TW202227467A

TW202227467A - 大腸桿菌組合物及其方法

Info

Publication number: TW202227467A
Application number: TW110139527A
Authority: TW
Inventors: 安納麗莎西柏爾安德森; 勞倫特奧利佛丘洛; 羅伯特喬治康瑞德唐納; 賈克琳瑪里里坡韋; 蕊潘
Original assignee: 美商輝瑞大藥廠
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2022-07-16
Also published as: MX2023004912A; CO2023005372A2; JP2023546615A; CA3199610A1; KR20230096033A; AU2021368151A8; IL302362A; WO2022090893A2; AU2021368151A1; WO2022090893A3; EP4237428A2; PE20231934A1

Abstract

本發明係關於包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及衍生自大腸桿菌脂多醣之經修飾O-多醣分子及其綴合物的組合物，及其使用方法。

Description

大腸桿菌組合物及其方法

本發明係關於適用於引發個體針對大腸桿菌( E. coli)及肺炎克雷伯氏桿菌( Klebsiella pneumoniae)血清型之免疫反應之疫苗的新穎免疫原性組合物。

大腸桿菌為最常見人類細菌病原體中之一者，其具有包括血流感染、泌尿道感染(導尿管及非導尿管相關)；手術部位感染、肺炎及嚴重食物中毒相關之腹瀉的臨床表現。其在血清學上藉由脂多醣相關之O-抗原(＞180種已知血清型)、莢膜多醣K抗原(＞100種血清型)及鞭毛H抗原(＞50種血清型)之結構差異分類。

尿路感染(UTI)最常表現為膀胱炎，其在一些個體中可在消退後反覆復發。如不治療，其可能發展為腎盂腎炎及血流感染。大腸桿菌感染與高水準之抗生素抗性相關[Al-Hasan MN等人. The Journal of antimicrobial chemotherapy 2009；64:169-74]，其中許多菌株對多種抗生素具有抗性，包括最後採用的抗生素，諸如碳青黴烯類及多黏菌素類[Zowawi HM等人. Nature reviews Urology 2015；12:570-84]。特定言之，O25b血清型多位點序列類型(MLST) 131已成為全球大流行性純系，主要引起社區起始之感染(community-onset infection)，伴之以對超廣譜頭孢菌素(ESBL)及氟喹諾酮之較高抗性比率[Rogers BA等人The Journal of antimicrobial chemotherapy 2011; 66:1-14; Nicolas-Chanoine M-H等人Clinical Microbiology Reviews 2014; 27:543-74]。大腸桿菌BSI及UTI感染菌株亦稱為侵襲性腸道外病原性大腸桿菌(ExPEC)或泌尿道病原性大腸桿菌(UPEC)。

僅次於大腸桿菌，克雷伯氏菌屬(包括肺炎克雷伯氏桿菌及催產克雷伯氏菌( K . oxytoca))為第二大最常見革蘭氏陰性病原體，其與包括UTI之侵襲性感染、肺炎、腹內感染及血流感染(BSI)相關[Nicolas-Chanoine M-H等人Clinical Microbiology Reviews 2014; 27:543-74; Podschun R等人Clin Microbiol Rev 1998; 11:589-603; Yinnon AM等人QJM : monthly journal of the Association of Physicians 1996; 89:933-41; Anderson DJ等人PLoS One 2014; 9:e91713]。克雷伯氏菌經由水平傳染性ESBL及碳青黴烯類抗性賦予基因維持獲得抗生素抗性之強大能力[Chen L等人Trends Microbiol 2014; 22:686-96; Iredell J等人Bmj 2016; 352:h6420]。因此，在過去十年間，產生超廣譜β-內醯胺酶(ESBL)之ESBL抗性克雷伯氏菌的盛行率在全球範圍內急劇增加。克雷伯氏菌屬可表現至多8種不同的O型及＞80種K型。雖然存在許多與毒性克雷伯氏菌菌株相關之K抗原，但僅四種O-抗原血清型佔克雷伯氏菌臨床分離株之＞80%，無論樣品部位(血液、尿液、痰液)、感染狀態(侵襲性與非侵襲性)或獲得之性質(社區與院內) [Follador R等人. Microbial Genomics 2016；2:e000073]。

脆弱的新生兒群體及老年人中侵襲性多重抗藥性(MDR)大腸桿菌及克雷伯氏菌感染率的增加強調需要基於疫苗之方法來替代變得不太有效的標準照護抗生素。

為了滿足此等及其他需求，本發明係關於組合物及其使用方法，其用於產生適用於引發個體針對大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌血清型之免疫反應之疫苗的新穎免疫原性組合物。

在本文所提供之方法之一些實施例中，個體為哺乳動物，較佳為人類。在一些特定實施例中，人類為兒童，諸如嬰兒。在一些其他特定實施例中，人類為女性，尤其孕婦。

組合物可在投與或不投與佐劑之情況下向個體投與。向個體投與之有效量為足以引發個體針對大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌抗原之免疫反應的量。可經選擇用於治療之個體包括由於暴露或可能暴露於大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌而處於患上大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌感染之風險下的彼等個體。因為人類可能在2歲時感染大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌，所以整個出生組被列為免疫接種之相關群體。舉例而言，此可藉由對以下各者開始執行免疫接種方案來實現：在自出生至6個月大、自6個月至5歲的任何時間；妊娠期婦女(或生育年齡之女性)，從而藉由抗體之被動轉移保護其嬰兒；仍在子宮內之嬰兒；及大於50歲之個體。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包含FimH多肽，該FimH多肽包含具有選自由SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113或其任何組合組成之群之序列的胺基酸。在一些實施例中，組合物進一步包括選自具有表 1中之式，較佳式O1A、式O1B、式O2、式O6及式O25B，其中 n為1至100之整數，較佳31至100，之任何醣的醣。

在一個態樣中，本發明係關於一種包括與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 29或其任何組合具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性之多肽的組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括具有至少n個來自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 29中之任一者之連續胺基酸的多肽，其中n為7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20或更大)。在一些實施例中，該組合物進一步包括選自表 1中之任一式之醣，較佳為式O1A、式O1B、式O2、式O6及式O25B，其中 n為整數1至100，較佳31至100。

相關申請之交叉參考本申請案主張2021年10月11日申請之美國臨時申請案第63/254,195號、2021年2月1日申請之美國臨時申請案第63/144,058號及2020年10月27日申請之美國臨時申請案第63/106,077號的權益。前述各申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。

序列表之引用本申請案經由EFS-Web以電子方式申請且包括呈.txt格式之以電子方式提交之序列表。該.txt文件含有2020年10月26日創建且大小為160 KB之名稱為「PC72671_ST25.txt」之序列表。此.txt文件中所含之序列表為本說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。

本發明係關於一種包含大腸桿菌FimH多肽及O-抗原醣綴合物之組合物、用於產生且純化該等組合物之方法及使用該等組合物之方法。

在一個態樣中，本發明包括一種組合物，其包括本文所描述之FimH多肽或其片段。該組合物可包括適合於活體內投與之多肽或其片段。舉例而言，此類組合物中之多肽或其片段可具有以質量計至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之純度。在一實施例中，此類組合物中之多肽可具有至少95質量%之純度。在一實施例中，此類組合物中之多肽可具有至少97質量%之純度。在一實施例中，此類組合物中之多肽可具有至少98質量%之純度。在一實施例中，此類組合物中之多肽可具有至少99質量%之純度。該組合物可進一步包含佐劑。

在另一態樣中，本發明包括一種用於誘導針對大腸桿菌或大腸桿菌感染之免疫反應的組合物。亦揭示本文所描述之組合物用於誘導針對大腸桿菌或大腸桿菌感染之免疫反應的用途及本文所描述之組合物在製造用於誘導針對大腸桿菌或大腸桿菌感染之免疫反應的藥物中之用途。

本文中值的範圍之敍述僅僅意欲充當個別地提及處於該範圍內之每一單獨值的簡寫方法。除非本文中另外指示，否則每一個別值併入至本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。除非本文另外指明或與內容明顯矛盾，否則本文所描述之所有方法可以任何適合之順序進行。使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲進一步說明本發明且不對申請專利範圍之範疇造成限制。本說明書中之語言不應理解為指示任何未主張之要素對於實踐本發明而言必不可少。

在本說明書之整個文本中引用若干文獻。本文引用之各文獻(包括所有專利、專利申請案、科學公開案、製造商之說明書、說明等)無論在上文抑或下文，均以全文引用的方式併入本文中。不應將本文中之任何內容解釋為承認本發明無權先於此揭示內容。

定義如本文所使用，術語「約(about)」意謂大約或幾乎，且在本文所闡述之數值或範圍之情形下，在一個實施例中意謂±20%、±10%、±5%或±3%之所敍述或所主張之數值或範圍。

除非本文另外指示或明顯與上下文相矛盾，否則在描述本揭露內容之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)使用之術語「一(a/ an)」及「該」及類似參考物應理解為涵蓋單數及複數。

參考胺基酸序列(肽或蛋白質)之「片段」係指胺基酸序列之一部分，亦即表示在N端及/或C端處縮短之胺基酸序列的序列。在C端處縮短之片段(N端片段)可例如藉由轉譯截短之開讀框獲得，該開讀框不具有開讀框之3'端。在N端處縮短之片段(C端片段)可例如藉由轉譯截短之開讀框獲得，該開讀框不具有開讀框之5'端，只要該截短之開讀框包含用以起始轉譯之起始密碼子即可。胺基酸序列之片段包含例如來自胺基酸序列之至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%之胺基酸殘基。胺基酸序列之片段較佳包含來自胺基酸序列之至少6個，特定言之至少8個，至少12個、至少15個、至少20個、至少30個、至少50個或至少100個連續胺基酸。

如本文中所用，術語「野生型」或「WT」或「原生」係指在自然界中發現之胺基酸序列，包括對偶基因變異體。野生型胺基酸序列、肽或蛋白質具有未經有意修飾之胺基酸序列。

如本文中所用，胺基酸序列(肽、蛋白質或多肽)之「變異體」或「突變體」或提及「突變之」多肽包含胺基酸插入變異體/突變體、胺基酸添加變異體/突變體、胺基酸缺失變異體/突變體及/或胺基酸取代變異體/突變體。術語「變異體」或「突變體」包括所有突變體、剪接變異體、轉譯後修飾變異體、構形、同功型、對偶基因變異體、物種變異體及物種同源物，特定言之天然存在之彼等。術語「變異體」或「突變體」包括特定言之胺基酸序列之片段。

胺基酸插入變異體包含在特定胺基酸序列中插入單個或兩個或更多個胺基酸。在具有插入之胺基酸序列變異體的情況下，一或多個胺基酸殘基被插入至胺基酸序列之特定位點中，但亦可能藉由適當篩選所得產物進行隨機插入。胺基酸添加變異體包含一或多個胺基酸，諸如1、2、3、5、10、20、30、50個或更多個胺基酸的胺基及/或羧基端融合物。胺基酸缺失變異體之特徵為自序列中移除一或多個胺基酸，諸如移除1、2、3、5、10、20、30、50個或更多個胺基酸。缺失可能在蛋白質之任何位置中。包含在蛋白質之N端及/或C端處之缺失的胺基酸缺失變異體亦稱為N端及/或C端截短變異體。胺基酸取代變異體之特徵為移除序列中之至少一個殘基且在該位置插入另一殘基。較佳位於同源蛋白質或肽之間不保守之胺基酸序列位置中之修飾及/或用具有類似特性之其他胺基酸置換胺基酸。較佳地，肽及蛋白質變異體之胺基酸變化為保守性胺基酸變化，亦即類似地帶電或不帶電胺基酸之取代。保守性胺基酸變化涉及其側鏈中相關之胺基酸家族中之一者的取代。天然存在之胺基酸通常分成四個家庭：酸性(天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)及不帶電極性(甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)胺基酸。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時聯合分類為芳族胺基酸。在一個實施例中，保守胺基酸取代包括在以下群內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸；天冬醯胺、麩醯胺；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。

較佳地，指定胺基酸序列與作為該指定胺基酸序列之變異體的胺基酸序列之間的相似性，較佳一致性程度將為至少約60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。相似性或一致性程度較佳針對參考胺基酸序列之全長的至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%之胺基酸區域給出。舉例而言，若參考胺基酸序列由200個胺基酸組成，則相似性或一致性程度較佳針對至少約20個、至少約40個、至少約60個、至少約80個、至少約100個、至少約120個、至少約140個、至少約160個、至少約180個或約200個胺基酸，在一些實施例中為連續胺基酸給出。在一些實施例中，相似性或一致性程度針對參考胺基酸序列之全長給出。用於確定序列相似性，較佳序列一致性程度之比對可使用此項技術中已知之工具，較佳使用最佳序列比對，例如使用Align，其使用標準設置，較佳EMBOSS:針，基質：Blosum62，間隙開口10.0，間隙延伸0.5進行。

如本文中所用，「序列相似性」指示一致的或表示保守性胺基酸取代的胺基酸百分比。兩個胺基酸序列之間的「序列一致性」指示序列之間一致的胺基酸百分比。兩個核酸序列之間的「序列一致性」指示序列之間一致的核苷酸百分比。

術語「一致性%」、「一致性%」或類似術語意欲指特定言之在待比較之序列之間的最佳比對中一致的核苷酸或胺基酸之百分比。該百分比純粹為統計的，且兩個序列之間的差異可能但未必隨機分佈於待比較之序列的全長上。兩個序列之比較通常藉由在最佳比對之後相對於片段或「比較窗」比較序列來進行，以便鑑別相應序列之局部區域。用於比較之最佳比對可手動地或藉助於Smith及Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482之局部同源性算法、藉助於Neddleman及Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443之局部同源性算法、藉助於Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444之相似性搜尋算法或藉助於使用該等算法之電腦程式(在Wisconsin遺傳學軟體套件中之GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)進行。在一些實施例中，兩個序列之一致性百分比係使用如在美國國家生物技術資訊中心(NCBI)網站上(例如，blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq上)可獲得之BLASTN或BLASTP算法確定。在一些實施例中，用於NCBI網站上之BLASTN算法的算法參數包括：(i)期望臨限值設定為10；(ii)字長設定為28；(iii)詢問範圍中之最大匹配數設定為0；(iv)匹配/錯配評分設定為1、-2；(v)間隙成本設定為線性的；及(vi)用於正使用之低複雜度區域的過濾器。在一些實施例中，用於NCBI網站上之BLASTP算法的算法參數包括：(i)期望臨限值設定為10；(ii)字長設定為3；(iii)詢問範圍中之最大匹配數設定為0；(iv)基質設定為BLOSUM62；(v)間隙成本設定為存在：11延伸：1；及(vi)條件性組成評分基質調節。

一致性百分比係藉由確定待比較之序列對應的相同位置之數目，將此數值除以所比較之位置數(例如，參考序列中之位置數)且將此結果乘以100來獲得。

在一些實施例中，針對參考序列之全長的至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%的區域給出相似性或一致性程度。舉例而言，若參考核酸序列由200個核苷酸組成，則一致性程度係針對至少約100個、至少約120個、至少約140個、至少約160個、至少約180個或約200個核苷酸，在一些實施例中為連續核苷酸給出。在一些實施例中，相似性或一致性程度係針對參考序列之全長給出。

根據本發明，同源胺基酸序列展現出胺基酸殘基之至少40%，特定言之至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，且較佳至少95%、至少98%或至少99%一致性。本文所描述之胺基酸序列變異體/突變體可藉由熟習此項技術者容易地製備，例如藉由重組DNA操縱。用於製備具有取代、添加、插入或缺失之肽或蛋白質之DNA序列的操縱詳細描述於例如Sambrook等人(1989)中。此外，本文所描述之肽及胺基酸變異體可容易地藉助於已知肽合成技術，諸如藉由固相合成及類似方法製備。

在一個態樣中，胺基酸序列(肽或蛋白質)之片段或變異體/突變體較佳為「功能片段」或「功能變異體」。胺基酸序列之術語「功能片段」或「功能變異體/突變體」係指展現出與其所衍生之胺基酸序列相同或類似之一或多個功能特性，亦即其功能上為等效的任何片段或變異體/突變體。關於抗原或抗原序列，一種特定功能為藉由自片段或變異體衍生之胺基酸序列呈現的一或多種免疫原性活性。如本文中所用，術語「功能片段」或「功能變異體/突變體」特定言之係指包含胺基酸序列之變異體/突變體分子或序列，該胺基酸序列與親體分子或序列相比改變一或多個胺基酸且仍能夠滿足親體分子或序列之功能中之一或多者，例如誘導免疫反應。在一個態樣中，親體分子或序列之胺基酸序列中之修飾未顯著影響或改變該分子或序列之特徵。在不同實施例中，功能片段或功能變異體之功能可能降低但仍顯著存在，例如功能變異體之免疫原性可為親體分子或序列之至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。然而，在其他實施例中，功能片段或功能變異體之免疫原性可與親體分子或序列相比得以增強。

如本文所用，術語「經分離的」意謂自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活的動物中之核酸或肽並非「經分離的」，但自其天然狀態之共存物質部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離的」。經分離之核酸或蛋白質可以實質上純化形式存在，或可存在於諸如宿主細胞之非原生環境中。

I. 衍生自大腸桿菌之多肽及其片段在一個態樣中，本文揭示一種哺乳動物細胞，其包括編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的聚核苷酸。如本文所用之術語「衍生自……」係指包含如本文所描述之FimH多肽或FimCH多肽複合物或其片段之胺基酸序列的多肽，該胺基酸序列已藉由引入胺基酸殘基取代、缺失或添加而改變。較佳地，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的序列。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段之序列具有至少85%之一致性。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段之序列具有至少90%之一致性。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段之序列具有至少95%之一致性。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段之序列具有至少98%之一致性。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段之序列具有至少99%之一致性。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段與相應野生型FimH多肽或FimCH多肽複合物或其片段具有一致的胺基酸總長度。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽與相應野生型FimH多肽或FimCH多肽複合物具有一致的胺基酸總長度。

片段應包括來自序列之至少n個連續的胺基酸，且視特定序列而定，n為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20或更多)。較佳地，片段包括來自序列之抗原決定基。在一些實施例中，片段包括衍生自大腸桿菌之多肽之胺基酸序列的至少50個連續胺基酸殘基、至少100個連續胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基、至少150個連續胺基酸殘基、至少175個連續胺基酸殘基、至少200個連續胺基酸殘基或至少250個連續胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，片段包括衍生自大腸桿菌之多肽之胺基酸序列的至少50個連續胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，片段包括衍生自大腸桿菌之多肽之胺基酸序列的至少100個連續胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，片段包括衍生自大腸桿菌之多肽之胺基酸序列的至少150個連續胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，片段包括衍生自大腸桿菌之多肽之胺基酸序列的至少200個連續胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，片段包括衍生自大腸桿菌之多肽之胺基酸序列的至少250個連續胺基酸殘基的胺基酸序列。

在一些實施例中，與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段相比，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括一或多個非典型胺基酸。

如本文所使用，術語「FimH多肽」係指藉由引入胺基酸取代、缺失或添加而改變之如本文所描述之任何FimH多肽或其片段、全長野生型大腸桿菌FimH多肽之任何FimH域、全長野生型大腸桿菌FimH多肽或全長大腸桿菌FimH多肽之域的任何組合。舉例而言，在一個實施例中，本發明提供一種FimH多肽，其為FimH _LD多肽或FimH-DSG多肽。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段具有與相應野生型FimH多肽或其片段相似或相同的功能。

在一較佳實施例中，本發明之多肽或多肽複合物或其片段經分離或純化。

在一些實施例中，編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的聚核苷酸經整合至哺乳動物細胞之基因體DNA中，且當在適合之條件下培養時，該衍生自大腸桿菌之多肽或其片段由哺乳動物細胞表現。

在一較佳實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段為可溶的。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段係自哺乳動物宿主細胞分泌。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可包括額外胺基酸殘基，諸如N端或C端延伸部分。此類延伸部分可包括一或多個標籤，其可促進多肽或其片段之偵測(例如用於單株抗體偵測之抗原決定基標籤)及/或純化(例如允許在鎳螯合樹脂上純化之聚組胺酸標籤)。在一些實施例中，標籤包括選自SEQ ID NO: 21及SEQ ID NO: 25中之任一者的胺基酸序列。此類親和純化標籤為此項技術中已知的。親和純化標籤之實例包括例如His標籤(六組胺酸，其可例如與金屬離子結合)；麥芽糖結合蛋白質(MBP)，其可例如與直鏈澱粉結合)；麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)，其可例如與麩胱甘肽結合；FLAG標籤，其可例如與抗flag抗體結合)；Strep標籤，其可例如與鏈黴抗生物素蛋白或其衍生物結合)。在較佳實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段不包括額外胺基酸殘基，諸如N端或C端延伸部分。在一些實施例中，本文所描述之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段不包括外源性標籤序列。

雖然本文中可能提及大腸桿菌之特定菌株，但應理解，除非指明，否則衍生自大腸桿菌之多肽或其片段不限於特定菌株。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段包括在多肽之N端處的苯丙胺酸殘基。在一些實施例中，衍生自FimH之多肽或其片段包括在N端之前20個殘基位置內的苯丙胺酸殘基。較佳地，苯丙胺酸殘基位於多肽之位置1。舉例而言，在一些實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段不包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段之N端處的額外甘胺酸殘基。

在一些實施例中，野生型成熟大腸桿菌FimH之位置1處的苯丙胺酸殘基經脂族疏水性胺基酸，諸如Ile、Leu及Val殘基中之任一者置換。

在一些實施例中，訊號肽可用於表現衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。用於產生蛋白質之訊號序列及表現卡匣為此項技術中已知的。一般而言，前導肽為5-30個胺基酸長，且通常存在於新合成之多肽的N端。訊號肽一般含有具有形成單一α-螺旋之趨勢的長段疏水性胺基酸。另外，許多訊號肽以一段短的帶正電荷之胺基酸開始，其可有助於在易位期間加強多肽之適當拓樸結構。在訊號肽之末端，通常存在一段由訊號肽酶識別且裂解之胺基酸。訊號肽酶可在易位期間或在易位完成後裂解，以產生游離訊號肽及成熟蛋白。在一些實施例中，訊號肽包括與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 22中之任一者具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或100%之一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，訊號肽包括與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 22中之任一者具有至少99%之一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，訊號肽具有選自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 22中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可包括可裂解連接子。此類連接子允許標籤與經純化之複合物分離，例如藉由添加能夠裂解連接子之試劑。可裂解連接子為此項技術中已知的。此類連接子可例如藉由照射光不穩定鍵或酸催化之水解來裂解。可裂解連接子之另一實例包括多肽連接子，其併有蛋白酶識別位點且可藉由添加適合之蛋白酶而裂解。

在一些實施例中，與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段相比，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括修飾。修飾可包括分子與多肽之共價連接。舉例而言，此類修飾可包括醣基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、由已知保護基/阻隔基衍生化、蛋白水解裂解、與細胞配位體或其他蛋白質之連接等。在一些實施例中，與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或片段相比，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可包括修飾，諸如藉由使用熟習此項技術者已知之技術進行化學修飾，包括但不限於特定化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素(tunicamycin)之代謝合成等。在另一實施例中，修飾可包括脂質分子與多肽之共價連接。在一些實施例中，與相應野生型大腸桿菌FimH多肽或其片段相比，多肽不包括分子與多肽之共價連接。

舉例而言，細胞培養物中產生之蛋白質及多肽可為含有共價連接之碳水化合物結構(包括寡醣鏈)之醣蛋白。此等寡醣鏈經由N-連接或O-連接與蛋白質連接。寡醣鏈可佔醣蛋白質量之相當大的一部分。一般而言，N-連接之寡醣添加至Asn-X-Ser/Thr之目標共有序列內之天冬醯胺殘基之側鏈上的胺基，其中X可為除脯胺酸外之任何胺基酸。在一些實施例中，醣基化位點包括選自以下中之任一者之胺基酸序列：天冬醯胺-甘胺酸-蘇胺酸(NGT)、天冬醯胺-異白胺酸-蘇胺酸(NIT)、天冬醯胺-甘胺酸-絲胺酸(NGS)、天冬醯胺-絲胺酸-蘇胺酸(NST)及天冬醯胺-蘇胺酸-絲胺酸(NTS)。在哺乳動物細胞中產生之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可經醣基化。醣基化可發生在衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之序列中的N-連接之醣基化訊號Asn-Xaa-Ser/Thr處。「N-連接之醣基化」係指碳水化合物部分經由GIcNAc附接至多肽鏈中之天冬醯胺殘基。N-連接之碳水化合物含有常見的Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R核心結構，其中R表示所產生之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的天冬醯胺殘基。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段中之醣基化位點係藉由衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之序列內的突變而移除。舉例而言，在一些實施例中，醣基化模體(Asn-Xaa-Ser/Thr)之Asn殘基可較佳藉由取代而經突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Ser、Asp、Thr及Gln中之任一者。

在一些實施例中，醣基化模體之Ser殘基可較佳藉由取代而經突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Asp、Thr及Gln中之任一者。

在一些實施例中，醣基化模體之Thr殘基可較佳藉由取代而經突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Ser、Asp及Gln中之任一者。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段中之醣基化位點(諸如Asn-Xaa-Ser/Thr)未經移除或修飾。在一些實施例中，可將降低或抑制醣基化之化合物添加至細胞培養基中。在此類實施例中，多肽或蛋白質與在其他方面相同之條件下但不存在醣基化抑制化合物之情況下由細胞產生之其他方面相同的多肽或蛋白質相比，多包括至少一個未醣基化(亦即去醣基化)位點，亦即完全未佔據之聚醣位點，且無碳水化合物部分與其附接，或在相同的潛在醣基化位點處少包含至少一個碳水化合物部分。此類化合物為此項技術中已知的，且可包括但不限於衣黴素、衣黴素同系物、鏈病毒菌素(streptovirudin)、殺枝孢菌素(mycospocidin)、安福黴素(amphomycin)、津枝黴素(tsushimycin)、抗生素24010、抗生素MM 19290、枯草菌素(bacitracin)、棒狀桿菌毒素(corynetoxin)、焦土黴素(showdomycin)、金黴素(duimycin)、1-去氧甘露糖野尻黴素(1-deoxymannonojirimycin)、去氧野尻黴素(deoxynojirimycin)、N-甲基-1-去氧甘露糖野尻黴、布雷非德菌素A (brefeldin A)、葡萄糖及甘露糖類似物、2-去氧-D-葡萄糖、2-去氧葡萄糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)半乳糖、2-去氧-2-氟-D-葡萄糖、1,4-二去氧-1,4-亞胺基-D-甘露醇(DIM)、氟葡萄糖、氟甘露糖、UDP-2-去氧葡萄糖、GDP-2-去氧葡萄糖、羥甲基戊二醯-CoA還原酶抑制劑、25-羥基膽固醇、羥基膽固醇、苦馬豆素(swainsonine)、環己醯亞胺、嘌呤黴素(puromycin)、放線菌素D (actinomycin D)、莫能菌素(monensin)、間氯羰基氰化物苯腙(CCCP)、密實菌素(compactin)、多萜基-磷醯基^-去氧葡萄糖、N-乙醯基-D-葡糖胺、次黃嘌呤、胸苷、膽固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗樹精胺(castanospermine)、麩醯胺酸、溴環己烯四醇(bromoconduritol)、環己烯四醇環氧化物(conduritol epoxide)及環己烯四醇衍生物、醣基甲基對硝基苯基三氮烯、β-羥基正纈胺酸、蘇-β-氟天冬醯胺、D-(+)-葡萄糖酸δ-內酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、磷酸十二烷基酯、(二苯基甲基)-磷酸之2-二甲胺基乙酯、[2-(二苯基氧膦基氧基)乙基]三甲基碘化銨、碘乙酸酯及/或氟乙酸酯。一般熟習此項技術者將容易認識到或將能夠確定可根據本發明之方法及組合物使用之醣基化抑制物質，而無需過度實驗。在此類實施例中，可控制多肽或其片段之醣基化，而無需將胺基酸突變引入多肽或其片段中。

在一些實施例中，由哺乳動物細胞產生之多肽或其片段之醣基化含量(例如多肽或其片段上所佔據之聚醣位點數目、該位點處醣型之大小及/或複雜性及其類似者)低於在其他條件都相同下在缺乏此類糖酵解抑制化合物及/或突變之其他方面相同的培養基中產生之多肽或其片段的醣基化含量。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的序列不包括N-連接之蛋白質醣基化位點。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的序列不包括至少一個N連接之蛋白質醣基化位點。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的序列不包括任何N連接之蛋白質醣基化位點。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的序列包括N連接之蛋白質醣基化位點。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的序列包括至多1個N連接之蛋白質醣基化位點。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的序列包括至多2個N連接之蛋白質醣基化位點。

由不同細胞株表示且在轉殖基因動物中之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可具有與彼此相比不同的聚醣位點佔有率、醣型及/或醣基化模式。在一些實施例中，本發明涵蓋衍生自大腸桿菌之多肽或其片段，而不管在哺乳動物細胞中產生之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的醣基化、聚醣佔有率或醣型模式。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可衍生自大腸桿菌FimH多肽，其中該多肽之位置1處的胺基酸殘基為苯丙胺酸，而非甲硫胺酸，例如具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2之多肽。較佳地，衍生自大腸桿菌FimH之多肽包含衍生自大腸桿菌之多肽的胺基酸序列之位置1處的苯丙胺酸。在另一較佳實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3，較佳其中衍生自大腸桿菌之多肽之胺基酸序列的位置1處的殘基為苯丙胺酸。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可包括胺基酸序列SEQ ID NO: 4，其可衍生自大腸桿菌FimH多肽。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者具有至少95%之一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者具有至少99%之一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可衍生自大腸桿菌FimG多肽，例如具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可衍生自大腸桿菌FimC多肽，例如具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10。

A. 衍生自大腸桿菌FimH之多肽及其片段在一較佳實施例中，多肽或其片段衍生自大腸桿菌FimH。在一些實施例中，多肽或其片段包括全長大腸桿菌FimH。全長FimH包括兩個域：N端凝集素域及C端菌毛蛋白域，其藉由短連接子連接。在一些實施例中，大腸桿菌FimH之全長包括279個胺基酸，其包括大腸桿菌FimH之成熟蛋白的全長。在一些實施例中，大腸桿菌FimH之全長包括300個胺基酸，其包括大腸桿菌FimH之成熟蛋白的全長及長度為21個胺基酸之訊號肽序列。300個胺基酸長的野生型FimH之一級結構高度保存於大腸桿菌菌株中。

全長大腸桿菌FimH之例示性序列為SEQ ID NO: 1。全長FimH序列包括凝集素域之序列及菌毛蛋白域之序列。FimH之凝集素域含有碳水化合物識別域，其負責結合至尿道上皮細胞表面上之甘露醣基化尿溶蛋白1a。菌毛蛋白域經由後續FimG次單元之供體股錨定至菌毛之核心，其為稱為供體股補充之過程。

自N端開始，名稱及括弧中之全長FimH之各域的例示性胺基酸序列如下：FimH凝集素(SEQ ID NO: 2)及FimH菌毛蛋白(SEQ ID NO: 3)。

衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者具有不同程度之一致性的變異體，諸如與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的變異體。其他適合之多肽與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113具有至少95%之一致性。其他適合之多肽與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113具有至少99%之一致性。在某些實施例中，FimH變異體蛋白質：(i)形成FimH-FimC之一部分；(ii)包含來自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113之至少一個抗原決定基；及/或(iii)可在活體內引發與大腸桿菌FimH免疫交叉反應之抗體。

在一些實施例中，組合物包括具有至少n個來自以下中之任一者的連續胺基酸之多肽：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113，其中n為7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20或更大)。較佳地，片段包括來自序列之抗原決定基。在一些實施例中，組合物包括具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者之胺基酸序列的至少50個連續胺基酸殘基、至少100個連續胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基、至少150個連續胺基酸殘基、至少175個連續胺基酸殘基、至少200個連續胺基酸殘基或至少250個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，組合物包括具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者之至少50個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，組合物包括具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者之至少100個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，組合物包括具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者之至少200個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，組合物包括具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者之胺基酸序列的至少250個連續胺基酸殘基的多肽。

在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 1具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 1具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 1具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 1具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 1中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 2具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 2具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 2具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 2具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 2中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 3中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 4具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 4具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 4具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 4具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 4中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 5具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 5具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 5具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 5具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 5中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 6具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 6具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 6具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 6具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 6中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 20具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 20具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 20具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 20具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 20中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 23具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 23具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 23具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 23具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 23中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 24中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 26中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 27具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 27具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 27具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 27具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 27中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 28具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 28具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 28具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 28具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 28中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 29具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 29具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 29具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 29具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 29中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 110中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 111中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 112具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 112具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 112具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 112具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 112中所闡述之多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 113具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 113具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 113具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 113具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 113中所闡述之多肽。

本文所描述之衍生自大腸桿菌FimH之適合之多肽及其片段的另一實例顯示為SEQ ID NO: 2，其缺乏野生型N端訊號序列且對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基22-300。FimH片段之另一實例包括完整N端訊號序列及成熟蛋白，諸如SEQ ID NO: 1中所闡述。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段中之醣基化位點係藉由衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之序列內的突變而移除。舉例而言，在一些實施例中，成熟大腸桿菌FimH多肽之位置7處的Asn殘基(例如，根據SEQ ID NO: 2之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，大腸桿菌FimH多肽之凝集素域的位置7處的Asn殘基(例如，根據SEQ ID NO: 3之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Ser、Asp、Thr及Gln中之任一者。

在一些實施例中，成熟大腸桿菌FimH多肽之位置10處的Thr殘基(例如，根據SEQ ID NO: 2之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，大腸桿菌FimH多肽之凝集素域的位置7處的Thr殘基(例如，根據SEQ ID NO: 3之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Ser、Asp及Gln中之任一者。

在一些實施例中，成熟大腸桿菌FimH多肽之位置N235處的Asn殘基(例如，根據SEQ ID NO: 2之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，成熟大腸桿菌FimH多肽之位置N228處的Asn殘基(例如，根據SEQ ID NO: 2之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Ser、Asp、Thr及Gln中之任一者。

在一些實施例中，成熟大腸桿菌FimH多肽之位置70處的Asn殘基(例如，根據SEQ ID NO: 2之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，大腸桿菌FimH多肽之凝集素域的位置70處的Asn殘基(例如，根據SEQ ID NO: 3之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Ser、Asp、Thr及Gln中之任一者。

在一些實施例中，成熟大腸桿菌FimH多肽之位置72處的Ser殘基(例如，根據SEQ ID NO: 2之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，大腸桿菌FimH多肽之凝集素域的位置72處的Ser殘基(例如，根據SEQ ID NO: 3之編號)可較佳藉由取代來突變。在一些實施例中，殘基取代係選自Asp、Thr及Gln中之任一者。

如本文所用，術語「片段」係指多肽且定義為該多肽所特有或特徵性的給定多肽之任何離散部分。如本文所用之術語亦指給定多肽之任何離散部分，其保留至少一部分全長多肽之活性。在某些實施例中，保留的活性部分為全長多肽之活性的至少10%。在某些實施例中，保留的活性部分為全長多肽之活性的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，保留的活性部分為全長多肽之活性的至少95%、96%、97%、98%或99%。在某些實施例中，保留的活性部分為全長多肽之活性的100%或更多。在一些實施例中，片段包括至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個全長多肽之連續胺基酸。

B. FimH、FimC及其片段之複合物在一些實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段存在於與衍生自大腸桿菌FimC之多肽或其片段的複合物中。在一較佳實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段及衍生自大腸桿菌FimC之多肽或其片段以複合物形式存在，較佳以複合物中之1:1比率存在。不受理論或機制束縛，全長FimH可藉由周質伴隨蛋白FimC穩定在活性構形中，藉此使得有可能純化全長FimH蛋白質。因此，在一些實施例中，多肽或其片段包括全長FimH及全長FimC。

在一些實施例中，多肽或其片段包括FimH之片段及FimC之片段。在一些實施例中，多肽或其片段包括全長FimH及FimC之片段。大腸桿菌FimC之例示性序列闡述於SEQ ID NO: 10中。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括FimH之複合物形成片段。

FimH之複合物形成片段可為保留與FimC或其片段形成複合物之能力的FimH蛋白質之任何部分或部分。FimH之適合的複合物形成片段亦可藉由此項技術中已知之標準分析得到或確定，諸如共免疫沈澱分析、藉由螢光染色之交聯或共定位等。亦可使用SDS-PAGE或西方墨點(例如藉由如凝膠電泳所證明，FimH片段及FimC或其片段呈複合物形式)。在某些實施例中，FimH之複合物形成片段(i)形成FimH-FimC複合物之一部分；(ii)包含至少一個來自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111之抗原決定基；及/或(iii)可活體內引發抗體與大腸桿菌FimH發生免疫交叉反應。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括全長FimH，其中該FimH不與FimC複合。在其他實施例中，多肽或其片段包括FimH之片段，其中該片段不與FimC複合。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段FimC包括SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，複合物可自相同質體表現，較佳在各多肽或其片段之單獨啟動子的控制下。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段結合至衍生自大腸桿菌FimC之多肽或其片段，其可經工程化至衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段的結構中。結合至複合物中之FimH的FimC分子之部分稱為「供體股」，且使用來自結合至FimCH複合物中之FimH的FimC之股形成天然FimH結構之機制稱為「供體股互補」。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段可藉由FimH之適當供體股互補型式表示，其中與FimCH複合物中之FimH相互作用的FimC之胺基酸序列本身在FimH之C端進行工程化，以提供天然構形，而不需要存在該FimC分子之剩餘部分。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段可以包括其經分離域之複合物形式表現，諸如凝集素結合域及菌毛蛋白域，且此類域可共價或非共價連接在一起。舉例而言，在一些實施例中，連接片段可包括胺基酸序列或其他寡聚結構，包括簡單聚合物結構。

本發明之方法及組合物可包括本文所描述之複合物，其中衍生自大腸桿菌之該等多肽或其片段經共表現或以組合狀態形成。

C. 凝集素域、菌毛蛋白域及其變異體 FimH之凝集素域的構形及配位體結合特性可在FimH之菌毛蛋白域的異位控制下。在靜態條件下，全長FimH之兩個域的相互作用使凝集素域在較低親和力下穩定成單甘露糖狀態(例如 K _d 約300 µM)，其特徵為淺結合袋(shallow binding pocket)。結合至甘露糖甘配位體可誘導構形變化，從而產生中等親和力狀態，其中凝集素及菌毛蛋白域保持緊密接觸。然而，在剪應力時，凝集素可與菌毛蛋白域分開且誘導較高親和力狀態(例如， K _d＜1.2 µM)。

因為不存在由菌毛蛋白域施加之負變構調節，所以FimH之經分離凝集素域被鎖定在較高親和力狀態下(例如， K _d＜1.2 µM)。經分離重組凝集素域經鎖定在較高親和力狀態。然而，以較低親和力構形鎖定黏附素(例如 K _d約300 µM)誘發產生抑制黏附之抗體。因此，關注使凝集素域在低親和力狀態下穩定。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括大腸桿菌FimH之凝集素域。凝集素域之例示性序列包括SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之任一者。在一些實施例中，大腸桿菌FimH之凝集素域包括半胱胺酸取代。在一較佳實施例中，大腸桿菌FimH之凝集素域包括在凝集素域之前50個胺基酸殘基內的半胱胺酸取代。在一些實施例中，凝集素域可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個半胱胺酸取代。較佳地，凝集素域包括2個半胱胺酸取代。參見例如pSB02158及pSB02198。

衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 3具有不同程度一致性的FimH凝集素域變異體，諸如與SEQ ID NO: 3所闡述之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 3具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 3中所闡述之多肽。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括大腸桿菌FimH之菌毛蛋白域。衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 7具有不同程度一致性的FimH菌毛蛋白域變異體，諸如與SEQ ID NO: 7所闡述之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 7具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 7具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 7具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 7具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 7中所闡述之多肽。衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 8具有不同程度一致性的FimH凝集素域變異體，諸如與SEQ ID NO: 8所闡述之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 8具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 8具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 8具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 8具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 8中所闡述之多肽。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括大腸桿菌FimH之菌毛蛋白域。衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 24具有不同程度一致性的FimH菌毛蛋白域變異體，諸如與SEQ ID NO: 24所闡述之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 24具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 24中所闡述之多肽。衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 26具有不同程度一致性的FimH凝集素域變異體，諸如與SEQ ID NO: 26所闡述之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 26具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 26中所闡述之多肽。衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 110具有不同程度一致性的FimH凝集素域變異體，諸如與SEQ ID NO: 110所闡述之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 110具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 110中所闡述之多肽。衍生自大腸桿菌FimH之其他適合之多肽及其片段包括與SEQ ID NO: 111具有不同程度一致性的FimH凝集素域變異體，諸如與SEQ ID NO: 111所闡述之序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致性。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少90%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少95%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括與SEQ ID NO: 111具有至少99%之一致性的多肽。在一些實施例中，組合物包括如SEQ ID NO: 111中所闡述之多肽。

在一些實施例中，組合物包括具有至少n個來自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之任一者的連續胺基酸之多肽，其中n為7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20或更大)。較佳地，片段包括來自序列之抗原決定基。在一些實施例中，該組合物包括具有SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之任一者之胺基酸序列的至少50個連續胺基酸殘基、至少100個連續胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基、至少150個連續胺基酸殘基、至少175個連續胺基酸殘基、至少200個連續胺基酸殘基或至少250個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，該組合物包括具有SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之任一者的至少50個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，該組合物包括具有SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之任一者的至少100個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，該組合物包括具有SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之任一者的至少150個連續胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，該組合物包括具有SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之任一者之胺基酸序列的至少250個連續胺基酸殘基的多肽。

大腸桿菌FimH或其同源物或變異體之凝集素域的位置及長度可基於其序列與SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 110及SEQ ID NO: 111中之一者的成對比對來預測，例如藉由將FimH之胺基酸序列與SEQ ID NO: 1比對，且鑑別與SEQ ID NO: 1之殘基22-179比對的序列。

D. 野生型N端訊號序列在一些實施例中，全長FimH之N端野生型訊號序列在宿主細胞中裂解以產生成熟FimH多肽。因此，由宿主細胞表現之FimH可能缺乏N端訊號序列。在較佳實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可由缺乏野生型N端訊號序列之編碼序列的核苷酸序列編碼。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括FimH之形成FimH-FimC複合物之片段、N端訊號序列(諸如SEQ ID NO: 1之殘基1-21)或其組合。FimH之複合物形成片段可為保留與FimC形成複合物之能力的FimH蛋白質之任何部分或部分。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可能在全長FimH多肽之N端及/或C端處缺乏1與21個之間的胺基酸殘基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個胺基酸殘基，或缺乏1至21個殘基、1至20個殘基、1至15個殘基、1至10個殘基、2至20個殘基、2至15個殘基、2至10個殘基、5至20個殘基、5至15個殘基或5至10個殘基)，該胺基酸殘基可包括訊號序列、凝集素域及菌毛蛋白域。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之N端處缺乏1-21個殘基。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之N端處缺乏1-10個殘基。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之N端處缺乏5-15個殘基。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之N端處缺乏5-10個殘基。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之C端處缺乏1-21個殘基。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之C端處缺乏1-10個殘基。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之C端處缺乏5-15個殘基。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段在全長FimH多肽之C端處缺乏5-10個殘基。

II. 核酸在一個態樣中，揭示編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的核酸。編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的一或多個核酸構築體可用於衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的基因體整合及後續表現。舉例而言，可將編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的單一核酸構築體引入至宿主細胞中。或者，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的編碼序列可由兩個或更多個核酸構築體攜帶，其隨後同時或依次引入宿主細胞中。

舉例而言，在一個例示性實施例中，單一核酸構築體編碼大腸桿菌FimH之凝集素域及菌毛蛋白域。在另一例示性實施例中，一個核酸構築體編碼凝集素域，且第二核酸構築體編碼大腸桿菌FimH之菌毛蛋白域。在一些實施例中，實現基因體整合。

核酸構築體可包含基因體DNA，其包含一或多個內含子或cDNA。當存在內含子時，一些基因更有效地表現。在一些實施例中，核酸序列適用於在該哺乳動物細胞中表現外源性多肽。

在一些實施例中，編碼多肽或其片段之核酸經密碼子最佳化以增加任何特定細胞中之表現量。

在一些實施例中，核酸構築體包括編碼引導衍生自大腸桿菌之多肽或其片段分泌之肽的訊號序列。在一些實施例中，核酸包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽的天然訊號序列。在衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括內源性訊號序列的一些實施例中，編碼訊號序列之核酸序列可經密碼子最佳化以增加蛋白質在宿主細胞中之表現量。

在一些實施例中，訊號序列為以下長度中之任一者：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30個胺基酸長。在一些實施例中，訊號序列為20個胺基酸長。在一些實施例中，訊號序列為21個胺基酸長。

在一些實施例中，在多肽或其片段包括訊號序列時，與多肽天然締合之內源性訊號序列可經不與野生型多肽締合之訊號序列置換，以改進經培養細胞中之多肽或其片段的表現量。因此，在一些實施例中，核酸不包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的天然訊號序列。在一些實施例中，核酸不包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽的天然訊號序列。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可由異源性肽表現，該異源性肽較佳為在成熟蛋白或衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之N端處具有特定裂解位點的訊號序列或其他肽。舉例而言，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段可由異源性肽(例如IgK訊號序列)表現，該異源性肽較佳為在成熟大腸桿菌FimH蛋白質之N端處具有特定裂解位點的訊號序列或其他肽。在較佳實施例中，成熟蛋白大腸桿菌FimH之N端處的特定裂解位點緊接著在成熟大腸桿菌FimH蛋白質之初始苯丙胺酸殘基之前發生。所選異源性序列較佳為經宿主細胞識別且處理(亦即藉由訊號肽酶裂解)之序列。

在較佳實施例中，訊號序列為IgK訊號序列。在一些實施例中，核酸編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，核酸編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，核酸編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 22。在較佳實施例中，訊號序列為小鼠IgK訊號序列。

用於產生衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的適合之哺乳動物表現載體為此項技術中已知的且可商購的，諸如來自Invitrogen™之pSecTag2表現載體。例示性小鼠Ig κ訊號肽序列包括序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 54)。在一些實施例中，載體包括來自Thermo Fisher之pBudCE4.1哺乳動物表現載體。額外例示性及適合之載體包括pcDNA™3.1哺乳動物表現載體(Thermo Fisher)。

在一些實施例中，訊號序列不包括紅血球凝集素訊號序列。

在一些實施例中，核酸包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的天然訊號序列。在一些實施例中，訊號序列不為IgK訊號序列。在一些實施例中，訊號序列包括紅血球凝集素訊號序列。

在一個態樣中，本文揭示包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之編碼序列的載體。例示性載體包括能夠自主複製或在哺乳動物細胞中複製的質體。典型表現載體含有適合之啟動子、強化子及終止子，其適用於調節表現構築體中之編碼序列的表現。載體亦可包括選擇標記物，以提供用於選擇經轉化宿主細胞之表型特點(諸如賦予對抗生素，諸如安比西林或新黴素之抗性)。

適合之啟動子為此項技術中已知的。例示性啟動子包括例如CMV啟動子、腺病毒、EF1 a、GAPDH金屬硫蛋白啟動子、SV-40早期啟動子、SV-40晚期啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子等。啟動子可為組成性或誘導性的。可使用一或多種載體(例如編碼所有次單元或域或其片段之一種載體，或一起編碼次單元或域或其片段之多種載體)。

亦可使用內部核糖體入口位點(IRES)及2A肽序列。IRES及2A肽提供用於共表現多個序列之替代性方法。IRES為允許信使RNA (mRNA)序列中間之轉譯起始作為蛋白質合成之較大過程之一部分的核苷酸序列。通常，在真核生物中，轉譯可僅在mRNA分子之5'端處起始。IRES元件允許在一個轉錄物中之多個基因之表現。表現來自一個轉錄物中之多個蛋白質的IRES類多順反子載體可減少非表現純系自選擇中之逃逸。2A肽允許多個蛋白質在單個開讀框中轉譯為聚合蛋白質，其隨後經由核糖體跳躍機制裂解為個別蛋白質。2A肽可提供多個蛋白質產物之更平衡的表現。例示性IRES序列包括例如EV71 IRES、EMCV IRES、HCV IRES。對於基因體整合，整合可為定點的或隨機的。定點重組可藉由將同源序列引入本文所描述之核酸構築體中實現。此類同源序列實質上匹配宿主基因體中之特定目標位點處的內源性序列。替代地，可使用隨機整合。有時，蛋白質之表現量可視整合位點而變化。因此，可能需要根據重組蛋白質表現量選擇許多純系以鑑別實現所需表現量之純系。

例示性核酸構築體進一步描述於圖式中，諸如圖 2A-2T中之任一者。

在一個態樣中，核酸序列編碼與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113中之任一者具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或100%之一致性的胺基酸序列。

III. 宿主細胞在一個態樣中，本發明係關於細胞，其中編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的序列在哺乳動物宿主細胞中表現。在一個實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段短暫表現於宿主細胞中。在另一實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段穩定整合至宿主細胞之基因體中，且當在適合之條件下培養時，表現衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。在一較佳實施例中，聚核苷酸序列以高效率及基因體穩定性表現。

適合之哺乳動物宿主細胞為此項技術中已知的。較佳地，宿主細胞適用於在工業製造規模下產生蛋白質。例示性哺乳動物宿主細胞包括以下中之任一者及其衍生物：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞(衍生自猴(非洲綠猴)腎臟之細胞株)、Vero細胞、Hela細胞、嬰兒倉鼠腎臟(BHK)細胞、人類胚胎腎臟(HEK)細胞、NSO細胞(鼠類骨髓瘤細胞株)及C127細胞(無致瘤性小鼠細胞株)。其他例示性哺乳動物宿主細胞包括小鼠Sertoli (TM4)、水牛鼠肝(BRL 3A)、小鼠乳房腫瘤(MMT)、大鼠肝癌(HTC)、小鼠骨髓瘤(NSO)、鼠類融合瘤(Sp2/0)、小鼠胸腺瘤(EL4)、中國倉鼠卵巢(CHO)及CHO細胞衍生物、鼠類胚胎(NIH/3T3，3T3 Li)、大鼠心肌(H9c2)、小鼠成肌細胞(C2C12)及小鼠腎臟(miMCD-3)。哺乳動物細胞株之其他實例包括NS0/1、Sp2/0、Hep G2、PER.C6、COS-7、TM4、CV1、VERO-76、MDCK、BRL 3A、W138、MMT 060562、TR1、MRC5及FS4。

對細胞培養敏感之任何細胞均可根據本發明使用。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。可根據本發明使用之哺乳動物細胞之非限制性實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤細胞株(NSO/l，ECACC第85110503號)；人類視網膜母細胞(PER.C6，CruCell，Leiden，The Netherlands)；經SV40轉型之猴腎臟CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(經次選殖以便在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人, J. Gen Virol., 36:59,1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR (CHO，Urlaub and Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell) (TM4，Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝臟細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人, Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤株(Hep G2)。在一些較佳實施例中，細胞為CHO細胞。在一些較佳實施例中，細胞為GS細胞。

另外，任何數目之可商購獲得及不可商購獲得之融合瘤細胞株均可根據本發明使用。如本文所用，術語「融合瘤」係指由永生化細胞及產生抗體之細胞的融合產生之細胞或細胞後代。此類所得融合瘤為產生抗體之永生化細胞。用於產生融合瘤之個別細胞可來自任何哺乳動物來源，包括但不限於大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊及人類。在一些實施例中，融合瘤為三源融合瘤細胞株，其在作為在人類細胞與鼠類骨髓瘤細胞株之間融合的產物之雜交骨髓瘤融合物之後代隨後與漿細胞融合時得到。在一些實施例中，融合瘤為產生抗體，諸如四源融合瘤，之任何永生化雜交細胞株(參見例如Milstein等人, Nature, 537:3053, 1983)。熟習此項技術者將瞭解，融合瘤細胞株可具有不同營養需求及/或可需要不同培養條件以實現最佳生長，且將能夠視需要修改條件。

在一些實施例中，細胞包含第一相關基因，其中第一相關基因經染色體整合。在一些實施例中，第一相關基因包含報導基因、選擇基因、相關基因(例如編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些實施例中，治療相關基因包含編碼難以表現(DtE)蛋白質之基因。

在一些實施例中，第一相關基因位於定點整合(SSI)哺乳動物細胞中之兩個不同的重組目標位點(RTS)之間，其中兩個RTS染色體整合於NL1基因座或NL2基因座內。關於NL1基因座、NL2基因座、NL3基因座、NL4基因座、NL5基因座及NL6基因座之描述參見例如美國專利申請公開案第20200002727號。在一些實施例中，第一相關基因位於NL1基因座內。在一些實施例中，細胞包含第二相關基因，其中第二相關基因經染色體整合。在一些實施例中，第二相關基因包含報導基因、選擇基因、治療相關基因(諸如衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些實施例中，治療相關基因包含編碼DtE蛋白質之基因。在一些實施例中，第二相關基因位於RTS中之兩者之間。在一些實施例中，第二相關基因位於NL1基因座或NL2基因座內。在一些實施例中，第一相關基因位於NL1基因座內，且第二相關基因位於NL2基因座內。在一些實施例中，細胞包含第三相關基因，其中第三相關基因經染色體整合。在一些實施例中，第三相關基因包含報導基因、選擇基因、治療相關基因(諸如衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些實施例中，治療相關基因包含編碼DtE蛋白質之基因。在一些實施例中，第三相關基因位於RTS中之兩者之間。在一些實施例中，第三相關基因位於NL1基因座或NL2基因座內。在一些實施例中，第三相關基因位於與NL1基因座及NL2基因座不同之基因座內。在一些實施例中，第一相關基因、第二相關基因及第三相關基因在三個獨立基因座內。在一些實施例中，第一相關基因、第二相關基因及第三相關基因中之至少一者在NL1基因座內，且第一相關基因、第二相關基因及第三相關基因中之至少一者在NL2基因座內。在一些實施例中，細胞包含定點重組酶基因。在一些實施例中，定點重組酶基因經染色體整合。

在一些實施例中，本發明提供一種包含至少四種不同RTS之哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩種不同RTS經染色體整合於NL1基因座或NL2基因座內；(b)第一相關基因經整合於(a)之至少兩種RTS之間，其中第一相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白質之基因、輔助基因或其組合；及(c)第二相關基因經整合於不同於(a)之基因座的第二染色體基因座內，其中第二相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白質之基因(諸如衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些實施例中，本發明提供一種包含至少四種不同RTS之哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩種不同RTS經染色體整合於Fer1L4基因座內；(b)至少兩種不同RTS經染色體整合於NL1基因座或NL2基因座內；(c)第一相關基因經染色體整合於Fer1L4基因座內，其中第一相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白質之基因、輔助基因或其組合；及(d)第二相關基因整合於(b)之NL1基因座或NL2基因座內，其中第二相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白質之基因(諸如衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。

在一些實施例中，本發明提供一種包含至少六種不同RTS之哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩種不同RTS及第一相關基因經染色體整合於Fer1L4基因座內；(b)至少兩種不同RTS及第二相關基因經染色體整合於NL1基因座內；及(c)至少兩種不同RTS及第三相關基因經染色體整合於NL2基因座內。

