酸水解酶的近端和远端基因(在Genbank MG1655 NC_000913.3中注释)中的区域结合。使用前述引物扩增含有沙门氏菌属fepE基因和启动子的PCR片段。基于可获得的Genbank基因组序列或内部产生的全基因组数据(在GAR2401和O25K5H1的情况下)，设计了类似的大肠杆菌fepE引物。低拷贝数质粒pBAD33用于表达在阿拉伯糖启动子控制下的O-抗原生物合成基因。首先改造质粒(表12)以便于克隆(通过Gibson方法)长PCR片段，所述长PCR片段是使用与5’启动子和3’6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(gnd)基因同源的通用引物扩增的。含有O25b生物合成操纵子的pBAD33亚克隆如图12A-图12B所示。

表12质粒

实施例12：O-抗原纯化

用乙酸处理发酵液至终浓度为1-2％(终pH值为4.1)。通过将酸处理的肉汤加热至100℃达2小时来实现OAg的提取和去脂作用。在酸水解结束时，将批料冷却至环境温度，加入14％NH₄OH至终pH为6.1。将中和的肉汤离心，并收集浓缩物。向浓缩物中加入于磷酸钠中的CaCl₂，将所得浆液在室温下孵育30分钟。通过离心除去固体，用10kDa膜将浓缩物浓缩12倍，然后针对水进行两次渗滤。然后使用碳过滤器纯化含有OAg的渗余物。用4.0M硫酸铵以1:1(v/v)稀释碳滤液。硫酸铵的终浓度为2M。用2M硫酸铵作为运行缓冲液，用膜进一步纯化硫酸铵处理的碳滤液。在流过液中收集OAg。对于长OAg，将HIC滤液浓缩，然后使用5kDa膜用水(20个渗体积(diavolume))交换缓冲液。对于短(天然)OAg多糖，进一步减小MWCO以提高产率。

实施例13：O25b长O-抗原与CRM₁₉₇的缀合

使用高碘酸盐氧化产生第一组长链O25b多糖-CRM₁₉₇缀合物，随后使用还原胺化化学(RAC)(表14)进行缀合。通过改变氧化水平而具有三种激活水平(低、中和高)的缀合物变体。使用氰基硼氢化钠作为还原剂，通过使在DMSO培养基中复原的冻干的活化的多糖与冻干的CRM₁₉₇反应，产生缀合物。缀合反应在23℃下进行24小时，然后用硼氢化钠封端3小时。在缀合淬灭步骤后，使用100K MWCO再生的纤维素膜，使用5mM琥珀酸盐/0.9％NaCl，pH6.0，通过超滤/渗滤纯化缀合物。使用0.22μm的膜对缀合物进行最终过滤。

除非另有明确说明，否则在整个以下实施例中公开的缀合物包括核心糖部分。

1.1.异源聚合酶链长度调节剂赋予的长O-抗原表达

最初的大肠杆菌菌株构建集中于O25血清型。目标是过表达异源wzzB或fepE基因，以观察它们是否在O25 wzzB敲除菌株中赋予更长的链长。首先，通过PCR筛选血液分离物以鉴定O25a和O25b亚型的菌株。接下来，筛选菌株对氨苄青霉素的敏感性。鉴定了其中引入了wzzB缺失的单一氨苄青霉素敏感型O25b分离株GAR2401。类似地，在O25a株O25K5H1中产生wzzB缺失。为了这些突变的遗传互补，将来自GAR 2401和O25K5H1的wzzB基因亚克隆到高拷贝PCR-Blunt II克隆性载体中，并通过电穿孔引入两种菌株。类似地克隆和转移来自大肠杆菌K-12和鼠伤寒沙门氏菌LT2的附加的wzzB基因；同样，类似地克隆和转移来自大肠杆菌O25K5H1、GAR 2401、O25a ETEC NR-5、O157:H7:K-和鼠伤寒沙门氏菌LT2的fepE基因。

将细菌在LB培养基中生长过夜，用苯酚提取LPS，通过SDS PAGE(4-12％丙烯酰胺)解析并染色。凝胶的每个孔装载有从相同数量的细菌细胞(大约2OD₆₀₀单位)中提取的LPS。根据内部天然大肠杆菌LPS标准，并通过计数显示宽的链长分布(相差一个重复单元)的样品子集可辨别的梯带，来估计LPS的大小。在图13A的左边，显示了O25a O25K5HΔwzzB的质粒转化体的LPS图谱；右边是O25b GAR 2401ΔwzzB转化体的类似图谱。用O25特异性血清探测的重复凝胶的免疫印迹如图13B所示。

该实验的结果显示，将同源wzzB基因引入大肠杆菌O25aΔwzzB宿主中，恢复了短O25 LPS的表达(10-20倍)，沙门氏菌属LT2 wzzB也是如此。来自GAR2401的O25b wzzB基因的引入并未如此，表明来自该菌株的wzzB酶是有缺陷的。大肠杆菌WzzB氨基酸序列的对比表明A210E和P253S取代可能是原因。值得注意的是，沙门氏菌属LT2 fepE和来自O25aO25K5H1的大肠杆菌fepE赋予了表达非常长的(VL)OAg LPS的能力，其中沙门菌属LT2 fepE导致大小超过了大肠杆菌fepE所赋予的大小的OAg。

对于GAR2401ΔwzzB转化体观察到类似的表达模式：大肠杆菌O25a或K12菌株wzzB恢复了产生短LPS的能力。沙门氏菌属LT2fepE产生最长的LPS，大肠杆菌fepE产生稍短的LPS，而沙门氏菌属LT2 wzzB产生中等大小的长LPS(L)。在用大肠杆菌O25aΔwzzB的转化体进行的单独实验中，评估了其它大肠杆菌fepE基因产生非常长的LPS的能力。来自GAR2401、O25a ETEC株和O157志贺氏菌属毒素产生性菌株的fepE基因也赋予了产生非常长的LPS(但不如用沙门氏菌属LT2 fepE产生的LPS长)的能力(图14)。

在血清型O25a株和O25b株中确定沙门氏菌属LT2 fepE产生所评估的聚合酶调节剂中最长的LPS后，我们接着寻求确定其是否也在其它大肠杆菌血清型中产生非常长的LPS。用沙门氏菌属fepE质粒转化血清型O1、O2、O6、O15和O75的野生型菌血症分离株并提取LPS。图15所示的结果证实了沙门氏菌属fepE能够赋予在与血液感染相关的其它流行血清型中产生非常长的LPS的能力。结果还表明，沙门氏菌属fepE基于质粒的表达似乎超越了这些菌株中内源wzzB通常施加的对链长的控制。

1.2.O-抗原在共同的大肠杆菌宿主菌株中的基于质粒的表达。

从生物工艺开发的角度来看，在共同的大肠杆菌宿主而不是多个菌株中产生不同血清型的O-抗原的能力将大大简化单种抗原的生产。为此，通过PCR扩增来自不同血清型的O-抗原基因簇，并克隆到处于阿拉伯糖调节的启动子控制下的低拷贝数质粒(pBAD33)中。该质粒与大肠杆菌中的沙门氏菌属LT2 fepE质粒相容(可以共存),因为其含有不同的(p15a)复制子和不同的选择标记(氯霉素对比卡那霉素)。在第一实验中，将pBAD33 O25b操纵子质粒亚克隆与沙门氏菌属LT2 fepE质粒共转染到GAR2401ΔwzzB中，并且在0.2％阿拉伯糖存在或不存在的情况下生长转化体。图16A-图16B所示的结果证明了以阿拉伯糖依赖的方式产生了非常长的O-抗原LPS。

类似地评估从其它血清型克隆的o-抗原基因簇，结果如图17所示。沙门氏菌属LT2fepE和pBAD33-OAg质粒的共表达导致可检测的对应于O1、O2(对于四个克隆中的两个)、O16、O21和O75血清型的长链LPS。由于未知的原因，pBAD33-O6质粒在所有四个测试的分离株中未能产生可检测的LPS。尽管表达水平是可变的，但结果表明在共同宿主中表达长链O-抗原是可行的。然而，在一些情况下，可能需要进一步优化(例如通过修饰质粒启动子序列)以提高表达。

来自具有或不具有沙门氏菌属LT2 fepE质粒的不同血清型O25大肠杆菌菌株的LPS的图谱如图18所示。研究了两种菌株的发酵、O-抗原的提取和纯化：GAR2831，用于生产天然短O25b OAg；和GAR2401ΔwzzB/fepE，用于生产长O25b OAg。图18SDS-PAGE凝胶中所示的相应的短和长形式的LPS用红色突出显示。用醋酸直接从发酵的细菌中提取多糖并进行纯化。纯化的短和长或非常长的O25b多糖的尺寸排阻色谱图谱如图19A-图19B所示。将两批短多糖(来自GAR2831)的性质与单种非常长的多糖制剂(来自菌株GAR2401ΔwzzB/fepE)进行比较。长O-抗原的分子量是短O-抗原的3.3倍，重复单元的数量估计为约65(非常长)对比约20。参见表13。

表13

多糖批号	天然的	天然的	经修饰的(长链)
				多糖批号	709766-24A	709722-24B	709766-25A
多糖MW(kDa)	17.3	16.3	55.3
				重复单元数	20	19	64

使用常规还原胺化方法将非常长的O25b O-抗原多糖与白喉类毒素CRM₁₉₇缀合。用不同程度：中度(5.5％)、低度(4.4％)和高度(8.3％)的高碘酸盐活化制备三个不同批次的糖缀合物。所得制剂和未缀合的多糖经显示不含内毒素污染)(表14)。

根据图20A中所示的方案，用10mcg糖缀合物和20mcg QS21佐剂和血清样品(VAC-2017-PRL-EC-0723)分别接种每组四只兔(雌性新西兰白兔)的组。值得注意的是，在评估细菌糖缀合物时，10mcg的剂量是通常给予兔子的范围的低端(20-50mcg是更典型的)。在一项单独的研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中，还使用相同的剂量(10mcg多糖+20mcg Qs21佐剂)和相同的施用方案用未缀合的多糖接种一组兔子。

在LUMINEX测定中评估了兔子对三种O25b糖缀合物制剂的抗体反应，在所述LUMINEX测定中羧基珠粒包被有预先与未缀合的O25b长多糖结合的甲基化的人血清白蛋白。用藻红蛋白(PE)标记的抗IgG二抗检测血清样品中O25b特异性IgG抗体的存在。第0周(免疫前)、第6周(第2次给药后，PD2)、第8周(第3次给药后，PD3)和第12周(第4次给药后，PD4)在反应最好的兔子(每组4只中的1只)取样的血清中观察到的免疫反应曲线如图21A-图21C所示。在12只兔子的任一只中没有检测到显著的免疫前血清IgG滴度。相反，在所有三个组的兔子的接种后血清中检测到O25b抗原特异性抗体反应，低度活化糖缀合物组的反应倾向于略高于中度或高度活化糖缀合物组。在给药后3个时间点观察到最大反应。低度活化组中的一只兔子和高度活化组中的一只兔子对疫苗接种没有反应(无应答者)。

为了评估CRM₁₉₇载体蛋白缀合对长O25b OAg多糖的免疫原性的影响，将接种了未缀合多糖的兔血清中抗体的存在与接种了低度活化CRM₁₉₇糖缀合物的兔血清中抗体的存在进行了比较，图22A-图22F。值得注意的是，游离多糖没有免疫原性，在免疫血清对比免疫前血清中几乎没有引起IgG反应(图22A)。相比之下，在一系列血清稀释度(从1:100到1:6400)上，在来自四只接种了O25b OAg-CRM₁₉₇的兔子中的三只的PD4血清中，观察到O25b OAg-特异性IgG平均荧光强度值(MFI)比免疫前血清水平高大约十倍。这些结果证明了在10mcg剂量水平下，运载体蛋白缀合以产生针对O25b OAg多糖的IgG抗体的必要性。

将TSA平板上生长的细菌悬浮在PBS中，调节至OD₆₀₀为2.0，并固定在4％的于PBS中的多聚甲醛中。在4％BSA/PBS中封闭1h后，将细菌与在2％BSA/PBS中的免疫前和PD3免疫血清的系列稀释液一起孵育，并用PE标记的第二F(ab)抗体检测结合的IgG。

