CN116940590A

CN116940590A - 大肠杆菌fimh突变体和其用途

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Publication number: CN116940590A
Application number: CN202180094463.7A
Authority: CN
Inventors: 车晔; L·O·乔罗; R·G·K·唐纳德; M·C·格里夫尔; N·C·希尔蒙德莫内里
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-10-24

Abstract

本公开涉及大肠杆菌突变的FimH多肽(其产生改善的生化性质和免疫原性)的设计，包含这样的多肽的组合物以及其用途。

Description

大肠杆菌FIMH突变体和其用途

相关申请

本申请要求2020年12月23日提交的美国临时申请号63/130,153、2021年5月7日提交的美国临时申请号63/185,425和2021年11月23日提交的美国临时申请号63/282,244的优先权。上述申请的每一个的完整内容通过引用全部并入本文。

参考序列表

本申请通过EFS-Web以电子方式提交且包括以.txt格式电子提交的序列表。.txt文档含有名为“PC072713_ST25_17Nov2021.txt”的序列表，其于2021年11月17日创建，大小为220KB。此.txt文档所含有的序列表是说明书的一部分并通过引用全部并入本文。

技术领域

本公开涉及突变的大肠杆菌(Escherichia coli)FimH多肽和其使用方法。

发明背景

尿路感染(UTI)在五分之一的女性一生中至少影响一次且造成显著的发病率和死亡率，给医疗保健系统带来了沉重的负担。尽管若干种不同细菌能导致UTI，但最常见的病因(90-95％病例)是革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)。大部分大肠杆菌UTI由尿路致病性大肠杆菌(UPEC)导致，所述大肠杆菌定植在胃肠道并从粪便菌丛迁移到泌尿生殖道，在该处其粘附宿主尿路上皮细胞，因而建立尿路上行性感染的储存宿主(reservoir)。菌毛粘附素，包括1型菌毛帮助粘附，所述粘附素结合上皮层中或分泌入尿液的甘露糖化糖蛋白。1型菌毛在临床UPEC分离物中高度保守且由称为fim的基因簇编码，fim编码辅助蛋白(FimC、FimD)、多种结构亚基(FimE、FimF、FimG)和称为FimH的粘附素。FimH对小鼠模型中UTI感染的所有特征而言是必需的，所述模型模仿人膀胱感染的方面(Hannan等，PLoSPathog.2010Aug12；6(8):e1001042；doi:10.1371/journal.ppat.1001042；Schwartz等，Infect Immun.2011Oct；79(10):4250-9.doi:10.1128/IAI.05339-11)。通过模拟甘露糖化受体而靶向FimH的小分子抑制剂进一步确认FimH在UTI中的作用，并在动物模型中显示治疗前景(Cusumano CK等.Sci Transl Med.2011；3(109):109ra115.doi:10.1126/scitranslmed.3003021)。另外，FimH在大肠杆菌人膀胱炎分离物中处于正选择下(ChenSL,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2009Dec 29；106(52):22439-44.doi:10.1073/pnas.0902179106)且正选择的残留物可能影响膀胱炎小鼠模型中的毒力(Schwartz,D.J.等.Proc Natl Acad Sci U S A 110,15530-15537,doi:10.1073/pnas.1315203110(2013))。

FimH由2个结构域构成，即负责结合甘露糖化糖蛋白的凝集素结合域(FimH_LD)和菌毛蛋白结构域。菌毛蛋白结构域用于通过称为供体链交换的机制连接FimH与其他菌毛结构亚基如FimG(Le Trong,I等,J.Struct Biol.2010Dec；172(3):380-8.doi:10.1016/j.jsb.2010.06.002)。FimH菌毛蛋白结构域形成不完全免疫球蛋白折叠，产生的沟提供FimG N末端β链的结合位点，形成FimH与FimG之间的强分子间连接。尽管FimH_LD能以可溶、稳定形式表达，但全长FimH单独并不稳定(Vetsch,M.等.J.Mol.Biol.322:827–840(2002)；Barnhart MM等,Proc Natl Acad Sci U S A.(2000)Jul5；97(14):7709-14)，除非在与伴侣FimC的复合体中或与用肽形式或作为融合蛋白的FimG供体链肽补足(Barnhart MM等.,Proc Natl Acad Sci U S A.(2000)Jul 5；97(14):7709-14；Sauer MM等.Nat Commun.(2016)Mar 7；7:10738；Barnhart MM等.JBacteriol.2003May；185(9):2723-30)。先前描述了通过经甘氨酸-丝氨酸接头来连接FimG供体肽与全长FimH的全长FimH分子的设计和表达(PCT Intl.公开号WO2021/084429,2021年5月6日公开)，并命名为FimH-DSG。

FimH_LD被认为在刺激功能性免疫原性方面是弱免疫原。一些研究表明，尽管能用有或没有佐剂的FimH_LD引发结合抗体滴度，但仅在佐剂存在下观察到功能性中和滴度(PCTIntl.公开号WO2021/084429,2021年5月6日公开)。研究表明将FimH锁定于开放构象，对甘露糖苷配体的亲和性下降，提高功能性免疫原性(Kisiela,D.I.等,Proc Natl Acad Sci US A 110,19089-19094(2013))。因此，本领域需要新的FimH突变体，其对甘露糖苷配体的亲和性下降且生化性质改善，产生相对于野生型FimH提高的功能性免疫原性。

发明概述

本公开涉及大肠杆菌FimH突变多肽(其产生改善的生化性质和免疫原性)的设计，包含这样的多肽的组合物以及其应用。例如，一方面，本公开提供突变的FimH多肽，其相对于野生型FimH多肽的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，其中突变位置选自：F1、P12、G14、G15、G16、A18、P26、V27、V28、Q32、N33、L34、V35、R60、S62、Y64、G65、L68、F71、T86、L107、Y108、L109、V112、S113、A115、G116、V118、A119、A127、L129、Q133、F144、V154、V155、V156、P157、T158、V163和V185，其中氨基酸位置根据SEQ ID NO:59编号。

另一方面是突变的FimH多肽，其包含选自以下的至少一个突变：F1I、F1L、F1V、F1M、F1Y、F1W、P12C、G14C、G15A、G15P、G16A、G16P、A18C、P26C、V27A、V27C、V28C、Q32C、N33C、L34C、L34N、L34S、L34T、L34D、L34E、L34K、L34R、V35C、R60P、S62C、Y64C、G65A、L68C、F71C、T86C、L107C、Y108C、L109C、V112C、S113C、A115V、G116C、V118C、A119C、A119N、A119S、A119T、A119D、A119E、A119K、A119R、A127C、L129C、Q133K、F144C、V154C、V156C、P157C、T158C、V163I和V185I，或其任何组合。例如，突变的FimH多肽包含突变G15A和G16A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变P12C和A18C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变G14C和F144C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变P26C和V35C。还有例如，突变的FimH多肽包含突变P26C和V154C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变P26C和V156C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变V27C和L34C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变V28C和N33C。还有例如，突变的FimH多肽包含突变V28C和P157C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变Q32C和Y108C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变N33C和L109C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含N33C和P157C。还有例如，突变的FimH多肽包含突变V35C和L107C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变V35C和L109C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变S62C和T86C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变S62C和L129C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变Y64C和L68C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变Y64C和A127C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变L68C和F71C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变V112C和T158C。还有例如，突变的FimH多肽包含突变S113C和G116C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变S113C和T158C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变V118C和V156C。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变A119C和V155C。还有例如，突变的FimH多肽包含突变L34N和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变L34S和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变L34T和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变L34D和V27A。还有例如，突变的FimH多肽包含突变L34E和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变L34K和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变L34R和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变A119N和V27A。还有例如，突变的FimH多肽包含突变A119S和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变A119T和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变A119D和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变A119E和V27A。还有例如，突变的FimH多肽包含突变A119K和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变A119R和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变G15A和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变G16A和V27A。还有例如，突变的FimH多肽包含突变G15P和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变G16P和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变G15A、G16A和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变G65A和V27A。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变V27A和Q133K。进一步，例如，突变的FimH多肽包含突变G15A、G16A、V27A和Q133K。进一步，例如，突变的FimH多肽包含SEQ IDNO:2-58和60-64中任一者的序列。进一步，例如，本文所公开的突变的FimH多肽，其中所述多肽是经分离的。

在另一个示例中，本公开提供药物组合物，其包含(i)本文所公开的突变的FimH多肽和(ii)药学上可接受的载体。

在另一个示例中，本公开提供包含本文所公开的突变的FimH多肽的免疫原性组合物。例如，所述免疫原性组合物还包含至少一种额外抗原，如多糖或糖缀合物或蛋白。进一步，例如，所述免疫原性组合物还包含至少一种佐剂。

在另一个示例中，本公开提供核酸分子，其包含编码本文所公开的突变的FimH多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。

在另一个示例中，本公开提供本文所公开的突变的FimH多肽，其中所述多肽具有免疫原性。

本公开还提供重组哺乳动物细胞，其包含编码本文所公开的突变的FimH多肽的多核苷酸。

本公开还提供包含本文所公开的重组细胞的培养物，其中所述培养物的大小是至少5升、至少10升、至少20升、至少50升、至少100升、至少200升、至少500升、至少1000升或至少2000升。

本公开还提供生产本文所公开的突变的FimH多肽的方法，所述方法包括在合适条件下培养本文所公开的重组哺乳动物细胞，从而表达所述多肽；和收获所述多肽。

本公开还提供(i)在对象中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或(ii)在对象中诱导对肠外致病性大肠特异的调理吞噬抗体和/或中和抗体产生的方法，其中所述方法包括给对象施用有效量的本文所公开的组合物。在一个示例中，所述对象处于发展尿路感染的风险。在另一个示例中，所述对象处于发展菌血症的风险。在另一个示例中，所述对象处于发展败血症的风险。在另一个示例中，所述对象处于发展克罗恩氏病的风险。

本公开还提供在哺乳动物中引发针对大肠杆菌的免疫应答的方法，包括给所述哺乳动物施用有效率的本文所公开的组合物。在一个示例中，所述免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体和/或中和抗体。在另一个示例中，所述免疫应答保护哺乳动物免于大肠杆菌感染。

本公开还提供在对象中预防、治疗或缓解细菌性感染、疾病或病症的方法，包括给对象施用免疫有效量的本文所公开的组合物。

附图简要说明

图1A-1B显示FimH_LD和FimH-DSG突变体的圆二色谱。图1A显示近紫外区的圆二色谱，图1B显示远紫外区的圆二色谱。

图2显示FimH_LD突变体在酵母甘露聚糖中和试验中在PD3的相对免疫原性。

图3A-3B显示FimH_LD和FimH-DSG突变体在酵母甘露聚糖中和试验中在PD2(图3A)及PD3(图3B)的免疫原性。

图4是显示用于分离野生型与突变形式的带His标签的FimH-DsG的主要纯化步骤的图。

图5A-5B显示FimH-DSG WT的纯化谱(profile)。图5A是FimH-DSG WT在SP-琼脂糖凝胶(Sepharose)柱上的洗脱谱，图5B是洗脱的级分的SDS-PAGE分析。

图6A-6B显示FimH-DSG G15A G16A V27A突变体的纯化谱。图6A显示FimH-DSGG15A G16A V27A突变体在SP-琼脂糖凝胶柱上的洗脱谱，图6B显示洗脱的级分的SDS-PAGE分析。

图7A-7B显示FimH-DSG蛋白的分析SEC。FimH-DSG G15A G16A V27A的分析SEC如图7A所示，野生型FimH-DSG WT的分析SEC如图7B所示。

图8显示FimH HMW复合体形成机制的示意图。

图9显示非人灵长类的免疫接种计划以及本文实施例21所述的后续攻击。

图10显示用FimH-DSG G15A G16A V27A突变体+4价大肠杆菌O抗原(O1a、O2、O6和O25b)接种NHP后，O抗原血清型特异性抗体的上升。图例：安慰剂(圆形)；FimH-DSG G15AG16A V27A(正方形)；FimH-DSG G15A G16A V27A +4价O抗原(三角形)。

图11A-11B显示用FimH-DSG G15A G16A V27A+/-4重O抗原免疫可引发有力的功能性抗FimH抗体应答。图11A显示来自直接Luminex FimH IgG试验的结果，图11B显示来自大肠杆菌结合抑制试验的结果。如本文所用，术语“4重”与术语“4价”具有相同意义且可互换。

图12显示接种疫苗的非人灵长类(NHP)在如实施例21所述攻击后的菌尿症减少。图例：安慰剂(圆形)；FimH-DSG G15A G16A V27A(正方形)；FimH-DSG G15A G16AV27A +4价O抗原(三角形)；*p≤0.007相较安慰剂组。

图13A-13C显示接种疫苗的NHP在以下3组攻击后的感染生物标志物减少：安慰剂，单独FimH-DSG G15A G16AV27A和FimH-DSG G15A G16A V27A+4价O抗原，如实施例21所述。图13A显示尿液中的MPO定量，图13B显示尿液中的IL-8定量，图13C显示尿液中PMN增加的动物百分比。图例：安慰剂(圆形)；FimH-DSG G15A G16AV27A (正方形)；FimH-DSG G15A G16AV27A +4价O抗原(三角形)。

序列标识

SEQ ID NO:1列出野生型大肠杆菌FimH_LD(FimHLD_WT)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2列出突变体大肠杆菌FimHLD_G65A_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3列出突变体大肠杆菌FimHLD_F1I的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4列出突变体大肠杆菌FimHLD_F1L的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5列出突变体大肠杆菌FimHLD_F1V的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6列出突变体大肠杆菌FimHLD_F1M的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7列出突变体大肠杆菌FimHLD_F1Y的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8列出突变体大肠杆菌FimHLD_F1W的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9列出突变体大肠杆菌FimHLD_Q133K的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10列出突变体大肠杆菌FimHLD_G15A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11列出突变体大肠杆菌FimHLD_G15P的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12列出突变体大肠杆菌FimHLD_G16A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13列出突变体大肠杆菌FimHLD_G16P的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14列出突变体大肠杆菌FimHLD_G15A_G16A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15列出突变体大肠杆菌FimHLD_R60P的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16列出突变体大肠杆菌FimHLD_G65A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17列出突变体大肠杆菌FimHLD_P12C_A18C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18列出突变体大肠杆菌FimHLD_G14C_F144C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19列出突变体大肠杆菌FimHLD_P26C_V35C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20列出突变体大肠杆菌FimHLD_P26C_V154C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21列出突变体大肠杆菌FimHLD_P26C_V156C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22列出突变体大肠杆菌FimHLD_V27C_L34C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23列出突变体大肠杆菌FimHLD_V28C_N33C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24列出突变体大肠杆菌FimHLD_V28C_P157C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25列出突变体大肠杆菌FimHLD_Q32C_Y108C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26列出突变体大肠杆菌FimHLD_N33C_L109C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27列出突变体大肠杆菌FimHLD_N33C_P157C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28列出突变体大肠杆菌FimHLD_V35C_L107C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29列出突变体大肠杆菌FimHLD_V35C_L109C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:30列出突变体大肠杆菌FimHLD_S62C_T86C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:31列出突变体大肠杆菌FimHLD_S62C_L129C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:32列出突变体大肠杆菌FimHLD_Y64C_L68C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:33列出突变体大肠杆菌FimHLD_Y64C_A127C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:34列出突变体大肠杆菌FimHLD_L68C_F71C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:35列出突变体大肠杆菌FimHLD_V112C_T158C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:36列出突变体大肠杆菌FimHLD_S113C_G116C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:37列出突变体大肠杆菌FimHLD_S113C_T158C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:38列出突变体大肠杆菌FimHLD_V118C_V156C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:39列出突变体大肠杆菌FimHLD_A119C_V155C的氨基酸序列。

SEQ ID NO:40列出突变体大肠杆菌FimHLD_L34N_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:41列出突变体大肠杆菌FimHLD_L34S_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:42列出突变体大肠杆菌FimHLD_L34T_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:43列出突变体大肠杆菌FimHLD_A119N_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:44列出突变体大肠杆菌FimHLD_A119S_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:45列出突变体大肠杆菌FimHLD_A119T_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:46列出突变体大肠杆菌FimH-DSG_A115V的氨基酸序列。

SEQ ID NO:47列出突变体大肠杆菌FimH-DSG_V163I的氨基酸序列。

SEQ ID NO:48列出突变体大肠杆菌FimH-DSG_V185I的氨基酸序列。

SEQ ID NO:49列出突变体大肠杆菌FimH-DSG_DSG_V3I的氨基酸序列。

SEQ ID NO:50列出突变体大肠杆菌FimHLD_G15A_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:51列出突变体大肠杆菌FimHLD_G16A_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:52列出突变体大肠杆菌FimHLD_G15P_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:53列出突变体大肠杆菌FimHLD_G16P_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:54列出突变体大肠杆菌FimHLD_G15A_G16A_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:55列出突变体大肠杆菌FimHLD_V27A_R60P的氨基酸序列。

SEQ ID NO:56列出突变体大肠杆菌FimHLD_G65A_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:57列出突变体大肠杆菌FimHLD_V27A_Q133K的氨基酸序列。

SEQ ID NO:58列出突变体大肠杆菌FimHLD_G15A_G16A_V27A_Q133K的氨基酸序列。

SEQ ID NO:59列出野生型大肠杆菌全长FimH(FimH-DSG_WT)的氨基酸序列，包括经接头连接的供体链FimG肽。

SEQ ID NO:60列出突变体大肠杆菌FimH-DSG_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:61列出突变体大肠杆菌FimH-DSG_G15A_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:62列出突变体大肠杆菌FimH DSG_G15A_G16A_V27A的氨基酸序列。

SEQ ID NO:63列出突变体大肠杆菌FimH DSG_V27A_Q133K的氨基酸序列。

SEQ ID NO:64列出突变体大肠杆菌FimH DSG_G15A_G16A_V27A_Q133K的氨基酸序列。

SEQ ID NO:65列出小鼠Ig Kappa信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:66–108列出纳米结构相关的多肽或其片段的氨基酸和核酸序列。

SEQ ID NO:109–PCR引物。

SEQ ID NO:110–PCR引物。

SEQ ID NO:111–PCR探针。

SEQ ID NO:112列出O25b 2401WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:113列出O25a:K5:H1WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:114列出O25a ETEC ATCC WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:115列出K12 W3110 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:116列出沙门氏菌(Salmonella)LT2 WzzB氨基酸序列。

SEQ ID NO:117列出O25b 2401FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:118列出O25a:K5:H1FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:119列出O25a ETEC ATCC FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:120列出O157 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:121列出沙门氏菌LT2 FepE氨基酸序列。

SEQ ID NO:122列出LT2wzzB_S的引物序列。

SEQ ID NO:123列出LT2wzzB_AS的引物序列。

SEQ ID NO:124列出O25bFepE_S的引物序列。

SEQ ID NO:125列出O25bFepE_A的引物序列。

SEQ ID NO:126列出wzzB P1_S的引物序列。

SEQ ID NO:127列出wzzB P2_AS的引物序列。

SEQ ID NO:128列出wzzB P3_S的引物序列。

SEQ ID NO:129列出wzzB P4_AS的引物序列。

SEQ ID NO:130列出O157 FepE_S的引物序列。

SEQ ID NO:131列出O157 FepE_AS的引物序列。

SEQ ID NO:132列出pBAD33_adaptor_S的引物序列。

SEQ ID NO:133列出pBAD33_adaptor_AS的引物序列。

SEQ ID NO:134列出JUMPSTART_r的引物序列。

SEQ ID NO:135列出gnd_f的引物序列。

SEQ ID NO:136列出人IgG受体FcRn大亚基p51信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:137列出人IL10蛋白信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:138列出人呼吸道合胞病毒A(毒株A2)融合糖蛋白F0信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:139列出甲型流感血凝素信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:140-147列出用于信号肽预测的来自各种物种SignalP 4.1(DTUBioinformatics)序列。

发明详述

本公开涉及大肠杆菌FimH突变的多肽(突变体)、包含FimH突变体的组合物、生产和纯化FimH突变体的方法、编码FimH突变体的核酸、包含这样的核酸的宿主细胞，以及使用包含FimH突变体的组合物的方法。

本文列举数值范围仅意在用作分别提及范围内各不同的值的快捷方法。除非本文另有说明，各单独值并入说明书，就如其在本文中单独列举。本文所述的全部方法能以任何合适顺序进行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。使用本文所提供的任何及所有示例或示范性语言(例如“如”)仅意在进一步阐明本公开而不对权利要求范围造成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指明任何未要求保护的要素对实施本公开是必要的。

在本公开通篇引用若干文件。本文所引用的各文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、厂商说明书、使用说明等)，在前或在后，都通过引用全文并入本文。本文任何内容都不应被解释为承认本公开不被承认先于这些公开。

定义

本文所用术语“约”指大致或接近，且在一个实施方案中，在本文所示数值或范围的上下文中，指所列举或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％或±3％。

术语“一(a和an)”及“所述”以及描述本公开上下文(特别是权利要求上下文)中所用的类似词语(reference)应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

对于氨基酸序列(肽或蛋白)，“片段”涉及部分氨基酸序列，即代表在N末端和/或C末端缩短的氨基酸序列的序列。可获得在C末端缩短的片段(N末端片段)，如通过翻译缺乏开放阅读框3’末端的截短的开放阅读框。可获得在N末端缩短的片段(C末端片段)，如通过翻译缺乏开放阅读框5’末端的截短的开放阅读框获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的氨基酸残基的至少50％、至少60％,至少70％、至少80％、至少90％。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6，尤其是至少8、至少12、至少15、至少20、至少30、至少50或至少100个连续氨基酸。

本文所用术语“野生型”或“WT”或“天然的”指自然中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白具有未有意修饰的氨基酸序列。

本文所用术语氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)的“变体”，或“突变体”，或者提及“突变的”多肽时，包括氨基酸插入变体/突变体、氨基酸添加变体/突变体、氨基酸缺失变体/突变体和/或氨基酸取代变体/突变体。术语“变体”或“突变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，尤其是天然出现的那些。特别地，术语“变体”或“突变体”包括氨基酸序列片段。

氨基酸插入变体包含特定氨基酸序列中单一或者2个或更多氨基酸插入。在有插入的氨基酸序列情况中，一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列特定位点，尽管适当筛选所得产物的随机插入也是可能的。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸，如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多氨基酸的氨基-和/或羧基-末端融合。氨基酸缺失变体的特征是从序列中去除一个或多个氨基酸，如去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多氨基酸。缺失可以在蛋白任意位置。在蛋白N末端和/或C末端处包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N末端和/或C末端截短变体。氨基酸取代变体的特征是去除序列中至少一个残基且另一残基插入其位置。优选修饰处于氨基酸序列中同源蛋白或肽之间不保守的位置和/或氨基酸用具有类似特性的氨基酸取代。优选地，肽和蛋白变体的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即取代类似带电或不带电氨基酸。保守氨基酸变化涉及取代侧链相关的氨基酸的家族之一。天然存在的氨基酸一般分成4个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同分类为芳族氨基酸。在一个实施方案中，所述保守氨基酸取代包括下列组内的取代：

甘氨酸、丙氨酸；

缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；

天冬氨酸、谷氨酸；

天冬酰胺、谷氨酰胺；

丝氨酸、苏氨酸；

赖氨酸、精氨酸；和

苯丙氨酸、酪氨酸。

优选地，给定氨基酸序列与所述给定氨基酸序列变体的氨基酸序列之间的相似性优选相同性的程度是至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。相似性或相同性的程度优选对于参考氨基酸序列完整长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，若参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，相似性或相同性的程度优选对于至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸给出，在一些实施方案中，所述氨基酸是连续氨基酸。在一些实施方案中，所述相似性或相同性的程度对于完整长度的参考氨基酸序列给出。用于确定序列相似性优选序列相同性的比对，能用本领域已知工具完成，优选用最佳序列比对，例如用Align，采用标准设置，优选EMBOSS::needle,Matrix:Blosum62,Gap Open 10.0,GapExtend 0.5。

本文所用“序列相似性”指相同的或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。2条氨基酸序列之间的“序列相同性”指序列之间相同的氨基酸百分比。2条核酸序列之间的“序列相同性”指序列之间相同的核苷酸的百分比。

具体地，本术语“％相同的”、“％相同性”或类似术语意指最优比对中在待比较序列之间相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计的，而2条序列之间的差异可以但不必定随机分布于待比较的序列的完整长度上。2条序列的比较通常如下进行：在最优比对后，对于区段或“比较窗”比较序列，以鉴定对应序列的局部区域。用于比较的最优比对可手动完成，或用Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法协助，用Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法协助，用Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的局部同源性算法协助，或用使用所述算法的计算机程序协助(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，WisconsinGenetics软件包，GCG(Genetics Computer Group),575Science Drive,威斯康星州麦迪逊)。在一些实施方案中，所述2条序列的相同性百分比用BLASTN或BLASTP算法确定，所述算法可获自美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(例如blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LIN K_LOC＝align2seq)。在一些实施方案中，用于NCBI网站上BLASTN算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)匹配/错配分数设置为1,-2；(v)空位成本设置为线性；和(vi)所用低复杂度区域的过滤器。在一些实施方案中，用于NCBI网站上BLASTP算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)空位成本设置为存在:11延伸:1；和(vi)条件成分得分矩阵调整。

相同性百分比如下获得：确定待比较的序列对应的相同位置数，将此数字除以待比较的位置数(如参考序列中的位置数)，把该结果乘以100。

在一些实施方案中，所述相似性或相同性的程度对于参考序列完整长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出。例如，若参考核酸序列由200个核苷酸组成，相同性的程度对于至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸给出，在一些实施方案中，所述核苷酸是连续核苷酸。在一些实施方案中，所述相似性或相同性的程度对于完整长度的参考序列给出。

同源氨基酸序列根据本公开显示至少40％，尤其是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％且优选至少95％、至少98或至少99％的氨基酸残基的相同性。本文所述氨基酸序列变体/突变体易由技术人员制备，例如通过重组DNA操作。例如，DNA序列操作详述于Sambrook等.(1989)，所述操作用于制备有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白。此外，本文所述肽和氨基酸变体在已知肽合成技术协助下容易制备，例如通过固相合成和类似方法。

一方面，氨基酸序列(肽或蛋白)的片段或变体/突变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体/突变体”涉及显示一种或多种功能性质的任意片段或变体/突变体，所述性质与其衍生自的氨基酸序列相同或类似，即其在功能上是等同的。关于抗原或抗原性序列，一个特定功能是衍生所述片段或变体的氨基酸序列所展示的一种或多种免疫原性活性。具体地，本文所用术语“功能性片段”或“功能性变体/突变体”指一种变体/突变体分子或序列，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列相较于亲本分子或序列的氨基酸序列改变一个或多个氨基酸，且仍能实现亲本分子或序列的一种或多种功能，如诱导免疫应答。一方面，亲本分子或序列的氨基酸序列修饰不显著影响或改变分子或序列的特征。在不同实施方案中，所述功能性片段或功能性变体的功能可减少，但仍显著存在，如功能性变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在其它实施方案中，所述功能性片段或功能性变体的免疫原性可相较于亲本分子或序列增强。

本文所用“经分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活体动物内的核酸或肽不是“经分离的”，但部分或完全与其天然状态共存物质分离的相同核酸或肽是“经分离的”。经分离的核酸或蛋白能以基本纯形式存在，或能在非天然环境，例如宿主细胞中存在。

I.大肠杆菌FimH多肽

菌毛粘附素(包括1型菌毛)结合上皮层中或分泌入尿液的甘露糖基化的糖蛋白。1型菌毛在临床UPEC分离物中高度保守且由称为fim的基因簇编码，所述基因簇编码辅助蛋白(FimC、FimD)、各种结构亚基(FimE、FimF、FimG)和称为FimH的粘附素。FimH由2个结构域构成，即负责结合甘露糖基化的糖蛋白的凝集素结合域(FimH_LD)，和菌毛蛋白结构域。菌毛蛋白结构域用于连接FimH与其他菌毛结构亚基如FimG，这是通过称为供体链交换的机制进行的。FimH菌毛蛋白结构域形成不完整的免疫球蛋白折叠，产生的沟提供FimG的N末端β链的结合位点，形成FimH与FimG之间的强分子间键。尽管FimH_LD能以可溶、稳定形式表达，全长FimH单独并不稳定，除非与伴侣FimC复合或与肽形式或作为融合蛋白的FimG的供体链肽互补。因此，通过将FimG供体肽与全长FimH的C末端经甘氨酸-丝氨酸接头连接，表达稳定的全长FimH分子是可能的，并命名为FimH-DSG。

一方面，本公开提供突变的FimH多肽，如表1所示那些。相对于对应的野生型(WT)FimH多肽的氨基酸序列，这样的突变体提供氨基酸序列中的突变。在一些方面，这样的突变体具有针对野生型FimH蛋白或针对表达野生型FimH多肽的细菌的免疫原性。在某些方面，FimH突变体具备某些有益特征，如相较于对应的野生型FimH多肽增加的免疫原性性质。

本文所用术语“FimH多肽”涉及全长野生型大肠杆菌FimH多肽的任意结构域，全长野生型大肠杆菌FimH多肽的结构域的任意组合，或全长大肠杆菌FimH多肽，或其任何片段。例如，在一个实施方案中，本公开提供突变的FimH多肽，其是突变FimH_LD多肽或FimH-DSG多肽。本公开涉及新的FimH_LD和FimH-DSG突变体，其对甘露糖苷配体的亲和性下降(通过生物化学和生物物理学分析确认)，这改善功能性免疫原性且描述这些突变体相对于野生型FimH_LD的中和反应评估。

FimH突变体多肽中引入的氨基酸突变能包括氨基酸取代、缺失或添加。在一些方面，FimH多肽突变体氨基酸序列中的仅有的突变是相对于野生型FimH蛋白的氨基酸取代。

表1:FimH野生型和突变体序列

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野生型FimH多肽的氨基酸序列是本领域熟知的。例如，FimH_LD结构域的氨基酸序列在本文中提供为SEQ ID NO:1。全长野生型FimH多肽，包括经甘氨酸-丝氨酸接头与全长FimH的C末端连接的FimG供体肽，在本文中提供为SEQ ID NO:59。编码这样的氨基酸序列的核酸序列也是本领域熟知的。

在本公开的一方面，某些突变的FimH多肽产生锁定的、开放的构象，其导致对甘露糖苷配体的亲和性下降且导致功能性免疫原性改善。因此，这样的FimH突变体能用作针对大肠杆菌感染的免疫原性组合物(如疫苗)中的抗原。由于野生型FimH_LD在其刺激功能性免疫原性能力方面被视作弱免疫原，这样的FimH突变体能提供改善的用于这些免疫原性组合物的抗原。

一方面，如实施例1所述，尝试设计FimH突变体以将FimH凝集素结构域锁于开放的构象，从而降低对甘露糖苷配体的亲和性。这样的突变体能包括至少1、2、3、4、5个或更多突变。突变能包括：在尿路感染分离物中常见的天然存在的氨基酸取代(V27A)；FimH_LD配体结合侧的取代(如在位置F1和Q133)；FimH_LD中的甘氨酸开关突变(如在位置G15、G16和G65)；引入半胱氨酸对用于FimH_LD中的二硫键稳定化(如在位置对P12-A18；G14-F144；P26-V35；P26-V154；P26-V156；V27-L34；V28-N33；V28-P157；Q32-Y108；N33-L109；N33-P157；V35-L107；V35–L109；S62–T86；S62–L129；Y64–A127；L68–F71；V112–T158；S113–T158；V118–V156；和/或A119–V155)；FimH_LD中的非极性到极性的突变(如在位置V27、L34、A119或其任意组合)；在FimH-DSG的菌毛蛋白-凝集素界面处的腔填充突变(如在位置A115、V163、V185或V3，在DSG序列内)；或突变类型与上示氨基酸位置的任意组合。另一方面，本公开提供FimH突变体，如SEQ ID NO:2-58和60-64所提供，或这些序列中任一者所示的突变体的任何组合。另一方面，本公开提供SEQ ID NO:23、50、51、52、53、54、60和62中任一者的FimH突变体。另外一方面，本公开提供SEQ ID NO:62的FimH突变体。

另一方面，本公开提供SEQ ID NO:2-58和60-64所提供的FimH突变体的任一者，其中所述突变体是经分离的。例如，一方面，本公开提供SEQ ID NO:23、50、51、52、53、54、60和62中任一者的FimH突变体，其中所述FimH突变体是经分离的。另一方面，本公开提供SEQ IDNO:62的FimH突变体，其中所述FimH突变体是经分离的。