如本文中所提及，術語「以可操作組合形式」、「以可操作次序」及「可操作地連接」係指核酸序列之鍵以使得核酸分子能夠引導給定基因之轉錄及/或所需蛋白質分子之合成的方式產生。術語亦指胺基酸序列之鍵以此類方式以使得產生功能性蛋白。在一些實施例中，相關基因可操作地連接於啟動子，其中相關基因經染色體整合於宿主細胞中。在一些實施例中，相關基因可操作地連接至異源性啟動子；其中相關基因經染色體整合於宿主細胞中。在一些實施例中，輔助基因可操作地連接於啟動子，其中該輔助基因經染色體整合於宿主細胞基因體中。在一些實施例中，輔助基因可操作地連接於異源啟動子；其中該輔助基因經染色體整合於宿主細胞基因體中。在一些實施例中，編碼DtE蛋白質之基因可操作地連接於啟動子，其中編碼DtE蛋白質之基因經染色體整合於宿主細胞基因體中。在一些實施例中，編碼DtE蛋白質之基因可操作地連接於異源性啟動子，其中編碼DtE蛋白質之基因經染色體整合於宿主細胞基因體中。在一些實施例中，重組酶基因可操作地連接於啟動子，其中重組酶基因經染色體整合於宿主細胞中。在一些實施例中，重組酶基因可操作地連接於啟動子，其中重組酶基因未整合於宿主細胞基因體中。在一些實施例中，重組酶基因可操作地連接於異源性啟動子，其中重組酶基因未染色體整合於宿主細胞基因體中。在一些實施例中，重組酶基因可操作地連接於異源性啟動子，其中重組酶基因未染色體整合於宿主細胞基因體中。

如本文所提及，術語「染色體整合(chromosomally-integrated)」或「染色體整合(chromosomal integration)」係指核酸序列穩定併入至宿主細胞之染色體中，例如哺乳動物細胞。亦即，經染色體整合於宿主細胞，例如哺乳動物細胞之基因體DNA (gDNA)中的核酸序列。在一些實施例中，經染色體整合之核酸序列為穩定的。在一些實施例中，經染色體整合之核酸序列不位於質體或載體上。在一些實施例中，經染色體整合之核酸序列未切除。在一些實施例中，染色體整合係藉由成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關蛋白質(Cas)基因編輯系統(CRISPR/CAS)介導。

在一些實施例中，宿主細胞適用於在懸浮培養物中生長。懸浮液勝任型宿主細胞通常單分散或以鬆散聚集體形式生長，而無實質性聚集。懸浮液勝任型宿主細胞包括適合於懸浮液培養而無需調適或操作之細胞(例如造血細胞、淋巴細胞)，及已藉由修飾或調適貼壁依賴性細胞而使懸浮液勝任之細胞(例如上皮細胞、纖維母細胞)。

在一些實施例中，與在細菌細胞，諸如大腸桿菌宿主細胞中衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之表現相比，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之表現量或活性增加至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍。在一些實施例中，與在大腸桿菌宿主細胞中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的表現相比，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的表現量增加至少2倍。在一些實施例中，與在大腸桿菌宿主細胞中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的表現相比，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的表現量增加至少50倍。在一些實施例中，與在大腸桿菌宿主細胞中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的表現相比，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的表現量增加至少100倍。

本文所描述之宿主細胞適用於大規模培養。舉例而言，細胞培養物可為10 L、30 L、50 L、100 L、150 L、200 L、300 L、500 L、1000 L、2000 L、3000 L、4000 L、5000 L、10,000 L或更大。在一些實施例中，細胞培養物尺寸之範圍可為10 L至5000 L、10 L至10,000 L、10 L至20,000 L、10 I至50,000 L、40 I至50,000 L、100 L至50,000 L、500 L至50,000 L、1000 L至50,000 L、2000 L至50,000 L、3000 I至50,000 L、4000 L至50,000 L、4500 L至50,000 L、1000 L至10,000 L、1000 L至20,000 L、1000 L至25,000 L、1000 L至30,000 L、15 L至2000 L、40 L至1000 L、100 L至500 L、200 L至400 L或在其之間的任何整數。細胞培養物之培養基組分為此項技術中已知，且可包括例如緩衝液、胺基酸含量、維生素含量、鹽含量、礦物質含量、血清含量、碳源含量、脂質含量、核酸含量、激素含量、痕量元素含量、氨含量、輔因子含量、指示物含量、小分子含量、水解產物含量及酶調節劑含量。

如本文所用，術語「培養基」、「細胞培養基」及「培養基」係指含有營養素之溶液，其滋養使哺乳動物細胞生長。通常，此類溶液提供用於細胞基本生長及/或生存所需的必需及非必需胺基酸、維生素、能量源、脂質及痕量元素。此類溶液亦可含有使生長及/或存活率增加超過最小速率之補充組分，包括但不限於激素及/或其他生長因子、特定離子(諸如鈉、氯、鈣、鎂及磷酸根)、緩衝液、維生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以極低最終濃度存在之無機化合物)、以較高最終濃度存在之無機化合物(例如鐵)、胺基酸、脂質及/或葡萄糖或其他能量來源。在一些實施例中，培養基經有利地調配至對於細胞存活及增殖為最佳之pH值及鹽濃度。在一些實施例中，培養基為在細胞培養開始之後添加的進料培養基。

在一些實施例中，細胞可在多種化學成分確定之培養基中之一者中生長，其中該培養基之組分為已知的且受控制的。在一些實施例中，細胞可在培養基之所有組分並非為已知的及/或受控制的複雜培養基中生長。在過去的幾十年裏，已廣泛開發且公開了用於哺乳動物細胞培養之化學成分確定的培養基。成分確定的培養基之所有組分經充分表徵，且因此確定的培養基未含有複合添加劑，諸如血清或水解產物。早期培養基調配物經研發以准許細胞生長且維持成活力，而對蛋白質產生很少或無關注。近年來，已出於支援高度產生性重組蛋白質產生細胞培養物之表現目的研發出培養基調配物。此類培養基較佳用於本發明之方法中。此類培養基一般包含大量營養素及特定言之胺基酸，以支援細胞生長及/或維持在高密度下。必要時，此等培養基可由熟習此項技術者修改以用於本發明之方法。舉例而言，熟習此項技術者可減少此等培養基中之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及/或甲硫胺酸之量，以在如本文所揭示之方法中使其用作基礎培養基或進料培養基。

複雜培養基之所有組分未經充分表徵，且因此複雜培養基可能含有添加劑，尤其諸如簡單及/或複雜碳源、簡單及/或複雜氮源及血清。在一些實施例中，適用於本發明之複雜培養基含有添加劑，諸如除本文所描述之成分確定的培養基之其他組分以外的水解產物。在一些實施例中，成分確定的培養基通常包括在水中已知濃度下大致五十個化學實體。其中大多數亦含有一或多種充分表徵之蛋白質，諸如胰島素、IGF-1、運鐵蛋白或BSA，但其他不需要蛋白質組分且因此稱為不含蛋白質之成分確定的培養基。培養基之典型化學組分分為五種廣泛類別：胺基酸、維生素、無機鹽、痕量元素及定義純分類之混雜類別。

細胞培養基可視情況補充有補充組分。如本文所用，術語「補充組分」係指使生長及/或存活率增加超過最小速率之組分，包括但不限於激素及/或其他生長因子、特定離子(諸如鈉、氯、鈣、鎂及磷酸根)、緩衝液、維生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以極低最終濃度存在之無機化合物)、胺基酸、脂質及/或葡萄糖或其他能量來源。在一些實施例中，補充組分可添加至初始細胞培養物中。在一些實施例中，補充組分可在細胞培養開始之後添加。通常，痕量元素係指以微莫耳或更低量包括之多種無機鹽。舉例而言，通常包括之痕量元素為鋅、硒、銅及其他元素。在一些實施例中，鐵(二價鐵或三價鐵)可在微莫耳濃度下作為痕量元素包括於初始細胞培養基中。錳亦常常以奈莫耳濃度至微莫耳濃度範圍作為二價陽離子(MnCl ₂或MnSO ₄)包括於痕量元素當中。大量不太常見的痕量元素通常以奈莫耳濃度添加。

在一些實施例中，用於本發明方法之培養基為適合於支援細胞培養物中之較高細胞密度，諸如1×10 ⁶個細胞/毫升、5×10 ⁶個細胞/毫升、1×10 ⁷個細胞/毫升、5×10 ⁷個細胞/毫升、1×10 ⁸個細胞/毫升或5×10 ⁸個細胞/毫升的培養基。在一些實施例中，細胞培養物為哺乳動物細胞分批進料培養物，較佳為CHO細胞分批進料培養物。

在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之色胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之白胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之絲胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之蘇胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之甘胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之兩者：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸及酪胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸及色胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸及甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸及色胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸及甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之色胺酸及甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之三者：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸及甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸、色胺酸及甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之四者：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及甲硫胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之五者：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之六者：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之七者：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸：低於2 mM、低於1 mM、在0.1與2 mM之間、在0.1與1 mM之間、在0.5與1.5 mM之間或在0.5與1 mM之間。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含濃度高於2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM，較佳為2 mM之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及天冬醯胺。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含濃度高於2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM，較佳為2 mM之至少5個甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及天冬醯胺。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含濃度高於2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM，較佳為2 mM之甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及天冬醯胺。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含濃度高於2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM，較佳為2 mM之至少1、2、3、4、5、6、7、8或9個纈胺酸、異白胺酸、脯胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及天冬醯胺。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含濃度高於2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM，較佳為2 mM之至少5個纈胺酸、異白胺酸、脯胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及天冬醯胺。在一些實施例中，細胞培養基進一步包含濃度高於2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM，較佳為2 mM之纈胺酸、異白胺酸、脯胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及天冬醯胺。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度高於3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM，較佳為10 mM之絲胺酸。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度高於3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM，較佳為10 mM之纈胺酸。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度高於3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM，較佳為10 mM之半胱胺酸。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度高於3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM，較佳為10 mM之異白胺酸。在一些實施例中，細胞培養基包含濃度高於3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM，較佳為10 mM之白胺酸。在一些實施例中，以上細胞培養基用於本文所揭示之方法中。在一些實施例中，以上細胞培養基在本文所揭示之方法中用作基礎培養基。在一些實施例中，以上細胞培養基在本文所揭示之方法中用作進料培養基。

IV. 產生方法在一個態樣中，本發明包括一種產生衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之方法。該方法包括在適合之條件下培養哺乳動物細胞，藉此表現衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。該方法可進一步包括自培養物中收穫衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。該方法可進一步包括純化衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。

在一些實施例中，該方法產生以0.1 g/L至0.5 g/L產率之多肽或其片段。

在一些實施例中，細胞可在分批或分批進料培養基中生長，其中培養物在足夠表現多肽之後終止，其後收穫經表現之多肽且視情況純化。在一些實施例中，細胞可在灌注培養物中生長，其中不終止培養且將新型營養素及其他組分週期性或連續添加至培養物中，在此期間週期性或連續收穫經表現之多肽。

在一些實施例中，細胞可在以幾毫升至幾公升之體積範圍內的小規模反應容器中生長。在一些實施例中，細胞可生長於大規模商業生物反應器中，其體積範圍為約至少1公升至10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000公升或更多，或其間的任何體積。

細胞培養物之溫度將主要基於使細胞培養物保持活力(此時產生高含量多肽)的溫度、使代謝廢料產物之產生或積累最小化的溫度，及/或此等或被醫師認為重要的其他因素之任何組合的範圍來選擇。作為一個非限制性實例，CHO細胞良好生長且在約37℃下產生較高含量或蛋白質或多肽。一般而言，大多數哺乳動物細胞良好生長及/或可在約25℃至42℃範圍內，但由本發明教示之方法不限於此等溫度，產生較高含量或蛋白質或多肽。某些哺乳動物細胞生長良好及/或可在約35℃至40℃範圍內產生較高含量或蛋白質或多肽。在某些實施例中，細胞培養物在細胞培養過程期間在20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃之溫度下生長一或多次。

如本文所用，術語「培養」及「細胞培養物」指在適合於細胞群體之存活及/或生長之條件下懸浮於培養基中之細胞群體。如一般熟習此項技術者將清楚，在一些實施例中，本文所用之此等術語係指包含細胞群體及使該群體懸浮於其中之培養基的組合。在一些實施例中，細胞培養物之細胞包含哺乳動物細胞。

本發明可與適合於所需過程(例如產生重組蛋白質(例如抗體))之任何細胞培養方法一起使用。作為非限制性實例，細胞可在分批或分批進料培養基中生長，其中培養物在足夠表現重組蛋白質(例如抗體)之後終止，其後收穫經表現之蛋白質。或者，作為另一非限制性實例，細胞可在分批進料培養基中生長，其中不終止培養且將新型營養素及其他組分週期性或連續添加至培養物中，在此期間週期性或連續收穫經表現之重組蛋白質(例如抗體)。其他適合之方法(例如旋轉管培養)為此項技術中已知且可用於實踐本發明。

在一些實施例中，適合於本發明之細胞培養為分批進料培養。如本文所用，術語「分批進料培養」係指培養細胞之方法，其中在培養過程開始之後的一個或多個時間向培養物提供額外組分。此類所提供組分通常包含用於在培養過程期間耗乏之細胞的營養組分。通常在某一時刻停止分批進料培養且收穫培養基中之細胞及/或組分，且視情況純化。在一些實施例中，分批進料培養物包含補充有進料培養基之基本培養基。

細胞可以由從業者選擇之任何方便的體積生長。舉例而言，細胞可在以幾毫升至幾公升之體積範圍內的小規模反應容器中生長。在一些實施例中，細胞可生長於大規模商業生物反應器中，其體積範圍為約至少1公升至10、50、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15000、20000或25000公升或更多，或其間的任何體積。

細胞培養物之溫度將主要基於使細胞培養物保持活力之溫度範圍及產生較高含量所需產物(例如重組蛋白質)之範圍來選擇。一般而言，大多數哺乳動物細胞良好生長且可在約25℃至42℃範圍內，但由本發明教示之方法不限於此等溫度，產生所需產物(例如重組蛋白質)。某些哺乳動物細胞良好生長且可在約35℃至40℃範圍內產生所需產物(例如重組蛋白質或抗體)。在某些實施例中，細胞培養物在細胞培養過程期間在20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃之溫度下生長一或多次。一般熟習此項技術者將能夠選擇使細胞生長之適當溫度，其視細胞之特定需求及醫師之特定生產要求而定。細胞可生長任何時間量，視從業者之需求及細胞自身之需求而定。在一些實施例中，細胞在37℃下生長。在一些實施例中，細胞在36.5℃下生長。

在一些實施例中，細胞可在初始生長階段(或生長階段)期間生長更長時間或更短時間量，視從業者之需求及細胞自身之需求而定。在一些實施例中，細胞生長持續足以達成預定義細胞密度之時間段。在一些實施例中，細胞生長持續足以達成如下之細胞密度的時間段，該細胞密度為若使細胞不受干擾地生長，則細胞最終將達至之最大細胞密度的給定百分比。舉例而言，細胞可生長持續足以達成以下之所需活細胞密度的時間段：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%之最大細胞密度。在一些實施例中，細胞生長直至細胞密度增加不超過15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%培養物/天。在一些實施例中，細胞生長直至細胞密度增加不超過5%培養物/天。

在一些實施例中，使細胞生長持續限定的時間段。舉例而言，視細胞培養物之起始濃度、細胞生長之溫度及細胞之固有生長速率而定，細胞可生長0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天，較佳4至10天。在一些情況下，可允許細胞生長持續一個月或更久。本發明之從業者將能夠視蛋白質生產要求及細胞自身之需求而定選擇初始生長階段之持續時間。

細胞培養物可在初始培養階段期間攪動或振盪，以增加氧合及營養物至細胞的分散。根據本發明，一般熟習此項技術者應瞭解，在初始生長階段期間控制或調節生物反應器之某些內部條件可為有益的，包括但不限於pH值、溫度、氧合等。

在初始生長階段結束時，培養條件中之至少一者可經改變，使得應用第二組培養條件且在培養物中發生代謝轉變。代謝轉變可藉由例如溫度、pH值、重量莫耳滲透濃度或細胞培養物之化學誘導濃度之變化來實現。在一個非限制性實施例中，培養條件藉由改變培養物之溫度而變化。然而，如此項技術中已知，轉變溫度並非可實現適當代謝轉變之唯一機制。舉例而言，此類代謝轉變亦可藉由使其他培養條件，包括但不限於pH、重量莫耳滲透濃度及丁酸鈉含量轉變來達成。培養物轉變之時序將由本發明之從業者基於蛋白質生產要求或細胞自身之需要而確定。

當轉變培養物之溫度時，溫度轉變可為相對逐漸的。舉例而言，其可耗費若干小時或數天以完成溫度變化。替代地，溫度轉變可為相對突然的。舉例而言，溫度變化可在不到若干小時內完成。鑒於適當生產及控制設備，諸如在多肽或蛋白質之商業大規模生產中為標準的，溫度變化甚至可在不到一小時內完成。

在一些實施例中，一旦細胞培養物之條件已如上文所論述轉變，細胞培養物在第二組培養條件下維持後續生產階段，該第二組培養條件有助於細胞培養物之存活及成活力，且適合於在商業上適當之含量下表現所需多肽或蛋白質。

如上文所論述，培養物可藉由使多種培養條件中之一或多者轉變而變化，包括但不限於溫度、pH值、重量莫耳滲透濃度及丁酸鈉含量。在一些實施例中，培養物之溫度改變。根據此實施例，在後續生產階段期間，使培養物維持在低於初始生長階段之溫度或溫度範圍的溫度或溫度範圍下。如上文所論述，可採用多個離散溫度轉變以增加細胞密度或成活力，或增加重組蛋白質之表現。

在一些實施例中，細胞可維持在後續生產階段中，直至達到所需細胞密度或生產效價。在本發明之另一實施例中，使細胞在後續生產階段期間生長持續限定的時間段。舉例而言，視後續生長階段開始時細胞培養物之濃度、細胞生長之溫度及細胞之內部生長速率而定，細胞可生長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天。在一些情況下，可允許細胞生長持續一個月或更久。本發明之從業者將能夠視多肽或蛋白質生產要求及細胞自身之需求而定選擇後續生長階段之持續時間。

細胞培養物可在後續生產階段期間攪動或振盪，以增加氧合作用及營養物至細胞的分散。根據本發明，一般熟習此項技術者應瞭解，在後續生長階段期間控制或調節生物反應器之某些內部條件，包括但不限於pH值、溫度、氧合等，可為有益的。

在一些實施例中，細胞表現重組蛋白質且本發明之細胞培養方法包含生長階段及生產階段。

在一些實施例中，本文所揭示之方法中之任一者的步驟(ii)在細胞培養方法之全部期間應用。在一些實施例中，在細胞培養方法之一部分期間應用本文所揭示之方法中之任一者的步驟(ii)。在一些實施例中，應用步驟(ii)直至得到預定活細胞密度。

在一些實施例中，本發明之細胞培養方法包含生長階段及產生階段，且在生長階段期間應用步驟(ii)。在一些實施例中，本發明之細胞培養方法包含生長階段及產生階段，且在生長階段之一部分期間應用步驟(ii)。在一些實施例中，本發明之細胞培養方法包含生長階段及產生階段，且在生長階段及產生階段期間應用步驟(ii)。

在本文所揭示之方法中之任一者的步驟(ii)中，術語「維持」可指對於整個培養過程(直至收穫)或對於培養過程之一部分，諸如生長階段、生長階段之一部分或直至得到預定細胞密度，將胺基酸或代謝物之濃度維持在C1或C2以下。

在上文所提及之方法中之任一者的一些實施例中，細胞生長及/或生產率相較於對照培養物增加，該對照培養物相同，但其不包含步驟(ii)。

在上文所提及之方法中之任一者的一些實施例中，本發明之方法為用於改進細胞生長之方法。在一些實施例中，本發明之方法為一種用於改進在較高密度細胞培養物中在較高細胞密度下之細胞生長的方法。

如本文所用，較高細胞密度係指高於以下之細胞密度：1×10 ⁶個細胞/毫升、5×10 ⁶個細胞/毫升、1×10 ⁷個細胞/毫升、5×10 ⁷個細胞/毫升、1×10 ⁸個細胞/毫升或5×10 ⁸個細胞/毫升，較佳高於1×10 ⁷個細胞/毫升，更佳高於5×10 ⁷個細胞/毫升。

在一些實施例中，本發明之方法為一種用於改進細胞培養物中之細胞生長的方法，其中細胞密度為高於1×10 ⁶個細胞/毫升、5×10 ⁶個細胞/毫升、1×10 ⁷個細胞/毫升、5×10 ⁷個細胞/毫升、1×10 ⁸個細胞/毫升或5×10 ⁸個細胞/毫升。在一些實施例中，本發明之方法為一種用於改進細胞培養物中之細胞生長的方法，其中最大細胞密度為高於1×10 ⁶個細胞/毫升、5×10 ⁶個細胞/毫升、1×10 ⁷個細胞/毫升、5×10 ⁷個細胞/毫升、1×10 ⁸個細胞/毫升或5×10 ⁸個細胞/毫升。

在一些實施例中，細胞生長由活細胞密度(VCD)、最大活細胞密度或整合活細胞計數(IVCC)確定。在一些實施例中，細胞生長藉由最大活細胞密度確定。

如本文所用，術語「活細胞密度」係指存在於既定體積之培養基中之細胞的數目。活細胞密度可藉由熟習此項技術者已知之任何方法量測。較佳地，使用自動化細胞計數器，諸如Bioprofile Flex®來量測活細胞密度。如本文所用，術語「最大細胞密度」係指在細胞培養期間達成之最大細胞密度。如本文所用，術語「細胞成活力」係指培養物中之細胞在既定之一系列培養條件或實驗變化下存活的能力。一般熟習此項技術者應瞭解，用於確定細胞成活力之許多方法中之一者涵蓋於本發明中。舉例而言，可使用染料(例如錐蟲藍)，其不通過活細胞之膜，但可通過死亡或染色細胞之經破壞膜以便確定細胞成活力。

如本文所用，術語「整合活細胞計數」(IVCC)係指在活細胞密度(VCD)曲線下之面積。IVCC可使用下式計算：IVCC _t ₊ ₁= IVCC _t+(VCD _t+VCD _t ₊ ₁)*(∆t)/2，其中∆t為t與t+1時間點之間的時間差。IVCC _t ₌ ₀可假定為可忽略的。VCD _t及VCD _t ₊ ₁為t及t+1時間點下之活細胞密度。

如本文所用，術語「效價」係指例如以培養基體積之給定量藉由細胞培養物產生之以重組方式表現之蛋白質的總量。效價通常以每公升培養基之蛋白質公克數單位表示。

在一些實施例中，細胞生長相較於對照培養物增加至少5%、10%、15%、20%或25%。在一些實施例中，細胞生長相較於對照培養物增加至少10%。在一些實施例中，細胞生長相較於對照培養物增加至少20%。

在一些實施例中，藉由效價及/或體積生產率確定生產率。

在一些實施例中，生產率藉由效價確定。在一些實施例中，與對照培養物相比，生產率增加至少5%、10%、15%、20%或25%。在一些實施例中，與對照培養物相比，生產率增加至少10%。在一些實施例中，與對照培養物相比，生產率增加至少20%。

在一些實施例中，細胞培養物之最大細胞密度大於1×10 ⁶個細胞/毫升、5×10 ⁶個細胞/毫升、1×10 ⁷個細胞/毫升、5×10 ⁷個細胞/毫升、1×10 ⁸個細胞/毫升或5×10 ⁸個細胞/毫升。在一些實施例中，細胞培養物之最大細胞密度大於5×10 ⁶個細胞/毫升。在一些實施例中，細胞培養物之最大細胞密度大於1×10 ⁸個細胞/毫升。

V. 純化在一些實施例中，用於產生衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的方法包括分離及/或純化衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之經表現多肽或其片段分泌於培養基中，且因此細胞及其他固體可藉由離心及/或過濾移除。

根據本文所描述之方法產生的衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可自宿主細胞中收穫且使用熟習此項技術者已知的任何適合之方法純化。用於純化多肽或其片段之適合的方法包括沈澱及各種類型之層析，諸如疏水相互作用、離子交換、親和力、螯合及尺寸排阻，其均為此項技術中已知的。適合之純化流程可包括此等或其他適合方法中之兩者或更多者。在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段中之一或多者可包括促進純化之「標籤」，諸如抗原決定基標籤或HIS標籤、鏈黴素標籤。此類經標記多肽可方便地例如藉由螯合層析法或親和層析法自條件培養基純化。視情況，標籤序列可在純化後裂解。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可包括用於親和純化之標籤。親和純化標籤為此項技術中已知的。實例包括例如His標籤(結合至金屬離子)、抗體、麥芽結合蛋白質(MBP) (結合至直鏈澱粉)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST) (結合至麩胱甘肽)、FLAG標籤、Strep標籤(結合至鏈黴抗生物素蛋白或其衍生物)。

在一較佳實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段不包括純化標籤。

在一些實施例中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的產率為至少約1 mg/L、至少約2 mg/L、至少約3 mg/L、至少約4 mg/L、至少約5 mg/L、至少約6 mg/L、至少約7 mg/L、至少約8 mg/L、至少約9 mg/L、至少約10 mg/L、至少約11 mg/L、至少約12 mg/L、至少約13 mg/L、至少約14 mg/L、至少約15 mg/L、至少約16 mg/L、至少約17 mg/L、至少約18 mg/L、至少約19 mg/L、至少約20 mg/L、至少約25 mg/L、至少約30 mg/L、至少約35 mg/L、至少約40 mg/L、至少約45 mg/L、至少約50 mg/L、至少約55 mg/L、至少約60 mg/L、至少約65 mg/L、至少約70 mg/L、至少約75 mg/L、至少約80 mg/L、至少約85 mg/L、至少約90 mg/L、至少約95 mg/L或至少約100 mg/L。

在一些實施例中，培養物之尺寸為至少約10公升，例如體積為至少約10L、至少約20L、至少約30L、至少約40L、至少約50L、至少約60 L、至少約70L、至少約80L、至少約90L、至少約100L、至少約150L、至少約200L、至少約250L、至少約300L、至少約400L、至少約500L、至少約600L、至少約700L、至少約800L、至少約900L、至少約1000 L、至少約2000 L、至少約3000 L、至少約4000 L、至少約5000 L、至少約6000 L、至少約10,000 L、至少約15,000 L、至少約20,000 L、至少約25,000 L、至少約30,000 L、至少約35,000 L、至少約40,000 L、至少約45,000 L、至少約50,000 L、至少約55,000 L、至少約60,000 L、至少約65,000 L、至少約70,000 L、至少約75,000 L、至少約80,000 L、至少約85,000 L、至少約90,000 L、至少約95,000 L、至少約100,000 L等。

VI. 組合物及調配物在一個態樣中，本發明包括一種包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之組合物。在一些實施例中，該組合物引發可賦予針對大腸桿菌病原性物種之免疫力的免疫反應，包括抗體。

在一些實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段作為唯一抗原。在一些實施例中，該組合物不包括綴合物。

在一些實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段及額外抗原。在一些實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段及額外大腸桿菌抗原。在一些實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段及來自大腸桿菌之醣綴合物。

在一些實施例中，多肽或其片段係衍生自大腸桿菌FimH。

在一些實施例中，組合物包括自大腸桿菌FimC衍生之多肽或其片段。

在一些實施例中，組合物包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；及衍生自大腸桿菌FimC之多肽或其片段。

在一個態樣中，本發明包括一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；及包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。

在一些實施例中，該組合物包括本文所揭示之醣中之任一者。在較佳實施例中，該組合物包括本文所揭示之綴合物中之任一者。

在一些實施例中，該組合物包括至少一個來自大腸桿菌血清型O25，較佳血清型O25b之醣綴合物。在一個實施例中，該組合物包括至少一個來自大腸桿菌血清型O1，較佳血清型O1a之醣綴合物。在一個實施例中，該組合物包括至少一個來自大腸桿菌血清型O2之醣綴合物。在一個實施例中，該組合物包括至少一個來自大腸桿菌血清型O6之醣綴合物。

在一個實施例中，該組合物包含至少一個選自以下大腸桿菌血清型中之任一者之醣綴合物：O25、O1、O2及O6，較佳O25b、O1a、O2及O6。在一個實施例中，該組合物包含至少兩個選自以下大腸桿菌血清型中之任一者之醣綴合物：O25、O1、O2及O6，較佳O25b、O1a、O2及O6。在一個實施例中，該組合物包含至少三個選自以下大腸桿菌血清型中之任一者之醣綴合物：O25、O1、O2及O6，較佳O25b、O1a、O2及O6。在一個實施例中，該組合物包含來自以下大腸桿菌血清型中之每一者之醣綴合物：O25、O1、O2及O6，較佳O25b、O1a、O2及O6。

在一較佳實施例中，以上組合物中之任一者之醣綴合物個別地與CRM ₁₉₇綴合。在一較佳實施例中，以上組合物中之任一者之醣綴合物個別地與SCP綴合。

因此，在一些實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自至少一種大腸桿菌血清型之O-抗原。在一較佳實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自超過1種大腸桿菌血清型之O-抗原。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型(或「v」，價數)至12種不同血清型(12v)之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自3種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自4種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括來自5種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自6種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自7種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自8種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自9種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自10種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自11種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自12種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自13種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自14種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自15種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自16種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自17種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自18種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自19種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自20種不同血清型之O-抗原。

較佳地，大腸桿菌醣之數目可在1種血清型(或「v」，價數)至26種不同血清型(26v)範圍內。在一個實施例中，存在一種血清型。在一個實施例中，存在2種不同血清型。在一個實施例中，存在3種不同血清型。在一個實施例中，存在4種不同血清型。在一個實施例中，存在5種不同血清型。在一個實施例中，存在6種不同血清型。在一個實施例中，存在7種不同血清型。在一個實施例中，存在8種不同血清型。在一個實施例中，存在9種不同血清型。在一個實施例中，存在10種不同血清型。在一個實施例中，存在11種不同血清型。在一個實施例中，存在12種不同血清型。在一個實施例中，存在13種不同血清型。在一個實施例中，存在14種不同血清型。在一個實施例中，存在15種不同血清型。在一個實施例中，存在16種不同血清型。在一個實施例中，存在17種不同血清型。在一個實施例中，存在18種不同血清型。在一個實施例中，存在19種不同血清型。在一個實施例中，存在20種不同血清型。在一個實施例中，存在21種不同血清型。在一個實施例中，存在22種不同血清型。在一個實施例中，存在23種不同血清型。在一個實施例中，存在24種不同血清型。在一個實施例中，存在25種不同血清型。在一個實施例中，存在26種不同血清型。醣與載體蛋白質綴合以形成如本文所描述之醣綴合物。

在一個態樣中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括來自至少一個大腸桿菌血清群之O-抗原的醣綴合物，其中該O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自超過1種大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自2種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自3種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自4種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自5種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自6種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自7種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自8種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自9種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之O-抗原；及10種不同大腸桿菌血清型，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之O-抗原；及11種不同大腸桿菌血清型，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自12種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自13種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自14種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自15種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自16種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自17種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自18種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自19種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自20種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質綴合。

在另一態樣中，組合物包括來自至少一種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一較佳實施例中，組合物包括來自超過1種大腸桿菌血清型之O-多醣。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型至12種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自3種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自4種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自5種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自6種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自7種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自8種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自9種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自10種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自11種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自12種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自13種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，該組合物包括來自14種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自15種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自16種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自17種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自18種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自19種不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自20種不同血清型之O-多醣。

在一較佳實施例中，該組合物包括來自至少一種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中該O-多醣與載體蛋白質綴合。在一較佳實施例中，該組合物包括來自超過1種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型至12種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自3種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自4種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自5種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自6種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自7種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自8種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自9種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自10種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自11種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自12種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自13種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自14種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自15種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自16種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自17種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自18種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自19種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。在一個實施例中，組合物包括來自20種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合。

在一最佳實施例中，該組合物包括來自至少一種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中該O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中該O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一較佳實施例中，組合物包括來自超過1種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中該O-多醣包括O-抗原及核心醣。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型至12種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自3種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自4種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自5種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自6種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自7種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自8種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自9種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自10種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自11種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自12種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自13種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自14種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自15種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自16種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自17種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自18種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自19種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自20種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一較佳實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

在另一較佳實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O25a及核心醣，其中 n為至少40。在一較佳實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O25b及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O1a及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O2及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O6及核心醣，其中 n為至少40。

在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O17及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O15及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O18A及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O75及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O4及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O16及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O13及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O7及核心醣，其中 n為至少40。

在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O8及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，O-多醣包括式O8，其中 n為1-20，較佳2-5，更佳3。式O8展示於例如圖 10B中。在另一實施例中，該組合物進一步包括與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O9及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，O-多醣包括式O9，其中 n為1-20，較佳4-8，更佳5。式O9展示於例如圖 10B中。在另一實施例中，O-多醣包括式O9a，其中 n為1-20，較佳4-8，更佳5。式O9a展示於例如圖 10B中。

在一些實施例中，O-多醣包括選自式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101中之任一者，其中 n為1-20，較佳4-8，更佳5。參見例如圖 10B。

如上文所描述，該組合物可包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及經綴合O-多醣(抗原)之任何組合。在一個例示性實施例中，該組合物包括：包括式O25b之多醣、包括式O1A之多醣、包括式O2之多醣及包括式O6之多醣。更具體言之，諸如包括以下之組合物：(i)與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O25b及核心醣，其中 n為至少40；(ii)與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中O-多醣包括式O1a及核心醣，其中 n為至少40；(iii)與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中O-多醣包括式O2及核心醣，其中 n為至少40；及(iv)與CRM ₁₉₇綴合之O-多醣，其中該O-多醣包括式O6及核心醣，其中 n為至少40。

在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及至少一個自任何大腸桿菌血清型衍生之O-多醣，其中該血清型不為O25a。舉例而言，在一個實施例中，該組合物不包括：包括式O25a之醣。此類組合物可包括：例如包括式O25b之O-多醣、包括式O1A之O-多醣、包括式O2之O-多醣及包括式O6之O-多醣。

在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自2種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自3種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自4種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自5種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自6種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自7種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自8種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自9種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自10種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自11種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自12種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自13種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自14種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自15種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自16種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自17種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自18種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自19種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及來自20種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇綴合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O25b，其中 n為15±2。在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O25b，其中 n為17 ± 2。在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O25b，其中 n為55 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O25b，其中 n為51±2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌K12核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，綴合物係藉由單端連接之綴合來製備。在一個實施例中，綴合物係較佳在DMSO緩衝液中藉由還原胺化化學方法來製備。在一個實施例中，醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合。較佳地，該組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O25B多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所確定。因此，可進行用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清OPA活性之比較，且比較其對血清型O25B之反應，以評定反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O25B，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O25B，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O25B之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物引發至少50%之個體中針對大腸桿菌血清型O25B之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物引發至少60%、70%、80%或至少90%之個體中針對大腸桿菌血清型O25B之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O25B之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加人類個體針對大腸桿菌血清型O25B之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O1a，其中 n為39±2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O1a，其中 n為13±2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，綴合物係藉由單端連接之綴合來製備。在一個實施例中，綴合物係較佳在DMSO緩衝液中藉由還原胺化化學方法來製備。在一個實施例中，醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合。較佳地，該組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O1A多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所確定。因此，可進行用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清OPA活性之比較，且比較其對血清型O1A之反應，以評定反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O1A，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O1A，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O1A之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物引發至少50%之個體中針對大腸桿菌血清型O1A之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物引發至少60%、70%、80%或至少90%之個體中針對大腸桿菌血清型O1A之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O1A之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O1A之人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O2，其中 n為43 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O2，其中 n為47 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括：包括共價結合載體蛋白質之醣的綴合物，其中該醣包括式O2，其中 n為17 ± 2。在另一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括：包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O2，其中 n為18±2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R4核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，綴合物係藉由單端連接之綴合來製備。在一個實施例中，綴合物係較佳在DMSO緩衝液中藉由還原胺化化學方法來製備。在一個實施例中，醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合。較佳地，該組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O2多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所確定。因此，可進行用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清OPA活性之比較，且比較其對血清型O2之反應，以評定反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O2，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O2，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O2之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物引發至少50%之個體中針對大腸桿菌血清型O2之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物引發至少60%、70%、80%或至少90%之個體中針對大腸桿菌血清型O2之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O2之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O2之人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O6，其中 n為42 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O6，其中 n為50 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括包含共價結合載體蛋白質之醣的綴合物，其中該醣包括式O6，其中 n為17 ± 2。在另一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括：包括與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包括式O6，其中 n為18 ± 2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，綴合物係藉由單端連接之綴合來製備。在一個實施例中，綴合物係較佳在DMSO緩衝液中藉由還原胺化化學方法來製備。在一個實施例中，醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合。較佳地，該組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O6多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所確定。因此，可進行用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清OPA活性之比較，且比較其對血清型O6之反應，以評定反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O6，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O6，如藉由活體外調理吞噬活性分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O6之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物引發至少50%之個體中針對大腸桿菌血清型O6之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物引發至少60%、70%、80%或至少90%之個體中針對大腸桿菌血清型O6之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所確定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O6之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所確定，血清效價為至少1:8之個體)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O6之人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，該組合物包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段；及包括共價結合至載體蛋白質之醣的綴合物，其中該醣包括選自以下中之任一者的結構：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數，較佳31至90。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R2核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R3核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R4核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌K12核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，綴合物係藉由單端連接之綴合來製備。在一個實施例中，綴合物係較佳在DMSO緩衝液中藉由還原胺化化學方法來製備。在一個實施例中，醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合。較佳地，該組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。在一個實施例中，該組合物進一步包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29種額外綴合物至至多30種額外綴合物，各綴合物包括與載體蛋白質共價結合之醣，其中該醣包括選自該等式中之任一者之結構。

A. 醣在一個實施例中，藉由表現(未必過度表現)不同Wzz蛋白質(例如WzzB)以控制醣之大小，來產生醣。

如本文所用，術語「醣」係指單一糖部分或單醣單元，以及經共價連接以形成雙醣、寡醣及多醣之兩個或更多個單一糖部分或單醣單元的組合。醣可為直鏈或分支鏈。

在一個實施例中，在重組革蘭氏陰性細菌中產生醣。在一個實施例中，在重組大腸桿菌細胞中產生醣。在一個實施例中，在重組沙門氏菌細胞中產生醣。例示性細菌包括大腸桿菌O25K5H1、大腸桿菌BD559、大腸桿菌GAR2831、大腸桿菌GAR865、大腸桿菌GAR868、大腸桿菌GAR869、大腸桿菌GAR872、大腸桿菌GAR878、大腸桿菌GAR896、大腸桿菌GAR1902、大腸桿菌O25a ETC NR-5、大腸桿菌O157:H7:K-、腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒菌株LT2、大腸桿菌GAR2401、腸沙門氏菌血清型腸炎CVD 1943、腸沙門氏菌血清型鼠傷寒CVD 1925、腸沙門氏菌血清型副傷寒A CVD 1902及弗氏志賀菌( Shigella flexneri) CVD 1208S。在一個實施例中，細菌不為大腸桿菌GAR2401。此針對醣產生之遺傳學方法允許有效產生作為疫苗組分之O-多醣及O-抗原分子。

如本文所用，術語「wzz蛋白質」係指鏈長決定子多肽，諸如wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzzl及wzz2。例示性wzz基因序列之GenBank寄存編號為：對於E4991/76，AF011910；對於F186，AF011911，對於M70/1-1，AF011912；對於79/311，AF011913；對於Bi7509-41，AF011914；對於C664-1992，AF011915；對於C258-94，AF011916；對於C722-89，AF011917；及對於EDL933，AF011919。G7及Bi316-41 wzz基因序列之GenBank寄存編號分別為U39305及U39306。例示性wzz基因序列之其他GenBank寄存編號為：對於腸沙門氏菌亞種腸道血清變型鼠傷寒菌株LT2 FepE，NP_459581；對於大腸桿菌O157:H7菌株EDL933 FepE，AIG66859；對於腸沙門氏菌亞種腸道血清變型鼠傷寒菌株LT2 WzzB，NP_461024；對於大腸桿菌K-12亞種菌株MG1655 WzzB，NP_416531；對於大腸桿菌K-12亞種菌株MG1655 FepE，NP_415119。在較佳實施例中，wzz家族蛋白質為以下中之任一者：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2，最佳地wzzB，更佳地fepE。

例示性wzzB序列包括SEQ ID Nos: 30-34中所闡述之序列。例示性FepE序列包括SEQ ID Nos: 35-39中所闡述之序列。

在一些實施例中，經修飾醣(相較於對應野生型醣被修飾)可藉由以下來產生：在革蘭氏陰性細菌中自革蘭氏陰性細菌表現(不一定過度表現) wzz家族蛋白質(例如fepE)，及/或藉由斷開(亦即抑制、缺失、移除)第二wzz基因(例如wzzB)以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣，諸如脂多醣。舉例而言，經修飾醣可藉由表現(不一定過度表現) wzz2且斷開wzzl來產生。或在替代方案中，經修飾醣可藉由表現(不一定過度表現) wzzfepE且斷開wzzB來產生。在另一實施例中，經修飾醣可藉由表現(不一定過度表現) wzzB但斷開wzzfepE來產生。在另一實施例中，經修飾醣可藉由表現fepE來產生。較佳地，wzz家族蛋白質係衍生自對於宿主細胞而言異源的菌株。

在一些實施例中，醣係藉由表現具有與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 39中之任一者具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的wzz家族蛋白質產生。在一個實施例中，wzz家族蛋白質包括選自SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 39中之任一者的序列。較佳地，wzz家族蛋白質與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，醣係藉由表現具有與fepE蛋白質具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質來產生。

在一個態樣中，本發明係關於藉由在革蘭氏陰性細菌中表現wzz家族蛋白質，較佳地fepE，以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣所產生的醣，該等醣相較於對應野生型O-多醣增加至少1、2、3、4或5個重複單元。在一個態樣中，本發明係關於由培養物中之革蘭氏陰性細菌所產生之醣，該培養物自革蘭氏陰性細菌表現(不一定過度表現) wzz家族蛋白質(例如wzzB)以產生含有中等或長O-抗原鏈的高分子量醣，該等醣相較於對應野生型O-抗原增加至少1、2、3、4或5個重複單元。對於相較於對應野生型醣具有增加數目之重複單元之額外例示性醣，參見下文O-多醣及O-抗原之描述。所需鏈長為在給予疫苗構築體之情形下產生改進或最大免疫原性之鏈長。

在另一實施例中，醣包括選自表 1之任一式，其中醣中之重複單元數目 n比對應野生型O-多醣中之重複單元數目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元。較佳地，醣相較於對應野生型O-多醣包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元之增加。參見例如表 24。確定醣長度之方法為此項技術中已知的。此類方法包括核磁共振、質譜分析及尺寸排阻層析，如實例 13中所描述。

在一較佳實施例中，本發明係關於一種在重組大腸桿菌宿主細胞中產生之醣，其中將內源性wzz O-抗原長度調節劑(例如wzzB)之基因缺失且經來自對於重組大腸桿菌宿主細胞而言為異源之革蘭氏陰性細菌之(第二) wzz基因(例如沙門氏菌fepE)置換，以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣，諸如脂多醣。在一些實施例中，重組大腸桿菌宿主細胞包括來自沙門氏菌，較佳地來自腸沙門氏菌之wzz基因。

在一個實施例中，宿主細胞包括wzz家族蛋白質之異源基因作為穩定維持的質體載體。在另一實施例中，宿主細胞包括wzz家族蛋白質之異源基因作為宿主細胞之染色體DNA中之經整合基因。在大腸桿菌宿主細胞中穩定地表現質體載體之方法及將異源基因整合至大腸桿菌宿主細胞之染色體中之方法為此項技術中已知的。在一個實施例中，宿主細胞包括O-抗原之異源基因作為穩定維持的質體載體。在另一實施例中，宿主細胞包括O-抗原之異源基因作為宿主細胞之染色體DNA中之經整合基因。在大腸桿菌宿主細胞及沙門氏菌宿主細胞中穩定地表現質體載體之方法為此項技術中已知的。將異源基因整合至大腸桿菌宿主細胞及沙門氏菌宿主細胞之染色體中之方法為此項技術中已知的。

在一個態樣中，在包含碳源之培養基中培養重組宿主細胞。用於培養大腸桿菌之碳源為此項技術中已知的。例示性碳源包括糖醇、多元醇、醇醛糖或酮糖，包括(但不限於)阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸酯、丁二酸酯及甲基胺。在一較佳實施例中，培養基包括葡萄糖。在一些實施例中，培養基包括多元醇或醇醛糖作為碳源，例如甘露醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨糖醇、乳糖及阿拉伯糖。可在開始培養之前，向培養基中添加全部碳源，或其可在培養期間逐步地或連續添加。

用於重組宿主細胞之例示性培養基包括選自以下中之任一者之成分(element)：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。較佳地，培養基包括KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。

本文所用之培養基可為固體或液體，合成(亦即，人造)或天然的，且可包括用於培養重組宿主細胞之足夠的營養物質。較佳地，培養基為液體培養基。

在一些實施例中，培養基可進一步包括適合之無機鹽。在一些實施例中，培養基可進一步包括痕量營養物質。在一些實施例中，培養基可進一步包括生長因子。在一些實施例中，培養基可進一步包括額外碳源。在一些實施例中，培養基可進一步包括適合之無機鹽、痕量營養物質、生長因子及補充碳源。適合於培養大腸桿菌之無機鹽、痕量營養物質、生長因子及補充碳源為此項技術中已知的。

在一些實施例中，培養基可視需要包括額外組分，諸如蛋白腖、N-Z胺、酶促大豆水解產物、額外酵母提取物、麥芽提取物、補充碳源及多種維生素。在一些實施例中，培養基不包括此類額外組分，諸如蛋白腖、N-Z胺、酶促大豆水解產物、額外酵母提取物、麥芽提取物、補充碳源及多種維生素。

適合之補充碳源之說明性實例包括(但不限於)其他碳水化合物，諸如葡萄糖、果糖、甘露醇、澱粉或澱粉水解產物、纖維素水解產物及糖蜜；有機酸，諸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸及反丁烯二酸；及醇類，諸如甘油、肌醇、甘露醇及山梨糖醇。

在一些實施例中，培養基進一步包括氮源。適合於培養大腸桿菌之氮源為此項技術中已知的。適合之氮源之說明性實例包括(但不限於)氨，包括氨氣及氨水；無機酸或有機酸之銨鹽，諸如氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、硫酸銨及乙酸銨；脲；硝酸鹽或亞硝酸鹽及其他含氮材料，包括呈純或粗製劑形式之胺基酸、肉提取物、蛋白腖、魚粉、魚水解產物、玉米漿、酪蛋白水解產物、大豆餅水解產物、酵母提取物、乾燥的酵母、乙醇-酵母餾出物、大豆粉、棉籽粉及其類似物。

在一些實施例中，培養基包括無機鹽。適合之無機鹽之說明性實例包括(但不限於)鉀、鈣、鈉、鎂、錳、鐵、鈷、鋅、銅、鉬、鎢及其他痕量元素之鹽，及磷酸鹽。

在一些實施例中，培養基包括適當生長因子。適當痕量營養物質、生長因子及其類似者之說明性實例包括(但不限於)輔酶A、泛酸、吡哆醇-HCl、生物素、硫胺素、核黃素、黃素單核苷酸、黃素腺二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、葉酸、維生素B ₁₂、其他維生素、胺基酸(諸如半胱胺酸及羥脯胺酸)、鹼基(諸如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶)、硫代硫酸鈉、對胺基苯甲酸或r-胺基苯甲酸、菸鹼醯胺、乙酸亞硝酸鹽及其類似者，其呈純或部分純化的化學化合物形式或在天然材料中存在。量可由熟習此項技術者根據此項技術中已知之方法及技術憑經驗確定。

在另一實施例中，本文所描述之經修飾醣(相較於對應野生型醣)以合成方式例如活體外產生。合成產生或醣之合成可有助於避免成本及時間密集型生產製程。在一個實施例中，醣以合成方式合成來自受適當保護之單醣中間物，諸如藉由使用依序醣基化策略或依序醣基化與[3+2]塊體合成策略之組合。舉例而言，硫醣及醣基三氯乙醯亞胺酯衍生物可用作醣基化中之醣基供體。在一個實施例中，以合成方式活體外合成之醣與藉由重組手段，諸如藉由操縱上文所描述之wzz家族蛋白質所產生之醣具有一致結構。

所產生之醣(藉由重組或合成方式)包括衍生自任何大腸桿菌血清型之結構，該血清型包括例如以下大腸桿菌血清型中之任一者：O1 (例如，O1A、O1B及O1C)、O2、O3、O4 (例如，O4:K52及O4:K6)、O5 (例如，O5ab及O5ac (菌株180/C3))、O6 (例如，O6:K2；K13；K15及O6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18 (例如，O18A、O18ac、O18A1、O18B及O18B1)、O19、O20、O21、O22、O23 (例如，O23A)、O24、O25 (例如，O25a及O25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45 (例如，O45及O45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D ₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73 (例如，O73 (菌株73-1))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

個別多醣通常經由此項技術中已知之方法來純化(相對於多醣-蛋白質綴合物之量增濃)，該等方法諸如滲析、濃縮操作、透濾操作、切向流過濾、沈澱、溶離、離心、沈澱、超過濾、深度過濾及/或管柱層析(離子交換層析、多模式離子交換層析、DEAE及疏水相互作用層析)。較佳地，多醣經由包括切向流過濾之方法來純化。

經純化多醣可被活化(例如化學活化)以使其能夠反應(例如直接與載體蛋白質反應或經由諸如eTEC間隔基之連接子)，且隨後併入本發明之醣綴合物中，如本文進一步描述。

在一個較佳實施例中，本發明之醣係衍生自大腸桿菌血清型，其中血清型為O25a。在另一較佳實施例中，血清型為O25b。在另一較佳實施例中，血清型為O1A。在另一較佳實施例中，血清型為O2。在另一較佳實施例中，血清型為O6。在另一較佳實施例中，血清型為O17。在另一較佳實施例中，血清型為O15。在另一較佳實施例中，血清型為O18A。在另一較佳實施例中，血清型為O75。在另一較佳實施例中，血清型為O4。在另一較佳實施例中，血清型為O16。在另一較佳實施例中，血清型為O13。在另一較佳實施例中，血清型為O7。在另一較佳實施例中，血清型為O8。在另一較佳實施例中，血清型為O9。

如本文所用，提及上文所列之血清型中之任一者，係指涵蓋此項技術中已知之重複單元結構(O-單元，如下文所描述)且對於對應血清型特有的血清型。舉例而言，術語「O25a」血清型(在此項技術中亦稱為血清型「O25」)係指涵蓋表 1中所展示之式O25之血清型。作為另一實例，術語「O25b」血清型係指涵蓋表 1中所展示之式O25b之血清型。

如本文所用，除非另外規定，否則血清型在本文中為一般提及的，例如術語式「O18」一般係指涵蓋式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B及式O18B1。

如本文所用，術語「O1」一般係指根據表 1涵蓋在式名稱中包括通用術語「O1」之式的物種，諸如式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C中之任一者，其中之每一者在表 1中展示。因此，「O1血清型」一般係指涵蓋式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C中之任一者之血清型。

如本文所用，術語「O6」一般係指根據表 1在式名稱中包括通用術語「O6」之式物種，諸如式O6:K2；K13；K15；及O6:K54中之任一者，其中之每一者在表 1中展示。因此，「O6血清型」一般係指涵蓋式O6:K2；K13；K15；及O6:K54中之任一者之血清型。

一般係指根據表 1在式名稱中包括通用術語之式物種的術語之其他實例包括：「O4」、「O5」、「O18」及「O45」。

如本文所用，術語「O2」係指表 1中展示之式O2。術語「O2 O-抗原」係指涵蓋表 1中展示之式O2之醣。

如本文所用，提及來自上文所列之血清型的O-抗原係指涵蓋用對應血清型名稱標記之式的醣。舉例而言，術語「O25B O-抗原」係指涵蓋表 1中展示之式O25B之醣。

作為另一實例，術語「O1 O-抗原」一般係指涵蓋包括術語「O1」，諸如式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C (其中之每一者在表 1中展示)之式的醣。

作為另一實例，術語「O6 O-抗原」一般係指涵蓋包括術語「O6」，諸如式O6:K2；式O6:K13；式O6:K15及式O6:K54 (其中之每一者在表 1中展示)之式的醣。

B. O-多醣如本文所用，術語「O-多醣」係指包括O-抗原之任何結構，其限制條件為該結構不包括全細胞或脂質A。舉例而言，在一個實施例中，O-多醣包括脂多醣，其中未結合脂質A。移除脂質A之步驟為此項技術中已知的，且作為一實例，包括在添加酸之情況下進行熱處理。例示性程序包括在100℃下用1%乙酸處理90分鐘。將此程序與作為移除分離脂質A之程序組合。用於分離脂質A之例示性程序包括超速離心。

在一個實施例中，O-多醣係指由O-抗原組成之結構，在此情況下，O-多醣與術語O-抗原同義。在一個較佳實施例中，O-多醣係指包括O-抗原之重複單元而不具有核心醣之結構。因此，在一個實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌K12核心部分。在另一較佳實施例中，O-多醣係指包括O-抗原及核心醣之結構。在另一實施例中，O-多醣係指包括O-抗原、核心醣及KDO部分之結構。

自LPS純化包括核心寡醣之O-多醣之方法為此項技術中已知的。舉例而言，在純化LPS之後，經純化LPS可藉由以下來進行水解：在100攝氏度下於1% (v/v)乙酸中加熱90分鐘，接著在4攝氏度下於142,000×g下超速離心5小時。將含有O-多醣之上清液冷凍乾燥且儲存在4攝氏度下。在某些實施例中，描述莢膜合成基因之缺失以使得能夠簡化O-多醣之純化。

O-多醣可藉由包括(但不限於)弱酸水解以自LPS移除脂質A之方法來進行分離。其他實施例可包括使用肼作為用於O-多醣製備之藥劑。LPS之製備可藉由此項技術中已知的方法來實現。

在某些實施例中，提供自表現(不一定過度表現) wzz蛋白質(例如wzzB)之野生型、經修飾或減毒革蘭氏陰性菌株純化之O-多醣，以用於綴合物疫苗中。在較佳實施例中，自表現(不一定過度表現) wzz蛋白質用作呈綴合物或複合疫苗之疫苗抗原的革蘭氏陰性菌株純化O-多醣鏈。

在一個實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加以下倍之分子量：約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多倍。在一較佳實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加至少1倍及至多5倍之分子量。在另一實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加至少2倍及至多4倍之分子量。O-多醣之分子量相較於對應野生型O-多醣之增加較佳地與O-抗原重複單元之數目之增加相關。在一個實施例中，O-多醣之分子量之增加係由於wzz家族蛋白質所致。

在一個實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加以下之分子量：約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 kDa或更多。在一個實施例中，本發明之O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加至少1 kDa及至多200 kDa之分子量。在一個實施例中，分子量增加至少5及至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少18及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少21及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少22及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少30及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少1及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少5及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少1及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少5及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少18及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少30及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多90kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多85kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多70kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多60kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多50kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多49kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多48kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多47kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多46kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多45kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多44kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多43kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多42kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多41kDa。O-多醣之分子量相較於對應野生型O-多醣之此類增加較佳地與O-抗原重複單元之數目之增加相關。在一個實施例中，O-多醣之分子量之增加係由於wzz家族蛋白質所致。參見例如表 21。

在另一實施例中，O-多醣包括選自表 1之任一式，其中O-多醣中之重複單元數目 n比對應野生型O-多醣中之重複單元數目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元。較佳地，醣相較於對應野生型O-多醣包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元之增加。參見例如表 21。

