TWI831394B

TWI831394B - 大腸桿菌組合物及其方法

Info

Publication number: TWI831394B
Application number: TW111136870A
Authority: TW
Inventors: 羅伯特ＧＫ唐納德; 安納麗莎西柏爾安德森; 勞倫特奧利佛丘洛; 建新顧; 金進煥; 斯林尼瓦斯柯達力; 傑森阿諾德洛特文; 賈斯汀凱斯摩蘭; 蕊潘; 阿瓦里克里續納普瑞沙; 馬克愛德華魯賓; 蘇德漢辛格; 玲朱; 史考特伊利斯隆博克; 凱倫清子高根; 尼旭斯莫常特; 偉陳
Original assignee: 美商輝瑞大藥廠
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2024-02-01

Abstract

在一個態樣中，本發明係關於一種免疫原性組合物，其包含衍生於大腸桿菌( E. coli)脂多醣之經修飾之O-多醣分子及其共軛物。多價疫苗可藉由組合針對不同大腸桿菌血清型之兩種或更多種一價免疫原性組合物來製備。在一個實施例中，該等經修飾之O-多醣分子係由包括wzz基因之重組細菌產生。

Description

大腸桿菌組合物及其方法

本發明係關於大腸桿菌( Escherichia coli)組合物及其方法。

革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)之細胞壁包括外膜及外膜內部上之肽聚糖層。外膜包括磷脂、脂多醣(LPS)、脂蛋白及膜蛋白。脂多醣存在於膜外層及其內層中之磷脂中。

LPS包括將核心寡醣與O-多醣聚合物連接之脂質A膜錨，該O-多醣聚合物含有形成短、長或極長O-鏈之重複的醣單體單元。儘管核心寡醣在個別細菌物種中為最保守的，但O-多醣可根據血清型不同而變化。

大腸桿菌( Escherichia coli/ E. coli)為一種已知會引起危及生命之細菌性敗血症之革蘭氏陰性細菌。莢膜(K)及脂多醣(LPS) O-抗原兩者均為重要的毒性因子。

人們對於使用O-多醣作為針對大腸桿菌之疫苗之基礎具有很大的興趣。然而，先前嘗試使用習知化學共軛或生物共軛方法研發大腸桿菌糖共軛物疫苗未能產生針對所有血清型之穩固的功能免疫反應。因此，迫切需要產生穩固的功能免疫反應之針對大腸桿菌的免疫原性組合物。

為了滿足此等及其他需要，本發明係關於用於引起針對大腸桿菌血清型之免疫反應之組合物及其使用方法。

在一個實施例中，本發明係關於醣、包含其之共軛物及組合物，其由已經工程改造以表現具有生物工藝發展之改良特性及較高密度之免疫原性抗原決定基的較長O-抗原脂多醣(LPS)的大腸桿菌菌株產生。舉例而言，在一個實施例中，大腸桿菌菌株經工程改造以自高複本質體表現腸沙門氏菌( Salmonella enterica) fepE基因，此使得在不同O-抗原血清型之大腸桿菌菌株中產生長鏈LPS。

初始菌株研發聚焦於血清型O25b之O-抗原，其與難以治療相關聯，出現多重抗性分離物。自臨床大腸桿菌O25b菌株缺失 wzzB基因。在用沙門氏菌 fepE質體轉化之後，現在工程改造大腸桿菌O25b菌株僅僅產生長鏈LPS。在用乙酸化學提取以自細菌表面釋放O-抗原之後，所得長鏈O25b多醣適合於習知純化及共軛技術。不同於經由生物共軛產生之O-抗原，此等較長鏈O-抗原保留內部及外部核心寡醣，該等寡醣獨立地具有引發均為殺細菌性且能夠阻斷敗血症之功能抗體的潛能。例示性O25b糖共軛物在哺乳動物中出人意料地比未共軛多醣顯著地更具免疫原性。

因此，在一個態樣中，本發明係關於一種醣，其包括相較於大腸桿菌之對應野生型O-多醣增加至少5個重複單元。

在一個實施例中，該組合物包括選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至1000之整數。參見表1及圖9A-圖9C及圖10A-圖10B。

如本文所用，除非另外明確說明，否則術語「其中 n為」係指式中之選自該組之「 n」。在一個實施例中，該組合物包括選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至1000之整數。參見表1及圖9A-圖9C及圖10A-圖10B。

在一個實施例中，該組合物包括選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D ₁、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167及式O172，其中 n為1至1000之整數。參見表1及圖9A-圖9C及圖10A。

在一個實施例中，該組合物包括選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173及式62D ₁，其中 n為1至1000之整數。參見表1及圖9A-圖9C。

在一個實施例中，該組合物不包括選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101。在另一實施例中，該組合物包括選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101，其中 n為1至10之整數。參見表1及圖10B。

在一個實施例中，大腸桿菌為選自以下中之任一者之大腸桿菌血清型：O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O25b、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D ₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

在一個實施例中，大腸桿菌為選自由以下組成之群之大腸桿菌血清型：O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O25b、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D ₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

在一個實施例中，醣係藉由在革蘭氏陰性細菌中表現wzz家族蛋白質以產生該醣來產生。在一個實施例中，該醣係藉由增加由培養物中之革蘭氏陰性細菌產生之O-多醣的重複單元來產生，其包含在革蘭氏陰性細菌中表現(不一定過度表現) wzz家族蛋白質以產生該醣。在一較佳實施例中，該wzz家族蛋白質係選自以下中之任一者：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。在一較佳實施例中，所表現(不一定過度表現)之wzz家族蛋白質係選自由以下組成之群：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。在一替代實施例中，該醣係以合成方式合成。在一個實施例中，該醣與載體蛋白質共價結合(共軛)。較佳地，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括醣及/或其共軛物及醫藥學上可接受之稀釋劑。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於誘導個體之免疫反應之方法，其包括向該個體投與有效量之該組合物。在一個實施例中，該免疫反應包括誘導抗大腸桿菌O-特異性多醣抗體。

序列識別符

SEQ ID NO: 1闡述表4中描述之LT2wzzB_S之引子序列。

SEQ ID NO: 2闡述表4中描述之LT2wzzB_AS之引子序列。

SEQ ID NO: 3闡述表4中描述之O25bFepE_S之引子序列。

SEQ ID NO: 4闡述表4中描述之O25bFepE_A之引子序列。

SEQ ID NO: 5闡述表4中描述之wzzB P1_S之引子序列。

SEQ ID NO: 6闡述表4中描述之wzzB P2_AS之引子序列。

SEQ ID NO: 7闡述表4中描述之wzzB P3_S之引子序列。

SEQ ID NO: 8闡述表4中描述之wzzB P4_AS之引子序列。

SEQ ID NO: 9闡述表4中描述之O157 FepE_S之引子序列。

SEQ ID NO: 10闡述表4中描述之O157 FepE_AS之引子序列。

SEQ ID NO: 11闡述表4中描述之pBAD33_adaptor_S之引子序列。

SEQ ID NO: 12闡述表4中描述之pBAD33_adaptor_AS之引子序列。

SEQ ID NO: 13闡述表4中描述之JUMPSTART_r之引子序列。

SEQ ID NO: 14闡述表4中描述之gnd_f之引子序列。

SEQ ID NO: 15闡述顯示於圖 5中之O25b 2401 FepE胺基酸序列。

SEQ ID NO: 16闡述顯示於圖 5中之O25a:K5:H1 FepE胺基酸序列。

SEQ ID NO: 17闡述顯示於圖 5中之O25a ETEC ATCC FepE胺基酸序列。

SEQ ID NO: 18闡述顯示於圖 5中之O157 FepE胺基酸序列。

SEQ ID NO: 19闡述顯示於圖 5中之沙門氏菌LT2 FepE胺基酸序列。

SEQ ID NO: 20闡述顯示於圖 2中之O25b 2401 WzzB胺基酸序列。

SEQ ID NO: 21闡述顯示於圖 2中之O25a:K5:H1 WzzB胺基酸序列。

SEQ ID NO: 22闡述顯示於圖 2中之O25a ETEC ATCC WzzB胺基酸序列。

SEQ ID NO: 23闡述顯示於圖 2中之K12 W3110 WzzB胺基酸序列。

SEQ ID NO: 24闡述顯示於圖 2中之沙門氏菌LT2 WzzB胺基酸序列。

相關申請案之交叉參考本申請案主張以下各者之優先權：2018年8月24日申請之美國臨時申請案第62/722,370號、2018年12月26日申請之美國臨時申請案第62/784,940號及2019年7月31日申請之美國臨時申請案第62/881,361號，其中之每一者以全文引用之方式併入。

本發明人出人意料地發現，由工程改造不同Wzz蛋白(例如WzzB)產生之大腸桿菌抗原，包括出人意料發現免疫原性共軛物及其使用方法。本發明人進一步出人意料地發現含有諸如經由二價異雙官能連接子(在本文中被稱作(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基)與載體蛋白質共價共軛之此類醣之糖共軛物。本發明人亦出人意料地發現含有諸如經由還原胺化(RAC)與載體蛋白質共軛之醣之糖共軛物。特定言之，在非質子性溶劑中，較佳地在DMSO (RAC/DMSO)中或在水溶液中進行RAC。本發明進一步係關於包含此類糖共軛物之免疫原性組合物，及使用此類糖共軛物及免疫原性組合物之方法。另外，本發明人出人意料地發現，在一些實施例中，相較於具有相對短O-抗原鏈之糖共軛物，具有中等或長O-抗原鏈之含有高分子量醣之糖共軛物可更具免疫原性。此外，本發明人發現，在一些實施例中，藉由在與載體蛋白質共軛之前諸如藉由包含RAC或單端共軛或eTEC之方法而多端活化醣所產生之糖共軛物，可比藉由在與載體蛋白質共軛之前單端活化醣所產生的糖共軛物更具免疫原性。

在一個實施例中，藉由表現(不一定過度表現)不同Wzz蛋白(例如WzzB)以控制醣之大小，來產生醣。

如本文所用，術語「醣」係指單一糖部分或單醣單元，以及經共價連接以形成雙醣、寡醣及多醣之之兩個或更多個單一糖部分或單醣單元的組合。醣可為直鏈或分支鏈。

在一個實施例中，在重組革蘭氏陰性細菌中產生醣。在一個實施例中，在重組大腸桿菌細胞中產生醣。在一個實施例中，在重組沙門氏菌細胞中產生醣。例示性細菌包括大腸桿菌O25K5H1、大腸桿菌BD559、大腸桿菌GAR2831、大腸桿菌GAR865、大腸桿菌GAR868、大腸桿菌GAR869、大腸桿菌GAR872、大腸桿菌GAR878、大腸桿菌GAR896、大腸桿菌GAR1902、大腸桿菌O25a ETC NR-5、大腸桿菌O157:H7:K-、腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒(Typhimurium)菌株LT2、大腸桿菌GAR2401、腸沙門氏菌血清型腸炎(Enteritidis)CVD 1943、腸沙門氏菌血清型鼠傷寒CVD 1925、腸沙門氏菌血清型副傷寒(Paratyphi)A CVD 1902及弗氏志賀菌( Shigella flexneri) CVD 1208S。在一個實施例中，細菌不為大腸桿菌GAR2401。此針對醣產生之遺傳學方法允許有效產生作為疫苗組分之O-多醣及O-抗原分子。

如本文所用，術語「wzz蛋白」係指鏈長決定子多肽，諸如wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzzl及wzz2。例示性wzz基因序列之GenBank寄存編號為：對於E4991/76，AF011910；對於F186，AF011911，對於M70/1-1，AF011912；對於79/311，AF011913；對於Bi7509-41，AF011914；對於C664-1992，AF011915；對於C258-94，AF011916；對於C722-89，AF011917；及對於EDL933，AF011919。G7及Bi316-41 wzz基因序列之GenBank寄存編號分別為U39305及U39306。例示性wzz基因序列之其他GenBank寄存編號為：對於腸沙門氏菌亞種腸道血清變型鼠傷寒菌株LT2 FepE，NP_459581；對於大腸桿菌O157:H7菌株EDL933 FepE，AIG66859；對於腸沙門氏菌亞種腸道血清變型鼠傷寒菌株LT2 WzzB，NP_461024；對於大腸桿菌K-12亞種菌株MG1655 WzzB，NP_416531；對於大腸桿菌K-12亞種菌株MG1655 FepE，NP_415119。在較佳實施例中，wzz家族蛋白質為以下中之任一者：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2，最佳地wzzB，更佳地fepE。

例示性wzzB序列包括：＞O25b 2401 WzzB ＞O25a:K5:H1 WzzB ＞O25a ETEC ATCC WzzB ＞K12 W3110 WzzB ＞沙門氏菌LT2 WzzB

例示性FepE序列包括：＞O25b GAR2401 FepE ＞O25a:K5:H1 FepE ＞ O25a ETEC ATCC FepE ＞ O157 FepE ＞沙門氏菌LT2 FepE

在一些實施例中，經修飾醣(相較於對應野生型醣經修飾)可藉由以下來產生：在革蘭氏陰性細菌中自革蘭氏陰性細菌表現(不一定過度表現)wzz家族蛋白質(例如fepE)，及/或藉由斷開(亦即抑制、缺失、移除)第二wzz基因(例如wzzB)以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣，諸如脂多醣。舉例而言，經修飾醣可藉由表現(不一定過度表現) wzz2且斷開wzzl來產生。或在替代例中，經修飾醣可藉由表現(不一定過度表現) wzzfepE且斷開wzzB來產生。在另一實施例中，經修飾醣可藉由表現(不一定過度表現) wzzB但斷開wzzfepE來產生。在另一實施例中，經修飾醣可藉由表現fepE來產生。較佳地，wzz家族蛋白質係來源於對於宿主細胞而言異源的菌株。

在一些實施例中，醣係藉由表現具有與以下中之任一者具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的wzz家族蛋白質來產生：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。在一個實施例中，wzz家族蛋白質包括選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。較佳地，wzz家族蛋白質與以下各者具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，醣係藉由表現具有與fepE蛋白具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質來產生。

在一個態樣中，本發明係關於藉由在革蘭氏陰性細菌中表現wzz家族蛋白質(較佳地fepE)以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣所產生的醣，該等醣相較於對應野生型O-多醣增加至少1、2、3、4或5個重複單元。在一個態樣中，本發明係關於由培養物中之革蘭氏陰性細菌所產生之醣，該等培養物自革蘭氏陰性細菌表現(不一定過度表現) wzz家族蛋白質(例如wzzB)以產生含有中等或長O-抗原鏈的高分子量醣，該等醣相較於對應野生型O-抗原增加至少1、2、3、4或5個重複單元。對於相較於對應野生型醣具有增加數目之重複單元之額外例示性醣，參見下文O-多醣及O-抗原之描述。所需鏈長為在給予疫苗構築體之情形下產生改良或最大免疫原性之鏈長。

在另一實施例中，醣包括選自表1之任一式，其中醣中之重複單元數目 n比對應野生型O-多醣中之重複單元數目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元。較佳地，醣相較於對應野生型O-多醣包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元之增加。參見例如表 21。測定醣長度之方法為此項技術中已知的。此類方法包括核磁共振、質譜分析及尺寸排阻層析，如實例5中所描述。

在一較佳實施例中，本發明係關於一種在重組大腸桿菌宿主細胞中產生之醣，其中將內源性wzz O-抗原長度調節劑(例如wzzB)之基因缺失且經來自對於重組大腸桿菌宿主細胞而言異源之革蘭氏陰性細菌之(第二) wzz基因(例如沙門氏菌fepE)置換，以產生含有中等或長O-抗原鏈的高分子量醣，諸如脂多醣。在一些實施例中，重組大腸桿菌宿主細胞包括來自沙門氏菌，較佳地來自腸沙門氏菌之wzz基因。

在一個實施例中，宿主細胞包括wzz家族蛋白質之異源基因作為穩定維持的質體載體。在另一實施例中，宿主細胞包括wzz家族蛋白質之異源基因作為宿主細胞之染色體DNA中之經整合基因。在大腸桿菌宿主細胞中穩定地表現質體載體之方法及將異源基因整合至大腸桿菌宿主細胞之染色體中之方法為此項技術中已知的。在一個實施例中，宿主細胞包括O-抗原之異源基因作為穩定維持的質體載體。在另一實施例中，宿主細胞包括O-抗原之異源基因作為宿主細胞之染色體DNA中之經整合基因。在大腸桿菌宿主細胞及沙門氏菌宿主細胞中穩定地表現質體載體之方法為此項技術中已知的。將異源基因整合至大腸桿菌宿主細胞及沙門氏菌宿主細胞之染色體中之方法為此項技術中已知的。

在一個態樣中，在包含碳源之培養基中培養重組宿主細胞。用於培養大腸桿菌之碳源為此項技術中已知的。例示性碳源包括糖醇、多元醇、醇醛糖或酮糖，包括(但不限於)阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸酯、丁二酸酯及甲基胺。在一較佳實施例中，培養基包括葡萄糖。在一些實施例中，培養基包括多元醇或醇醛糖作為碳源，例如甘露醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨糖醇、乳糖及阿拉伯糖。可在開始培養之前，向培養基中添加全部碳源，或其可在培養期間逐步地或連續添加。

用於重組宿主細胞之例示性培養基包括選自以下中之任一者之成分(element)：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。較佳地，培養基包括KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。

本文所用之培養基可為固體或液體，合成(亦即，人造)或天然的，且可包括用於培養重組宿主細胞之足夠的營養物質。較佳地，培養基為液體培養基。

在一些實施例中，培養基可進一步包括適合的無機鹽。在一些實施例中，培養基可進一步包括微量營養物質。在一些實施例中，培養基可進一步包括生長因子。在一些實施例中，培養基可進一步包括額外碳源。在一些實施例中，培養基可進一步包括適合的無機鹽、微量營養物質、生長因子及補充碳源。適合於培養大腸桿菌之無機鹽、微量營養物質、生長因子及補充碳源為此項技術中已知的。

在一些實施例中，培養基可視需要包括額外組分，諸如蛋白腖、N-Z胺、酶促大豆水解產物、額外酵母提取物、麥芽提取物、補充碳源及多種維生素。在一些實施例中，培養基不包括此類額外組分，諸如蛋白腖、N-Z胺、酶促大豆水解產物、額外酵母提取物、麥芽提取物、補充碳源及多種維生素。

適合的補充碳源之說明性實例包括(但不限於)其他碳水化合物，諸如葡萄糖、果糖、甘露醇、澱粉或澱粉水解產物、纖維素水解產物及糖蜜；有機酸，諸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸及反丁烯二酸；及醇類，諸如甘油、肌醇、甘露醇及山梨糖醇。

在一些實施例中，培養基進一步包括氮源。適合於培養大腸桿菌之氮源為此項技術中已知的。適合的氮源之說明性實例包括(但不限於)氨，包括氨氣及氨水；無機酸或有機酸之銨鹽，諸如氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、硫酸銨及乙酸銨；脲；硝酸鹽或亞硝酸鹽及其他含氮材料，包括呈純或粗製劑形式之胺基酸、肉提取物、蛋白腖、魚粉、魚水解產物、玉米漿、酪蛋白水解產物、大豆餅水解產物、酵母提取物、乾燥的酵母、乙醇-酵母餾出物、大豆粉、棉籽粉及其類似者。

在一些實施例中，培養基包括無機鹽。適合的無機鹽之說明性實例包括(但不限於)鉀、鈣、鈉、鎂、錳、鐵、鈷、鋅、銅、鉬、鎢及其他微量元素之鹽，及磷酸鹽。

在一些實施例中，培養基包括適當生長因子。適當微量營養物質、生長因子及其類似者之說明性實例包括(但不限於)輔酶A、泛酸、吡哆醇-HCl、生物素、硫胺素、核黃素、黃素單核苷酸、黃素腺二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、葉酸、維生素B ₁₂、其他維生素、胺基酸(諸如半胱胺酸及羥脯胺酸)、鹼基(諸如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶)、硫代硫酸鈉、對胺基苯甲酸或r-胺基苯甲酸、菸鹼醯胺、乙酸亞硝酸鹽及其類似者，其呈純或部分純化的化學化合物形式或在天然材料中存在。量可由熟習此項技術者根據此項技術中已知之方法及技術憑經驗測定。