O25b OAg-CRM₁₉₇引发的O25b抗体的特异性在利用完整细菌的流式细胞术实验中得到证实。在Accuri流式细胞仪中用缀合有PE的F(ab')₂片段山羊抗兔IgG检测IgG与完整细胞的结合。

如图23A-图23C所示，免疫前的兔抗体不能与野生型血清型O25b分离株GAR2831和GAR2401或与K-12大肠杆菌菌株结合，然而匹配的PD3抗体以浓度依赖的方式对O25b细菌染色。缺乏表达OAg能力的阴性对照K-12株仅显示非常弱的PD3抗体结合，最可能是由于在其表面上存在暴露的内核寡糖表位。将沙门氏菌属fepE质粒引入野生型O25b分离株导致显著增强的染色，这与较长OAg多糖提供的免疫原性表位的较高密度一致。

结论：所述结果表明，沙门氏菌属fepE不仅是沙门氏菌属物种中非常长的O-抗原多糖的决定簇，而且其还能赋予不同O-抗原血清型的大肠杆菌菌株产生非常长的OAg的能力。通过促进纯化和与适当的运载体蛋白的化学缀合，以及通过潜在地增强免疫原性(通过形成更高分子量的复合物)，可以利用这种特性来生产具有用于生物工艺开发的改进特性的O-抗原疫苗多糖。

实施例14：最初的兔子研究产生了针对RAC O25b OAg-CRM₁₉₇的第一多克隆抗体试剂和IgG反应

使用高碘酸盐氧化，然后使用还原胺化化学(RAC)进行缀合来产生长链O25b多糖-CRM₁₉₇缀合物(表14)。另请参见表24。

表14

在兔子研究1(VAC-2017-PRL-EC-0723)(也在上文实施例13中描述的)-五(5)只兔子/组中，按照图20A所示的时间表接受具有10ug L-、M-或H-活化RAC(+QS21)的组合物。在随访兔子研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中观察到未缀合的游离O25b多糖没有免疫原性(参见图25)。

在兔子研究2(VAC-2018-PRL-EC-077)-2只兔子/组中，按照图20B所示的时间表接受具有L-RAC(AlOH₃、QS21或无佐剂)的组合物。

兔子4-1、4-2、5-1、5-2、6-1和6-2接受实施例13中所述的非常长的未缀合的O25b多糖，并测试第18周的血清。

更具体地，向兔子4-1施用了包含50ug未缀合的O25b、100ug AlOH₃佐剂的组合物。向兔子4-2施用了包含50ug未缀合的O25b、100ug AlOH₃佐剂的组合物。向兔子5-1施用了包含50ug未缀合的O25b、50ug QS-21佐剂的组合物。向兔子5-2施用了包含50ug未缀合的O25b、50ug QS-21佐剂的组合物。向兔子6-1施用了包含50ug未缀合的O25b、无佐剂的组合物。向兔子6-2施用了包含50ug未缀合的O25b、无佐剂的组合物。

实施例15：用O25b RAC缀合物进行的兔子研究：dLIA血清稀释滴度

兔子研究2(VAC-2018-PRL-EC-077)O25b dLIA血清稀释滴试对比来自研究1(VAC-2017-PRL-EC-0723)的反应最佳的兔子。对于这些实验，实施了改进的直接结合Luminex分析，其中将O25b长O-抗原的聚赖氨酸缀合物被动吸附到Luminex羧基珠上而不是前述的甲基化血清白蛋白长O-抗原混合物上。聚赖氨酸-O25b缀合物的使用提高了测定的灵敏度和IgG浓度依赖性反应的质量，从而允许通过使用曲线拟合(四参数非线性方程)来确定血清稀释度。将来自第一项研究的最高滴度兔子的血清中的O25b IgG滴度与表15中的第二项研究兔子的血清中的O25b IgG滴度进行比较。

表15

第二项兔子研究中的较高剂量(50/20ug对比10ug)没有提高IgG滴度。

两个月的休息增强了IgG反应(间隔时间较短时未观察到)。

与QS21或无佐剂相比，明矾似乎增强了兔子的IgG反应。

建立了利用幼兔补体(BRC)和HL60细胞(作为中性粒细胞来源)的调理吞噬测定(OPA)，以测量O-抗原糖缀合物的功能性免疫原性。将大肠杆菌GAR2831的预冷冻细菌原液在37℃下于Luria肉汤(LB)培养基中生长。将细胞沉淀并悬浮在补充有20％甘油的PBS中至浓度为1OD₆₀₀单位/ml，并冷冻。在U型底组织培养微量板中，将预先滴定的解冻细菌在含有1％明胶的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)中稀释到0.5X 10⁵CFU/ml，并将10μL(10³CFU)与20μL系列稀释的血清合并，并在5％CO₂培养箱中，在37℃下将混合物在BELLCO振荡器上以700rpm振荡30min。将10μL 2.5％补体(在HBG中预稀释的幼免血清、PEL-FREEZ 31061–3)和20μLHL-60细胞(0.75X10⁷/ml)以及40μL HBG加入到U型底组织培养微量板中，并在5％CO₂培养箱中，在37℃下将混合物在BELLCO振荡器上以700rpm振荡45min。随后，将每种100μL反应物的10μL转移到预先润湿的MILLIPORE MULTICRENHTS Hv滤板的相应孔中，所述滤板是通过施加100μL水、过滤抽真空并施加150μL的50％LB而制备的。将滤板真空过滤，并在5％CO₂培养箱中于37℃培养过夜。第二天，在固定、在用考马斯染料染色以及用脱色溶液脱色后，使用

分析仪和IMMUNOCAPTURE软件计数菌落。为了确定OPA活性的特异性，在OPA反应中与其它测定组分混合之前，用100μg/mL纯化的长O25b O-抗原预孵育免疫血清。OPA测定包括无HL60细胞或补体的对照反应，以证明任何观察到的杀伤对这些组分的依赖性。

在测定中评估了来自两项兔子研究的代表性兔子的匹配的免疫前和接种后血清样品，并测定了血清稀释滴度(表16，图26A-图26B)。利用未缀合的O25b长O-抗原多糖的预孵育阻断了杀菌活性，证明了OPA的特异性(图19C)。表16OPA滴度

兔子2-3按如下给药：兔子2-3给药：10/10/10/10ug RAC缀合物+Qs21，第4次给药后(PD)放血。兔子1-2按如下给药：50/20/20/20ug RAC缀合物+Al(OH)₃，PD4放血。

实施例16：由未缀合的O25b长O-抗原多糖和衍生的O25b RAC/DMSO长O-抗原糖缀合物诱发的O-抗原O25b IgG水平。

在第0、5和13周，通过皮下注射给10只CD-1小鼠的组施用0.2或2.0μg/动物的O25bRAC/DMSO长O-抗原糖缀合物，在第3周(第1次给药后，PD1)、第6周(第2次给药后，PD2)和第13周(第3次给药后，PD3)时间点取血用于免疫原性测试。用O25b-特异性小鼠mAb作为内标，通过定量Luminex测定法(参见实施例15中的细节)测定抗原特异性IgG的水平。测定从20倍随机选择的未接种小鼠合并的血清中的基线IgG水平(虚线)。游离的未缀合的O25b长O-抗原多糖免疫原在任何时间点都未诱导高于基线水平的IgG。相比之下，在两次剂量的O25b-CRM₁₉₇ RAC长缀合物糖缀合物后观察到IgG反应：在PD3观察到强劲的一致IgG反应，在PD2观察到中等和更可变的IgG水平。GMT IgG值(ng/ml)用95％CI误差条柱表示。参见图27A-图27C。

实施例17：O25b幼兔补体(BRC)OPA的特异性。

A-B)来自兔子2-3和1-2的O25b RAC/DMSO长O-抗原免疫后血清(但非匹配的免疫前对照血清)显示出杀菌OPA活性。C)通过用100μg/mL长O-抗原O25b多糖预孵育，阻断了来自兔子1-2的免疫血清的OPA活性。将菌株GAR2831细菌与HL60、2.5％BRC和血清系列稀释液在37℃孵育1h，并通过计数过滤板的小菌落(CFU)来计数存活的细菌。参见图26A-图26C。

实施例18：RAC和eTEC O25b长糖缀合物比单端糖缀合物更具免疫原性。

用抗碳青霉烯耐氟喹酮MDR菌株Atlas187913进行BRC OPA测定。20只CD-1小鼠为一组，按照与图28A-图28B所示的相同时间表接种2μg糖缀合物，并在第2次给药后(PD2)(图28A)和第3次给药后(PD3)(图28B)时间点测定OPA反应。条柱表示具有95％CI的GMT。指示高于未接种基线的无应答者比率。使用带有Welch校正的未配对t检验(Graphpad Prism)评估不同组的对数转换数据，以评估差异是否具有统计学显著性。结果概述于表17中。参见图28A-图28B。在用2μg的eTEC O1a长糖缀合物接种的小鼠中，观察到针对O1a、PD2和PD3的OPA滴度(数据未显示)分别高于针对O25b、PD2和PD3的OPA滴度，如表17所示。

表17

实施例19：eTEC化学的OPA免疫原性可以通过改变多糖活化水平来改善。

用抗碳青霉烯耐氟喹酮MDR菌株Atlas187913进行BRC OPA测定。用0.2μg或2μg指示的长O25b eTEC糖缀合物接种20只CD-1小鼠的组，并在PD2时间测定OPA反应。使用带有Welch校正的未配对t检验(Graphpad Prism)，对来自4％活化组对比17％活化组的聚集对数转换数据(Aggregated log transformed data)进行评估，以确认OPA反应的差异具有统计学显著性。表18中概述了各组的GMT和应答者比率。参见图29。

表18

说明	应答者％(n/N)	几何平均滴度
			eTEC长4％活化(0.2μg)	35(7/20)	628
eTEC长4％活化(0.2μg)	65(13/20)	8,185
			eTEC长10％活化(0.2μg)	45(9/20)	1,085
eTEC长10％活化(0.2μg)	90(18/20)	27,368
			eTEC长17％活化(0.2μg)	70(14/20)	3,734
eTEC长17％活化(0.2μg)	80(16/20)	25,461

实施例20：攻击研究表明，长大肠杆菌O25b eTEC缀合物在三剂后引发保护。

用1x 10⁹个菌株GAR2831的细菌IP攻击按照所示时间表用2μg的剂量免疫的20xCD-1小鼠的组。监测随后的存活率，持续六天。用以4％、10％或17％水平活化的eTEC糖缀合物接种的小鼠组免于致命感染，而未接种的对照小鼠或用2μg未缀合的O25b长多糖接种的小鼠则未免疫致命感染。参见图30A-图30B。

实施例21：制备eTEC连接的糖缀合物的方法

糖的活化和胱胺二盐酸盐的硫醇化。将糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中复原。通过Karl Fischer(KF)分析测定溶液的水分含量，并调节至水分含量为0.1-1.0％，通常为0.5％。

为了启动活化，在DMSO中新鲜制备浓度为100mg/mL的1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或1,1’-羰基二咪唑(CDI)溶液。糖用不同量的CDT/CDI(1-10摩尔当量)活化，使反应在室温或35℃下进行1-5小时。加入水以淬灭活化反应溶液中任何残留的CDI/CDT。进行计算以确定水的添加量，并允许最终含水量为总含水量的2-3％。使反应在室温下进行0.5小时。在无水DMSO中新鲜制备浓度为50mg/mL的胱胺二盐酸盐。使活化的糖与1-2摩尔当量的胱胺二盐酸盐反应。或者，使活化的糖与1-2摩尔当量的半胱胺盐酸盐反应。使硫醇化反应在室温进行5-20小时，以产生硫醇化糖。硫醇化水平由CDT/CDI的加入量决定。

活化的硫醇化糖的还原和纯化。向硫醇化糖反应混合物中加入3-6摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液，并允许在室温下进行3-5小时。然后通过加入预冷的10mM磷酸二氢钠将反应混合物稀释5-10倍，并通过5μm过滤器进行过滤。针对30-40倍渗体积的预冷的10mM磷酸二氢钠进行硫醇化糖的渗滤。取出活化的硫醇化糖残余物的等分试样以确定糖浓度和硫醇含量(Ellman)测定。