C. O-抗原 O-抗原為革蘭氏陰性細菌外膜中之脂多醣(LPS)之一部分。O-抗原係在細胞表面上且為一種可變細胞成分。O-抗原之變化性為革蘭氏陰性細菌之血清分型提供基礎。目前大腸桿菌血清分型方案包括O-多醣1至181。

O-抗原包括寡醣重複單元(O-單元)，其野生型結構通常含有來自大範圍糖之兩個至八個殘基。例示性大腸桿菌O-抗原之O單元展示於表 1中，亦參見圖 9A 至圖 9C及圖 10A 至圖 10 B。

在一個實施例中，本發明之醣可為一個寡醣單元。在一個實施例中，本發明之醣為相關血清型之一個重複寡醣單元。在此類實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97及式O101中之任一者的結構。在另一實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6及式O25b中之任一者的結構。

在一個實施例中，本發明之醣可為寡醣。寡醣具有低數目之重複單元(通常5-15個重複單元)，且通常以合成方式或藉由多醣之水解得到。在此類實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97及式O101中之任一者的結構。在另一實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6及式O25b中之任一者的結構。

較佳地，本發明及本發明之免疫原性組合物中之所有醣為多醣。高分子量多醣可由於存在於抗原表面上之抗原決定基而誘導某些抗體免疫反應。較佳地涵蓋高分子量多醣之分離及純化，以用於本發明之綴合物、組合物及方法中。

在一些實施例中，各個別O-抗原聚合物中之重複O單元之數目(且因此聚合物鏈之長度及分子量)視wzz鏈長調節劑(一種內膜蛋白質)而定。不同wzz蛋白質賦予不同範圍之模態長度(4至＞100個重複單元)。術語「模態長度」係指重複O-單元之數目。革蘭氏陰性細菌通常具有賦予兩種不同OAg模態鏈長(一個較長且一個較短)之兩種不同Wzz蛋白質。革蘭氏陰性細菌中之wzz家族蛋白質(例如wzzB)之表現(不一定過度表現)可允許操縱O-抗原長度，以改變或調節某些長度範圍之O-抗原之細菌產量，及以增強高產率大分子量脂多醣之產量。在一個實施例中，如本文所用，「短」模態長度係指低數目之重複O-單元，例如1-20個。在一個實施例中，如本文所用，「長」模態長度係指大於20及至多最大40個之多個重複O-單元。在一個實施例中，如本文所用，「極長」模態長度係指大於40個重複O-單元。

在一個實施例中，所產生之醣相較於對應野生型O-多醣增加至少10個重複單元、15個重複單元、20個重複單元、25個重複單元、30個重複單元、35個重複單元、40個重複單元、45個重複單元、50個重複單元、55個重複單元、60個重複單元、65個重複單元、70個重複單元、75個重複單元、80個重複單元、85個重複單元、90個重複單元、95個重複單元或100個重複單元。

在另一實施例中，本發明之醣相較於對應野生型O-多醣增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元。較佳地，醣相較於對應野生型O-多醣包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元之增加。參見例如表 21。確定醣長度之方法為此項技術中已知的。此類方法包括核磁共振、質譜分析及尺寸排阻層析，如實例 13中所描述。

確定醣中之重複單元數目之方法亦為此項技術中已知的。舉例而言，重複單元數目(或式中之「 n」)可藉由以下來計算：將多醣之分子量(不具有核心醣或KDO殘基之分子量)除以重複單元之分子量(亦即，例如表 1中展示之對應式中之結構之分子量，其可理論上計算為式中之各單醣之分子量的總和)。式中之各單醣之分子量為此項技術中已知的。式O25b之重複單元之分子量例如為約862 Da。式O1a之重複單元之分子量例如為約845 Da。式O2之重複單元之分子量例如為約829 Da。式O6之重複單元之分子量例如為約893 Da。當確定綴合物中之重複單元數目時，將載體蛋白質分子量及蛋白質:多醣比率納入計算。如本文所定義，「 n」係指多醣分子中之重複單元( 表 1中之括號中所表示)之數目。如此項技術中已知，在生物學大分子中，重複結構中可穿插有不完全重複區，諸如丟失分支。另外，此項技術中已知，自天然來源(諸如細菌)分離及純化之多醣在大小上及在分支上可為非均一的。在此情況下， n可表示群體中之分子之 n的平均或中位值。

在一個實施例中，O-多醣相較於對應野生型O-多醣具有O-抗原之至少一個重複單元之增加。O-抗原之重複單元在表 1中展示。在一個實施例中，O-多醣包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個總重複單元。較佳地，醣具有總共至少3個至至多80個重複單元。在另一實施例中，O-多醣相較於對應野生型O-多醣具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元之增加。

在一個實施例中，醣包括O-抗原，其中O-抗原式(諸如表 1中展示之式(亦參見圖 9A 至圖 9C及圖 10A 至圖 10B))中之任一者中之 n為至少1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40及至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50之整數。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。例示性範圍包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；及至少20至至多80，較佳地至多90。在一個較佳實施例中， n為至少31至至多90。在一較佳實施例中， n為40至90，更佳地60至85。

在一個實施例中，醣包括O-抗原，其中O-抗原式中之任一者中之 n為至少1及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少5及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少10及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少25及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少75及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少100及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少125及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少150及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少175及至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少1及至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少5及至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少10及至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少25及至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50及至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少75及至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少1及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少5及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少10及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少20及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少25及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少30及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少40及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少30及至多90。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多85。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多70。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多60。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多50。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多49。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多48。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多47。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35及至多46。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少36及至多45。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少37及至多44。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少38及至多43。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少39及至多42。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少39及至多41。

舉例而言，在一個實施例中，醣中之 n為31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90，最佳地40。在另一實施例中， n為至少35至至多60。舉例而言，在一個實施例中， n為以下中之任一者：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59及60，較佳地50。在另一較佳實施例中， n為至少55至至多75。舉例而言，在一個實施例中， n為55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69，最佳地60。

醣結構可藉由此項技術中已知之方法及工具確定，諸如NMR，包括1D、1H及/或13C、2D TOCSY、DQF-COSY、NOESY及/或HMQC。

在一些實施例中，在綴合之前經純化多醣具有5 kDa至400 kDa之間的分子量。在其他此類實施例中，醣具有以下之分子量：在10 kDa與400 kDa之間；在5 kDa與400 kDa之間；在5 kDa與300 kDa之間；在5 kDa與200 kDa之間；在5 kDa與150 kDa之間；在10 kDa與100 kDa之間；在10 kDa與75 kDa之間；在10 kDa與60 kDa之間；在10 kDa與40 kDa之間；在10 kDa與100 kDa之間；在10 kDa與200 kDa之間；在15 kDa與150 kDa之間；在12 kDa與120 kDa之間；在12 kDa與75 kDa之間；在12 kDa與50 kDa之間；在12 kDa與60 kDa之間；在35 kDa與75 kDa之間；在40 kDa與60 kDa之間；在35 kDa與60 kDa之間；在20 kDa與60 kDa之間；在12 kDa與20 kDa之間；或在20 kDa與50 kDa之間。在其他實施例中，多醣具有在以下之間的分子量：7 kDa至15 kDa；8 kDa至16 kDa；9 kDa至25 kDa；10 kDa至100 kDa；10 kDa至60 kDa；10 kDa至70 kDa；10 kDa至160 kDa；15 kDa至600 kDa；20 kDa至1000 kDa；20 kDa至600 kDa；20 kDa至400 kDa；30 kDa至1,000 KDa；30 kDa至60 kDa；30 kDa至50 kDa或5 kDa至60 kDa。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

如本文所用，術語多醣或載體蛋白質-多醣綴合物之「分子量」係指藉由尺寸排阻層析(SEC)與多角度雷射光散射偵測器(MALLS)組合計算之分子量。

多醣之大小在正常純化程序期間可能略微減小。另外，如本文所描述，多醣可在綴合之前經受尺寸測試技術。可採用機械或化學大小確定。可使用乙酸進行化學水解。機械大小測定可使用高壓均質化剪切來進行。上文提及之分子量範圍係指在綴合之前(例如在活化之前)之經純化多醣。表1：大腸桿菌血清群/血清型及O-單元部分

血清群 / 血清型	部分結構 ( O - 單元 )	部分結構在本文中被稱作：
O1A，O1A1	[→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1A
O1B	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→\|β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1B
O1C	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→\|β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1C
O2	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Fuc3NAc-(1→2) ] _n	式O2
O3	[β-L-RhaNAc(1→4)α-D-Glc-(1→4)\| \| →3)-β-D-GlcNAc-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O3
O4:K52	[→2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O4:K52
O4:K6	[α-D-Glc-(1→3) \| →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O4:K6
O5ab	[→4)-β-D-Qui3NAc-(1→3)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc(1→] _n	式O5ab
O5ac (菌株180/C3)	[→2)-β-D-Qui3NAc-(1→3)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc(1→ ] _n	式O5ac (菌株180/C3)
O6:K2；K13；K15	[→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→2) ] _n	式O6:K2；K13；K15
O6:K54	[→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→\|β-D-GlcNAc-(1→2) ] _n	式O6:K54
O7	[α-L-Rha-(1→3) \| →3)-β-D-Qui4NAc-(1→2)-α-D-Man-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O7
O10	[→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Fuc4N醯基-(1→2)醯基=乙醯基(60%)或(R)-3-羥基丁醯基(40%) ] _n	式O10
O16	[→2)-β-D-Galf-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-Rha2Ac-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O16
O17	[α-D-Glc-(1→6) \| →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O17
O18A、O18ac	[→2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O18A、式O18ac
O18A1	[α-D-Glc-(1→6) \| →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O18A1
O18B	[→3)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→3) ] _n	式O18B
O18B1	[α-D-Glc-(1→4) \| →3)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→3) ] _n	式O18B1
O21	[β-D-Gal-(1→4) \| →3)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→2) ] _n	式O21
O23A	[α-D-Glc-(1→6) \| →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc(1→3) ] _n	式O23A
O24	[→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-D-Glc-(1→2) ] _n	式O24
O25/O25a	[β-D-Glc-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-L-Rha-(1→3) ] _n	式O25a
O25b	β-Glc p- 1 ↓ 6 [α-Rha p-(1→3)-α-Glc p-(1→3)-α-Rha p2OAc-(1→3)-β-Glc pNAc-] _n	式O25b
O26	[ →3)-α-L-Rha-(1→4)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O26
O28	[ →2)-(R)-Gro-1-P→4)-β-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-Galf2Ac-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O28
O36	[α-L-Rha p-(1→2)-α-L-Fuc p1 ↓ 3 →4)-α-D-Man p-(1→3)-α-L-Fuc p-(1→3)-β-D-Glc pNAc-(1→] n	式O36
O44	[ α-D-Glc-(1→4) \| →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O44
O45	[ →2)-β-D-Glc-(1→3)-α-L-6dTal2Ac-(1→3)-α-D-FucNAc-(1→ ] _n	式O45
O45rel	[ →2)-β-D-Glc-(1→3)-α-L-6dTal2Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O45rel
O54	[→4)-α-d-GalpA-(1 → 2)-α-l-Rhap-(1 → 2)-β-d-Ribf-(1 → 4)-β-d-Galp-(1 → 3)-β-d-GlcpNAc-(1→] n	式O54
O55	[ →6)-β-D-GlcNAc-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-Col-(1→2)-β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O55
O56	[ →7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Gal-(1→2) ] _n	式O56
O57	[→3)-α-D-Gal p-(1→3)-α-L-Fuc pNAc-(1→3)-α-D-Glc pNAc-(1→] n2 4 ↑ ↑ 1 1 α-D-Gal pA2/3Ac β-D-Glc p	式O57
O58	[ 3-O-[(R)-1-羧基乙基]-α-L-Rha -(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man2Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O58
O64	[ β-D-Gal-(1→6) \| →3)-α-D-ManNAc-(1→3)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O64
O68	[α-L-Rha pα-D-Glc p1 1 ↓ ↓ 3 3 →6)-α-D-Man p-(1→2)-α-D-Man p-(1→2)-α-D-Man p-(1→2)-β-D-Man p-(1→3)-α-D-Glc pNAC-(1→] n	式O68
O69	[ →2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O69
O73 (菌株73-1)	[ α-D-Glc-(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GalNAc(1→ ] _n	式O73 (菌株73-1)
O74	→6)-α-D-Glc pNAc-(1→4)-β-D-Gal pA-(1→3)-β-D-Glc pNAc-(1→] n⎮ [β-D-Fuc p3NAc-(1→3)	式O74
O75	[ β-D-Man-(1→4) \| →3)-α-D-Gal-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O75
O76	[→4)-β-D-Glc pA-(1→4)-β-D-Gal pNAc3Ac-(1→4)-α-D-Gal pNAc-(1→3)-β-D-Gal pNAc-(1→] n	式O76
O77	[ →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O77
O78	[ →4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O78
O86	[ α-D-Gal-(1→3) \| →4)-α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O86
O88	[ α-L-6dTal-(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O88
O90	[ →4)-α-L-Fuc2/3Ac-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O90
O98	[ →3)-α-L-QuiNAc-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-α-L-QuiNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O98
O104	[ →4)-α-D-Gal-(1→4)-α-Neu5,7,9Ac ₃-(2→3)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] _n	式O104
O111	[ α-Col-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-Col-(1→3) ] _n	式O111
O113	[ →4)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O113
O114	[ →4)-β-D-Qui3N(N-乙醯基-L-絲胺醯基)-(1→3)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O114
O119	[ β-D-RhaNAc3NFo-(1→3) \| →2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-Gal-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O119
O121	[ →3)-β-D-Qui4N(N-乙醯基-甘胺醯基)-(1→4)-α-D-GalNAc3AcA6N-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O121
O124	[ 4-O-[(R)-1-羧基乙基]-β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc(1→4) \|→3)-α-D-Gal-(1→6)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O124
O125	[ α-D-Glc-(1→3) \| →4)-β-D-GalNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ \| β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O125
O126	[ →2)-β-D-Man-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-L-Fuc-(1→2) ] _n	式O126
O127	[ →2)-α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O127
O128	[ α-L-Fuc-(1→2) \| →6)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O128
O136	[ →4)-β-Pse5Ac7Ac-(2→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→β-Pse5Ac7Ac=5,7-二乙醯胺基-3,5,7,9-四去氧基-L- 丙三氧基-β-L- 甘露-尤羅索尼克酸] _n	式O136
O138	[ →2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O138
O140	[α-D-Gal f-(1→2)-α-L-Rha p1 ↓ 4 →3)-β-D-Gal p-(1→4)-α-D-Glc p-(1→4)-β-D-Glc pA-(1→3)-β-D-Gal pNAc-(1→] n	式O140
O141	[ α-L-Rha-(1→3) \|→4)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man6Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcA-(1→2) ] _n	式O141
O142	[ →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O142
O143	[ →2)-β-D-GalA6R3,4Ac-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ R=1,3-二羥基-2-丙胺基] _n	式O143
O147	[ →2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→4)-β-D-GalA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O147
O149	[ →3)-β-D-GlcNAc-(S)-4,6Py-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ (S)-4,6Py=4,6-O-[(S)-1-羧基亞乙基]- ] _n	式O149
O152	[ β-L-Rha-(1→4) \| →3)-α-D-GlcNAc-(1-P→6)-α-D-Glc-(1→2)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O152
O157	[ →2)-α-D-Rha4NAc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O157
O158	[ α-D-Glc-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-L-Rha-(1→3) ] _n	式O158
O159	[ α-L-Fuc-(1→4) \| →3)-β-D-GlcNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O159
O164	[ β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc(1→4) \| →3)-β-D-Gal-(1→6)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O164
O173	[ α-L-Fuc-(1→4) \| →3)-α-D-Glc-(1-P→6)-α-D-Glc-(1→2)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→] _n	式O173
62D ₁視為草生歐文氏菌( Erwinia herbicola)	[ α-D-Gal(1→6) \| →2)-β-D-Qui3NAc-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-FucNAc-(1→ ] _n	式62D ₁
O22	[ →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-GalNAc3Ac-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] _n	式O22
O35	[ →3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-GalNAcA6N-(1→2) ] _n	式O35
O65	[ →2)-β-D-Qui3NAc-(1→4)-α-D-GalA6N-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GalA-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O65
O66	[ →2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→2)-β-D-Glc3Ac-(1→3)-α-L-6dTal-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O66
O83	[ →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→6)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O83
O91	[ →4)-α-D-Qui3N醯基-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-GlcA6NGly-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→醯基=(R)-3-羥基丁醯基] _n	式O91
O105	[ β-D-Ribf-(1→3) \|→4)-α-D-GlcA2Ac3Ac-(1→2)-α-L-Rha4Ac-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc6Ac-(1→ ] _n	式O105
O116	[ →2)-β-D-Qui4NAc-(1→6)-α-D-GlcNAc-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O116
O117	[ →4)-β-D-GalNAc-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→] _n	式O117
O139	[ β-D-Glc-(1→3) \| →3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalA-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O139
O153	[ →2)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-α-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O153
O167	[ α-D-Galf-(1→4) \| →2)-β-D-GalA6N(L)Ala-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→2)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O167
O172	[ →3)-α-L-FucNAc-(1→4)-α-D-Glc6Ac-(1-P→4)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O172
O8	[ →2)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-β-D-Man-(1→ ] _n	式O8
O9a	[ →2)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→ ] _n	式O9a
O9	[ →2)-[α-D-Man-(1→2)] ₂-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→ ] _n	式O9
O20ab	[ →2)-β-D-Ribf-(1→4)-α-D-Gal-(1→ ] _n	式O20ab
O20ac	[ α-D-Gal-(1→3) \| →2)-β-D-Ribf-(1→4)-α-D-Gal-(1→ ] _n	式O20ac
O52	[ →3)-β-D-Fucf-(1→3)-β-D-6dmanHep2Ac-(1→ ] _n	式O52
O97	[ →3)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→ \|\| β-D-Xulf-(2→2)β-D-Xulf-(2→2) ] _n	式O97

† β-D-6d manHep2Ac為2- O -乙醯基-6-去氧-β-D- 甘露-庚哌喃糖基。 ‡ β-D-Xul f為β-D- 蘇-呋喃戊醣基。

D. 核心寡醣核心寡醣位於野生型大腸桿菌LPS中之脂質A與O-抗原外區之間。更具體言之，核心寡醣為多醣中包括野生型大腸桿菌中之O-抗原與脂質A之間的鍵的部分。此鍵包括最內3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO))殘基之半縮酮官能基與脂質A之GlcNAc-殘基之羥基之間的酮苷鍵。在野生型大腸桿菌菌株中，核心寡醣區顯示較高程度之相似性。其通常包括有限數目之糖。核心寡醣包括內部核心區及外部核心區。

更具體言之，內部核心主要由L-甘油-D-甘露-庚醣(庚醣)及KDO殘基構成。內部核心為高度保守的。KDO殘基包括以下式KDO：

核心寡醣之外區展示比內部核心區更多變化，此區域中之差異區分大腸桿菌中之五種化學型：R1、R2、R3、R4及K-12。參見圖 24，其說明五種已知化學型之外部核心寡醣之碳水化合物主鏈之一般化結構。HepII為內部核心寡醣之最後一個殘基。儘管所有外部核心寡醣共用結構主題，具有(己醣) ₃碳水化合物主鏈及兩個側鏈殘基，但主鏈中之己糖之次序及側鏈殘基之性質、位置及連接全部均可變化。R1及R4外部核心寡醣之結構高度類似，相差僅單個β-連接的殘基。

在此項技術中，基於遠端寡醣之結構，將野生型大腸桿菌之核心寡醣分成五種不同化學型：大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12。

在一較佳實施例中，本文所描述之組合物包括醣綴合物，其中O-多醣包括與O-抗原結合之核心寡醣。在一個實施例中，組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者的免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少兩種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少三種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少四種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對所有五種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。

在另一較佳實施例中，本文所描述之組合物包括醣綴合物，其中O-多醣不包括與O-抗原結合之核心寡醣。在一個實施例中，此類組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者的免疫反應，儘管醣綴合物具有不包括核心寡醣之O-多醣。

大腸桿菌血清型可根據五種化學型中之一者來進行表徵。表 2列舉根據化學型表徵之例示性血清型。呈粗體形式之血清型表示最常與所指示核心化學型相關之血清型。因此，在一較佳實施例中，組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者的免疫反應，該免疫反應包括針對各別對應大腸桿菌血清型中之任一者的免疫反應。表2：核心化學型及相關大腸桿菌血清型

核心化學型	血清型
R1	O25a、O6、 O2、 O1、O75、O4、 O16、O8、O18、O9、O13、O20、O21、O91及O163。
R2	O21、O44、O11、O89、O162、O9
R3	O25b、O15、O153、O21、O17、O11、O159、O22、O86、O93
R4	O2、O1、O86、O7、O102、O160、O166
K-12	O25b、O16

在一些實施例中，組合物包括包含衍生自具有R1化學型之血清型的結構，例如選自具有以下之醣的醣：式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O8、式O18、式O9、式O13、式O20、式O21、式O91及式O163，其中 n為1至100。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如展示於圖 24中之大腸桿菌R1核心部分。

在一些實施例中，組合物包括包含衍生自具有R1化學型之血清型的結構，例如選自具有以下之醣的醣：式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O18、式O13、式O20、式O21、式O91及式O163，其中 n為1至100，較佳地31至100，較佳地31至90，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括在該醣中之大腸桿菌R1核心部分。

在一些實施例中，組合物包括包含衍生自具有R2化學型之血清型之結構，例如選自具有以下之醣的醣：式O21、式O44、式O11、式O89、式O162及式O9，其中 n為1至100，較佳地31至100，較佳地31至90，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如展示於圖 24中之大腸桿菌R2核心部分。

在一些實施例中，組合物包括包含衍生自具有R3化學型之血清型之結構，例如選自具有以下之醣的醣：式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86及式O93，其中 n為1至100，較佳地31至100，較佳地31至90，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如展示於圖 24中之大腸桿菌R3核心部分。

在一些實施例中，組合物包括包含衍生自具有R4化學型之血清型之結構，例如選自具有以下之醣的醣：式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160及式O166，其中 n為1至100，較佳地31至100，較佳地31至90，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如展示於圖 24中之大腸桿菌R4核心部分。

在一些實施例中，組合物包括包含衍生自具有K-12化學型之血清型之結構(例如選自具有式O25b之醣及具有式O16之醣)的醣，其中 n為1至1000，較佳地31至100，較佳地31至90，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如展示於圖 24中之大腸桿菌K-12核心部分。

在一些實施例中，醣包括核心醣。因此，在一個實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌K12核心部分。

在一些實施例中，醣不包括核心醣。因此，在一個實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌K12核心部分。

E.綴合O-抗原 O-抗原或較佳地O-多醣與蛋白質載體之化學鍵可改進O-抗原或O-多醣之免疫原性。然而，聚合物大小之變化性表示用於生產之一個實踐難題。在商業用途中，醣之大小可影響與不同綴合合成策略之相容性、產物均一性及綴合物免疫原性。經由操縱O-抗原合成路徑控制Wzz家族蛋白質鏈長調節劑之表現允許在多種革蘭氏陰性菌株(包括大腸桿菌)中產生所需長度之O-抗原鏈。

在一個實施例中，經純化醣經化學活化以產生能夠與載體蛋白質反應之活化醣。一旦活化，則各醣單獨地與載體蛋白質綴合，形成綴合物，即醣綴合物。如本文所用，術語「醣綴合物」係指與載體蛋白質共價連接之醣。在一個實施例中，醣直接與載體蛋白質連接。在另一實施例中，醣經由間隔基/連接子與蛋白質連接。

可藉由在沿O-抗原之一個位點處或在多個位點處將載體與O-抗原結合之方案，或藉由活化核心寡醣之至少一個殘基之方案，來製備綴合物。

在一個實施例中，各醣與相同載體蛋白質綴合。

若組合物中之2種或更多種醣之蛋白質載體相同，則該等醣可與載體蛋白質之相同分子(例如具有與其綴合之2種或更多種醣之載體分子)綴合。

在一較佳實施例中，醣各自獨立地與蛋白質載體之不同分子(蛋白質載體之各分子僅具有與其綴合之一種類型的醣)綴合。在該實施例中，將醣稱為獨立地與載體蛋白質綴合。

醣之化學活化及與載體蛋白質之後續綴合可藉由本文所揭示之活化及綴合方法來達成。在多醣與載體蛋白質綴合之後，藉由多種技術來純化(相對於多醣-蛋白質綴合物之量增濃)醣綴合物。此等技術包括濃縮/透濾操作、沈澱/溶離、管柱層析及深度過濾。在將個別醣綴合物純化之後，將其進行混配以調配本發明之免疫原性組合物。

活化 .本發明進一步係關於根據本文所描述之任一實施例產生之經活化多醣，其中該多醣用化學試劑活化以產生用於與連接子或載體蛋白質綴合之反應性基團。在一些實施例中，本發明之醣係在與載體蛋白質綴合之前活化。在一些實施例中，活化程度不顯著地減小多醣之分子量。舉例而言，在一些實施例中，活化程度不使多醣主鏈裂解。在一些實施例中，活化程度不顯著地影響綴合程度，如藉由載體蛋白質(諸如CRM ₁₉₇)中經修飾之離胺酸殘基之數目(如藉由胺基酸分析所確定)所量測。舉例而言，在一些實施例中，相較於在相同活化程度下，與參考多醣綴合之載體蛋白質中經修飾之離胺酸殘基之數目，活化程度不顯著地增加載體蛋白質中經修飾之離胺酸殘基之數目(如藉由胺基酸分析所確定) 3倍。在一些實施例中，活化程度不增加未綴合游離醣之水準。在一些實施例中，活化程度不降低最佳醣/蛋白質比率。

在一些實施例中，經活化醣具有以下之活化百分比，其中經活化醣之每醣重複單元之硫醇莫耳數係在1-100%之間，諸如在2-80%之間，在2-50%之間，在3-30%之間及在4-25%之間。活化程度為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%或≥ 90%，或約100%。較佳地，活化程度為至多50%，更佳地至多25%。在一個實施例中，活化程度為至多20%。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。

在一個實施例中，多醣用1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)活化，形成氰酸酯。隨後，將經活化多醣直接與載體蛋白質(較佳地CRM ₁₉₇或破傷風類毒素)上之胺基偶聯或經由間隔基(連接子)與其偶聯。

舉例而言，間隔基可為產生硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該硫醇化多醣可經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[Y-馬來醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵素乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯胺、N-丁二醯亞胺基溴乙酸酯(SBA；SIB)、N-丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、磺基丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、N-丁二醯亞胺基碘乙酸酯(SIA)或丁二醯亞胺基3-[溴乙醯胺基]丙酸酯(SBAP))反應之後獲得之硫醚鍵，而與載體偶聯。在一個實施例中，將氰酸酯(視情況藉由CDAP化學方法製備)與己烷二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶聯，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學方法，經由蛋白質載體上之羧基，將胺基衍生之醣與載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)綴合。

用於綴合之其他適合之技術使用碳二醯亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基丁二醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。綴合可涉及羰基連接子，其可藉由醣之游離羥基與CDI反應，接著與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵來形成。此可涉及將變旋異構端還原成一級羥基，視情況選用之保護/去保護該一級羥基，該一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間物，且將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上之胺基偶聯(CDI化學方法)。

分子量 .在一些實施例中，醣綴合物包含具有在10 kDa與2,000 kDa之間的分子量之醣。在其他實施例中，醣之分子量在50 kDa與1,000 kDa之間。在其他實施例中，醣之分子量在70 kDa與900 kDa之間。在其他實施例中，醣之分子量在100 kDa與800 kDa之間。在其他實施例中，醣之分子量在200 kDa與600 kDa之間。在其他實施例中，醣之分子量為100 kDa至1000 kDa；100 kDa至900 kDa；100 kDa至800 kDa；100 kDa至700 kDa；100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；150 kDa至1,000 kDa；150 kDa至900 kDa；150 kDa至800 kDa；150 kDa至700 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；200 kDa至1,000 kDa；200 kDa至900 kDa；200 kDa至800 kDa；200 kDa至700 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；200 kDa至300；250 kDa至1,000 kDa；250 kDa至900 kDa；250 kDa至800 kDa；250 kDa至700 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至1,000 kDa；300 kDa至900 kDa；300 kDa至800 kDa；300 kDa至700 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至1,000 kDa；400 kDa至900 kDa；400 kDa至800 kDa；400 kDa至700 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa。在一個實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由單端綴合產生。在另一實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由在水性緩衝液中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

在一些實施例中，本發明之醣綴合物具有在400 kDa與15,000 kDa之間；在500 kDa與10,000 kDa之間；在2,000 kDa與10,000 kDa之間；在3,000 kDa與8,000 kDa之間；或在3,000 kDa與5,000 kDa之間的分子量。在其他實施例中，醣綴合物具有在500 kDa與10,000 kDa之間的分子量。在其他實施例中，醣綴合物具有在1,000 kDa與8,000 kDa之間的分子量。在另其他實施例中，醣綴合物具有在2,000 kDa與8,000 kDa之間或在3,000 kDa與7,000 kDa之間的分子量。在其他實施例中，本發明之醣綴合物具有以下之分子量：在200 kDa與20,000 kDa之間；在200 kDa與15,000 kDa之間；在200 kDa與10,000 kDa之間；在200 kDa與7,500 kDa之間；在200 kDa與5,000 kDa之間；在200 kDa與3,000 kDa之間；在200 kDa與1,000 kDa之間；在500 kDa與20,000 kDa之間；在500 kDa與15,000 kDa之間；在500 kDa與12,500 kDa之間；在500 kDa與10,000 kDa之間；在500 kDa與7,500 kDa之間；在500 kDa與6,000 kDa之間；在500 kDa與5,000 kDa之間；在500 kDa與4,000 kDa之間；在500 kDa與3,000 kDa之間；在500 kDa與2,000 kDa之間；在500 kDa與1 ,500 kDa之間；在500 kDa與1,000 kDa之間；在750 kDa與20,000 kDa之間；在750 kDa與15,000 kDa之間；在750kDa與12,500 kDa之間；在750kDa與10,000 kDa之間；在750kDa與7,500 kDa之間；在750 kDa與6,000 kDa之間；在750 kDa與5,000 kDa之間；在750 kDa與4,000 kDa之間；在750 kDa與3,000 kDa之間；在750 kDa與2,000 kDa之間；在750 kDa與1,500 kDa之間；在1,000 kDa與15,000 kDa之間；在1,000 kDa與12,500 kDa之間；在1,000 kDa與10,000 kDa之間；在1,000 kDa與7,500 kDa之間；在1,000 kDa與6,000 kDa之間；在1,000 kDa與5,000 kDa之間；在1,000 kDa與4,000 kDa之間；在1,000 kDa與2,500 kDa之間；在2,000 kDa與15,000 kDa之間；在2,000 kDa與12,500 kDa之間；在2,000 kDa與10,000 kDa之間；在2,000 kDa與7,500 kDa之間；在2,000 kDa與6,000 kDa之間；在2,000 kDa與5,000 kDa之間；在2,000 kDa與4,000 kDa；或在2,000 kDa與3,000 kDa之間。在一個實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由本文所描述之eTEC綴合產生。在另一實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由還原胺化化學方法(RAC)產生。在另一實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由在DMSO中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生。

在其他實施例中，本發明之醣綴合物具有以下之分子量：在1,000 kDa與20,000 kDa之間；在1,000 kDa與15,000 kDa之間；在2,000 kDa與10,000 kDa之間；在2000 kDa與7,500 kDa之間；在2,000 kDa與5,000 kDa之間；在3,000 kDa與20,000 kDa之間；在3,000 kDa與15,000 kDa之間；在3,000 kDa與12,500 kDa之間；在4,000 kDa與10,000 kDa之間；在4,000 kDa與7,500 kDa之間；在4,000 kDa與6,000 kDa；或在5,000 kDa與7,000 kDa之間。在一個實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由還原胺化化學方法(RAC)產生。在另一實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由在DMSO中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生。在另一實施例中，具有此類分子量之醣綴合物係藉由本文所描述之eTEC綴合產生。

在其他實施例中，本發明之醣綴合物具有在5,000 kDa與20,000 kDa之間；在5,000 kDa與15,000 kDa之間；在5,000 kDa與10,000 kDa之間；在5,000 kDa與7,500 kDa之間；在6,000 kDa與20,000 kDa之間；在6,000 kDa與15,000 kDa之間；在6,000 kDa與12,500 kDa之間；在6,000 kDa與10,000 kDa之間或在6,000 kDa與7,500 kDa之間的分子量。

醣綴合物之分子量可藉由SEC-MALLS來量測。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。本發明之醣綴合物亦可藉由醣與載體蛋白質之比率(重量/重量)表徵。在一些實施例中，醣綴合物中之多醣與載體蛋白質之比率(w/w)係在0.5與3之間(例如約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0)。在其他實施例中，醣與載體蛋白質比率(w/w)係在0.5與2.0之間、在0.5與1.5之間、在0.8與1.2之間、在0.5與1.0之間、在1.0與1.5之間或在1.0與2.0之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白質比率(w/w)在0.8與1.2之間。在一較佳實施例中，綴合物中之多醣與載體蛋白質之比率係在0.9與1.1之間。在一些此類實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

醣綴合物亦可藉由其分子大小分佈(K _d)表徵。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於確定綴合物之相對分子大小分佈。在重力饋送柱中使用尺寸排阻層析(SEC)以得到綴合物之分子大小分佈概況。大分子排除在比小分子更快速溶離之介質中之孔之外。級分收集器用於收集管柱溶離液。藉由醣分析比色測試溶離份。為了確定K _d，將管柱進行校準以確立完全排除分子(V ₀)，(K _d=0)之分數；及表示最大保留(V _i)，(K _d=1)之分數。達到指定樣品屬性之分數(V _e)係關於藉由以下表述之K _d：K _d= (V _e- V _o)/ (V _i- V ₀)。

游離醣 .本發明之醣綴合物及免疫原性組合物可包括未與載體蛋白質共價綴合但仍存在於醣綴合物組合物中之游離醣。游離醣可未與醣綴合物共價結合(亦即未與其共價結合、吸附或包埋於其中)。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含至多50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含低於約25%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含至多約20%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含至多約15%之游離多醣。在另一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含至多約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含低於約8%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含至多約6%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，醣綴合物包含至多約5%之游離多醣。參見例如表 19、表 20、表 21、表 22、表 23、表 24及表 25。

共價連接 . 在其他實施例中，對於每5至10個醣重複單元、每2至7個醣重複單元、每3至8個醣重複單元、每4至9個醣重複單元、每6至11個醣重複單元、每7至12個醣重複單元、每8至13個醣重複單元、每9至14個醣重複單元、每10至15個醣重複單元、每2至6個醣重複單元、每3至7個醣重複單元、每4至8個醣重複單元、每6至10個醣重複單元、每7至11個醣重複單元、每8至12個醣重複單元、每9至13個醣重複單元、每10至14個醣重複單元、每10至20個醣重複單元、每4至25個醣重複單元或每2至25個醣重複單元，綴合物在載體蛋白質與醣之間包含至少一個共價連接。在常見實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在另一實施例中，對於多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個醣重複單元，在載體蛋白質與醣之間存在至少一個連接。在一個實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

離胺酸殘基 .用以表徵本發明之醣綴合物的另一方式為藉由變得與特徵可為一系列經綴合離胺酸(綴合程度)之醣綴合之載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)中之離胺酸殘基的數目。載體蛋白質之由於與多醣共價連接所致之離胺酸修飾之證據，可藉由胺基酸分析，使用熟習此項技術者已知之常規方法來獲得。綴合引起所回收離胺酸殘基之數目與用於產生綴合物材料之載體蛋白質起始物質相比而減少。在一較佳實施例中，本發明之醣綴合物之綴合程度係在2與15之間、與2與13之間、與2與10之間、與2與8之間、與2與6之間、與2與5之間、與2與4之間、與3與15之間、與3與13之間、與3與10之間、與3與8之間、與3與6之間、與3與5之間、與3與4之間、與5與15之間、與5與10之間、與8與15之間、與8與12之間、與10與15之間或在10與12之間。在一個實施例中，本發明之醣綴合物之綴合程度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在一較佳實施例中，本發明之醣綴合物之綴合程度在4與7之間。在一些此類實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

醣鏈與載體蛋白質上之離胺酸之連接的頻率為對本發明之醣綴合物進行表徵之另一參數。舉例而言，在一些實施例中，對於多醣之每4個醣重複單元，在載體蛋白質與多醣之間至少一個共價連接。在另一實施例中，載體蛋白質與多醣之間的共價連接在多醣之每10個醣重複單元中發生至少一次。在另一實施例中，載體蛋白質與多醣之間的共價連接在多醣之每15個醣重複單元中發生至少一次。在又一實施例中，載體蛋白質與多醣之間的共價連接在多醣之每25個醣重複單元中發生至少一次。

O - 乙醯化 .在一些實施例中，本發明之醣為O-乙醯化的。在一些實施例中，醣綴合物包含具有在10-100%之間，在20-100%之間，在30-100%之間，在40-100%之間，在50-100%之間，在60-100%之間，在70-100%之間，在75-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%之間的O-乙醯化程度之醣。在其他實施例中，O-乙醯化程度為≥ 10%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%或≥ 90%，或約100%。藉由O-乙醯化之%，其意謂指定醣相對於100% (其中各重複單元相對於其經乙醯化結構為完全乙醯化的)之百分比。

在一些實施例中，藉由還原胺化來製備醣綴合物。在一些實施例中，醣綴合物為單端連接之綴合醣，其中該醣直接與載體蛋白質共價結合。在一些實施例中，醣綴合物經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共價結合。

還原性胺化 .在一個實施例中，醣藉由還原胺化與載體蛋白質綴合(諸如在美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2007/0231340號、第2007/0184071號及第2007/0184072號，WO 2006/110381，WO 2008/079653及WO 2008/143709中所描述)。

還原胺化包括(1)醣之氧化，(2)經活化醣及載體蛋白質之還原以形成綴合物。在氧化之前，醣視情況進行水解。可採用機械或化學水解。可使用乙酸進行化學水解。

氧化步驟可涉及與過碘酸鹽反應。如本文所用，術語「過碘酸鹽/過碘酸(periodate)」係指過碘酸鹽(periodate)及過碘酸(periodic acid)兩者。該術語亦包括偏過碘酸根(IO ₄ ⁻)及原過碘根(IO ₆ ⁵ ⁻)以及過碘酸之各種鹽(例如過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在一個實施例中，多醣係在存在偏過碘酸(鹽)之情況下，較佳地在存在過碘酸鈉(NalO ₄)之情況下氧化。在另一實施例中，多醣係在存在原過碘酸(鹽)之情況下，較佳地在存在過碘酸之情況下氧化。

在一個實施例中，氧化劑為穩定的硝醯基或氮氧化物基團化合物，諸如哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物，在存在氧化劑之情況下選擇性地氧化一級羥基。在該反應中，在催化循環中，實際氧化劑為N-氧銨鹽。在一態樣中，該穩定的硝醯基或氮氧化物基團化合物為哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物。在一態樣中，該穩定的硝醯基或氮氧化物基團化合物攜帶TEMPO (2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL (2,2,5,5-四甲基-1-吡咯啶氧基)部分。在一態樣中，該穩定的硝醯基團化合物為TEMPO或其衍生物。在一態樣中，該氧化劑為攜帶N-鹵基部分之分子。在一態樣中，該氧化劑係選自N-氯丁二醯亞胺、N-溴丁二醯亞胺、N-碘丁二醯亞胺、二氯異三聚氰酸、1,3,5-三氯-l,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮、二溴異三聚氰酸、1,3,5-三溴-l,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮、二碘異三聚氰酸及1,3,5-三碘-l,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮中之任一者。較佳地，該氧化劑為N-氯丁二醯亞胺。

在醣之氧化步驟之後，醣稱為經活化的且在本文下文被稱作「經活化」。經活化醣及載體蛋白質可獨立地(分散凍乾)或一起(共凍乾)經凍乾(冷凍乾燥)。在一個實施例中，共凍乾經活化醣及載體蛋白質。在另一實施例中，獨立地凍乾經活化多醣及載體蛋白質。

在一個實施例中，凍乾在存在非還原糖之情況下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及異麥芽酮糖醇。

綴合程序之下一步驟為使用還原劑，還原經活化醣及載體蛋白質，以形成綴合物(所謂的還原胺化)。適合之還原劑包括氰基硼氫化物，諸如氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉或在布朗斯特酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)之存在下之硼氫化鈉或硼氫化鋅；胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe'PrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)、硼烷-吡啶或硼氫化物交換樹脂。在一個實施例中，還原劑為氰基硼氫化鈉。

在一實施例中，在水性溶劑(例如選自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、二甘胺酸或HEPB，在6.0與8.5之間、7.0與8.0之間或7.0與7.5之間的pH下)中進行還原反應，在另一實施例中，在非質子性溶劑中進行反應。在一實施例中，還原反應在DMSO (二甲亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。DMSO或DMF溶劑可用於將已凍乾之經活化多醣及載體蛋白質復原。

在還原反應結束時，可在綴合物中存在剩餘未反應之醛基，此等可使用適合之封端劑進行封端。在一個實施例中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH ₄)。在綴合(還原反應及視情況封端)之後，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術來純化(相對於多醣-蛋白質綴合物之量增濃)醣綴合物。此等技術包括滲析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沈澱/溶離、管柱層析(DEAE或疏水相互作用層析)及深度過濾。醣綴合物可藉由透濾及/或離子交換層析及/或尺寸排阻層析來純化。在一實施例中，醣綴合物係藉由透濾或離子交換層析或尺寸排阻層析來純化。在一個實施例中，將醣綴合物進行無菌過濾。

在一較佳實施例中，藉由還原胺化來製備來自選自O25B、O1、O2及O6中之任一者之大腸桿菌血清型的醣綴合物。在一較佳實施例中，藉由還原胺化來製備來自大腸桿菌血清型O25B、O1、O2及O6之醣綴合物。

在一個態樣中，本發明係關於一種綴合物，其包括與式O25B之醣連接的載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)，該醣以下式表示：

，其中 n為大於或等於1之任何整數。在一較佳實施例中， n為至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40及至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50之整數。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。例示性範圍包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；及至少20至至多80。在一個較佳實施例中， n為至少31至至多90，更佳地40至90，最佳地60至85。

在另一態樣中，本發明係關於一種綴合物，其包括與醣連接之載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)，該醣具有表 1(亦參見圖 9A 至圖 9C及圖 10A 至圖 10 B)中顯示之以下結構中之任一者，其中 n為大於或等於1之整數。

在不受理論或機制束縛之情況下，在一些實施例中，咸信穩定的綴合物需要一定水準之醣抗原修飾，該醣抗原修飾針對保持抗原之關鍵免疫原性抗原決定基之結構完整性進行平衡。

醛之活化及形成 .在一些實施例中，本發明之醣經活化且使得形成醛。在其中醣經活化之此類實施例中，活化百分比(%) (或氧化(DO)程度)(參見例如實例 31)係指醣重複單元莫耳數/經活化多醣之醛莫耳數。舉例而言，在一些實施例中，醣藉由多醣之重複單元上之鄰二醇之過碘酸氧化而經活化，從而使得形成醛。變化過碘酸鈉相對於醣重複單元之莫耳當量(meq)及氧化期間之溫度，產生變化水準之氧化(DO)程度。

醣及醛濃度通常藉由比色分析來確定。替代性試劑為TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶1-烴氧基)-N-氯丁二醯亞胺(NCS)組合，其引起自一級醇基團形成醛。

在一些實施例中，經活化醣具有以下之氧化程度，其中醣重複單元之莫耳數/經活化醣之醛之莫耳數係在1-100之間，諸如在2-80之間、在2-50之間、在3-30之間及在4-25之間。活化程度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、≥ 20、≥ 30、≥ 40、≥ 50、≥ 60、≥ 70、≥ 80或≥ 90，或約100。較佳地，氧化(DO)程度為至少5及至多50，更佳地至少10及至多25。在一個實施例中，活化程度為至少10及至多25。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。氧化程度值可表示為活化百分比(%)。舉例而言，在一個實施例中，10之DO值係指在經活化醣中，一個經活化醣重複單元/總共10個醣重複單元，在此情況下，10之DO值可表示為10%活化。

在一些實施例中，藉由還原胺化化學反應製備之綴合物包括載體蛋白質及醣，其中該醣包括選自以下中之任一者的結構：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，綴合物中之醣包括式，其中 n為1至1000、5至1000，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65之整數。

單端連接之綴合物 .在一些實施例中，綴合物為單端連接之綴合醣，其中醣在該醣之一端與載體蛋白質共價結合。在一些實施例中，單端連接之綴合多醣具有末端醣。舉例而言，若多醣之末端(末端醣殘基)中之一者與載體蛋白質共價結合，則綴合物為單端連接的。在一些實施例中，若多醣之末端醣殘基經由連接子與載體蛋白質共價結合，則綴合物為單端連接的。此類連接子可包括例如胱胺連接子(A1)、3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼)連接子(A4)及2,2'-二硫基-N,N'-雙(乙烷-2,1-二基)雙(2-(胺氧基)乙醯胺)連接子(A6)。

在一些實施例中，醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與載體蛋白質綴合，形成單端連接之綴合物。參見例如實例 26 、實例 27 、實例 28 及圖 17。

在一些實施例中，綴合物較佳地不為生物綴合物。術語「生物綴合物」係指蛋白質(例如載體蛋白質)與抗原，例如在宿主細胞背景中製備之O-抗原(例如O25B)之間的綴合物，其中宿主細胞機制將抗原與蛋白質連接(例如N-連接)。醣綴合物包括生物綴合物，以及藉由不需要在宿主細胞中製備綴合物之手段(例如藉由蛋白質與醣之化學連接來綴合)來製備之糖抗原(例如寡醣及多醣)-蛋白質綴合物。

硫醇活化之醣 .在一些實施例中，本發明之醣為經硫醇活化的。在其中醣為經硫醇活化之此類實施例中，活化百分比(%)係指硫醇之莫耳數/經活化多醣之醣重複單元。醣及硫醇濃度通常藉由用於硫氫基定量之Ellman分析來確定。舉例而言，在一些實施例中，醣包括用二硫化胺連接子活化2-酮-3-去氧辛酸(KDO)。參見例如實例 10 及圖 31 。在一些實施例中，醣經由二價異雙官能連接子(在本文中亦被稱作「間隔基」)與載體蛋白質共價結合。連接子較佳地在醣與載體蛋白質之間提供硫醚鍵，從而產生在本文中被稱作「硫醚醣綴合物」之醣綴合物。在一些實施例中，連接子進一步提供胺基甲酸酯及醯胺鍵，諸如胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)。參見例如實例 21。

在一些實施例中，單端連接之綴合物包括載體蛋白質及醣，其中該醣包括選自以下中之任一者的結構：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，綴合物中之醣包括式，其中 n為1至1000、5至1000，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65之整數。

舉例而言，在一個實施例中，單端連接之綴合物包括載體蛋白質及醣，該醣具有選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101，其中 n為1至10之整數。

F. eTEC綴合物在一個態樣中，本發明大體上係關於醣綴合物，其包含衍生自上文所描述之大腸桿菌、經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基(如例如在美國專利9517274及國際專利申請公開案WO2014027302中所描述，其以其全文以引用之方式併入本文中)與載體蛋白質共價綴合之醣，包括含此類醣綴合物之免疫原性組合物；及用於製備及使用此類醣綴合物及免疫原性組合物之方法。該等醣綴合物包含經由一或多個eTEC間隔子與載體蛋白質共價綴合之醣，其中醣經由胺基甲酸酯連接與eTEC間隔基共價綴合，且其中載體蛋白質經由醯胺連接與eTEC間隔基共價綴合。eTEC間隔基包括七個線性原子(亦即-C(O)NH(CH ₂) ₂SCH ₂C(O)-)，且在醣與載體蛋白質之間提供穩定的硫醚及醯胺鍵。

本發明之eTEC連接之醣綴合物可由以下通式(I)表示：

(I)，其中包含eTEC間隔基之原子含於中心方框中。

在本發明之該等醣綴合物中，醣可為多醣或寡醣。

併入本發明之醣綴合物中之載體蛋白質係選自一般適合於此類目的之如本文進一步描述或熟習此項技術者已知之載體蛋白質的群。在特定實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

在另一態樣中，本發明提供一種製備包含經由eTEC間隔基與載體蛋白質綴合的本文所描述之醣的醣綴合物之方法，該方法包含以下步驟：a)在有機溶劑中，使醣與碳酸衍生物反應以產生經活化醣；b)使經活化醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使硫醇化醣與還原劑反應，以產生包含一或多個游離硫醇基殘基之經活化硫醇化醣；d)使經活化硫醇化醣與包含一或多個α-鹵乙醯胺基之經活化載體蛋白質反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白質綴合物；及e)使硫醇化醣-載體蛋白質綴合物與以下反應：(i)能夠對經活化載體蛋白質之未綴合α-鹵乙醯胺基團封端的第一封端試劑；及/或(ii)能夠對經活化硫醇化醣之未綴合游離硫醇基殘基封端的第二封端試劑；由此產生eTEC連接之醣綴合物。

在常見實施例中，碳酸衍生物為1,1'-羰基-二(1,2,4-三唑) (CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)。較佳地，碳酸衍生物為CDT，且有機溶劑為極性非質子溶劑，諸如二甲亞碸(DMSO)。在較佳實施例中，藉由經活化醣與雙功能對稱硫烷基胺試劑、胱胺或其鹽反應，來產生硫醇化醣。可替代地，可藉由經活化醣與半胱胺或其鹽反應，來形成硫醇化醣。藉由本發明之方法產生之eTEC連接之醣綴合物可由通式(I)表示。

在常見實施例中，第一封端試劑為N-乙醯基-L-半胱胺酸，其與載體蛋白質之離胺酸殘基上之未綴合α-鹵乙醯胺基團反應，形成經由硫醚連接與經活化離胺酸殘基共價連接之S-羧甲基半胱胺酸(CMC)殘基。

在其他實施例中，第二封端試劑為碘乙醯胺(IAA)，其與經活化硫醇化醣之未綴合游離硫氫基反應，得到經封端硫乙醯胺。常見地，步驟e)包含用第一封端試劑及第二封端試劑進行封端。在某些實施例中，步驟e)包含用作為第一封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸及作為第二封端試劑之IAA進行封端。

在一些實施例中，封端步驟e)進一步包含在與第一及/或第二封端試劑反應之後，與還原劑，例如DTT、TCEP或巰基乙醇反應。

本發明之eTEC連接之醣綴合物及免疫原性組合物可包括游離硫醇基殘基。在一些情況下，藉由本文所提供之方法形成之經活化硫醇化醣將包括多個游離硫醇基殘基，其中一些可能在綴合步驟期間不經歷與載體蛋白質之共價綴合。藉由與硫醇反應性封端試劑，例如碘乙醯胺(IAA)反應，對此類殘餘游離硫醇基殘基進行封端，以將潛在地反應性官能基封端。亦涵蓋其他硫醇反應性封端試劑，例如含有順丁烯二醯亞胺之試劑及其類似者。

另外，本發明之eTEC連接之醣綴合物及免疫原性組合物可包括殘餘未綴合載體蛋白質，其可包括已在封端處理步驟期間經受修飾之經活化載體蛋白質。

在一些實施例中，步驟d)進一步包含在使經活化硫醇化醣與經活化載體蛋白質反應之前，提供包含一或多個α-鹵乙醯胺基團之經活化載體蛋白質。在常見實施例中，經活化載體蛋白質包含一或多個α-溴乙醯胺基團。

在另一態樣中，本發明提供一種eTEC連接之醣綴合物，其包含經由根據本文所揭示之方法中之任一者產生之eTEC間隔基與載體蛋白質綴合之本文所描述的醣。

在一些實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇，且經由eTEC間隔基在CRM ₁₉₇與多醣之間的共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中發生至少一次。

對於本發明之態樣中之每一者，在本文所描述之方法及組合物之特定實施例中，eTEC連接之醣綴合物包含本文所描述之醣，諸如衍生自大腸桿菌之醣。

在另一態樣中，本發明提供一種預防、治療或改善個體之細菌性感染、疾病或病況之方法，其包含向個體投與免疫學上有效量之本發明之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含含本文所描述之醣的eTEC連接之醣綴合物。在一些實施例中，醣係衍生自大腸桿菌。

在一些實施例中，eTEC連接之醣綴合物包含載體蛋白質及醣，其中該醣包含選自以下中之任一者的結構：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，綴合物中之醣包括式，其中 n為1至1000、5至1000，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65之整數。

變得與醣綴合之載體蛋白質中之離胺酸殘基之數目的特徵可為一系列經綴合離胺酸。舉例而言，在免疫原性組合物之一些實施例中，CRM ₁₉₇可包含4至16個/39個離胺酸殘基與醣共價連接。表示此參數之另一方式為約10%至約41%之CRM ₁₉₇離胺酸與醣共價連接。在其他實施例中，CRM ₁₉₇可包含2至20個/39個離胺酸殘基與醣共價連接。表述此參數之另一方式為約5%至約50%之CRM ₁₉₇離胺酸與醣共價連接。

在常見實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇，且經由eTEC間隔基在CRM ₁₉₇與多醣之間的共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中發生至少一次。

在其他實施例中，對於每5至10個醣重複單元、每2至7個醣重複單元、每3至8個醣重複單元、每4至9個醣重複單元、每6至11個醣重複單元、每7至12個醣重複單元、每8至13個醣重複單元、每9至14個醣重複單元、每10至15個醣重複單元、每2至6個醣重複單元、每3至7個醣重複單元、每4至8個醣重複單元、每6至10個醣重複單元、每7至11個醣重複單元、每8至12個醣重複單元、每9至13個醣重複單元、每10至14個醣重複單元、每10至20個醣重複單元或每4至25個醣重複單元，綴合物在載體蛋白質與醣之間包含至少一個共價連接。

在另一實施例中，對於多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個醣重複單元，在載體蛋白質與醣之間存在至少一個連接。

G. 載體蛋白質本發明之醣綴合物之組分為與醣綴合之載體蛋白質。術語「蛋白質載體」或「載體蛋白質」或「載體」可在本文中互換使用。載體蛋白質對於標準綴合程序應為可改進的。

綴合物之一個組分為與O-多醣綴合之載體蛋白質。在一個實施例中，綴合物包括與O-多醣之核心寡醣(參見圖 24)綴合之載體蛋白質。在一個實施例中，綴合物包括與O-多醣之O-抗原綴合之載體蛋白質。

術語「蛋白質載體」或「載體蛋白質」或「載體」可在本文中互換使用。載體蛋白質對於標準綴合程序應為可改進的。

在一較佳實施例中，綴合物之載體蛋白質係獨立地選自以下中之任一者：TT、DT、DT突變(諸如CRM ₁₉₇)、嗜血桿菌流感( H . influenzae)蛋白質D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特定言之WO 01/98334及WO 03/54007中描述之彼等)、經解毒的肺炎鏈球菌溶血素( Streptococcus pneumoniaePneumolysin)、PorB、N19蛋白質、PspA、OMPC、艱難梭菌( C . Difficile)之毒素A或毒素B及PsaA。在一實施例中，本發明之綴合物之載體蛋白質為DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明之綴合物之載體蛋白質為TT (破傷風類毒素)。在另一實施例中，本發明之綴合物之載體蛋白質為PD (流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)蛋白質D，參見例如EP 0 594 610 B)。在一些實施例中，載體蛋白質包括聚(L-離胺酸) (PLL)。