因此，在一些特定方面，本公开提供包含引入的突变的组合的FimH突变体，其中所述突变包括表1所提供任一突变体中(即在SEQ ID NO:2-58和60-64中)列出的突变的组合。可以使野生型FimH多肽序列形成表1中各突变体中提供的氨基酸取代的任意组合以获得不同FimH突变体。本公开范围也涵盖FimH突变体，其基于任意其他亚型或菌株的天然FimH多肽序列且包含本文所述的突变的任意组合。

本公开的另一方面是与SEQ ID NO:1-64中任一者至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽。在一个优选方面，所述多肽与SEQ ID NO:62至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。本发明的另外一方面是SEQ ID NO:1-64任一者至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的多肽。在一个优选方面，所述多肽与SEQ IDNO:62至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同。

本公开所提供的FimH突变体能通过本领域已知常规方法制备，如在重组宿主系统中用适当载体表达。合适的重组宿主细胞包括例如昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、细菌和酵母细胞。合适的昆虫细胞示例包括例如Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞(克隆分离物，衍生自亲代Trichoplusiani BTI-TN-5B1-4细胞系(英杰公司(Invitrogen))。合适的哺乳动物细胞示例包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞(HEK293或Expi 293细胞，一般由经剪切的5型腺病毒DNA转化)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞和HeLa细胞。合适的禽类细胞包括例如鸡胚胎干细胞(如细胞)、鸡胚成纤维细胞、鸡胚生殖细胞、鹌鹑成纤维细胞(如ELL-O)和鸭细胞。合适的昆虫细胞表达系统如杆状病毒载体系统是本领域技术人员已知的，且描述于例如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料与方法以试剂盒形式市售可得，尤其是英杰公司，加利福尼亚州圣地亚哥。禽类细胞表达系统是本领域技术人员已知的，且描述于例如美国专利号5,340,740；5,656,479；5,830,510；6,114,168；和6,500,668。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域已知的，且描述于例如《酵母遗传工程》(Yeast Genetic Engineering)(Barr等,编,1989)伦敦巴特沃思出版社(Butterworths)。

用于在昆虫或哺乳动物细胞中表达重组蛋白的一些合适载体是本领域熟知的且是常规的。合适的载体能包含一些组分，包括但不限于以下中的一种或多种：复制起点；选择标记基因；一个或多个表达控制元件，如转录控制元件(如启动子、增强子、终止子)和/或一个或多个翻译信号；和用于在选定宿主细胞中靶向分泌通路的信号序列或前导序列(如哺乳动物来源或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种)。例如，对于昆虫细胞中的表达，合适的杆状病毒表达载体如pFastBac(英杰公司)，用于产生重组杆状病毒颗粒。杆状病毒颗粒经扩增并用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。对于哺乳动物细胞中的表达，所用载体会驱动所需哺乳动物宿主细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)中的构建体表达。

FimH突变体多肽能用任何合适方法分离。例如，通过免疫亲和层析来纯化FimH蛋白突变体多肽的方法是本领域已知的，Ruiz-Arguello等,J.Gen.Virol.,85:3677-3687(2004)。本领域熟知纯化所需蛋白的适当方法，包括沉淀和多种类型的层析，如疏水相互作用、离子交换、亲和、螯合及尺寸排阻。合适的纯化方案能用这些或其他合适方法中的2种或更多来建立。若需要，FimH突变体多肽能包括促进纯化的“标签”，如表位标签或组氨酸(His)标签。这样的带标签的多肽能方便地分离，例如通过螯合层析或亲和层析从条件培养基分离。

本文所用术语“抗原”指能由抗体识别的分子。抗原的示例包括多肽、肽、脂质、多糖和含有抗原决定簇的核酸，如由免疫细胞识别的那些。

II.编码FimH突变体的核酸

另一方面，本公开提供编码本文所公开的FimH突变体的核酸分子。这样的核酸分子包括DNA、cDNA和RNA序列。在一个实施方案中，所述核酸分子能并入载体，如表达载体。

一方面，公开了编码大肠杆菌FimH突变的多肽或任意片段的核酸。编码FimH突变体多肽或其片段的一个或多个核酸构建体可用于基因组整合和后续多肽表达。例如，编码FimH突变体多肽或其片段的单一核酸构建体可引入宿主细胞。或者，多肽编码序列可由2个或多个核酸构建体携带，所述构建体随后同时或依序引入宿主细胞。

例如，在一个示范性实施方案中，单一核酸构建体编码大肠杆菌FimH的凝集素结构域和菌毛蛋白结构域。在另一示范性实施方案中，一个核酸构建体编码大肠杆菌FimH的凝集素结构域且第二核酸构建体编码大肠杆菌FimH的菌毛蛋白结构域。在一些方面，实现基因组整合。

核酸构建体可包含基因组DNA(包含一个或多个内含子)或者cDNA。当内含子存在时，一些基因更高效地表达。在一些方面，所述核酸序列适合在所述哺乳动物细胞中表达外源多肽。

在一些方面，编码多肽或其片段的核酸进行密码子优化以提高任意特定细胞中的表达水平。

在一些方面，核酸构建体包括信号序列，其编码的肽指导衍生自大肠杆菌的多肽或其片段分泌。在一些方面，核酸包括从大肠杆菌FimH衍生的多肽的天然信号序列。在一些方面，当衍生自大肠杆菌的多肽或其片段包括内源信号序列时，编码信号序列的核酸序列可进行密码子优化以提高宿主细胞中的蛋白表达水平。

在一些方面，信号序列具有下列任何长度：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个氨基酸长。在一些方面，信号序列长度是20个氨基酸。在一些方面，信号序列长度是21个氨基酸。

在一些方面，当多肽或其片段包括信号序列时，可用与野生型多肽不相关的信号序列取代与多肽天然相关的内源信号序列，以提高多肽或其片段在培养的细胞中的表达。因此，在一些方面，核酸不包括衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的天然信号序列。在一些方面，核酸不包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽的天然信号序列。在一些方面，衍生自大肠杆菌的多肽或其片段可与异源肽一起表达，其优选是在衍生自大肠杆菌的成熟蛋白或者多肽或其片段的N末端具有特定切割位点的信号序列或其他肽。例如，衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段可与异源肽(如IgK信号序列)一起表达，其优选是在成熟大肠杆菌FimH蛋白N末端具有特定切割位点的信号序列或其他肽。在优选的方面，成熟的蛋白大肠杆菌FimH N末端处的特定切割位点紧接在成熟大肠杆菌FimH蛋白初始苯丙氨酸残基前出现。选定的异源序列优选是宿主细胞识别和加工(即由信号肽酶切割)的序列。

在优选的方面，信号序列是IgK信号序列。在一些方面，核酸编码具有SEQ ID NO:1-64任一者所示的氨基酸序列的多肽。在一些方面，核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:23、50、51、52、53、54、60、61或62。在一些方面，核酸编码具有SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的多肽。在优选方面，信号序列是小鼠IgK信号序列。

用于生产FimH突变体多肽或其片段的合适哺乳动物表达载体是本领域已知的且是市售可得的，如来自Invitrogen^TM的pSecTag2表达载体。示范性小鼠Ig Kappa信号肽序列包括序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:65)。在一些方面，载体包括来自赛默飞世尔(Thermo Fisher)的pBudCE4.1哺乳动物表达载体。另外的示范性和合适的载体包括pcDNA^TM3.1哺乳动物表达载体(赛默飞世尔)。

在一些方面，信号序列不包括血球凝集素信号序列。

在一些方面，核酸序列包括FimH多肽或其片段的天然信号序列。在一些方面，信号序列不是IgK信号序列。在一些方面，信号序列包括血球凝集素信号序列。

一方面，本文公开包括FimH突变体多肽或其片段的编码序列的载体。示范性载体包括在哺乳动物细胞中能够自主复制或能够被复制的质粒。典型的表达载体含有合适的启动子、增强子和终止子，其用于调节表达构建体中的编码序列表达。载体还可包括选择标记以提供表型性状来选择经转化的宿主细胞(例如，赋予对抗生素如氨苄青霉素或新霉素的抗性)。

本领域已知合适启动子。示范性启动子包括例如CMV启动子、腺病毒、EF1 a、GAPDH金属硫蛋白启动子、SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子等。

还可使用内部核糖体进入位点(IRES)和2A肽序列。IRES和2A肽提供用于共表达多种序列的替代方法。IRES是核苷酸序列，其允许在信使RNA(mRNA)序列中间起始翻译，作为更大蛋白质合成工艺的一部分。通常，在真核细胞中，翻译可仅在mRNA分子5'末端起始。IRES元件允许多个基因在一个转录物中表达。基于IRES的多顺反子载体从一个转录本表达多种蛋白，可减少非表达克隆从选择逃逸。2A肽允许多种蛋白在单一开放阅读框中翻译成多蛋白，其随后经核糖体跳跃机制切割成单独的蛋白。2A肽可提供多种蛋白产物的更平衡的表达。示范性IRES序列包括例如EV71 IRES、EMCV IRES、HCV IRES。对于基因组整合，整合可以是位点特异性的或随机的。通过将同源序列引入本文所述的核酸构建体，可实现位点特异性重组。这样的同源序列基本匹配宿主基因组中特定靶位点的内源序列。或者，可使用随机整合。有时，蛋白表达水平可根据整合位点而变化。因此，可能需要根据重组蛋白表达水平来选择一些克隆以鉴定实现所需的表达水平的克隆。

示范性的核酸构建体进一步在图中描述，如2021年5月6日公开的PCT Intl.公开号WO2021/084429的图2A-2T，其通过引用并入本文。

一方面，核酸序列编码与SEQ ID NO:1-64任一者有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的氨基酸序列。在一个优选方面，核酸序列编码与SEQ ID NO:62至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％,至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在本发明的另一方面，核酸序列编码与SEQ ID NO:1-64任一者至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的核酸序列。在一个优选方面，核酸序列编码与SEQ ID NO:62至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的氨基酸序列。

在本公开的某些方面，RNA是信使RNA(mRNA)，其涉及编码肽或蛋白的RNA转录物。如本领域所建立，mRNA一般包含5'非翻译区(5'-UTR)、肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，所述RNA通过体外转录和化学合成产生。在一个实施方案中，所述mRNA通过用DNA模板体外转录产生，其中DNA指含有脱氧核苷酸的核酸。一方面，本文所述的RNA可具有经修饰的核苷。在一些方面，RNA包含取代至少一个(如每一个)尿苷的经修饰的核苷。

在一些实施方案中，本文所述的组合物或医疗制品包含RNA，所述RNA编码包含FimH突变体多肽的氨基酸序列。同样，本文所述的方法包括施用这样RNA。本文所用的一个可能平台是基于抗原编码RNA疫苗以诱导稳健中和抗体和陪伴/伴随T细胞应答，以实现保护性免疫且优选极小的疫苗剂量。施用的RNA优选是体外转录的RNA。尤其优选3种不同的RNA平台，即含有未经修饰的尿苷的mRNA(uRNA)、核苷经修饰的mRNA(modRNA)和自扩增RNA(saRNA)。在一个尤其优选方面，RNA是体外转录的RNA。

III.宿主细胞

一方面，本公开涉及细胞，其中编码FimH突变体多肽的序列或其片段在哺乳动物宿主细胞中表达。在一个实施方案中，所述多肽在宿主细胞中瞬时表达。在另一个实施方案中，所述多肽稳定整合入宿主细胞基因组，当在适当条件下培养时，表达多肽或其片段。在一个优选实施方案中，所述多核苷酸序列以高效率和基因组稳定性表达。

本领域已知合适的哺乳动物宿主细胞。优选地，宿主细胞适合以工业生产规模产生蛋白。示范性哺乳动物宿主细胞包括以下任何一种和其衍生物：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞(细胞系衍生自猴肾(非洲绿猴))、Vero细胞、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞、NSO细胞(鼠骨髓瘤细胞系)和C127细胞(非致瘤性小鼠细胞系)。其他示范性哺乳动物宿主细胞包括小鼠Sertoli(TM4)、buffalo大鼠肝(BRL 3A)、小鼠如腺瘤(MMT)、大鼠肝癌(HTC)、小鼠骨髓瘤(NSO)、鼠杂交瘤(Sp2/0)、小鼠胸腺瘤(EL4)、中国仓鼠卵巢(CHO)和CHO细胞衍生物、鼠胚胎(NIH/3T3、3T3 Li)、大鼠心肌(H9c2)、小鼠成肌细胞(C2C12)和小鼠肾(miMCD-3)。其他哺乳动物细胞示例包括NS0/1、Sp2/0、Hep G2、PER.C6、COS-7、TM4、CV1、VERO-76、MDCK、BRL 3A、W138、MMT 060562、TR1、MRC5和FS4。

易受细胞培养影响的任意细胞可根据本发明使用。在一些方面，细胞是哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞非限制性示例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l，ECACC No:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell，荷兰莱顿)；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或亚克隆以在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠yophil细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；小鼠肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562,ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。在一些优选实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在一些优选方面，细胞是GS-细胞。

另外，任意数目的市售和非市售可得的杂交瘤细胞系可根据本发明使用。本文所用术语“杂交瘤”指由永生化细胞与抗体产生细胞的融合产生的细胞或细胞的后代。这样获得的杂交瘤是产生抗体的永生化细胞。用于产生杂交瘤的个体细胞能来自任何哺乳动物源，包括但不限于大鼠、猪、兔、绵羊、猪、山羊和人。在一些方面，杂交瘤是三源杂交瘤细胞系，其在异种杂交骨髓瘤融合物后代与浆细胞后续融合时产生，所述融合物是人细胞与鼠骨髓瘤细胞系之间的融合产物。在一些方面，杂交瘤是产生抗体的任何永生化杂交细胞系，例如四源杂交瘤(参见例如Milstein等,Nature537:3053(1983))。本领域技术人员应理解杂交瘤细胞系可有不同营养需求和/或可能要求不同培养条件用于最优生长，且能够按需修改条件。

在一些方面，所述细胞包含第一感兴趣的基因，其中所述第一感兴趣的基因是染色体整合的。在一些方面，第一感兴趣的基因包括报告基因、选择基因、感兴趣的基因(如编码衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些方面，感兴趣的治疗基因包括编码难表达(difficult to express，DtE)蛋白的基因。

在一些方面，第一感兴趣的基因位于位点特异性整合(SSI)的哺乳动物细胞中的2个不同重组靶位点(RTS)之间，其中2个RTS在NL1基因座或NL2基因座内染色体整合。NL1基因座、NL2基因座、NL3基因座、NL4基因座、NL5基因座和NL6基因座的描述，参见例如美国专利申请公开号20200002727，在一些方面，第一感兴趣的基因位于NL1基因座内。在一些方面，所述细胞包含第二感兴趣的基因，其中第二感兴趣的基因是染色体整合的。在一些方面，第二感兴趣的基因包括报告基因、选择基因、感兴趣的治疗基因(如FimH突变体多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些方面，感兴趣的治疗基因包括编码DtE蛋白的基因。在一些方面，第二感兴趣的基因位于2个RTS之间。在一些方面，第二感兴趣的基因位于NL1或NL2基因座内。在一些方面，第一感兴趣的基因位于NL1基因座内，且第二感兴趣的基因位于NL2基因座内。在一些方面，所述细胞包括第三感兴趣的基因，其中第三感兴趣的基因是染色体整合的。在一些方面，第三感兴趣的基因包括报告基因、选择基因、感兴趣的治疗基因(如衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)、辅助基因或其组合。在一些方面，感兴趣的治疗基因包括编码DtE蛋白的基因。在一些方面，第三感兴趣的基因位于2个RTS之间。在一些方面，第三感兴趣的基因位于NL1基因座或NL2基因座内。在一些方面，第三感兴趣的基因位于和NL1基因座及NL2基因座不同的基因座内。在一些方面，第一感兴趣的基因、第二感兴趣的基因和第三感兴趣的基因位于3个不同的基因座内。在一些方面，第一感兴趣的基因、第二感兴趣的基因和第三感兴趣的基因中的至少一个位于NL1基因座内，第一感兴趣的基因、第二感兴趣的基因和第三感兴趣的基因中的至少一个位于NL2基因座内。在一些方面，所述细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些方面，位点特异性重组酶基因是染色体整合的。

在另一方面，本公开提供包含至少4个不同RTS的哺乳动物细胞，其中所述细胞包含(a)至少2个不同RTS在NL1基因座或NL2基因座内染色体整合；(b)第一感兴趣的基因在(a)的至少2个RTS之间整合，其中第一感兴趣的基因包括报告基因、编码DtE蛋白的基因、辅助基因或其组合；(c)第二感兴趣的基因在不同于(a)基因座的第二染色体基因座内整合，其中第二感兴趣的基因包括报告基因、编码DtE蛋白(如衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)的基因、辅助基因或其组合。在一些方面，本公开提供包含至少4个不同RTS的哺乳动物细胞，其中所述细胞包含(a)至少2个不同RTS在Fer1L4基因座内染色体整合；(b)至少2个不同RTS在NL1基因座或NL2基因座内染色体整合；(c)第一感兴趣的基因在Fer1L4基因座内染色体整合，其中第一感兴趣的基因包括报告基因、编码DtE蛋白的基因、辅助基因或其组合；和(d)第二感兴趣的基因在(b)的NL1基因座或NL2基因座内染色体整合，其中第二感兴趣的基因包括报告基因、编码DtE蛋白(如衍生自大肠杆菌的多肽或其片段)的基因、辅助基因或其组合。

在一些方面，本公开提供含至少6个不同RTS的哺乳动物细胞，其中所述细胞包括(a)至少2个不同RTS和第一感兴趣的基因在Fer1L4基因座内染色体整合；(b)至少2个不同RTS和第二感兴趣的基因在NL1基因座内染色体整合；和(c)至少2个不同RTS和第三感兴趣的基因在NL2基因座内染色体整合。

本文所涉及的术语“以可操作组合”“以可操作顺序”和“可操作连接”指核酸序列连接的方式使得核酸分子能够指导给定基因转录和/或合成所需的蛋白分子。该术语也指氨基酸序列连接的方式使得能够产生功能性蛋白。在一些方面，感兴趣的基因可操作连接启动子，其中感兴趣的基因染色体整合入宿主细胞。在一些方面，感兴趣的基因可操作连接异源启动子；其中感兴趣的基因染色体整合入宿主细胞。在一些方面，辅助基因可操作连接启动子，其中辅助基因染色体整合入宿主细胞基因组。在一些方面，辅助基因可操作连接异源启动子；其中辅助基因染色体整合入宿主细胞基因组。在一些方面，编码DtE蛋白的基因可操作连接启动子，其中编码DtE蛋白的基因染色体整合入宿主细胞基因组。在一些方面，编码DtE蛋白的基因可操作连接异源启动子，其中编码DtE蛋白的基因染色体整合入宿主细胞基因组。在一些方面，重组酶基因可操作连接启动子，其中重组酶基因染色体整合入宿主细胞。在一些方面，重组酶基因可操作连接启动子，其中重组酶基因不整合入宿主细胞基因组。在一些方面，重组酶基因可操作连接异源启动子，其中重组酶基因不染色体整合入宿主细胞基因组。在一些方面，重组酶基因可操作连接异源启动子，其中重组酶基因不染色体整合入宿主细胞基因组。

本文所涉及的术语“染色体整合的”或“染色体整合”指核酸序列稳定并入宿主细胞(如哺乳动物细胞)的染色体，即核酸序列染色体整合入宿主细胞(如哺乳动物细胞)的基因组DNA(gDNA)。在一些方面，染色体整合的核酸序列是稳定的。在一些方面，染色体整合的核酸序列不位于质粒或载体上。在一些方面，染色体整合的核酸序列不是经切离的。在一些方面，染色体整合通过规律间隔的成簇短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)基因编辑系统(CRISPR/CAS)介导。

IV.组合物和制剂

一方面，本公开包括包含至少一种本文所述的FimH突变体多肽或其片段的组合物。在一些方面，组合物引发免疫应答，包括抗体，其可赋予对大肠杆菌的致病性种类的免疫力。

在一些方面，组合物包含FimH突变体多肽作为唯一抗原。在一些方面，组合物不包含缀合物。

在一些方面，组合物包含FimH突变体多肽和至少一种额外的抗原。在一些方面，组合物包含FimH突变体多肽和额外的大肠杆菌抗原。在一些方面，组合物包含FimH突变体多肽和来自大肠杆菌的糖缀合物。

在一些方面，组合物包含FimH突变体多肽和衍生自大肠杆菌FimC的多肽或其片段。

在一个实施方案中，本公开包括组合物，所述组合物包含FimH突变体多肽和包含选自公开于2021年5月6日公开的PCT Intl.公开号WO2021/084429和2020年2月27日公开的WO2020/039359以及2020年2月27日公开的US公开号US2020/0061177(其通过引用全文并入本文)的糖结构中的任意一种的结构的糖。一方面，本公开包括组合物，所述组合物包含FimH突变体多肽的组合物和包含选自以下任意一种的结构的糖：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是1-100，优选31-90的整数。

在一些实施方案中，所述组合物包括本文公开的任意一种糖。在优选实施方案中，所述组合物包括本文公开的任意一种缀合物。

在一些实施方案中，所述组合物包括来自大肠杆菌血清型O25，优选血清型O25b的至少一种糖缀合物。在一个实施方案中，所述组合物包括来自大肠杆菌血清型O1，优选血清型O1a的至少一种糖缀合物。在一个实施方案中，所述组合物包括来自大肠杆菌血清型O2的至少一种糖缀合物。在一个实施方案中，所述组合物包括来自大肠杆菌血清型O6的至少一种糖缀合物。

在一个实施方案中，所述组合物包含选自下列大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的任一种的至少一种糖缀合物。在一个实施方案中，所述组合物包含选自下列大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的任一种的至少2种糖缀合物。在另一实施方案中，所述组合物包含选自下列大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的任一种的至少3种糖缀合物。在另外一个实施方案中，所述组合物包含来下列各大肠杆菌血清型O25、O1、O2和O6，优选O25b、O1a、O2和O6的每一种的糖缀合物。

在一个优选实施方案中，所述任意上述组合物的糖缀合物是与CRM₁₉₇单独缀合的。在另一优选实施方案中，任意上述组合物的糖缀合物是与SCP单独缀合的。

因此，在一些实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自至少一种大肠杆菌血清型的O抗原。在一个优选实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自多于1种大肠杆菌血清型的O抗原。例如，组合物可包括来自2种不同大肠杆菌血清型(或“v”，价)-12种不同血清型(12v)的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自3种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自4种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自5种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自6种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自7种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自8种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自9种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自10种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自11种不同大肠杆菌血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自12种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自13种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自14种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自15种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自16种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自17种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自18种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自19种不同血清型的O抗原。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自20种不同血清型的O抗原。

优选地，大肠杆菌糖的数目范围可以是1种血清型(或“v”，价)-26种不同血清型(26v)。在一个实施方案中，没有1种血清型。在一个实施方案中，有2种不同血清型。在一个实施方案中，有3种不同血清型。在一个实施方案中，有4种不同血清型。在一个实施方案中，有5种不同血清型。在一个实施方案中，有6种不同血清型。在一个实施方案中，有7种不同血清型。在一个实施方案中，有8种不同血清型。在一个实施方案中，有9种不同血清型。在一个实施方案中，有10种不同血清型。在一个实施方案中，有11种不同血清型。在一个实施方案中，有12种不同血清型。在一个实施方案中，有13种不同血清型。在一个实施方案中，有14种不同血清型。在一个实施方案中，有15种不同血清型。在一个实施方案中，有16种不同血清型。在一个实施方案中，有17种不同血清型。在一个实施方案中，有18种不同血清型。在一个实施方案中，有19种不同血清型。在一个实施方案中，有20种不同血清型。在一个实施方案中，有21种不同血清型。在一个实施方案中，有22种不同血清型。在一个实施方案中，有23种不同血清型。在一个实施方案中，有24种不同血清型。在一个实施方案中，有25种不同血清型。在一个实施方案中，有26种不同血清型。糖缀合载体蛋白以形成本文所述的糖缀合物。

一方面，组合物包括FimH突变体多肽；和糖缀合物，其包括来自至少一种大肠杆菌血清型的O抗原，其中O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽；和来自多于1种大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自2种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自3种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自4种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自5种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自6种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自7种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自8种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自9种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自FimH突变体多肽和10种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自FimH突变体多肽和11种不同大肠杆菌血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自12种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自13种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自14种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自15个不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自16种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自17种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自18种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自19种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自20种不同血清型的O抗原，其中各O抗原缀合载体蛋白。

另一方面，组合物包括来自至少一种大肠杆菌血清型的O多糖。在一个优选实施方案中，所述组合物包括来自多于1种大肠杆菌血清型的O多糖。例如，组合物可包括来自2种不同大肠杆菌血清型-12种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自3种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自4种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自5种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自6种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自7种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自8种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自9种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自10种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自11种不同大肠杆菌血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自12种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自13种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自14种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自15种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自16种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自17种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自18种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自19种不同血清型的O多糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自20种不同血清型的O多糖。

在一个优选实施方案中，所述组合物包括来自至少一种大肠杆菌血清型的O多糖，其中O多糖缀合载体蛋白。在一个优选实施方案中，所述组合物包括来自多于1种大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。例如，组合物可包括来自2种不同大肠杆菌血清型-12种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自3种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自4种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自5种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自6种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自7种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自8种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自9种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自10种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自11种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自12种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自13种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自14种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自15种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自16种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自17种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自18种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自19种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包括来自20种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白。

在一个最优选实施方案中，所述组合物包括来自至少一个大肠杆菌血清型的O多糖，其中O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个优选实施方案中，所述组合物包括来自多于1种大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。例如，组合物可包括来自2种不同大肠杆菌血清型-12种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自3种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自4种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自5种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自6种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自7种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自8种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自9种不同大肠杆菌血清型的的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自10种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自11种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自12种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自13种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自14种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自15种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自16种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自17种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自18种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自19种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括来自20种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合载体蛋白，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个优选实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

在另一优选实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和缀合CRM₁₉₇的O多肽，其中O多糖包括式O25a和核心糖，其中n是至少30。在一个优选实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O25b和核心糖，其中n是至少40。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O1a和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O2和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O6和核心糖，其中n是至少30。

在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O17和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O15和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O18A和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O75和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括O4和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O16和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O13和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O7和核心糖，其中n是至少30。

在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O8和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述O多糖包括式O8，其中n是1-20，优选2-5，更优选3。在另一实施方案中，所述组合物还包括缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O9和核心糖，其中n是至少30。在另一实施方案中，所述O多糖包括式O9，其中n是1-20，优选4-8，更优选5。在另一实施方案中，所述O多糖包括式O9a，其中n是1-20，优选4-8，更优选5。

在一些实施方案中，所述O多糖选自任意一种式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101，其中n是1-20，优选4-8，更优选5。

如上所述，组合物可包括FimH突变体多肽和任意组合的缀合O多糖(抗原)。在一个示范性实施方案中，所述组合物包括包括式O25b的多糖、包括式O1a的多糖、包括式O2的多糖和包括式O6的多糖。更特定地，这样的组合物包括：(i)缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O25b和核心糖，其中n是至少30；(ii)缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O1a和核心糖，其中n是至少30；(iii)缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O2和核心糖，其中n是至少30；和(iv)缀合CRM₁₉₇的O多糖，其中O多糖包括式O6和核心糖，其中n是至少30。

在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和衍生自任意大肠杆菌血清型的至少一种O多糖，其中所述血清型不是O25a。例如，在一个实施方案中，所述组合物不包括含式O25a的糖。这样的组合物可包括例如包括O25b的O多糖、包括式O1a的O多糖、包括式O2的O多糖和包括式O6的O多糖。

在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自2种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自3种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自4种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自5种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中各O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自6种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中各O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自7种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自8种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多糖和来自9种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自10种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多糖和来自11种不同大肠杆菌血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中各O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自12种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自13种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自14种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自15种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自16种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自17种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自18种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自19种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。在一个实施方案中，所述组合物包括FimH突变体多肽和来自20种不同血清型的O多糖，其中各O多糖缀合CRM₁₉₇，且其中O多糖包括O抗原和核心糖。

一方面，本发明提供组合物，所述组合物包括FimH突变体多肽和包括共价结合载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n是15±2。一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包括FimH突变体多肽和包括共价结合载体蛋白的糖的组合物，其中糖包括式O25b，其中n是17±2。一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包括FimH突变体多肽和含糖共价结合载体蛋白的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n是55±2。另一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包括FimH突变体多肽和包括共价结合载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n是51±2。另一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包括FimH突变体多肽和包括共价结合载体蛋白的糖的缀合物，其中糖包括式O25b，其中n是大于30的整数，优选n是31-100的整数。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在另一实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌K12核心糖部分。在另一实施方案中，所述糖还包括KDO部分。载体蛋白优选是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单末端连接缀合来制备。在一个实施方案中，所述缀合物通过还原胺化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，所述糖经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子来缀合载体蛋白。所述组合物优选还包括药学上可接受稀释剂。

一方面，免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，所述抗体能够以ELISA试验所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml浓度结合大肠杆菌血清型O25b多糖。因此，能比较用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后血清OPA活性，并就其对血清型O25b的反应对比以评估响应者的潜在增加。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O25b。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发功能性抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O25b。在一个实施方案中，相较免疫前群体，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O25b的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述免疫原性组合物在至少50％对象中针对大肠杆菌血清型O25b引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％对象中针对大肠杆菌血清型O25b引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O25b的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加人对象针对大肠杆菌血清型O25b的OPA滴度。

一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O1a，其中n是大于30的整数，优选n是31-100的整数。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O1a，其中n是39±2。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O1a，其中n是13±2。在一个实施方案中，所述糖包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括KDO部分。载体蛋白优选是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单末端连接缀合来制备。在一个实施方案中，所述缀合物通过还原胺化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，所述糖经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子来缀合载体蛋白。所述组合物优选还包括药学上可接受稀释剂。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，所述抗体能够以如ELISA试验所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml浓度结合大肠杆菌血清型O1a多糖。因此，能比较用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后OPA活性，并就其对血清型O1a的反应对比以评估响应者的潜在增加。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O1a。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发功能性抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O1a。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O1a的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述免疫原性组合物在至少50％对象中针对大肠杆菌血清型O1a引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％对象中针对大肠杆菌血清型O1a引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O1a的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加人对象针对大肠杆菌血清型O1a的OPA滴度。

一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O2，其中n是大于30的整数，优选n是31-100的整数。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O2，其中n是43±2。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O2，其中n是47±2。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O2，其中n是17±2。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O2，其中n是18±2。在一个实施方案中，所述糖包括大肠杆菌R1核心糖部分。在另一实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R4核心糖部分。在另一实施方案中，所述糖还包括KDO部分。载体蛋白优选是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单末端连接缀合来制备。在一个实施方案中，所述缀合物通过还原胺化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，所述糖经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子来缀合载体蛋白。所述组合物优选还包括药学上可接受稀释剂。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，所述抗体能够以，ELISA试验所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml浓度结合大肠杆菌血清型O2多糖。因此，能比较用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后OPA活性，并就其对血清型O2的反应对比以评估响应者的潜在增加。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O2。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发功能性抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O2。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O2的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述免疫原性组合物在至少50％对象中针对大肠杆菌血清型O2引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％对象中针对大肠杆菌血清型O2引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，相较免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O2的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加人对象针对大肠杆菌血清型O2的OPA滴度。

一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O6，其中n是大于30的整数，优选n是31-100的整数。一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O6，其中n是42±2。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O6，其中n是50±2。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O6，其中n是17±2。另一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括式O6，其中n是18±2。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在另一实施方案中，所述糖还包括KDO部分。载体蛋白优选是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单末端连接缀合来制备。在一个实施方案中，所述缀合物通过还原胺化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，所述糖经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子来缀合载体蛋白。所述组合物优选还包括药学上可接受稀释剂。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，所述抗体能够以，ELISA试验所测定的至少0.2pg/ml、0.3pg/ml、0.35pg/ml、0.4pg/ml或0.5pg/ml浓度结合大肠杆菌血清型O6多糖。因此，能比较用本发明的免疫原性组合物免疫前和免疫后OPA活性，并就其对血清型O6的反应对比以评估响应者的潜在增加。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发IgG抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O6。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物在人中引发功能性抗体，如体外调理吞噬试验所测定的，所述抗体能够杀伤大肠杆菌血清型O6。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物增加针对大肠杆菌血清型O6的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述免疫原性组合物在至少50％对象中针对大肠杆菌血清型O6引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，如体外调理吞噬杀伤试验所测定的，所述本发明的免疫原性组合物在至少60％、70％、80％或至少90％对象中针对大肠杆菌血清型O6引发至少1:8滴度。在一个实施方案中，相较免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加针对大肠杆菌血清型O6的响应者比例(即如体外OPA所测定的，个体的血清滴度为至少1:8)。在一个实施方案中，相较于免疫前群体，本发明的免疫原性组合物显著增加人对象针对大肠杆菌血清型O6的OPA滴度。