溴乙酰化运载体蛋白的活化和纯化。运载体蛋白的游离氨基通过与溴乙酰化剂诸如溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)、溴乙酰基溴或另一种合适的试剂反应而被溴乙酰化。

活化前，首先将运载体蛋白(于0.1M磷酸钠，pH 8.0±0.2中)保持在8±3℃，pH约为7。以0.25–0.5的BAANS:蛋白质(w/w)比例向蛋白质溶液中加入作为储备二甲基亚砜(DMSO)溶液的溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)(20mg/mL)。将反应在5±3℃下轻轻混合30-60分钟。例如，使用10mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液，通过使用10kDa MWCO膜的超滤/渗滤来纯化所得溴乙酰化的(活化的)蛋白质。纯化后，溴乙酰化运载体蛋白的蛋白浓度通过Lowry蛋白测定进行估计。

活化程度通过利用离子交换液相色谱结合抑制型电导检测(suppressedconductivity detection)(离子色谱)进行的总溴化物测定来确定。将活化的溴乙酰化蛋白质上结合的溴化物在测定样品制备中从蛋白质上切割下来，并与可能存在的任何游离溴化物一起进行定量。通过在碱性2-巯基乙醇中加热样品，将蛋白质上任何剩余的共价结合的溴转化为离子溴化物而释放出来。

溴乙酰化CRM₁₉₇的活化和纯化。用10mM磷酸盐缓冲的0.9％NaCl pH 7(PBS)将CRM₁₉₇稀释至5mg/mL，然后用1M储备溶液配制成0.1M NaHCO₃ pH 7.0。使用20mg/mL DMSO的BAANS储备溶液以1:0.35(w:w)的CRM₁₉₇:BAANS比例添加BAANS。将反应混合物在3℃与11℃之间孵育30min至1小时，然后使用10K MWCO膜和10mM磷酸钠/0.9％NaCl,pH 7.0通过超滤/渗滤进行纯化。通过Lowry测定法测定纯化的活化CRM₁₉₇以确定蛋白质浓度，然后用PBS稀释至5mg/mL。加入5％wt/vol的蔗糖作为冷冻保护剂，将活化的蛋白冷冻并于-25℃下储存直至需要缀合。

CRM₁₉₇的赖氨酸残基的溴乙酰化非常一致，导致从39个可用的赖氨酸中活化15至25个赖氨酸。所述反应产生了高产量的活性的蛋白质。

活化的硫醇化糖与溴乙酰化运载体蛋白的缀合。随后加入溴乙酰化运载体蛋白和活化的硫醇化糖。糖/蛋白质输入比为0.8±0.2。用1M NaOH溶液将反应pH调节至9.0±0.1。使结合反应在5℃下进行20±4小时。

残留反应性官能团的封端。通过与2摩尔当量的作为封端剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃下反应3-5小时来淬灭运载体蛋白上未反应的溴乙酰化残基。用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)在5℃下对残留的游离巯基进行封端，持续20-24小时。

eTEC连接的糖缀合物的纯化。将缀合反应(IAA封端后)混合物通过0.45μm过滤器过滤。糖缀合物的超滤/渗滤用5mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0进行。然后将糖缀合物残余物通过0.2μm过滤器过滤。取出糖缀合物的等分试样用于测定。将剩余的糖缀合物于5℃下储存。参见表21、表22、表23、表24和表25。

实施例22：大肠杆菌-O25B ETEC结合物的制备

活化过程-大肠杆菌-O25b脂多糖的活化。在无水二甲基亚砜(DMSO)中复原冻干的大肠杆菌O25b多糖。通过Karl Fischer(KF)分析测定了冻干的O25b/DMSO溶液的水分含量。通过向O25b/DMSO溶液中加入WFI来调节水分含量，使水分含量达到0.5％。

为了启动活化，在DMSO溶液中新鲜制备100mg/mL的1,1’-羰基二咪唑(CDI)。在硫醇化步骤之前，用不同量的CDI活化大肠杆菌-O25b多糖。在室温或35℃下进行CDI活化1-3小时。加入水以淬灭活化反应溶液中的任何残留的CDI。进行计算以确定水的添加量，并允许最终含水量为总含水量的2-3％。使反应在室温下进行0.5小时。

活化的大肠杆菌O25b多糖的硫醇化。在无水DMSO中新鲜制备半胱胺二盐酸盐，并向活化的多糖反应溶液中加入1-2摩尔当量的半胱胺二盐酸盐。使反应在室温下进行20±4小时。

活化的巯基化大肠杆菌-O25b多糖的还原与纯化。向硫醇化的糖反应混合物中加入3-6摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液，并使其在室温下进行3-5小时。然后通过加入预冷的10mM磷酸二氢钠将反应混合物稀释5-10倍，并通过5μm过滤器进行过滤。用5KMWCO超滤膜盒对40倍渗体积的预冷的10mM磷酸二氢钠进行硫醇化糖的渗滤。取出硫醇化O25b多糖残余物用于糖浓度和硫醇(Ellman)测定。图32A中提供了活化过程的流程图。

缀合过程-硫醇化大肠杆菌-O25b多糖与溴乙酰化CRM₁₉₇的缀合。如实施例21中所述，通过溴乙酰化单独活化CRM₁₉₇运载体蛋白，然后将其与活化的大肠杆菌-O25b多糖反应以进行缀合反应。将溴乙酰化CRM₁₉₇和硫醇化O25b多糖在反应容器中混合在一起。糖/蛋白质输入比为0.8±0.2。将反应pH调节至8.0–10.0。使缀合反应在5℃下进行20±4小时。

溴乙酰化CRM₁₉₇和硫醇化大肠杆菌-O25b多糖上反应基团的封端。通过将CRM₁₉₇蛋白上未反应的溴乙酰化残基与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃下反应3-5小时，随后用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)在5℃下对硫醇化O25b-多糖的任何残留的游离巯基封端20-24小时，来对所述CRM₁₉₇蛋白上未反应的溴乙酰化残基进行封端。

eTEC连接的大肠杆菌-O25b糖缀合物的纯化。将缀合溶液通过0.45μm或5μm过滤器进行过滤。用100K MWCO超滤膜盒进行O25b糖缀合物的渗滤。渗滤是针对5mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH6.0进行的。然后将大肠杆菌-O25b糖缀合物100K残余物通过0.22μm过滤器进行过滤，并于5℃下储存。

图32B中提供了缀合过程的流程图。

结果

几个批次的大肠杆菌-O25b eTEC糖缀合物的反应参数和表征数据如表19所示。利用胱胺二盐酸盐进行的CDI活化-硫醇化产生了糖产率为41至92％且游离糖<5至14％的糖缀合物。另请参见表21、表22、表23、表24和表25。

表19大肠杆菌-O25b eTEC缀合物的实验参数和表征数据

实施例23：大肠杆菌O-抗原多糖-CRM₁₉₇ eTEC缀合物的制备方法(适用于大肠杆菌血清型O25b、O1a、O2和O6的O-抗原)

多糖的活化。

将大肠杆菌O-抗原多糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中复原。为了启动活化，向多糖溶液中加入不同量的1,1’-羰基二咪唑(CDI)(1-10摩尔当量)，并使反应在室温或35℃下进行1-5小时。然后，加入水(2-3％，v/v)以淬灭活化反应溶液中任何残留的CDI。在使反应在室温下进行0.5小时后，加入1-2摩尔当量的胱胺二盐酸盐。使反应在室温下进行5-20小时，然后用3-6摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理以产生硫醇化糖。硫醇化水平由CDI的加入量决定。

然后通过加入预冷的10mM磷酸二氢钠将反应混合物稀释5-10倍，并通过5μm过滤器进行过滤。对30-40倍透析渗体积的预冷的10mM磷酸二氢钠进行硫醇化糖的渗滤。取出活化的硫醇化糖残余物的等分试样以确定糖浓度和硫醇含量(Ellman)测定。

运载体蛋白(CRM₁₉₇)的活化

在活化之前，首先将CRM₁₉₇(于0.1M磷酸钠，pH 8.0±0.2中)保持在8±3℃，pH约为8。以0.25–0.5的BAANS:蛋白质(w/w)比例向蛋白质溶液中加入作为储备二甲基亚砜(DMSO)溶液的溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)(20mg/mL)。将反应在5±3℃下轻轻混合30-60分钟。例如，使用10mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液，通过使用10kDa MWCO膜的超滤/渗滤来纯化所得溴乙酰化的(活化的)蛋白质。纯化后，溴乙酰化运载体蛋白的蛋白浓度通过Lowry蛋白测定进行估计。

缀合

随后将活化的CRM₁₉₇和活化的大肠杆菌O-抗原多糖加入到反应器中并混合。糖/蛋白质输入比为1±0.2。用1M NaOH溶液将反应pH调节至9.0±0.1。使结合反应在5℃下进行20±4小时。通过与2摩尔当量的作为封端剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃下反应3-5小时来淬灭运载体蛋白上未反应的溴乙酰化残基。用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)在5℃下对残留的游离巯基进行封端，持续20-24小时。然后，使用针对5mM琥珀酸盐-0.9％盐水，pH 6.0进行的超滤/渗滤来纯化掇应混合物。然后将纯化的缀合物通过0.2μm过滤器进行过滤。参见表21、表22、表23、表24和表25。

实施例24：一般方法-通过还原胺化化学(RAC)进行的O-抗原(来自大肠杆菌血清型O1、O2、O6、25b)多糖的缀合

二甲基亚砜(RAC/DMSO)中的缀合

活化多糖

通过依次加入计算量的500mM磷酸钠缓冲剂(pH 6.0)和注射用水(WFI)以得到2.0g/L的最终多糖浓度，在100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0±0.2)中进行多糖氧化。如果需要，将反应pH调节至大约pH 6.0。pH调节后，将反应温度冷却至4℃。通过加入约0.09-0.13摩尔当量的高碘酸钠引发氧化。将氧化反应在5±3℃下进行大约20±4小时。

使用5K MWCO超滤盒对活化的多糖进行浓缩和渗滤。针对20倍透析滤体积的WFI进行渗滤。然后将纯化的活化的多糖在5±3℃下储存。纯化的活化的糖的特征尤其在于：(i)通过比色测定测量的糖浓度；(ii)通过比色测定法测量的醛浓度；(iii)氧化程度；和(iv)通过SEC-MALLS测量的分子量。

将活化的多糖与蔗糖赋形剂复合，并冷冻干燥

将活化的多糖与蔗糖以25克蔗糖/克活化的多糖的比例混合。然后将该瓶复合混合物冻干。冻干后，将含有冻干的活化的多糖的瓶子于-20±5℃下储存。将计算量的CRM₁₉₇蛋白壳冻(shell-frozen)并分别冻干。在-20±5℃下储存冻干的CRM₁₉₇。

使冻干的活化的多糖和运载体蛋白复原

在无水二甲基亚砜(DMSO)中复原冻干的活化的多糖。多糖完全溶解后，向冻干的CRM₁₉₇中加入等量的无水DMSO用于重构。

缀合和封端

在反应容器中将复原的活化的多糖与复原的CRM₁₉₇组合，随后彻底混合以获得澄清溶液，然后启始与氰基硼氢化钠的缀合。反应溶液中的最终的多糖浓度约为1g/L。通过向反应混合物中添加0.5–2.0Meq的氰基硼氢化钠，并在23±2℃下孵育20-48小时来启动缀合。通过加入2MEq的硼氢化钠(NaBH₄)以对未反应的醛进行封端来终止缀合反应。在23±2℃下继续该封端反应，持续3±1小时。

纯化缀合物

用冷却的5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)以1:10稀释缀合物溶液，以准备使用100-300K MWCO膜通过切向流过滤进行纯化。将稀释的缀合物溶液通过5μm过滤器，并使用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH 6.0)作为介质进行渗滤。渗滤完成后，将缀合物残余物转移通过0.22μm过滤器。用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH 6)进一步稀释缀合物，以达到大约0.5mg/mL的目标糖浓度。或者，通过使用100-300K MWCO膜的切向流过滤，使用20mM组氨酸-0.9％盐水(pH6.5)纯化缀合物。完成最后的0.22μm过滤步骤以获得免疫原性缀合物。参见表21、表22、表23、表24和表25。

