CN116615439A

CN116615439A - 大肠杆菌组合物及其方法

Info

Publication number: CN116615439A
Application number: CN202180080638.9A
Authority: CN
Inventors: A·S·安德森; L·O·乔罗; R·G·K·唐纳德; J·M·利波维; R·潘
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-08-18

Abstract

本发明涉及包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及衍生自大肠杆菌脂多糖的经修饰O‑多糖分子及其缀合物的组合物，及其使用方法。

Description

大肠杆菌组合物及其方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年10月11日提交的美国临时申请第63/254,195号、2021年2月1日提交的美国临时申请第63/144,058号及2020年10月27日提交的美国临时申请第63/106,077号的权益。前述各申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

序列表的引用

本申请经由EFS-Web以电子方式提交并且包括呈.txt格式的以电子方式提交的序列表。该.txt文件含有2020年10月26日创建且大小为160KB的名称为“PC72671_ST25.txt”的序列表。此.txt文件中所含的序列表为本说明书的一部分且以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及适用于引发受试者针对大肠杆菌(E.coli)及肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)血清型的免疫反应的疫苗的新颖免疫原性组合物。

背景技术

大肠杆菌为最常见人类细菌病原体中的一种，其具有包括血流感染、泌尿道感染(导尿管及非导尿管相关)；手术部位感染、肺炎及严重食物中毒相关的腹泻的临床表现。其在血清学上通过脂多糖相关的O-抗原(＞180种已知血清型)、荚膜多糖K抗原(＞100种血清型)及鞭毛H抗原(＞50种血清型)的结构差异分类。

尿路感染(UTI)最常表现为膀胱炎，其在一些个体中可在消退后反复复发。如不治疗，其可能发展为肾盂肾炎及血流感染。大肠杆菌感染与高水平的抗生素抗性相关[Al-Hasan MN等人,The Journal of antimicrobial chemotherapy 2009；64:169-74]，其中许多菌株对多种抗生素具有抗性，包括最后采用的抗生素，诸如碳青霉烯类及多黏菌素类[Zowawi HM等人,Nature reviews Urology 2015；12:570-84]。特别地，O25b血清型多位点序列类型(MLST)131已成为全球大流行性克隆，主要引起小区起始的感染(community-onset infection)，伴随对超广谱头孢菌素(ESBL)及氟喹诺酮的较高抗性比率[Rogers BA等人,The Journal of antimicrobial chemotherapy 2011；66:1-14；Nicolas-ChanoineM-H等人,Clinical Microbiology Reviews 2014；27:543-74]。大肠杆菌BSI及UTI感染菌株还被称为侵袭性肠道外病原性大肠杆菌(ExPEC)或泌尿道病原性大肠杆菌(UPEC)。

仅次于大肠杆菌，克雷伯氏菌属的一些种(包括肺炎克雷伯氏杆菌及催产克雷伯氏菌(K.oxytoca))为第二大最常见革兰氏阴性病原体，其与包括UTI的侵袭性感染、肺炎、腹内感染及血流感染(BSI)相关[Nicolas-Chanoine M-H等人,Clinical MicrobiologyReviews 2014；27:543-74；Podschun R等人,Clin Microbiol Rev 1998；11:589-603；Yinnon AM等人,QJM:monthly journal of the Association of Physicians 1996；89:933-41；Anderson DJ等人,PLoS One 2014；9:e91713]。克雷伯氏菌经由水平传染性ESBL及碳青霉烯类抗性赋予基因维持获得抗生素抗性的强大能力[Chen L等人,TrendsMicrobiol 2014；22:686-96；Iredell J等人,Bmj 2016；352:h6420]。因此，在过去十年间，产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的ESBL抗性克雷伯氏菌的流行率在全球范围内急剧增加。克雷伯氏菌属可表现至多8种不同的O型及>80种K型。虽然存在许多与毒性克雷伯氏菌菌株相关的K抗原，但仅四种O-抗原血清型占克雷伯氏菌临床分离株的>80％，无论样品部位(血液、尿液、痰液)、感染状态(侵袭性与非侵袭性)或获得的性质(小区与院内)[Follador R等人,Microbial Genomics 2016；2:e000073]。

脆弱的新生儿群体及老年人中侵袭性多重抗药性(MDR)大肠杆菌及克雷伯氏菌感染率的增加强调需要基于疫苗的方法来替代变得不太有效的护理标准抗生素。

发明内容

为了满足这些及其他需求，本发明涉及组合物及其使用方法，其用于产生适用于引发受试者针对大肠杆菌及肺炎克雷伯氏杆菌血清型的免疫反应的疫苗的新颖免疫原性组合物。

在本文所提供的方法的一些实施方案中，受试者为哺乳动物，优选为人类。在一些特定实施方案中，人类为儿童，诸如婴儿。在一些其他特定实施方案中，人类为女性，尤其孕妇。

组合物可在施用或不施用佐剂的情况下向受试者施用。向受试者施用的有效量为足以引发受试者针对大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌抗原的免疫反应的量。可经选择用于治疗的受试者包括由于暴露或可能暴露于大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌而处于患上大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌感染的风险下的那些受试者。因为人类可能在2岁时感染大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌，所以整个出生队列被包括为免疫接种的相关群体。例如，这可通过在以下任何时间开始执行免疫接种方案来实现：自出生至6个月大、自6个月大至5岁；妊娠期妇女(或生育年龄的女性)，从而通过抗体的被动转移保护其婴儿；仍在子宫内的婴儿；以及大于50岁的受试者。

在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含FimH多肽，该FimH多肽包含具有选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113或其任何组合组成的组的序列的氨基酸。在一些实施方案中，组合物进一步包括选自具有表1中的式，优选式O1A、式O1B、式O2、式O6和式O25B(其中n为1至100的整数，优选31至100)的任何糖的糖。

在一个方面，本发明涉及一种包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29或其任何组合具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性的多肽的组合物。

在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括具有至少n个来自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29中的任一个的连续氨基酸的多肽，其中n为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20或更大)。在一些实施方案中，该组合物进一步包括选自表1中的任一式的糖，优选为式O1A、式O1B、式O2、式O6和式O25B，其中n为整数1至100，优选31至100。

附图简要说明

图1A-1H-描绘氨基酸序列，包括衍生自大肠杆菌的示例性多肽或其片段的氨基酸序列；以及示例性wzzB序列的氨基酸序列。

图2A-2T-描绘示例性表达载体的图谱。

图3-描绘表达及纯化的结果。

图4-描绘表达及纯化的结果。

图5-描绘表达的结果。

图6A-6C-描绘pSB02083及pSB02158 SEC池及亲和力，包括产率。

图7-描绘pSB2198 FimH dscG锁突变型构建体表达的结果。

图8-描绘pSB2307 FimH dscG野生型表达的结果。

图9A-9C-描绘通过聚合酶依赖性路径合成的O-抗原的结构，其主链中具有四个或更少的残基。

图10A-10B-图10A描绘通过聚合酶依赖性路径合成的O-抗原的结构，其主链中具有五个或六个残基；图10B描绘据信通过ABC转运体依赖性路径合成的O-抗原。

图11-描绘Phe1与其他具有脂肪族疏水性侧链的氨基酸(例如Ile、Leu和Val)的计算突变诱发扫描，这些氨基酸可稳定FimH蛋白质且容纳甘露糖结合。

图12A-12B-描绘质粒：pUC复制子质粒，每个细胞500-700x拷贝，链长调控因子(图12A)；以及P15a复制子质粒，每个细胞10-12x拷贝，O-抗原操纵子(图12B)。

图13A-13B-描绘通过基于质粒的异源wzzB和fepE链长调控因子的表达对血清型O25a及O25b菌株中O-抗原链长的调节。显示wzzB敲除菌株O25K5H1(O25a)及GAR2401(O25b)的质粒转化体中LPS表达的遗传互补。在图13A的左侧，显示O25a O25K5HΔwzzB的质粒转化体的LPS概况；且在右侧，显示O25b GAR 2401ΔwzzB转化体的类似概况。图13B中显示用O25特异性血清(Statens Serum Institut)探测的复制凝胶的免疫印迹。O25aΔwxxB(敲除)背景与泳道1-7相关；O25b 2401ΔwzzB(敲除)背景与泳道8-15相关。

图14-描绘宿主O25K5H1ΔwzzB中由大肠杆菌及沙门氏菌fepE质粒赋予的长链O-抗原表达。

图15-描绘沙门氏菌fepE表达在多种临床分离株中产生长O-抗原LPS。

图16A-16B-描绘O25b O-抗原敲除宿主菌株中质粒介导、阿拉伯糖诱导的O25b长O-抗原LPS的表达。SPS PAGE的结果展示于图16A中，且O25免疫印迹的结果展示于图16B中，其中在图16A及图16B中，泳道1来自克隆1，无阿拉伯糖；泳道2来自克隆1，0.2％阿拉伯糖；泳道3来自克隆9，无阿拉伯糖；泳道4来自克隆9，0.2％阿拉伯糖；泳道5来自O55大肠杆菌LPS标准物；以及泳道6来自O111大肠杆菌LPS标准物。

图17-描绘常见宿主菌株中质粒介导、阿拉伯糖诱导的长O-抗原LPS的表达。

图18-描绘探索性生物过程菌株中O25 O-抗原LPS的表达。

图19A-19B-描绘从菌株GAR2831及‘2401ΔwzzB/fepE中纯化的短(图19A，菌株1O25b wt 2831)及长O25b O-抗原(图19B，菌株2 O25b 2401ΔwzzB/LT2 FepE)的SEC概况及特性。

图20A-20B-描绘兔的疫苗接种时程：(图20A)关于兔研究1VAC-2017-PRL-EC-0723的疫苗接种时程的信息；(图20B)兔研究2VAC-2018-PRL-EC-077的疫苗接种时程。

图21A-21C-描绘O25b糖缀合物IgG反应，其中-●-表示放血前结果；-■-放血1(第6周)；-▲-放血2(第8周)；-◆-放血3(第12周)。图21A描绘兔1-3(中等活化)的结果；图21B描绘兔2-3(较低活化)的结果；图21C描绘兔3-1(较高活化)的结果。

图22A-22F-描绘对O25b长O-抗原糖缀合物，即低活化O25b-CRM₁₉₇缀合物(图22D-22F，其中-●-表示兔2-1的放血前结果，-■-兔2-1的第12周抗血清)与未缀合多糖，即游离O25b多糖(图22A-22C，其中-●-表示兔A-1的放血前结果，-■-兔A-1的第6周抗血清，-▲-兔A-1的第8周抗血清)的IgG反应。请注意，MFI是按对数比例绘制的，以突出在<1000MFI范围内的免疫前抗体与免疫抗体之间的差异。图22A描绘兔A-1(未缀合多糖)的结果；图22B描绘兔A-3(未缀合多糖)的结果；图22C描绘兔A-4(未缀合多糖)的结果；图22D描绘兔2-1(低活化)的结果；图22E描绘兔2-2(低活化)的结果；以及图22F描绘兔2-3(低活化)的结果。

图23A-23C-描绘用O25b抗血清检测的天然与长O25b O-抗原的表面表达。图23A描绘结果，其中-●-表示O25b 2831与PD3抗血清的结果；-■-表示O25b 2831wt与放血前的结果；-▲-表示O25b 2831/fepE与PD3抗血清的结果；-▼-表示O25b 2831/fepE与放血前的结果。图23B描绘结果，其中-●-表示O25b 2401与PD3抗血清的结果；-■-表示O25b 2401与放血前的结果；-▲-表示O25b 2401/fepE与PD3抗血清的结果；-▼-表示O25b 2401/fepE与放血前的结果。图23C描绘结果，其中-●-表示大肠杆菌K12与PD3抗血清的结果；且-■-表示大肠杆菌K12与放血前的结果。

图24-描绘五种已知化学型的外部核心寡糖的碳水化合物主链的一般化结构。除非另外指明，否则所有单糖均呈α-变旋异构组态。产物催化各连接形成的基因以虚线箭头指示。星号表示与O-抗原连接的核心寡糖的残基。

图25-描绘未缀合的游离O25b多糖不具有免疫原性(dLIA)，其中-●-表示来自4-1的第18周(1周＝PD4)抗血清的结果；-■-表示来自4-2的第18周(1周＝PD4)抗血清的结果；-▲-表示来自5-1的第18周(1周＝PD4)抗血清的结果；-▼-表示来自5-2的第18周(1周＝PD4)抗血清的结果；-*-表示来自6-1的第18周(1周＝PD4)抗血清的结果；--表示来自6-2的第18周(1周＝PD4)抗血清的结果。

图26A-26C-描绘示出BRC兔O25b RAC缀合免疫血清OPA效价的特异性的图。图26A展示兔2-3免疫前血清(-●-)及免疫后血清第13周(-■-)的OPA效价。图26B显示兔1-2免疫前血清(-●-)及免疫后血清第19周(-■-)的OPA效价。图26C显示兔1-2第19周OPA效价特异性，其中兔1-2免疫血清的OPA活性通过与100μg/mL经纯化的未缀合O25b长O-抗原多糖一起预孵育来阻断，其中-■-表示兔1-2免疫血清第19周的结果；以及-▼-表示兔1-2第19周w/R1长OAg的结果。

图27A-27C-图27A描绘示例性施用时程的图示。图27B及图27C显示描绘由未缀合的O25b长O-抗原多糖(图27B，O25b游离多糖(2μg))及衍生的O25b RAC/DMSO长O-抗原糖缀合物(图27C，O25b-CRM₁₉₇ RAC长(2μg))引起的O-抗原O25b IgG含量的图，其中-...-(虚线)表示初始CD1O25b IgG含量。

图28A-28B-描绘显示RAC、eTEC O25b长糖缀合物及单端糖缀合物给药后2(图28A)及给药后3(图28B)的OPA免疫原性的图，其中-○-表示单端短2μg；-●-单端长2μg；-▲-RAC/DMSO长2μg；-▼-eTEC长2μg；*背景对照(n＝20)的结果。应答速率为效价>2×未经疫苗接种基线的小鼠％。

图29-描绘显示eTEC化学物质及经调节的多糖活化水平的OPA免疫原性的图。应答速率为效价>2×未经疫苗接种基线的小鼠％。

图30A-30B-描绘示例性施用时程的图示(图30A)；以及描绘用各剂量的大肠杆菌eTEC缀合物免疫接种的小鼠免于O25b分离株的致死性攻击的图(图30B)，其中-◇-表示eTEC长链17％活化；-Δ-eTEC表示长链10％活化；--表示eTEC长链4％活化；-□-表示O25b多糖；-○-表示未经疫苗接种的对照。

图31-描绘说明单端缀合物的示例性制备的示意图，其中缀合过程涉及在暴露硫醇官能基后，用二硫胺接头选择性活化2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)。随后，将KDO与溴活化的CRM₁₉₇蛋白质缀合，如图31(单端缀合物的制备)中所描绘。

图32A-32B-描绘用于制备与CRM₁₉₇的大肠杆菌糖缀合物的活化(图32A)及缀合(图32B)方法的示例性方法流程图。

图33-描绘大肠杆菌及肺炎克雷伯氏杆菌多聚甘露糖O-抗原的重复单元(RU)的结构。图例：三聚体大肠杆菌O8及肺炎克雷伯氏杆菌O5相同，四聚体大肠杆菌O9A/肺炎克雷伯氏杆菌O3a及五聚体大肠杆菌O9/肺炎克雷伯氏杆菌O3也相同。肺炎克雷伯氏杆菌O3亚型在生物合成酶序列水平上的差异描述于Guachalla LM等人,(Scientific Reports 2017；7:6635)中。

图34A-34B-描绘大肠杆菌血清型O8免疫血清对侵袭性肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5菌株具有杀细菌作用。图例：在使用大肠杆菌O8菌株(图34A)及肺炎克雷伯氏杆菌O5菌株(图34B)的杀细菌分析中评估由大肠杆菌血清型O8 O-抗原CRM₁₉₇缀合物引发的兔免疫血清。在两次疫苗剂量(第15周)后观察到针对大肠杆菌O8菌株的强效调理吞噬分析(OPA)活性，而在用未缀合的O8多糖(O8-OAg)或匹配的免疫前血清(第0周)预吸附后，该活性不存在。相同兔免疫血清展现出针对肺炎克雷伯氏杆菌O5菌株的抗原特异性血清杀细菌活性(SBA)。BRC(幼兔补体)、hC(IgG/IgM耗乏的人类血清)用作补体来源。

图35A-35B-描绘大肠杆菌血清型O9 O-抗原免疫血清对侵袭性肺炎克雷伯氏杆菌O3分离株具有杀细菌作用。图例：在使用大肠杆菌O9a菌株(图35A)及肺炎克雷伯氏杆菌O3b菌株(图35B)的调理吞噬分析(OPA)中评估由大肠杆菌血清型O9a O-抗原CRM₁₉₇缀合物引发的兔免疫血清。在两次疫苗剂量(第15周)后观察到针对大肠杆菌O9菌株的OPA活性，而在用未缀合的O9多糖(O9-OAg)或匹配的免疫前血清(第0周)预吸附后，该活性不存在。相同兔免疫血清还展现出针对肺炎克雷伯氏杆菌O3b菌株的强效抗原特异性血清杀细菌活性(SBA)。BRC(幼兔补体)、hC(IgG/IgM耗乏的人类血清)用作补体来源。

图36A-36B-描绘大肠杆菌FimH_LD抗原需要强效佐剂来引发中和抗体。图36A描绘研究VAC-2019-PRL-EC-1369的给药时程：使每组12及20只之间的CD-1小鼠在具有或不具有20μg QS21/PS80或50μg AlPO₄佐剂的情况下接种3μg或30μg剂量的大肠杆菌FimH_LD抗原。图36B描绘在接种分别显示为封闭符号或空心符号的野生型FimH_LD或FimH_LD锁突变抗原的个体小鼠的剂量3之后的效价。示出来自对数转换的中和效价数据的t检验(不配对韦尔奇氏校正(Welch's correction))的p值。

图37A-37B-证实FimH-DSG变体比FimH_LD构建体更具免疫原性。图37A描绘研究VAC-2019-PRL-EC-1438的给药时程：使每组20只CD-1小鼠接种10μg或30μg的具有20μg QS21/PS80的大肠杆菌FimH_LD或FimH-DSG抗原变体。图37B-描绘在接种分别显示为封闭符号或空心符号的野生型FimH_LD或FimH_LD锁突变抗原的个体小鼠的剂量3之后的效价。示出来自对数转换的中和效价数据的t检验(不配对韦尔奇氏校正)的p值。

图38-描绘用于FimH-DSG及O-抗原组合的时程及给药及佐剂制剂研究(研究VAC-2020-PRL-EC-1679)。

图39A-39B-描绘研究VAC-2020-PRL-EC-1679，其证实佐剂及FimH-DSG及4价O-抗原组合对FimH中和的影响。在PD2(图39A)及PD3(图39B)时间点时的酵母菌甘露聚糖分析结合中和效价。封闭符号反映了仅接种O-抗原或FimH-DSG抗原的小鼠；空心符号为接种在x轴上标记的FimH-DSG O-抗原组合的组的小鼠。

图40A-40B-描绘使用小鼠血清池的膀胱分析的结果证实使用个体小鼠血清的酵母菌甘露聚糖分析数据。来自汇集的小鼠血清(n＝10)的膀胱细胞结合抑制曲线。图例中的细节与图39A-39B中相同。兔抗FimH阳性对照血清滴定还显示为恒定分析参考标准。

图41-描绘佐剂及FimH-DSG对O-抗原特异性血清IgG含量的影响。封闭符号及空心符号分别表示PD2及PD3时间点值。汇集每组十只预先接种的CD-1小鼠，以确定用于各抗原的基线IgG含量。各预先接种的池的GMT＜自标准曲线偏差分析确定的定量的下限(0.15μg/mL，虚线)。反应者比率指示为每组小鼠中显示出效价比基线增加大于5倍的百分比。各组之间的抗体效价差异通过不配对t检验来分析，其中韦尔奇氏校正**P＜0.05。

图42-描绘佐剂及FimH-DSG对O-抗原特异性血清OPA效价的影响。细节与图41相同。虚线反映来自小鼠预先接种血清池(1/2x LOD或50，n＝10)的基线效价。封闭符号及空心符号分别表示PD2及PD3时间点值。

序列识别符

SEQ ID NO:1示出野生型1型伞毛D-甘露糖特异性黏附素[大肠杆菌FimH J96]的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2示出对应于SEQ ID NO:1的aa残基22-300(成熟FimH蛋白质)的FimH片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3示出FimH凝集素域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4示出FimH菌毛蛋白域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02198-FimH mIgK信号肽/F22..Q300J96 FimH N28S V48C L55C N91 S N249Q/7AA接头/FimG A1..K14/GGHis8于pcDNA3.1(+)中)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02307-FimH mIgK信号肽/F22..Q300J96 FimH N28S N91S N249Q/His8于pcDNA3.1(+)中)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02083 FimH凝集素域野生型构建体)的多肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02158 FimH凝集素域锁突变体)的多肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9示出衍生自大肠杆菌FimG(FimG A1..K14)的多肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10示出衍生自大肠杆菌FimC的多肽片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11示出4aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12示出5aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13示出6aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14示出7aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15示出8aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16示出9aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17示出10aa接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18示出FimH J96信号序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19示出SEQ ID NO:5的信号肽(pSB02198-FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7AA接头/FimG A1..K14/GGHis8于pcDNA3.1(+)中)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20示出根据SEQ ID NO:5的衍生自大肠杆菌FimH(pSB02198-FimHmIgK信号肽/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55CN91 S N249Q/7AA接头/FimG A1..K14/GGHis8于pcDNA3.1(+)中的成熟蛋白)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21示出衍生自大肠杆菌FimG的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22示出SEQ ID NO:6的信号肽(pSB02307-FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8于pcDNA3.1(+)中)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23示出根据SEQ ID NO:6的衍生自大肠杆菌FimH(FimH mIgK信号肽/F22..Q300 J96 FimH N28S N91 S N249Q/His8于pcDNA3.1(+)中的成熟蛋白)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24示出根据SEQ ID NO:7的衍生自大肠杆菌FimH(pSB02083 FimH凝集素域野生型构建体的成熟蛋白)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25示出His标签的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26示出根据SEQ ID NO:8的衍生自大肠杆菌FimH(pSB02158 FimH凝集素域锁突变体的成熟蛋白)的多肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:27示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB01878)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28示出衍生自大肠杆菌FimH(K12)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29示出衍生自大肠杆菌FimH(UTI89)的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:30示出O25b 2401WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:31示出O25a:K5:H1 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:32示出O25a ETEC ATCC WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:33示出K12 W3110 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:34示出沙门氏菌LT2 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:35示出O25b 2401FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:36示出O25a:K5:H1 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:37示出O25a ETEC ATCC FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:38示出O157 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:39示出沙门氏菌LT2 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:40示出LT2wzzB_S的引物序列。

SEQ ID NO:41示出LT2wzzB_AS的引物序列。

SEQ ID NO:42示出O25bFepE_S的引物序列。

SEQ ID NO:43示出O25bFepE_A的引物序列。

SEQ ID NO:44示出wzzB P1_S的引物序列。

SEQ ID NO:45示出wzzB P2_AS的引物序列。

SEQ ID NO:46示出wzzB P3_S的引物序列。

SEQ ID NO:47示出wzzB P4_AS的引物序列。

SEQ ID NO:48示出O157 FepE_S的引物序列。

SEQ ID NO:49示出O157 FepE_AS的引物序列。

SEQ ID NO:50示出pBAD33_转接子_S的引物序列。

SEQ ID NO:51示出pBAD33_转接子_AS的引物序列。

SEQ ID NO:52示出JUMPSTART_r的引物序列。

SEQ ID NO:53示出gnd_f的引物序列。

SEQ ID NO:54示出小鼠IgK信号序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO:55示出人类IgG受体FcRn大亚单元p51信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:56示出人类IL10蛋白质信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:57示出人类呼吸道合胞病毒A(病毒株A2)融合糖蛋白F0信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:58示出A型流感血球凝集素信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:59-101示出纳米结构相关多肽或其片段的氨基酸及核酸序列。

SEQ ID NO:102-109示出用于信号肽预测的各种物种的SignalP 4.1(DTUBioinformatics)序列。

SEQ ID NO:110示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02083--FimH_LD(mIgK信号肽，N28S，N91S))的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:111示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02158--FimH_LD-LM(mIgK信号肽，N28S N91S V48C L55C))的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:112示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02307-FimH-DSG(mIgK信号肽，N28SN91 S N249Q 7aa接头FimG A1..K14))的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:113示出衍生自大肠杆菌FimH(pSB02198-FimH-DSG-LM(mIgK信号肽，N28S N91S 249Q V48C L55C 7aa接头FimG A1..K14))的多肽的氨基酸序列。

发明详述

本公开内容涉及一种包含大肠杆菌FimH多肽及O-抗原糖缀合物的组合物、用于产生且纯化这些组合物的方法及使用这些组合物的方法。

在一个方面，本发明包括一种组合物，其包括本文所描述的FimH多肽或其片段。该组合物可包括适合于体内施用的多肽或其片段。例如，此类组合物中的多肽或其片段可具有以质量计至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的纯度。在一个实施方案中，此类组合物中的多肽可具有以质量计至少95％的纯度。在一个实施方案中，此类组合物中的多肽可具有以质量计至少97％的纯度。在一个实施方案中，此类组合物中的多肽可具有以质量计至少98％的纯度。在一个实施方案中，此类组合物中的多肽可具有以质量计至少99％的纯度。该组合物可进一步包含佐剂。

在另一方面，本发明包括一种用于诱导针对大肠杆菌或大肠杆菌感染的免疫反应的组合物。还公开本文所描述的组合物用于诱导针对大肠杆菌或大肠杆菌感染的免疫反应的用途及本文所描述的组合物在制造用于诱导针对大肠杆菌或大肠杆菌感染的免疫反应的药物中的用途。

本文中值的范围的叙述仅仅旨在充当单独地提及处于该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指示，否则每个单独值并入至本说明书中，如同其在本文中单独地叙述一般。除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法可以任何适合的顺序进行。使用本文所提供的任何及所有实施例或示例性语言(例如“诸如”)仅旨在进一步说明本公开内容且不对权利要求的范围造成限制。本说明书中的语言不应理解为指示任何未主张的要素对于实践本公开内容而言必不可少。

在本公开内容的整个文本中引用若干文献。本文引用的各文献(包括所有专利、专利申请、科学公开、制造商的说明书、说明等)无论在上文还是下文，均以全文引用的方式并入本文中。不应将本文中的任何内容解释为承认本公开内容无权先于此公开内容。

定义

如本文所使用，术语“约(about)”是指大约或几乎，且在本文所阐述的数值或范围的情形下，在一个实施方案中是指±20％、±10％、±5％或±3％的所叙述或所主张的数值或范围。

除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其在权利要求的上下文中)使用的术语“一(a/an)”和“该”以及类似参考物应理解为涵盖单数及复数。

参考氨基酸序列(肽或蛋白质)的“片段”是指氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端处缩短的氨基酸序列的序列。在C端处缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译截短的开放阅读框获得，该开放阅读框不具有开放阅读框的3'端。在N端处缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译截短的开放阅读框获得，该开放阅读框不具有开放阅读框的5'端，只要该截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含例如来自氨基酸序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个，特别地至少8个，至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。

如本文所用，术语“野生型”或“WT”或“天然”是指在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变体。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。

如本文所用，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”或“突变体”或提及“突变的”多肽包含氨基酸插入变体/突变体、氨基酸添加变体/突变体、氨基酸缺失变体/突变体和/或氨基酸取代变体/突变体。术语“变体”或“突变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构型、同功型、等位基因变体、物种变体以及物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”或“突变体”包括特别地氨基酸序列的片段。

氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或多个氨基酸残基被插入至氨基酸序列的特定位点中，但还可能通过适当筛选所得产物进行随机插入。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸，诸如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合物。氨基酸缺失变体的特征为从序列中移除一个或多个氨基酸，诸如移除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可能在蛋白质的任何位置中。包含在蛋白质的N端和/或C端处的缺失的氨基酸缺失变体还称为N端和/或C端截短变体。氨基酸取代变体的特征为移除序列中的至少一个残基且在该位置插入另一残基。优选位于同源蛋白质或肽之间不保守的氨基酸序列位置中的修饰和/或用具有类似特性的其他氨基酸置换氨基酸。优选地，肽及蛋白质变体的氨基酸变化为保守性氨基酸变化，即类似地带电或不带电氨基酸的取代。保守性氨基酸变化涉及其侧链中相关的氨基酸家族中的一种的取代。天然存在的氨基酸通常分成四个家庭：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)及不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸有时联合分类为芳族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸取代包括在以下组内的取代：

甘氨酸、丙氨酸；

缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；

天冬氨酸、谷氨酸；

天冬酰胺、谷氨酰胺；

丝氨酸、苏氨酸；

赖氨酸、精氨酸；以及

苯丙氨酸、酪氨酸。

优选地，指定氨基酸序列与作为该指定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。相似性或同一性程度优选针对参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性程度优选针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，在一些实施方案中为连续氨基酸给出。在一些实施方案中，相似性或同一性程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性程度的比对可使用本领域已知的工具，优选使用最佳序列比对，例如使用Align，其使用标准设置，优选EMBOSS:针，矩阵：Blosum62，间隙开口10.0，间隙延伸0.5进行。

如本文所用，“序列相似性”指示相同的或表示保守性氨基酸取代的氨基酸百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的氨基酸百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的核苷酸百分比。

术语“同一性％”、“同一性％”或类似术语旨在指特别地在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。该百分比纯粹为统计的，且两个序列之间的差异可能但未必随机分布于待比较的序列的全长上。两个序列的比较通常通过在最佳比对之后相对于片段或“比较窗”比较序列来进行，以便鉴别相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可手动地或借助于Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助于Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法或借助于使用这些算法的计算机程序(在Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis.)进行。在一些实施方案中，两个序列的同一性百分比是使用如在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上(例如，blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq上)可获得的BLASTN或BLASTP算法确定。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTN算法的算法参数包括：(i)期望临界值设定为10；(ii)字长设定为28；(iii)询问范围中的最大匹配数设定为0；(iv)匹配/错配评分设定为1、-2；(v)间隙成本设定为线性的；以及(vi)用于正使用的低复杂度区域的过滤器。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTP算法的算法参数包括：(i)期望临界值设定为10；(ii)字长设定为3；(iii)询问范围中的最大匹配数设定为0；(iv)矩阵设定为BLOSUM62；(v)间隙成本设定为存在：11延伸：1；以及(vi)条件性组成评分矩阵调节。

同一性百分比是通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，将此数值除以所比较的位置数(例如，参考序列中的位置数)且将此结果乘以100来获得。

在一些实施方案中，针对参考序列的全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出相似性或同一性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则同一性程度针对至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个核苷酸，在一些实施方案中为连续核苷酸给出。在一些实施方案中，相似性或同一性程度针对参考序列的全长给出。

根据本发明，同源氨基酸序列展现出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，且优选至少95％、至少98％或至少99％同一性。本文所描述的氨基酸序列变体/突变体可由本领域技术人员容易地制备，例如通过重组DNA操纵。用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操纵详细描述于例如Sambrook等人,(1989)中。此外，本文所描述的肽及氨基酸变体可容易地借助于已知肽合成技术，诸如通过固相合成及类似方法制备。

在一个方面，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体/突变体优选为“功能片段”或“功能变体”。氨基酸序列的术语“功能片段”或“功能变体/突变体”是指展现出与其所衍生的氨基酸序列相同或类似的一个或多个功能特性，即其功能上为等效的任何片段或变体/突变体。关于抗原或抗原序列，一种特定功能为通过从片段或变体衍生的氨基酸序列呈现的一种或多种免疫原性活性。如本文所用，术语“功能片段”或“功能变体/突变体”特别地是指包含氨基酸序列的变体/突变体分子或序列，该氨基酸序列与亲本分子或序列相比改变一个或多个氨基酸且仍能够满足亲本分子或序列的功能中的一种或多种，例如诱导免疫反应。在一个方面，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰未显著影响或改变该分子或序列的特征。在不同实施方案中，功能片段或功能变体的功能可能降低但仍显著存在，例如功能变体的免疫原性可为亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在其他实施方案中，功能片段或功能变体的免疫原性可与亲本分子或序列相比得以增强。

如本文所用，术语“经分离的”是指自天然状态改变或移除。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽并非“经分离的”，但自其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽为“经分离的”。经分离的核酸或蛋白质可以实质上纯化形式存在，或可存在于诸如宿主细胞的非天然环境中。I.衍生自大肠杆菌的多肽及其片段

在一个方面，本文公开一种哺乳动物细胞，其包括编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的多核苷酸。如本文所用的术语“衍生自……”是指包含如本文所描述的FimH多肽或FimCH多肽复合物或其片段的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变。优选地，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的序列。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段的序列具有至少85％的同一性。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段的序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段的序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段的序列具有至少98％的同一性。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段的序列具有至少99％的同一性。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段与相应野生型FimH多肽或FimCH多肽复合物或其片段具有相同的氨基酸总长度。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽与相应野生型FimH多肽或FimCH多肽复合物具有相同的氨基酸总长度。

片段应包括来自序列的至少n个连续的氨基酸，且取决于特定序列，n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20或更多)。优选地，片段包括来自序列的表位。在一些实施方案中，片段包括衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，片段包括衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，片段包括衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的至少100个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，片段包括衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的至少150个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，片段包括衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的至少200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，片段包括衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。

在一些实施方案中，与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段相比，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括一个或多个非典型氨基酸。

如本文所使用，术语“FimH多肽”是指通过引入氨基酸取代、缺失或添加而改变的如本文所描述的任何FimH多肽或其片段、全长野生型大肠杆菌FimH多肽的任何FimH域、全长野生型大肠杆菌FimH多肽或全长大肠杆菌FimH多肽的域的任何组合。例如，在一个实施方案中，本发明提供一种FimH多肽，其为FimH_LD多肽或FimH-DSG多肽。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段具有与相应野生型FimH多肽或其片段相似或相同的功能。

在一个优选实施方案中，本发明的多肽或多肽复合物或其片段经分离或纯化。

在一些实施方案中，编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的多核苷酸经整合至哺乳动物细胞的基因组DNA中，且当在适合的条件下培养时，该衍生自大肠杆菌的多肽或其片段由哺乳动物细胞表达。

在一个优选实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段为可溶的。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段从哺乳动物宿主细胞分泌。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可包括额外氨基酸残基，诸如N端或C端延伸部分。此类延伸部分可包括一个或多个标签，其可促进多肽或其片段的检测(例如用于单克隆抗体检测的表位标签)和/或纯化(例如允许在镍螯合树脂上纯化的聚组氨酸标签)。在一些实施方案中，标签包括选自SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25中的任一个的氨基酸序列。此类亲和纯化标签是本领域已知的。亲和纯化标签的实例包括例如His标签(六组氨酸，其可例如与金属离子结合)；麦芽糖结合蛋白质(MBP)，其可例如与直链淀粉结合)；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，其可例如与谷胱甘肽结合；FLAG标签，其可例如与抗flag抗体结合)；Strep标签，其可例如与链霉抗生物素蛋白或其衍生物结合)。在优选实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段不包括额外氨基酸残基，诸如N端或C端延伸部分。在一些实施方案中，本文所描述的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段不包括外源性标签序列。

虽然本文中可能提及大肠杆菌的特定菌株，但应理解，除非指明，否则衍生自大肠杆菌的多肽或其片段不限于特定菌株。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段包括在多肽的N端处的苯丙氨酸残基。在一些实施方案中，衍生自FimH的多肽或其片段包括在N端之前20个残基位置内的苯丙氨酸残基。优选地，苯丙氨酸残基位于多肽的位置1。例如，在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段不包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段的N端处的额外甘氨酸残基。

在一些实施方案中，野生型成熟大肠杆菌FimH的位置1处的苯丙氨酸残基被脂肪族疏水性氨基酸，诸如Ile、Leu和Val残基中的任一个置换。

在一些实施方案中，信号肽可用于表达衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。用于产生蛋白质的信号序列和表达盒是本领域已知的。一般而言，前导肽为5-30个氨基酸长，且通常存在于新合成的多肽的N端。信号肽一般含有具有形成单一α-螺旋的趋势的长段疏水性氨基酸。另外，许多信号肽以一段短的带正电荷的氨基酸开始，其可有助于在易位期间加强多肽的适当拓朴结构。在信号肽的末端，通常存在一段由信号肽酶识别且裂解的氨基酸。信号肽酶可在易位期间或在易位完成后裂解，以产生游离信号肽及成熟蛋白。在一些实施方案中，信号肽包括与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包括与SEQID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22中的任一个具有至少99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽具有选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:22中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所描述的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可包括可裂解接头。此类接头允许标签与经纯化的复合物分离，例如通过添加能够裂解接头的试剂。可裂解接头是本领域已知的。此类接头可例如通过照射光不稳定键或酸催化的水解来裂解。可裂解接头的另一实例包括多肽接头，其掺入蛋白酶识别位点且可通过添加适合的蛋白酶而裂解。

在一些实施方案中，与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段相比，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括修饰。修饰可包括分子与多肽的共价连接。例如，此类修饰可包括糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护基/阻隔基衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质的连接等。在一些实施方案中，与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或片段相比，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可包括修饰，诸如通过使用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰，包括但不限于特定化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素(tunicamycin)的代谢合成等。在另一个实施方案中，修饰可包括脂质分子与多肽的共价连接。在一些实施方案中，与相应野生型大肠杆菌FimH多肽或其片段相比，多肽不包括分子与多肽的共价连接。

例如，细胞培养物中产生的蛋白质及多肽可以是含有共价连接的碳水化合物结构(包括寡糖链)的糖蛋白。这些寡糖链经由N-连接或O-连接与蛋白质连接。寡糖链可占糖蛋白质量的相当大的一部分。一般而言，N-连接的寡糖添加至Asn-X-Ser/Thr的目标共有序列内的天冬酰胺残基的侧链上的氨基，其中X可为除脯氨酸外的任何氨基酸。在一些实施方案中，糖基化位点包括选自以下中的任一个的氨基酸序列：天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸(NGT)、天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)以及天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)。在哺乳动物细胞中产生的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可经糖基化。糖基化可发生在衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列中的N-连接的糖基化信号Asn-Xaa-Ser/Thr处。“N-连接的糖基化”是指碳水化合物部分经由GIcNAc附接至多肽链中的天冬酰胺残基。N-连接的碳水化合物含有常见的Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R核心结构，其中R表示所产生的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的天冬酰胺残基。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段中的糖基化位点通过衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列内的突变而移除。例如，在一些实施方案中，糖基化基序(Asn-Xaa-Ser/Thr)的Asn残基可优选通过取代而突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一个。

在一些实施方案中，糖基化基序的Ser残基可优选通过取代而突变。在一些实施方案中，残基取代选自Asp、Thr和Gln中的任一个。

在一些实施方案中，糖基化基序的Thr残基可优选通过取代而突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp及Gln中的任一个。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段中的糖基化位点(诸如Asn-Xaa-Ser/Thr)未经移除或修饰。在一些实施方案中，可将降低或抑制糖基化的化合物添加至细胞培养基中。在这类实施方案中，多肽或蛋白质与在其他方面相同的条件下但不存在糖基化抑制化合物的情况下由细胞产生的其他方面相同的多肽或蛋白质相比，多包括至少一个未糖基化(即去糖基化)位点，即完全未占据的聚糖位点，且无碳水化合物部分与其附接，或在相同的潜在糖基化位点处少包含至少一个碳水化合物部分。此类化合物是本领域已知的，且可包括但不限于衣霉素、衣霉素同系物、链病毒菌素(streptovirudin)、杀枝孢菌素(mycospocidin)、安福霉素(amphomycin)、津枝霉素(tsushimycin)、抗生素24010、抗生素MM 19290、枯草菌素(bacitracin)、棒状杆菌毒素(corynetoxin)、焦土霉素(showdomycin)、金霉素(duimycin)、1-脱氧甘露糖野尻霉素(1-deoxymannonojirimycin)、脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin)、N-甲基-1-脱氧甘露糖野尻霉、布雷菲德菌素A(brefeldin A)、葡萄糖及甘露糖类似物、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧葡萄糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖、1,4-二脱氧-1,4-亚胺基-D-甘露醇(DIM)、氟葡萄糖、氟甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、羟甲基戊二酰-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆固醇、羟基胆固醇、苦马豆素(swainsonine)、环己酰亚胺、嘌呤霉素(puromycin)、放线菌素D(actinomycin D)、莫能菌素(monensin)、间氯羰基氰化物苯腙(CCCP)、密实菌素(compactin)、多萜基-磷酰基^-脱氧葡萄糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗树精胺(castanospermine)、谷酰氨酸、溴环己烯四醇(bromoconduritol)、环己烯四醇环氧化物(conduritol epoxide)及环己烯四醇衍生物、糖基甲基对硝基苯基三氮烯、β-羟基正缬氨酸、苏-β-氟天冬酰胺、D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、磷酸十二烷基酯、(二苯基甲基)-磷酸的2-二甲胺基乙酯、[2-(二苯基氧膦基氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸酯和/或氟乙酸酯。本领域普通技术人员将容易认识到或将能够确定可根据本发明的方法及组合物使用的糖基化抑制物质，而无需过度实验。在这类实施方案中，可控制多肽或其片段的糖基化，而无需将氨基酸突变引入多肽或其片段中。

在一些实施方案中，由哺乳动物细胞产生的多肽或其片段的糖基化含量(例如多肽或其片段上所占据的聚糖位点数目、该位点处糖型的大小和/或复杂性等)低于在其他条件都相同下在缺乏此类糖酵解抑制化合物和/或突变的其他方面相同的培养基中产生的多肽或其片段的糖基化含量。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列不包括N-连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列不包括至少一个N连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列不包括任何N连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列包括N连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列包括至多1个N连接的蛋白质糖基化位点。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列包括至多2个N连接的蛋白质糖基化位点。

由不同细胞系表示且在转基因动物中的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可具有与彼此相比不同的聚糖位点占有率、糖型和/或糖基化模式。在一些实施方案中，本发明涵盖衍生自大肠杆菌的多肽或其片段，而不管在哺乳动物细胞中产生的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的糖基化、聚糖占有率或糖型模式。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可衍生自大肠杆菌FimH多肽，其中该多肽的位置1处的氨基酸残基为苯丙氨酸，而非甲硫氨酸，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽。优选地，衍生自大肠杆菌FimH的多肽包含衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的位置1处的苯丙氨酸。在另一优选实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，优选其中衍生自大肠杆菌的多肽的氨基酸序列的位置1处的残基为苯丙氨酸。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可包括氨基酸序列SEQID NO:4，其可衍生自大肠杆菌FimH多肽。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个具有至少95％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个具有至少99％的同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可衍生自大肠杆菌FimG多肽，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可衍生自大肠杆菌FimC多肽，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO:10。

A.衍生自大肠杆菌FimH的多肽及其片段

在一个优选实施方案中，多肽或其片段衍生自大肠杆菌FimH。在一些实施方案中，多肽或其片段包括全长大肠杆菌FimH。全长FimH包括两个域：N端凝集素域和C端菌毛蛋白域，其通过短接头连接。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH的全长包括279个氨基酸，其包括大肠杆菌FimH的成熟蛋白的全长。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH的全长包括300个氨基酸，其包括大肠杆菌FimH的成熟蛋白的全长及长度为21个氨基酸的信号肽序列。300个氨基酸长的野生型FimH的一级结构在大肠杆菌菌株中高度保守。

全长大肠杆菌FimH的示例性序列为SEQ ID NO:1。全长FimH序列包括凝集素域的序列和菌毛蛋白域的序列。FimH的凝集素域含有碳水化合物识别域，其负责结合至尿路上皮细胞表面上的甘露糖基化尿溶蛋白1a。菌毛蛋白域经由后续FimG亚单元的供体链锚定至菌毛的核心，其称为供体链补充的过程。

自N端开始，名称及括号中的全长FimH的各域的示例性氨基酸序列如下：FimH凝集素(SEQ ID NO:2)及FimH菌毛蛋白(SEQ ID NO:3)。

衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个具有不同程度的同一性的变体，诸如与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的变体。其他适合的多肽与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:112和SEQ ID NO:113具有至少95％的同一性。其他适合的多肽与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113具有至少99％的同一性。在某些实施方案中，FimH变体蛋白质：(i)形成FimH-FimC的一部分；(ii)包含来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113的至少一个表位；和/或(iii)可在体内引发与大肠杆菌FimH免疫交叉反应的抗体。

在一些实施方案中，组合物包括具有至少n个来自以下中的任一个的连续氨基酸的多肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113，其中n为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20或更大)。优选地，片段包括来自序列的表位。在一些实施方案中，组合物包括具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:112和SEQ ID NO:113中的任一个的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，组合物包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个的至少50个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，组合物包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个的至少100个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，组合物包括具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:112和SEQ ID NO:113中的任一个的至少200个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，组合物包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个的氨基酸序列的至少250个连续氨基酸残基的多肽。

在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:1具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:1具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:1中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:2具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:2具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:2具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:2具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:2中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ IDNO:3具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:3具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:3具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:3具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:3中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:4具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:4具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:4具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:4具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:4中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:5具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:5具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:5具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:5具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:5中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:6具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:6具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:6具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:6具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:6中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:20具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:20具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:20具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:20具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:20中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:23具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ IDNO:23具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:23具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:23具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:23中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:24具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:24具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:24具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQID NO:24具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:24中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:26具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:26具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:26具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:26具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:26中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:27具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:27具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:27具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:27具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:27中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:28具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:28具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQID NO:28具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:28具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:28中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:29具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:29具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:29具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:29具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:29中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:110中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:111具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:111具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ IDNO:111具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:111具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:111中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:112具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:112具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:112具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:112具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:112中所示的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:113具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:113具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:113具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:113具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:113中所示的多肽。

本文所描述的衍生自大肠杆菌FimH的适合的多肽及其片段的另一实例显示为SEQID NO:2，其缺乏野生型N端信号序列且对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基22-300。FimH片段的另一实例包括完整N端信号序列及成熟蛋白，诸如SEQ ID NO:1中所阐述。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段中的糖基化位点通过衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列内的突变而移除。例如，在一些实施方案中，成熟大肠杆菌FimH多肽的位置7处的Asn残基(例如，根据SEQ ID NO:2的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH多肽的凝集素域的位置7处的Asn残基(例如，根据SEQ IDNO:3的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一个。

在一些实施方案中，成熟大肠杆菌FimH多肽的位置10处的Thr残基(例如，根据SEQID NO:2的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH多肽的凝集素域的位置7处的Thr残基(例如，根据SEQ ID NO:3的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp及Gln中的任一个。

在一些实施方案中，成熟大肠杆菌FimH多肽的位置N235处的Asn残基(例如，根据SEQ ID NO:2的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，成熟大肠杆菌FimH多肽的位置N228处的Asn残基(例如，根据SEQ ID NO:2的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一个。

在一些实施方案中，成熟大肠杆菌FimH多肽的位置70处的Asn残基(例如，根据SEQID NO:2的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH多肽的凝集素域的位置70处的Asn残基(例如，根据SEQ ID NO:3的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，残基取代选自Ser、Asp、Thr和Gln中的任一个。

在一些实施方案中，成熟大肠杆菌FimH多肽的位置72处的Ser残基(例如，根据SEQID NO:2的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH多肽的凝集素域的位置72处的Ser残基(例如，根据SEQ ID NO:3的编号)可优选通过取代来突变。在一些实施方案中，残基取代选自Asp、Thr和Gln中的任一个。

如本文所用，术语“片段”是指多肽且定义为该多肽所特有或特征性的给定多肽的任何离散部分。如本文所用的术语还指给定多肽的任何离散部分，其保留至少一部分全长多肽的活性。在某些实施方案中，保留的活性部分为全长多肽的活性的至少10％。在某些实施方案中，保留的活性部分为全长多肽的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，保留的活性部分为全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，保留的活性部分为全长多肽的活性的100％或更多。在一些实施方案中，片段包括至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个全长多肽的连续氨基酸。

B.FimH、FimC及其片段的复合物

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段存在于衍生自大肠杆菌FimC的多肽或其片段的复合物中。在一个优选实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段及衍生自大肠杆菌FimC的多肽或其片段以复合物形式存在，优选以复合物中的1:1比率存在。不受理论或机制束缚，全长FimH可通过周质伴随蛋白FimC稳定在活性构型中，由此使得有可能纯化全长FimH蛋白质。因此，在一些实施方案中，多肽或其片段包括全长FimH及全长FimC。

在一些实施方案中，多肽或其片段包括FimH的片段及FimC的片段。在一些实施方案中，多肽或其片段包括全长FimH及FimC的片段。大肠杆菌FimC的示例性序列阐述于SEQID NO:10中。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括FimH的复合物形成片段。