一方面，本发明涉及包括FimH突变体多肽和缀合物的组合物，所述缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括选自以下任意一种的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是1-100的整数，优选31-90。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R1核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R2核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R3核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌R4核心糖部分。在一个实施方案中，所述糖还包括大肠杆菌K12核心糖部分。在另一实施方案中，所述糖还包括KDO部分。载体蛋白优选是CRM₁₉₇。在一个实施方案中，所述缀合物通过单末端连接缀合来制备。在一个实施方案中，所述缀合物通过还原胺化学制备，优选在DMSO缓冲液中。在一个实施方案中，所述糖经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子来缀合载体蛋白。所述组合物优选还包括药学上可接受稀释剂。在一个实施方案中，所述组合物还包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29种额外的缀合物到至多30种额外的缀合物，各缀合物包括共价结合载体蛋白的糖，其中糖包括选自所述式的任意一种的结构。

A.糖

1.糖和O多糖

在一个实施方案中，所述糖通过表达(不必定过表达)不同Wzz蛋白(如WzzB)以控制糖大小产生。

本文所用术语“糖”指单一糖部分或单糖单元以及2个或更多单一糖部分或单糖单元的组合，共价连接形成二糖、寡糖和多糖。糖可以是线性的或分支的。

在一个实施方案中，所述糖在重组革兰阴性菌中产生。在一个实施方案中，所述糖在重组大肠杆菌细胞中产生。在一个实施方案中，所述糖在重组沙门氏菌(Salmonella)细胞中产生。示范性细菌包括大肠杆菌O25K5H1、大肠杆菌BD559、大肠杆菌GAR2831、大肠杆菌GAR865、大肠杆菌GAR868、大肠杆菌GAR869、大肠杆菌GAR872、大肠杆菌GAR878、大肠杆菌GAR896、大肠杆菌GAR1902、大肠杆菌O25a ETC NR-5、大肠杆菌O157:H7:K-、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)鼠伤寒血清型菌株LT2、大肠杆菌GAR2401、肠道沙门氏菌肠炎血清型CVD 1943、肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型CVD 1925、肠道沙门氏菌甲型副伤寒血清型ACVD1902和弗氏志贺菌(Shigella flexneri)CVD 1208S。在一个实施方案中，所述细菌不是大肠杆菌GAR2401。此趋向糖生产的遗传学方法允许有效产生O多糖和O抗原作为疫苗组分。

本文所用术语“wzz蛋白”指链长决定多肽，例如wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzzl和wzz2。示范性wzz基因序列的GenBank登陆号是E4991/76的AF011910，F186的AF011911，M70/1-1的AF011912，79/311的AF011913，Bi7509-41的AF011914，C664-1992的AF011915，C258-94的AF011916，C722-89的AF011917和EDL933的AF011919。G7和Bi316-41wzz基因序列的GenBank登陆号分别是U39305和U39306。示范性wzz基因序列的其他GenBank登陆号是肠道沙门氏菌肠炎亚种鼠伤寒血清型str.LT2 FepE的NP_459581；大肠杆菌O157:H7菌株EDL933 FepE的AIG66859；肠道沙门氏菌肠炎亚种str.LT2 WzzB的NP_461024；大肠杆菌K-12substr.MG1655 WzzB的NP_416531；大肠杆菌K-12substr.MG1655 FepE的NP_415119。在优选方面，wzz家族蛋白是任意一种wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2，最优选wzzB，更优选fepE。

示范性wzzB序列包括SEQ ID NO:112-116所示的序列。示范性FepE序列包括SEQID NO:117-121所示的序列。

在一些方面，经修饰的糖(相较于对应野生型糖修饰)可如下产生：从革兰阴性菌中表达(不必定过表达)wzz家族蛋白(fepE)和/或关闭(遏制、缺失或去除)第二wzz基因(如wzzB)以产生含有中等或长O抗原链的高分子量糖如脂多糖，其重复单元的数目相较于对应的野生型O多糖增加。例如，经修饰的糖可如下产生：表达(不必定过表达)wzz2和关闭wzzl。或者，在另一种情况下，经修饰的糖可如下产生：表达(不必定过表达)wzz/fepE和/或关闭wzzB。在另一实施方案中，所述经修饰的糖可如下产生：表达(不必定过表达)wzzB，但关闭wzz/fepE。在另一实施方案中，所述经修饰的糖可通过表达fepE而产生。优选地，wzz家族蛋白衍生自与宿主细胞异源的菌株。本领域已知确定糖长度的方法。这样的方法包括但不限于核磁共振、质谱分析和尺寸排阻层析。产生本文所述含有中等或长O抗原链的高分子量糖如脂多糖的方法描述于PCT Intl.公开号WO2020/039359和对应US公开号US2020/0061177，其各通过引用全文并入本文。

在一些实施方案中，所述糖通过表达wzz家族蛋白产生，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121任一者有至少30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性。在一个实施方案中，所述wzz家族蛋白包括选自SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121任一者的序列。优选地，wzz家族蛋白与SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116有至少30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性。在一些实施方案中，所述糖通过表达蛋白产生，所述蛋白的氨基酸序列与fepE蛋白有至少30％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性。

一方面，本发明涉及如下产生的糖：在革兰阴性菌中表达wzz家族蛋白优选fepE，以产生含有中等或长O抗原链的高分子量糖，其相较于对应的野生型O多糖增加至少1、2、3、4或5个重复单元。一方面，本发明涉及培养物中的革兰氏阴性菌产生的糖，所述革兰氏阴性菌表达(不必定过表达)来自革兰阴性菌的wzz家族蛋白(如wzzB)以产生含有中等或长O抗原链的高分子量糖，其相较于对应的野生型O多糖增加至少1、2、3、4或5个重复单元。重复单元数目相较于对应的野生型糖增加的额外示范性糖参见下面O多糖和O抗原的描述。所需的链长度是在给定疫苗构建体背景下产生改善的或最大的免疫原性的那种。

在另一实施方案中，所述糖包括选自表A的任意一种化学式，其中糖内的重复单元数目比对应的野生型O多糖的重复单元数目大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多重复单元。优选地，糖包括相较于对应的野生型O多糖，增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元。本领域已知确定糖长度的方法。这样的方法包括核磁共振、质谱分析和尺寸排阻层析。

在一个优选实施方案中，本发明涉及在重组大肠杆菌宿主细胞内产生的糖，其中用于内源wzz O抗原长度调节蛋白(如wzzB)的基因缺失并被(第二)wzz基因取代，所述wzz基因来自与重组大肠杆菌宿主细胞异源的革兰阴性菌(如沙门氏菌fepE)，以产生含有中等或长O抗原链的高分子量糖如脂多糖。在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌宿主细胞包括来自沙门氏菌的wzz基因，优选来自肠道沙门氏菌。

在一个实施方案中，所述宿主细胞包括wzz家族蛋白的异源基因，作为稳定维持的质粒载体。在另一实施方案中，所述宿主细胞包括wzz家族蛋白的异源基因，作为宿主细胞染色体DNA中的整合基因。本领域已知在大肠杆菌宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法和将异源基因整合入大肠杆菌宿主细胞染色体的方法。在一个实施方案中，所述宿主细胞包括O抗原的异源基因，作为稳定维持的质粒载体。在另一实施方案中，所述宿主细胞包括O抗原的异源基因，作为宿主细胞染色体DNA中的整合基因。本领域已知在大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法。本领域已知将异源基因整合入大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌宿主细胞染色体的方法。

一方面，重组宿主细胞在包含碳源的培养基中培养。本领域已知培养大肠杆菌的碳源。示范性碳源包括糖醇、多元醇、醇醛糖或酮糖，包括但不限于阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸盐、琥珀酸盐和甲胺。在一个优选实施方案中，所述培养基包括葡萄糖。在一些实施方案中，所述培养基包括多元醇或醇醛糖，例如甘露醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨醇、乳糖和阿拉伯糖作为碳源。所有碳源可在培养开始前加入培养基，或可在培养期间逐步或连续添加。

用于重组宿主细胞的示范性培养基包括选自以下任意一种的元素：KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。培养基优选包括KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O。

本文所用培养基可以是固体的或液体的，合成(即人工)的或天然的，且可包括足够的营养用于培养重组宿主细胞。培养基优选是液体培养基。

在一些实施方案中，所述培养基还可包括合适的无机盐。在一些实施方案中，所述培养基还可包括微量营养素。在一些实施方案中，所述培养基还可包括生长因子。在一些实施方案中，所述培养基还可包括额外的碳源。在一些实施方案中，所述培养基还可包括合适的无机盐、微量营养素、生长因子和补充碳源。本领域已知适合培养大肠杆菌的无机盐、微量营养素、生长因子和补充碳源。

在一些实施方案中，所述培养基适当时可包括额外组分，如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解物、额外的酵母提取物、麦芽膏、补充碳源和各种维生素。在一些实施方案中，所述培养基不包括这样的额外组分，如蛋白胨、N-Z胺、酶促大豆水解物、额外的酵母提取物、麦芽膏、补充碳源和各种维生素。

合适的补充碳源的说明性示例包括但不限于其他碳水化合物，如葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉或淀粉水解物、纤维素水解物和糖蜜；有机酸，如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸和富马酸；和醇，如甘油、肌醇、甘露醇和山梨醇。

在一些实施方案中，所述培养基还包括氮源。本领域已知适合培养大肠杆菌的氮源。合适的氮源的说明性示例包括但不限于氨，包括氨气和氨水；无机或有机酸的铵盐，如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和醋酸铵；尿素；硝酸盐或亚硝酸盐，和其他含氮物质，包括作为纯或粗制品的氨基酸、肉膏、蛋白胨、鱼粉、鱼水解物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物、酵母提取物、干酵母、乙醇-酵母蒸馏物、大豆粉、棉籽粉等。

在一些实施方案中，所述培养基包括无机盐。合适的无机盐的说明性示例包括但不限于钾、钙、钠、镁、锰、铁、钴、锌、铜、钼、钨和其他微量元素和磷酸的盐。

在一些实施方案中，所述培养基包括合适的生长因子。合适的微量营养素、生长因子等的说明性示例包括但不限于辅酶A、泛酸、吡哆醇-HCl、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、叶酸、维生素B12、其他维生素、氨基酸如半胱氨酸和羟脯氨酸，碱基如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶、硫代硫酸钠、p-或r-氨基苯甲酸、烟酰胺、次氮基乙酸等，作为纯或部分纯化的化合物或存在于天然材料。量可由本领域技术人员根据本领域已知方法和技术凭经验确定。

在另一实施方案中，本文所述的经修饰的糖(相较于对应的野生型糖)是合成产生，例如体外。糖的合成产生或合成可有利于避免耗钱和耗时的生产过程。在一个实施方案中，所述糖是人工合成的，例如用顺序糖基化策略或顺序糖基化与[3+2]块合成策略的组合从适当保护的单糖中间体合成。例如，硫苷和糖基三氯乙酰亚胺酯衍生物可用作糖基化中的糖基供体。在一个实施方案中，所述体外合成糖具有与重组方式，如通过操纵上述wzz家族蛋白所产生糖相同的结构。

(通过重组或合成方式)产生的糖包括衍生自任意大肠杆菌血清型的结构，包括例如下列大肠杆菌血清型的任意一种：O1(如O1A、O1B和O1C)、O2、O3、O4(如O4:K52和O4:K6)、O5(如O5ab和O5ac(菌株180/C3))、O6(如O6:K2；K13；K15和O6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18(如O18A、O18ac、O18A1、O18B和O18B1)、O19、O20、O21、O22、O23(如O23A)、O24、O25(如O25a和O25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45(如O45和O45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D1、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73(如O73(菌株73-1))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186和O187。

各种多糖一般通过本领域已知方法纯化(涉及多糖-蛋白缀合物的量富集)，例如透析、浓缩操作、透析过滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深层过滤和/或柱层析(离子交换层析、多模式离子交换层析、DEAE和疏水相互作用层析)。多糖优选通过括切向流过滤的方法纯化。

如本文进一步所述，可激活(如化学激活)经纯化的多糖以使其能够反应(如直接与载体蛋白反应或经接头如eTEC间隔子)，随后并入本发明糖缀合物。

在一个优选实施方案中，本发明的糖衍生自大肠杆菌血清型，其中所述血清型是O25a。在另一优选实施方案中，所述血清型是O25b。在另一优选实施方案中，所述血清型是O1A。在另一优选实施方案中，所述血清型是O2。在另一优选实施方案中，所述血清型是O6。在另一优选实施方案中，所述血清型是O17。在另一优选实施方案中，所述血清型是O15。在另一优选实施方案中，所述血清型是O18A。在另一优选实施方案中，所述血清型是O75。在另一优选实施方案中，所述血清型是O4。在另一优选实施方案中，所述血清型是O16。在另一优选实施方案中，所述血清型是O13。在另一优选实施方案中，所述血清型是O7。在另一优选实施方案中，所述血清型是O8。在另一优选实施方案中，所述血清型是O9。

如本文所用，涉及上面所列的任意血清型时，所指的血清型涵盖本领域已知且对相应的血清型独特的重复单元结构(下述O单元)。例如，术语“O25a”血清型(本领域也称为血清型“O25”)指涵盖表A所示的式O25的血清型。另外例如，术语“O25b”血清型指涵盖表A所示式O25b的血清型。

如本文所用，除非另有特别说明，血清型在本文如同一般所指，例如，术语式“O18”一般指涵盖式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B和式O18B1。

本文所用术语“O1”一般指涵盖包括表A所述化学式名称中的通用术语“O1”的化学式种类，如式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C的任意一种，其各如表A所示。因此，“O1血清型”一般指涵盖式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C的任意一种的血清型。

本文所用术语“O6”一般指包括表A所述化学式名称中的通用术语“O6”的化学式种类，如式O6:K2；K13；K15；和O6:K54的任意一种，其各如表A所示。因此，“O6血清型”一般指涵盖式O6:K2；K13；K15；和O6:K54的任意一种的血清型。

一般涉及化学式种类的其他术语示例包括：“O4”、“O5”、“O18”和“O45”，所述化学式包括表A所述的化学式名称中的通用术语。

本文所用术语“O2”一般指表A所示式O2。术语“O2 O抗原”指涵盖表A所示式O2的糖。

如本文所用，提及来自上面所列血清型的O抗原时，指涵盖标记有对应血清型名称的化学式的糖。例如，术语“O25B O抗原”指涵盖表A所示式O25B的糖。

另外例如，术语“O1 O抗原”一般指涵盖包括术语“O1”的化学式的糖，如式O1A、式O1A1、式O1B和式O1C，其各如表A所示。

另外例如，术语“O6 O抗原”一般指涵盖包括术语“O6”的化学式的糖，如式O6:K2；式O6:K13；式O6:K15和式O6:K54，其各如表A所示。

本文所用术语“O多糖”指包括O抗原的任意结构，只要该结构不包括全细胞或脂质A。例如，在一个实施方案中，所述O多糖包括脂多糖，其中不结合脂质A。去除脂质A的步骤为本领域已知且包括例如添加酸的热处理。示范性工艺包括用1％乙酸在100℃处理90分钟。此工艺与分离所去除的脂质A的工艺组合。分离脂质A的示范性工艺包括超离心。

在一个实施方案中，所述O多糖指由O抗原组成的结构，其中O多糖与术语O抗原同义。在一个优选实施方案中，所述O多糖含O抗原重复单元、而没有核心糖的结构。因此，在一个实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R1核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R2核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R3核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R4核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌K12核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖指包括O抗原和核心糖的结构。在另一实施方案中，所述O多糖指包括O抗原、核心糖和KDO部分的结构。

本领域已知从LPS纯化O多糖的方法，所述O多糖包括核心寡糖。例如，LPS纯化后，经纯化的LPS可如下水解：在1％(v/v)乙酸中于100摄氏度加热90分钟，然后在142,000x g，4摄氏度超离心5小时。含O多糖的上清在4摄氏度冷冻干燥和保存。在某些实施方案中，描述了实现O多糖简单纯化的胶囊合成基因缺失。

O多糖能通过包括但不限于以下的方法分离：温和酸水解以从LPS去除脂质A。其他实施方案可包括使用肼作为制备O多糖的试剂。LPS制备能通过本领域已知方法完成。

在某些实施方案中，提供从表达(不必定过表达)Wzz蛋白(如wzzB)的野生型、经修饰的或减毒的革兰氏阴性菌株纯化的O多糖用于缀合疫苗。在优选实施方案中，所述从表达(不必定过表达)wzz蛋白的革兰氏阴性菌株纯化O多糖链，用作疫苗抗原，作为缀合物或复合疫苗。

在一个实施方案中，所述O多糖的分子量相较于对应的野生型O多糖增加约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多。在一个优选实施方案中，所述O多糖的分子量相较于对应的野生型O多糖增加至少1倍且至多5倍。在另一实施方案中，所述O多糖的分子量相较于对应的野生型O多糖增加至少2倍且至多4倍。O多糖分子量相较于对应的野生型O多糖的增加优选与O抗原重复单元数目增加相关联。在一个实施方案中，所述O多糖的分子量增加归因于wzz家族蛋白。

在一个实施方案中，所述O多糖的分子量相较于对应的野生型O多糖增加约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100kDa或更多。在一个实施方案中，所述本发明O多糖的分子量相较于对应的野生型O多糖增加至少1且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少5且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少12且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少15且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少18且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少21且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少22且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少30且至多200kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少1且至多100kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少5且至多100kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多100kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少12且至多100kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少15且至多100kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多100kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少1且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少5且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少12且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少15且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少18且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少30且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多90kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少12且至多85kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多75kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多70kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多60kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多50kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多49kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多48kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多47kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少10且至多46kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多45kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多44kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多43kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多42kDa。在一个实施方案中，所述分子量增加至少20且至多41kDa。这样的O多糖分子量相较于对应的野生型O多糖的增加，优选与O抗原重复单元数目增加相关联。在一个实施方案中，所述O多糖的分子量归因于wzz家族蛋白。

在另一实施方案中，所述O多糖包括选自表A的任意一种化学式，其中O多糖的重复单元数目比对应的野生型O多糖的重复单元数目大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多重复单元。优选地，相较于对应的野生型O多糖，所述糖包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元的增加。

2.O抗原

O抗原是革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖(LPS)的一部分。O抗原在细胞表面上且是可变的细胞成分。O抗原的可变性为革兰氏阴性菌血清学分型提供基础。目前的大肠杆菌血清学分型包括O多糖1-181。

O抗原包括寡糖重复单元(O单元)，其野生型结构通常含有来自广泛范围糖的2-8个残基。示范性大肠杆菌O抗原的O单元描述于表A和2021年5月6日公开的PCT Intl.公开号WO2021/084429，其通过引用全文并入本文。在一些实施方案中，本公开包括包含至少一种FimH突变体多肽和至少一种O抗原的组合物，所述O抗原描述于表A和2021年5月6日公开的PCT Intl.公开号WO2021/084429，其通过引用全文并入本文。

在一个实施方案中，本发明的糖可以是一个寡糖单元。在一个实施方案中，本发明的糖是相关血清型的一个重复寡糖单元。在这样的实施方案中，所述糖可包括选自以下任意一种的结构：式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97和式O101。在另一实施方案中，所述糖可包括选自以下任意一种的结构：式O1a、式O2、式O6和式O25b。

在一个实施方案中，本发明的糖可以是寡糖。寡糖具有低数量的重复单元(通常5-15个重复单元)且一般是合成获得的或是通过多糖水解获得的。在这样的实施方案中，所述糖可包括选自以下任意一种的结构：式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97和式O101。在另一实施方案中，所述糖可包括选自以下任意一种的结构：式O1a、式O2、式O6和式O25b。

优选地，所有本发明的糖和本发明的免疫原性组合物中的糖都是多糖。高分子量多糖可诱导某些抗体免疫应答，这归因于抗原表面存在的表位。高分子量多糖的分离和纯化优选考虑用于本发明缀合物、组合物和方法。

在某些实施方案中，所述各单独的O抗原聚合物中的重复O单元数目(和因此的聚合物链的长度及分子量)取决于wzz链长度调节蛋白，内膜蛋白。不同wzz蛋白赋予不同范围的模态长度(modal length)(4到>100个重复单元)。术语“模态长度”指重复O单元数目。革兰氏阴性菌通常具有2个不同Wzz蛋白，其赋予2种不同Oag模态长度，一种较长而一种较短。Wzz家族蛋白(如wzzB)在革兰氏阴性菌中的表达(不必定过表达)可允许操纵O抗原长度，以转向或偏向某些长度范围的O抗原产生，增强高产量大分子量脂多糖的产生。在一个实施方案中，本文所用的“短”模态长度指低数量的重复O单元，如1-20。在一个实施方案中，本文所用的“长”模态长度指重复O单元的数目超过20且多至最高40。在一个实施方案中，本文所用“极长”模态长度指大于40个重复O单元。

在一个实施方案中，所述产生的糖相较于对应的野生型O多糖增加至少10个重复单元、15个重复单元、20个重复单元、25个重复单元、30个重复单元、40个重复单元、45个重复单元、50个重复单元、55个重复单元、60个重复单元、65个重复单元、70个重复单元、75个重复单元、80个重复单元、85个重复单元、90个重复单元、95个重复单元或100个重复单元。

在另一实施方案中，相较于对应的野生型O多糖，本发明的糖增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多重复单元。优选地，相较于对应的野生型O多糖，所述糖增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元。参见例如表21。本领域已知确定糖长度的方法。这样的方法包括核磁共振、质谱分析和尺寸排阻层析，如实施例13所述。

本领域还已知确定糖中重复单元数目的方法。例如，重复单元数目(或化学式中的“n”)可如下计算：将多糖分子量(没有核心糖或KDO残基的分子量)除以重复单元分子量(即如表1所示对应化学式中结构的分子量，其可理论上计算为化学式内各单糖分子量总和)。本领域已知化学式内各单糖的分子量。例如，式O25b重复单元的分子量为约862Da。例如，式O1a重复单元的分子量为约845Da。例如，式O2重复单元的分子量为约829Da。例如，式O6重复单元的分子量为约893Da。当确定缀合物中的重复单元数目时，载体蛋白分子量和蛋白:多糖比被考虑到计算内。如本文所定义，“n”指多糖分子中的重复单元(以表1中括号表示)的数目。如本领域已知，在生物大分子中，重复结构可以是散布的，有不完美重复的区域，例如缺少的分支。另外，本领域已知从天然来源如细菌分离和纯化的多糖可以在大小和分支上不均匀。这种情况下，就群体中分子而言，n可代表n的平均或中值。

在一个实施方案中，所述O多糖相较于对应的野生型O多糖增加至少一个O抗原重复单元。O抗原重复单元如表1所示。在一个实施方案中，所述O多糖共包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个重复单元。所述糖优选具有总共至少3个-至多80个重复单元。在另一实施方案中，相较于对应的野生型O多糖，所述O多糖增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多重复单元。

在一个实施方案中，所述糖包括O抗原，其中任意O抗原式中的n(例如表1所示的式(也参见图9A-9C和图10A-10B))是至少1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40，且至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50的整数。任何最小值和任何最大值可组合以定义范围。示范性范围包括例如至少1-至多1000；至少10-至多500；和至少20-至多80，优选至多90。在一个优选实施方案中，n是至少31-至多90。在一个优选实施方案中，n是40-90，更优选60-85。

在一个实施方案中，所述糖包括O抗原，其中任意O抗原式中的n是至少1且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少5且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少10且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少25且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少50且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少75且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少100且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少125且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少150且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少175且至多200。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少1且至多100。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少5且至多100。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少10且至多100。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少25且至多100。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少50且至多100。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少75且至多100。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少1且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少5且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少10且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少20且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少25且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少30且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少40且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少50且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少30且至多90。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多85。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多75。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多70。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多60。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多50。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多49。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多48。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多47。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少35且至多46。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少36且至多45。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少37且至多44。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少38且至多43。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少39且至多42。在一个实施方案中，所述任意O抗原式中的n是至少39且至多41。

例如，在一个实施方案中，所述糖中的n是31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90，最优选40。在另一实施方案中，所述n是至少35-至多60。例如，在一个实施方案中，所述n是35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中的任意一个，优选50。在另一优选实施方案中，所述n是至少55-至多75。例如，在一个实施方案中，所述n是55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69，最优选60。

所述糖结构可通过本领域已知方法和工具确定，例如NMR，包括1D、1H和/或13C、2DTOCSY、DQF-COSY、NOESY和/或HMQC。

在一些实施方案中，缀合前的经纯化的多糖具有5kDa-400kDa的分子量。在其他这样的实施方案中，所述糖的分子量为10kDa-400kDa；5kDa-400kDa；5kDa-300kDa；5kDa-200kDa；5kDa-150kDa；10kDa-100kDa；10kDa-75kDa；10kDa-60kDa；10kDa-40kDa；10kDa-100kDa；10kDa-200kDa；15kDa-150kDa；12kDa-120kDa；12kDa-75kDa；12kDa-50kDa；12-60kDa；35kDa-75kDa；40kDa-60kDa；35kDa-60kDa；20kDa-60kDa；12kDa-20kDa；或20kDa-50kDa。在其他实施方案中，所述糖的分子量为7kDa-15kDa；8kDa-16kDa；9kDa-25kDa；10kDa-100；10kDa-60kDa；10kDa-70kDa；10kDa-160kDa；15kDa-600kDa；20kDa-1000kDa；20kDa-600kDa；20kDa-400kDa；30kDa-1,000Kda；30kDa-60kDa；30kDa-50kDa或5kDa-60kDa。上述任意范围内的任何整数被视作本公开的实施方案。

本文所用术语多糖或载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”指通过尺寸排阻层析(SEC)与多角度激光光散射探测器(MALLS)组合计算的分子量。

多糖在正常纯化过程中大小可能变得略小。另外，如本文所述，多糖能在缀合前经历改变大小(sizing)技术。可采用机械或化学改变大小。化学水解可用乙酸实施。机械改变大小可用高压均质剪切实施。上述分子量范围涉及缀合前(如激活前)的经纯化的多糖。

表A:大肠杆菌血清组/血清型和O单元部分

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β-D-6dmanHep2Ac是2-O-乙酰-6-脱氧-β-D-甘露-庚糖吡喃基.

β-D-Xulf是β-D-苏式-呋喃戊糖基.

3.核心寡糖

核心寡糖位于野生型大肠杆菌LPS中脂质A与O抗原外区之间。更特定地，核心寡糖是多糖一部分，其包括野生型大肠杆菌中O抗原与脂质A之间的键。此键包括最内部3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO))残基的半缩酮官能团与脂质A中GlcNAc残基的羟基之间的酮苷键。核心寡糖区在野生型大肠杆菌株中显示高度相似性。其通常包括有限数量的糖。核心寡糖包括内核区和外核区。

更特定地，内核主要由L-甘油-D-甘露-庚糖(庚糖)和KDO残基构成。内核高度保守。KDO残基包括下式KDO：

核心寡糖的外区展示出比内部核心区更大的变化，此区域的差异区分大肠杆菌的5种化学型：R1、R2、R3、R4和K-12。5种已知化学型的外核寡糖的碳水化合物主干的一般结构是本领域熟知的。HepII是内核核心寡糖的最后一个残基。尽管所有外核寡糖共有一个结构主体(theme)，具有(己糖)₃碳水化合物主干和2个侧链残基，但主干的己糖顺序以及侧链残基的性质、位置和连接都可能变化。R1和R4外部核心寡糖的结构高度类似，差异仅在于单个β连接的残基。

野生型大肠杆菌的核心寡糖在本领域中基于远端寡糖结构分成5类不同化学型：大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12。

在一个优选实施方案中，本文所述的组合物包括糖缀合物，其中O多糖包括结合O抗原的核心寡糖。在一个实施方案中，所述组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12的至少一种的免疫应答。在另一实施方案中，所述组合物诱导免疫应答针对至少2种核心大肠杆菌化学型。在另一实施方案中，所述组合物诱导免疫应答针对至少3种核心大肠杆菌化学型。在另一实施方案中，所述组合物诱导免疫应答针对至少4种核心大肠杆菌化学型。在另一实施方案中，所述组合物诱导免疫应答针对所有5种核心大肠杆菌化学型。

在另一优选实施方案中，本文所述的组合物包括糖缀合物，其中O多糖不包括结合O抗原的核心寡糖。在一个实施方案中，这样的组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12的至少一种的免疫应答，尽管糖缀合物具有不包括核心寡糖的O多糖。

大肠杆菌血清型可根据5种化学型之一表征。表B列出根据化学型表征的血清型。加粗显示的血清型代表与所示核心化学型最常关联的血清型。因此，在一个优选实施方案中，所述组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌R1、大肠杆菌R2、大肠杆菌R3、大肠杆菌R4和大肠杆菌K12的至少一种的免疫应答，其包括针对各对应大肠杆菌血清型中的任意一种的免疫应答。

表B:核心化学型和相关大肠杆菌血清型

在一些实施方案中，所述组合物包括糖，其包括衍生自具有R1化学型的血清型的结构，例如选自具有式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O8、式O18、式O9、式O13、式O20、式O21、式O91和式O163的糖，其中n是1-100。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌R1核心部分。

在一些实施方案中，所述组合物包括糖，其包括衍生自具有R1化学型的血清型的结构，例如选自具有式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O18、式O13、式O20、式O21、式O91和式O163的糖，其中n是1-100，优选31-100，优选31-90，更优选35-90，最优选35-65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括糖中的大肠杆菌R1核心部分。

在一些实施方案中，所述组合物包括糖，其包括衍生自具有R2化学型的血清型的结构，例如选自具有式O21、式O44、式O11、式O89、式O162和式O9的糖，其中n是1-100，优选31-100，优选31-90，更优选35-90，最优选35-65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括还包括大肠杆菌R2核心部分。

在一些实施方案中，所述组合物包括糖，其包括衍生自具有R3化学型的血清型的结构，例如选自具有式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86和式O93的糖，其中n是1-100，优选31-100，优选31-90，更优选35-90，最优选35-65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌R3核心部分。

在一些实施方案中，所述组合物包括糖，其包括衍生自具有R4化学型的血清型的结构，例如选自具有式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160和式O166的糖，其中n是1-100，优选31-100，优选31-90，更优选35-90，最优选35-65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌R4核心部分。

在一些实施方案中，所述组合物包括糖，其包括衍生自具有K-12化学型的血清型的结构(例如选自具有式O25b的糖和具有式O16的糖)，其中n是1-1000，优选31-100，优选31-90，更优选35-90，最优选35-65。在一些实施方案中，所述组合物中的糖还包括大肠杆菌K-12核心部分。

在一些实施方案中，所述组合物包括核心糖。因此，在一些实施方案中，所述O多糖还包括大肠杆菌R1核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖还包括大肠杆菌R2核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖还包括大肠杆菌R3核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖还包括大肠杆菌R4核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖还包括大肠杆菌K12核心部分。

在一些实施方案中，所述糖不包括核心糖。因此，在一些实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R1核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R2核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R3核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌R4核心部分。在另一实施方案中，所述O多糖不包括大肠杆菌K12核心部分。

4.缀合O抗原

O抗原或优选O多糖与蛋白载体的化学连接可改善O抗原或O多糖的免疫原性。然而，聚合物大小变化代表生产中的实际挑战。在商业用途中，糖的大小能影响与不同缀合合成策略的相容性、产品一致性和缀合物免疫原性。通过操纵O抗原合成通路来控制Wzz家族蛋白链长调节因子表达，可允许在多种革兰氏阴性菌株中产生所需长度的O抗原链，包括大肠杆菌。

在一个实施方案中，经纯化的糖被化学激活以产生能够与载体蛋白反应的经活化的糖。被激活后，各糖分别缀合载体蛋白以形成缀合物，即糖缀合物。本文所用术语“糖缀合物”涉及共价连接载体蛋白的糖。在一个实施方案中，所述糖直接连接载体蛋白。在另一实施方案中，所述糖经间隔子/接头连接蛋白。