实施例25：水性缓冲液(RAC/水性)中的缀合，适用于大肠杆菌血清型O25B、O1A、O2和O6

以与基于DMSO的缀合相同的方式进行多糖活化和渗滤。

根据血清型，以在0.4至2w/w的范围内的多糖与蛋白质的质量比将过滤的活化的糖与CRM₁₉₇混合。选择该输入比率以控制所得缀合物中多糖与CRM₁₉₇的比率。

然后将混合的混合物冻干。缀合后，将多糖和蛋白质混合物溶解在0.1M磷酸钠缓冲液中，根据血清型，多糖浓度在5至25g/L的范围内，根据血清型，将pH调节在6.0至8.0之间。通过向反应混合物中加入0.5–2.0Meq的氰基硼氢化钠，并在23±2℃下孵育20-48小时来启动缀合。通过加入1-2MEq的硼氢化钠(NaBH₄)以对未反应的醛进行封端来终止缀合反应。

或者，将过滤的活化的糖和计算量的CRM₁₉₇蛋白进行壳冻并分别冻干，然后在溶解于0.1M磷酸钠缓冲液中后合并，然后可以如上所述进行随后的缀合。

表20概述了来自在DMSO和水性缓冲液中制备的缀联物的结果

	RAC/DMSO	RAC/水性
			多糖MW(kDa)	48K	46K
氧化程度(DO)	12	12
			糖/蛋白质比率	0.8	1.0
游离糖％	<5％	32％
			通过SEC-MALLS测得的缀合物MW，kDa	7950	260

实施例26：大肠杆菌O-抗原多糖-CRM₁₉₇单端缀合物的制备方法

脂多糖(LPS)是革兰阴性细菌外膜的常见成分，包括脂质A、核心区和O-抗原(也称为O-特异性多糖或O-多糖)。不同血清型的O-抗原重复单元在其组成、结构和血清学特征上不同。本发明中使用的O-抗原附着于核心结构域，该结构域在其链末端含有称为2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)的糖单元。不同于一些基于多糖链的随机活化的缀合方法(例如用高碘酸钠或碳化二亚胺活化)。本发明公开了一种缀合方法，其包括在暴露硫醇官能团后，用二硫胺接头选择性活化KDO，然后将其与溴活化的CRM₁₉₇蛋白缀合，如图31所示(单端缀合物的制备)。

基于胱胺接头的缀合(A1)

将O-抗原多糖和胱胺(50-250摩尔当量的KDO)在磷酸盐缓冲液中混合，将pH值调节至6.0-7.0。向混合物中加入氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)(5-30摩尔当量的KDO)并将混合物在37℃搅拌48-72小时。冷却至室温并用等体积的磷酸盐缓冲液稀释后，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(加入1.2摩尔当量的胱胺)处理混合物。然后通过使用5KDa MWCO膜针对10mM磷酸二氢钠溶液进行渗滤来纯化混合物，以提供含有硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可以通过Ellman测定来确定。

然后通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白以0.5-2.0的比例混合来进行缀合。用1M NaOH溶液将反应混合物的pH调节至8.0-10.0。将缀合反应在5℃下进行24±4小时。通过将运载体蛋白上未反应的溴残基与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃下反应3-5小时来淬灭所述未反应的溴残基。然后加入3摩尔当量的碘乙酰胺(与加入的N-乙酰基-L-半胱氨酸相关)以将残留的游离巯基封端。将该封端反应在5℃下再进行3-5小时，并且通过加入1M NaOH将两个封端步骤的pH保持在8.0-10.0。在使用30KDa MWCO膜针对5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)进行超滤/渗滤后，获得所得缀合物。参见表21、表22、表23、表24和表25。

实施例27：基于3,3’-二硫代双(丙酸二酰肼)接头的缀合(A4)

将O-抗原多糖和3,3’-二硫代双(丙酸二酰肼)(5-50摩尔当量的KDO)在乙酸盐缓冲液中混合，将pH调节至4.5-5.5。向混合物中加入氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)(5-30摩尔当量的KDO)并将混合物在23-37℃下搅拌24-72小时。然后用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(加入1.2摩尔当量的3,3’-二硫代双(丙酸二酰肼)接头)处理混合物。然后通过使用5KDa MWCO膜针对10mM磷酸二氢钠溶液进行渗滤来纯化混合物，以提供含有硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可以通过Ellman测定来确定。

然后通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白以0.5-2.0的比例混合来进行缀合。用1M NaOH溶液将反应混合物的pH调节至8.0-10.0。将缀合反应在5℃下进行24±4小时。通过将运载体蛋白上未反应的溴残基与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃下反应3-5小时来淬灭所述未反应的溴残基。然后加入3摩尔当量的碘乙酰胺(与加入的N-乙酰基-L-半胱氨酸相关)以将残留的游离巯基封端。将该封端反应在5℃下再进行3-5小时，并且通过加入1M NaOH将两个封端步骤的pH保持在8.0-10.0。在使用30KDa MWCO膜针对5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)进行超滤/渗滤后，获得所得缀合物。

实施例28：基于2,2’-二硫代-N,N’-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(氨基氧基)乙酰胺)接头的缀合(A6)

将O-抗原多糖与2,2’-二硫代-N,N’-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(氨基氧基)乙酰胺)(5-50摩尔当量的KDO)在乙酸盐缓冲液中混合，将pH调节至4.5-5.5。然后将混合物在23-37℃下搅拌24-72小时，随后加入氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)(5-30摩尔当量的KDO)并将混合物再搅拌3-24小时。然后用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(加入1.2摩尔当量的接头)处理所述混合物。然后通过使用5KDa MWCO膜针对10mM磷酸二氢钠溶液进行渗滤来纯化混合物，以提供含有硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可以通过Ellman测定来确定。

实施例29：溴活化的CRM₁₉₇的制备

CRM₁₉₇在0.1M磷酸钠(pH 8.0±0.2)溶液中制备，并冷却至5±3℃。以0.25–0.5的BAANS:蛋白质(w/w)比例向蛋白质溶液中加入作为储备二甲基亚砜(DMSO)溶液的溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)(20mg/mL)。将反应在5±3℃下轻轻混合30-60分钟。例如，使用10mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液，通过使用10kDa MWCO膜的超滤/渗滤来纯化所得溴乙酰化的(活化的)蛋白质。纯化后，溴乙酰化运载体蛋白的蛋白浓度通过Lowry蛋白测定进行估计。

表21:O1a缀合物

表22O2缀合物

表23O6缀合物

表24O25b缀合物

表25O25b K-12缀合物

实施例29：大肠杆菌O-Ag-TT缀合物的制备

将50mg冻干的大肠杆菌血清型O25b长多糖(批号709766-30)(约6.92mg/mL，MW：约39kDa)用于破伤风类毒素(TT)缀合。

将大肠杆菌血清型O1a长多糖710958-142-3(约6.3mg/mL，MW：约44.3kDa)(50mg,7.94mL)冻干。

将大肠杆菌血清型O6长多糖710758-121-1(约16.8mg/mL，MW：约44kDa)(50mg,2.98mL)冻干。

将上文所列的每种冻干多糖溶解在WFI中，使其浓度大约为5-10mg/mL，加入0.5mL(100mg(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)在1mL乙腈中的溶液)并在室温下搅拌。加入三乙胺(TEA)0.2M(2mL)并在室温下搅拌。

破伤风类毒素(TT)的制备：将TT(100mg,47ml)浓缩至约20mL，使用过滤管用盐水(2x50mL)洗涤两次。然后用HEPES和盐水稀释其，使最终HEPES浓度约为0.25M。

如上所述制备TT，并将反应的pH调节至约9.1-9.2。室温下搅拌反应混合物

20-24小时后，用甘氨酸(0.5mL)淬灭反应。之后，使用MWCO再生纤维素膜将其浓缩，并对盐水进行渗滤。过滤和分析。参见表26。

表26示例性实施方案：

实施例30：O-抗原发酵、纯化和缀合的其它结果

下文描述的示例性方法通常适用于所有大肠杆菌血清型。每种多糖的生产包括分批生产发酵，然后在下游纯化之前进行化学灭活。

菌株和储存。用于短链O-抗原生物合成的菌株是大肠杆菌的临床野生型菌株。长链O-抗原是用短链生产菌的衍生物生产的，所述短链生产菌已通过Wanner-Datsenko方法改造，具有天然wzzb基因的缺失，并由来自沙门氏菌属的“长链”延伸者功能fepE补足。fepE功能由其在基于colE1的高拷贝“topo”载体或已从其删除了T7启动子区域的基于colE1的载体pET30a的低拷贝衍生物上的天然启动子表达。

通过在无动物LB或基本培养基中培养细胞至至少3.0的OD₆₀₀来制备细胞库。然后将肉汤稀释在新鲜培养基中，并与80％甘油混合，以获得具有2.0OD₆₀₀/mL的20％甘油终浓度。

用于种子培养和发酵的培养基。所用的种子和发酵培养基共享以下配方：KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

种子和发酵条件。从单个种子小瓶中以0.1％接种种子。将种子瓶(seed flask)在37℃下孵育16-18小时，通常达到10-20OD₆₀₀/mL。

在10L不锈钢原位蒸汽发酵罐中进行发酵。

发酵罐的接种通常是从10OD₆₀₀开始的1:1000。分批阶段，即在10g/L分批葡萄糖上生长进行的时期，通常持续8小时。葡萄糖耗尽时，溶解氧突然上升，此时葡萄糖被加入发酵中。然后发酵通常进行16-18小时，收获量>120OD₆₀₀/mL。

血清型O1a、O2、O6和O25b的短/长链O-抗原产生的初步评估。将O1a、O2、O6和O25b的野生型菌株在补充的基本培养基中以分批模式发酵至OD₆₀₀＝15-20。在葡萄糖耗尽时，导致氧消耗的突然减少，从葡萄糖溶液中应用生长限制性葡萄糖进料16-18小时。达到124-145OD₆₀₀单位/mL的细胞密度。随后将收获肉汤的pH调节至约3.8，并加热至95℃持续2小时。然后将水解的肉汤冷却至25℃,调节至pH6.0，离心除去固体。然后将所得的上清液施加到SEC-HPLC柱中，用于O-抗原的定量。获得了在2240-4180mg/L的范围内的生产力。发现来自这些批次的纯化的短链O-抗原的分子量在10-15kDa的范围内。还注意到O2和O6水解产物的SEC色谱显示了明显的和可分离的混合型多糖，这在O1a和O25b水解产物中不明显。

通过对每个菌株的wzzb缺失形式进行发酵获得O1a、O2、O6和O25b O-抗原的长链形式，所述菌株在高拷贝卡那霉素选择性topo质粒上携带异源的、互补fepE基因。如对于短链那样进行发酵，尽管使用卡那霉素选择。在124-177OD₆₀₀/mL下观察到的最终细胞密度与3500-9850mg/L的O-抗原生产力相关。长链O-抗原的基于互补的合成至少与亲本短链菌株一样多产，在某些情况下甚至更多。纯化的O-抗原多糖的分子量为33-49kDa，或约为相应短链大小的3倍。

注意到O2和O6的长链水解产物显示了混合型多糖峰的证据，在长链抗原的情况下，观察到其为主O-抗原峰上的肩；O1和O25b没有显示出产生混合型多糖的证据，如先前在短链亲本中所见。

发现生长速率抑制与缺乏fepE的topo复制子的存在相关。另外，Δwzzb本身对生长速率没有不利影响，表明受干扰的生长速率是由质粒载体传递的。

菌株的O11、O13、O16、O21和O75 O-抗原生产的评估。通过SEC-HPLC评估血清型O11、O13、O16、O21和O75的多个野生型菌株在发酵中产生不需要的多糖的倾向。O11、O13、O16、O21和O75的菌株被选择因为不含混合型多糖，以及它们产生>1000mg/L O-抗原的能力，且抗生素敏感性谱的显示其允许用于引入Δwzzb性状的Wanner-Datsenko重组工程。

构建了fepE和pET-fepE的氯霉素可选择形式，其允许将fepE引入到通常被发现对卡那霉素具有抗性的O11、O13、O16、O21和O75wzzb菌株中。用氯霉素选择发酵所得的携带topo-fepE和pET-fepE的菌株，并通过SEC-HPLC评价酸水解的肉汤的上清液。高拷贝(topo)和低拷贝(pET)fepE构建体都指导O-抗原的合成，各自的生产力相当于亲本野生型。未观察到潜在干扰多糖的表达。