FimH的复合物形成片段可为保留与FimC或其片段形成复合物的能力的FimH蛋白质的任何部分或部分。FimH的适合的复合物形成片段还可通过本领域已知的标准分析得到或确定，诸如共免疫沉淀分析、通过荧光染色的交联或共定位等。还可使用SDS-PAGE或蛋白质印迹(例如通过如凝胶电泳所证明，FimH片段及FimC或其片段呈复合物形式)。在某些实施方案中，FimH的复合物形成片段(i)形成FimH-FimC复合物的一部分；(ii)包含至少一个来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111的表位；和/或(iii)可体内引发抗体与大肠杆菌FimH发生免疫交叉反应。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括全长FimH，其中该FimH不与FimC复合。在其他实施方案中，多肽或其片段包括FimH的片段，其中该片段不与FimC复合。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段FimC包括SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，复合物可从相同质粒表达，优选在各多肽或其片段的单独启动子的控制下。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段结合至衍生自大肠杆菌FimC的多肽或其片段，其可经工程化至衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段的结构中。结合至复合物中的FimH的FimC分子的部分称为“供体链”，且使用来自结合至FimCH复合物中的FimH的FimC的链形成天然FimH结构的机制称为“供体链互补”。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段可通过FimH的适当供体链互补型式表示，其中与FimCH复合物中的FimH相互作用的FimC的氨基酸序列本身在FimH的C端进行工程化，以提供天然构型，而不需要存在该FimC分子的剩余部分。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段可以包括其经分离域的复合物形式表达，诸如凝集素结合域及菌毛蛋白域，且此类域可共价或非共价连接在一起。例如，在一些实施方案中，连接片段可包括氨基酸序列或其他寡聚结构，包括简单聚合物结构。

本发明的方法及组合物可包括本文所描述的复合物，其中衍生自大肠杆菌的这些多肽或其片段共表达或以组合状态形成。

C.凝集素域、菌毛蛋白域及其变体

FimH的凝集素域的构型及配体结合特性可在FimH的菌毛蛋白域的异位控制下。在静态条件下，全长FimH的两个域的相互作用使凝集素域在较低亲和力下稳定成单甘露糖状态(例如K_d约300μM)，其特征为浅结合袋(shallow binding pocket)。结合至甘露糖甘配体可诱导构型变化，从而产生中等亲和力状态，其中凝集素及菌毛蛋白域保持紧密接触。然而，在剪切应力下，凝集素可与菌毛蛋白域分开且诱导较高亲和力状态(例如，K_d<1.2μM)。

因为不存在由菌毛蛋白域施加的负变构调节，所以FimH的经分离凝集素域被锁定在较高亲和力状态下(例如，K_d<1.2μM)。经分离重组凝集素域经锁定在较高亲和力状态。然而，以较低亲和力构型锁定黏附素(例如K_d约300μM)诱导产生抑制黏附的抗体。因此，关注使凝集素域在低亲和力状态下稳定。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括大肠杆菌FimH的凝集素域。凝集素域的示例性序列包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111中的任一个。在一些实施方案中，大肠杆菌FimH的凝集素域包括半胱氨酸取代。在一个优选实施方案中，大肠杆菌FimH的凝集素域包括在凝集素域之前50个氨基酸残基内的半胱氨酸取代。在一些实施方案中，凝集素域可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个半胱氨酸取代。优选地，凝集素域包括2个半胱氨酸取代。参见例如pSB02158及pSB02198。

衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ ID NO:3具有不同程度同一性的FimH凝集素域变体，诸如与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:3具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:3具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:3具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:3具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQID NO:3中所示的多肽。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括大肠杆菌FimH的菌毛蛋白域。衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ ID NO:7具有不同程度同一性的FimH菌毛蛋白域变体，诸如与SEQ ID NO:7所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:7具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:7具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:7具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:7具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:7中所示的多肽。衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ ID NO:8具有不同程度同一性的FimH凝集素域变体，诸如与SEQ ID NO:8所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:8具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:8具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:8具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:8具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:8中所示的多肽。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括大肠杆菌FimH的菌毛蛋白域。衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ ID NO:24具有不同程度同一性的FimH菌毛蛋白域变体，诸如与SEQID NO:24所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ IDNO:24具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:24具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:24具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:24具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:24中所示的多肽。衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ ID NO:26具有不同程度同一性的FimH凝集素域变体，诸如与SEQ ID NO:26所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:26具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:26具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQID NO:26具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:26具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:26中所示的多肽。衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ IDNO:110具有不同程度同一性的FimH凝集素域变体，诸如与SEQ ID NO:110所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:110具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:110中所示的多肽。衍生自大肠杆菌FimH的其他适合的多肽及其片段包括与SEQ ID NO:111具有不同程度同一性的FimH凝集素域变体，诸如与SEQ ID NO:111所示的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:111具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:111具有至少90％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:111具有至少95％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括与SEQ ID NO:111具有至少99％的同一性的多肽。在一些实施方案中，组合物包括如SEQ ID NO:111中所示的多肽。

在一些实施方案中，组合物包括具有至少n个来自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111中的任一个的连续氨基酸的多肽，其中n为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20或更大)。优选地，片段包括来自序列的表位。在一些实施方案中，该组合物包括具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111中的任一个的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，该组合物包括具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111中的任一个的至少50个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，该组合物包括具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111中的任一个的至少100个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，该组合物包括具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:110和SEQ ID NO:111中的任一个的至少150个连续氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，该组合物包括具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111中的任一个的氨基酸序列的至少250个连续氨基酸残基的多肽。

大肠杆菌FimH或其同源物或变体的凝集素域的位置及长度可基于其序列与SEQID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:110和SEQID NO:111中的一种的成对比对来预测，例如通过将FimH的氨基酸序列与SEQ ID NO:1比对，且鉴别与SEQ ID NO:1的残基22-179比对的序列。

D.野生型N端信号序列

在一些实施方案中，全长FimH的N端野生型信号序列在宿主细胞中裂解以产生成熟FimH多肽。因此，由宿主细胞表达的FimH可能缺乏N端信号序列。在优选实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可由缺乏野生型N端信号序列的编码序列的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括FimH的形成FimH-FimC复合物的片段、N端信号序列(诸如SEQ ID NO:1的残基1-21)或其组合。FimH的复合物形成片段可为保留与FimC形成复合物的能力的FimH蛋白质的任何部分或部分。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可能在全长FimH多肽的N端和/或C端处缺乏1与21个之间的氨基酸残基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸残基，或缺乏1至21个残基、1至20个残基、1至15个残基、1至10个残基、2至20个残基、2至15个残基、2至10个残基、5至20个残基、5至15个残基或5至10个残基)，该氨基酸残基可包括信号序列、凝集素域及菌毛蛋白域。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的N端处缺乏1-21个残基。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的N端处缺乏1-10个残基。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的N端处缺乏5-15个残基。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的N端处缺乏5-10个残基。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的C端处缺乏1-21个残基。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的C端处缺乏1-10个残基。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的C端处缺乏5-15个残基。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段在全长FimH多肽的C端处缺乏5-10个残基。

II.核酸

在一个方面，公开编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的核酸。编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的一个或多个核酸构建体可用于衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的基因组整合及后续表达。例如，可将编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的单一核酸构建体引入至宿主细胞中。或者，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的编码序列可由两个或更多个核酸构建体携带，其随后同时或依次引入宿主细胞中。

例如，在一个示例性实施方案中，单一核酸构建体编码大肠杆菌FimH的凝集素域及菌毛蛋白域。在另一示例性实施方案中，一个核酸构建体编码凝集素域，且第二核酸构建体编码大肠杆菌FimH的菌毛蛋白域。在一些实施方案中，实现基因组整合。

核酸构建体可包含基因组DNA，其包含一个或多个内含子或cDNA。当存在内含子时，一些基因更有效地表达。在一些实施方案中，核酸序列适用于在该哺乳动物细胞中表达外源性多肽。

在一些实施方案中，编码多肽或其片段的核酸经密码子优化以增加任何特定细胞中的表达量。

在一些实施方案中，核酸构建体包括编码引导衍生自大肠杆菌的多肽或其片段分泌的肽的信号序列。在一些实施方案中，核酸包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽的天然信号序列。在衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括内源性信号序列的一些实施方案中，编码信号序列的核酸序列可经密码子优化以增加蛋白质在宿主细胞中的表达量。

在一些实施方案中，信号序列为以下长度中的任一个：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30个氨基酸长。在一些实施方案中，信号序列为20个氨基酸长。在一些实施方案中，信号序列为21个氨基酸长。

在一些实施方案中，在多肽或其片段包括信号序列时，与多肽天然缔合的内源性信号序列可经不与野生型多肽缔合的信号序列置换，以改进经培养细胞中的多肽或其片段的表达量。因此，在一些实施方案中，核酸不包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的天然信号序列。在一些实施方案中，核酸不包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽的天然信号序列。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可由异源性肽表达，该异源性肽优选为在成熟蛋白或衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的N端处具有特定裂解位点的信号序列或其他肽。例如，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段可由异源性肽(例如IgK信号序列)表达，该异源性肽优选为在成熟大肠杆菌FimH蛋白质的N端处具有特定裂解位点的信号序列或其他肽。在优选实施方案中，成熟蛋白大肠杆菌FimH的N端处的特定裂解位点紧接着在成熟大肠杆菌FimH蛋白质的初始苯丙氨酸残基之前发生。所选异源性序列优选为经宿主细胞识别且处理(即通过信号肽酶裂解)的序列。

在优选实施方案中，信号序列为IgK信号序列。在一些实施方案中，核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:22。在优选实施方案中，信号序列为小鼠IgK信号序列。

用于产生衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的适合的哺乳动物表达载体是本领域已知的且可商购的，诸如来自Invitrogen^TM的pSecTag2表达载体。示例性小鼠Igκ信号肽序列包括序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:54)。在一些实施方案中，载体包括来自Thermo Fisher的pBudCE4.1哺乳动物表达载体。额外示例性和适合的载体包括pcDNA^TM3.1哺乳动物表达载体(Thermo Fisher)。

在一些实施方案中，信号序列不包括红血球凝集素信号序列。

在一些实施方案中，核酸包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的天然信号序列。在一些实施方案中，信号序列不是IgK信号序列。在一些实施方案中，信号序列包括红血球凝集素信号序列。

在一个方面，本文公开包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的编码序列的载体。示例性载体包括能够自主复制或在哺乳动物细胞中复制的质粒。典型表达载体含有适合的启动子、强化子及终止子，其适用于调节表达构建体中的编码序列的表达。载体还可包括选择标记物，以提供用于选择经转化宿主细胞的表型特点(诸如赋予对抗生素，诸如氨苄青霉素或新霉素的抗性)。

适合的启动子是本领域已知的。示例性启动子包括例如CMV启动子、腺病毒、EF1a、GAPDH金属硫蛋白启动子、SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、鼠类乳房肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子等。启动子可为组成性或诱导性的。可使用一种或多种载体(例如编码所有亚单元或域或其片段的一种载体，或一起编码亚单元或域或其片段的多种载体)。

还可使用内部核糖体进入位点(IRES)和2A肽序列。IRES和2A肽提供用于共表达多个序列的替代性方法。IRES为允许信使RNA(mRNA)序列中间的翻译起始作为蛋白质合成的较大过程的一部分的核苷酸序列。通常，在真核生物中，翻译可仅在mRNA分子的5'端处起始。IRES组件允许在一个转录物中的多个基因的表达。表达来自一个转录物中的多个蛋白质的IRES类多顺反子载体可减少非表达克隆自选择中的逃逸。2A肽允许多个蛋白质在单个开放阅读框中翻译为聚合蛋白质，其随后经由核糖体跳跃机制裂解为单个蛋白质。2A肽可提供多个蛋白质产物的更平衡的表达。示例性IRES序列包括例如EV71 IRES、EMCV IRES、HCV IRES。对于基因组整合，整合可为定点的或随机的。定点重组可通过将同源序列引入本文所描述的核酸构建体中实现。此类同源序列实质上匹配宿主基因组中的特定目标位点处的内源性序列。替代地，可使用随机整合。有时，蛋白质的表达量可视整合位点而变化。因此，可能需要根据重组蛋白质表达量选择许多克隆以鉴别实现所需表达量的克隆。

示例性核酸构建体进一步描述于附图中，诸如图2A-2T中的任一个。

在一个方面，核酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的同一性的氨基酸序列。

III.宿主细胞

在一个方面，本发明涉及细胞，其中编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的序列在哺乳动物宿主细胞中表达。在一个实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段短暂表达于宿主细胞中。在另一个实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段稳定整合至宿主细胞的基因组中，且当在适合的条件下培养时，表达衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。在一个优选实施方案中，多核苷酸序列以高效率及基因组稳定性表达。

适合的哺乳动物宿主细胞是本领域已知的。优选地，宿主细胞适用于在工业制造规模下产生蛋白质。示例性哺乳动物宿主细胞包括以下中的任一个及其衍生物：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞(衍生自猴(非洲绿猴)肾脏的细胞系)、Vero细胞、Hela细胞、婴儿仓鼠肾脏(BHK)细胞、人类胚胎肾脏(HEK)细胞、NSO细胞(鼠类骨髓瘤细胞系)以及C127细胞(无致瘤性小鼠细胞系)。其他示例性哺乳动物宿主细胞包括小鼠Sertoli(TM4)、水牛鼠肝(BRL 3A)、小鼠乳房肿瘤(MMT)、大鼠肝癌(HTC)、小鼠骨髓瘤(NSO)、鼠类融合瘤(Sp2/0)、小鼠胸腺瘤(EL4)、中国仓鼠卵巢(CHO)以及CHO细胞衍生物、鼠类胚胎(NIH/3T3，3T3 Li)、大鼠心肌(H9c2)、小鼠成肌细胞(C2C12)以及小鼠肾脏(miMCD-3)。哺乳动物细胞系的其他实例包括NS0/1、Sp2/0、Hep G2、PER.C6、COS-7、TM4、CV1、VERO-76、MDCK、BRL 3A、W138、MMT060562、TR1、MRC5以及FS4。

对细胞培养敏感的任何细胞均可根据本发明使用。在一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC第85110503号)；人类视网膜母细胞(PER.C6，CruCell，Leiden，TheNetherlands)；经SV40转型的猴肾脏CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人类胚肾细胞系(经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59,1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub andChasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠塞特利氏细胞(mouse sertolicell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人类子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝脏细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人类肝肿瘤系(Hep G2)。在一些优选实施方案中，细胞为CHO细胞。在一些优选实施方案中，细胞为GS细胞。

另外，任何数目的可商购获得以及不可商购获得的融合瘤细胞系均可根据本发明使用。如本文所用，术语“融合瘤”是指由永生化细胞及产生抗体的细胞的融合产生的细胞或细胞后代。此类所得融合瘤为产生抗体的永生化细胞。用于产生融合瘤的个体细胞可来自任何哺乳动物来源，包括但不限于大鼠、猪、兔、绵羊、猪、山羊及人类。在一些实施方案中，融合瘤为三源融合瘤细胞系，其在作为在人类细胞与鼠类骨髓瘤细胞系之间融合的产物的杂交骨髓瘤融合物的后代随后与浆细胞融合时得到。在一些实施方案中，融合瘤为产生抗体诸如四源融合瘤的任何永生化杂交细胞系(参见例如Milstein等人,Nature,537:3053,1983)。本领域技术人员将了解，融合瘤细胞系可具有不同营养需求和/或可需要不同培养条件以实现最佳生长，且将能够视需要修改条件。

在一些实施方案中，细胞包含第一相关基因，其中第一相关基因经染色体整合。在一些实施方案中，第一相关基因包含报道基因、选择基因、相关基因(例如编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，治疗相关基因包含编码难以表达(DtE)蛋白质的基因。

在一些实施方案中，第一相关基因位于定点整合(SSI)哺乳动物细胞中的两个不同的重组目标位点(RTS)之间，其中两个RTS染色体整合于NL1基因座或NL2基因座内。关于NL1基因座、NL2基因座、NL3基因座、NL4基因座、NL5基因座及NL6基因座的描述参见例如美国专利申请公开第20200002727号。在一些实施方案中，第一相关基因位于NL1基因座内。在一些实施方案中，细胞包含第二相关基因，其中第二相关基因经染色体整合。在一些实施方案中，第二相关基因包含报道基因、选择基因、治疗相关基因(诸如衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，治疗相关基因包含编码DtE蛋白质的基因。在一些实施方案中，第二相关基因位于RTS中的两者之间。在一些实施方案中，第二相关基因位于NL1基因座或NL2基因座内。在一些实施方案中，第一相关基因位于NL1基因座内，且第二相关基因位于NL2基因座内。在一些实施方案中，细胞包含第三相关基因，其中第三相关基因经染色体整合。在一些实施方案中，第三相关基因包含报道基因、选择基因、治疗相关基因(诸如衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，治疗相关基因包含编码DtE蛋白质的基因。在一些实施方案中，第三相关基因位于RTS中的两者之间。在一些实施方案中，第三相关基因位于NL1基因座或NL2基因座内。在一些实施方案中，第三相关基因位于与NL1基因座及NL2基因座不同的基因座内。在一些实施方案中，第一相关基因、第二相关基因以及第三相关基因在三个独立基因座内。在一些实施方案中，第一相关基因、第二相关基因以及第三相关基因中的至少一种在NL1基因座内，且第一相关基因、第二相关基因以及第三相关基因中的至少一种在NL2基因座内。在一些实施方案中，细胞包含定点重组酶基因。在一些实施方案中，定点重组酶基因经染色体整合。

在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少四种不同RTS的哺乳动物细胞，其中该细胞包含(a)至少两种不同RTS经染色体整合于NL1基因座或NL2基因座内；(b)第一相关基因经整合于(a)的至少两种RTS之间，其中第一相关基因包含报道基因、编码DtE蛋白质的基因、辅助基因或其组合；以及(c)第二相关基因经整合于不同于(a)的基因座的第二染色体基因座内，其中第二相关基因包含报道基因、编码DtE蛋白质的基因(诸如衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少四种不同RTS的哺乳动物细胞，其中该细胞包含(a)至少两种不同RTS经染色体整合于Fer1L4基因座内；(b)至少两种不同RTS经染色体整合于NL1基因座或NL2基因座内；(c)第一相关基因经染色体整合于Fer1L4基因座内，其中第一相关基因包含报道基因、编码DtE蛋白质的基因、辅助基因或其组合；以及(d)第二相关基因整合于(b)的NL1基因座或NL2基因座内，其中第二相关基因包含报道基因、编码DtE蛋白质的基因(诸如衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。

在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少六种不同RTS的哺乳动物细胞，其中该细胞包含(a)至少两种不同RTS以及第一相关基因经染色体整合于Fer1L4基因座内；(b)至少两种不同RTS以及第二相关基因经染色体整合于NL1基因座内；以及(c)至少两种不同RTS以及第三相关基因经染色体整合于NL2基因座内。

如本文中所提及，术语“以可操作组合形式”、“以可操作顺序”以及“可操作地连接”是指核酸序列的键以使得核酸分子能够引导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的方式产生。术语还指氨基酸序列的键以此类方式以使得产生功能性蛋白。在一些实施方案中，相关基因可操作地连接于启动子，其中相关基因经染色体整合于宿主细胞中。在一些实施方案中，相关基因可操作地连接至异源性启动子；其中相关基因经染色体整合于宿主细胞中。在一些实施方案中，辅助基因可操作地连接于启动子，其中该辅助基因经染色体整合于宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，辅助基因可操作地连接于异源启动子；其中该辅助基因经染色体整合于宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，编码DtE蛋白质的基因可操作地连接于启动子，其中编码DtE蛋白质的基因经染色体整合于宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，编码DtE蛋白质的基因可操作地连接于异源性启动子，其中编码DtE蛋白质的基因经染色体整合于宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，重组酶基因可操作地连接于启动子，其中重组酶基因经染色体整合于宿主细胞中。在一些实施方案中，重组酶基因可操作地连接于启动子，其中重组酶基因未整合于宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，重组酶基因可操作地连接于异源性启动子，其中重组酶基因未染色体整合于宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，重组酶基因可操作地连接于异源性启动子，其中重组酶基因未染色体整合于宿主细胞基因组中。

如本文所提及，术语“染色体整合(chromosomally-integrated)”或“染色体整合(chromosomal integration)”是指核酸序列稳定并入至宿主细胞的染色体中，例如哺乳动物细胞。即，经染色体整合于宿主细胞，例如哺乳动物细胞的基因组DNA(gDNA)中的核酸序列。在一些实施方案中，经染色体整合的核酸序列为稳定的。在一些实施方案中，经染色体整合的核酸序列不位于质粒或载体上。在一些实施方案中，经染色体整合的核酸序列未切除。在一些实施方案中，染色体整合通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)以及CRISPR相关蛋白质(Cas)基因编辑系统(CRISPR/CAS)介导。

在一些实施方案中，宿主细胞适用于在悬浮培养物中生长。悬浮液胜任型宿主细胞通常单分散或以松散聚集体形式生长，而无实质性聚集。悬浮液胜任型宿主细胞包括适合于悬浮液培养而无需调适或操作的细胞(例如造血细胞、淋巴细胞)，以及已通过修饰或调适贴壁依赖性细胞而使悬浮液胜任的细胞(例如上皮细胞、纤维母细胞)。

在一些实施方案中，与在细菌细胞，诸如大肠杆菌宿主细胞中衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达相比，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达量或活性增加至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍。在一些实施方案中，与在大肠杆菌宿主细胞中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达相比，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达量增加至少2倍。在一些实施方案中，与在大肠杆菌宿主细胞中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达相比，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达量增加至少50倍。在一些实施方案中，与在大肠杆菌宿主细胞中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达相比，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达量增加至少100倍。

本文所描述的宿主细胞适用于大规模培养。例如，细胞培养物可为10L、30L、50L、100L、150L、200L、300L、500L、1000L、2000L、3000L、4000L、5000L、10,000L或更大。在一些实施方案中，细胞培养物尺寸的范围可为10L至5000L、10L至10,000L、10L至20,000L、10I至50,000L、40I至50,000L、100L至50,000L、500L至50,000L、1000L至50,000L、2000L至50,000L、3000I至50,000L、4000L至50,000L、4500L至50,000L、1000L至10,000L、1000L至20,000L、1000L至25,000L、1000L至30,000L、15L至2000L、40L至1000L、100L至500L、200L至400L或在其之间的任何整数。细胞培养物的培养基组分是本领域已知，且可包括例如缓冲液、氨基酸含量、维生素含量、盐含量、矿物质含量、血清含量、碳源含量、脂质含量、核酸含量、激素含量、微量元素含量、氨含量、辅因子含量、指示物含量、小分子含量、水解产物含量及酶调节剂含量。

如本文所用，术语“培养基”、“细胞培养基”以及“培养基”是指含有营养素的溶液，其滋养使哺乳动物细胞生长。通常，此类溶液提供用于细胞基本生长和/或生存所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质及微量元素。此类溶液还可含有使生长和/或存活率增加超过最小速率的补充组分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(诸如钠、氯、钙、镁及磷酸根)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、以较高最终浓度存在的无机化合物(例如铁)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能量来源。在一些实施方案中，培养基经有利地调配至对于细胞存活及增殖为最佳的pH值及盐浓度。在一些实施方案中，培养基为在细胞培养开始之后添加的进料培养基。

在一些实施方案中，细胞可在多种化学成分确定的培养基中的一种中生长，其中该培养基的组分为已知的且受控制的。在一些实施方案中，细胞可在培养基的所有组分并非为已知的和/或受控制的复杂培养基中生长。在过去的几十年里，已广泛开发且公开了用于哺乳动物细胞培养的化学成分确定的培养基。成分确定的培养基的所有组分经充分表征，且因此确定的培养基未含有复合添加剂，诸如血清或水解产物。早期培养基制剂经研发以准许细胞生长且维持生存力，而对蛋白质产生很少或无关注。近年来，已出于支持高度产生性重组蛋白质产生细胞培养物的表达目的研发出培养基制剂。此类培养基优选用于本发明的方法中。此类培养基一般包含大量营养素及特别地氨基酸，以支持细胞生长和/或维持在高密度下。必要时，这些培养基可由本领域技术人员修改以用于本发明的方法。例如，本领域技术人员可减少这些培养基中的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和/或甲硫氨酸的量，以在如本文所公开的方法中使其用作基础培养基或进料培养基。

复杂培养基的所有组分未经充分表征，且因此复杂培养基可能含有添加剂，尤其诸如简单和/或复杂碳源、简单和/或复杂氮源以及血清。在一些实施方案中，适用于本发明的复杂培养基含有添加剂，诸如除本文所描述的成分确定的培养基的其他组分以外的水解产物。在一些实施方案中，成分确定的培养基通常包括在水中已知浓度下大致五十个化学实体。其中大多数还含有一种或多种充分表征的蛋白质，诸如胰岛素、IGF-1、转铁蛋白或BSA，但其他不需要蛋白质组分且因此称为不含蛋白质的成分确定的培养基。培养基的典型化学组分分为五种广泛类别：氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及定义纯分类的混杂类别。

细胞培养基可任选地补充有补充组分。如本文所用，术语“补充组分”是指使生长和/或存活率增加超过最小速率的组分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(诸如钠、氯、钙、镁及磷酸根)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以极低最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能量来源。在一些实施方案中，补充组分可添加至初始细胞培养物中。在一些实施方案中，补充组分可在细胞培养开始之后添加。通常，微量元素是指以微摩尔或更低量包括的多种无机盐。例如，通常包括的微量元素为锌、硒、铜及其他元素。在一些实施方案中，铁(二价铁或三价铁)可在微摩尔浓度下作为微量元素包括于初始细胞培养基中。锰还常常以纳摩尔浓度至微摩尔浓度范围作为二价阳离子(MnCl₂或MnSO₄)包括于微量元素当中。大量不太常见的微量元素通常以纳摩尔浓度添加。

在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基为适合于支持细胞培养物中的较高细胞密度，诸如1×10⁶个细胞/毫升、5×10⁶个细胞/毫升、1×10⁷个细胞/毫升、5×10⁷个细胞/毫升、1×10⁸个细胞/毫升或5×10⁸个细胞/毫升的培养基。在一些实施方案中，细胞培养物为哺乳动物细胞补料分批培养物，优选为CHO细胞补料分批培养物。

在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的酪氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的色氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的亮氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的丝氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苏氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的甘氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甘氨酸中的两种：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸及酪氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸以及色氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸以及甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的酪氨酸以及色氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的酪氨酸以及甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的色氨酸以及甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甘氨酸中的三种：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸以及甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甘氨酸中的四种：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甘氨酸中的五种：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甘氨酸中的六种：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甘氨酸中的七种：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为以下的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甘氨酸：低于2mM、低于1mM、在0.1与2mM之间、在0.1与1mM之间、在0.5与1.5mM之间或在0.5与1mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基进一步包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及天冬酰胺中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种。在一些实施方案中，细胞培养基进一步包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及天冬酰胺中的至少5种。在一些实施方案中，细胞培养基进一步包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及天冬酰胺。在一些实施方案中，细胞培养基进一步包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及天冬酰胺中的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9种。在一些实施方案中，细胞培养基进一步包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及天冬酰胺中的至少5种。在一些实施方案中，细胞培养基进一步包含浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选为2mM的缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及天冬酰胺。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选为10mM的丝氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选为10mM的缬氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选为10mM的半胱氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选为10mM的异亮氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选为10mM的亮氨酸。在一些实施方案中，以上细胞培养基用于本文所公开的方法中。在一些实施方案中，以上细胞培养基在本文所公开的方法中用作基础培养基。在一些实施方案中，以上细胞培养基在本文所公开的方法中用作进料培养基。

IV.产生方法

在一个方面，本发明包括一种产生衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的方法。该方法包括在适合的条件下培养哺乳动物细胞，由此表达衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。该方法可进一步包括从培养物中收获衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。该方法可进一步包括纯化衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。

在一些实施方案中，该方法产生以0.1g/L至0.5g/L产率的多肽或其片段。

在一些实施方案中，细胞可在分批或补料分批培养基中生长，其中培养物在多肽表达足够之后终止，其后收获经表达的多肽且任选地纯化。在一些实施方案中，细胞可在灌注培养物中生长，其中不终止培养且将新的营养素及其他组分周期性或连续添加至培养物中，在此期间周期性或连续收获经表达的多肽。

在一些实施方案中，细胞可在以几毫升至几升的体积范围内的小规模反应容器中生长。在一些实施方案中，细胞可生长于大规模商业生物反应器中，其体积范围为约至少1升至10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多，或其间的任何体积。

细胞培养物的温度将主要基于使细胞培养物保持活力(此时产生高含量多肽)的温度、使代谢废料产物的产生或积累最小化的温度，和/或这些或被医师认为重要的其他因素的任何组合的范围来选择。作为一个非限制性实例，CHO细胞良好生长且在约37℃下产生较高含量或蛋白质或多肽。一般而言，大多数哺乳动物细胞良好生长和/或可在约25℃至42℃范围内，但由本发明教示的方法不限于这些温度，产生较高含量或蛋白质或多肽。某些哺乳动物细胞生长良好和/或可在约35℃至40℃范围内产生较高含量或蛋白质或多肽。在某些实施方案中，细胞培养物在细胞培养过程期间在20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃的温度下生长一次或多次。

如本文所用，术语“培养”和“细胞培养物”指在适合于细胞群体的存活和/或生长的条件下悬浮于培养基中的细胞群体。如本领域普通技术人员将清楚，在一些实施方案中，本文所用的这些术语是指包含细胞群体及使该群体悬浮于其中的培养基的组合。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞包含哺乳动物细胞。

本发明可与适合于所需过程(例如产生重组蛋白质(例如抗体))的任何细胞培养方法一起使用。作为非限制性实例，细胞可在分批或补料分批培养基中生长，其中培养物在重组蛋白质(例如抗体)表达足够之后终止，其后收获经表达的蛋白质。或者，作为另一非限制性实例，细胞可在补料分批培养基中生长，其中不终止培养且将新的营养素及其他组分周期性或连续添加至培养物中，在此期间周期性或连续收获经表达的重组蛋白质(例如抗体)。其他适合的方法(例如旋转管培养)是本领域已知且可用于实践本发明。

在一些实施方案中，适合于本发明的细胞培养为补料分批培养。如本文所用，术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始之后的一个或多个时间向培养物提供额外组分。此类所提供组分通常包含在培养过程期间耗乏的细胞的营养组分。通常在某一时刻停止补料分批培养且收获培养基中的细胞和/或组分，且任选地纯化。在一些实施方案中，补料分批培养物包含补充有进料培养基的基本培养基。

细胞可以由从业者选择的任何方便的体积生长。例如，细胞可在以几毫升至几升的体积范围内的小规模反应容器中生长。在一些实施方案中，细胞可生长于大规模商业生物反应器中，其体积范围为约至少1升至10、50、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15000、20000或25000升或更多，或其间的任何体积。

细胞培养物的温度将主要基于使细胞培养物保持活力的温度范围及产生较高含量所需产物(例如重组蛋白质)的范围来选择。一般而言，大多数哺乳动物细胞良好生长且可在约25℃至42℃范围内，但由本公开内容教示的方法不限于这些温度，产生所需产物(例如重组蛋白质)。某些哺乳动物细胞良好生长且可在约35℃至40℃范围内产生所需产物(例如重组蛋白质或抗体)。在某些实施方案中，细胞培养物在细胞培养过程期间在20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃的温度下生长一次或多次。本领域普通技术人员将能够选择使细胞生长的适当温度，其视细胞的特定需求及医师的特定生产要求而定。细胞可生长任何时间量，视从业者的需求及细胞自身的需求而定。在一些实施方案中，细胞在37℃下生长。在一些实施方案中，细胞在36.5℃下生长。

在一些实施方案中，细胞可在初始生长阶段(或生长阶段)期间生长更长时间或更短时间量，视从业者的需求及细胞自身的需求而定。在一些实施方案中，细胞生长持续足以达成预定义细胞密度的时间段。在一些实施方案中，细胞生长持续足以达成如下的细胞密度的时间段，该细胞密度为若使细胞不受干扰地生长，则细胞最终将达至的最大细胞密度的给定百分比。例如，细胞可生长持续足以达成以下的所需活细胞密度的时间段：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％的最大细胞密度。在一些实施方案中，细胞生长直至细胞密度增加不超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％培养物/天。在一些实施方案中，细胞生长直至细胞密度增加不超过5％培养物/天。

在一些实施方案中，使细胞生长持续限定的时间段。例如，视细胞培养物的起始浓度、细胞生长的温度及细胞的固有生长速率而定，细胞可生长0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天，优选4至10天。在一些情况下，可允许细胞生长持续一个月或更久。本发明的从业者将能够视蛋白质生产要求及细胞自身的需求而定选择初始生长阶段的持续时间。

细胞培养物可在初始培养阶段期间搅动或振荡，以增加氧合及营养物至细胞的分散。根据本发明，本领域普通技术人员应了解，在初始生长阶段期间控制或调节生物反应器的某些内部条件可为有益的，包括但不限于pH值、温度、氧合等。

在初始生长阶段结束时，培养条件中的至少一种可经改变，使得应用第二组培养条件且在培养物中发生代谢转变。代谢转变可通过例如温度、pH值、重量克分子渗透压浓度或细胞培养物的化学诱导浓度的变化来实现。在一个非限制性实施方案中，培养条件通过改变培养物的温度而变化。然而，如本领域已知，转变温度并非可实现适当代谢转变的唯一机制。例如，此类代谢转变还可通过使其他培养条件，包括但不限于pH、重量克分子渗透压浓度以及丁酸钠含量转变来达成。培养物转变的时序将由本发明的从业者基于蛋白质生产要求或细胞自身的需要而确定。

当转变培养物的温度时，温度转变可为相对逐渐的。例如，其可耗费若干小时或数天以完成温度变化。替代地，温度转变可为相对突然的。例如，温度变化可在不到若干小时内完成。鉴于适当生产及控制设备，诸如在多肽或蛋白质的商业大规模生产中为标准的，温度变化甚至可在不到一小时内完成。

在一些实施方案中，一旦细胞培养物的条件已如上文所论述转变，细胞培养物在第二组培养条件下维持后续生产阶段，该第二组培养条件有助于细胞培养物的存活及生存力，且适合于在商业上适当的含量下表达所需多肽或蛋白质。

如上文所论述，培养物可通过使多种培养条件中的一种或多种转变而变化，包括但不限于温度、pH值、重量克分子渗透压浓度及丁酸钠含量。在一些实施方案中，培养物的温度改变。根据此实施方案，在后续生产阶段期间，使培养物维持在低于初始生长阶段的温度或温度范围的温度或温度范围下。如上文所论述，可采用多个离散温度转变以增加细胞密度或生存力，或增加重组蛋白质的表达。

在一些实施方案中，细胞可维持在后续生产阶段中，直至达到所需细胞密度或生产效价。在本发明的另一实施方案中，使细胞在后续生产阶段期间生长持续限定的时间段。例如，视后续生长阶段开始时细胞培养物的浓度、细胞生长的温度及细胞的内部生长速率而定，细胞可生长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天。在一些情况下，可允许细胞生长持续一个月或更久。本发明的从业者将能够视多肽或蛋白质生产要求及细胞自身的需求而定选择后续生长阶段的持续时间。

细胞培养物可在后续生产阶段期间搅动或振荡，以增加氧合作用及营养物至细胞的分散。根据本发明，本领域普通技术人员应了解，在后续生长阶段期间控制或调节生物反应器的某些内部条件，包括但不限于pH值、温度、氧合等，可为有益的。

在一些实施方案中，细胞表达重组蛋白质且本发明的细胞培养方法包括生长阶段和生产阶段。

在一些实施方案中，本文所公开的方法中的任一个的步骤(ii)在细胞培养方法的全部期间应用。在一些实施方案中，在细胞培养方法的一部分期间应用本文所公开的方法中的任一个的步骤(ii)。在一些实施方案中，应用步骤(ii)直至得到预定活细胞密度。

在一些实施方案中，本发明的细胞培养方法包括生长阶段及产生阶段，且在生长阶段期间应用步骤(ii)。在一些实施方案中，本发明的细胞培养方法包括生长阶段和产生阶段，且在生长阶段的一部分期间应用步骤(ii)。在一些实施方案中，本发明的细胞培养方法包括生长阶段及产生阶段，且在生长阶段及产生阶段期间应用步骤(ii)。

在本文所公开的方法中的任一个的步骤(ii)中，术语“维持”可指对于整个培养过程(直至收获)或对于培养过程的一部分，诸如生长阶段、生长阶段的一部分或直至得到预定细胞密度，将氨基酸或代谢物的浓度维持在C1或C2以下。

在上文所提及的方法中的任一个的一些实施方案中，细胞生长和/或生产率相较于对照培养物增加，该对照培养物相同，但其不包含步骤(ii)。

在上文所提及的方法中的任一个的一些实施方案中，本发明的方法为用于改进细胞生长的方法。在一些实施方案中，本发明的方法为一种用于改进在较高密度细胞培养物中在较高细胞密度下的细胞生长的方法。

如本文所用，较高细胞密度是指高于以下的细胞密度：1×10⁶个细胞/毫升、5×10⁶个细胞/毫升、1×10⁷个细胞/毫升、5×10⁷个细胞/毫升、1×10⁸个细胞/毫升或5×10⁸个细胞/毫升，优选高于1×10⁷个细胞/毫升，更优选高于5×10⁷个细胞/毫升。

在一些实施方案中，本发明的方法为一种用于改进细胞培养物中的细胞生长的方法，其中细胞密度为高于1×10⁶个细胞/毫升、5×10⁶个细胞/毫升、1×10⁷个细胞/毫升、5×10⁷个细胞/毫升、1×10⁸个细胞/毫升或5×10⁸个细胞/毫升。在一些实施方案中，本发明的方法为一种用于改进细胞培养物中的细胞生长的方法，其中最大细胞密度为高于1×10⁶个细胞/毫升、5×10⁶个细胞/毫升、1×10⁷个细胞/毫升、5×10⁷个细胞/毫升、1×10⁸个细胞/毫升或5×10⁸个细胞/毫升。

在一些实施方案中，细胞生长由活细胞密度(VCD)、最大活细胞密度或整合活细胞计数(IVCC)确定。在一些实施方案中，细胞生长通过最大活细胞密度确定。

如本文所用，术语“活细胞密度”是指存在于既定体积的培养基中的细胞的数目。活细胞密度可通过本领域技术人员已知的任何方法测量。优选地，使用自动化细胞计数器，诸如Bioprofile来测量活细胞密度。如本文所用，术语“最大细胞密度”是指在细胞培养期间达成的最大细胞密度。如本文所用，术语“细胞生存力”是指培养物中的细胞在既定的一系列培养条件或实验变化下存活的能力。本领域普通技术人员应了解，用于确定细胞生存力的许多方法中的一种涵盖于本发明中。例如，可使用染料(例如台盼蓝)，其不通过活细胞的膜，但可通过死亡或染色细胞的经破坏膜以便确定细胞生存力。

如本文所用，术语“整合活细胞计数”(IVCC)是指在活细胞密度(VCD)曲线下的面积。IVCC可使用下式计算：IVCC_t+1＝IVCC_t+(VCD_t+VCD_t+1)*(Δt)/2，其中Δt为t与t+1时间点之间的时间差。IVCC_t＝0可假定为可忽略的。VCD_t及VCD_t+1为t及t+1时间点下的活细胞密度。

如本文所用，术语“效价”是指例如以培养基体积的给定量通过细胞培养物产生的以重组方式表达的蛋白质的总量。效价通常以每升培养基的蛋白质克数单位表示。

在一些实施方案中，细胞生长相较于对照培养物增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，细胞生长相较于对照培养物增加至少10％。在一些实施方案中，细胞生长相较于对照培养物增加至少20％。

在一些实施方案中，通过效价和/或体积生产率确定生产率。

在一些实施方案中，生产率通过效价确定。在一些实施方案中，与对照培养物相比，生产率增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，与对照培养物相比，生产率增加至少10％。在一些实施方案中，与对照培养物相比，生产率增加至少20％。

在一些实施方案中，细胞培养物的最大细胞密度大于1×10⁶个细胞/毫升、5×10⁶个细胞/毫升、1×10⁷个细胞/毫升、5×10⁷个细胞/毫升、1×10⁸个细胞/毫升或5×10⁸个细胞/毫升。在一些实施方案中，细胞培养物的最大细胞密度大于5×10⁶个细胞/毫升。在一些实施方案中，细胞培养物的最大细胞密度大于1×10⁸个细胞/毫升。

V.纯化

在一些实施方案中，用于产生衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的方法包括分离和/或纯化衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的经表达多肽或其片段分泌于培养基中，且因此细胞及其他固体可通过离心和/或过滤移除。

根据本文所描述的方法产生的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可自宿主细胞中收获且使用本领域技术人员已知的任何适合的方法纯化。用于纯化多肽或其片段的适合的方法包括沉淀及各种类型的层析，诸如疏水相互作用、离子交换、亲和力、螯合及尺寸排阻，其均是本领域已知的。适合的纯化流程可包括这些或其他适合方法中的两种或更多种。在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段中的一种或多种可包括促进纯化的“标签”，诸如表位标签或HIS标签、链霉素标签。此类经标记多肽可方便地例如通过螯合层析法或亲和层析法从条件培养基纯化。任选地，标签序列可在纯化后裂解。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可包括用于亲和纯化的标签。亲和纯化标签是本领域已知的。实例包括例如His标签(结合至金属离子)、抗体、麦芽糖结合蛋白质(MBP)(结合至直链淀粉)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(结合至谷胱甘肽)、FLAG标签、Strep标签(结合至链霉抗生物素蛋白或其衍生物)。

在一个优选实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段不包括纯化标签。

在一些实施方案中，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的产率为至少约1mg/L、至少约2mg/L、至少约3mg/L、至少约4mg/L、至少约5mg/L、至少约6mg/L、至少约7mg/L、至少约8mg/L、至少约9mg/L、至少约10mg/L、至少约11mg/L、至少约12mg/L、至少约13mg/L、至少约14mg/L、至少约15mg/L、至少约16mg/L、至少约17mg/L、至少约18mg/L、至少约19mg/L、至少约20mg/L、至少约25mg/L、至少约30mg/L、至少约35mg/L、至少约40mg/L、至少约45mg/L、至少约50mg/L、至少约55mg/L、至少约60mg/L、至少约65mg/L、至少约70mg/L、至少约75mg/L、至少约80mg/L、至少约85mg/L、至少约90mg/L、至少约95mg/L或至少约100mg/L。

在一些实施方案中，培养物的尺寸为至少约10升，例如体积为至少约10L、至少约20L、至少约30L、至少约40L、至少约50L、至少约60L、至少约70L、至少约80L、至少约90L、至少约100L、至少约150L、至少约200L、至少约250L、至少约300L、至少约400L、至少约500L、至少约600L、至少约700L、至少约800L、至少约900L、至少约1000L、至少约2000L、至少约3000L、至少约4000L、至少约5000L、至少约6000L、至少约10,000L、至少约15,000L、至少约20,000L、至少约25,000L、至少约30,000L、至少约35,000L、至少约40,000L、至少约45,000L、至少约50,000L、至少约55,000L、至少约60,000L、至少约65,000L、至少约70,000L、至少约75,000L、至少约80,000L、至少约85,000L、至少约90,000L、至少约95,000L、至少约100,000L等。

VI.组合物及制剂

在一个方面，本发明包括一种包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的组合物。在一些实施方案中，该组合物引发可赋予针对大肠杆菌病原性物种的免疫力的免疫反应，包括抗体。

在一些实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段作为唯一抗原。在一些实施方案中，该组合物不包括缀合物。

在一些实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段及额外抗原。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段及额外大肠杆菌抗原。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段及来自大肠杆菌的糖缀合物。

在一些实施方案中，多肽或其片段衍生自大肠杆菌FimH。

在一些实施方案中，组合物包括从大肠杆菌FimC衍生的多肽或其片段。

在一些实施方案中，组合物包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；以及衍生自大肠杆菌FimC的多肽或其片段。

在一个方面，本发明包括一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；以及包含选自以下中的任一个的结构的糖：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为1至100的整数。

在一些实施方案中，该组合物包括本文所公开的糖中的任一个。在优选实施方案中，该组合物包括本文所公开的缀合物中的任一个。

在一些实施方案中，该组合物包括至少一个来自大肠杆菌血清型O25，优选血清型O25b的糖缀合物。在一个实施方案中，该组合物包括至少一个来自大肠杆菌血清型O1，优选血清型O1a的糖缀合物。在一个实施方案中，该组合物包括至少一个来自大肠杆菌血清型O2的糖缀合物。在一个实施方案中，该组合物包括至少一个来自大肠杆菌血清型O6的糖缀合物。

在一个实施方案中，该组合物包含至少一个选自以下大肠杆菌血清型中的任一个的糖缀合物：O25、O1、O2及O6，优选O25b、O1 a、O2及O6。在一个实施方案中，该组合物包含至少两个选自以下大肠杆菌血清型中的任一个的糖缀合物：O25、O1、O2及O6，优选O25b、O1 a、O2及O6。在一个实施方案中，该组合物包含至少三个选自以下大肠杆菌血清型中的任一个的糖缀合物：O25、O1、O2及O6，优选O25b、O1 a、O2及O6。在一个实施方案中，该组合物包含来自以下大肠杆菌血清型中的每一种的糖缀合物：O25、O1、O2及O6，优选O25b、O1a、O2及O6。

在一个优选实施方案中，以上组合物中的任一个的糖缀合物单独地与CRM₁₉₇缀合。在一个优选实施方案中，以上组合物中的任一个的糖缀合物单独地与SCP缀合。

因此，在一些实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自至少一种大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个优选实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自超过1种大肠杆菌血清型的O-抗原。例如，组合物可包括来自两种不同大肠杆菌血清型(或“v”，价数)至12种不同血清型(12v)的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自3种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自4种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括来自5种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自6种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自7种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自8种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自9种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自10种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自11种不同大肠杆菌血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自12种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自13种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自14种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自15种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自16种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自17种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自18种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自19种不同血清型的O-抗原。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自20种不同血清型的O-抗原。

优选地，大肠杆菌糖的数目可在1种血清型(或“v”，价数)至26种不同血清型(26v)范围内。在一个实施方案中，存在一种血清型。在一个实施方案中，存在2种不同血清型。在一个实施方案中，存在3种不同血清型。在一个实施方案中，存在4种不同血清型。在一个实施方案中，存在5种不同血清型。在一个实施方案中，存在6种不同血清型。在一个实施方案中，存在7种不同血清型。在一个实施方案中，存在8种不同血清型。在一个实施方案中，存在9种不同血清型。在一个实施方案中，存在10种不同血清型。在一个实施方案中，存在11种不同血清型。在一个实施方案中，存在12种不同血清型。在一个实施方案中，存在13种不同血清型。在一个实施方案中，存在14种不同血清型。在一个实施方案中，存在15种不同血清型。在一个实施方案中，存在16种不同血清型。在一个实施方案中，存在17种不同血清型。在一个实施方案中，存在18种不同血清型。在一个实施方案中，存在19种不同血清型。在一个实施方案中，存在20种不同血清型。在一个实施方案中，存在21种不同血清型。在一个实施方案中，存在22种不同血清型。在一个实施方案中，存在23种不同血清型。在一个实施方案中，存在24种不同血清型。在一个实施方案中，存在25种不同血清型。在一个实施方案中，存在26种不同血清型。糖与载体蛋白质缀合以形成如本文所描述的糖缀合物。

在一个方面，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括来自至少一个大肠杆菌血清群的O-抗原的糖缀合物，其中该O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自超过1种大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自2种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自3种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自4种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自5种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自6种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自7种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自8种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自9种不同大肠杆菌血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的O-抗原；以及10种不同大肠杆菌血清型，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的O-抗原；以及11种不同大肠杆菌血清型，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自12种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自13种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自14种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自15种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自16种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自17种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自18种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自19种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自20种不同血清型的O-抗原，其中各O-抗原与载体蛋白质缀合。

在另一方面，组合物包括来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个优选实施方案中，组合物包括来自超过1种大肠杆菌血清型的O-多糖。例如，组合物可包括来自两种不同大肠杆菌血清型至12种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自12种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自13种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，该组合物包括来自14种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自15种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自16种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自17种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自18种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自19种不同血清型的O-多糖。在一个实施方案中，组合物包括来自20种不同血清型的O-多糖。

在一个优选实施方案中，该组合物包括来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中该O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个优选实施方案中，该组合物包括来自超过1种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。例如，组合物可包括来自两种不同大肠杆菌血清型至12种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自12种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自13种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自14种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自15种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自16种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自17种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自18种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自19种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。在一个实施方案中，组合物包括来自20种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合。

在一个最优选的实施方案中，该组合物包括来自至少一种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中该O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中该O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个优选实施方案中，组合物包括来自超过1种大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中该O-多糖包括O-抗原及核心糖。例如，组合物可包括来自两种不同大肠杆菌血清型至12种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自12种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自13种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自14种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自15种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自16种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自17种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自18种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自19种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，组合物包括来自20种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与载体蛋白质缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个优选实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇。