可以通过使载体与O抗原在一个或沿着O抗原的多个位点结合的方案，或在核心寡糖的至少一个残基处激活的方案制备缀合物。

在一个实施方案中，各糖缀合相同载体蛋白。

如果对于组合物中2种或更多糖而言蛋白载体是相同的，则所述糖可缀合同一载体蛋白分子(例如，载体分子有2个或更多不同糖与其缀合)。

在一个优选实施方案中，所述糖各自单独缀合不同蛋白载体分子(蛋白载体的各分子仅具有一类与其缀合的糖)。在所述实施方案中，所述糖称为单独缀合载体蛋白。

化学激活糖和后续缀合载体蛋白能通过本文公开的激活及缀合方法实现。多糖缀合载体蛋白后，糖缀合物通过多种技术纯化(涉及多糖-蛋白缀合物的量来富集)。这些技术包括浓缩/透析过滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深层过滤。各个糖缀合物纯化后，将其混合以配制本发明的免疫原性组合物。

a.激活。本发明还涉及从本文所述的任意实施方案中产生的经活化的多糖，其中所述多糖用化学试剂激活以产生反应性基团，从而缀合接头或载体蛋白。在一些实施方案中，本发明的糖在缀合载体蛋白之前激活。在一些实施方案中，所述激活的程度不显著降低多糖的分子量。例如，在一些实施方案中，所述激活的程度不切割多糖骨架。在一些实施方案中，所述激活的程度不显著影响缀合程度，如载体蛋白，例如CRM₁₉₇中修饰的赖氨酸残基数目(如通过氨基酸分析所测定)。例如，在一些实施方案中，与用参考多糖相同激活程度的缀合物的载体蛋白中所修饰赖氨酸残基数目相比，所述激活的程度不显著增加载体蛋白中修饰的赖氨酸残基数目(如通过氨基酸分析所测定)达到3倍。在一些实施方案中，所述激活的程度不提高未缀合游离糖的水平。在一些实施方案中，所述激活的程度不减少最优糖/蛋白比。

在一些实施方案中，所述经活化的糖具有激活百分比，其中经活化的糖的每糖重复单元的巯基摩尔是1-100％，例如2-80％、2-50％、3-30％和4-25％。激活程度是至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％、或约100％。激活程度优选是至多50％，更优选至多25％。在一个实施方案中，所述激活的程度是至多20％。任何最小值和任何最大值可组合定义范围。

在一个实施方案中，所述多糖用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)激活形成氰酸酯。经活化的多糖随后直接或经间隔子(接头)基团偶联载体蛋白(优选CRM₁₉₇或破伤风类毒素)上的氨基。

例如，间隔子可以是胱胺或半胱胺以产生巯基化多糖，其能经硫醚键偶联载体，所述硫醚键是在与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用N-[Y-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS))或卤代乙酰化的载体蛋白(例如使用76yophilized76e、N-溴乙酸羟基琥珀酰亚胺酯(SBA；SIB)、N-琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀酰亚胺酯(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)或琥珀酰亚胺3-[溴乙酰胺]丙酸酯(SBAP))反应后获得。在一个实施方案中，所述氰酸酯(可选通过CDAP化学制备)与己二胺或己二酰肼(ADH)偶联，且氨基衍生化的糖用碳二亚胺(如EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基来缀合载体蛋白(如CRM₁₉₇)。

用于缀合的其他合适技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。缀合可包括羰基接头，其可通过糖的游离羟基与CDI反应然后与蛋白反应形成氨基甲酸酯键来形成。这可涉及异头末端还原成伯羟基，可选保护/去保护伯羟基，伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间物以及偶联CDI氨基甲酸酯中间物与蛋白上的氨基(CDI化学)。

b.分子量。在一些实施方案中，所述糖缀合物包含分子量为10kDa-2,000kDa的糖。在其他实施方案中，所述糖的分子量为50kDa-1,000kDa。在其他实施方案中，所述糖的分子量为70kDa-900kDa。在其他实施方案中，所述糖的分子量为100kDa-800kDa。在其他实施方案中，所述糖的分子量为200kDa-600kDa。在进一步的实施方案中，所述糖的分子量为100kDa-1000kDa；100kDa-900kDa；100kDa-800kDa；100kDa-700kDa；100kDa-600kDa；100kDa-500kDa；100kDa-400kDa；100kDa-300kDa；150kDa-1,000kDa；150kDa-900kDa；150kDa-800kDa；150kDa-700kDa；150kDa-600kDa；150kDa-500kDa；150kDa-400kDa；150kDa-300kDa；200kDa-1,000kDa；200kDa-900kDa；200kDa-800kDa；200kDa-700kDa；200kDa-600kDa；200kDa-500kDa；200kDa-400kDa；200kDa-300；250kDa-1,000kDa；250kDa-900kDa；250kDa-800kDa；250kDa-700kDa；250kDa-600kDa；250kDa-500kDa；250kDa-400kDa；250kDa-350kDa；300kDa-1,000kDa；300kDa-900kDa；300kDa-800kDa；300kDa-700kDa；300kDa-600kDa；300kDa-500kDa；300kDa-400kDa；400kDa-1,000kDa；400kDa-900kDa；400kDa-800kDa；400kDa-700kDa；400kDa-600kDa；500kDa-600kDa。在一个实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过单末端缀合产生。在另一实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过在水性缓冲液中制备的还原胺化学(RAC)产生。上面范围内的任意整数被视作本公开的实施方案。

在一些实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量为400kDa-15,000kDa；500kDa-10,000kDa；2,000kDa-10,000kDa；3,000kDa-8,000kDa；或3,000kDa-5,000kDa。在其他实施方案中，所述糖缀合物的分子量为500kDa-10,000kDa。在其他实施方案中，所述糖缀合物的分子量为1,000kDa-8,000kDa。在其他实施方案中，所述糖缀合物的分子量为2,000kDa-8,000kDa或3,000kDa-7,000kDa。在进一步的实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量为200kDa-20,000kDa；200kDa-15,000kDa；200kDa-10,000kDa；200kDa-7,500kDa；200kDa-5,000kDa；200kDa-3,000kDa；200kDa-1,000kDa；500kDa-20,000kDa；500kDa-15,000kDa；500kDa-12,500kDa；500kDa-10,000kDa；500kDa-7,500kDa；500kDa-6,000kDa；between500kDa-5,000kDa；500kDa-4,000kDa；500kDa-3,000kDa；500kDa-2,000kDa；500kDa-1,500kDa；500kDa-1,000kDa；750kDa-20,000kDa；750kDa-15,000kDa；750kDa-12,500kDa；750kDa-10,000kDa；750kDa-7,500kDa；750kDa-6,000kDa；750kDa-5,000kDa；750kDa-4,000kDa；750kDa-3,000kDa；750kDa-2,000kDa；750kDa-1,500kDa；1,000kDa-15,000kDa；1,000kDa-12,500kDa；1,000kDa-10,000kDa；1,000kDa-7,500kDa；1,000kDa-6,000kDa；1,000kDa-5,000kDa；1,000kDa-4,000kDa；1,000kDa-2,500kDa；2,000kDa-15,000kDa；2,000kDa-12,500kDa；2,000kDa-10,000kDa；2,000kDa-7,500kDa；2,000kDa-6,000kDa；2,000kDa-5,000kDa；2,000kDa-4,000kDa；或2,000kDa-3,000kDa。在一个实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过本文所述eTEC缀合产生。在另一实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过还原胺化学(RAC)产生。在另一实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过在DMSO中制备的还原胺化学(RAC)产生。

在进一步的实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量为1,000kDa-20,000kDa；1,000kDa-15,000kDa；2,000kDa-10,000kDa；2000kDa-7,500kDa；2,000kDa-5,000kDa；3,000kDa-20,000kDa；3,000kDa-15,000kDa；3,000kDa-12,500kDa；4,000kDa-10,000kDa；4,000kDa-7,500kDa；4,000kDa-6,000kDa；或5,000kDa-7,000kDa。在一个实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过还原胺化学(RAC)产生。在另一实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过在DMSO中制备的还原胺化学(RAC)产生。在另一实施方案中，所述有这样的分子量的糖缀合物通过本文所述eTEC缀合产生。

在进一步的实施方案中，本发明的糖缀合物的分子量为5,000kDa-20,000kDa；5,000kDa-15,000kDa；5,000kDa-10,000kDa；5,000kDa-7,500kDa；6,000kDa-20,000kDa；6,000kDa-15,000kDa；6,000kDa-12,500kDa；6,000kDa-10,000kDa或6,000kDa-7,500kDa。

糖缀合物的分子量可通过SEC-MALLS检测。任意上述范围内的任何整数被视作本公开的实施方案。本发明糖缀合物还可通过糖与载体蛋白之比(重量/重量)表征。在一个实施方案中，所述糖缀合物中多糖与载体蛋白之比(w/w)是0.5-3(例如，约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0)。在其他实施方案中，所述糖与载体蛋白之比(w/w)是0.5-2.0、0.5-1.5、0.8-1.2、0.5-1.0、1.0-1.5或1.0-2.0。在进一步的实施方案中，所述糖与载体蛋白之比(w/w)是0.8-1.2。在一个优选实施方案中，所述糖缀合物中多糖与载体蛋白之比是0.9-1.1。在一些这样的实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。

糖缀合物还可通过其分子分布(Kd)鉴定。尺寸排阻层析介质(CL-4B)能用于确定缀合物的相对分子大小分布。尺寸排阻层析(SEC)用于重力进料柱以概括缀合物的分子大小分布。从介质孔中排出的大分子洗脱比小分子更迅速。部分收集器用于保护柱洗脱液。所述部分通过糖试验比色检测。为测定Kd，校准柱以确立分子充分排出的级分(V0),(Kd＝0)，和代表最大保留的级分(Vi),(Kd＝1)。达到特定样品属性的级分(Ve)，通过以下表达式与Kd相关：Kd＝(Ve–Vo)/(Vi–V0)。

c.游离糖。本发明的糖缀合物和免疫原性组合物可包括未共价缀合载体蛋白，而仍存在于糖缀合组合物中的游离糖。游离糖可与糖缀合物非共价相联(即非共价结合糖缀合物、吸附于糖缀合物、或被捕获于糖缀合物中或与糖缀合物一起被捕获)。在一个优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含至少50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含小于约25％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含至多约20％的游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含至多约15％游离多糖。在另一优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含至多约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含小于约8％游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含至多约6％游离多糖。在一个优选实施方案中，相较于多糖总量，所述糖缀合物包含至多约5％游离多糖。

d.共价键。在其他实施方案中，每5-10个糖重复单元；每2-7个糖重复单元；每3-8个糖重复单元；每4-9个糖重复单元；每6-11个糖重复单元；每7-12个糖重复单元；每8-13个糖重复单元；每9-14个糖重复单元；每10-15个糖重复单元；每2-6个糖重复单元,每3-7个糖重复单元；每4-8个糖重复单元；每6-10个糖重复单元；每7-11个糖重复单元；每8-12个糖重复单元；每9-13个糖重复单元；每10-14个糖重复单元；每10-20个糖重复单元；每4-25个糖重复单元或每2-25个糖重复单元，所述缀合物包含在载体蛋白与糖之间的至少一个共价键。在常见实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。在另一实施方案中，多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个糖重复单元，出现至少一个在载体蛋白与糖之间的键。在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。上面范围内的任意整数被视作本公开的实施方案。

e.赖氨酸残基。鉴定本发明的糖缀合物的另一方法是通过载体蛋白(如CRM₁₉₇)中的赖氨酸残基数目，所述载体蛋白变成与糖缀合，其能鉴定为一定范围的缀合赖氨酸(缀合程度)。由多糖共价键所引起载体蛋白的赖氨酸修饰证据能通过氨基酸分析获得，使用本领域技术人员已知的常规方法。缀合导致恢复的赖氨酸残基数目相较于用于产生缀合材料的载体蛋白起始材料降低。在一个优选实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度是2-15、2-13、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、3-15、3-13、3-10、3-8、3-6、3-5、3-4、5-15、5-10、8-15、8-12、10-15或10-12。在一个实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度是约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在一个优选实施方案中，本发明的糖缀合物的缀合程度是4-7。在一些这样的实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

糖链与载体蛋白上的赖氨酸的附着频率是表征本发明的糖缀合物的另一参数。例如，在一些实施方案中，多糖的每4个糖重复单元，有至少一个在载体蛋白与多糖之间的共价键。在另一实施方案中，所述载体蛋白与多糖之间的共价键在多糖的每10个糖重复单元中出现至少一次。在另一实施方案中，所述载体蛋白与多糖之间的共价键在多糖的每15个糖重复单元中出现至少一次。在另外一实施方案中，所述载体蛋白与多糖之间的共价键在多糖的每25个糖重复单元中出现至少一次。

f.O-乙酰化。在一些实施方案中，本发明糖是O乙酰化的。在一些实施方案中，所述糖缀合物包含O乙酰化程度为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、75-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或80-90％的糖。在其他实施方案中，所述O乙酰化程度是≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、或≥90％、或约100％。％O乙酰化是指给定糖相对于100％(其中各重复单元相对于其乙酰化结构充分乙酰化)的百分比。

在一些实施方案中，所述糖缀合物通过还原胺化制备。在一些实施方案中，所述糖缀合物是单末端连接的缀合糖，其中糖直接共价结合载体蛋白。在一些实施方案中，所述糖缀合物经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子共价结合载体蛋白。

g.还原胺化。在一个实施方案中，所述糖通过还原胺化来缀合载体蛋白(如美国专利申请公开号2006/0228380、2007/0231340、2007/0184071和2007/0184072、WO 2006/110381、WO 2008/079653和WO 2008/143709所描述)。

还原胺化包括：(1)糖的氧化，(2)经活化的糖和载体蛋白的还原以形成缀合物。氧化前，糖任选地经水解。可采用机械或化学水解。化学水解可用乙酸实施。

氧化步骤可涉及与过碘酸反应。本文所用术语“过碘酸”指过碘酸盐和过碘酸。该术语还包括高碘酸钠(IO4-)和原过碘酸盐(IO65-)以及各种过碘酸盐(如过碘酸钠和过碘酸钾)。在一个实施方案中，所述多糖在高碘酸钠存在下氧化，优选在过碘酸钠(NaIO4)存在下。在另一实施方案中，所述多糖在原过碘酸存在下氧化，优选在过碘酸存在下。

在一个实施方案中，氧化物质(oxidizing agent)是在氧化剂(oxidant)存在下选择性氧化伯羟基的稳定的硝酰或硝基氧自由基化合物，如哌啶-N-氧或吡咯烷-N-氧化合物。在所述反应中，在催化循环中，实际氧化剂是的N-氧铵(N-oxoammonium)盐。一方面，所述稳定的硝酰或硝基氧化合物是哌啶-N-氧或吡咯烷-N-氧化合物。一方面，所述稳定的硝酰或硝基氧自由基化合物携带TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基)或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分。一方面，所述稳定的硝基氧自由基化合物是TEMPO或其衍生物。一方面，所述氧化剂是携带N-卤素部分的分子。一方面，所述氧化剂选自N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺、二氯异氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二溴异氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二碘异氰尿酸和1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮的任意一种。所述氧化剂优选是N-氯代琥珀酰亚胺。

糖的氧化步骤后，糖被称为被激活并在下文称为“经活化的”。经活化的糖和载体蛋白可以是冻干的(冷冻干燥的)，独立(分开冻干)或一起(共冻干)。在一个实施方案中，所述经活化的糖与载体蛋白共同冻干。在一个实施方案中，所述经活化的多糖与载体蛋白独立冻干。

在一个实施方案中，所述冻干在非还原糖存在下发生，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、右旋糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽酮糖醇。

缀合过程的下一步是经活化的糖和载体蛋白的还原以形成缀合物(所谓还原胺化)，使用还原剂。合适的还原剂包括氰基硼氢化物，如氰基硼氢化钠，三乙酰氧基硼氢化钠或者硼氢化钠或硼氢化锌(存在布朗斯特酸或路易斯酸)，胺硼烷如吡啶硼烷，2-甲基吡啶硼烷，2,6-乙硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，t-BuMe’PrN-BH3，苄胺-BH或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)，硼烷-吡啶或硼氢化物交换树脂。在一个实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。

在一个实施方案中，所述还原反应在水性溶剂(如选自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、Bicine或HEPB，pH6.0-8.5、7.0-8.0、或7.0-7.5)中完成，在另一实施方案中，所述反应在非质子溶剂中完成。在一个实施方案中，所述还原反应在DMSO(二甲亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中完成。DMSO或DMF溶剂可用于重构冻干的经活化的多糖和载体蛋白。

在还原反应结束时，缀合物中可能有剩余的未反应的醛基，这些可用适当加帽剂加帽。在一个实施方案中，所述加帽剂是硼氢化钠(NaBH4)。缀合(还原反应和任选存在的加帽)后，糖缀合物可通过技术人员已知的各种技术纯化(对于多糖-蛋白缀合物的量进行富集)。这些技术包括透析、浓缩/透析操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水相互作用层析)和深层过滤。糖缀合物可通过透析和/或离子交换层析和/或尺寸排阻层析纯化。在一个实施方案中，所述糖缀合物通过透析或离子交换层析或尺寸排阻层析纯化。在一个实施方案中，所述糖缀合物无菌过滤。

在一个优选实施方案中，所述来自大肠杆菌血清型的糖缀合物通过还原胺化制备，所述血清型选自任意一种O25b、O1a、O2和O6。在一个优选实施方案中，所述来自大肠杆菌血清型O25b、O1a、O2和O6的糖缀合物通过还原胺化制备。

一方面，本发明涉及包括载体蛋白的糖缀合物，所述载体蛋白例如CRM197，连接式O25B的糖，由以下表示：

其中n是大于或等于1的任何整数。在一个优选实施方案中，所述n是至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40且至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50的整数。任何最小值和任何最大值可组合以定义范围。示范性范围包括例如至少1-至多1000；至少10-至多500；和至少20-至多80。在一个优选实施方案中，所述n是至少31-至多90，更优选40-90，最优选60-85。

另一方面，本发明涉及包括载体蛋白的糖缀合物，所述载体蛋白例如CRM197，连接具有任意一种下列表A所示结构的糖，其中n是大于或等于1的整数。

不受理论或机制约束，在一些实施方案中，所述稳定的缀合物被认为需要一定水平的糖抗原修饰，其针对保护抗原关键免疫原性表位的结构完整性进行平衡。

h.醛的激活和形成。在一些实施方案中，本发明的糖被激活并导致醛形成。在这样的糖激活的实施方案中，所述激活百分比(％)(或氧化程度(DO))指经活化的多糖的摩尔糖重复单位每摩尔醛。例如，在一些实施方案中，所述糖通过多糖重复单元上邻二醇的过碘酸盐氧化来激活，导致醛形成。改变过碘酸钠相对于糖重复单元的摩尔当量(meq)和氧化期间的温度，产生不同水平的氧化程度(DO)。

糖和醛浓度一般通过比色试验测定。替代性试剂是TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基)–N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)组合，其导致从伯醇基形成醛。

在一些实施方案中，所述经活化的糖具有一定氧化程度，其中经活化的糖的摩尔糖重复单位每摩尔醛是1-100，例如2-80、2-50、3-30和4-25。激活程度是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、≥20、≥30、≥40、≥50、≥60、≥70、≥80、或≥90或约100。氧化程度(DO)优选是至少5且至多50，更优选至少10且至多25。在一个实施方案中，所述激活程度是至少10且至多25。任何最小值和任何最大值可组合以定义范围。氧化值程度可由激活百分比(％)表示。例如，在一个实施方案中，所述DO值10指经活化的糖内总共10个糖重复单元中有一个经活化的糖重复单元，其中DO值10可由10％激活表示。

在一些实施方案中，所述通过还原胺化学制备的缀合物包括载体蛋白和糖，其中糖包括选自以下任意一种的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，所述缀合物中的糖包括化学式，其中n是1-1000的整数，5-1000，优选31-100或31-90，更优选35-90，最优选35-65。

i.单末端连接缀合物。在一些实施方案中，所述缀合物是单末端连接的缀合糖，其中所述糖在糖的一个末端共价结合载体蛋白。在一些实施方案中，所述单末端连接的缀合多糖具有末端糖。例如，若多糖末端之一(一个末端糖残基)共价结合载体蛋白，则缀合物是单末端连接的。在一些实施方案中，如果多糖的末端糖残基经接头共价结合载体蛋白，所述缀合物是单末端连接的。这样的接头可包括例如胱胺接头(A1)、3,3’-二硫代双(丙二酰肼)接头(A4)和2,2’-二硫代-N,N’-双(乙烷-2,1-二基)双(2-(氨氧基)乙酰胺)接头(A6)。

在一些实施方案中，所述糖经3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基缀合载体蛋白以形成单末端连接缀合物。

在一些实施方案中，所述缀合物优选不是生物缀合物。术语“生物缀合物”指宿主细胞背景下制备的、蛋白(如载体蛋白)与抗原如O抗原(例如O25B)之间的缀合物，其中宿主细胞体系使抗原与蛋白连接(如N连接)。糖缀合物包括生物缀合物以及糖抗原(如寡-和多糖)-蛋白缀合物，通过不需要在宿主细胞中制备缀合物的方式来制备，如通过蛋白与糖的化学键缀合。

j.巯基活化的糖。在一些实施方案中，所本发明糖是巯基活化的。在这样的糖是巯基活化的实施方案中，所述激活百分比(％)指经活化的多糖的摩尔巯基酶每糖重复单元。糖和巯基浓度一般由Ellman试验测定以定量硫氢基。例如，在一些实施方案中，所述糖包括用二硫胺接头激活2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)。在一些实施方案中，所述糖经二价、异双功能接头(本文也称为“间隔子”)共价结合载体蛋白。所述接头优选提供在糖与载体蛋白之间的硫醚键，产生的糖缀合物在本文称为“硫醚糖缀合物”。在一些实施方案中，所述接头还提供氨基甲酸酯和酰胺键，例如(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)。

在一些实施方案中，所述单末端连接缀合物包括载体蛋白和糖，其中所述糖包括选自以下任意一种的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，所述缀合物中的糖包括化学式，其中n是1-1000，5-1000的整数，优选31-100，更优选35-90，最优选35-65。

例如，在一个实施方案中，所述单末端连接缀合物包括载体蛋白和糖，所述糖具有选自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101的结构，其中n是1-10的整数。

5.eTEC缀合物

一方面，本发明一般涉及糖缀合物，其包含上述衍生自大肠杆菌的糖，经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子共价缀合载体蛋白(例如描述于美国专利9517274和国际专利申请公开WO2014027302，其通过引用全文并入本文)，包括含这样的糖缀合物的免疫原性组合物，以及制备和使用这样的糖缀合物及免疫原性组合物的方法。所述糖缀合物包含经一个或多个eTEC间隔子共价缀合载体蛋白的糖，其中所述糖经氨基甲酸酯键共价缀合eTEC间隔子，且其中载体蛋白经酰胺键共价缀合eTEC间隔子。eTEC间隔子包括7个线性原子(即–C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)且提供在糖与载体蛋白之间的稳定硫醚键和酰胺键。

本发明的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示：

其中包含eTEC间隔子的原子包含于中心盒。

在本发明的所述糖缀合物中，糖可以是多糖或寡糖。

并入本发明的糖缀合物的载体蛋白选自一般适合这样的目的的载体蛋白的组，如本文进一步所述或本领域技术人员已知。在特定实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。

另一方面，本发明提供制备糖缀合物的方法，所述糖缀合物包含经eTEC间隔子缀合载体蛋白的本文所述的糖，所述方法包括以下步骤：a)使糖与碳酸衍生物在有机溶剂中反应以产生经活化的糖；b)使经活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应以产生巯基化的糖；c)使巯基化的糖与还原剂反应以产生包含一个或多个游离硫氢基的经活化的巯基化的糖；d)使经活化的巯基化的糖与包含一个或多个α-卤乙酰胺基的经活化的载体蛋白反应，以产生巯基化的糖-载体蛋白缀合物；和e)使巯基化的糖-载体蛋白缀合物与(i)能够给经活化的载体蛋白的未缀合的α-卤乙酰胺基加帽的第一加帽剂；和/或(ii)能够给经活化的巯基化的糖的未缀合的游离硫氢基残基加帽的第二加帽剂反应；从而产生eTEC连接的糖缀合物。

在常见的实施方案中，所述碳酸衍生物是1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1’-羰二咪唑(CDI)。优选地，碳酸衍生物是CDT且有机溶剂是极性非质子溶剂，如二甲亚砜(DMSO)。在优选实施方案中，所述巯基化糖是通过经活化的糖与双功能对称的硫代烷基胺、胱胺或其盐反应产生的。或者，巯基化的糖可通过经活化的糖与半胱胺或其盐反应而形成。通过本发明方法产生的eTEC连接的糖缀合物可由通式(I)表示。

在常见的实施方案中，所述第一加帽剂是N-乙酰-L-半胱氨酸，其与载体蛋白的赖氨酸残基上未缀合的α-卤乙酰胺基反应，形成S-羧甲基半胱氨酸(CMC)残基，所述残基经硫醚键共价连接经活化的赖氨酸残基。

在其他实施方案中，所述第二加帽剂是碘乙酰胺(IAA)，其与经活化的巯基化的糖的未缀合的游离硫氢基反应以提供加帽的硫代乙酰胺。通常，步骤e)包括用第一加帽剂和第二加帽剂加帽。在某些实施方案中，所述步骤e)包括用N-乙酰-L-半胱氨酸作为第一加帽剂和IAA作为第二加帽剂。

在一些实施方案中，所述加帽步骤e)还包括在与第一和/或第二加帽剂反应后，与还原剂例如DTT、DTT或巯基乙醇反应。

本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可包括游离硫氢基残基。一些情况下，通过本文所提供的方法形成的活化巯基化糖会包括多个游离硫氢基残基，其中一些可能在缀合步骤中不经历与载体蛋白的共价缀合。这样的残留的游离硫氢基残基通过与巯基活性加帽剂例如碘乙酰胺(IAA)反应来加帽，以限制潜在的反应功能性。还考虑其他巯基活性加帽剂如含马来酰亚胺的试剂等。

另外，本发明的eTEC连接的糖缀合物和免疫原性组合物可包括剩余未缀合载体蛋白，其可包括在加帽工艺步骤中未经历修饰的经活化的载体蛋白。

在一些实施方案中，所述步骤d)还包括在经活化的巯基化的糖与经活化的载体蛋白反应前，提供包含一个或多个α-卤乙酰胺基的经活化的载体蛋白。在常见的实施方案中，所述经活化的载体蛋白包括一个或多个α-溴乙酰胺基。

在另一方面，本发明提供根据本文所公开的任意方法产生的eTEC连接的糖缀合物，其包含经eTEC间隔子缀合载体蛋白的本文所述的糖。

在一些实施方案中，所述载体蛋白是CRM197且经eTEC间隔子在CRM197与多糖之间的共价键于多糖的每4、10、15或25个糖重复单元中出现至少一次。

对于本发明的各方面，在本文所述方法和组合物的特定实施方案中，所述eTEC连接的糖缀合物包括本文所述的糖，如衍生自大肠杆菌的糖。

在另一方面，本发明提供在对象中预防、治疗或缓解细菌性感染、疾病或病症的方法，包括给对象施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含eTEC连接的糖缀合物，其包含本文所述的糖。在一些实施方案中，所述糖衍生自大肠杆菌。

在一些实施方案中，所述eTEC连接的糖缀合物包含载体蛋白和糖，其中所述糖包含选自以下任意一种的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(e.g.、式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(e.g.、式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，所述缀合物中的糖包括化学式，其中n是1-1000，5-1000的整数，优选31-100，更优选35-90，最优选35-65。

所述载体蛋白中与糖缀合的赖氨酸残基数目能表征为一定范围的缀合赖氨酸。例如，在免疫原性组合物的一些实施方案中，所述CRM₁₉₇可包含39个中的4-16个共价连接糖的赖氨酸残基。另一表示此参数的方式是约10％-约41％的CRM₁₉₇赖氨酸共价连接糖。在其他实施方案中，所述CRM₁₉₇可包括39个中的2-20个共价连接糖的赖氨酸残基。另一表示此参数的方式是约5％-约50％的CRM₁₉₇赖氨酸共价连接糖。

在常见的实施方案中，所述载体蛋白是CRM₁₉₇且经eTEC间隔子在CRM₁₉₇与多糖之间的共价键于多糖的每4、10、15或25个糖重复单元中出现至少一次。

在其他实施方案中，所述缀合物包含每5-10个糖重复单元；每2-7个糖重复单元；每3-8个糖重复单元；每4-9个糖重复单元；每6-11个糖重复单元；每7-12个糖重复单元；每8-13个糖重复单元；每9-14个糖重复单元；每10-15个糖重复单元；每2-6个糖重复单元、每3-7个糖重复单元；每4-8个糖重复单元；每6-10个糖重复单元；每7-11个糖重复单元；每8-12个糖重复单元；每9-13个糖重复单元；每10-14个糖重复单元；每10-20个糖重复单元；每4-25个糖重复单元，至少一个在载体蛋白与糖之间的共价键。

在另一实施方案中，多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个糖重复单元，出现至少一个在载体蛋白与糖之间的键。

6.载体蛋白

本发明的糖缀合物的一种组分是缀合糖的载体蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”在本文中可互换使用。载体蛋白应可修改以适应标准缀合过程。

一种缀合物组分是缀合O多糖的载体蛋白。在一个实施方案中，所述缀合物包括缀合O多糖的核心寡糖的载体蛋白。在一个实施方案中，所述缀合物包括缀合O多糖O抗原的载体蛋白。

术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”可在本文中互换使用。载体蛋白应可修改以适应标准缀合过程。

在一个优选实施方案中，所述缀合物的载体蛋白独立选自TT、DT、DT突变体(如CRM197)，流感嗜血杆菌蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(尤其是描述于WO 01/98334和WO03/54007的那些)、脱毒肺炎球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B和PsaA中的任意一种。在一个实施方案中，所述本发明缀合物的载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一实施方案中，所述本发明缀合物的载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。在另一实施方案中，所述本发明缀合物的载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D–参见例如EP 0 594 610 B)。在一些实施方案中，所述载体蛋白包括聚(L赖氨酸)(PLL)。

在一个优选实施方案中，所述糖缀合CRM197蛋白。CRM197蛋白是无毒型白喉毒素，但与白喉毒素在免疫学上无法区分。CRM197通过由非产毒性噬菌体β197tox感染的白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)产生，所述噬菌体通过产毒性β棒状噬菌体的亚硝基胍诱变建立。CRM197蛋白的分子量与白喉毒素相同，但差异在于结构基因的单碱基变化(从鸟嘌呤到腺嘌呤)。此单碱基变化导致成熟蛋白中的氨基酸取代(谷氨酸取代甘氨酸)且消除白喉毒素的毒性。CRM197蛋白是用于糖的安全和有效的T细胞依赖性载体。

因此，在一些实施方案中，所述本发明缀合物包括CRM₁₉₇作为载体蛋白，其中所述糖共价连接CRM₁₉₇。

在一个优选实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白选自DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素)或TT的片段C、CRM197(白喉毒素的无毒但抗原性相同变体)、其他DT突变体(如CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida等J.Biol.Chem.218；3838-3844,1973)、CRM9,CRM45,CRM102,CRM103或CRM107；和由Nicholls及Youle,《基因工程毒素》(GeneticallyEngineered Toxins),编:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992描述的其他突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala158缺失或突变为Giy以及US 4709017或US 4950740公开的其他突变；Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534至少一个或多个残基的突变以及US 5917017或US 6455673公开的其他突变；或US 5843711公开的片段)、肺炎球菌溶血素(Kuo等(1995)Infect lmmun 63；2706-13)(包括以一些方式脱毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO04081515,PCT/EP2005/010258)或dPLY-GMBS)、PhtX(包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列公开于WO 00/37105或WO 00/39299)和Pht蛋白的融合物例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、PhtA-E(WO 01/98334、WO 03/54007、WO2009/000826))、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白–通常提取自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)血清组B–EP0372501)、PorB(来自脑膜炎奈瑟菌)、PD(流感嗜血杆菌蛋白D–参见例如EP 0 594 610 B)或其免疫学功能等价物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热激蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471 177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、包含来自不同病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等(2001)EurJImmunol 31；3816-3824)如N19蛋白(Baraldoi等(2004)Infect lmmun 72；4884-7)、肺炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、艰难梭菌的毒素A或B(WO00/61761)、转铁结合蛋白、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、重组铜绿假单胞菌外毒素A(特别是其无毒突变体(如携带谷氨酸553处的取代的外毒素A (Uchida Cameron DM,RJCollier.1987.J.Bacteriol.169:4967-4971))。其他蛋白如卵清蛋白、钥孔戚血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)也能用作载体蛋白。其他合适的载体蛋白包括灭活细菌毒素如霍乱类毒素(如描述于Int’l专利申请号WO 2004/083251)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。