对携带wzzb质粒的菌株的生长速率的评估表明，O11、O13和O21会因topo-fepE的存在而被延缓，但不会因pET-fepE而被延缓；菌株O16和O75菌株无论选择何种复制子都显示出可接受的生长速率。

表27

多糖的纯化过程包括酸水解以释放O-抗原。将发酵反应器中血清型特异性大肠杆菌培养物的粗悬液直接用乙酸处理至最终pH为3.5±0.5，并将酸化的肉汤加热至95±5℃的温度，持续至少1小时。这种处理使寡糖近端处的KDO与脂质A之间的不稳定键联断裂，从而释放出O-Ag链。将含有释放的O-Ag的酸化肉汤冷却至20±10℃，然后用NH₄OH中和至pH 7±1.0。该方法还包括几个离心、过滤和浓缩/渗滤操作步骤。

表28

实施例31：研究了与O-抗原(O4、O11、O21、O75)的缀合(RAC/DMSO)

表29O4缀合物

表30O11缀合物

表31O21缀合物

表32O75缀合物

实施例32：制备的PLL缀合物

表33

实施例33：大肠杆菌多肽的稳定哺乳动物细胞表达，使用SSI(位点特异性整合)稳定表达系统产生表达FimH GSD或FimH LD的稳定CHO克隆。

宿主CHO细胞是来自CHOK1SV GS-KO背景的工程化细胞系(关于CHOK1SV GS-KO宿主细胞系的描述，参见，例如美国专利申请20200002727)。简言之，将具有由两个FRT位点包围的绿色荧光蛋白(GFP)基因的着陆垫(landing pad)靶向宿主细胞基因组中的转录热点。GFP基因可以与GS基因和目标基因交换，GS基因和目标基因也被来自与翻转酶重组酶(FLPe)共表达的LVEC载体的FRT位点包围。该系统不仅具有比随机整合相比有利的生长和生产力谱，而且显示了至少100代的基因型和表型稳定性。

如本文中所述，术语“FRT位点”是指酵母2μm质粒的翻转酶(FLP)基因产物FLP重组酶能够在其处催化位点特异性重组的核苷酸序列。各种不同的FRT位点是本领域已知的。各种FRT位点的序列是相似的，因为它们都含有相同的13个碱基对的反向重复序列，所述反向重复序列位于其中发生重组的8个碱基对的不对称核心区域的两侧。正是不对称的核心区域决定了位点的方向性以及不同FRT位点之间的变化。这些FRT位点的说明性(非限制性)实例包括天然存在的FRT(F)，以及几个突变或变体FRT位点，诸如FRT F1和FRT F2。

如本文中所述，术语“着陆垫”是指包含在染色体上整合到宿主细胞中的第一重组靶位点的核酸序列。在一些实施方案中，着陆位点包含两个或更多个在染色体上整合到宿主细胞中的重组靶位点。在一些实施方案中，细胞包含1、2、3、4、5、6、7或8个着陆垫。在一些实施方案中，细胞包含1、2或3个着陆垫。在一些实施方案中，细胞包含4个着陆垫。在一些实施方案中，着陆垫被整合在多达1、2、3、4、5、6、7或8个不同的染色体基因座中。在一些实施方案中，着陆垫被整合在多达1、2或3个不同的染色体基因座中。在一些实施方案中，着陆垫被整合在4个不同的染色体基因座中。

利用BioRad Gene Pulser Xcell或Amaxa 4D-Nucleofector，通过电穿孔将用于FimH GSD或FimH LD的LVEC表达载体和FLPe表达载体共转染到SSI宿主细胞中。然后在不含谷氨酰胺的培养基中培养细胞，以选择在着陆垫位点整合了GS基因的细胞。通常细胞会在2-3周内恢复。然后通过FACS或有限稀释在96孔板中进行单细胞克隆。将来自具有细胞的孔的滴度分级以缩小到前48个克隆。在24个深孔板中进行第二轮补料分批筛选，以将克隆缩小到前12个。在Ambr15中进行第三轮补料分批筛选，以将克隆缩小到前3个。Ambr250实验用于鉴定最佳克隆。在对顶部克隆进行鉴定后，产生其的主细胞库和工作细胞库。

实施例34：细胞系开发以及FimH-DSG WT和FimH_LD WT蛋白的生产反应器表达

本文所述的实施例描述了由稳定的CHO细胞系产生FimH-DSG WT和FimH_LD Wt蛋白的示例性生产，其中每种蛋白的编码序列已被稳定地整合到CHO基因组中。

在生产生物反应器设置中，所选的稳定CHO细胞系能够以每升培养物约1克(对于FimH-DSG Wt)和每升培养物250毫克(对于FimH_LD Wt)产生靶蛋白。将用于生产反应器的种子培养(seed train)从工作细胞库的小瓶解冻中连续放大，并在摇瓶中使用0.3x10⁶个细胞/ml的接种活细胞密度通过摇瓶中的三个传代周期进行扩增，以为生产反应器提供足够的细胞。将细胞在36.5℃、5％CO₂下生长3-4天。

从最终的摇瓶接种生产反应器，目标接种细胞密度为1x10⁶个细胞/ml。使用7.05(+/-0.15)的pH和5-10％的目标CO₂饱和度，将生产反应器在36.5℃下生长7天。pH通过碳酸氢钠/碳酸氢钾控制碱度，CO₂喷射控制酸度。通过喷射使用纯氧将溶解氧控制在40％的设定点。在第七天，将温度调节到31℃。反应器在第1天使用添加与活细胞密度相关的进料的进料策略进料，这通过使用0.75的进料因子来实现，以确保进料组分在运行期间不会耗尽。然后连续添加进料，以在一天的过程中提供所需体积的进料。

在第13天收获生产反应器，在下游处理之前，将收获培养物离心并进行0.22μm过滤。

以下条款描述了本发明的附加实施方案：

C1.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含选自以下的任一种的结构的糖：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3株))、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如式O23A)、式O24、式O25(例如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如式O73(73-1株))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是从1至100的整数。

C2.根据条款C1所述的组合物，其中所述糖包含选自以下的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3株))、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O21、式O23(例如式O23A)、式O24、式O25(例如式O25a和式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(例如式O45和式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(例如式O73(73-1株))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D1、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167和式O172，其中n是从20至100的整数。

C3.根据条款C2所述的组合物，其中所述糖包含选自以下的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如式O5ab和式O5ac(180/C3株))、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O21、式O23(例如式O23A)、式O24、式O25(例如式O25a和式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(例如式O45和式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(例如式O73(73-1)株)、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173和式62D1，其中n是20至100的整数。

C4.根据条款C2所述的组合物，其包含选自以下的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O15、式O16、式O21、式O25(例如式O25a和式O25b)和式O75。

C5.根据条款C2所述的组合物，其包含选自式O4、式O11、式O21和式O75的结构。

C6.根据条款C1所述的组合物，其中所述糖不包含选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101的结构。

C7.根据条款C1所述的组合物，其中所述糖不包含选自式O12的结构。

C8.根据条款C4所述的组合物，其中所述糖是通过在革兰阴性细菌中表达wzz家族蛋白以产生所述糖而产生的。

C9.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白选自由以下组成的组：wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzzfepE、wzz1和wzz2。

C10.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白是wzzB。

C11.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白是fepE。

C12.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白是wzzB和fepE。

C13.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白源自肠道沙门氏菌。

C14.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白包含选自以下序列中的任一种的序列：SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。

C15.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白包含与以下序列中的任一种具有至少90％序列同一性的序列：SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:33,SEQ ID NO:34。

C16.根据条款C8所述的组合物，其中所述wzz家族蛋白包含选自以下序列中的任一种的序列：SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。

C17.根据条款C1的组合物，其中所述糖是合成地合成的。

C18.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R1部分。

C19.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R2部分。

C20.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R3部分。

C21.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R4部分。

C22.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌K-12部分。

C23.根据条款C1至C22中任一项所述的组合物，其中所述糖还包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C24.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R1部分。

C25.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C26.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R3部分。

C27.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R4部分。

C28.根据条款C1至C17中任一项所述的组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌K-12部分。

C29.根据条款C1至C22中任一项所述的组合物，其中所述糖不进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C30.根据条款C1至C23中任一项所述的组合物，其中所述糖不包含脂质A。

C31.根据条款C1至C30中任一项所述的组合物，其中所述多糖的分子量介于10kDa与2,000kDa之间，或介于50kDa与2,000kDa之间。

C32.根据条款C1至C31中任一项所述的组合物，其中所述糖的平均分子量为20-40kDa。

C33.根据条款C1至C32中任一项的组合物，其中所述糖的平均分子量为40,000至60,000kDa。

C34.根据条款C1至C33中任一项所述的组合物，其中n是31至90的整数。

C35.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中所述糖源自大肠杆菌。

C36.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含共价结合运载体蛋白的根据条款C1至条款C34中任一项的糖的缀合物。

C37.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和根据条款C35至条款C36中任一项的缀合物，其中所述运载体蛋白选自以下的任一种：聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、霍乱毒素B亚单位(CTB)、肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素及其解毒的变体、空肠弯曲菌AcrA和空肠弯曲菌天然糖蛋白。

C38.根据条款C35至条款C37中任一项所述的组合物，其中所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。

C39.根据条款C35至条款C37中任一项所述的组合物，其中所述运载体蛋白是破伤风类毒素(TT)。

C40.根据条款C35至条款C37中任一项所述的组合物，其中所述运载体蛋白是聚(L-赖氨酸)。

C41.根据条款C35至条款C39中任一项所述的组合物，其中所述缀合物通过还原胺化来制备。

C42.根据条款C35至条款C39中任一项所述的组合物，其中所述缀合物通过CDAP化学制备。

C43.根据条款C35至条款C39中任一项所述的组合物，其中所述缀合物是单端连接的缀合糖。

C44.根据条款C35至条款C39中任一项所述的组合物，其中所述糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合。

C45.根据条款C44所述的组合物，其中所述糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与所述运载体蛋白缀合，其中所述糖通过氨基甲酸酯键联与所述eTEC间隔子共价连接，并且其中所述运载体蛋白通过酰胺键联与所述eTEC间隔子共价连接。

C46.根据条款C44至条款C45中任一项所述的组合物，其中所述CRM₁₉₇包含2至20个或4至16个通过eTEC间隔子与所述多肽共价连接的赖氨酸残基。

C47.根据条款C35至条款C46中任一项所述的组合物，其中所述糖∶运载体蛋白的比例(w/w)介于0.2与4之间。

C48.根据条款C35至条款C46中任一项所述的组合物，其中糖与蛋白质的比例为至少0.5且至多2。

C49.根据条款C35至条款C46中任一项所述的组合物，其中糖与蛋白质的比例介于0.4与1.7之间。

C50.根据条款C43至条款C49中任一项所述的组合物，其中所述糖通过3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与所述运载体蛋白缀合。

C51.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含共价结合运载体蛋白的糖的缀合物，其中所述糖包含选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101的结构，其中n是1至10的整数。

C52.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和根据条款C1至条款C34中任一项的糖，以及药学上可接受的稀释剂。

C53.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和根据条款C35至条款C51中任一项的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂。

C54.根据条款C53所述的组合物，其相对于组合物中糖的总量，包含至多约25％的游离糖。

C55.根据条款C52至条款C53中任一项所述的组合物，其还包含佐剂。

C56.根据条款C52至条款C53中任一项所述的组合物，其还包含铝。

C57.根据条款C52至条款C53中任一项所述的组合物，其还包含QS-21。

C58.根据条款C52至条款C53中任一项所述的组合物，其还包含CpG寡核苷酸。

C59.根据条款C52至条款C53中任一项所述的组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C60.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和通过(2-((2-氧乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔基与运载体蛋白偶联的来自大肠杆菌的糖，其中多糖通过氨基甲酸酯键与eTEC间隔基共价连接，运载体蛋白通过酰胺键联与eTEC间隔子共价连接。