在另一个优选实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O25a及核心糖，其中n为至少40。在一个优选实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O25b及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O1a及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O2及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O6及核心糖，其中n为至少40。

在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O17及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O15及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O18A及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O75及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O4及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O16及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O13及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O7及核心糖，其中n为至少40。

在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O8及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，O-多糖包括式O8，其中n为1-20，优选2-5，更优选3。式O8展示于例如图10B中。在另一个实施方案中，该组合物进一步包括与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O9及核心糖，其中n为至少40。在另一个实施方案中，O-多糖包括式O9，其中n为1-20，优选4-8，更优选5。式O9展示于例如图10B中。在另一个实施方案中，O-多糖包括式O9a，其中n为1-20，优选4-8，更优选5。式O9a展示于例如图10B中。

在一些实施方案中，O-多糖包括选自式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101中的任一个，其中n为1-20，优选4-8，更优选5。参见例如图10B。

如上文所描述，该组合物可包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及经缀合O-多糖(抗原)的任何组合。在一个示例性实施方案中，该组合物包括：包括式O25b的多糖、包括式O1A的多糖、包括式O2的多糖及包括式O6的多糖。更具体地说，诸如包括以下的组合物：(i)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O25b及核心糖，其中n为至少40；(ii)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O1a及核心糖，其中n为至少40；(iii)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中O-多糖包括式O2及核心糖，其中n为至少40；以及(iv)与CRM₁₉₇缀合的O-多糖，其中该O-多糖包括式O6及核心糖，其中n为至少40。

在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及至少一个从任何大肠杆菌血清型衍生的O-多糖，其中该血清型不是O25a。例如，在一个实施方案中，该组合物不包括：包括式O25a的糖。此类组合物可包括：例如包括式O25b的O-多糖、包括式O1A的O-多糖、包括式O2的O-多糖及包括式O6的O-多糖。

在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自2种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自3种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自4种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自5种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自6种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自7种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自8种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自9种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自10种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自11种不同大肠杆菌血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自12种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自13种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自14种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自15种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自16种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自17种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自18种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自19种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。在一个实施方案中，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及来自20种不同血清型的O-多糖，其中各O-多糖与CRM₁₉₇缀合，且其中O-多糖包括O-抗原及核心糖。

在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O25b，其中n为15±2。在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O25b，其中n为17±2。在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O25b，其中n为55±2。在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O25b，其中n为51±2。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R1核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌K12核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包括KDO部分。优选地，载体蛋白质为CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，缀合物优选在DMSO缓冲液中通过还原氨基化化学方法来制备。在一个实施方案中，糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合。优选地，该组合物进一步包括药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够在以下的浓度下结合大肠杆菌血清型O25B多糖：至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml，如通过ELISA分析所确定。因此，可进行用本发明的免疫原性组合物免疫接种前及免疫接种后血清OPA活性的比较，且比较其对血清型O25B的反应，以评定反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O25B，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发功能抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O25B，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O25B的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物引发至少50％的受试者中针对大肠杆菌血清型O25B的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物引发至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中针对大肠杆菌血清型O25B的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O25B的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加人类受试者针对大肠杆菌血清型O25B的OPA效价。

在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O1a，其中n为39±2。在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O1a，其中n为13±2。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包括KDO部分。优选地，载体蛋白质为CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，缀合物优选在DMSO缓冲液中通过还原氨基化化学方法来制备。在一个实施方案中，糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合。优选地，该组合物进一步包括药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够在以下的浓度下结合大肠杆菌血清型O1A多糖：至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml，如通过ELISA分析所确定。因此，可进行用本发明的免疫原性组合物免疫接种前及免疫接种后血清OPA活性的比较，且比较其对血清型O1A的反应，以评定反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O1A，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发功能抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O1A，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O1A的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物引发至少50％的受试者中针对大肠杆菌血清型O1A的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物引发至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中针对大肠杆菌血清型O1A的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O1A的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著地增加针对大肠杆菌血清型O1A的人类受试者的OPA效价。

在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O2，其中n为43±2。在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O2，其中n为47±2。在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括：包括共价结合载体蛋白质的糖的缀合物，其中该糖包括式O2，其中n为17±2。在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括：包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O2，其中n为18±2。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R1核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R4核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包括KDO部分。优选地，载体蛋白质为CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，缀合物优选在DMSO缓冲液中通过还原氨基化化学方法来制备。在一个实施方案中，糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合。优选地，该组合物进一步包括药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够在以下的浓度下结合大肠杆菌血清型O2多糖：至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml，如通过ELISA分析所确定。因此，可进行用本发明的免疫原性组合物免疫接种前及免疫接种后血清OPA活性的比较，且比较其对血清型O2的反应，以评定反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O2，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发功能抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O2，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O2的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物引发至少50％的受试者中针对大肠杆菌血清型O2的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物引发至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中针对大肠杆菌血清型O2的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O2的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著地增加针对大肠杆菌血清型O2的人类受试者的OPA效价。

在一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O6，其中n为42±2。在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O6，其中n为50±2。在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括包含共价结合载体蛋白质的糖的缀合物，其中该糖包括式O6，其中n为17±2。在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括：包括与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包括式O6，其中n为18±2。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包括KDO部分。优选地，载体蛋白质为CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，缀合物优选在DMSO缓冲液中通过还原氨基化化学方法来制备。在一个实施方案中，糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合。优选地，该组合物进一步包括药学上可接受的稀释剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够在以下的浓度下结合大肠杆菌血清型O6多糖：至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml，如通过ELISA分析所确定。因此，可进行用本发明的免疫原性组合物免疫接种前及免疫接种后血清OPA活性的比较，且比较其对血清型O6的反应，以评定反应者的潜在增加。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发IgG抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O6，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，免疫原性组合物在人类中引发功能抗体，这些抗体能够杀死大肠杆菌血清型O6，如通过体外调理吞噬分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O6的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，免疫原性组合物引发至少50％的受试者中针对大肠杆菌血清型O6的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物引发至少60％、70％、80％或至少90％的受试者中针对大肠杆菌血清型O6的至少1:8的效价，如通过体外调理吞噬杀伤分析所确定。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O6的反应者(即，如通过体外OPA所确定，血清效价为至少1:8的个体)的比例。在一个实施方案中，与免疫接种前的群体相比，本发明的免疫原性组合物显著地增加针对大肠杆菌血清型O6的人类受试者的OPA效价。

在一个方面，该组合物包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段；以及包括共价结合至载体蛋白质的糖的缀合物，其中该糖包括选自以下中的任一个的结构：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为1至100的整数，优选31至90。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R2核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R3核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌R4核心糖部分。在一个实施方案中，糖进一步包括大肠杆菌K12核心糖部分。在另一个实施方案中，糖进一步包括KDO部分。优选地，载体蛋白质为CRM₁₉₇。在一个实施方案中，缀合物通过单端连接的缀合来制备。在一个实施方案中，缀合物优选在DMSO缓冲液中通过还原氨基化化学方法来制备。在一个实施方案中，糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合。优选地，该组合物进一步包括药学上可接受的稀释剂。在一个实施方案中，该组合物进一步包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29种额外缀合物至至多30种额外缀合物，各缀合物包括与载体蛋白质共价结合的糖，其中该糖包括选自这些式中的任一个的结构。

A.糖

在一个实施方案中，通过表达(未必过度表达)不同Wzz蛋白质(例如WzzB)以控制糖的大小，来产生糖。

如本文所用，术语“糖”是指单一糖部分或单糖单元，以及经共价连接以形成双糖、寡糖及多糖的两个或更多个单一糖部分或单糖单元的组合。糖可为直链或分支链。

在一个实施方案中，在重组革兰氏阴性细菌中产生糖。在一个实施方案中，在重组大肠杆菌细胞中产生糖。在一个实施方案中，在重组沙门氏菌细胞中产生糖。示例性细菌包括大肠杆菌O25K5H1、大肠杆菌BD559、大肠杆菌GAR2831、大肠杆菌GAR865、大肠杆菌GAR868、大肠杆菌GAR869、大肠杆菌GAR872、大肠杆菌GAR878、大肠杆菌GAR896、大肠杆菌GAR1902、大肠杆菌O25a ETC NR-5、大肠杆菌O157:H7:K-、肠沙门氏菌血清变型鼠伤寒菌株LT2、大肠杆菌GAR2401、肠沙门氏菌血清型肠炎CVD 1943、肠沙门氏菌血清型鼠伤寒CVD1925、肠沙门氏菌血清型副伤寒A CVD 1902以及弗氏志贺菌(Shigella flexneri)CVD1208S。在一个实施方案中，细菌不是大肠杆菌GAR2401。这种针对糖产生的遗传学方法允许有效产生作为疫苗组分的O-多糖以及O-抗原分子。

如本文所用，术语“wzz蛋白质”是指链长决定子多肽，诸如wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzzfepE、wzzl及wzz2。示例性wzz基因序列的GenBank登录号为：对于E4991/76，AF011910；对于F186，AF011911，对于M70/1-1，AF011912；对于79/311，AF011913；对于Bi7509-41，AF011914；对于C664-1992，AF011915；对于C258-94，AF011916；对于C722-89，AF011917；以及对于EDL933，AF011919。G7以及Bi316-41 wzz基因序列的GenBank登录号分别为U39305及U39306。示例性wzz基因序列的其他GenBank登录号为：对于肠沙门氏菌亚种肠道血清变型鼠伤寒菌株LT2 FepE，NP_459581；对于大肠杆菌O157:H7菌株EDL933 FepE，AIG66859；对于肠沙门氏菌亚种肠道血清变型鼠伤寒菌株LT2 WzzB，NP_461024；对于大肠杆菌K-12亚种菌株MG1655 WzzB，NP_416531；对于大肠杆菌K-12亚种菌株MG1655FepE，NP_415119。在优选实施方案中，wzz家族蛋白质为以下中的任一个：wzzB、wzz、wzzSF、wzzST、fepE、wzz_fepE、wzz1及wzz2，最优选wzzB，更优选地fepE。

示例性wzzB序列包括SEQ ID Nos:30-34中所示的序列。示例性FepE序列包括SEQID Nos:35-39中所示的序列。

在一些实施方案中，经修饰糖(相较于对应野生型糖被修饰)可通过以下来产生：在革兰氏阴性细菌中从革兰氏阴性细菌表达(不一定过度表达)wzz家族蛋白质(例如fepE)，和/或通过断开(即抑制、缺失、移除)第二wzz基因(例如wzzB)以产生含有中等或长O-抗原链的高分子量糖，诸如脂多糖。例如，经修饰糖可通过表达(不一定过度表达)wzz2且断开wzzl来产生。或者，在替代方案中，经修饰糖可通过表达(不一定过度表达)wzzfepE且断开wzzB来产生。在另一个实施方案中，经修饰糖可通过表达(不一定过度表达)wzzB但断开wzzfepE来产生。在另一个实施方案中，经修饰糖可通过表达fepE来产生。优选地，wzz家族蛋白质衍生自对于宿主细胞而言异源的菌株。

在一些实施方案中，糖通过表达具有与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:39中的任一个具有至少30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的wzz家族蛋白质产生。在一个实施方案中，wzz家族蛋白质包括选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中的任一个的序列。优选地，wzz家族蛋白质与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34具有至少30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，糖通过表达具有与fepE蛋白质具有至少30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质来产生。

在一个方面，本发明涉及通过在革兰氏阴性细菌中表达wzz家族蛋白质，优选地fepE，以产生含有中等或长O-抗原链的高分子量糖所产生的糖，这些糖相较于对应野生型O-多糖增加至少1、2、3、4或5个重复单元。在一个方面，本发明涉及由培养物中的革兰氏阴性细菌所产生的糖，该培养物自革兰氏阴性细菌表达(不一定过度表达)wzz家族蛋白质(例如wzzB)以产生含有中等或长O-抗原链的高分子量糖，这些糖相较于对应野生型O-抗原增加至少1、2、3、4或5个重复单元。对于相较于对应野生型糖具有增加数目的重复单元的额外示例性糖，参见下文O-多糖以及O-抗原的描述。所需链长为在给予疫苗构建体的情形下产生改进或最大免疫原性的链长。

在另一个实施方案中，糖包括选自表1的任一式，其中糖中的重复单元数目n比对应野生型O-多糖中的重复单元数目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元。优选地，糖相较于对应野生型O-多糖包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元的增加。参见例如表24。确定糖长度的方法是本领域已知的。此类方法包括核磁共振、质谱分析以及尺寸排阻层析，如实施例13中所描述。

在一个优选实施方案中，本发明涉及一种在重组大肠杆菌宿主细胞中产生的糖，其中内源性wzz O-抗原长度调节剂(例如wzzB)的基因缺失且置换为来自对于重组大肠杆菌宿主细胞而言为异源的革兰氏阴性细菌的(第二)wzz基因(例如沙门氏菌fepE)，以产生含有中等或长O-抗原链的高分子量糖，诸如脂多糖。在一些实施方案中，重组大肠杆菌宿主细胞包括来自沙门氏菌，优选地来自肠沙门氏菌的wzz基因。

在一个实施方案中，宿主细胞包括wzz家族蛋白质的异源基因作为稳定维持的质粒载体。在另一个实施方案中，宿主细胞包括wzz家族蛋白质的异源基因作为宿主细胞的染色体DNA中的经整合基因。在大肠杆菌宿主细胞中稳定地表达质粒载体的方法及将异源基因整合至大肠杆菌宿主细胞的染色体中的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，宿主细胞包括O-抗原的异源基因作为稳定维持的质粒载体。在另一个实施方案中，宿主细胞包括O-抗原的异源基因作为宿主细胞的染色体DNA中的经整合基因。在大肠杆菌宿主细胞及沙门氏菌宿主细胞中稳定地表达质粒载体的方法是本领域已知的。将异源基因整合至大肠杆菌宿主细胞及沙门氏菌宿主细胞的染色体中的方法是本领域已知的。

在一个方面，在包含碳源的培养基中培养重组宿主细胞。用于培养大肠杆菌的碳源是本领域已知的。示例性碳源包括糖醇、多元醇、醇醛糖或酮糖，包括(但不限于)阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸酯、丁二酸酯以及甲基胺。在一个优选实施方案中，培养基包括葡萄糖。在一些实施方案中，培养基包括多元醇或醇醛糖作为碳源，例如甘露醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨糖醇、乳糖及阿拉伯糖。可在开始培养之前，向培养基中添加全部碳源，或其可在培养期间逐步地或连续添加。

用于重组宿主细胞的示例性培养基包括选自以下中的任一个的成分：KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂及CaCl₂-2H₂O。优选地，培养基包括KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂及CaCl₂-2H₂O。

本文所用的培养基可为固体或液体，合成(即，人造)或天然的，且可包括用于培养重组宿主细胞的足够的营养物质。优选地，培养基为液体培养基。

在一些实施方案中，培养基可进一步包括适合的无机盐。在一些实施方案中，培养基可进一步包括微量营养物质。在一些实施方案中，培养基可进一步包括生长因子。在一些实施方案中，培养基可进一步包括额外碳源。在一些实施方案中，培养基可进一步包括适合的无机盐、微量营养物质、生长因子以及补充碳源。适合于培养大肠杆菌的无机盐、微量营养物质、生长因子以及补充碳源是本领域已知的。

在一些实施方案中，培养基可视需要包括额外组分，诸如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解产物、额外酵母提取物、麦芽提取物、补充碳源以及多种维生素。在一些实施方案中，培养基不包括此类额外组分，诸如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解产物、额外酵母提取物、麦芽提取物、补充碳源以及多种维生素。

适合的补充碳源的说明性实例包括(但不限于)其他碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉或淀粉水解产物、纤维素水解产物及糖蜜；有机酸，诸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸以及反丁烯二酸；以及醇类，诸如甘油、肌醇、甘露醇以及山梨糖醇。

在一些实施方案中，培养基进一步包括氮源。适合于培养大肠杆菌的氮源是本领域已知的。适合的氮源的说明性实例包括(但不限于)氨，包括氨气和氨水；无机酸或有机酸的铵盐，诸如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵及乙酸铵；脲；硝酸盐或亚硝酸盐及其他含氮材料，包括呈纯或粗制剂形式的氨基酸、肉提取物、蛋白胨、鱼粉、鱼水解产物、玉米浆、酪蛋白水解产物、大豆饼水解产物、酵母提取物、干燥的酵母、乙醇-酵母馏出物、大豆粉、棉籽粉等。

在一些实施方案中，培养基包括无机盐。适合的无机盐的说明性实例包括(但不限于)钾、钙、钠、镁、锰、铁、钴、锌、铜、钼、钨及其他微量元素的盐以及磷酸盐。

在一些实施方案中，培养基包括适当生长因子。适当微量营养物质、生长因子等的说明性实例包括(但不限于)辅酶A、泛酸、吡哆醇-HCl、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、叶酸、维生素B₁₂、其他维生素、氨基酸(诸如半胱氨酸以及羟脯氨酸)、碱基(诸如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶以及胞嘧啶)、硫代硫酸钠、对氨基苯甲酸或r-氨基苯甲酸、烟碱酰胺、乙酸亚硝酸盐等，其呈纯或部分纯化的化学化合物形式或在天然材料中存在。量可由本领域技术人员根据本领域已知的方法及技术凭经验确定。

在另一个实施方案中，本文所描述的经修饰糖(相较于对应野生型糖)以合成方式例如体外产生。合成产生或糖的合成可有助于避免成本及时间密集型生产过程。在一个实施方案中，糖以合成方式合成来自受适当保护的单糖中间物，诸如通过使用顺序糖基化策略或顺序糖基化与[3+2]块体合成策略的组合。例如，硫糖及糖基三氯乙酰亚胺酯衍生物可用作糖基化中的糖基供体。在一个实施方案中，以合成方式体外合成的糖与通过重组手段，诸如通过操纵上文所描述的wzz家族蛋白质所产生的糖具有一致结构。

所产生的糖(通过重组或合成方式)包括衍生自任何大肠杆菌血清型的结构，该血清型包括例如以下大肠杆菌血清型中的任一个：O1(例如，O1A、O1B及O1C)、O2、O3、O4(例如，O4:K52及O4:K6)、O5(例如，O5ab及O5ac(菌株180/C3))、O6(例如，O6:K2；K13；K15及O6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18(例如，O18A、O18ac、O18A1、O18B及O18B1)、O19、O20、O21、O22、O23(例如，O23A)、O24、O25(例如，O25a及O25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45(例如，O45及O45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73(例如，O73(菌株73-1))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

个体多糖通常经由本领域已知的方法来纯化(相对于多糖-蛋白质缀合物的量富集)，这些方法诸如渗析、浓缩操作、透滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超过滤、深度过滤和/或柱层析(离子交换层析、多模式离子交换层析、DEAE以及疏水相互作用层析)。优选地，多糖经由包括切向流过滤的方法来纯化。

经纯化多糖可被活化(例如化学活化)以使其能够反应(例如直接与载体蛋白质反应或经由诸如eTEC间隔基的接头)，且随后并入本发明的糖缀合物中，如本文进一步描述。

在一个优选实施方案中，本发明的糖衍生自大肠杆菌血清型，其中血清型为O25a。在另一优选实施方案中，血清型为O25b。在另一优选实施方案中，血清型为O1A。在另一优选实施方案中，血清型为O2。在另一优选实施方案中，血清型为O6。在另一优选实施方案中，血清型为O17。在另一优选实施方案中，血清型为O15。在另一优选实施方案中，血清型为O18A。在另一优选实施方案中，血清型为O75。在另一优选实施方案中，血清型为O4。在另一优选实施方案中，血清型为O16。在另一优选实施方案中，血清型为O13。在另一优选实施方案中，血清型为O7。在另一优选实施方案中，血清型为O8。在另一优选实施方案中，血清型为O9。

如本文所用，提及上文所列的血清型中的任一个，是指涵盖本领域已知的重复单元结构(O-单元，如下文所描述)且对于对应血清型特有的血清型。例如，术语“O25a”血清型(在本领域还称为血清型“O25”)是指涵盖表1中所展示的式O25的血清型。作为另一实例，术语“O25b”血清型是指涵盖表1中所展示的式O25b的血清型。

如本文所用，除非另外规定，否则血清型在本文中为一般提及的，例如术语式“O18”一般是指涵盖式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B和式O18B1。

如本文所用，术语“O1”一般是指根据表1涵盖在式名称中包括通用术语“O1”的式的物种，诸如式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C中的任一个，其中的每一种在表1中展示。因此，“O1血清型”一般是指涵盖式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C中的任一个的血清型。

如本文所用，术语“O6”一般是指根据表1在式名称中包括通用术语“O6”的式物种，诸如式O6:K2；K13；K15；以及O6:K54中的任一个，其中的每一种在表1中展示。因此，“O6血清型”一般是指涵盖式O6:K2；K13；K15；以及O6:K54中的任一个的血清型。

一般是指根据表1在式名称中包括通用术语的式物种的术语的其他实例包括：“O4”、“O5”、“O18”以及“O45”。

如本文所用，术语“O2”是指表1中展示的式O2。术语“O2 O-抗原”是指涵盖表1中展示的式O2的糖。

如本文所用，提及来自上文所列的血清型的O-抗原是指涵盖用对应血清型名称标记的式的糖。例如，术语“O25B O-抗原”是指涵盖表1中展示的式O25B的糖。

作为另一实例，术语“O1 O-抗原”一般是指涵盖包括术语“O1”，诸如式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C(其中的每一种在表1中展示)的式的糖。

作为另一实例，术语“O6 O-抗原”一般是指涵盖包括术语“O6”，诸如式O6:K2；式O6:K13；式O6:K15和式O6:K54(其中的每一种在表1中展示)的式的糖。

B.O-多糖

如本文所用，术语“O-多糖”是指包括O-抗原的任何结构，其限制条件为该结构不包括全细胞或脂质A。例如，在一个实施方案中，O-多糖包括脂多糖，其中未结合脂质A。移除脂质A的步骤是本领域已知的，且作为实例，包括在添加酸的情况下进行热处理。示例性程序包括在100℃下用1％乙酸处理90分钟。将此程序与作为移除分离脂质A的程序组合。用于分离脂质A的示例性程序包括超速离心。

在一个实施方案中，O-多糖是指由O-抗原组成的结构，在此情况下，O-多糖与术语O-抗原同义。在一个优选实施方案中，O-多糖是指包括O-抗原的重复单元而不具有核心糖的结构。因此，在一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌K12核心部分。在另一优选实施方案中，O-多糖是指包括O-抗原及核心糖的结构。在另一个实施方案中，O-多糖是指包括O-抗原、核心糖及KDO部分的结构。

从LPS纯化包括核心寡糖的O-多糖的方法是本领域已知的。例如，在纯化LPS之后，经纯化LPS可通过以下来进行水解：在100摄氏度下于1％(v/v)乙酸中加热90分钟，接着在4摄氏度下于142,000×g下超速离心5小时。将含有O-多糖的上清液冷冻干燥且储存在4摄氏度下。在某些实施方案中，描述荚膜合成基因的缺失以使得能够简化O-多糖的纯化。

O-多糖可通过包括(但不限于)弱酸水解以从LPS移除脂质A的方法来进行分离。其他实施方案可包括使用肼作为用于O-多糖制备的药剂。LPS的制备可通过本领域已知的方法来实现。

在某些实施方案中，提供从表达(不一定过度表达)wzz蛋白质(例如wzzB)的野生型、经修饰或减毒革兰氏阴性菌株纯化的O-多糖，以用于缀合物疫苗中。在优选实施方案中，从表达(不一定过度表达)wzz蛋白质用作呈缀合物或复合疫苗的疫苗抗原的革兰氏阴性菌株纯化O-多糖链。

在一个实施方案中，O-多糖具有相较于对应野生型O-多糖增加以下倍的分子量：约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多倍。在一个优选实施方案中，O-多糖具有相较于对应野生型O-多糖增加至少1倍及至多5倍的分子量。在另一个实施方案中，O-多糖具有相较于对应野生型O-多糖增加至少2倍及至多4倍的分子量。O-多糖的分子量相较于对应野生型O-多糖的增加优选地与O-抗原重复单元的数目的增加相关。在一个实施方案中，O-多糖的分子量的增加是由于wzz家族蛋白质。

在一个实施方案中，O-多糖具有相较于对应野生型O-多糖增加以下的分子量：约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100kDa或更多。在一个实施方案中，本发明的O-多糖具有相较于对应野生型O-多糖增加至少1kDa及至多200kDa的分子量。在一个实施方案中，分子量增加至少5及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少12及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少15及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少18及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少21及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少22及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少30及至多200kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少1及至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少5及至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少12及至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少15及至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多100kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少1及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少5及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少12及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少15及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少18及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少30及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多90kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少12及至多85kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多75kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多70kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多60kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多50kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多49kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多48kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多47kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少10及至多46kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多45kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多44kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多43kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多42kDa。在一个实施方案中，分子量增加至少20及至多41kDa。O-多糖的分子量相较于对应野生型O-多糖的此类增加优选地与O-抗原重复单元的数目的增加相关。在一个实施方案中，O-多糖的分子量的增加是由于wzz家族蛋白质。参见例如表21。

在另一个实施方案中，O-多糖包括选自表1的任一式，其中O-多糖中的重复单元数目n比对应野生型O-多糖中的重复单元数目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元。优选地，糖相较于对应野生型O-多糖包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元的增加。参见例如表21。

C.O-抗原

O-抗原为革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖(LPS)的一部分。O-抗原在细胞表面上且为一种可变细胞成分。O-抗原的变化性为革兰氏阴性细菌的血清分型提供基础。目前大肠杆菌血清分型方案包括O-多糖1至181。

O-抗原包括寡糖重复单元(O-单元)，其野生型结构通常含有来自大范围糖的2至8个残基。示例性大肠杆菌O-抗原的O单元展示于表1中，还参见图9A至图9C及图10A至图10B。

在一个实施方案中，本发明的糖可为一个寡糖单元。在一个实施方案中，本发明的糖为相关血清型的一个重复寡糖单元。在这类实施方案中，糖可包括选自式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97和式O101中的任一个的结构。在另一个实施方案中，糖可包括选自式O1a、式O2、式O6和式O25b中的任一个的结构。

在一个实施方案中，本发明的糖可为寡糖。寡糖具有低数目的重复单元(通常5-15个重复单元)，且通常以合成方式或通过多糖的水解得到。在这类实施方案中，糖可包括选自式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97和式O101中的任一个的结构。在另一个实施方案中，糖可包括选自式O1a、式O2、式O6和式O25b中的任一个的结构。

优选地，本发明及本发明的免疫原性组合物中的所有糖为多糖。高分子量多糖可由于存在于抗原表面上的表位而诱导某些抗体免疫反应。优选地涵盖高分子量多糖的分离及纯化，以用于本发明的缀合物、组合物及方法中。

在一些实施方案中，每个个体O-抗原聚合物中的重复O单元的数目(且因此聚合物链的长度和分子量)取决于wzz链长调节剂(一种内膜蛋白质)。不同wzz蛋白质赋予不同范围的模态长度(4至>100个重复单元)。术语“模态长度”是指重复O-单元的数目。革兰氏阴性细菌通常具有赋予两种不同OAg模态链长(一个较长且一个较短)的两种不同Wzz蛋白质。革兰氏阴性细菌中的wzz家族蛋白质(例如wzzB)的表达(不一定过度表达)可允许操纵O-抗原长度，以改变或调节某些长度范围的O-抗原的细菌产量，以及以增强高产率大分子量脂多糖的产量。在一个实施方案中，如本文所用，“短”模态长度是指低数目的重复O-单元，例如1-20个。在一个实施方案中，如本文所用，“长”模态长度是指大于20及至多最大40个的多个重复O-单元。在一个实施方案中，如本文所用，“极长”模态长度是指大于40个重复O-单元。

在一个实施方案中，所产生的糖相较于对应野生型O-多糖增加至少10个重复单元、15个重复单元、20个重复单元、25个重复单元、30个重复单元、35个重复单元、40个重复单元、45个重复单元、50个重复单元、55个重复单元、60个重复单元、65个重复单元、70个重复单元、75个重复单元、80个重复单元、85个重复单元、90个重复单元、95个重复单元或100个重复单元。

在另一个实施方案中，本发明的糖相较于对应野生型O-多糖增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元。优选地，糖相较于对应野生型O-多糖包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元的增加。参见例如表21。确定糖长度的方法是本领域已知的。此类方法包括核磁共振、质谱分析和尺寸排阻层析，如实施例13中所描述。

确定糖中的重复单元数目的方法也是本领域已知的。例如，重复单元数目(或式中的“n”)可通过以下来计算：将多糖的分子量(不具有核心糖或KDO残基的分子量)除以重复单元的分子量(即，例如表1中展示的对应式中的结构的分子量，其可理论上计算为式中的各单糖的分子量的总和)。式中的各单糖的分子量是本领域已知的。式O25b的重复单元的分子量例如为约862Da。式O1a的重复单元的分子量例如为约845Da。式O2的重复单元的分子量例如为约829Da。式O6的重复单元的分子量例如为约893Da。当确定缀合物中的重复单元数目时，将载体蛋白质分子量和蛋白质:多糖比率纳入计算。如本文所定义，“n”是指多糖分子中的重复单元(表1中的括号中所表示)的数目。如本领域已知，在生物学大分子中，重复结构中可穿插有不完全重复区，诸如丢失分支。另外，本领域已知，从天然来源(诸如细菌)分离和纯化的多糖在大小上和在分支上可为异质的。在此情况下，n可表示群体中的分子的n的平均或中位值。

在一个实施方案中，O-多糖相较于对应野生型O-多糖具有O-抗原的至少一个重复单元的增加。O-抗原的重复单元在表1中展示。在一个实施方案中，O-多糖包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个总重复单元。优选地，糖具有总共至少3个至至多80个重复单元。在另一个实施方案中，O-多糖相较于对应野生型O-多糖具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元的增加。

在一个实施方案中，糖包括O-抗原，其中O-抗原式(诸如表1中展示的式(还参见图9A至图9C及图10A至图10B))中的任一个中的n为至少1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40及至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50的整数。可将任何最小值及任何最大值进行组合以界定范围。示例性范围包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；以及至少20至至多80，优选地至多90。在一个优选实施方案中，n为至少31至至多90。在一个优选实施方案中，n为40至90，更优选地60至85。

在一个实施方案中，糖包括O-抗原，其中O-抗原式中的任一个中的n为至少1及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少5及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少10及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少25及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少50及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少75及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少100及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少125及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少150及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少175及至多200。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少1及至多100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少5及至多100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少10及至多100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少25及至多100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少50及至多100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少75及至多100。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少1及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少5及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少10及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少20及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少25及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少30及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少40及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少50及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少30及至多90。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多85。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多75。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多70。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多60。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多50。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多49。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多48。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多47。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少35及至多46。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少36及至多45。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少37及至多44。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少38及至多43。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少39及至多42。在一个实施方案中，O-抗原式中的任一个中的n为至少39及至多41。

例如，在一个实施方案中，糖中的n为31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90，最优选40。在另一个实施方案中，n为至少35至至多60。例如，在一个实施方案中，n为以下中的任一个：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59以及60，优选地50。在另一优选实施方案中，n为至少55至至多75。例如，在一个实施方案中，n为55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69，最优选60。

糖结构可通过本领域已知的方法和工具确定，诸如NMR，包括1D、1H和/或13C、2DTOCSY、DQF-COSY、NOESY和/或HMQC。

在一些实施方案中，在缀合之前经纯化多糖具有5kDa至400kDa之间的分子量。在其他这类实施方案中，糖具有以下的分子量：在10kDa与400kDa之间；在5kDa与400kDa之间；在5kDa与300kDa之间；在5kDa与200kDa之间；在5kDa与150kDa之间；在10kDa与100kDa之间；在10kDa与75kDa之间；在10kDa与60kDa之间；在10kDa与40kDa之间；在10kDa与100kDa之间；在10kDa与200kDa之间；在15kDa与150kDa之间；在12kDa与120kDa之间；在12kDa与75kDa之间；在12kDa与50kDa之间；在12kDa与60kDa之间；在35kDa与75kDa之间；在40kDa与60kDa之间；在35kDa与60kDa之间；在20kDa与60kDa之间；在12kDa与20kDa之间；或在20kDa与50kDa之间。在其他实施方案中，多糖具有在以下之间的分子量：7kDa至15kDa；8kDa至16kDa；9kDa至25kDa；10kDa至100kDa；10kDa至60kDa；10kDa至70kDa；10kDa至160kDa；15kDa至600kDa；20kDa至1000kDa；20kDa至600kDa；20kDa至400kDa；30kDa至1,000KDa；30kDa至60kDa；30kDa至50kDa或5kDa至60kDa。作为本公开内容的一个实施方案，涵盖以上范围中的任一个内的任何全数整数。

如本文所用，术语多糖或载体蛋白质-多糖缀合物的“分子量”是指通过尺寸排阻层析(SEC)与多角度激光散射检测器(MALLS)组合计算的分子量。

多糖的尺寸在正常纯化程序期间可能略微减小。另外，如本文所描述，多糖可在缀合之前经受尺寸测试技术。可采用机械或化学尺寸测试。可使用乙酸进行化学水解。机械尺寸测定可使用高压均质化剪切来进行。上文提及的分子量范围是指在缀合之前(例如在活化之前)的经纯化多糖。

表1：大肠杆菌血清群/血清型和O-单元部分

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β-D-6dmanHep2Ac为2-O-乙酰基-6-脱氧-β-D-甘露-庚哌喃糖基。

β-D-Xulf为β-D-苏-呋喃戊糖基。

D.核心寡糖

核心寡糖位于野生型大肠杆菌LPS中的脂质A与O-抗原外区之间。更具体地说，核心寡糖为多糖中包括野生型大肠杆菌中的O-抗原与脂质A之间的键的部分。此键包括最内3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO))残基的半缩酮官能基与脂质A的GlcNAc-残基的羟基之间的酮苷键。在野生型大肠杆菌菌株中，核心寡糖区显示较高程度的相似性。其通常包括有限数目的糖。核心寡糖包括内部核心区和外部核心区。

更具体地说，内部核心主要由L-甘油-D-甘露-庚糖(庚糖)和KDO残基构成。内部核心为高度保守的。KDO残基包括以下式KDO：

核心寡糖的外区比内部核心区展示更多的变化，此区域中的差异区分大肠杆菌中的五种化学型：R1、R2、R3、R4和K-12。参见图24，其说明五种已知化学型的外部核心寡糖的碳水化合物主链的一般化结构。HepII为内部核心寡糖的最后一个残基。尽管所有外部核心寡糖共享结构主题，具有(己糖)₃碳水化合物主链以及两个侧链残基，但主链中的己糖的顺序和侧链残基的性质、位置以及连接全部均可变化。R1和R4外部核心寡糖的结构高度类似，相差仅单个β-连接的残基。

在本领域，基于远端寡糖的结构，将野生型大肠杆菌的核心寡糖分成五种不同化学型：大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4及大肠杆菌K12。

在一个优选实施方案中，本文所描述的组合物包括糖缀合物，其中O-多糖包括与O-抗原结合的核心寡糖。在一个实施方案中，组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12中的至少任一个的免疫反应。在另一个实施方案中，组合物诱导针对至少两种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一个实施方案中，组合物诱导针对至少三种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一个实施方案中，组合物诱导针对至少四种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一个实施方案中，组合物诱导针对所有五种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。

在另一优选实施方案中，本文所描述的组合物包括糖缀合物，其中O-多糖不包括与O-抗原结合的核心寡糖。在一个实施方案中，此类组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12中的至少任一个的免疫反应，尽管糖缀合物具有不包括核心寡糖的O-多糖。

大肠杆菌血清型可根据五种化学型中的一种来进行表征。表2列举根据化学型表征的示例性血清型。呈粗体形式的血清型表示最常与所指示核心化学型相关的血清型。因此，在一个优选实施方案中，组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12中的至少任一个的免疫反应，该免疫反应包括针对各别对应大肠杆菌血清型中的任一个的免疫反应。

表2：核心化学型和相关大肠杆菌血清型

在一些实施方案中，组合物包括包含衍生自具有R1化学型的血清型的结构，例如选自具有以下的糖的糖：式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O8、式O18、式O9、式O13、式O20、式O21、式O91和式O163，其中n为1至100。在一些实施方案中，该组合物中的糖进一步包括例如展示于图24中的大肠杆菌R1核心部分。

在一些实施方案中，组合物包括包含衍生自具有R1化学型的血清型的结构，例如选自具有以下的糖的糖：式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O18、式O13、式O20、式O21、式O91和式O163，其中n为1至100，优选地31至100，优选地31至90，更优选地35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，该组合物中的糖进一步包括在该糖中的大肠杆菌R1核心部分。

在一些实施方案中，组合物包括包含衍生自具有R2化学型的血清型的结构，例如选自具有以下的糖的糖：式O21、式O44、式O11、式O89、式O162和式O9，其中n为1至100，优选地31至100，优选地31至90，更优选地35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，该组合物中的糖进一步包括例如展示于图24中的大肠杆菌R2核心部分。

在一些实施方案中，组合物包括包含衍生自具有R3化学型的血清型的结构，例如选自具有以下的糖的糖：式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86和式O93，其中n为1至100，优选地31至100，优选地31至90，更优选地35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，该组合物中的糖进一步包括例如展示于图24中的大肠杆菌R3核心部分。

在一些实施方案中，组合物包括包含衍生自具有R4化学型的血清型的结构，例如选自具有以下的糖的糖：式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160和式O166，其中n为1至100，优选地31至100，优选地31至90，更优选地35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，该组合物中的糖进一步包括例如展示于图24中的大肠杆菌R4核心部分。

在一些实施方案中，组合物包括包含衍生自具有K-12化学型的血清型的结构(例如选自具有式O25b的糖和具有式O16的糖)的糖，其中n为1至1000，优选地31至100，优选地31至90，更优选地35至90，最优选35至65。在一些实施方案中，该组合物中的糖进一步包括例如展示于图24中的大肠杆菌K-12核心部分。

在一些实施方案中，糖包括核心糖。因此，在一个实施方案中，O-多糖进一步包括大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包括大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包括大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包括大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖进一步包括大肠杆菌K12核心部分。

在一些实施方案中，糖不包括核心糖。因此，在一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R1核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R2核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R3核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌R4核心部分。在另一个实施方案中，O-多糖不包括大肠杆菌K12核心部分。

E.缀合O-抗原

O-抗原或优选地O-多糖与蛋白质载体的化学键可改进O-抗原或O-多糖的免疫原性。然而，聚合物大小的变化性表示用于生产的一个实践难题。在商业用途中，糖的大小可影响与不同缀合合成策略的兼容性、产物均一性和缀合物免疫原性。经由操纵O-抗原合成路径控制Wzz家族蛋白质链长调节剂的表达允许在多种革兰氏阴性菌株(包括大肠杆菌)中产生所需长度的O-抗原链。

在一个实施方案中，经纯化糖经化学活化以产生能够与载体蛋白质反应的活化糖。一旦活化，则各糖单独地与载体蛋白质缀合，形成缀合物，即糖缀合物。如本文所用，术语“糖缀合物”是指与载体蛋白质共价连接的糖。在一个实施方案中，糖直接与载体蛋白质连接。在另一个实施方案中，糖经由间隔基/接头与蛋白质连接。

可通过在沿O-抗原的一个位点处或在多个位点处将载体与O-抗原结合的方案，或通过活化核心寡糖的至少一个残基的方案，来制备缀合物。

在一个实施方案中，各糖与相同载体蛋白质缀合。

若组合物中的2种或更多种糖的蛋白质载体相同，则这些糖可与载体蛋白质的相同分子(例如具有与其缀合的2种或更多种糖的载体分子)缀合。

在一个优选实施方案中，糖各自独立地与蛋白质载体的不同分子(蛋白质载体的各分子仅具有与其缀合的一种类型的糖)缀合。在该实施方案中，将糖称为独立地与载体蛋白质缀合。

糖的化学活化以及与载体蛋白质的后续缀合可通过本文所公开的活化和缀合方法来达成。在多糖与载体蛋白质缀合之后，通过多种技术来纯化(相对于多糖-蛋白质缀合物的量富集)糖缀合物。这些技术包括浓缩/透滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深度过滤。在将个别糖缀合物纯化之后，将其进行混配以调配本发明的免疫原性组合物。

活化.本发明进一步涉及根据本文所描述的任一实施方案产生的经活化多糖，其中该多糖用化学试剂活化以产生用于与接头或载体蛋白质缀合的反应性基团。在一些实施方案中，本发明的糖在与载体蛋白质缀合之前活化。在一些实施方案中，活化程度不显著地减小多糖的分子量。例如，在一些实施方案中，活化程度不使多糖主链裂解。在一些实施方案中，活化程度不显著地影响缀合程度，如通过载体蛋白质(诸如CRM₁₉₇)中经修饰的赖氨酸残基的数目(如通过氨基酸分析所确定)所测量的。例如，在一些实施方案中，相较于在相同活化程度下，与参考多糖缀合的载体蛋白质中经修饰的赖氨酸残基的数目，活化程度不显著地增加载体蛋白质中经修饰的赖氨酸残基的数目(如通过氨基酸分析所确定)3倍。在一些实施方案中，活化程度不增加未缀合游离糖的水平。在一些实施方案中，活化程度不降低最佳糖/蛋白质比率。

在一些实施方案中，经活化糖具有以下的活化百分比，其中经活化糖的每糖重复单元的硫醇摩尔数在1-100％之间，诸如在2-80％之间，在2-50％之间，在3-30％之间和在4-25％之间。活化程度为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％，或约100％。优选地，活化程度为至多50％，更优选地至多25％。在一个实施方案中，活化程度为至多20％。可将任何最小值及任何最大值进行组合以界定范围。

在一个实施方案中，多糖用1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化，形成氰酸酯。随后，将经活化多糖直接与载体蛋白质(优选地CRM₁₉₇或破伤风类毒素)上的氨基偶联或经由间隔基(接头)与其偶联。

例如，间隔基可为产生硫醇化多糖的胱胺或半胱胺，该硫醇化多糖可经由在与经顺丁烯二酰亚胺活化的载体蛋白质(例如使用N-[Y-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS))或经卤素乙酰化的载体蛋白质(例如使用碘乙酰胺、N-丁二酰亚胺基溴乙酸酯(SBA；SIB)、N-丁二酰亚胺基(4-碘乙酰基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、磺基丁二酰亚胺基(4-碘乙酰基)胺基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、N-丁二酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)或丁二酰亚胺基3-[溴乙酰胺基]丙酸酯(SBAP))反应之后获得的硫醚键，而与载体偶联。在一个实施方案中，将氰酸酯(任选地通过CDAP化学方法制备)与己烷二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，且使用碳化二亚胺(例如EDAC或EDC)化学方法，经由蛋白质载体上的羧基，将氨基衍生的糖与载体蛋白质(例如CRM₁₉₇)缀合。

用于缀合的其他适合的技术使用碳二酰亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的游离羟基与CDI反应，接着与蛋白质反应以形成氨基甲酸酯键来形成。这可涉及将变旋异构端还原成一级羟基，任选地选用的保护/去保护该一级羟基，该一级羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间物，且将CDI氨基甲酸酯中间物与蛋白质上的氨基偶联(CDI化学方法)。

分子量.在一些实施方案中，糖缀合物包含具有在10kDa与2,000kDa之间的分子量的糖。在其他实施方案中，糖的分子量在50kDa与1,000kDa之间。在其他实施方案中，糖的分子量在70kDa与900kDa之间。在其他实施方案中，糖的分子量在100kDa与800kDa之间。在其他实施方案中，糖的分子量在200kDa与600kDa之间。在其他实施方案中，糖的分子量为100kDa至1000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1,000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa。在一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过单端缀合产生。在另一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过在水性缓冲液中进行的还原氨基化化学方法(RAC)产生。作为本发明的一个实施方案，涵盖以上范围中的任一个内的任何全数整数。

在一些实施方案中，本发明的糖缀合物具有在400kDa与15,000kDa之间；在500kDa与10,000kDa之间；在2,000kDa与10,000kDa之间；在3,000kDa与8,000kDa之间；或在3,000kDa与5,000kDa之间的分子量。在其他实施方案中，糖缀合物具有在500kDa与10,000kDa之间的分子量。在其他实施方案中，糖缀合物具有在1,000kDa与8,000kDa之间的分子量。在其他实施方案中，糖缀合物具有在2,000kDa与8,000kDa之间或在3,000kDa与7,000kDa之间的分子量。在其他实施方案中，本发明的糖缀合物具有以下的分子量：在200kDa与20,000kDa之间；在200kDa与15,000kDa之间；在200kDa与10,000kDa之间；在200kDa与7,500kDa之间；在200kDa与5,000kDa之间；在200kDa与3,000kDa之间；在200kDa与1,000kDa之间；在500kDa与20,000kDa之间；在500kDa与15,000kDa之间；在500kDa与12,500kDa之间；在500kDa与10,000kDa之间；在500kDa与7,500kDa之间；在500kDa与6,000kDa之间；在500kDa与5,000kDa之间；在500kDa与4,000kDa之间；在500kDa与3,000kDa之间；在500kDa与2,000kDa之间；在500kDa与1,500kDa之间；在500kDa与1,000kDa之间；在750kDa与20,000kDa之间；在750kDa与15,000kDa之间；在750kDa与12,500kDa之间；在750kDa与10,000kDa之间；在750kDa与7,500kDa之间；在750kDa与6,000kDa之间；在750kDa与5,000kDa之间；在750kDa与4,000kDa之间；在750kDa与3,000kDa之间；在750kDa与2,000kDa之间；在750kDa与1,500kDa之间；在1,000kDa与15,000kDa之间；在1,000kDa与12,500kDa之间；在1,000kDa与10,000kDa之间；在1,000kDa与7,500kDa之间；在1,000kDa与6,000kDa之间；在1,000kDa与5,000kDa之间；在1,000kDa与4,000kDa之间；在1,000kDa与2,500kDa之间；在2,000kDa与15,000kDa之间；在2,000kDa与12,500kDa之间；在2,000kDa与10,000kDa之间；在2,000kDa与7,500kDa之间；在2,000kDa与6,000kDa之间；在2,000kDa与5,000kDa之间；在2,000kDa与4,000kDa；或在2,000kDa与3,000kDa之间。在一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过本文所描述的eTEC缀合产生。在另一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过还原氨基化化学方法(RAC)产生。在另一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过在DMSO中进行的还原氨基化化学方法(RAC)产生。

在其他实施方案中，本发明的糖缀合物具有以下的分子量：在1,000kDa与20,000kDa之间；在1,000kDa与15,000kDa之间；在2,000kDa与10,000kDa之间；在2000kDa与7,500kDa之间；在2,000kDa与5,000kDa之间；在3,000kDa与20,000kDa之间；在3,000kDa与15,000kDa之间；在3,000kDa与12,500kDa之间；在4,000kDa与10,000kDa之间；在4,000kDa与7,500kDa之间；在4,000kDa与6,000kDa；或在5,000kDa与7,000kDa之间。在一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过还原氨基化化学方法(RAC)产生。在另一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过在DMSO中进行的还原氨基化化学方法(RAC)产生。在另一个实施方案中，具有此类分子量的糖缀合物通过本文所描述的eTEC缀合产生。

在其他实施方案中，本发明的糖缀合物具有在5,000kDa与20,000kDa之间；在5,000kDa与15,000kDa之间；在5,000kDa与10,000kDa之间；在5,000kDa与7,500kDa之间；在6,000kDa与20,000kDa之间；在6,000kDa与15,000kDa之间；在6,000kDa与12,500kDa之间；在6,000kDa与10,000kDa之间或在6,000kDa与7,500kDa之间的分子量。

糖缀合物的分子量可通过SEC-MALLS来测量。作为本发明的一个实施方案，涵盖以上范围中的任一个内的任何全数整数。本发明的糖缀合物还可通过糖与载体蛋白质的比率(重量/重量)表征。在一些实施方案中，糖缀合物中的多糖与载体蛋白质的比率(w/w)在0.5与3之间(例如约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0)。在其他实施方案中，糖与载体蛋白质比率(w/w)在0.5与2.0之间、在0.5与1.5之间、在0.8与1.2之间、在0.5与1.0之间、在1.0与1.5之间或在1.0与2.0之间。在其他实施方案中，糖与载体蛋白质比率(w/w)在0.8与1.2之间。在一个优选实施方案中，缀合物中的多糖与载体蛋白质的比率在0.9与1.1之间。在一些这类实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇。

糖缀合物还可通过其分子大小分布(K_d)表征。尺寸排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布。在重力进料柱中使用尺寸排阻层析(SEC)以得到缀合物的分子大小分布概况。大分子排除在介质中的孔之外，比小分子更快速洗脱。级分收集器用于收集柱洗脱液。通过糖分析比色测试级分。为了确定K_d，将柱进行校准以确立完全排除分子(V₀)，(K_d＝0)的分数；以及表示最大保留(V_i)，(K_d＝1)的分数。达到指定样品属性的分数(V_e)涉及通过以下表述的K_d：K_d＝(V_e-V_o)/(V_i-V₀)。