在一些实施方案中，所述载体蛋白选自以下任意一种例如CRM197、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素、或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、鞭毛蛋白、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的脱毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚基(CTB)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲菌(C.jejuni)AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)。在一个实施方案中，所述载体蛋白是脱毒假单胞菌外毒素(EPA)。在另一实施方案中，所述载体蛋白不是脱毒假单胞菌外毒素(EPA)。在一个实施方案中，所述载体蛋白是鞭毛蛋白。在另一实施方案中，所述载体蛋白不是鞭毛蛋白。

在一个优选实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白独立选自TT、DT、DT突变体(如CRM197)，流感嗜血杆菌蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(尤其是描述于WO 01/98334和WO03/54007的那些)、脱毒肺炎球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艰难梭菌的毒素A或B和PsaA。在一个实施方案中，所述本发明缀合物的载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一实施方案中，所述本发明缀合物的载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。在另一实施方案中，所述本发明缀合物的载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌蛋白D–参见例如EP 0 594 610 B)。

在一个优选实施方案中，本发明的荚膜糖缀合CRM197蛋白。CRM197蛋白是无毒型白喉毒素，但与白喉毒素在免疫学上无法区分。CRM197由非产毒性噬菌体β197tox感染的白喉棒状杆菌产生，所述噬菌体通过产毒性β棒状噬菌体的亚硝基胍诱变产生(Uchida,T.等.1971,Nature New Biology 233:8-11)。CRM197蛋白的分子量与白喉毒素相同，但差异在于结构基因的单碱基变化(从鸟嘌呤到腺嘌呤)。此单碱基变化导致成熟蛋白中的氨基酸取代(谷氨酸取代甘氨酸)且消除白喉毒素的毒性。CRM197蛋白是用于糖的安全和有效的T细胞依赖性载体。关于CRM197和其生产的进一步细节可参见例如US 5,614,382。

因此，在常见的实施方案中，本发明的糖缀合物包含CRM197作为载体蛋白，其中所述荚膜多糖共价连接CRM197。

在另一个实施方案中，所述糖缀合物的载体蛋白是SCP(链球菌C5a肽酶)。β-溶血性链球菌的所有人分离株产生高度保守的细胞壁蛋白SCP(链球菌C5a肽酶)，所述SCP特异性灭活C5a。scp基因编码含有1,134-1,181个氨基酸的多肽(Brown等,PNAS,2005,卷102,第51期18391–18396页)。前31个残基是输出信号前序列且在穿过细胞质膜后去除。接下来68个残基用作前导序列且必须去除以产生活性SCP。接下来10个残基能去除而不损失蛋白酶活性。在另一端，从Lys-1034开始，是4个连续17-残基基序，然后是细胞分选和细胞壁粘附信号。此联合信号由含LPTTND序列的20-残基亲水序列、17-残基疏水序列和短碱性羧基端构成。

SCP能分成多个结构域(参见Brown等,PNAS,2005,卷102,第51期18391–18396页的图1B)。这些结构域是Pre/Pro结构域(其包括输出信号前序列(通常是前31个残基)和前导序列(通常是接下来68个残基))、蛋白酶结构域(其分成2个部分(蛋白酶部分1且通常残基89–333/334，以及蛋白酶结构域部分2且通常残基467/468–583/584)、蛋白酶相关结构域(PA结构域)(通常是残基333/334–467/468)、3个纤连蛋白III型(Fn)结构域(Fn1，通常是残基583/584–712/713；Fn2，通常是残基712/713–928/929/930；通常是Fn3，残基929/930-1029/1030/1031)和细胞壁锚定结构域(通常是相对C末端的残基1029/1030/1031)。

在一个实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白是来自GBS的SCP(SCPB)。SCPB的示例如WO97/26008的SEQ.ID.NO:3所提供。还参见WO00/34487的SEQ ID NO:3。

在另一实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白是来自GAS的SCP(SCPA)。SCPA的示例可参见WO97/26008的SEQ.ID.NO:1和SEQ.ID.NO:2。还参见WO00/34487的SEQ ID NO:1、2。

在另一实施方案中，本发明的糖缀合物的载体蛋白是WO2014/136064的SEQ IDNO:150或151所示的SCP。

B.佐剂

在一些方面，本文所公开的免疫原性组合物还可包含至少1、2或3种佐剂。术语“佐剂”指增强对抗原免疫应答的化合物或混合物。抗原可主要作为递送系统、主要作为免疫调节剂起作用，或同时具有两者的强烈特征。合适的佐剂包括适合用于包括人的哺乳动物的那些。

已知能用于人的合适递送-系统类型佐剂的示例包括但不限于：铝(如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳液如MF59(4.3％w/v鲨烯,0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween 80),0.5％w/v山梨坦三油酸酯(Span 85))、油包水乳液如Montanide和聚(D,L-丙交酯-co-已交酯)(PLG)微粒或纳米颗粒。

一方面，本文所公开的免疫原性组合物包含铝盐(铝)作为佐剂(如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。另一方面，本文所公开的免疫原性组合物包含磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。一方面，本文所公开的免疫原性组合物包含0.1mg/mL-1mg/mL或0.2mg/mL-0.3mg/mL磷酸铝形式的元素铝。一方面，本文所公开的免疫原性组合物包含约0.25mg/mL磷酸铝形式的元素铝。

已知能用于人的合适的免疫调节类型佐剂的示例包括但不限于：来自Aquilla树的树皮的皂素提取物(QS21、Quil A)、TLR4拮抗剂如MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰MPL)或GLA-AQ、LT/CT突变体、细胞因子如各种白介素(如IL-2、IL-12)或GM-CSF、AS01等。

已知能用于人、有递送和免疫调节特性的合适的免疫调节类型佐剂的示例包括但不限于：ISCOMS(参见例如等.(1998)J.Leukocyte Biol.64:713；WO 90/03184、WO96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 2006/134423和WO 2007/026190)或GLA-EM，其是TLR4激动剂和水包油乳液的组合。

对于包括但不限于动物实验的兽医学应用，能使用完全弗氏佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、Emulsigen、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637,称为nor-MDP),N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-顺式-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其包含提取自细菌的3种组分,即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)，溶于2％鲨烯/Tween 80乳液。

增强本文所公开的免疫原性组合物效力的其他示范性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳液制剂(有或没有其他特异性免疫刺激剂如胞壁肽(见下)或细菌细胞壁组分)，例如(a)SAF，包含10％角鲨烷、0.4％ Tween 80、5％pluronic嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化入亚微乳剂或涡旋产生较大粒径乳液，和(b)RIBI^TM佐剂系统(RAS)(利比免疫化学公司(RibiImmunochem),蒙大拿州汉密尔顿)，含有2％鲨烯、0.2％ Tween 80和一种或多种细胞壁组分如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOX^TM)；(2)皂素佐剂，如QS21,STIMULON^TM(坎布里奇生物科学公司(CambridgeBioscience)，马萨诸塞州伍斯特)、(Isconova，瑞典)或可使用/>(英联邦血清实验室(Commonwealth Serum Laboratories)，澳大利亚)，或其中产生的颗粒如ISCOMs(免疫刺激复合物)，所述ISCOMS可缺乏额外d洗涤剂(如WO 00/07621)；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(例如WO 99/44636))、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰MPL(3dMPL)(参见例如GB2220211、EP0689454)(参见例如WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(参见例如WO 99/52549)；(8)聚氧乙烯山梨醇酐酯表面活性剂与辛苯聚醇的组合(例如WO 01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种额外非离子型表面活性剂如辛苯聚醇的组合(例如WO 01/21152)；(9)皂素和免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)(例如WO00/62800)；(10)免疫刺激剂和金属盐颗粒(参见例如WO 00/23105)；(11)皂素和水包油乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂素(例如QS21)+3dMPL+IM2(可选+甾醇)(例如WO 98/57659)；(13)用作免疫刺激剂以增强组合物功效的其他物质。胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-顺式-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在另一实施方案中，所述佐剂是脂质体Quillaja Saponaria-21(QS21)制剂，包含5.1mg/mL QS-21、5mM琥珀酸盐、60mM NaCl、0.1％ PS80、pH 5.6。在另一实施方案中，所述佐剂是脂质体单磷酰脂质A(MPLA，合成的，Avanti)制剂，包含15mM磷酸盐缓冲液、pH 6.1、4mg/mL 1,2-二油酰-顺式-甘油-3-胆碱磷酸(DOPC)、1mg/mL胆固醇、0.2mg/mLMPLA (Lot 00714551-0018-2XLipoMPL)，通过动态光散射确定，脂质体粒径为71nm。在另外一个实施方案中，所述佐剂是脂质体MPLA/QS21制剂，包含15mM磷酸盐缓冲液、pH 6.1、4mg/mL DOPC、1mg/mL胆固醇、0.2mg/mL MPLA和0.2mg/mL QS-21(Lot 00714551-0018-2XlipoMQ)，通过动态光散射确定，MPLA-QS21脂质体的粒径为75nm。

在本公开的另一方面，本文所公开的免疫原性组合物包含CpG寡核苷酸作为佐剂。本文所用的CpG寡核苷酸指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，因此，除非另有说明，这些术语可互换使用。免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸包含一个或多个免疫刺激性CpG基序，其是未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，任选地在某些优选碱基背景内。CpG免疫刺激性基序的甲基化状态一般涉及二核苷酸中的胞嘧啶残基。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是含有由磷酸键连接3′鸟嘌呤的5′未甲基化胞嘧啶，且通过结合Toll样受体(TLR-9)激活免疫系统的寡核苷酸。在另一实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸可含有一个或多个甲基化的CpG二核苷酸，其通过TLR9激活免疫系统，但不如未甲基化的CpG基序强烈。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一个或多个回文，其进而可涵盖CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已描述于一些授权的专利、公开的专利申请和其他公开物，包括美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。

鉴定了不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些称为A、B、C和P种类，且更详细描述于WO 2010/125480的第3页第22行到第12页第36行。本公开的方法包括使用这些不同种类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。

V.纯化和生产的方法

一方面，本公开涉及产生FimH突变多肽的方法。这样的方法能包括例如在适当条件下培养哺乳动物细胞，从而表达Fim H突变体多肽。所述方法还可包括从培养物收获多肽。所述工艺还包括纯化多肽。

在一些方面，所述方法以约0.1g/L-0.5g/L产量产生FimH突变体多肽。在一些方面，所述FimH突变的多肽的产量是至少约1mg/L、至少约2mg/L、至少约3mg/L、至少约4mg/L、至少约5mg/L、至少约6mg/L、至少约7mg/L、至少约8mg/L、至少约9mg/L、至少约10mg/L、至少约11mg/L、至少约12mg/L、至少约13mg/L、至少约14mg/L、至少约15mg/L、至少约16mg/L、至少约17mg/L、至少约18mg/L、至少约19mg/L、至少约20mg/L、至少约25mg/L、至少约30mg/L、至少约35mg/L、至少约40mg/L、至少约45mg/L、至少约50mg/L、至少约55mg/L、至少约60mg/L、至少约65mg/L、至少约70mg/L、至少约75mg/L、至少约80mg/L、至少约85mg/L、至少约90mg/L、至少约95mg/L或至少约100mg/L。

在一些方面，适合本公开的细胞培养是补料分批培养。本文所用术语“补料分批培养”指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的一个或多个时间向培养物提供额外组分。这样的提供的组分通常包括在培养过程中耗尽的营养成分。补料分批培养通常在一些点停止，收获且任选地分离培养基内的细胞和/或组分。在一些方面，补料分批培养包括用补料培养基补充的基础培养基。

在一些方面，细胞可在分批或补料分批培养中生长，其中所述培养在多肽重组表达后终止，之后收获且任选地分离表达的多肽。在一些方面，细胞可在灌注培养中生长，其中所述培养不终止，新营养物和其他组分定期或连续加入培养物，其间定期或连续收获表达的多肽。

在一些方面，相较于FimH突变体多肽在细菌细胞例如大肠杆菌宿主细胞内的表达，FimH突变体多肽的表达水平或活性增加至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍。

在一些方面，细胞可在小规模反应容器中生长以形成体积范围从数毫升到数升的细胞培养物。在一些方面，细胞可在大规模商业生物反应器中生长以形成细胞培养物，其中细胞培养物的体积范围可从约至少1升到10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多，或之间的任意体积。在一些实施方案中，所述细胞培养物的大小范围可以是10L-5000L、10L-10,000L、10L-20,000L、10L-50,000L、40L-50,000L、100L-50,000L、500L-50,000L、1000L-50,000L、2000L-50,000L、3000L-50,000L、4000L-50,000L、4500L-50,000L、1000L-10,000L、1000L-20,000L、1000L-25,000L、1000L-30,000L、15L-2000L、40L-1000L、100L-500L、200L-400L，或之间的任意整数。

细胞培养的温度主要基于以下温度范围选择：在该温度细胞培养物仍能存活，在该温度产生高水平多肽，在该温度的代谢废物产生或积聚最小，和/或实施者视作重要的这些或其他因素的任意组合。作为一个非限制性示例，CHO细胞在约37℃生长良好并产生高水平的蛋白或多肽。一般，大部分哺乳动物细胞在约25℃-42℃范围内生长良好和/或能产生高水平蛋白或多肽，尽管本公开教授的方法不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在约35℃-40℃范围内生长良好和/或能产生高水平蛋白或多肽。在某些方面，细胞培养物在细胞培养过程中的一个或多个时间，于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃温度生长。

本文所用术语“培养物”和“细胞培养物”指在适合细胞群体存活和/或生长条件下悬于培养基的细胞群体。如本领域普通技术人员所清楚了解的，在一些方面，本文所用的这些术语涉及包含细胞群体和该群体在其中悬浮的培养基的组合。在一些方面，细胞培养物的细胞包含哺乳动物细胞。

在一些方面，细胞可在各种化学成分确定的培养基之一中生长，其中培养基组分是已知且受控的。在一些方面，细胞可在复合培养基中生长，其中不是所有培养基组分都是已知和/或受控的。用于哺乳动物细胞培养的化学成分确定的生长培养基在过去几十年中已经广泛开发并公开。成分确定培养基的所有组分良好表征，且这种成分确定的培养基不含有复合添加剂如血清或水解产物。开发了早期培养基制剂以允许细胞生长和维持生存力，而对蛋白产生的关注很少或没有。最近，出于表达目的开发了培养基制剂，支持产生高产重组蛋白的细胞培养物。这样的培养基优选用于本发明方法。这样的培养基一般包含大量营养物且尤其是氨基酸以支撑细胞高密度生长和/或维持。若必需，这些培养基能由技术人员改良用于本发明方法。例如，技术人员可减少这些培养基中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和/或甲硫氨酸的量，以用作本文所公开方法中的基础培养基或补料培养基。

不是所有复合培养基组分得到良好表征，且这种复合培养基可包含添加剂如简单和/或复合碳源、简单和/或复合氮源以及血清等。在一些方面，除了本文所述的成分确定培养基的其他组分，适合本发明的复合培养基还含有添加剂如水解产物。在一些方面，成分确定的培养基通常包括水中已知浓度的大约50种化学实体。其中大部分还包括一个或多个特征明确的蛋白如胰岛素、IGF-1、转铁蛋白或BSA，但其他不需要蛋白组分且因而称为无蛋白的成分确定培养基。培养基的典型化学组分分成5个广泛类别：氨基酸、维生素、无机盐、微量元素和无法进行简单分类的其他类别。

细胞培养基任选地补充有补充组分。本文所用术语“补充组分”指使生长和/或存活高于最低率的组分，包括但不限于激素和/或其他生长因子，尤其是离子(如钠、氯、钙、镁和磷)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(无机化合物通常以极低终浓度存在)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能源。在一些方面，补充组分可加入初始细胞培养物。在一些方面，补充组分可在细胞培养开始后加入。通常，微量元素指以微摩尔或更低水平包括的多种无机盐。例如，通常包括的微量元素是锌、硒、铜等。在一些方面，可以包括微摩尔浓度的铁(亚铁盐或铁盐)作为初始细胞培养基中微量元素。在微量元素中常常也包括二价阳离子的锰(MnCl2或MnSO4)，浓度范围是纳摩尔到微摩尔。许多不太常见的微量元素通常以纳摩尔浓度加入。

在一些方面，用于本发明方法的培养基是适合支持高细胞密度的培养基，例如细胞培养物中1x 106细胞/mL、5x 106细胞/mL、1x 107细胞/mL、5x 107细胞/mL、1X 108细胞/mL或5X 108细胞/mL。在一些方面，细胞培养物是哺乳动物细胞的补料分批培养物，优选CHO细胞的补料分批培养物。

在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含酪氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含色氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含亮氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含丝氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苏氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含甘氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的2种，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸和酪氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸和色氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸和甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含酪氨酸和色氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含酪氨酸和甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含色氨酸和甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的3种，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。

在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。

在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的4种，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。

在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的5种，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的6种，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸中的7种，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基包含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸，浓度低于2mM、低于1mM、在0.1-2mM之间、0.1-1mM之间、0.5-1.5mM之间或0.5-1mM之间。在一些方面，细胞培养基还包含甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种，浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选2mM。在一些方面，细胞培养基还包含甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少5种，浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选2mM。在一些方面，细胞培养基还包含甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺，浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选2mM。在一些方面，细胞培养基还包含缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9种，浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选2mM。在一些方面，细胞培养基还包含缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺中的至少5种，浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选2mM。在一些方面，细胞培养基还包含缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺，浓度高于2mM、3mM、4mM、5mM、10mM、15mM，优选2mM。在一些方面，细胞培养基包含丝氨酸，浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选10mM。在一些方面，细胞培养基包含缬氨酸，浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选10mM。在一些方面，细胞培养基包含半胱氨酸，浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选10mM。在一些方面，细胞培养基包含异亮氨酸，浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选10mM。

在一些方面，细胞培养基包含亮氨酸，浓度高于3mM、5mM、7mM、10mM、15mM或20mM，优选10mM。在一些方面，上面的细胞培养基用于本文所公开方法。在一些方面，上面的细胞培养基用于本文所公开方法，作为基础培养基。在一些方面，上面的细胞培养基用于本文所公开方法，作为补料培养基。

本公开的方法可与适合所需过程(如产生重组蛋白)的任何细胞培养方法一起使用。作为一个非限制性示例，细胞可在分批或补料分批培养中生长，其中所述培养在重组蛋白(如抗体)充足表达后终止，之后收获表达的蛋白。或者，作为另一非限制性示例，细胞可分批再补料生长，其中所述培养不终止，新营养物和其他组分定期或连续加入培养物，其间定期或连续收获表达的重组蛋白。其他合适方法(如转管培养)是本领域已知的且能用于实施本发明。

细胞可在由实施者选定的任何常规体积中生长。例如，细胞可在小规模反应容器中生长，体积范围是数毫升到数升。或者，细胞可在大规模商业生物反应器中生长，体积范围从约至少1升到10、50、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15000、20000或25000升或更多，或之间的任意体积。

细胞培养的温度主要基于以下温度范围选择：在该温度细胞培养物仍能存活且该范围内产生高水平所需产物(如重组蛋白)。一般，大部分哺乳动物细胞在约25℃-42℃范围内生长良好且能产生所需产物(如重组蛋白)，尽管本公开教授的方法不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在约35℃-40℃范围内生长良好且能产生所需产物(如重组蛋白或抗体)。在某些方面，细胞培养物在细胞培养过程中的一个或多个时间，于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃温度生长。本领域普通技术人员能够选择一个或多个使细胞生长的合适温度，这是根据特定细胞需求和实施者的特定生产要求。细胞可生长任意时间量，这取决于实施者需求和细胞本身要求。在一些实施方案中，所述细胞在37℃生长。在一些方面，所述细胞在36.5℃生长。

在一些方面，根据实施者需求和细胞本身要求，细胞可在初始生长期(或生长期)生长更长或更短的时间。在一些方面，细胞生长时间段足以达到预定义细胞密度。在一些方面，细胞生长时间段足以达到一定细胞密度，其是允许不受干扰生长时，细胞实际会达到最大细胞密度的给定百分比。例如，细胞生长时间段足以达到、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％最大细胞密度的所需活细胞密度。在一些方面，细胞生长，直至细胞密度增加不超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％/天培养。在一些方面，细胞生长，直至细胞密度增加不超过5％/天培养。

在一些方面，细胞允许生长确定时间段。例如，根据细胞培养的起始浓度、细胞生长的温度和细胞的内在增长率，细胞可生长0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，优选4-10天。一些情况下，细胞可允许生长一个月或更长。根据蛋白生产要求和细胞本身需求，本发明的实施者能够选择初始生长期的持续时间。

细胞培养可初始培养期间搅拌或振荡，以增加对细胞的氧合作用和营养物分散。根据本发明，本领域普通技术人员应理解其能有益于控制或调节生物反应器在初始生长期间的某些内部条件，包括但不限于pH、温度、氧合作用等。

在初始生长期结束时，至少一种培养条件可改变，从而应用第二组培养条件且培养物中出现代谢转变。代谢转变能通过例如细胞培养的温度、pH、渗透性或化学感应物水平变化来完成。在一个非限制性实施方案中，所述培养条件通过转变培养温度来改变。然而，如本领域已知，转变温度不是能实现适当代谢转变的唯一机制。例如，这种代谢转变还能通过转变其他培养条件完成，包括但不限于pH、渗透性和丁酸钠水平。培养转变的时间由本发明实施者根据蛋白生产要求或细胞本身需求确定。

当转变培养温度时，温度转变可以是相对缓慢的。例如，可花数小时或数天来完成温度变化。或者，温度转变可相对突然。例如，温度变化可少于数小时完成。考虑到合适的生产和控制设备，如在商业大规模多肽或蛋白生产中标准的，温度变化可甚至在少于一小时完成。

在一些方面，一旦细胞培养条件如上所述改变，细胞培养在第二组培养条件下维持后续生产期，所述条件有助于细胞培养物的存活和活力并且适合以合乎商业需要的水平表达所需多肽或蛋白。

如上所讨论的，细胞培养可通过转变一些培养条件中的一种或多种来转变，包括但不限于温度、pH、渗透性和丁酸钠水平。在一些方面，转变培养温度。根据此实施方案，在后续生产期间，培养在低于初始生长期的温度或温度范围下维持。如上所讨论，多种不同温度变化可用于增加细胞密度或活力或提高重组蛋白表达。

例如，本文所用术语“滴度”指细胞培养物在给定培养基体积中产生的重组表达蛋白总量。滴度通常以蛋白克数/升培养基的单位表示。

在一些方面，细胞生长相较于对照培养物增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些方面，细胞生长相较于对照培养物增加至少10％。在一些方面，细胞生长相较对照培养物增加至少20％。

在一些方面，生产力由滴度和/或容积生产率确定。

在一些方面，生产力由滴度确定。在一些方面，生产力相较于对照培养物增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些方面，生产力相较于对照培养物增加至少10％。在一些方面，生产力相较于对照培养物增加至少20％。

纯化

在一些方面，产生FimH突变体多肽的方法包括分离和/或纯化多肽。在一些方面，表达的多肽分泌入培养基，因而细胞和其他固体可通过离心和/或过滤去除。在一个优选实施方案中，所述多肽或其片段是可溶的。

可自宿主细胞收获根据本文所述的方法产生的FimH突变的多肽并使用任何合适的且一般为本领域已知的方法(如Ruiz-Arguello等,J.Gen.Virol.,85:3677-3687(2004))分离。纯化多肽的合适方法包括沉淀和各种类型的层析，如疏水相互作用、离子交换、亲和、螯合及尺寸排阻，这些都是本领域已知的。合适的纯化方案可包括这些或其他适当方法中的2个或更多。在一些方面，一种或多种多肽可包括促进纯化或检测的“标签”。示例包括例如His标签(结合金属离子，如六聚组氨酸)、抗体、麦芽糖结合蛋白(MBP)(结合直链淀粉)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(结合谷胱甘肽)、FLAG标签(结合抗标记抗体)、Strep标签(结合链霉亲和素或其衍生物)。这样的带标签的多肽可通过螯合层析或亲和层析方便地分离，例如从条件培养基分离。任选地，标签序列可在纯化后切割。一方面，FimH突变体多肽不包括纯化标签。

一方面，FimH突变体多肽能如下分离：首先获得细胞培养物上清，随后使上清经历超滤和透析过滤方法。这种过滤方法是本领域技术人员已知的。超滤和透析过滤后，所得无细胞溶液随之进行层析步骤，如Ni-NTA层析，使用例如镍亲和树脂。此步骤后可以是透析，接着可以是阳离子交换层析，如用SP柱进行。在SP-琼脂糖的纯化期间使用酸性pH(如小于约6.0，小于约5.5、小于约5.0、小于约4.5、约4.4、约4.3、约4.2、约4.1或约4.0或更小)，可能在某些条件下是需要的。

尽管在本文中可参考大肠杆菌特定菌株，应理解衍生自大肠杆菌的多肽或其片段不限于特定菌株，除非有特别说明。

VI.组合物的用途

一方面，本公开提供FimH突变体多肽、编码这样的突变体的核酸、表达这样的突变体的载体、包含这样的突变体的组合物或核酸作为药物的用途，或在生产药物中的用途，所述药物用于在对象中引发针对大肠杆菌感染的免疫应答或预防大肠杆菌感染。

在其他方面，本公开提供在对象如人中引发免疫应答针对大肠杆菌的免疫应答的方法，包括给对象施用有效量的FimH突变体多肽、编码FimH突变体多肽的核酸分子、或含FimH突变体多肽的组合物或核酸分子。本公开还提供在对象中预防大肠杆菌感染的方法，包括给对象施用有效量的药物组合物如疫苗，所述组合物包含FimH突变体多肽、编码FimH突变体多肽的核酸或表达FimH突变体多肽的载体。在一些特定方面，药物组合物包含本文所公开的FimH突变体多肽。在上文提供的一些方面，所述对象是人。

在其他方面，本公开提供在对象中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或在对肠外致病性大肠杆菌特异的对象中诱导调理吞噬抗体和/或中和抗体产生的方法，其中所述方法包括给对象施用有效量的任意本文所述的组合物，如包含本文所述的FimH突变体多肽的那些。在这样的方法的另一方面，对象处于发展尿路感染的风险和/或发展菌血症的风险和/或发展败血症的风险。

另一方面，本公开提供在哺乳动物中引发针对大肠杆菌的免疫应答的方法，包括给哺乳动物施用有效量的任意本文所述的组合物。例如，一方面，免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体和/或中和抗体。在另一方面，免疫应答保护哺乳动物免于大肠杆菌感染。

另一方面，本公开提供在对象中预防、治疗或改善细菌性感染、疾病或病症的方法，包括给对象施用免疫有效量的任意本文所述组合物。

在本公开的方法中，可以给对象施用组合物，而施用或不施用佐剂。给对象施用的有效量是足以在对象中引发针对大肠杆菌抗原如FimH蛋白的免疫应答的量。能选择用于治疗的对象包括处于发展大肠杆菌感染风险的那些，如由于暴露于大肠杆菌或有暴露于大肠杆菌可能性，而处于发展尿路感染风险和/或发展菌血症风险和/或发展败血症风险的那些。

本文所用的“对象”指哺乳动物，优选人。在一个实施方案中，所述对象处于发展选自以下的病症的任意一种的风险：尿路感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血性尿毒症综合征、新生儿脑膜炎、尿脓毒病、腹腔内感染、脑膜炎、合并肺炎、伤口感染、前列腺活检后相关感染、新生儿/婴儿败血症、中性粒细胞缺乏性发烧和其他血流感染；肺炎、菌血症和败血症。

施用本公开所提供的组合物如药物组合物，能用标准施用途径完成。非限制性实施方案包括肠胃外施用，如皮内、肌肉内、皮下、经皮、粘膜或口服施用。

如熟练的实施者已知的，在一次施用过程中提供给对象的组合物的总剂量可以改变。

还可能提供免疫原性组合物的一个或多个的一次或多次加强施用。如果进行加强免疫接种，通常在给对象第一次施用组合物(这样的情况下称为初次免疫接种)后1周-10年之间，优选2周-6个月的时间给同一对象施用这样的免疫接种。在替代的加强方案中，还可能在初次免疫接种后给对象施用不同载体，如一种或多种腺病毒，或其他载体如经修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)或DNA或蛋白。本公开所提供的免疫原性组合物可与一种或多种其他免疫原性组合物一起使用。

组合物剂量

剂量方案可调整以提供最优所需应答。例如，可施用单剂量的突变的FimH多肽，可随着时间施用分次剂量，或剂量可按比例减少或增加，如情况的紧急程度所示。应注意，剂量值可随着待缓解病症的类型和严重度而变化，且能包括单剂量或多剂量。还应理解对于任何特定对象，特定剂量方案应根据个体需求和施用或监督组合物施用的人的专业判断随着时间调整，本文所示剂量范围仅作为示范性，不意在限制要求权利的组合物的范围或实施。

在一些方面，组合物中FimH突变体多肽的含量范围可以是约10μg–约300μg各蛋白抗原。在一些方面，组合物中FimH突变体多肽的含量范围可以是约20μg–约200μg各蛋白抗原。

各剂量中糖缀合物的量选定为包括免疫保护性反应的量，而没有典型疫苗中的显著副作用。这样的量根据采用的哪种特异性免疫原和其如何呈递而变化。

免疫原性组合物中特定糖缀合物的量能基于缀合物的总多糖(缀合和未缀合)计算。例如，有20％游离多糖的糖缀合物在100g多糖剂量中具有约80g缀合多糖和约20g未缀合多糖。糖缀合物的量能根据大肠杆菌血清型而变化。糖浓度能通过糖醛酸试验测定。

免疫原性组合物中不同多糖的“免疫原性量”可不同且各可包含约1.0g、约2.0g、约3.0g、约4.0g、约5.0g、约6.0g、约7.0g、约8.0g、约9.0g、约10.0g、约15.0g、约20.0g、约30.0g、约40.0pg、约50.0pg、约60.0pg、约70.0pg、约80.0pg、约90.0pg或约100.0g的任意特定多糖抗原。一般，各剂量就给定血清型而言包括0.1g-100g多糖，特定是0.5g-20g，更特定是1g-10且甚至更特定是2g-5g。上面范围内的任何整数被视作本公开的实施方案。在一个实施方案中，各剂量就给定血清型而言包括1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g或20g多糖。

VII.与衍生自肺炎克雷伯菌(KLEBSIELLA PNEUMONIAE)的糖和/或多肽或其片段的组合

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)是革兰氏阴性病原菌，已知导致尿路感染、菌血症和败血症。多药耐药性肺炎克雷伯菌感染是在有风险的脆弱群体中导致死亡率增加的病因。O抗原血清型在导致全球侵袭性疾病的菌株中非常普遍，O抗原糖缀合物是有吸引力的疫苗抗原。

一方面，本文公开的任意组合物还可包含至少一种糖，其是或衍生自至少一种肺炎克雷伯菌血清型，选自O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8和O12。在一个优选实施方案中，本文公开的任意组合物还可包含衍生自肺炎克雷伯菌的多肽，选自衍生自肺炎克雷伯菌I型菌毛蛋白的多肽或其免疫原性片段；或衍生自肺炎克雷伯菌III型菌毛蛋白的多肽或其免疫原性片段；或其组合。

如本领域已知的，肺炎克雷伯菌O1和O2 O抗原及其对应的v1和v2亚型是重复单元结构有差异的聚合半乳聚糖。肺炎克雷伯菌O1和O2抗原包含均聚物半乳糖单元(或半乳聚糖)。肺炎克雷伯菌O1和O2抗原各包含D-半乳聚糖单元(有时称为O2a重复单元)，但O1抗原的差异在于O1抗原具有D-半乳聚糖II帽结构。D-半乳聚糖III(d-Gal-III)是D-半乳聚糖I的变体。基础半乳聚糖I和III的结构定义2个不同血清型O2亚型O2v1和O2v2；通过半乳聚糖II加帽形成的衍生嵌合体的结构产生亚型O1v1和O1v2，其如Kelly SD等.J Biol Chem2019；294:10863-76；和Clarke BR等.J Biol Chem 2018；293:4666-79所示。

在一个实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O1的糖包括[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O1的糖包括[→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O1的糖包括[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]的重复单元和[→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O1的糖包括→3)-β-D-Galf-(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-(1→]的重复单元。(Kol O.等.(1992)Carbohydr.Res.236,339–344；Whitfield C.等.(1991)J.Bacteriol.173,1420–1431)。