在一較佳實施例中，醣與CRM ₁₉₇蛋白質綴合。CRM ₁₉₇蛋白質為一種無毒性形式之白喉毒素，但在免疫學上與白喉毒素為不可區分的。CRM ₁₉₇由受藉由產毒棒狀桿菌噬菌體β之亞硝基胍突變誘發產生之無毒噬菌體β197tox ^-感染的棒狀白喉桿菌產生。CRM ₁₉₇蛋白質具有與白喉毒素相同之分子量，但與其不同之處在於結構基因中之單鹼基變化(鳥嘌呤變為腺嘌呤)。此單鹼基變化引起成熟蛋白中之麩胺酸取代甘胺酸之胺基酸取代，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM ₁₉₇蛋白質為安全且有效的T細胞依賴性醣載體。

因此，在一些實施例中，本發明之綴合物包括作為載體蛋白質之CRM ₁₉₇，其中醣與CRM ₁₉₇共價連接。

在一較佳實施例中，醣綴合物之載體蛋白質係選自由以下組成之群：DT (白喉毒素)、TT (破傷風類毒素)或TT之片段C；CRM197 (白喉毒素之無毒性但抗原上相同之變異體)、其他DT突變體(諸如CRM176、CRM228、CRM 45 (Uchida等人J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103或CRM107；及由Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992中描述之其他突變；Glu-148至Asp、Gln或Ser及/或Ala 158至GIy之缺失或突變及US 4709017或US 4950740中所揭示之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變及US 5917017或US 6455673中所揭示之其他突變；或US 5843711中所揭示之片段)；肺炎鏈球菌溶血素(Kuo等人(1995) Infect lmmun 63; 2706-13)，包括以某種方式ply去毒，例如dPLY-GMBS (WO 04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-formol、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE (WO 00/37105或WO 00/39299中所揭示之PhtA、PhtB、PhtD或PhtE序列)及Pht蛋白質之融合，例如PhtDE融合、PhtBE融合、Pht A-E (WO 01/98334、WO 03/54007、WO2009/000826)、OMPC (腦膜炎球菌外膜蛋白質-通常自奈瑟氏腦膜炎菌血清群B提取- EP0372501)、PorB (來自奈瑟氏腦膜炎菌)、PD (流感嗜血桿菌蛋白質D -參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫學上功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471 177)、細胞介素、淋巴介質、生長因子或激素(WO 91/01146)、包含來自各種病原體衍生之抗原的多個人類CD4+ T細胞表位之人工蛋白(Falugi等人(2001 ) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824)，諸如N19蛋白質(Baraldoi等人(2004) Infect lmmun 72; 4884-7)肺炎鏈球菌表面蛋白質PspA (WO 02/091998)、鐵吸收蛋白質(WO 01/72337)、艱難梭菌之毒素A或B (WO 00/61761)、運鐵蛋白結合蛋白、肺炎鏈球菌黏附蛋白(PsaA)、重組綠膿桿菌外毒素A (特定言之其無毒性突變體(諸如攜帶麩胺酸553處之取代的外毒素A (Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971))。其他蛋白，諸如卵白蛋白、匙孔螺血氰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之純化蛋白衍生物(PPD)亦可用作載體蛋白質。其他適合之載體蛋白質包括滅活細菌毒素，諸如霍亂類毒素(例如如國際專利申請案第WO 2004/083251號中所描述)；大腸桿菌LT；大腸桿菌ST；及來自綠膿桿菌之外毒素A。

在一些實施例中，該載體蛋白質選自由以下組成之群：例如CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、鞭毛蛋白、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌( C. jejuni) AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。在一個實施例中，載體蛋白質為經解毒綠膿桿菌外毒素(EPA)。在另一實施例中，載體蛋白質不為經解毒綠膿桿菌外毒素(EPA)。在一個實施例中，載體蛋白質為鞭毛蛋白。在另一實施例中，載體蛋白質不為鞭毛蛋白。

在一較佳實施例中，醣綴合物之載體蛋白質獨立地選自由以下組成之群：TT、DT、DT突變(諸如CRM ₁₉₇)、流感嗜血桿菌蛋白質D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特定言之WO 01/98334及WO 03/54007中描述之彼等)、經解毒肺炎鏈球菌溶血素、PorB、N19蛋白質、PspA、OMPC、艱難梭菌之毒素A或毒素B及PsaA。在一實施例中，本發明之醣綴合物之載體蛋白質為DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明之醣綴合物之載體蛋白質為TT (破傷風類毒素)。在另一實施例中，本發明之醣綴合物之載體蛋白質為PD (流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白質D，參見例如EP 0 594 610 B)。

在一較佳實施例中，本發明之莢膜醣與CRM ₁₉₇蛋白質綴合。CRM ₁₉₇蛋白質為一種無毒性形式之白喉毒素，但在免疫學上與白喉毒素為不可區分的。CRM ₁₉₇由受藉由產毒棒狀桿菌噬菌體β之亞硝基胍突變誘發產生之無毒噬菌體β197tox感染的棒狀白喉桿菌產生(Uchida, T等人1971, Nature New Biology 233:8-11)。CRM ₁₉₇蛋白質具有與白喉毒素相同之分子量，但與其不同之處在於結構基因中之單鹼基變化(鳥嘌呤變為腺嘌呤)。此單鹼基變化引起成熟蛋白中之麩胺酸取代甘胺酸之胺基酸取代，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM ₁₉₇蛋白質為安全且有效的T細胞依賴性醣載體。關於CRM ₁₉₇及其產生之其他細節可例如在US 5,614,382中找到。

因此，在常見實施例中，本發明之醣綴合物包含作為載體蛋白質之CRM ₁₉₇，其中莢膜多醣與CRM ₁₉₇共價連接。

在另一實施例中，醣綴合物之載體蛋白質為SCP (鏈球菌C5a肽酶)。β-溶血性鏈球菌之所有人類分離株產生尤其使C5a不活化之高度保守的細胞壁蛋白質SCP (鏈球菌C5a肽酶)。 scp基因編碼含有在1,134與1,181個胺基酸之間的多肽(Brown等人., PNAS, 2005, 第102卷, 第51號.第18391-18396頁)。前31個殘基為輸出訊號前序列且在穿過細胞質膜時移除。隨後68個殘基充當後序列且必須經移除以產生活性SCP。隨後10個殘基可在無蛋白酶活性損失之情況下移除。在另一端，以Lys-1034開始為四個連續17個殘基模體，接著為細胞分選及細胞壁附接訊號。此組合之訊號由含有LPTTND序列之20個殘基親水性序列、17個殘基疏水性序列及較短鹼性羧基端構成。

SCP可分成域(參見Brown等人, PNAS, 2005, 第102卷, 第51號.第18391-18396頁之圖1B)。此等域為前域/後域(其包含輸出訊號前序列(通常為前31個殘基)及後序列(通常為後68個殘基))、蛋白酶域(其分解為兩部分(蛋白酶部分1，通常為殘基89-333/334；及蛋白酶域部分2，且通常為殘基467/468-583/584)、蛋白酶相關域(PA域) (通常為殘基333/334-467/468)、三個纖維結合蛋白質III型(Fn)域(Fn1，通常為殘基583/584-712/713；Fn2，通常為殘基712/713-928/929/930；通常Fn3，殘基929/930-1029/1030/1031)及細胞壁錨定域(通常為殘基1029/1030/1031至C端)。

在一實施例中，本發明之醣綴合物的載體蛋白質為來自GBS之SCP (SCPB)。SCPB之實例提供於WO97/26008之SEQ. ID.NO: 3。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 3。

在另一實施例中，本發明之醣綴合物的載體蛋白質為來自GAS之SCP (SCPA)。SCPA之實例可見於WO97/26008之SEQ.ID.NO:1及SEQ.ID.NO:2。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 1、2及23。

在另一實施例中，本發明之醣綴合物的載體蛋白質為如WO2014/136064之SEQ ID NO: 150或151中所闡述之SCP。

H. 組合物之劑量可調整給藥方案以提供最佳所需反應。舉例而言，可投與單次劑量之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段，可隨時間推移投與若干分次劑量，或可如情形之緊急程度所指示而按比例減少或增加劑量。應注意，劑量值可隨待減輕之病況的類型及嚴重程度而變化，且可包括單次或多次劑量。此外應瞭解，對任何特定個體而言，特定劑量方案應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之人員的專業判斷而隨時間調整，且本文所闡述之劑量範圍僅為例示性的，且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實務。確定投與治療性蛋白質之適當劑量及方案在相關技術中已熟知，且一旦提供本文所揭示之教示內容，則熟習此項技術者會瞭解其涵蓋於此教示內容中。

在一些實施例中，組合物中之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的量之範圍可在各蛋白質抗原之約10 µg至約300 µg範圍內。在一些實施例中，組合物中之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的量之範圍可在各蛋白質抗原之約20 µg至約200 µg範圍內。

各劑量中之醣綴合物之量經選擇為誘導免疫保護性反應而無典型疫苗中之明顯不良副作用之量。此類量將視採用哪種特定免疫原及其如何提供而變化。

可基於彼綴合物(綴合及非綴合)之總多醣，來計算免疫原性組合物中之特定醣綴合物之量。舉例而言，在100 μg多醣劑量中，具有20%游離多醣之醣綴合物將具有約80 μg之經綴合多醣及約20 μg之未綴合多醣。醣綴合物之量可視大腸桿菌血清型而變化。可藉由糖醛酸分析來確定醣濃度。

免疫原性組合物中之不同多醣組分的「免疫原性量」可分散，且各自可包含約1.0 μg、約2.0 μg、約3.0 μg、約4.0 μg、約5.0 μg、約6.0 μg、約7.0 μg、約8.0 μg、約9.0 μg、約10.0 μg、約15.0 μg、約20.0 μg、約30.0 μg、約40.0 μg、約50.0 μg、約60.0 μg、約70.0 μg、約80.0 μg、約90.0 μg或約100.0 μg之任何特定多醣抗原。一般而言，對於給定血清型，各劑量將包含0.1 μg至100 μg之多醣，特定言之0.5 μg至20 μg，更特定言之1 μg至10 μg，且甚至更特定言之2 μg至5 μg。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。在一個實施例中，對於給定血清型，各劑量將包含1 μg、2 μg、3 μg、4 μg、5 μg、6 μg、7 μg、8 μg、9 μg、10 μg、15 μg或20 μg之多醣。

載體蛋白質量 .通常，各劑量將包含5 μg至150 μg載體蛋白質，特定言之10 μg至100 μg載體蛋白質，更特定言之15 μg至100 μg載體蛋白質，更特定言之25 μg至75 μg載體蛋白質，更特定言之30 μg至70 μg載體蛋白質，更特定言之30 μg至60 μg載體蛋白質，更特定言之30 μg至50 μg載體蛋白質，及甚至更特定言之40 μg至60 μg載體蛋白質。在一個實施例中，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，各劑量將包含約25 μg、約26 μg、約27 μg、約28 μg、約29 μg、約30 μg、約31 μg、約32 μg、約33 μg、約34 μg、約35 μg、約36 μg、約37 μg、約38 μg、約39 μg、約40 μg、約41 μg、約42 μg、約43 μg、約44 μg、約45 μg、約46 μg、約47 μg、約48 μg、約49 μg、約50 μg、約51 μg、約52 μg、約53 μg、約54 μg、約55 μg、約56 μg、約57 μg、約58 μg、約59 μg、約60 μg、約61 μg、約62 μg、約63 μg、約64 μg、約65 μg、約66 μg、約67 μg、68 μg、約69 μg、約70 μg、約71 μg、約72 μg、約73 μg、約74 μg或約75 μg之載體蛋白質。在一個實施例中，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在另一實施例中，該載體蛋白質為SCP。

I. 佐劑在一些實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物可進一步包含至少一種、兩種或三種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物可進一步包含至少一種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物可進一步包含一種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物可進一步包含兩種佐劑。術語「佐劑」係指增強對抗原之免疫反應之化合物或混合物。抗原可主要用作遞送系統，主要用作免疫調節劑或具有兩者之強力特徵。適合之佐劑包括適用於哺乳動物(包括人類)之彼等。

已知可在人類中使用之適合的遞送系統類型佐劑之實例包括(但不限於)明礬(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)、磷酸鈣、脂質體、水包油乳液(諸如MF59) (4.3% w/v角鯊烯，0.5% w/v聚山梨醇酯80 (Tween 80)，0.5% w/v脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳液(諸如孟塔納(Montanide))及聚(D,L-丙交酯-共聚-乙交酯) (PLG)微米粒子或奈米粒子。

在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之鋁鹽(明礬) (例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)。在一較佳實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之磷酸鋁或氫氧化鋁。在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含0.1 mg/mL至1 mg/mL或0.2 mg/mL至0.3 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含約0.25 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。

已知可在人類中使用之適合的免疫調節類型佐劑之實例包括(但不限於)來自阿奎拉(Aquilla)樹之樹皮之皂素提取物(QS21，Quil A)、TLR4促效劑(諸如MPL (單磷醯基脂質A)、3DMPL (3-O-去醯化MPL)或GLA-AQ)、LT/CT突變體、細胞介素(諸如多種介白素(例如IL-2、IL-12)或GM-CSF)、AS01及其類似物。

已知可在人類中使用之具有遞送及免疫調節特徵兩者之適合的免疫調節類型佐劑之實例包括(但不限於) ISCOMS (參見例如Sjölander等人(1998) J. Leukocyte Biol. 64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 2006/134423及WO 2007/026190)或GLA-EM (其為TLR4促效劑與水包油乳液之組合)。

對於包括(但不限於)動物實驗之獸醫學應用，吾人可使用弗氏完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant；CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)、Emulsigen、N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，被稱作去甲MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-丙三氧基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(CGP 19835A，被稱作MTP-PE)及RIBI，其含有含自細菌提取之三種組分(單磷醯基脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁構架(MPL+TDM+CWS))之2%角鯊烯/Tween 80乳液。

用於增強本文所揭示之免疫原性組合物之有效性的其他例示性佐劑包括(但不限於) (1)水包油乳液調配物(具有或不具有其他特定免疫刺激劑，諸如胞壁醯基肽(參見下文)或細菌細胞壁組分)，諸如(a) SAF，其含有10%角鯊烷、0.4% Tween 80、5%普洛尼克封端之聚合物L121及thr-MDP (微流化至次微米級乳液中或經渦旋以產生較大粒度乳液)，及(b) RIBI™佐劑系統(RAS)，(Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.)含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種細菌細胞壁組分，諸如單磷醯脂A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳MPL+CWS (DETOX™)；(2)可使用皂素佐劑，諸如QS21、STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.)、ABISCO® (Isconova, Sweden)或ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia)或自其產生之粒子，諸如ISCOM (免疫刺激複合物)，該ISCOMS可能不含額外清潔劑(例如，WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐劑(CFA)及弗氏不完全佐劑(IFA)；(4)細胞介素，諸如介白素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 (例如，WO 99/44636))、干擾素(例如，γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯基脂質A (MPL)或3-O-去醯化MPL (3dMPL) (參見例如GB2220211、EP0689454) (參見例如WO 00/56358)；(6) 3dMPL與例如QS21及/或水包油乳化液之組合(參見例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧化乙烯醚或聚氧化乙烯酯(參見例如WO 99/52549)；(8)聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑與辛苯聚醇(例如，WO 01/21207)之組合或聚環氧乙烷烷基醚或酯界面活性劑與至少一種額外非離子界面活性劑，諸如辛苯聚醇之組合(例如，WO 01/21152)；(9)皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸) (例如，WO 00/62800)；(10)免疫刺激劑及金屬鹽粒子(參見例如WO 00/23105)；(11)皂素及水包油乳液(例如，WO 99/11241)；(12)皂素(例如，QS21)+3dMPL+IM2 (視情況+固醇) (例如，WO 98/57659)；(13)充當免疫刺激劑以增強組合物之有效性的其他物質。胞壁醯基肽包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-丙三氧基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在另一實施例中，佐劑為如實例35中所闡述之脂質體QS21調配物。在另一實施例中，佐劑為如實例35中所闡述之脂質體MPLA調配物。在另一實施例中，佐劑為如實例35中所闡述之脂質體MPLA/QS21調配物。

在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之CpG寡核苷酸。如本文所用，CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡脫氧核苷酸(CpG ODN)，且因此除非另外指示，否則此等術語可互換地使用。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有視情況在某些較佳的鹼基情況內為未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸之一或多個免疫刺激性CpG模體。CpG免疫刺激性模體之甲基化狀態一般係指二核苷酸中之胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸為含有藉由磷酸酯鍵與3'鳥嘌呤連接之5'未甲基化胞嘧啶且經由與Toll樣受體9 (TLR-9)結合而活化免疫系統的寡核苷酸。在另一實施例中，免疫刺激性寡核苷酸可含有將經由TLR9活化免疫系統但不如CpG模體未甲基化一樣強烈之一或多個甲基化CpG二核苷酸。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含轉而可包圍CpG二核苷酸之一或多個回文結構。CpG寡核苷酸已在多個頒予之專利、公開專利申請案及其他公開案中描述，包括美國專利第6,194,388號、第6,207,646號、第6,214,806號、第6,218,371號、第6,239 116號；及第6,339,068號。

在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原性組合物包含WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行所描述之CpG寡核苷酸中之任一者。

已鑑別出不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸。此等被稱為A、B、C及P類，且更詳細地描述於WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行。本發明之方法涵蓋此等不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸之用途。

VII. 奈米粒子在另一態樣中，本文揭示一種免疫原性複合物，其包括1)奈米結構；及2)至少一個繖毛多肽抗原或其片段。較佳地，繖毛多肽或其片段衍生自大腸桿菌繖毛H (fimH)。在一較佳實施例中，繖毛多肽選自上文所描述之繖毛多肽中之任一者。舉例而言，繖毛多肽可包含選自SEQ ID NOs:1-10、18、20、21、23、24、26-29及110-113之任一個胺基酸序列。

在一些實施例中，抗原與奈米結構外部融合或綴合，以刺激針對所呈現之抗原決定基之適應性免疫反應的發展。在一些實施例中，免疫原性複合物進一步包括佐劑或其他連接至外部及/或囊封於籠內部之免疫調節化合物，以幫助調整針對各病原體產生之免疫反應的類型。

在一些實施例中，奈米結構包括含有複數個相同第一奈米結構相關多肽之單一組裝體。

在替代實施例中，奈米結構包括含有複數個相同第一奈米結構相關多肽之複數個組裝體及複數個第二組裝體，各第二組裝體包含複數個相同第二奈米結構相關多肽。

各種奈米結構平台可用於產生本文所描述之免疫原性組合物。在一些實施例中，所採用之奈米結構由單一次單元之多個複本形成。在一些實施例中，所採用之奈米結構由多個不同次單元之多個複本形成。

奈米結構典型地為球狀，及/或具有旋轉對稱性(例如具有3倍及5倍軸)，例如具有本文所例示之二十面體結構。

在一些實施例中，抗原呈現於自組裝奈米粒子上，諸如衍生自鐵蛋白(FR)、E2p、Qβ及I3-01之自組裝奈米結構。E2p為來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之二氫硫辛酸醯基轉移酶的重新設計變異體。I3-01為可自組裝至超穩定奈米粒子之經工程化蛋白質。此等蛋白質之次單元的序列為此項技術中已知的。在第一態樣中，本文揭示一種包含胺基酸序列之奈米結構相關多肽，其長度與選自由SEQ ID NOS: 59-92組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列至少75%一致，且與至少一個經鑑別界面位置一致。奈米結構相關多肽可用於例如製備奈米結構。奈米結構相關多肽係針對其成對自組裝形成奈米結構，諸如二十面體奈米結構之能力設計。

在一些實施例中，奈米結構包括(a)複數個第一組裝體，各第一組裝體包含複數個相同第一奈米結構相關多肽，其中該等第一奈米結構相關多肽包含選自由SEQ ID NOS: 59-92組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列；及(b)複數個第二組裝體，各第二組裝體包含複數個相同第二奈米結構相關多肽，其中該第二奈米結構相關多肽包含選自由SEQ ID NOS: 59-92組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列，且其中第二奈米結構相關多肽與第一奈米結構相關多肽不同；其中該複數個第一組裝體與該複數個第二組裝體非共價相互作用以形成奈米結構。

奈米結構包括將第一組裝體及第二組裝體定向為奈米結構之對稱重複非天然非共價多肽-多肽界面，諸如具有二十面體對稱性之奈米結構。

SEQ ID NOS: 59-92提供例示性奈米結構相關多肽之胺基酸序列。SEQ ID NO:59-92之例示性奈米結構相關多肽的界面殘基數目在4至13個殘基範圍內。在各種實施例中，奈米結構相關多肽包含胺基酸序列，其長度與選自由SEQ ID NOS: 59-92組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致，且與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個經鑑別界面位置一致(視既定奈米結構相關多肽之界面殘基數目而定)。在其他實施例中，奈米結構相關多肽包含胺基酸序列，其長度與選自由SEQ ID NOS: 59-92組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致，且與至少20%、25%、33%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或100%之經鑑別界面位置一致(視既定奈米結構相關多肽之界面殘基數目而定)。在其他實施例中，奈米結構相關多肽包括奈米結構相關多肽，其具有選自由SEQ ID NOS: 59-98組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列。

在一個非限制性實施例中，奈米結構相關多肽可經修飾以有助於與相關「貨物」之共價連接。在一個非限制性實例中，奈米結構相關多肽可經修飾，諸如藉由在限定位置處引入各種半胱胺酸殘基以促進與一或多個相關抗原之連接，使得奈米結構相關多肽之奈米結構將提供骨架以提供大量抗原作為疫苗遞送以產生改善之免疫反應。

在一些實施例中，存在於奈米結構相關多肽中但不意欲用於綴合之一些或所有原生半胱胺酸殘基可突變成其他胺基酸以促進限定位置處之綴合。在另一非限制性實施例中，奈米結構相關多肽可藉由與部分之連接(共價或非共價)修飾以有助於促進「核內體逃逸」。對於涉及將相關分子遞送至目標細胞之應用，諸如靶向遞送，關鍵步驟可為自核內體(一種膜結合之細胞器，其為遞送媒劑進入細胞中之入口點)逃逸。胞內體成熟於溶酶體中，其降解其內含物。因此，若遞送媒劑在其變成溶酶體之前在某種程度上未自胞內體「逃逸」，則其將降解且將不執行其功能。存在破壞核內體且允許逸出至胞溶質中之多種脂質或有機聚合物。因此，在此實施例中，奈米結構相關多肽可例如藉由引入半胱胺酸殘基修飾，該等半胱胺酸殘基將允許此類脂質或有機聚合物化學綴合至單體或所得組裝體表面。在另一非限制性實例中，奈米結構相關多肽可例如藉由引入半胱胺酸殘基來改質，該等半胱胺酸殘基將允許螢光團或其他成像劑之化學綴合，從而允許活體外或活體內觀測奈米結構。

奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可經突變以改進蛋白質次單元或組裝之奈米結構的穩定性或溶解度。如熟習此項技術者已知，若奈米結構相關多肽與現有蛋白質家族具有顯著序列同源性，則來自該家族之其他蛋白質的多重序列比對可用於指導在非保守位置選擇可增加蛋白質穩定性及/或溶解度之胺基酸突變，該方法稱為共同蛋白質設計(9)。

奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可突變成帶正電(Arg、Lys)或帶負電(Asp、Glu)胺基酸，以賦予蛋白質表面總體正或總體負電荷。在一個非限制性實施例中，奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可經突變以賦予自組裝奈米結構之內表面較高淨電荷。歸因於奈米結構內表面與貨物分子之間的靜電相互作用，此類奈米結構可隨後用於封裝或囊封具有相反淨電荷之貨物分子。在一個非限制性實施例中，奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可主要突變成精胺酸或離胺酸殘基，以賦予自組裝奈米結構之內表面淨正電荷。含有奈米結構相關多肽之溶液隨後可在核酸貨物分子存在下混合，諸如dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA、cDNA、miRNA、siRNA、shRNA、piRNA或其他核酸，以便將核酸囊封於自組裝奈米結構內部。此類奈米結構可用於例如保護、遞送或濃縮核酸。

在一個實施例中，奈米結構具有二十面體對稱性。在此實施例中，奈米結構可包含60個第一奈米結構相關多肽之複本及60個第二奈米結構相關多肽之複本。在一個此類實施例中，各第一組裝體中相同第一奈米結構相關多肽的數目與各第二組裝體中相同第二奈米結構相關多肽的數目不同。舉例而言，在一個實施例中，奈米結構包含十二個第一組裝體及二十個第二組裝體；在此實施例中，各第一組裝體可例如包含相同第一奈米結構相關多肽之五個複本，且各第二組裝體可例如包含相同第二奈米結構相關多肽之三個複本。在另一實施例中，奈米結構包含十二個第一組裝體及三十個第二組裝體；在此實施例中，各第一組裝體可例如包含相同第一奈米結構相關多肽之五個複本，且各第二組裝體可例如包含相同第二奈米結構相關多肽之兩個複本。在另一實施例中，奈米結構包含二十個第一組裝體及三十個第二組裝體；在此實施例中，各第一組裝體可例如包含相同第一奈米結構相關多肽之三個複本，且各第二組裝體可例如包含相同第二奈米結構相關多肽之兩個複本。所有此等實施例能夠形成具有規則二十面體對稱性之合成奈米材料。

VIII. 與醣及 / 或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽或其片段組合肺炎克雷伯氏桿菌( Klebsiella pneumoniae / K . pneumoniae)為一種革蘭氏陰性病原體，已知會引起泌尿道感染、菌血症及敗血症。多重抗藥性肺炎克雷伯氏桿菌感染為處於風險下之易感群體中之死亡率增加的原因。O-抗原血清型在全球引起侵襲性疾病之菌株中高度普遍，且衍生之O-抗原醣綴合物作為疫苗抗原具有吸引力。

在一個態樣中，本文所揭示之組合物中之任一者可進一步包含至少一種醣，其為或衍生自選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型。在一較佳實施例中，本文所揭示之組合物中之任一者可進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽，其選自衍生自肺炎克雷伯氏桿菌I型繖毛蛋白或其免疫原性片段之多肽；或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌III型繖毛蛋白或其免疫原性片段之多肽；或其組合。

如此項技術中已知，肺炎克雷伯氏桿菌O1及O2 O-抗原及其相應v1及v2亞型為在其重複單位之結構方面不同的聚合半乳聚糖。肺炎克雷伯氏桿菌O1及O2抗原含有均聚物半乳糖單元(或半乳聚糖)。肺炎克雷伯氏桿菌O1及O2抗原各自含有D-半乳聚糖I單元(有時稱為O2a重複單元)，但O1抗原之不同之處在於O1抗原具有D-半乳聚糖II帽結構。D-半乳聚糖III (d-Gal-III)為D-半乳聚糖I之變異體。定義兩種不同血清型O2亞型(O2v1及O2v2)之鹼基半乳聚糖I及III的結構；及由產生亞型O1v1及O1v2之半乳聚糖II封端產生的衍生之嵌合體的結構展示於Kelly SD,等人. J Biol Chem 2019; 294:10863-76；及Clarke BR,等人. J Biol Chem 2018；293:4666-79中。

在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括[→3)-β-D-Gal f-(1→3)-α-D-Gal p-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括[→3)-α-D- Gal p-(1→3)- β-D-Gal p-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括[→3)-β-D-Gal f-(1→3)-α-D-Gal p-(1→]之重複單元及[→3)-α-D- Gal p-(1→3)- β-D-Gal p-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括→3)-β-D-Gal f-(1→3)-[α-D-Gal p-(1→4)]-α-D-Gal p-(1→]之重複單元(稱為D-Gal-III重複單元)。(Kol O.等人(1992) Carbohydr. Res. 236, 339-344; Whitfield C.等人(1991) J. Bacteriol. 173, 1420-1431)。

在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括[→3)-α-ᴅ-Gal p-(1→3)-β-ᴅ-Gal f-(1→]之重複單元(其可為肺炎克雷伯氏桿菌血清型O2a抗原之元素)。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括[→3)-β-ᴅ-GlcpNAc-(1→5)-β-ᴅ-Gal f-(1→]之重複單元(其可為肺炎克雷伯氏桿菌血清型O2c抗原之元素)。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括藉由側鏈添加(1→4)連接之Gal p殘基(其可為肺炎克雷伯氏桿菌O2afg抗原之元素)而對O2a重複單元之修飾。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括藉由側鏈添加(1→2)連接之Gal p殘基(其可為肺炎克雷伯氏桿菌O2aeh抗原之元素)而對O2a重複單元之修飾。(Whitfield C.等人(1992) J. Bacteriol. 174, 4913-4919)。

在不受機制或理論束縛之情況下，此項技術中所揭示之肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3及O5之O-抗原多醣結構分別與大腸桿菌血清型O9a (式O9a)及O8 (式O8)之彼等結構相同。

在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O4之醣包括[→4)-α-D-Gal p-(1→2)-β-D-Rib f-(1→)]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O7之醣包括[→2-a-L-Rha p-(1→2)-β-D-Rib f- (1→3)-α-L-Rha p-(1→3)-α-L-Rha p-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O8血清型之醣包括與肺炎克雷伯氏桿菌O2a相同之重複單元結構，但經非化學計量之O-乙醯化。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O12血清型之醣包括[α-Rhap-(1 →3)-β-GlcpNAc]二醣重複單元之重複單元。

在一個態樣中，本發明包括一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；及至少一種醣，該醣為或衍生自選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型。在一些實施例中，該組合物包括來自或衍生自血清型O1、O2、O3及O5中之一或多者的醣或其組合。在一些實施例中，該組合物包括來自或衍生自血清型O1、O2、O3及O5中之每一者之醣。

在另一態樣中，本發明包括一種組合物，其包括至少一種醣，其為或衍生自選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型；及衍生自具有選自以下中之任一者之結構的大腸桿菌O-抗原之醣：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。在一些實施例中，該組合物包括來自或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O1、O2、O3及O5中之一或多者的醣或其組合。在一些實施例中，該組合物包括來自或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O1、O2、O3及O5中之每一者之醣。在一些實施例中，該組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。在一些實施例中，該組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。

在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；至少一種醣，其為或衍生自選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型；及具有選自以下中之任一者之結構的醣：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數，較佳31至90。在一些實施例中，該組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。在一些實施例中，該組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。

在一些實施例中，該組合物包括至少一種衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣。

在一些實施例中，該組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原選自亞型v1 (O1v1)或亞型v2 (O1v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原選自亞型v1 (O1v1)及亞型v2 (O1v2)。在一些實施例中，該組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原選自亞型v1 (O2v1)或亞型v2 (O2v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原選自亞型v1 (O2v1)及亞型v2 (O2v2)。在另一態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原選自由以下組成之群：a)血清型O1亞型v1 (O1v1)、b)血清型O1亞型v2 (O1v2)、c)血清型O2亞型v1 (O2v1)及d)血清型O2亞型v2 (O2v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v1 (O1v1)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v2 (O1v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v1 (O2v1)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v2 (O2v2)。在此實施例之另一態樣中，組合物包含選自由以下組成之群的一個、兩個、三個或四個肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原：a)血清型O1亞型v1 (O1v1)、b)血清型O1亞型v2 (O1v2)、c)血清型O2亞型v1 (O2v1)及d)血清型O2亞型v2 (O2v2)。在一些實施例中，該組合物包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之醣之組合，其中第一醣衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌類型中之任一者；且第二醣衍生自一種醣，該醣衍生自選自由以下組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌類型中之任一者：O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12。舉例而言，在一些實施例中，該組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣及至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。在一較佳實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之醣與載體蛋白質綴合；且衍生自大腸桿菌之醣與載體蛋白質綴合。

在另一個態樣中，本發明包括一種組合物，其包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；及至少一種衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣。

在另一態樣中，本發明包括至少一種衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型的醣；及至少一種衍生自具有選自以下中之任一者之結構的大腸桿菌之醣：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，該組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。在一些實施例中，該組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。

在一些實施例中，該組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣；及至少一種衍生自大腸桿菌之醣，其具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。在另一實施例中，該組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣；及至少一種衍生自大腸桿菌之醣，其具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。在另一實施例中，該組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣；至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣；及至少一種衍生自大腸桿菌之醣，其具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。

在一個實施例中，本發明提供一種誘導個體對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與免疫學上有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含至少一種來自大腸桿菌血清型O8或O9之醣綴合物，其中該免疫原性組合物不包含來自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5或O3之醣綴合物。在一個態樣中，該組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。在另一態樣中，該組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。

在另一實施例中，本發明提供一種誘導個體對大腸桿菌之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與免疫學上有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含至少一種來自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5或O3之醣綴合物或其變異體，其中該免疫原性組合物不包含來自大腸桿菌血清型O8或O9之醣綴合物。在一個態樣中，該組合物包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣，且不包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原的醣。在一個態樣中，該組合物包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣，且不包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原的醣。

在一些實施例中，組合物包括至少一種醣，其為或衍生自選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型；至少一種衍生自大腸桿菌之醣，其具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。在一些實施例中，組合物包括至少一種醣，其為或衍生自選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型；至少一種衍生自大腸桿菌之醣，其具有選自由式O1A、式O1B、式O2、式O6及式O25B組成之群的結構。

在一些實施例中，組合物進一步包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽，其選自衍生自肺炎克雷伯氏桿菌I型繖毛蛋白或其免疫原性片段之多肽；或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌III型繖毛蛋白或其免疫原性片段之多肽；或其組合。該等多肽之序列為此項技術中已知的。

IX. 組合物之用途在一個態樣中，本發明提供本文所描述之組合物、編碼大腸桿菌FimH多肽或用於表現其之載體的核酸或包含多肽或核酸之組合物作為藥劑的用途，或在製造用以引發個體針對大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應或預防個體之大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌感染之藥劑中的用途。

在其他態樣中，本發明提供一種引發在個體，諸如人類中針對大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與有效量之本文所描述之組合物或編碼大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌多肽之核酸分子。本發明亦提供一種預防個體之大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌感染的方法，其包含向該個體投與有效量之醫藥組合物，諸如疫苗，其包含本文所描述之大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌組合物。

如本文所用，「個體」意謂哺乳動物，較佳為人類。在一些特定實施例中，人類為兒童，諸如嬰兒。在一些其他特定實施例中，人類為女性，尤其孕婦。本發明之組合物可在投與或不投與佐劑之情況下向個體投與。向個體投與之有效量為足以引發個體針對大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌抗原之免疫反應的量。可經選擇用於治療之個體包括由於暴露或可能暴露於大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌而處於患上大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌感染之風險下的彼等個體。因為人類可能在2歲時感染大腸桿菌或肺炎克雷伯氏桿菌，所以整個出生組被列為免疫接種之相關群體。舉例而言，此可藉由對以下各者開始執行免疫接種方案來實現：在自出生至6個月大、自6個月至5歲的任何時間；妊娠期婦女(或生育年齡之女性)，從而藉由抗體之被動轉移保護其嬰兒；仍在子宮內之嬰兒；及大於50歲之個體。

可使用標準投與途徑投與由本發明提供之組合物，諸如醫藥組合物。非限制性實施例包括非經腸投與，諸如皮內、肌肉內、皮下、經皮、經黏膜或經口投與。

在一次投與期間向個體提供之組合物的總劑量可如熟習此項技術者已知而變化。

亦有可能提供疫苗組合物中之一或多者的一或多個加打投與。若進行加打疫苗接種，則通常此類加打疫苗接種將在向個體首次投與組合物(其在此類情況下，稱為「初打疫苗接種」)之後的一週與10年之間，較佳兩週與六個月之間的某一時刻向同一個體投與。在替代加打方案中，亦有可能在初打疫苗接種之後向該個體投與不同載體，例如一或多個腺病毒，或其他載體，諸如安卡拉(MVA)之經改質痘瘡病毒，或DNA或蛋白質。舉例而言，有可能向該個體投與本文之重組病毒載體作為初打，且使用本文所描述之組合物進行加打。

在某些實施例中，投與包含初打投與及至少一個加打投與。在某些其他實施例中，每年提供投與。在另其他實施例中，每年與流感病毒疫苗一起提供投與。

由本發明提供之疫苗可與一或多種其他疫苗一起使用。舉例而言，在成人中，其可與流感病毒疫苗、Prevnar、破傷風疫苗、白喉疫苗及百日咳疫苗一起使用。對於兒童使用，由本發明提供之疫苗可與用於兒童患者之任何其他疫苗一起使用。

實例為了能更好地理解本發明，闡述以下實例。此等實例僅為達成說明之目的且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。以下實例說明本發明之一些實施例。

實例1 細菌繖毛黏附素FimH及FmlH允許大腸桿菌經由識別特異性宿主細胞醣蛋白而採用不同泌尿道微環境。FimH結合至腎臟及發炎膀胱中之上皮表面蛋白質上的尿路上皮中之甘露醣基化尿溶蛋白受體，而FmlH結合至半乳糖或N-乙醯半乳胺糖O-聚醣。FimH繖毛亦在腸道中之腸毒性大腸桿菌(ETEC)及多重抗藥性侵襲性大腸桿菌經由結合至腸上皮上的高度甘露醣基化蛋白質來選殖方面起一定作用。

全長FimH由兩個域構成：N端凝集素域及C端菌毛蛋白域，其藉由短連接子連接。FimH之凝集素域含有碳水化合物識別域，其負責結合至尿道上皮細胞表面上之甘露醣基化尿溶蛋白1a。菌毛蛋白域經由後續FimG次單元之供體股錨定至菌毛之核心，其為稱為供體股補充之過程。

FimH之凝集素域的構形及配位體結合特性係在FimH之菌毛蛋白域的異位控制下。在靜態條件下，全長FimH之兩個域的相互作用使凝集素域在較低親和力下穩定成單甘露糖(例如 K _d約300 µM)狀態，其特徵為淺結合袋。結合至甘露糖甘配位體誘導構形變化，從而產生中等親和力狀態，其中凝集素及菌毛蛋白域保持緊密接觸。然而，在剪應力時，凝集素與菌毛蛋白域分開，藉此誘導較高親和力狀態(例如K _d＜1.2 µM)。

因為不存在由菌毛蛋白域施加之負變構調節，所以FimH之經分離凝集素域被鎖定在較高親和力狀態下。鎖定在較高親和力狀態之經分離重組凝集素域展現出較高穩定性。然而，以低結合構形鎖定黏附素誘發產生抑制黏附之抗體。因此，關注使凝集素域在低親和力狀態下穩定。

表3闡述用於製備各種構築體以解決此等需求之FimH構築體。表3：FimH構築體之概述

構築體	質體	訊號序列	蛋白質描述	連接子	額外蛋白質變異體	主鏈	質量
FimH凝集素域	pSB01877	FimH訊號序列	FimH J96 F22..G181	無	無	pcDNA3.1(+)或 pCAG載體
FimH凝集素域	pSB01878	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..G181	無	無	pcDNA3.1(+)或 pCAG載體	完全折合質量，具有His標籤：18117.48 觀測到之非折合質量，具有His標籤：18117.90 無標籤之質量： 17022.08
FimH/C	pSB01879	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	無	無	pBudCE4.1 雙啟動子載體(CMV及EF1α)
FimH/C	pSB01880	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	無	無	pBudCE4.1 雙啟動子載體(CMV & EF1α)
FimH/C	pSB01881	mIgK訊號序列	FimC G37..E241 (根據SEQ ID NO: 18)	無	無	pBudCE4.1 雙啟動子載體(CMV & EF1α)
FimH-dscG	pSB01882	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	DNKQ	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01883	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGSGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01884	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGSSGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01885	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGSSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)	N端殘基在W20處，且因此似乎尚未在較佳位置進行處理；存在少量蛋白質展現較佳處理，如偵測到少量FACK肽所指示
FimH-dscG	pSB01886	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGGSSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01887	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGGSGSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01888	FimH訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGGSGGSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01889	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	DNKQ	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01890	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGSGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01891	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGSSGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01892	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGSSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)	似乎已對訊號肽進行處理，其中F22為較佳N端殘基；藉由MS/MS確認肽之身分
FimH-dscG	pSB01893	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGGSSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01894	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGGSGSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH-dscG	pSB01895	mIgK訊號序列	FimH J96 F22..Q300	GGGSGGSGGG	FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)
FimH凝集素域	pSB02081	mIgK訊號序列	F22..G181 J96 FimH N28Q N91S /His8於pcDNA3.1(+)中
FimH凝集素域	pSB02082	mIgK訊號序列	F22..G181 J96 FimH N28Q N91S /His8於pcDNA3.1(+)中
FimH凝集素域	pSB02083	mIgK訊號序列	F22..G181 J96 FimH N28S N91S /His8於pcDNA3.1(+)中
FimH凝集素域	pSB02088	mIgK訊號序列	F22..G181 J96 FimH V48C L55C /His8於pcDNA3.1(+)中
FimH凝集素域	pSB02089	mIgK訊號序列	F22..G181 J96 FimH N28Q V48C L55C N91S /His8於pcDNA3.1(+)中
FimH凝集素域	pSB02158	mIgK訊號序列	F22..G181 J96 FimH N28S V48C L55C N91S /His8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02159
FimH-dscG	pSB02198	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02199	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N256Q / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02200	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q N256Q / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02304	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T251A / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02305	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T258A / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02306	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T251A T258A / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02307	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中
FimH-dscG	pSB02308	mIgK訊號序列	FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N256Q / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中

所有研究之FimH構築體均為預期分子量之單體蛋白質。表4

蛋白質	沈降係數，S	M _w,app	M _w _，預期	均質性
大腸桿菌表現
*細胞溶質FimH-LD*	1.9 S	18 kDa	18 kDa	98%
*周質FimH-LD*	1.9 S	18 kDa	18 kDa	98%
*FimH-LD* *鎖突變體*	2.0 S	19 kDa	18 kDa	97%

*哺乳動物表現*
*FimH-LD*	1.9 S	18 kDa	18 kDa	＞99%
*FimH* *-LD* *鎖突變體*	1.9 S	18 kDa	18 kDa	98%
*FimH* *野生型*	2.7 S	36 kDa	34 kDa	96%
*FimH* *鎖突變體*	2.7 S	34 kDa	34 kDa	94%

FimC-FimH複合物之預期分子量為53.1 kDa； FimC之預期分子量為24 kDa。

實例 2 ： FimH 凝集素結合域之哺乳動物表現本發明非限制性實例係關於在HEK細胞株中產生衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。與在大腸桿菌宿主細胞中之衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的表現相比，產率相對較高。

為了實現自哺乳動物細胞產生FimH變異體，使用訊號肽預測算法分析用於蛋白質及片段之分泌的不同異源性訊號序列。亦分析野生型FimH前導序列。預測結果表明，野生型FimH前導序列可對FimH變異體在哺乳動物細胞中之分泌起作用，然而，預測所分泌之變異體在全長野生型FimH (參見SEQ ID NO: 1)之W20殘基處，而非全長野生型FimH (參見SEQ ID NO: 1)之F22殘基處裂解。預測血球凝集素訊號序列不起作用。預測鼠類IgK訊號序列產生SEQ ID NO: 1之F22的N端或成熟蛋白之F1殘基。

基於此等分析，合成DNA且重組產生構築體以表現具有野生型FimH前導序列之FimH凝集素結合域。亦製備構築體以表現具有mIgK訊號序列之FimH凝集素結合域。將親和純化標籤，諸如His標籤引入衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的C端以促進純化。

將表現質體轉染至HEK宿主細胞，亦即EXPI293哺乳動物細胞中。

成功地表現衍生自大腸桿菌之多肽或其片段。舉例而言，pSB01892 FimHdscG構築體藉由MS證明使用融合至FimH在F22之成熟起點的mIgK訊號序列的較佳N端處理。咸信該處理對於凝集素域構築體pSB01878為正確的，且質譜資料支援此點。

原生FimH前導肽未展現出較佳N端處理(亦即在SEQ ID NO: 1之F22處的處理)。

pSB01877及pSB01878構築體在pcDNA3.1(+)哺乳動物表現載體中。將細胞稀釋且隨後用於20 ml轉染。使用各構築體之1 μg/ml DNA，且使用Expifectamine方案在125 ml燒瓶中轉染細胞。72小時後，細胞活力仍良好，因此允許表現繼續直至96小時。在72小時獲取樣品且在SDS PAGE凝膠上各運行10 μl以檢查表現。

96小時後，收穫條件培養基且添加0.25 ml Nickel Excel樹脂，在4℃旋轉下分批結合O/N隔夜。在TrisCl pH 8.0、NaCl、咪唑中溶離。參見圖 4。

pSB01878之預期質量與N端F22一致。醣基化存在於1或2個位點(N-D之每次去醯胺化的質量+1)。

構築醣基化突變體。參見例如pSB02081、pSB02082、pSB02083、pSB02088及pSB02089。醣基化突變體表現相關多肽。結果參見圖 5。

亦構築FimH凝集素域鎖突變體。參見例如pSB02158。pSB02158構築體之表現結果顯示於圖 6B中。

使用0.5皮莫耳螢光素綴合之胺基苯基-哌喃甘露糖苷(APMP)進行螢光偏振分析。該分析在室溫、300 RPM下進行64小時。結果顯示於圖 6C中。

實例3：FimH/C複合物，pSB01879及pSB01880之哺乳動物表現為了產生FimH/C複合物，製備在EF1α啟動子下之FimC及具有野生型或mIgK訊號肽之FimH的雙表現構築體。將其選殖至pBudCE4.1哺乳動物表現載體(ThermoFisher)中，且將C端His標籤添加至FimC。FimC變異體經設計以使用mIgK訊號肽進行分泌，因為其產生基於訊號肽分析產生G37 FimC作為成熟蛋白之第一個殘基的正向預測。

更特定言之，此等構築體經設計以具有在載體pBudCE4.1中在EF1α啟動子下之FimC片段及在同一載體中在CMV啟動子下之FimH片段插入物。載體pBudCE4.1為來自Thermo Fisher之表現載體，其具有2個用於在哺乳動物細胞中表現之啟動子。FimC片段插入物(pSB01881插入物)藉由用NotI及XhoI消化且在相同位點次選殖至pBudCE4.1載體中來進行次選殖。將其塗鋪於2xYT吉歐黴素50 μg/ml盤上。將菌落接種至具有吉歐黴素50 μg/ml之2xYT中，在37℃下生長隔夜且準備質體。將其用NotI及XhoI消化以檢查插入物，且所有菌落之插入物大小為約722 bp。

pSB01881用HindIII及BamHI消化，且pSB01879插入物及pSB01880插入物DNA用HindIII及BamHI消化。將此等片段進行凝膠分離，且次選殖至pSB01881載體中且塗鋪於2xYTzeo50 μg/ml盤上。將來自各者之菌落接種至2xYT zeo50 μg/ml中，在37℃下生長隔夜，準備質體且用NotI及XhoI消化以測試FimC插入物，及用HindIII及BamHI消化以測試FimH插入物。所有純系在兩個選殖位點處均具有預期大小之插入物。隨後使用pSB01879-1及pSB01880-1純系進行表現。

已證明FimH/FimC複合物亦在EXPI293細胞中表現。表現可藉由切換啟動子，諸如EF1α、CAG、Ub、Tub或其他啟動子來最佳化。

用於訊號肽預測之訊號肽4.1 (DTU Bioinformatics)之例示性結果顯示如下。預測額外的訊號肽在成熟FimH多肽或其片段之位置1處產生Phe之較佳N端。以下僅為4種常見訊號序列之代表性樣品集。

預測以下訊號肽序列在成熟FimH多肽或其片段之位置1處產生Phe之較佳N端：表5

	訊號肽序列	SEQ ID NO:
＞sp\|P55899\|FCGRN_HUMAN IgG受體FcRn大次單元p51 OS=智人OX=9606 GN=FCGRT PE=1 SV=1	MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLG	SEQ ID NO: 55
＞tr\|Q6FGW4\|Q6FGW4_HUMAN IL10蛋白OS=智人OX=9606 GN=IL10 PE=2 SV=1	MHSSALLCCLVLLTGVRA	SEQ ID NO: 56

預測以下訊號肽序列不在成熟FimH多肽或其片段之位置1處產生Phe之較佳N端：表6

	訊號肽序列	SEQ ID NO:
＞sp\|P03420\|FUS_HRSVA融合醣蛋白F0 OS=人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)OX=11259 GN=F PE=1 SV=1	MELLILKANAITTILTAVTFCFASG	SEQ ID NO: 57
＞sp\|P03451\|HEMA_I57A0紅血球凝集素OS=A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2)OX=387161 GN=HA PE=1 SV=1	MAIIYLILLFTAVRG	SEQ ID NO: 58

表7 用於預測之 訊號肽 4 . 1

	融合序列
＞sp\|P55899\|FCGRN_HUMAN IgG受體FcRn大次單元p51 OS=智人OX=9606 GN=FCGRT PE=1 SV=1 MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLGAESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLS YNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCE LGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLF SCPHRLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGL AAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSSVLV VGIVIGVLLLTAAAVGGALLWRRMRSGLPAPWISLRGDDTGVLLPTPGEAQDADLKDVNV IPATA (SEQ ID NO: 102)	來自各別左欄中所列之蛋白質的訊號肽展示於下文大寫字母中。FimH之N端用小寫字母描繪。 MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 103)
	#量測位置值截止訊號肽?
	max. C 24 0.664
	max. Y 24 0.788
	max. S 9 0.966
	平均S 1-23 0.935
	D 1-23 0.867 0.450 YES
	名稱 = 序列，SP = 在位置23 及24 之間的「YES 」裂解位點：SLG -FA D =0 .867 D - 截止 =0 .450 網路 = 訊號肽 - 無TM
＞sp\|P03420\|FUS_HRSVA融合醣蛋白F0 OS=人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)OX=11259 GN=F PE=1 SV=1	來自各別左欄中所列之蛋白質的訊號肽展示於下文大寫字母中。FimH之N端用小寫字母描繪。 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 105)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE
LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLN	#量測位置值截止訊號肽?
NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVS	max. C 28 0.188
LSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVN	max. Y 28 0.263
AGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV	max. S 11 0.478
VQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV	平均S 1-27 0.387
QSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT	D 1-27 0.312 0.500 NO
KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP	名稱 = 序列 SP='NO' D=0.312D-截止= 0.500 網路 = 訊號肽 -TM
LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLS
LIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 104)
＞tr\|Q6FGW4\|Q6FGW4_HUMAN IL10蛋白OS=智人OX=9606 GN=IL10 PE=2 SV=1	來自各別左欄中所列之蛋白質的訊號肽展示於下文大寫字母中。FimH之N端用小寫字母描繪。 MHSSALLCCLVLLTGVRAfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 107)
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQ LDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLR LRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 106)
#量測位置值截止訊號肽?
max. C 19 0.726
	max. Y 19 0.829
	max. S 4 0.973
	平均S 1-18 0.947
	D 1-18 0.893 0.450 YES
	名稱 = 序列 SP= 在位置18 及19 之間的「YES 」裂解位點： VRA-FA D=0.893D-截止= 0.450 網路 = 訊號肽 - 無 TM
＞sp\|P03451\|HEMA_I57A0紅血球凝集素OS= A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2) OX=387161 GN=HA PE=1 SV=1	來自各別左欄中所列之蛋白質的訊號肽展示於下文大寫字母中。FimH之N端用小寫字母描繪。 MAIIYLILLFTAVRGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 109)
MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTNLERNVTVTHAKDILEKTHNGKLCKLN
GIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRDGLCYPGSFNDYEELKHLL	#量測位置值截止訊號肽?
SSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKEGSDYPVAKGSYNN	max. C 18 0.524
TSGEQMLIIWGVHHPIDETEQRTLYQNVGTYVSVGTSTLNKRSTPEIATRPKVNGQGGRM	max. Y 18 0.690
EFSWTLLDMWDTINFESTGNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAIN	max. S 1 0.951
TTLPFHNVHPLTIGECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDG	平均S 1-17 0.895
WYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFGNLERRLENL	D 1-17 0.800 0.450 YES
NKRMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEF	名稱 = 序列 SP= 在位置17 及18 之間的「YES 」裂解位點： GFA-CK D=0.800D-截止= 0.450 網路 = 訊號肽 - 無 TM
YHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLA
IMMAGISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 108)

實例4：FimH與FimG肽之供體股互補序列融合物的哺乳動物表現測試若干連接子長度。準備在野生型FimH及與FimH之F22融合之mIgK訊號肽中，用此等連接子融合FimH與N端FimG肽進行重組表現。

FimH供體股互補FimG構築體亦已顯示在EXPI293細胞中具有穩固的表現。

對於供體股互補構築體，寡核苷酸經設計以在pcDNA3.1(+)中產生含有各種連接子及FimG肽之鹼基構築體。根據FimH之SEQ ID NO: 1之編號，在G294 V295 T296殘基處併入獨特的BstEII位點。將相同的BstEII位點併入連接子中以產生鹼基構築體。

構築pSB01882-01895之鹼基構築體。使用引子以ACCUPRIME PFX DNA聚合酶(Thermo Fisher)進行PCR擴增pcDNA3.1(+)，用NdeI (在CMV啟動子中)及BamHI消化PCR產物，且選殖至用NdeI及BamHI消化之pcDNA3.1(+)中且進行凝膠分離以移除片段。

用pSB01877、01878、01879、01880、01885及01892與EXPI293細胞一起進行另一瞬時轉染作為對照。

按照製造商的方案，將構築體pSB01882至pSB01895用於來自Thermo Fisher之EXPI293細胞中的瞬時轉染表現測試。參見圖 3，其顯示在20 mL EXPI293細胞中表現，72小時，負載10 μl條件培養基後的結果；觀測到較高表現量；在自pSB01879及pSB01880構築體表現後存在FimH/FimC複合物；20 ml條件培養基分批與Nickel Excel結合，40 CV洗滌，在咪唑中溶離。

製備額外的FimH供體股互補構築體。參見例如pSB02198、pSB02199、pSB02200、pSB02304、pSB02305、pSB02306、pSB02307、pSB02308構築體。pSB2198 FimH dscG鎖突變體構築體之表現展示於圖 7中。pSB2198 FimH dscG鎖突變體自短暫表現產生12 mg/L。

根據Vi-CELL XR 2.04 (Beckman Coulter, Inc.)，觀測到以下(用於表現之實際細胞類型為HEK細胞)：表8

樣品	輸入之細胞類型參數	存活力(%)	總細胞數/毫升(x10 ⁶)	活細胞數/毫升(x10 ⁶)	平均直徑(微米)
EXPI P13	CHO	97.8	3.56	3.48	19.33
pSB01882	CHO	90.9	4.98	4.53	17.39
pSB01889	CHO	89.2	5.23	4.67	17.14
細胞	CHO	88.9	6.66	5.92	16.91
Expi Start	CHO	93.7	3.35	3.14	18.72
樣品在轉染之後約85-86小時收穫：
1877	SF-9	57.3	4.32	2.48	16.00
pSB01878	SF-9	57.6	3.88	2.24	15.49
pSB01879	SF-9	59.1	5.24	3.10	15.32
pSB01880	SF-9	56.8	5.97	3.39	15.10
pSB01885	SF-9	63.1	6.95	4.39	16.08
pSB01892	SF-9	56.2	4.89	2.75	15.91
187772	SF-9	79.5	5.14	4.09	18.36
187872	SF-9	72.6	5.26	3.81	17.35
expicont	SF-9	75.5	4.95	3.74	18.62