在另一實施例中，本文所描述之經修飾醣(相較於對應野生型醣)以合成方式例如活體外產生。合成產量或醣之合成可有助於避免成本及時間密集型生產工藝。在一個實施例中，醣以合成方式合成自受適當保護的單醣中間物，諸如藉由使用依序糖基化策略或依序糖基化與[3+2]塊合成策略之組合。舉例而言，硫苷及糖基三氯乙醯亞胺酯衍生物可用作糖基化中之糖基供體。在一個實施例中，以合成方式活體外合成之醣與藉由重組手段，諸如藉由操縱上文所描述之wzz家族蛋白質所產生之醣具有一致結構。

(藉由重組或合成手段)所產生之醣包括來源於包括(例如)以下大腸桿菌血清型中之任一者之任何大腸桿菌血清型之結構：O1 (例如O1A、O1B及O1C)、O2、O3、O4 (例如O4:K52及O4:K6)、O5 (例如O5ab及O5ac (菌株180/C3))、O6 (例如O6:K2; K13; K15及O6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18 (例如O18A、O18ac、O18A1、O18B及O18B1)、O19、O20、O21、O22、O23 (例如O23A)、O24、O25 (例如O25a及O25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45 (例如O45及O45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D ₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73 (例如O73 (菌株73-1))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

個別多醣通常經由此項技術中已知之方法來純化(相對於多醣-蛋白質共軛物之量增濃)，該等方法諸如滲析、濃縮操作、透濾操作、切向流過濾、沈澱、溶離、離心、超過濾、深度過濾及/或管柱層析(離子交換層析、多模式離子交換層析、DEAE及疏水相互作用層析)。較佳地，多醣經由包括切向流過濾之方法來純化。

經純化多醣可進行活化(例如化學活化)以使其能夠反應(例如直接與載體蛋白質反應或經由諸如eTEC間隔基之連接子)，且隨後併入本發明之糖共軛物中，如本文進一步描述。

在一個較佳實施例中，本發明之醣係來源於大腸桿菌血清型，其中血清型為O25a。在另一較佳實施例中，血清型為O25b。在另一較佳實施例中，血清型為O1A。在另一較佳實施例中，血清型為O2。在另一較佳實施例中，血清型為O6。在另一較佳實施例中，血清型為O17。在另一較佳實施例中，血清型為O15。在另一較佳實施例中，血清型為O18A。在另一較佳實施例中，血清型為O75。在另一較佳實施例中，血清型為O4。在另一較佳實施例中，血清型為O16。在另一較佳實施例中，血清型為O13。在另一較佳實施例中，血清型為O7。在另一較佳實施例中，血清型為O8。在另一較佳實施例中，血清型為O9。

如本文所用，提及上文所列之血清型中之任一者，係指涵蓋此項技術中已知之重複單元結構(O-單元，如下文所描述)且對於對應血清型特有的血清型。舉例而言，術語「O25a」血清型(在此項技術中亦稱為血清型「O25」)係指涵蓋表1中所顯示之式O25之血清型。作為另一實例，術語「O25b」血清型係指涵蓋表1中所顯示之式O25b之血清型。

如本文所用，除非另外規定，否則血清型在本文中為一般提及的，例如術語式「O18」一般係指涵蓋式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B及式O18B1。

如本文所用，術語「O1」一般係指根據表1涵蓋在式名稱中包括通用術語「O1」之式物種，諸如式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C中之任一者，其中之每一者在表1中顯示。因此，「O1血清型」一般係指涵蓋式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C中之任一者之血清型。

如本文所用，術語「O6」一般係指根據表1在式名稱中包括通用術語「O6」之式物種，諸如式O6:K2；K13；K15；及O6:K54中之任一者，其中之每一者在表1中顯示。因此，「O6血清型」一般係指涵蓋式O6:K2；K13；K15；及O6:K54中之任一者之血清型。

一般係指根據表1在式名稱中包括通用術語之式物種之術語之其他實例包括：「O4」、「O5」、「O18」及「O45」。

如本文所用，術語「O2」係指表1中顯示之式O2。術語「O2 O-抗原」係指涵蓋表1中顯示之式O2之醣。

如本文所用，提及來自上文所列之血清型之O-抗原係指涵蓋用對應血清型名稱標記之式之醣。舉例而言，術語「O25B O-抗原」係指涵蓋表1中顯示之式O25B之醣。

作為另一實例，術語「O1 O-抗原」一般係指涵蓋包括術語「O1」，諸如式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C (其中之每一者在表1中顯示)之式的醣。

作為另一實例，術語「O6 O-抗原」一般係指涵蓋包括術語「O6」，諸如式O6:K2；式O6:K13；式O6:K15及式O6:K54 (其中之每一者在表1中顯示)之式的醣。

O- 多醣如本文所用，術語「O-多醣」係指包括O-抗原之任何結構，其限制條件為該結構不包括全細胞或脂質A。舉例而言，在一個實施例中，O-多醣包括脂多醣，其中未結合脂質A。移除脂質A之步驟為此項技術中已知的，且作為一實例，包括在添加酸之情況下進行熱處理。例示性程序包括在100℃下用1%乙酸處理90分鐘。將此程序與作為移除分離脂質A之程序組合。用於分離脂質A之例示性程序包括超速離心。

在一個實施例中，O-多醣係指由O-抗原組成之結構，在此情況下，O-多醣與術語O-抗原同義。在一個較佳實施例中，O-多醣係指包括O-抗原之重複單元而不具有核心醣之結構。因此，在一個實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌K12核心部分。在另一較佳實施例中，O-多醣係指包括O-抗原及核心醣之結構。在另一實施例中，O-多醣係指包括O-抗原、核心醣及KDO部分之結構。

自LPS純化出包括核心寡醣之O-多醣之方法為此項技術中已知的。舉例而言，在純化LPS之後，經純化LPS可藉由以下來進行水解：在100攝氏度下於1% (v/v)乙酸中加熱90分鐘，隨後在4攝氏度下於142,000 × g下超速離心5小時。將含有O-多醣之上清液冷凍乾燥且儲存在4攝氏度下。在某些實施例中，描述莢膜合成基因之缺失以使得能夠簡化O-多醣之純化。

O-多醣可藉由包括(但不限於)弱酸水解以自LPS移除脂質A之方法來進行分離。其他實施例可包括使用肼作為用於O-多醣製備之藥劑。LPS之製備可藉由此項技術中已知的方法來實現。

在某些實施例中，提供自表現(不一定過度表現) Wzz蛋白(例如wzzB)之野生型、經修飾或減毒革蘭氏陰性菌株純化之O-多醣，以用於共軛物疫苗中。在較佳實施例中，自表現(不一定過度表現) wzz蛋白用作呈共軛物或複合疫苗之疫苗抗原之革蘭氏陰性菌株純化出O-多醣鏈。

在一個實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加以下倍數之分子量：約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多倍。在一較佳實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加至少1倍且至多5倍之分子量。在另一實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加至少2倍且至多4倍之分子量。O-多醣之分子量相較於對應野生型O-多醣之增加較佳地與O-抗原重複單元之數目之增加相關。在一個實施例中，O-多醣之分子量之增加係由於wzz家族蛋白所致。

在一個實施例中，O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加以下之分子量：約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 kDa或更多。在一個實施例中，本發明之O-多醣具有相較於對應野生型O-多醣增加至少1 kDa且至多200 kDa之分子量。在一個實施例中，分子量增加至少5 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少18 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少21 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少22 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少30 kDa且至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少1 kDa且至多100 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少5 kDa且至多100 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多100 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12 kDa且至多100 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15 kDa且至多100 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多100 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少1 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少5 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少18 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少30 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多90 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12 kDa且至多85 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多75 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多70 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多60 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多50 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多49 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多48 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多47 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10 kDa且至多46 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多45 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多44 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多43 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多42 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20 kDa且至多41 kDa。O-多醣之分子量相較於對應野生型O-多醣之此種增加較佳地與O-抗原重複單元之數目之增加相關。在一個實施例中，O-多醣之分子量之增加係由於wzz家族蛋白所致。參見例如表 21。

在另一實施例中，O-多醣包括選自表1之任一式，其中O-多醣中之重複單元數目 n比對應野生型O-多醣中之重複單元數目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元。較佳地，醣相較於對應野生型O-多醣包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元之增加。參見例如表 21。

O- 抗原O-抗原為革蘭氏陰性細菌外膜中之脂多醣(LPS)之一部分。O-抗原係在細胞表面上且為一種可變細胞成分。O-抗原之變化性為革蘭氏陰性細菌之血清分型提供基礎。目前大腸桿菌血清分型方案包括O-多醣1至181。

O-抗原包括寡醣重複單元(O-單元)，其野生型結構通常含有來自大範圍糖之兩個至八個殘基。例示性大腸桿菌O-抗原之O-單元在表1中顯示，亦參見圖9A至圖9C及圖10A至圖10B。

在一個實施例中，本發明之醣可為一個寡醣單元。在一個實施例中，本發明之醣為相關血清型之一個重複寡醣單元。在此類實施例中，醣可包括選自以下中之任一者之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101。

在一個實施例中，本發明之醣可為寡醣。寡醣具有低數目之重複單元(通常5-15個重複單元)且通常以合成方式或藉由多醣之水解得到。在此類實施例中，醣可包括選自以下中之任一者之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101。

較佳地，本發明之醣及本發明之免疫原性組合物中之醣全部均為多醣。高分子量多醣可由於存在於抗原表面上之抗原決定基而誘導某些抗體免疫反應。較佳地涵蓋高分子量多醣之分離及純化，以用於本發明之共軛物、組合物及方法中。.

在一些實施例中，各個別O-抗原聚合物中之重複O單元之數目(且因此聚合物鏈之長度及分子量)視wzz鏈長調節劑(一種內膜蛋白質)而定。不同wzz蛋白賦予不同範圍之模態長度(4至＞100個重複單元)。術語「模態長度」係指重複O-單元之數目。革蘭氏陰性細菌通常具有賦予兩種不同OAg模態鏈長(一個較長且一個較短)之二種不同Wzz蛋白。革蘭氏陰性細菌中之wzz家族蛋白質(例如wzzB)之表現(不一定過度表現)可允許操縱O-抗原長度，以改變或變化某些長度範圍之O-抗原之細菌產量，及以增強高產率大分子量脂多醣之產量。在一個實施例中，如本文所用，「短」模態長度係指低數目之重複O-單元，例如1-20個。在一個實施例中，如本文所用，「長」模態長度係指大於20且至多最大40個之多個重複O-單元。在一個實施例中，如本文所用，「極長」模態長度係指大於40個重複O-單元。

在一個實施例中，所產生之醣相較於對應野生型O-多醣增加至少10個重複單元、15個重複單元、20個重複單元、25個重複單元、30個重複單元、35個重複單元、40個重複單元、45個重複單元、50個重複單元、55個重複單元、60個重複單元、65個重複單元、70個重複單元、75個重複單元、80個重複單元、85個重複單元、90個重複單元、95個重複單元或100個重複單元。

在另一實施例中，本發明之醣相較於對應野生型O-多醣增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元。較佳地，醣相較於對應野生型O-多醣包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元之增加。參見例如表 21。測定醣長度之方法為此項技術中已知的。此類方法包括核磁共振、質譜分析及尺寸排阻層析，如實例5中所描述。

測定醣中之重複單元數目之方法亦為此項技術中已知的。舉例而言，式中之重複單元數目(或「 n」)可藉由以下來計算：將多醣之分子量(不具有核心醣或KDO殘基之分子量)除以重複單元之分子量(亦即例如表1中顯示之對應式中之結構之分子量，其可理論上計算為式中之各單醣之分子量之總和)。式中之各單醣之分子量為此項技術中已知的。式O25b之重複單元之分子量例如為約862 Da。式O1a之重複單元之分子量例如為約845 Da。式O2之重複單元之分子量例如為約829 Da。式O6之重複單元之分子量例如為約893 Da。當測定共軛物中之重複單元數目時，將載體蛋白質分子量及蛋白質:多醣比率納入計算。如本文所定義，「 n」係指多醣分子中之重複單元之數目(表1中之括號中所表示)。如此項技術中已知，在生物學大分子中，重複結構中可穿插有不完全重複區，諸如失去分支。另外，此項技術中已知，自天然來源(諸如細菌)分離及純化出之多醣在大小上及在分支上可為非均一性。在此情況下， n可表示群體中之分子之 n之平均或中位值。

在一個實施例中，O-多醣相較於對應野生型O-多醣具有O-抗原之至少一個重複單元之增加。O-抗原之重複單元在表 1中顯示。在一個實施例中，O-多醣包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個總重複單元。較佳地，醣具有總共至少3個至至多80個重複單元。在另一實施例中，O-多醣相較於對應野生型O-多醣具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個重複單元之增加。

在一個實施例中，醣包括O-抗原，其中O-抗原式(諸如表1中顯示之式(亦參見圖9A至圖9C及圖10A至圖10B))中之任一者中之 n為至少1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40且至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50之整數。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。例示性範圍包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；及至少20至至多80，較佳地至多90。在一個較佳實施例中， n為至少31至至多90。在一較佳實施例中， n為40至90，更佳地60至85。

在一個實施例中，醣包括O-抗原，其中O-抗原式中之任一者中之 n為至少1且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少5且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少10且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少25且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少75且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少100且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少125且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少150且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少175且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少1且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少5且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少10且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少25且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少75且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少1且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少5且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少10且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少20且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少25且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少30且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少40且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少30且至多90。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多85。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多70。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多60。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多50。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多49。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多48。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多47。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多46。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少36且至多45。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少37且至多44。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少38且至多43。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少39且至多42。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少39且至多41。

舉例而言，在一個實施例中，醣中之 n為31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90，最佳地40。在另一實施例中， n為至少35至至多60。舉例而言，在一個實施例中， n為以下中之任一者：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59及60，較佳地50。在另一較佳實施例中， n為至少55至至多75。舉例而言，在一個實施例中， n為55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69，最佳地60。

醣結構可藉由此項技術中已知之方法及工具測定，諸如NMR，包括1D、1H及/或13C、2D TOCSY、DQF-COSY、NOESY及/或HMQC。

在一些實施例中，在共軛之前經純化多醣具有5 kDa與400 kDa之間的分子量。在其他此類實施例中，醣具有以下的分子量：在10 kDa與400 kDa之間；在5 kDa與400 kDa之間；在5 kDa與300 kDa之間；在5 kDa與200 kDa之間；在5 kDa與150 kDa之間；在10 kDa與100 kDa之間；在10 kDa與75 kDa之間；在10 kDa與60 kDa之間；在10 kDa與40 kDa之間；在10 kDa與100 kDa之間；在10 kDa與200 kDa之間；在15 kDa與150 kDa之間；在12 kDa與120 kDa之間；在12 kDa與75 kDa之間；在12 kDa與50 kDa之間；在12 kDa與60 kDa之間；在35 kDa與75 kDa之間；在40 kDa與60 kDa之間；在35 kDa與60 kDa之間；在20 kDa與60 kDa之間；在12 kDa與20 kDa之間；或在20 kDa與50 kDa之間。在其他實施例中，多醣具有以下之間的分子量：7 kDa至15 kDa；8 kDa至16 kDa；9 kDa至25 kDa；10 kDa至100 kDa；10 kDa至60 kDa；10 kDa至70 kDa；10 kDa至160 kDa；15 kDa至600 kDa；20 kDa至1000 kDa；20 kDa至600 kDa；20 kDa至400 kDa；30 kDa至1,000 KDa；30 kDa至60 kDa；30 kDa至50 kDa或5 kDa至60 kDa。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

如本文所用，術語多醣或載體蛋白質-多醣共軛物之「分子量」係指藉由尺寸排阻層析(SEC)與多角度雷射光散射偵測器(MALLS)組合所計算之分子量。

多醣之大小在正常純化程序期間可變得略微減小。另外，如本文中所描述，多醣可在共軛之前經受大小測試技術。可採用機械或化學大小測定。可使用乙酸進行化學水解。機械大小測定可使用高壓均質化剪切來進行。上文提及之分子量範圍係指在共軛之前(例如在活化之前)之經純化多醣。表 1 ： 大腸桿菌血清組 / 血清型及 O- 單元部分