在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O2的糖包括[→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→]的重复单元(其可以是肺炎克雷伯菌血清型O2a抗原的元件)。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O2的糖包括[→3)-β-D-GlcpNAc-(1→5)-β-D-Galf-(1→]的重复单元(其可以是肺炎克雷伯菌血清型O2c抗原的元件)。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O2的糖包括侧链添加(1→4)连接Galp残基的O2a重复单元的修饰(其可以是肺炎克雷伯菌O2afg抗原的元件)。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O2的糖包括侧链添加(1→2)连接的Galp残基的O2a重复单元的修饰(其可以是肺炎克雷伯菌O2aeh抗原的元件)(Whitfield C.等.(1992)J.Bacteriol.174,4913–4919)。

不受机制或理论约束，肺炎克雷伯菌血清型O3和O5的O抗原多糖结构如本领域所公开的，分别与大肠杆菌血清型O9a(式O9a)和O8(式O8)的那些相同。

在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O4的糖包括[→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]的重复单元。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O7的糖包括[→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]的重复单元。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O8血清型的糖包括与肺炎克雷伯菌O2a相同的重复单元结构，但非化学计量地O乙酰化。在一些实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌O12血清型的糖包括[α-Rhap-(1→3)-β-GlcpNAc]二糖重复单元的重复单元。

一方面，本发明包括组合物，包含衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；和至少一种糖，其是或衍生自至少一种肺炎克雷伯菌血清型，选自O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8和O12。在一些实施方案中，所述组合物包括来自或衍生自血清型O1、O2、O3和O5的一种或多种或其组合的糖。在一些实施方案中，所述组合物包括来自或衍生自各血清型O1、O2、O3和O5的糖。

另一方面，本发明包括组合物，其包括至少一种糖，所述至少一种糖是或衍生自至少一种肺炎克雷伯菌血清型，选自O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8和O12；和衍生自大肠杆菌O抗原的糖，具有选自以下任意一种的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(e.g.、式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是1-100的整数。在一些实施方案中，所述组合物包括来自或衍生自肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O3和O5的一种或多种或其组合的糖。在一些实施方案中，所述组合物包括来自或衍生自各肺炎克雷伯菌血清型O1、O2、O3和O5的糖。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O3的糖。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O5的糖。

另一方面，本发明涉及组合物，包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；至少一种糖，其是或衍生自至少一种肺炎克雷伯菌血清型，选自O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8和O12；和具有选自以下任意一种结构的糖：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是1-100的整数，优选31-90。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O3的糖。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O5的糖。

在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种糖，其衍生自选自O1、O2、O3和O5的任意一种肺炎克雷伯菌类型。

在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌O1型的至少一种糖。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原选自亚型v1(O1v1)或亚型v2(O1v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原选自亚型v1(O1v1)和亚型v2(O1v2)。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌O2型的至少一种糖。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原选自亚型(O2v1)或亚型v2(O2v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原选自亚型v1(O2v1)和亚型v2(O2v2)。在另一方面，肺炎克雷伯菌O抗原选自下组：a)血清型O1亚型v1(O1v1)、b)血清型O1亚型v2(O1v2)、c)血清型O2亚型v1(O2v1)、和d)血清型O2亚型v2(O2v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原是亚型v1(O1v1)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原是亚型v2(O1v2)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原是亚型v1(O2v1)。在此实施方案的一个方面，肺炎克雷伯菌O抗原是亚型v2(O2v2)。在此实施方案的另一方面，组合物包括选自下组的1、2、3或4种肺炎克雷伯菌O抗原：a)血清型O1亚型v1(O1v1)、b)血清型O1亚型v2(O1v2)、c)血清型O2亚型v1(O2v1)和d)血清型O2亚型v2(O2v2)。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌的糖组合，其中第一糖衍生自任意一种选自O1、O2、O3和O5的肺炎克雷伯菌类型；第二糖衍生自任意一种选自O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8和O12的肺炎克雷伯菌类型。例如，在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌O1型的至少一种糖和衍生自肺炎克雷伯菌O2型的至少一种糖。在一个优选实施方案中，所述衍生自肺炎克雷伯菌的糖缀合载体蛋白；且衍生自大肠杆菌的糖缀合载体蛋白。

在另一方面，本发明包括组合物，其包括衍生自大肠杆菌FimH的多肽或其片段；和至少一种糖，其衍生自选自O1、O2、O3和O5的任意一种肺炎克雷伯菌类型。

在另一方面，本发明包括至少一种糖，其衍生自任意一种选自O1、O2、O3和O5的肺炎克雷伯菌类型；和衍生自大肠杆菌的至少一种糖，其具有选自以下任意一种的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(e.g.、式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O3的糖。在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O5的糖。

在一些实施方案中，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌O1型的至少一种糖；和衍生自具有选自式O8和式O9结构的大肠杆菌的至少一种糖。在另一实施方案中，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌O2型的至少一种糖；和衍生自具有选自式O8和式O9结构的大肠杆菌的至少一种糖。在另一实施方案中，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌O1型的至少一种糖；衍生自肺炎克雷伯菌O2型的的至少一种糖；和衍生自具有选自式O8和式O9结构的大肠杆菌O抗原的至少一种糖。

在一个实施方案中，本发明提供在对象中诱导针对肺炎克雷伯菌的免疫应答的方法，包括给对象施用免疫有效量的免疫原性组合物，所述组合物包含来自大肠杆菌血清型O8或O9的至少一种糖缀合物，其中所述免疫原性组合物不包含来自肺炎克雷伯菌血清型O5或O3的糖缀合物。一方面，所述组合物包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O5的糖。在另一方面，所述组合物包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O抗原的糖，且不包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O3的糖。

在另一实施方案中，本发明提供在对象中诱导针对大肠杆菌的免疫应答的方法，包括给对象施用免疫有效量的免疫原性组合物，所述组合物包含来自肺炎克雷伯菌血清型O5或O3的至少一种糖缀合物或其变体，其中所述免疫原性组合物不包含来自大肠杆菌血清型O8或O9的糖缀合物。一方面，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O5的糖，且不包括衍生自具有式O8的大肠杆菌O抗原的糖。在另一方面，所述组合物包括衍生自肺炎克雷伯菌血清型O3的糖，且不包括衍生自具有式O9的大肠杆菌O抗原的糖。

在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种糖，其是或衍生自至少一种肺炎克雷伯菌血清型，选自O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8和O12；至少一种糖，其衍生自具有选自式O8和式O9结构的大肠杆菌。在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种糖，其是或衍生自至少一种肺炎克雷伯菌血清型，选自O1(和d-Gal-III变体)、O2(和d-Gal-III变体)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8和O12；至少一种糖，其衍生自具有选自式O1A、式O1B、式O2、式O6和式O25B结构的大肠杆菌。

在一些实施方案中，所述组合物还包括衍生自肺炎克雷伯菌的多肽，选自衍生自肺炎克雷伯菌I型菌毛蛋白的多肽或其免疫原性片段；或衍生自肺炎克雷伯菌III型菌毛蛋白的多肽或其免疫原性片段，或其组合。所述多肽的序列是本领域已知的。

VIII.纳米颗粒

在另一方面，本文公开免疫原性复合物，包括1)纳米结构；和2)至少一种菌毛多肽或其片段。菌毛多肽或其片段优选衍生自大肠杆菌菌毛H(fimH)。在一个优选实施方案中，所述菌毛多肽选自任意一种上述菌毛多肽。例如，菌毛多肽可包含选自SEQ ID NO:1-65的任意一条氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗原融合或缀合外部纳米结构以刺激对所展示的表位发展出适应性免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫原性复合物还包括佐剂和其他免疫调节化合物，附于外部和/或包封于笼内以协助调整对于各病原体产生的免疫应答类型。

在一些实施方案中，所述纳米结构包括单一组装，包括多个相同的第一纳米结构相关多肽。

在替代的实施方案中，所述纳米结构包括多重组装，包括多个相同的第一纳米结构相关多肽，以及多重第二组装，各第二组装包含多个相同的第二纳米结构相关多肽。

各种纳米结构平台能用于产生本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所用纳米结构通过多拷贝的单一亚基形成。在一些实施方案中，所用纳米结构通过多拷贝的多个不同亚基形成。

纳米结构通常是球形，和/或具有旋转对称性(如具有3倍和5倍轴)，例如有本文所示例的二十面体结构。

在一些实施方案中，所述抗原在自组装纳米颗粒上呈递，如衍生自铁蛋白(FR)、E2p、Qβ和I3-01的自组装纳米颗粒。E2p是二氢硫辛酸转乙酰基酶的重新设计变体，来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。I3-01是可自组装成超稳定纳米颗粒的工程蛋白。这些蛋白的亚基序列是本领域已知的。在第一方面，本文公开的是包含氨基酸序列的纳米结构相关多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:66-105的纳米结构相关多肽的氨基酸序列在其长度上具有至少75％相同性，且至少在一个经鉴定的界面位置相同。纳米结构相关多肽能用于例如制备纳米结构。为了其成对自组装形成纳米结构，如二十面体纳米结构的能力，设计纳米结构相关多肽。

在一些实施方案中，所述纳米结构包括(a)多重第一组装，各第一组装包含多个相同的第一纳米结构相关多肽，其中第一纳米结构相关多肽包含选自SEQ ID NO:66-105的纳米结构相关多肽的氨基酸序列；和(b)多重第二组装，各第二组装包含多个相同的第二纳米结构相关多肽，其中第二纳米结构相关多肽包含选自SEQ ID NO:66-105的纳米结构相关多肽的氨基酸序列，且其中第二纳米结构相关多肽不同于第一纳米结构相关多肽；其中多重第一组装与多重第二组装非共价相互作用以形成纳米结构。

纳米结构包括对称重复、非天然、非共价多肽-多肽界面，其使第一组装和第二组装定向进入纳米结构，如二十面体纳米结构。

SEQ ID NO:66-105提供示范性纳米结构相关多肽的氨基酸序列。示范性纳米结构相关多肽SEQ ID NO:66-105的界面残基数目范围是4-13个残基。在各种实施方案中，所述纳米结构相关多肽包括氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:66-105的纳米结构相关多肽的氨基酸序列在其长度上具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性，且至少在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个经鉴定的界面位置相同(取决于用于给定纳米结构相关多肽的界面残基数目)。在其他实施方案中，所述纳米结构相关多肽包含氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:66-105的纳米结构相关多肽的氨基酸序列在其长度上具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性，且至少在20％、25％、33％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或100％的经鉴定的界面位置相同。在其他实施方案中，所述纳米结构相关多肽包括具有选自SEQ ID NO:66-105的纳米结构相关多肽的氨基酸序列的纳米结构相关多肽。

在一个非限制性实施方案中，所述纳米结构相关多肽能修饰成促进共价连接感兴趣的“货物”。在一个非限制性实施方案中，所述纳米结构相关多肽可以是经修饰的，如通过在规定位置引入多个半胱氨酸残基以促进连接一个或多个感兴趣抗原，从而纳米结构相关多肽的纳米结构会提供支架，以提供作为疫苗递送的大量抗原，从而产生改善的免疫应答。

在一些实施方案中，存在于纳米结构相关多肽但不意在用于缀合的一些或所有天然半胱氨酸残基可突变成其他氨基酸以促进在规定位置的缀合。在另一非限制性实施方案中，所述纳米结构相关多肽可通过连接(共价或非共价)有助于促进“内体逃逸”的部分来修饰。对于涉及递送感兴趣的分子到靶细胞的用途如靶向递送，关键步骤可以是从内体——一种膜结合细胞器——逃逸，所述内体是递送介质进入细胞的入口点。内体成熟成为溶酶体，溶酶体降解其内容物。因此，如果递送介质未以某种方式在其成为溶酶体前从内含体“逃逸”，其会降解而不行使其功能。有多种破坏内体并允许逃入胞质的脂质或有机聚合物。因此，在此实施方案中，所述纳米结构相关多肽可以是经修饰的，例如通过引入半胱氨酸残基，其允许这种脂质或有机聚合物化学缀合单体或所得的组装表面。在另一非限制性示例中，纳米结构相关多肽可以是经修饰的，例如通过引入半胱氨酸残基，其允许荧光团或其他成像剂化学缀合，允许纳米结构体外或体内可视化。

可以突变纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基以提高蛋白亚基或组装的纳米结构的稳定性或溶解度。如本领域技术人员已知的，如果纳米结构相关多肽与现有蛋白家族有显著序列同源性，则多序列比对来自该家族的其他蛋白能用于引导非保守位置处的氨基酸突变选择，这能增加蛋白稳定性和/或溶解度，此过程称为共有蛋白设计(9)。

纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基能突变成带正电(Arg、Lys)或带负电(Asp、Glu)氨基酸，以赋予蛋白表面总体正或总体负电荷。在一个非限制性实施方案中，所述纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基能突变成向自组装纳米结构内表面赋予高净电荷。这种纳米结构随后能用于包装或包封带相反净电荷的货物分子，这归因于纳米结构内部表面与货物分子之间的静电相互作用。在一个非限制性实施方案中，所述纳米结构相关多肽上的表面氨基酸残基能主要突变成精氨酸或赖氨酸残基以向自组装纳米结构内表面赋予净正电荷。含有纳米结构相关多肽的溶液随后能在核酸货物分子如dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA、cDNA、miRNA.、siRNA、shRNA、piRNA或其他核酸存在下混合，以在自组装纳米结构内封装核酸。这种纳米结构能用于例如保护、递送或浓缩核酸。

在一个实施方案中，所述纳米结构具有二十面体对称性。在此实施方案中，所述纳米结构可包含60拷贝的第一纳米结构相关多肽和60拷贝的第二纳米结构相关多肽。在一个这样的实施方案中，所述各第一组装中相同第一纳米结构相关多肽的数目不同于各第二组装中相同第二纳米结构相关多肽的数目。例如，在一个实施方案中，所述纳米结构包含12个第一组装和20个第二组装；在此实施方案中，所述各第一组装可例如包含5拷贝的相同第一纳米结构相关多肽，且各第二组装可例如包含3拷贝的相同第二纳米结构相关多肽。在另一实施方案中，所述纳米结构包含12个第一组装和30个第二组装；在此实施方案中，所述各第一组装可例如包含5拷贝的相同第一纳米结构相关多肽，且各第二组装可例如包含2拷贝的相同第二纳米结构相关多肽。在另一实施方案中，所述纳米结构包含20个第一组装和30个第二组装；在此实施方案中，所述各第一组装可例如包含3拷贝的相同第一纳米结构相关多肽，且各第二组装可例如包含2拷贝的相同第二纳米结构相关多肽。所有这些实施方案能够形成有正二十面体对称性的合成纳米材料。

实施例

为了更好理解本公开，列出以下实施例。这些实施例仅用于说明目的且不视作以任何方式限制本公开的范围。

实施例1：抗原设计

FimH_LD或FimH-DSG中的突变设计成将FimH凝集素结构域锁定于开放构象，旨在提高功能性免疫原性。突变是不同种类的，描述于下表2-9。各种突变的FimH多肽的氨基酸序列如表1所示。

表2:野生型FimH_LD构建体，包括引入UTI临床分离株中天然存在的氨基酸取代

SEQ ID NO:	蛋白ID	取代
			1	FimHLD_WT	WT
	FimHLD_V27A	V27A

表3:FimH_LD配体结合位点中的取代

表4:FimH_LD中的甘氨酸开关突变

SEQ ID NO:	蛋白ID	取代
			10	FimHLD_G15A	G15A
11	FimHLD_G15P	G15P
			12	FimHLD_G16A	G16A
13	FimHLD_G16P	G16P
			14	FimHLD_G15A_G16A	G15A G16A
15	FimHLD_R60P	R60P
			16	FimHLD_G65A	G65A

表5:FimH_LD中用于二硫键稳定化的半胱氨酸对

表6:FimH_LD中的非极性到极性的突变

SEQ ID NO:	蛋白ID	取代
			40	FimHLD_L34N_V27A	V27A L34N
41	FimHLD_L34S_V27A	V27A L34S
			42	FimHLD_L34T_V27A	V27A L34T
43	FimHLD_A119N_V27A	V27A A119N
			44	FimHLD_A119S_V27A	V27A A119S
45	FimHLD_A119T_V27A	V27A A119T
				FimHLD_L34D_V27A	V27AL34D
	FimHLD_L34E_V27A	V27AL34E
				FimHLD_L34K_V27A	V27AL34K
	FimHLD_L34R_V27A	V27A L34R
				FimHLD_A119D_V27A	V27AA119D
	FimHLD_A119E_V27A	V27AA119E
				FimHLD_A119K_V27A	V27AA119K
	FimHLD_A119R_V27A	V27AA119R

表7:FimH-DSG的菌毛蛋白-凝集素界面处的腔填充突变

SEQ ID NO:	蛋白ID	取代
			46	FimH-DSG_A115V	A115V
47	FimH-DSG_V163I	V163I
			48	FimH-DSG_V185I	V185I
49	FimH-DSG_DSG_V3I	DSG V3I

表8:FimH_LD中的代表性突变的组合

表9:FimH-DSG中的代表性突变的组合

实施例2：抗原表达和纯化

如前所述，将编码FimH_LD和FimH-DSG突变体的DNA克隆入含有小鼠IgK信号肽的pcDNA3.1并在Expi293^TM细胞中表达(PCT Intl.公开号WO2021/084429，2021年5月6日公开)。为了蛋白鉴定和免疫原性研究，用镍亲和树脂和尺寸排阻层析分离蛋白，如PCT Intl.公开号WO2021/084429,2021年5月6日公开所述。

实施例3：荧光偏振测定

为测定FimH突变体对甘露糖苷配体的解离常数，基于Rabbani等.(J.Biol.Chem.293:1835-1849(2018))所述的方法开发了荧光偏振测定，使用缀合对FimH有高亲和性的甘露糖苷配体的荧光素。在黑色平底96孔聚丙烯板(葛莱娜(Greiner))中以11点三倍滴定，在20mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.05mg/mL加BSA 0.05％中稀释FimH蛋白，终体积是50μL。向各孔加入相同缓冲液中的50μL的0.7nM荧光素辛基联苯甘露吡喃糖苷配体。平板室温100rpm振荡孵育过夜。20-24小时后，平板在ClarioStar Plus酶标仪中读取，荧光素在488nm激发且在530nm发射。

实施例4：热稳定性测定(ThermoFluor试验)

开发使用SYPRO橙的384孔热稳定性测定以确定采用APO(未结合)形式且存在配体时分离蛋白的熔解温度。甘露糖苷化合物(甲基α-D-甘露吡喃糖苷(西格玛(Sigma)M6882)，模拟FimH的天然配体(甘露糖))用于分析蛋白结合。FimH蛋白储液如下制备：蛋白在40mMTris pH 8、400mM NaCl(测试缓冲液)中稀释到4μM；SYPRO橙染料(英杰公司(Invitrogen)S6650)在测试缓冲液中1:10稀释。对于10μL终反应体积，4μM FimH突变体(5μL)与1:10SYPRO橙染料(0.1μL)以及测试缓冲液或稀释于测试缓冲液的配体(5μL)在MicroAmpEnduraPlate光学384孔板(应用生物系统公司(Applied Biosystems)4483285)中混合。平板在QuantStudio 5实时PCR系统(赛默飞世尔科技(ThermoFisher))中接受熔解曲线分析，使用20℃-98℃，0.05℃/秒的解离操作。TAMRA被指定为靶标和报告基因，ROX作为参比荧光(然而，不用于任何分析)。数据作图为Maxwell–Boltzmann分布，X轴是温度(从20℃到98℃)且Y轴记录了来自TAMRA通道的荧光(熔解曲线中读取的各温度点被赋予特定荧光激发值以用于TAMRA报告基因)。确立了校准算法以均衡孔与样品之间的荧光强度，从而能板对板比较Y轴荧光，刻度从0(无荧光)到1(最高记录的荧光)。此公式如下所示。使用Microsoft Excel的搜索功能(也如下)，记录0.5的相对荧光(校准后)(指示约一半蛋白解离)，与特定温度相关联。因而计算此温度，即获取的蛋白熔解温度(T_m)。熔解温度变化(ΔT_m)如下计算：从apo条件中减去蛋白+配体的T_m。Microsoft Excel中的数据透视表用于从板布局整理T_m。

校准TAMRA 荧光信号的公式:

Excel搜索功能以鉴定T_m(0.5经校准的荧光，或50％蛋白熔解)：

＝LOOKUP(0.5，经校准的荧光值开始:值结束，$温度值开始:$值结束)

实施例5：用FimH特异性中和单克隆抗体确认FimH突变体的构象状态

中和单克隆抗体299-3、304-1和440-2(内部开发)用于确认FimH突变体的构象状态；229-3和304-1结合与MAb 475及926(Kisiela,D.I.等.Proc Natl Acad Sci U S A110,19089-19094(2013))相似的表位，而440-2识别不同表位且似乎优选结合开放构象态的FimH_LD。维持与野生型相似结构完整性的变体预期结合所有抗体。来自ForteBio的OctetHTX用于所有动力学实时生物分子相互作用实验以测量抗体与各突变体的反应性。实验在含有每孔240μL的96孔黑色板中于30℃，1000rpm搅拌下完成。Ni-NTA生物传感器在含有1xPBS缓冲液的缓冲液中平衡，所述1x PBS缓冲液含有0.5％ BSA和0.05％Tween 20(PBT)，然后允许其以加载5μg/mL带His标签FimH突变体蛋白5分钟。加载FimH的生物传感器能够在PBT中重建基线3分钟，然后允许其以5μg/mL与来自不同箱的抗体结合5分钟。Octet数据分析软件用于结合步骤的动力学分析并获得以nm变化计的反应(制表)。

实施例6：圆二色谱学

就FimH_LD和FimH-DSG突变体记录远UV(320-250nm)及近UV(260-200nm)圆二色谱，使用装有JASCO PTC-424S/15(日本分光(Jasco))温度控制的JASCO J-810Spectropolaromiter(日本分光)和Isotemp水浴(飞世尔科技(Fisher Scientific))单元。对于远UV，使用1mm格(cell)，对于近UV，使用10mm格。蛋白在PBS中稀释到0.3mg且光谱在20℃记录，使用1mm(远UV)或10mm(近UV)光程长度的格。扫描以100nm/min进行，DIT设为1s，带宽为3s，数据节距为0.1nm。灵敏度设为标准。积累了10个光谱，分别就近UV取平均且5个用于远UV测量。光谱相对于背景手工校准，使用来自空白PBS运行的CD谱，并用EQ.1转变成平均残基椭圆率。θMRE是计算的平均残基椭圆率时，θEXP是实验测量的CD信号，MW是蛋白分子量，N是氨基酸残基数，C是以mg/mL计的蛋白浓度，l是以cm计的光程程度。

EQ.1

θ_MRE＝(θ_EXP·MW)/(10·N·C·l)

实施例7：动物免疫原性研究EC-1678

6-8周龄CD-1小鼠获自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)。对于各组，20只动物在0、4和8周皮下免疫，使用混合20μg皂树-21(QS-21)的10μg FimH蛋白，所述QS-21来自含有5mM琥珀酸盐、60mM NaCl、0.1％ PS80、pH 5.6的5.1mg/mL QS-21储液。

实施例8：FimH全细胞中和测定

为评估来自免疫接种的动物的血清在抑制有毛缘的大肠杆菌结合甘露糖化底物的能力，如PCT Intl.公开号WO2021/084429,2021年5月6日公开所述，采用使用酵母甘露聚糖的全细胞中和测定。

实施例9：从CHO细胞纯化FimH-DSG WT和FimH-DSG G15A G16A V27A突变体

蛋白表达于CHO细胞，表达为带C末端His标签的分泌蛋白。收获细胞培养物上清，加入1M Tris pH 7.4和5M NaCl分别至终浓度20mM及150mM终浓度。5kDa TFF盒缓冲液在有500mM NaCl和40mM咪唑的20mM Tris pH 7.5中冲洗并平衡。上清浓缩2倍并针对6体积的20mM Tris pH 7.5 500mM NaCl 40mM咪唑透析过滤。收集保留物，用50-100mL的20mM TrispH 7.5 500mM NaCl 40mM咪唑冲洗。过滤保留物，用0.2μm瓶嘴式滤器冲洗。把Ni-Sepharose 6快速流动树脂(格来赛生命科技公司(Cytiva Life Sciences))装进XK26/20柱且用5柱体积的20mM Tris pH 7.5 500mM NaCl 40mM咪唑平衡。保留物以一半流速施加，并洗涤直至达到稳定基线(约55柱体积)。结合的蛋白用20mM Tris,500mM NaCl,500mM咪唑,pH 7.5洗脱。合并含感兴趣的蛋白的级分，并在2kDa透析盒中针对20mM醋酸钠，pH 4.3在4℃透析，采用2个缓冲液变化。蛋白施加于SP-Sepharose阳离子交换柱(格来赛生命科技公司)，所述柱已用相同缓冲液平衡。结合阳离子交换柱的材料用NaCl线性梯度洗脱，使用20mM醋酸钠，pH 4.3,1M NaCl缓冲液。收集各级分，针对TBS,pH 7.4透析。

实施例10：FimH-DSG WT和FimH-DSG G15AG16AV27A的分析尺寸排阻色谱(SEC)

分析SEC用Waters X桥蛋白BEH SEC2.5μm，4.6x 300mm柱在含有10mM EDTA的TBS,pH 7.4中在25℃实施。注射体积是10μL且流速是0.5mL/min。

实施例11：通过使用脉冲安培检测的高pH阴离子交换层析(HPAEC-PAD)分析单糖

FimH-DSG野生型和FimH-DSG三重突变体(G15A、G16A、V27A)的水性样品在2N三氟乙酸中120℃消化2小时。在此之后，样品在真空下45℃蒸发至干，持续6小时。样品用Milli-Q H₂O重建，通过HPAEC-PAD在DIONEX ICS 3000离子层析系统上评估。使用有等度洗脱的DionexCarboPac PA1柱(4x 250mm)，采用H₂O和200mM NaOH的混合物。单糖组合物如下确认：将FimH样品中检测的峰保留时间与具有已知单糖标准的溶液比较。

实施例12：检测结合FimH-DSG WT和FimH-DSG G15A G16AV27突变体的O抗原糖部分

来自ForteBio的Octet HTX用于所有动力学实时生物分子相互作用实验以检测可能的O抗原与FimH-DSG WT和FimH-DSG G15A G16A V27A突变体相互作用。实验在含每孔240μl的96孔黑色板中于30℃,1000rpm搅拌下完成。Ni-NTA传感器在缓冲液中平衡，所述缓冲液包括含0.5％ BSA和0.05％ Tween 20(PBT)的1x PBS缓冲液，然后允许其以5μg/mL加载带His标签FimH-DSG WT或FimH-DSG G15AG16AV27A突变体5分钟。加载FimH-DSG WT或FimH-DSG G15A G16A V27A的生物传感器能够在PBT中重建基线3分钟，然后允许其加载2倍滴定(200–3.125μg/ml)的O抗原多糖CRM缀合物，O9或O25b或O1a或O2。加载抗原而没有任何多糖的传感器用作参考。加载FimH和O抗原滴定的传感器浸入PBT持续3分钟以建立新基线。检测结合突变体的O抗原，在有5μg/mL O抗原特异性mAb的结合步骤中测试5分钟(MAb 601用于O9，MAb ECO-80-11用于O25b，MAb ECO-48-2用于O1a且MAb ECO-172-13用于O2)。Octet数据分析软件用于结合步骤的动力学分析并获得以nm变化计的反应(制表)。

实施例13：蛋白表达和纯化

FimH_LD和FimH-DSG突变体在Expi293细胞中表达，通过镍亲和捕捉然后尺寸排阻层析从上清中分离。应注意一些突变体具有弱表达水平且未进展到生物化学或生物物理评估(如FimH_LD P26C V35C、N33C P157C、N33C L109C、V35C L107C、V35C L109C、S113C T158C)。能获得充足产量的突变体在热稳定性和配体结合试验中评估。

实施例14：鉴定在甘露糖苷存在下热稳定性提高且熔解温度变化减少的FimH_LD和FimH-DSG突变体

FimH突变体蛋白的熔解温度用SYPRO橙基于热移位的差示扫描荧光测定法确定，其中T_m指定50％蛋白未折叠的温度。非共价配体通常在特异性结合后使蛋白靶稳定，引起蛋白熔解温度增加。熔解温度因而在甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下测定，甲基α-D-甘露吡喃糖苷是α-D-甘露糖的衍生物且对FimH有微摩尔级亲和性(Bouckaert,J.等.MolMicrobiol.55,441-455(2005))，并计算配体存在下相对于apo形式的蛋白熔解温度差异(ΔT_m)。

野生型(WT)FimH-DSG蛋白表现出相较于FimH_LD WT显著更高的熔解温度且在配体存在下具有更低的ΔT_m(表10、表11)。FimH-DSG WT具有71.66℃的熔解温度，而FimH_LD WT的熔解温度显著更低(61.54℃)。在甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下，FimH_LD WT的熔解温度变化10.99℃，而FimH-DSG的温度在配体存在下仅变化2.13℃。这表明相较于FimH-DSG，FimH_LD受到配体更有效地稳定化，这可能反映FimH-DSG的配体结合下降。

突变影响apo状态和配体存在下FimH蛋白的熔解温度。前述FimH_LD锁突变体V27CL34C(Kisiela,D.I.等.Proc Natl Acad Sci U S A 110,19089-19094(2013)；Rodriguez,V.B.等.J Biol Chem 288,24128-24139(2013))相较于野生型FimH_LD(61.54℃)显示更低的熔解温度(51.42℃)，这与公开的数据一致(Kisiela,D.I.等.Proc Natl Acad Sci U S A110,19089-19094(2013)；Rodriguez,V.B.等.J Biol Chem 288,24128-24139(2013))。FimH_LD V27C L34C与甲基α-D-甘露吡喃糖苷一起孵育，使得熔解温度相较于apo形式增加7.27℃，表明此突变体部分由配体稳定化且可具有残留的配体结合效率。在FimH-DSG背景下，V27C L34C突变体相较于WT(T_m＝63.29℃)较不耐热，V27C L34C中配体存在下的温度变化相较于WT(ΔT_m＝1.29℃)略有下降。6个Phe1 FimH_LD突变体中的5个相较于WT FimH_LD具有降低的熔解温度，除了F1L有类似熔解温度。在配体存在下，6个FimH_LD Phe1突变体中的4个显示小ΔTm，表明配体的稳定化作用弱。相反，最保守的氨基酸取代F1W和F1Y相较于Phe1野生型FimH_LD分别显示中等和相当的ΔTm值。关于总体热稳定性，R60P参考突变(如前所述-Rabbani等.J.Biol.Chem.293:1835-1849(2018)；Rodriguez,V.B.et al.J Biol Chem288,24128-24139(2013))和数个内部设计的新突变相对于V27C L34C具有显著增加的熔解温度。有趣的是，FimH_LD V28C N33C(2个位点都离参照FimH_LD V27C L34C移动仅1个残基)在任何FimH_LD突变体具有最高熔解温度(T_m＝65.77℃)且在甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下具有2.81℃的ΔT_m，表明对配体的亲和性下降。FimH_LD中的甘氨酸环区突变(G15A,G16A)相对于V27CL34C显著提高热稳定性，在配体存在下观察到极小的熔解温度变化。甘氨酸环突变也略提高FimH-DSG的热稳定性且用配体没有观察到温度变化，共同表明FimH_LD和FimH-DSG突变体被配体稳定化并因而相对于野生型可具有降低的结合效率。

FimH_LD WT的序列衍生自大肠杆菌UTI分离株J96(Hull,R.A.等,Infect Immun 33,933-938(1981))。V27A是与强毒性UTI分离株和克罗恩氏病相关分离株关联的天然变体(Schwartz,D.J.等,Proc Natl Acad Sci USA 110,15530-15537(2013)；Cespedes等,Front Microbiol 8:639(2017))。将V27A并入FimH_LD略微降低了FimH_LD WT的熔解温度，在甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下观察到V27A相较于WT的变化更小。另一方面，V27A似乎在FimH_LD中甘氨酸环突变体G15A、G16A、G15P、G16P背景下具有稳定化作用，其与没有时候相比，有V27A的熔解温度都更高，且与没有此突变时多至6.05℃(G16P)相比，在V27A存在下具有<2℃的ΔTm。另外，含有V27A的FimH-DSG突变体的热稳定性略微增加，且在配体存在下没有检测到温度变化。这共同表明V27A对FimH的熔解温度产生稳定化作用并降低配体结合效率。