實例5：具有經處理之訊號肽的分子量片段表9

pSB01877 FimH J96 ELL41155.1 [大腸桿菌J96]
分析
	分析	片段15-189	完整蛋白質
	長度	175 aa	189 aa
	分子量	18948.34	20522.36 m.w.
	1 μg =	52.775皮莫耳	48.727皮莫耳
	分子消光係數	35800	35800
	1 A(280)校正至：	0.53 mg/ml	0.57 mg/ml
	1 mg/ml之A[280]	1.89 AU	1.74 AU
	等電點	6.81	8
	在pH7下之電荷	-0.48	1.52

pSB01878 FimH J96 ELL41155.1 [大腸桿菌J96]
分析
	分析	片段21-188	完整蛋白質
	長度	168 aa	188 aa
	分子量	18117.48	20344.08 m.w.
	1 μg =	55.195皮莫耳	49.154皮莫耳
	分子消光係數	24420	35800
	1 A(280)校正至：	0.74 mg/ml	0.57 mg/ml
	1 mg/ml之A[280]	1.35 AU	1.76 AU
	等電點	6.81	6.29
	在pH7下之電荷	-0.48	-2.47

pSB01885 FimH J96 ELL41155.1 [大腸桿菌J96]
分析
	分析	片段20-331	完整蛋白質
	長度	312 aa	331 aa
	分子量	32406.19	34537.79 m.w.
	1 μg =	30.858皮莫耳	28.954皮莫耳
	分子消光係數	38030	43720
	1 A(280)校正至：	0.85 mg/ml	0.79 mg/ml
	1 mg/ml之A[280]	1.17 AU	1.27 AU
	等電點	7.25	8.32
	在pH7下之電荷	0.5	2.5

pSB01892 FimH J96 ELL41155.1 [大腸桿菌J96]
分析
	分析	片段21-330	完整蛋白質
	長度	310 aa	330 aa
	分子量	32132.91	34359.51 m.w.
	1 μg =	31.121皮莫耳	29.104皮莫耳
	分子消光係數	32340	43720
	1 A(280)校正至：	0.99 mg/ml	0.79 mg/ml
	1 mg/ml之A[280]	1.01 AU	1.27 AU
	等電點	7.25	6.51
	在pH7下之電荷	0.5	-1.49

pSB01893 FimH J96 ELL41155.1 [大腸桿菌J96]
分析
	分析	完整蛋白質
	長度	331 aa
	分子量	34416.56
	1 μg =	29.056皮莫耳
	分子消光係數	43720
	1 A(280)校正至：	0.79 mg/ml
	1 mg/ml之A[280]	1.27 AU
	等電點	6.51
	在pH7下之電荷	-1.49

pSB01894 FimH J96 ELL41155.1 [大腸桿菌J96]
分析
	分析	片段21-332	完整蛋白質
	長度	312 aa	332 aa
	分子量	32247.01	34473.61 m.w.
	1 μg =	31.011皮莫耳	29.008皮莫耳
	分子消光係數	32340	43720
	1 A(280)校正至：	1.00 mg/ml	0.79 mg/ml
	1 mg/ml之A[280]	1.00 AU	1.27 AU
	等電點	7.25	6.51
	在pH 7下之電荷	0.5	-1.49

pSB02083

分析	片段21-188	完整蛋白質
長度	168 aa	188 aa
分子量	18063.42	20290.02 m.w.
1 μg =	55.361皮莫耳	49.285皮莫耳
莫耳消光係數	24420	35800
1 A(280)校正至：	0.74 mg/ml	0.57 mg/ml
1 mg/ml之A[280]	1.35 AU	1.76 AU
等電點	6.81	6.29
在pH 7下之電荷	-0.48	-2.47

pSB02198

樣品	FimH PSB 2198 1.45 mg/ml 5 ml 20190918 SS
體積 (ml )	25
濃度(mg/ml)	1.45
總量(mg)	36.25
等分試樣	5ml x5
產率	12mg/L
緩衝液：50 mM TrisCl pH8.0，300 mM NaCl

pSB02307

樣品名稱	Fim H 2307 0.48 mg/ml 5 ml 20190918 SS
體積(ml)	22.5 mls
濃度(mg/ml)	0.48 mg/ml
總量(mg)	10.8mg
產率	3.6mg/L
緩衝液：50 mM TrisCl pH8.0，300 mM NaCl

實例6：FimH成熟蛋白中之Phe1 (根據SEQ ID NO: 2之編號)的N端α-胺基為D-甘露糖提供關鍵的極性識別在不受理論或機制束縛的情況下，表明FimH成熟蛋白之Phe1 (根據SEQ ID NO: 2之編號)正前方正確的訊號肽裂解對表現功能性FimH蛋白質為重要的。N端α-胺基處之變化，諸如藉由在FimH蛋白質之Phe1前方N端處添加胺基酸可消除與D-甘露糖之O2、O5及O6原子的氫鍵相互作用，且引入與D-甘露糖之空間排斥，從而阻斷甘露糖結合。吾等實驗觀測結果證實，在SEQ ID NO: 2之Phe1前方添加額外的Gly殘基導致偵測不到甘露糖結合。

在分析與D-甘露糖結合之FimH的晶體結構後，觀測到以下：Phe1之N端α-胺基連同FimH之Asp54之側鏈(根據SEQ ID NO: 2之編號)及FimH之Gln133 (根據SEQ ID NO: 2之編號)一起為D-甘露糖提供關鍵的極性識別模體，且此等極性相互作用之突變及變化導致無甘露糖結合。

實例7：FimH中Phe1之側鏈不與D-甘露糖直接相互作用，而是埋入FimH內部，表明Phe1可經其他殘基，例如脂族疏水性殘基(Ile、Leu或Val)置換對FimH在與D-甘露糖及其類似物(例如PDB ID：1QUN)之複合物中之晶體結構的分析表明，Phe1 (根據SEQ ID NO: 2之編號)之側鏈不與D-甘露糖直接相互作用，而是藉由其芳族環與Val56、Tyr95、Gln133及Phe144 (根據SEQ ID NO: 2之編號)之側鏈堆疊而穩定結合袋。

代替Phe之替代性N端殘基可穩定FimH蛋白質，容納甘露糖結合且允許正確的訊號肽裂解。此類殘基可藉由此項技術中已知之適合方法來鑑別，諸如藉由目視檢查FimH之晶體結構，或使用計算蛋白質設計軟體進行更多定量選擇，諸如BioLuminate ^TM[BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2017]、Discovery Studio ^TM[Discovery Studio Modeling Environment, Dassault Systèmes, San Diego, 2017]、MOE ^TM[Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2017]及Rosetta ^TM[Rosetta, University of Washington, Seattle, 2017]。說明性實例顯示於圖 9A - 9C中。置換胺基酸可為脂族疏水性胺基酸(例如Ile、Leu及Val)。圖 11描繪Phe1與其他具有脂族疏水性側鏈之胺基酸(例如Ile、Leu及Val)之計算突變誘發掃描，該等胺基酸可穩定FimH蛋白質且容納甘露糖結合。

實例8：FimH蛋白質中Asn7 (根據SEQ ID NO: 2之編號)之突變可移除推定的N-醣基化位點且防止去醯胺化，而不影響甘露糖、mAb21或mAb475結合. 根據SEQ ID NO: 2之編號，哺乳動物細胞株過度表現分泌性大腸桿菌FimH可能導致殘基Asn7之N-連接醣基化。另外，殘基Asn7暴露於溶劑且隨後為Gly殘基，從而使其極易於去醯胺化。

對FimH在與 D -甘露糖及其類似物(例如PDB ID：1QUN)之複合物中之晶體結構的分析表明，Asn7距離甘露糖結合位點大於20 Å，且該位點之突變不應影響甘露糖結合。因此，Asn7突變為其他胺基酸(例如Ser、Asp及Gln)可有效地移除推定的N-醣基化位點且防止去醯胺化。

實例9：大腸桿菌及腸道沙門氏菌菌株臨床菌株及衍生物列於表 10中。額外參考菌株包括：O25K5H1，一種臨床O25a血清型菌株；及腸道沙門氏菌血清變異型鼠傷寒菌株LT2。

構築大腸桿菌菌株中之基因剔除，從而移除經靶向開讀框但留下短疤痕序列。

為簡單起見，經水解之O-抗原鏈及核心糖隨後指示為O-多醣(OPS)。表 10： 大腸桿菌菌株

菌株	菌株別名	基因型	血清型
GAR2401	PFEEC0100	wt (血液分離株)	O25b
'2401ΔwzzB	--	ΔwzzB	O25b
'2401ΔAraAΔ(OPS)	--	ΔAraA Δ(rflB-wzzB)	OPS-
O25K5H1	PFEEC0101	wt	O25a
O25K5H1ΔwzzB		ΔwzzB	O25a
BD559	--	W3110 ΔAraA ΔfhuA ΔrecA	OPS-
BD559ΔwzzB	--	W3110ΔAraA ΔfhuA ΔrecAΔwzzB	OPS-
BD559Δ(OPS)	--	BD559 Δ(rflB-wzzB)	OPS-
GAR2831	PFEEC0102	wt (血液分離株)	O25b
GAR865	PFEEC0103	wt (血液分離株)	O2
GAR868	PFEEC0104	wt (血液分離株)	O2
GAR869	PFEEC0105	wt (血液分離株)	O15
GAR872	PFEEC0106	wt (血液分離株)	O1
GAR878	PFEEC0107	wt (血液分離株)	O75
GAR896	PFEEC0108	wt (血液分離株)	O15
GAR1902	PFEEC0109	wt (血液分離株)	O6
Atlas187913	PFEEC0068	wt (血液分離株)	O25b
腸沙門氏菌血清變異型鼠傷寒菌株LT2	--	wt	N/A

實例10：用於 _WZZ B、 fepE及O-抗原基因簇選殖之寡核苷酸引子表11：寡核苷酸引子

名稱	引子序列	評述
LT2wzzB_S	GAAGCAAACCGTACGCGTAAAG (SEQ ID NO: 40)	基於 GenbankGCA_000006945.2 腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒菌株LT2
LT2wzzB_AS	CGACCAGCTCTTACACGGCG (SEQ ID NO: 41)
O25bFepE_S	GAAATAGGACCACTAATAAATACACAAATTAATAAC (SEQ ID NO: 42)	基於Genbank GCA_000285655.3 O25b EC958菌株ST131組裝及O25b GAR2401 WGS資料
O25bFepE_A	ATAATTGACGATCCGGTTGCC (SEQ ID NO: 43)
wzzB P1_S	GCTATTTACGCCCTGATTGTCTTTTGT (SEQ ID NO: 44)	基於大腸桿菌K-12菌株序列，Genbank MG1655NC_000913.3或W3110組裝GCA_000010245.1
wzzB P2_AS	ATTGAGAACCTGCGTAAACGGC (SEQ ID NO: 45)
wzzB P3_S	TGAAGAGCGGTTCAGATAACTTCC (SEQ ID NO: 46) ( UDP-葡萄糖-6-脫氫酶)
wzzB P4_AS	CGATCCGGAAACCTCCTACAC (SEQ ID NO:47) (磷酸核糖-AMP環水解酶/磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶)
O157 FepE_S	GATTATTCGCGCAACGCTAAACAGAT (SEQ ID NO: 48)	大腸桿菌O157 fepE (基於Genbank EDL933菌株GCA_000732965.1)
O157 FepE_AS	TGATCATTGACGATCCGGTAGCC (SEQ ID NO: 49)
pBAD33_轉接子_S	CGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGGTTTAAACCCAAGCAACAGATCGGCGTCGTCGGTATGGA (SEQ ID NO: 50)	接附子具有中央 PmeI位點及與保守5' OAg操縱子啟動子及3' gnd基因序列之同源性

pBAD33_轉接子_AS	AGCTTCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGGGTTTAAACCACGCTACCGCCCCTGGCTTTACAGCTACCGAGCT (SEQ ID NO: 51)
JUMPSTART_r	GGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTG (SEQ ID NO: 52)	通用Jumpstart (OAg操縱子啟動子)
gnd_f	CCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG (SEQ ID NO: 53)	通用3' OAg (gnd)操縱子反義引子

實例11：質體質體載體及次純系列於表 12中。自經純化基因體DNA擴增攜帶各種大腸桿菌及沙門氏菌 wzzB及 fepE基因之PCR片段，且將其次選殖至Invitrogen PCR®Blunt選殖套組中提供之較高複本數質體中( 圖 12A - 12B)。此質體係基於pUC複製子。引子P3及P4用於擴增大腸桿菌 wzzB基因與其原生啟動子，且經設計以分別與編碼UDP-葡萄糖-6-去氫酶及磷酸腺嘌呤核苷酸水解酶之近端及遠端基因中之區域結合(在Genbank MG1655NC_000913.3中註釋)。使用先前所描述之引子來擴增含有沙門氏菌 fepE基因及啟動子之PCR片段。類似的大腸桿菌 fepE引子係基於可用的Genbank基因體序列或內部生成之全基因體資料(在GAR2401及O25K5H1之情況下)設計。低複本數質體pBAD33用於在阿拉伯糖啟動子之控制下表現O-抗原生物合成基因。質體首先經修飾以便於選殖(經由Gibson方法)使用與5'啟動子同源之通用引子及3' 6-磷酸葡萄糖去氫酶( gnd)基因擴增之長PCR片段( 表 12)。含有O25b生物合成操縱子之pBAD33次純系顯示於圖 12A - 12B中。表12

質體
名稱	複製子	抗性標記物	評述
PCR®Blunt II TOPO	pUC	KanR	Invitrogen PCR選殖載體
pBAD33	P15a	CamR	阿拉伯糖誘導性載體
pBAD33-OAg	P15a	CamR	OAg操縱子Gibson選殖載體
pBAD33-O25b	P15a	CamR	O25b OAg表現質體
pBAD33-O21	P15a	CamR	O21 OAg表現質體
pBAD33-O16	P15a	CamR	O16 OAg表現質體
pBAD33-O75	P15a	CamR	O75 OAg表現質體
pBAD33-O1	P15a	CamR	O1 OAg表現質體
pBAD33-O2	P15a	CamR	O2 OAg表現質體
pTOPO-O25b 2401 wzzB	pUC	KanR	GAR 2401 gDNA模板
pTOPO-O25b 2401 fepE	pUC	KanR
pTOPO-K12 wzzB	pUC	KanR	大腸桿菌K-12菌株gDNA模板
pTOPO-O25a wzzB	pUC	KanR	大腸桿菌O25a菌株O25K5H1 gDNA模板
pTOPO-O25a fepE	pUC	KanR
pTOPO-沙門氏菌LT2 wzzB	pUC	KanR	腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒菌株LT2 gDNA模板
pTOPO-沙門氏菌LT2 fepE	pUC	KanR
pTOPO-O25a ETEC wzzB	pUC	KanR	購自ATCC之O25a ETEC菌株gDNA (「NR-5」 E2539-C1)
pTOPO-O25a ETEC fepE	pUC	KanR
pTOPO-O157fepE	pUC	KanR	購自ATCC之O157:H7:K-志賀桿菌屬(Shigella)毒素菌株gDNA (EDL933 #43895D-5)

實例12：O-抗原純化醱酵液用乙酸處理至最終濃度為1-2% (最終pH為4.1)。OAg之提取及去脂化係藉由將經酸處理之培養液加熱至100℃持續2小時來達成。在酸水解結束時，將該批次冷卻至環境溫度，且添加14% NH ₄OH至6.1之最終pH。離心經中和之培養液且收集離心分離液。向離心分離液中添加含CaCl ₂之磷酸鈉，且將所得漿料在室溫下培育30分鐘。藉由離心移除固體，且使用10 kDa膜將離心分離液濃縮12倍，接著相對於水進行兩次透濾。隨後，使用碳過濾器純化含有OAg之保留物。碳濾液用4.0 M硫酸銨1:1 (v/v)稀釋。最終硫酸銨濃度為2 M。經硫酸銨處理之碳濾液使用膜，以2 M硫酸銨作為操作緩衝液進一步純化。在流經時收集OAg。對於長OAg，濃縮HIC濾液，且隨後使用5kDa膜相對於水(20透濾體積)進行緩衝液交換。對於短(原生) OAg多醣，進一步降低MWCO以提高產量。

實例13：O25b長O-抗原與CRM ₁₉₇之綴合第一組長鏈O25b多醣-CRM ₁₉₇綴合物係使用過碘酸鹽氧化，接著使用還原胺化化學方法(RAC)進行綴合來產生( 表 14)。藉由改變氧化水準，使綴合物變異體具有三種活化水準(低、中等及高)。綴合物係藉由使用氰基硼氫化鈉作為還原劑，使在DMSO培養基中復原之凍乾的活化多醣與凍乾的CRM ₁₉₇反應來產生。綴合反應在23℃下進行24小時，接著使用硼氫化鈉封端3小時。在綴合淬滅步驟後，綴合物係藉由使用5 mM丁二酸鹽/0.9% NaCl，pH 6.0，使用100K MWCO再生纖維素膜進行超濾/透濾來純化。使用0.22 µm膜進行綴合物之最終過濾。

除非另外明確說明，否則貫穿以下實例中所揭示之綴合物包括核心醣部分。

藉由異源聚合酶鏈長調控因子賦予之長O-抗原表現. 最初的大腸桿菌菌株構築集中於O25血清型。目標為過度表現異源 wzzB或 fepE基因以查看其是否在O25 wzzB基因剔除菌株中賦予較長鏈長。首先，藉由PCR篩選血液分離株，以鑑別O25a及O25b亞型之菌株。接下來，針對安比西林敏感性篩選菌株。鑑別出單個安比西林敏感性O25b分離株GAR2401，向其中引入 wzzB缺失。類似地，在O25a菌株O25K5H1中製備 wzzB缺失。為了對此等突變進行基因互補，將來自GAR 2401及O25K5H1之 wzzB基因次選殖至高複本PCR-Blunt II選殖載體中，且藉由電穿孔引入兩種菌株中。類似地選殖且轉移來自大腸桿菌K-12及腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒LT2之額外 wzzB基因；來自大腸桿菌O25K5H1、GAR 2401、O25a ETEC NR-5、O157:H7:K-及腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒LT2之 fepE基因同樣如此。

使細菌在LB培養基中生長隔夜，且LPS用酚提取，藉由SDS PAGE (4-12%丙烯醯胺)進行解析且進行染色。凝膠之各孔負載有自相同數目之細菌細胞(大致2個OD ₆₀₀單位)提取之LPS。LPS之大小係根據內部原生大腸桿菌LPS標準物且藉由計數自顯示廣泛分佈之鏈長(相差一個重複單元)之樣品子集中可辨別的梯子來估計。在圖 13A之左側，顯示O25a O25K5HΔ wzzB之質體轉型體的LPS概況；且在右側，顯示O25b GAR 2401Δ wzzB轉型體之類似概況。用O25特異性血清探測之一式多份凝膠的免疫墨點顯示於圖 13B中。

此實驗之結果顯示，將同源 wzzB基因引入至大腸桿菌O25aΔ wzzB宿主中，恢復短O25 LPS (10-20x)之表現，沙門氏菌 LT2 wzzB亦如此。引入來自GAR2401之O25b wzzB基因則不能，表明來自此菌株之WzzB酶為有缺陷的。大腸桿菌WzzB胺基酸序列之比較表明，A210E及P253S取代可為原因。明顯的是，沙門氏菌 LT2 fepE及來自O25a O25K5H1之大腸桿菌 fepE賦予表現極長(VL) OAg LPS之能力，其中沙門氏菌 LT2 fepE引起超過藉由大腸桿菌fepE賦予之大小的OAg。

對於GAR2401Δ wzzB轉化體，觀測到類似的表現模式：大腸桿菌O25a或K12菌株 wzzB恢復產生短LPS之能力。沙門氏菌 LT2 fepE產生最長LPS，大腸桿菌 fepE產生略微較短LPS，而沙門氏菌 LT2 wzzB產生中等大小的長LPS (L)。在使用大腸桿菌O25aΔ wzzB轉型體之另一個實驗中，評定其他大腸桿菌 fepE基因產生極長LPS之能力。來自GAR2401、O25a ETEC菌株及O157志賀桿菌毒素產生菌株之 fepE基因亦賦予產生極長LPS之能力，但不如沙門氏菌 LT2 fepE產生之LPS長 ( 圖 14)。

已在血清型O25a及O25b菌株中確立，沙門氏菌 LT2 fepE產生所評估之聚合酶調控因子之最長LPS，吾人接下來設法確定是否其亦將在其他大腸桿菌血清型中產生極長LPS。用沙門氏菌 fepE質體轉型血清型O1、O2、O6、O15及O75之野生型菌血症分離株，且提取LPS。圖 15中所示之結果證實，沙門氏菌fepE可賦予其他與血液感染相關之盛行血清型產生極長LPS之能力。結果亦顯示，基於質體之沙門氏菌 fepE之表現似乎超越此等菌株中通常由內源性 wzzB施加之鏈長控制。

O-抗原在常見大腸桿菌宿主菌株中之基於質體之表現. 根據生物製程發展之觀點，在常見大腸桿菌宿主而非多個菌株中產生不同血清型之O-抗原之能力將極大地簡化個別抗原的製造。為此目的，來自不同血清型之O-抗原基因簇藉由PCR擴增，且選殖至在阿拉伯糖調節之啟動子控制下的低複本數質體(pBAD33)中。此質體可與沙門氏菌 LT2 fepE質體在大腸桿菌中相容(可共存)，此係因為其具有不同(p15a)複製子及不同可選標記物(氯黴素與康黴素)。在第一實驗中，將pBAD33 O25b操縱子質體次純系與沙門氏菌 LT2 fepE質體共轉染至GAR2401ΔwzzB中，且轉化體在存在或不存在0.2%阿拉伯糖之情況下生長。圖 16A 至 16B中所示之結果表明，極長的O-抗原LPS係以阿拉伯糖依賴性方式產生。

類似地評估選殖於其他血清型之O-抗原基因簇，且結果顯示於圖 17中。沙門氏菌 LT2 fepE及pBAD33-OAg質體之共表現產生可偵測之長鏈LPS，其對應於O1、O2 (四個純系中之兩個)、O16、O21及O75血清型。由於未知的原因，pBAD33-O6質體在所有測試的四個分離株中均未能產生可偵測之LPS。儘管表現量不同，但結果顯示，在常見宿主中表現長鏈O-抗原為可行的。然而，在一些情況下，可能需要進一步最佳化以改進表現，例如藉由修飾質體啟動子序列。

來自具有或不具有沙門氏菌 LT2 fepE質體之不同血清型O25大腸桿菌菌株之LPS的概況展示於圖 18中。研究兩個菌株之O-抗原：GAR2831之醱酵、提取及純化，原生短O25b OAg之產量；及研究GAR2401Δ wzzB/ fepE之長O25b OAg的產量。圖 18SDS-PAGE凝膠中顯示之相應的短及長形式LPS以紅色突出顯示。用乙酸直接自醱酵細菌提取多醣，且進行純化。經純化之短及長或極長O25b多醣之尺寸排阻層析概況展示於圖 19A-19B中。將兩批短多醣(來自GAR2831)之特性與單個極長多醣製劑(來自菌株GAR2401Δ wzzB/ fepE)進行比較。長O-抗原之分子量比短O-抗原之分子量大3.3倍，且重複單元之數目經估計為約65 (極長)與約20。參見表 13 。表13

聚合物批次號	原生	原生	經修飾(長鏈)
聚合物批次號	709766-24A	709722-24B	709766-25A
聚合物MW (kDa)	17.3	16.3	55.3
重複單元數目	20	19	64

使用習知還原胺化方法，將極長O25b O-抗原多醣與白喉類毒素CRM ₁₉₇綴合。製備三個不同批次之具有不同過碘酸鹽活化程度之醣綴合物：中等(5.5%)、低(4.4%)及高(8.3%)。顯示所得製劑及未綴合多醣不含內毒素污染) ( 表 14)。

根據圖20A中所示之時程，每組四隻兔(紐西蘭白色雌性)各自接種10微克醣綴合物及20微克QS21佐劑，且對血清進行取樣(VAC-2017-PRL-EC-0723)。值得注意的是，10微克劑量為在評估細菌醣綴合物時慣常給予兔之範圍的低端(20-50微克為更典型的)。亦在獨立研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中，使用相同劑量(10微克多醣+20微克QS21佐劑)及相同投與時程，對一組兔進行疫苗接種未綴合多醣。

在LUMINEX分析中評估兔對三種O25b醣綴合物製劑之抗體反應，其中羧基珠粒塗有與未綴合O25b長多醣預結合之甲基化人類血清白蛋白。用藻紅素(PE)標記之抗IgG二級抗體偵測血清樣品中O25b特異性IgG抗體之存在。在第0週(免疫前)、第6週(給藥後2，PD2)、第8週(給藥後3，PD3)及第12週(給藥後4，PD4)在最佳反應兔(每組四隻中之一隻)中取樣之血清中觀測到的免疫反應概況展示於圖 21A-21C中。在12隻兔中之任一者中未偵測到顯著的免疫前血清IgG效價。相反，在所有三組兔之接種後血清中均偵測到O25b抗原特異性抗體反應，其中低活化醣綴合物組之反應趨勢略高於中等或高活化醣綴合物組。在給藥後3個時間點觀測到最大反應。低活化組之一隻兔及高活化組之一隻兔未能對疫苗接種起反應(無反應者)。

為了評定CRM ₁₉₇載體蛋白質綴合對長O25b OAg多醣之免疫原性的影響，將經未綴合多醣接種之兔血清中存在的抗體與經低活化CRM ₁₉₇醣綴合物接種之兔血清進行比較，圖 22A-22F。值得注意的是，游離多醣沒有免疫原性，在免疫與免疫前血清中幾乎不引發IgG反應 ( 圖 22A)。相比之下，在來自四隻疫苗接種O25b OAg-CRM ₁₉₇之兔的三隻的PD4血清中，在一系列血清稀釋液(1:100至1:6400)中，觀測到比免疫前血清含量高約十倍的O25b OAg特異性IgG平均螢光強度值(MFI)。此等結果證明在10微克劑量水準下載體蛋白質綴合產生針對O25b OAg多醣之IgG抗體的必要性。

將在TSA盤上生長之細菌懸浮於PBS中，調節至OD ₆₀₀為2.0，且固定在含4%多聚甲醛之PBS中。在4% BSA/PBS中阻斷1 h之後，將細菌與含免疫前及PD3免疫血清之2% BSA/PBS之連續稀釋液一起培育，且用經PE標記之二級F(ab)抗體偵測結合的IgG。

在用完整細菌進行之流式細胞測量術實驗中證實由O25b OAg-CRM ₁₉₇引發之O25b抗體的特異性。在Accuri流式細胞儀中，用PE綴合的F(ab') ₂片段山羊抗兔IgG偵測IgG與全細胞之結合。

如圖 23A - 23C中所示，免疫前兔抗體未能與野生型血清型O25b分離株GAR2831及GAR2401或K-12大腸桿菌菌株結合，而匹配的PD3抗體以濃度依賴性方式對O25b細菌進行染色。缺乏表現OAg之能力的陰性對照K-12菌株僅顯示極弱的PD3抗體結合，最可能歸因於其表面上存在暴露之內核寡醣抗原決定基。將沙門氏菌 fepE質體引入野生型O25b分離株中導致染色顯著增強，其與較長OAg多醣提供之免疫原性抗原決定基的較高密度一致。

結論：所描述之結果顯示，不僅沙門氏菌 fepE為沙門氏菌屬物種中之極長O-抗原多醣的決定因素，而且其亦可賦予不同O-抗原血清型在大腸桿菌菌株上製備極長OAg的能力。此特性可經利用以藉由促進純化及與適當載體蛋白質之化學綴合，及經由形成較高分子量複合物潛在增強免疫原性來產生具有改進之生物製程開發特性的O-抗原疫苗多醣。

實例14：最初兔研究產生第一多株抗體試劑及針對RAC O25b OAg-CRM ₁₉₇之IgG反應長鏈O25b多醣-CRM ₁₉₇綴合物係使用過碘酸鹽氧化，接著使用還原胺化化學方法(RAC)進行綴合來產生( 表 14)。亦參見表24。表14

CRM ₁₉₇ 綴合物	132242-28 中等5 .5 % 活化	132242-27 低 4.5% 活化	132242-29 高 8.3% 活化	709766-29 游離 O25b 多醣
多醣濃度 (mg /mL )	0.7	0.6	0.67	1
內毒素 (Eu / μg )	0.02	0.02	0.02	＜0.6 EU
基質	5 μm丁二酸鹽緩衝液/鹽水，pH 6.0

在兔研究1 (VAC-2017-PRL-EC-0723) (亦在上文實例 13中描述)中，具有10 μg低、中等或高活化RAC (+QS21)之五(5) 隻兔/組根據圖 20A中所示之時程接受組合物。在後續兔研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中觀測到未綴合游離O25b多醣不具有免疫原性(參見圖 25)。

在兔研究2 (VAC-2018-PRL-EC-077)中，具有L-RAC (AlOH ₃，QS21或無佐劑)之2隻兔/組根據圖 20B中所示之時程接受組合物。

兔4-1、4-2、5-1、5-2、6-1及6-2接受描述於實例 13中之極長未綴合O25b多醣，且測試第18週血清。

更具體言之，向兔4-1投與包括50 μg未綴合O25b、100 μg AlOH ₃佐劑之組合物。向兔4-2投與包括50 μg未綴合O25b、100 μg AlOH ₃佐劑之組合物。向兔5-1投與包括50 μg未綴合O25b、50 μg QS-21佐劑之組合物。向兔5-2投與包括50 μg未綴合O25b、50 μg QS-21佐劑之組合物。向兔6-1投與包括50 μg未綴合O25b、無佐劑之組合物。向兔6-2投與包括50 μg未綴合O25b、無佐劑之組合物。

實例15：用O25b RAC綴合物進行之兔研究：dLIA血清稀釋效價兔研究2 (VAC-2018-PRL-EC-077) O25b dLIA血清稀釋效價與研究1 (VAC-2017-PRL-EC-0723)之最佳反應兔對比。對於此等實驗，實施經改良之直接結合Luminex分析，其中O25b長O-抗原之聚離胺酸綴合物被動地吸附於Luminex羧基珠粒上，而非先前描述之甲基化血清白蛋白長O-抗原混合物。使用聚離胺酸-O25b綴合物改進分析之靈敏度及IgG濃度依賴性反應之品質，允許經由使用曲線擬合(四參數非線性方程式)確定血清稀釋效價。在表 15中將第一研究中最高效價兔之血清中的O25b IgG效價與第二研究中之兔血清進行比較。表15

	具有明礬佐劑之O25b -CRM 低活化綴合物 (EC ₅₀ 作為血清稀釋 )	具有QS21 佐劑之O25b -CRM 低活化綴合物 (EC ₅₀ 作為血清稀釋 )	不具有佐劑之O25b -CRM 低活化綴合物 (EC ₅₀ 作為血清稀釋 )
	兔 1-1	兔 1-2	兔 2-1	兔 2-2	兔 3-1	兔 3-2
第 3 週抗血清 ( 在初次之 3 週之後 )	~1:200	~1:200	＜1:100	＜1:100	~1:200	~1:200
第7 週抗血清 ( 在加打1 之1 週之後 )	1:1600	1:4000	1:250	1:500	1:250	1:1500
第10 週抗血清 ( 在加打2 之1 週之後 )	1:1100	1:1900	1:250	1:500	1:800	1:1200
第18 週抗血清 ( 在加打4 之1 週之後 )	1:1600	1:4000	1:1300	1:1200	1:1400	1:1600
	來自兔 2-3 之最佳抗血清之 6 次重複的平均值 ( 第一研究之分析標準 ) EC ₅₀= 1:1700

第二兔研究中之較高劑量(50/20 μg對比10 μg)未改進IgG效價。

休息兩個月增強IgG反應(間隔較短時未觀測到)。

與QS21或無佐劑相比，明礬似乎增強兔之IgG反應。

確立用幼兔補體(BRC)及HL60細胞作為嗜中性白血球來源之調理吞噬活性分析(OPA)，以量測O-抗原醣綴合物之功能免疫原性。預先冷凍之大腸桿菌GAR2831的細菌儲備液在37℃下在Luria培養液(LB)培養基中生長。使細胞集結且懸浮於補充有20%甘油之PBS中達到1個OD ₆₀₀單位/毫升之濃度且冷凍。將滴定前解凍的細菌稀釋於具有1%明膠之HBSS (漢克氏(Hank's)平衡鹽溶液)中至0.5× 10 ⁵CFU/ml，且將10 μL (10 ³CFU)與20 μL連續稀釋血清合併在U形底組織培養微量盤中，且混合物在700 rpm (BELLCO振盪器)下在37℃下於5% CO ₂培育箱中振盪30 min。將10 μl 2.5%補體(幼兔血清，PEL-FREEZ 31061-3，預稀釋於HBG中)及20 μL HL-60細胞(0.75X 10 ⁷個/ml)及40 μL HBG添加至U形底組織培養微量盤，且混合物在700 rpm (BELLCO振盪器)下在37℃下於5% CO ₂培育箱中振盪45 min。隨後，將各100 μL反應物之10 μL轉移至藉由施加100 μL水、真空過濾且施加150 μL 50% LB製備之預潤濕MILLIPORE MULTISCREENHTS HV過濾盤之相應孔中。真空過濾過濾盤，且在37℃下於5% CO ₂培育箱中培育隔夜。次日，在固定、用庫馬斯(COOMASSIE)染料及Destain溶液染色及去染色之後，使用IMMUNOSPOT®分析器及IMMUNOCAPTURE軟體對群落進行計數。為了確立OPA活性之特異性，在與OPA反應中之其他分析組分組合之前，將免疫血清與100 μg/mL經純化之長O25b O-抗原一起預培育。OPA分析包括不具有HL60細胞或補體之對照反應，以證明任何觀測到之殺傷對此等組分之依賴性。

在分析中評估來自兩個兔研究之代表性兔之匹配的免疫前及疫苗接種後血清樣品，且確定血清稀釋效價( 表 16 ，圖 26A - 26B)。與未綴合O25b長O-抗原多醣之預培育阻斷殺細菌活性，證明OPA之特異性( 圖 19C)。表16 OPA效價

兔2-3給藥如下：兔2-3給藥：10/10/10/10 μg RAC綴合物+ QS21，給藥後(PD) 4放血。兔1-2給藥如下：50/20/20/20 μg RAC綴合物+ Al(OH)3，PD4放血。

表16
樣品	效價
兔2-3免疫前血清	537
兔2-3 13週血清(最終放血)	13686
兔1-2免疫前血清	＜200
兔1-2 19週血清(最終放血)	22768

實例16：由未綴合O25b長O-抗原多醣及衍生之O25b RAC/DMSO長O-抗原醣綴合物引發之O-抗原O25b IgG含量. 在第0、5及13週藉由皮下注射0.2或2.0 μg/動物O25b RAC/DMSO長O-抗原醣綴合物對各組十隻CD-1小鼠進行給藥，在第3週(給藥後1，PD1)、第6週(給藥後2，PD2)及第13週(給藥後3，PD3)時間點進行放血以用於免疫原性測試。用O25b特異性小鼠mAb作為內標，藉由定量Luminex分析(詳情參見實例 15)來確定抗原特異性IgG之水準。在自20×隨機選擇的未經疫苗接種小鼠之合併血清中，確定基線IgG含量(虛線)。游離的未綴合O25b長O-抗原多醣免疫原在任何時間點均不誘導高於基線水準之IgG。相反，在兩次劑量之O25b-CRM197 RAC長綴合物醣綴合物之後觀測到IgG反應：至PD3時觀測到穩固均一的IgG反應，在PD2時觀測到中等且變化較大的IgG含量。GMT IgG值(ng/ml)用95% CI誤差條指示。參見圖 27A - 27C。

實例17：O25b幼兔補體(BRC) OPA之特異性. A-B)來自兔2-3及1-2之O25b RAC/DMSO長O-抗原免疫後血清(而非匹配的免疫前對照血清)顯示殺細菌OPA活性。C)藉由與100 µg/mL長O-抗原O25b多醣一起預培育，阻斷來自兔1-2之免疫血清的OPA活性。將菌株GAR2831細菌與HL60、2.5% BRC及血清之連續稀釋液在37℃下一起培育1 h，且藉由計數過濾板上之微群落(CFU)來對存活細菌計數。參見圖 26A - 26C。

實例18：RAC及eTEC O25b長醣綴合物比單端醣綴合物更具免疫原性. 用碳青黴烯類抗性氟喹諾酮抗性MDR菌株Atlas187913進行BRC OPA分析。根據與圖 28A - 28B中所示相同之時程，用2 µg醣綴合物接種各組20隻CD-1小鼠，且在給藥後2 (PD2) ( 圖 28A)及給藥後3 (PD3) ( 圖 28B)時間點確定OPA反應。條形圖指示具有95% CI之GMT。指示高於未經疫苗接種基線之反應率。使用未配對t檢驗與韋爾奇氏校正(Welch's correction) (Graphpad Prism)評估不同組之對數轉換資料，以評定差異是否為統計學上顯著的。結果概述於表 17中。參見圖 28A - 28B 。在用2 µg eTEC O1a長醣綴合物接種之小鼠中，觀測到針對O1a、PD2及PD3之OPA效價(資料未示出)分別大於表 17中所示之針對O25b、PD2及PD3之OPA效價。表17

描述	反應者%(n/N)*	幾何平均效價PD2	反應者% (n/N)*	幾何平均效價PD3
單端短，2 µg	45 (9/20)	1,552	85 (17/20)	17,070
單端長，2 µg	30 (6/20)	763	85 (17/20)	10,838
RAC/DMSO長，2µg	65 (13/20)	8,297	95 (19/20)	163,210
eTEC (10%)長，2µg	90 (18/20)	27,368	100 (19/19)	161,526

實例19：eTEC化學物質之OPA免疫原性可藉由調節多醣活化含量來改進. 用碳青黴烯類抗性氟喹諾酮抗性MDR菌株Atlas187913進行BRC OPA分析。用0.2 µg或2 µg指定長O25b eTEC醣綴合物接種各組20隻CD-1小鼠，且在PD2時間點確定OPA反應。評估來自4%活化與17%活化組之彙總對數轉換資料，以使用未配對T測試與韋爾奇氏校正(Graphpad Prism)確認OPA反應之差異為統計學上顯著的。個別組之GMT及反應率彙總於表 18中。參見圖 29。表18

描述	反應者% (n/N)	幾何平均效價
eTEC長4%活化(0.2 µg)	35 (7/20)	628
eTEC長4%活化(0.2 µg)	65 (13/20)	8,185
eTEC長10%活化(0.2 µg)	45 (9/20)	1,085
eTEC長10%活化(0.2 µg)	90 (18/20)	27,368
eTEC長17%活化(0.2 µg)	70 (14/20)	3,734
eTEC長17%活化(0.2 µg)	80 (16/20)	25,461

實例20：攻擊研究表明長大腸桿菌 O25beTEC綴合物在三個劑量後引發保護. 根據指定時程用2 µg劑量免疫接種之各組20隻CD-1小鼠用菌株GAR2831之1×10 ⁹個細菌IP攻擊。監測後續存活六天。保護用在4%、10%或17%含量下經活化之eTEC醣綴合物疫苗接種之小鼠群組免於致死性感染，而未經疫苗接種對照小鼠或疫苗接種2 µg未綴合O25b長多醣之小鼠則不。參見圖 30A - 30B。

實例21：用於製備eTEC連接之醣綴合物的方法 醣之活化及用胱胺二鹽酸鹽之硫醇化。將醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。藉由Karl Fischer (KF)分析來確定溶液之水分含量，且將其調節至達到0.1及1.0%之水分含量，通常0.5%。

為了啟動活化，在DMSO中以100 mg/mL之濃度新鮮製備1,1'-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)之溶液。醣用不同量之CDT/CDI (1-10莫耳當量)活化，且使反應在室溫或35℃下進行1-5小時。添加水以淬滅活化反應溶液中之任何殘餘CDI/CDT。進行計算以確定添加之水量，且以使得最終水分含量為總水溶液之2-3%。使反應在室溫下進行0.5小時。胱胺二鹽酸鹽係在無水DMSO中新鮮製備，濃度為50 mg/mL。活化的醣與1-2莫耳當量之胱胺二鹽酸鹽反應。或者，活化的醣與1-2莫耳當量之半胱胺鹽酸鹽反應。使硫醇化反應在室溫下進行5至20小時以產生硫醇化醣。硫醇化水準係藉由CDT/CDI之添加量來決定。

活化的硫醇化醣的還原及純化 .向硫醇化醣反應混合物中添加3-6莫耳當量之參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之溶液，且使其在室溫下進行3-5小時。隨後，將反應混合物添加至預冷卻之10 mM磷酸二氫鈉中稀釋5-10倍，且經由5 μm過濾器過濾。相對於30-40倍透濾體積之預冷卻之10 mM磷酸二氫鈉進行硫醇化醣之透濾。抽取活化的硫醇化醣保留物的等分試樣用於確定醣濃度及硫醇含量(Ellman)分析。

溴乙醯化載體蛋白質之活化及純化 .載體蛋白質之游離胺基藉由與溴乙醯化劑，諸如溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)、溴乙醯溴或另一適合之試劑反應而經溴乙醯化。

在活化之前，首先將載體蛋白質(於0.1M磷酸鈉，pH 8.0±0.2中)保持在8±3℃下、在約pH 7下。以0.25-0.5 BAANS:蛋白質(w/w)之比率向蛋白質溶液中添加溴乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)之二甲亞碸(DMSO)儲備溶液(20 mg/mL)。反應物在5±3℃下輕輕混合30-60分鐘。所得溴乙醯化(活化)蛋白質經純化，例如藉由使用10 kDa MWCO膜，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液進行超濾/透濾。純化後，藉由Lowry蛋白質分析估計溴乙醯化載體蛋白質之蛋白質濃度。

活化程度係藉由利用與抑制電導率偵測偶聯之離子交換液相層析(離子層析法)的總溴化物分析來確定。活化的溴乙醯化蛋白質上的結合溴化物係在分析樣品製備中自蛋白質裂解，且連同可能存在之任何游離溴化物一起定量。藉由在鹼性2-巰基乙醇中加熱樣品，將蛋白質上任何剩餘共價結合之溴轉化為離子溴化物而釋放。

溴乙醯化 CRM ₁₉₇ 之活化及純化 .CRM ₁₉₇用10 mM磷酸鹽緩衝之0.9% NaCl pH 7 (PBS)稀釋至5 mg/mL，且隨後使用1 M儲備溶液製成0.1 M NaHCO ₃pH 7.0。以1:0.35 (w:w)之CRM ₁₉₇:BAANS比率，使用20 mg/mL DMSO之BAANS儲備溶液，添加BAANS。在3℃與11℃之間培育反應混合物30分鐘至1小時，隨後藉由超過濾/透濾，使用10K MWCO膜及10mM磷酸鈉/0.9% NaCl pH 7.0來純化。經純化之活化的CRM ₁₉₇係藉由Lowry分析法分析以確定蛋白質濃度，且隨後用PBS稀釋至5 mg/mL。添加蔗糖至5% wt/體積作為低溫保護劑，且將經活化蛋白質冷凍且儲存在-25℃下，直至綴合需要。

CRM ₁₉₇之離胺酸殘基的溴乙醯化非常一致，致使39個可用離胺酸中之15至25個離胺酸活化。該反應產生高產率之活化蛋白質。

活化的硫醇化醣與溴乙醯化載體蛋白質之綴合 .隨後添加溴乙醯化載體蛋白質及活化的硫醇化醣。醣/蛋白質輸入比率為0.8 ± 0.2。用1 M NaOH溶液將反應pH添加至9.0 ± 0.1。使綴合反應在5℃下進行20 ± 4小時。

殘餘反應性官能基之封端 .載體蛋白質上未反應之溴乙醯化殘基藉由在5℃下與2莫耳當量作為封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時來淬滅。殘餘游離巰基在5℃下用4莫耳當量之碘乙醯胺(IAA)封端20-24小時。

eTEC 連接之醣綴合物的純化 .綴合反應(IAA封端後)混合物經由0.45 µm過濾器過濾。相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%生理鹽水pH 6.0進行醣綴合物之超濾/透濾。醣綴合物保留物隨後經由0.2 µm過濾器過濾。抽取醣綴合物之等分試樣用於分析。其餘醣綴合物儲存在5℃下。參見表 21、表 22、表 23、表 24及表 25。

實例22：大腸桿菌-O25B ETEC綴合物之製備 活化方法 - 大腸桿菌 - O25b 脂多醣之活化 .將凍乾的大腸桿菌-O25b多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。藉由Karl Fischer (KF)分析來確定凍乾的O25b/DMSO溶液之水分含量。藉由向O25b/DMSO溶液中添加WFI來調整水分含量，以達到0.5%之水分含量。

為了啟動活化，1,1'-羰基二咪唑(CDI)以100 mg/mL在DMSO溶液中新鮮製備。大腸桿菌-O25b多醣在硫醇化步驟之前用各種量之CDI活化。CDI活化在室溫或35℃下進行1-3小時。添加水以淬滅活化反應溶液中之任何殘餘CDI。進行計算以確定添加之水量，且以使得最終水分含量為總水溶液之2-3%。使反應在室溫下進行0.5小時。

活化的大腸桿菌 - O25b 多醣之硫醇化. 在無水DMSO中新鮮製備胱胺二鹽酸鹽，且向活化的多醣反應溶液中添加1-2莫耳當量之胱胺二鹽酸鹽。使反應在室溫下進行20 ± 4小時。

活化的硫醇化大腸桿菌 - O25b 多醣的還原及純化 .向硫醇化醣反應混合物中添加3-6莫耳當量之參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之溶液，且使其在室溫下進行3至5小時。隨後，將反應混合物添加至預冷卻之10 mM磷酸二氫鈉中稀釋5-10倍，且經由5 μm過濾器過濾。用5K MWCO超濾器膜盒，相對於40倍透濾體積之預冷卻的10 mM磷酸二氫鈉進行經硫醇化醣之透濾。抽取硫醇化O25b多醣保留物用於醣濃度及硫醇(Ellman)分析。活化方法之流程圖提供於圖 32A )中。

綴合方法 - 硫醇化大腸桿菌 - O25b 多醣與溴乙醯化 CRM ₁₉₇ 之綴合 . 如實例 21中所描述，CRM ₁₉₇載體蛋白質藉由溴乙醯化單獨活化，且隨後與活化的大腸桿菌-O25b多醣反應以進行綴合反應。溴乙醯化CRM ₁₉₇及硫醇化O25b多醣在反應容器中混合在一起。醣/蛋白質輸入比率為0.8 ± 0.2。將反應pH調整至8.0-10.0。使綴合反應在5℃下進行20 ± 4小時。

溴乙醯化 CRM ₁₉₇ 及硫醇化大腸桿菌 - O25b 多醣上之反應性基團之封端 .CRM ₁₉₇蛋白質上之未反應之經溴乙醯化殘基藉由以下來進行封端：在5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時，隨後在5℃下用4莫耳當量之碘乙醯胺(IAA)封端經硫醇化O25b-多醣之任何殘餘游離硫氫基20-24小時。

eTEC 連接之大腸桿菌 - O25b 醣綴合物的純化 .綴合溶液經由0.45 µm或5 µm過濾器過濾。用100K MWCO超濾膜盒進行O25b醣綴合物之透濾。相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%生理鹽水pH 6.0進行透濾。大腸桿菌-O25b醣綴合物100K保留物隨後經由0.22 µm過濾器過濾，且儲存在5℃下。

綴合方法之流程圖提供於圖 32B中。

結果若干批次之大腸桿菌-O25b eTEC醣綴合物之反應參數及表徵資料顯示於表 19中。用胱胺二鹽酸鹽進行之CDI活化-硫醇化產生具有41至92%醣產率及＜5至14%游離醣的醣綴合物。亦參見表 21 、表 22 、表 23 、表 24 及表 25。表19.大腸桿菌-O25b eTEC綴合物之實驗參數及特徵資料

綴合物批次	O25b-1A	O25b-2B	O25b-3C	O25b-4D	O25b-5E	O25b-6F
活化水準(硫醇之mol/多醣之mol)，%	10	20	22	17	25	24
輸入醣/蛋白質比率	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
醣產率(%)	56	57	79	92	41	59
輸出醣/蛋白比率	0.88	1	1.18	1.32	2.9	1.4
游離醣，%	8	˂5	6	5	14	5
游離蛋白質，%	＜ 1	＜ 1	＜ 1	＜ 1	＜ 1	＜ 1
綴合物Mw，kDa	1057	4124	2259	2306	1825	1537
總CMCA	3	na	na	7.2	na	na

實例23：用於製備大腸桿菌O-抗原多醣-CRM197 eTEC綴合物之程序(適用於大腸桿菌血清型O25b、O1a、O2及O6之O-抗原 多醣之活化 .將大腸桿菌O-抗原多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。為了起始活化，向多醣溶液中添加各種量之1,1'-羰基二咪唑(CDI) (1-10莫耳當量)，且使反應在rt或35℃下進行1-5小時。隨後，添加水(2-3%，v/v)以淬滅活化反應溶液中之任何殘餘CDI。在使反應在室溫下進行0.5小時之後，添加1-2莫耳當量之胱胺二鹽酸鹽。使反應在室溫下進行5-20小時，且隨後用3-6莫耳當量之參(2-羧基乙基)膦(TCEP)處理以產生硫醇化醣。硫醇化水準係藉由CDT之添加量來決定。

隨後，將反應混合物添加至預冷卻之10 mM磷酸二氫鈉中稀釋5-10倍，且經由5 μm過濾器過濾。相對於30-40倍透濾體積之預冷卻之10 mM磷酸二氫鈉進行硫醇化醣之透濾。抽取活化的硫醇化醣保留物的等分試樣用於確定醣濃度及硫醇含量(Ellman)分析。

載體蛋白質 ( CRM ₁₉₇ ) 之活化 .在活化之前，首先將CRM ₁₉₇(於0.1M磷酸鈉，pH 8.0±0.2中)保持在8±3℃下、在約pH 8下。以0.25-0.5 BAANS:蛋白質(w/w)之比率向蛋白質溶液中添加溴乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)之二甲亞碸(DMSO)儲備溶液(20 mg/mL)。反應物在5±3℃下輕輕混合30-60分鐘。所得溴乙醯化(活化)蛋白質經純化，例如藉由使用10 kDa MWCO膜，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液進行超濾/透濾。純化後，藉由Lowry蛋白質分析估計溴乙醯化載體蛋白質之蛋白質濃度。

綴合 .隨後將活化的CRM ₁₉₇及活化的大腸桿菌O-抗原多醣添加至反應器中且混合。醣/蛋白質輸入比率為1±0.2。用1 M NaOH溶液將反應pH添加至9.0 ± 0.1。使綴合反應在5℃下進行20 ± 4小時。載體蛋白質上未反應之溴乙醯化殘基藉由在5℃下與2莫耳當量作為封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時來淬滅。殘餘游離巰基在5℃下用4莫耳當量之碘乙醯胺(IAA)封端20-24小時。隨後，使用相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%生理鹽水pH 6.0進行之超濾/透濾純化反應混合物。隨後，經純化綴合物經由0.2 µm過濾器過濾。參見表 21 、表 22 、表 23 、表 24 及表 25 。

實例24：通用程序-藉由還原胺化化學方法(RAC)進行O-抗原(來自大腸桿菌血清型O1、O2、O6、25b)多醣之綴合 在二甲亞碸 (RAC/DMSO) 中之綴合 活化多醣.在100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.0 ± 0.2)中進行多醣氧化，藉由依次添加計算量之500 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)及注射用水(WFI)，使最終多醣濃度為2.0 g/L。必要時，將反應pH調整至大致pH 6.0。在pH調節之後，將反應溫度冷卻至4℃。藉由添加大致0.09-0.13莫耳當量之過碘酸鈉開始氧化。氧化反應在5±3℃下進行大致20±4小時。

使用5K MWCO超濾盒進行活化的多醣之濃縮及透濾。相對於20倍透濾體積之WFI進行透濾。經純化之活化的多醣隨後儲存在5±3℃下。經純化之活化的醣之特徵尤其在於：(i)藉由比色分析測定之醣濃度；(ii)藉由比色分析測定之醛濃度；(iii)氧化程度；及(iv)藉由SEC-MALLS測定之分子量。

將活化的多醣與蔗糖賦形劑混配且凍乾 .將活化的多醣與蔗糖混配，比率為25公克蔗糖/公克活化的多醣。隨後將一瓶混配混合物凍乾。在凍乾之後，將含有經凍乾之活化的多醣的瓶子儲存在-20 ± 5℃下。將計算量之CRM ₁₉₇蛋白質單獨進行殼凍且凍乾。將凍乾的CRM ₁₉₇儲存在-20 ± 5℃下。

復原凍 乾 的活化的多醣及載體蛋白質 .將經凍乾之活化的多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。在多醣完全溶解後，將等量的無水DMSO添加至凍乾的CRM ₁₉₇中以進行復原。

綴合及封端 .復原的活化的多醣與復原的CRM ₁₉₇在反應容器中組合，接著充分混合以獲得澄清溶液，隨後開始與氰基硼氫化鈉綴合。反應溶液中之最終多醣濃度為大致1 g/L。藉由向反應混合物中添加0.5-2.0毫當量之氰基硼氫化鈉及在23 ± 2℃下培育20-48小時，來起始綴合。藉由添加2 MEq硼氫化鈉(NaBH ₄)以封端未反應之醛來終止綴合反應。此封端反應在23 ± 2℃下持續3 ± 1小時。

純化綴合物 .綴合物溶液用冷卻的5 mM丁二酸鹽-0.9%生理鹽水(pH 6.0)以1:10稀釋，以準備藉由使用100-300K MWCO膜進行切向流過濾來純化。使經稀釋之綴合物溶液通過5 µm過濾器，且使用5 mM丁二酸鹽/0.9%生理鹽水(pH 6.0)作為介質進行透濾。在透濾完成後，將綴合物保留物轉移通過0.22 μm過濾器。綴合物用5 mM丁二酸鹽/0.9%鹽水(pH 6)進一步稀釋至大致0.5 mg/mL之目標醣濃度。可替代地，使用20 mM組胺酸-0.9%鹽水(pH 6.5)，藉由切向流過濾，使用100-300K MWCO膜，來純化綴合物。完成最終的0.22 μm過濾步驟，以獲得免疫原性綴合物。參見表 21 、表 22 、表 23 、表 24 及表 25 。

實例25：在水性緩衝液(RAC/水性)中之綴合，適用於大腸桿菌血清型O25B、O1A、O2及O6 多醣活化及透濾以與基於DMSO之綴合的多醣活化及透濾相同的方式進行。

視血清型而定，將經過濾之活化的醣與CRM ₁₉₇以在0.4至2 w/w範圍內之多醣與蛋白質的質量比混配。此輸入比率經選擇以控制所得綴合物中多醣與CRM ₁₉₇之比率。

隨後凍乾混配混合物。在綴合後，視血清型而定，以在5至25 g/L範圍內之多醣濃度，將多醣及蛋白質混合物溶解於0.1M磷酸鈉緩衝液中，視血清型而定，將pH調整在6.0至8.0之間。藉由向反應混合物中添加0.5-2.0毫當量之氰基硼氫化鈉及在23 ± 2℃下培育20-48小時，來起始綴合。藉由添加1-2 MEq硼氫化鈉(NaBH ₄)終止綴合反應，以封端未反應之醛。

或者，將經過濾之活化的醣及計算量之CRM ₁₉₇蛋白質分別進行殼凍且凍乾，且隨後在溶解於0.1 M磷酸鈉緩衝液後合併，隨後可如上所描述進行後續綴合。表20.在DMSO及水性緩衝液中製備之兩種綴合的結果之概述