血清組/ 血清型	部分(Moiety) 結構(O- 單元)	部分結構在本文中被稱作：
O1A，O1A1	[→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1A
O1B	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→\|β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1B
O1C	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→\|β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1C
O2	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Fuc3NAc-(1→2) ] _n	式O2
O3	[β-L-RhaNAc(1→4)α-D-Glc-(1→4)\| \| →3)-β-D-GlcNAc-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O3
O4:K52	[→2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O4:K52
O4:K6	[α-D-Glc-(1→3) \| →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O4:K6
O5ab	[→4)-β-D-Qui3NAc-(1→3)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc(1→] _n	式O5ab
O5ac (菌株180/C3)	[→2)-β-D-Qui3NAc-(1→3)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc(1→ ] _n	式O5ac (菌株180/C3)
O6:K2；K13；K15	[→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→2) ] _n	式O6:K2；K13；K15
O6:K54	[→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→\|β-D-GlcNAc-(1→2) ] _n	式O6:K54
O7	[α-L-Rha-(1→3) \| →3)-β-D-Qui4NAc-(1→2)-α-D-Man-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O7
O10	[→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Fuc4NAcyl-(1→2) Acyl=乙醯基(60%)或(R)-3-羥基丁醯基(40%) ] _n	式O10
O16	[→2)-β-D-Galf-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-Rha2Ac-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O16
O17	[α-D-Glc-(1→6) \| →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O17
O18A，O18ac	[→2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O18A，式O18ac
O18A1	[α-D-Glc-(1→6) \| →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O18A1
O18B	[→3)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→3) ] _n	式O18B
O18B1	[α-D-Glc-(1→4) \| →3)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→3) ] _n	式O18B1
O21	[β-D-Gal-(1→4) \| →3)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→2) ] _n	式O21
O23A	[α-D-Glc-(1→6) \| →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc(1→3) ] _n	式O23A
O24	[→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-D-Glc-(1→2) ] _n	式O24
O25/O25a	[β-D-Glc-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-L-Rha-(1→3) ] _n	式O25a
O25b		式O25b
O26	[ →3)-α-L-Rha-(1→4)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O26
O28	[→2)-(R)-Gro-1-P→4)-β-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-Galf2Ac-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O28
O36		式O36
O44	[α-D-Glc-(1→4) \| →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O44
O45	[→2)-β-D-Glc-(1→3)-α-L-6dTal2Ac-(1→3)-α-D-FucNAc-(1→ ] _n	式O45
O45rel	[ →2)-β-D-Glc-(1→3)-α-L-6dTal2Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O45rel
O54	[→4)-α-d-GalpA-(1 → 2)-α-l-Rhap-(1 → 2)-β-d-Ribf-(1 → 4)-β-d-Galp-(1 → 3)-β-d-GlcpNAc-(1→] n	式O54
O55	[ →6)-β-D-GlcNAc-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-Col-(1→2)-β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O55
O56	[→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Gal-(1→2) ] _n	式O56
O57		式O57
O58	[3-O-[(R)-1-羧基乙基]-α-L-Rha -(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man2Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O58
O64	[β-D-Gal-(1→6) \| →3)-α-D-ManNAc-(1→3)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O64
O68		式O68
O69	[→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O69
O73 (菌株73-1)	[ α-D-Glc-(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GalNAc(1→ ] _n	式O73 (菌株73-1)
O74	→6)-α-D-Glc pNAc-(1→4)-β-D-Gal pA-(1→3)-β-D-Glc pNAc-(1→] n \|[β-D-Fuc p3NAc-(1→3)	式O74
O75	[ β-D-Man-(1→4) \| →3)-α-D-Gal-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O75
O76	[→4)-β-D-Glc pA-(1→4)-β-D-Gal pNAc3Ac-(1→4)-α-D-Gal pNAc-(1→3)-β-D-Gal pNAc-(1→] n	式O76
O77	[ →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O77
O78	[ →4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O78
O86	[ α-D-Gal-(1→3) \| →4)-α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O86
O88	[ α-L-6dTal-(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O88
O90	[ →4)-α-L-Fuc2/3Ac-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O90
O98	[ →3)-α-L-QuiNAc-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-α-L-QuiNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O98
O104	[ →4)-α-D-Gal-(1→4)-α-Neu5,7,9Ac ₃-(2→3)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] _n	式O104
O111	[ α-Col-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-Col-(1→3) ] _n	式O111
O113	[ →4)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O113
O114	[ →4)-β-D-Qui3N(N-乙醯基-L-絲胺醯基)-(1→3)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O114
O119	[ β-D-RhaNAc3NFo-(1→3) \| →2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-Gal-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O119
O121	[ →3)-β-D-Qui4N(N-乙醯基-甘胺醯基)-(1→4)-α-D-GalNAc3AcA6N-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O121
O124	[ 4-O-[(R)-1-羧基乙基]-β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc(1→4) \|→3)-α-D-Gal-(1→6)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O124
O125	[ α-D-Glc-(1→3) \| →4)-β-D-GalNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ \| β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O125
O126	[ →2)-β-D-Man-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-L-Fuc-(1→2) ] _n	式O126
O127	[ →2)-α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O127
O128	[ α-L-Fuc-(1→2) \| →6)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O128
O136	[ →4)-β-Pse5Ac7Ac-(2→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→β-Pse5Ac7Ac=5,7-二乙醯胺基-3,5,7,9-四去氧基-L- 甘油-β-L- 甘露-尤羅索尼克酸(nonulosonic acid) ] _n	式O136
O138	[ →2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O138
O140		式O140
O141	[ α-L-Rha-(1→3) \|→4)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man6Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcA-(1→2) ] _n	式O141
O142	[ →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O142
O143	[ →2)-β-D-GalA6R3,4Ac-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ R=1,3-二羥基-2-丙胺基 ] _n	式O143
O147	[ →2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→4)-β-D-GalA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O147
O149	[ →3)-β-D-GlcNAc-(S)-4,6Py-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ (S)-4,6Py=4,6-O-[(S)-1-羧基亞乙基]- ] _n	式O149
O152	[ β-L-Rha-(1→4) \| →3)-α-D-GlcNAc-(1-P→6)-α-D-Glc-(1→2)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O152
O157	[ →2)-α-D-Rha4NAc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O157
O158	[ α-D-Glc-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-L-Rha-(1→3) ] _n	式O158
O159	[ α-L-Fuc-(1→4) \| →3)-β-D-GlcNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O159
O164	[ β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc(1→4) \| →3)-β-D-Gal-(1→6)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O164
O173	[ α-L-Fuc-(1→4) \| →3)-α-D-Glc-(1-P→6)-α-D-Glc-(1→2)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→] _n	式O173
62D ₁建議為歐文氏菌( Erwinia herbicola)	[ α-D-Gal(1→6) \| →2)-β-D-Qui3NAc-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-FucNAc-(1→ ] _n	式62D ₁
O22	[ →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-GalNAc3Ac-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] _n	式O22
O35	[ →3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-GalNAcA6N-(1→2) ] _n	式O35
O65	[ →2)-β-D-Qui3NAc-(1→4)-α-D-GalA6N-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GalA-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O65
O66	[ →2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→2)-β-D-Glc3Ac-(1→3)-α-L-6dTal-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O66
O83	[ →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→6)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O83
O91	[ →4)-α-D-Qui3NAcyl-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-GlcA6NGly-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ Acyl=(R)-3-羥基丁醯基 ] _n	式O91
O105	[ β-D-Ribf-(1→3) \|→4)-α-D-GlcA2Ac3Ac-(1→2)-α-L-Rha4Ac-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc6Ac-(1→ ] _n	式O105
O116	[ →2)-β-D-Qui4NAc-(1→6)-α-D-GlcNAc-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O116
O117	[ →4)-β-D-GalNAc-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→] _n	式O117
O139	[ β-D-Glc-(1→3) \| →3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalA-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O139
O153	[ →2)-β-D-Ribf-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-α-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O153
O167	[ α-D-Galf-(1→4) \| →2)-β-D-GalA6N(L)Ala-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→2)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O167
O172	[ →3)-α-L-FucNAc-(1→4)-α-D-Glc6Ac-(1-P→4)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O172
O8	[ →2)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-β-D-Man-(1→ ] _n	式O8
O9a	[ →2)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→ ] _n	式O9a
O9	[ →2)-[α-D-Man-(1→2)] ₂-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→ ] _n	式O9
O20ab	[ →2)-β-D-Ribf-(1→4)-α-D-Gal-(1→ ] _n	式O20ab
O20ac	[ α-D-Gal-(1→3) \| →2)-β-D-Ribf-(1→4)-α-D-Gal-(1→ ] _n	式O20ac
O52	[ →3)-β-D-Fucf-(1→3)-β-D-6dmanHep2Ac-(1→ ] _n	式O52
O97	[ →3)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→ \|\| β-D-Xulf-(2→2)β-D-Xulf-(2→2) ] _n	式O97

† β-D-6d manHep2Ac為2 -O-乙醯基-6-去氧-β-D-甘露-庚哌喃糖基。 ‡ β-D-Xul f為β-D-蘇-呋喃戊醣基。

核心寡醣核心寡醣位於野生型大腸桿菌LPS中之脂質A與O-抗原外區之間。更具體言之，核心寡醣為多醣中包括野生型大腸桿菌中之O-抗原與脂質A之間的鍵的部分。此鍵包括最內3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO))殘基之半縮酮官能基與脂質A之GlcNAc-殘基之羥基之間的酮苷鍵。在野生型大腸桿菌菌株中，核心寡醣區顯示較高程度之相似性。其通常包括有限數目之糖。核心寡醣包括內部核心區及外部核心區。

更具體言之，內部核心主要由L-甘油-D-甘露-庚醣(庚醣)及KDO殘基構成。內部核心為高度保守的。KDO殘基包括以下式KDO：核心寡醣之外區展示比內部核心區更可變，此區中之差異區分大腸桿菌中之五種化學型：R1、R2、R3、R4及K-12。參見圖 17，其說明五種已知化學型之外部核心寡醣之碳水化合物主鏈之一般化結構。HepII為內部核心寡醣之最後一個殘基。儘管所有外部核心寡醣共用結構主題，具有(己醣) ₃碳水化合物主鏈及兩個側鏈殘基，但主鏈中之己糖之次序及側鏈殘基之性質、位置及連接全部均可變化。R1及R4外部核心寡醣之結構高度類似，相差僅單個β-連接的殘基。

在此項技術中，基於遠端寡醣之結構，將野生型大腸桿菌之核心寡醣分成五種不同化學型：大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12。

在一較佳實施例中，本文所描述之組合物包括糖共軛物，其中O-多醣包括與O-抗原結合之核心寡醣。在一個實施例中，組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少兩種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少三種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少四種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對所有五種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。

在另一較佳實施例中，本文所描述之組合物包括糖共軛物，其中O-多醣不包括與O-抗原結合之核心寡醣。在一個實施例中，此種組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者之免疫反應，即使糖共軛物具有不包括核心寡醣之O-多醣。

大腸桿菌血清型可根據五種化學型中之一者來進行表徵。表2列舉根據化學型表徵之例示性血清型。呈粗體形式之血清型表示最常與所指示核心化學型相關之血清型。因此，在一較佳實施例中，組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者之免疫反應，該免疫反應包括針對各別對應大腸桿菌血清型中之任一者之免疫反應。表 2 ：核心化學型及相關大腸桿菌血清型

核心化學型	血清型
R1	O25a、O6、 O2、 O1、O75、O4、 O16、O8、O18、O9、O13、O20、O21、O91及O163.
R2	O21、O44、O11、O89、O162、O9
R3	O25b、O15、O153、O21、O17、O11、O159、O22、O86、O93
R4	O2、O1、O86、O7、O102、O160、O166
K-12	O25b、O16

在一些實施例中，組合物包括含來源於具有R1化學型之血清型之結構，例如選自具有以下各者之醣的醣：式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O8、式O18、式O9、式O13、式O20、式O21、式O91及式O163，其中 n為1至100。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如顯示於圖17中之大腸桿菌R1核心部分。

在一些實施例中，組合物包括含來源於具有R1化學型之血清型之結構，例如選自具有以下各者之醣的醣：式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O18、式O13、式O20、式O21、式O91及式O163，其中 n為1至100，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括醣中之大腸桿菌R1核心部分。

在一些實施例中，組合物包括含來源於具有R2化學型之血清型之結構，例如選自具有以下各者之醣的醣：式O21、式O44、式O11、式O89、式O162及式O9，其中 n為1至100，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如顯示於圖17中之大腸桿菌R2核心部分。

在一些實施例中，組合物包括含來源於具有R3化學型之血清型之結構，例如選自具有以下各者之醣的醣：式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86及式O93，其中 n為1至100，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如顯示於圖17中之大腸桿菌R3核心部分。

在一些實施例中，組合物包括含來源於具有R4化學型之血清型之結構，例如選自具有以下各者之醣的醣：式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160及式O166，其中 n為1至100，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如顯示於圖17中之大腸桿菌R4核心部分。

在一些實施例中，組合物包括含來源於具有K-12化學型之血清型之結構(例如選自具有式O25b之醣及具有式O16之醣)的醣，其中 n為1至1000，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括例如顯示於圖17中之大腸桿菌K-12核心部分。

在一些實施例中，醣包括核心醣。因此，在一個實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌K12核心部分。

在一些實施例中，醣不包括核心醣。因此，在一個實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌K12核心部分。

經共軛之 O- 抗原O-抗原或較佳地O-多醣與蛋白質載劑之化學連接可提高O-抗原或O-多醣之免疫原性。然而，聚合物大小之變化性代表用於生產之一個實踐難題。在商業用途中，醣之大小可影響與不同共軛合成策略之相容性、產物均一性及共軛物免疫原性。經由操縱O-抗原合成路徑控制Wzz家族蛋白質鏈長調節劑之表現允許在多種革蘭氏陰性菌株(包括大腸桿菌)中產生所需長度之O-抗原鏈。

在一個實施例中，經純化醣經化學活化以產生能夠與載體蛋白質反應之活化醣。一旦活化，則各醣單獨地與載體蛋白質共軛，形成共軛物，即糖共軛物。如本文所用，術語「糖共軛物」係指與載體蛋白質共價連接之醣。在一個實施例中，醣直接與載體蛋白質連接。在另一實施例中，醣經由間隔基/連接子與蛋白質連接。

可藉由在沿O-抗原之一個位點處或在多個位點處將載劑與O-抗原結合之方案，或藉由活化核心寡醣之至少一個殘基之方案，來製備共軛物。

在一個實施例中，各醣與相同載體蛋白質共軛。

若組合物中之2種或更多種醣之蛋白質載劑相同，則該等醣可與載體蛋白質之相同分子(例如具有與其共軛之2種或更多種醣之載劑分子)共軛。

在一較佳實施例中，醣各自獨立地與蛋白質載劑之不同分子(蛋白質載劑之各分子僅具有與其共軛之一種類型的醣)共軛。在該實施例中，將醣稱為獨立地與載體蛋白質共軛。

醣之化學活化及與載體蛋白質之後續共軛可藉由本文所揭示之活化及共軛方法來達成。在多醣與載體蛋白質共軛之後，藉由多種技術來純化(相對於多醣-蛋白質共軛物之量增濃)糖共軛物。此等技術包括濃縮/透濾操作、沈澱/溶離、管柱層析及深度過濾。在將個別糖共軛物純化之後，將其進行混配以調配本發明之免疫原性組合物。

活化.本發明進一步係關於根據本文所描述之任一實施例產生之經活化多醣，其中該等多醣用化學試劑進行活化以產生用於與連接子或載體蛋白質共軛之反應性基團。在一些實施例中，本發明之醣係在與載體蛋白質共軛之前進行活化。在一些實施例中，活化程度不顯著地減小多醣之分子量。舉例而言，在一些實施例中，活化程度不使多醣主鏈裂解。在一些實施例中，活化程度不顯著地影響共軛程度，如藉由載體蛋白質(諸如CRM ₁₉₇)中經修飾之離胺酸殘基之數目(如藉由胺基酸分析所測定)所量測。舉例而言，在一些實施例中，相較於在相同活化程度下，與參考多醣共軛之載體蛋白質中經修飾之離胺酸殘基之數目，活化程度不顯著地增加載體蛋白質中經修飾之離胺酸殘基之數目(如藉由胺基酸分析所測定) 3倍。在一些實施例中，活化程度不增加未共軛游離醣之水準。在一些實施例中，活化程度不降低最佳醣/蛋白質比率。

在一些實施例中，經活化醣具有以下之活化百分比，其中經活化醣之每醣重複單元之硫醇莫耳數係在1-100%之間，諸如在2-80%之間，在2-50%之間，在3-30%之間及在4-25%之間。活化程度為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%或≥ 90%，或約100%。較佳地，活化程度為至多50%，更佳地至多25%。在一個實施例中，活化程度為至多20%。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。

在一個實施例中，多醣用1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)活化，形成氰酸酯。隨後，將經活化多醣直接與載體蛋白質(較佳地CRM ₁₉₇或破傷風類毒素)上之胺基偶合或經由間隔基(連接子)與其偶合。

舉例而言，間隔基可為產生硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該硫醇化多醣可經由在與經順丁烯二醯亞胺活化的載體蛋白質(例如使用N-[Y-馬來醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵素乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯胺、N-丁二醯亞胺基溴乙酸酯(SBA；SIB)、N-丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、磺基丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、N-丁二醯亞胺基碘乙酸酯(SIA)或丁二醯亞胺基3-[溴乙醯胺基]丙酸酯(SBAP))反應之後獲得之硫醚鍵，而與載劑偶合。在一個實施例中，將氰酸酯(視情況藉由CDAP化學方法製備)與己烷二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學方法，經由蛋白質載劑上之羧基，將胺基衍生醣與載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)共軛。

用於共軛之其他適合的技術使用碳二醯亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基丁二醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。共軛可涉及羰基連接子，其可藉由醣之游離羥基與CDI反應，隨後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵來形成。此可涉及將變旋異構端還原成一級羥基，視情況選用之保護/去保護該一級羥基，該一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間物，及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上之胺基偶合(CDI化學方法)。

分子量 .在一些實施例中，糖共軛物包含具有在10 kDa與2,000 kDa之間的分子量之醣。在其他實施例中，醣具有在50 kDa與1,000 kDa之間的分子量。在其他實施例中，醣具有在70 kDa與900 kDa之間的分子量。在其他實施例中，醣具有在100 kDa與800 kDa之間的分子量。在其他實施例中，醣具有在200 kDa與600 kDa之間的分子量。在其他實施例中，醣具有以下之分子量：100 kDa至1000 kDa；100 kDa至900 kDa；100 kDa至800 kDa；100 kDa至700 kDa；100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；150 kDa至1,000 kDa；150 kDa至900 kDa；150 kDa至800 kDa；150 kDa至700 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；200 kDa至1,000 kDa；200 kDa至900 kDa；200 kDa至800 kDa；200 kDa至700 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；200 kDa至300；250 kDa至1,000 kDa；250 kDa至900 kDa；250 kDa至800 kDa；250 kDa至700 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至1,000 kDa；300 kDa至900 kDa；300 kDa至800 kDa；300 kDa至700 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至1,000 kDa；400 kDa至900 kDa；400 kDa至800 kDa；400 kDa至700 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa。在一個實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由單端共軛產生。在另一實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由在水性緩衝液中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

在一些實施例中，本發明之糖共軛物具有以下的分子量：在400 kDa與15,000 kDa之間；在500 kDa與10,000 kDa之間；在2,000 kDa與10,000 kDa之間；在3,000 kDa與8,000 kDa之間；或在3,000 kDa與5,000 kDa之間。在其他實施例中，糖共軛物具有在500 kDa與10,000 kDa之間的分子量。在其他實施例中，糖共軛物具有在1,000 kDa與8,000 kDa之間的分子量。在另其他實施例中，糖共軛物具有在2,000 kDa與8,000 kDa之間或在3,000 kDa與7,000 kDa之間的分子量。在其他實施例中，本發明之糖共軛物具有以下的分子量：在200 kDa與20,000 kDa之間；在200 kDa與15,000 kDa之間；在200 kDa與10,000 kDa之間；在200 kDa與7,500 kDa之間；在200 kDa與5,000 kDa之間；在200 kDa與3,000 kDa之間；在200 kDa與1,000 kDa之間；在500 kDa與20,000 kDa之間；在500 kDa與15,000 kDa之間；在500 kDa與12,500 kDa之間；在500 kDa與10,000 kDa之間；在500 kDa與7,500 kDa之間；在500 kDa與6,000 kDa之間；在500 kDa與5,000 kDa之間；在500 kDa與4,000 kDa之間；在500 kDa與3,000 kDa之間；在500 kDa與2,000 kDa之間；在500 kDa與1,500 kDa之間；在500 kDa與1,000 kDa之間；在750 kDa與20,000 kDa之間；在750 kDa與15,000 kDa之間；在750kDa與12,500 kDa之間；在750kDa與10,000 kDa之間；在750kDa與7,500 kDa之間；在750 kDa與6,000 kDa之間；在750 kDa與5,000 kDa之間；在750 kDa與4,000 kDa之間；在750 kDa與3,000 kDa之間；在750 kDa與2,000 kDa之間；在750 kDa與1,500 kDa之間；在1,000 kDa與15,000 kDa之間；在1,000 kDa與12,500 kDa之間；在1,000 kDa與10,000 kDa之間；在1,000 kDa與7,500 kDa之間；在1,000 kDa與6,000 kDa之間；在1,000 kDa與5,000 kDa之間；在1,000 kDa與4,000 kDa之間；在1,000 kDa與2,500 kDa之間；在2,000 kDa與15,000 kDa之間；在2,000 kDa與12,500 kDa之間；在2,000 kDa與10,000 kDa之間；在2,000 kDa與7,500 kDa之間；在2,000 kDa與6,000 kDa之間；在2,000 kDa與5,000 kDa之間；在2,000 kDa與4,000 kDa之間；或在2,000 kDa與3,000 kDa之間。在一個實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由本文所描述之eTEC共軛產生。在另一實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由還原胺化化學方法(RAC)產生。在另一實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由在DMSO中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生。

在其他實施例中，本發明之糖共軛物具有以下的分子量：在1,000 kDa與20,000 kDa之間；在1,000 kDa與15,000 kDa之間；在2,000 kDa與10,000 kDa之間；在2000 kDa與7,500 kDa之間；在2,000 kDa與5,000 kDa之間；在3,000 kDa與20,000 kDa之間；在3,000 kDa與15,000 kDa之間；在3,000 kDa與12,500 kDa之間；在4,000 kDa與10,000 kDa之間；在4,000 kDa與7,500 kDa之間；在4,000 kDa與6,000 kDa之間；或在5,000 kDa與7,000 kDa之間。在一個實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由還原胺化化學方法(RAC)產生。在另一實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由在DMSO中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生。在另一實施例中，具有此種分子量之糖共軛物係藉由本文所描述之eTEC共軛產生。

在其他實施例中，本發明之糖共軛物具有以下的分子量：在5,000 kDa與20,000 kDa之間；在5,000 kDa與15,000 kDa之間；在5,000 kDa與10,000 kDa之間；在5,000 kDa與7,500 kDa之間；在6,000 kDa與20,000 kDa之間；在6,000 kDa與15,000 kDa之間；在6,000 kDa與12,500 kDa之間；在6,000 kDa與10,000 kDa之間或在6,000 kDa與7,500 kDa之間。

糖共軛物之分子量可藉由SEC-MALLS來量測。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。本發明之糖共軛物亦可藉由醣與載體蛋白質之比率(重量/重量)表徵。在一些實施例中，糖共軛物中之多醣與載體蛋白質之比率(w/w)係在0.5與3之間(例如約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0)。在其他實施例中，醣與載體蛋白質比率(w/w)係在0.5與2.0之間、在0.5與1.5之間、在0.8與1.2之間、在0.5與1.0之間、在1.0與1.5之間或在1.0與2.0之間。在其他實施例中，醣與載體蛋白質比率(w/w)係在0.8與1.2之間。在一較佳實施例中，共軛物中之多醣與載體蛋白質之比率係在0.9與1.1之間。在一些此等實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

糖共軛物亦可藉由其分子大小分佈(K _d)表徵。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定共軛物之相對分子大小分佈。在重力饋送柱中使用尺寸排阻層析(SEC)以得到共軛物之分子大小分佈型態。大分子排除在比小分子更快速溶離之介質中之孔之外。級分收集器用於收集管柱溶離液。藉由醣分析，色度地測試級分。對於K _d之測定，將柱進行校準以確立完全排除分子之分數(V ₀)，(K _d=0)；及表示最大保留(V _i)，(K _d=1)之分數。達到指定樣本屬性之級分(V _e)係關於藉由以下表述之Kd：K _d= (V _e- V _o)/ (V _i- V ₀)。