游离糖.本发明的糖缀合物和免疫原性组合物可包括未与载体蛋白质共价缀合但仍存在于糖缀合物组合物中的游离糖。游离糖可未与糖缀合物共价结合(即未与其共价结合、吸附或包埋于其中)。在一个优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含至多50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含低于约25％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含至多约20％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含至多约15％的游离多糖。在另一优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含至多约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含低于约8％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含至多约6％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖的总量，糖缀合物包含至多约5％的游离多糖。参见例如表19、表20、表21、表22、表23、表24及表25。

共价连接.在其他实施方案中，对于每5至10个糖重复单元、每2至7个糖重复单元、每3至8个糖重复单元、每4至9个糖重复单元、每6至11个糖重复单元、每7至12个糖重复单元、每8至13个糖重复单元、每9至14个糖重复单元、每10至15个糖重复单元、每2至6个糖重复单元、每3至7个糖重复单元、每4至8个糖重复单元、每6至10个糖重复单元、每7至11个糖重复单元、每8至12个糖重复单元、每9至13个糖重复单元、每10至14个糖重复单元、每10至20个糖重复单元、每4至25个糖重复单元或每2至25个糖重复单元，缀合物在载体蛋白质与糖之间包含至少一个共价连接。在常见实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇。在另一个实施方案中，对于多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个糖重复单元，在载体蛋白质与糖之间存在至少一个连接。在一个实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇。作为本发明的一个实施方案，涵盖以上范围中的任一个内的任何全数整数。

赖氨酸残基.用以表征本发明的糖缀合物的另一方式为通过变得与特征可为一系列经缀合赖氨酸(缀合程度)的糖缀合的载体蛋白质(例如CRM₁₉₇)中的赖氨酸残基的数目。载体蛋白质的由于与多糖共价连接所致的赖氨酸修饰的证据，可通过氨基酸分析，使用本领域技术人员已知的常规方法来获得。缀合引起所回收赖氨酸残基的数目与用于产生缀合物材料的载体蛋白质起始物质相比减少。在一个优选实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度在2与15之间、与2与13之间、与2与10之间、与2与8之间、与2与6之间、与2与5之间、与2与4之间、与3与15之间、与3与13之间、与3与10之间、与3与8之间、与3与6之间、与3与5之间、与3与4之间、与5与15之间、与5与10之间、与8与15之间、与8与12之间、与10与15之间或在10与12之间。在一个实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在一个优选实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度在4与7之间。在一些这类实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇。

糖链与载体蛋白质上的赖氨酸的连接的频率为对本发明的糖缀合物进行表征的另一参数。例如，在一些实施方案中，对于多糖的每4个糖重复单元，在载体蛋白质与多糖之间至少一个共价连接。在另一个实施方案中，载体蛋白质与多糖之间的共价连接在多糖的每10个糖重复单元中发生至少一次。在另一个实施方案中，载体蛋白质与多糖之间的共价连接在多糖的每15个糖重复单元中发生至少一次。在又一实施方案中，载体蛋白质与多糖之间的共价连接在多糖的每25个糖重复单元中发生至少一次。

O-乙酰化.在一些实施方案中，本发明的糖为O-乙酰化的。在一些实施方案中，糖缀合物包含具有在10-100％之间，在20-100％之间，在30-100％之间，在40-100％之间，在50-100％之间，在60-100％之间，在70-100％之间，在75-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或80-90％之间的O-乙酰化程度的糖。在其他实施方案中，O-乙酰化程度为≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％，或约100％。通过O-乙酰化的％，其是指指定糖相对于100％(其中各重复单元相对于其经乙酰化结构为完全乙酰化的)的百分比。

在一些实施方案中，通过还原氨基化来制备糖缀合物。在一些实施方案中，糖缀合物为单端连接的缀合糖，其中该糖直接与载体蛋白质共价结合。在一些实施方案中，糖缀合物经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质共价结合。

还原性胺化.在一个实施方案中，糖通过还原氨基化与载体蛋白质缀合(诸如在美国专利申请公开第2006/0228380号、第2007/0231340号、第2007/0184071号和第2007/0184072号，WO 2006/110381，WO 2008/079653和WO 2008/143709中所描述)。

还原氨基化包括(1)糖的氧化，(2)经活化糖以及载体蛋白质的还原以形成缀合物。在氧化之前，糖任选地进行水解。可采用机械或化学水解。可使用乙酸进行化学水解。

氧化步骤可涉及与过碘酸盐反应。如本文所用，术语“过碘酸盐/过碘酸(periodate)”是指过碘酸盐(periodate)及过碘酸(periodic acid)两者。该术语还包括偏过碘酸根(IO₄ ^-)和原过碘根(IO₆ ^5-)以及过碘酸的各种盐(例如过碘酸钠和过碘酸钾)。在一个实施方案中，多糖在存在偏过碘酸(盐)的情况下，优选地在存在过碘酸钠(NalO₄)的情况下氧化。在另一个实施方案中，多糖在存在原过碘酸(盐)的情况下，优选地在存在过碘酸的情况下氧化。

在一个实施方案中，氧化剂为稳定的硝酰基或氮氧化物基团化合物，诸如哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物，在存在氧化剂的情况下选择性地氧化一级羟基。在该反应中，在催化循环中，实际氧化剂为N-氧铵盐。在一方面，该稳定的硝酰基或氮氧化物基团化合物为哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物。在一方面，该稳定的硝酰基或氮氧化物基团化合物携带TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯啶氧基)部分。在一方面，该稳定的硝酰基团化合物为TEMPO或其衍生物。在一方面，该氧化剂为携带N-卤基部分的分子。在一方面，该氧化剂选自N-氯丁二酰亚胺、N-溴丁二酰亚胺、N-碘丁二酰亚胺、二氯异三聚氰酸、1,3,5-三氯-l,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二溴异三聚氰酸、1,3,5-三溴-l,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二碘异三聚氰酸和1,3,5-三碘-l,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮中的任一个。优选地，该氧化剂为N-氯丁二酰亚胺。

在糖的氧化步骤之后，糖称为经活化的且在本文下文被称作“经活化”。经活化糖及载体蛋白质可独立地(分散冻干)或一起(共冻干)经冻干(冷冻干燥)。在一个实施方案中，共冻干经活化糖和载体蛋白质。在另一个实施方案中，独立地冻干经活化多糖和载体蛋白质。

在一个实施方案中，冻干在存在非还原糖的情况下发生，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇以及异麦芽酮糖醇。

缀合程序的下一步骤为使用还原剂，还原经活化糖和载体蛋白质，以形成缀合物(所谓的还原氨基化)。适合的还原剂包括氰基硼氢化物，诸如氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠或在布朗斯特酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)的存在下的硼氢化钠或硼氢化锌；胺硼烷，诸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe'PrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)、硼烷-吡啶或硼氢化物交换树脂。在一个实施方案中，还原剂为氰基硼氢化钠。

在一个实施方案中，在水性溶剂(例如选自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、二甘氨酸或HEPB，在6.0与8.5之间、7.0与8.0之间或7.0与7.5之间的pH下)中进行还原反应，在另一个实施方案中，在非质子性溶剂中进行反应。在一个实施方案中，还原反应在DMSO(二甲亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。DMSO或DMF溶剂可用于将已冻干的经活化多糖和载体蛋白质重构。

在还原反应结束时，可在缀合物中存在剩余未反应的醛基，这些可使用适合的封端剂进行封端。在一个实施方案中，此封端剂为硼氢化钠(NaBH₄)。在缀合(还原反应和任选地封端)之后，可通过本领域技术人员已知的多种技术来纯化(相对于多糖-蛋白质缀合物的量富集)糖缀合物。这些技术包括渗析、浓缩/透滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水相互作用层析)和深度过滤。糖缀合物可通过透滤和/或离子交换层析和/或尺寸排阻层析来纯化。在一个实施方案中，糖缀合物通过透滤或离子交换层析或尺寸排阻层析来纯化。在一个实施方案中，将糖缀合物进行无菌过滤。

在一个优选实施方案中，通过还原氨基化来制备来自选自O25B、O1、O2和O6中的任一个的大肠杆菌血清型的糖缀合物。在一个优选实施方案中，通过还原氨基化来制备来自大肠杆菌血清型O25B、O1、O2及O6的糖缀合物。

在一个方面，本发明涉及一种缀合物，其包括与式O25B的糖连接的载体蛋白质(例如CRM₁₉₇)，该糖以下式表示：其中n为大于或等于1的任何整数。在一个优选实施方案中，n为至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40及至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50的整数。可将任何最小值和任何最大值进行组合以界定范围。示例性范围包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；以及至少20至至多80。在一个优选实施方案中，n为至少31至至多90，更优选地40至90，最优选60至85。

在另一方面，本发明涉及一种缀合物，其包括与糖连接的载体蛋白质(例如CRM₁₉₇)，该糖具有表1(还参见图9A至图9C以及图10A至图10B)中显示的以下结构中的任一个，其中n为大于或等于1的整数。

在不受理论或机制束缚的情况下，在一些实施方案中，据信稳定的缀合物需要一定水平的糖抗原修饰，该糖抗原修饰针对保持抗原的关键免疫原性表位的结构完整性进行平衡。

醛的活化和形成.在一些实施方案中，本发明的糖经活化且使得形成醛。在其中糖经活化的这类实施方案中，活化百分比(％)(或氧化(DO)程度)(参见例如实施例31)是指糖重复单元摩尔数/经活化多糖的醛摩尔数。例如，在一些实施方案中，糖通过多糖的重复单元上的邻二醇的过碘酸氧化而经活化，从而使得形成醛。变化过碘酸钠相对于糖重复单元的摩尔当量(meq)及氧化期间的温度，产生变化水平的氧化(DO)程度。

糖和醛浓度通常通过比色分析来确定。替代性试剂为TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶1-烃氧基)-N-氯丁二酰亚胺(NCS)组合，其引起自一级醇基团形成醛。

在一些实施方案中，经活化糖具有以下的氧化程度，其中糖重复单元的摩尔数/经活化糖的醛的摩尔数在1-100之间，诸如在2-80之间、在2-50之间、在3-30之间和在4-25之间。活化程度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、≥20、≥30、≥40、≥50、≥60、≥70、≥80或≥90，或约100。优选地，氧化(DO)程度为至少5及至多50，更优选地至少10及至多25。在一个实施方案中，活化程度为至少10及至多25。可将任何最小值及任何最大值进行组合以界定范围。氧化程度值可表示为活化百分比(％)。例如，在一个实施方案中，10的DO值是指在经活化糖中，一个经活化糖重复单元/总共10个糖重复单元，在此情况下，10的DO值可表示为10％活化。

在一些实施方案中，通过还原氨基化化学反应制备的缀合物包括载体蛋白质和糖，其中该糖包括选自以下中的任一个的结构：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，缀合物中的糖包括式，其中n为1至1000、5至1000，优选地31至100，更优选地35至90，最优选35至65的整数。

单端连接的缀合物.在一些实施方案中，缀合物为单端连接的缀合糖，其中糖在该糖的一端与载体蛋白质共价结合。在一些实施方案中，单端连接的缀合多糖具有末端糖。例如，如果多糖的末端(末端糖残基)中的一种与载体蛋白质共价结合，则缀合物为单端连接的。在一些实施方案中，如果多糖的末端糖残基经由接头与载体蛋白质共价结合，则缀合物为单端连接的。此类接头可包括例如胱胺接头(A1)、3,3'-二硫基双(丙酸二酰肼)接头(A4)和2,2'-二硫基-N,N'-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(胺氧基)乙酰胺)接头(A6)。

在一些实施方案中，糖经由3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与载体蛋白质缀合，形成单端连接的缀合物。参见例如实施例26、实施例27、实施例28和图17。

在一些实施方案中，缀合物优选地不是生物缀合物。术语“生物缀合物”是指蛋白质(例如载体蛋白质)与抗原，例如在宿主细胞背景中制备的O-抗原(例如O25B)之间的缀合物，其中宿主细胞机制将抗原与蛋白质连接(例如N-连接)。糖缀合物包括生物缀合物，以及通过不需要在宿主细胞中制备缀合物的手段(例如通过蛋白质与糖的化学连接来缀合)来制备的糖抗原(例如寡糖和多糖)-蛋白质缀合物。

硫醇活化的糖.在一些实施方案中，本发明的糖为经硫醇活化的。在其中糖为经硫醇活化的这类实施方案中，活化百分比(％)是指硫醇的摩尔数/经活化多糖的糖重复单元。糖和硫醇浓度通常通过用于硫氢基定量的Ellman分析来确定。例如，在一些实施方案中，糖包括用二硫化胺接头活化2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)。参见例如实施例10和图31。在一些实施方案中，糖经由二价异双官能接头(在本文中还被称作“间隔基”)与载体蛋白质共价结合。接头优选地在糖与载体蛋白质之间提供硫醚键，从而产生在本文中被称作“硫醚糖缀合物”的糖缀合物。在一些实施方案中，接头进一步提供氨基甲酸酯和酰胺键，诸如氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)。参见例如实施例21。

在一些实施方案中，单端连接的缀合物包括载体蛋白质和糖，其中该糖包括选自以下中的任一个的结构：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，缀合物中的糖包括式，其中n为1至1000、5至1000，优选地31至100，更优选地35至90，最优选35至65的整数。

例如，在一个实施方案中，单端连接的缀合物包括载体蛋白质和糖，该糖具有选自以下的结构：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101，其中n为1至10的整数。

F.eTEC缀合物

在一个方面，本发明大体上涉及糖缀合物，其包含衍生自上文所描述的大肠杆菌、经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基(如例如在美国专利9517274和国际专利申请公开WO2014027302中所描述，其以其全文以引用的方式并入本文中)与载体蛋白质共价缀合的糖，包括含此类糖缀合物的免疫原性组合物；以及用于制备及使用此类糖缀合物及免疫原性组合物的方法。这些糖缀合物包含经由一个或多个eTEC间隔子与载体蛋白质共价缀合的糖，其中糖经由氨基甲酸酯连接与eTEC间隔基共价缀合，且其中载体蛋白质经由酰胺连接与eTEC间隔基共价缀合。eTEC间隔基包括七个线性原子(即-C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-)，且在糖与载体蛋白质之间提供稳定的硫醚和酰胺键。

本发明的eTEC连接的糖缀合物可由以下通式(I)表示：

其中包含eTEC间隔基的原子含于中心方框中。

在本发明的这些糖缀合物中，糖可为多糖或寡糖。

并入本发明的糖缀合物中的载体蛋白质选自一般适合于此类目的的如本文进一步描述或本领域技术人员已知的载体蛋白质的组。在特定实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇。

在另一方面，本发明提供一种制备包含经由eTEC间隔基与载体蛋白质缀合的本文所描述的糖的糖缀合物的方法，该方法包括以下步骤：a)在有机溶剂中，使糖与碳酸衍生物反应以产生经活化糖；b)使经活化糖与胱胺或半胱胺或其盐反应，以产生硫醇化糖；c)使硫醇化糖与还原剂反应，以产生包含一个或多个游离硫醇基残基的经活化硫醇化糖；d)使经活化硫醇化糖与包含一个或多个α-卤乙酰胺基的经活化载体蛋白质反应，以产生硫醇化糖-载体蛋白质缀合物；以及e)使硫醇化糖-载体蛋白质缀合物与以下反应：(i)能够对经活化载体蛋白质的未缀合α-卤乙酰胺基团封端的第一封端试剂；和/或(ii)能够对经活化硫醇化糖的未缀合游离硫醇基残基封端的第二封端试剂；由此产生eTEC连接的糖缀合物。

在常见实施方案中，碳酸衍生物为1,1'-羰基-二(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)。优选地，碳酸衍生物为CDT，且有机溶剂为极性非质子溶剂，诸如二甲亚砜(DMSO)。在优选实施方案中，通过经活化糖与双功能对称硫烷基胺试剂、胱胺或其盐反应，来产生硫醇化糖。可替代地，可通过经活化糖与半胱胺或其盐反应，来形成硫醇化糖。通过本发明的方法产生的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示。

在常见实施方案中，第一封端试剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，其与载体蛋白质的赖氨酸残基上的未缀合α-卤乙酰胺基团反应，形成经由硫醚连接与经活化赖氨酸残基共价连接的S-羧甲基半胱氨酸(CMC)残基。

在其他实施方案中，第二封端试剂为碘乙酰胺(IAA)，其与经活化硫醇化糖的未缀合游离硫氢基反应，得到经封端硫乙酰胺。常见地，步骤e)包含用第一封端试剂和第二封端试剂进行封端。在某些实施方案中，步骤e)包含用作为第一封端试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸和作为第二封端试剂的IAA进行封端。

在一些实施方案中，封端步骤e)进一步包含在与第一和/或第二封端试剂反应之后，与还原剂，例如DTT、TCEP或巯基乙醇反应。

本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可包括游离硫醇基残基。在一些情况下，通过本文所提供的方法形成的经活化硫醇化糖将包括多个游离硫醇基残基，其中一些可能在缀合步骤期间不经历与载体蛋白质的共价缀合。通过与硫醇反应性封端试剂，例如碘乙酰胺(IAA)反应，对此类残余游离硫醇基残基进行封端，以将潜在地反应性官能基封端。还涵盖其他硫醇反应性封端试剂，例如含有顺丁烯二酰亚胺的试剂等。

另外，本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可包括残余未缀合载体蛋白质，其可包括已在封端处理步骤期间经受修饰的经活化载体蛋白质。

在一些实施方案中，步骤d)进一步包含在使经活化硫醇化糖与经活化载体蛋白质反应之前，提供包含一个或多个α-卤乙酰胺基团的经活化载体蛋白质。在常见实施方案中，经活化载体蛋白质包含一个或多个α-溴乙酰胺基团。

在另一方面，本发明提供一种eTEC连接的糖缀合物，其包含经由根据本文所公开的方法中的任一个产生的eTEC间隔基与载体蛋白质缀合的本文所描述的糖。

在一些实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇，且经由eTEC间隔基在CRM₁₉₇与多糖之间的共价连接在多糖的每4、10、15或25个糖重复单元中发生至少一次。

对于本发明的方面的每一种，在本文所描述的方法和组合物的特定实施方案中，eTEC连接的糖缀合物包含本文所描述的糖，诸如衍生自大肠杆菌的糖。

在另一方面，本发明提供一种预防、治疗或改善受试者的细菌性感染、疾病或病况的方法，其包括向受试者施用免疫学上有效量的本发明的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含含本文所描述的糖的eTEC连接的糖缀合物。在一些实施方案中，糖衍生自大肠杆菌。

在一些实施方案中，eTEC连接的糖缀合物包含载体蛋白质和糖，其中该糖包含选自以下中的任一个的结构：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，缀合物中的糖包括式，其中n为1至1000、5至1000，优选地31至100，更优选地35至90，最优选35至65的整数。

变得与糖缀合的载体蛋白质中的赖氨酸残基的数目的特征可为一系列经缀合赖氨酸。例如，在免疫原性组合物的一些实施方案中，CRM₁₉₇可包含4至16个/39个赖氨酸残基与糖共价连接。表示此参数的另一方式为约10％至约41％的CRM₁₉₇赖氨酸与糖共价连接。在其他实施方案中，CRM₁₉₇可包含2至20个/39个赖氨酸残基与糖共价连接。表述此参数的另一方式为约5％至约50％的CRM₁₉₇赖氨酸与糖共价连接。

在常见实施方案中，载体蛋白质为CRM₁₉₇，且经由eTEC间隔基在CRM₁₉₇与多糖之间的共价连接在多糖的每4、10、15或25个糖重复单元中发生至少一次。

在其他实施方案中，对于每5至10个糖重复单元、每2至7个糖重复单元、每3至8个糖重复单元、每4至9个糖重复单元、每6至11个糖重复单元、每7至12个糖重复单元、每8至13个糖重复单元、每9至14个糖重复单元、每10至15个糖重复单元、每2至6个糖重复单元、每3至7个糖重复单元、每4至8个糖重复单元、每6至10个糖重复单元、每7至11个糖重复单元、每8至12个糖重复单元、每9至13个糖重复单元、每10至14个糖重复单元、每10至20个糖重复单元或每4至25个糖重复单元，缀合物在载体蛋白质与糖之间包含至少一个共价连接。

在另一个实施方案中，对于多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个糖重复单元，在载体蛋白质与糖之间存在至少一个连接。

G.载体蛋白质

本发明的糖缀合物的组分为与糖缀合的载体蛋白质。术语“蛋白质载体”或“载体蛋白质”或“载体”可在本文中互换使用。载体蛋白质对于标准缀合程序应为可改进的。

缀合物的一个组分为与O-多糖缀合的载体蛋白质。在一个实施方案中，缀合物包括与O-多糖的核心寡糖(参见图24)缀合的载体蛋白质。在一个实施方案中，缀合物包括与O-多糖的O-抗原缀合的载体蛋白质。

术语“蛋白质载体”或“载体蛋白质”或“载体”可在本文中互换使用。载体蛋白质对于标准缀合程序应为可改进的。

在一个优选实施方案中，缀合物的载体蛋白质独立地选自以下中的任一个：TT、DT、DT突变(诸如CRM₁₉₇)、嗜血杆菌流感(H.influenzae)蛋白质D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特别地WO 01/98334及WO 03/54007中描述的那些)、经解毒的肺炎链球菌溶血素(Streptococcus pneumoniae Pneumolysin)、PorB、N19蛋白质、PspA、OMPC、艰难梭菌(C.Difficile)的毒素A或毒素B以及PsaA。在一个实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白质为DT(白喉类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白质为TT(破伤风类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白质为PD(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白质D，参见例如EP 0 594 610 B)。在一些实施方案中，载体蛋白质包括聚(L-赖氨酸)(PLL)。

在一个优选实施方案中，糖与CRM₁₉₇蛋白质缀合。CRM₁₉₇蛋白质为一种无毒性形式的白喉毒素，但在免疫学上与白喉毒素为不可区分的。CRM₁₉₇由被通过产毒棒状杆菌噬菌体β的亚硝基胍突变诱发产生的无毒噬菌体β197tox^-感染的棒状白喉杆菌产生。CRM₁₉₇蛋白质具有与白喉毒素相同的分子量，但与其不同之处在于结构基因中的单碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)。此单碱基变化引起成熟蛋白中的谷氨酸取代甘氨酸的氨基酸取代，且消除白喉毒素的毒性特性。CRM₁₉₇蛋白质为安全且有效的T细胞依赖性糖载体。

因此，在一些实施方案中，本发明的缀合物包括作为载体蛋白质的CRM₁₉₇，其中糖与CRM₁₉₇共价连接。

在一个优选实施方案中，糖缀合物的载体蛋白质选自由以下组成的组：DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素)或TT的片段C；CRM197(白喉毒素的无毒性但抗原上相同的变体)、其他DT突变体(诸如CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida等人,J.Biol.Chem.218；3838-3844,1973)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103或CRM107；以及由Nicholls和Youle在GeneticallyEngineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992中描述的其他突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至GIy的缺失或突变以及US 4709017或US 4950740中所公开的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及US5917017或US 6455673中所公开的其他突变；或US 5843711中所公开的片段)；肺炎链球菌溶血素(Kuo等人,(1995)Infect lmmun 63；2706-13)，包括以某种方式ply去毒，例如dPLY-GMBS(WO 04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-formol、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(WO 00/37105或WO 00/39299中所公开的PhtA、PhtB、PhtD或PhtE序列)以及Pht蛋白质的融合，例如PhtDE融合、PhtBE融合、Pht A-E(WO 01/98334、WO 03/54007、WO2009/000826)、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白质-通常从奈瑟氏脑膜炎菌血清群B提取-EP0372501)、PorB(来自奈瑟氏脑膜炎菌)、PD(流感嗜血杆菌蛋白质D-参见例如EP 0 594 610 B)或其免疫学上功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471 177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、包含来自各种病原体衍生的抗原的多个人类CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等人,(2001)Eur J Immunol 31；3816-3824)，诸如N19蛋白质(Baraldoi等人,(2004)Infectlmmun 72；4884-7)肺炎链球菌表面蛋白质PspA(WO 02/091998)、铁吸收蛋白质(WO 01/72337)、艰难梭菌的毒素A或B(WO 00/61761)、转铁蛋白结合蛋白、肺炎链球菌黏附蛋白(PsaA)、重组绿脓杆菌外毒素A(特别地其无毒性突变体(诸如携带谷氨酸553处的取代的外毒素A(Uchida Cameron DM,RJ Collier.1987.J.Bacteriol.169:4967-4971))。其他蛋白，诸如卵白蛋白、钥孔虫戚血兰素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)还可用作载体蛋白质。其他适合的载体蛋白质包括灭活细菌毒素，诸如霍乱类毒素(例如如国际专利申请第WO 2004/083251号中所描述)；大肠杆菌LT；大肠杆菌ST；以及来自绿脓杆菌的外毒素A。

在一些实施方案中，该载体蛋白质选自由以下组成的组：例如CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、鞭毛蛋白、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。在一个实施方案中，载体蛋白质为经解毒绿脓杆菌外毒素(EPA)。在另一个实施方案中，载体蛋白质不是经解毒绿脓杆菌外毒素(EPA)。在一个实施方案中，载体蛋白质为鞭毛蛋白。在另一个实施方案中，载体蛋白质不是鞭毛蛋白。

在一个优选实施方案中，糖缀合物的载体蛋白质独立地选自由以下组成的组：TT、DT、DT突变(诸如CRM₁₉₇)、流感嗜血杆菌蛋白质D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特别地WO 01/98334和WO 03/54007中描述的那些)、经解毒肺炎链球菌溶血素、PorB、N19蛋白质、PspA、OMPC、艰难梭菌的毒素A或毒素B和PsaA。在一个实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白质为DT(白喉类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白质为TT(破伤风类毒素)。在另一个实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白质为PD(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白质D，参见例如EP 0 594 610 B)。

在一个优选实施方案中，本发明的荚膜糖与CRM₁₉₇蛋白质缀合。CRM₁₉₇蛋白质为一种无毒性形式的白喉毒素，但在免疫学上与白喉毒素为不可区分的。CRM₁₉₇由被通过产毒棒状杆菌噬菌体β的亚硝基胍突变诱发产生的无毒噬菌体β197tox感染的棒状白喉杆菌产生(Uchida,T等人,1971,Nature New Biology 233:8-11)。CRM₁₉₇蛋白质具有与白喉毒素相同的分子量，但与其不同之处在于结构基因中的单碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)。此单碱基变化引起成熟蛋白中的谷氨酸取代甘氨酸的氨基酸取代，且消除白喉毒素的毒性特性。CRM₁₉₇蛋白质为安全且有效的T细胞依赖性糖载体。关于CRM₁₉₇及其产生的其他细节可例如在US 5,614,382中找到。

因此，在常见实施方案中，本发明的糖缀合物包含作为载体蛋白质的CRM₁₉₇，其中荚膜多糖与CRM₁₉₇共价连接。

在另一个实施方案中，糖缀合物的载体蛋白质为SCP(链球菌C5a肽酶)。β-溶血性链球菌的所有人类分离株产生尤其使C5a不活化的高度保守的细胞壁蛋白质SCP(链球菌C5a肽酶)。scp基因编码含有在1,134与1,181个氨基酸之间的多肽(Brown等人,PNAS,2005,第102卷,第51号.第18391-18396页)。前31个残基为输出信号前序列且在穿过细胞质膜时移除。随后68个残基充当后序列且必须经移除以产生活性SCP。随后10个残基可在无蛋白酶活性损失的情况下移除。在另一端，以Lys-1034开始为四个连续17个残基基序，接着为细胞分选和细胞壁附接信号。此组合的信号由含有LPTTND序列的20个残基亲水性序列、17个残基疏水性序列及较短碱性羧基端构成。

SCP可分成域(参见Brown等人,PNAS,2005,第102卷,第51号.第18391-18396页的图1B)。这些域为前域/后域(其包含输出信号前序列(通常为前31个残基)和后序列(通常为后68个残基))、蛋白酶域(其分解为两部分(蛋白酶部分1，通常为残基89-333/334；以及蛋白酶域部分2，且通常为残基467/468-583/584)、蛋白酶相关域(PA域)(通常为残基333/334-467/468)、三个纤维结合蛋白质III型(Fn)域(Fn1，通常为残基583/584-712/713；Fn2，通常为残基712/713-928/929/930；通常Fn3，残基929/930-1029/1030/1031)以及细胞壁锚定域(通常为残基1029/1030/1031至C端)。

在一个实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白质为来自GBS的SCP(SCPB)。SCPB的实例提供于WO97/26008的SEQ.ID.NO:3。还参见WO00/34487的SEQ ID NO:3。

在另一个实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白质为来自GAS的SCP(SCPA)。SCPA的实例可见于WO97/26008的SEQ.ID.NO:1和SEQ.ID.NO:2。还参见WO00/34487的SEQ IDNO:1、2和23。

在另一个实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白质为如WO2014/136064的SEQID NO:150或151中所示的SCP。

H.组合物的剂量

可调整给药方案以提供最佳所需反应。例如，可施用单次剂量的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段，可随时间推移施用若干分次剂量，或可如情形的紧急程度所指示而按比例减少或增加剂量。应注意，剂量值可随待减轻的病况的类型及严重程度而变化，且可包括单次或多次剂量。此外应了解，对任何特定受试者而言，特定剂量方案应根据个体需要及施用组合物或监督组合物施用的人员的专业判断而随时间调整，且本文所示的剂量范围仅为示例性的，且不旨在限制所主张的组合物的范围或实务。确定施用治疗性蛋白质的适当剂量和方案在相关技术中已熟知，且一旦提供本文所公开的教导，则本领域技术人员会了解其涵盖于此教导中。

在一些实施方案中，组合物中的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的量的范围可在各蛋白质抗原的约10μg至约300μg范围内。在一些实施方案中，组合物中的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的量的范围可在各蛋白质抗原的约20μg至约200μg范围内。

各剂量中的糖缀合物的量经选择为诱导免疫保护性反应而无典型疫苗中的明显不良副作用的量。此类量将视采用哪种特定免疫原以及其如何提供而变化。

可基于缀合物(缀合及非缀合)的总多糖，来计算免疫原性组合物中的特定糖缀合物的量。例如，在100μg多糖剂量中，具有20％游离多糖的糖缀合物将具有约80μg的经缀合多糖及约20μg的未缀合多糖。糖缀合物的量可视大肠杆菌血清型而变化。可通过糖醛酸分析来确定糖浓度。

免疫原性组合物中的不同多糖组分的“免疫原性量”可分散，且各自可包含约1.0μg、约2.0μg、约3.0μg、约4.0μg、约5.0μg、约6.0μg、约7.0μg、约8.0μg、约9.0μg、约10.0μg、约15.0μg、约20.0μg、约30.0μg、约40.0μg、约50.0μg、约60.0μg、约70.0μg、约80.0μg、约90.0μg或约100.0μg的任何特定多糖抗原。一般而言，对于给定血清型，各剂量将包含0.1μg至100μg的多糖，特别地0.5μg至20μg，更特别地1μg至10μg，且甚至更特别地2μg至5μg。作为本发明的一个实施方案，涵盖以上范围中的任一个内的任何全数整数。在一个实施方案中，对于给定血清型，各剂量将包含1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg或20μg的多糖。

载体蛋白质量.通常，各剂量将包含5μg至150μg载体蛋白质，特别地10μg至100μg载体蛋白质，更特别地15μg至100μg载体蛋白质，更特别地25μg至75μg载体蛋白质，更特别地30μg至70μg载体蛋白质，更特别地30μg至60μg载体蛋白质，更特别地30μg至50μg载体蛋白质，以及甚至更特别地40μg至60μg载体蛋白质。在一个实施方案中，该载体蛋白质为CRM₁₉₇。在一个实施方案中，各剂量将包含约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg或约75μg的载体蛋白质。在一个实施方案中，该载体蛋白质为CRM₁₉₇。在另一个实施方案中，该载体蛋白质为SCP。

I.佐剂

在一些实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含至少一种、两种或三种佐剂。在一些实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含至少一种佐剂。在一些实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含一种佐剂。在一些实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物可进一步包含两种佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。抗原可主要用作递送系统，主要用作免疫调节剂或具有两者的强效特征。适合的佐剂包括适用于哺乳动物(包括人类)的那些。

已知可在人类中使用的适合的递送系统类型佐剂的实例包括(但不限于)明矾(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳液(诸如MF59)(4.3％w/v角鲨烯，0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween 80)，0.5％w/v脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳液(诸如Montanide)及聚(D,L-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)微米粒子或纳米粒子。

在一个实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含作为佐剂的铝盐(明矾)(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在一个优选实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含作为佐剂的磷酸铝或氢氧化铝。在一个实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含0.1mg/mL至1mg/mL或0.2mg/mL至0.3mg/mL的呈磷酸铝形式的元素铝。在一个实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含约0.25mg/mL的呈磷酸铝形式的元素铝。

已知可在人类中使用的适合的免疫调节类型佐剂的实例包括(但不限于)来自阿奎拉(Aquilla)树的树皮的皂素提取物(QS21，Quil A)、TLR4促效剂(诸如MPL(单磷酰基脂质A)、3DMPL(3-O-去酰化MPL)或GLA-AQ)、LT/CT突变体、细胞因子(诸如多种白介素(例如IL-2、IL-12)或GM-CSF)、AS01等。

已知可在人类中使用的具有递送及免疫调节特征两者的适合的免疫调节类型佐剂的实例包括(但不限于)ISCOMS(参见例如等人,(1998)J.LeukocyteBiol.64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO2006/134423和WO 2007/026190)或GLA-EM(其为TLR4促效剂与水包油乳液的组合)。

对于包括(但不限于)动物实验的兽医学应用，可使用弗氏完全佐剂(CompleteFreund′s Adjuvant；CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、Emulsigen、N-乙酰基-胞壁酰基-L-羟丁胺酰基-D-异谷酰氨酸(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷酰氨酸(CGP 11637，被称作去甲MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2'-二软脂酰基-sn-丙三氧基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，被称作MTP-PE)以及RIBI，其含有包含从细菌提取的三种组分(单磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯及细胞壁构架(MPL+TDM+CWS))的2％角鲨烯/Tween 80乳液。

用于增强本文所公开的免疫原性组合物的有效性的其他示例性佐剂包括(但不限于)(1)水包油乳液制剂(具有或不具有其他特定免疫刺激剂，诸如胞壁酰基肽(参见下文)或细菌细胞壁组分)，诸如(a)SAF，其含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％普朗尼克封端的聚合物L121以及thr-MDP(微流化至次微米级乳液中或经涡旋以产生较大粒度乳液)，以及(b)RIBI^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.)含有2％角鲨烯、0.2％Tween 80以及一种或多种细菌细胞壁组分，诸如单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)可使用皂素佐剂，诸如QS21、STIMULON^TM(Cambridge Bioscience,Worcester,Mass.)、(Isconova,Sweden)或(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)或自其产生的粒子，诸如ISCOM(免疫刺激复合物)，该ISCOMS可能不含额外清洁剂(例如，WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐剂(CFA)及弗氏不完全佐剂(IFA)；(4)细胞因子，诸如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(例如，WO 99/44636))、干扰素(例如，γ干扰素)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰基脂质A(MPL)或3-O-去酰化MPL(3dMPL)(参见例如GB2220211、EP0689454)(参见例如WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳化液的组合(参见例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧化乙烯醚或聚氧化乙烯酯(参见例如WO 99/52549)；(8)聚氧化乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇(例如，WO 01/21207)的组合或聚环氧乙烷烷基醚或酯表面活性剂与至少一种额外非离子表面活性剂，诸如辛苯聚醇的组合(例如，WO 01/21152)；(9)皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(例如，WO 00/62800)；(10)免疫刺激剂及金属盐粒子(参见例如WO 00/23105)；(11)皂素和水包油乳液(例如，WO 99/11241)；(12)皂素(例如，QS21)+3dMPL+IM2(任选地+固醇)(例如，WO 98/57659)；(13)充当免疫刺激剂以增强组合物的有效性的其他物质。胞壁酰基肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-羟丁胺酰基-D-异谷酰氨酸(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷酰氨酸(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二软脂酰基-sn-丙三氧基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在另一个实施方案中，佐剂为如实施例35中所示的脂质体QS21制剂。在另一个实施方案中，佐剂为如实施例35中所示的脂质体MPLA制剂。在另一个实施方案中，佐剂为如实施例35中所示的脂质体MPLA/QS21制剂。

在本发明的一个实施方案中，如本文所公开的免疫原性组合物包含作为佐剂的CpG寡核苷酸。如本文所用，CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，且因此除非另外指示，否则这些术语可互换地使用。免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸含有任选地在某些优选的碱基情况内为未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的一个或多个免疫刺激性CpG基序。CpG免疫刺激性基序的甲基化状态一般是指二核苷酸中的胞嘧啶残基。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸为含有通过磷酸酯键与3'鸟嘌呤连接的5'未甲基化胞嘧啶且经由与Toll样受体9(TLR-9)结合而活化免疫系统的寡核苷酸。在另一个实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸可含有将经由TLR9活化免疫系统但不如CpG基序未甲基化一样强烈的一个或多个甲基化CpG二核苷酸。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含转而可包围CpG二核苷酸的一个或多个回文结构。CpG寡核苷酸已在多个发布的专利、公开专利申请及其他公开中描述，包括美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239116号；以及第6,339,068号。

在本发明的一个实施方案中，如本文所公开的免疫原性组合物包含WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行所描述的CpG寡核苷酸中的任一个。

已鉴别出不同类别的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些被称为A、B、C及P类，且更详细地描述于WO 2010/125480的第3页第22行至第12页第36行。本发明的方法涵盖这些不同类别的CpG免疫刺激性寡核苷酸的用途。

VII.纳米粒子

在另一方面，本文公开一种免疫原性复合物，其包括1)纳米结构；以及2)至少一个伞毛多肽抗原或其片段。优选地，伞毛多肽或其片段衍生自大肠杆菌伞毛H(fimH)。在一个优选实施方案中，伞毛多肽选自上文所描述的伞毛多肽中的任一个。例如，伞毛多肽可包含选自SEQ ID NOs:1-10、18、20、21、23、24、26-29及110-113的任一个氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原与纳米结构外部融合或缀合，以刺激针对所呈现的表位的适应性免疫反应的发展。在一些实施方案中，免疫原性复合物进一步包括佐剂或其他连接至外部和/或囊封于笼内部的免疫调节化合物，以帮助调整针对各病原体产生的免疫反应的类型。

在一些实施方案中，纳米结构包括含有复数个相同第一纳米结构相关多肽的单一组装体。

在替代实施方案中，纳米结构包括含有复数个相同第一纳米结构相关多肽的复数个组装体及复数个第二组装体，各第二组装体包含复数个相同第二纳米结构相关多肽。

各种纳米结构平台可用于产生本文所描述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所采用的纳米结构由单一亚单元的多个拷贝形成。在一些实施方案中，所采用的纳米结构由多个不同亚单元的多个拷贝形成。

纳米结构典型地为球状，和/或具有旋转对称性(例如具有3倍和5倍轴)，例如具有本文所例示的二十面体结构。

在一些实施方案中，抗原呈现于自组装纳米粒子上，诸如衍生自铁蛋白(FR)、E2p、Qβ及I3-01的自组装纳米结构。E2p为来自嗜热脂肪芽孢杆菌的二氢硫辛酸酰基转移酶的重新设计变体。I3-01为可自组装至超稳定纳米粒子的经工程化蛋白质。这些蛋白质的亚单元的序列是本领域已知的。在第一方面，本文公开一种包含氨基酸序列的纳米结构相关多肽，其长度与选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列至少75％相同，且与至少一个经鉴别界面位置相同。纳米结构相关多肽可用于例如制备纳米结构。纳米结构相关多肽针对其成对自组装形成纳米结构，诸如二十面体纳米结构的能力设计。

在一些实施方案中，纳米结构包括(a)复数个第一组装体，各第一组装体包含复数个相同第一纳米结构相关多肽，其中这些第一纳米结构相关多肽包含选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列；以及(b)复数个第二组装体，各第二组装体包含复数个相同第二纳米结构相关多肽，其中该第二纳米结构相关多肽包含选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列，且其中第二纳米结构相关多肽与第一纳米结构相关多肽不同；其中该复数个第一组装体与该复数个第二组装体非共价相互作用以形成纳米结构。

纳米结构包括将第一组装体和第二组装体定向为纳米结构的对称重复非天然非共价多肽-多肽界面，诸如具有二十面体对称性的纳米结构。

SEQ ID NOS:59-92提供示例性纳米结构相关多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:59-92的示例性纳米结构相关多肽的界面残基数目在4至13个残基范围内。在各种实施方案中，纳米结构相关多肽包含氨基酸序列，其长度与选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，且与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个经鉴别界面位置相同(取决于既定纳米结构相关多肽的界面残基数目)。在其他实施方案中，纳米结构相关多肽包含氨基酸序列，其长度与选自由SEQ ID NOS:59-92组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，且与至少20％、25％、33％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％的经鉴别界面位置相同(取决于既定纳米结构相关多肽的界面残基数目)。在其他实施方案中，纳米结构相关多肽包括纳米结构相关多肽，其具有选自由SEQ ID NOS:59-98组成的组的纳米结构相关多肽的氨基酸序列。

在一个非限制性实施方案中，纳米结构相关多肽可经修饰以有助于与相关“货物”的共价连接。在一个非限制性实例中，纳米结构相关多肽可经修饰，诸如通过在限定位置处引入各种半胱氨酸残基以促进与一个或多个相关抗原的连接，使得纳米结构相关多肽的纳米结构将提供骨架以提供大量抗原作为疫苗递送以产生改善的免疫反应。

在一些实施方案中，存在于纳米结构相关多肽中但不旨在用于缀合的一些或所有天然半胱氨酸残基可突变成其他氨基酸以促进限定位置处的缀合。在另一非限制性实施方案中，纳米结构相关多肽可通过与部分的连接(共价或非共价)修饰以有助于促进“胞内体逃逸”。对于涉及将相关分子递送至目标细胞的应用，诸如靶向递送，关键步骤可为自胞内体(一种膜结合的细胞器，其为递送媒介物进入细胞中的入口点)逃逸。胞内体成熟于溶酶体中，其降解其内含物。因此，若递送媒介物在其变成溶酶体之前在某种程度上未自胞内体“逃逸”，则其将降解且将不执行其功能。存在破坏胞内体且允许逸出至胞溶质中的多种脂质或有机聚合物。因此，在此实施方案中，纳米结构相关多肽可例如通过引入半胱氨酸残基修饰，这些半胱氨酸残基将允许此类脂质或有机聚合物化学缀合至单体或所得组装体表面。在另一非限制性实例中，纳米结构相关多肽可例如通过引入半胱氨酸残基来修饰，这些半胱氨酸残基将允许荧光团或其他成像剂的化学缀合，从而允许体外或体内观察纳米结构。

纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可经突变以改进蛋白质亚单元或组装的纳米结构的稳定性或溶解度。如本领域技术人员已知，若纳米结构相关多肽与现有蛋白质家族具有显著序列同源性，则来自该家族的其他蛋白质的多重序列比对可用于指导在非保守位置选择可增加蛋白质稳定性和/或溶解度的氨基酸突变，该方法称为共同蛋白质设计(9)。

纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可突变成带正电(Arg、Lys)或带负电(Asp、Glu)氨基酸，以赋予蛋白质表面总体正或总体负电荷。在一个非限制性实施方案中，纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可经突变以赋予自组装纳米结构的内表面较高净电荷。归因于纳米结构内表面与货物分子之间的静电相互作用，此类纳米结构可随后用于封装或囊封具有相反净电荷的货物分子。在一个非限制性实施方案中，纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基可主要突变成精氨酸或赖氨酸残基，以赋予自组装纳米结构的内表面净正电荷。含有纳米结构相关多肽的溶液随后可在核酸货物分子存在下混合，诸如dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA、cDNA、miRNA、siRNA、shRNA、piRNA或其他核酸，以便将核酸囊封于自组装纳米结构内部。此类纳米结构可用于例如保护、递送或浓缩核酸。

在一个实施方案中，纳米结构具有二十面体对称性。在此实施方案中，纳米结构可包含60个第一纳米结构相关多肽的拷贝及60个第二纳米结构相关多肽的拷贝。在一个这类实施方案中，各第一组装体中相同第一纳米结构相关多肽的数目与各第二组装体中相同第二纳米结构相关多肽的数目不同。例如，在一个实施方案中，纳米结构包含十二个第一组装体及二十个第二组装体；在此实施方案中，各第一组装体可例如包含相同第一纳米结构相关多肽的五个拷贝，且各第二组装体可例如包含相同第二纳米结构相关多肽的三个拷贝。在另一个实施方案中，纳米结构包含十二个第一组装体及三十个第二组装体；在此实施方案中，各第一组装体可例如包含相同第一纳米结构相关多肽的五个拷贝，且各第二组装体可例如包含相同第二纳米结构相关多肽的两个拷贝。在另一个实施方案中，纳米结构包含二十个第一组装体及三十个第二组装体；在此实施方案中，各第一组装体可例如包含相同第一纳米结构相关多肽的三个拷贝，且各第二组装体可例如包含相同第二纳米结构相关多肽的两个拷贝。所有这些实施方案能够形成具有规则二十面体对称性的合成纳米材料。

VIII.与糖和/或衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的多肽或其片段组合

肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae/K.pneumoniae)为一种革兰氏阴性病原体，已知会引起泌尿道感染、菌血症和脓毒症。多重抗药性肺炎克雷伯氏杆菌感染为处于风险下的易感群体中的死亡率增加的原因。O-抗原血清型在全球引起侵袭性疾病的菌株中高度普遍，且衍生的O-抗原糖缀合物作为疫苗抗原具有吸引力。

在一个方面，本文所公开的组合物中的任一个可进一步包含至少一种糖，其为或衍生自选自O1(及d-Gal-III变体)、O2(及d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12的至少一种肺炎克雷伯氏杆菌血清型。在一个优选实施方案中，本文所公开的组合物中的任一个可进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的多肽，其选自衍生自肺炎克雷伯氏杆菌I型伞毛蛋白或其免疫原性片段的多肽；或衍生自肺炎克雷伯氏杆菌III型伞毛蛋白或其免疫原性片段的多肽；或其组合。

如本领域已知，肺炎克雷伯氏杆菌O1和O2 O-抗原及其相应v1及v2亚型为在其重复单位的结构方面不同的聚合半乳聚糖。肺炎克雷伯氏杆菌O1和O2抗原含有均聚物半乳糖单元(或半乳聚糖)。肺炎克雷伯氏杆菌O1和O2抗原各自含有D-半乳聚糖I单元(有时称为O2a重复单元)，但O1抗原的不同之处在于O1抗原具有D-半乳聚糖II帽结构。D-半乳聚糖III(d-Gal-III)为D-半乳聚糖I的变体。定义两种不同血清型O2亚型(O2v1及O2v2)的碱基半乳聚糖I及III的结构；以及由产生亚型O1v1和O1v2的半乳聚糖II封端产生的衍生的嵌合体的结构展示于Kelly SD,等人,J Biol Chem 2019；294:10863-76；以及Clarke BR,等人,JBiol Chem 2018；293:4666-79中。

在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O1的糖包括[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O1的糖包括[→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O1的糖包括[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]的重复单元及[→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O1的糖包括→3)-β-D-Galf-(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-(1→]的重复单元(称为D-Gal-III重复单元)。(Kol O.等人,(1992)Carbohydr.Res.236,339-344；WhitfieldC.等人,(1991)J.Bacteriol.173,1420-1431)。

在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O2的糖包括[→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→]的重复单元(其可为肺炎克雷伯氏杆菌血清型O2a抗原的元素)。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O2的糖包括[→3)-β-D-GlcpNAc-(1→5)-β-D-Galf-(1→]的重复单元(其可为肺炎克雷伯氏杆菌血清型O2c抗原的元素)。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O2的糖包括通过侧链添加(1→4)连接的Galp残基(其可为肺炎克雷伯氏杆菌O2afg抗原的元素)而对O2a重复单元的修饰。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O2的糖包括通过侧链添加(1→2)连接的Galp残基(其可为肺炎克雷伯氏杆菌O2aeh抗原的元素)而对O2a重复单元的修饰。(Whitfield C.等人,(1992)J.Bacteriol.174,4913-4919)。

在不受机制或理论束缚的情况下，本领域所公开的肺炎克雷伯氏杆菌血清型O3和O5的O-抗原多糖结构分别与大肠杆菌血清型O9a(式O9a)和O8(式O8)的那些结构相同。

在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O4的糖包括[→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]的重复单元。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O7的糖包括[→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O8血清型的糖包括与肺炎克雷伯氏杆菌O2a相同的重复单元结构，但经非化学计量的O-乙酰化。在一些实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌O12血清型的糖包括[α-Rhap-(1→3)-β-GlcpNAc]二糖重复单元的重复单元。