C61.根据条款C60所述的组合物，其中所述糖是源自大肠杆菌的O-抗原。

C62.根据条款C60所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、运载体或稀释剂。

C63.根据条款C60所述的组合物，其中所述糖是源自大肠杆菌的O-抗原。

C64.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和根据条款C1至条款C17中任一项的糖，其通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合，其中所述多糖通过氨基甲酸酯键联与所述eTEC间隔子共价连接，并且其中所述运载体蛋白通过酰胺键联与所述eTEC间隔子共价连接。

C65.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和(i)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O1A抗原的缀合物，(iii)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O2抗原的缀合物，和(iv)与运载体蛋白共价偶联的O6抗原的缀合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构，其中n是大于30的整数。

C66.条款C65的组合物，其中所述运载体蛋白选自以下的任一种：聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、霍乱毒素B亚单位(CTB)、肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素及其解毒的变体、空肠弯曲菌AcrA和空肠弯曲菌天然糖蛋白。

C67.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和(i)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O4抗原的缀合物，(iii)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O11抗原的缀合物，和(iv)与运载体蛋白共价偶联的O21抗原的缀合物，其中大肠杆菌O25B抗原包含式O75的结构，其中n是大于30的整数。

C68.条款C67的组合物，其中所述运载体蛋白选自以下的任一种：聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、霍乱毒素B亚单位(CTB)、肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素及其解毒的变体、空肠弯曲菌AcrA和空肠弯曲菌天然糖蛋白。

C69.一种制备组合物的方法，所述组合物包含源自FimH的多肽或其片段；和包含通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合的糖的缀合物，所述方法包括以下步骤：a)使糖与1,1′-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1′-羰基二咪唑(CDI)在有机溶剂中反应，以产生活化的糖；b)使所述活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应，以产生硫醇化的糖；c)使所述硫醇化糖与还原剂反应，以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化糖；d)使所述活化的硫醇化糖与包含一个或多α-卤代乙酰胺基团的活化的运载体蛋白反应，以产生硫醇化糖-运载体蛋白缀合物；以及e)使所述硫醇化糖-运载体蛋白缀合物与(i)能够将活化的运载体蛋白的未缀合的α-卤代乙酰胺基团封端的第一封端试剂和/或(ii)能够将未缀合的游离巯基残基封端的第二封端试剂反应；由此产生eTEC连接的糖缀合物，其中所述糖源自大肠杆菌；还包括在重组哺乳动物细胞中表达编码源自FimH的多肽或其片段的多核苷酸，以及分离所述多肽或其片段。

C70.根据条款C69所述的方法，其包括制备根据条款C1至条款C34中任一项的组合物。

C71.根据条款C69至条款C70中任一项所述的方法，其中所述封端步骤e)包括使所述硫醇化糖-运载体蛋白缀合物与(i)作为第一封端试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或(ii)作为第二封端试剂的碘乙酰胺反应。

C72.根据条款C69至条款C71中任一项所述的方法，其还包括通过与三唑或咪唑反应来复合糖以提供复配糖的步骤，其中在步骤a)之前，将所述复配糖进行壳冷冻、冻干并在有机溶剂中复原。

C73.根据条款C69至条款C72中任一项所述的方法，其还包括纯化步骤c)中产生的硫醇化多糖，其中所述纯化步骤包括渗滤。

C74.根据条款C69至条款C73中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过渗滤纯化eTEC连接的糖缀合物。

C75.根据条款C69至条款C74中任一项所述的方法，其中步骤a)中的有机溶剂是极性非质子溶剂，其选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)和六甲基磷酰胺(HMPA)中的任一种，或其混合物。

C76.一种培养基，其包含KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

C77.根据条款C76所述的培养基，其中所述培养基用于培养大肠杆菌。

C78.根据条款C1至条款C34中任一项的产生糖的方法，其包括在培养基中培养重组大肠杆菌；通过在所述培养基中培养所述细胞产生所述糖；由此所述细胞产生所述糖。

C79.根据条款C78所述的方法，其中所述培养基包含选自KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O中的任一种的元素。

C80.根据条款C78所述的方法，其中所述培养基包含大豆水解产物。

C81.根据条款C78所述的方法，其中所述培养基包含酵母提取物。

C82.根据条款C78所述的方法，其中所述培养基不进一步包含大豆水解产物和酵母提取物。

C83.根据条款C78所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞包含选自wzzB,wzz,wzzSF,wzzST,fepE,wzzfepE,wzz1和wzz2中的任一种的异源wzz家族蛋白。

C84.根据条款C78所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞包含选自wzzB,wzz,wzzSF,wzzST,fepE,wzzfepE,wzz1和wzz2中的任一种的肠道沙门氏菌wzz家族蛋白。

C85.根据条款C84所述的方法，其中所述wzz家族蛋白包含选自以下序列中的任一种的序列：SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。

C86.根据条款C78所述的方法，其中所述培养产生>120OD600/mL的产量。

C87.根据条款C78所述的方法，其还包括纯化所述糖。

C88.根据条款C78所述的方法，其中所述纯化步骤包括以下步骤中的任一种：透析、浓缩操作、渗滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深度过滤和柱色谱(离子交换色谱、多峰离子交换色谱、DEAE和疏水相互作用色谱)。

C89.一种用于在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用根据条款C1至条款C68中任一项的组合物。

C90.根据条款C89所述的方法，其中所述免疫反应包括诱导抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体。

C91.根据条款C89所述的方法，其中所述免疫反应包括诱导抗大肠杆菌IgG抗体。

C92.根据条款C89所述的方法，其中所述免疫反应包括诱导针对大肠杆菌的杀菌活性。

C93.根据条款C89所述的方法，其中所述免疫反应包括诱导针对大肠杆菌的调理吞噬细胞抗体。

C94.根据条款C89所述的方法，其中所述免疫反应包括初始给药后为至少1,000至200,000的几何平均滴度(GMT)水平。

C95.根据条款C89所述的方法，其中所述组合物包含含有式O25的糖，其中n是40至100的整数，其中所述免疫反应包括初始给药后为至少1,000至200,000的几何平均滴度(GMT)水平。

C96.根据条款C89所述的方法，其中所述哺乳动物处于选自以下的任一种疾患的风险中：尿路感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血性尿毒症综合征、新生儿脑膜炎、尿脓毒症、腹内感染、脑膜炎、并发肺炎、伤口感染、前列腺活检后相关感染、新生儿/婴儿脓毒症、中性粒细胞减少性发热和其它血流感染；肺炎、菌血症和脓毒症。

C97.根据项C89的方法，其中所述哺乳动物患有选自以下的疾患中的任一种疾患：尿路感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血性尿毒症综合征、新生儿脑膜炎、尿脓毒症、腹内感染、脑膜炎、并发肺炎、伤口感染、前列腺活检后相关感染、新生儿/婴儿脓毒症、中性粒细胞减少性发热和其它血流感染；肺炎、菌血症和脓毒症。

C98.一种方法，其用于(i)在受试者中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫反应，(ii)在受试者中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或(iii)在受试者中诱导对肠外致病性大肠杆菌特异的调理吞噬细胞抗体的产生，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据条款C1至条款C68中任一项的组合物。

C99.条款C98的方法，其中所述受试者处于发生尿路感染的风险中。

C100.条款C98的方法，其中所述受试者有患菌血症的风险中。

C101.条款C98的方法，其中所述受试者处于发生脓毒症的风险中。

C102.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和(i)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O1A抗原的缀合物，(iii)与运载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O2抗原的缀合物，和(iv)与运载体蛋白共价偶联的O6抗原的缀合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构，其中n是大于30的整数。

C103.条款C102的组合物，其中所述运载体蛋白选自由以下组成的组：聚(L-赖氨酸)、铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A(EPA)、CRM₁₉₇、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的解毒的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、霍乱毒素B亚单位(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒的变体、肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素及其解毒的变体、空肠弯曲菌AcrA和空肠弯曲菌天然糖蛋白。

C104.一种方法，其用于(i)在受试者中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫反应，(ii)在受试者中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫反应，或(iii)在受试者中诱导对肠外致病性大肠杆菌特异的调理吞噬细胞抗体的产生，其中所述方法包括向受试者施用有效量的条款C1的组合物。

C105.条款C104的方法，其中所述受试者处于发生尿路感染的风险中。

C106.条款C104的方法，其中所述受试者有患菌血症的风险中。

C107.条款C104的方法，其中所述受试者处于发生脓毒症的风险中。

C108.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含与相应的大肠杆菌野生型O-多糖相比增加了至少5个重复单元的糖。

C109.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖包含式O25a，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O25a。

C110.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖包含式O25b，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O25b。

C111.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖包含式O2，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O2。

C112.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖包含式O6，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O6。

C113.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖包含式O1，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O1。

C114.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖包含式O17，并且所述大肠杆菌是大肠杆菌血清型O17。

C115.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是5至1000的整数。

C116.根据条款C108所述的组合物，其中所述大肠杆菌是大肠杆菌是选自由以下组成的组的大肠杆菌血清型：O1,O2,O3,O4,O5,O6,O7,O8,O9,O10,O11,O12,O13,O14,O15,O16,O17,O18,O19,O20,O21,O22,O23,O24,O25,O25b,O26,O27,O28,O29,O30,O32,O33,O34,O35,O36,O37,O38,O39,O40,O41,O42,O43,O44,O45,O46,O48,O49,O50,O51,O52,O53,O54,O55,O56,O57,O58,O59,O60,O61,O62,O63,O64,O65,O66,O68,O69,O70,O71,O73,O74,O75,O76,O77,O78,O79,O80,O81,O82,O83,O84,O85,O86,O87,O88,O89,O90,O91,O92,O93,O95,O96,O97,O98,O99,O100,O101,O102,O103,O104,O105,O106,O107,O108,O109,O110,0111,O112,O113,O114,O115,O116,O117,O118,O119,O120,O121,O123,O124,O125,O126,O127,O128,O129,O130,O131,O132,O133,O134,O135,O136,O137,O138,O139,O140,O141,O142,O143,O144,O145,O146,O147,O148,O149,O150,O151,O152,O153,O154,O155,O156,O157,O158,O159,O160,O161,O162,O163,O164,O165,O166,O167,O168,O169,O170,O171,O172,O173,O174,O175,O176,O177,O178,O179,O180,O181,O182,O183,O184,O185,O186和O187。

C117.根据条款C108所述的组合物，其中所述糖通过增加培养物中由革兰阴性细菌产生的O-多糖的重复单位来产生，包括在革兰阴性细菌中过表达wzz家族蛋白以产生所述糖。

C118.根据条款C117所述的组合物，其中所述过表达的wzz家族蛋白选自由以下组成的组：wzzB,wzz,wzzSF,wzzST,fepE,wzzfepE,wzz1和wzz2。

C119.根据条款C117所述的组合物，其中所述过表达的wzz家族蛋白是wzzB。

C120.根据条款C117所述的组合物，其中所述过表达的wzz家族蛋白是fepE。

C121.根据条款C117所述的组合物，其中所述过表达的wzz家族蛋白是wzzB和fepE。

C122.根据条款C108的组合物，其中所述糖是合成地合成的。

C123.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含与运载体蛋白共价结合的根据条款C108的糖的缀合物。

C124.根据条款C123所述的组合物，其中所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。

C125.根据条款C123所述的组合物，其中所述糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是5至1000的整数。

C126.根据条款C123所述的组合物，其中与相应的野生型O-多糖相比，所述糖包含至少5个重复单元的增加。

C127.根据条款C1的组合物，其还包含药学上可接受的稀释剂。

C128.根据条款C127的组合物，其还包含佐剂。

C129.根据条款C127的组合物，其还包含铝。

C130.根据条款C127的组合物，其还包含QS-21。

C131.根据条款C127的组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C132.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用根据条款C127的组合物。

C133.根据条款C123的组合物，其还包含药学上可接受的稀释剂。

C134.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用根据条款C133的组合物。

C135.根据条款C132或C134的方法，其中所述免疫反应包括诱导抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体。

C136.根据条款C135所述的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是IgG抗体。

C137.根据条款C135所述的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是具有针对大肠杆菌的杀菌活性的IgG抗体。

C138.一种免疫原性组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与运载体蛋白缀合的源自大肠杆菌的糖，其所述中多糖通过氨基甲酸酯键联与eTEC间隔子共价连接，并且其中所述运载体蛋白通过酰胺键联与eTEC间隔子共价连接。