游離醣 .本發明之糖共軛物及免疫原性組合物可包括未與載體蛋白質共價共軛但仍存在於糖共軛物組合物中之游離醣。游離醣可未與糖共軛物共價結合(亦即未與其共價結合、吸附或包埋在其中)。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含至多50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含小於約25%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含至多約20%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含至多約15%之游離多醣。在另一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含至多約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含小於約8%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含至多約6%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含至多約5%之游離多醣。參見例如表12、表13、表14、表15、表16、表17及表18。

共價連接 .在其他實施例中，對於每5至10醣重複單元、每2至7醣重複單元、每3至8醣重複單元、每4至9醣重複單元、每6至11醣重複單元、每7至12醣重複單元、每8至13醣重複單元、每9至14醣重複單元、每10至15醣重複單元、每2至6醣重複單元, 每3至7醣重複單元、每4至8醣重複單元、每6至10醣重複單元、每7至11醣重複單元、每8至12醣重複單元、每9至13醣重複單元、每10至14醣重複單元、每10至20醣重複單元、每4至25醣重複單元或每2至25醣重複單元，共軛物在載體蛋白質與醣之間包含至少一個共價連接。在常見實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在另一實施例中，對於多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個醣重複單元，在載體蛋白質與醣之間存在至少一個連接。在一個實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

離胺酸殘基 .表徵本發明之糖共軛物之另一方式為藉由變得與特徵可為一系列經共軛離胺酸(共軛程度)之醣共軛之載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)中之離胺酸殘基的數目。載體蛋白質之由於與多醣共價連接所致之離胺酸修飾之證據，可藉由胺基酸分析，使用熟習此項技術者已知之常規方法來獲得。共軛引起所回收離胺酸殘基之數目相較於用於產生共軛物材料之載體蛋白質起始物質而減少。在一較佳實施例中，本發明之糖共軛物之共軛程度係在2與15之間、與2與13之間、與2與10之間、與2與8之間、與2與6之間、與2與5之間、與2與4之間、與3與15之間、與3與13之間、與3與10之間、與3與8之間、與3與6之間、與3與5之間、與3與4之間、與5與15之間、與5與10之間、與8與15之間、與8與12之間、與10與15之間或在10與12之間。在一個實施例中，本發明之糖共軛物之共軛程度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在一較佳實施例中，本發明之糖共軛物之共軛程度係在4與7之間。在一些此等實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

醣鏈與載體蛋白質上之離胺酸之連接之頻率為對本發明之糖共軛物進行表徵之另一參數。舉例而言，在一些實施例中，對於多醣之每4個醣重複單元，在載體蛋白質與多醣之間至少一個共價連接。在另一實施例中，載體蛋白質與多醣之間的共價連接在多醣之每10個醣重複單元中發生至少一次。在另一實施例中，載體蛋白質與多醣之間的共價連接在多醣之每15個醣重複單元中發生至少一次。在又一實施例中，載體蛋白質與多醣之間的共價連接在多醣之每25個醣重複單元中發生至少一次。 O- 乙醯化 .在一些實施例中，本發明之醣為O-乙醯化的。在一些實施例中，糖共軛物包含具有以下之O-乙醯化程度之醣：在10-100%之間，在20-100%之間，在30-100%之間，在40-100%之間，在50-100%之間，在60-100%之間，在70-100%之間，在75-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%之間。在其他實施例中，O-乙醯化程度為≥ 10%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%或≥ 90%，或約100%。藉由O-乙醯化之%，其意謂給定醣相對於100% (其中各重複單元相對於其經乙醯化結構為完全乙醯化的)之百分比。

在一些實施例中，藉由還原胺化來製備糖共軛物。在一些實施例中，糖共軛物為單端連接的共軛醣，其中醣直接與載體蛋白質共價結合。在一些實施例中，糖共軛物經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共價結合。

還原胺化 .在一個實施例中，醣藉由還原胺化與載體蛋白質共軛(諸如在以下中描述：美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2007/0231340號、第2007/0184071號及第2007/0184072號，WO 2006/110381，WO 2008/079653及WO 2008/143709)。

還原胺化包括(1)醣之氧化，(2)經活化醣及載體蛋白質之還原以形成共軛物。在氧化之前，醣視情況進行水解。可採用機械或化學水解。可使用乙酸進行化學水解。

氧化步驟可涉及與過碘酸(鹽) (periodate)反應。如本文所用，術語「過碘酸(鹽) (periodate)」係指過碘酸鹽(periodate)及過碘酸(periodic acid)兩者。該術語亦包括偏過碘酸根(IO ₄ ^-)及原過碘根(IO ₆ ⁵ ^-)以及過碘酸之各種鹽(例如過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在一個實施例中，多醣係在存在偏過碘酸(鹽)之情況下，較佳地在存在過碘酸鈉(NalO ₄)之情況下氧化。在另一實施例中，多醣係在存在原過碘酸(鹽)之情況下，較佳地在存在過碘酸之情況下氧化。

在一個實施例中，氧化劑為穩定的硝醯基或氮氧化物自由基化合物，諸如哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物，在存在氧化劑之情況下選擇性地氧化一級羥基。在該反應中，在催化循環中，實際氧化劑為N-氧銨鹽。在一態樣中，該穩定硝醯基或氮氧化物自由基化合物為哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物。在一態樣中，該穩定硝醯基或氮氧化物自由基化合物攜帶TEMPO (2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL (2,2,5,5-四甲基-1-吡咯啶氧基)部分。在一態樣中，該穩定硝醯自由基化合物為TEMPO或其衍生物。在一態樣中，該氧化劑為攜帶N-鹵基部分之分子。在一態樣中，該氧化劑係選自以下中之任一者：N-氯丁二醯亞胺、N-溴丁二醯亞胺、N-碘丁二醯亞胺、二氯異三聚氰酸、1,3,5-三氯-l,3,5- 三嗪烷-2,4,6-三酮、二溴異三聚氰酸、1,3,5-三溴-l,3,5- 三嗪烷-2,4,6-三酮、二碘異三聚氰酸及1,3,5-三碘-l,3,5- 三嗪烷-2,4,6-三酮。較佳地，該氧化劑為N-氯丁二醯亞胺。

在醣之氧化步驟之後，醣稱為經活化且在本文下文被稱作「經活化」。經活化醣及載體蛋白質可獨立地(分散凍乾)或一起(共凍乾)經凍乾(冷凍乾燥)。在一個實施例中，共凍乾經活化醣及載體蛋白質。在另一實施例中，獨立地凍乾經活化多醣及載體蛋白質。

在一個實施例中，凍乾在存在非還原糖之情況下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及異麥芽酮糖醇。

共軛程序之下一步驟為使用還原劑，還原經活化醣及載體蛋白質，以形成共軛物(所謂的還原胺化)。適合的還原劑包括氰基硼氫化物，諸如氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉或在存在布朗斯特酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)之情況下硼氫化鈉或硼氫化鋅；胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe'PrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)、硼烷-吡啶或硼氫化物交換樹脂。在一個實施例中，還原劑為氰基硼氫化鈉。

在一實施例中，在水性溶劑(例如選自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、二甘胺酸或HEPB，在6.0與8.5之間、7.0與8.0之間或7.0與7.5之間的pH下)中進行還原反應；在另一實施例中，在非質子性溶劑中進行反應。在一實施例中，在DMSO (二甲亞碸)中或在DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行還原反應。DMSO或DMF溶劑可用於將已凍乾之經活化多醣及載體蛋白質復原。

在還原反應結束時，可在共軛物中存在剩餘未反應之醛基，此等可使用適合的封端劑進行封端。在一個實施例中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH ₄)。在共軛(還原反應及視情況封端)之後，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術，來純化(相對於多醣-蛋白質共軛物之量增濃)糖共軛物。此等技術包括滲析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沈澱/溶離、管柱層析(DEAE或疏水相互作用層析)及深度過濾。糖共軛物可能藉由透濾及/或離子交換層析及/或尺寸排阻層析來純化。在一實施例中，糖共軛物藉由透濾或離子交換層析或尺寸排阻層析來純化。在一個實施例中，將糖共軛物進行無菌過濾。

在一較佳實施例中，藉由還原胺化來製備來自選自以下中之任一者之大腸桿菌血清型之糖共軛物：O25B、O1、O2及O6。在一較佳實施例中，藉由還原胺化來製備來自大腸桿菌血清型O25B、O1、O2及O6之糖共軛物。

在一個態樣中，本發明係關於一種共軛物，其包括與式O25B之醣連接之載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)，該醣以下式表示：，其中 n為大於或等於1之任何整數。在一較佳實施例中， n為至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40且至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50之整數。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。例示性範圍包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；及至少20至至多80。在一個較佳實施例中， n為至少31至至多90，更佳地40至90，最佳地60至85。

在另一態樣中，本發明係關於一種共軛物，其包括與醣連接之載體蛋白質(例如CRM ₁₉₇)，該醣具有表1 (亦參見圖9A至圖9C及圖10A至圖10B)中顯示之以下結構中之任一者，其中 n為大於或等於1之整數。

在不受理論或機制束縛之情況下，在一些實施例中，咸信穩定共軛物需要一定水準之醣抗原修飾，該醣抗原修飾與保持抗原之關鍵免疫原性抗原決定基之結構完整性進行平衡。

活化及醛之形成.在一些實施例中，本發明之醣經活化且使得形成醛。在其中醣經活化之此類實施例中，活化百分比(%) (或氧化程度(DO))係指醣重複單元莫耳數/經活化多醣之醛莫耳數。舉例而言，在一些實施例中，醣藉由多醣之重複單元上之鄰二醇之過碘酸氧化而經活化，從而使得形成醛。變化過碘酸鈉相對於醣重複單元之莫耳當量(meq)及氧化期間之溫度，產生變化水準之氧化程度(DO)。

醣及醛濃度通常藉由比色分析來測定。替代性試劑為TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶1-烴氧基)-N-氯丁二醯亞胺(NCS)組合，其引起自一級醇基團形成醛。

在一些實施例中，經活化醣具有以下之氧化程度，其中醣重複單元之莫耳數/經活化醣之醛之莫耳數係在1-100之間，諸如在2-80之間、在2-50之間、在3-30之間及在4-25之間。活化程度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、≥ 20、≥ 30、≥ 40、≥ 50、≥ 60、≥ 70、≥ 80或≥ 90，或約100。較佳地，氧化程度(DO)為至少5且至多50，更佳地至少10且至多25。在一個實施例中，活化程度為至少10且至多25。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。氧化程度值可表示為活化百分比(%)。舉例而言，在一個實施例中，10之DO值係指在經活化醣中，一個經活化醣重複單元/總共10個醣重複單元，在此情況下，10之DO值可表示為10%活化。

在一些實施例中，藉由還原胺化化學方法來製備之共軛物包括載體蛋白質及醣，其中醣包括選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，共軛物中之醣包括式中 n為1至1000、5至1000，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65之整數。

單端連接的共軛物.在一些實施例中，共軛物為單端連接的共軛醣，其中醣在該醣之一端與載體蛋白質共價結合。在一些實施例中，單端連接的共軛多醣具有末端醣。舉例而言，若多醣之末端(末端醣殘基)中之一者與載體蛋白質共價結合，則共軛物為單端連接。在一些實施例中，若多醣之末端醣殘基經由連接子與載體蛋白質共價結合，則共軛物為單端連接。此類連接子可包括例如胱胺連接子(A1)、3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼)連接子(A4)及2,2'-二硫基-N,N'-雙(乙烷-2,1-二基)雙(2-(胺氧基)乙醯胺)連接子(A6)。

在一些實施例中，醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與載體蛋白質共軛，形成單端連接的共軛物。參見例如實例18、實例19、實例20及圖24。

在一些實施例中，共軛物較佳地不為生物共軛物。術語「生物共軛物」係指蛋白質(例如載體蛋白質)與抗原(例如在宿主細胞背景中製備之O-抗原(例如O25B))之間的共軛物，其中宿主細胞機制將抗原與蛋白質連接(例如N-連接)。糖共軛物包括生物共軛物，以及藉由不需要在宿主細胞中製備共軛物之手段(例如藉由蛋白質與醣之化學連接來共軛)來製備之糖抗原(例如寡醣及多醣)-蛋白質共軛物。

經硫醇活化的醣.在一些實施例中，本發明之醣為經硫醇活化的。在其中醣為經硫醇活化之此類實施例中，活化百分比(%)係指每個經活化多醣之醣重複單元之硫醇莫耳數。醣及硫醇濃度通常藉由用於定量氫硫基之艾爾曼(Ellman)分析來測定。舉例而言，在一些實施例中，醣包括用二硫化胺連接子活化2-酮-3-去氧辛酸(KDO)。參見例如實例18及圖24。在一些實施例中，醣經由二價雜二官能連接子(在本文中亦被稱作「間隔基」)與載體蛋白質共價結合。連接子較佳地在醣與載體蛋白質之間提供硫醚鍵，從而產生在本文中稱作「硫醚糖共軛物」之糖共軛物。在一些實施例中，連接子進一步提供胺基甲酸酯及醯胺鍵，諸如(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)。參見例如實例13。

在一些實施例中，單端連接的共軛物包括載體蛋白質及醣，其中該醣包括選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，共軛物中之醣包括式，其中 n為1至1000、5至1000，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65之整數。

舉例而言，在一個實施例中，單端連接的共軛物包括載體蛋白質及醣，該醣具有選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101，其中 n為1至10之整數。

eTEC 共軛物在一個態樣中，本發明大體上係關於糖共軛物，其包含來源於上文所描述之大腸桿菌、經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基(如例如在美國專利9517274及國際專利申請公開案WO2014027302中所描述，其以其全文以引用之方式併入本文中)與載體蛋白質共價共軛之醣，包括含此類糖共軛物之免疫原性組合物；及用於製備及使用此類糖共軛物及免疫原性組合物之方法。該等糖共軛物包含經由一或多個eTEC間隔子與載體蛋白質共價共軛之醣，其中醣經由胺基甲酸酯連接與eTEC間隔基共價共軛，且其中載體蛋白質經由醯胺連接與eTEC間隔基共價共軛。eTEC間隔基包括七個線性原子(亦即-C(O)NH(CH ₂) ₂SCH ₂C(O)-)，且在醣與載體蛋白質之間提供穩定硫醚及醯胺鍵。

本發明之eTEC連接的糖共軛物可由以下通式(I)表示： (I)，其中包含eTEC間隔基之原子含於中心方框中。

在本發明之該等糖共軛物中，醣可為多醣或寡醣。

併本發明之糖共軛物入中之載體蛋白質係選自一般適合於此類目的之如本文進一步描述或熟習此項技術者已知之載體蛋白質的群。在特定實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

在另一態樣中，本發明提供一種製備包含經由eTEC間隔基與載體蛋白質共軛之本文所描述之醣之糖共軛物的方法，該方法包含以下步驟：a)在有機溶劑中，使醣與碳酸衍生物反應以產生經活化醣；b)使經活化醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使硫醇化醣與還原劑反應，以產生包含一或多個游離硫醇基殘基之經活化硫醇化醣；d)使經活化硫醇化醣與包含一或多個α-鹵乙醯胺基之經活化載體蛋白質反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白質共軛物；及e)使硫醇化醣-載體蛋白質共軛物與以下反應：(i)能夠對經活化載體蛋白質之未共軛α-鹵乙醯胺基團封端的第一封端試劑；及/或(ii)能夠對經活化硫醇化醣之未共軛游離硫醇基殘基封端的第二封端試劑；由此產生eTEC連接的糖共軛物。

在常見實施例中，碳酸衍生物為1,1'-羰基-二(1,2,4-三唑) (CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)。較佳地，碳酸衍生物為CDT，且有機溶劑為極性非質子溶劑，諸如二甲亞碸(DMSO)。在較佳實施例中，藉由經活化醣與雙功能對稱硫烷基胺試劑、胱胺或其鹽反應，來產生硫醇化醣。可替代地，可藉由經活化醣與半胱胺或其鹽反應，來形成硫醇化醣。藉由本發明之方法產生之eTEC連接的糖共軛物可由通式(I)表示。

在常見實施例中，第一封端試劑為N-乙醯基-L-半胱胺酸，其與載體蛋白質之離胺酸殘基上之未共軛α-鹵乙醯胺基團反應，形成經由硫醚連接與經活化離胺酸殘基共價連接之S-羧甲基半胱胺酸(CMC)殘基。

在其他實施例中，第二封端試劑為碘乙醯胺(IAA)，其與經活化硫醇化醣之未共軛游離氫硫基反應，得到經封端的硫乙醯胺。常見地，步驟e)包含用第一封端試劑及第二封端試劑進行封端。在某些實施例中，步驟e)包含用作為第一封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸及作為第二封端試劑之IAA進行封端。

在一些實施例中，封端步驟e)進一步包含在與第一及/或第二封端試劑反應之後，與還原劑，例如DTT、TCEP或巰基乙醇反應。

本發明之eTEC連接的糖共軛物及免疫原性組合物可包括游離硫醇基殘基。在一些情況下，藉由本文所提供之方法形成之經活化硫醇化醣將包括多個游離硫醇基殘基，其中一些可能在共軛步驟期間不經歷與載體蛋白質之共價共軛。藉由與硫醇反應性封端試劑，例如碘乙醯胺(IAA)反應，對此類殘餘游離硫醇基殘基進行封端，以將潛在地反應性官能基封端。亦涵蓋其他硫醇反應性封端試劑，例如含有順丁烯二醯亞胺之試劑及其類似者。

另外，本發明之eTEC連接的糖共軛物及免疫原性組合物可包括殘餘未共軛載體蛋白質，其可包括已在封端處理步驟期間經受修飾之經活化載體蛋白質。

在一些實施例中，步驟d)進一步包含在使經活化硫醇化醣與經活化載體蛋白質反應之前，提供包含一或多個α-鹵乙醯胺基團之經活化載體蛋白質。在常見實施例中，經活化載體蛋白質包含一或多個α-溴乙醯胺基團。

在另一態樣中，本發明提供一種eTEC連接的糖共軛物，其包含經由根據本文所揭示之方法中之任一者產生之eTEC間隔基與載體蛋白質共軛之本文所描述的醣。

在一些實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇，且經由eTEC間隔基在CRM ₁₉₇與多醣之間的共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中發生至少一次。

對於本發明之態樣中之每一者，在本文所描述之方法及組合物之特定實施例中，eTEC連接的糖共軛物包含本文所描述之醣，諸如來源於大腸桿菌之醣。

在另一態樣中，本發明提供一種預防、治療或改善個體之細菌性感染、疾病或病狀之方法，其包含向個體投與免疫學上有效量之本發明之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含含本文所描述之醣之eTEC連接的糖共軛物。在一些實施例中，醣係來源於大腸桿菌。

在一些實施例中，eTEC連接的糖共軛物包括載體蛋白質及醣，其中該醣包括選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，共軛物中之醣包括式，其中 n為1至1000、5至1000，較佳地31至100，更佳地35至90，最佳地35至65之整數。

變為與醣共軛之載體蛋白質中之離胺酸殘基之數目之特徵可為一系列經共軛離胺酸。舉例而言，在免疫原性組合物之一些實施例中，CRM ₁₉₇可包含4至16個/39個離胺酸殘基與醣共價連接。表述此參數之另一方式為約10%至約41%之CRM ₁₉₇離胺酸與醣共價連接。在其他實施例中，CRM ₁₉₇可包含2至20個/39個離胺酸殘基與醣共價連接。表述此參數之另一方式為約5%至約50%之CRM ₁₉₇離胺酸與醣共價連接。

在常見實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇，且經由eTEC間隔基在CRM ₁₉₇與多醣之間的共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中發生至少一次。

在其他實施例中，對於每5至10醣重複單元、每2至7醣重複單元、每3至8醣重複單元、每4至9醣重複單元、每6至11醣重複單元、每7至12醣重複單元、每8至13醣重複單元、每9至14醣重複單元、每10至15醣重複單元、每2至6醣重複單元, 每3至7醣重複單元、每4至8醣重複單元、每6至10醣重複單元、每7至11醣重複單元、每8至12醣重複單元、每9至13醣重複單元、每10至14醣重複單元、每10至20醣重複單元或每4至25醣重複單元，共軛物在載體蛋白質與醣之間包含至少一個共價連接。