在一个方面，本发明包括一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；以及至少一种糖，该糖为或衍生自选自O1(及d-Gal-III变体)、O2(及d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12的至少一种肺炎克雷伯氏杆菌血清型。在一些实施方案中，该组合物包括来自或衍生自血清型O1、O2、O3和O5中的一种或多种的糖或其组合。在一些实施方案中，该组合物包括来自或衍生自血清型O1、O2、O3和O5中的每一种的糖。

在另一方面，本发明包括一种组合物，其包括至少一种糖，其为或衍生自选自O1(及d-Gal-III变体)、O2(及d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12的至少一种肺炎克雷伯氏杆菌血清型；以及衍生自具有选自以下中的任一个的结构的大肠杆菌O-抗原的糖：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为1至100的整数。在一些实施方案中，该组合物包括来自或衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O1、O2、O3和O5中的一种或多种的糖或其组合。在一些实施方案中，该组合物包括来自或衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O1、O2、O3和O5中的每一种的糖。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O3的糖。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5的糖。

在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；至少一种糖，其为或衍生自选自O1(及d-Gal-III变体)、O2(及d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12的至少一种肺炎克雷伯氏杆菌血清型；以及具有选自以下中的任一个的结构的糖：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为1至100的整数，优选31至90。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O3的糖。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5的糖。

在一些实施方案中，该组合物包括至少一种衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的任一种肺炎克雷伯氏杆菌类型的糖。

在一些实施方案中，该组合物包括至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O1的糖。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原选自亚型v1(O1v1)或亚型v2(O1v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原选自亚型v1(O1v1)和亚型v2(O1v2)。在一些实施方案中，该组合物包括至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O2的糖。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原选自亚型v1(O2v1)或亚型v2(O2v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原选自亚型v1(O2v1)及亚型v2(O2v2)。在另一方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原选自由以下组成的组：a)血清型O1亚型v1(O1v1)、b)血清型O1亚型v2(O1v2)、c)血清型O2亚型v1(O2v1)以及d)血清型O2亚型v2(O2v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原为亚型v1(O1v1)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原为亚型v2(O1v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原为亚型v1(O2v1)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原为亚型v2(O2v2)。在此实施方案的另一方面，组合物包含选自由以下组成的组的一个、两个、三个或四个肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原：a)血清型O1亚型v1(O1v1)、b)血清型O1亚型v2(O1v2)、c)血清型O2亚型v1(O2v1)以及d)血清型O2亚型v2(O2v2)。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的糖的组合，其中第一糖衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的肺炎克雷伯氏杆菌类型中的任一个；且第二糖衍生自一种糖，该糖衍生自选自由以下组成的组的肺炎克雷伯氏杆菌类型中的任一个：O1(及d-Gal-III变体)、O2(及d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12。例如，在一些实施方案中，该组合物包括至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O1的糖以及至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O2的糖。在一个优选实施方案中，衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的糖与载体蛋白质缀合；且衍生自大肠杆菌的糖与载体蛋白质缀合。

在另一个方面，本发明包括一种组合物，其包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；以及至少一种衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的任一种肺炎克雷伯氏杆菌类型的糖。

在另一方面，本发明包括至少一种衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的任一种肺炎克雷伯氏杆菌类型的糖；以及至少一种衍生自具有选自以下中的任一个的结构的大肠杆菌的糖：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O3的糖。在一些实施方案中，该组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5的糖。

在一些实施方案中，该组合物包括至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O1的糖；以及至少一种衍生自大肠杆菌的糖，其具有选自由式O8和式O9组成的组的结构。在另一个实施方案中，该组合物包括至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O2的糖；以及至少一种衍生自大肠杆菌的糖，其具有选自由式O8和式O9组成的组的结构。在另一个实施方案中，该组合物包括至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O1的糖；至少一种衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O2的糖；以及至少一种衍生自大肠杆菌的糖，其具有选自由式O8和式O9组成的组的结构。

在一个实施方案中，本发明提供一种诱导受试者对肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用免疫学上有效量的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含至少一种来自大肠杆菌血清型O8或O9的糖缀合物，其中该免疫原性组合物不包含来自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5或O3的糖缀合物。在一个方面，该组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5的糖。在另一方面，该组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O-抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O3的糖。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导受试者对大肠杆菌的免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用免疫学上有效量的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5或O3的糖缀合物或其变体，其中该免疫原性组合物不包含来自大肠杆菌血清型O8或O9的糖缀合物。在一个方面，该组合物包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5的糖，且不包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O-抗原的糖。在一个方面，该组合物包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌血清型O3的糖，且不包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O-抗原的糖。

在一些实施方案中，组合物包括至少一种糖，其为或衍生自选自O1(及d-Gal-III变体)、O2(及d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12的至少一种肺炎克雷伯氏杆菌血清型；至少一种衍生自大肠杆菌的糖，其具有选自由式O8和式O9组成的组的结构。在一些实施方案中，组合物包括至少一种糖，其为或衍生自选自O1(及d-Gal-III变体)、O2(及d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12的至少一种肺炎克雷伯氏杆菌血清型；至少一种衍生自大肠杆菌的糖，其具有选自由式O1A、式O1B、式O2、式O6和式O25B组成的组的结构。

在一些实施方案中，组合物进一步包括衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的多肽，其选自衍生自肺炎克雷伯氏杆菌I型伞毛蛋白或其免疫原性片段的多肽；或衍生自肺炎克雷伯氏杆菌III型伞毛蛋白或其免疫原性片段的多肽；或其组合。这些多肽的序列是本领域已知的。

IX.组合物的用途

在一个方面，本发明提供本文所描述的组合物、编码大肠杆菌FimH多肽或用于表达其的载体的核酸或包含多肽或核酸的组合物作为药剂的用途，或在制造用以引发受试者针对大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应或预防受试者的大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌感染的药剂中的用途。

在其他方面，本发明提供一种引发在受试者，诸如人类中针对大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文所描述的组合物或编码大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌多肽的核酸分子。本发明还提供一种预防受试者的大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌感染的方法，其包括向该受试者施用有效量的医药组合物，诸如疫苗，其包含本文所描述的大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌组合物。

如本文所用，“受试者”是指哺乳动物，优选为人类。在一些特定实施方案中，人类为儿童，诸如婴儿。在一些其他特定实施方案中，人类为女性，尤其孕妇。本发明的组合物可在施用或不施用佐剂的情况下向受试者施用。向受试者施用的有效量为足以引发受试者针对大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌抗原的免疫反应的量。可经选择用于治疗的受试者包括由于暴露或可能暴露于大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌而处于患上大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌感染的风险下的那些受试者。因为人类可能在2岁时感染大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌，所以整个出生队列被包括为免疫接种的相关群体。例如，这可通过在以下任何时间开始执行免疫接种方案来实现：自出生至6个月大、自6个月大至5岁；妊娠期妇女(或生育年龄的女性)，从而通过抗体的被动转移保护其婴儿；仍在子宫内的婴儿；以及大于50岁的受试者。

可使用标准施用途径施用由本发明提供的组合物，诸如医药组合物。非限制性实施方案包括非经肠施用，诸如皮内、肌肉内、皮下、经皮、经黏膜或经口施用。

在一次施用期间向受试者提供的组合物的总剂量可如本领域技术人员已知而变化。

还有可能提供疫苗组合物中的一种或多种的一个或多个加强施用。若进行加强疫苗接种，则通常此类加强疫苗接种将在向受试者首次施用组合物(其在此类情况下，称为“初免疫苗接种”)之后的一周与10年之间，优选两周与六个月之间的某一时刻向同一受试者施用。在替代加强方案中，还有可能在初免疫苗接种之后向该受试者施用不同载体，例如一个或多个腺病毒，或其他载体，诸如安卡拉(MVA)的经修饰痘苗病毒，或DNA或蛋白质。例如，有可能向该受试者施用本文的重组病毒载体作为初免，且使用本文所描述的组合物进行加强。

在某些实施方案中，施用包含初免施用和至少一个加强施用。在某些其他实施方案中，每年提供施用。在其他实施方案中，每年与流感病毒疫苗一起提供施用。

由本发明提供的疫苗可与一种或多种其他疫苗一起使用。例如，在成人中，其可与流感病毒疫苗、Prevnar、破伤风疫苗、白喉疫苗以及百日咳疫苗一起使用。对于儿童使用，由本发明提供的疫苗可与用于儿童患者的任何其他疫苗一起使用。

实施例

为了能更好地理解本发明，阐述以下实施例。这些实施例仅为达成说明的目的且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。以下实施例说明本发明的一些实施方案。

实施例1

细菌伞毛黏附素FimH和FmlH允许大肠杆菌经由识别特异性宿主细胞糖蛋白而采用不同泌尿道微环境。FimH结合至尿路上皮中的甘露糖基化尿溶蛋白受体，而FmlH结合至肾脏和发炎膀胱中的上皮表面蛋白质上的半乳糖或N-乙酰半乳胺糖O-聚糖。FimH伞毛还在肠道中的肠毒性大肠杆菌(ETEC)和多重抗药性侵袭性大肠杆菌经由结合至肠上皮上的高度甘露糖基化蛋白质来克隆方面起一定作用。

全长FimH由两个域构成：N端凝集素域和C端菌毛蛋白域，其通过短接头连接。FimH的凝集素域含有碳水化合物识别域，其负责结合至尿路上皮细胞表面上的甘露糖基化尿溶蛋白1a。菌毛蛋白域经由后续FimG亚单元的供体链锚定至菌毛的核心，其为称为供体链补充的过程。

FimH的凝集素域的构型及配体结合特性在FimH的菌毛蛋白域的异位控制下。在静态条件下，全长FimH的两个域的相互作用使凝集素域在较低亲和力下稳定成单甘露糖(例如K_d约300μM)状态，其特征为浅结合袋。结合至甘露糖甘配体诱导构型变化，从而产生中等亲和力状态，其中凝集素和菌毛蛋白域保持紧密接触。然而，在剪切应力下，凝集素与菌毛蛋白域分开，由此诱导较高亲和力状态(例如K_d<1.2μM)。

因为不存在由菌毛蛋白域施加的负变构调节，所以FimH的经分离凝集素域被锁定在较高亲和力状态下。锁定在较高亲和力状态的经分离重组凝集素域展现出较高稳定性。然而，以低结合构型锁定黏附素诱导产生抑制黏附的抗体。因此，关注使凝集素域在低亲和力状态下稳定。

表3阐述用于制备各种构建体以解决这些需求的FimH构建体。

表3：FimH构建体的概述

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所有研究的FimH构建体均为预期分子量的单体蛋白质。

表4

FimC-FimH复合物的预期分子量为53.1kDa；

FimC的预期分子量为24kDa。

实施例2：FimH凝集素结合域的哺乳动物表达

本发明非限制性实施例涉及在HEK细胞系中产生衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。与在大肠杆菌宿主细胞中的衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的表达相比，产率相对较高。

为了实现从哺乳动物细胞产生FimH变体，使用SignalP预测算法分析用于蛋白质和片段的分泌的不同异源性信号序列。还分析野生型FimH前导序列。预测结果表明，野生型FimH前导序列可对FimH变体在哺乳动物细胞中的分泌起作用，然而，预测所分泌的变体在全长野生型FimH(参见SEQ ID NO:1)的W20残基处，而非全长野生型FimH(参见SEQ ID NO:1)的F22残基处裂解。预测血球凝集素信号序列不起作用。预测鼠类IgK信号序列产生SEQID NO:1的F22的N端或成熟蛋白的F1残基。

基于这些分析，合成DNA且重组产生构建体以表达具有野生型FimH前导序列的FimH凝集素结合域。还制备构建体以表达具有mIgK信号序列的FimH凝集素结合域。将亲和纯化标签，诸如His标签引入衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的C端以促进纯化。

将表达质粒转染至HEK宿主细胞，即EXPI293哺乳动物细胞中。

成功地表达衍生自大肠杆菌的多肽或其片段。例如，pSB01892FimHdscG构建体通过MS证明使用融合至FimH在F22的成熟起点的mIgK信号序列的优选N端处理。据信该处理对于凝集素域构建体pSB01878为正确的，且质谱数据支持这一点。

天然FimH前导肽未展现出优选N端处理(即在SEQ ID NO:1的F22处的处理)。

pSB01877和pSB01878构建体在pcDNA3.1(+)哺乳动物表达载体中。将细胞稀释且随后用于20ml转染。使用各构建体的1μg/ml DNA，且使用Expifectamine方案在125ml烧瓶中转染细胞。72小时后，细胞活力仍良好，因此允许表达继续直至96小时。在72小时获取样品且在SDS PAGE凝胶上各运行10μl以检查表达。

96小时后，收获条件培养基且添加0.25ml Nickel Excel树脂，在4℃旋转下分批结合O/N过夜。在TrisCl pH 8.0、NaCl、咪唑中洗脱。参见图4。

pSB01878的预期质量与N端F22一致。糖基化存在于1或2个位点(N-D的每次去酰胺化的质量+1)。

构建糖基化突变体。参见例如pSB02081、pSB02082、pSB02083、pSB02088及pSB02089。糖基化突变体表达感兴趣的多肽。结果参见图5。

还构建FimH凝集素域锁突变体。参见例如pSB02158。pSB02158构建体的表达结果显示于图6B中。

使用0.5皮摩尔荧光素缀合的胺基苯基-哌喃甘露糖苷(APMP)进行荧光偏振分析。该分析在室温、300RPM下进行64小时。结果显示于图6C中。

实施例3：FimH/C复合物，pSB01879和pSB01880的哺乳动物表达

为了产生FimH/C复合物，制备在EF1α启动子下的FimC和具有野生型或mIgK信号肽的FimH的双表达构建体。将其克隆至pBudCE4.1哺乳动物表达载体(ThermoFisher)中，且将C端His标签添加至FimC。FimC变体经设计以使用mIgK信号肽进行分泌，因为其产生基于SignalP分析产生G37 FimC作为成熟蛋白的第一个残基的正向预测。

更特别地，这些构建体经设计以具有在载体pBudCE4.1中在EF1α启动子下的FimC片段及在同一载体中在CMV启动子下的FimH片段插入物。载体pBudCE4.1为来自ThermoFisher的表达载体，其具有2个用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。FimC片段插入物(pSB01881插入物)通过用NotI及XhoI消化且在相同位点亚克隆至pBudCE4.1载体中来进行亚克隆。将其涂铺于2xYT吉欧霉素50μg/ml板上。将菌落接种至具有吉欧霉素50μg/ml的2xYT中，在37℃下生长过夜且准备质粒。将其用NotI及XhoI消化以检查插入物，且所有菌落的插入物大小为约722bp。

pSB01881用HindIII和BamHI消化，且pSB01879插入物和pSB01880插入物DNA用HindIII和BamHI消化。将这些片段进行凝胶分离，以及亚克隆至pSB01881载体中并涂铺于2xYTzeo50μg/ml板上。将来自各者的菌落接种至2xYT zeo50μg/ml中，在37℃下生长过夜，准备质粒且用NotI及XhoI消化以测试FimC插入物，以及用HindIII和BamHI消化以测试FimH插入物。所有克隆在两个克隆位点处均具有预期大小的插入物。随后使用pSB01879-1和pSB01880-1克隆进行表达。

已证明FimH/FimC复合物还在EXPI293细胞中表达。表达可通过切换启动子，诸如EF1α、CAG、Ub、Tub或其他启动子来优化。

用于信号肽预测的SignalP 4.1(DTU Bioinformatics)的示例性结果显示如下。预测额外的信号肽在成熟FimH多肽或其片段的位置1处产生Phe的优选N端。以下仅为4种常见信号序列的代表性样品集。

预测以下信号肽序列在成熟FimH多肽或其片段的位置1处产生Phe的优选N端：

表5

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预测以下信号肽序列不在成熟FimH多肽或其片段的位置1处产生Phe的优选N端：

表6

表7

用于预测的SignalP 4.1

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实施例4：FimH与FimG肽的供体链互补序列融合物的哺乳动物表达

测试若干接头长度。准备在野生型FimH以及与FimH的F22融合的mIgK信号肽中，用这些接头融合FimH与N端FimG肽进行重组表达。

FimH供体链互补FimG构建体还已显示在EXPI293细胞中具有稳固的表达。

对于供体链互补构建体，寡核苷酸经设计以在pcDNA3.1(+)中产生含有各种接头和FimG肽的碱基构建体。根据FimH的SEQ ID NO:1的编号，在G294 V295 T296残基处并入独特的BstEII位点。将相同的BstEII位点并入接头中以产生碱基构建体。

构建pSB01882-01895的碱基构建体。使用引物以ACCUPRIME PFX DNA聚合酶(Thermo Fisher)进行PCR扩增pcDNA3.1(+)，用NdeI(在CMV启动子中)和BamHI消化PCR产物，且克隆至用NdeI和BamHI消化的pcDNA3.1(+)中且进行凝胶分离以移除片段。

用pSB01877、01878、01879、01880、01885以及01892与EXPI293细胞一起进行另一瞬时转染作为对照。

按照制造商的方案，将构建体pSB01882至pSB01895用于来自Thermo Fisher的EXPI293细胞中的瞬时转染表达测试。参见图3，其显示在20mL EXPI293细胞中表达，72小时，负载10μl条件培养基后的结果；观察到较高表达量；在从pSB01879和pSB01880构建体表达后存在FimH/FimC复合物；20ml条件培养基分批与Nickel Excel结合，40CV洗涤，在咪唑中洗脱。

制备额外的FimH供体链互补构建体。参见例如pSB02198、pSB02199、pSB02200、pSB02304、pSB02305、pSB02306、pSB02307、pSB02308构建体。pSB2198 FimH dscG锁突变体构建体的表达展示于图7中。pSB2198 FimH dscG锁突变体从短暂表达产生12mg/L。

根据Vi-CELL XR 2.04(Beckman Coulter,Inc.)，观察到以下(用于表达的实际细胞类型为HEK细胞)：

表8

实施例5：具有经处理的信号肽的分子量片段

表9

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pSB02083

分析	片段21-188	完整蛋白质
			长度	168aa	188aa
分子量	18063.42	20290.02m.w.
			1μg＝	55.361皮摩尔	49.285皮摩尔
摩尔消光系数	24420	35800
			1A(280)校正至：	0.74mg/ml	0.57mg/ml
1mg/ml的A[280]	1.35AU	1.76AU
			等电点	6.81	6.29
在pH 7下的电荷	-0.48	-2.47

pSB02198

pSB02307

实施例6：FimH成熟蛋白(根据SEQ ID NO:2的编号)中的Phe1的N端α-氨基为D-甘露糖提供关键的极性识别

在不受理论或机制束缚的情况下，表明FimH成熟蛋白(根据SEQ ID NO:2的编号)的Phe1正前方正确的信号肽裂解对表达功能性FimH蛋白质是重要的。N端α-氨基处的变化，诸如通过在FimH蛋白质的Phe1前方N端处添加氨基酸可消除与D-甘露糖的O2、O5以及O6原子的氢键相互作用，且引入与D-甘露糖的空间排斥，从而阻断甘露糖结合。我们的实验观察结果证实，在SEQ ID NO:2的Phe1前方添加额外的Gly残基导致检测不到甘露糖结合。

在分析与D-甘露糖结合的FimH的晶体结构后，观察到以下：Phe1的N端α-氨基连同根据SEQ ID NO:2的编号的FimH的Asp54的侧链和根据SEQ ID NO:2的编号的FimH的Gln133一起为D-甘露糖提供关键的极性识别基序，且这些极性相互作用的突变和变化导致无甘露糖结合。

实施例7：FimH中Phe1的侧链不与D-甘露糖直接相互作用，而是埋入FimH内部，表明Phe1可经其他残基，例如脂肪族疏水性残基(Ile、Leu或Val)置换

对FimH在与D-甘露糖及其类似物(例如PDB ID：1QUN)的复合物中的晶体结构的分析表明，Phe1(根据SEQ ID NO:2的编号)的侧链不与D-甘露糖直接相互作用，而是通过其芳族环与Val56、Tyr95、Gln133和Phe144(根据SEQ ID NO:2的编号)的侧链堆栈而稳定结合袋。

代替Phe的替代性N端残基可稳定FimH蛋白质，容纳甘露糖结合且允许正确的信号肽裂解。此类残基可通过本领域已知的适合方法来鉴别，诸如通过目视检查FimH的晶体结构，或使用计算蛋白质设计软件进行更多定量选择，诸如BioLuminate^TM[BioLuminate,Schrodinger LLC,New York,2017]、Discovery Studio^TM[Discovery Studio ModelingEnvironment,Dassault Systèmes,San Diego,2017]、MOE^TM[Molecular OperatingEnvironment,Chemical Computing Group Inc.,Montreal,2017]以及Rosetta^TM[Rosetta,University of Washington,Seattle,2017]。说明性实施例显示于图9A-9C中。置换氨基酸可为脂肪族疏水性氨基酸(例如Ile、Leu和Val)。图11描绘Phe1与其他具有脂肪族疏水性侧链的氨基酸(例如Ile、Leu和Val)的计算突变诱发扫描，这些氨基酸可稳定FimH蛋白质且容纳甘露糖结合。

实施例8：FimH蛋白质(根据SEQ ID NO:2的编号)中Asn7的突变可移除推定的N-糖基化位点且防止去酰胺化，而不影响甘露糖、mAb21或mAb475结合.

根据SEQ ID NO:2的编号，哺乳动物细胞系过度表达分泌性大肠杆菌FimH可能导致残基Asn7的N-连接糖基化。另外，残基Asn7暴露于溶剂且随后为Gly残基，从而使其极易于去酰胺化。

对FimH在与D-甘露糖及其类似物(例如PDB ID：1QUN)的复合物中的晶体结构的分析表明，Asn7距离甘露糖结合位点大于且该位点的突变不应影响甘露糖结合。因此，Asn7突变为其他氨基酸(例如Ser、Asp和Gln)可有效地移除推定的N-糖基化位点且防止去酰胺化。

实施例9：大肠杆菌和肠道沙门氏菌菌株

临床菌株和衍生物列于表10中。额外参考菌株包括：O25K5H1，一种临床O25a血清型菌株；以及肠道沙门氏菌血清变异型鼠伤寒菌株LT2。

构建大肠杆菌菌株中的基因敲除，从而移除靶向开放阅读框但留下短疤痕序列。

为简单起见，经水解的O-抗原链和核心糖随后指示为O-多糖(OPS)。

表10：大肠杆菌菌株

实施例10：用于WZZB、fepE和O-抗原基因簇克隆的寡核苷酸引物

表11：寡核苷酸引物

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实施例11：质粒

质粒载体和亚克隆列于表12中。自经纯化基因组DNA扩增携带各种大肠杆菌和沙门氏菌wzzB以及fepE基因的PCR片段，且将其亚克隆至InvitrogenBlunt克隆套组中提供的较高拷贝数质粒中(图12A-12B)。此质粒基于pUC复制子。引物P3和P4用于扩增大肠杆菌wzzB基因与其天然启动子，且经设计以分别与编码UDP-葡萄糖-6-脱氢酶以及磷酸腺嘌呤核苷酸水解酶的近端和远端基因中的区域结合(在Genbank MG1655 NC_000913.3中注释)。使用先前所描述的引物来扩增含有沙门氏菌fepE基因和启动子的PCR片段。类似的大肠杆菌fepE引物基于可用的Genbank基因组序列或内部生成的全基因组数据(在GAR2401和O25K5H1的情况下)设计。低拷贝数质粒pBAD33用于在阿拉伯糖启动子的控制下表达O-抗天然物合成基因。质粒首先经修饰以便于克隆(经由Gibson方法)使用与5'启动子同源的通用引物和3'6-磷酸葡萄糖脱氢酶(gnd)基因扩增的长PCR片段(表12)。含有O25b生物合成操纵子的pBAD33亚克隆显示于图12A-12B中。

表12

实施例12：O-抗原纯化

发酵液用乙酸处理至最终浓度为1-2％(最终pH为4.1)。OAg的提取和去脂化通过将经酸处理的培养液加热至100℃持续2小时来达成。在酸水解结束时，将该批次冷却至环境温度，且添加14％ NH₄OH至6.1的最终pH。离心经中和的培养液且收集离心分离液。向离心分离液中添加含CaCl₂的磷酸钠，且将所得浆料在室温下孵育30分钟。通过离心移除固体，且使用10kDa膜将离心分离液浓缩12倍，接着相对于水进行两次透滤。随后，使用碳过滤器纯化含有OAg的保留物。碳滤液用4.0M硫酸铵1:1(v/v)稀释。最终硫酸铵浓度为2M。经硫酸铵处理的碳滤液使用膜，以2M硫酸铵作为操作缓冲液进一步纯化。在流经时收集OAg。对于长OAg，浓缩HIC滤液，且随后使用5kDa膜相对于水(20透滤体积)进行缓冲液交换。对于短(天然)OAg多糖，进一步降低MWCO以提高产量。

实施例13：O25b长O-抗原与CRM₁₉₇的缀合

第一组长链O25b多糖-CRM₁₉₇缀合物使用过碘酸盐氧化，接着使用还原氨基化化学方法(RAC)进行缀合来产生(表14)。通过改变氧化水平，使缀合物变体具有三种活化水平(低、中等和高)。缀合物通过使用氰基硼氢化钠作为还原剂，使在DMSO培养基中重构的冻干的活化多糖与冻干的CRM₁₉₇反应来产生。缀合反应在23℃下进行24小时，接着使用硼氢化钠封端3小时。在缀合淬灭步骤后，缀合物通过使用5mM丁二酸盐/0.9％NaCl，pH 6.0，使用100K MWCO再生纤维素膜进行超滤/透滤来纯化。使用0.22μm膜进行缀合物的最终过滤。

除非另外明确说明，否则贯穿以下实施例中所公开的缀合物包括核心糖部分。

通过异源聚合酶链长调控因子赋予的长O-抗原表达.

最初的大肠杆菌菌株构建集中于O25血清型。目标为过度表达异源wzzB或fepE基因以查看其是否在O25 wzzB敲除菌株中赋予较长链长。首先，通过PCR筛选血液分离株，以鉴别O25a和O25b亚型的菌株。接下来，针对氨苄青霉素敏感性筛选菌株。鉴别出单个氨苄青霉素敏感性O25b分离株GAR2401，向其中引入wzzB缺失。类似地，在O25a菌株O25K5H1中制备wzzB缺失。为了对这些突变进行基因互补，将来自GAR 2401及O25K5H1的wzzB基因亚克隆至高拷贝PCR-Blunt II克隆载体中，且通过电穿孔引入两种菌株中。类似地克隆且转移来自大肠杆菌K-12和肠沙门氏菌血清变型鼠伤寒LT2的额外wzzB基因；来自大肠杆菌O25K5H1、GAR 2401、O25a ETEC NR-5、O157:H7:K-和肠沙门氏菌血清变型鼠伤寒LT2的fepE基因同样如此。

使细菌在LB培养基中生长过夜，且用酚提取LPS，通过SDS PAGE(4-12％丙烯酰胺)进行解析且进行染色。凝胶的各孔负载有自相同数目的细菌细胞(大致2个OD₆₀₀单位)提取的LPS。LPS的大小根据内部天然大肠杆菌LPS标准物且通过计数自显示广泛分布的链长(相差一个重复单元)的样品子集中可辨别的梯度来估计。在图13A的左侧，显示O25aO25K5HΔwzzB的质粒转化体的LPS概况；且在右侧，显示O25b GAR 2401ΔwzzB转化体的类似概况。用O25特异性血清探测的一式多份凝胶的免疫印迹显示于图13B中。

此实验的结果显示，将同源wzzB基因引入至大肠杆菌O25aΔwzzB宿主中，恢复短O25 LPS(10-20x)的表达，沙门氏菌LT2 wzzB也如此。引入来自GAR2401的O25b wzzB基因则不能，表明来自此菌株的WzzB酶是有缺陷的。大肠杆菌WzzB氨基酸序列的比较表明，A210E和P253S取代可能是原因。明显的是，沙门氏菌LT2 fepE和来自O25a O25K5H1的大肠杆菌fepE赋予表达极长(VL)OAg LPS的能力，其中沙门氏菌LT2 fepE引起超过通过大肠杆菌fepE赋予的大小的OAg。

对于GAR2401ΔwzzB转化体，观察到类似的表达模式：大肠杆菌O25a或K12菌株wzzB恢复产生短LPS的能力。沙门氏菌LT2 fepE产生最长LPS，大肠杆菌fepE产生略微较短LPS，而沙门氏菌LT2 wzzB产生中等大小的长LPS(L)。在使用大肠杆菌O25aΔwzzB转化体的另一个实验中，评定其他大肠杆菌fepE基因产生极长LPS的能力。来自GAR2401、O25aETEC菌株及O157志贺杆菌毒素产生菌株的fepE基因还赋予产生极长LPS的能力，但不如沙门氏菌LT2 fepE产生的LPS长(图14)。

已在血清型O25a和O25b菌株中确立，沙门氏菌LT2 fepE产生所评估的聚合酶调控因子的最长LPS，接下来设法确定是否其还将在其他大肠杆菌血清型中产生极长LPS。用沙门氏菌fepE质粒转型血清型O1、O2、O6、O15及O75的野生型菌血症分离株，且提取LPS。图15中所示的结果证实，沙门氏菌fepE可赋予其他与血液感染相关的流行血清型产生极长LPS的能力。结果还显示，基于质粒的沙门氏菌fepE的表达似乎超越这些菌株中通常由内源性wzzB施加的链长控制。

O-抗原在常见大肠杆菌宿主菌株中的基于质粒的表达.

根据生物过程发展的观点，在常见大肠杆菌宿主而非多个菌株中产生不同血清型的O-抗原的能力将极大地简化个体抗原的制造。为此目的，来自不同血清型的O-抗原基因簇通过PCR扩增，且克隆至在阿拉伯糖调节的启动子控制下的低拷贝数质粒(pBAD33)中。此质粒可与沙门氏菌LT2fepE质粒在大肠杆菌中兼容(可共存)，这是因为其具有不同(p15a)复制子及不同可选标记物(氯霉素与卡那霉素)。在第一实验中，将pBAD33 O25b操纵子质粒亚克隆与沙门氏菌LT2 fepE质粒共转染至GAR2401ΔwzzB中，且转化体在存在或不存在0.2％阿拉伯糖的情况下生长。图16A至16B中所示的结果表明，极长的O-抗原LPS以阿拉伯糖依赖性方式产生。

类似地评估克隆于其他血清型的O-抗原基因簇，且结果显示于图17中。沙门氏菌LT2 fepE和pBAD33-OAg质粒的共表达产生可检测的长链LPS，其对应于O1、O2(四个克隆中的两个)、O16、O21和O75血清型。由于未知的原因，pBAD33-O6质粒在所有测试的四个分离株中均未能产生可检测的LPS。尽管表达量不同，但结果显示，在常见宿主中表达长链O-抗原为可行的。然而，在一些情况下，可能需要进一步优化以改进表达，例如通过修饰质粒启动子序列。

来自具有或不具有沙门氏菌LT2 fepE质粒的不同血清型O25大肠杆菌菌株的LPS的概况展示于图18中。研究两个菌株的O-抗原：GAR2831的发酵、提取及纯化，天然短O25bOAg的产量；以及研究GAR2401ΔwzzB/fepE的长O25b OAg的产量。图18SDS-PAGE凝胶中显示的相应的短和长形式LPS以红色突出显示。用乙酸直接从发酵细菌提取多糖，且进行纯化。经纯化的短和长或极长O25b多糖的尺寸排阻层析概况展示于图19A-19B中。将两批短多糖(来自GAR2831)的特性与单个极长多糖制剂(来自菌株GAR2401ΔwzzB/fepE)进行比较。长O-抗原的分子量比短O-抗原的分子量大3.3倍，且重复单元的数目经估计为约65(极长)与约20。参见表13。

表13

聚合物批次号	天然	天然	经修饰(长链)
				聚合物批次号	709766-24A	709722-24B	709766-25A
聚合物MW(kDa)	17.3	16.3	55.3
				重复单元数目	20	19	64

使用常规还原氨基化方法，将极长O25b O-抗原多糖与白喉类毒素CRM₁₉₇缀合。制备三个不同批次的具有不同过碘酸盐活化程度的糖缀合物：中等(5.5％)、低(4.4％)和高(8.3％)。显示所得制剂和未缀合多糖不含内毒素污染)(表14)。

根据图20A中所示的时程，每组四只兔(新西兰白色雌性)各自接种10微克糖缀合物和20微克QS21佐剂，且对血清进行取样(VAC-2017-PRL-EC-0723)。值得注意的是，10微克剂量为在评估细菌糖缀合物时惯常给予兔的范围的低端(20-50微克为更典型的)。还在独立研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中，使用相同剂量(10微克多糖+20微克QS21佐剂)及相同施用时程，对一组兔进行疫苗接种未缀合多糖。

在LUMINEX分析中评估兔对三种O25b糖缀合物制剂的抗体反应，其中羧基珠粒涂有与未缀合O25b长多糖预结合的甲基化人类血清白蛋白。用藻红素(PE)标记的抗IgG二级抗体检测血清样品中O25b特异性IgG抗体的存在。在第0周(免疫前)、第6周(给药后2，PD2)、第8周(给药后3，PD3)以及第12周(给药后4，PD4)在最佳反应兔(每组四只中的一只)中取样的血清中观察到的免疫反应概况展示于图21A-21C中。在12只兔中的任一个中未检测到显著的免疫前血清IgG效价。相反，在所有三组兔的接种后血清中均检测到O25b抗原特异性抗体反应，其中低活化糖缀合物组的反应趋势略高于中等或高活化糖缀合物组。在给药后3个时间点观察到最大反应。低活化组的一只兔和高活化组的一只兔未能对疫苗接种起反应(无反应者)。

为了评定CRM₁₉₇载体蛋白质缀合对长O25b OAg多糖的免疫原性的影响，将经未缀合多糖接种的兔血清中存在的抗体与经低活化CRM₁₉₇糖缀合物接种的兔血清进行比较，图22A-22F。值得注意的是，游离多糖没有免疫原性，在免疫与免疫前血清中几乎不引发IgG反应(图22A)。相比之下，在来自四只疫苗接种O25b OAg-CRM₁₉₇的兔的三只的PD4血清中，在一系列血清稀释液(1:100至1:6400)中，观察到比免疫前血清含量高约十倍的O25b OAg特异性IgG平均荧光强度值(MFI)。这些结果证明在10微克剂量水平下载体蛋白质缀合产生针对O25b OAg多糖的IgG抗体的必要性。

将在TSA板上生长的细菌悬浮于PBS中，调节至OD₆₀₀为2.0，且固定在含4％多聚甲醛的PBS中。在4％ BSA/PBS中阻断1h之后，将细菌与含免疫前和PD3免疫血清的2％ BSA/PBS的连续稀释液一起孵育，且用经PE标记的二级F(ab)抗体检测结合的IgG。

在用完整细菌进行的流式细胞测量术实验中证实由O25b OAg-CRM₁₉₇引发的O25b抗体的特异性。在Accuri流式细胞仪中，用PE缀合的F(ab')₂片段山羊抗兔IgG检测IgG与全细胞的结合。

如图23A-23C中所示，免疫前兔抗体未能与野生型血清型O25b分离株GAR2831和GAR2401或K-12大肠杆菌菌株结合，而匹配的PD3抗体以浓度依赖性方式对O25b细菌进行染色。缺乏表达OAg的能力的阴性对照K-12菌株仅显示极弱的PD3抗体结合，最可能归因于其表面上存在暴露的内核寡糖表位。将沙门氏菌fepE质粒引入野生型O25b分离株中导致染色显著增强，其与较长OAg多糖提供的免疫原性表位的较高密度一致。

结论：所描述的结果显示，不仅沙门氏菌fepE为沙门氏菌属物种中的极长O-抗原多糖的决定因素，而且其还可赋予不同O-抗原血清型在大肠杆菌菌株上制备极长OAg的能力。此特性可经利用以通过促进纯化和与适当载体蛋白质的化学缀合，以及经由形成较高分子量复合物潜在增强免疫原性来产生具有改进的生物过程开发特性的O-抗原疫苗多糖。

实施例14：最初兔研究产生第一多克隆抗体试剂和针对RAC O25b OAg-CRM₁₉₇的IgG反应

长链O25b多糖-CRM₁₉₇缀合物使用过碘酸盐氧化，接着使用还原氨基化化学方法(RAC)进行缀合来产生(表14)。还参见表24。

表14

在兔研究1(VAC-2017-PRL-EC-0723)(还在上文实施例13中描述)中，具有10μg低、中等或高活化RAC(+QS21)的五(5)只兔/组根据图20A中所示的时程接受组合物。在后续兔研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中观察到未缀合游离O25b多糖不具有免疫原性(参见图25)。

在兔研究2(VAC-2018-PRL-EC-077)中，具有L-RAC(AlOH₃，QS21或无佐剂)的2只兔/组根据图20B中所示的时程接受组合物。

兔4-1、4-2、5-1、5-2、6-1及6-2接受描述于实施例13中的极长未缀合O25b多糖，且测试第18周血清。

更具体地说，向兔4-1施用包括50μg未缀合O25b、100μg AlOH₃佐剂的组合物。向兔4-2施用包括50μg未缀合O25b、100μg AlOH₃佐剂的组合物。向兔5-1施用包括50μg未缀合O25b、50μg QS-21佐剂的组合物。向兔5-2施用包括50μg未缀合O25b、50μg QS-21佐剂的组合物。向兔6-1施用包括50μg未缀合O25b、无佐剂的组合物。向兔6-2施用包括50μg未缀合O25b、无佐剂的组合物。

实施例15：用O25b RAC缀合物进行的兔研究：dLIA血清稀释效价

兔研究2(VAC-2018-PRL-EC-077)O25b dLIA血清稀释效价与研究1(VAC-2017-PRL-EC-0723)的最佳反应兔对比。对于这些实验，实施经改良的直接结合Luminex分析，其中O25b长O-抗原的聚赖氨酸缀合物被动地吸附于Luminex羧基珠粒上，而非先前描述的甲基化血清白蛋白长O-抗原混合物。使用聚赖氨酸-O25b缀合物改进分析的灵敏度和IgG浓度依赖性反应的质量，允许经由使用曲线拟合(四参数非线性方程式)确定血清稀释效价。在表15中将第一研究中最高效价兔的血清中的O25b IgG效价与第二研究中的兔血清进行比较。

表15

第二兔研究中的较高剂量(50/20μg对比10μg)未改进IgG效价。

休息两个月增强IgG反应(间隔较短时未观察到)。

与QS21或无佐剂相比，明矾似乎增强兔的IgG反应。

确立用幼兔补体(BRC)和HL60细胞作为中性粒细胞来源的调理吞噬分析(OPA)，以测量O-抗原糖缀合物的功能免疫原性。预先冷冻的大肠杆菌GAR2831的细菌储备液在37℃下在Luria培养液(LB)培养基中生长。使细胞沉淀且悬浮于补充有20％甘油的PBS中达到1个OD₆₀₀单位/毫升的浓度且冷冻。将滴定前解冻的细菌稀释于具有1％明胶的HBSS(汉克氏(Hank's)平衡盐溶液)中至0.5×10⁵CFU/ml，且将10μL(10³CFU)与20μL连续稀释血清合并在U形底组织培养孔板中，且混合物在700rpm(BELLCO振荡器)下在37℃下于5％ CO₂培养箱中振荡30min。将10μl2.5％补体(幼兔血清，PEL-FREEZ 31061-3，预稀释于HBG中)和20μLHL-60细胞(0.75X 10⁷个/ml)以及40μL HBG添加至U形底组织培养孔板，且混合物在700rpm(BELLCO振荡器)下在37℃下于5％ CO₂培养箱中振荡45min。随后，将各100μL反应物的10μL转移至通过施加100μL水、真空过滤且施加150μL 50％ LB制备的预润湿MILLIPOREMULTISCREENHTS HV过滤板的相应孔中。真空过滤过滤板，且在37℃下于5％ CO₂培养箱中孵育过夜。次日，在固定、用考马斯(COOMASSIE)染料及Destain溶液染色及去染色之后，使用分析器和IMMUNOCAPTURE软件对集落进行计数。为了确立OPA活性的特异性，在与OPA反应中的其他分析组分组合之前，将免疫血清与100μg/mL经纯化的长O25b O-抗原一起预孵育。OPA分析包括不具有HL60细胞或补体的对照反应，以证明任何观察到的杀伤对这些组分的依赖性。

在分析中评估来自两个兔研究的代表性兔的匹配的免疫前及疫苗接种后血清样品，且确定血清稀释效价(表16，图26A-26B)。与未缀合O25b长O-抗原多糖的预孵育阻断杀细菌活性，证明OPA的特异性(图19C)。表16OPA效价。

兔2-3给药如下：兔2-3给药：10/10/10/10μg RAC缀合物+QS21，给药后(PD)4放血。兔1-2给药如下：50/20/20/20μg RAC缀合物+Al(OH)3，PD4放血。

实施例16：由未缀合O25b长O-抗原多糖及衍生的O25b RAC/DMSO长O-抗原糖缀合物引发的O-抗原O25b IgG含量.

在第0、5及13周通过皮下注射0.2或2.0μg/动物O25b RAC/DMSO长O-抗原糖缀合物对各组十只CD-1小鼠进行给药，在第3周(给药后1，PD1)、第6周(给药后2，PD2)及第13周(给药后3，PD3)时间点进行放血以用于免疫原性测试。用O25b特异性小鼠mAb作为内标，通过定量Luminex分析(详情参见实施例15)来确定抗原特异性IgG的水平。在从20×随机选择的未经疫苗接种小鼠的合并血清中，确定基线IgG含量(虚线)。游离的未缀合O25b长O-抗原多糖免疫原在任何时间点均不诱导高于基线水平的IgG。相反，在两次剂量的O25b-CRM197 RAC长缀合物糖缀合物之后观察到IgG反应：至PD3时观察到稳固均一的IgG反应，在PD2时观察到中等且变化较大的IgG含量。GMT IgG值(ng/ml)用95％ CI误差条指示。参见图27A-27C。

实施例17：O25b幼兔补体(BRC)OPA的特异性.

A-B)来自兔2-3及1-2的O25b RAC/DMSO长O-抗原免疫后血清(而非匹配的免疫前对照血清)显示杀细菌OPA活性。C)通过与100μg/mL长O-抗原O25b多糖一起预孵育，阻断来自兔1-2的免疫血清的OPA活性。将菌株GAR2831细菌与HL60、2.5％ BRC及血清的连续稀释液在37℃下一起孵育1h，且通过计数过滤板上的小集落(CFU)来对存活细菌计数。参见图26A-26C。

实施例18：RAC和eTEC O25b长糖缀合物比单端糖缀合物更具免疫原性.

用碳青霉烯类抗性氟喹诺酮抗性MDR菌株Atlas187913进行BRC OPA分析。根据与图28A-28B中所示相同的时程，用2μg糖缀合物接种各组20只CD-1小鼠，且在给药后2(PD2)(图28A)和给药后3(PD3)(图28B)时间点确定OPA反应。条形图指示具有95％ CI的GMT。指示高于未经疫苗接种基线的反应率。使用未配对t检验与韦尔奇氏校正(Welch'scorrection)(Graphpad Prism)评估不同组的对数转换数据，以评定差异是否为统计学上显著的。结果概述于表17中。参见图28A-28B。在用2μgeTEC O1a长糖缀合物接种的小鼠中，观察到针对O1a、PD2和PD3的OPA效价(数据未示出)分别大于表17中所示的针对O25b、PD2和PD3的OPA效价。

表17

实施例19：eTEC化学物质的OPA免疫原性可通过调节多糖活化含量来改进.

用碳青霉烯类抗性氟喹诺酮抗性MDR菌株Atlas187913进行BRC OPA分析。用0.2μg或2μg指定长O25b eTEC糖缀合物接种各组20只CD-1小鼠，且在PD2时间点确定OPA反应。评估来自4％活化与17％活化组的汇总对数转换数据，以使用未配对t检验与韦尔奇氏校正(Graphpad Prism)确认OPA反应的差异为统计学上显著的。单个组的GMT和反应率汇总于表18中。参见图29。

表18

描述	反应者％(n/N)	几何平均效价
			eTEC长4％活化(0.2μg)	35(7/20)	628
eTEC长4％活化(0.2μg)	65(13/20)	8,185
			eTEC长10％活化(0.2μg)	45(9/20)	1,085
eTEC长10％活化(0.2μg)	90(18/20)	27,368
			eTEC长17％活化(0.2μg)	70(14/20)	3,734
eTEC长17％活化(0.2μg)	80(16/20)	25,461

实施例20：攻击研究表明长大肠杆菌O25b eTEC缀合物在三个剂量后引发保护.