C139.根据条款C138所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

C140.根据条款C138所述的免疫原性组合物，其中所述糖是源自大肠杆菌的O-抗原。

C141.根据条款C138所述的免疫原性组合物，其中所述糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是5至1000的整数。

C142.根据条款C138的免疫原性组合物，其中所述糖具有75％至100％的O-乙酰化程度。

C143.根据条款C138的免疫原性组合物，其中所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。

C144.根据条款C143的免疫原性组合物，其中所述CRM₁₉₇包含通过eTEC间隔子共价连接至所述多糖的2至20个赖氨酸残基。

C145.根据条款C143的免疫原性组合物，其中所述CRM₁₉₇包含通过eTEC间隔子共价连接至所述多糖的4至16个赖氨酸残基。

C146.根据条款C138的免疫原性组合物，其还包含附加的抗原。

C147.根据条款C138的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

C148.根据条款C147的免疫原性组合物，其中所述佐剂是选自由磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝组成的组的铝基佐剂。

C149.根据条款C138的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C150.一种免疫原性组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含与运载体蛋白缀合的源自大肠杆菌的糖的糖缀合物，其中所述糖缀合物使用还原胺化制备。

C151.根据条款C150所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

C152.根据条款C150所述的免疫原性组合物，其中所述糖是源自大肠杆菌的O-抗原。

C153.根据条款C150所述的免疫原性组合物，其中所述糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是5至1000的整数。

C154.根据条款C150的免疫原性组合物，其中所述糖具有75％至100％的O-乙酰化程度。

C155.根据条款C150的免疫原性组合物，其中所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。

C156.根据条款C150的免疫原性组合物，其还包含附加的抗原。

C157.根据条款C150的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

C158.根据条款C157的免疫原性组合物，其中所述佐剂是选自由磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝组成的组的铝基佐剂。

C159.根据条款C150的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C160.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用根据条款C138-C159中任一项的组合物。

C161.根据条款C160所述的方法，其中所述免疫反应包括诱导抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体。

C162.根据条款C135所述的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是IgG抗体。

C163.根据条款C135所述的方法，其中所述抗大肠杆菌O-特异性多糖血清抗体是具有针对大肠杆菌的杀菌活性的IgG抗体。

C164.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含选自以下的任一种的结构的糖：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187，其中n大于相应的野生型大肠杆菌多肽中的重复单元数。

C165.根据条款C164所述的组合物，其中n是31至100的整数。

C166.根据条款C164所述的组合物，其中所述糖包含根据式O1A、式O1B和式O1C、式O2、式O6和式O25B中的任一种的结构。

C167.根据条款C164所述的组合物，其中所述糖在重组宿主细胞中产生，所述重组宿主细胞表达与以下序列中的任一个具有至少90％序列同一性的wzz家族蛋白：SEQ IDNO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。

C168.根据条款C167所述的组合物，其中所述蛋白质包含以下序列中的任一个：SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34。

C169.根据条款C164所述的糖，其中所述糖是合成地合成的。

C170.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段；和包含与糖共价结合的运载体蛋白的缀合物，所述糖包含选自以下的任一种的结构：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187，其中n是1至100的整数。

C171.根据条款C170所述的组合物，其中所述糖包含以下式O25b、式O1A、式O2和式O6中的任一种。

C172.根据条款C170所述的组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分和大肠杆菌K-12部分中的任一种。

C173.根据条款C170所述的组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分和大肠杆菌K-12部分中的任一种。根据条款C170的组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C174.根据条款C170的组合物，其中所述糖还包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C175.根据条款C170所述的组合物，其中所述运载体蛋白选自以下的任一种：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、霍乱毒素B亚单位(CTB)、肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素及其解毒的变体、空肠弯曲菌AcrA和空肠弯曲菌天然糖蛋白。

C176.根据条款C170所述的组合物，其中所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。

C177.根据条款C170的组合物，其中所述运载体蛋白是破伤风类毒素。

C178.根据条款C170的组合物，其中糖与蛋白质的比例为至少0.5至至多2。

C179.根据条款C170的组合物，其中所述缀合物通过还原胺化来制备。

C180.根据条款C170的组合物，其中所述糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子与所述运载体蛋白缀合。

C181.根据条款C170所述的组合物，其中所述糖是单端连接的缀合的糖。

C182.根据条款C174所述的组合物，其中所述糖通过3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与所述运载体蛋白缀合。

C183.根据条款C170所述的组合物，其中所述缀合物是通过CDAP化学制备的。

C184.一种组合物，其包含源自FimH的多肽或其片段物；和(a)包含与含有式O25b的糖共价结合的运载体蛋白的缀合物，其中n是31至90的整数，(b)包含与含有式O1A的糖共价结合的运载体蛋白的缀合物，其中n是31至90的整数，(c)包含与含有式O2的糖共价结合的运载体蛋白的缀合物，其中n是31至90的整数，以及(d)包含与含有式O6的糖共价结合的运载体蛋白的缀合物，其中n是31至90的整数。

C185.根据条款C184所述的组合物，其还包含缀合物，所述缀合物包含与糖共价结合的运载体蛋白，所述糖包含选自以下的任一种的结构：式O15、式O16、式O17、式O18和式O75，其中n是31至90的整数。

C186.根据条款C184的组合物，其包含与所述组合物中的糖的总量相比至多25％的游离糖。

C187.一种引发哺乳动物的针对大肠杆菌的免疫反应的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的根据条款C184至C186中任一项的组合物。

C188.根据条款C187所述的方法，其中所述免疫反应包括针对大肠杆菌的调理吞噬细胞抗体。

C189.根据条款C187所述的方法，其中所述免疫反应保护所述哺乳动物免受大肠杆菌感染。

C190.一种哺乳动物细胞，其包含(a)编码源自大肠杆菌的多肽或其片段的第一目标基因，其中所述基因被整合在至少两个重组靶位点(RTS)之间。

C191.条款C190的实施方案，其中所述两个RTS被染色体整合在NL1基因座或NL2基因座内。

C192.条款C190的实施方案，其中所述第一个目标基因还包含报道基因、编码难以表达的蛋白质的基因、辅助基因或其组合。

C193.条款C190的实施方案，其还包含整合在不同于(a)的基因座的第二染色体基因座内的第二目标基因，其中所述第二目标基因包含报道基因、编码难以表达的蛋白质的基因、辅助基因或其组合。

SEQUENCE LISTING

<110> Pfizer Inc.

Donald, Robert G.K.

<120> 大肠杆菌组合物及其方法

<130> PC72517

<160> 109

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser

1 5 10 15

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Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe

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Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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Val Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro

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Asn Val Gly Gln Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成的

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<212> PRT

<213> 人工序列

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65 70 75 80

Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys

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Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg

100 105 110

Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr

115 120 125

Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser

130 135 140

Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp

145 150 155 160

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165 170 175

Pro Thr Gly Gly His His His His His His His His

180 185

<210> 8

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

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1 5 10 15

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20 25 30

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165 170 175

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<213> 人工序列

<220>

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20

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<212> PRT

<213> 智人

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1 5 10 15

Arg Ala

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<212> PRT

<213> 甲型人呼吸道合胞病毒 (A2株)

<400> 57

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<213> A型流感病毒（A株/日本/305/1957 H2N2）

<400> 58

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly

1 5 10 15

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成的

<400> 59

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195 200 205

<210> 60

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 60

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<220>

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115 120 125

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<210> 62

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 62

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35 40 45

Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys

65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Thr Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr

85 90 95

Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn

100 105 110

Asn Pro Ser Thr Val Glu Ala Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser

130 135 140

Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160

Thr Pro Ser Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

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Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Thr Asn Gly Glu

180 185 190

Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn

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Pro

<210> 63

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 63

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro

1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30

Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Ser Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

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Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

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Thr Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 64

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Ala Glu His His Arg

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Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala

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Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 65

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

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Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

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Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190

Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

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<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 66

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Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

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Phe Glu Ala Ala Met Ala Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

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65 70 75 80

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<220>

<223> 合成的

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<223> 合成的

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165 170 175

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180 185 190

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<220>

<223> 合成的

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 72

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 73

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Leu Ala Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Gly Val

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65 70 75 80

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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50 55 60

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<220>

<223> 合成的

<400> 75

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Gln Arg Leu Ala Val Arg Val Ile His Ala Cys Gly Met Val Asp Val

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65 70 75 80

Glu Gly Ile Thr Arg Ser Arg Leu Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Tyr

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115 120 125

Ser Ile Val Ala Ile Gly Asn Ala Pro Thr Ala Leu Phe Arg Leu Phe

130 135 140

Glu Leu Leu Asp Ala Gly Ala Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ile Gly Met

145 150 155 160

Pro Val Gly Phe Val Gly Ala Ala Glu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala

165 170 175

Asn Ser Arg Gly Val Pro Tyr Val Ile Val Arg Gly Arg Arg Gly Gly

180 185 190

Ser Ala Met Thr Ala Ala Ala Val Asn Ala Leu Ala Ser Glu Arg Glu

195 200 205

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 76

Met Ile Thr Val Phe Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ala Pro Arg Arg Glu

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Lys Leu Ala Glu Val Ile Tyr Ser Ser Leu His Leu Gly Leu Asp Ile

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Pro Lys Gly Lys His Ala Ile Arg Phe Leu Cys Leu Glu Lys Glu Asp

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Asn Leu Met Ala Gly Arg Ser Glu Glu Thr Lys Met Leu Leu Ile Phe

65 70 75 80

Leu Leu Phe Ile Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Ala His Asp

85 90 95

Val Glu Ile Thr Ile Lys Glu Gln Pro Ala His Cys Trp Gly Phe Arg

100 105 110

Gly Arg Thr Gly Asp Ser Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 77

Met Gly Ser Asp Leu Gln Lys Leu Gln Arg Phe Ser Thr Cys Asp Ile

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Ser Asp Gly Leu Leu Asn Val Tyr Asn Ile Pro Thr Gly Gly Tyr Phe

20 25 30

Pro Asn Leu Thr Ala Ile Ser Pro Pro Gln Asn Ser Ser Ile Val Gly

35 40 45

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50 55 60

Val Asn Tyr Ile Asp Ser Val Pro Pro Asn Ser Ile Leu Val Leu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Pro His Leu Gln Ser Gln Phe His Pro Phe Ile Lys Ile Thr

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Gln Ala Met Tyr Gly Gly Leu Met Ser Thr Arg Ala Gln Tyr Leu Lys

100 105 110

Ser Asn Gly Thr Val Val Phe Gly Arg Ile Arg Asp Val Asp Glu His

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Arg Thr Leu Asn His Pro Val Phe Ala Tyr Gly Val Gly Ser Cys Ala

130 135 140

Pro Lys Ala Val Val Lys Ala Val Gly Thr Asn Val Gln Leu Lys Ile

145 150 155 160

Leu Thr Ser Asp Gly Val Thr Gln Thr Ile Cys Pro Gly Asp Tyr Ile

165 170 175

Ala Gly Asp Asn Asn Gly Ile Val Arg Ile Pro Val Gln Glu Thr Asp

180 185 190

Ile Ser Lys Leu Val Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Ile Glu Val Asp Arg

195 200 205

Leu Val Ser Glu Ala Ile Lys Asn Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Gln

210 215 220

Thr Ala Arg Arg Met Val Leu Lys Asp Tyr Ile

225 230 235

<210> 78

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 78

Met Ser Gly Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly Tyr Glu

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Leu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Phe Leu Lys Met Thr Gly His Glu Pro

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Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Thr His Glu Ala Pro Pro Val Pro Gly Ala

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Pro Ala

<210> 79

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 79

Met Gly Asp Asp Ala Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Val Asp Glu Leu

1 5 10 15

Asn Ser Gln Ile Gly Val Leu Leu Ala Glu Pro Leu Pro Asp Asp Val

20 25 30

Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ile Gln His Asp Leu Phe Asp Leu Gly Gly

35 40 45

Glu Leu Cys Ile Pro Gly His Ala Ala Ile Thr Glu Asp His Leu Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Glu Phe Ile Leu Pro Gly Gly Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala His

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ala Arg Val Leu Asn Arg Ala Ala