在另一實施例中，對於多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個醣重複單元，在載體蛋白質與醣之間存在至少一個連接。

載體蛋白質本發明之糖共軛物之組分為與醣共軛之載體蛋白質。術語「蛋白質載劑」或「載體蛋白質」或「載劑」可在本文中互換使用。載體蛋白質對於標準共軛程序應為可改善的。

共軛物之一個組分為與O-多醣共軛之載體蛋白質。在一個實施例中，共軛物包括與O-多醣之核心寡醣(參見圖 17)共軛之載體蛋白質。在一個實施例中，共軛物包括與O-多醣之O-抗原共軛之載體蛋白質。

術語「蛋白質載劑」或「載體蛋白質」或「載劑」可在本文中互換使用。載體蛋白質對於標準共軛程序應為可改善的。

在一較佳實施例中，共軛物之載體蛋白質係獨立地選自以下中之任一者：TT、DT、DT突變(諸如CRM ₁₉₇)、流感嗜血桿菌( H.influenzae)蛋白質D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特定言之WO 01/98334及WO 03/54007中描述之彼等)、經解毒的肺炎鏈球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艱難梭菌( C. Difficile)之毒素A或毒素B及PsaA。在一實施例中，本發明之共軛物之載體蛋白質為DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明之共軛物之載體蛋白質為TT (破傷風類毒素)。在另一實施例中，本發明之共軛物之載體蛋白質為PD (流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)蛋白質D，參見例如EP 0 594 610 B)。

在一較佳實施例中，醣與CRM ₁₉₇蛋白共軛。CRM ₁₉₇蛋白為一種無毒性形式之白喉毒素，但在免疫學上與白喉毒素為不可區分的。CRM ₁₉₇由受藉由產毒棒狀桿菌噬菌體β之亞硝基胍突變誘發產生之無毒噬菌體β197tox ^-感染的棒狀白喉桿菌產生。CRM ₁₉₇蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但在結構基因中與其相差單鹼基變化(鳥嘌呤變為腺嘌呤)。此單鹼基變化引起成熟蛋白中之麩胺酸取代甘胺酸之胺基酸取代，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM ₁₉₇蛋白為醣之安全且有效的T細胞依賴性載劑。

因此，在一些實施例中，本發明之共軛物包括作為載體蛋白質之CRM ₁₉₇，其中醣與CRM ₁₉₇共價連接。

在一較佳實施例中，糖共軛物之載體蛋白質係選自由以下各者組成之群：DT (白喉毒素)；TT (破傷風類毒素)或TT之片段C；CRM197 (白喉毒素之無毒性但抗原一致變體)；其他DT突變體(諸如CRM176、CRM228、CRM 45 (Uchida等人J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103或CRM107；及由Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins, Frankel編, Maecel Dekker Inc, 1992中所描述之其他突變；缺失Glu-148或突變成Asp，缺失Gln或Ser及/或Ala 158或突變成GIy，及在US 4709017或US 4950740中揭示之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變，及在US 5917017或US 6455673中揭示之其他突變；或在US 5843711中揭示之片段)；肺炎球菌肺炎鏈球菌溶血素(Kuo等人 (1995) Infect lmmun 63; 2706-13)，包括以某種方式解毒的ply，例如dPLY-GMBS (WO 04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-formol、PhtX (包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE (在WO 00/37105或WO 00/39299中揭示PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列)；及Pht蛋白質之融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E (WO 01/98334、WO 03/54007、WO2009/000826)、OMPC (腦膜炎球菌外膜蛋白，通常提取自奈瑟氏腦膜炎菌(N. meningitidis)血清組B-EP0372501)、PorB (來自奈瑟氏腦膜炎菌)、PD (流感嗜血桿菌蛋白質D，參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫學上功能等效物；合成肽(EP0378881，EP0427347)；熱休克蛋白(WO 93/17712，WO 94/03208)；百日咳蛋白質(WO 98/58668，EP0471 177)；細胞介素；淋巴介質；生長因子或激素(WO 91/01146)；包含來自各種病原體源性抗原之多個人類CD4+ T細胞抗原決定基的人工蛋白質(Falugi等人 (2001 ) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824)，諸如N19蛋白(Baraldoi等人 (2004) Infect lmmun 72; 4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA (WO 02/091998)；鐵吸收蛋白(WO 01/72337)；艱難梭菌之毒素A或毒素B(WO 00/61761)；運鐵蛋白結合蛋白；肺炎球菌黏附蛋白(PsaA)；重組綠膿桿菌外毒素A (特定言之其無毒突變體(諸如攜帶在麩胺酸553處之取代之外毒素A (Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971))。其他蛋白質，諸如卵白蛋白、匙孔螺血氰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之經純化蛋白質衍生物(PPD)亦可用作載體蛋白質。其他適合的載體蛋白質包括滅活細菌毒素，諸如霍亂類毒素(例如如國際專利申請案第WO 2004/083251號中所描述)；大腸桿菌LT；大腸桿菌ST；及來自綠膿桿菌之外毒素A。

在一些實施例中，載體蛋白質係選自以下中之任一者：例如CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌( P. aeruginosa)之經解毒的外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、鞭毛蛋白、金黃色葡萄球菌( S. aureus)之經解毒的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae)肺炎鏈球菌溶血素及其經解毒的變體、空腸彎麴菌( C. jejuni) AcrA及空腸彎麴菌天然醣蛋白。在一個實施例中，載體蛋白質為經解毒的綠膿桿菌外毒素(EPA)。在另一實施例中，載體蛋白質不為經解毒的綠膿桿菌外毒素(EPA)。在一個實施例中，載體蛋白質為鞭毛蛋白。在另一實施例中，載體蛋白質不為鞭毛蛋白。

在一較佳實施例中，糖共軛物之載體蛋白質獨立地選自由以下各者組成之群：TT、DT、DT突變(諸如CRM ₁₉₇)、流感嗜血桿菌( H.influenzae)蛋白質D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特定言之WO 01/98334及WO 03/54007中描述之彼等)、經解毒的肺炎鏈球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艱難梭菌( C. Difficile)之毒素A或毒素B及PsaA。在一實施例中，本發明之糖共軛物之載體蛋白質為DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明之糖共軛物之載體蛋白質為TT (破傷風類毒素)。在另一實施例中，本發明之糖共軛物之載體蛋白質為PD (流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白質D，參見例如EP 0 594 610 B)。

在一較佳實施例中，本發明之莢膜醣與CRM ₁₉₇蛋白共軛。CRM ₁₉₇蛋白為一種無毒性形式之白喉毒素，但在免疫學上與白喉毒素為不可區分的。CRM ₁₉₇由受藉由產毒棒狀桿菌噬菌體β之亞硝基胍突變誘發產生之無毒噬菌體β197tox感染的棒狀白喉桿菌產生(Uchida, T等人 1971, Nature New Biology 233:8-11)。CRM ₁₉₇蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但在結構基因中與其相差單鹼基變化(鳥嘌呤變為腺嘌呤)。此單鹼基變化引起成熟蛋白中之麩胺酸取代甘胺酸之胺基酸取代，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM ₁₉₇蛋白為醣之安全且有效的T細胞依賴性載劑。關於CRM ₁₉₇及其產生之其他細節可例如在US 5,614,382中找到。

因此，在常見實施例中，本發明之糖共軛物包含作為載體蛋白質之CRM ₁₉₇，其中莢膜多醣與CRM ₁₉₇共價連接。

組合物及疫苗本發明人另外研發出包括上文所描述之至少一種醣的組合物及包括上文所描述之至少一種共軛物的組合物。在一較佳實施例中，組合物為免疫原性組合物。在另一實施例中，組合物為疫苗。

在一個態樣中，免疫原性組合物包括本文所揭示之醣中之任一者。在一較佳態樣中，免疫原性組合物包括本文所揭示之共軛物中之任一者。

在一個實施例中，免疫原性組合物包括來自大腸桿菌血清型O25，較佳地血清型O25b之至少一種糖共軛物。在一個實施例中，免疫原性組合物包括來自大腸桿菌血清型O1，較佳地血清型O1a之至少一種糖共軛物。在一個實施例中，免疫原性組合物包括來自大腸桿菌血清型O2之至少一種糖共軛物。在一個實施例中，免疫原性組合物包括來自大腸桿菌血清型O6之至少一種糖共軛物。

在一個實施例中，免疫原性組合物包括選自以下大腸桿菌血清型中之任一者之至少一種糖共軛物：O25、O1、O2及O6，較佳地O25b、O1a、O2及O6。在一個實施例中，免疫原性組合物包括選自以下大腸桿菌血清型中之任一者之至少兩種糖共軛物：O25、O1、O2及O6，較佳地O25b、O1a、O2及O6。在一個實施例中，免疫原性組合物包括選自以下大腸桿菌血清型中之任一者之至少三種糖共軛物：O25、O1、O2及O6，較佳地O25b、O1a、O2及O6。在一個實施例中，免疫原性組合物包括選自以下大腸桿菌血清型中之每一者之糖共軛物：O25、O1、O2及O6，較佳地O25b、O1a、O2及O6。

在一較佳實施例中，以上免疫原性組合物中之任一者之糖共軛物獨立地與CRM ₁₉₇共軛。

因此，組合物包括來自至少一個大腸桿菌血清型之O-抗原。在一較佳實施例中，組合物包括來自大於1個大腸桿菌血清型之O-抗原。舉例而言，組合物可包括來自兩個不同大腸桿菌血清型(或「v」，價數)至12個不同血清型(12v)之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自3個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自4個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自5個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自6個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自7個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自8個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自9個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自10個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自11個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自12個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自13個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自14個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自15個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自16個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自17個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自18個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自19個不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括來自20個不同血清型之O-抗原。

較佳地，大腸桿菌醣之數目可以在1個血清型(或「v」，價數)至26個不同血清型(26v)範圍內。在一個實施例中，存在一個血清型。在一個實施例中，存在2個不同血清型。在一個實施例中，存在3個不同血清型。在一個實施例中，存在4個不同血清型。在一個實施例中，存在5個不同血清型。在一個實施例中，存在6個不同血清型。在一個實施例中，存在7個不同血清型。在一個實施例中，存在8個不同血清型。在一個實施例中，存在9個不同血清型。在一個實施例中，存在10個不同血清型。在一個實施例中，存在11個不同血清型。在一個實施例中，存在12個不同血清型。在一個實施例中，存在13個不同血清型。在一個實施例中，存在14個不同血清型。在一個實施例中，存在15個不同血清型。在一個實施例中，存在16個不同血清型。在一個實施例中，存在17個不同血清型。在一個實施例中，存在18個不同血清型。在一個實施例中，存在19個不同血清型。在一個實施例中，存在20個不同血清型。在一個實施例中，存在21個不同血清型。在一個實施例中，存在22個不同血清型。在一個實施例中，存在23個不同血清型。在一個實施例中，存在24個不同血清型。在一實施例中，存在25個不同血清型。在一個實施例中，存在26個不同血清型。醣與載體蛋白質共軛，以形成如本文所描述之糖共軛物。

在一個態樣中，組合物包括含來自至少一個大腸桿菌血清組之O-抗原的糖共軛物，其中O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自大於1個大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自3個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自4個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自5個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自6個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自7個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自8個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自9個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自10個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自11個不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自12個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自13個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自14個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自15個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自16個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自17個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自18個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自19個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自20個不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白質共軛。

在另一態樣中，組合物包括來自至少一個大腸桿菌血清型之O-多醣。在一較佳實施例中，組合物包括來自大於1個大腸桿菌血清型之O-多醣。舉例而言，組合物可包括來自兩個不同大腸桿菌血清型至12個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自3個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自4個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自5個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自6個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自7個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自8個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自9不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自10個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自11個不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自12個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自13個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自14個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自15個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自16個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自17個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自18個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自19個不同血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自20個不同血清型之O-多醣。

在一較佳實施例中，組合物包括來自至少一個大腸桿菌血清型之O-多醣，其中O-多醣與載體蛋白質共軛。在一較佳實施例中，組合物包括來自大於1個大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。舉例而言，組合物可包括來自兩個不同大腸桿菌血清型至12個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自3個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自4個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自5個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自6個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自7個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自8個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自9個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自10個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自11個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自12個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自13個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自14個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自15個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自16個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自17個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自18個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自19個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。在一個實施例中，組合物包括來自20個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛。

在一個最佳實施例中，組合物包括來自至少一個大腸桿菌血清型之O-多醣，其中O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一較佳實施例中，組合物包括來自大於1個大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。舉例而言，組合物可包括來自兩個不同大腸桿菌血清型至12個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自3個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自4個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自5個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自6個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自7個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自8個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自9個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自10個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自11個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自12個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自13個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自14個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自15個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自16個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自17個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自18個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自19個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自20個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白質共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一較佳實施例中，載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

在另一較佳實施例中，組合物包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O25a及核心醣，其中 n為至少40。在一較佳實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O25b及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O1a及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O2及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O6及核心醣，其中 n為至少40。

在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O17及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O15及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O18A及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O75及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O4及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O16及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O13及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O7及核心醣，其中 n為至少40。

在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O8及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，O-多醣包括式O8，其中 n為1-20，較佳地2-5，更佳地3。式O8例如顯示於圖 10B中。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O9及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，O-多醣包括式O9，其中 n為1-20，較佳地4-8，更佳地5。式O9例如顯示於圖 10B中。在另一實施例中，O-多醣包括式O9a，其中 n為1-20，較佳地4-8，更佳地5。式O9a例如顯示於圖 10B中。

在一些實施例中，O-多醣包括選自以下中之任一者：式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101，其中 n為1-20，較佳地4-8，更佳地5。參見例如圖 10B。

如上文所描述，組合物可包括經共軛O-多醣(抗原)之任何組合。在一例示性實施例中，組合物包括含式O25b之多醣、含式O1A之多醣、含式O2之多醣及含式O6之多醣。更具體言之，諸如包括以下之組合物：(i)與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O25b及核心醣，其中 n為至少40；(ii)與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O1a及核心醣，其中 n為至少40；(iii)與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O2及核心醣，其中 n為至少40；及(iv)與CRM ₁₉₇共軛之O-多醣，其中O-多醣包括式O6及核心醣，其中 n為至少40。

在一個實施例中，組合物包括來源於任何大腸桿菌血清型之至少一種O-多醣，其中血清型不為O25a。舉例而言，在一個實施例中，組合物不包括含式O25a之醣。此種組合物可包括例如含式O25b之O-多醣、含式O1A之O-多醣、含式O2之O-多醣及含式O6之O-多醣。

在一個實施例中，組合物包括來自2個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自3個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自4個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自5個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自6個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自7個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自8個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自9個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自10個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自11個不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自12個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自13個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自14個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自15個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自16個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自17個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自18個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自19個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自20個不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇共軛，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含與載體蛋白質共價結合之醣的共軛物，其中醣包括式O25b，其中 n為15 ± 2。在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含與載體蛋白質共價結合之醣的共軛物，其中醣包括式O25b，其中 n為17 ± 2。在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含與載體蛋白質共價結合之醣的共軛物，其中醣包括式O25b，其中 n為55 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含與載體蛋白質共價結合之醣的共軛物，其中醣包括式O25b，其中 n為51 ± 2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌K12核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接的共軛來製備共軛物。在一個實施例中，藉由較佳地在DMSO緩衝液中之還原胺化化學方法來製備共軛物。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O25B多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所測定。因此，可比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性，且比較其對於血清型O25B之反應以評定可能的反應者增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O25B，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O25B，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O25B之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O25B至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O25B至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O25B之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O25B之人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O1a，其中 n為39 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O1a，其中 n為13 ± 2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接的共軛來製備共軛物。在一個實施例中，藉由較佳地在DMSO緩衝液中之還原胺化化學方法來製備共軛物。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O1A多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所測定。因此，可比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性，且比較其對於血清型O1A之反應以評定可能的反應者增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O1A，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O1A，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O1A之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O1A至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O1A至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O1A之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O1A之人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O2，其中 n為43 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O2，其中 n為47 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O2，其中 n為17 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O2，其中 n為18 ± 2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R4核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接的共軛來製備共軛物。在一個實施例中，藉由較佳地在DMSO緩衝液中之還原胺化化學方法來製備共軛物。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O2多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所測定。因此，可比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性，且比較其對於血清型O2之反應以評定可能的反應者增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O2，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O2，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O2之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O2至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O2至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O2之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O2之人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O6，其中 n為42 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O6，其中 n為50 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O6，其中 n為17 ± 2。在另一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包括含共價結合載體蛋白質之醣的共軛物，其中醣包括式O6，其中 n為18 ± 2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接的共軛來製備共軛物。在一個實施例中，藉由較佳地在DMSO緩衝液中之還原胺化化學方法來製備共軛物。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O6多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所測定。因此，可比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性，且比較其對於血清型O6之反應以評定可能的反應者增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O6，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起功能抗體，該等抗體能夠殺死大腸桿菌血清型O6，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O6之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O6至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引起針對大腸桿菌血清型O6至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O6之反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O6之人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，組合物包括含與載體蛋白質共價結合之醣之共軛物，其中醣包括選自以下中之任一者的結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100的整數。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R2核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R3核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R4核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌K12核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接的共軛來製備共軛物。在一個實施例中，藉由較佳地在DMSO緩衝液中之還原胺化化學方法來製備共軛物。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。在一個實施例中，組合物進一步包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29種額外共軛物至至多30種額外共軛物，各共軛物包括與載體蛋白質共價結合之醣，其中醣包括選自該等式中之任一者的結構。

組合物之劑量各劑量中之糖共軛物之量經選擇為誘導免疫保護性反應而無典型疫苗中之明顯不良副作用之量。此種量將視採用哪種特定免疫原及其如何提供而變化。

可基於彼共軛物(經共軛及未共軛)之總多醣，來計算免疫原性組合物中之特定糖共軛物之量。舉例而言，在100 g多醣劑量中，具有20%游離多醣之糖共軛物將具有約80 g之經共軛多醣及約20 g之未共軛多醣。糖共軛物之量可視大腸桿菌血清型而變化。可藉由糖醛酸分析來測定醣濃度。

免疫原性組合物中之不同多醣組分之「 免疫原性量」可分散，且各自可包含約1.0 g、約2.0 g、約3.0 g、約4.0 g、約5.0 g、約6.0 g、約7.0 g、約8.0 g、約9.0 g、約10.0 g、約15.0 g、約20.0 g、約30.0 g、約40.0 pg、約50.0 pg、約60.0 pg、約70.0 pg、約80.0 pg、約90.0 pg或約100.0 g之任何特定多醣抗原。一般而言，對於給定血清型，各劑量將包含0.1 g至100 g之多醣，特定言之0.5 g至20 g，更特定言之1 g至10 g，及甚至更特定言之2 g至5 g。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。在一個實施例中，對於給定血清型，各劑量將包含1 g、2 g、3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g、10 g、15 g或20 g之多醣。

載體蛋白質量 .一般而言，各劑量將包含5 g至150 g之載體蛋白質，特定言之10 g至100 g之載體蛋白質，更特定言之15 g至100 g之載體蛋白質，更特定言之25至75 g之載體蛋白質，更特定言之30 g至70 g之載體蛋白質，更特定言之30至60 g之載體蛋白質，更特定言之30 g至50 g之載體蛋白質及甚至更特定言之40至60 g之載體蛋白質。在一個實施例中，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，各劑量將包含約25 g、約26 g、約27 g、約28 g、約29 g、約30 g、約31 g、約32 g、約33 g、約34 g、約35 g、約36 g、約37 g、約38 g、約39 g、約40 g、約41 g、約42 g、約43 g、約44 g、約45 g、約46 g、約47 g、約48 g、約49 g、約50 g、約51 g、約52 g、約53 g、約54 g、約55 g、約56 g、約57 g、約58 g、約59 g、約60 g、約61 g、約62 g、約63 g、約64 g、約65 g、約66 g、約67 g、68 g、約69 g、約70 g、約71 g、約72 g、約73 g、約74 g或約75 g之載體蛋白質。在一個實施例中，該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。

佐劑在一些實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物可進一步包含至少一種、兩種或三種佐劑。術語「佐劑」係指增強對於抗原之免疫反應之化合物或混合物。抗原可主要用作遞送系統，主要用作免疫調節物或具有兩者之強力特徵。適合的佐劑包括適用於哺乳動物(包括人類)之彼等。