根据指定时程用2μg剂量免疫接种的各组20只CD-1小鼠用菌株GAR2831的1×10⁹个细菌IP攻击。监测后续存活六天。保护用在4％、10％或17％含量下经活化的eTEC糖缀合物疫苗接种的小鼠群组免于致死性感染，而未经疫苗接种对照小鼠或疫苗接种2μg未缀合O25b长多糖的小鼠则不。参见图30A-30B。

实施例21：用于制备eTEC连接的糖缀合物的方法

糖的活化以及用胱胺二盐酸盐的硫醇化。将糖在无水二甲亚砜(DMSO)中重构。通过Karl Fischer(KF)分析来确定溶液的水分含量，且将其调节至达到0.1及1.0％的水分含量，通常0.5％。

为了启动活化，在DMSO中以100mg/mL的浓度新鲜制备1,1'-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)的溶液。糖用不同量的CDT/CDI(1-10摩尔当量)活化，且使反应在室温或35℃下进行1-5小时。添加水以淬灭活化反应溶液中的任何残余CDI/CDT。进行计算以确定添加的水量，且以使得最终水分含量为总水溶液的2-3％。使反应在室温下进行0.5小时。胱胺二盐酸盐在无水DMSO中新鲜制备，浓度为50mg/mL。活化的糖与1-2摩尔当量的胱胺二盐酸盐反应。或者，活化的糖与1-2摩尔当量的半胱胺盐酸盐反应。使硫醇化反应在室温下进行5至20小时以产生硫醇化糖。硫醇化水平通过CDT/CDI的添加量来决定。

活化的硫醇化糖的还原及纯化.向硫醇化糖反应混合物中添加3-6摩尔当量的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的溶液，且使其在室温下进行3-5小时。随后，将反应混合物添加至预冷却的10mM磷酸二氢钠中稀释5-10倍，且经由5μm过滤器过滤。相对于30-40倍透滤体积的预冷却的10mM磷酸二氢钠进行硫醇化糖的透滤。抽取活化的硫醇化糖保留物的等分试样用于确定糖浓度及硫醇含量(Ellman)分析。

溴乙酰化载体蛋白质的活化及纯化.载体蛋白质的游离胺基通过与溴乙酰化剂，诸如溴乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯(BAANS)、溴乙酰溴或另一适合的试剂反应而经溴乙酰化。

在活化之前，首先将载体蛋白质(于0.1M磷酸钠，pH 8.0±0.2中)保持在8±3℃下、在约pH 7下。以0.25-0.5BAANS:蛋白质(w/w)的比率向蛋白质溶液中添加溴乙酸的N-羟基丁二酰亚胺酯(BAANS)的二甲亚砜(DMSO)储备溶液(20mg/mL)。反应物在5±3℃下轻轻混合30-60分钟。所得溴乙酰化(活化)蛋白质经纯化，例如通过使用10kDa MWCO膜，使用10mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液进行超滤/透滤。纯化后，通过Lowry蛋白质分析估计溴乙酰化载体蛋白质的蛋白质浓度。

活化程度通过利用与抑制电导率检测偶联的离子交换液相层析(离子层析法)的总溴化物分析来确定。活化的溴乙酰化蛋白质上的结合溴化物在分析样品制备中从蛋白质裂解，且连同可能存在的任何游离溴化物一起定量。通过在碱性2-巯基乙醇中加热样品，将蛋白质上任何剩余共价结合的溴转化为离子溴化物而释放。

溴乙酰化CRM₁₉₇的活化及纯化.CRM₁₉₇用10mM磷酸盐缓冲的0.9％NaCl pH 7(PBS)稀释至5mg/mL，且随后使用1M储备溶液制成0.1MNaHCO₃ pH 7.0。以1:0.35(w:w)的CRM₁₉₇:BAANS比率，使用20mg/mL DMSO的BAANS储备溶液，添加BAANS。在3℃与11℃之间孵育反应混合物30分钟至1小时，随后通过超过滤/透滤，使用10K MWCO膜及10mM磷酸钠/0.9％ NaClpH 7.0来纯化。经纯化的活化的CRM₁₉₇通过Lowry分析法分析以确定蛋白质浓度，且随后用PBS稀释至5mg/mL。添加蔗糖至5％wt/体积作为低温保护剂，且将经活化蛋白质冷冻且储存在-25℃下，直至缀合需要。

CRM₁₉₇的赖氨酸残基的溴乙酰化非常一致，致使39个可用赖氨酸中的15至25个赖氨酸活化。该反应产生高产率的活化蛋白质。

活化的硫醇化糖与溴乙酰化载体蛋白质的缀合.随后添加溴乙酰化载体蛋白质及活化的硫醇化糖。糖/蛋白质输入比率为0.8±0.2。用1MNaOH溶液将反应pH添加至9.0±0.1。使缀合反应在5℃下进行20±4小时。

残余反应性官能基的封端.载体蛋白质上未反应的溴乙酰化残基通过在5℃下与2摩尔当量作为封端试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸反应3-5小时来淬灭。残余游离巯基在5℃下用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)封端20-24小时。

eTEC连接的糖缀合物的纯化.缀合反应(IAA封端后)混合物经由0.45μm过滤器过滤。相对于5mM丁二酸盐-0.9％生理盐水pH 6.0进行糖缀合物的超滤/透滤。糖缀合物保留物随后经由0.2μm过滤器过滤。抽取糖缀合物的等分试样用于分析。其余糖缀合物储存在5℃下。参见表21、表22、表23、表24和表25。

实施例22：大肠杆菌-O25B ETEC缀合物的制备

活化方法-大肠杆菌-O25b脂多糖的活化.将冻干的大肠杆菌-O25b多糖在无水二甲亚砜(DMSO)中重构。通过Karl Fischer(KF)分析来确定冻干的O25b/DMSO溶液的水分含量。通过向O25b/DMSO溶液中添加WFI来调整水分含量，以达到0.5％的水分含量。

为了启动活化，1,1'-羰基二咪唑(CDI)以100mg/mL在DMSO溶液中新鲜制备。大肠杆菌-O25b多糖在硫醇化步骤之前用各种量的CDI活化。CDI活化在室温或35℃下进行1-3小时。添加水以淬灭活化反应溶液中的任何残余CDI。进行计算以确定添加的水量，且以使得最终水分含量为总水溶液的2-3％。使反应在室温下进行0.5小时。

活化的大肠杆菌-O25b多糖的硫醇化.在无水DMSO中新鲜制备胱胺二盐酸盐，且向活化的多糖反应溶液中添加1-2摩尔当量的胱胺二盐酸盐。使反应在室温下进行20±4小时。

活化的硫醇化大肠杆菌-O25b多糖的还原及纯化.向硫醇化糖反应混合物中添加3-6摩尔当量的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的溶液，且使其在室温下进行3至5小时。随后，将反应混合物添加至预冷却的10mM磷酸二氢钠中稀释5-10倍，且经由5μm过滤器过滤。用5KMWCO超滤器膜盒，相对于40倍透滤体积的预冷却的10mM磷酸二氢钠进行经硫醇化糖的透滤。抽取硫醇化O25b多糖保留物用于糖浓度和硫醇(Ellman)分析。活化方法的流程图提供于图32A)中。

缀合方法-硫醇化大肠杆菌-O25b多糖与溴乙酰化CRM₁₉₇的缀合.如实施例21中所描述，CRM₁₉₇载体蛋白质通过溴乙酰化单独活化，且随后与活化的大肠杆菌-O25b多糖反应以进行缀合反应。溴乙酰化CRM₁₉₇和硫醇化O25b多糖在反应容器中混合在一起。糖/蛋白质输入比率为0.8±0.2。将反应pH调整至8.0-10.0。使缀合反应在5℃下进行20±4小时。

溴乙酰化CRM₁₉₇及硫醇化大肠杆菌-O25b多糖上的反应性基团的封端.CRM₁₉₇蛋白质上的未反应的经溴乙酰化残基通过以下来进行封端：在5℃下与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸反应3-5小时，随后在5℃下用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)封端经硫醇化O25b-多糖的任何残余游离硫氢基20-24小时。

eTEC连接的大肠杆菌-O25b糖缀合物的纯化.缀合溶液经由0.45μm或5μm过滤器过滤。用100K MWCO超滤膜盒进行O25b糖缀合物的透滤。相对于5mM丁二酸盐-0.9％生理盐水pH 6.0进行透滤。大肠杆菌-O25b糖缀合物100K保留物随后经由0.22μm过滤器过滤，且储存在5℃下。

缀合方法的流程图提供于图32B中。

结果

若干批次的大肠杆菌-O25b eTEC糖缀合物的反应参数及表征数据显示于表19中。用胱胺二盐酸盐进行的CDI活化-硫醇化产生具有41至92％糖产率及<5至14％游离糖的糖缀合物。还参见表21、表22、表23、表24及表25。

表19.大肠杆菌-O25b eTEC缀合物的实验参数及特征数据

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实施例23：用于制备大肠杆菌O-抗原多糖-CRM197 eTEC缀合物的程序(适用于大肠杆菌血清型O25b、O1a、O2及O6的O-抗原

多糖的活化.将大肠杆菌O-抗原多糖在无水二甲亚砜(DMSO)中重构。为了起始活化，向多糖溶液中添加各种量的1,1'-羰基二咪唑(CDI)(1-10摩尔当量)，且使反应在室温或35℃下进行1-5小时。随后，添加水(2-3％，v/v)以淬灭活化反应溶液中的任何残余CDI。在使反应在室温下进行0.5小时之后，添加1-2摩尔当量的胱胺二盐酸盐。使反应在室温下进行5-20小时，且随后用3-6摩尔当量的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)处理以产生硫醇化糖。硫醇化水平通过CDT的添加量来决定。

随后，将反应混合物添加至预冷却的10mM磷酸二氢钠中稀释5-10倍，且经由5μm过滤器过滤。相对于30-40倍透滤体积的预冷却的10mM磷酸二氢钠进行硫醇化糖的透滤。抽取活化的硫醇化糖保留物的等分试样用于确定糖浓度及硫醇含量(Ellman)分析。

载体蛋白质(CRM₁₉₇)的活化.在活化之前，首先将CRM₁₉₇(于0.1M磷酸钠，pH 8.0±0.2中)保持在8±3℃下、在约pH 8下。以0.25-0.5BAANS:蛋白质(w/w)的比率向蛋白质溶液中添加溴乙酸的N-羟基丁二酰亚胺酯(BAANS)的二甲亚砜(DMSO)储备溶液(20mg/mL)。反应物在5±3℃下轻轻混合30-60分钟。所得溴乙酰化(活化)蛋白质经纯化，例如通过使用10kDa MWCO膜，使用10mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液进行超滤/透滤。纯化后，通过Lowry蛋白质分析估计溴乙酰化载体蛋白质的蛋白质浓度。

缀合.随后将活化的CRM₁₉₇及活化的大肠杆菌O-抗原多糖添加至反应器中且混合。糖/蛋白质输入比率为1±0.2。用1M NaOH溶液将反应pH添加至9.0±0.1。使缀合反应在5℃下进行20±4小时。载体蛋白质上未反应的溴乙酰化残基通过在5℃下与2摩尔当量作为封端试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸反应3-5小时来淬灭。残余游离巯基在5℃下用4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)封端20-24小时。随后，使用相对于5mM丁二酸盐-0.9％生理盐水pH 6.0进行的超滤/透滤纯化反应混合物。随后，经纯化缀合物经由0.2μm过滤器过滤。参见表21、表22、表23、表24及表25。

实施例24：通用程序-通过还原氨基化化学方法(RAC)进行O-抗原(来自大肠杆菌血清型O1、O2、O6、25b)多糖的缀合

在二甲亚砜(RAC/DMSO)中的缀合

活化多糖.在100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0±0.2)中进行多糖氧化，通过依次添加计算量的500mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)和注射用水(WFI)，使最终多糖浓度为2.0g/L。必要时，将反应pH调整至大致pH 6.0。在pH调节之后，将反应温度冷却至4℃。通过添加大致0.09-0.13摩尔当量的过碘酸钠开始氧化。氧化反应在5±3℃下进行大致20±4小时。

使用5K MWCO超滤盒进行活化的多糖的浓缩及透滤。相对于20倍透滤体积的WFI进行透滤。经纯化的活化的多糖随后储存在5±3℃下。经纯化的活化的糖的特征尤其在于：(i)通过比色分析测定的糖浓度；(ii)通过比色分析测定的醛浓度；(iii)氧化程度；以及(iv)通过SEC-MALLS测定的分子量。

将活化的多糖与蔗糖赋形剂混配且冻干.将活化的多糖与蔗糖混配，比率为25克蔗糖/克活化的多糖。随后将一瓶混配混合物冻干。在冻干之后，将含有经冻干的活化的多糖的瓶子储存在-20±5℃下。将计算量的CRM₁₉₇蛋白质单独进行壳冻且冻干。将冻干的CRM₁₉₇储存在-20±5℃下。

重构冻干的活化的多糖和载体蛋白质.将经冻干的活化的多糖在无水二甲亚砜(DMSO)中重构。在多糖完全溶解后，将等量的无水DMSO添加至冻干的CRM₁₉₇中以进行重构。

缀合及封端.重构的活化的多糖与重构的CRM₁₉₇在反应容器中组合，接着充分混合以获得澄清溶液，随后开始与氰基硼氢化钠缀合。反应溶液中的最终多糖浓度为大致1g/L。通过向反应混合物中添加0.5-2.0毫当量的氰基硼氢化钠以及在23±2℃下孵育20-48小时，来起始缀合。通过添加2MEq硼氢化钠(NaBH₄)以封端未反应的醛来终止缀合反应。此封端反应在23±2℃下持续3±1小时。

纯化缀合物.缀合物溶液用冷却的5mM丁二酸盐-0.9％生理盐水(pH6.0)以1:10稀释，以准备通过使用100-300K MWCO膜进行切向流过滤来纯化。使经稀释的缀合物溶液通过5μm过滤器，且使用5mM丁二酸盐/0.9％生理盐水(pH 6.0)作为介质进行透滤。在透滤完成后，将缀合物保留物转移通过0.22μm过滤器。缀合物用5mM丁二酸盐/0.9％盐水(pH 6)进一步稀释至大致0.5mg/mL的目标糖浓度。可替代地，使用20mM组氨酸-0.9％盐水(pH 6.5)，通过切向流过滤，使用100-300K MWCO膜，来纯化缀合物。完成最终的0.22μm过滤步骤，以获得免疫原性缀合物。参见表21、表22、表23、表24和表25。

实施例25：在水性缓冲液(RAC/水性)中的缀合，适用于大肠杆菌血清型O25B、O1A、O2和O6

多糖活化和透滤以与基于DMSO的缀合的多糖活化及透滤相同的方式进行。

视血清型而定，将经过滤的活化的糖与CRM₁₉₇以在0.4至2w/w范围内的多糖与蛋白质的质量比混配。此输入比率经选择以控制所得缀合物中多糖与CRM₁₉₇的比率。

随后冻干混配混合物。在缀合后，视血清型而定，以在5至25g/L范围内的多糖浓度，将多糖及蛋白质混合物溶解于0.1M磷酸钠缓冲液中，视血清型而定，将pH调整在6.0至8.0之间。通过向反应混合物中添加0.5-2.0毫当量的氰基硼氢化钠及在23±2℃下孵育20-48小时，来起始缀合。通过添加1-2MEq硼氢化钠(NaBH₄)终止缀合反应，以封端未反应的醛。

或者，将经过滤的活化的糖及计算量的CRM₁₉₇蛋白质分别进行壳冻且冻干，且随后在溶解于0.1M磷酸钠缓冲液后合并，随后可如上所描述进行后续缀合。

表20.在DMSO和水性缓冲液中制备的两种缀合的结果的概述

	RAC/DMSO	RAC/水溶液
			聚合物MW(kDa)	48K	46K
氧化程度(DO)	12	12
			糖/蛋白质比率	0.8	1.0
游离糖％	<5％	32％
			通过SEC-MALLS确定的缀合物MW，kDa	7950	260

实施例26：大肠杆菌O-抗原多糖-CRM₁₉₇单端缀合物的制备程序

脂多糖(LPS)为革兰氏阴性细菌外膜的常见组分，包含脂质A、核心区和O-抗原(还称为O特异性多糖或O-多糖)。不同血清型的O-抗原重复单元在其组成、结构及血清学特征上有所不同。本发明中使用的O-抗原与核心域连接，该核心域在其链末端含有称为2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)的糖单元。与一些基于多糖链的无规活化(例如用过碘酸钠或碳化二亚胺活化)的缀合方法不同。本发明公开一种缀合方法，其涉及用二硫胺接头选择性活化KDO，在暴露硫醇官能基后，硫醇官能基随后如图31中所描绘与溴活化的CRM₁₉₇蛋白质缀合(单端缀合物的制备)。

基于胱胺接头(A1)的缀合.将O-抗原多糖及胱胺(50-250摩尔当量的KDO)混合于磷酸盐缓冲液中，将pH调整至6.0-7.0。向混合物中添加氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)(5-30摩尔当量的KDO)，且在37℃下搅拌混合物48-72小时。冷却至室温后，用等体积的磷酸盐缓冲液稀释，用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)(1.2mol，所添加胱胺的当量)处理混合物。混合物随后经由使用5kDa MWCO膜相对于10mM磷酸二氢钠溶液进行透滤来纯化，得到含有硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可通过Ellman分析来确定。

随后，通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白质以0.5-2.0的比率混合来进行缀合。用1M NaOH溶液，将反应混合物的pH调节至8.0-10.0。缀合反应在5℃下进行24±4小时。载体蛋白质上未反应的溴残基通过在5℃下与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸反应3-5小时来淬灭。随后，添加3摩尔当量的碘乙酰胺(与所添加的N-乙酰基-L-半胱氨酸相关)，以封端残余游离硫氢基。在5℃下再进行此封端反应3-5小时，且通过添加1MNaOH，将两个封端步骤的pH维持在8.0-10.0下。在使用30kDa MWCO膜相对于5mM丁二酸盐-0.9％生理盐水pH 6.0进行超滤/透滤后，获得所得缀合物。参见表21、表22、表23、表24和表25。

实施例27：基于3,3'-二硫基双(丙酸二酰肼)接头(A4)的缀合

将O-抗原多糖和3,3'-二硫基双(丙酸二酰肼)(5-50摩尔当量的KDO)混合于乙酸盐缓冲液中，将pH调节至4.5-5.5。向混合物中添加氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)(5-30摩尔当量的KDO)，且在23-37℃下搅拌混合物24-72小时。混合物随后用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)(1.2mol，所添加3,3'-二硫基双(丙酸二酰肼)接头的当量)处理。混合物随后经由使用5kDaMWCO膜相对于10mM磷酸二氢钠溶液进行透滤来纯化，得到含有硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可通过Ellman分析来确定。

随后，通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白质以0.5-2.0的比率混合来进行缀合。用1M NaOH溶液，将反应混合物的pH调节至8.0-10.0。缀合反应在5℃下进行24±4小时。载体蛋白质上未反应的溴残基通过在5℃下与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸反应3-5小时来淬灭。随后，添加3摩尔当量的碘乙酰胺(与所添加的N-乙酰基-L-半胱氨酸相关)，以封端残余游离硫氢基。在5℃下再进行此封端反应3-5小时，且通过添加1MNaOH，将两个封端步骤的pH维持在8.0-10.0下。在使用30kDa MWCO膜相对于5mM丁二酸盐-0.9％生理盐水pH 6.0进行超滤/透滤后，获得所得缀合物。

实施例28：基于2,2'-二硫基-N,N'-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(胺氧基)乙酰胺)接头(A6)的缀合

将O-抗原多糖和2,2′-二硫基-N,N'-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(胺氧基)乙酰胺)(5-50摩尔当量的KDO)混合于乙酸盐缓冲液中，将pH调节至4.5-5.5。混合物随后在23-37℃下搅拌24-72小时，接着添加氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)(5-30摩尔当量的KDO)，且再搅拌混合物3-24小时。混合物随后用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)(1.2mol，所添加接头的当量)处理。混合物随后经由使用5kDa MWCO膜相对于10mM磷酸二氢钠溶液进行透滤来纯化，得到含有硫醇的O-抗原多糖。硫醇含量可通过Ellman分析来确定。

随后，通过将上述硫醇活化的O-抗原多糖与溴活化的CRM₁₉₇蛋白质以0.5-2.0的比率混合来进行缀合。用1M NaOH溶液，将反应混合物的pH调节至8.0-10.0。缀合反应在5℃下进行24±4小时。载体蛋白质上未反应的溴残基通过在5℃下与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸反应3-5小时来淬灭。随后添加3摩尔当量的碘乙酰胺(与所添加的N-乙酰基-L-半胱氨酸有关)，以封端残余游离巯基。在5℃下再进行此封端反应3-5小时，且通过添加1MNaOH，将两个封端步骤的pH维持在8.0-10.0下。在使用30kDa MWCO膜相对于5mM丁二酸盐-0.9％生理盐水pH 6.0进行超滤/透滤后，获得所得缀合物。

实施例29A：经溴活化的CRM₁₉₇的制备

在0.1M磷酸钠pH 8.0±0.2溶液中制备CRM₁₉₇，且将其冷却至5±3℃。以0.25-0.5BAANS:蛋白质(w/w)的比率向蛋白质溶液中添加溴乙酸的N-羟基丁二酰亚胺酯(BAANS)的二甲亚砜(DMSO)储备溶液(20mg/mL)。反应物在5±3℃下轻轻混合30-60分钟。所得溴乙酰化(活化)蛋白质经纯化，例如通过使用10kDa MWCO膜，使用10mM磷酸盐(pH7.0)缓冲液进行超滤/透滤。纯化后，通过Lowry蛋白质分析估计溴乙酰化载体蛋白质的蛋白质浓度。

表21：O1a缀合物

表22：O2缀合物

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表23：O6缀合物

表24：O25b缀合物

表25：O25b K-12缀合物

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实施例29B：大肠杆菌O-Ag-TT缀合物的制备

将50mg冻干的大肠杆菌血清型O25b长多糖批次号709766-30(约6.92mg/mL，MW：约39kDa)用于破伤风类毒素(TT)缀合。

将大肠杆菌血清型O1a长多糖710958-142-3(约6.3mg/mL，MW：约44.3kDa)(50mg，7.94mL)冻干。

将大肠杆菌血清型O6长多糖710758-121-1(约16.8mg/mL，MW：约44kDa)(50mg，2.98mL)冻干。

将以上示出的冻干多糖中的每一种溶解于WFI中，使其达到大致5-10mg/mL，添加0.5mL(100mg(1-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)于1mL乙腈中的溶液)且在室温下搅拌。添加三乙胺(TEA)0.2M(2mL)且在室温下搅拌。

破伤风类毒素(TT)的制备：将TT(100mg，47ml)浓缩至大致20mL，且使用过滤管用生理盐水(2×50mL)洗涤两次。此后，将其用HEPES及生理盐水稀释，以使得最终HEPES浓度为约0.25M。

如上文所描述制备TT，且将反应物的pH调节至约9.1-9.2。将反应混合物在室温下搅拌。

20至24小时后，用甘氨酸(0.5mL)淬灭反应。此后，使用MWCO再生纤维素膜将其浓缩，且相对于生理盐水进行透滤。过滤且分析。参见表26。

表26

示例性实施方案：

实施例30：O-抗原发酵、纯化及缀合的其他结果

以下所描述的示例性方法一般适用于所有大肠杆菌血清型。各多糖的生产包括分批生产发酵，接着在下游纯化之前进行化学不活化。

菌株和储存.用于短链O-抗天然物合成的菌株为大肠杆菌的临床野生型菌株。长链O-抗原用短链产生者的衍生物产生，这些衍生物已通过Wanner-Datsenko方法工程化以具有天然wzzb基因的缺失，且由沙门氏菌的“长链”延伸子功能fepE补充。fepE功能从其天然启动子在基于colE1的高拷贝“拓朴”载体或基于colE1的载体pET30a的低拷贝衍生物上表达，其中T7启动子区已缺失。

细胞库通过使细胞在非动物LB或基本培养基中生长至OD₆₀₀为至少3.0来制备。随后，将培养液稀释于新鲜培养基中且与80％甘油组合，获得具有2.0OD₆₀₀/mL的20％甘油最终浓度。

用于种菌培养和发酵的培养基.所采用的种菌培养基和发酵培养基共享以下制剂：KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

种菌和发酵条件.自单个种菌小瓶以0.1％接种种菌。种菌瓶在37℃下孵育16-18小时，且通常达到10-20OD₆₀₀/mL。

发酵在10L不锈钢原位蒸汽发酵罐中进行。

通常从10OD₆₀₀种菌以1:1000接种发酵罐。分批阶段为在10g/L分批葡萄糖上进行生长的时段，通常持续8小时。葡萄糖耗尽后，溶解氧突然上升，此时将葡萄糖进料至发酵。随后，发酵通常进行16-18小时，其中收获>120OD₆₀₀/mL。

对血清型O1a、O2、O6和O25b的短/长链O-抗原产生的初步评估.O1a、O2、O6和O25b的野生型菌株在补充的基本培养基中以分批模式发酵至OD₆₀₀＝15-20。在葡萄糖耗尽后，其引起氧消耗急剧降低，从葡萄糖溶液施加生长限制性葡萄糖进料16-18小时。细胞密度达到124-145OD₆₀₀单位/毫升。随后，将收获培养液的pH调整至约3.8，且加热至95℃持续2小时。随后，将经水解培养液冷却至25℃，使其达到pH 6.0，且离心以移除固体。随后，将所得上清液施加于SEC-HPLC柱以进行O-抗原定量。获得的生产率在2240-4180mg/L范围内。发现来自这些批次的经纯化短链O-抗原的分子量在10-15kDa范围内。还注意到，O2和O6水解产物的SEC层析显示独特且可分离的污染性多糖，其在O1a和O25b水解产物中并不明显。

O1a、O2、O6和O25b O-抗原的长链型式经由各菌株的wzzb缺失型式发酵而获得，该菌株在高拷贝卡那霉素可选拓朴质粒上携带异源、补充fepE基因。即使具有卡那霉素选择，仍如短链一般进行发酵。最终观察到的细胞密度为124-177OD₆₀₀/mL，与3500-9850mg/L的O-抗天然产率相关。基于互补的长链O-抗原的合成至少与在亲本短链菌株中一样高产，且在一些情况下更高产。经纯化的O-抗原多糖的分子量为33-49kDa或为相应短链大小的约3倍。

注意到，O2和O6的长链水解产物显示污染性多糖峰的证据，在长链抗原的情况下，观察到为主要O-抗原峰上的肩部；O1和O25b未显示产生污染性多糖的证据，正如先前关于短链亲本所见。

发现生长速率抑制与缺乏fepE的拓朴复制子的存在相关联。另外，Δwzzb突变本身对生长速率无不良影响，表明受干扰的生长速率由质粒载体传达。

用于产生O11、O13、O16、O21和O75 O-抗原的菌株的评估.通过SEC-HPLC评估血清型O11、O13、O16、O21和O75的多个野生型菌株在发酵中产生非所要多糖的倾向。O11、O13、O16、O21和O75的菌株经选择为不存在污染性多糖，以及其产生>1000mg/L O-抗原的能力且显示抗生素敏感性概况，允许进行Wanner-Datsenko重组工程化以引入Δwzzb性状。

构建拓朴fepE和pET-fepE的氯霉素可选型式，允许将fepE引入O11、O13、O16、O21和O75Δwzzb菌株中，这些菌株一般发现具有卡那霉素耐受性。将所得携带拓朴fepE和pET-fepE的菌株在氯霉素选择下发酵，且通过SEC-HPLC评估来自酸水解培养液的上清液。高(拓朴)和低拷贝(pET)fepE构建体指导O-抗原的合成，其中各构建体的生产率与亲本野生型相当。未观察到潜在干扰性多糖的表达。

wzzb质粒携带菌株的生长速率的评价显示，O11、O13和O21通过拓朴-fepE但不通过pET-fepE的存在而迟延；菌株O16和O75菌株显示与复制子选择无关的可接受的生长速率。

表27

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多糖的纯化方法包括酸水解以释放O-抗原。发酵反应器中血清型特异性大肠杆菌培养物的粗悬浮液直接用乙酸处理至最终pH为3.5±0.5，且将酸化培养液加热至95±5℃的温度至少一小时。此处理裂解寡糖近端的KDO与脂质A之间的不稳定键，由此释放O-Ag链。在使用NH₄OH中和至pH 7±1.0之前，将含有经释放的O-Ag的经酸化的培养液冷却至20±10℃。该方法进一步包括若干离心、过滤及浓缩/透滤操作步骤。

表28

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实施例31：所研究的对O-抗原(O4、O11、O21、O75)的缀合(RAC/DMSO)

表29：O4缀合物

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表30：O11缀合物

表31：O21缀合物

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表32：O75缀合物

实施例32：所制备的PLL缀合物

表33

实施例33：大肠杆菌多肽的稳定的哺乳动物细胞表达

使用SSI(位点特异性整合)稳定表达系统生成表达FimH GSD或FimH LD的稳定CHO克隆。宿主CHO细胞为来自CHOK1 SV GS-KO背景的经工程化的细胞系(关于CHOK1SV GS-KO宿主细胞系的描述，参见例如美国专利申请20200002727)。简而言之，将由两个FRT位点包围的具有绿色荧光蛋白(GFP)基因的着陆垫靶向宿主细胞基因组中的转录热点中。GFP基因可与GS基因及相关基因进行交换，这些基因还由LVEC载体的FRT位点包围且与翻转酶重组酶(FLPe)共表达。此系统不仅具有与随机整合相比优越的生长及生产率概况，且还呈现至少100代的基因型及表达型稳定性。

如本文中所提及，术语“FRT位点”是指酵母2μm质粒的翻转酶(FLP)基因的产物，FLP重组酶，可催化位点特异性重组的核苷酸序列。多种不一致FRT位点为此项技术已知的。各种FRT位点的序列为相似的，因为其均含有一致的13个碱基对的反向重复序列，侧接发生重组的8个碱基对的不对称核心区。不对称核心区负责位点的方向性及不同FRT位点中的变异。这些的说明性(非限制性)实施例包括天然存在的FRT(F)及若干突变或变异型FRT位点，诸如FRT F1和FRT F2。

如本文中所提及，术语“着陆垫”是指包含染色体整合至宿主细胞中的第一重组目标位点的核酸序列。在一些实施方案中，着陆位点包含染色体整合至宿主细胞中的两个或更多个重组目标位点。在一些实施方案中，细胞包含1、2、3、4、5、6、7或8个着陆垫。在一些实施方案中，细胞包含1、2或3个着陆垫。在一些实施方案中，细胞包含4个着陆垫。在一些实施方案中，着陆垫整合在至多1、2、3、4、5、6、7或8个不同的染色体基因座。在一些实施方案中，着陆垫整合在至多1、2或3个不同的染色体基因座。在一些实施方案中，着陆垫整合在4个不同的染色体基因座。

通过用BioRad Gene Pulser Xcell或Amaxa 4D-Nucleofector电穿孔，将FimHGSD或FimH LD的LVEC表达载体和FLPe表达载体共转染至SSI宿主细胞中。随后，细胞在无谷酰氨酸的培养基中培养，以选择在着陆垫位点整合有GS基因的细胞。通常，细胞在2至3周内回收。随后在96孔板中通过FACS或限制稀释法进行单细胞克隆。对具有细胞的孔的效价进行排序，以缩减至前48个克隆。在24深孔板中进行第二轮进料分批筛选，以将克隆缩减至前12个。在Ambr15中执行第三轮进料分批筛选，以将克隆缩减至前3个。Ambr250实验用于鉴别最佳克隆。鉴别后，生成最佳克隆的主细胞库和工作细胞库。

实施例34：FimH-DSG WT和FimH_LD WT蛋白质的细胞系开发及生产反应器表达

本文所描述的实施例描述从稳定的CHO细胞系示例性产生FimH-DSG WT和FimH_LDWT蛋白质，其中各蛋白质的编码序列已稳定整合至CHO基因组中。

在生产生物反应器设置中，所选择的稳定的CHO细胞系能够对于FimH-DSG WT以约1克/升培养物，且对于FimH_LD WT以250克/升培养物产生目标蛋白质。生产反应器的种菌罐从工作细胞库的小瓶解冻不断规模放大，且在摇瓶中使用0.3×10⁶个细胞/毫升的接种活细胞密度，经由摇瓶中的三个继代循环扩增，得到足够用于生产反应器的细胞。细胞在36.5℃、5％ CO₂下生长三至四天。

从最终的摇瓶中接种生产反应器，目标为1×10⁶个细胞/毫升的接种细胞密度。使用7.05(+/-0.15)的pH，且目标为5-10％的CO₂饱和度，使生产反应器在36.5℃下生长七天。通过用于碱控制的碳酸氢钠/碳酸氢钾及用于酸控制的CO₂鼓泡控制pH。使用纯氧经由鼓泡将溶解氧控制在40％的设定点。在第七天将温度调整至31℃。反应器在第1天进料，使用的进料策略为添加与活细胞密度相关的进料，此通过使用0.75的进料系数来实现，以确保进料组分在运行期间不会耗尽。随后连续添加进料，以在当天过程中提供所需的进料量。

在第13天收获生产反应器，且将收获培养物离心且进行0.22μm过滤，随后进行下游处理。

实施例35：小鼠中FimH抗原和O-抗原组合的免疫原性

在小鼠免疫原性研究中评估大肠杆菌FimH凝集素结合域(FimH_LD)及全长(FimH-DSG或FimCH)变体，这些小鼠免疫原性研究评定所引发的抗体中和伞毛化大肠杆菌与甘露糖基化配体的结合的能力。在小鼠中，从哺乳动物细胞中以高产率分泌和纯化的野生型FimH抗原具有类似的免疫原性，与从大肠杆菌胞外质中以较低产率纯化的天然抗原类似。相比之下，含有凝集素域和菌毛蛋白域两者的全长FimH抗原的免疫原性显著高于FimH_LD。需要使用含有QS21的佐剂制剂，以产生针对这些伞毛抗原的稳固的功能性免疫反应。后续研究探究FimH与四价O-抗原糖缀合物混合物及不同佐剂的组合的免疫原性。在第二剂量之后，在FimH中和和O-抗原特异性OPA分析两者中，疫苗接种脂质体QS21制剂的小鼠与未给予佐剂或给予脂质体单磷酰基脂质A(MPLA)的组相比对组合的抗原持续地诱导更高功能性反应。

动物免疫原性.从Charles River中获得6-8周龄CD-1小鼠，且用0.1mL测试抗原或缓冲液对照皮下(SC)给予10或20只动物的组。通过用三个剂量的具有100μg完全弗氏佐剂的大肠杆菌FimH_LD抗原(在第0周)，接着100μg不完全弗氏佐剂中的抗原(在第4周和第8周)(Covance)免疫兔来制备多克隆抗FimH兔对照血清。各疫苗接种在两个部位(皮下-背侧)施用含有50μg抗原的0.5mL。

佐剂制剂.针对无佐剂的抗原的稀释剂为10mM磷酸盐缓冲液(pH6.1)。对于AlPO₄，每小鼠剂量提供50μg(100μL的0.5mg/mL悬浮液)。用于临床前研究的皂皮树-21(QS21)的预设剂量为每只小鼠20μg，来自含有5.1mg/mL QS-21、5mM丁二酸盐、60mM NaCl、0.1％ PS80、pH5.6的储备液。单磷酰基脂质A(MPLA，合成性，，Avanti)及QS21的脂质制剂使用1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸胆碱(DOPC)和胆固醇(Avanti极性脂质)制备。脂质体MPLA以5μg每剂量使用，来自包含15mM磷酸盐缓冲液，pH 6.1，4mg/mL DOPC，1mg/mL胆固醇，0.2mg/mL MPLA(批次00714551-0018-2XLipoMPL)，具有通过动态光散射确定的71nm的脂质体粒度的储备液。脂质体MPLA/QS21制剂以5μg各每剂量使用，来自包含15mM磷酸盐缓冲液，pH 6.1，4mg/mL DOPC、1mg/mL胆固醇、0.2mg/mL MPLA和0.2mg/mL QS-21(批次00714551-0018-2XLipoMQ)，具有通过动态光散射确定的75nm的MPLA-QS21脂质体粒度的储备液。

用于免疫原性研究的表达质粒及所衍生的FimH伞毛抗原.使用以下表达质粒产生重组蛋白质用于小鼠实验：

>pSB02083--FimH_LD(mIgK信号肽，N28S，N91S)，处理的蛋白质序列：

>pSB02158--FimH_LD-LM(mIgK信号肽，N28S N91S V48CL55C)，处理的蛋白质序列：

>pSB02307-FimH-DSG(mIgK信号肽，N28S N91S N249Q 7aa接头FimG A1..K14)，处理的蛋白质序列：

>pSB02198-FimH-DSG-LM(mIgK信号肽，N28S N91 S 249QV48C L55C 7aa接头FimGA1..K14)，处理的蛋白质序列：

氨基酸编号基于J96菌株FimH的全长氨基酸序列，而理论公开使用基于在信号肽处理之后暴露的N端苯丙氨酸(在位置21处)的编号。其他突变移除在全长FimH-DSG构建体(N249Q)的凝集素域(N28S及N91 S)中、在菌毛蛋白域中的糖基化位点天冬酰胺残基。添加至C端的供体-链G肽使FimH稳定。如上文实施例中所描述，使7氨基酸接头长度针对哺乳动物表达优化。

FimH全细胞中和分析.开发FimH中和分析，以测量血清抗体对伞毛化大肠杆菌与甘露糖甘配体的结合的抑制。配体为表达甘露糖基化尿溶蛋白受体UPIa的经孔板固定的酵母菌甘露聚糖或膀胱5637细胞。

对于酵母菌甘露聚糖分析，黑色微量滴定96孔板(Maxisorb，Nunc)经20μg/ml含酵母菌甘露聚糖(Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液包被。这些孔用含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)的PBS阻断20min。人类膀胱上皮细胞系5637从ATCC(ATCC HTB-9)获得。使细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，Sigma)、2.0g/l碳酸氢钠(Sigma)和0.3g/l L-谷酰氨酸的RPMI 1640(Sigma，St Louis，MO)中生长于黑色组织培养孔板(Greiner)上，在37℃下在5％ CO₂下生长且在第10代和第24代之间使用。通过使用多克隆抗体(Novus#NBP214694)的免疫荧光染色确认尿溶蛋白1a受体的表面表达。大肠杆菌血清型O25b UTI菌株PFEEC0547在10mL静态LB培养物中在37℃下连续继代以诱导FimH表达。通过流式细胞测量术，使用针对FimH_LD抗原的兔免疫血清，确认细菌表面上的FimH表达。通过包括在50mM含量下使结合下降>95％的阴性对照化合物甲基α-D-吡喃甘露糖苷(sigma)确立结合至甘露聚糖或膀胱细胞的细菌的特异性。在添加至经固定酵母菌甘露聚糖或5637细胞单层之前，将以1:100(在PBS中，0.1％BSA)开始的八步二倍连续稀释的测试血清与1x10⁷个大肠杆菌在37℃下一起共孵育1小时。将连续稀释的抗FimH_LD兔血清用作各板上的内标。在洗掉未结合的细菌之前，在37℃下将板孵育1小时。将结合的大肠杆菌在室温下用3μg/ml与Alexafluor 488缀合的O25b-特异性mAb染色45min。mAb由O25b抗体3E9-11的可变轻链及重链序列重构(Nagy E,Nagy G,Szijarto V,等人,Antibodies to multi-drug resistant Escherichia coli:Arsanis Biosciences GmbH,Austria.2014:76pp)。人类pTT5 IgG表达质粒用作克隆载体。在ClarioStar Plus仪器上读取个体孔的荧光强度。使用S形剂量反应可变斜率曲线拟合(Graphpad Prism)内插IC₅₀抑制值。效价为在观察到半最大抑制时的血清稀释的倒数。疫苗抗原反应者定义为在1:100的起始血清稀释下超过80％抑制的中和效价。另外，结合活性的血清稀释滴定必须满足可变斜率S形曲线拟合参数(R²>0.95，具有内插Log IC50值或以更广泛稀释度触发实验重复直至消退)。各组之间的反应差异的统计显著性(p值)使用未配对t检验确定，其中韦尔奇氏校正应用于对数转换数据。

对于涉及疫苗接种不同血清型的多价O-抗原缀合物的小鼠的实验，酵母菌甘露聚糖分析适用于Bactiter Glo检测试剂(Promega)，以避免所引发的抗O-Ag IgG对细菌检测的潜在的干扰。在此情况下，检测基于在自预渗透的活细菌中释放ATP之后通过萤火虫萤光素酶催化的光子发射。此试剂的使用通过消除洗涤步骤而简化检测，且经由液体处置自动化(Bravo，Agilent)促进更高通量的384孔分析形式的实施。微型化分析使反应体积自100μL减小至30μL，且使所需细菌数目从1x10⁷个每孔降低至1x10⁶个。在于PBS中1:1稀释之后，将Bactiter Glo添加至所有孔中，且在混合之后，在亮度计模式下在ClarioStar读取器上进行读取。选择血清型O6:K2大肠杆菌UTI菌株CFT073(700928^TM)用于半自动化384孔分析，这是因为其具有与O25b UTI菌株PFEEC0547相比增强的敏感性。两种菌株均在比较小鼠疫苗接种组(数据未展示)的子组中的个别血清效价的衔接性研究中产生类似结果。

大肠杆菌O-Ag小鼠IgG直接Luminex免疫分析(dLIA).通过eBPD(Pfizer)内部产生的血清型O25b、O1a、O2和O6的长链大肠杆菌O-Ag多糖与聚-L-赖氨酸缀合，且随后与具有EDC/NHS的Luminex珠粒微球体缀合。针对各O-抗原使用具有不同光谱地址的珠粒实现四重多任务。将珠粒在4℃下与连续稀释的个体小鼠血清或对照mAb在振荡下一起孵育18小时。在洗涤之后，用PE-缀合的山羊抗小鼠IgG小鼠二级抗体(90min室温孵育)检测经结合的血清型特异性IgG。在FlexMap 3D仪器(Biorad)上读取孔板。将具有类似结合特性(内部产生)的血清型特异性小鼠IgG mAb用作内标以定量IgG含量。各mAb的标准曲线的图得到在10³血清稀释中的重叠的线性斜率特征曲线(对数发光相对于对数血清稀释)。从标准曲线偏差计算0.15259ug/mL的4-plex IgG dLIA的定量下限(LLOQ)，其对于四个抗原中的每一种为相同的。

大肠杆菌调理吞噬分析(OPA).临床大肠杆菌侵袭性血液分离株获自Pfizer赞助的抗微生物测试领导及监督(Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance，ATLAS)数据库，其由国际健康管理协会(International Health Management Associates，IHMA)临床实验室维护。菌株通过WGS使用Illumina Miseq平台，包括用于预测O-抗原和K-荚膜类型的计算机仿真血清分型，以基因型方式表征。当在达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中在细胞储备条件下生长时表达O-抗原及K-抗原两者的血清型O1a、O2、O6及O25b菌株用作测试菌株，以及表示O6及O25b血清型的多重抗药性未囊封菌株。通过流式细胞测量术使用内部产生的抗原特异性单克隆或多克隆抗体确认O-抗原表达。使用K1-荚膜mAbmAb13D9-151(自NRC，加拿大获得)确认K1-抗原表达。使用K2分型血清(Statens SerumInstitute)检测K2-抗原表达。通过在用肝素酶处理时增加的潜在O-抗原的表面暴露确认K5肝素前体荚膜的表达。开发以下大肠杆菌临床菌株用于OPA分析：

O1a:K1(PFEEC0435，ST-95)，

O2:K1(PFEEC0146，ST-95，替卡西林(Ticarcillin)/克拉维酸(Clavulanic Acid)^R)，

O6:K-(PFEEC0412，ST-127，替卡西林/克拉维酸R，ESBL)，

O6:K2(PFEEC0150，ST-127)，

O25b:K-(PFEEC0068，ST-131，亚胺培南(Imipenem)^R，氟喹诺酮(fluoroquinolone)^R)，

O25b:K5(PFEEC0066，ST-131，fluorquinolone^R)。

将预先冷冻的细菌储备液在DMEM中生长至OD₆₀₀在0.5与1.0之间，且在冷冻之前添加丙三醇至最终浓度20％。将滴定前解冻的细菌在OPA缓冲液(汉克氏平衡盐溶液(LifeTechnologies)、0.1％明胶、1mM MgCl₂、2.5mM CaCl₂)中稀释至1×10⁵CFU/ml，且将20μL(10³CFU)细菌悬浮液在室温下在384孔组织培养孔板中用10μL连续稀释的血清调理30分钟。诸如需要调理步骤的条件、幼兔补体含量、分析孵育长度及HL60与细菌的比率略微变化，且根据所使用的分析菌株优化。随后，向各孔中添加10μl 2-6％补体(幼兔血清，Pel-Freez)及10μL的HL-60细胞(以100-200:1比率)，且在5％CO₂培养箱中在37℃下在2000rpm下振荡混合物45-60min。将各50μL反应物的10μL转移至含有50μL水的预润湿的384孔Millipore MultiScreen HTS HV过滤器板的相应孔中。在真空过滤液体之后，施加50μL的50％DMEM且过滤，且板在密封拉链袋中在37℃下孵育过夜。次日，在用考马斯染料染色后，使用分析仪及ImmunoCapture软件对菌落进行计数。为了确定OPA活性的特异性，在调理步骤之前，将免疫血清与20μg/mL同源血清型纯化的O-抗原一起预孵育。OPA分析包括不具有HL60细胞或补体的对照反应，以证明任何观察到的杀伤对这些组分的依赖性。使用可变斜率曲线拟合(Excel)计算个体血清OPA效价。使用GraphPad Prism绘制组合的数据，以产生GMT和相关显著性p值(具有来自经对数转换数据的韦尔奇氏校正的未配对t检验)。

结果

小鼠免疫原性研究.第一研究经设计以评估在不同剂量水平下且在不同佐剂下自大肠杆菌胞外质表达及纯化的重组FimH_LD抗原的免疫原性。FimH_LD的纯化基于先前已描述的方法(Schembri MA,Hasman H,Klemm P.Expression and purification of themannose recognition domain of the FimH adhesin.FEMS microbiology letters2000；188:147-51)。第二研究比较大肠杆菌FimH_LD与哺乳动物表达的FimH_LD及全长FimH-DsG变体的活性。最终，第三研究探究FimH-DSG与4价长O-抗原糖缀合物混合物及不同佐剂制剂的组合的免疫原性。

FimH抗原的免疫原性.使用与先前基于大肠杆菌对表面固定的酵母菌甘露聚糖(Kisiela DI,Avagyan H,Friend D,等人,Inhibition and Reversal of MicrobialAttachment by an Antibody with Parasteric Activity against the FimH Adhesinof Uropathogenic E.coli.PLOS Pathogens 2015；11:e1004857)或膀胱上皮细胞(Langermann S,Palaszynski S,Barnhart M等人,Prevention of mucosal Escherichiacoli infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination.Science 1997；276:607-11；Starks CM,Miller MM,Broglie PM等人,Optimization and Qualification ofan Assay that Demonstrates that a FimH Vaccine Induces Functional AntibodyResponses in Women with Histories of Urinary Tract Infections.Human Vaccines&Immunotherapeutics 2020:1-10)的结合的抑制类似的中和分析所描述的那些来评定由各种FimH构建体诱发的功能性抗FimH抗体的诱导。通过确定防止伞毛化细菌结合至酵母菌甘露糖甘配体的血清中和效价来定量抗原变体的功能效能。效价经定义为在疫苗接种动物血清的八点两倍滴定中，50％细菌结合至分析孔板时的血清稀释的倒数。使用从大肠杆菌纯化的FimH_LD抗原的初步研究的结果展示于图36A和图36B以及表34中。疫苗接种的时程展示于图36A中，且个体小鼠反应绘制于图36B中。

小鼠免疫原性实验1-比较不同大肠杆菌周质产生的FimH构建体.在用三个3μg剂量的FimH_LD抗原疫苗接种之后，在无佐剂组中或接受50μgAlPO₄佐剂的组中仅25％小鼠在酵母菌甘露聚糖分析中产生中和抗体效价。相比之下，在接受20μg QS21/PS80佐剂组中的61％小鼠产生中和效价。在此情况下，几何平均效价(GMT)比其他组高5倍(p值<0.05)。在具有QS21/PS80的30μg FimH_LD剂量水平下，观察到GMT和78％血清反应者比率再增加三倍。在此佐剂情形下，经设计和预测通过将FimH_LD抗原锁定于开放构型中以增强功能性免疫原性的二硫键突变的存在(Rodriguez VB,Kidd BA,Interlandi G等人,Allosteric couplingin the bacterial adhesive protein FimH.J Biol Chem 2013；288:24128-39；KisielaDI,Rodriguez VB,Tchesnokova V等人,Conformational inactivation inducesimmunogenicity of the receptor-binding pocket of a bacterialadhesin.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 2013；110:19089-94)与野生型FimH_LD构建体相比未改进免疫原性。观察到与接近统计显著性(p＝0.09)的野生型相比，锁突变体的GMT低约三倍。此研究的关键观察结果为大肠杆菌FimH_LD抗原需要强效QS21佐剂制剂以引发小鼠中的稳固的中和抗体含量。

表34.VAC-2019-PRL-EC-1369中和效价GMT及反应者比率

疫苗接种组	反应者％	反应者数目	几何平均(IC₅₀)效价
				3ug FimH_LD无佐剂	25	3/12	88
3ug FimH_LDAlPO₄	25	5/20	93
				3ug FimH_LDQS21/PS80	61	11/18	495
30ug FimH_LDQS21/PS80	78	14/18	1486
				30ug FimH_LDLM^a-QS21	58	11/19	459

a.LM为二硫键锁突变V48C L55C

与哺乳动物产生FimH构建体相比周质的免疫原性.在第二研究中，将在大肠杆菌中表达的FimH_LD及全长FimH蛋白质的免疫原性与在Expi293哺乳动物细胞中表达的类似变体进行比较。将与其周质伴随蛋白FimC复合的大肠杆菌表达的全长FimH用作基准。在三个疫苗接种之后，比较通过在具有或不具有锁突变的情况下大肠杆菌相对于哺乳动物表达的抗原诱导的功能性抗体的相对含量的中和数据展示于图37A和图37B以及表35中。根据图37B中所示的方案，抗原以10μg，各具有20μg QS21/PS80，进行给予。大肠杆菌表达的FimH_LD小鼠组得到300的中和分析GMT和55％反应者比率，其在统计学上没有不同于类似哺乳动物表达的FimH_LD组(其中GMT为194且45％反应者比率)。哺乳动物全长FimH-DSG比其FimH_LD对应体具有更显著的免疫原性，展现出两倍高的GMT(529相对于194)及增加的血清反应者比率(75％相对于45％)。如同第一研究，在FimH_LD(经大肠杆菌或哺乳动物表达)或全长FimH-DSG的情形下，锁突变的存在就产生功能性中和反应而言无益处。哺乳动物表达的FimH-DSG(在具有或不具有锁突变的情况下)还呈现为比大肠杆菌FimCH抗原具有更高免疫原性，尽管差异在统计学上并不显著。综合而言，这些结果鉴别全长FimH-DSG作为后续探究选择的抗原。推测此构建体中的与C端FimG供体链肽复合的FimH菌毛蛋白域的存在可提供额外功能性表位和/或增强的稳定性。

表35.VAC-2019-PRL-EC-1438中和效价GMT及反应者比率

疫苗接种组	反应者％	反应者数目	几何平均(IC₅₀)效价
				周质-FimH_LD	55	11/20	300
周质-FimH_LD-LM	40	8/20	254
				哺乳动物-FimH_LD	45	9/20	194
哺乳动物-FimH_LD-LM	10	2/20	73
				哺乳动物FimH-DSG	75	15/20	529
哺乳动物FimH-DSG-LM	80	16/20	579
				周质-FimCH	67	12/18	354

小鼠中的共调配的哺乳动物产生的FimH-DSG和4价O-抗原糖缀合物的免疫原性.第三小鼠研究经设计以评定组合的O-抗原及佐剂制剂对FimH-DSG免疫原性的影响。将代表四种最普遍血清型O25b、O1a、O2和O6的CRM₁₉₇的长O-抗原糖缀合物混合且以2μg的剂量施用，各自作为基线对照组(图38)。其他疫苗组评估对单独或与四价O-抗原组合的具有10μgFimH-DSG的三种佐剂的免疫原性的影响。佐剂为预设20μgQS21/PS80每剂量制剂(用于FimH研究1和2)；脂质体合成性MPLA制剂(5μg每剂量)；以及脂质体合成性MPLA/QS21制剂(以5μg各每剂量)。在给药后2(PD2)及给药后3(PD3)时间点在功能性FimH中和及O-抗原特异性调理吞噬(OPA)分析中测试血清。

在PD2和PD3时间点的酵母菌甘露聚糖FimH结合中和分析的结果展示于图39A和图39B中，其中GMT和反应者比率概述于表36中。

表36.VAC-2020-PRL-EC-1679组合研究酵母菌甘露聚糖结合中和分析反应者比率和GMT.