	RAC/DMSO	RAC/水溶液
聚合物MW (kDa)	48K	46K
氧化程度(DO)	12	12
醣/蛋白質比率	0.8	1.0
游離醣%	＜5%	32%
藉由SEC-MALLS確定之綴合物MW，kDa	7950	260

實例26：大腸桿菌O-抗原多醣-CRM ₁₉₇單端綴合物之製備程序脂多醣(LPS)為革蘭氏陰性細菌外膜之常見組分，包含脂質A、核心區及O-抗原(亦稱為O特異性多醣或O-多醣)。不同血清型之O-抗原重複單元在其組成、結構及血清學特徵上有所不同。本發明中使用之O-抗原與核心域連接，該核心域在其鏈末端含有稱為2-酮-3-去氧辛酸(KDO)之糖單元。與一些基於多醣鏈之無規活化(例如用過碘酸鈉或碳化二亞胺活化)的綴合方法不同。本發明揭示一種綴合方法，其涉及用二硫胺連接子選擇性活化KDO，在暴露硫醇官能基後，硫醇官能基隨後如圖 31中所描繪與溴活化之CRM ₁₉₇蛋白質綴合(單端綴合物之製備)。

基於胱胺連接子 ( A1 ) 之綴合 .將O-抗原多醣及胱胺(50-250莫耳當量之KDO)混合於磷酸鹽緩衝液中，將pH調整至6.0-7.0。向混合物中添加氰基硼氫化鈉(NaCNBH ₃) (5-30莫耳當量之KDO)，且在37℃下攪拌混合物48-72小時。冷卻至室溫後，用等體積之磷酸鹽緩衝液稀釋，用參(2-羧基乙基)膦(TCEP) (1.2 mol，所添加胱胺之當量)處理混合物。混合物隨後經由使用5 kDa MWCO膜相對於10 mM磷酸二氫鈉溶液進行透濾來純化，得到含有硫醇之O-抗原多醣。硫醇含量可藉由Ellman分析來確定。

隨後，藉由將上述硫醇活化之O-抗原多醣與溴活化之CRM ₁₉₇蛋白質以0.5-2.0之比率混合來進行綴合。用1 M NaOH溶液，將反應混合物之pH調節至8.0-10.0。綴合反應在5℃下進行24 ± 4小時。載體蛋白質上未反應之溴殘基係藉由在5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時來淬滅。隨後，添加3莫耳當量之碘乙醯胺(與所添加之N-乙醯基-L-半胱胺酸相關)，以封端殘餘游離硫氫基。在5℃下再進行此封端反應3-5小時，且藉由添加1M NaOH，將兩個封端步驟之pH維持在8.0-10.0下。在使用30 kDa MWCO膜相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%生理鹽水pH 6.0進行超濾/透濾後，獲得所得綴合物。參見表 21 、表 22 、表 23 、表 24 及表 25 。

實例27：基於3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼)連接子(A4)之綴合將O-抗原多醣及3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼) (5-50莫耳當量之KDO)混合於乙酸鹽緩衝液中，將pH調節至4.5-5.5。向混合物中添加氰基硼氫化鈉(NaCNBH ₃) (5-30莫耳當量之KDO)，且在23-37℃下攪拌混合物24-72小時。混合物隨後用參(2-羧基乙基)膦(TCEP) (1.2 mol，所添加3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼)連接子之當量)處理。混合物隨後經由使用5 kDa MWCO膜相對於10 mM磷酸二氫鈉溶液進行透濾來純化，得到含有硫醇之O-抗原多醣。硫醇含量可藉由Ellman分析來確定。

隨後，藉由將上述硫醇活化之O-抗原多醣與溴活化之CRM ₁₉₇蛋白質以0.5-2.0之比率混合來進行綴合。用1 M NaOH溶液，將反應混合物之pH調節至8.0-10.0。綴合反應在5℃下進行24±4小時。載體蛋白質上未反應之溴殘基係藉由在5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時來淬滅。隨後，添加3莫耳當量之碘乙醯胺(與所添加之N-乙醯基-L-半胱胺酸相關)，以封端殘餘游離硫氫基。在5℃下再進行此封端反應3-5小時，且藉由添加1M NaOH，將兩個封端步驟之pH維持在8.0-10.0下。在使用30 kDa MWCO膜相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%生理鹽水pH 6.0進行超濾/透濾後，獲得所得綴合物。

實例28：基於2,2'-二硫基-N,N'-雙(乙烷-2,1-二基)雙(2-(胺氧基)乙醯胺)連接子(A6)之綴合將O-抗原多醣及2,2'-二硫基-N,N'-雙(乙烷-2,1-二基)雙(2-(胺氧基)乙醯胺) (5-50莫耳當量之KDO)混合於乙酸鹽緩衝液中，將pH調節至4.5-5.5。混合物隨後在23-37℃下攪拌24-72小時，接著添加氰基硼氫化鈉(NaCNBH ₃) (5-30莫耳當量之KDO)，且再攪拌混合物3-24小時。混合物隨後用參(2-羧基乙基)膦(TCEP) (1.2 mol，所添加連接子之當量)處理。混合物隨後經由使用5 kDa MWCO膜相對於10 mM磷酸二氫鈉溶液進行透濾來純化，得到含有硫醇之O-抗原多醣。硫醇含量可藉由Ellman分析來確定。

隨後，藉由將上述硫醇活化之O-抗原多醣與溴活化之CRM ₁₉₇蛋白質以0.5-2.0之比率混合來進行綴合。用1 M NaOH溶液，將反應混合物之pH調節至8.0-10.0。綴合反應在5℃下進行24 ± 4小時。載體蛋白質上未反應之溴殘基係藉由在5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時來淬滅。隨後添加3莫耳當量之碘乙醯胺(與所添加之N-乙醯基-L-半胱胺酸有關)，以封端殘餘游離巰基。在5℃下再進行此封端反應3-5小時，且藉由添加1M NaOH，將兩個封端步驟之pH維持在8.0-10.0下。在使用30 kDa MWCO膜相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%生理鹽水pH 6.0進行超濾/透濾後，獲得所得綴合物。

實例 29A ：經溴活化之 CRM ₁₉₇ 之製備在0.1 M磷酸鈉pH 8.0 ± 0.2溶液中製備CRM ₁₉₇，且將其冷卻至5 ± 3℃。以0.25-0.5 BAANS:蛋白質(w/w)之比率向蛋白質溶液中添加溴乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)之二甲亞碸(DMSO)儲備溶液(20 mg/mL)。反應物在5±3℃下輕輕混合30-60分鐘。所得溴乙醯化(活化)蛋白質經純化，例如藉由使用10 kDa MWCO膜，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液進行超濾/透濾。純化後，藉由Lowry蛋白質分析估計溴乙醯化載體蛋白質之蛋白質濃度。表21：O1a綴合物

綴合物批次號	132240-112-2	132242-106	132242-124	132242-127	132242-130
聚合物批次號	709756-160	709756-160	709756-160	710958-116	710958-116
聚合物類型	長鏈	短鏈
聚合物 MW ( kDa )	33	33	33	11	11
變異體	eTEC	單端	RAC/DMSO	單端	RAC/DMSO
活化	8% SH	2.1% SH	DO: 13	6.4% SH	DO: 16
綴合物資料
產率 ( % )	30	26	77	45	35
SP 比率	0.6	0.5	1.0	0.7	0.6
游離醣 (%)	9	9	20	5	6
MW (kDa)	1035	331	1284	280	2266
醣濃度 (mg.mL)	0.31	0.37	0.58	0.59	0.37
內毒素 (EU/ug)	0.03	0.02	0.01	0.01	0.01
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表22：O2綴合物

綴合物批次號	00709749-0003-1	132242-161	132242-152	132242-159	132242-157
聚合物批次號	709766-33	709766-65	710958-141-2
聚合物類型	長鏈	短鏈
聚合物 MW (kDa)	36	39	14
變異體	eTEC	單端	RAC/DMSO	單端	RAC/DMSO
活化	6.8% SH	1.6% SH	DO: 17	6.3% SH	DO: 19
綴合物資料
產率 (%)	26	33	50	38	36
SP 比率	1.5	0.8	0.8	1.0	0.6
游離醣 (%)	11	24%	＜5	＜5	6
MW (kDa)	1161	422	3082	234	1120
內毒素 (Eu/ μ g)	0.025	0.02	0.01	0.01	0.01
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表23：O6綴合物

綴合物批次號	132240-117-1	132242-134	132242-137	132242-146	132242-145
聚合物批次號	710958-121-1	710958-143-3
聚合物類型	長鏈	短鏈
聚合物MW (kDa)	44	15
變異體	eTEC	單端	RAC/DMSO	單端	RAC/DMSO
活化	18% SH	2.2% SH	DO: 16.5	6.1% SH	DO: 22
	綴合物資料
產率 (%)	27	23	58	48	30
SP 比率	0.78	0.6	0.82	0.7	0.6
游離醣 (%)	9	4	4	＜5	8
MW (kDa)	1050	340	1910	256	2058
醣濃度 (mg.mL)	0.39	0.45	0.59	0.88	0.41
內毒素 (Eu/ μ g)	0.03	0.02	0.01	0.004	0.005
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表24：O25b綴合物

綴合物批次號	132242-28	132242-98	132240-73-1-1	132240-62-1	132240-81	132242-116	132242-121	132242-27	132242-29
聚合物批次號	709766-28	709766-29	709766-30	709766-30	709766-30	710958-117/118	710958-117/118	709766-28	709766-28
Poly type	長鏈	短鏈	長鏈	長鏈
聚合物 MW (kDa)	51	48	48	48	48	14	14	51	51
變異體	RAC/DMSO	單端	eTEC	eTEC	eTEC	單端	RAC/DMSO	RAC/DMSO	RAC/DMSO
活化	DO: 18	2.4% SH	10% SH	4% SH	17% SH	6.6% SH	DO: 17	21	12
綴合物資料
產率 (%)	82	26	56	32	92	28	18	71	80
SP 比率	0.9	0.82	0.88	0.64	1.32	0.7	0.36	0.81	0.84
游離醣 (%)	7.2	5	＜ 5	11	＜ 5	＜ 5	＜ 5	8.3	＜5
綴合物 MW (kDa)	4415	840	1057	1029	2306	380	9114	3303	7953
醣濃度 (mg.mL)	0.7	0.4	0.43	0.36	0.9	0.45	0.19	0.6	0.67
內毒素 (Eu/ μ g)	0.01	0.02	0.08	0.08	0.01	0.01	0.01	0.02	0.22
綴合物 ( DS ) 緩衝液基質	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表25：O25b K-12綴合物

綴合物批次號	709749-015-2	709744-0016
聚合物批次號	710958-137
聚合物類型	長鏈 (K12)
聚合物MW (kDa)	44
變異體	eTEC	RAC/DMSO
活化	SH: 24%	DO: 19
綴合物資料
產率 (%)	59%	33%
SP 比率	1.4	0.83
游離醣 (%)	5%	5.2%
MW (kDa)	1537	4775
醣濃度 (mg.mL)	0.91	0.29
內毒素 (Eu/ μ g)	0.08	0.01
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

實例29B：大腸桿菌O-Ag-TT綴合物之製備將50 mg凍乾的大腸桿菌血清型O25b長多醣批次號709766-30 (約6.92 mg/mL，MW：約39 kDa)用於破傷風類毒素(TT)綴合。將大腸桿菌血清型O1a長多醣710958-142-3 (約6.3 mg/mL，MW：約44.3 kDa) (50 mg，7.94 mL)凍乾。將大腸桿菌血清型O6長多醣710758-121-1 (約16.8 mg/mL，MW：約44 kDa) (50 mg，2.98 mL)凍乾。

將以上列出之凍乾多醣中之每一者溶解於WFI中，使其達到大致5-10 mg/mL，添加0.5 mL (100 mg (1-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)於1 mL乙腈中之溶液)且在室溫下攪拌。添加三乙胺(TEA) 0.2 M (2 mL)且在室溫下攪拌。

破傷風類毒素(TT)之製備：將TT (100 mg，47 ml)濃縮至大致20 mL，且使用過濾管用生理鹽水(2 × 50 mL)洗滌兩次。此後，將其用HEPES及生理鹽水稀釋，以使得最終HEPES濃度為約0.25 M。

如上文所描述製備TT，且將反應物之pH調節至約9.1-9.2。將反應混合物在室溫下攪拌。

20至24小時後，用甘胺酸(0.5 mL)淬滅反應。此後，使用MWCO再生纖維素膜將其濃縮，且相對於生理鹽水進行透濾。過濾且分析。參見表 26。表26 例示性實施例：

大腸桿菌血清型O25b -TT 綴合物

大腸桿菌血清型O6 -TT 綴合物

體積：41 mL 醣濃度 ( 蒽酮 ) ：1 .122 mg /mL (92 % 產率 ) 蛋白質濃度 (Lowry ) ：1.133 mg/mL SP 比率：0.99 游離醣 (DOC ) ：74.7% 使用MWCO再生纖維素膜將所獲得之產物濃縮至15 mL，且相對於生理鹽水(40×透濾體積)進行透濾。經由0.22 μm過濾器過濾且進行分析。體積：27 mL 醣濃度 ( 蒽酮 ) ：1 .041 mg /mL (56 % 產率 ) 蛋白質濃度 (Lowry ) ：1.012 mg/mL SP 比率：1.03 游離醣 (DOC ) ：60 .6 % ( 聚合物回收率100 %)

體積：42 mL 醣濃度 ( 蒽酮 ) ：0 .790 mg /mL (66 % 產率 ) 蛋白質濃度 (Lowry ) ：1.895 mg/mL SP 比率：0.42 游離醣 (DOC ) ：＜5% MW (kDa)：1192 內毒素 (EU / μg ) ：0.022

實例30：O-抗原醱酵、純化及綴合之其他結果以下所描述之例示性方法一般適用於所有大腸桿菌血清型。各多醣之生產包括分批生產醱酵，接著在下游純化之前進行化學不活化。

菌株及儲存 .用於短鏈O-抗原生物合成之菌株為大腸桿菌之臨床野生型菌株。長鏈O-抗原係用短鏈產生者之衍生物產生，該等衍生物已藉由Wanner-Datsenko方法工程化以具有原生 wzzb基因之缺失，且由沙門氏菌之「長鏈」延伸子功能 fepE補充。 fepE功能係自其原生啟動子在基於colE1之高複本「拓樸」載體或基於colE1之載體pET30a的低複本衍生物上表現，其中T7啟動子區已缺失。

細胞庫係藉由使細胞在非動物LB或基本培養基中生長至OD ₆₀₀為至少3.0來製備。隨後，將培養液稀釋於新鮮培養基中且與80%甘油組合，獲得具有2.0 OD ₆₀₀/mL之20%甘油最終濃度。

用於種菌培養及醱酵之培養基 .所採用之種菌培養基及醱酵培養基共用以下調配物：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。

種菌及醱酵條件 .自單個種菌小瓶以0.1%接種種菌。種菌瓶在37℃下培育16-18小時，且通常達到10-20 OD ₆₀₀/mL。

醱酵係在10 L不鏽鋼原位蒸汽醱酵槽中進行。

通常自10 OD ₆₀₀種菌以1:1000接種醱酵槽。分批階段為在10 g/L分批葡萄糖上進行生長之時段，通常持續8小時。葡萄糖耗盡後，溶解氧突然上升，此時將葡萄糖饋送至醱酵。隨後，醱酵通常進行16-18小時，其中收穫＞ 120 OD ₆₀₀/mL。

對血清型 O1a 、 O2 、 O6 及 O25b 之短 / 長鏈 O- 抗原 產生的初步評估 .O1a、O2、O6及O25b之野生型菌株在補充的基本培養基中以分批模式醱酵至OD ₆₀₀= 15-20。在葡萄糖耗盡後，其引起氧消耗急劇降低，自葡萄糖溶液施加生長限制性葡萄糖饋料16-18小時。細胞密度達到124-145 OD ₆₀₀單位/毫升。隨後，將收穫培養液之pH調整至約3.8，且加熱至95℃持續2小時。隨後，將經水解培養液冷卻至25℃，使其達到pH 6.0，且離心以移除固體。隨後，將所得上清液施加於SEC-HPLC管柱以進行O-抗原定量。獲得之生產率在2240-4180 mg/L範圍內。發現來自此等批次之經純化短鏈O-抗原的分子量在10-15 kDa範圍內。亦注意到，O2及O6水解產物之SEC層析顯示獨特且可分離之污染性多醣，其在O1a及O25b水解產物中並不明顯。

O1a、O2、O6及O25b O-抗原之長鏈型式係經由各菌株之 wzzb缺失型式醱酵而獲得，該菌株在高複本康黴素可選拓樸質體上攜帶異源、補充 fepE基因。即使具有康黴素選擇，仍如短鏈一般進行醱酵。最終觀測到之細胞密度為124-177 OD ₆₀₀/mL，與3500-9850 mg/L之O-抗原生產率相關。基於互補之長鏈O-抗原之合成至少與在親體短鏈菌株中一樣高產，且在一些情況下更高產。經純化之O-抗原多醣的分子量為33-49 kDa或約為相應短鏈大小的3倍。

注意到，O2及O6之長鏈水解產物顯示污染性多醣峰之證據，在長鏈抗原之情況下，觀測到為主要O-抗原峰上之肩部；O1及O25b未顯示產生污染性多醣之證據，正如先前關於短鏈親體所見。

發現生長速率抑制與缺乏 fepE之拓樸複製子的存在相關聯。另外，Δ wzzb突變本身對生長速率無不良影響，表明受干擾之生長速率係由質體載體傳達。

用於產生 O11 、 O13 、 O16 、 O21 及 O75 O- 抗原 之菌株的評估 .藉由SEC-HPLC評估血清型O11、O13、O16、O21及O75之多個野生型菌株在醱酵中產生非所要多醣的傾向。O11、O13、O16、O21及O75之菌株經選擇為不存在污染性多醣，以及其產生＞1000 mg/L O-抗原之能力且顯示抗生素敏感性概況，允許進行Wanner-Datsenko重組工程化以引入Δ wzzb性狀。

構築拓樸 fepE及pET- fepE之氯黴素可選型式，允許將 fepE引入O11、O13、O16、O21及O75 Δwzzb菌株中，該等菌株一般發現具有康黴素耐受性。將所得攜帶拓樸 fepE及pET- fepE之菌株在氯黴素選擇下醱酵，且藉由SEC-HPLC評估來自酸水解培養液之上清液。高(拓樸)及低複本(pET) fepE構築體指導O-抗原之合成，其中各構築體之生產率與親體野生型相當。未觀測到潛在干擾性多醣之表現。

wzzb質體攜帶菌株之生長速率的評價顯示，O11、O13及O21藉由拓樸-fepE但不藉由pET-fepE之存在而遲延；菌株O16及O75菌株顯示與複製子選擇無關之可接受的生長速率。表27

O - 抗原類型	IHMA 類型	短鏈 (SC ) 或長鏈 (LC )	fep E 質體類型	標記物	最終細胞密度OD ₆₀₀	最終Oag 產率 (mg /L )	MW - kDa	SEC 雜質
O1a	wt	SC	無	無	125	2550	11	N
O1a	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	Kana	130	5530	33	N
O1a	Δwzzb/fepE	LC	pET	Kana	未進行(ND)	ND	ND	ND
O2	wt	SC	無	無	127	2240	13	Y
O2	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	Kana	177	3750	49	Y
O2	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O6	wt	SC	無	無	145	4180	16	Y
O6	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	Kana	124	9850	44	Y
O6	Δwzzb/fepE	LC	pET	Kana	ND	ND	ND	ND
O11	wt	SC	無	無	194	4720	x	N
O11	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	Kana	142	7220	x	N
O11	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O13	wt	SC	無	x	113	4770	x	N
O13	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	cam	101	4680	x	N
O13	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	108	4600	x	N
O16	wt	SC	無	x	154	1870	x	N
O16	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	cam	129	1180	x	N
O16	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	137	1280	x	N
O21	wt	SC	無	x	140	1180	x	N
O21	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	cam	ND	ND	x	N
O21	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	131	820	x	N
O25b	2831	SC	無	無	126	3550	10	N
O25b	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	Kana	152	3500	49	N
O25b	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O75	wt	SC	無	x	149	1690	x	N
O75	Δwzzb/fepE	LC	拓樸	cam	132	1500	x	N
O75	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	138	1520	x	N

多醣之純化方法包括酸水解以釋放O-抗原。醱酵反應器中血清型特異性大腸桿菌培養物之粗懸浮液直接用乙酸處理至最終pH為3.5±0.5，且將酸化培養液加熱至95±5℃之溫度至少一小時。此處理裂解寡醣近端之KDO與脂質A之間的不穩定鍵，由此釋放O-Ag鏈。在使用NH ₄OH中和至pH 7 ± 1.0之前，將含有經釋放之O-Ag之經酸化的培養液冷卻至20 ± 10℃。該方法進一步包括若干離心、過濾及濃縮/透濾操作步驟。表28

血清型 ( 核心 )	描述	預期聚合物大小	效價 (g/L)	經純化之聚合物 M . W . (kDa)	重複單元之數目	M . W . ( kDa ) 相對於短鏈之增加	NMR	經純化之綴合物 M . W . ( kDa )	綴合批次號
O25b (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	5.3	47	55	34	ü	5365	132242-28 (RAC/DMSO)
1423	132242-98 (單端)
1258	132240-73-1-1 (eTEC)
ΔwzzB + O25a wzzB	短	2.3	13/14	15	NA	ü	380	132242-116 (單端)
9114	132242-121 (RAC/DMSO)
O25b (K12)	ΔwzzB+ LT2FepE	長	3.5	44	51	27	ü	1537	709749-015-2 (eTEC)
4775	709744-0016 (RAC/DMSO
wt	短	3.5	17	17	NA	ü
O1a (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	5.5	33	39		ü	1035	132240-112-2 (eTEC)
22	331	132242-106 (單端)
	1284	132242-124 (RAC/DMSO)
wt	短	2.5	11	13	NA	ü	280	132242-127 (單端)
2266	132242-130 (RAC/DMSO)
O2 (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	4.9	36	43	22	ü	1161	00707947-0003-1 (eTEC)
39	47	25		422	132242-161 (單端)
3082	132242-152 (RAC/DMSO)
wt	短	2.8	14	17	NA	ü	234	132242-159 (單端)
1120	1322421-157 (RAC/DMSO)
O2 (R4)	ΔwzzB + LT2FepE	長	5.1	NA	NA	NA	NA
wt	短	2.1	14.7	18	NA	ü
O6 (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	6.9	37.2	42	22.2	ü
wt	短	3.5	15	17	NA	ü	256	132242-146 (單端_
		2058	123342-145 (RAC/DMSO)
O6 (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	8.4	44.4	50	28.2	ü	1050	132240-117-1 (eTEC)
340	132242-134 (單端) 132242-137
1910	(RAC/DMSO)
wt	短	3.6	16.2	18	NA	ü

實例31：所研究之對O-抗原(O4、O11、O21、O75)之綴合(RAC/DMSO) 表29：O4綴合物

綴合物批次號	709744-70	709744-73	709744-72
聚合物批次號	709740-168
聚合物MW (kDa)	52
DO	26	19	15
活化的聚合物MW (kDa)	51
綴合
輸入SP	1.0	1.0	1.0
SP比率	0.85	1.0	1.0
游離醣(%)	＜5%	＜5%	＜5%
MW (kDa)	4764	4758	3423
產率(%)	72	80	82
內毒素(Eu/μg)	0.003	0.001	0.005

表30：O11綴合物

綴合物批次號	709744-64	709744-66	709744-65	709744-67
聚合物批次號	709740-162
聚合物MW (kDa)	39
DO	21	14
活化的聚合物(kDa)	40
綴合
輸入SP	1.0	1.3	1.0	1.3
SP比率	0.5	0.64	0.65	0.75
游離醣(%)	＜5%	＜5%	＜5%	＜5%
MW (kDa)	10520	7580	4814	4338
產率(%)	30	30	44	38
內毒素(Eu/μg)	0.005	0.005	0.005	0.005

表31：O21綴合物

綴合物批次號	709749-113	709749-111	709749-112	709749-115	709749-116
聚合物批次號	709740-165
聚合物MW (kDa)	40
DO	25	18	15
活化的聚合物(KDa)	40	41	40
綴合
輸入SP	1.0	1.0	0.8	1.0	1.25
SP比率	0.6	0.6	0.5	0.9	1.1
游離醣(%)	6%	5%	＜5%	12%	7%
MW (kDa)	6920	5961	9729	2403	1960
產率(%)	31	36	37	52	54
內毒素(Eu/μg)	0.02	0.02	0.03	0.01	0.009

表32：O75綴合物

綴合物批次號	709749-101	709749-102	709749-103
聚合物批次號	709766-080B
聚合物MW (kDa)	48
DO	18	25
活化的聚合物(kDa)	43	44
綴合
輸入SP	1.0	0.8	1.0
SP比率	0.94	0.76	0.78
游離醣(%)	＜5%	6%	6%
MW (kDa)	2304	2427	5229
產率(%)	62	65	45
內毒素(Eu/μg)	0.02	0.01	0.01

實例32：所製備之PLL綴合物表33

血清型	O11	O75	O21	O4
綴合物批次號	00707779-0413	00707779-0414	00707779-0415	00707779-0416
聚合物批次號	709740-162	709766-080B	709740-165	709740-168
聚合物MW(kDa)	39	48	40	52
綴合物資料
SP比率	13.5	16.8	18.1	21.2
游離醣(%)	9.8%	＜5%	＜5%	6.9%
醣濃度	789 µg/mL	676 µg/mL	978 µg/mL	837 µg/mL
PLL 濃度	58.3 µg/mL	40.3 µg/mL	54.0 µg/mL	39.4 µg/mL
內毒素(Eu/μg)	0.002	0.002	0.005	0.004
綴合物(DS)基質	1X PBS，1M NaCl

實例 33 ： 大腸桿菌多肽之穩定的哺乳動物細胞表現使用SSI (位點特異性整合)穩定表現系統生成表現FimH GSD或FimH LD之穩定CHO純系。宿主CHO細胞為來自CHOK1SV GS-KO背景之經工程化之細胞株(關於CHOK1SV GS-KO宿主細胞株之描述，參見例如美國專利申請案20200002727)。簡言之，將由兩個FRT位點包圍之具有綠色螢光蛋白(GFP)基因之著陸墊靶向宿主細胞基因體中之轉錄熱點中。GFP基因可與GS基因及相關基因進行交換，該等基因亦由LVEC載體之FRT位點包圍且與翻轉酶重組酶(FLPe)共表現。此系統不僅具有與隨機整合相比優越的生長及生產率概況，且亦呈現至少100代之基因型及表現型穩定性。

如本文中所提及，術語「FRT位點」係指酵母2 μm質體之翻轉酶(FLP)基因的產物，FLP重組酶，可催化位點特異性重組的核苷酸序列。多種不一致FRT位點為此項技術已知的。各種FRT位點之序列為相似的，因為其均含有一致的13個鹼基對的反向重複序列，側接發生重組之8個鹼基對的不對稱核心區。不對稱核心區負責位點之方向性及不同FRT位點中的變異。此等之說明性(非限制性)實例包括天然存在之FRT (F)及若干突變或變異型FRT位點，諸如FRT F1及FRT F2。

如本文中所提及，術語「著陸墊」係指包含染色體整合至宿主細胞中之第一重組目標位點的核酸序列。在一些實施例中，著陸位點包含染色體整合至宿主細胞中之兩個或更多個重組目標位點。在一些實施例中，細胞包含1、2、3、4、5、6、7或8個著陸墊。在一些實施例中，細胞包含1、2或3個著陸墊。在一些實施例中，細胞包含4個著陸墊。在一些實施例中，著陸墊整合在至多1、2、3、4、5、6、7或8個不同的染色體基因座。在一些實施例中，著陸墊整合在至多1、2或3個不同的染色體基因座。在一些實施例中，著陸墊整合在4個不同的染色體基因座。

藉由用BioRad Gene Pulser Xcell或Amaxa 4D-Nucleofector電穿孔，將FimH GSD或FimH LD之LVEC表現載體及FLPe表現載體共轉染至SSI宿主細胞中。隨後，細胞在無麩醯胺酸之培養基中培養，以選擇在著陸墊位點整合有GS基因之細胞。通常，細胞在2至3週內回收。隨後在96孔盤中藉由FACS或限制稀釋法進行單細胞選殖。對具有細胞之孔的效價進行排序，以縮減至前48個純系。在24深孔盤中進行第二輪進料分批篩選，以將純系縮減至前12個。在Ambr15中執行第三輪進料分批篩選，以將純系縮減至前3個。Ambr250實驗用於鑑別最佳純系。鑑別後，生成最佳純系之主細胞庫及工作細胞庫。

實例34：FimH-DSG WT及FimH _LDWT蛋白質之細胞株開發及生產反應器表現本文所描述之實例描述自穩定的CHO細胞株例示性產生FimH-DSG WT及FimH _LDWT蛋白質，其中各蛋白質之編碼序列已穩定整合至CHO基因體中。

在生產生物反應器設置中，所選擇之穩定的CHO細胞株能夠對於FimH-DSG WT以約1公克/公升培養物，且對於FimH _LDWT以250公克/公升培養物產生目標蛋白質。生產反應器之種菌罐自工作細胞庫之小瓶解凍不斷規模放大，且在搖瓶中使用0.3×10 ⁶個細胞/毫升之接種活細胞密度，經由搖瓶中之三個繼代循環擴增，得到足夠用於生產反應器之細胞。細胞在36.5℃、5% CO ₂下生長三至四天。

自最終的搖瓶中接種生產反應器，目標為1×10 ⁶個細胞/毫升之接種細胞密度。使用7.05 (+/- 0.15)之pH，且目標為5-10%之CO ₂飽和度，將生產反應器在36.5℃下生長七天。藉由用於鹼控制之碳酸氫鈉/碳酸氫鉀及用於酸控制之CO ₂鼓泡控制pH。使用純氧經由鼓泡將溶解氧控制在40%之設定點。在第七天將溫度調整至31℃。反應器在第1天進料，使用的進料策略為添加與活細胞密度相關之進料，此係藉由使用0.75之進料係數來實現，以確保進料組分在運行期間不會耗盡。隨後連續添加進料，以在當天過程中提供所需的進料量。

在第13天收穫生產反應器，且將收穫培養物離心且進行0.22 µm過濾，隨後進行下游處理。

實例35：小鼠中FimH抗原及O-抗原組合之免疫原性在小鼠免疫原性研究中評估大腸桿菌FimH凝集素結合域(FimH _LD)及全長(FimH-DSG或FimCH)變異體，該等小鼠免疫原性研究評定所引發之抗體中和繖毛化大腸桿菌與甘露醣基化配位體之結合的能力。在小鼠中，自哺乳動物細胞中以高產率分泌及純化之野生型FimH抗原具有類似的免疫原性，與自大腸桿菌胞外質中以較低產率純化之原生抗原類似。相比之下，含有凝集素域及菌毛蛋白域兩者之全長FimH抗原的免疫原性顯著高於FimH _LD。需要使用含有QS21之佐劑調配物，以產生針對此等繖毛抗原之穩固的功能性免疫反應。後續研究探究FimH與四價O-抗原醣綴合物混合物及不同佐劑之組合的免疫原性。在第二劑量之後，在FimH中和及O-抗原特異性OPA分析兩者中，疫苗接種脂質體QS21調配物之小鼠與未給予佐劑或給予脂質體單磷醯基脂質A (MPLA)之組相比對組合之抗原持續地誘導更高功能性反應。

動物免疫原性 .自查爾斯河中獲得6-8週齡CD-1小鼠，且用0.1 mL測試抗原或緩衝液對照皮下(SC)給予10或20隻動物之組。藉由用三個劑量之具有100 µg完全弗氏佐劑之大腸桿菌FimH _LD抗原(在第0週)，接著100 µg不完全弗氏佐劑中之抗原(在第4及8週) (Covance)免疫兔來製備多株抗FimH兔對照血清。各疫苗接種在兩個部位(皮下-背側)投與含有50 µg抗原之0.5 mL。

佐劑調配物 .針對無佐劑的抗原之稀釋劑為10 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.1)。對於AlPO ₄，每小鼠劑量提供50 µg (100 µL之0.5 mg/mL懸浮液)。用於臨床前研究之皂皮樹-21 (QS21)的預設劑量為每隻小鼠20 µg，來自含有5.1 mg/mL QS-21、5 mM丁二酸鹽、60 mM NaCl、0.1% PS80、pH 5.6之儲備液。單磷醯基脂質A (MPLA，合成性，PHAD®，Avanti)及QS21的脂質調配物係使用1,2-二油醯基-sn-丙三氧基-3-磷酸膽鹼(DOPC)及膽固醇(Avanti極性脂質)製備。脂質體MPLA係以5 µg每劑量使用，來自包含15 mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.1，4 mg/mL DOPC，1 mg/mL膽固醇，0.2 mg/mL MPLA (批次00714551-0018-2XLipoMPL)，具有藉由動態光散射確定之71 nm之脂質體粒度的儲備液。脂質體MPLA/QS21調配物係以5 µg各每劑量使用，來自包含15 mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.1，4 mg/mL DOPC、1 mg/mL膽固醇、0.2 mg/mL MPLA及0.2 mg/mL QS-21 (批次00714551-0018-2XLipoMQ)，具有藉由動態光散射確定之75 nm之MPLA-QS21脂質體粒度的儲備液。

用於免疫原性研究之表現質體及所衍生之 FimH 繖毛抗原 .使用以下表現質體產生重組蛋白質用於小鼠實驗：＞pSB02083 -- FimH _LD(mIgK訊號肽，N28S，N91S)，處理之蛋白質序列：

＞pSB02158 -- FimH _LD-LM (mIgK訊號肽，N28S N91S V48C L55C)，處理之蛋白質序列：

＞pSB02307 - FimH-DSG (mIgK訊號肽，N28S N91S N249Q 7aa連接子FimG A1..K14)，處理之蛋白質序列：

＞pSB02198 - FimH-DSG-LM (mIgK訊號肽，N28S N91S 249Q V48C L55C 7aa連接子FimG A1..K14)，處理之蛋白質序列：

胺基酸編號係基於J96菌株FimH之全長胺基酸序列，而理論公開案使用基於在訊號肽處理之後暴露之N端苯丙胺酸(在位置21處)的編號。其他突變移除在全長FimH-DSG構築體(N249Q)之凝集素域(N28S及N91S)中、在菌毛蛋白域中之醣基化位點天冬醯胺殘基。添加至C端之供體-股G肽使FimH穩定。如上文實例中所描述，使7胺基酸連接子長度針對哺乳動物表現最佳化。

FimH 全細胞中和分析 .開發FimH中和分析，以量測血清抗體對繖毛化大腸桿菌與甘露糖甘配位體之結合的抑制。配位體為表現甘露醣基化尿溶蛋白受體UPIa之經微量盤固定的酵母菌甘露聚糖或膀胱5637細胞。

對於酵母菌甘露聚糖分析，黑色微量滴定96孔盤(Maxisorb，Nunc)經20 μg/ml含酵母菌甘露聚糖(Sigma-Aldrich)之PBS緩衝液塗佈。該等孔用含1%牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)之PBS阻斷20 min。人類膀胱上皮細胞株5637係自ATCC (ATCC HTB-9)獲得。使細胞在補充有10%胎牛血清(FBS，Sigma)、2.0 g/l碳酸氫鈉(Sigma)及0.3 g/l L-麩醯胺酸之RPMI 1640 (Sigma，St Louis，MO)中生長於黑色組織培養微量盤(Greiner)上，在37℃下在5% CO ₂下生長且在第10代及第24代之間使用。藉由使用多株抗體(Novus #NBP214694)之免疫螢光染色確認尿溶蛋白1a受體之表面表現。大腸桿菌血清型O25b UTI菌株PFEEC0547係在10 mL靜態LB培養物中在37℃下連續繼代以誘導FimH表現。藉由流式細胞測量術，使用針對FimH _LD抗原之兔免疫血清，確認細菌表面上之FimH表現。藉由包括在50 mM含量下使結合下降＞95%之陰性對照化合物甲基α-D-吡喃甘露糖苷(sigma)確立結合至甘露聚糖或膀胱細胞之細菌的特異性。在添加至經固定酵母菌甘露聚糖或5637細胞單層之前，將以1:100 (在PBS中，0.1%BSA)開始之八步二倍連續稀釋的測試血清與1x10 ⁷個大腸桿菌在37℃下一起共培育1小時。將連續稀釋之抗FimH _LD兔血清用作各盤上之內標。在洗掉未結合之細菌之前，在37℃下將盤培育1小時。將結合之大腸桿菌在室溫下用3 µg/ml與Alexafluor 488綴合之O25b-特異性mAb染色45 min。mAb由O25b抗體3E9-11之可變輕鏈及重鏈序列重構(Nagy E, Nagy G, Szijarto V,等人. Antibodies to multi-drug resistant Escherichia coli: Arsanis Biosciences GmbH, Austria. 2014:76pp)。人類pTT5 IgG表現質體係用作選殖載體。在ClarioStar Plus儀器上讀取個別孔之螢光強度。使用S形劑量反應可變斜率曲線擬合(Graphpad Prism)內插IC ₅₀抑制值。效價為在觀測到半最大抑制時之血清稀釋的倒數。疫苗抗原反應者定義為在1:100之起始血清稀釋下超過80%抑制之中和效價。另外，結合活性之血清稀釋滴定必須滿足可變斜率S形曲線擬合參數(R ²＞0.95，具有內插Log IC50值或以更廣泛稀釋度觸發實驗重複直至消退)。各組之間的反應差異之統計顯著性( p值)係使用未配對T測試確定，其中韋爾奇氏校正應用於對數轉換資料。

對於涉及疫苗接種不同血清型之多價O-抗原綴合物的小鼠之實驗，酵母菌甘露聚糖分析適用於Bactiter Glo偵測試劑(Promega)，以避免所引發之抗O-Ag IgG對細菌偵測之潛在的干擾。在此情況下，偵測係基於在自預滲透之活細菌中釋放ATP之後藉由螢火蟲螢光素酶催化之光子發射。此試劑之使用藉由消除洗滌步驟而簡化偵測，且經由液體處置自動化(Bravo，Agilent)促進更高通量之384孔分析形式的實施。微型化分析使反應體積自100 µL減小至30 µL，且使所需細菌數目自1x10 ⁷個每孔降低至1x10 ⁶個。在於PBS中1:1稀釋之後，將Bactiter Glo添加至所有孔中，且在混合之後，在光度計模式下在ClarioStar讀取器上進行讀取。選擇血清型O6:K2大腸桿菌UTI菌株CFT073 (ATCC® 700928™)用於半自動化384孔分析，此係因為其具有與O25b UTI菌株PFEEC0547相比增強之敏感性。兩種菌株均在比較小鼠疫苗接種組(資料未展示)之子組中之個別血清效價的銜接性研究中產生類似結果。

大腸桿菌 O - Ag 小鼠 IgG 直接 Luminex 免疫分析 ( dLIA ) .藉由eBPD (Pfizer)內部產生之血清型O25b、O1a、O2及O6的長鏈大腸桿菌O-Ag多醣係與聚-L-離胺酸綴合，且隨後與具有EDC/NHS之Luminex珠粒微球體綴合。針對各O-抗原使用具有不同光譜位址之珠粒實現四重多工。將珠粒在4℃下與連續稀釋之個別小鼠血清或對照mAb在振盪下一起培育18小時。在洗滌之後，用PE-綴合之山羊抗小鼠IgG小鼠二級抗體(90 min室溫培育)偵測經結合之血清型特異性IgG。在FlexMap 3D儀器(Biorad)上讀取微量盤。將具有類似結合特性(內部產生)之血清型特異性小鼠IgG mAb用作內標以定量IgG含量。各mAb之標準曲線的圖得到在10 ³血清稀釋中之重疊的線性斜率特徵曲線(對數發光相對於對數血清稀釋)。自標準曲線偏差計算0.15259 ug/mL之4-plex IgG dLIA的定量下限(LLOQ)，其對於四個抗原中之每一者為相同的。

大腸桿菌調理吞噬活性分析(OPA) .臨床大腸桿菌侵襲性血液分離株係獲自Pfizer贊助之抗微生物測試領導及監督(Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance，ATLAS)資料庫，其由國際健康管理協會(International Health Management Associates，IHMA)臨床實驗室維護。菌株係藉由WGS使用Illumina Miseq平台，包括用於預測O-抗原及K-莢膜類型之電腦模擬血清分型，以基因型方式表徵。當在達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)中在細胞儲備條件下生長時表現O-抗原及K-抗原兩者之血清型O1a、O2、O6及O25b菌株係用作測試菌株，以及表示O6及O25b血清型之多重抗藥性未囊封菌株。藉由流式細胞測量術使用內部產生之抗原特異性單株或多株抗體確認O-抗原表現。使用K1-莢膜mAb mAb13D9-151 (自NRC，加拿大獲得)確認K1-抗原表現。使用K2分型血清(Statens Serum Institute)偵測K2-抗原表現。藉由在用肝素酶處理時增加之潛在O-抗原的表面暴露確認K5肝素前體莢膜之表現。開發以下大腸桿菌臨床菌株用於OPA分析： O1a:K1 (PFEEC0435，ST-95)， O2:K1 (PFEEC0146，ST-95，替卡西林(Ticarcillin)/克拉維酸(Clavulanic Acid) ^R)， O6:K- (PFEEC0412，ST-127，替卡西林/克拉維酸 ^R，ESBL)， O6:K2 (PFEEC0150，ST-127)， O25b:K- (PFEEC0068，ST-131，亞胺培南(Imipenem) ^R，氟喹諾酮(fluoroquinolone) ^R)， O25b:K5 (PFEEC0066，ST-131，fluorquinolone ^R)。

將預先冷凍之細菌儲備液在DMEM中生長至OD ₆₀₀在0.5與1.0之間，且在冷凍之前添加丙三醇至最終濃度20%。將滴定前解凍之細菌在OPA緩衝液(漢克氏平衡鹽溶液(Life Technologies)、0.1%明膠、1 mM MgCl ₂、2.5mM CaCl ₂)中稀釋至1×10 ⁵CFU/ml，且將20 µL (10 ³CFU)細菌懸浮液在室溫下在384孔組織培養微量盤中用10 µL連續稀釋之血清調理30分鐘。諸如需要調理步驟之條件、幼兔補體含量、分析培育長度及HL60與細菌之比率略微變化，且根據所使用之分析菌株最佳化。隨後，向各孔中添加10 µl 2-6%補體(幼兔血清，Pel-Freez)及10 µL之HL-60細胞(以100-200:1比率)，且在5% CO ₂培育箱中在37℃下在2000 rpm下振盪混合物45-60 min。將各50 µL反應物之十µL轉移至含有50 µL水之預潤濕之384孔Millipore MultiScreen HTS HV過濾器板的相應孔中。在真空過濾液體之後，施加50 µL之50% DMEM且過濾，且盤在密封拉鏈袋中在37℃下培育隔夜。次日，在用庫馬斯染料染色後，使用ImmunoSpot®分析儀及ImmunoCapture軟體對菌落進行計數。為了確定OPA活性之特異性，在調理步驟之前，將免疫血清與20 µg/mL同源血清型純化之O-抗原一起預培育。OPA分析包括不具有HL60細胞或補體之對照反應，以證明任何觀測到之殺傷對此等組分之依賴性。使用可變斜率曲線擬合(Excel)計算個別血清OPA效價。使用GraphPad稜鏡繪製組合之資料，以產生GMT及相關顯著性p值(具有來自經對數轉換資料之韋爾奇氏校正的未配對T測試)。

結果 小鼠免疫原性研究 .第一研究經設計以評估在不同劑量水準下且在不同佐劑下自大腸桿菌胞外質表現及純化之重組FimH _LD抗原的免疫原性。FimH _LD之純化係基於先前已描述之方法(Schembri MA, Hasman H, Klemm P. Expression and purification of the mannose recognition domain of the FimH adhesin. FEMS microbiology letters 2000; 188:147-51)。第二研究比較大腸桿菌FimH _LD與哺乳動物表現之FimH _LD及全長FimH-DsG變異體的活性。最終，第三研究探究FimH-DSG與4價長O-抗原醣綴合物混合物及不同佐劑調配物之組合的免疫原性。

FimH 抗原之免疫原性 .使用與先前基於大腸桿菌對表面固定之酵母菌甘露聚糖(Kisiela DI, Avagyan H, Friend D,等人. Inhibition and Reversal of Microbial Attachment by an Antibody with Parasteric Activity against the FimH Adhesin of Uropathogenic E. coli. PLOS Pathogens 2015; 11:e1004857)或膀胱上皮細胞(Langermann S, Palaszynski S, Barnhart M等人Prevention of mucosal Escherichia coli infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science 1997; 276:607-11; Starks CM, Miller MM, Broglie PM等人Optimization and Qualification of an Assay that Demonstrates that a FimH Vaccine Induces Functional Antibody Responses in Women with Histories of Urinary Tract Infections. Human Vaccines & Immunotherapeutics 2020:1-10)之結合的抑制類似之中和分析所描述之彼等來評定由各種FimH構築體誘發之功能性抗FimH抗體之誘導。藉由確定防止繖毛化細菌結合至酵母菌甘露糖甘配位體之血清中和效價來定量抗原變異體之功能效能。效價經定義為在疫苗接種動物血清之八點兩倍滴定中，50%細菌結合至分析微量盤時之血清稀釋的倒數。使用自大腸桿菌純化之FimH _LD抗原的初步研究之結果展示於圖 36A及圖 36B及表 34中。疫苗接種之時程展示於圖 36A中，且個別小鼠反應繪製於圖 36B中。

小鼠免疫原性實驗 1 - 比較不同大腸桿菌周質產生之 FimH 構築體 .在用三個3 µg劑量之FimH _LD抗原疫苗接種之後，在無佐劑組中或接受50 µg AlPO ₄佐劑之組中僅25%小鼠在酵母菌甘露聚糖分析中產生中和抗體效價。相比之下，在接受20 µg QS21/PS80佐劑組中之61%小鼠產生中和效價。在此情況下，幾何平均效價(GMT)比其他組高5倍( p值＜0.05)。在具有QS21/PS80之30 µg FimH _LD劑量水準下，觀測到GMT及78%血清反應者比率再增加三倍。在此佐劑情形下，經設計及預測藉由將FimH _LD抗原鎖定於開放構形中以增強功能性免疫原性的二硫鍵突變之存在(Rodriguez VB, Kidd BA, Interlandi G等人Allosteric coupling in the bacterial adhesive protein FimH. J Biol Chem 2013; 288:24128-39; Kisiela DI, Rodriguez VB, Tchesnokova V等人Conformational inactivation induces immunogenicity of the receptor-binding pocket of a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013; 110:19089-94)與野生型FimH _LD構築體相比未改進免疫原性。觀測到與接近統計顯著性( p=0.09)之野生型相比，鎖突變體之GMT低約三倍。此研究之關鍵觀測結果為大腸桿菌FimH _LD抗原需要強力QS21佐劑調配物以引發小鼠中之穩固的中和抗體含量。表 34. VAC-2019-PRL-EC-1369 中和效價 GMT 及反應者比率

疫苗接種組	反應者 %	反應者數目	幾何平均 (IC ₅₀ ) 效價
3ug FimH _LD無佐劑	25	3/12	88
3ug FimH _LDAlPO ₄	25	5/20	93
3ug FimH _LDQS21/PS80	61	11/18	495
30ug FimH _LDQS21/PS80	78	14/18	1486
30ug FimH _LDLM ^a- QS21	58	11/19	459
a. LM為二硫鍵鎖突變V48C L55C

與哺乳動物產生 FimH 構築體相比周質之免疫原性 .在第二研究中，將在大腸桿菌中表現之FimH _LD及全長FimH蛋白質的免疫原性與在Expi293哺乳動物細胞中表現之類似變異體進行比較。將與其周質伴隨蛋白FimC複合之大腸桿菌表現之全長FimH用作基準。在三個疫苗接種之後，比較藉由在具有或不具有鎖突變之情況下大腸桿菌相對於哺乳動物表現之抗原誘導之功能性抗體的相對含量之中和資料展示於圖 37A及圖 37B及表 35中。根據圖 37B中所示之方案，抗原以10 µg，各具有20 µg QS21/PS80，進行給予。大腸桿菌表現之FimH _LD小鼠組得到300之中和分析GMT及55%反應者比率，其在統計學上未不同於類似哺乳動物表現之FimH _LD組(其中GMT為194且45%反應者比率)。哺乳動物全長FimH-DSG比其FimH _LD對應體具有更顯著的免疫原性，展現出兩倍高之GMT (529相對於194)及增加之血清反應者比率(75%相對於45%)。如同第一研究，在FimH _LD(經大腸桿菌或哺乳動物表現)或全長FimH-DSG之情形下，鎖突變之存在就產生功能性中和反應而言無益處。哺乳動物表現之FimH-DSG (在具有或不具有鎖突變之情況下)亦呈現為比大腸桿菌FimCH抗原具有更高免疫原性，儘管差異在統計學上並不顯著。綜合而言，此等結果鑑別全長FimH-DSG作為後續探究選擇的抗原。吾人推測，此構築體中之與C端FimG供體股肽複合之FimH菌毛蛋白域的存在可提供額外功能性表位及/或增強之穩定性。表 35. VAC-2019-PRL-EC-1438 中和效價 GMT 及反應者比率

疫苗接種組	反應者 %	反應者數目	幾何平均 (IC ₅₀ ) 效價
周質- FimH _LD	55	11/20	300
周質- FimH _LD-LM	40	8/20	254
哺乳動物- FimH _LD	45	9/20	194
哺乳動物- FimH _LD-LM	10	2/20	73
哺乳動物FimH-DSG	75	15/20	529
哺乳動物FimH-DSG-LM	80	16/20	579
周質- FimCH	67	12/18	354

小鼠中之共調配之哺乳動物產生之 FimH - DSG 及 4 價 O - 抗原 醣綴合物的免疫原性 .第三小鼠研究經設計以評定組合之O-抗原及佐劑調配物對FimH-DSG免疫原性之影響。將代表四種最普遍血清型O25b、O1a、O2及O6之CRM ₁₉₇的長O-抗原醣綴合物混合且以2 µg之劑量投與，各自作為基線對照組( 圖 38)。其他疫苗組評估對單獨或與四價O-抗原組合之具有10 µg FimH-DSG之三種佐劑之免疫原性的影響。佐劑為預設20 µg QS21/PS80每劑量調配物(用於FimH研究1及2)；脂質體合成性MPLA調配物(5 µg每劑量)；及脂質體合成性MPLA/QS21調配物(以5 µg各每劑量)。在給藥後2 (PD2)及給藥後3 (PD3)時間點在功能性FimH中和及O-抗原特異性調理吞噬活性(OPA)分析中測試血清。

在PD2及PD3時間點之酵母菌甘露聚糖FimH結合中和分析之結果展示於圖 39A及圖 39B中，其中GMT及反應者比率概述於表 36中。表 36. VAC-2020-PRL-EC-1679 組合研究酵母菌甘露聚糖結合中和分析反應者比率及 GMT.