已知可在人類中使用之適合的遞送系統類型佐劑之實例包括(但不限於)明礬(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)、磷酸鈣、脂質體、水包油乳液(諸如MF59) (4.3% w/v角鯊烯，0.5% w/v 聚山梨醇酯80 (Tween 80)，0.5% w/v脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳液(諸如孟塔納(Montanide))及聚(D,L-丙交酯-共聚-乙交酯) (PLG)微米粒子或奈米粒子。

在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之鋁鹽(明礬) (例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)。在一較佳實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之磷酸鋁或氫氧化鋁。在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含0.1 mg/mL至1 mg/mL或0.2 mg/mL至0.3 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物包含約0.25 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。已知可在人類中使用之適合的免疫調節類型佐劑之實例包括(但不限於)自阿奎拉(Aquilla)樹之樹皮之皂素提取物(QS21，Quil A)、TLR4促效劑(諸如MPL (單磷醯基脂質A)、3DMPL (3-O-去醯化MPL)或GLA-AQ)、LT/CT突變體、細胞介素(諸如多種介白素(例如IL-2、IL-12)或GM-CSF)、AS01及其類似者。

已知可在人類中使用之具有遞送及免疫調節特徵兩者之適合的免疫調節類型佐劑之實例包括(但不限於) ISCOMS (參見例如Sjölander等人 (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 2006/134423及WO 2007/026190)或GLA-EM (其為TLR4促效劑與水包油乳液之組合)。

對於包括(但不限於)動物實驗之獸醫學應用，吾人可使用弗氏完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant；CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)、Emulsigen、N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，被稱作去甲MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(CGP 19835A，被稱作MTP-PE)及RIBI，其含有含自細菌提取之三種組分(單磷醯基脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁構架(MPL+TDM+CWS))的2%角鯊烯/Tween 80乳液。

增強本文所揭示之免疫原性組合物之效果之其他例示性佐劑包括(但不限於)：(1)水包油乳液調配物(具有或不具有其他特定免疫刺激劑，諸如胞壁醯基肽(參見下文)或細菌細胞壁組分)，諸如(a) SAF，其含有微流化成次微米級乳液或渦旋以產生較大粒徑乳液之10%角鯊烷、0.4% Tween 80、5%普洛尼克嵌段的聚合物L121及thr-MDP，及(b) RIBI™佐劑系統(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.)，其含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種細菌細胞壁組分(諸如單磷醯脂A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳地MPL+CWS (DETOX™)；(2)可使用皂素佐劑，諸如QS21、STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.)、ABISCO® (Isconova, Sweden)或ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia)，或自其產生之粒子，諸如ISCOMs (免疫刺激複合物)，該ISCOMS可不含額外清潔劑(例如WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐劑(CFA)及弗氏不完全佐劑(IFA)；(4)細胞介素，諸如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 (例如WO 99/44636))、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯脂A (MPL)或3 -O-去醯化MPL (3dMPL) (參見例如GB2220211、EP0689454) (參見例如WO 00/56358)；(6) 3dMPL與例如QS21及/或水包油乳液之組合(參見例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧化乙烯醚或聚氧化乙烯酯(參見例如WO 99/52549)；(8)與辛苯聚醇組合之聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑(例如WO 01/21207)或與至少一種額外非離子界面活性劑(諸如辛苯聚醇)組合之聚環氧乙烷烷基醚或酯界面活性劑(例如WO 01/21152)；(9)皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸) (例如WO 00/62800)；(10)免疫刺激劑及金屬鹽粒子(參見例如WO 00/23105)；(11)皂素及水包油乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂素(例如QS21) +3dMPL+IM2 (視情況+固醇) (例如WO 98/57659)；(13)充當增強組合物之功效之免疫刺激劑的其他物質。胞壁醯基肽包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(去甲MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之CpG寡核苷酸。如本文所用，CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡脫氧核苷酸(CpG ODN)，且因此除非另外指示，否則此等術語可互換地使用。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有視情況在某些較佳的鹼基情況內為未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸之一或多個免疫刺激性CpG基元。CpG免疫刺激性基元之甲基化狀態一般係指二核苷酸中之胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸為含有藉由磷酸酯鍵與3'鳥嘌呤連接之5'未甲基化胞嘧啶且經由與Toll樣受體9 (TLR-9)結合而活化免疫系統的寡核苷酸。在另一實施例中，免疫刺激性寡核苷酸可含有將經由TLR9活化免疫系統但不如CpG基元未甲基化一樣強烈之一或多個甲基化CpG二核苷酸。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含轉而可包圍CpG二核苷酸之一或多個回文結構。CpG寡核苷酸已在多個頒予專利、公開專利申請案及其他公開案中描述，包括美國專利第6,194,388號、第6,207,646號、第6,214,806號、第6,218,371號、第6,239,116號；及第6,339,068號。

在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原性組合物包含在WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行所描述之CpG寡核苷酸中之任一者。

已鑑別出不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸。此等被稱為A、B、C及P類，且更詳細地描述在WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行。本發明之方法涵蓋此等不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸之用途。

調配物本發明之免疫原性組合物可調配呈液體形式(亦即溶液或懸浮液)或呈凍乾形式。液體調配物可宜直接自其封裝形式投與，且因此在無需如本發明之凍乾組合物另外所需之復原於水性介質中之情況下對於注射為理想的。

本發明之免疫原性組合物之調配可使用此項技術中公認的方法來實現。舉例而言，可將個別共軛物與生理學上可接受之媒劑一起調配以製備組合物。此類媒劑之實例包括(但不限於)水、緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇)及右旋糖溶液。

本發明提供一種免疫原性組合物，其包含本文所揭示之糖共軛物與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑之組合中之任一者。

在某些實施例中，免疫原性組合物調配物包括醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或醫藥學上可接受之載劑。在一個實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑包括無菌水、注射用水、無菌等張鹽水或生物學緩衝液。以習知方式，將多醣-蛋白質共軛物及/或蛋白質免疫原與此類稀釋劑或載劑混合。如本文所用，措辭醫藥學上可接受之「載劑」意欲包括與向人類或其他脊椎動物宿主投與相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似者。適當載劑對於熟習此項技術者而言為明顯的，且將很大程度上視投與途徑而定。

舉例而言，可存在於免疫原性組合物調配物中之賦形劑包括防腐劑、化學穩定劑及懸浮劑或分散劑。通常，穩定劑、防腐劑及其類似者經最佳化以判定對於在目標接受者(例如人類個體)中之功效為最佳調配。防腐劑之實例包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、酚及對氯苯酚。穩定化成分之實例包括酪蛋白胺基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、二磷酸一鉀、乳糖、乳白蛋白水解產物及乾燥奶粉。

在一實施例中，本發明之免疫原性組合物呈液體形式，較佳地呈水性液體形式。

本發明之免疫原性組合物可包含以下中之一或多者：緩衝液、鹽、二價陽離子、非離子性清潔劑、低溫保護劑(諸如糖)及抗氧化劑(諸如自由基清除劑或螯合劑)或其任何多個組合。

在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包含緩衝液。在一實施例中，該緩衝液具有約3.5至約7.5之pKa。在一些實施例中，緩衝液為磷酸鹽、丁二酸鹽、組胺酸鹽或檸檬酸鹽。在某些實施例中，緩衝液為在1 mM至10 mM之最終濃度下之丁二酸鹽。在一個特定實施例中，丁二酸鹽緩衝液之最終濃度為約5 mM。

在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包含鹽。在一些實施例中，鹽係選自以下中之任一者：氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉及其組合。在一些實施例中，鹽係選自由以下組成之群：氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉及其組合。在一個特定實施例中，鹽為氯化鈉。在一個特定實施例中，本發明之免疫原性組合物包含在150 mM下之氯化鈉。

在一實施例中，本發明之免疫原性組合物包含界面活性劑。在一些實施例中，組合物包括非離子界面活性劑，包括(但不限於)聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯。在一實施例中，界面活性劑係選自以下中之任一者：聚山梨醇酯20 (TWEEN™20)、聚山梨醇酯40 (TWEEN™40)、聚山梨醇酯60 (TWEEN™60)、聚山梨醇酯65 (TWEEN™65)、聚山梨醇酯80 (TWEEN™80)、聚山梨醇酯85 (TWEEN™85)、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯聚醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧化乙烯-660羥基硬脂酸酯(PEG-15，Solutol H 15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(CREMOPHOR® EL)、大豆卵磷脂及泊洛沙姆(poloxamer)。在一實施例中，界面活性劑係選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20 (TWEEN™20)、聚山梨醇酯40 (TWEEN™40)、聚山梨醇酯60 (TWEEN™60)、聚山梨醇酯65 (TWEEN™65)、聚山梨醇酯80 (TWEEN™80)、聚山梨醇酯85 (TWEEN™85)、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯聚醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧化乙烯-660羥基硬脂酸酯(PEG-15，Solutol H 15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(CREMOPHOR® EL)、大豆卵磷脂及泊洛沙姆。在一些實施例中，組合物進一步包括以下聚氧化乙烯烷基醚中之任一者，包括(但不限於)BRIJ 58、BRIJ 35、TRITON X-100、TRITON X-114、NP40、SPAN 85及普洛尼克(pluronic)系列之非離子界面活性劑，例如普洛尼克121。在一個特定實施例中，界面活性劑為聚山梨醇酯80。在一些該實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為至少0.0001%至10%重量/重量 (w/w)聚山梨醇酯80。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為至少0.001%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在一些該等實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為至少0.01%至1%重量/重量(w/w)聚山梨醇酯80。在其他實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中之聚山梨醇酯80之最終濃度為1% (w/w)聚山梨醇酯80。

在某些實施例中，本發明之免疫原性組合物具有5.5至7.5之pH，更佳地5.6至7.0 之pH，甚至更佳地5.8至6.0 之pH。

在一個實施例中，本發明提供一種填充有本文所揭示之免疫原性組合物中之任一者之容器。在一個實施例中，容器係選自以下中之任一者：小瓶、注射器、燒瓶、醱酵器、生物反應器、袋子、廣口瓶、安瓿、柱及拋棄式筆。在一個實施例中，容器係選自由以下組成之群：小瓶、注射器、燒瓶、醱酵器、生物反應器、袋子、廣口瓶、安瓿、柱及拋棄式筆。在某些實施例中，容器為矽化的。在一實施例中，本發明之容器係由玻璃、金屬(例如鋼、不鏽鋼、鋁等)及/或聚合物(例如熱塑性塑膠、彈性體、熱塑性彈性體)製成。在一實施例中，本發明之容器係由玻璃製成。

在一個實施例中，本發明提供一種填充有本文所揭示之免疫原性組合物中之任一者之注射器。在某些實施例中，注射器為矽化的及/或係由玻璃製成。

注射用之本發明之免疫原性組合物之通常劑量具有0.1 mL至2 mL，更佳地0.2 mL至1 mL之體積，甚至更佳地約0.5 mL之體積

因此，如上文所定義之容器或注射器填充有0.1 mL至2 mL，更佳地0.2 mL至1 mL之體積，甚至更佳地約0.5 mL之體積之任一本文所定義的免疫原性組合物。

本發明之組合物可藉由一或多種已知方法，諸如非經腸、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、經皮內、經鼻內、皮下、腹膜內來投與至個體，且相應地調配。

在一個實施例中，本發明之組合物經由表皮注射、肌肉內注射、靜脈內、動脈內、皮下注射或呼吸黏膜內注射液體製劑來投與。本發明組合物可調配為單次劑量小瓶、多劑量小瓶或調配為預填充注射器形式。

在另一實施例中，本發明之組合物經經口投與，且因此調配呈適合於經口投與之形式，亦即呈固體或液體製劑形式。固體口服調配物包括錠劑、膠囊、丸劑、粒劑、團塊及其類似者。液體口服調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似者。用於液體調配物之醫藥學上可接受之載劑為水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。

水性載劑包括水、醇溶液/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。油之實例為動物、植物或合成來源之彼等，例如花生油、大豆油、橄欖油、葵花子油、魚肝油、另一海洋油，或來自牛奶或蛋之脂質。

醫藥組合物可為等張、低張或高張的。用於輸注或注射之醫藥組合物在投與其時較佳地為基本上等張的。對於儲存，醫藥組合物可較佳地為等張或高張的。若對於儲存，醫藥組合物為高張的，則其可在投與之前經稀釋以變成等張溶液。等張劑可為離子性等張劑(諸如鹽)或非離子性等張劑(諸如碳水化合物)。離子性等張劑之實例包括(但不限於) NaCl、CaCl ₃、KCl及MgCl ₂。非離子性等張劑之實例包括(但不限於)蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇及甘油。

亦為較佳的是，至少一種醫藥學上可接受之添加劑為緩衝液。出於一些目的，例如當醫藥組合物意欲用於輸注或注射時，常常需要組合物包含緩衝液，其能夠將溶液緩衝至在4至10，諸如5至9，例如6至8範圍內之pH。緩衝液可例如選自以下中之任一者：Tris、乙酸鹽、麩胺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、L-組胺酸、甘胺酸、丁二酸鹽及三乙醇胺緩衝液。緩衝液可此外例如選自用於非經腸用途(特定言之，當醫藥調配物係用於非經腸用途時)之USP相容性緩衝液。舉例而言，緩衝液可選自以下中之任一者：一元酸，諸如乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甘油酸及乳酸；二元酸，諸如烏頭酸、己二酸、抗壞血酸、碳酸、麩胺酸、蘋果酸、丁二酸及酒石酸；多元酸，諸如檸檬酸及磷酸；及鹼，諸如氨水、二乙醇胺、甘胺酸、三乙醇胺及Tris。非經腸媒劑(用於皮下、靜脈內、動脈內或肌肉內注射)包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏溶液及不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充劑)及類似媒劑。實例為添加或不添加界面活性劑及其他醫藥學上可接受之佐劑之無菌液體，諸如水及油。一般而言，水、鹽水、水性右旋糖及相關糖溶液、二醇(諸如丙二醇或聚乙二醇)、聚山梨醇酯80 (PS-80)、聚山梨醇酯20 (PS-20)及泊洛沙姆188 (PI 88)為較佳的液體載劑，特定言之對於可注射溶液。油之實例為動物、植物或合成來源之彼等，例如花生油、大豆油、橄欖油、葵花子油、魚肝油、另一海洋油，或來自牛奶或蛋之脂質。

調配物可進一步包括界面活性劑。較佳的界面活性劑包括(但不限於)：聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑(通常被稱作TWEEN)，尤其PS-20及PS-80；在DOWFAX™商標名下銷售之氧化乙烯(EO)、環氧丙烷(PO)及/或環氧丁烷(BO)之共聚物，諸如線性EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚醇，其之重複乙氧基(氧基-1,2-乙二基)之數目可變化，其中辛苯聚醇-9 (TRITON X-100或第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)尤其受關注；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，諸如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，諸如TERGITOL™NP系列；衍生於月桂醇、鯨蠟醇、十八烷醇及油醇之聚氧化乙烯脂肪醚(被稱為BRIJ界面活性劑)，諸如三乙二醇醚(BRIJ 30)；及脫水山梨糖醇酯(通常被稱為SPAN)，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯(SPAN 85)及脫水山梨糖醇單月桂酸酯。含於乳液中之較佳的界面活性劑為PS-20或PS-80。

可使用界面活性劑之混合物，例如PS-80/SPAN 85混合物。聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯(諸如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(PS-80))與辛苯聚醇(諸如第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇TRITON X-100))之組合亦為適合的。另一適用組合包含月桂醇醚9加聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯及/或辛苯聚醇。

調配物亦可包括pH-緩衝鹽水溶液。緩衝液可例如選自以下中之任一者：Tris、乙酸鹽、麩胺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、L-組胺酸、甘胺酸、丁二酸鹽、HEPES (4-(2-羥乙基)-L-哌嗪乙磺酸酸)、MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)、MES (2-(N-嗎啉基)乙磺酸)及三乙醇胺緩衝液。緩衝液能夠將溶液緩衝至在4至10、5.2至7.5或5.8至7.0範圍內之pH。在某些態樣中，緩衝液選自以下中之任一者：磷酸鹽、丁二酸鹽、L-組胺酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸鹽或檸檬酸鹽。緩衝液可此外例如選自用於非經腸用途(特定言之，當醫藥調配物係用於非經腸用途時)之USP相容性緩衝液。緩衝液之濃度將在1 mM至50 mM或5 mM至50 mM範圍內。在某些態樣中，緩衝液為在5 mM至50 mM之最終濃度下之L-組胺酸或在1 mM至10 mM之最終濃度下之丁二酸鹽。在某些態樣中，L-組胺酸係在20 mM ± 2 mM之最終濃度下。

儘管鹽水溶液(亦即包括NaCl之溶液)為較佳的，但適合於調配物之其他鹽包括(但不限於) CaCl ₃、KCl及MgCl ₂及其組合。可使用包括(但不限於)蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇及甘油之非離子性等張劑來代替鹽。適合的鹽範圍包括(但不限於) 25 mM至500 mM或40 mM至170 mM。在一個態樣中，鹽水為NaCl，視情況以20 mM至170 mM之濃度存在。在一較佳實施例中，調配物包含具有氯化鈉之L-組胺酸緩衝液。

在另一實施例中，醫藥組合物係以控制釋放系統形式遞送。舉例而言，藥劑可使用靜脈內輸注、經皮貼片、脂質體或其他投與模式來投與。在另一實施例中，使用聚合材料；例如以微球體形式或以植入物形式。

活性在一個實施例中，本文所描述之醣能夠誘導調理性活性。在另一實施例中，本文所描述之醣能夠誘導調理性及吞噬性活性(例如調理吞噬活性)。

本發明人出人意料地發現，相較於野生型醣，重複單元相較於對應野生型醣增加之醣在哺乳動物中誘導免疫反應之增加。本發明人亦出人意料地發現，相較於投與包括含載體蛋白質及對應野生型醣之共軛物之組合物的哺乳動物，包括含載體蛋白質及重複單元相較於對應野生型醣增加之醣之共軛物的組合物在哺乳動物中誘導免疫反應的增加。在不受機制或理論束縛之情況下，重複單元增加之醣之保留抗原決定基可增加，此會引起免疫反應的增加。

調理性活性或調理作用係指調理素(例如抗體或補體因子)藉以與抗原(例如本文所描述之醣或其共軛物)結合之過程，其有助於將抗原黏附於吞噬細胞(phagocyte/phagocytic cell) (例如巨噬細胞、樹突狀細胞及多形核白血球(PMNL)。一些細菌，諸如由於莢膜存在而通常不會被吞噬之膜包裹細菌，在用調理性抗體包覆時，變得更可能被吞噬細胞識別。在一個實施例中，醣誘導免疫反應，諸如呈調理性之抗體。在一個實施例中，調理性活性係針對革蘭氏陰性細菌，較佳地針對大腸桿菌( Echerichia)物種，更佳地針對至少一種大腸桿菌菌株。

吞噬活性或吞噬作用係指吞噬細胞細胞藉以吞噬材料且將該材料包圍在其細胞質中之過程。在一個實施例中，醣誘導免疫反應，諸如有助於吞噬作用之抗體。在一個實施例中，吞噬活性係針對革蘭氏陰性細菌，較佳地針對大腸桿菌物種，更佳地針對至少一種大腸桿菌菌株。舉例而言，針對本文所描述之經分離醣升高之兔抗體可在存在補體之情況下，能夠介導表現醣之菌株之調理吞噬作用特異性，如例如藉由活體外吞噬作用分析所指示。

在又一實施例中，本文所描述之醣能夠誘導殺細菌免疫反應。在一個實施例中，殺菌活性係針對革蘭氏陰性細菌，較佳地針對大腸桿菌物種，更佳地針對至少一種大腸桿菌菌株。

用於量測調理作用、吞噬作用及/或殺菌活性之方法為此項技術中已知的，諸如藉由量測活體內細菌負荷之降低(例如藉由量測受大腸桿菌刺激之哺乳動物中之菌血症水準)及/或藉由量測活體外細菌細胞殺傷(例如活體外調理吞噬活性分析)。在一個實施例中，相較於適當對照，諸如相較於針對熱殺死的革蘭氏陰性細菌升高之抗血清，醣能夠誘導調理性、吞噬細胞及/或殺菌活性。