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由于在先前实验中在两个剂量之后对个体FimH及单价血清型O25b抗原的抗体反应为次最大的，预期PD2时间点将最佳区分疫苗抗原及佐剂组合物作用。实际上，截至PD3反应者比率及FimH中和GMT在任一组之间无显著差异(p>0.05)。在PD2时，脂质体佐剂制剂对使用单独FimH-DSG的组无显著影响。相比之下，与疫苗接种脂质体MPLA/QS21的小鼠组或单独FimH-DSG中的任一个组相比，对于疫苗接种组合的FimH-DSG/O-抗原的组，在使用无佐剂或脂质体MPLA组中观察到显著更低的FimH中和GMT。还测试PD1血清，但小鼠中无一种表达出中和效价。

膀胱细胞结合中和分析用于测试在PD2和PD3时间点时从各疫苗组合并的血清。膀胱5637细胞组成性地表达作为用于FimH的天然配体的甘露糖基化尿溶蛋白受体UPIa(Thumbikat P,Berry RE,Zhou G等人,Bacteria-induced uroplakin signalingmediates bladder response to infection.PLoS pathogens 2009；5:e1000415-e；-Prastowska I,Lis J,Matejuk A.Glycosylation of uroplakins.Implicationsfor bladder physiopathology.Glycoconjugate journal 2014；31:623-36)。展示于图40A和图40B以及表37中的结果与使用个体血清进行的酵母菌甘露聚糖中和分析的发现一致。同样，用脂质体MPLA或不使用佐剂调配的组合的FimH-DSG/O-抗原比脂质体MPLA/QS21组产生显著较弱的中和反应，该脂质体MPLA/QS21组类似于疫苗接种QS21/PS80或脂质体MPLA/QS21和无O-抗原的FimH-DSG的小鼠组反应。甘露聚糖与膀胱中和分析数据之间的微小差异为后者倾向于与针对疫苗接种仅FimH-DSG或组合的FimH-DSG/O-抗原的组的脂质体MPLA制剂产生较弱反应。

表37.在小鼠血清池下VAC-2020-PRL-EC-1679膀胱细胞中和效价

疫苗接种组	PD2 IC50	PD3 IC50
			4V O-Ag	无活性	无活性
FimH-DSG QS21	3656	1140
			FimH-DSG MPLA	775	750-1000^a
FimH-DSG MPLA/QS21	2458	1198
			FimH-DSG+4V O-Ag无佐剂	337	1177
FimH-DSG+4V O-Ag MPLA	无活性	434
			FimH-DSG+4V O-Ag MPLA/QS21	3447	931
兔血清对照	3266	3809

a.归因于双相曲线与可变斜率方程的不良拟合的IC₅₀效价评估值。

在使用单独或与FimH-DSG和脂质体佐剂组合的4价O-抗原疫苗接种四个小鼠组之后使用4-plex dLIA产生的O-抗原特异性总IgG的含量展示于图41和表38中。在两个剂量之后血清型O25b特异性IgG反应明显地低于通过血清型O1a、O2和O6 O-抗原引发的那些反应，与使用单价O-抗原进行的先前缀合物化学研究(未示出)及使用四价生物缀合物O-抗原的报导的临床前研究的结果一致(van den Dobbelsteen G,FaéKC,Serroyen J等人,Immunogenicity and safety of a tetravalent E.coli O-antigen bioconjugatevaccine in animal models.Vaccine 2016；34:4152-60)。在无佐剂的FimH-DSG和O-抗原组合的情况下观察到在PD2时O25b组中的抗O-Ag IgG的最低含量，仅产生单个效价超过基线IgG反应者临界值的五倍；相比之下，尽管仅无佐剂的O-抗原组产生56％的更高反应者比率(5/9)，但两个组之间的GMT差异(0.79相对于0.24μg/mL IgG)在统计学上并不显著(p>0.5)。在PD2时，脂质体MPLA/QS21佐剂通过诱导GMT增加16倍(3.84相对于0.24)且提高反应者比率(70％相对于10％)而显著增强FimH-DSG和O-抗原组合的免疫原性；还在PD3时观察到GMT显著增加(40.78相对于3.75)。反应者经定义为具有产生符合可变斜率曲线拟合准则的完全稀释依赖性杀伤反应的血清的小鼠。尽管对于血清型O25b各组之间反应者比率及效价更高，但对于FimH-DSG及O-抗原组合的血清型O1a IgG效价还通过脂质体MPLA/QS21在PD2及PD3时分别显著提高5.9及4.6倍。由于疫苗接种组之间的GMT的总体差异较小，MPLA/QS21对O2及O6 O-抗原的影响不如O1a及O25b明显。

表38.VAC-2020-PRL-EC-1679：佐剂及FimH-DSG对O-抗原特异性血清IgG GMT的影响

使用侵袭性临床菌株在OPA分析中评定由4价组合物的个别O-抗原诱导的功能性杀菌抗体。OPA菌株的选择基于以下因子的组合：在体外生长条件和/或多药抗性下O-抗原和k-荚膜两者的表达；以及能够鉴别能够在中性粒细胞样HL60细胞和O-抗原特异性抗体存在下促进杀菌杀伤的兼容幼兔血清补体。尽管大肠杆菌O-抗原被视为用于预防血清补体的非特异性杀伤的主要决定因素，但K1、K2和K5荚膜抗原还表明在抗全血吞噬作用中起一定作用(Sarkar S,Ulett GC,Totsika M等人,Role of Capsule and O Antigen in theVirulence of Uropathogenic Escherichia coli.PLoS ONE 2014；9:e94786；Burns SM,Hull SI.Loss of resistance to ingestion and phagocytic killing by O(-)and K(-)mutants of a uropathogenic Escherichia coli O75:K5 strain.Infection andimmunity 1999；67:3757-62；Buckles EL,Wang X,Lane MC等人,Role of the K2 Capsulein Escherichia coli Urinary Tract Infection and Serum Resistance.The Journalof infectious diseases 2009；199:10.1086/598524)。

使用四种囊封O1a、O2、O6和O25b菌株以及两种多重抗药性未囊封O6和O25b菌株的OPA分析结果展示于图42及表39中。除展现出针对疫苗接种前血清的174的相对较高基线效价的O6:K-菌株分析之外，来自所有其他菌株的未接种疫苗的小鼠的血清产生的效价在分析检测极限(LOD)或100，即起始血清稀释。对四价O-抗原的个体OPA反应很大程度上与IgG结合抗体效价平行(图41，表38)。例如，在使用经囊封血清型O1a、O2及O6菌株的OPA中确认脂质体MPLA/QS21制剂对FimH-DSG 4价O-抗原组合的免疫原性的显著积极影响，这些OPA报导在两个疫苗剂量之后反应者比率为70％或更大。相比之下，仅在第三剂量之后，O25b:K5OPA菌株才报导到达使用MPLA/QS21制剂的此功能活性水平。与其囊封的O6:K1和O25b:K5对应物相比，未囊封的O6及O25b菌株产生更高OPA效价和反应者比率，尤其在疫苗接种单独O-抗原或组合的FimH-DSG/4价O-抗原的非佐剂小鼠组中。此更高敏感性与先前所示的不存在各别K2或K5荚膜一致，以赋予对吞噬作用的抗性(Burns SM,Hull SI.Loss of resistanceto ingestion and phagocytic killing by O(-)and K(-)mutants of a uropathogenicEscherichia coli O75:K5 strain.Infection and immunity 1999；67:3757-62；BucklesEL,Wang X,Lane MC等人,Role of the K2 Capsule in Escherichia coli UrinaryTract Infection and Serum Resistance.The Journal of infectious diseases 2009；199:10.1086/598524)。

表39.VAC-2020-PRL-EC-1679：佐剂和FimH-DSG对O-抗原特异性血清OPA GMT的影响

结论

综合而言，这些研究的结果支持哺乳动物产生的FimH-DSG(或衍生的突变体变体)与O-抗原糖缀合物以及QS21佐剂的组合作为用以预防侵袭性大肠杆菌感染的疫苗组合物的用途。此类制剂可有利于预防老年患者的反复性UTI感染和脓毒症。结果确认QS21佐剂用于增强对FimH-DSG及长O25b O-抗原的功能性免疫反应的益处，其与小鼠中类似的血清型O1a、O2和O6 O-抗原糖缀合物相比分别地具有更低的免疫原性。

实施例36：大肠杆菌血清型O8及O9 O-抗原的CRM₁₉₇缀合物引发的抗体展现出针对肺炎克雷伯氏杆菌血清型O5和O3侵袭性分离株的交叉保护杀细菌活性.

此实施例证实，大肠杆菌血清型O8和O9 O-抗原的短单端天然CRM₁₉₇多聚甘露糖缀合物引发的抗体具有针对表达等效或相关O-抗原的克雷伯氏杆菌O5和O3菌株的杀细菌及交叉保护作用。

大肠杆菌及肺炎克雷伯氏杆菌具有共同的多聚甘露糖O-抗原，其由高度同源的生物合成基因簇编码的酶合成。大肠杆菌O8及O9 O-抗原多糖为线性甘露糖均聚物，其重复单元在单糖键及残基数目有所不同。其在肺炎克雷伯氏杆菌中的对应物为血清型O5及O3 O-抗原。大肠杆菌及肺炎克雷伯氏杆菌多聚甘露糖O-抗原的生物合成涉及与其他大肠杆菌O-抗原不同的O单元易位和链合成机制。在此情况下，链延长由生物合成的WbdA-WbdD复合物调节(King JD,Berry S等人,Proceedings of the National Academy of Sciences2014；111:6407-12)，其不同于Wzx/Wzy依赖性路径，其中链长受WzzB或FepE酶控制。因此，天然多聚甘露糖O-抗原仅可以其短形式产生，需要与经工程化的长大肠杆菌O-抗原不同的生物过程方法进行纯化和载体蛋白质缀合。相同机制和限制适用于主要肺炎克雷伯氏杆菌血清型O1和O2 O-抗原，其为由半乳糖残基构成的聚半乳聚糖。

这些O-抗原及其亚型之间的结构关系展示于图33中。大肠杆菌O8和肺炎克雷伯氏杆菌O5 O-抗原为相同的(Vinogradov E等人,J Biol Chem 2002；277:25070-81)。大肠杆菌O9和肺炎克雷伯氏杆菌O3 O-抗原具有共同的四聚体O9a/O3a及五聚体O9/O3重复单元亚型，而三聚体O3b亚型仅在肺炎克雷伯氏杆菌中发现。这些亚型可通过血清学及基因型进行鉴别(Guachalla LM等人,Scientific Reports 2017；7:6635)。血清型O3a基因座通过wbdA中的单个点突变(C80R)来区分。大肠杆菌O9 wbdA酶中的类似点突变(C55R)将O9多糖转化为O9a(Kido N,Kobayashi H.Journal of bacteriology 2000；182:2567-73)。O3b亚型在WbdD酶的序列中具有足够的核苷酸差异，因此需要单独的参考序列。Kaptive网络算法(Wick RR等人,J Clin Microbiol 2018；56)，实施于Pfizer的BigSdb全基因组定序(WGS)管线中，将O3基因座指定为O3/O3a(由相同参考序列覆盖)或O3b。

材料及方法

a.在兔中产生大肠杆菌血清型O8和O9 CRM₁₉₇免疫血清

在Covance进行的研究中使用两组、每组四只雌性新西兰白兔。动物每剂量接受10μg/动物血清型O8或O9 CRM₁₉₇缀合物，以CFA/IFA作为佐剂。使用单端化学方法缀合天然O8和O9 O-抗原。各1mL剂量的10μg抗原分配至两个皮下疫苗接种部位。在第0、6及14周进行疫苗接种，在第7周和第15周抽血，其对应于给药后二(PD2)和给药后三(PD3)时间点。

b.细菌菌株

大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌临床分离株获自Pfizer赞助的抗微生物测试领导及监督(Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance，ATLAS)集合，其由国际健康管理协会(International Health Management Associates，IHMA)临床实验室维护。菌株通过使用Miseq平台(Illumina)的全基因组定序(WGS)进行基因型表征。WGS数据用于使用整合至BigDdb平台中的已建立的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌方案产生多焦点序列类型(MLST)信息(Wirth T等人,Molecular microbiology 2006；60:1136-51；Jolley KA等人,Wellcome Open Res 2018；3:124；Diancourt L等人,Journal of clinicalmicrobiology 2005；43:4178-82)。大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌的嵌入式计算机仿真血清分型算法用于预测O-抗原血清型(Wick RR等人,J Clin Microbiol 2018；56；JoensenKG等人,J Clin Microbiol 2015；53:2410-26)。

表40.用于O-抗原产生或杀细菌分析开发的临床分离株

ID	物种	MLST ST	血清型(亚型)	来源
					EC0130	大肠杆菌	162	O8	血液
EC0423	大肠杆菌	46	O9a	血液
					EC0305	大肠杆菌	448	O8	血液
KP0121	肺炎克雷伯氏杆菌	279	O5	血液
					EC0611	大肠杆菌	New	O9a	UTI，肾脏
KP0009	肺炎克雷伯氏杆菌	37	O3b	UTI，膀胱

c.大肠杆菌O8和O9 CRM₁₉₇缀合物

血清型O8和O9a O-抗原多糖分别从菌株EC0130和EC0423中提取且纯化(表40)。缀合过程涉及用二硫胺接头选择性活化短天然大肠杆菌O8和O9 O-抗原的还原端上存在的Kdo单糖。在暴露硫醇官能基后，随后将其与溴活化的CRM₁₉₇蛋白质缀合，如本文所描述的实施例26所描述。

d.杀细菌分析

预冷冻的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌储备液通过使菌株在DMEM或LB培养基中生长至OD₆₀₀在0.5至1.0之间来制备，且在冷冻之前添加甘油至最终浓度为20％。特定分析条件根据针对各细菌菌株优化的条件而变化。将滴定前解冻的细菌在OPA缓冲液(汉克氏平衡盐溶液(Life Technologies)和0.1％明胶)中稀释至1×10⁵CFU/ml，且将20μL(10³CFU)细菌悬浮液在室温下在组织培养孔板中用20μL连续稀释的血清调理30分钟。随后，向具有OPA缓冲液的各孔中添加10μl补体(幼兔血清或IgG/IgM耗乏人类血清，Pel-Freez)和20μL HL-60细胞(按100-200:1的比率)，以使最终体积为100μL。反应混合物在37℃下在5％CO₂培养箱中振荡60分钟。在一些情况下，细菌无需预调理步骤即可直接与补体和HL60组合，且在37℃、5％CO₂下振荡60分钟。在孵育后，将各反应物的10μL转移至含有100μL水的预润湿的Millipore MultiScreen HTS HV过滤板的相应孔中。在真空过滤液体之后，施加100μL的50％细菌生长培养基且过滤，且板在密封拉链袋中在37℃下孵育过夜。次日，在用考马斯染料染色后，使用分析仪和ImmunoCapture软件对小集落进行计数。在大肠杆菌血清型O9分析的情况下，OPA经微型化为384孔格式的50μL反应体积。为了确定OPA活性的特异性，在调理步骤之前，将免疫血清与经纯化的O-抗原多糖一起预孵育。OPA分析包括无HL60细胞或补体的对照反应，以证明任何观察到的杀伤对这些组分的依赖性。对于HL60的存在无影响的克雷伯氏杆菌血清型O5分析，在不存在效应细胞的情况下进行血清杀细菌反应。

结果

a.用于杀细菌分析的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌菌株选择

在通过LPS概况分析(通过SDS-PAGE)确认O-抗原表达及通过用O-抗原特异性兔抗血清进行流动式细胞测量术确认O-抗原表面可接近性之后，首先选择临床细菌菌株。接下来，对血清补体进行经验性筛选，以鉴别在一系列浓度内的个别兼容批次，这些批次提供低水平的非特异性杀伤以及在免疫血清存在下的高度敏感性的适当平衡。额外的分析优化参数包括调整HL60效应细胞与细菌的比率、振荡器速度、存在/不存在板密封物及包括调理预孵育步骤。

b.大肠杆菌O8和肺炎克雷伯氏杆菌O5 O-抗原免疫血清的交叉保护及特异性

选择大肠杆菌O8菌株EC0305和肺炎克雷伯氏杆菌O5菌株KP0121进行分析开发。两者均为血液分离株。EC0305对头孢菌素和四环素具有耐受性，而KP0121对氨苄青霉素具有耐受性。开发用于大肠杆菌O8菌株EC0305的OPA分析，条件包括3.0％ BRC、1:100的细菌与HL60的比率及单步60分钟OPA孵育反应。由于发现肺炎克雷伯氏杆菌O5菌株KP0121在免疫血清存在下的杀细菌活性与HL60效应细胞无关，因此开发SBA。在此情况下，SBA反应需要使用10％耗乏的人类血清用作补体来源。用这些大肠杆菌O8和肺炎克雷伯氏杆菌O5菌株进行杀细菌分析的结果显示于图34A-34B中。在大肠杆菌血清型O8 OPA中，在两个剂量的O8-CRM₁₉₇缀合物后产生的兔免疫血清展现出强效的O-抗原特异性杀伤，其通过用游离O8 O-抗原多糖预吸附免疫血清而阻断。在血清稀释低于1:1000时，观察到完全杀伤。来自同一只兔的匹配免疫前血清为无活性的。相同的兔血清在肺炎克雷伯氏杆菌O5 SBA中进行评估，且发现在1:2000的血清稀释下具有类似的杀细菌作用。杀伤经游离O8 O-抗原阻断，且免疫前血清不存在杀伤。在此情况下，血清基质前区在低于1:1000的血清稀释下掩盖SBA活性。

c.大肠杆菌O9和肺炎克雷伯氏杆菌O3 OPA O-抗原免疫血清交叉保护及特异性

选择大肠杆菌O9a菌株EC0611和肺炎克雷伯氏杆菌O3b菌株KP0009进行分析开发。EC0611对氨苄青霉素具有耐受性，而KP0009对头孢菌素、氟喹诺酮和四环素具有耐受性。两者分别为来自肾脏和膀胱感染的UTI分离株。用于产生CRM₁₉₇缀合物的O9a O-抗原及所得免疫血清具有四聚体多聚甘露糖重复单元结构且与O9a EC0611分析菌株O-抗原相同；然而，其与肺炎克雷伯氏杆菌O3b O-抗原KP0009分析菌株在结构上为异源的，该菌株基于其wbdD基因的序列经预测表达较短三聚体重复单元(参见图33)。大肠杆菌O9a和肺炎克雷伯氏杆菌O3b菌株的OPA结果显示，抗大肠杆菌O9a免疫血清针对两者均有效(图35A-35B)。对于大肠杆菌O9a菌株，在血清稀释低于1:8,000时及对于克雷伯氏杆菌O3b菌株，在血清稀释低于1:1,600时，观察到OPA的完全杀伤。通过在用游离O9a O-抗原及匹配的免疫前血清对血清进行预吸附后缺乏活性来证明特异性。

结论

大肠杆菌血清型O8和O9多聚甘露糖CRM₁₉₇缀合物引发功能性抗体，其不仅能够在杀细菌分析中杀伤同源大肠杆菌临床菌株，且还杀伤克雷伯氏杆菌血清型O5和O3菌株。结果证实，这些缀合物引发的抗体对表达结构上相关的多聚甘露糖O-抗原的两个物种的分离株均具有交叉保护作用。

以下条项描述本发明的其他实施方案：

C1.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含选自以下中的任一个的结构的糖：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为1至100的整数。

C2.如条项C1的组合物，其中该糖包含选自以下的结构：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O21、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D₁、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167和式O172，其中n为20至100的整数。

C3.如条项C2的组合物，其中该糖包含选自以下的结构：式O1(例如，式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(例如，式O4:K52和式O4:K6)、式O5(例如，式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(例如，式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O21、式O23(例如，式O23A)、式O24、式O25(例如，式O25a和式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(例如，式O45和式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(例如，式O73(菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173和式62D₁，其中n为20至100的整数。

C4.如条项C2的组合物，其包含选自以下的结构：式O1(例如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O6(例如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O15、式O16、式O21、式O25(例如式O25a和式O25b)和式O75。

C5.如条项C2的组合物，其包含选自式O4、式O11、式O21和式O75的结构。

C6.如条项C1的组合物，其中该糖不包含选自以下的结构：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101。

C7.如条项C1的组合物，其中该糖不包含选自式O12的结构。

C8.如条项C4的组合物，其中该糖通过在革兰氏阴性细菌中表达wzz家族蛋白质以产生该糖而产生。

C9.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质选自由以下组成的组：wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2。

C10.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质为wzzB。

C11.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质为fepE。

C12.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质为wzzB和fepE。

C13.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质衍生自肠道沙门氏菌。

C14.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质包含选自以下中的任一个的序列：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。

C15.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质包含与以下中的任一个具有至少90％序列同一性的序列：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34。

C16.如条项C8的组合物，其中该wzz家族蛋白质包含选自以下中的任一个的序列：SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。

C17.如条项C1的组合物，其中该糖以合成方式合成。

C18.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌R1部分。

C19.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌R2部分。

C20.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌R3部分。

C21.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌R4部分。

C22.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌K-12部分。

C23.如条项C1至C22中任一项的组合物，其中该糖进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C24.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R1部分。

C25.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C26.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R3部分。

C27.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R4部分。

C28.如条项C1至C17中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌K-12部分。

C29.如条项C1至C22中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C30.如条项C1至C23中任一项的组合物，其中该糖不包含脂质A。

C31.如条项C1至C30中任一项的组合物，其中该多糖的分子量在10kDa至2,000kDa之间或在50kDa至2,000kDa之间。

C32.如条项C1至C31中任一项的组合物，其中该糖的平均分子量为20-40kDa。

C33.如条项C1至C32中任一项的组合物，其中该糖的平均分子量为40,000至60,000kDa。

C34.如条项C1至C33中任一项的组合物，其中n为整数31至90。

C35.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖衍生自大肠杆菌。

C36.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含与载体蛋白质共价结合的如条项C1至条项C34中任一项的糖的缀合物。

C37.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及如条项C35至条项C36中任一项的缀合物，其中该载体蛋白质选自以下中的任一个：聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。

C38.如条项C35至条项C37中任一项的组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C39.如条项C35至条项C37中任一项的组合物，其中该载体蛋白质为破伤风类毒素(TT)。

C40.如条项C35至条项C37中任一项的组合物，其中该载体蛋白质为聚(L-赖氨酸)。

C41.如条项C35至条项C39中任一项的组合物，其中该缀合物通过还原氨基化来制备。

C42.如条项C35至条项C39中任一项的组合物，其中该缀合物通过CDAP化学方法来制备。

C43.如条项C35至条项C39中任一项的组合物，其中该缀合物为单端连接的缀合糖。

C44.如条项C35至条项C39中任一项的组合物，其中该糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与该载体蛋白质缀合。

C45.如条项C44的组合物，其中该糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与该载体蛋白质缀合，其中该糖经由氨基甲酸酯键与该eTEC间隔基共价连接，且其中该载体蛋白质经由酰胺键与该eTEC间隔基共价连接。

C46.如条项C44至条项C45中任一项的组合物，其中该CRM₁₉₇包含经由eTEC间隔基与该多糖共价连接的2至20或4至16个赖氨酸残基。

C47.如条项C35至条项C46中任一项的组合物，其中该糖:载体蛋白质比率(w/w)在0.2与4之间。

C48.如条项C35至条项C46中任一项的组合物，其中该糖与蛋白质的比率为至少0.5及至多2。

C49.如条项C35至条项C46中任一项的组合物，其中该糖与蛋白质的比率在0.4与1.7之间。

C50.如条项C43至条项C49中任一项的组合物，其中该糖经由3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与该载体蛋白质缀合。

C51.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中该糖包含选自以下的结构：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101，其中n为整数1至10。

C52.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及如条项C1至条项C34中任一项的糖，以及药学上可接受的稀释剂。

C53.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及如条项C35至条项C51中任一项的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂。

C54.如条项C53的组合物，其包含与该组合物中糖的总量相比至多约25％的游离糖。

C55.如条项C52至条项C53中任一项的组合物，其进一步包含佐剂。

C56.如条项C52至条项C53中任一项的组合物，其进一步包含铝。

C57.如条项C52至条项C53中任一项的组合物，其进一步包含QS-21。

C58.如条项C52至条项C53中任一项的组合物，其进一步包含CpG寡核苷酸。

C59.如条项C52至条项C53中任一项的组合物，其中该组合物不包括佐剂。

C60.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及衍生自大肠杆菌、经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合的糖，其中该多糖经由氨基甲酸酯键与该eTEC间隔基共价连接，且其中该载体蛋白质经由酰胺键与该eTEC间隔基共价连接。

C61.如条项C60的组合物，其中该糖为衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C62.如条项C60的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。

C63.如条项C60的组合物，其中该糖为衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C64.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合的如条项C1至条项C17中任一项的糖，其中该多糖经由氨基甲酸酯键与该eTEC间隔基共价连接，且其中该载体蛋白质经由酰胺键与该eTEC间隔基共价连接。

C65.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及(i)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O1A抗原的缀合物，(iii)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O2抗原的缀合物，以及(iv)与载体蛋白质共价偶联的O6抗原的缀合物，其中该大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构，其中n为大于30的整数。

C66.如条项C65的组合物，其中该载体蛋白质选自以下中的任一个：聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。

C67.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及(i)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O4抗原的缀合物，(iii)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O11抗原的缀合物，以及(iv)与载体蛋白质共价偶联的O21抗原的缀合物，其中该大肠杆菌O25B抗原包含式O75的结构，其中n为大于30的整数。

C68.如条项C67的组合物，其中该载体蛋白质选自以下中的任一个：聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。

C69.一种制备组合物的方法，该组合物包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合的糖的缀合物，该方法包括以下步骤：a)使糖与1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)在有机溶剂中反应，以产生活化的糖；b)使该活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应，以产生硫醇化糖；c)使该硫醇化糖与还原剂反应，以产生包含一个或多个游离巯基残基的活化的硫醇化糖；d)使该活化的硫醇化糖与包含一个或多个α-卤基乙酰胺基团的活化的载体蛋白质反应，以产生硫醇化糖-载体蛋白质缀合物；以及e)使该硫醇化糖-载体蛋白质缀合物与(i)能够封端该活化的载体蛋白质的未缀合的α-卤基乙酰胺基团的第一封端试剂；和/或(ii)能够封端未缀合的游离巯基残基的第二封端试剂反应；由此产生eTEC连接的糖缀合物，其中该糖衍生自大肠杆菌；该方法进一步包含在重组哺乳动物细胞中表达编码衍生自FimH的多肽或其片段的多核苷酸，且分离该多肽或其片段。

C70.如条项C69的方法，其包括制备如条项C1至条项C34中任一项的组合物。

C71.如条项C69至条项C70中任一项的方法，其中封端步骤e)包含使该硫醇化糖-载体蛋白质缀合物与(i)作为第一封端试剂的N-乙酰基-L-半胱氨酸，和/或(ii)作为第二封端试剂的碘乙酰胺反应。

C72.如条项C69至条项C71中任一项的方法，其进一步包含通过与三唑或咪唑反应而使糖混配以得到混配糖的步骤，其中该混配糖经壳冻、冻干且在步骤a)之前在有机溶剂中重构。

C73.如条项C69至条项C72中任一项的方法，其进一步包含纯化在步骤c)中产生的硫醇化多糖，其中纯化步骤包含透滤。

C74.如条项C69至条项C73中任一项的方法，其中该方法进一步包含通过透滤纯化该eTEC连接的糖缀合物。

C75.如条项C69至条项C74中任一项的方法，其中步骤a)中的该有机溶剂为选自以下中的任一个的极性非质子溶剂：二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)和六甲基磷酰胺(HMPA)或其混合物。

C76.一种培养基，其包含KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

C77.如条项C76的培养基，其中该培养基用于培养大肠杆菌。

C78.一种用于产生如条项C1至条项C34中任一项的糖的方法，其包括在培养基中培养重组大肠杆菌；通过在该培养基中培养该细胞来产生该糖；由此该细胞产生该糖。

C79.如条项C78的方法，其中该培养基包含选自以下中的任一个的元素：KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

C80.如条项C78的方法，其中该培养基包含大豆水解产物。

C81.如条项C78的方法，其中该培养基包含酵母提取物。

C82.如条项C78的方法，其中该培养基不进一步包含大豆水解产物和酵母提取物。

C83.如条项C78的方法，其中该大肠杆菌细胞包含选自以下中的任一个的异源wzz家族蛋白质：wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2。

C84.如条项C78的方法，其中该大肠杆菌细胞包含选自以下中的任一个的肠道沙门氏菌wzz家族蛋白质：wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2。

C85.如条项C84的方法，其中该wzz家族蛋白质包含选自以下中的任一个的序列：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。

C86.如条项C78的方法，其中该培养产生的产率为>120OD₆₀₀/mL。

C87.如条项C78的方法，其进一步包含纯化该糖。

C88.如条项C78的方法，其中该纯化步骤包含以下中的任一个：透析、浓缩操作、透滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深度过滤和柱层析(离子交换层析、多模式离子交换层析、DEAE和疏水相互作用层析)。

C89.一种用于在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包括向受试者施用如条项C1至条项C68中任一项的组合物。

C90.如条项C89的方法，其中该免疫反应包含诱导抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体。

C91.如条项C89的方法，其中该免疫反应包含诱导抗大肠杆菌IgG抗体。

C92.如条项C89的方法，其中该免疫反应包含诱导针对大肠杆菌的杀细菌活性。

C93.如条项C89的方法，其中该免疫反应包含诱导针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C94.如条项C89的方法，其中该免疫反应包含在初始给药后至少1,000至200,000的几何平均效价(GMT)水平。

C95.如条项C89的方法，其中该组合物包含：包含式O25的糖，其中n为整数40至100，其中该免疫反应包含在初始给药后至少1,000至200,000的几何平均效价(GMT)水平。

C96.如条项C89的方法，其中该哺乳动物处于选自以下的病况中的任一个的风险下：泌尿道感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血尿毒综合征、新生儿脑膜炎、尿路性脓毒症、腹内感染、脑膜炎、复杂性肺炎、伤口感染、前列腺活检后相关感染、新生儿/婴儿脓毒症、中性粒细胞减少性发热和其他血流感染；肺炎、菌血症和脓毒症。

C97.如条项C89的方法，其中该哺乳动物患有选自以下的病况中的任一个：泌尿道感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血尿毒综合征、新生儿脑膜炎、尿路性脓毒症、腹内感染、脑膜炎、复杂性肺炎、伤口感染、前列腺活检后相关感染、新生儿/婴儿脓毒症、中性粒细胞减少性发热和其他血流感染；肺炎、菌血症和脓毒症。

C98.一种方法，其用于(i)诱导受试者针对肠外病原性大肠杆菌的免疫反应，(ii)诱导受试者针对肠外病原性大肠杆菌的免疫反应，或(iii)诱导受试者产生对肠外病原性大肠杆菌具有特异性的调理吞噬抗体，其中该方法包括向该受试者施用有效量的如条项C1至条项C68中任一项的组合物。

C99.如条项C98的方法，其中该受试者处于发展泌尿道感染的风险下。

C100.如条项C98的方法，其中该受试者处于发展菌血症的风险下。

C101.如条项C98的方法，其中该受试者处于发展脓毒症的风险下。

C102.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及(i)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O1A抗原的缀合物，(iii)与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌O2抗原的缀合物，以及(iv)与载体蛋白质共价偶联的O6抗原的缀合物，其中该大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构，其中n为大于30的整数。

C103.如条项C102的组合物，其中该载体蛋白质选自由以下组成的组：聚(L-赖氨酸)、绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、CRM₁₉₇、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。

C104.一种方法，其用于(i)诱导受试者针对肠外病原性大肠杆菌的免疫反应，(ii)诱导受试者针对肠外病原性大肠杆菌的免疫反应，或(iii)诱导受试者产生对肠外病原性大肠杆菌具有特异性的调理吞噬抗体，其中该方法包括向该受试者施用有效量的如条项C1的组合物。

C105.如条项C104的方法，其中该受试者处于发展泌尿道感染的风险下。

C106.如条项C104的方法，其中该受试者处于发展菌血症的风险下。

C107.如条项C104的方法，其中该受试者处于发展脓毒症的风险下。

C108.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含与大肠杆菌的相应野生型O-多糖相比增加至少5个重复单元的糖。

C109.如条项C108的组合物，其中该糖包含式O25a，且该大肠杆菌为大肠杆菌血清型O25a。

C110.如条项C108的组合物，其中该糖包含式O25b，且该大肠杆菌为大肠杆菌血清型O25b。

C111.如条项C108的组合物，其中该糖包含式O2，且该大肠杆菌为大肠杆菌血清型O2。

C112.如条项C108的组合物，其中该糖包含式O6，且该大肠杆菌为大肠杆菌血清型O6。

C113.如条项C108的组合物，其中该糖包含式O1，且该大肠杆菌为大肠杆菌血清型O1。

C114.如条项C108的组合物，其中该糖包含式O17，且该大肠杆菌为大肠杆菌血清型O17。

C115.如条项C108的组合物，其中该糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为5至1000的整数。

C116.如条项C108的组合物，其中该大肠杆菌为选自由以下组成的组的大肠杆菌血清型：O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O25b、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

C117.如条项C108的组合物，其中该糖通过增加由革兰氏阴性细菌在培养中产生的O-多糖的重复单元而产生，包含在革兰氏阴性细菌中过度表达wzz家族蛋白质以产生该糖。

C118.如条项C117的组合物，其中该过度表达的wzz家族蛋白质选自由以下组成的组：wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1及wzz2。

C119.如条项C117的组合物，其中该过度表达的wzz家族蛋白质为wzzB。

C120.如条项C117的组合物，其中该过度表达的wzz家族蛋白质为fepE。

C121.如条项C117的组合物，其中该过度表达的wzz家族蛋白质为wzzB和fepE。

C122.如条项C108的组合物，其中该糖以合成方式合成。

C123.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含与载体蛋白质共价结合的如条项C108的糖的缀合物。

C124.如条项C123的组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C125.如条项C123的组合物，其中该糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为5至1000的整数。

C126.如条项C123的组合物，其中该糖包含与相应的野生型O-多糖相比，增加至少5个重复单元。

C127.如条项C1的组合物，其进一步包含药学上可接受的稀释剂。

C128.如条项C127的组合物，其进一步包含佐剂。

C129.如条项C127的组合物，其进一步包含铝。

C130.如条项C127的组合物，其进一步包含QS-21。

C131.如条项C127的组合物，其中该组合物不包括佐剂。

C132.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，其包括向该受试者施用如条项C127的组合物。

C133.如条项C123的组合物，其进一步包含药学上可接受的稀释剂。

C134.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，其包括向该受试者施用如条项C133的组合物。

C135.如条项C132或C134的方法，其中该免疫反应包含诱导抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体。

C136.如条项C135的方法，其中该抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体为IgG抗体。

C137.如条项C135的方法，其中该抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体为具有针对大肠杆菌的杀细菌活性的IgG抗体。

C138.一种免疫原性组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及衍生自大肠杆菌、经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质缀合的糖，其中该多糖经由氨基甲酸酯键与该eTEC间隔基共价连接，且其中该载体蛋白质经由酰胺键与该eTEC间隔基共价连接。

C139.如条项C138的免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。

C140.如条项C138的免疫原性组合物，其中该糖为衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C141.如条项C138的免疫原性组合物，其中该糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为5至1000的整数。

C142.如条项C138的免疫原性组合物，其中该糖的O-乙酰化程度在75-100％之间。

C143.如条项C138的免疫原性组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C144.如条项C143的免疫原性组合物，其中该CRM197包含经由eTEC间隔基与该多糖共价连接的2至20个赖氨酸残基。

C145.如条项C143的免疫原性组合物，其中该CRM197包含经由eTEC间隔基与该多糖共价连接的4至16个赖氨酸残基。

C146.如条项C138的免疫原性组合物，其进一步包含额外抗原。

C147.如条项C138的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

C148.如条项C147的免疫原性组合物，其中该佐剂为选自由磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝组成的组的基于铝的佐剂。

C149.如条项C138的免疫原性组合物，其中该组合物不包含佐剂。

C150.一种免疫原性组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含与载体蛋白质缀合的衍生自大肠杆菌的糖的糖缀合物，其中该糖缀合物使用还原氨基化来制备。

C151.如条项C150的免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。

C152.如条项C150的免疫原性组合物，其中该糖为衍生自大肠杆菌的O-抗原。

C153.如条项C150的免疫原性组合物，其中该糖包含选自以下的结构：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n为5至1000的整数。

C154.如条项C150的免疫原性组合物，其中该糖的O-乙酰化程度在75-100％之间。

C155.如条项C150的免疫原性组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C156.如条项C150的免疫原性组合物，其进一步包含额外抗原。

C157.如条项C150的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

C158.如条项C157的免疫原性组合物，其中该佐剂为选自由磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝组成的组的基于铝的佐剂。

C159.如条项C150的免疫原性组合物，其中该组合物不包含佐剂。

C160.一种用于诱导受试者的免疫反应的方法，其包括向该受试者施用如条项C138至C159中任一项的组合物。

C161.如条项C160的方法，其中该免疫反应包含诱导抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体。

C162.如条项C135的方法，其中该抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体为IgG抗体。

C163.如条项C135的方法，其中该抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体为具有针对大肠杆菌的杀细菌活性的IgG抗体。

C164.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含选自以下中的任一个的结构的糖：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187，其中n大于相应野生型大肠杆菌多糖中的重复单元数目。

C165.如条项C164的组合物，其中n为整数31至100。

C166.如条项C164的组合物，其中该糖包含根据式O1A、式O1B和式O1C、式O2、式O6和式O25B中的任一个的结构。

C167.如条项C164的组合物，其中该糖在重组宿主细胞中产生，该细胞表达与以下中的任一个具有至少90％序列同一性的wzz家族蛋白质：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38和SEQ ID NO:39。

C168.如条项C167的组合物，其中该蛋白质包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34中的任一个。

C169.如条项C164的糖，其中该糖以合成方式合成。

C170.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含与糖共价结合的载体蛋白质的缀合物，该糖包含选自以下中的任一个的结构：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186或式O187，其中n为1至100的整数。

C171.如条项C170的组合物，其中该糖包含以下式O25b、式O1A、式O2和式O6中的任一个。

C172.如条项C170的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分及大肠杆菌K-12部分中的任一个。

C173.如条项C170的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分及大肠杆菌K-12部分中的任一个。如条项C170的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C174.如条项C170的组合物，其中该糖进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C175.如条项C170的组合物，其中该载体蛋白质选自以下中的任一个：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。

C176.如条项C170的组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C177.如条项C170的组合物，其中该载体蛋白质为破伤风类毒素。

C178.如条项C170的组合物，其中该糖与蛋白质的比率为至少0.5至至多2。

C179.如条项C170的组合物，其中该缀合物经由还原氨基化来制备。

C180.如条项C170的组合物，其中该糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与该载体蛋白质缀合。

C181.如条项C170的组合物，其中该糖为单端连接的缀合糖。

C182.如条项C174的组合物，其中该糖经由3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与该载体蛋白质缀合。

C183.如条项C170的组合物，其中该缀合物经由CDAP化学方法来制备。

C184.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及(a)包含与包含式O25b的糖共价结合的载体蛋白质的缀合物，其中n为整数31至90，(b)包含与包含式O1A的糖共价结合的载体蛋白质的缀合物，其中n为整数31至90，(c)包含与包含式O2的糖共价结合的载体蛋白质的缀合物，其中n为整数31至90，以及(d)包含与包含式O6的糖共价结合的载体蛋白质的缀合物，其中n为整数31至90。

C185.如条项C184的组合物，其进一步包含：包含与糖共价结合的载体蛋白质的缀合物，该糖包含选自以下中的任一个的结构：式O15、式O16、式O17、式O18和式O75，其中n为整数31至90。

C186.如条项C184的组合物，其包含与该组合物中糖的总量相比至多25％的游离糖。

C187.一种引发哺乳动物针对大肠杆菌的免疫反应的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的如条项C184至C186中任一项的组合物。

C188.如条项C187的方法，其中该免疫反应包含针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C189.如条项C187的方法，其中该免疫反应保护该哺乳动物免受大肠杆菌感染。

C190.一种哺乳动物细胞，其包含(a)编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的第一相关基因，其中该基因整合在至少两个重组目标位点(RTS)之间。

C191.如条项C190的实施方案，其中该两个RTS染色体整合在NL1基因座或NL2基因座内。

C192.如条项C190的实施方案，其中该第一相关基因进一步包含报道基因、编码难以表达蛋白质的基因、辅助基因或其组合。

C193.如条项C190的实施方案，其进一步包含整合在不同于(a)的基因座的第二染色体基因座内的第二相关基因，其中该第二相关基因包含报道基因、编码难以表达蛋白质的基因、辅助基因或其组合。

C194.一种重组哺乳动物细胞，其包含编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的多核苷酸。

C195.如C194的重组细胞，其中该多肽衍生自大肠杆菌伞毛H(FimH)。

C196.如C195的重组细胞，其中该多肽在该多肽的N端处包含苯丙氨酸残基。

C197.如C195的重组细胞，其中该多肽在N端之前20个残基位置内包含苯丙氨酸残基。

C198.如C195的重组细胞，其中该多肽在该多肽的位置1处包含苯丙氨酸残基。

C199.如C198的重组细胞，其中该多肽在紧接该多肽的位置1处的苯丙氨酸残基之前不包含甘氨酸残基。

C200.如C195的重组细胞，其中该多肽在该多肽的位置7处不包含N-糖基化位点。

C201.如C199的重组细胞，其中该多肽在该多肽的位置7处不包含Asn残基。

C202.如C201的重组细胞，其中该多肽在位置7处包含选自由Ser、Asp、Thr和Gln组成的组的残基。

C203.如C198的重组细胞，其中该多肽在该多肽的位置70处不包含N-糖基化位点。

C204.如C203的重组细胞，其中该多肽在该多肽的位置70处不包含Asn残基。

C205.如C203的重组细胞，其中该多肽在该多肽的位置70处不包含Ser残基。

C206.如C194的重组细胞，其中该多肽在该多肽的N-糖基化位点处包含选自由Ser、Asp、Thr和Gln组成的组的残基取代。

C207.如C206的重组细胞，其中该N-糖基化位点包含该多肽的位置N235。

C208.如C206的重组细胞，其中该N-糖基化位点包含该多肽的位置N228。

C209.如C206的重组细胞，其中该N-糖基化位点包含该多肽的位置N235和位置N228。

C210.如C195的重组细胞，其中该多肽包含SEQ ID NO:3。

C211.如C195的重组细胞，其中该多肽包含SEQ ID NO:2。

C212.如C194的重组细胞，其中该多肽在该多肽的位置1处包含脂肪族疏水性氨基酸残基。

C213.如C212的重组细胞，其中该脂肪族疏水性氨基酸残基选自由Ile、Leu和Val组成的组。

C214.如C194的重组细胞，其中该多肽包含FimH的片段。

C215.如C214的重组细胞，其中该多肽包含FimH的凝集素域。

C216.如C215的重组细胞，其中该凝集素域包含约17022道尔顿的质量。

C217.如C194的重组细胞，其中该多肽与FimC多肽或其片段复合。

C218.如C217的重组细胞，其中该FimC多肽或其片段在该FimC多肽或其片段的位置37处包含甘氨酸残基。

C219.如C195的重组细胞，其中该多肽呈低亲和力构型。

C220.如C195的重组细胞，其中该多肽通过FimG稳定。

C221.如C195的重组细胞，其中该多肽通过FimG的供体链肽(DsG)稳定。

C222.如C221的重组细胞，其中该多核苷酸序列进一步编码接头序列。

C223.如C222的重组细胞，其中该接头包含至少4个氨基酸残基及至多15个氨基酸残基。

C224.如C222的重组细胞，其中该接头包含至少5个氨基酸残基及至多10个氨基酸残基。

C225.如C222的重组细胞，其中该接头包含7个氨基酸残基。

C226.如C194的重组细胞，其中该多肽不包含选自由以下组成的组的信号肽：天然FimH前导肽、流感血球凝集素信号肽及人类呼吸道合胞病毒A(病毒株A2)融合糖蛋白F0信号肽。

C227.如C194的重组细胞，其中该多肽包含鼠类IgK信号肽序列。

C228.如C194的重组细胞，其中该多肽包含选自人类IgG受体FcRn大亚单元p51信号肽及人类IL10蛋白质信号肽的任一信号肽序列。

C229.如C195的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:3的编号，该多肽在氨基酸位置60处包含精氨酸至脯氨酸的突变(R60P)。

C230.如C194的重组细胞，其中该多肽的表达量大于在野生型大肠杆菌细胞的周质中表达的相应野生型多肽的表达量。

C231.如C194的重组细胞，其中该多肽的表达量大于10mg/L。

C232.如C194的重组细胞，其中该多核苷酸序列整合至该哺乳动物细胞的基因组DNA中。

C233.如C194的重组细胞，其中该多核苷酸序列经密码子优化以在该细胞中表达。

C234.如C194的重组细胞，其中该细胞为人类胚胎肾细胞。

C235.如C234的重组细胞，其中该人类胚胎肾细胞包含HEK293细胞。

C236.如C235的重组细胞，其中该HEK293细胞选自HEK293T细胞、HEK293TS细胞及HEK293E细胞中的任一个。

C237.如C195的重组细胞，其中该细胞为CHO细胞。

C238.如C237的重组细胞，其中该CHO细胞为CHO-K1细胞、CHO-DUXB11、CHO-DG44细胞或CHO-S细胞。

C239.如C194的重组细胞，其中该多肽为可溶的。

C240.如C194的重组细胞，其中该多肽从该细胞分泌。

C241.如C195的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号，该多肽包含N28Q取代。

C242.如C195的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号，该多肽包含N28D取代。

C243.如C195的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号，该多肽包含N28S取代。

C244.如C195的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号，该多肽包含选自N28Q、V48C和L55C中的任一个的取代。

C245.如C195的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号，该多肽包含取代N92S。

C246.如C194的重组细胞，其中根据SEQ ID NO:1的编号，该衍生自FimH的多肽或其片段包含选自V48C和L55C中的任一个的取代。

C247.一种包含C194的重组细胞的培养物，其中该培养物的大小为至少5升。

C248.如C242的培养物，其中该多肽或其片段的产率为至少0.05g/L。

C249.如C248的培养物，其中该多肽或其片段的产率为至少0.10g/L。

C250.一种用于产生衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的方法，其包括在适合的条件下培养如C194的重组哺乳动物细胞，从而表达该多肽或其片段；以及收获该多肽或其片段。

C251.如C250的方法，其进一步包含纯化该多肽或其片段。

C252.如C250的方法，其中该细胞包含编码SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:27中的任一个的核酸。

C253.如C250的方法，其中该多肽或其片段的产率为至少0.05g/L。

C254.如C250的方法，其中该多肽或其片段的产率为至少0.10g/L。

C255.一种组合物，其包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:29中的任一个具有至少70％同一性的多肽。

C256.如C255的组合物，其进一步包含：包含选自表1中的任一式的结构的糖。

C257.如C256的组合物，其中该糖与载体蛋白质共价结合。

C258.如条项C257的组合物，其中该载体蛋白质选自以下中的任一个：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。

C259.如C257的组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C260.如C257的组合物，其中该载体蛋白质为破伤风类毒素(TT)。

C261.如C257的组合物，其中该载体蛋白质为聚(L-赖氨酸)。

C262.如C257的组合物，其中该糖通过还原氨基化与载体蛋白质共价结合。

C263.如C257的组合物，其中该糖通过CDAP化学方法与载体蛋白质共价结合。

C264.如C257的组合物，其中该糖通过单端连接的缀合与载体蛋白质共价结合。

C265.如C257的组合物，其中该糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与载体蛋白质共价结合。

C266.一种多肽，其包含选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:27组成的组的氨基酸序列。

C267.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及包含选自以下中的任一个的结构的糖：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187。

C268.如条项C267的组合物，其进一步包含至少一种衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的任一种肺炎克雷伯氏杆菌类型的糖。

C269.如条项C267的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O1的糖。

C270.如条项C267的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O2的糖。

C271.如条项C267的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O3的糖。

C272.如条项C267的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O5的糖。

C273.如条项C267的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O1的糖及衍生自肺炎克雷伯氏杆菌类型O2的糖。

C274.如条项C268的组合物，其中衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的糖与载体蛋白质缀合；且衍生自大肠杆菌的糖与载体蛋白质缀合。

C275.如条项C267的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的多肽。

C276.一种组合物，其包含衍生自FimH的多肽或其片段；以及至少一种衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的任一种肺炎克雷伯氏杆菌类型的糖。

C277.如条项C276的组合物，其进一步包含至少一种包含选自以下中的任一个的结构的糖：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B 1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187。