	反應者 %	IC50 之幾何平均值	反應者數目 ( 總共10 名 )
疫苗接種組	PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3
4plex O-抗原組合-無佐劑	0	0	50	50	0	0
FimH-DSG (10µg)- QS21 (20µg)	100	100	3938	1457	10	10
FimH-DSG (10µg)- MPLA (5µg)	90	90	1243	559	9	9
FimH-DSG (10µg)- MPLA/QS21 (5µg/5µg)	70	90	1075	990	7	9
FimH-DSG (10µg) + 4plex O-抗原組合-無佐劑	40	100	169	581	4	10
FimH-DSG (10µg) + 4plex O-抗原組合- MPLA (5µg)	40	70	176	397	4	8
FimH-DSG (10µg) + 4plex O-抗原組合- MPLA/QS21 (5µg/5µg)	90	90	1332	1223	9	9

由於在先前實驗中在兩個劑量之後對個別FimH及單價血清型O25b抗原之抗體反應為次最大的，預期PD2時間點將最佳區分疫苗抗原及佐劑組合物作用。實際上，截至PD3反應者比率及FimH中和GMT在任一組之間無顯著差異( p＞0.05)。在PD2時，脂質體佐劑調配物對使用單獨FimH-DSG之組無顯著影響。相比之下，與疫苗接種脂質體MPLA/QS21之小鼠組或單獨FimH-DSG中之任一者組相比，對於疫苗接種組合之FimH-DSG/O-抗原之組，在使用無佐劑或脂質體MPLA組中觀測到顯著更低的FimH中和GMT。亦測試PD1血清，但小鼠中無一者表現出中和效價。

膀胱細胞結合中和分析用於測試在PD2及PD3時間點時自各疫苗組合併之血清。膀胱5637細胞構成性地表現作為用於FimH之天然配位體的甘露醣基化尿溶蛋白受體UPIa (Thumbikat P, Berry RE, Zhou G等人Bacteria-induced uroplakin signaling mediates bladder response to infection. PLoS pathogens 2009; 5:e1000415-e; Kątnik-Prastowska I, Lis J, Matejuk A. Glycosylation of uroplakins. Implications for bladder physiopathology. Glycoconjugate journal 2014; 31:623-36)。展示於圖 40A及圖 40B及表37中之結果與使用個別血清進行之酵母菌甘露聚糖中和分析的發現一致。同樣，用脂質體MPLA或不使用佐劑調配之組合之FimH-DSG/O-抗原比脂質體MPLA/QS21組產生顯著較弱的中和反應，該脂質體MPLA/QS21組類似於疫苗接種QS21/PS80或脂質體MPLA/QS21及無O-抗原之FimH-DSG的小鼠組反應。甘露聚糖與膀胱中和分析資料之間的微小差異為後者傾向於與針對疫苗接種僅FimH-DSG或組合之FimH-DSG/O-抗原的組之脂質體MPLA調配物產生較弱反應。表 37. 在小鼠血清池下 VAC-2020-PRL-EC-1679 膀胱細胞中和效價

疫苗接種組	PD2 IC50	PD3 IC50
4V O-Ag	無活性	無活性
FimH-DSG QS21	3656	1140
FimH-DSG MPLA	775	750-1000 ^a
FimH-DSG MPLA/QS21	2458	1198
FimH-DSG + 4V O-Ag無佐劑	337	1177
FimH-DSG + 4V O-Ag MPLA	無活性	434
FimH-DSG + 4V O-Ag MPLA/QS21	3447	931
兔血清對照	3266	3809
a.歸因於雙相曲線與可變斜率方程之不良擬合的IC ₅₀效價評估值。

在使用單獨或與FimH-DSG及脂質體佐劑組合之4價O-抗原疫苗接種四個小鼠組之後使用4-plex dLIA產生之O-抗原特異性總IgG之含量展示於圖 41及表 38中。在兩個劑量之後血清型O25b特異性IgG反應明顯地低於藉由血清型O1a、O2及O6 O-抗原引發之彼等反應，與使用單價O-抗原進行之先前綴合物化學研究(未示出)及使用四價生物綴合物O-抗原之報導之臨床前研究的結果一致(van den Dobbelsteen G, Faé KC, Serroyen J等人Immunogenicity and safety of a tetravalent E. coliO-antigen bioconjugate vaccine in animal models. Vaccine 2016; 34:4152-60)。在無佐劑的FimH-DSG及O-抗原組合之情況下觀測到在PD2時O25b組中之抗O-Ag IgG的最低含量，僅產生單個效價超過基線IgG反應者臨界值的五倍；相比之下，儘管僅無佐劑的O-抗原組產生56%之更高反應者比率(5/9)，但兩個組之間的GMT差異(0.79相對於0.24 µg/ mL IgG)在統計學上並不顯著( p＞0.5)。在PD2時，脂質體MPLA/QS21佐劑藉由誘導GMT增加16倍(3.84相對於0.24)且提高反應者比率(70%相對於10%)而顯著增強FimH-DSG及O-抗原組合之免疫原性；亦在PD3時觀測到GMT顯著增加(40.78相對於3.75)。反應者經定義為具有產生符合可變斜率曲線擬合準則之完全稀釋依賴性殺傷反應之血清的小鼠。儘管對於血清型O25b各組之間反應者比率及效價更高，但對於FimH-DSG及O-抗原組合之血清型O1a IgG效價亦藉由脂質體MPLA/QS21在PD2及PD3時分別顯著提高5.9及4.6倍。由於疫苗接種組之間的GMT之總體差異較小，MPLA/QS21對O2及O6 O-抗原之影響不如O1a及O25b明顯。表 38. VAC-2020-PRL-EC-1679 ： 佐劑及 FimH-DSG 對 O- 抗原 特異性血清 IgG GMT 之影響

疫苗接種組	O1a	O2	O6	O25b
PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3
4v O-Ag	13.86	56.72	21.96	145.99	9.66	74.25	0.79	13.73
FimH-DSG + 4v O-Ag無佐劑	13.42	39.05	20.56	86.81	19.19	101.48	0.24	3.75
FimH-DSG + 4v O-Ag於脂質體MPLA中	54.48	61.59	89.69	138.18	13.86	35.15	0.68	19.05
FimH-DSG + 4v O-Ag於脂質體MPLA/QS21中	79.59	181.73	52.82	230.35	39.64	94.34	3.84	40.78

使用侵襲性臨床菌株在OPA分析中評定由4價組合物之個別O-抗原誘發的功能性殺菌抗體。OPA菌株之選擇係基於以下因子之組合：在活體外生長條件及/或多藥抗性下O-抗原及k-莢膜兩者之表現；及能夠鑑別能夠在嗜中性白血球樣HL60細胞及O-抗原特異性抗體存在下促進殺菌殺傷之相容幼兔血清補體。儘管大腸桿菌O-抗原被視為用於預防血清補體之非特異性殺傷的主要決定因素，但K1、K2及K5莢膜抗原亦表明在抗全血吞噬作用中起一定作用(Sarkar S, Ulett GC, Totsika M等人Role of Capsule and O Antigen in the Virulence of Uropathogenic Escherichia coli. PLoS ONE 2014; 9:e94786; Burns SM, Hull SI. Loss of resistance to ingestion and phagocytic killing by O(-) and K(-) mutants of a uropathogenic Escherichia coli O75:K5 strain. Infection and immunity 1999; 67:3757-62; Buckles EL, Wang X, Lane MC等人Role of the K2 Capsule in Escherichia coli Urinary Tract Infection and Serum Resistance. The Journal of infectious diseases 2009; 199:10.1086/598524)。

使用四種囊封O1a、O2、O6及O25b菌株及兩種多重抗藥性未囊封O6及O25b菌株之OPA分析結果展示於圖 42及表 39中。除展現出針對疫苗接種前血清之174之相對較高基線效價的O6:K-菌株分析之外，來自所有其他菌株之未接種疫苗的小鼠之血清產生之效價係在分析偵測極限(LOD)或100，即起始血清稀釋。對四價O-抗原之個別OPA反應很大程度上與IgG結合抗體效價平行( 圖 41 ，表 38)。舉例而言，在使用經囊封血清型O1a、O2及O6菌株之OPA中確認脂質體MPLA/QS21調配物對FimH-DSG 4價O-抗原組合之免疫原性的顯著積極影響，該等OPA報導在兩個疫苗劑量之後反應者比率為70%或更大。相比之下，僅在第三劑量之後，O25b:K5 OPA菌株才報導到達使用MPLA/QS21調配物之此功能活性水準。與其囊封之O6:K1及O25b:K5對應物相比，未囊封之O6及O25b菌株產生更高OPA效價及反應者比率，尤其在疫苗接種單獨O-抗原或組合之FimH-DSG/4價O-抗原的非佐劑小鼠組中。此更高敏感性與先前所示之不存在各別K2或K5莢膜一致，以賦予對吞噬作用之抗性(Burns SM, Hull SI. Loss of resistance to ingestion and phagocytic killing by O(-) and K(-) mutants of a uropathogenic Escherichia coli O75:K5 strain. Infection and immunity 1999; 67:3757-62; Buckles EL, Wang X, Lane MC等人Role of the K2 Capsule in Escherichia coli Urinary Tract Infection and Serum Resistance. The Journal of infectious diseases 2009; 199:10.1086/598524)。表 39. VAC-2020-PRL-EC-1679 ：佐劑及 FimH-DSG 對 O- 抗原特異性血清 OPA GMT 之影響

疫苗接種組	O1a:K1 OPA	O2:K1 OPA	O6:K2	O6:K-	O25b:K5	O25b:K-
PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3
4v O-Ag	119	348	191	1108	50	155	383	1931	68	461	1516	14260
FimH-DSG + 4v O-Ag無佐劑	157	575	161	385	98	1256	760	5375	50	443	223	9000
FimH-DSG + 4v O-Ag於脂質體MPLA/QS21中	675	979	499	1525	510	388	714	1104	91	457	1382	28204
FimH-DSG + 4v O-Ag於脂質體MPLA/QS21中/QS21	6978	7714	984	8610	1064	737	1681	1961	110	606	2593	19462

結論綜合而言，此等研究之結果支援哺乳動物產生之FimH-DSG (或衍生之突變體變異體)與O-抗原醣綴合物及QS21佐劑之組合作為用以預防侵襲性大腸桿菌感染之疫苗組合物的用途。此類調配物可有利於預防老年患者之反覆性UTI感染及敗血症。結果確認QS21佐劑用於增強對FimH-DSG及長O25b O-抗原之功能性免疫反應的益處，其與小鼠中類似的血清型O1a、O2及O6 O-抗原醣綴合物相比分別地具有更低的免疫原性。

實例 36 ：大腸桿菌血清型 O8 及 O9 O- 抗原之CRM ₁₉₇綴合物 引發的抗體展現出針對肺炎克雷伯氏桿菌血清型 O5 及 O3 侵襲性分離株之交叉保護殺細菌活性 .此實例證實，大腸桿菌血清型O8及O9 O-抗原之短單端原生CRM ₁₉₇多聚甘露醣綴合物引發的抗體具有針對表現等效或相關O-抗原之克雷伯氏桿菌O5及O3菌株的殺細菌及交叉保護作用。

大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌具有共同的多聚甘露糖O-抗原，其係由高度同源之生物合成基因簇編碼的酶合成。大腸桿菌O8及O9 O-抗原多醣為線性甘露糖均聚物，其重複單元在單醣鍵及殘基數目有所不同。其在肺炎克雷伯氏桿菌中之對應物為血清型O5及O3 O-抗原。大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌多聚甘露糖O-抗原之生物合成涉及與其他大腸桿菌O-抗原不同的O單元易位及鏈合成機制。在此情況下，鏈延長由生物合成之WbdA-WbdD複合物調節(King JD, Berry S等人, Proceedings of the National Academy of Sciences 2014; 111:6407-12)，其不同於Wzx/Wzy依賴性路徑，其中鏈長受WzzB或FepE酶控制。因此，原生多聚甘露糖O-抗原僅可以其短形式產生，需要與經工程化之長大腸桿菌O-抗原不同的生物製程方法進行純化及載體蛋白質綴合。相同機制及限制適用於主要肺炎克雷伯氏桿菌血清型O1及O2 O-抗原，其為由半乳糖殘基構成之聚半乳聚糖。

此等O-抗原及其亞型之間的結構關係展示於圖 33中。大腸桿菌O8及肺炎克雷伯氏桿菌O5 O-抗原為相同的(Vinogradov E等人, J Biol Chem 2002; 277:25070-81)。大腸桿菌O9及肺炎克雷伯氏桿菌O3 O-抗原具有共同的四聚體O9a/O3a及五聚體O9/O3重複單元亞型，而三聚體O3b亞型僅在肺炎克雷伯氏桿菌中發現。此等亞型可藉由血清學及基因型進行鑑別(Guachalla LM等人, Scientific Reports 2017; 7:6635)。血清型O3a基因座藉由wbdA中之單個點突變(C80R)來區分。大腸桿菌O9 wbdA酶中之類似點突變(C55R)將O9多醣轉化為O9a (Kido N, Kobayashi H. Journal of bacteriology 2000; 182:2567-73)。O3b亞型在WbdD酶之序列中具有足夠的核苷酸差異，因此需要單獨的參考序列。Kaptive網路算法(Wick RR等人, J Clin Microbiol 2018; 56)，實施於Pfizer之BigSdb全基因體定序(WGS)管線中，將O3基因座指定為O3/O3a (由相同參考序列覆蓋)或O3b。

材料及方法 a. 在 兔中產生大腸桿菌血清型 O8 及 O9 CRM ₁₉₇ 免疫血清

在Covance進行之研究中使用兩組、每組四隻雌性紐西蘭白兔。動物每劑量接受10 µg/動物血清型O8或O9 CRM ₁₉₇綴合物，以CFA/IFA作為佐劑。使用單端化學方法綴合原生O8及O9 O-抗原。各1 mL劑量之10 µg抗原分配至兩個皮下疫苗接種部位。在第0、6及14週進行疫苗接種，在第7及15週抽血，其對應於給藥後二(PD2)及給藥後三(PD3)時間點。

b. 細菌菌株大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌臨床分離株係獲自Pfizer贊助之抗微生物測試領導及監督(Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance，ATLAS)集合，其由國際健康管理協會(International Health Management Associates，IHMA)臨床實驗室維護。菌株藉由使用Miseq平台(Illumina)之全基因體定序(WGS)進行基因型表徵。WGS資料用於使用整合至BigDdb平台中之已建立的大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌方案產生多焦點序列類型(MLST)資訊(Wirth T等人, Molecular microbiology 2006; 60:1136-51；Jolley KA等人, Wellcome Open Res 2018; 3:124；Diancourt L等人, Journal of clinical microbiology 2005; 43:4178-82)。大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌之嵌入式電腦模擬血清分型算法用於預測O-抗原血清型(Wick RR等人, J Clin Microbiol 2018; 56；Joensen KG等人, J Clin Microbiol 2015; 53:2410-26)。表 40. 用於 O - 抗原產生或殺細菌分析開發之臨床分離株

ID	物種	MLST ST	血清型 ( 亞型 )	來源
EC0130	大腸桿菌	162	O8	血液
EC0423	大腸桿菌	46	O9a	血液
EC0305	大腸桿菌	448	O8	血液
KP0121	肺炎克雷伯氏桿菌	279	O5	血液
EC0611	大腸桿菌	New	O9a	UTI，腎臟
KP0009	肺炎克雷伯氏桿菌	37	O3b	UTI，膀胱

c. 大腸桿菌 O8 及 O9 CRM ₁₉₇ 綴合物血清型O8及O9a O-抗原多醣分別自菌株EC0130及EC0423中提取且純化( 表 40)。綴合過程涉及用二硫胺連接子選擇性活化短原生大腸桿菌O8及O9 O-抗原之還原端上存在的Kdo單醣。在暴露硫醇官能基後，隨後將其與溴活化之CRM ₁₉₇蛋白質綴合，如本文所描述之實例 26所描述。

d. 殺細菌分析預冷凍之大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌儲備液係藉由使菌株在DMEM或LB培養基中生長至OD ₆₀₀在0.5至1.0之間來製備，且在冷凍之前添加甘油至最終濃度為20%。特定分析條件根據針對各細菌菌株最佳化之條件而變化。將滴定前解凍之細菌在OPA緩衝液(漢克氏平衡鹽溶液(Life Technologies)及0.1%明膠)中稀釋至1×10 ⁵CFU/ml，且將20 µL (10 ³CFU)細菌懸浮液在室溫下在組織培養微量盤中用20 µL連續稀釋之血清調理30分鐘。隨後，向具有OPA緩衝液之各孔中添加10 µl補體(幼兔血清或IgG/IgM耗乏人類血清，Pel-Freez)及20 µL HL-60細胞(按100-200:1之比率)，以使最終體積為100 µL。反應混合物在37℃下在5% CO ₂培育箱中振盪60分鐘。在一些情況下，細菌無需預調理步驟即可直接與補體及HL60組合，且在37℃、5% CO ₂下振盪60分鐘。在培育後，將各反應物之10 µL轉移至含有100 µL水之預潤濕的Millipore MultiScreen HTS HV過濾盤的相應孔中。在真空過濾液體之後，施加100 µL之50%細菌生長培養基且過濾，且盤在密封拉鏈袋中在37℃下培育隔夜。次日，在用庫馬斯染料染色後，使用ImmunoSpot®分析儀及ImmunoCapture軟體對微群落進行計數。在大腸桿菌血清型O9分析之情況下，OPA經微型化為384孔格式的50 µL反應體積。為了確定OPA活性之特異性，在調理步驟之前，將免疫血清與經純化之O-抗原多醣一起預培育。OPA分析包括無HL60細胞或補體之對照反應，以證明任何觀測到之殺傷對此等組分之依賴性。對於HL60之存在無影響的克雷伯氏桿菌血清型O5分析，在不存在效應細胞之情況下進行血清殺細菌反應。

結果 a. 用於殺細菌分析之大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌菌株選擇在藉由LPS概況分析(藉由SDS-PAGE)確認O-抗原表現及藉由用O-抗原特異性兔抗血清進行流動式細胞測量術確認O-抗原表面可接近性之後，首先選擇臨床細菌菌株。接下來，對血清補體進行經驗性篩選，以鑑別在一系列濃度內之個別相容批次，該等批次提供低水準之非特異性殺傷以及在免疫血清存在下之高度敏感性的適當平衡。額外的分析最佳化參數包括調整HL60效應細胞與細菌之比率、振盪器速度、存在/不存在盤密封物及包括調理預培育步驟。

b. 大腸桿菌 O8 及肺炎克雷伯氏桿菌 O5 O - 抗原 免疫血清之交叉保護及特異性選擇大腸桿菌O8菌株EC0305及肺炎克雷伯氏桿菌O5菌株KP0121進行分析開發。兩者均為血液分離株。EC0305對頭孢菌素及四環素具有耐受性，而KP0121對安比西林具有耐受性。開發用於大腸桿菌O8菌株EC0305之OPA分析，條件包括3.0% BRC、1:100之細菌與HL60之比率及單步60分鐘OPA培育反應。由於發現肺炎克雷伯氏桿菌O5菌株KP0121在免疫血清存在下之殺細菌活性與HL60效應細胞無關，因此開發SBA。在此情況下，SBA反應需要使用10%耗乏之人類血清作為補體來源。用此等大腸桿菌O8及肺炎克雷伯氏桿菌O5菌株進行殺細菌分析之結果顯示於圖 34A - 34B中。在大腸桿菌血清型O8 OPA中，在兩個劑量之O8-CRM ₁₉₇綴合物後產生之兔免疫血清展現出強效的O-抗原特異性殺傷，其藉由用游離O8 O-抗原多醣預吸附免疫血清而阻斷。在血清稀釋低於1:1000時，觀測到完全殺傷。來自同一隻兔之匹配免疫前血清為無活性的。相同的兔血清在肺炎克雷伯氏桿菌O5 SBA中進行評估，且發現在1:2000之血清稀釋下具有類似的殺細菌作用。殺傷經游離O8 O-抗原阻斷，且免疫前血清不存在殺傷。在此情況下，血清基質前區在低於1:1000之血清稀釋下掩蓋SBA活性。

c. 大腸桿菌 O9 及肺炎克雷伯氏桿菌 O3 OPA O - 抗原 免疫血清交叉保護及特異性選擇大腸桿菌O9a菌株EC0611及肺炎克雷伯氏桿菌O3b菌株KP0009進行分析開發。EC0611對安比西林具有耐受性，而KP0009對頭孢菌素、氟喹諾酮及四環素具有耐受性。兩者分別為來自腎臟及膀胱感染之UTI分離株。用於產生CRM ₁₉₇綴合物之O9a O-抗原及所得免疫血清具有四聚體多聚甘露糖重複單元結構且與O9a EC0611分析菌株O-抗原相同；然而，其與肺炎克雷伯氏桿菌O3b O-抗原KP0009分析菌株在結構上為異源的，該菌株基於其 wbdD基因之序列經預測表現較短三聚體重複單元(參見圖 33)。大腸桿菌O9a及肺炎克雷伯氏桿菌O3b菌株之OPA結果顯示，抗大腸桿菌O9a免疫血清針對兩者均有效( 圖 35A - 35B)。對於大腸桿菌O9a菌株，在血清稀釋低於1:8,000時及對於克雷伯氏桿菌O3b菌株，在血清稀釋低於1:1,600時，觀測到OPA之完全殺傷。藉由在用游離O9a O-抗原及匹配之免疫前血清對血清進行預吸附後缺乏活性來證明特異性。

結論大腸桿菌血清型O8及O9多聚甘露糖CRM ₁₉₇綴合物引發功能性抗體，其不僅能夠在殺細菌分析中殺傷同源大腸桿菌臨床菌株，且亦殺傷克雷伯氏桿菌血清型O5及O3菌株。結果證實，此等綴合物引發之抗體對表現結構上相關之多聚甘露糖O-抗原之兩個物種的分離株均具有交叉保護作用。

以下條項描述本發明之其他實施例：

C1.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。

C2.如條項C1之組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D ₁、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167及式O172，其中 n為20至100之整數。

C3.如條項C2之組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1 (例如，式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如，式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如，式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如，式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如，式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如，式O23A)、式O24、式O25 (例如，式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如，式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如，式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173及式62D ₁，其中 n為20至100之整數。

C4.如條項C2之組合物，其包含選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O15、式O16、式O21、式O25 (例如式O25a及式O25b)及式O75。

C5.如條項C2之組合物，其包含選自式O4、式O11、式O21及式O75之結構。

C6.如條項C1之組合物，其中該醣不包含選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101。

C7.如條項C1之組合物，其中該醣不包含選自式O12之結構。

C8.如條項C4之組合物，其中該醣係藉由在革蘭氏陰性細菌中表現wzz家族蛋白質以產生該醣而產生。

C9.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質係選自由以下組成之群：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。

C10.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質為wzzB。

C11.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質為fepE。

C12.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質為wzzB及fepE。

C13.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質衍生自腸道沙門氏菌。

C14.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質包含選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 39。

C15.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質包含與以下中之任一者具有至少90%序列一致性的序列：SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34。

C16.如條項C8之組合物，其中該wzz家族蛋白質包含選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 39。

C17.如條項C1之組合物，其中該醣係以合成方式合成。

C18.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R1部分。

C19.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R2部分。

C20.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R3部分。

C21.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R4部分。

C22.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌K-12部分。

C23.如條項C1至C22中任一項之組合物，其中該醣進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C24.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R1部分。

C25.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R2部分。

C26.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R3部分。

C27.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R4部分。

C28.如條項C1至C17中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌K-12部分。

C29.如條項C1至C22中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C30.如條項C1至C23中任一項之組合物，其中該醣不包含脂質A。

C31.如條項C1至C30中任一項之組合物，其中該多醣之分子量在10 kDa至2,000 kDa之間或在50 kDa至2,000 kDa之間。

C32.如條項C1至C31中任一項之組合物，其中該醣之平均分子量為20-40 kDa。

C33.如條項C1至C32中任一項之組合物，其中該醣之平均分子量為40,000至60,000 kDa。

C34.如條項C1至C33中任一項之組合物，其中 n為整數31至90。

C35.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣衍生自大腸桿菌。

C36.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含與載體蛋白質共價結合之如條項C1至條項C34中任一項之醣的綴合物。

C37.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及如條項C35至條項C36中任一項之綴合物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：聚(L-離胺酸)、CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎麴菌AcrA、空腸彎麴菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。

C38.如條項C35至條項C37中任一項之組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C39.如條項C35至條項C37中任一項之組合物，其中該載體蛋白質為破傷風類毒素(TT)。

C40.如條項C35至條項C37中任一項之組合物，其中該載體蛋白質為聚(L-離胺酸)。

C41.如條項C35至條項C39中任一項之組合物，其中該綴合物係藉由還原胺化來製備。

C42.如條項C35至條項C39中任一項之組合物，其中該綴合物係藉由CDAP化學方法來製備。

C43.如條項C35至條項C39中任一項之組合物，其中該綴合物為單端連接之綴合醣。

C44.如條項C35至條項C39中任一項之組合物，其中該醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與該載體蛋白質綴合。

C45.如條項C44之組合物，其中該醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與該載體蛋白質綴合，其中該醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。

C46.如條項C44至條項C45中任一項之組合物，其中該CRM ₁₉₇包含經由eTEC間隔基與該多醣共價連接之2至20或4至16個離胺酸殘基。

C47.如條項C35至條項C46中任一項之組合物，其中該醣:載體蛋白質比率(w/w)在0.2與4之間。

C48.如條項C35至條項C46中任一項之組合物，其中該醣與蛋白質之比率為至少0.5及至多2。

C49.如條項C35至條項C46中任一項之組合物，其中該醣與蛋白質之比率在0.4與1.7之間。

C50.如條項C43至條項C49中任一項之組合物，其中該醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與該載體蛋白質綴合。

C51.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含與載體蛋白質共價結合之醣的綴合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101，其中 n為整數1至10。

C52.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及如條項C1至條項C34中任一項之醣，及醫藥學上可接受之稀釋劑。

C53.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及如條項C35至條項C51中任一項之綴合物，及醫藥學上可接受之稀釋劑。

C54.如條項C53之組合物，其包含與該組合物中醣之總量相比至多約25%之游離醣。

C55.如條項C52至條項C53中任一項之組合物，其進一步包含佐劑。

C56.如條項C52至條項C53中任一項之組合物，其進一步包含鋁。

C57.如條項C52至條項C53中任一項之組合物，其進一步包含QS-21。

C58.如條項C52至條項C53中任一項之組合物，其進一步包含CpG寡核苷酸。

C59.如條項C52至條項C53中任一項之組合物，其中該組合物不包括佐劑。

C60.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及衍生自大腸桿菌、經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合之醣，其中該多醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。

C61.如條項C60之組合物，其中該醣為衍生自大腸桿菌之O-抗原。

C62.如條項C60之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。

C63.如條項C60之組合物，其中該醣為衍生自大腸桿菌之O-抗原。

C64.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合之如條項C1至條項C17中任一項之醣，其中該多醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。

C65.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及(i)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O25B抗原之綴合物，(ii)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O1A抗原之綴合物，(iii)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O2抗原之綴合物，及(iv)與載體蛋白質共價偶聯之O6抗原之綴合物，其中該大腸桿菌O25B抗原包含式O25B之結構，其中 n為大於30之整數。

C66.如條項C65之組合物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：聚(L-離胺酸)、CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎麴菌AcrA、空腸彎麴菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。

C67.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及(i)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O25B抗原之綴合物，(ii)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O4抗原之綴合物，(iii)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O11抗原之綴合物，及(iv)與載體蛋白質共價偶聯之O21抗原之綴合物，其中該大腸桿菌O25B抗原包含式O75之結構，其中n為大於30之整數。

C68.如條項C67之組合物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：聚(L-離胺酸)、CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎麴菌AcrA、空腸彎麴菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。

C69.一種製備組合物之方法，該組合物包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合之醣的綴合物，該方法包含以下步驟：a)使醣與1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)在有機溶劑中反應，以產生活化的醣；b)使該活化的醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使該硫醇化醣與還原劑反應，以產生包含一或多個游離巰基殘基之活化的硫醇化醣；d)使該活化的硫醇化醣與包含一或多個α-鹵基乙醯胺基團之活化的載體蛋白質反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白質綴合物；及e)使該硫醇化醣-載體蛋白質綴合物與(i)能夠封端該活化的載體蛋白質之未綴合之α-鹵基乙醯胺基團的第一封端試劑；及/或(ii)能夠封端未綴合之游離巰基殘基的第二封端試劑反應；由此產生eTEC連接之醣綴合物，其中該醣衍生自大腸桿菌；該方法進一步包含在重組哺乳動物細胞中表現編碼衍生自FimH之多肽或其片段的聚核苷酸，且分離該多肽或其片段。

C70.如條項C69之方法，其包含製備如條項C1至條項C34中任一項之組合物。

C71.如條項C69至條項C70中任一項之方法，其中封端步驟e)包含使該硫醇化醣-載體蛋白質綴合物與(i)作為第一封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸，及/或(ii)作為第二封端試劑之碘乙醯胺反應。

C72.如條項C69至條項C71中任一項之方法，其進一步包含藉由與三唑或咪唑反應而使醣混配以得到混配醣之步驟，其中該混配醣經殼凍、凍乾且在步驟a)之前在有機溶劑中復原。

C73.如條項C69至條項C72中任一項之方法，其進一步包含純化在步驟c)中產生之硫醇化多醣，其中純化步驟包含透濾。

C74.如條項C69至條項C73中任一項之方法，其中該方法進一步包含藉由透濾純化該eTEC連接之醣綴合物。

C75.如條項C69至條項C74中任一項之方法，其中步驟a)中之該有機溶劑為選自以下中之任一者之極性非質子溶劑：二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)及六甲基磷醯胺(HMPA)或其混合物。

C76.一種培養基，其包含KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。

C77.如條項C76之培養基，其中該培養基用於培養大腸桿菌。

C78.一種用於產生如條項C1至條項C34中任一項之醣的方法，其包含在培養基中培養重組大腸桿菌；藉由在該培養基中培養該細胞來產生該醣；由此該細胞產生該醣。

C79.如條項C78之方法，其中該培養基包含選自以下中之任一者之元素：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。

C80.如條項C78之方法，其中該培養基包含大豆水解產物。

C81.如條項C78之方法，其中該培養基包含酵母提取物。

C82.如條項C78之方法，其中該培養基不進一步包含大豆水解產物及酵母提取物。

C83.如條項C78之方法，其中該大腸桿菌細胞包含選自以下中之任一者之異源wzz家族蛋白質：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。

C84.如條項C78之方法，其中該大腸桿菌細胞包含選自以下中之任一者之腸道沙門氏菌wzz家族蛋白質：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。

C85.如條項C84之方法，其中該wzz家族蛋白質包含選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。

C86.如條項C78之方法，其中該培養產生之產率為＞ 120 OD ₆₀₀/mL。

C87.如條項C78之方法，其進一步包含純化該醣。

C88.如條項C78之方法，其中該純化步驟包含以下中之任一者：透析、濃縮操作、透濾操作、切向流過濾、沈澱、溶離、離心、沈澱、超濾、深度過濾及管柱層析(離子交換層析、多模式離子交換層析、DEAE及疏水相互作用層析)。

C89.一種用於在哺乳動物中誘導免疫反應之方法，其包含向個體投與如條項C1至條項C68中任一項之組合物。

C90.如條項C89之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O特異性多醣血清抗體。

C91.如條項C89之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌IgG抗體。

C92.如條項C89之方法，其中該免疫反應包含誘導針對大腸桿菌之殺細菌活性。

C93.如條項C89之方法，其中該免疫反應包含誘導針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。

C94.如條項C89之方法，其中該免疫反應包含在初始給藥後至少1,000至200,000之幾何平均效價(GMT)水準。

C95.如條項C89之方法，其中該組合物包含：包含式O25之醣，其中 n為整數40至100，其中該免疫反應包含在初始給藥後至少1,000至200,000之幾何平均效價(GMT)水準。

C96.如條項C89之方法，其中該哺乳動物處於選自以下之病況中之任一者的風險下：泌尿道感染、膽囊炎、膽管炎、腹瀉、溶血尿毒症候群、新生兒腦膜炎、尿路性敗血症、腹內感染、腦膜炎、複雜性肺炎、傷口感染、前列腺活檢後相關感染、新生兒/嬰兒敗血症、嗜中性白血球減少性發熱及其他血流感染；肺炎、菌血症及敗血症。

C97.如條項C89之方法，其中該哺乳動物患有選自以下之病況中之任一者：泌尿道感染、膽囊炎、膽管炎、腹瀉、溶血尿毒症候群、新生兒腦膜炎、尿路性敗血症、腹內感染、腦膜炎、複雜性肺炎、傷口感染、前列腺活檢後相關感染、新生兒/嬰兒敗血症、嗜中性白血球減少性發熱及其他血流感染；肺炎、菌血症及敗血症。

C98.一種方法，其用於(i)誘導個體針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，(ii)誘導個體針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，或(iii)誘導個體產生對腸外病原性大腸桿菌具有特異性之調理吞噬活性抗體，其中該方法包含向該個體投與有效量之如條項C1至條項C68中任一項之組合物。

C99.如條項C98之方法，其中該個體處於罹患泌尿道感染之風險下。

C100.如條項C98之方法，其中該個體處於罹患菌血症之風險下。

C101.如條項C98之方法，其中該個體處於罹患敗血症之風險下。

C102.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及(i)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O25B抗原之綴合物，(ii)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O1A抗原之綴合物，(iii)與載體蛋白質共價偶聯之大腸桿菌O2抗原之綴合物，及(iv)與載體蛋白質共價偶聯之O6抗原之綴合物，其中該大腸桿菌O25B抗原包含式O25B之結構，其中 n為大於30之整數。

C103.如條項C102之組合物，其中該載體蛋白質係選自由以下組成之群：聚(L-離胺酸)、綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、CRM ₁₉₇、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之解毒變異體、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎麴菌AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。

C104.一種方法，其用於(i)誘導個體針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，(ii)誘導個體針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，或(iii)誘導個體產生對腸外病原性大腸桿菌具有特異性之調理吞噬活性抗體，其中該方法包含向該個體投與有效量之如條項C1之組合物。

C105.如條項C104之方法，其中該個體處於罹患泌尿道感染之風險下。

C106.如條項C104之方法，其中該個體處於罹患菌血症之風險下。

C107.如條項C104之方法，其中該個體處於罹患敗血症之風險下。

C108.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含與大腸桿菌之相應野生型O-多醣相比增加至少5個重複單元之醣。

C109.如條項C108之組合物，其中該醣包含式O25a，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O25a。

C110.如條項C108之組合物，其中該醣包含式O25b，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O25b。

C111.如條項C108之組合物，其中該醣包含式O2，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O2。

C112.如條項C108之組合物，其中該醣包含式O6，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O6。

C113.如條項C108之組合物，其中該醣包含式O1，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O1。

C114.如條項C108之組合物，其中該醣包含式O17，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O17。

C115.如條項C108之組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為5至1000之整數。

C116.如條項C108之組合物，其中該大腸桿菌為選自由以下組成之群的大腸桿菌血清型：O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O25b、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

C117.如條項C108之組合物，其中該醣係藉由增加由革蘭氏陰性細菌在培養中產生之O-多醣的重複單元而產生，包含在革蘭氏陰性細菌中過度表現wzz家族蛋白質以產生該醣。

C118.如條項C117之組合物，其中該過度表現之wzz家族蛋白質係選自由以下組成之群：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。

C119.如條項C117之組合物，其中該過度表現之wzz家族蛋白質為wzzB。

C120.如條項C117之組合物，其中該過度表現之wzz家族蛋白質為fepE。

C121.如條項C117之組合物，其中該過度表現之wzz家族蛋白質為wzzB及fepE。

C122.如條項C108之組合物，其中該醣係以合成方式合成。

C123.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含與載體蛋白質共價結合之如條項C108之醣的綴合物。

C124.如條項C123之組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C125.如條項C123之組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為5至1000之整數。

C126.如條項C123之組合物，其中該醣包含與相應的野生型O-多醣相比，增加至少5個重複單元。

C127.如條項C1之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之稀釋劑。

C128.如條項C127之組合物，其進一步包含佐劑。

C129.如條項C127之組合物，其進一步包含鋁。

C130.如條項C127之組合物，其進一步包含QS-21。

C131.如條項C127之組合物，其中該組合物不包括佐劑。

C132.一種用於誘導個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與如條項C127之組合物。

C133.如條項C123之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之稀釋劑。

C134.一種用於誘導個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與如條項C133之組合物。

C135.如條項C132或C134之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O特異性多醣血清抗體。

C136.如條項C135之方法，其中該抗大腸桿菌O特異性多醣血清抗體為IgG抗體。

C137.如條項C135之方法，其中該抗大腸桿菌O特異性多醣血清抗體為具有針對大腸桿菌之殺細菌活性的IgG抗體。

C138.一種免疫原性組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及衍生自大腸桿菌、經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質綴合之醣，其中該多醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。

C139.如條項C138之免疫原性組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。

C140.如條項C138之免疫原性組合物，其中該醣為衍生自大腸桿菌之O-抗原。

C141.如條項C138之免疫原性組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為5至1000之整數。

C142.如條項C138之免疫原性組合物，其中該醣之O-乙醯化程度在75-100%之間。

C143.如條項C138之免疫原性組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C144.如條項C143之免疫原性組合物，其中該CRM197包含經由eTEC間隔基與該多醣共價連接之2至20個離胺酸殘基。

C145.如條項C143之免疫原性組合物，其中該CRM197包含經由eTEC間隔基與該多醣共價連接之4至16個離胺酸殘基。

C146.如條項C138之免疫原性組合物，其進一步包含額外抗原。

C147.如條項C138之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。

C148.如條項C147之免疫原性組合物，其中該佐劑為選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群的基於鋁之佐劑。

C149.如條項C138之免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。

C150.一種免疫原性組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含與載體蛋白質綴合之衍生自大腸桿菌之醣的醣綴合物，其中該醣綴合物係使用還原胺化來製備。

C151.如條項C150之免疫原性組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。

C152.如條項C150之免疫原性組合物，其中該醣為衍生自大腸桿菌之O-抗原。

C153.如條項C150之免疫原性組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為5至1000之整數。

C154.如條項C150之免疫原性組合物，其中該醣之O-乙醯化程度在75-100%之間。

C155.如條項C150之免疫原性組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C156.如條項C150之免疫原性組合物，其進一步包含額外抗原。

C157.如條項C150之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。

C158.如條項C157之免疫原性組合物，其中該佐劑為選自由磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁組成之群的基於鋁之佐劑。

C159.如條項C150之免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。

C160.一種用於誘導個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投與如條項C138至C159中任一項之組合物。

C161.如條項C160之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O特異性多醣血清抗體。

C162.如條項C135之方法，其中該抗大腸桿菌O特異性多醣血清抗體為IgG抗體。

C163.如條項C135之方法，其中該抗大腸桿菌O特異性多醣血清抗體為具有針對大腸桿菌之殺細菌活性的IgG抗體。

C164.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187，其中 n大於相應野生型大腸桿菌多醣中之重複單元數目。

C165.如條項C164之組合物，其中 n為整數31至100。

C166.如條項C164之組合物，其中該醣包含根據式O1A、式O1B及式O1C、式O2、式O6及式O25B中之任一者之結構。

C167.如條項C164之組合物，其中該醣係在重組宿主細胞中產生，該細胞表現與以下中之任一者具有至少90%序列一致性的wzz家族蛋白質：SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 39。

C168.如條項C167之組合物，其中該蛋白質包含SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34中之任一者。

C169.如條項C164之醣，其中該醣係以合成方式合成。

C170.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含與醣共價結合之載體蛋白質的綴合物，該醣包含選自以下中之任一者之結構：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186或式O187，其中 n為1至100之整數。

C171.如條項C170之組合物，其中該醣包含以下式O25b、式O1A、式O2及式O6中之任一者。

C172. 如條項C170之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R1部分、大腸桿菌R2部分、大腸桿菌R3部分、大腸桿菌R4部分及大腸桿菌K-12部分中之任一者。

C173.如條項C170之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R1部分、大腸桿菌R2部分、大腸桿菌R3部分、大腸桿菌R4部分及大腸桿菌K-12部分中之任一者。如條項C170之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R2部分。

C174.如條項C170之組合物，其中該醣進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C175.如條項C170之組合物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎麴菌AcrA、空腸彎麴菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。

C176.如條項C170之組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C177.如條項C170之組合物，其中該載體蛋白質為破傷風類毒素。

C178.如條項C170之組合物，其中該醣與蛋白質之比率為至少0.5至至多2。

C179.如條項C170之組合物，其中該綴合物係經由還原胺化來製備。

C180.如條項C170之組合物，其中該醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與該載體蛋白質綴合。

C181.如條項C170之組合物，其中該醣為單端連接之綴合醣。

C182.如條項C174之組合物，其中該醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與該載體蛋白質綴合。

C183.如條項C170之組合物，其中該綴合物係經由CDAP化學方法來製備。

C184.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及(a)包含與包含式O25b之醣共價結合之載體蛋白質的綴合物，其中 n為整數31至90，(b)包含與包含式O1A之醣共價結合之載體蛋白質的綴合物，其中 n為整數31至90，(c)包含與包含式O2之醣共價結合之載體蛋白質的綴合物，其中 n為整數31至90，及(d)包含與包含式O6之醣共價結合之載體蛋白質的綴合物，其中 n為整數31至90。

C185.如條項C184之組合物，其進一步包含：包含與醣共價結合之載體蛋白質的綴合物，該醣包含選自以下中之任一者之結構：式O15、式O16、式O17、式O18及式O75，其中 n為整數31至90。

C186.如條項C184之組合物，其包含與該組合物中醣之總量相比至多25%之游離醣。

C187.一種引發哺乳動物針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之如條項C184至C186中任一項之組合物。

C188.如條項C187之方法，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。

C189.如條項C187之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。

C190.一種哺乳動物細胞，其包含(a)編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的第一相關基因，其中該基因整合在至少兩個重組目標位點(RTS)之間。

C191.如條項C190之實施例，其中該兩個RTS染色體整合在NL1基因座或NL2基因座內。

C192.如條項C190之實施例，其中該第一相關基因進一步包含報導基因、編碼難以表現蛋白質之基因、輔助基因或其組合。

C193.如條項C190之實施例，其進一步包含整合在不同於(a)之基因座之第二染色體基因座內的第二相關基因，其中該第二相關基因包含報導基因、編碼難以表現蛋白質之基因、輔助基因或其組合。

C194.一種重組哺乳動物細胞，其包含編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的聚核苷酸。

C195.如C194之重組細胞，其中該多肽衍生自大腸桿菌繖毛H (FimH)。

C196.如C195之重組細胞，其中該多肽在該多肽之N端處包含苯丙胺酸殘基。

C197.如C195之重組細胞，其中該多肽在N端之前20個殘基位置內包含苯丙胺酸殘基。

C198.如C195之重組細胞，其中該多肽在該多肽之位置1處包含苯丙胺酸殘基。

C199.如C198之重組細胞，其中該多肽在緊接該多肽之位置1處之苯丙胺酸殘基之前不包含甘胺酸殘基。

C200.如C195之重組細胞，其中該多肽在該多肽之位置7處不包含N-醣基化位點。

C201.如C199之重組細胞，其中該多肽在該多肽之位置7處不包含Asn殘基。

C202.如C201之重組細胞，其中該多肽在位置7處包含選自由Ser、Asp、Thr及Gln組成之群的殘基。

C203.如C198之重組細胞，其中該多肽在該多肽之位置70處不包含N-醣基化位點。

C204.如C203之重組細胞，其中該多肽在該多肽之位置70處不包含Asn殘基。

C205.如C203之重組細胞，其中該多肽在該多肽之位置70處不包含Ser殘基。

C206.如C194之重組細胞，其中該多肽在該多肽之N-醣基化位點處包含選自由Ser、Asp、Thr及Gln組成之群的殘基取代。

C207.如C206之重組細胞，其中該N-醣基化位點包含該多肽之位置N235。

C208.如C206之重組細胞，其中該N-醣基化位點包含該多肽之位置N228。

C209.如C206之重組細胞，其中該N-醣基化位點包含該多肽之位置N235及位置N228。

C210.如C195之重組細胞，其中該多肽包含SEQ ID NO: 3。

C211.如C195之重組細胞，其中該多肽包含SEQ ID NO: 2。

C212.如C194之重組細胞，其中該多肽在該多肽之位置1處包含脂族疏水性胺基酸殘基。

C213.如C212之重組細胞，其中該脂族疏水性胺基酸殘基係選自由Ile、Leu及Val組成之群。

C214.如C194之重組細胞，其中該多肽包含FimH之片段。

C215.如C214之重組細胞，其中該多肽包含FimH之凝集素域。

C216.如C215之重組細胞，其中該凝集素域包含約17022道爾頓之質量。

C217.如C194之重組細胞，其中該多肽與FimC多肽或其片段複合。

C218.如C217之重組細胞，其中該FimC多肽或其片段在該FimC多肽或其片段之位置37處包含甘胺酸殘基。

C219.如C195之重組細胞，其中該多肽呈低親和力構形。

C220.如C195之重組細胞，其中該多肽係藉由FimG穩定。

C221.如C195之重組細胞，其中該多肽係藉由FimG之供體股肽(DsG)穩定。

C222.如C221之重組細胞，其中該聚核苷酸序列進一步編碼連接子序列。

C223.如C222之重組細胞，其中該連接子包含至少4個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基。

C224.如C222之重組細胞，其中該連接子包含至少5個胺基酸殘基及至多10個胺基酸殘基。

C225.如C222之重組細胞，其中該連接子包含7個胺基酸殘基。

C226.如C194之重組細胞，其中該多肽不包含選自由以下組成之群的訊號肽：原生FimH前導肽、流感血球凝集素訊號肽及人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)融合醣蛋白F0訊號肽。

C227.如C194之重組細胞，其中該多肽包含鼠類IgK訊號肽序列。

C228.如C194之重組細胞，其中該多肽包含選自人類IgG受體FcRn大次單元p51訊號肽及人類IL10蛋白質訊號肽之任一訊號肽序列。

C229.如C195之重組細胞，其中根據SEQ ID NO: 3之編號，該多肽在胺基酸位置60處包含精胺酸至脯胺酸之突變(R60P)。

C230.如C194之重組細胞，其中該多肽之表現量大於在野生型大腸桿菌細胞之周質中表現之相應野生型多肽的表現量。

C231.如C194之重組細胞，其中該多肽之表現量大於10 mg/L。

C232.如C194之重組細胞，其中該聚核苷酸序列整合至該哺乳動物細胞之基因體DNA中。

C233.如C194之重組細胞，其中該聚核苷酸序列經密碼子最佳化以在該細胞中表現。

C234.如C194之重組細胞，其中該細胞為人類胚胎腎細胞。

C235.如C234之重組細胞，其中該人類胚胎腎細胞包含HEK293細胞。

C236.如C235之重組細胞，其中該HEK293細胞係選自HEK293T細胞、HEK293TS細胞及HEK293E細胞中之任一者。

C237.如C195之重組細胞，其中該細胞為CHO細胞。

C238.如C237之重組細胞，其中該CHO細胞為CHO-K1細胞、CHO-DUXB11、CHO-DG44細胞或CHO-S細胞。

C239.如C194之重組細胞，其中該多肽為可溶的。

C240.如C194之重組細胞，其中該多肽係自該細胞分泌。

C241.如C195之重組細胞，其中根據SEQ ID NO: 1之編號，該多肽包含N28Q取代。

C242.如C195之重組細胞，其中根據SEQ ID NO: 1之編號，該多肽包含N28D取代。

C243.如C195之重組細胞，其中根據SEQ ID NO: 1之編號，該多肽包含N28S取代。

C244.如C195之重組細胞，其中根據SEQ ID NO: 1之編號，該多肽包含選自N28Q、V48C及L55C中之任一者的取代。

C245.如C195之重組細胞，其中根據SEQ ID NO: 1之編號，該多肽包含取代N92S。

C246.如C194之重組細胞，其中根據SEQ ID NO: 1之編號，該衍生自FimH之多肽或其片段包含選自V48C及L55C中之任一者的取代。

C247.一種包含C194之重組細胞的培養物，其中該培養物之大小為至少5公升。

C248.如C242之培養物，其中該多肽或其片段之產率為至少0.05 g/L。

C249.如C248之培養物，其中該多肽或其片段之產率為至少0.10 g/L。

C250.一種用於產生衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的方法，其包含在適合之條件下培養如C194之重組哺乳動物細胞，從而表現該多肽或其片段；及收穫該多肽或其片段。

C251.如C250之方法，其進一步包含純化該多肽或其片段。

C252.如C250之方法，其中該細胞包含編碼SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 27中之任一者之核酸。

C253.如C250之方法，其中該多肽或其片段之產率為至少0.05 g/L。

C254.如C250之方法，其中該多肽或其片段之產率為至少0.10 g/L。

C255.一種組合物，其包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 29中之任一者具有至少70%一致性的多肽。

C256.如C255之組合物，其進一步包含：包含選自表 1中之任一式之結構之醣。

C257.如C256之組合物，其中該醣與載體蛋白質共價結合。

C258.如條項C257之組合物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎麴菌AcrA、空腸彎麴菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。

C259.如C257之組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C260.如C257之組合物，其中該載體蛋白質為破傷風類毒素(TT)。

C261.如C257之組合物，其中該載體蛋白質為聚(L-離胺酸)。

C262.如C257之組合物，其中該醣藉由還原胺化與載體蛋白質共價結合。

C263.如C257之組合物，其中該醣藉由CDAP化學方法與載體蛋白質共價結合。

C264.如C257之組合物，其中該醣藉由單端連接之綴合與載體蛋白質共價結合。

C265.如C257之組合物，其中該醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共價結合。

C266.一種多肽，其包含選自由SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 27組成之群的胺基酸序列。

C267.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187。

C268.如條項C267之組合物，其進一步包含至少一種衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣。

C269.如條項C267之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣。

C270.如條項C267之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。

C271.如條項C267之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O3之醣。

C272.如條項C267之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O5之醣。

C273.如條項C267之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣及衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。

C274.如條項C268之組合物，其中衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之醣與載體蛋白質綴合；且衍生自大腸桿菌之醣與載體蛋白質綴合。

C275.如條項C267之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽。

C276.一種組合物，其包含衍生自FimH之多肽或其片段；及至少一種衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣。

C277.如條項C276之組合物，其進一步包含至少一種包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187。

C278.如條項C277之組合物，其中衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之醣與載體蛋白質綴合；且衍生自大腸桿菌之醣與載體蛋白質綴合。

C279.如條項C277之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽。

C280.一種組合物，其包含至少一種衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型的醣；及至少一種包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187。

C281.如條項C280之組合物，其進一步包含衍生自FimH之多肽或其片段。

C282.如條項C280之組合物，其中大腸桿菌醣包含式O8。

C283.如條項C280之組合物，其中大腸桿菌醣包含式O9。

C284.如條項C280之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽。

C285.如條項C267至C284中任一項之組合物，其中該醣與載體蛋白質共價結合。

C286.如條項C285之組合物，其中該醣進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C287.如條項C285之組合物，其中該醣包含脂質A。

C288.如條項C285至C287中任一項之組合物，其中該醣係以合成方式合成。

C289.如條項C285之組合物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎麴菌AcrA、空腸彎麴菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。

C290.一種引發哺乳動物針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之如條項C267至C289中任一項之組合物。

C291.如條項C290之方法，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。

C292.如條項C290之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。

C293.一種引發哺乳動物針對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之如條項C267至C289中任一項之組合物。

C294.如條項C293之方法，其中該免疫反應包含針對肺炎克雷伯氏桿菌之調理吞噬活性抗體。

C295.如條項C293之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受肺炎克雷伯氏桿菌感染。

C296.如條項C1至C266中任一項之組合物及方法，其進一步包含至少一種衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群之任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣。

C297.如條項C296之組合物及方法，其中該肺炎克雷伯氏桿菌血清型O1包含變異體O1V1或O1V2。

C298.如條項C296之組合物及方法，其中該肺炎克雷伯氏桿菌血清型O2包含變異體O2V1或O2V2。

C299.一種如條項C1至C298中任一項所闡述之組合物如本文所闡述之用途。

C300.一種組合物，其包含 (i)衍生自繖毛H (FimH)之多肽或其片段；及 (ii)一或多個綴合物，其中該綴合物包含共價結合至醣之載體蛋白質，該醣包含選自由以下組成之群的結構：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。

C301.如條項C300之組合物，其中該醣選自由以下組成之群：式O25b、式O1A、式O2、式O6、式O8及式O9。

C302.如條項C301之組合物，其中該醣選自由以下組成之群：式O25b、式O1A、式O2及式O6。

C303.一種組合物，其包含衍生自繖毛抗原H (FimH)之多肽或其片段；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數， (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數， (e)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O8，其中 n為31至90之整數，及 (f)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O9，其中 n為31至90之整數。

C304.如條項C303之組合物，其包含衍生自繖毛抗原H (FimH)之多肽或其片段；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數，及 (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數。

C305.如條項C303或C304之組合物，其進一步包含一或多個具有選自由式O15、式O16、式O17、式O18及式O75組成之群之醣的綴合物，其中n為31至90.7之整數。如條項1至6中任一項之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R1部分、大腸桿菌R2部分、大腸桿菌R3部分、大腸桿菌R4部分及大腸桿菌K-12部分中之任一者。

C306.如條項C300至C304中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R1部分、大腸桿菌R2部分、大腸桿菌R3部分、大腸桿菌R4部分及大腸桿菌K-12部分中之任一者。

C307.如條項C306之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R2部分。

C308.如條項C300至C307中任一項之組合物，其中該醣進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C309.如條項C300至C308中任一項之組合物，其中該載體蛋白質選自由以下組成之群：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)或其變異體。

C310.如條項C309之組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C311.如條項C309之組合物，其中該載體蛋白質為破傷風類毒素。

C312.如條項C300至C311中任一項之組合物，其中該醣與蛋白質之比率為至少0.5至至多2。

C313.如條項C300至C312中任一項之組合物，其中該綴合物係經由還原胺化來製備。

C314.如條項C300至C312中任一項之組合物，其中該醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與該載體蛋白質綴合。

C315.如條項C300至C314中任一項之組合物，其中該醣為單端連接之綴合醣。

C316.如條項C308之組合物，其中該醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與該載體蛋白質綴合。

C317.如條項C300至C313中任一項之組合物，其中該綴合物係經由CDAP化學方法來製備。

C318.如條項C300至C317中任一項之組合物，其中該多肽衍生自大腸桿菌繖毛H (FimH)。

C319.如條項C318之組合物，其中該多肽在該多肽之N端處包含苯丙胺酸殘基。

C320.如條項C318之組合物，其中該多肽在N端之前20個殘基位置內包含苯丙胺酸殘基。

C321.如條項C314之組合物，其中該多肽在該多肽之位置1處包含苯丙胺酸殘基。

C322.如條項C317之組合物，其中該多肽在緊接該多肽之位置1處之苯丙胺酸殘基之前不包含甘胺酸殘基。

C323.如條項C314之組合物，其中該多肽在該多肽之位置7處不包含N-醣基化位點。

C324.如條項C318之組合物，其中該多肽在該多肽之位置7處不包含Asn殘基。

C325.如條項C320之組合物，其中該多肽在位置7處包含選自由Ser、Asp、Thr及Gln組成之群的殘基。

C326.如條項C317之組合物，其中該多肽在該多肽之位置70處不包含N-醣基化位點。

C327.如條項C322之組合物，其中該多肽在該多肽之位置70處不包含Asn殘基。

C328.如條項C322之組合物，其中該多肽在該多肽之位置70處不包含Ser殘基。

C329.如條項C314之組合物，其中該多肽在該多肽之N-醣基化位點處包含選自由Ser、Asp、Thr及Gln組成之群的殘基取代。

C330.如條項C325之組合物，其中該N-醣基化位點包含該多肽之位置N235。

C331.如條項C325之組合物，其中該N-醣基化位點包含該多肽之位置N228。

C332.如條項C325之組合物，其中該N-醣基化位點包含該多肽之位置N235及位置N228。

C333.如條項C314之組合物，其中該多肽包含SEQ ID NO: 2。

C334.如條項C314之組合物，其中該多肽包含SEQ ID NO: 3。

C335.如條項C314之組合物，其中該多肽包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的胺基酸：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113。

C336.如條項C314之組合物，其中該多肽包含具有與由以下組成之群具有至少70%一致性之胺基酸序列的胺基酸：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113。

C337.如條項C314之組合物，其中該多肽在該多肽之位置1處包含脂族疏水性胺基酸殘基。

C338.如條項C333之組合物，其中該脂族疏水性胺基酸殘基係選自由Ile、Leu及Val組成之群。

C339.如條項C314之組合物，其中該多肽包含FimH之片段。

C340.如條項C335之組合物，其中該多肽包含FimH之凝集素域。

C341.如條項C336之組合物，其中該凝集素域包含約17022道爾頓之質量。

C342.如條項C314之組合物，其中該多肽與FimC多肽或其片段複合。

C343.如條項C338之組合物，其中該FimC多肽或其片段在該FimC多肽或其片段之位置37處包含甘胺酸殘基。

C344.如條項C314之組合物，其中該多肽呈低親和力構形。

C345.如條項C314之組合物，其中該多肽係藉由FimG穩定。

C346.如條項C314之組合物，其中該多肽係藉由FimG之供體股肽(DsG)穩定。

C347.如條項C346之組合物，其中該多肽進一步包含連接子。

C348.如條項C343之組合物，其中該連接子包含至少4個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基。

C349.如條項C343之組合物，其中該連接子包含至少5個胺基酸殘基及至多10個胺基酸殘基。

C350.如條項C343之組合物，其中該連接子包含7個胺基酸殘基。

C351.如條項C314之組合物，其中該多肽不包含選自由以下組成之群的訊號肽：原生FimH前導肽、流感血球凝集素訊號肽及人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)融合醣蛋白F0訊號肽。

C352.如條項C314之組合物，其中該多肽包含鼠類IgK訊號肽序列。

C353.如條項C314之組合物，其中該多肽包含選自人類IgG受體FcRn大次單元p51訊號肽及人類IL10蛋白質訊號肽之任一訊號肽序列。

C354.如條項C314之組合物，其中根據SEQ ID NO: 3之編號，該多肽在胺基酸位置60處包含精胺酸至脯胺酸之突變(R60P)。

C355.如條項C300至C354之組合物，其包含與該組合物中醣之總量相比至多25%之游離醣。

C356.如條項C300至C354中任一項之組合物，其進一步包含一或多個綴合物，其中該綴合物包含共價結合至選自O1及O2之肺炎克雷伯氏桿菌( K . pneumoniae) O-抗原之載體蛋白質。

C357.如條項C356之組合物，其中該肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原選自由以下組成之群：a)血清型O1亞型v1 (O1v1)、b)血清型O1亞型v2 (O1v2)、c)血清型O2亞型v1 (O2v1)及d)血清型O2亞型v2 (O2v2)。

C358.一種組合物，其包含 (i)一或多個綴合物，其包含共價結合至選自由血清型O1亞型v1 (O1v1)、血清型O1亞型v2 (O1v2)、血清型O2亞型v1 (O2v1)及血清型O2亞型v2 (O2v2)組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原的載體蛋白質；及 (ii)一或多個綴合物，其中該綴合物包含共價結合至醣之載體蛋白質，該醣包含選自由以下組成之群的結構：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。