調理吞噬活性分析，其量測在存在功能抗體及補體之情況下，吞噬細胞效應細胞對大腸桿菌細胞之殺傷，可為一種用於評價大腸桿菌疫苗對於特定大腸桿菌血清型，諸如大腸桿菌血清型O25B之效果的替代物。活體外調理吞噬活性分析可藉由以下來進行：將大腸桿菌細胞、待測試之熱滅活人類血清、分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及外源性補體源(例如幼兔補體)之混合物一起培育。調理吞噬作用在培育期間進行，且包覆有抗體及補體之細菌細胞在調理吞噬作用後被殺死。藉由塗鋪分析混合物來測定逃脫調理吞噬作用之存活細菌之菌落形成單位(cfu)。OPA效價定義為引起細菌計數相對於無測試血清之對照孔降低50%之倒數稀釋。OPA效價自涵蓋此50%殺死截止值之兩個稀釋內插得到。

1:8或更大之端點效價視為此等殺死類型OPA中之陽性結果。

在一些實施例中，個體可由於例如天然暴露於大腸桿菌(例如在成人個體之情況下)，而在疫苗接種之前具有血清型特定OPA效價。

因此，可比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性，且比較其對於特定大腸桿菌血清型，諸如大腸桿菌血清型O25B之反應以評定可能的反應者增加。

在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)之比例。

亦可藉由比較OPA效價之可能增加，來比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性。

因此，可比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性，且比較其對於特定大腸桿菌血清型，諸如大腸桿菌血清型O25B之反應以評定OPA效價增加的可能。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物能夠顯著地增加人類個體之OPA效價。

在一個態樣中，組合物誘導針對至少一種大腸桿菌血清型之免疫反應。大腸桿菌血清型可為任何血清型，包括(例如)以下大腸桿菌血清型中之任一者：O1 (例如O1A、O1B及O1C)、O2、O3、O4 (例如O4:K52及O4:K6)、O5 (例如O5ab及O5ac (菌株180/C3))、O6 (例如O6:K2；K13；K15及O6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18 (例如O18A、O18ac、O18A1、O18B及O18B1)、O19、O20、O21、O22、O23 (例如O23A)、O24、O25 (例如O25a及O25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45 (例如O45及O45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D ₁、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73 (例如O73 (菌株73-1))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。在一個實施例中，血清型為O25a。在另一實施例中，血清型為O25b。在另一實施例中，血清型為O1A。在另一實施例中，血清型為O2。在另一實施例中，血清型為O6。在另一實施例中，血清型為O6。在另一實施例中，血清型為O17。在另一實施例中，血清型為O15。在另一實施例中，血清型為O18A。在另一實施例中，血清型為O75。在另一實施例中，血清型為O4。在另一實施例中，血清型為O16。在另一實施例中，血清型為O13。在另一實施例中，血清型為O7。在另一實施例中，血清型為O8。

在一較佳實施例中，組合物誘導針對至少兩個大腸桿菌血清型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少3個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少4個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物包括來自5個不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物誘導針對至少6個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少7個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少8個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少9個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少10個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少11個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少12個大腸桿菌血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少13個不同血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少14個不同血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少15個不同血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少16個不同血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少17個不同血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少18個不同血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少19個不同血清型之免疫反應。在一個實施例中，組合物誘導針對至少20個不同血清型之免疫反應。

在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠與特定大腸桿菌血清型醣(諸如大腸桿菌血清型O25B醣)結合，如藉由ELISA分析所測定。較佳地，增強的免疫反應可包括IgG1及/或IgG2a及/或IgM之產量增加。

在ELISA (酶聯免疫吸附分析)方法中，將來自經疫苗接種個體之血清之抗體與已經吸附至固體載體之多醣一起培育。使用酶共軛的二級偵測抗體來偵測經結合抗體。ELISA量測人類血清中存在之類型特異性IgG抗大腸桿菌多醣抗體。當向包覆類型特異性多醣之微量滴定培養盤中添加人類血清之稀釋液時，對該多醣具有特異性之抗體與微量滴定培養盤結合。使用山羊抗人類IgG鹼性磷酸酶標記的抗體，隨後磷酸對硝苯酯受質，來偵測與培養盤結合之抗體。有色終產物之光密度與血清中存在之抗O-抗原多醣抗體之量成比例。

在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對大腸桿菌血清型O25B、O1、O2及O6之人類個體之OPA效價。

在一些實施例中，諸如在初始給藥約30天之後，較佳地在初始給藥約60天之後，本發明組合物有效地增加哺乳動物中針對大腸桿菌之抗體的產量至至少1,000，較佳地至少5,000及至多200,000之幾何平均效價(GMT)水準。在一較佳實施例中，在初始給藥之後，組合物有效地增加哺乳動物中針對大腸桿菌血清型O25B之抗體之產量至至少1,000，較佳地至少5,000及至多200,000之幾何平均效價(GMT)水準。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠結合對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型。舉例而言，組合物可引起在以下之濃度下之IgG抗體：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析所測定。因此，可比較用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及後之血清之OPA活性，且比較其對於各別血清型之反應以評定可能的反應者增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起IgG抗體，該等抗體能夠殺死對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引起功能抗體，該等抗體能夠殺死對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型，如藉由活體外調理吞噬活性分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物增加針對對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型的反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)的比例。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少50%之個體中引起針對對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型至少1:8的效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引起針對對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型至少1:8的效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析所測定。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型的反應者(亦即血清之效價為至少1:8之個體，如藉由活體外OPA所測定)的比例。在一個實施例中，相較於免疫前群體，本發明之免疫原性組合物顯著地增加針對對應於組合物中之醣之重複單元之大腸桿菌血清型的人類個體的OPA效價。

方法在另一態樣中，本發明係關於預防個體，例如人類個體之感染之方法，其包括向個體投與有效量之本文所描述之組合物(例如免疫原性組合物)。

在另一態樣中，本發明係關於治療個體，例如人類個體之感染之方法，其包括向個體投與有效量之本文所描述之組合物(例如免疫原性組合物)。

在另一態樣中，本發明係關於誘導個體，例如人類個體之免疫反應之方法，其包含向個體投與有效量之本文所描述之組合物(例如免疫原性組合物)。

在另一態樣中，本發明係關於誘導在個體，例如人類個體中產生調理吞噬活性抗體之方法，其包含向個體投與有效量之本文所描述之組合物(例如免疫原性組合物)。

如本文所用，在向個體投與本文所描述之組合物之情形下，術語「有效量」係指具有預防性及/或治療效果之組合物之量。在某些實施例中，「有效量」係指足以達成以下效果中之至少一個、兩個、三個、四個或更多之組合物之量：(i)降低或改善大腸桿菌感染或其相關症狀之嚴重程度；(ii)降低大腸桿菌感染或其相關症狀之持續時間；(iii)預防大腸桿菌感染或其相關症狀之進展；(iv)引起大腸桿菌感染或其相關症狀消退；(v)預防大腸桿菌感染或其相關症狀之發展或發作；(vi)預防大腸桿菌感染或其相關症狀復發；(vii)降低與大腸桿菌感染相關之器官衰竭；(viii)降低患有大腸桿菌感染之個體住院；(ix)降低患有大腸桿菌感染之個體之住院時長；(x)增加患有大腸桿菌感染之個體之存活期；(xi)消除個體中之大腸桿菌感染；(xii)抑制或降低個體中之大腸桿菌複製；及/或(xiii)增強或改良另一療法之預防性或治療效果。

在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物用作藥物。可在用於預防、治療或改善個體之細菌性感染、疾病或病狀之各種治療性或預防性方法中使用本文所描述之免疫原性組合物。特定言之，本文所描述之免疫原性組合物可用於預防、治療或改善個體之大腸桿菌感染、疾病或病狀。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種預防、治療或改善個體之與大腸桿菌相關之感染、疾病或病狀之方法，其包含向個體投與免疫學上有效量之本發明的免疫原性組合物。

在一個態樣中，本發明提供一種預防、治療或改善個體之與大腸桿菌相關之感染、疾病或病狀之方法，其包含向個體投與免疫學上有效量之本發明的免疫原性組合物。

在一個態樣中，本發明提供一種在個體中誘導對於大腸桿菌之免疫反應之方法，其包含向個體投與免疫學上有效量之本發明之免疫原性組合物。

在一個態樣中，本發明之免疫原性組合物用於預防、治療或改善個體之由大腸桿菌引起之感染、疾病或病狀的方法中在另一態樣中，本發明之組合物用於保護哺乳動物免於由大腸桿菌引起之感染、疾病或病狀的方法中。

在一個實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物中之任一者用於免疫個體針對大腸桿菌之感染的方法中。

在一個態樣中，本發明係針對一種本文所揭示之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於預防、治療或改善個體之由大腸桿菌引起之感染、疾病或病狀的藥劑。

在一實施例中，本發明係針對一種本文所揭示之免疫原性組合物之用途，其用於製造用於免疫個體針對大腸桿菌之感染的藥劑。

在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物用作疫苗。更特定言之，本文所描述之免疫原性組合物可用於預防個體之大腸桿菌感染。因此，在一個態樣中，本發明提供一種預防個體受大腸桿菌感染之方法，其包含向個體投與免疫學上有效量之本發明之免疫原性組合物。

在一些此等實施例中，感染係選自以下中之任一者：泌尿道感染、膽囊炎、膽管炎、腹瀉、溶血尿毒症候群、新生兒腦膜炎、尿路性敗血症、腹內感染、腦膜炎、複雜性肺炎、傷口感染、前列腺活檢後相關感染、新生兒/嬰兒敗血症、嗜中性粒細胞減少性發熱、肺炎、菌血症及敗血症，及其他血流感染。舉例而言，與新生兒腦膜炎相關之大腸桿菌血清型包括血清型O1、O6、O7、O16、O18及O83。因此，在一個實施例中，組合物包括含具有選自以下中之任一者之結構之醣的共軛物：式O1、式O6、式O7、式O16、式O18、式O83及其共軛物之任何組合。作為另一實例，與菌血症相關之大腸桿菌血清型包括血清型O1、O2、O6、O15及O75。因此，在另一實施例中，組合物包括含具有選自以下中之任一者之結構之醣的至少一種共軛物：式O1、O2、O6、O15及O75及其共軛物之任何組合。作為另一實例，大腸桿菌O1及O2菌株，諸如O1:K1:H7或O2:K1:H4、O2:K1:H5、O2:K1:H6及O2:K1:H7，經鑑別為人類及動物中之泌尿道感染、敗血病及新生兒腦膜炎之病原體。O1及O2血清組兩者佔引起人類患者中之菌血症及敗血症之菌株的大部分。因此，在一個實施例中，組合物包括含具有式O1之醣的共軛物及含具有式O2之醣的共軛物。

因此，藉由利用此等用途及方法升高哺乳動物中之免疫反應，可保護哺乳動物免於大腸桿菌(包括ExPEC及非ExPEC菌株)感染。本發明尤其適用於提供針對病原性大腸桿菌(包括腸病變型，諸如EPEC、EAEC、EIEC、ETEC及DAEC病變型)之寬廣保護。因此，可保護哺乳動物免於包括(但不限於)以下之疾病：腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎、心內膜炎、前列腺炎、泌尿道感染(UTI)、腦膜炎(尤其新生兒腦膜炎)、敗血症(或SIRS)、脫水、肺炎、腹瀉(幼稚型，旅行者的(travellers')，急性，持久的等)、細菌性痢疾、溶血尿毒症候群(HUS)、心包炎、細菌尿等。

在一個態樣中，待進行疫苗接種之個體為哺乳動物，諸如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛或犬。較佳地，待進行疫苗接種之個體為人類。當疫苗係用於預防性用途時，人類較佳地為兒童(例如幼兒或嬰兒)或少年或成人；當疫苗係用於治療用途時，人類較佳地為少年或成人。預期用於兒童之疫苗亦可向成人投與例如以評定安全性、劑量、免疫原性等。

本發明之疫苗可用於治療兒童及成人兩者。因此，人類患者可小於1歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。用於接受疫苗之較佳的患者為老年人(例如≧50歲、≧60歲及較佳地≧65歲)、幼齡人(例如≦5歲)、住院患者、保健工人、武裝服務及軍事人員、妊娠期婦女、長期有病的或免疫缺乏患者。然而，疫苗不僅僅適合於此等群組，且更一般而言可在群體中使用。

本發明之疫苗尤其適用於預期進行手術操作之患者或其他住院患者。其亦適用於將插入導管之患者。其亦適用於青少年女性(例如11-18歲)及適用於患有慢性泌尿道感染之患者。

在一實施例中，藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下途徑投與本文所揭示之免疫原性組合物。在一實施例中，藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下注射投與本文所揭示之免疫原性組合物。在一實施例中，藉由肌肉內或皮下注射投與本文所揭示之免疫原性組合物。

在一實施例中，本發明係針對一種方法，其包含以下步驟：(i)向個體注射免疫學上有效量之本文所定義之免疫原性組合物中之任一者；(ii)自該個體採集血清樣本；(iii)藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析(OPA)，測試該血清樣本針對大腸桿菌血清型O25B之調理吞噬活性殺傷活性。

個體如本文所揭示，可在用於預防、治療或改善個體之細菌性感染、疾病或病狀之各種治療性或預防性方法中使用本文所描述之免疫原性組合物。

在一較佳實施例中，該個體為人類。在一個最佳實施例中，該個體為新生兒(亦即低於三月齡)、嬰兒(亦即年齡在3個月至一歲)或幼兒(亦即一歲至四歲)。

在一實施例中，本文所揭示之免疫原性組合物用作疫苗。

在一實施例中，待進行疫苗接種之個體可低於1歲。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11或約12個月齡。在一實施例中，待進行疫苗接種之個體為約2、4或6個月齡。在另一實施例中，待進行疫苗接種之個體低於2歲。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可為約12個月齡至約15個月齡。在一些情況下，需要少至一個劑量之根據本發明之免疫原性組合物，但在一些情形下，可投與第二、第三或第四劑量。

在一實施例中，待進行疫苗接種之個體可低於18歲。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16或約17歲。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可為約10至約18歲。在一些情況下，需要少至一個劑量之根據本發明之免疫原性組合物，但在一些情形下，可投與第二、第三或第四劑量。

在另一實施例中，待進行疫苗接種之個體可為18歲或更大之人類。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可為約18至約50歲。在一些情況下，需要少至一個劑量之根據本發明之免疫原性組合物，但在一些情形下，可投與第二、第三或第四劑量。

在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之個體為50歲或更大之人類，更佳地55歲或更大之人類。在一實施例中，待進行疫苗接種之個體為65歲或更大，70歲或更大，75歲或更大，或80歲或更大之人類。在一實施例中，待進行疫苗接種之個體為免疫功能不全個體(人類)。免疫功能不全個體一般定義為呈現建立對於感染劑刺激之正常體液或細胞防禦之能力減弱或降低的人。

在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體罹患削弱免疫系統且引起不足以防止泌尿道感染或治療泌尿道感染之抗體反應的疾病。

在一實施例中，疾病為原發性免疫缺乏病症。較佳地，原發性免疫缺乏病症係選自以下中之任一者：組合性T細胞及B細胞免疫缺乏症、抗體缺乏症、界限分明的症候群、免疫調節異常疾病、吞噬細胞病症、先天性免疫性缺乏、自體發炎性病症及補體缺乏症。

在本發明之一特定實施例中，待進行疫苗接種之免疫功能不全個體罹患選自以下中之任一者之疾病：HIV感染、後天免疫缺乏症候群(AIDS)、癌症、慢性心臟病或肺病、充血性心臟衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液滲漏、心肌病、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障礙(諸如鐮狀細胞疾病)、脾功能缺乏(無脾症)、血液惡性疾病、白血病、多發性骨髓瘤、霍奇金氏(Hodgkin's)疾病、淋巴瘤、腎衰竭、腎病症候群及哮喘。

在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之個體罹患營養不良。

在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之個體服用藥物或減少身體對於感染之抗性之治療。

在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之個體為吸菸者。

在本發明之一實施例中，待進行疫苗接種之個體具有以下之白血球計數(white blood cell count/leukocyte count)：低於5 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於4 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於3 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於2 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於1 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於0.5 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於0.3 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於0.1 × 10 ⁹個細胞/公升。

白血球計數(White blood cell count/leukocyte count)：血液中之白血球(WBC)之數目。WBC通常作為CBC (全血球計數)之一部分量測。白血球為血液中之感染對抗細胞，且不同於被稱為紅血球之紅色(攜帶氧)血細胞。存在不同類型的白血球，包括嗜中性白血球(多形核白血球；PMN)、帶狀細胞(略微不成熟的嗜中性白血球)、T-型淋巴球(T細胞)、B型淋巴球(B細胞)、單核球、嗜酸性球及嗜鹼性球。所有類型之白血球均在白血球計數中反映。白血球計數之正常範圍通常在4,300與10,800個細胞/立方毫米血液之間。此亦可被稱作白血球計數，且可以國際單位形式表述為4.3-10.8 × 10 ⁹個細胞/公升。

在一實施例中，待進行疫苗接種之個體罹患嗜中性白血球減少症。舉例而言，待進行疫苗接種之個體可具有以下之嗜中性白血球計數：低於2 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於1 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於0.5 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於0.1 × 10 ⁹個細胞/公升、或低於0.05 × 10 ⁹個細胞/公升。

低白血球計數或「嗜中性白血球減少症」為特徵在於在循環血液中異常低含量之嗜中性白血球的病狀。嗜中性白血球為幫助預防及對抗感染之一種特定種類之白血球。癌症患者經歷嗜中性白血球減少症之最常見原因為作為化學療法之副作用。化學療法誘發的嗜中性白血球減少症增加患者之感染風險且干擾癌症治療。

在一實施例中，待進行疫苗接種之個體具有低於500/mm ³之CD4+細胞計數、或低於300/mm ³之CD4+細胞計數、或低於200/mm ³之CD4+細胞計數、低於100/mm ³之CD4+細胞計數、低於75/mm ³之CD4+細胞計數、或低於50/mm ³之CD4+細胞計數。

CD4細胞測試通常報導為mm ³中之細胞數目。正常CD4計數在500與1600之間，且CD8計數在375與1100之間。CD4計數在患有HIV之人中大大降低。

在本發明之一實施例中，本文所揭示之免疫功能不全個體中之任一者為男性人類或女性人類。

方案在一些情況下，少至一個劑量之根據本發明之免疫原性組合物為有效的，在其他情況下，諸如較高免疫缺乏之條件下，可投與第二、第三或第四劑量。在初次疫苗接種之後，個體可接受經恰當間隔之一次或若干次增強免疫接種。

在一實施例中，根據本發明之免疫原性組合物之疫苗接種之時程為單次劑量。在另一實施例中，該單次劑量時程係針對至少2歲之健康人群。

在一實施例中，根據本發明之免疫原性組合物之疫苗接種之時程為多劑量時程。在另一實施例中，該多劑量時程包括由約1個月至約2個月之間隔隔開之一系列2次劑量。在一實施例中，該多劑量時程包括由約1個月之間隔隔開之一系列2次劑量，或由約2個月之間隔隔開之一系列2次劑量。

在另一實施例中，該多劑量時程包括由約1個月至約2個月之間隔隔開之一系列3次劑量。在另一實施例中，該多劑量時程包括由約1個月之間隔隔開之一系列3次劑量，或由約2個月之間隔隔開之一系列3次劑量。

在另一實施例中，該多劑量時程包括由約1個月至約2個月之間隔隔開之一系列3次劑量，隨後在第一劑量約10個月至約13個月之後，第四次劑量。在另一實施例中，該多劑量時程包括由約1個月之間隔隔開之一系列3次劑量，隨後在第一劑量約10個月至約13個月之後，第四次劑量；或由約2個月之間隔隔開之一系列3次劑量，隨後在第一劑量約10個月至約13個月之後，第四次劑量。

在一實施例中，多劑量時程包括在一歲中之至少一次劑量(例如1、2或3次劑量)，隨後至少一次幼兒劑量。

在一實施例中，多劑量時程包括自2個月齡開始，由約1個月至約2個月之間隔(例如在劑量之間相隔28-56天)隔開之一系列2或3次劑量，及隨後在12-18個月齡一次幼兒劑量。在一實施例中，該多劑量時程包括自2個月齡開始，由約1至2個月之間隔(例如在劑量之間相隔28-56天)隔開之一系列3次劑量，及隨後在12-15個月齡一次幼兒劑量。在另一實施例中，該多劑量時程包括自2個月齡開始，由約2個月之間隔隔開之一系列2次劑量，及隨後在12-18個月齡一次幼兒劑量。