C278.如条项C277的组合物，其中衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的糖与载体蛋白质缀合；且衍生自大肠杆菌的糖与载体蛋白质缀合。

C279.如条项C277的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的多肽。

C280.一种组合物，其包含至少一种衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的任一种肺炎克雷伯氏杆菌类型的糖；以及至少一种包含选自以下中的任一个的结构的糖：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187。

C281.如条项C280的组合物，其进一步包含衍生自FimH的多肽或其片段。

C282.如条项C280的组合物，其中大肠杆菌糖包含式O8。

C283.如条项C280的组合物，其中大肠杆菌糖包含式O9。

C284.如条项C280的组合物，其进一步包含衍生自肺炎克雷伯氏杆菌的多肽。

C285.如条项C267至C284中任一项的组合物，其中该糖与载体蛋白质共价结合。

C286.如条项C285的组合物，其中该糖进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C287.如条项C285的组合物，其中该糖包含脂质A。

C288.如条项C285至C287中任一项的组合物，其中该糖以合成方式合成。

C289.如条项C285的组合物，其中该载体蛋白质选自以下中的任一个：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。

C290.一种引发哺乳动物针对大肠杆菌的免疫反应的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的如条项C267至C289中任一项的组合物。

C291.如条项C290的方法，其中该免疫反应包含针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C292.如条项C290的方法，其中该免疫反应保护该哺乳动物免受大肠杆菌感染。

C293.一种引发哺乳动物针对肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的如条项C267至C289中任一项的组合物。

C294.如条项C293的方法，其中该免疫反应包含针对肺炎克雷伯氏杆菌的调理吞噬抗体。

C295.如条项C293的方法，其中该免疫反应保护该哺乳动物免受肺炎克雷伯氏杆菌感染。

C296.如条项C1至C266中任一项的组合物及方法，其进一步包含至少一种衍生自选自由O1、O2、O3和O5组成的组的任一种肺炎克雷伯氏杆菌类型的糖。

C297.如条项C296的组合物及方法，其中该肺炎克雷伯氏杆菌血清型O1包含变体O1V1或O1V2。

C298.如条项C296的组合物及方法，其中该肺炎克雷伯氏杆菌血清型O2包含变体O2V1或O2V2。

C299.一种如条项C1至C298中任一项所示的组合物如本文所示的用途。

C300.一种组合物，其包含：

(i)衍生自伞毛H(FimH)的多肽或其片段；以及

(ii)一个或多个缀合物，其中该缀合物包含共价结合至糖的载体蛋白质，该糖包含选自由以下组成的组的结构：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，

其中n为1至100的整数。

C301.如条项C300的组合物，其中该糖选自由以下组成的组：式O25b、式O1A、式O2、式O6、式O8和式O9。

C302.如条项C301的组合物，其中该糖选自由以下组成的组：式O25b、式O1A、式O2和式O6。

C303.一种组合物，其包含衍生自伞毛抗原H(FimH)的多肽或其片段；以及

(a)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O25b，其中n为31至90的整数，

(b)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O1A，其中n为31至90的整数，

(c)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O2，其中n为31至90的整数，

(d)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O6，其中n为31至90的整数，

(e)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O8，其中n为31至90的整数，以及

(f)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O9，其中n为31至90的整数。

C304.如条项C303的组合物，其包含衍生自伞毛抗原H(FimH)的多肽或其片段；以及

(c)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O2，其中n为31至90的整数，以及

(d)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，该糖包含式O6，其中n为31至90的整数。

C305.如条项C303或C304的组合物，其进一步包含一个或多个具有选自由式O15、式O16、式O17、式O18和式O75组成的组的糖的缀合物，其中n为31至90的整数。7.如条项1至6中任一项的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分及大肠杆菌K-12部分中的任一个。

C306.如条项C300至C304中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分及大肠杆菌K-12部分中的任一个。

C307.如条项C306的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C308.如条项C300至C307中任一项的组合物，其中该糖进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C309.如条项C300至C308中任一项的组合物，其中该载体蛋白质选自由以下组成的组：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)或其变体。

C310.如条项C309的组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C311.如条项C309的组合物，其中该载体蛋白质为破伤风类毒素。

C312.如条项C300至C311中任一项的组合物，其中该糖与蛋白质的比率为至少0.5至至多2。

C313.如条项C300至C312中任一项的组合物，其中该缀合物经由还原氨基化来制备。

C314.如条项C300至C312中任一项的组合物，其中该糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与该载体蛋白质缀合。

C315.如条项C300至C314中任一项的组合物，其中该糖为单端连接的缀合糖。

C316.如条项C308的组合物，其中该糖经由3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与该载体蛋白质缀合。

C317.如条项C300至C313中任一项的组合物，其中该缀合物经由CDAP化学方法来制备。

C318.如条项C300至C317中任一项的组合物，其中该多肽衍生自大肠杆菌伞毛H(FimH)。

C319.如条项C318的组合物，其中该多肽在该多肽的N端处包含苯丙氨酸残基。

C320.如条项C318的组合物，其中该多肽在N端之前20个残基位置内包含苯丙氨酸残基。

C321.如条项C314的组合物，其中该多肽在该多肽的位置1处包含苯丙氨酸残基。

C322.如条项C317的组合物，其中该多肽在紧接该多肽的位置1处的苯丙氨酸残基之前不包含甘氨酸残基。

C323.如条项C314的组合物，其中该多肽在该多肽的位置7处不包含N-糖基化位点。

C324.如条项C318的组合物，其中该多肽在该多肽的位置7处不包含Asn残基。

C325.如条项C320的组合物，其中该多肽在位置7处包含选自由Ser、Asp、Thr和Gln组成的组的残基。

C326.如条项C317的组合物，其中该多肽在该多肽的位置70处不包含N-糖基化位点。

C327.如条项C322的组合物，其中该多肽在该多肽的位置70处不包含Asn残基。

C328.如条项C322的组合物，其中该多肽在该多肽的位置70处不包含Ser残基。

C329.如条项C314的组合物，其中该多肽在该多肽的N-糖基化位点处包含选自由Ser、Asp、Thr和Gln组成的组的残基取代。

C330.如条项C325的组合物，其中该N-糖基化位点包含该多肽的位置N235。

C331.如条项C325的组合物，其中该N-糖基化位点包含该多肽的位置N228。

C332.如条项C325的组合物，其中该N-糖基化位点包含该多肽的位置N235和位置N228。

C333.如条项C314的组合物，其中该多肽包含SEQ ID NO:2。

C334.如条项C314的组合物，其中该多肽包含SEQ ID NO:3。

C335.如条项C314的组合物，其中该多肽包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的氨基酸：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:27、SEQID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113。

C336.如条项C314的组合物，其中该多肽包含具有与由以下组成的组具有至少70％同一性的氨基酸序列的氨基酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113。

C337.如条项C314的组合物，其中该多肽在该多肽的位置1处包含脂肪族疏水性氨基酸残基。

C338.如条项C333的组合物，其中该脂肪族疏水性氨基酸残基选自由Ile、Leu和Val组成的组。

C339.如条项C314的组合物，其中该多肽包含FimH的片段。

C340.如条项C335的组合物，其中该多肽包含FimH的凝集素域。

C341.如条项C336的组合物，其中该凝集素域包含约17022道尔顿的质量。

C342.如条项C314的组合物，其中该多肽与FimC多肽或其片段复合。

C343.如条项C338的组合物，其中该FimC多肽或其片段在该FimC多肽或其片段的位置37处包含甘氨酸残基。

C344.如条项C314的组合物，其中该多肽呈低亲和力构型。

C345.如条项C314的组合物，其中该多肽通过FimG稳定。

C346.如条项C314的组合物，其中该多肽通过FimG的供体链肽(DsG)稳定。

C347.如条项C346的组合物，其中该多肽进一步包含接头。

C348.如条项C343的组合物，其中该接头包含至少4个氨基酸残基及至多15个氨基酸残基。

C349.如条项C343的组合物，其中该接头包含至少5个氨基酸残基及至多10个氨基酸残基。

C350.如条项C343的组合物，其中该接头包含7个氨基酸残基。

C351.如条项C314的组合物，其中该多肽不包含选自由以下组成的组的信号肽：天然FimH前导肽、流感血球凝集素信号肽及人类呼吸道合胞病毒A(病毒株A2)融合糖蛋白F0信号肽。

C352.如条项C314的组合物，其中该多肽包含鼠类IgK信号肽序列。

C353.如条项C314的组合物，其中该多肽包含选自人类IgG受体FcRn大亚单元p51信号肽及人类IL10蛋白质信号肽的任一信号肽序列。

C354.如条项C314的组合物，其中根据SEQ ID NO:3的编号，该多肽在氨基酸位置60处包含精氨酸至脯氨酸的突变(R60P)。

C355.如条项C300至C354的组合物，其包含与该组合物中糖的总量相比至多25％的游离糖。

C356.如条项C300至C354中任一项的组合物，其进一步包含一个或多个缀合物，其中该缀合物包含共价结合至选自O1和O2的肺炎克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)O-抗原的载体蛋白质。

C357.如条项C356的组合物，其中该肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原选自由以下组成的组：a)血清型O1亚型v1(O1v1)、b)血清型O1亚型v2(O1v2)、c)血清型O2亚型v1(O2v1)及d)血清型O2亚型v2(O2v2)。

C358.一种组合物，其包含：

(i)一个或多个缀合物，其包含共价结合至选自由血清型O1亚型v1(O1v1)、血清型O1亚型v2(O1v2)、血清型O2亚型v1(O2v1)及血清型O2亚型v2(O2v2)组成的组的肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原的载体蛋白质；以及

其中n为1至100的整数。

C359.如条项C358的组合物，其中该糖选自由以下组成的组：式O25b、式O1A、式O2、式O6、式O8和式O9。

C360.如条项C359的组合物，其中该糖选自由以下组成的组：式O25b、式O1A、式O2和式O6。

C361.一种组合物，其包含一个或多个缀合物，这些缀合物包含共价结合至选自由血清型O1亚型v1(O1v1)、血清型O1亚型v2(O1v2)、血清型O2亚型v1(O2v1)及血清型O2亚型v2(O2v2)组成的组的肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原的载体蛋白质；以及

C362.如条项C361的组合物，其包含(i)一个或多个缀合物，其包含共价结合至选自由血清型O1亚型v1(O1v1)、血清型O1亚型v2(O1v2)、血清型O2亚型v1(O2v1)及血清型O2亚型v2(O2v2)组成的组的肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原的载体蛋白质；以及

C363.如条项C361或C362的组合物，其进一步包含一个或多个具有选自由式O15、式O16、式O17、式O18和式O75组成的组的糖的缀合物，其中n为31至90的整数。

C364.如条项C358至C363中任一项的组合物，其中该糖进一步包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分及大肠杆菌K-12部分中的任一个。

C365.如条项C358至C363中任一项的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R1部分、大肠杆菌R2部分、大肠杆菌R3部分、大肠杆菌R4部分及大肠杆菌K-12部分中的任一个。

C366.如条项67的组合物，其中该糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C367.如条项C358至C366中任一项的组合物，其中该糖进一步包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C368.如条项C358至C367中任一项的组合物，其中该载体蛋白质选自由以下组成的组：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)或其变体。

C369.如条项C368的组合物，其中该载体蛋白质为CRM₁₉₇。

C370.如条项C368的组合物，其中该载体蛋白质为破伤风类毒素。

C371.如条项C358至C370中任一项的组合物，其中该糖与蛋白质的比率为至少0.5至至多2。

C372.如条项C358至C371中任一项的组合物，其中该缀合物经由还原氨基化来制备。

C373.如条项C358至C371中任一项的组合物，其中该糖经由氨基甲酸(2-((2-氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)间隔基与该载体蛋白质缀合。

C374.如条项C358至C373中任一项的组合物，其中该糖为单端连接的缀合糖。

C375.如条项C367的组合物，其中该糖经由3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基与该载体蛋白质缀合。

C376.如条项C358至C372中任一项的组合物，其中该缀合物经由CDAP化学方法来制备。

C377.如条项C358至C376的组合物，其包含与该组合物中糖的总量相比至多25％的游离糖。

C378.如条项C300至C377中任一项的组合物，其进一步包含佐剂。

C379.如条项C378的组合物，其中该佐剂包含铝。

C380.如条项C378的组合物，其中该佐剂包含QS21。

C381.如条项C378的组合物，其中该佐剂包含MPLA。

C382.如条项C380或C381的组合物，其中该佐剂为脂质体佐剂。

C383.一种引发哺乳动物针对大肠杆菌的免疫反应的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的如条项C300至C382中任一项的组合物。

C384.如条项C383的方法，其中该免疫反应包含针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C385.如条项C383的方法，其中该免疫反应保护该哺乳动物免受大肠杆菌感染。

C386.如条项C300至C382中任一项的组合物的用途，其用于诱导针对大肠杆菌的免疫反应。

C387.如条项C300至C382中任一项的组合物的用途，其用于制造用以诱导针对大肠杆菌的免疫反应的药剂。

C388.如条项C386或C387的用途，其中该免疫反应包含针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C389.如条项C386或C387的用途，其中该免疫反应保护该哺乳动物免受大肠杆菌感染。

C390.一种引发哺乳动物针对肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的如条项C300至C382中任一项的组合物。

C391.如条项C390的方法，其中该免疫反应包含针对肺炎克雷伯氏杆菌的调理吞噬抗体。

C392.如条项C390的方法，其中该免疫反应保护该哺乳动物免受肺炎克雷伯氏杆菌感染。

C393.如条项C300至C382中任一项的组合物的用途，其用于诱导针对肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应。

C394.如条项C300至C382中任一项的组合物的用途，其用于制造用以诱导针对肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应的药剂。

C395.如条项C386或C387的用途，其中该免疫反应包含针对肺炎克雷伯氏杆菌的调理吞噬抗体。

C396.如条项C386或C387的用途，其中该免疫反应保护该哺乳动物免受肺炎克雷伯氏杆菌感染。

C397.一种核酸，其包含编码如条项C1至C382中任一项的多肽的核苷酸。

C398.如条项C397的核酸，其中该核酸为RNA。

C399.纳米粒子，其包含如条项C397或C398的核酸。

C400.如条项303、304、305、359、360、361、362或363中任一项的组合物，其进一步包含具有选自由式O4、式O11、式O13、式O21和式O86组成的组的糖的一个或多个缀合物，其中n为1至100的整数，优选31至90。

序列表

<110> 辉瑞大药厂(Pfizer Inc.)

<120> 大肠杆菌组合物及其方法

<130> PC72671

<150> US63/106,077

<151> 2020-10-27

<150> US63/144,058

<151> 2021-02-01

<150> US63/254,195

<151> 2021-10-11

<160> 113

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser

1 5 10 15

Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile

20 25 30

Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val

35 40 45

Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe

50 55 60

Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln

65 70 75 80

Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val

85 90 95

Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro

100 105 110

Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu

115 120 125

Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly

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Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser

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Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val

165 170 175

Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr

180 185 190

Leu Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys

195 200 205

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210 215 220

Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln

225 230 235 240

Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn

245 250 255

Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly

260 265 270

Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn

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Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

290 295 300

<210> 2

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln

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Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

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Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

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Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val

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Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly

145 150 155 160

Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro

165 170 175

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Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile

195 200 205

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Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu

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Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr

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275

<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln

20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

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<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr

1 5 10 15

Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln

20 25 30

Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser

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Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn

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Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile

100 105 110

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<210> 5

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

Val Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro

20 25 30

Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val

35 40 45

Asn Val Gly Gln Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys

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Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp

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Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val

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Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala

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Gly Gly His His His His His His His His

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<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

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Gly Gly His His His His His His His His

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro

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<210> 8

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro

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Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val

35 40 45

Asn Val Gly Gln Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys

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His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg

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Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

Met Ser Asn Lys Asn Val Asn Val Arg Lys Ser Gln Glu Ile Thr Phe

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Cys Leu Leu Ala Gly Ile Leu Met Phe Met Ala Met Met Val Ala Gly

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Arg Ala Glu Ala Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro

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Glu

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<220>

<223> 合成

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Asp Asn Lys Gln

1

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

Gly Gly Ser Ser Gly Gly

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

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<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser

1 5 10 15

Val Asn Ala Trp Ser

20

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<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

Val Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 20

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln

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Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr

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Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

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Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val

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130 135 140

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Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr

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<210> 21

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

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20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

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1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

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1 5 10 15

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275

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<220>

<223> 合成

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<211> 160

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

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Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln

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<211> 279

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<220>

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<400> 29

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275

<210> 30

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

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Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

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Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 31

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

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Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

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305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 32

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

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Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

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Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ser Lys

325

<210> 33

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

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180 185 190

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245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp

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Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 34

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

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130 135 140

Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala

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Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln

245 250 255

Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp

260 265 270

Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg

275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu

325

<210> 35

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

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115 120 125

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130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

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<210> 36

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

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1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 37

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 38

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 39

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu

20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val

85 90 95

Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser

100 105 110

Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly

145 150 155 160

Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr

165 170 175

Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln

180 185 190

Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn

195 200 205

Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp

210 215 220

Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His

225 230 235 240

Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr

245 250 255

Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu

260 265 270

Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr

275 280 285

Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val

290 295 300

Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe

305 310 315 320

Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly

325 330 335

Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala

340 345 350

Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu

355 360 365

Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val

370 375

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

gaagcaaacc gtacgcgtaa ag 22

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

cgaccagctc ttacacggcg 20

<210> 42

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac 36

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

ataattgacg atccggttgc c 21

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

gctatttacg ccctgattgt cttttgt 27

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

attgagaacc tgcgtaaacg gc 22

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

tgaagagcgg ttcagataac ttcc 24

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

cgatccggaa acctcctaca c 21

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

gattattcgc gcaacgctaa acagat 26

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

tgatcattga cgatccggta gcc 23

<210> 50

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg 60

tcggtatgga 70

<210> 51

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg 60

ctttacagct accgagct 78

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg 30

<210> 54

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 54

Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly

1 5 10 15

Ser Thr Gly

<210> 55

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 55

Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly

20

<210> 56

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 56

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala

<210> 57

<211> 25

<212> PRT

<213> 人类呼吸道合胞病毒A (病毒株A2)

<400> 57

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly

20 25

<210> 58

<211> 15

<212> PRT

<213> A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2)

<400> 58

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly

1 5 10 15

<210> 59

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 59

Met Glu Gly Met Asp Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Leu Leu

1 5 10 15

Pro Leu Leu Thr Val Arg Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Leu Ala Thr

20 25 30

Val Leu Glu Leu Met Gly Val Gly Ala Leu Glu Ile Thr Leu Arg Thr

35 40 45

Glu Lys Gly Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ser Gly Leu Leu

50 55 60

Leu Gly Ala Gly Thr Val Arg Ser Pro Lys Glu Ala Glu Ala Ala Leu

65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ser Pro Gly Leu Leu Glu Glu Val

85 90 95

Ala Ala Leu Ala Gln Ala Arg Gly Val Pro Tyr Leu Pro Gly Val Leu

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Leu

115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Pro Phe Gln Gly Val Arg Val Leu Arg Ala

130 135 140

Tyr Ala Glu Val Phe Pro Glu Val Arg Phe Leu Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160

Lys Glu Glu His Leu Pro His Tyr Ala Ala Leu Pro Asn Leu Leu Ala

165 170 175

Val Gly Gly Ser Trp Leu Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ala Val Met Lys

180 185 190

Lys Val Lys Ala Ala Lys Ala Leu Leu Ser Pro Gln Ala Pro Gly

195 200 205

<210> 60

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 60

Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp

1 5 10 15

Met Ala Glu Ala Ala Ile Arg Thr Leu Lys Ala Leu Ser Pro Asn Ile

20 25 30

Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala

35 40 45

Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu

50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80

Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile

85 90 95

Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Asp Glu Leu Asp

100 105 110

Ile Leu Ala Leu Val Arg Ala Ile Glu His Ala Ala Asn Val Tyr Tyr

115 120 125

Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu

130 135 140

Arg Gln Gly Arg Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu

145 150 155

<210> 61

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 61

Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp

1 5 10 15

Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile

20 25 30

Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala

35 40 45

Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu

50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80

Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile

85 90 95

Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys

100 105 110

Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr

115 120 125

Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu

130 135 140

Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu

145 150 155

<210> 62

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 62

Met Ser Thr Ile Asn Asn Gln Leu Lys Ala Leu Lys Val Ile Pro Val

1 5 10 15

Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu

20 25 30

Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala

35 40 45

Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys

65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Thr Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr

85 90 95

Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn

100 105 110

Asn Pro Ser Thr Val Glu Ala Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser

130 135 140

Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160

Thr Pro Ser Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

165 170 175

Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Thr Asn Gly Glu

180 185 190

Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn

195 200 205

Pro

<210> 63

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 63

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro

1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30

Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Ser Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

85 90 95

Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110

Thr Phe

<210> 64

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 64

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Ala Glu His His Arg

115 120 125

Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 65

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 65

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190

Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205

<210> 66

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 66

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Ala Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 67

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 67

Met Phe Thr Lys Ser Gly Asp Asp Gly Asn Thr Asn Val Ile Asn Lys

1 5 10 15

Arg Val Gly Lys Asp Ser Pro Leu Val Asn Phe Leu Gly Asp Leu Asp

20 25 30

Glu Leu Asn Ser Phe Ile Gly Phe Ala Ile Ser Lys Ile Pro Trp Glu

35 40 45

Asp Met Lys Lys Asp Leu Glu Arg Val Gln Val Glu Leu Phe Glu Ile

50 55 60

Gly Glu Asp Leu Ser Thr Gln Ser Ser Lys Lys Lys Ile Asp Glu Ser

65 70 75 80

Tyr Val Leu Trp Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Arg Ile Glu Ser

85 90 95

Gly Pro Val Lys Leu Phe Val Ile Pro Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ser

100 105 110

Val Leu His Val Thr Arg Ser Val Ala Arg Arg Val Glu Arg Asn Ala

115 120 125

Val Lys Tyr Thr Lys Glu Leu Pro Glu Ile Asn Arg Met Ile Ile Val

130 135 140

Tyr Leu Asn Arg Leu Ser Ser Leu Leu Phe Ala Met Ala Leu Val Ala

145 150 155 160

Asn Lys Arg Arg Asn Gln Ser Glu Lys Ile Tyr Glu Ile Gly Lys Ser

165 170 175

Trp

<210> 68

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 68

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Gln Cys Val Arg Ala

20 25 30

Phe Glu Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Ser Ser Arg Glu His His Glu

115 120 125

Phe Phe Arg Glu His Phe Met Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Cys Ile Thr Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 69

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 69

Met Gly His Thr Lys Gly Pro Thr Pro Gln Gln His Asp Gly Ser Ala

1 5 10 15

Leu Arg Ile Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Ile Ile Met

20 25 30

Pro Leu Leu Ile Gly Thr Ile Ala Lys Leu Leu Glu Cys Gly Val Lys

35 40 45

Ala Ser Asn Ile Val Val Gln Ser Val Pro Gly Ser Trp Glu Leu Pro

50 55 60

Ile Ala Val Gln Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Gln Leu Gln Thr Pro Ser

65 70 75 80

Ser Gly Pro Ser Leu Ser Ala Gly Asp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Asp Leu Thr Ala Leu Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ser Thr Gly Pro Phe

100 105 110

Asp Ala Leu Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Glu Thr Met His

115 120 125

Phe Glu Tyr Ile Ala Asp Ser Val Ser His Gly Leu Met Arg Val Gln

130 135 140

Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Val Leu Thr

145 150 155 160

Asp Asp Gln Ala Lys Ala Arg Ala Gly Val Ile Glu Gly Ser His Asn

165 170 175

His Gly Glu Asp Trp Gly Leu Ala Ala Val Glu Met Gly Val Arg Arg

180 185 190

Arg Asp Trp Ala Ala Gly Lys Thr Glu

195 200

<210> 70

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 70

Met Tyr Glu Val Asp His Ala Asp Val Tyr Asp Leu Phe Tyr Leu Gly

1 5 10 15

Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ser Asp Ile Ala Asp Leu Val

20 25 30

Arg Ser Arg Thr Pro Glu Ala Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly

35 40 45

Thr Gly Thr His Leu Glu His Phe Thr Lys Glu Phe Gly Asp Thr Ala

50 55 60

Gly Leu Glu Leu Ser Glu Asp Met Leu Thr His Ala Arg Lys Arg Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ala Thr Leu His Gln Gly Asp Met Arg Asp Phe Gln Leu Gly

85 90 95

Arg Lys Phe Ser Ala Val Val Ser Met Phe Ser Ser Val Gly Tyr Leu

100 105 110

Lys Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Ala Val Ala Ser Phe Ala Glu His

115 120 125

Leu Glu Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu

130 135 140

Thr Phe Ala Asp Gly Trp Val Ser Ala Asp Val Val Arg Arg Asp Gly

145 150 155 160

Arg Thr Val Ala Arg Val Ser His Ser Val Arg Glu Gly Asn Ala Thr

165 170 175

Arg Met Glu Val His Phe Thr Val Ala Asp Pro Gly Lys Gly Val Arg

180 185 190

His Phe Ser Asp Val His Leu Ile Thr Leu Phe His Gln Arg Glu Tyr

195 200 205

Glu Ala Ala Phe Met Ala Ala Gly Leu Arg Val Glu Tyr Leu Glu Gly

210 215 220

Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Pro Ala

225 230 235

<210> 71

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 71

Met Gly Met Lys Glu Lys Phe Val Leu Ile Ile Thr His Gly Asp Phe

1 5 10 15

Gly Lys Gly Leu Leu Ser Gly Ala Glu Val Ile Ile Gly Lys Gln Glu

20 25 30

Asn Val His Thr Val Gly Leu Asn Leu Gly Asp Asn Ile Glu Lys Val

35 40 45

Ala Lys Glu Val Met Arg Ile Ile Ile Ala Lys Leu Ala Glu Asp Lys

50 55 60

Glu Ile Ile Ile Val Val Asp Leu Phe Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Leu Glu Met Met Lys Thr Phe Asp Val Lys Val Ile Thr Gly Ile

85 90 95

Asn Met Pro Met Leu Val Glu Leu Leu Thr Ser Ile Asn Val Tyr Asp

100 105 110

Thr Thr Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ser Lys Ile Gly Lys Asp Gly Ile

115 120 125

Lys Val Ile Glu Lys Ser Ser Leu Lys Met

130 135

<210> 72

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 72

Met Lys Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg

1 5 10 15

Trp Asn Leu Glu Ile Ile Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ile Lys Arg

20 25 30

Leu Gln Glu Phe Gly Val Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val

35 40 45

Pro Gly Ser Phe Glu Leu Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys

50 55 60

Gln Lys Arg Leu Gly Lys Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val

65 70 75 80

Leu Ile Lys Gly Ser Thr Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr

85 90 95

Thr His Gln Leu Met Lys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile

100 105 110

Phe Gly Val Leu Thr Cys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala

115 120 125

Gly Leu Ile Glu Gly Lys Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala

130 135 140

Ala Ala Val Glu Met Ala Thr Lys Phe Asn

145 150

<210> 73

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 73

Met Ala Val Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Lys Tyr Asp Gly Ser

1 5 10 15

Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp Asn Arg Lys Ile Ile

20 25 30

Leu Ala Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Gly Val

35 40 45

Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro Gly Ser Phe Glu Leu

50 55 60

Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln Lys Arg Leu Gly Lys

65 70 75 80

Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Ser Thr

85 90 95

Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr His Gln Leu Met Lys

100 105 110

Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys

115 120 125

Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly Leu Ile Glu Gly Lys

130 135 140

Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala

145 150 155 160

Thr Lys Phe Asn

<210> 74

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 74

Met Gly Ala Asn Trp Tyr Leu Asp Asn Glu Ser Ser Arg Leu Ser Phe

1 5 10 15

Thr Ser Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ala Glu Val His Arg Phe Leu Val

20 25 30

Leu His Gly Lys Val Asp Pro Lys Gly Leu Ala Glu Val Glu Val Glu

35 40 45

Thr Glu Ser Ile Ser Thr Gly Ile Pro Leu Arg Asp Met Leu Leu Arg

50 55 60

Val Leu Val Phe Gln Val Ser Lys Phe Pro Val Ala Gln Ile Asn Ala

65 70 75 80

Gln Leu Asp Met Arg Pro Ile Asn Asn Leu Ala Pro Gly Ala Gln Leu

85 90 95

Glu Leu Arg Leu Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg Gly Lys Ser His Ser

100 105 110

Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ala Thr Arg Leu Asp Glu Arg Arg Phe Gln

115 120 125

Val Val Thr Leu Glu Pro Leu Val Ile His Ala Gln Asp Phe Asp Met

130 135 140

Val Arg Ala Phe Asn Ala Leu Arg Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Val

145 150 155 160

Ser Leu Ser Val Pro Val Gly Ala Val Leu Ile Phe Thr Ala Arg

165 170 175

<210> 75

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 75

Met Thr Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Ser Ala Ile Lys Ala Leu Ser Phe

1 5 10 15

Ala Ile Ile Leu Ala Glu Ala Asp Leu Arg His Ile Pro Gln Asp Leu

20 25 30

Gln Arg Leu Ala Val Arg Val Ile His Ala Cys Gly Met Val Asp Val

35 40 45

Ala Asn Asp Leu Ala Phe Ser Glu Gly Ala Gly Lys Ala Gly Arg Asn

50 55 60

Ala Leu Leu Ala Gly Ala Pro Ile Leu Cys Asp Ala Arg Met Val Ala

65 70 75 80

Glu Gly Ile Thr Arg Ser Arg Leu Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Tyr

85 90 95

Thr Leu Ser Asp Pro Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Gly Asn

100 105 110

Thr Arg Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Trp Leu Pro His Ile Glu Gly

115 120 125

Ser Ile Val Ala Ile Gly Asn Ala Pro Thr Ala Leu Phe Arg Leu Phe

130 135 140

Glu Leu Leu Asp Ala Gly Ala Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ile Gly Met

145 150 155 160

Pro Val Gly Phe Val Gly Ala Ala Glu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala

165 170 175

Asn Ser Arg Gly Val Pro Tyr Val Ile Val Arg Gly Arg Arg Gly Gly

180 185 190

Ser Ala Met Thr Ala Ala Ala Val Asn Ala Leu Ala Ser Glu Arg Glu

195 200 205

<210> 76

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 76

Met Ile Thr Val Phe Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ala Pro Arg Arg Glu

1 5 10 15

Lys Leu Ala Glu Val Ile Tyr Ser Ser Leu His Leu Gly Leu Asp Ile

20 25 30

Pro Lys Gly Lys His Ala Ile Arg Phe Leu Cys Leu Glu Lys Glu Asp

35 40 45

Phe Tyr Tyr Pro Phe Asp Arg Ser Asp Asp Tyr Thr Val Ile Glu Ile

50 55 60

Asn Leu Met Ala Gly Arg Ser Glu Glu Thr Lys Met Leu Leu Ile Phe

65 70 75 80

Leu Leu Phe Ile Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Ala His Asp

85 90 95

Val Glu Ile Thr Ile Lys Glu Gln Pro Ala His Cys Trp Gly Phe Arg

100 105 110

Gly Arg Thr Gly Asp Ser Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Val

115 120 125

<210> 77

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 77

Met Gly Ser Asp Leu Gln Lys Leu Gln Arg Phe Ser Thr Cys Asp Ile

1 5 10 15

Ser Asp Gly Leu Leu Asn Val Tyr Asn Ile Pro Thr Gly Gly Tyr Phe

20 25 30

Pro Asn Leu Thr Ala Ile Ser Pro Pro Gln Asn Ser Ser Ile Val Gly

35 40 45

Thr Ala Tyr Thr Val Leu Phe Ala Pro Ile Asp Asp Pro Arg Pro Ala

50 55 60

Val Asn Tyr Ile Asp Ser Val Pro Pro Asn Ser Ile Leu Val Leu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Pro His Leu Gln Ser Gln Phe His Pro Phe Ile Lys Ile Thr

85 90 95

Gln Ala Met Tyr Gly Gly Leu Met Ser Thr Arg Ala Gln Tyr Leu Lys

100 105 110

Ser Asn Gly Thr Val Val Phe Gly Arg Ile Arg Asp Val Asp Glu His

115 120 125

Arg Thr Leu Asn His Pro Val Phe Ala Tyr Gly Val Gly Ser Cys Ala

130 135 140

Pro Lys Ala Val Val Lys Ala Val Gly Thr Asn Val Gln Leu Lys Ile

145 150 155 160

Leu Thr Ser Asp Gly Val Thr Gln Thr Ile Cys Pro Gly Asp Tyr Ile

165 170 175

Ala Gly Asp Asn Asn Gly Ile Val Arg Ile Pro Val Gln Glu Thr Asp

180 185 190

Ile Ser Lys Leu Val Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Ile Glu Val Asp Arg

195 200 205

Leu Val Ser Glu Ala Ile Lys Asn Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Gln

210 215 220

Thr Ala Arg Arg Met Val Leu Lys Asp Tyr Ile

225 230 235

<210> 78

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 78

Met Ser Gly Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly Tyr Glu

1 5 10 15

Leu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Phe Leu Lys Met Thr Gly His Glu Pro

20 25 30

Ile Asp Cys Gly Ala Leu Arg Tyr Asp Ala Asp Asp Asp Tyr Pro Ala

35 40 45

Phe Cys Ile Ala Ala Ala Thr Arg Thr Val Ala Asp Pro Gly Ser Leu

50 55 60

Gly Ile Val Leu Gly Gly Ser Gly Asn Gly Glu Gln Ile Ala Ala Asn

65 70 75 80

Lys Val Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Ala Trp Ser Val Gln Thr Ala

85 90 95

Ala Leu Ala Arg Glu His Asn Asn Ala Gln Leu Ile Gly Ile Gly Gly

100 105 110

Arg Met His Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Ile Val Lys Ala Phe Val

115 120 125

Thr Thr Pro Trp Ser Lys Ala Gln Arg His Gln Arg Arg Ile Asp Ile

130 135 140

Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Thr His Glu Ala Pro Pro Val Pro Gly Ala

145 150 155 160

Pro Ala

<210> 79

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 79

Met Gly Asp Asp Ala Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Val Asp Glu Leu

1 5 10 15

Asn Ser Gln Ile Gly Val Leu Leu Ala Glu Pro Leu Pro Asp Asp Val

20 25 30

Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ile Gln His Asp Leu Phe Asp Leu Gly Gly

35 40 45

Glu Leu Cys Ile Pro Gly His Ala Ala Ile Thr Glu Asp His Leu Leu

50 55 60

Arg Leu Ala Leu Trp Leu Val His Tyr Asn Gly Gln Leu Pro Pro Leu

65 70 75 80

Glu Glu Phe Ile Leu Pro Gly Gly Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala His

85 90 95

Val Cys Arg Thr Val Cys Arg Arg Ala Glu Arg Ser Ile Lys Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Ser Glu Pro Leu Asn Ile Ala Pro Ala Ala Tyr Val Asn Leu

115 120 125

Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ala Arg Val Leu Asn Arg Ala Ala

130 135 140

Gly Gly Ala Asp Val Leu Trp Asp Arg Thr Arg Ala His

145 150 155

<210> 80

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 80

Met Ile Leu Ser Ala Glu Gln Ser Phe Thr Leu Arg His Pro His Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Ala Leu Ala Phe Val Arg Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala

20 25 30

Gly Val Gln Arg Leu Arg Gly Leu Asp Ser Asp Gly Glu Gln Val Trp

35 40 45

Gly Glu Leu Leu Val Arg Val Pro Leu Leu Gly Glu Val Asp Leu Pro

50 55 60

Phe Arg Ser Glu Ile Val Arg Thr Pro Gln Gly Ala Glu Leu Arg Pro

65 70 75 80

Leu Thr Leu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Val Ala Val Ser Gly Gln Ala

85 90 95

Thr Ala Ala Glu Gly Gly Glu Met Ala Phe Ala Phe Gln Phe Gln Ala

100 105 110

His Leu Ala Thr Pro Glu Ala Glu Gly Glu Gly Gly Ala Ala Phe Glu

115 120 125

Val Met Val Gln Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Met

130 135 140

Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ala Ala Gly Leu Pro Pro Ala

145 150 155

<210> 81

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 81

Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp

1 5 10 15

Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile

20 25 30

Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala

35 40 45

Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu

50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Lys Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80

Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile

85 90 95

Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys

100 105 110

Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr

115 120 125

Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu

130 135 140

Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu

145 150 155

<210> 82

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 82

Met Asp Asp Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Leu Lys Val Ile Pro Val

1 5 10 15

Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu

20 25 30

Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala

35 40 45

Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys

65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Asp Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr

85 90 95

Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn

100 105 110

Asn Pro Ser Thr Val Glu Gln Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser

130 135 140

Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160

Thr Pro Asp Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

165 170 175

Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Arg Asn Gly Glu

180 185 190

Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn

195 200 205

Pro

<210> 83

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 83

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro

1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30

Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

85 90 95

Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110

Thr Phe

<210> 84

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 84

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro

1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30

Glu Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Glu Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

85 90 95

Ile His Phe Val Asp Leu Asp Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110

Thr Phe

<210> 85

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 85

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Glu His His Arg

115 120 125

Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 86

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 86

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Glu Asp His Glu

115 120 125

Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 87

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 87

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190

Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205

<210> 88

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 88

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Glu Phe Val Glu Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asp

145 150 155 160

Leu Asp Asp Val Cys Glu Trp Phe Asp Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Asp Ala Leu Val Glu Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Asp

180 185 190

Ala Lys Glu Phe Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205

<210> 89

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 89

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Lys Ala Leu Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190

Ala Lys Lys Phe Val Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205

<210> 90

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 90

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 91

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 91

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Ala Asp Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 92

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 92

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 93

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (70)..(70)

<223> Xaa为A或K

<400> 93

Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp

1 5 10 15

Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile

20 25 30

Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala

35 40 45

Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu

50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Xaa Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80

Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile

85 90 95

Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys

100 105 110

Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr

115 120 125

Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu

130 135 140

Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu

145 150 155

<210> 94

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa为S或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa为T或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa为A或R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (85)..(85)

<223> Xaa为T或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (119)..(119)

<223> Xaa为A或Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (163)..(163)

<223> Xaa为S或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (189)..(189)

<223> Xaa为T或R

<400> 94

Met Xaa Xaa Ile Asn Asn Gln Leu Lys Xaa Leu Lys Val Ile Pro Val

1 5 10 15

Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu

20 25 30

Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala

35 40 45

Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys

65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Xaa Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr

85 90 95

Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn

100 105 110

Asn Pro Ser Thr Val Glu Xaa Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser

130 135 140

Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160

Thr Pro Xaa Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

165 170 175

Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Xaa Asn Gly Glu

180 185 190

Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn

195 200 205

Pro

<210> 95

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa为T或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa为K或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (71)..(71)

<223> Xaa为S或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (74)..(74)

<223> Xaa为R或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (101)..(101)

<223> Xaa为N或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (103)..(103)

<223> Xaa为N或D

<400> 95

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Xaa Asp Val Pro

1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30

Xaa Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Xaa Lys Asn Xaa Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

85 90 95

Ile His Phe Val Xaa Leu Xaa Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110

Thr Phe

<210> 96

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa为Y或H

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (82)..(82)

<223> Xaa为N或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (87)..(87)

<223> Xaa为R或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (105)..(105)

<223> Xaa为S或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (119)..(119)

<223> Xaa为R或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (121)..(121)

<223> Xaa为R或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (124)..(124)

<223> Xaa为A或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (126)..(126)

<223> Xaa为H或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (128)..(128)

<223> Xaa为R或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (150)..(150)

<223> Xaa为A或N

<400> 96

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Asp Ser Xaa Glu Xaa His Xaa

115 120 125

Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Ile Glu Ile Leu Xaa Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 97

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (126)..(126)

<223> Xaa为T或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (139)..(139)

<223> Xaa为Q或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (142)..(142)

<223> Xaa为K或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (160)..(160)

<223> Xaa为N或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (163)..(163)

<223> Xaa为N或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (166)..(166)

<223> Xaa为E或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (169)..(169)

<223> Xaa为D或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (179)..(179)

<223> Xaa为S、D或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (183)..(183)

<223> Xaa为K或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (185)..(185)

<223> Xaa为T、D或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (192)..(192)

<223> Xaa为D或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (195)..(195)

<223> Xaa为A、E或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (198)..(198)

<223> Xaa为E或K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (199)..(199)

<223> Xaa为E或K

<400> 97

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Xaa Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Xaa Phe Val Xaa Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Xaa

145 150 155 160

Leu Asp Xaa Val Cys Xaa Trp Phe Xaa Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Xaa Ala Leu Val Xaa Gly Xaa Pro Asp Glu Val Arg Glu Xaa

180 185 190

Ala Lys Xaa Phe Val Xaa Xaa Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205

<210> 98

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa为Y或H

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> Xaa为A或R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (82)..(82)

<223> Xaa为N或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (87)..(87)

<223> Xaa为R或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (97)..(97)

<223> Xaa为N或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (105)..(105)

<223> Xaa为S、N或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (119)..(119)

<223> Xaa为R、E或N

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (121)..(121)

<223> Xaa为R、E或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (122)..(122)

<223> Xaa为K或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (124)..(124)

<223> Xaa为K或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (126)..(126)

<223> Xaa为H或D

<400> 98

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Xaa Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Xaa Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155

<210> 99

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 99

taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt attgtacacg gccgcataat cgaaattaat 60

acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta 120

agtataagaa ggagatatac tt 142

<210> 100

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 100

taaagaagga gatatcat 18

<210> 101

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 101

tgagaaggag atatcat 17

<210> 102

<211> 365

<212> PRT

<213> 智人

<400> 102

Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr

20 25 30

His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp

35 40 45

Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu

50 55 60

Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val

65 70 75 80

Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys

85 90 95

Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr

100 105 110

Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val

115 120 125

Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp

130 135 140

Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile

145 150 155 160

Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr

165 170 175

Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg

180 185 190

Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys

195 200 205

Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe

210 215 220

Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser

245 250 255

Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His

260 265 270

Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val

275 280 285

Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val

290 295 300

Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu

305 310 315 320

Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg

325 330 335

Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp

340 345 350

Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala

355 360 365

<210> 103

<211> 62

<212> PRT

<213> 智人

<400> 103

Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr

20 25 30

Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala

35 40 45

Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55 60

<210> 104

<211> 574

<212> PRT

<213> 人类呼吸道合胞病毒A (病毒株A2)

<400> 104

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 105

<211> 64

<212> PRT

<213> 人类呼吸道合胞病毒A (病毒株A2)

<400> 105

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn

20 25 30

Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn

35 40 45

Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55 60

<210> 106

<211> 178

<212> PRT

<213> 智人

<400> 106

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175

Arg Asn

<210> 107

<211> 57

<212> PRT

<213> 智人

<400> 107

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val

35 40 45

Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55

<210> 108

<211> 562

<212> PRT

<213> A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2)

<400> 108

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp

1 5 10 15

Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp

20 25 30

Thr Asn Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro

65 70 75 80

Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu

85 90 95

Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp

100 105 110

Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys

115 120 125

Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly

130 135 140

Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn

145 150 155 160

Met Val Trp Leu Thr Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly

165 170 175

Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val

180 185 190

His His Pro Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val

195 200 205

Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr

210 215 220

Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met

225 230 235 240

Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu

245 250 255

Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys

260 265 270

Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys

275 280 285

Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro

290 295 300

Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val

305 310 315 320

Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln

325 330 335

Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly

340 345 350

Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn

355 360 365

Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala

370 375 380

Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn

385 390 395 400

Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Arg Arg

405 410 415

Leu Glu Asn Leu Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp

420 425 430

Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu

435 440 445

Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met

450 455 460

Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe

465 470 475 480

Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr

485 490 495

Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu

500 505 510

Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala

515 520 525

Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala

530 535 540

Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile

545 550 555 560

Cys Ile

<210> 109

<211> 54

<212> PRT

<213> A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2)

<400> 109

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Phe

1 5 10 15

Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn

35 40 45

Leu Val Val Asp Leu Ser

50

<210> 110

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 110

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln

20 25 30

Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr

50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn

85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val

100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val

115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe

130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly

145 150 155 160

Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro

165 170 175

Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn

180 185 190

Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile

195 200 205

Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln

210 215 220

Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu

225 230 235 240

Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr

245 250 255

Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile

260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp

275 280 285

Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly His His

290 295 300

His His His His His His

305 310

<210> 111

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 111

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln

20 25 30

Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr

50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn

85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val

100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val

115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe

130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly

145 150 155 160

His His His His His His His His

165

<210> 112

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 112

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln

20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr

50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn

85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val

100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val

115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe

130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly

145 150 155 160

Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro

165 170 175

Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn

180 185 190

Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile

195 200 205

Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln

210 215 220

Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu

225 230 235 240

Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr

245 250 255

Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile

260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp

275 280 285

Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly His His

290 295 300

His His His His His His

305 310

<210> 113

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 113

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln

20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr

50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn

85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val

100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val

115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe

130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly

145 150 155 160

His His His His His His His His

165

Claims

1.一种组合物，其包含：

(i)衍生自伞毛H(FimH)的多肽或其片段；以及

(ii)一个或多个缀合物，其中所述缀合物包含共价结合至糖的载体蛋白质，所述糖包含选自由以下组成的组的结构：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，

其中n为1至100的整数。

2.一种组合物，其包含衍生自伞毛抗原H(FimH)的多肽或其片段；以及

(a)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O25b，其中n为31至90的整数，

(b)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O1A，其中n为31至90的整数，

(c)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O2，其中n为31至90的整数，

(d)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O6，其中n为31至90的整数，

(e)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O8，其中n为31至90的整数，以及

(f)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O9，其中n为31至90的整数。

3.权利要求2的组合物，其包含衍生自伞毛抗原H(FimH)的多肽或其片段；以及

(c)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O2，其中n为31至90的整数，以及

(d)包含共价结合至糖的载体蛋白质的缀合物，所述糖包含式O6，其中n为31至90的整数。

4.权利要求2或3的组合物，其进一步包含一个或多个具有选自由式O15、式O16、式O17、式O18和式O75组成的组的糖的缀合物，其中n为31至90的整数。

5.权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述载体蛋白质选自由以下组成的组：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(diphtheria toxin fragment B；DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(Diphtheria toxoid；DT)、破伤风类毒素(tetanus toxoid；TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(Exotoxin A of P.aeruginosa；EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(Cholera toxin Bsubunit；CTB)、肺炎链球菌溶血素(Streptococcus pneumoniae Pneumolysin)及其解毒变体、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(StreptococcalC5a peptidase；SCP)或其变体。

6.权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述多肽衍生自大肠杆菌伞毛H(FimH)。

7.权利要求6的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2。

8.权利要求6的组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3。

9.权利要求6的组合物，其中所述多肽包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的氨基酸：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113。

10.权利要求6的组合物，其中所述多肽包含具有与由以下组成的组具有至少70％同一性的氨基酸序列的氨基酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113。

11.权利要求6的组合物，其中所述多肽包含FimH的片段。

12.权利要求11的组合物，其中所述多肽包含FimH的凝集素域。

13.权利要求6的组合物，其中所述多肽与FimC多肽或其片段复合。

14.权利要求6的组合物，其中所述多肽通过FimG的供体链肽(DsG)稳定化。

15.权利要求14的组合物，其中所述多肽进一步包含接头。

16.权利要求1至15中任一项的组合物，其进一步包含一个或多个缀合物，其中所述缀合物包含共价结合至选自O1和O2的肺炎克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)O-抗原的载体蛋白质。

17.一种组合物，其包含：

其中n为1至100的整数。

18.权利要求17的组合物，其中所述糖选自由式O25b、式O1A、式O2、式O6、式O8和式O9组成的组。

19.权利要求18的组合物，其中所述糖选自由式O25b、式O1A、式O2和式O6组成的组。

20.一种组合物，其包含一个或多个缀合物，这些缀合物包含共价结合至选自由血清型O1亚型v1(O1v1)、血清型O1亚型v2(O1v2)、血清型O2亚型v1(O2v1)及血清型O2亚型v2(O2v2)组成的组的肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原的载体蛋白质；以及

21.权利要求20的组合物，其包含(i)一个或多个缀合物，其包含共价结合至选自由血清型O1亚型v1(O1v1)、血清型O1亚型v2(O1v2)、血清型O2亚型v1(O2v1)及血清型O2亚型v2(O2v2)组成的组的肺炎克雷伯氏杆菌O-抗原的载体蛋白质；以及

22.权利要求20或21的组合物，其进一步包含一个或多个具有选自由式O15、式O16、式O17、式O18和式O75组成的组的糖的缀合物，其中n为31至90的整数。

23.权利要求17至22中任一项的组合物，其中所述载体蛋白质选自由以下组成的组：CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素或来自绿脓杆菌的外毒素A；绿脓杆菌的解毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚单元(CTB)、肺炎链球菌溶血素及其解毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA、空肠弯曲杆菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)或其变体。

24.权利要求23的组合物，其中所述载体蛋白质为CRM₁₉₇。

25.权利要求1至24中任一项的组合物，其进一步包含佐剂。

26.一种引发哺乳动物针对大肠杆菌的免疫反应的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求1至25中任一项的组合物。

27.一种引发哺乳动物针对肺炎克雷伯氏杆菌的免疫反应的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求1至25中任一项的组合物。

28.一种核酸，其包含编码权利要求1至23中任一项的多肽的核苷酸。