130 135 140

Gly Gly Ala Asp Val Leu Trp Asp Arg Thr Arg Ala His

145 150 155

<210> 80

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 80

Met Ile Leu Ser Ala Glu Gln Ser Phe Thr Leu Arg His Pro His Gly

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Gln Ala Ala Ala Leu Ala Phe Val Arg Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala

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Gly Val Gln Arg Leu Arg Gly Leu Asp Ser Asp Gly Glu Gln Val Trp

35 40 45

Gly Glu Leu Leu Val Arg Val Pro Leu Leu Gly Glu Val Asp Leu Pro

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Leu Thr Leu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Val Ala Val Ser Gly Gln Ala

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Val Met Val Gln Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Met

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Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ala Ala Gly Leu Pro Pro Ala

145 150 155

<210> 81

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 81

Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp

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Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile

20 25 30

Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala

35 40 45

Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu

50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Lys Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu

130 135 140

Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu

145 150 155

<210> 82

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 82

Met Asp Asp Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Leu Lys Val Ile Pro Val

1 5 10 15

Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu

20 25 30

Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala

35 40 45

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50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys

65 70 75 80

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Asn Pro Ser Thr Val Glu Gln Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser

130 135 140

Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160

Thr Pro Asp Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

165 170 175

Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Arg Asn Gly Glu

180 185 190

Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn

195 200 205

Pro

<210> 83

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 83

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro

1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30

Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

85 90 95

Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110

Thr Phe

<210> 84

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 84

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro

1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30

Glu Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Glu Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

85 90 95

Ile His Phe Val Asp Leu Asp Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110

Thr Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 85

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

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115 120 125

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Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

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<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 86

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 87

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

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<210> 88

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 88

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

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<210> 89

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 89

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1 5 10 15

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<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 90

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<210> 91

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 91

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145 150 155

<210> 92

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 92

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (70)..(70)

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Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala

35 40 45

Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu

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65 70 75 80

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<210> 94

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> Xaa 为 T 或 R

<400> 94

Met Xaa Xaa Ile Asn Asn Gln Leu Lys Xaa Leu Lys Val Ile Pro Val

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Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (103)..(103)

<223> Xaa 为 N 或 D

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Thr Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa 为 Y 或 H

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<400> 96

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

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Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

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145 150 155

<210> 97

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (126)..(126)

<223> Xaa 为 T 或 D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (139)..(139)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (163)..(163)

<223> Xaa 为 N 或 D

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (199)..(199)

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<400> 97

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

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Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

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85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

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<210> 98

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa 为 Y 或 H

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (121)..(121)

<223> Xaa 为 R, E, 或 D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (122)..(122)

<223> Xaa 为 K 或 D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (124)..(124)

<223> Xaa 为 K 或 D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (126)..(126)

<223> Xaa 为 H 或 D

<400> 98

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Xaa Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Xaa Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 99

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 99

taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt attgtacacg gccgcataat cgaaattaat 60

acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta 120

agtataagaa ggagatatac tt 142

<210> 100

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 100

taaagaagga gatatcat 18

<210> 101

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 101

tgagaaggag atatcat 17

<210> 102

<211> 365

<212> PRT

<213> 智人

<400> 102

Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr

20 25 30

His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp

35 40 45

Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu

50 55 60

Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val

65 70 75 80

Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys

85 90 95

Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr

100 105 110

Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val

115 120 125

Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp

130 135 140

Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile

145 150 155 160

Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr

165 170 175

Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg

180 185 190

Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys

195 200 205

Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe

210 215 220

Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser

245 250 255

Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His

260 265 270

Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val

275 280 285

Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val

290 295 300

Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu

305 310 315 320

Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg

325 330 335

Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp

340 345 350

Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala

355 360 365

<210> 103

<211> 62

<212> PRT

<213> 智人

<400> 103

Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr

20 25 30

Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala

35 40 45

Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55 60

<210> 104

<211> 574

<212> PRT

<213> 甲型人呼吸道合胞病毒 (A2株)

<400> 104

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 105

<211> 64

<212> PRT

<213> 甲型人呼吸道合胞病毒 (A2株)

<400> 105

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn

20 25 30

Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn

35 40 45

Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55 60

<210> 106

<211> 178

<212> PRT

<213> 智人

<400> 106

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175

Arg Asn

<210> 107

<211> 57

<212> PRT

<213> 智人

<400> 107

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val

35 40 45

Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55

<210> 108

<211> 562

<212> PRT

<213> A型流感病毒（A株/日本/305/1957 H2N2）

<400> 108

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp

1 5 10 15

Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp

20 25 30

Thr Asn Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro

65 70 75 80

Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu

85 90 95

Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp

100 105 110

Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys

115 120 125

Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly

130 135 140

Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn

145 150 155 160

Met Val Trp Leu Thr Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly

165 170 175

Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val

180 185 190

His His Pro Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val

195 200 205

Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr

210 215 220

Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met

225 230 235 240

Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu

245 250 255

Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys

260 265 270

Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys

275 280 285

Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro

290 295 300

Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val

305 310 315 320

Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln

325 330 335

Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly

340 345 350

Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn

355 360 365

Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala

370 375 380

Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn

385 390 395 400

Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Arg Arg

405 410 415

Leu Glu Asn Leu Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp

420 425 430

Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu

435 440 445

Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met

450 455 460

Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe

465 470 475 480

Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr

485 490 495

Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu

500 505 510

Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala

515 520 525

Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala

530 535 540

Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile

545 550 555 560

Cys Ile

<210> 109

<211> 54

<212> PRT

<213> A型流感病毒（A株/日本/305/1957 H2N2）

<400> 109

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Phe

1 5 10 15

Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn

35 40 45

Leu Val Val Asp Leu Ser

50

Claims

1.一种重组哺乳动物细胞，其包含编码源自大肠杆菌(E.coli)的多肽或其片段的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽源自大肠杆菌菌毛H(FimH)。

3.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的N末端处包含苯丙氨酸残基。

4.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽在N末端的前20个残基位置内包含苯丙氨酸残基。

5.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的位置1处包含苯丙氨酸残基。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其中所述多肽不包含紧接在所述多肽的位置1处的苯丙氨酸残基之前的甘氨酸残基。

7.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的位置7处不包含N-糖基化位点。

8.根据权利要求6所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的位置7处不包含Asn残基。

9.根据权利要求8所述的重组细胞，其中所述多肽在位置7处包含选自由Ser、Asp、Thr和Gln组成的组的残基。

10.根据权利要求5所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的位置70处不包含N-糖基化位点。

11.根据权利要求10所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的位置70处不包含Asn残基。

12.根据权利要求10所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的位置70处不包含Ser残基。

13.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的N-糖基化位点处包含选自由Ser、Asp、Thr和Gln组成的组的残基取代。

14.根据权利要求13所述的重组细胞，其中所述N-糖基化位点包含所述多肽的位置N235。

15.根据权利要求13所述的重组细胞，其中所述N-糖基化位点包含所述多肽的位置N228。

16.根据权利要求13所述的重组细胞，其中所述N-糖基化位点包括所述多肽的位置N235和位置N228。

17.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3。

18.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2。

19.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽在所述多肽的位置1处包含脂肪族疏水氨基酸残基。

20.根据权利要求19所述的重组细胞，其中所述脂肪族疏水性氨基酸残基选自由Ile、Leu和Val组成的组。

21.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽包含FimH的片段。

22.根据权利要求21所述的重组细胞，其中所述多肽包含FimH的凝集素结构域。

23.根据权利要求22所述的重组细胞，其中所述凝集素结构域包含约17022道尔顿的质量。

24.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽与FimC多肽或其片段复合。

25.根据权利要求24所述的重组细胞，其中所述FimC多肽或其片段在所述FimC多肽或其片段的位置37处包含甘氨酸残基。

26.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽处于低亲和力构象。

27.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽被FimG稳定化。

28.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽被FimG的供体链肽(DsG)稳定化。

29.根据权利要求28所述的重组细胞，其中所述多核苷酸序列还编码接头序列。

30.根据权利要求29所述的重组细胞，其中所述接头包含至少4个氨基酸残基和至多15个氨基酸残基。

31.根据权利要求29所述的重组细胞，其中所述接头包含至少5个氨基酸残基和至多10个氨基酸残基。

32.根据权利要求29所述的重组细胞，其中所述接头包含7个氨基酸残基。

33.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽不包含选自由以下组成的组的信号肽：天然FimH前导肽、流感血凝素信号肽和甲型人呼吸道合胞病毒(A2株)融合糖蛋白F0信号肽。

34.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽包含鼠IgK信号肽序列。

35.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽包含选自人IgG受体FcRn大亚单位p51信号肽和人IL10蛋白信号肽的任一信号肽序列。

36.根据权利要求2所述的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:3的编号所述多肽在氨基酸位置60处包含精氨酸至脯氨酸的突变(R60P)。

37.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽的表达水平高于在野生型大肠杆菌细胞的周质中表达的相应野生型多肽的表达水平。

38.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽的表达水平高于10mg/L。

39.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多核苷酸序列被整合到所述哺乳动物细胞的基因组DNA中。

40.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多核苷酸序列为在所述细胞中表达经密码子优化。

41.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞是人胚胎肾细胞。

42.根据权利要求40所述的重组细胞，其中所述人胚胎肾细胞包含HEK293细胞。

43.根据权利要求42所述的重组细胞，其中所述HEK293细胞选自HEK293T细胞、HEK293TS细胞和HEK293E细胞中的任一种。

44.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

45.根据权利要求44所述的重组细胞，其中所述CHO细胞是CHO-K1细胞、CHO-DUXB11细胞、CHO-DG44细胞或CHO-S细胞。

46.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽是可溶的。

47.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述多肽是从所述细胞分泌的。

48.根据权利要求2所述的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号所述多肽包含N28Q取代。

49.根据权利要求2所述的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号所述多肽包含N28D取代。

50.根据权利要求2所述的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号所述多肽包含N28S取代。

51.根据权利要求2所述的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号所述多肽包含选自N28Q、V48C和L55C中的任一个的取代。

52.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述多肽根据SEQ ID NO:1的编号包含取代N92S。

53.根据权利要求1所述的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号，所述源自FimH的多肽或其片段包含选自V48C和L55C中的任一个的取代。

54.一种培养物，其包含权利要求1所述的重组细胞，其中所述培养物的体积至少为5升。

55.根据权利要求49所述的培养物，其中所述多肽或其片段的产量至少为0.05g/L。

56.根据权利要求55所述的培养物，其中所述多肽或其片段的产量至少为0.10g/L。

57.一种用于产生源自大肠杆菌的多肽或其片段的方法，其包括在合适的条件下培养根据权利要求1的重组哺乳动物细胞，由此表达所述多肽或其片段；以及收获所述多肽或其片段。

58.根据权利要求57所述的方法，其还包括纯化所述多肽或其片段。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述细胞包含编码以下序列中的任一个的核酸：SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:27。

60.根据权利要求57所述的方法，其中所述多肽或其片段的产量至少为0.05g/L。

61.根据权利要求57所述的方法，其中所述多肽或其片段的产量至少为0.10g/L。

62.一种组合物，其包含与以下序列中的任一个具有至少70％同一性的多肽：SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。

63.根据权利要求62所述的组合物，其还包含含有选自表1中的任一式的结构的糖。

64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述糖共价结合运载体蛋白。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述运载体蛋白选自以下的任一种：聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A；铜绿假单胞菌的解毒的外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的解毒的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、霍乱毒素B亚单位(CTB)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎链球菌溶血素及其解毒的变体、空肠弯曲菌(C.jejuni)AcrA和空肠弯曲菌天然糖蛋白。

66.根据权利要求64所述的组合物，其中所述运载体蛋白是CRM₁₉₇。

67.根据权利要求64所述的组合物，其中所述运载体蛋白是破伤风类毒素(TT)。

68.根据权利要求64所述的组合物，其中所述运载体蛋白是聚(L-赖氨酸)。

69.根据权利要求64所述的组合物，其中所述糖通过还原胺化反应共价结合运载体蛋白。

70.根据权利要求64所述的组合物，其中所述糖通过CDAP化学共价结合运载体蛋白。

71.根据权利要求64所述的组合物，其中所述糖通过单端连接缀合共价结合运载体蛋白。

72.根据权利要求64所述的组合物，其中所述糖通过(2-((2-氧代乙基)硫代)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子共价结合运载体蛋白。

73.一种多肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:27。