数个FimH_LD二硫化物和非极性到极性残基突变体以低水平表达，并且在甘露糖苷化合物存在下热稳定性弱或表现出显著温度变化，表明其保留配体结合效率(表12)。这些在单一重复中测试并从进一步分析中排除。类似地，分析数个其他FimH-DSG突变体的热稳定性，其中2个的热稳定性提高且用配体的变化减少(FimH-DSG V27A Q133K和FimH-DSGG15A G16AV27AQ133K)(表13)。Q133K突变是消除配体结合的FimH的结合袋中的突变，如前所述(Schwartz等,Proc Natl Acad Sci USA 110:15530-15537(2013))。这些突变体未进一步分析。

表10:apo状态和甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下FimH_LD突变体的熔解温度

表11:apo状态和甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下FimH-DSG突变体的熔解温度

表12:apo状态和甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下的FimH_LD突变体的熔解温度，单一重复

FimH变体	T_m/℃	ΔT_m/℃
			FimH_LDP26C V156C	58.86	5.42
FimH_LDQ32C Y108C	61.09	9.77
			FimH_LDP26C V154C	62.51	4.65
FimH_LDV28C P157C	59.61	7.16
			FimH_LDS62C T86C	58.28	11.71
FimH_LDS62C L129C	57.12	12.77
			FimH_LDY64C A127C	60.22	12.87
FimH_LDV112C T158C	59.64	15.2
			FimH_LDV118C V156C	56.7	12.89
FimH_LDP12C A18C	54.47	5.23
			FimH_LDG14C F144C	49.24	-0.1
FimH_LDL68C F71C	49.92	12.2
			FimH_LDS113C G116C	59.8	9.29
FimH_LDA119C V155C	59.12	14.52
			FimH_LDL34S V27A	48.86	12.78
FimH_LDL34T V27A	53.22	10.46
			FimH_LDL34N V27A	47.31	13.07
FimH_LDA119S V27A	59.8	8.52
			FimH_LDA119T V27A	59.51	9.19
FimH_LDA119N V27A	57.87	7.55
			FimH_LDV27A G65A	59.8	10.85

表13:apo状态和甲基α-D-甘露吡喃糖苷存在下FimH-DSG突变体的熔解温度，有限重复

实施例15：鉴定对甘露糖苷配体亲和性降低的FimH突变体

FimH突变体对甘露糖苷配体的解离常数(K_d)用直接结合荧光偏振测定检测，采用缀合荧光素的辛基联苯甘露吡喃糖苷(BPMP)配体。FimH_LD突变体相对于WT的K_d值如表14所示。FimH_LD WT和V27A对BPMP显示相似的高亲和性。参考锁突变体FimH_LD V27C L34C(Kisiela,D.I.等,Proc Natl Acad Sci USA 110,19089-19094(2013)；Rodriguez,V.V.等,J Biol Chem 288:24128-24139(2013))对配体的亲和性相较于FimH_LD WT降低91倍，而FimH_LD R60P V27A(Rabbani等,J Biol Chem 293:1835-1849(2018))的亲和性降低179倍。本文公开的突变体与参考锁突变体作比较。甘氨酸环突变体FimH_LD G15A V27A、G15P V27A、G16P V27A和G16A G16A V27A没有检测到结合，而G16A V27A的K_d相对于WT增加156倍。甘氨酸环突变与V27A的组合表现出比单独甘氨酸环突变体显著更高的K_d，表明V27A具有不确定的稳定作用，尽管其对FimH_LD WT的K_d的影响很小。并入V27A还进一步减少FimH_LD R60P的结合亲和性。

3个新的二硫化物锁突变体在此试验中测试，其在配体亲和性方面相对于FimH_LDWT都有中等的下降(亲和性降低33-43倍)。含有非极性到极性突变(A119T V27A、A119NV27A、L34T V27A、L34N V27A)的FimH_LD突变体对BPMP有高亲和性，与FimH_LD WT类似。FimH_LD F1突变体表现出弱结合，除了F1Y，其与FimH_LD WT的结合亲和性相似。

FimH-DSG构建体的配体结合亲和性如表15所示。FimH-DSG WT的K_d比FimH_LD WT高100倍，可能反映了2种FimH形式的不同构象状态。FimH-DSG V27A还具有相对于FimH-DSGWT的较低亲和性。这与前面的数据一致，显示带A27的全长FimH与FimC和FimG的复合体对甘露糖苷的结合亲和性相较于FimH V27下降(Schwartz等,Proc Natl Acad Sci USA 110:15530-15537(2013))。向FimH-DSG引入锁突变V27C L34C使得对BPMP的亲和性降低2.5倍，而甘氨酸环突变体FimH-DSG G15A G16AV27A的亲和性相对于FimH-DSG WT降低28倍。无法就FimH-DSG G15A V27A和FimH-DSG G16A V27A计算K_d，表明这些突变体不能结合BPMP。突变设计成通过改变菌毛蛋白-凝集素结构域界面(A115I、V185I)来稳定开放构象的FimH-DSG，所述突变使得结合亲和性相对于FimH-DSG WT提高，如热稳定性数据所示(实施例14)。

总之，鉴定了FimH_LD或FimH-DSG蛋白中的甘氨酸环突变，其对BPMP的结合亲和性极低。基于这些和热稳定性数据，选定甘氨酸突变体用于小鼠中的功能性免疫原性研究。

表14:FimH_LD突变体对辛基联苯甘露吡喃糖苷配体的结合K_d

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表15:FimH-DSG突变体对辛基联苯甘露吡喃糖苷配体的结合K_d

实施例16：通过圆二色谱学确认FimH突变体的构象状态

显示热稳定性提高和对甘露糖苷配体结合亲和性下降的FimH_LD及FimH-DSG突变体(实施例14和15)通过圆二色谱学(CD)进行二级和三级结构分析。野生型和构象锁定的FimH_LD突变体具有不同的三级CD谱(Rabbani等,J Biol Chem 293:1835-1849(2018))。选定FimH_LD和FimH-DSG野生型及突变体蛋白的二级和三级结构通过远UV CD(二级结构)和近UVCD(三级结构)检测(参见图1)。FimH_LD的远UV CD谱与先前公开的数据(Rabbani等.J BiolChem 293:1835-1849(2018))一致且FimH_LD和FimH-DSG的远UV谱是有高β折叠含量的蛋白特征。FimH_LD V27C L34C相较于野生型FimH_LD具有略微不同的远UV谱，如其他人所观察到的(Rabbani等.J Biol Chem 293:1835-1849(2018))，反映出开放构象状态。天然存在的FimH_LD V27A突变体的二级结构谱也有些变化。总之，FimH_LD或FimH-DSG突变体的二级结构与野生型蛋白非常相似(图1)，表明这些突变体中的总体二级结构未改变。FimH_LD突变体的三级结构谱与FimH_LD V27 L34C和V27AR60P的内部及公开的CD色谱极为相似，其稳定化于开放构象状态(Rabbani等.J Biol Chem 293:1835-1849(2018))。本文所述突变体的谱相较于野生型FimH_LD或FimH_LD V27A略有不同。这些数据一起表明引入的突变使得FimH_LD构象转向开放构象，而FimH-DSG三级结构在引入本文所评估构象稳定突变后没有大幅变化。

实施例17：用中和单克隆抗体鉴定FimH突变体

数个选定的FimH抗原的构象通过生物层干涉试验表征，使用凝集素结构域特异性单克隆抗体299-3、304-1和440-2。竞争实验(未显示)证明抗体229-3和304-1结合的配体结合位点表位与MAb 475和926相似(Kisiela等,Proc Natl Acad Sci USA 110:19089-19094(2013))。单克隆抗体440-2结合不同表位且似乎优选结合开放构象的FimH_LD。抗体229-3和304-1能够识别所有FimH_LD(表16)和FimH-DSG(表17)变体，尽管对FimH_LD V27A的结合降低。相反，在所有FimH_LD或FimH-DSG突变体中，对抗体440-2的反应相较于WT或V27A更高。这与图1所示CD色谱的谱一致，表明FimH_LD突变体处于开放构象。用440-2的反应在FimH-DSG WT中也增加，这与FimH-DSG突变体和WT(实施例16)的重叠CD色谱的谱联合表明此蛋白处于开放构象，无论是否存在稳定化突变。

表16:FimH_LD变体的MAb结合

表17:FimH-DSG变体的MAb结合

实施例18：FimH突变体中和数据

为评估选定的突变体的相对免疫原性，用FimH突变体免疫接种小鼠。FimH突变体引发功能性抗体滴度的效力用上面和先前所述的全细胞酵母甘露糖中和试验(PCT Intl.公开号WO2021/084429,2021年5月6日公开)定量。简言之，有毛缘的大肠杆菌与血清一起孵育且允许结合酵母甘露糖包被的微量滴定板。洗涤平板且用发光探针检测结合平板的活大肠杆菌数目。从来自接种疫苗的小鼠的血清的8点2倍稀释系列测定抑制有毛缘的大肠杆菌结合酵母甘露糖的血清中和滴度。滴度代表50％细菌仍结合平板的血清稀释倒数。平均滴度和反应的概括如表18所示。在剂量2和3后各个小鼠IC₅₀反应的图如图2和图3所示。

表18:VAC-2020-PRL-EC-1678FimH_LD和FimH-DSG突变体酵母甘露糖结合中和试验应答者比率和GMT

先前的工作(PCT Intl.公开号WO2021/084429,6,2021年5月6日公开)显示前述二硫化物锁突变体FimH_LD V27C L34C(Kisiela等,Proc Natl Acad Sci USA 110:19089-19094(2013))相对于FimH_LD WT不提高功能性免疫原性。新型FimH_LD突变体和另一前述构象限制突变体FimH_LD V27AR60P(Rabbani等,J Biol Chem 293:1835-1849(2018))的功能性免疫原性在图2中直接对比。突变体FimH_LDG16A V27A、FimH_LDG15AG16AV27A和FimH_LDV27A R60P相较于FimH_LD WT产生更高数目的应答者和更高滴度(p值<0.05)。其他突变(G15AV27A、G16PV27A、V28C N33C)不显著增强功能性免疫原性，尽管就确实应答的小鼠观察到高滴度，这些组中的应答者数目与FimH_LD WT组类似。因此，数个突变体设计成通过将FimH_LD锁于开放构象来增强FimH_LD的功能性免疫原性，所述突变体相对于FimH_LD WT改善功能性免疫原性。用2剂FimH_LD和FimH-DSG突变体免疫接种后，相较于FimH_LD，接种FimH-DSG的组中显著更多的动物产生中和滴度(图3)。此趋势在剂量3后维持，其中接种FimH-DSG V27A、FimH-DSGG15AV27A和FimH-DSG G15A G16A V27A的组中95％-100％小鼠应答。接种FimH-DSG突变体的所有组中的IC₅₀几何平均滴度(GMT)在剂量3后也显著更高。类似FimH-DSG突变体(V27A、G15AV27A、G15AG16A V27A)相对于FimH_LD突变体产生更高的GMT(p值<0.05)。

实施例19：FimH-DSG G15A G16A V27A不结合宿主聚糖且能分离至均一

FimH-DSG WT和FimH-DSG G15A G16A V27A突变体蛋白在CHO细胞中表达，表达为含有C末端His标签的分泌蛋白。纯化FimH-DSG的重组的His标签的形式如图4所示进行。

超滤和透析过滤后，含有FimH-DSG WT的无细胞培养基在镍亲和树脂上分离并接受阳离子交换层析。洗脱峰相当宽广且显示数个不同肩峰，表明FimH-DSG WT种类可能具有异质性(图5)。有趣的是，当洗脱的级分通过SDS-PAGE分析时，各级分中仅检测到对应FimH-DSG WT的单一带。

在纯化过程中，FimH-DSG显示的特性表明其具有弱溶解度。特定地，FimH-DSG WTNi-Sepharose洗脱液通过目测检查总是模糊不清。就SP-Sepharose后续纯化而言转向酸性pH(4.3)，引起蛋白溶液澄清。然而，在分离蛋白转移(透析)入TBS，pH 7.4后，再次观察到FimH-DSG WT制品的弱溶解度和聚集倾向。这导致聚集和沉积引起的蛋白逐步损失。通过离心去除沉淀物未终止或减慢聚集过程，即使该点的蛋白浓度通常降低至0.2-0.4mg/mL。聚集引起的蛋白损失在有10％甘油并入存储(TBS,pH 7.4)缓冲液时能得到控制。然而，存在甘油不会防止HMW可溶性聚集物形成，其通过在350nm监测光散射用分光光度法检测。

当相同过程用于分离FimH-DSG G15A G16A V27A突变体时，观察到数种差异。首先，这些包括在从Ni-Sepharose柱洗脱蛋白后没有任何模糊迹象。第二，从SP-Sepharose柱峰洗脱的分布不如用WT FimH-DSG观察到的宽，图6。最后，FimH-DSG G15A G16AV27A突变体在转入生理pH缓冲液(TBS pH 7.4)后保持完全溶解。浓度多至5–6mg/mL时，FimH-DSG G15AG16A V27A突变体不显示任何聚集或沉淀迹象。

分析分离的FimH-DSG WT和FimH-DSG G15AG16A V27A突变体进一步揭示这2种FimH-DSG变体之间的显著差异。分析型尺寸排阻层析(SEC)证明FimH-DSG G15AG16A V27A突变体作为单一峰洗脱，保留时间与其分子量一致。相反，野生型FimH-DSG的洗脱分布由数个峰构成，其中主峰保留时间小于图7所示突变体。这些数据清楚证明FimH-DSG WT形成可由SEC检测的高分子量复合体。存在由FimH-DSG WT形成的HMW复合体和聚集趋势可能与其N末端凝集素结合域的功能活性相关。我们假设在CHO发酵期间和分泌入培养基后，FimH-DSGWT结合释放自宿主CHO细胞表面的聚糖分子。由于聚糖的分枝性质，每个聚糖能容纳多于一个拷贝的FimH-DSG分子。通过增加FimH-DSG数目来连续“装饰”聚糖，会引起多个HMW复合体形成并最终导致溶解度损失和沉淀(参见图8)。为检验此假设，分离的野生型和突变体FimH-DSG(及FimH_LD)种类接受高pH阴离子交换层析，采用脉冲安培(电化学)检测(HPAEC-PAD)分析。此方法允许在蛋白样品中鉴定寡糖或聚糖以及提供关于这些寡糖组合物的信息。简言之，实施酸水解以释放单糖，然后相对于单糖标准品分析峰。HPAEC-PAD分析结果显示分离的FimH-DSG WT(糖基化)和FimH_LD(未糖基化，数据未显示)制品包含大量单糖。FimH-DSG WT和FimH-DSG G15A G16A V27A突变体中已鉴定的单糖的概括如表19所示。FimH-DSGG15A G16A V27A突变体中的单糖含量显著小于FimH-DSG WT。此外，完全有可能的是，检测到的低单糖含量代表预测修饰N235的N-聚糖中的糖部分。

表19:通过HPAEC-PAD在来自FimH-DSG WT的多个SP-Sepharose级分和FimH-DSGG15A G16A V27A突变体主峰中检测到的单糖的标准化的量(μg/mg蛋白)

实施例20：FimH_LD和FimH-DSG G15A G16A V27A突变体不结合大肠杆菌O抗原

大肠杆菌O抗原O8和O9的重复单元由聚甘露糖残基构成。这提出一个问题，即FimH是否可能在FimH-O抗原缀合物组合疫苗中结合O抗原缀合物。生物层干涉实验设计成检验FimH_LD WT是否能结合游离O9多糖或CRM缀合的O9多糖，以及结合试验中显示对甘露糖苷配体的亲和性无法测得的FimH_LD G15A G16A V27A突变体是否能够结合。O抗原结合数据如表20所示。在高浓度游离多糖情况下，用FimH_LD WT观察到反应。用CRM缀合的多糖观察到更高反应。然而，可检测结合在用突变体蛋白FimH_LD G15A G16A V27A时被消除。就FimH-DSG设置类似实验，其中测试FimH-DSG WT或FimH-DSG G15A G16A V27A突变体结合不同血清型(O9、O25b、O1a和O2)的游离或CRM缀合O抗原的能力(表21)。如从其甘露糖苷配体结合性质所预期，FimH-DSG WT的总体结合亲和性显著低于对应的FimH_LD变体。在最高浓度的CRM缀合物情况下，一些可滴定结合用FimH-DSG WT观察到，仅略高于就游离多糖所见的结合的背景水平。如用FimH_LD G15A G16A V27A突变体，FimH-DSG G15A G16A V27A蛋白不结合游离或CRM缀合的多糖的任一者。总之，不同于亲代WT FimH_LD或WT FimH-DSG抗原，衍生的G15A G16AV27A突变体没有结合O抗原，提供开发FimH与O抗原联合疫苗的潜在途径。

表20:FimH_LD G15A G16A V27A突变体不结合游离或CRM缀合的O抗原O9多糖

表21:FimH-DSG G15A G16A V27A突变体不结合游离或CRM缀合的O抗原多糖

实施例21：用有和没有O抗原的FimH-DSG G15A G16A V27A突变体免疫接种非人灵长类

A.方法

1.FimH IgG dLIA

大肠杆菌突变体菌毛抗原FimH-DSG G15AG16A V27A偶联光谱上不同的MagPlex-C微球(路明克斯(Luminex))，其在封闭缓冲液中室温稀释至50,000珠/mL浓度，持续1-2小时，同时震荡后立即进行试验初次孵育。向试验板加入稀释的微球混合物，所述板含有适当稀释的非人灵长类血清样品、对照和参考标准品即结合FimH-DSG菌毛蛋白结构域的人源化内部单克隆抗体(FimH Y202)，在振荡下2-8℃孵育过夜。洗去未结合组分后，向微球混合物加入纯化的R-藻红蛋白山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearchLabortories),109-116-170)，在振荡下室温孵育90分钟。通过Luminex FLEXMAP 3D读数仪测量的荧光PE信号幅度与结合蛋白偶联微球的抗FimH-DSGIgG量成正比。数据用自定义SAS应用分析，其使用标准曲线与插入抗原特异性抗体浓度(μg/mL)的log/log线性回归模型，所述浓度来自中位荧光强度。0.763μg/mL的定量下限(LLOQ)计算自标准曲线偏差。

2.4价O-Ag IgG dLIA

具有血清型O25b、O1a、O2和O6的大肠杆菌O抗原多糖共价缀合聚-L-赖氨酸，衍生的缀合物偶联光谱上不同的MagPlex-C微球(路明克斯)，采用标准EDC/NHS介导的偶联操作。微球与连续稀释的非人灵长类血清样品、对照和多克隆标准一起孵育，在振荡下2-8℃孵育过夜。洗涤后，在振荡下室温孵育90分钟，然后结合的血清型特异性IgG用PE缀合的山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(杰克逊免疫研究实验室,109-115-098)检测。荧光通过Luminex 200读数仪就4个光谱上不同区域各自测量并表示为中位荧光强度。多克隆标准滴定的标准曲线图产生任意配置的线性斜率分布，从中信号能内推(interpolated)为血清型特异性抗体水平(U/mL)。

3.非人灵长类(NHP)

雌性猕猴(Cynomolgus Macaques)(食蟹猴(Macaca fasicularis))源自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(德克萨斯州休斯顿)，然后转至辉瑞(Pfizer),纽约州珍珠河(年龄范围:4-5岁，重量范围:3.1-5.9kg)。NHP住在标准四边笼内，自由提供水和食物。动物皮下植入微型芯片以监测内部温度。在阴性尿液qPCR结果(参见下面方法章节10)的基础上，仅没有大肠杆菌感染的NHP入选。

4.疫苗接种和血液收集

猕猴在第0、4和14周肌肉内免疫(0.55mL)，用载剂对照(PBS,pH6.2)即单体菌毛抗原FimH-DSG G15A G16A V27A (50μg/剂)或4价O25b、O1a、O2和O6 O抗原多糖缀合物(1μg/剂)联合单体菌毛抗原FimH-DSG G15A G16A V27A(50μg/剂)的混合物。疫苗抗原用AS01b(每剂量50μg MPL和50μg QS-21)作为佐剂。

在第0、6和16周，10mL血液经股静脉收集进入1个血清分离管(BD真空采血管)，使用21g安全针/真空采血管。收集管置于室温30分钟并在3000g离心10分钟。收集上清中的血清，等分并保存于-80℃。

5.大肠杆菌临床分离株

一个代表性ST131 O25b临床分离株基于患者年龄和样品收集来源(PFEEC0578,男性,38岁,膀胱来源)选择，所述样品来自UPEC菌株，收集作为辉瑞赞助的抗菌测试领导和监督(ATLAS)数据库一部分，所述数据库由国际健康管理协会(IHMA)临床实验室维护。菌株携带编码未知类型的荚膜多糖产生的基因。

6.UPEC菌株储液制品

大肠杆菌储液如下准备：接种12mL LB肉汤(天惠华(Teknova),#L8198)，然后在275rpm搅拌下37℃孵育过夜。18小时后，12mL培养物稀释入250mL烧瓶(康宁(Corning),#431407)中的113mL LB肉汤。培养物在～275rpm于37℃孵育2-3小时，直至OD₆₀₀达到2.1-2.7。25mL甘油(80％,MP,#3055-044)混合入培养物。5mL的等分样品在-80℃冷冻以长期储存。每瓶的活细菌浓度如下确认：将连续稀释的储液接种于TSA板(BD，BBL胰酶大豆琼脂(大豆酪蛋白消化琼脂)目录号B21283X)，30℃孵育18小时后进行分析。

7.膀胱炎的非人灵长类模型

NHP用肌肉内施用的克他命/Dexdomitor混合物麻醉。为防止来自导尿的膀胱污染，肛殖区用以无菌生理盐水湿润的无菌纱布和/或含苯扎氯铵的消毒湿巾擦拭。无菌5French红橡胶导管先前包被有Surgi Lube以防止组织刺激，经尿道温和引入膀胱。膀胱随后通过自然流出或用注射器抽吸而没有任何尿。通过导管，含10⁸CFU UPEC菌株PFEEC0578的1mL体积直接施用于膀胱内。

8.攻击后的动物监测

攻击后，动物在第1周一天监测2次，在后续的周中一天一次。NHP在攻击后监测多至30天。监测包括观察排尿外观、行为或食欲的变化、疼痛/不适的迹象和体温测量。

9.通过放置导管的尿采集

为允许收集干净尿样，已麻醉的NHP的膀胱如上所述将导管插入。导管置入后，膀胱通过自然流出或用注射器抽吸而没有任何尿。当膀胱不含尿时，输注10mL盐水并重复通过导管抽吸。收集的所有样品立即在冰上保存。

10.DNA提取

从多至3个NHP尿样重复中提取大肠杆菌DNA用Qiagen Minelute DNA提取试剂盒(凯杰(Qiagen),Ref#51306，量有时受采集的样品体积限制)实施。厂商的血液和体液旋转方案遵循下列改良：样品起始体积增加至500μL(如果样品体积允许)，缓冲液AL体积增至500μL，蛋白酶K体积增至50μL，50μL分子级水(康宁公司(Corning Inc.),Ref#46-000-CM)加热至37℃并用于取代洗脱缓冲液EB。最终，加入37℃分子级水后，旋转柱室温孵育5分钟，然后最终快速旋转。

11.定量实时PCR(qPCR)

定量实时PCR(qPCR)用于评价NHP尿样中的细菌负荷。大肠杆菌O25b血清型特异性DNA用qPCR扩增，使用下列引物：正向，TTGAAAGTGATGGTTTGGTAAGAAAT(SEQ ID NO:109)；反向，TGCAGCACGTATGATAACTTCAAAG(SEQ ID NO:110)，带有Fam荧光报告子和序列AGGATATTTTACCCAGCAGTGCCCCGT(SEQ ID NO:111)的探针用于定量复制。

O25b血清型特异性扩增子对应O25b血清型orf10区的部分。引物和探针定制设计，以冻干形式购买自集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，在缓冲液TE(康宁公司,Ref#46-009-CM)中重建至浓度100nmol/mL。

来自上述DNA提取过程的DNA样品在96孔Applied Biosystems MicroAmp光学96孔反应板(应用生物系统公司(Applied Biosystems),Ref#N8010560)中测定。qPCR反应在25μl总体积中进行，使用每孔12.5μL Applied Biosystems 2X Taqman Fast AdvancedMaster Mix(应用生物系统公司,Ref#4444554)、0.125μL每种重建的引物、0.5μL探针、1.75μL分子生物级水(康宁公司,Ref#46-000-CM)和10μL样品。

用于扩增DNA的反应条件是50℃,2分钟，然后95℃,2分钟以及40个循环的95℃,3秒和60℃,30秒，在Applied Biosystems 7500实时PCR系统或Applied BiosystemsQuantStudio 6实时PCR系统(应用生物系统公司)上运行。

为使定量可行，开发了线性标准曲线。用于各攻击实验的相同大肠杆菌冷冻储液等分样品(如上所述制品)在无菌PBS(康宁,21-040-CM)中稀释至1x109 CFU/mL。随后进行连续稀释以产生含1x10⁸、1x10⁷、1x10⁶、1x10⁵、1x10⁴、1000、100和10CFU/mL浓度大肠杆菌的溶液。连续稀释在无菌PBS(康宁,21-040-CM)中准备或收集，2次过滤，NHP尿液在接种前收集自对象。PBS中稀释和收集，2次过滤，稍后发现NHP尿液等同。各稀释存在的活细菌量通过接种于TSA板(BD，BBL胰酶大豆琼脂(大豆酪蛋白消化琼脂)目录号B21283X)确认。DNA提取在各连续稀释上进行，用于从样品提取DNA的方法相同，如上所述。这些qPCR标准品在各qPCR测定板上一式两份运行。

线性回归分析用Applied Biosystems QuantStudio软件进行。统计分析确定产生的标准曲线在100-1x10⁸细菌/mL之间线性表现。因此，定量下限(LLOQ)测定为100细菌/mL。一些情况下，样品达到荧光阈值，但处于对应LLOQ以下量的循环周期，其他情况下，荧光阈值根本未达到(未定值)。当这些条件中任一种出现时，所述值在本文中报告为LLOQ值(100细菌/mL)。

12.髓过氧化物酶(MPO)ELISA

Invitrogen髓过氧化物酶即时ELISA试剂盒(英杰公司,Ref#BMS2038INST)用于定量NHP尿液中的髓过氧化物酶(MPO)。向净尿样加入PIPES缓冲液至终浓度5％0.5MPIPES缓冲液pH 6.8(阿尔法埃莎(Alfa Aesar),Ref#J61786-AK)。样品涡旋15秒，随后用厂商提供的样品稀释剂1:1稀释。样品一式两份测定，试验剩余部分遵循厂商说明。在终点，450nm的色彩强度在Spectramax Plus instrument(Molecular Devices)上检测。检测试剂盒所含标准用于产生标准曲线。对于分析，测定试剂盒的低标准(156.25pg/mL)理解为检测下限(LLOD)。Spectramax instrument的配套软件(Softmax,Molecular Devices)可外推超出低标准值。LLOD的一半值(78.125pg/mL)取代外推低于该值的任何值，或此时任意测定结果完全低于检测极限。

13.IL-8Luminex试验

白介素8(IL-8)用定制Bio-Rad IL-8人细胞因子筛选组Luminex测定试剂盒(伯乐实验室公司(BioRad Laboratories Inc.),REF#17005177)检测。向净尿样加入PIPES缓冲液至终浓度5％0.5M PIPES缓冲液pH 6.8(阿尔法埃莎(Alfa Aesar),Ref#J61786-AK)。样品涡旋15秒，随后用50％改良LXA-4缓冲液(PBS1X,0.5％ BSA,0.025％叠氮化钠)稀释剂1:1稀释。样品一式两份测定，试验剩余部分遵循厂商说明。试验板在BioPlex 200Luminexinstrument(伯乐实验室公司)上读取。Bio-Plex 200Luminex instrument的配套软件“BioPlex Manager”和测定试剂盒所含标准用于产生标准曲线并从荧光强度中外推样品浓度。BioPlex Manager软件确定定量下限(LLOQ)。

14.尿沉渣的总有核细胞计数和光学显微镜分析

收集1小时内，尿样(500μl-1mL)用福尔马林固定至1％终浓度并在冰上连夜发送至康涅狄格州格罗顿的辉瑞。收到后，总有核细胞(表皮细胞和多形核白细胞)在血球计上计数。约300μL总数在Thermo Scientific Shandon EZ双细胞漏斗中加样，100μL进入一个漏斗且200μL进入另一漏斗。样品在Shandon Double Cytoslide Microscope Coated载玻片上于750rpm冷冻离心5分钟，使用Thermo Scientific CytoSpin 4冷冻离心机。对于有高细胞计数的样品，尿液用0.9％盐水1:10稀释，然后冷冻离心。使用Sysmex SP-10仪器，cytoprep载玻片随后进行简短甲醇固定并用Giemsa和May-Grunwald染料染色。对于各尿样，每尿样准备一个载玻片，采用上面所列的2个样品体积。

含有浓缩和染色的尿沉渣的细胞离心涂片机载玻片通过光学显微镜评估是否存在增加的多形核细胞(PMN，即有分段或肾形核的粒细胞，一般包含中性粒细胞，还包括嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。在没有PMN或PMN很少的观察的基础上确定不存在PMN细胞增加。相对于背景表皮细胞群，在超过很少PMN的观察基础上确定存在PMN增加。

B.结果

1.用有和没有O抗原的FimH-DSG G15A G16AV27A突变体免疫接种可在非人灵长类中引发有效的总抗体和中和抗体

非人灵长类用FimH-DSG G15AG16AV27A突变体免疫接种，有或没有4价O抗原缀合物(O25b、O6、O1a、O2)和AS01b佐剂(图9)。在FimH-DSG G15AG16AV27A和4价O抗原免疫接种组中，O抗原血清型特异抗体滴度在免疫接种后6周上升～400倍(图10和表22)。总抗FimH抗体滴度用直接Luminex免疫测定(dLIA)定量(图11A和表23)。安慰剂组中动物具有的滴度小于定量试验限度。在2个免疫接种组中，滴度在2剂后都上升且能用第三剂加强。总之，相较于单独的FimH-DSG G15AG16A V27A，用具有O抗原的FimH-DSG G15AG16AV27A免疫接种的动物中的滴度略低。

表22:用具有4价O抗原的FimH-DSG G15A G16A V27A免疫接种的非人灵长类中的O抗原血清型特异性滴度

表23:非人灵长类中的FimH IgG几何平均滴度

在大肠杆菌结合抑制试验中评估血清，以评价抗FimH抗体阻断大肠杆菌结合酵母甘露糖的能力(图11B和表24)。用单独FimH-DSG G15AG16A V27A免疫接种的动物中血清的平均IC₅₀在剂量2后上升至293.65且在剂量3后上升至1698.39，而用FimH-DSG G15A G16AV27A与O抗原组合免疫接种的动物中血清的平均IC₅₀在剂量2后为480.12且在剂量3后为756.45。

表24:用于非人灵长类血清的大肠杆菌中和试验IC₅₀

这些数据共同显示FimH-DSG G15AG16A V27A在非人灵长类中引发有效的抗体应答，与O抗原联合产生高滴度，尽管略低于单独用FimH。

2.用有或没有O抗原的FimH-DSG G15A G16A V27A突变体免疫接种在非人灵长类模型中减少菌尿症和感染的生物标志物

最终加强后5周，接种和安慰剂处理的NHP通过膀胱内导管插入术接种108CFU的UPEC分离PFEEC0578。在导管收集的尿液中监测菌尿症28天。在所有安慰剂处理的动物中，灌注活细菌导致菌尿症在攻击后第2天和第7天达到高水平(约106细菌/mL尿液的几何平均数)。相较于安慰剂组，接种FimH-DSG G15A G16A V27A或FimH-DSG G15A G16A V27A+4价O抗原的动物显示几何平均菌尿症在感染后第2天和第7天分别下降300倍或1000倍。

在第14天，约50％安慰剂免疫接种的动物仍表现出菌尿症>105细菌/mL尿液。最后，大部分安慰剂NHP在第21和28天清除感染。相反，大部分FimH-DSG G15A G16A V27A或FimH-DSG G15A G16A V27A +4价O抗原免疫接种的动物在第14天清除感染(图12)。

接下来，在受攻击的NHP的尿液中监测多个炎症生物标志物。在攻击后第7天，所有安慰剂处理的动物显示尿沉渣中的多形核细胞水平提高，如细胞学分析所确认。相反，小于25％的FimH-DSG G15A G16A V27A免疫接种的NHP且没有FimH-DSG G15A G16A V27A+4价O抗原免疫的动物在尿沉渣中的PMN细胞水平增加(图13C)。并行地，我们在7天时间段内测量尿样中的髓过氧物酶(MPO)和白介素8(IL-8)水平。在攻击后第2天，2个免疫接种组都显示MPO水平(几何平均为～200pg/mL)相较于安慰剂组(几何平均为470pg/mL)下降2倍(图13A)。