C359.如條項C358之組合物，其中該醣選自由以下組成之群：式O25b、式O1A、式O2、式O6、式O8及式O9。

C360.如條項C359之組合物，其中該醣選自由以下組成之群：式O25b、式O1A、式O2及式O6。

C361.一種組合物，其包含一或多個綴合物，該等綴合物包含共價結合至選自由血清型O1亞型v1 (O1v1)、血清型O1亞型v2 (O1v2)、血清型O2亞型v1 (O2v1)及血清型O2亞型v2 (O2v2)組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原的載體蛋白質；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數， (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數， (e)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O8，其中 n為31至90之整數，及 (f)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O9，其中 n為31至90之整數。

C362.如條項C361之組合物，其包含(i)一或多個綴合物，其包含共價結合至選自由血清型O1亞型v1 (O1v1)、血清型O1亞型v2 (O1v2)、血清型O2亞型v1 (O2v1)及血清型O2亞型v2 (O2v2)組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原的載體蛋白質；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數，及 (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數。

C363.如條項C361或C362之組合物，其進一步包含一或多個具有選自由式O15、式O16、式O17、式O18及式O75組成之群之醣的綴合物，其中 n為31至90之整數。

C364.如條項C358至C363中任一項之組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R1部分、大腸桿菌R2部分、大腸桿菌R3部分、大腸桿菌R4部分及大腸桿菌K-12部分中之任一者。

C365.如條項C358至C363中任一項之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R1部分、大腸桿菌R2部分、大腸桿菌R3部分、大腸桿菌R4部分及大腸桿菌K-12部分中之任一者。

C366.如條項67之組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R2部分。

C367.如條項C358至C366中任一項之組合物，其中該醣進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。

C368.如條項C358至C367中任一項之組合物，其中該載體蛋白質選自由以下組成之群：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)或其變異體。

C369.如條項C368之組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

C370.如條項C368之組合物，其中該載體蛋白質為破傷風類毒素。

C371.如條項C358至C370中任一項之組合物，其中該醣與蛋白質之比率為至少0.5至至多2。

C372.如條項C358至C371中任一項之組合物，其中該綴合物係經由還原胺化來製備。

C373.如條項C358至C371中任一項之組合物，其中該醣經由胺基甲酸(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔基與該載體蛋白質綴合。

C374.如條項C358至C373中任一項之組合物，其中該醣為單端連接之綴合醣。

C375.如條項C367之組合物，其中該醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與該載體蛋白質綴合。

C376.如條項C358至C372中任一項之組合物，其中該綴合物係經由CDAP化學方法來製備。

C377.如條項C358至C376之組合物，其包含與該組合物中醣之總量相比至多25%之游離醣。

C378.如條項C300至C377中任一項之組合物，其進一步包含佐劑。

C379.如條項C378之組合物，其中該佐劑包含鋁。

C380.如條項C378之組合物，其中該佐劑包含QS21。

C381.如條項C378之組合物，其中該佐劑包含MPLA。

C382.如條項C380或C381之組合物，其中該佐劑為脂質體佐劑。

C383.一種引發哺乳動物針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之如條項C300至C382中任一項之組合物。

C384.如條項C383之方法，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。

C385.如條項C383之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。

C386.一種如條項C300至C382中任一項之組合物之用途，其用於誘導針對大腸桿菌之免疫反應。

C387.一種如條項C300至C382中任一項之組合物之用途，其用於製造用以誘導針對大腸桿菌之免疫反應的藥劑。

C388.如條項C386或C387之用途，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。

C389.如條項C386或C387之用途，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。

C390.一種引發哺乳動物針對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之如條項C300至C382中任一項之組合物。

C391.如條項C390之方法，其中該免疫反應包含針對肺炎克雷伯氏桿菌之調理吞噬活性抗體。

C392.如條項C390之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受肺炎克雷伯氏桿菌感染。

C393.一種如條項C300至C382中任一項之組合物之用途，其用於誘導針對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應。

C394.一種如條項C300至C382中任一項之組合物之用途，其用於製造用以誘導針對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的藥劑。

C395.如條項C386或C387之用途，其中該免疫反應包含針對肺炎克雷伯氏桿菌之調理吞噬活性抗體。

C396.如條項C386或C387之用途，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受肺炎克雷伯氏桿菌感染。

C397.一種核酸，其包含編碼如條項C1至C382中任一項之多肽的核苷酸。

C398.如條項C397之核酸，其中該核酸為RNA。

C399.一種奈米粒子，其包含如條項C397或C398之核酸。

C400.如條項303、304、305、359、360、361、362或363中任一項之組合物，其進一步包含具有選自由式O4、式O11、式O13、式O21及式O86組成之群之醣的一或多個綴合物，其中n為1至100之整數，較佳31至90。

圖 1A - 1H -描繪胺基酸序列，包括衍生自大腸桿菌之例示性多肽或其片段的胺基酸序列；及例示性wzzB序列之胺基酸序列。

圖 2A - 2T -描繪例示性表現載體之圖譜。

圖 3 -描繪表現及純化之結果。

圖 4 -描繪表現及純化之結果。

圖 5 -描繪表現之結果。

圖 6A - 6C -描繪pSB02083及pSB02158 SEC池及親和力，包括產率。

圖 7 -描繪pSB2198 FimH dscG鎖突變型構築體表現之結果。

圖 8 -描繪pSB2307 FimH dscG野生型表現之結果。

圖 9A - 9C -描繪藉由聚合酶依賴性路徑合成之O-抗原的結構，其主鏈中具有四個或更少的殘基。

圖 10A - 10B - 圖 10A描繪藉由聚合酶依賴性路徑合成之O-抗原的結構，其主鏈中具有五個或六個殘基；圖 10B描繪咸信藉由ABC轉運體依賴性路徑合成之O-抗原。

圖 11 -描繪Phe1與其他具有脂族疏水性側鏈之胺基酸(例如Ile、Leu及Val)之計算突變誘發掃描，該等胺基酸可穩定FimH蛋白質且容納甘露糖結合。

圖 12A - 12B-描繪質體：pUC複製子質體，每個細胞500-700x複本，鏈長調控因子( 圖 12A)；及P15a複製子質體，每個細胞10-12x複本，O-抗原操縱子( 圖 12B)。

圖 13A - 13B-描繪藉由基於質體之異源 wzzB及 fepE鏈長調控因子之表現對血清型O25a及O25b菌株中O-抗原鏈長之調節。顯示wzzB基因剔除菌株O25K5H1 (O25a)及GAR2401 (O25b)之質體轉型體中LPS表現之遺傳互補。在圖 13A之左側，顯示O25a O25K5HΔwzzB之質體轉型體的LPS概況；且在右側，顯示O25b GAR 2401ΔwzzB轉型體之類似概況。圖 13B中顯示用O25特異性血清(Statens Serum Institut)探測之複製凝膠的免疫墨點。O25a Δ wxxB(基因剔除)背景與泳道1-7相關；O25b 2401 Δ wzzB(基因剔除)背景與泳道8-15相關。

圖 14-描繪宿主O25K5H1ΔwzzB中由大腸桿菌及沙門氏菌fepE質體賦予之長鏈O-抗原表現。

圖 15 -描繪沙門氏菌fepE表現在多種臨床分離株中產生長O-抗原LPS。

圖 16A - 16B-描繪O25b O-抗原基因剔除宿主菌株中質體介導、阿拉伯糖誘導之O25b長O-抗原LPS的表現。SPS PAGE之結果展示於圖 16A中，且O25免疫墨點之結果展示於圖 16B中，其中在圖 16A及圖 16B中，泳道1來自純系1，無阿拉伯糖；泳道2來自純系1，0.2%阿拉伯糖；泳道3來自純系9，無阿拉伯糖；泳道4來自純系9，0.2%阿拉伯糖；泳道5來自O55大腸桿菌LPS標準物；及泳道6來自O111大腸桿菌LPS標準物。

圖 17 -描繪常見宿主菌株中質體介導、阿拉伯糖誘導之長O-抗原LPS之表現。

圖 18-描繪探索性生物過程菌株中O25 O-抗原LPS之表現。

圖 19A - 19B-描繪自菌株GAR2831及‘2401ΔwzzB / fepE中純化之短( 圖 19A，菌株1 O25b wt 2831)及長O25b O-抗原( 圖 19B，菌株2 O25b 2401ΔwzzB/LT2 FepE)的SEC概況及特性。

圖 20A - 20B-描繪兔之疫苗接種時程：( 圖 20A)關於兔研究1 VAC-2017-PRL-EC-0723之疫苗接種時程的資訊；( 圖 20B)兔研究2 VAC-2018-PRL-EC-077之疫苗接種時程。

圖 21A - 21C-描繪O25b醣綴合物IgG反應，其中-●-表示放血前結果；-■-放血1 (6週)；-▲-放血2 (8週)；-♦-放血3 (12週)。圖 21A描繪兔1-3 (中等活化)之結果；圖 21B描繪兔2-3 (較低活化)之結果；圖 21C描繪兔3-1 (較高活化)之結果。

圖 22A - 22F-描繪對O25b長O-抗原醣綴合物，亦即低活化O25b-CRM ₁₉₇綴合物( 圖 22D - 22F，其中-●-表示兔2-1之放血前結果，-■-兔2-1之第12週抗血清)與未綴合多醣，亦即游離O25b多醣( 圖 22A - 22C，其中-●-表示兔A-1之放血前結果，-■-兔A-1之第6週抗血清，-▲-兔A-1之第8週抗血清)的IgG反應。請注意，MFI係按對數比例繪製的，以突出在＜1000 MFI範圍內之免疫前抗體與免疫抗體之間的差異。圖 22A描繪兔A-1 (未綴合多醣)之結果；圖 22B描繪兔A-3 (未綴合多醣)之結果；圖 22C描繪兔A-4 (未綴合多醣)之結果；圖 22D描繪兔2-1 (低活化)之結果；圖 22E描繪兔2-2 (低活化)之結果；及圖 22F描繪兔2-3 (低活化)之結果。

圖 23A - 23C -描繪用O25b抗血清偵測之原生與長O25b O-抗原的表面表現。圖 23A描繪結果，其中-●-表示O25b 2831與PD3抗血清之結果；-■-表示O25b 2831 wt與放血前之結果；-▲-表示O25b 2831/fepE與PD3抗血清之結果；-▼-表示O25b 2831/fepE與放血前之結果。圖 23B描繪結果，其中-●-表示O25b 2401與PD3抗血清之結果；-■-表示O25b 2401與放血前之結果；-▲-表示O25b 2401 / fepE與PD3抗血清之結果；-▼-表示O25b 2401/fepE與放血前之結果。圖 23C描繪結果，其中-●-表示大腸桿菌K12與PD3抗血清之結果；且-■-表示大腸桿菌K12與放血前之結果。

圖 24 -描繪五種已知化學型之外部核心寡醣之碳水化合物主鏈的一般化結構。除非另外指明，否則所有單醣均呈α-變旋異構組態。產物催化各連接形成之基因以虛線箭頭指示。星號表示與O-抗原連接之核心寡醣的殘基。

圖 25 -描繪未綴合之游離O25b多醣不具有免疫原性(dLIA)，其中-●-表示來自4-1之第18週(1週= PD4)抗血清的結果；-■-表示來自4-2之第18週(1週= PD4)抗血清的結果；-▲-表示來自5-1之第18週(1週= PD4)抗血清的結果；-▼-表示來自5-2之第18週(1週= PD4)抗血清的結果；-

-表示來自6-1之第18週(1週= PD4)抗血清的結果；-

-表示來自6-2之第18週(1週= PD4)抗血清的結果。

圖 26A - 26C -描繪繪示BRC兔O25b RAC綴合免疫血清OPA效價之特異性的圖。圖 26A展示兔2-3免疫前血清(-●-)及免疫後血清13週(-■-)之OPA效價。圖 26B顯示兔1-2免疫前血清(-●-)及免疫後血清19週(-■-)之OPA效價。圖 26C顯示兔1-2 19週OPA效價特異性，其中兔1-2免疫血清之OPA活性藉由與100 μg/mL經純化之未綴合O25b長O-抗原多醣一起預培育來阻斷，其中-■-表示兔1-2免疫血清19週之結果；及-▼-表示兔1-2 19週w/R1長OAg之結果。

圖 27A - 27C - 圖 27A描繪例示性投與時程之圖示。圖 27B及圖 27C顯示描繪由未綴合之O25b長O-抗原多醣( 圖 27B，O25b游離多醣(2 µg))及衍生之O25b RAC/DMSO長O-抗原醣綴合物( 圖 27C，O25b-CRM ₁₉₇RAC長(2 µg))引起之O-抗原O25b IgG含量的圖，其中-...- (虛線)表示初始CD1 O25b IgG含量。

圖 28A - 28B -描繪顯示RAC、eTEC O25b長醣綴合物及單端醣綴合物給藥後2 ( 圖 28A)及給藥後3 ( 圖 28B)之OPA免疫原性的圖，其中-○-表示單端短2 µg；-●-單端長2 µg；-▲- RAC/DMSO長2 µg；-▼- eTEC長2 µg；*背景對照(n=20)之結果。應答速率為效價＞ 2×未經疫苗接種基線之小鼠%。

圖 29 -描繪顯示eTEC化學物質及經調節之多醣活化水準之OPA免疫原性的圖。應答速率為效價＞ 2×未經疫苗接種基線之小鼠%。

圖 30A - 30B-描繪例示性投與時程之圖示( 圖 30A)；及描繪用各劑量之大腸桿菌eTEC綴合物免疫接種之小鼠免於O25b分離株之致死性攻擊的圖( 圖 30B)，其中-◊-表示eTEC長鏈17%活化；-∆- eTEC表示長鏈10%活化；-

-表示eTEC長鏈4%活化；-¨-表示O25b多醣；-○-表示未經疫苗接種之對照。

圖 31-描繪說明單端綴合物之例示性製備的示意圖，其中綴合過程涉及在暴露硫醇官能基後，用二硫胺連接子選擇性活化2-酮-3-去氧辛酸(KDO)。隨後，將KDO與溴活化之CRM ₁₉₇蛋白質綴合，如圖 31(單端綴合物之製備)中所描繪。

圖 32A - 32B-描繪用於製備與CRM ₁₉₇之大腸桿菌醣綴合物之活化( 圖 32A)及綴合( 圖 32B)方法的例示性方法流程圖。

圖 33 -描繪大腸桿菌及肺炎克雷伯氏桿菌多聚甘露糖O-抗原之重複單元(RU)的結構。圖例：三聚體大腸桿菌O8及肺炎克雷伯氏桿菌O5相同，四聚體大腸桿菌O9A/肺炎克雷伯氏桿菌O3a及五聚體大腸桿菌O9/肺炎克雷伯氏桿菌O3亦相同。肺炎克雷伯氏桿菌O3亞型在生物合成酶序列層面上之差異描述於Guachalla LM等人(Scientific Reports 2017；7:6635)中。

圖 34A - 34B -描繪大腸桿菌血清型O8免疫血清對侵襲性肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5菌株具有殺細菌作用。圖例：在使用大腸桿菌O8菌株( 圖 34A)及肺炎克雷伯氏桿菌O5菌株( 圖 34B)之殺細菌分析中評估由大腸桿菌血清型O8 O-抗原CRM ₁₉₇綴合物引發之兔免疫血清。在兩次疫苗劑量(第15週)後觀測到針對大腸桿菌O8菌株之強效調理吞噬活性分析(OPA)活性，而在用未綴合之O8多醣(O8-OAg)或匹配之免疫前血清(第0週)預吸附後，該活性不存在。相同兔免疫血清展現出針對肺炎克雷伯氏桿菌O5菌株之抗原特異性血清殺細菌活性(SBA)。BRC (幼兔補體)、hC (IgG/IgM耗乏之人類血清)作為補體來源。

圖 35A - 35B-描繪大腸桿菌血清型O9 O-抗原免疫血清對侵襲性肺炎克雷伯氏桿菌O3分離株具有殺細菌作用。圖例：在使用大腸桿菌O9a菌株( 圖 35A)及肺炎克雷伯氏桿菌O3b菌株( 圖 35B)之調理吞噬活性分析(OPA)中評估由大腸桿菌血清型O9a O-抗原CRM ₁₉₇綴合物引發之兔免疫血清。在兩次疫苗劑量(第15週)後觀測到針對大腸桿菌O9菌株之OPA活性，而在用未綴合之O9多醣(O9-OAg)或匹配之免疫前血清(第0週)預吸附後，該活性不存在。相同兔免疫血清亦展現出針對肺炎克雷伯氏桿菌O3b菌株之強力抗原特異性血清殺細菌活性(SBA)。BRC (幼兔補體)、hC (IgG/IgM耗乏之人類血清)用作補體來源。

圖 36A-36B-描繪大腸桿菌FimH _LD抗原需要強力佐劑來引發中和抗體。圖 36A描繪研究VAC-2019-PRL-EC-1369之給藥時程：使每組12及20隻之間的CD-1小鼠在具有或不具有20 µg QS21/PS80或50 µg AlPO ₄佐劑之情況下接種3 µg或30 µg劑量之大腸桿菌FimH _LD抗原。圖 36B描繪在接種分別展示為封閉符號或空心符號之野生型FimH _LD或FimH _LD鎖突變抗原之個別小鼠之劑量3之後的效價。指定來自對數轉換之中和效價資料的t測試(不配對韋爾奇氏校正(Welch's correction))之 p值。

圖 37A-37B-證實FimH-DSG變異體比FimH _LD構築體更具免疫原性。圖 37A描繪研究VAC-2019-PRL-EC-1438之給藥時程：使每組20隻CD-1小鼠接種10 µg或30 µg之具有20 µg QS21/PS80之大腸桿菌FimH _LD或FimH-DSG抗原變異體。圖 37B-描繪在接種分別展示為封閉符號或空心符號之野生型FimH _LD或FimH _LD鎖突變抗原之個別小鼠之劑量3之後的效價。指定來自對數轉換之中和效價資料的t測試(不配對韋爾奇氏校正)之 p值。

圖 38-描繪用於FimH-DSG及O-抗原組合之時程及給藥及佐劑調配物研究(研究VAC-2020-PRL-EC-1679)。

圖 39A-39B-描繪研究VAC-2020-PRL-EC-1679，其證實佐劑及FimH-DSG及4價O-抗原組合對FimH中和之影響。在PD2 ( 圖 39A)及PD3 ( 圖 39B)時間點時之酵母菌甘露聚糖分析結合中和效價。封閉符號反映了僅接種O-抗原或FimH-DSG抗原之小鼠；空心符號為接種在x軸上標記之FimH-DSG O-抗原組合之組的小鼠。

圖 40A-40B-描繪使用小鼠血清池之膀胱分析的結果證實使用個別小鼠血清之酵母菌甘露聚糖分析資料。來自匯集之小鼠血清(n=10)的膀胱細胞結合抑制曲線。圖例中之細節與圖 39A - 39B中相同。兔抗FimH陽性對照血清滴定亦展示為恆定分析參考標準。

圖 41-描繪佐劑及FimH-DSG對O-抗原特異性血清IgG含量之影響。封閉符號及空心符號分別表示PD2及PD3時間點值。匯集每組十隻預先接種之CD-1小鼠，以確定用於各抗原之基線IgG含量。各預先接種之池的GMT＜自標準曲線偏差分析確定之定量的下限(0.15 µg/mL，虛線)。反應者比率指示為每組小鼠中顯示出效價比基線增加大於5倍之百分比。各組之間的抗體效價差異藉由不配對t檢定來分析，其中韋爾奇氏校正**P＜0.05。

圖 42-描繪佐劑及FimH-DSG對O-抗原特異性血清OPA效價之影響。細節與圖 41相同。虛線反映來自小鼠預先接種血清池(1/2x LOD或50，n=10)之基線效價。封閉符號及空心符號分別表示PD2及PD3時間點值。

序列識別符 SEQ ID NO: 1列出野生型1型繖毛D-甘露糖特異性黏附素[大腸桿菌FimH J96]之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 2列出對應於SEQ ID NO: 1之aa殘基22-300 (成熟FimH蛋白質)之FimH片段的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 3列出FimH凝集素域之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 4列出FimH菌毛蛋白域之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 5列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02198 - FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 /GGHis8於pcDNA3.1(+)中)之多肽的胺基酸序列 SEQ ID NO: 6列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02307 - FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q /His8於pcDNA3.1(+)中)之多肽的胺基酸序列 SEQ ID NO: 7列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02083 FimH凝集素域野生型構築體)之多肽片段的胺基酸序列 SEQ ID NO: 8列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02158 FimH凝集素域鎖突變體)之多肽片段的胺基酸序列 SEQ ID NO: 9列出衍生自大腸桿菌FimG (FimG A1..K14)之多肽片段的胺基酸序列 SEQ ID NO: 10列出衍生自大腸桿菌FimC之多肽片段的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 11列出4 aa連接子之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 12列出5 aa連接子之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 13列出6 aa連接子之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 14列出7 aa連接子之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 15列出8 aa連接子之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 16列出9 aa連接子之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 17列出10 aa連接子之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 18列出FimH J96訊號序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 19列出SEQ ID NO: 5之訊號肽(pSB02198 - FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q / 7 AA連接子/ FimG A1..K14 / GGHis8於pcDNA3.1(+)中)的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 20列出根據SEQ ID NO: 5之衍生自大腸桿菌FimH (pSB02198 -FimH mIgK訊號肽/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7 AA連接子/FimG A1..K14/GGHis8於pcDNA3.1(+)中之成熟蛋白)之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 21列出衍生自大腸桿菌FimG之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 22列出SEQ ID NO: 6之訊號肽(pSB02307 - FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q / His8於pcDNA3.1(+)中)的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 23列出根據SEQ ID NO: 6之衍生自大腸桿菌FimH (FimH mIgK訊號肽/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q / His8於pcDNA3.1(+)中的成熟蛋白)之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 24列出根據SEQ ID NO: 7之衍生自大腸桿菌FimH (pSB02083 FimH凝集素域野生型構築體之成熟蛋白)之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 25列出His標籤之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 26列出根據SEQ ID NO: 8之衍生自大腸桿菌FimH (pSB02158 FimH凝集素域鎖突變體之成熟蛋白)之多肽的胺基酸序列 SEQ ID NO: 27列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB01878)之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 28列出衍生自大腸桿菌FimH (K12)之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 29列出衍生自大腸桿菌FimH (UTI89)之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 30列出O25b 2401 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 31列出O25a:K5:H1 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 32列出O25a ETEC ATCC WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 33列出K12 W3110 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 34列出沙門氏菌LT2 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 35列出O25b 2401 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 36列出O25a:K5:H1 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 37列出O25a ETEC ATCC FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 38列出O157 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 39列出沙門氏菌LT2 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 40列出LT2wzzB_S之引子序列。 SEQ ID NO: 41列出LT2wzzB_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 42列出O25bFepE_S之引子序列。 SEQ ID NO: 43列出O25bFepE_A之引子序列。 SEQ ID NO: 44列出wzzB P1_S之引子序列。 SEQ ID NO: 45列出wzzB P2_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 46列出wzzB P3_S之引子序列。 SEQ ID NO: 47列出wzzB P4_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 48列出O157 FepE_S之引子序列。 SEQ ID NO: 49列出O157 FepE_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 50列出pBAD33_轉接子_S之引子序列。 SEQ ID NO: 51列出pBAD33_轉接子_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 52列出JUMPSTART_r之引子序列。 SEQ ID NO: 53列出gnd_f之引子序列。 SEQ ID NO: 54列出小鼠IgK訊號序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 55列出人類IgG受體FcRn大次單元p51訊號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 56列出人類IL10蛋白質訊號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 57列出人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)融合醣蛋白F0訊號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 58列出A型流感血球凝集素訊號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 59-101列出奈米結構相關多肽或其片段之胺基酸及核酸序列。 SEQ ID NO: 102-109列出用於訊號肽預測之各種物種之訊號肽4.1 (DTU Bioinformatics)序列。 SEQ ID NO: 110列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02083 -- FimH _LD(mIgK訊號肽，N28S，N91S))之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 111列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02158 -- FimH _LD-LM (mIgK訊號肽，N28S N91S V48C L55C))之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 112列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02307 - FimH-DSG (mIgK訊號肽，N28S N91S N249Q 7aa連接子FimG A1..K14))之多肽的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 113列出衍生自大腸桿菌FimH (pSB02198 - FimH-DSG-LM (mIgK訊號肽，N28S N91S 249Q V48C L55C 7aa連接子FimG A1..K14))之多肽的胺基酸序列。


          <![CDATA[<110>  美商輝瑞大藥廠(Pfizer Inc.)]]>
          <![CDATA[<120>  大腸桿菌組合物及其方法]]>
          <![CDATA[<130>  PC72671]]>
          <![CDATA[<150>  US63/106,077]]>
          <![CDATA[<151>  2020-10-27]]>
          <![CDATA[<150>  US63/144,058]]>
          <![CDATA[<151>  2021-02-01]]>
          <![CDATA[<150>  US63/254,195]]>
          <![CDATA[<151>  2021-10-11]]>
          <![CDATA[<160>  113   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  300]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile 
                      20                  25                  30          
          Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val 
                  35                  40                  45              
          Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe 
              50                  55                  60                  
          Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val 
                          85                  90                  95      
          Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu 
                  115                 120                 125             
          Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val 
                          165                 170                 175     
          Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Leu Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys 
                  195                 200                 205             
          Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp 
              210                 215                 220                 
          Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn 
                          245                 250                 255     
          Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn 
                  275                 280                 285             
          Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 
              290                 295                 300 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  279]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 
                  275                 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  156]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile 
                      100                 105                 110         
          Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Val Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro 
                      20                  25                  30          
          Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val 
                  35                  40                  45              
          Asn Val Gly Gln Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys 
              50                  55                  60                  
          His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val 
                          165                 170                 175     
          Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu 
                      180                 185                 190         
          Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala 
              210                 215                 220                 
          Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn 
                          245                 250                 255     
          Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu 
                      260                 265                 270         
          Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Gly His His His His His His His His 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro 
                      20                  25                  30          
          Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val 
                  35                  40                  45              
          Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys 
              50                  55                  60                  
          His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val 
                          165                 170                 175     
          Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu 
                      180                 185                 190         
          Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala 
              210                 215                 220                 
          Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn 
                          245                 250                 255     
          Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu 
                      260                 265                 270         
          Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Gly His His His His His His His His 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  188]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro 
                      20                  25                  30          
          Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val 
                  35                  40                  45              
          Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys 
              50                  55                  60                  
          His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val 
                          165                 170                 175     
          Pro Thr Gly Gly His His His His His His His His 
                      180                 185             
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  188]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro 
                      20                  25                  30          
          Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val 
                  35                  40                  45              
          Asn Val Gly Gln Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys 
              50                  55                  60                  
          His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val 
                          165                 170                 175     
          Pro Thr Gly Gly His His His His His His His His 
                      180                 185             
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  241]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Met Ser Asn Lys Asn Val Asn Val Arg Lys Ser Gln Glu Ile Thr Phe 
          1               5                   10                  15      
          Cys Leu Leu Ala Gly Ile Leu Met Phe Met Ala Met Met Val Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Glu Ala Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro 
                  35                  40                  45              
          Ala Gly Gln Lys Gln Val Gln Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn 
              50                  55                  60                  
          Ser Thr Tyr Leu Ile Gln Ser Trp Val Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Gly Arg Phe Ile Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Met Lys Gly Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Asn Thr Leu Arg Ile Leu Asp Ala Thr Asn Asn Gln Leu Pro 
                      100                 105                 110         
          Gln Asp Arg Glu Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala Ile Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Met Asp Lys Ser Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gln Leu Ala Ile Ile 
              130                 135                 140                 
          Ser Arg Ile Lys Leu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Gln Ala Ala Glu Lys Leu Arg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Ile Asn Pro Thr Pro Tyr Tyr Leu Thr Val Thr Glu Leu Asn 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Thr Arg Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro Pro Met Gly Glu 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Val Lys Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn Ile Thr Tyr Arg 
              210                 215                 220                 
          Thr Ile Asn Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met 
          225                 230                 235                 240 
          Glu 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Asp Asn Lys Gln 
          1               
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gly Gly Ser Ser Gly Gly 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Ala Trp Ser 
                      20      
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Val Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly 
                      20  
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  279]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 
                  275                 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          His His His His His His His His 
                      20                  
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser Thr Gly 
                      20  
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  279]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 
                  275                 
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          His His His His His His His His 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  168]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          His His His His His His His His 
                          165             
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  279]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 
                  275                 
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  279]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ala Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Asn Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 
                  275                 
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  325]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Glu Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Glu Gln Val Thr Lys Pro Gln Val Gln Gln Thr Glu Asp Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Gln 
                          245                 250                 255     
          Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Leu 
                      260                 265                 270         
          Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Asn Ala Lys 
                          325 
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Asp Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
          Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Asn Tyr Asn Ala Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Lys Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Asp Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
          Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Asn Tyr Asn Ser Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Glu Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
          Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Asn Tyr Asn Ala Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln 
                          245                 250                 255     
          Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp 
                      260                 265                 270         
          Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu 
                          325         
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  378]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr 
                          165                 170                 175     
          Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp 
              210                 215                 220                 
          Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val 
              290                 295                 300                 
          Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly 
                          325                 330                 335     
          Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala 
                      340                 345                 350         
          Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu 
                  355                 360                 365             
          Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val 
              370                 375             
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          gaagcaaacc gtacgcgtaa ag                                                22
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          cgaccagctc ttacacggcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac                                 36
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          ataattgacg atccggttgc c                                                 21
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          gctatttacg ccctgattgt cttttgt                                           27
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          attgagaacc tgcgtaaacg gc                                                22
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          tgaagagcgg ttcagataac ttcc                                              24
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          cgatccggaa acctcctaca c                                                 21
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          gattattcgc gcaacgctaa acagat                                            26
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          tgatcattga cgatccggta gcc                                               23
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  70]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg       60
          tcggtatgga                                                              70
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  78]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg       60
          ctttacagct accgagct                                                     78
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg                                        30
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg                                        30
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Gly 
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly 
                      20              
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala 
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2)]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  207]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          Met Glu Gly Met Asp Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Pro Leu Leu Thr Val Arg Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Leu Ala Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Glu Leu Met Gly Val Gly Ala Leu Glu Ile Thr Leu Arg Thr 
                  35                  40                  45              
          Glu Lys Gly Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ser Gly Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Gly Ala Gly Thr Val Arg Ser Pro Lys Glu Ala Glu Ala Ala Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ser Pro Gly Leu Leu Glu Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Ala Ala Leu Ala Gln Ala Arg Gly Val Pro Tyr Leu Pro Gly Val Leu 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Pro Phe Gln Gly Val Arg Val Leu Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Tyr Ala Glu Val Phe Pro Glu Val Arg Phe Leu Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Glu His Leu Pro His Tyr Ala Ala Leu Pro Asn Leu Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Gly Ser Trp Leu Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ala Val Met Lys 
                      180                 185                 190         
          Lys Val Lys Ala Ala Lys Ala Leu Leu Ser Pro Gln Ala Pro Gly 
                  195                 200                 205         
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  156]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Glu Ala Ala Ile Arg Thr Leu Lys Ala Leu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Asp Glu Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Leu Val Arg Ala Ile Glu His Ala Ala Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Arg Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  156]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  209]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          Met Ser Thr Ile Asn Asn Gln Leu Lys Ala Leu Lys Val Ile Pro Val 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu 
                      20                  25                  30          
          Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Gly Ala Thr Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn 
                      100                 105                 110         
          Asn Pro Ser Thr Val Glu Ala Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Pro Ser Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Thr Asn Gly Glu 
                      180                 185                 190         
          Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn 
                  195                 200                 205             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Gly Ile Glu Pro Ser Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe 
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Ala Glu His His Arg 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  205]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ala Ala Met Ala Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  177]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Met Phe Thr Lys Ser Gly Asp Asp Gly Asn Thr Asn Val Ile Asn Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Val Gly Lys Asp Ser Pro Leu Val Asn Phe Leu Gly Asp Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Glu Leu Asn Ser Phe Ile Gly Phe Ala Ile Ser Lys Ile Pro Trp Glu 
                  35                  40                  45              
          Asp Met Lys Lys Asp Leu Glu Arg Val Gln Val Glu Leu Phe Glu Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Glu Asp Leu Ser Thr Gln Ser Ser Lys Lys Lys Ile Asp Glu Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Val Leu Trp Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Arg Ile Glu Ser 
                          85                  90                  95      
          Gly Pro Val Lys Leu Phe Val Ile Pro Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ser 
                      100                 105                 110         
          Val Leu His Val Thr Arg Ser Val Ala Arg Arg Val Glu Arg Asn Ala 
                  115                 120                 125             
          Val Lys Tyr Thr Lys Glu Leu Pro Glu Ile Asn Arg Met Ile Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Tyr Leu Asn Arg Leu Ser Ser Leu Leu Phe Ala Met Ala Leu Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Lys Arg Arg Asn Gln Ser Glu Lys Ile Tyr Glu Ile Gly Lys Ser 
                          165                 170                 175     
          Trp 
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Gln Cys Val Arg Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Ser Ser Arg Glu His His Glu 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Arg Glu His Phe Met Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Thr Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  201]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Met Gly His Thr Lys Gly Pro Thr Pro Gln Gln His Asp Gly Ser Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Arg Ile Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Ile Ile Met 
                      20                  25                  30          
          Pro Leu Leu Ile Gly Thr Ile Ala Lys Leu Leu Glu Cys Gly Val Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Ser Asn Ile Val Val Gln Ser Val Pro Gly Ser Trp Glu Leu Pro 
              50                  55                  60                  
          Ile Ala Val Gln Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Gln Leu Gln Thr Pro Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Gly Pro Ser Leu Ser Ala Gly Asp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Thr 
                          85                  90                  95      
          Asp Leu Thr Ala Leu Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ser Thr Gly Pro Phe 
                      100                 105                 110         
          Asp Ala Leu Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Glu Thr Met His 
                  115                 120                 125             
          Phe Glu Tyr Ile Ala Asp Ser Val Ser His Gly Leu Met Arg Val Gln 
              130                 135                 140                 
          Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Val Leu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Asp Gln Ala Lys Ala Arg Ala Gly Val Ile Glu Gly Ser His Asn 
                          165                 170                 175     
          His Gly Glu Asp Trp Gly Leu Ala Ala Val Glu Met Gly Val Arg Arg 
                      180                 185                 190         
          Arg Asp Trp Ala Ala Gly Lys Thr Glu 
                  195                 200     
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  237]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Met Tyr Glu Val Asp His Ala Asp Val Tyr Asp Leu Phe Tyr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ser Asp Ile Ala Asp Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Ser Arg Thr Pro Glu Ala Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Thr His Leu Glu His Phe Thr Lys Glu Phe Gly Asp Thr Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Leu Glu Leu Ser Glu Asp Met Leu Thr His Ala Arg Lys Arg Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Asp Ala Thr Leu His Gln Gly Asp Met Arg Asp Phe Gln Leu Gly 
                          85                  90                  95      
          Arg Lys Phe Ser Ala Val Val Ser Met Phe Ser Ser Val Gly Tyr Leu 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Ala Val Ala Ser Phe Ala Glu His 
                  115                 120                 125             
          Leu Glu Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu 
              130                 135                 140                 
          Thr Phe Ala Asp Gly Trp Val Ser Ala Asp Val Val Arg Arg Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Thr Val Ala Arg Val Ser His Ser Val Arg Glu Gly Asn Ala Thr 
                          165                 170                 175     
          Arg Met Glu Val His Phe Thr Val Ala Asp Pro Gly Lys Gly Val Arg 
                      180                 185                 190         
          His Phe Ser Asp Val His Leu Ile Thr Leu Phe His Gln Arg Glu Tyr 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Ala Phe Met Ala Ala Gly Leu Arg Val Glu Tyr Leu Glu Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Pro Ala 
          225                 230                 235         
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  138]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Met Gly Met Lys Glu Lys Phe Val Leu Ile Ile Thr His Gly Asp Phe 
          1               5                   10                  15      
          Gly Lys Gly Leu Leu Ser Gly Ala Glu Val Ile Ile Gly Lys Gln Glu 
                      20                  25                  30          
          Asn Val His Thr Val Gly Leu Asn Leu Gly Asp Asn Ile Glu Lys Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Lys Glu Val Met Arg Ile Ile Ile Ala Lys Leu Ala Glu Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Ile Ile Ile Val Val Asp Leu Phe Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Glu Met Met Lys Thr Phe Asp Val Lys Val Ile Thr Gly Ile 
                          85                  90                  95      
          Asn Met Pro Met Leu Val Glu Leu Leu Thr Ser Ile Asn Val Tyr Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ser Lys Ile Gly Lys Asp Gly Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Ile Glu Lys Ser Ser Leu Lys Met 
              130                 135             
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  154]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Met Lys Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Asn Leu Glu Ile Ile Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ile Lys Arg 
                      20                  25                  30          
          Leu Gln Glu Phe Gly Val Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val 
                  35                  40                  45              
          Pro Gly Ser Phe Glu Leu Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys 
              50                  55                  60                  
          Gln Lys Arg Leu Gly Lys Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ile Lys Gly Ser Thr Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Thr His Gln Leu Met Lys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile 
                      100                 105                 110         
          Phe Gly Val Leu Thr Cys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala 
                  115                 120                 125             
          Gly Leu Ile Glu Gly Lys Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Val Glu Met Ala Thr Lys Phe Asn 
          145                 150                 
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  164]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Met Ala Val Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Lys Tyr Asp Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp Asn Arg Lys Ile Ile 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Gly Val 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro Gly Ser Phe Glu Leu 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln Lys Arg Leu Gly Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr His Gln Leu Met Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly Leu Ile Glu Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Lys Phe Asn 
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  175]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Met Gly Ala Asn Trp Tyr Leu Asp Asn Glu Ser Ser Arg Leu Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ser Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ala Glu Val His Arg Phe Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Leu His Gly Lys Val Asp Pro Lys Gly Leu Ala Glu Val Glu Val Glu 
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Ser Ile Ser Thr Gly Ile Pro Leu Arg Asp Met Leu Leu Arg 
              50                  55                  60                  
          Val Leu Val Phe Gln Val Ser Lys Phe Pro Val Ala Gln Ile Asn Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Asp Met Arg Pro Ile Asn Asn Leu Ala Pro Gly Ala Gln Leu 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Arg Leu Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg Gly Lys Ser His Ser 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ala Thr Arg Leu Asp Glu Arg Arg Phe Gln 
                  115                 120                 125             
          Val Val Thr Leu Glu Pro Leu Val Ile His Ala Gln Asp Phe Asp Met 
              130                 135                 140                 
          Val Arg Ala Phe Asn Ala Leu Arg Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Ser Val Pro Val Gly Ala Val Leu Ile Phe Thr Ala Arg 
                          165                 170                 175 
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  208]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Met Thr Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Ser Ala Ile Lys Ala Leu Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ile Ile Leu Ala Glu Ala Asp Leu Arg His Ile Pro Gln Asp Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Arg Leu Ala Val Arg Val Ile His Ala Cys Gly Met Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Asn Asp Leu Ala Phe Ser Glu Gly Ala Gly Lys Ala Gly Arg Asn 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Leu Ala Gly Ala Pro Ile Leu Cys Asp Ala Arg Met Val Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Gly Ile Thr Arg Ser Arg Leu Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Ser Asp Pro Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Gly Asn 
                      100                 105                 110         
          Thr Arg Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Trp Leu Pro His Ile Glu Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Ile Val Ala Ile Gly Asn Ala Pro Thr Ala Leu Phe Arg Leu Phe 
              130                 135                 140                 
          Glu Leu Leu Asp Ala Gly Ala Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ile Gly Met 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Gly Phe Val Gly Ala Ala Glu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Arg Gly Val Pro Tyr Val Ile Val Arg Gly Arg Arg Gly Gly 
                      180                 185                 190         
          Ser Ala Met Thr Ala Ala Ala Val Asn Ala Leu Ala Ser Glu Arg Glu 
                  195                 200                 205             
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  128]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Met Ile Thr Val Phe Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ala Pro Arg Arg Glu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Ala Glu Val Ile Tyr Ser Ser Leu His Leu Gly Leu Asp Ile 
                      20                  25                  30          
          Pro Lys Gly Lys His Ala Ile Arg Phe Leu Cys Leu Glu Lys Glu Asp 
                  35                  40                  45              
          Phe Tyr Tyr Pro Phe Asp Arg Ser Asp Asp Tyr Thr Val Ile Glu Ile 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Met Ala Gly Arg Ser Glu Glu Thr Lys Met Leu Leu Ile Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Leu Phe Ile Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Ala His Asp 
                          85                  90                  95      
          Val Glu Ile Thr Ile Lys Glu Gln Pro Ala His Cys Trp Gly Phe Arg 
                      100                 105                 110         
          Gly Arg Thr Gly Asp Ser Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Val 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  235]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          Met Gly Ser Asp Leu Gln Lys Leu Gln Arg Phe Ser Thr Cys Asp Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Gly Leu Leu Asn Val Tyr Asn Ile Pro Thr Gly Gly Tyr Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Asn Leu Thr Ala Ile Ser Pro Pro Gln Asn Ser Ser Ile Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Thr Ala Tyr Thr Val Leu Phe Ala Pro Ile Asp Asp Pro Arg Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Tyr Ile Asp Ser Val Pro Pro Asn Ser Ile Leu Val Leu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Pro His Leu Gln Ser Gln Phe His Pro Phe Ile Lys Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Gln Ala Met Tyr Gly Gly Leu Met Ser Thr Arg Ala Gln Tyr Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ser Asn Gly Thr Val Val Phe Gly Arg Ile Arg Asp Val Asp Glu His 
                  115                 120                 125             
          Arg Thr Leu Asn His Pro Val Phe Ala Tyr Gly Val Gly Ser Cys Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Lys Ala Val Val Lys Ala Val Gly Thr Asn Val Gln Leu Lys Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Asp Gly Val Thr Gln Thr Ile Cys Pro Gly Asp Tyr Ile 
                          165                 170                 175     
          Ala Gly Asp Asn Asn Gly Ile Val Arg Ile Pro Val Gln Glu Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Ile Ser Lys Leu Val Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Ile Glu Val Asp Arg 
                  195                 200                 205             
          Leu Val Ser Glu Ala Ile Lys Asn Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Arg Arg Met Val Leu Lys Asp Tyr Ile 
          225                 230                 235 
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  162]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Met Ser Gly Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly Tyr Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Phe Leu Lys Met Thr Gly His Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Ile Asp Cys Gly Ala Leu Arg Tyr Asp Ala Asp Asp Asp Tyr Pro Ala 
                  35                  40                  45              
          Phe Cys Ile Ala Ala Ala Thr Arg Thr Val Ala Asp Pro Gly Ser Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Ile Val Leu Gly Gly Ser Gly Asn Gly Glu Gln Ile Ala Ala Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Val Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Ala Trp Ser Val Gln Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Ala Arg Glu His Asn Asn Ala Gln Leu Ile Gly Ile Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Arg Met His Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Ile Val Lys Ala Phe Val 
                  115                 120                 125             
          Thr Thr Pro Trp Ser Lys Ala Gln Arg His Gln Arg Arg Ile Asp Ile 
              130                 135                 140                 
          Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Thr His Glu Ala Pro Pro Val Pro Gly Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala 
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Met Gly Asp Asp Ala Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Val Asp Glu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ser Gln Ile Gly Val Leu Leu Ala Glu Pro Leu Pro Asp Asp Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ile Gln His Asp Leu Phe Asp Leu Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Glu Leu Cys Ile Pro Gly His Ala Ala Ile Thr Glu Asp His Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Ala Leu Trp Leu Val His Tyr Asn Gly Gln Leu Pro Pro Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Phe Ile Leu Pro Gly Gly Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala His 
                          85                  90                  95      
          Val Cys Arg Thr Val Cys Arg Arg Ala Glu Arg Ser Ile Lys Ala Leu 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Ser Glu Pro Leu Asn Ile Ala Pro Ala Ala Tyr Val Asn Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ala Arg Val Leu Asn Arg Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Ala Asp Val Leu Trp Asp Arg Thr Arg Ala His 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          Met Ile Leu Ser Ala Glu Gln Ser Phe Thr Leu Arg His Pro His Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Ala Leu Ala Phe Val Arg Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Gln Arg Leu Arg Gly Leu Asp Ser Asp Gly Glu Gln Val Trp 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Leu Leu Val Arg Val Pro Leu Leu Gly Glu Val Asp Leu Pro 
              50                  55                  60                  
          Phe Arg Ser Glu Ile Val Arg Thr Pro Gln Gly Ala Glu Leu Arg Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Thr Leu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Val Ala Val Ser Gly Gln Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Ala Ala Glu Gly Gly Glu Met Ala Phe Ala Phe Gln Phe Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          His Leu Ala Thr Pro Glu Ala Glu Gly Glu Gly Gly Ala Ala Phe Glu 
                  115                 120                 125             
          Val Met Val Gln Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ala Ala Gly Leu Pro Pro Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  156]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Lys Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  209]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Met Asp Asp Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Leu Lys Val Ile Pro Val 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu 
                      20                  25                  30          
          Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Gly Ala Asp Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn 
                      100                 105                 110         
          Asn Pro Ser Thr Val Glu Gln Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Pro Asp Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Arg Asn Gly Glu 
                      180                 185                 190         
          Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn 
                  195                 200                 205             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  83]]>
          Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe 
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Glu Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Glu Asp His Ser Ala Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile His Phe Val Asp Leu Asp Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe 
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Glu His His Arg 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Glu Asp His Glu 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  205]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  205]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Glu Phe Val Glu Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Asp Val Cys Glu Trp Phe Asp Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Asp Ala Leu Val Glu Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Asp 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Glu Phe Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  205]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Asn Val Cys Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Lys Ala Leu Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Lys Phe Val Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Ala Asp Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  156]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (70)..(70)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為A或K]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Xaa Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  209]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為S或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為T或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (10)..(10)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為A或R]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (85)..(85)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為T或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (119)..(119)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為A或Q]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (163)..(163)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為S或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (189)..(189)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為T或R]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Met Xaa Xaa Ile Asn Asn Gln Leu Lys Xaa Leu Lys Val Ile Pro Val 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu 
                      20                  25                  30          
          Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Gly Ala Xaa Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn 
                      100                 105                 110         
          Asn Pro Ser Thr Val Glu Xaa Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Pro Xaa Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Xaa Asn Gly Glu 
                      180                 185                 190         
          Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn 
                  195                 200                 205             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (13)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為T或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (33)..(33)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為K或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (71)..(71)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為S或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (74)..(74)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (101)..(101)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為N或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (103)..(103)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為N或D]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Xaa Asp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Xaa Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Gly Ile Glu Pro Xaa Lys Asn Xaa Asp His Ser Ala Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile His Phe Val Xaa Leu Xaa Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe 
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (9)..(9)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Y或H]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (82)..(82)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為N或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (87)..(87)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (105)..(105)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為S或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (119)..(119)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (121)..(121)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (124)..(124)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為A或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (126)..(126)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為H或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (128)..(128)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (150)..(150)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為A或N]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Asp Ser Xaa Glu Xaa His Xaa 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Xaa Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  205]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (126)..(126)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為T或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (139)..(139)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Q或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (142)..(142)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為K或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (160)..(160)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為N或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (163)..(163)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為N或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (166)..(166)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為E或K]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (169)..(169)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為D或K]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (179)..(179)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為S、D或K]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (183)..(183)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為K或E]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (185)..(185)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為T、D或K]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (192)..(192)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為D或K]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (195)..(195)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為A、E或K]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (198)..(198)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為E或K]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (199)..(199)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為E或K]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Xaa Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Xaa Phe Val Xaa Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Xaa 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Xaa Val Cys Xaa Trp Phe Xaa Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Xaa Ala Leu Val Xaa Gly Xaa Pro Asp Glu Val Arg Glu Xaa 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Xaa Phe Val Xaa Xaa Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (9)..(9)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為Y或H]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (38)..(38)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為A或R]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (82)..(82)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為N或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (87)..(87)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (97)..(97)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為N或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (105)..(105)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為S、N或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (119)..(119)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R、E或N]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (121)..(121)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為R、E或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (122)..(122)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為K或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (124)..(124)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為K或D]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (126)..(126)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa為H或D]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ala Ala Met Xaa Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Xaa Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  142]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  99]]>
          taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt attgtacacg gccgcataat cgaaattaat       60
          acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta      120
          agtataagaa ggagatatac tt                                               142
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          taaagaagga gatatcat                                                     18
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          tgagaaggag atatcat                                                      17
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  365]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 
                      20                  25                  30          
          His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 
                  35                  40                  45              
          Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 
                      180                 185                 190         
          Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 
                  195                 200                 205             
          Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 
              210                 215                 220                 
          Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 
                          245                 250                 255     
          Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 
                      260                 265                 270         
          Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val 
              290                 295                 300                 
          Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg 
                          325                 330                 335     
          Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp 
                      340                 345                 350         
          Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala 
                  355                 360                 365 
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  62]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr 
                      20                  25                  30          
          Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala 
                  35                  40                  45              
          Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50                  55                  60          
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  574]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 
                  35                  40                  45              
          Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 
              50                  55                  60                  
          Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 
                          85                  90                  95      
          Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 
                  115                 120                 125             
          Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 
              130                 135                 140                 
          Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 
              210                 215                 220                 
          Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 
                      260                 265                 270         
          Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 
                  275                 280                 285             
          Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 
              290                 295                 300                 
          Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 
                          325                 330                 335     
          Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 
                  355                 360                 365             
          Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val 
              370                 375                 380                 
          Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 
                          405                 410                 415     
          Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 
                      420                 425                 430         
          Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 
                  435                 440                 445             
          Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 
              450                 455                 460                 
          Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 
                          485                 490                 495     
          Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 
                      500                 505                 510         
          Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 
                  515                 520                 525             
          Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 
                          565                 570                 
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  64]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類呼吸道融合病毒A (病毒株A2)]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn 
                      20                  25                  30          
          Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50                  55                  60                  
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  178]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 
                          85                  90                  95      
          Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 
                      100                 105                 110         
          Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 
                  115                 120                 125             
          Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 
                          165                 170                 175     
          Arg Asn 
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  57]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50                  55          
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  562]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2)]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp 
                      20                  25                  30          
          Thr Asn Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu 
                  35                  40                  45              
          Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp 
                      100                 105                 110         
          Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys 
                  115                 120                 125             
          Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly 
              130                 135                 140                 
          Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Met Val Trp Leu Thr Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly 
                          165                 170                 175     
          Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val 
                      180                 185                 190         
          His His Pro Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val 
                  195                 200                 205             
          Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu 
                          245                 250                 255     
          Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys 
                      260                 265                 270         
          Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys 
                  275                 280                 285             
          Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro 
              290                 295                 300                 
          Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly 
                      340                 345                 350         
          Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn 
                  355                 360                 365             
          Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala 
              370                 375                 380                 
          Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Arg Arg 
                          405                 410                 415     
          Leu Glu Asn Leu Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp 
                      420                 425                 430         
          Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu 
                  435                 440                 445             
          Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met 
              450                 455                 460                 
          Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe 
          465                 470                 475                 480 
          Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr 
                          485                 490                 495     
          Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala 
                  515                 520                 525             
          Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala 
              530                 535                 540                 
          Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Cys Ile 
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  A型流感病毒(病毒株A/日本/305/1957 H2N2)]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Phe 
          1               5                   10                  15      
          Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser 
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50                  
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  310]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly His His 
              290                 295                 300                 
          His His His His His His 
          305                 310 
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  168]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          His His His His His His His His 
                          165             
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  310]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly His His 
              290                 295                 300                 
          His His His His His His 
          305                 310 
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  168]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          His His His His His His His His 
                          165

Claims

一種組合物，其包含 (i)衍生自繖毛H (FimH)之多肽或其片段；及 (ii)一或多個綴合物，其中該綴合物包含共價結合至醣之載體蛋白質，該醣包含選自由以下組成之群的結構：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。
一種組合物，其包含衍生自繖毛抗原H (FimH)之多肽或其片段；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數， (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數， (e)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O8，其中 n為31至90之整數，及 (f)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O9，其中 n為31至90之整數。
如請求項2之組合物，其包含衍生自繖毛抗原H (FimH)之多肽或其片段；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數，及 (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數。
如請求項2或3之組合物，其進一步包含一或多個具有選自由式O15、式O16、式O17、式O18及式O75組成之群之醣的綴合物，其中 n為31至90之整數。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該載體蛋白質選自由以下組成之群：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (diphtheria toxin fragment B；DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(Diphtheria toxoid；DT)、破傷風類毒素(tetanus toxoid；TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (Exotoxin A of P. aeruginosa；EPA)、麥芽糖結合蛋白質(maltose binding protein；MBP)、金黃色葡萄球菌( S. aureus)之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(Cholera toxin B subunit；CTB)、肺炎鏈球菌溶血素( Streptococcus pneumoniaePneumolysin)及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌( C. jejuni) AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(Streptococcal C5a peptidase；SCP)或其變異體。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該多肽衍生自大腸桿菌繖毛H (FimH)。
如請求項6之組合物，其中該多肽包含SEQ ID NO: 2。
如請求項6之組合物，其中該多肽包含SEQ ID NO: 3。
如請求項6之組合物，其中該多肽包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的胺基酸：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113。
如請求項6之組合物，其中該多肽包含具有與由以下組成之群具有至少70%一致性之胺基酸序列的胺基酸：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113。
如請求項6之組合物，其中該多肽包含FimH之片段。
如請求項11之組合物，其中該多肽包含FimH之凝集素域。
如請求項6之組合物，其中該多肽係與FimC多肽或其片段複合。
如請求項6之組合物，其中該多肽藉由FimG之供體股肽(DsG)穩定化。
如請求項14之組合物，其中該多肽進一步包含連接子。
如請求項1至3中任一項之組合物，其進一步包含一或多個綴合物，其中該綴合物包含共價結合至選自O1及O2之肺炎克雷伯氏桿菌( K . pneumoniae) O-抗原之載體蛋白質。
一種組合物，其包含 (i)一或多個綴合物，其包含共價結合至選自由血清型O1亞型v1 (O1v1)、血清型O1亞型v2 (O1v2)、血清型O2亞型v1 (O2v1)及血清型O2亞型v2 (O2v2)組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原的載體蛋白質；及 (ii)一或多個綴合物，其中該綴合物包含共價結合至醣之載體蛋白質，該醣包含選自由以下組成之群的結構：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2；K13；K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。
如請求項17之組合物，其中該醣選自由式O25b、式O1A、式O2、式O6、式O8及式O9組成之群。
如請求項18之組合物，其中該醣選自由式O25b、式O1A、式O2及式O6組成之群。
一種組合物，其包含一或多個綴合物，該等綴合物包含共價結合至選自由血清型O1亞型v1 (O1v1)、血清型O1亞型v2 (O1v2)、血清型O2亞型v1 (O2v1)及血清型O2亞型v2 (O2v2)組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原的載體蛋白質；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數， (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數， (e)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O8，其中 n為31至90之整數，及 (f)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O9，其中 n為31至90之整數。
如請求項20之組合物，其包含(i)一或多個綴合物，其包含共價結合至選自由血清型O1亞型v1 (O1v1)、血清型O1亞型v2 (O1v2)、血清型O2亞型v1 (O2v1)及血清型O2亞型v2 (O2v2)組成之群之肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原的載體蛋白質；及 (a)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O25b，其中 n為31至90之整數， (b)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O1A，其中 n為31至90之整數， (c)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O2，其中 n為31至90之整數，及 (d)包含共價結合至醣之載體蛋白質的綴合物，該醣包含式O6，其中 n為31至90之整數。
如請求項20或21之組合物，其進一步包含一或多個具有選自由式O15、式O16、式O17、式O18及式O75組成之群之醣的綴合物，其中 n為31至90之整數。
如請求項17至21中任一項之組合物，其中該載體蛋白質選自由以下組成之群：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)或其變異體。
如請求項23之組合物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。
如請求項1至3及17至21中任一項之組合物，其進一步包含佐劑。
一種如請求項1至25中任一項之組合物的用途，其用於製造用以引發哺乳動物針對大腸桿菌之免疫反應的藥劑。
一種如請求項1至25中任一項之組合物的用途，其用於製造用以引發哺乳動物針對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的藥劑。
一種核酸，其包含編碼如請求項1至23中任一項之多肽的核苷酸。