另外，在感染后第2天和第7天，相较于安慰剂处理的NHP所测的水平(几何平均为54.2pg/mL和32.7pg/mL)，FimH-DSG G15A G16A V27A免疫接种的动物中的IL-8尿浓度分别减少约10倍和5倍(几何平均为5.9pg/mL和9.8pg/m)。有着类似趋势，相较于安慰剂处理的动物所观察到的IL-8浓度，FimH-DSG G15A G16A V27A与O抗原组合免疫的NHP中的IL-8尿水平在第2天和第7天分别减少约5倍及3倍(几何平均为11.3pg/mL)(图13B)。

C.结论

FimH-DSG G15A G16A V27A突变体在NHP中诱导高抗FimH IgG滴度，其能用第3剂加强。用FimH-DSG G15A G16A V27A突变体与4价O抗原组合免疫接种的动物显示高O抗原IgG滴度。

FimH-DSG G15A G16A V27A在非人灵长类中引发有效的中和抗体。与4价O抗原的组合具有类似的免疫原性。

有或没有4价O抗原的FimH-DSG G15A G16A V27A突变体在猕猴尿路感染模型中减少菌尿症和感染的生物标志物。

下列条款描述了本公开的另外方面：

C1.一种突变的FimH多肽，相对于野生型FimH多肽的氨基酸序列，所述突变的FimH多肽包含至少一个氨基酸突变，其中所述突变位置选自F1、P12、G14、G15、G16、A18、P26、V27、V28、Q32、N33、L34、V35、R60、S62、Y64、G65、L68、F71、T86、L107、Y108、L109、V112、S113、A115、G116、V118、A119、A127、L129、Q133、F144、V154、V155、V156、P157、T158、V163和V185，其中氨基酸位置根据SEQ ID NO:59编号。

C2.如条款C1所述的突变的FimH多肽，其包含选自以下的至少一个突变：F1I；F1L；F1V；F1M；F1Y；F1W；P12C；G14C；G15A；G15P；G16A；G16P；A18C；P26C；V27A；V27C；V28C；Q32C；N33C；L34C；L34N；L34S；L34T；L34D；L34E；L34K；L34R；V35C；R60P；S62C；Y64C；G65A；L68C；F71C；T86C；L107C；Y108C；L109C；V112C；S113C；A115V；G116C；V118C；A119C；A119N；A119S；A119T；A119D；A119E；A119K；A119R；A127C；L129C；Q133K；F144C；V154C；V156C；P157C；T158C；V163I；和V185I，或其任意组合。

C3.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G15A和G16A。

C4.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变P12C和A18C。

C5.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G14C和F144C。

C6.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变P26C和V35C。

C7.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变P26C和V154C。

C8.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变P26C和V156C。

C9.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V27C和L34C。

C10.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V28C和N33C。

C11.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V28C和P157C。

C12.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变Q32C和Y108C。

C13.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变N33C和L109C。

C14.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变N33C和P157C。

C15.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V35C和L107C。

C16.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V35C和L109C。

C17.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变S62C和T86C。

C18.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变S62C和L129C。

C19.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变Y64C和L68C。

C20.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变Y64C和A127C。

C21.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L68C和F71C。

C22.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V112C和T158C。

C23.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变S113C和G116C。

C24.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变S113C和T158C。

C25.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V118C和V156C。

C26.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119C和V155C。

C27.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L34N和V27A。

C28.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L34S和V27A。

C29.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L34T和V27A。

C30.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L34D和V27A。

C31.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L34E和V27A。

C32.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L34K和V27A。

C33.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变L34R和V27A。

C34.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119N和V27A。

C35.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119S和V27A。

C36.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119T和V27A。

C37.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119D和V27A。

C38.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119E和V27A。

C39.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119K和V27A。

C40.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变A119R和V27A。

C41.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G15A和V27A。

C42.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G16A和V27A。

C43.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G15P和V27A。

C44.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G16P和V27A。

C45.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G15A、G16A和V27A。

C46.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G65A和V27A。

C47.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变V27A和Q133K。

C48.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含突变G15A、G16A、V27A和Q133K。

C49.如条款C2所述的突变的FimH多肽，其包含SEQ ID NO:2-58和60-64任一者的序列。

C50.如条款C1-C49中任一项所述的突变的FimH多肽，其中所述多肽是经分离的。

C51.一种药物组合物，其包含(i)条款C1-C50中任一项所述的突变的FimH多肽和(ii)药学上可接受的载体。

C52.一种免疫原性组合物，其包含条款C1-C50中任一项所述突变的FimH多肽。

C53.如条款C52所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种额外的抗原。

C54.如条款C53所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种额外的抗原是糖或多糖或糖缀合物或蛋白。

C55.如条款C52所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种佐剂。

C56.一种核酸分子，其包含编码条款C1-C49中任一项所述的突变的FimH多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。

C57.如条款C1-C50中任一项所述的突变的FimH多肽，其中所述多肽具有免疫原性。

C58.一种重组哺乳动物细胞，其包含编码条款C1-C50中任一项所述的突变的FimH多肽的多核苷酸。

C59.一种包含条款C58所述的重组细胞的培养物，其中所述培养物大小是至少5升。

C60.一种产生条款C1-C50中任一项所述突变的FimH多肽的方法，其包括在合适的条件下培养条款C58所述的重组哺乳动物细胞，从而表达所述多肽；和收获所述多肽。

C61.一种(i)在对象中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或(ii)在对象中诱导产生对肠外致病性大肠杆菌有特异性的调理吞噬抗体和/或中和抗体的方法，其中所述方法包括给所述对象施用有效量的条款C51-C55中任一项所述的组合物。

C62.如条款C61所述的方法，其中所述对象处于发展尿路感染的风险。

C63.如条款C61所述的方法，其中所述对象处于发展菌血症的风险。

C64.如条款C61所述的方法，其中所述对象处于发展败血症的风险。

C65.一种在哺乳动物中引发针对大肠杆菌的免疫应答的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的条款C51-C55中任一项所述的组合物。

C66.如条款C65所述的方法，其中所述免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体和/或中和抗体。

C67.如条款C65所述的方法，其中所述免疫应答保护哺乳动物免于大肠杆菌感染。

C68.一种在对象中预防、治疗或缓解细菌性感染、疾病或病症的方法，其包括给所述对象施用免疫有效量的条款C51-C55中任一项所述的组合物。

C69.如条款C54所述的免疫原性组合物，其中所述额外的抗原是包含选自以下的任意一种的结构的糖：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186和式O187，其中n是1-100的整数。

C70.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述糖包括选自以下的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B和式O18B1)、式O21、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D₁、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167和式O172，其中n是31-100的整数。

C71.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述糖包括选自以下的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O3、式O4(如式O4:K52和式O4:K6)、式O5(如式O5ab和式O5ac(菌株180/C3))、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18(如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B,和式O18B1)、式O21、式O23(如式O23A)、式O24、式O25(如式O25a和式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45(如式O45和式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73(如式O73(菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173和式62D₁，其中n是31-100的整数。

C72.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包括选自以下的结构：式O1(如式O1A、式O1B和式O1C)、式O2、式O6(如式O6:K2；K13；K15和式O6:K54)、式O15、式O16、式O21、式O25(如式O25a和式O25b)和式O75。

C73.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包括选自以下的结构：式O4、式O11、式O21和式O75。

C74.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述糖不包括选自以下的结构：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101。

C75.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述糖不包括选自式O12的结构。

C76.如条款C72所述的免疫原性组合物，其中所述糖如下产生：在革兰氏阴性菌中表达wzz家族蛋白以产生所述糖。

C77.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白选自wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2。

C78.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白是wzzB。

C79.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白是fepE。

C80.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白是wzzB和fepE。

C81.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白衍生自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)。

C82.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白包含选自SEQ IDNO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121任一者的序列。

C83.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白包含与112、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116任一者有至少90％序列相同性的序列。

C84.如条款C76所述的免疫原性组合物，其中所述wzz家族蛋白包含选自SEQ IDNO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121任一者的序列。

C85.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述糖是人工合成的(synthetically synthesized)。

C86.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R1部分。

C87.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R2部分。

C88.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R3部分。

C89.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌R4部分。

C90.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖还包含大肠杆菌K-12部分。

C91.如条款C69-C90中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖还包含3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C92.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R1部分。

C93.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R2部分。

C94.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R3部分。

C95.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌R4部分。

C96.如条款C69-C85中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌K-12部分。

C97.如条款C69-C90中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖不进一步包含大肠杆菌3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C98.如条款C69-C91中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖不包含脂质A。

C99.如条款C69-C98中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述多糖的分子量为10kDa-2,000kDa或50kDa-2,000kDa。

C100.如条款C69-C99中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖具有20-40kDaCD的平均分子量。

C101.如条款C69-C100中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖具有40,000-60,000kDa的平均分子量。

C102.如条款C69-C101中任一项所述的免疫原性组合物，其中n是31-90的整数。

C103.一种免疫原性组合物，其包含条款C69-C50中任一项所述的突变的FimH多肽和缀合物，所述缀合物包含共价结合载体蛋白的糖，其中所述糖衍生自大肠杆菌。

C104.一种免疫原性组合物，其包含条款C69-C50中任一项所述的突变的FimH多肽和缀合物，所述缀合物包含共价结合载体蛋白的条款C69-C102中任一项所述的糖。

C105.一种免疫原性组合物，其包含条款C69-C50中任一项所述的突变的FimH多肽或其片段；和如条款C69-C102中任一项所述的缀合物，其中载体蛋白选自聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素、或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚基(CTB)、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)中的任意一种。

C106.如条款C103-C105中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

C107.如条款C103-C105中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是破伤风类毒素(TT)。

C108.如条款C103-C105中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是聚(L-赖氨酸)。

C109.如条款C103-C107中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述缀合物通过还原胺化制备。

C110.如条款C103-C107中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述缀合物通过CDAP化学制备。

C111.如条款C103-C107中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述缀合物是单末端连接缀合糖。

C112.如条款C103-C107中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子缀合载体蛋白。

C113.如条款C112所述的免疫原性组合物，其中所述糖经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子来缀合载体蛋白，其中所述糖经氨基甲酸酯键共价连接eTEC间隔子且其中所述载体蛋白经酰胺键共价连接eTEC间隔子。

C114.如条款C112-C113中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述CRM₁₉₇包含2-20或4-16个经eTEC间隔子共价连接多糖的赖氨酸残基。

C115.如条款C103-C114中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖:载体蛋白之比(w/w)是0.2-4。

C116.如条款C103-C114中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖与蛋白之比是至少0.5且至多2。

C117.如条款C103-C114中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖与蛋白之比是0.4-1.7。

C118.如条款C111-C117中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述糖经3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基缀合载体蛋白。

C119.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中所述缀合物包含共价结合载体蛋白的糖，其中所述糖包含选自以下的结构：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97和式O101，其中n是1-10的整数。

C120.一种免疫原性组合物，其包含突变的FimH多肽，和条款C69-C102中任一项所述的糖，和药学上可接受稀释剂。

C121.一种免疫原性组合物，其包含突变的FimH多肽，和条款C103-C119中任一项所述的糖缀合物，和药学上可接受稀释剂。

C122.如条款C121所述的免疫原性组合物，其包含与组合物中糖总量相比至多约25％游离糖。

C123.如条款C120-C121中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

C124.如条款C120-C121中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含铝。

C125.如条款C120-C121中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含QS-21。

C126.如条款C120-C121中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含CpG寡核苷酸。

C127.如条款C120-C121中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物不包含佐剂。

C128.一种免疫原性组合物，其包含条款C69-C118中任一项所述的突变的FimH多肽和衍生自大肠杆菌的糖，其经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子缀合载体蛋白，其中所述多糖经氨基甲酸酯键共价连接eTEC间隔子且其中所述载体蛋白经酰胺键共价连接eTEC间隔子。

C129.如条款C128所述的免疫原性组合物，其中所述糖是衍生自大肠杆菌的O抗原。

C130.如条款C128所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受赋形剂、载体或稀释剂。

C131.如条款C128所述的免疫原性组合物，其中所述糖是衍生自大肠杆菌的O抗原。

C132.一种免疫原性组合物，其包含突变的FimH多肽和条款C69-C85中任一项所述的糖，其经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子来缀合载体蛋白，其中所述多糖经氨基甲酸酯键共价连接eTEC间隔子且其中所述载体蛋白经酰胺键共价连接eTEC间隔子。

C133.一种免疫原性组合物，其包含突变的FimH多肽和(i)共价偶联载体蛋白的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)共价偶联载体蛋白的大肠杆菌O1A抗原的缀合物，(iii)共价偶联载体蛋白的大肠杆菌O2抗原的缀合物和(iv)共价偶联载体蛋白的O6抗原的缀合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原包括式O25B的结构，其中n是大于30的整数。

C134.如条款C133所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白选自聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素、或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚基(CTB)、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)中的任意一种。

C135.一种免疫原性组合物，其包含条款C69-C118中任一项所述的突变的FimH多肽和(i)共价偶联载体蛋白的大肠杆菌O25B抗原的缀合物，(ii)共价偶联载体蛋白的大肠杆菌O4抗原的缀合物，(iii)共价偶联载体蛋白的大肠杆菌O11抗原的缀合物和(iv)共价偶联载体蛋白的O21抗原的缀合物，其中大肠杆菌O25B抗原包括式O75的结构，其中n是大于30的整数。

C136.如条款C135所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白选自聚(L-赖氨酸)、CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒(TT)、TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素、或来自铜绿假单胞菌的外毒素A；铜绿假单胞菌的脱毒外毒素A(EPA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍乱毒素B亚基(CTB)、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲菌AcrA、空肠弯曲菌天然糖蛋白和链球菌C5a肽酶(SCP)中的任意一种。

C137.一种制备免疫原性组合物的方法，所述组合物包含突变的FimH多肽和缀合物，所述缀合物包含经(2-((2-氧乙基)巯基)乙基)氨基甲酸酯(eTEC)间隔子缀合载体蛋白的糖，所述方法包括以下步骤：a)使糖与1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1’-羰二咪唑(CDI)在有机溶剂中反应，以产生经活化的糖；b)使经活化的糖与胱胺或半胱胺或其盐反应，以产生巯基化的糖；c)使巯基化的糖与还原剂反应，以产生包含一个或多个游离氢硫基残基的经活化的巯基化的糖；d)使经活化的巯基化的糖与包含一个或多个α-卤乙酰胺基的经活化的载体蛋白反应，以产生巯基化的糖-载体蛋白缀合物；和e)使巯基化的糖-载体蛋白缀合物与(i)能够加帽经活化的载体蛋白的未缀合α-卤乙酰胺基的第一加帽剂；和/或(ii)能够加帽未缀合的游离硫氢基残基的第二加帽剂反应；从而产生eTEC连接的糖缀合物，其中所述糖衍生自大肠杆菌；还包括在重组哺乳动物细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码衍生自FimH的多肽或其片段，和分离所述多肽或其片段。

C138.如条款C137所述的方法，其包括制备条款C69-C102中任一项所述的免疫原性组合物。

C139.如条款C137-C138中任一项所述的方法，其中所述加帽步骤e)包括使巯基化的糖-载体蛋白缀合物与(i)作为第一加帽剂的N-乙酰-L-半胱氨酸和/或(ii)作为第二加帽剂的碘乙酰胺反应。

C140.如条款C137-C139中任一项所述的方法，其还包括通过与三唑或咪唑反应复合糖的步骤，以提供复合糖，其中在步骤a)前于有机溶剂中壳冷冻、冻干和重建所述复合糖。

C141.如条款C137-C140中任一项所述的方法，其还包括纯化步骤c)中产生的巯基化的多糖，其中所述纯化步骤包括透析过滤。

C142.如条款C137-C141中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过透析过滤纯化eTEC连接的糖缀合物。

C143.如条款C137-C142中任一项所述的方法，其中所述步骤a)中的有机溶剂是选自以下的任意一种的极性非质子溶剂：二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)和六甲基磷酰胺(HMPA)或其混合物。

C144.如条款C137-C142中任一项所述的方法，其中所述培养基包含选自KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O中的任意一种的元素。

C145.如条款C144所述的培养基，其中所述培养基用于培养大肠杆菌。

C146.一种产生条款C69-C102中任一项所述糖的方法，所述方法包括在培养基中培养重组大肠杆菌；通过在所述培养基中培养所述细胞产生所述糖；其中所述细胞产生所述糖。

C147.如条款C146所述的方法，其中所述培养基包含选自KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸钠、Na₂SO₄、天冬氨酸、葡萄糖、MgSO₄、FeSO₄-7H₂O、Na₂MoO₄-2H₂O、H₃BO₃、CoCl₂-6H₂O、CuCl₂-2H₂O、MnCl₂-4H₂O、ZnCl₂和CaCl₂-2H₂O中的任意一种的元素。

C148.如条款C146所述的方法，其中所述培养基包含大豆水解产物。

C149.如条款C146所述的方法，其中所述培养基包含酵母提取物。

C150.如条款C146所述的方法，其中所述培养基不进一步包含大豆水解产物和酵母提取物。

C151.如条款C146所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞包含异源wzz家族蛋白，其选自wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2中的任意一种。

C152.如条款C146所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞包括肠道沙门氏菌wzz家族蛋白，其选自wzzB、wzz、wzz_SF、wzz_ST、fepE、wzz_fepE、wzz1和wzz2中的任意一种。

C153.如条款C152所述的方法，其中所述wzz家族蛋白包含选自SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116任一者的序列。

C154.如条款C146所述的方法，其中所述培养产生>120OD₆₀₀/mL的产量。

C155.如条款C146所述的方法，其还包括纯化糖。

C156.如条款C146所述的方法，其中纯化步骤包括下列任意一种：透析、浓缩操作、透析过滤操作、切向流过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深层过滤和柱层析(离子交换层析、多模态离子交换层析、DEAE和疏水相互作用层析)。

C157.一种在对象中诱导免疫应答的方法，去包括给对象施用条款C69-C136中任一项所述的组合物。

C158.如条款C157所述的方法，其中所述免疫应答包括诱导抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体。

C159.如条款C157所述的方法，其中所述免疫应答包括诱导抗大肠杆菌IgG抗体。

C160.如条款C157所述的方法，其中所述免疫应答包括诱导针对大肠杆菌的杀菌活性。

C161.如条款C157所述的方法，其中所述免疫应答包括诱导针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C162.如条款C157所述的方法，其中所述免疫应答包括在初始给药后至少1,000-200,000的几何平均滴度(GMT)水平。

C163.如条款C157所述的方法，其中所述组合物包含包含式O25的糖，其中n是40-100的整数，其中免疫应答包括在初始给药后至少1,000-200,000的几何平均滴度(GMT)水平。

C164.如条款C157所述的方法，其中所述对象处于选自以下病症的任意一种的风险：尿路感染、胆囊炎、胆管炎、腹泻、溶血性尿毒症综合征、新生儿脑膜炎、尿脓毒病、腹腔内感染、脑膜炎、合并肺炎、伤口感染、前列腺活检后相关感染、新生儿/婴儿败血症、中性粒细胞缺乏性发烧和其他血流感染；肺炎、菌血症和败血症。

C165.如条款C157所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

C166.一种(i)在对象中诱导针对肠外致病性大肠杆菌的免疫应答，或(ii)在对象中诱导调对肠外致病性大肠杆菌有特异性的理吞噬抗体产生的方法，其中所述方法包括给对象施用有效量的条款C69-C136中任一项所述的组合物。

C167.如条款C166所述的方法，其中所述对象处于发展尿路感染的风险。

C168.如条款C166所述的方法，其中所述对象处于发展菌血症的风险。

C169.如条款C166所述的方法，其中所述对象处于发展败血症的风险。

C170.一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给对象施用条款C69-C136中任一项所述的组合物。

C171.如条款C170所述的方法，其中所述免疫应答包括诱导抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体。

C172.如条款C170所述的方法，其中所述抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体是IgG抗体。

C173.如条款C170所述的方法，其中所述抗大肠杆菌O特异性多糖血清抗体是IgG抗体，具有针对大肠杆菌的杀菌活性。

C174.如条款C69所述的免疫原性组合物，其中n大于对应的野生型大肠杆菌多糖中的重复单元数目。

C175.如条款C174所述的组合物，其中n是31-100的整数。

C176.如条款C174所述的组合物，其中所述糖包含根据式O1A、式O1B和式O1C、式O2、式O6和式O25B中的任意一种的结构。

C177.如条款C174所述的组合物，其中所述糖在重组宿主细胞中产生，所述细胞表达wzz家族蛋白，所述蛋白与SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121任一者具有至少90％序列相同性。

C178.如条款C177所述的组合物，其中所述蛋白包含SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116任一者。

C179.如条款C174所述的糖，其中所述糖是人工合成的。

C180.一种免疫原性组合物，其包含条款C1-C55中任一项所述的突变的FimH多肽和

(a)包含共价结合包含式O25b的糖的载体蛋白的缀合物，其中n是31-90的整数，

(b)包含共价结合包含式O1A的糖的载体蛋白的缀合物，其中n是31-90的整数，

(c)包含共价结合包含式O2的糖的载体蛋白的缀合物，其中n是31-90的整数和(d)

包含共价结合包含式O6的糖的载体蛋白的缀合物，其中n是31-90的整数。

C181.如条款C180所述的免疫原性组合物，其还包含缀合物，所述缀合物包含共价结合包含选自以下的任意一种的结构的糖的载体蛋白：式O15、式O16、式O17、式O18和式O75，其中n是31-90的整数。

C182.如条款C180所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含与组合物中糖总量相比至多约25％的游离糖。

C183.一种在哺乳动物中引发针对大肠杆菌免疫应答的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的条款C180-C182中任一项所述组合物。

C184.如条款C183所述的方法，其中所述免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C185.如条款C183所述的方法，其中所述免疫应答保护哺乳动物免于大肠杆菌感染。

C186.一种重组哺乳动物细胞，所述细胞包含(a)第一感兴趣的基因，编码条款C1-C55中任一项所述的突变的FimH多肽，其中所述基因在至少2个重组靶位点(RTS)之间整合。

C187.如条款C186所述的实施方案，其中所述2个RTS在NL1基因座或NL2基因座内染色体整合。

C188.如条款C186所述的实施方案，其中所述第一感兴趣的基因还包含报告基因、编码难表达蛋白的基因、辅助基因或其组合。

C189.如条款C186所述的实施方案，其还包含在不同于(a)的基因座的第二染色体基因座内整合的第二感兴趣的基因，其中所述第二感兴趣的基因包含报告基因、编码难表达蛋白的基因、辅助基因或其组合。

C190.如条款C186所述的重组细胞，其中所述多核苷酸序列整合入所述哺乳动物细胞的基因组DNA。

C191.如条款C186所述的重组细胞，其中所述多核苷酸序列为细胞表达进行密码子优化。

C192.如条款C186所述的重组细胞，其中所述细胞是人胚胎肾细胞。

C193.如条款C192所述的重组细胞，其中所述人胚胎肾细胞包括HEK293细胞。

C194.如条款C193所述的重组细胞，其中所述HEK293细胞选自HEK293T细胞、HEK293TS细胞和HEK293E细胞中的任意一种。

C195.如条款C186所述的重组细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

C196.如条款C195所述的重组细胞，其中所述CHO细胞是CHO-K1细胞、CHO-DUXB11、CHO-DG44细胞或CHO-S细胞.

C197.如条款C186所述的重组细胞，其中所述多肽是可溶的。

C198.如条款C186所述的重组细胞，其中所述多肽从细胞分泌。

C199.一种包含C186所述的重组细胞的培养物，所述培养物大小是至少5升。

C200.如条款C199所述的培养物，其中所述多肽或其片段的产量是至少0.05g/L。

C201.如条款C199所述的培养物，其中所述多肽或其片段的产量是至少0.10g/L。

C202.一种产生衍生自大肠杆菌的多肽或其片段的方法，所述方法包括在合适条件下培养C186所述的重组哺乳动物细胞，从而表达所述多肽或其片段；和收获所述多肽或其片段。

C203.如条款C202所述的方法，其还包括纯化所述多肽或其片段。

C204.如条款C54所述的免疫原性组合物，其还包含衍生自任意一种肺炎克雷伯菌类型的至少一种糖，所述肺炎克雷伯菌类型选自O1、O2、O3和O5。

C205.如条款C204所述的免疫原性组合物，其还包含衍生自肺炎克雷伯菌O1型的糖。

C206.如条款C204所述的免疫原性组合物，其还包含衍生自肺炎克雷伯菌O2型的糖。

C207.如条款C204所述的组合物，其还包含衍生自肺炎克雷伯菌O3型的糖。

C208.如条款C204所述的免疫原性组合物，其还包含衍生自肺炎克雷伯菌O5型的糖。

C209.如条款C204所述的免疫原性组合物，其还包含衍生自肺炎克雷伯菌O1型的糖和衍生自肺炎克雷伯菌O2型的糖。

C210.如条款C204-C209中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含包含选自以下的任意一种的结构的至少一种糖：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187，其中n是1-100的整数，更优选31-90。

C211.如条款C210所述的免疫原性组合物，其中所述衍生自肺炎克雷伯菌的糖缀合载体蛋白；且衍生自大肠杆菌的糖缀合载体蛋白。

C212.一种在哺乳动物中引发针对大肠杆菌的免疫应答的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的条款C204-C211中任一项所述的组合物。

C213.如条款C212所述的方法，其中所述免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体。

C214.如条款C212所述的方法，其中所述免疫应答保护哺乳动物免于大肠杆菌感染。

C215.一种在哺乳动物中引针对肺炎克雷伯菌的发免疫应答的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的条款C204-C211中任一项所述的组合物。

C216.如条款C215所述的方法，其中所述免疫应答包括针对肺炎克雷伯菌的调理吞噬抗体。

C217.如条款C215所述的方法，其中所述免疫应答保护哺乳动物免于肺炎克雷伯菌感染。

C218.如条款C204-C217中任一项所述的组合物和方法，其中所述肺炎克雷伯菌血清型O1包括变体O1V1或O1V2。

C219.如条款C204-C217中任一项所述的组合物和方法,其中所述肺炎克雷伯菌血清型O2包括变体O2V1或O2V2。

C220.本文所示条款C1-C219中任一项所列的组合物的用途。

C221.如条款C211所述的组合物，其中所述肺炎克雷伯菌O抗原选自a)血清型O1亚型v1(O1v1)、b)血清型O1亚型v2(O1v2)、c)血清型O2亚型v1(O2v1)和d)血清型O2亚型v2(O2v2)。

C222.一种核酸，其包含编码条款C1-C221中任一项所述的多肽的核苷酸。

C223.如条款C222所述的核酸，其中所述核酸是RNA。

C224.一种包含条款C222或C223所述的核酸的纳米颗粒。

C225.本发明的免疫原性组合物，其还包含一种或多种缀合物，所述缀合物具有选自式O4、式O11、式O13、式O21和式O86的糖，其中n是1-100的整数，优选31-90。

C226.本发明的免疫原性组合物，其还包含一种或多种缀合物，所述缀合物具有选自式O1a、式O2、式O6和式O25b的糖，其中n是1-100的整数，优选31-90。

Claims

1.一种突变的FimH多肽，相对于野生型FimH多肽的氨基酸序列，所述突变的FimH多肽包含至少一个氨基酸突变，其中突变位置选自F1、P12、G14、G15、G16、A18、P26、V27、V28、Q32、N33、L34、V35、R60、S62、Y64、G65、L68、F71、T86、L107、Y108、L109、V112、S113、A115、G116、V118、A119、A127、L129、Q133、F144、V154、V155、V156、P157、T158、V163和V185，其中氨基酸位置根据SEQ ID NO:59编号。

2.权利要求1的突变的FimH多肽，其包含选自以下的至少一个突变：F1I、F1L、F1V、F1M、F1Y、F1W、P12C、G14C、G15A、G15P、G16A、G16P、A18C、P26C、V27A、V27C、V28C、Q32C、N33C、L34C、L34N、L34S、L34T、L34D、L34E、L34K；L34R；V35C、R60P、S62C、Y64C、G65A、L68C、F71C、T86C、L107C、Y108C、L109C、V112C、S113C、A115V、G116C、V118C、A119C、A119N、A119S、A119T、A119D、A119E、A119K、A119R、A127C、L129C、Q133K、F144C、V154C、V156C、P157C、T158C、V163I和V185I，或其任意组合。

3.权利要求2的突变的FimH多肽，其中所述突变的FimH多肽包含选自以下的突变：

a)突变G15A和G16A；

b)突变P12C和A18C；

c)突变G14C和F144C；

d)突变P26C和V35C；

e)突变P26C和V154C；

f)突变P26C和V156C；

g)突变V27C和L34C；

h)突变V28C和N33C；

i)突变V28C和P157C；

j)突变Q32C和Y108C；

k)突变N33C和L109C；

l)突变N33C和P157C；

m)突变V35C和L107C；

n)突变V35C和L109C；

o)突变S62C和T86C；

p)突变S62C和L129C；

q)突变Y64C和L68C；

r)突变Y64C和A127C；

s)突变L68C和F71C；

t)突变V112C和T158C；

u)突变S113C和G116C；

v)突变S113C和T158C；

w)突变V118C和V156C；

x)突变A119C和V155C；

y)突变L34N和V27A；

z)突变L34S和V27A；

aa)突变L34T和V27A；

ab)突变L34D和V27A；

ac)突变L34E和V27A；

ad)突变L34K和V27A；

ae)突变L34R和V27A；

af)突变A119N和V27A；

ag)突变A119S和V27A；

ah)突变A119T和V27A；

ai)突变A119D和V27A；

aj)突变A119E和V27A；

ak)突变A119K和V27A；

al)突变A119R和V27A；

am)突变G15A和V27A；

an)突变G16A和V27A；

ao)突变G15P和V27A；

ap)突变G16P和V27A；

aq)突变G15A、G16A和V27A；

ar)突变G65A和V27A；

as)突变V27A和Q133K；和

at)突变G15A、G16A、V27A和Q133K。

4.权利要求2的突变的FimH多肽，其包含SEQ ID NO:2-58和60-64中任一者的序列。

5.权利要求1-4中任一项的突变的FimH多肽，其中所述多肽是经分离的。

6.一种药物组合物，其包含(i)权利要求1-4中任一项的突变的FimH多肽和(ii)药学上可接受的载体。

7.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-4中任一项的突变的FimH多肽。

8.权利要求7的免疫原性组合物，其还包含至少一种额外的抗原。

9.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述至少一种额外的抗原是多糖或蛋白。

10.权利要求7的免疫原性组合物，其还包含至少一种佐剂。

11.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-4中任一项的突变的FimH多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。

12.权利要求1-4中任一项的突变的FimH多肽，其中所述多肽具有免疫原性。

13.一种重组哺乳动物细胞，其包含编码如权利要求1-4中任一项所述的突变的FimH多肽的多核苷酸。

14.一种包含权利要求13的重组细胞的培养物，其中所述培养物的大小是至少5升。

15.一种产生权利要求1-4中任一项的突变的FimH多肽的方法，包括在合适条件下培养权利要求13的重组哺乳动物细胞，从而表达所述多肽；和收获所述多肽。

16.一种(i)在对象中诱导针对肠外致病性大肠杆菌(E.coli)的免疫应答，或(ii)在对象中诱导产生对肠外致病性大肠杆菌有特异性的调理吞噬抗体和/或中和抗体的方法，其中所述方法包括给所述对象施用有效量的权利要求6-10中任一项的组合物。

17.权利要求16的方法，其中所述对象处于发展尿路感染的风险。

18.权利要求16的方法，其在所述对象处于发展菌血症的风险。

19.权利要求16的方法，其中所述对象处于发展败血症的风险。

20.一种在哺乳动物中引发针对大肠杆菌的免疫应答的方法，包括给所述哺乳动物施用有效量的权利要求6-10中任一项的组合物。

21.权利要求20的方法，其中所述免疫应答包括针对大肠杆菌的调理吞噬抗体和/或中和抗体。

22.权利要求20的方法，其中所述免疫应答保护所述哺乳动物免于大肠杆菌感染。

23.一种在对象中预防、治疗或缓解细菌性感染、疾病或病症的方法，包括给所述对象施用免疫有效量的权利要求6-10中任一项的组合物。