在一實施例中，該多劑量時程包括在2、4、6及12-15個月齡時之4次劑量系列疫苗。

在一實施例中，在第0天給予初始劑量，且以在約2至約24週範圍內之間隔，較佳地以4-8週之給藥間隔，給予一或多次增強劑量。

在一實施例中，在第0天給予初始劑量，且在約3個月後給予加強劑量。

套組及方法在一實施例中，本發明係針對一種套組，其包含本文所揭示之免疫原性組合物及資訊小冊。

在一實施例中，該資訊小冊包括組合物引起針對大腸桿菌之功能抗體之能力。

在一實施例中，該資訊小冊包括組合物在人類群體中引起針對大腸桿菌血清型O25B之OPA效價之能力。在一實施例中，該資訊小冊包括組合物在人類群體中引起針對大腸桿菌血清型O1之OPA效價之能力。在一實施例中，該資訊小冊包括組合物在人類群體中引起針對大腸桿菌血清型O2之OPA效價之能力。在一實施例中，該資訊小冊包括組合物在人類群體中引起針對大腸桿菌血清型O6之OPA效價之能力。

在一實施例中，本發明係針對一種用於產生包含免疫原性組合物及資訊小冊之套組之方法，該方法包含以下步驟：(i)產生本發明之免疫原性組合物，及(ii)將該免疫原性組合物及資訊小冊組合在同一套組中，其中該資訊小冊提及該組合物引起針對大腸桿菌之功能抗體之能力。

在一實施例中，本發明係針對一種用於產生包含免疫原性組合物及資訊小冊之套組之方法，該方法包含以下步驟：(i)產生本發明之免疫原性組合物，及(ii)將該免疫原性組合物及資訊小冊組合在同一套組中，其中該資訊小冊提及組合物在人類群體中引起針對大腸桿菌之抗O-抗原抗體之能力。

在一實施例中，本發明係針對一種用於產生包含免疫原性組合物及資訊小冊之套組之方法，該方法包含以下步驟：(i)產生本發明之免疫原性組合物，及(ii)將該免疫原性組合物及資訊小冊組合在同一套組中，其中該資訊小冊提及該組合物在人類群體中引起針對大腸桿菌之OPA效價之能力。

在一實施例中，本發明係針對一種用於產生包含免疫原性組合物及資訊小冊之套組之方法，該方法包含以下步驟：(i)產生本發明之免疫原性組合物；(ii)印刷資訊小冊，其中資訊小冊提及該組合物引起針對大腸桿菌之功能抗體之能力；(iii)將該免疫原性組合物及該資訊小冊組合在同一套組中。

在一實施例中，本發明係針對一種用於產生包含免疫原性組合物及資訊小冊之套組之方法，該方法包含以下步驟：(i)產生本發明之免疫原性組合物，(ii)印刷資訊小冊，其中該資訊小冊提及該組合物在人類群體中引起針對大腸桿菌之OPA效價之能力；(iii)將該免疫原性組合物及該資訊小冊組合在同一套組中。

實例為了能更好地理解本發明，闡述以下實例。此等實例僅出於說明之目的，且並不應視為以任何方式限制本發明之範疇。以下實例說明本發明之一些實施例。

實例 1 ：大腸桿菌及腸沙門氏菌( S.enterica)菌株臨床菌株及衍生物在表3中列出。額外參考菌株包括：O25K5H1，一種臨床O25a血清型菌株；及腸沙門氏菌( S. enterica)血清變型鼠傷寒菌株LT2。構築移除目標空心閱讀框但留下短疤痕序列之大腸桿菌菌株中之基因剔除。

為簡單起見，經水解的O-抗原鏈及核心糖隨後指示為O-多醣(OPS)。

表 3 ：大腸桿菌菌株
菌株	菌株別名	基因型	血清型
GAR2401	PFEEC0100	wt (血液分離物)	O25b
'2401ΔwzzB	--	ΔwzzB	O25b
'2401ΔAraAΔ(OPS)	--	ΔAraA Δ(rflB-wzzB)	OPS-
O25K5H1	PFEEC0101	wt	O25a
O25K5H1ΔwzzB		ΔwzzB	O25a
BD559	--	W3110 ΔAraA ΔfhuA ΔrecA	OPS-
BD559ΔwzzB	--	W3110ΔAraA ΔfhuA ΔrecAΔwzzB	OPS-
BD559Δ(OPS)	--	BD559 Δ(rflB-wzzB)	OPS-
GAR2831	PFEEC0102	wt (血液分離物)	O25b
GAR865	PFEEC0103	wt (血液分離物)	O2
GAR868	PFEEC0104	wt (血液分離物)	O2
GAR869	PFEEC0105	wt (血液分離物)	O15
GAR872	PFEEC0106	wt (血液分離物)	O1
GAR878	PFEEC0107	wt (血液分離物)	O75
GAR896	PFEEC0108	wt (血液分離物)	O15
GAR1902	PFEEC0109	wt (血液分離物)	O6
Atlas187913	PFEEC0068	wt (血液分離物)	O25b
腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒菌株LT2	--	wt	N/A

實例 2 ：用於 wzzB、 fepE及O-抗原基因叢選殖之寡核苷酸引子

表 4 ：寡核苷酸引子
名稱	引子序列	註釋
LT2wzzB_S	GAAGCAAACCGTACGCGTAAAG (SEQ ID NO: 1)	基於 GenbankGCA_000006945.2 腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒菌株LT2
LT2wzzB_AS	CGACCAGCTCTTACACGGCG (SEQ ID NO: 2)
O25bFepE_S	GAAATAGGACCACTAATAAATACACAAATTAATAAC (SEQ ID NO: 3)	基於Genbank GCA_000285655.3 O25b EC958菌株ST131組裝及O25b GAR2401 WGS資料
O25bFepE_A	ATAATTGACGATCCGGTTGCC (SEQ ID NO: 4)
wzzB P1_S	GCTATTTACGCCCTGATTGTCTTTTGT (SEQ ID NO: 5)	基於大腸桿菌K-12菌株序列Genbank MG1655NC_000913.3或W3110組裝GCA_000010245.1
wzzB P2_AS	ATTGAGAACCTGCGTAAACGGC (SEQ ID NO: 6)
wzzB P3_S	TGAAGAGCGGTTCAGATAACTTCC (SEQ ID NO: 7) ( UDP-葡萄糖-6-脫氫酶)
wzzB P4_AS	CGATCCGGAAACCTCCTACAC (SEQ ID NO: 8) (磷酸核糖-AMP環水解酶/磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶)
O157 FepE_S	GATTATTCGCGCAACGCTAAACAGAT (SEQ ID NO: 9)	大腸桿菌O157 fepE (基於Genbank EDL933菌株GCA_000732965.1)
O157 FepE_AS	TGATCATTGACGATCCGGTAGCC (SEQ ID NO: 10)
pBAD33_銜接子_S	CGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGGTTTAAACCCAAGCAACAGATCGGCGTCGTCGGTATGGA (SEQ ID NO: 11)	銜接子具有中心 PmeI位點且與保守的5'OAg操縱子啟動子及3' gnd基因序列同源
pBAD33_銜接子_AS	AGCTTCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGGGTTTAAACCACGCTACCGCCCCTGGCTTTACAGCTACCGAGCT (SEQ ID NO: 12)
JUMPSTART_r	GGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTG (SEQ ID NO: 13)	通用Jumpstart (OAg操縱子啟動子)
gnd_f	CCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG (SEQ ID NO: 14)	通用3'OAg (gnd)操縱子反義引子

實例 3 ：質體質體載體及次純系在表5中列出。自經純化基因組DNA擴增含有各種大腸桿菌及沙門氏菌 wzzB及 fepE基因之PCR片段，且將其次選殖至Invitrogen PCR®Blunt選殖套組中提供之高複本數質體中，圖1。此質體係基於pUC複製子。引子P3及P4用於擴增具有其原生啟動子之大腸桿菌 wzzB基因，且其經設計以與分別編碼UDP-葡萄糖-6-脫氫酶及磷酸腺嘌呤核苷酸羥化酶之近端及遠端基因(在Genbank MG1655NC_000913.3中標註)中之區結合使用先前所描述之引子來擴增含有沙門氏菌 fepE基因及啟動子之PCR片段。類似大腸桿菌 fepE引子係基於可獲得的Genbank基因組序列或內部產生之全基因組資料(在GAR2401及O25K5H1之情況下)設計。低複本數質體pBAD33用於在阿拉伯糖啟動子之控制下表現O-抗原生物合成基因。質體首先經修飾以便於使用與5'啟動子及3'6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶( gnd)基因同源之通用引子選殖(經由Gibson方法)所擴增之長PCR片段，表5。含有O25b生物合成操縱子之pBAD33次純系在圖1中說明。表5

質體
名稱	複製子	抗性標記	註釋
PCR®Blunt II TOPO	pUC	KanR	Invitrogen PCR選殖載體
pBAD33	P15a	CamR	阿拉伯糖誘導性載體
pBAD33-OAg	P15a	CamR	OAg操縱子Gibson選殖載體
pBAD33-O25b	P15a	CamR	O25b OAg表現質體
pBAD33-O21	P15a	CamR	O21 OAg表現質體
pBAD33-O16	P15a	CamR	O16 OAg表現質體
pBAD33-O75	P15a	CamR	O75 OAg表現質體
pBAD33-O1	P15a	CamR	O1 OAg表現質體
pBAD33-O2	P15a	CamR	O2 OAg表現質體
pTOPO-O25b 2401 wzzB	pUC	KanR	GAR 2401 gDNA模板
pTOPO-O25b 2401 fepE	pUC	KanR
pTOPO-K12 wzzB	pUC	KanR	大腸桿菌K-12菌株gDNA模板
pTOPO-O25a wzzB	pUC	KanR	大腸桿菌O25a菌株O25K5H1 gDNA模板
pTOPO-O25a fepE	pUC	KanR
pTOPO-沙門氏菌LT2 wzzB	pUC	KanR	腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒菌株LT2 gDNA模板
pTOPO-沙門氏菌LT2 fepE	pUC	KanR
pTOPO-O25a ETEC wzzB	pUC	KanR	購自ATCC之O25a ETEC菌株gDNA (「NR-5」 E2539-C1)
pTOPO-O25a ETEC fepE	pUC	KanR
pTOPO-O157fepE	pUC	KanR	購自ATCC之O157:H7:K-志賀桿菌屬(Shigella)毒素菌株gDNA (EDL933 #43895D-5)

實例4：O-抗原純化醱酵培養液用乙酸處理至1-2%之最終濃度(最終4.1 之pH)。藉由加熱經酸處理的培養液至100℃持續2小時，來達成OAg之提取及去脂化。在酸水解結束時，將該批次冷卻至環境溫度，且添加14% NH ₄OH至最終6.1 之pH。將經中和的培養液離心且採集離心分離液。向離心分離液中添加含CaCl ₂之磷酸鈉，且在室溫下培育所得漿液30分鐘。藉由離心移除固體，且使用10kDa膜濃縮離心分離液12倍，隨後相對於水進行兩次透濾。隨後，使用碳過濾器純化含有OAg之保留物。用4.0M硫酸銨1:1 (v/v)稀釋碳濾液。最終硫酸銨濃度為2M。使用膜來進一步純化經硫酸銨處理的碳濾液，其中2M硫酸銨作為操作緩衝液。在液流中採集OAg。對於長OAg，濃縮HIC濾液，且隨後使用5kDa膜相對於水(20透濾體積)進行緩衝液交換。對於短(原生) OAg多醣，進一步降低MWCO以提高產量。

實例5：O25b長O-抗原與CRM ₁₉₇之共軛使用過碘酸鹽氧化法，隨後使用還原胺化化學方法(RAC)共軛，產生第一組長鏈O25b多醣-CRM ₁₉₇共軛物(表7)。藉由改變氧化程度，共軛物變體具有三個活化程度(低、中等及高)。共軛物製法係由凍乾的活化多醣與凍乾的CRM ₁₉₇反應，使用氰基硼氫化鈉作為還原劑，在DMSO培養基中復原。共軛反應在23℃下進行24小時，隨後使用硼氫化鈉封端3小時。在共軛淬滅步驟之後，使用100K MWCO再生纖維素膜之超過濾/透濾，使用5mM丁二酸鹽/0.9%NaCl，pH 6.0來純化共軛物。使用0.22 µm膜，進行共軛物之最終過濾。

除非另外明確說明，否則在以下實例中所揭示之共軛物包括核心醣部分。

1.1. 藉由異源聚合酶鏈長調節劑賦予之長O-抗原表現初始大腸桿菌菌株之構築係聚焦於O25血清型。目標為過度表現異源 wzzB或 fepE基因，以查看其是否在O25 wzzB基因剔除菌株中賦予較長鏈長。首先，藉由PCR來篩選血液分離物，以鑑別O25a及O25b亞型之菌株。接下來，針對對於胺苄青黴素之敏感度，篩選菌株。鑑別其中已引入 wzzB缺失之單一胺苄青黴素敏感性O25b分離株GAR2401。類似地，在O25a菌株O25K5H1中製備 wzzB缺失。對於此等突變之基因互補，由來自GAR 2401及O25K5H1之 wzzB基因次選殖至高複本PCR-Blunt II選殖載體中，且藉由電穿孔引至兩個菌株中。依類似方式，額外選殖及轉移來自大腸桿菌K-12及腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒LT2之 wzzB基因；來自大腸桿菌O25K5H1、GAR 2401、O25a ETEC NR-5、O157:H7:K-及腸沙門氏菌血清變型鼠傷寒LT2之 fepE基因同樣如此。

在圖 2中顯示 wzzB基因剔除菌株O25K5H1 (O25a)及GAR2401 (O25b)之質體轉化體中之LPS表現之基因互補。使細菌在LB培養基中生長隔夜，且用苯酚提取LPS，藉由SDS PAGE (4-12%丙烯醯胺)進行解析且進行染色。在凝膠之各孔中裝載自相同數目之細菌細胞(大約2個OD ₆₀₀單位)提取之LPS。根據內部原生大腸桿菌LPS標準物及可由顯示寬廣鏈長分佈之樣本子集分級區別(相差一個重複單元)計數，來估算LPS之大小。圖3之A圖之左側，顯示O25a O25K5HΔ wzzB之質體轉化體之LPS型態；及右側，O25b GAR 2401Δ wzzB轉化體之類似型態。用O25-特異性血清探測之複製凝膠之免疫墨點顯示於圖 3之B圖中。

此實驗之結果顯示，將同源 wzzB基因引入至大腸桿菌O25aΔ wzzB宿主中，恢復短O25 LPS (10-20x)之表現，沙門氏菌 LT2 wzzB亦如此。引入來自GAR2401之O25b wzzB基因則不，表明缺乏來自此菌株之WzzB酶。大腸桿菌WzzB胺基酸序列之比較表明，A210E及P253S取代可為可靠的。明顯的是，沙門氏菌 LT2 fepE及來自O25a O25K5H1之大腸桿菌 fepE賦予表現極長(VL) OAg LPS之能力，其中沙門氏菌 LT2 fepE引起超過藉由大腸桿菌 fepE賦予之大小的OAg。

對於GAR2401Δ wzzB轉化體，觀測到類似的表現模式：大腸桿菌O25a或K12菌株 wzzB恢復產生短LPS之能力。沙門氏菌 LT2 fepE產生最長LPS，大腸桿菌 fepE產生略微較短LPS，而沙門氏菌 LT2 wzzB得到中等大小的長LPS (L)。在利用大腸桿菌O25aΔ wzzB之轉化體之獨立實驗中，評定其他大腸桿菌 fepE基因產生極長LPS之能力。來自GAR2401、O25a ETEC菌株及產生O157志賀桿菌屬毒素之菌株之 fepE基因亦賦予產生極長但不如用沙門氏菌 LT2 fepE所產生之LPS長之LPS的能力( 圖 4)。FepE胺基酸序列之比對顯示於圖 5中。

已在血清型O25a及O25b菌株中確立，沙門氏菌 LT2 fepE產生所評價之聚合酶調節劑之最長LPS，吾人接下來設法判定是否其亦將在其他大腸桿菌血清型中產生極長LPS。血清型O1、O2、O6、O15及O75之野生型菌血症分離株用沙門氏菌 fepE質體轉化，且進行LPS提取。顯示於圖 6中之結果確認，沙門氏菌 fepE可賦予在與血液感染相關之其他盛行血清型中製造極長LPS之能力。結果亦顯示，沙門氏菌 fepE之基於質體之表現似乎超越通常藉由此等菌株中之內源性 wzzB發揮之鏈長的控制。

1.2. 在常見大腸桿菌宿主菌株中，O-抗原之基於質體之表現。根據生物工藝發展之觀點，在常見大腸桿菌宿主而非多個菌株中產生不同血清型之O-抗原之能力將極大地簡化個別抗原的製造。為此目的，藉由PCR擴增來自不同血清型之O-抗原基因群集，且將其選殖至在阿拉伯糖調節的啟動子控制下的低複本數質體(pBAD33)中。此質體可與沙門氏菌 LT2 fepE質體在大腸桿菌中相容(可共存)，此係因為其具有不同(p15a)複製子及不同可選標記物(氯黴素與康黴素)。在第一實驗中，將pBAD33 O25b操縱子質體次純系與沙門氏菌 LT2 fepE質體共轉染至GAR2401ΔwzzB中，且轉化體在存在或不存在0.2%阿拉伯糖之情況下生長。顯示於圖 7中之結果表明，以阿拉伯糖依賴性方式產生極長O-抗原LPS。

類似地評價選殖於其他血清型之O-抗原基因群集，且結果顯示於圖 8中。共表現沙門氏菌 LT2 fepE及pBAD33-OAg質體產生可偵測的對應於O1、O2 (四個純系中之兩個)、O16、O21及O75血清型之長鏈LPS。由於未知的原因，pBAD33-O6質體未能在所測試之所有四個分離株中產生可偵測的LPS。儘管表現量不同，但結果顯示，在常見宿主中表現長鏈O-抗原為可行的。然而，在一些情況下，可能需要進一步最佳化以改良表現，例如藉由修飾質體啟動子序列。

來自具有或不具有沙門氏菌 LT2 fepE質體之不同血清型O25大腸桿菌菌株之LPS的型態顯示於圖 11中。研究兩個菌株之O-抗原：GAR2831之醱酵、提取及純化，原生短O25b OAg之產量；及研究GAR2401Δ wzzB/fepE之長O25b OAg的產量。在圖 11SDS-PAGE凝膠中顯示之對應短及長形式LPS以紅色突出顯示。用乙酸直接自醱酵細菌提取多醣，且進行純化。經純化短及長或極長O25b多醣之尺寸排阻層析型態顯示於圖 12中。將兩個批短多醣(來自GAR2831)之特性與單一極長多醣製劑(來自菌株GAR2401Δ wzzB/fepE)進行比較。長O-抗原之分子量比短O-抗原之分子量大3.3倍，且重複單元之數目經估計為~65 (極長)與~20。參見表6。表 6

聚合物批次號	原生的	原生的	經修飾的(長鏈)
聚合物批次號	709766-24A	709722-24B	709766-25A
聚合物MW (kDa)	17.3	16.3	55.3
重複單元數目	20	19	64

使用習知還原胺化方法，將極長O25b O-抗原多醣與白喉類毒素CRM ₁₉₇共軛。製備具有不同程度之過碘酸鹽活化：中等(5.5%)、低(4.4%)及高(8.3%)之三個不同批次之糖共軛物。顯示所得製劑及未共軛多醣不含內毒素雜質 ( 表 7 )。

對四隻兔(New Zealand白色雌性)之群組各自疫苗接種10微克糖共軛物及20微克QS21佐劑，且根據顯示於圖 13A中之時程進行血清取樣(VAC-2017-PRL-EC-0723)。值得注意的是，10微克劑量係在評價細菌糖共軛物慣常向兔給予之範圍的低端(更通常為20-50微克)。亦在獨立研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中，使用相同劑量(10微克多醣+20微克QS21佐劑)及一致投與時程，對一組兔進行疫苗接種未共軛多醣。

在其中羧基珠粒用預結合有未共軛O25b長多醣之甲基化人類血清白蛋白包覆之LUMINEX分析中，評價對於三個O25b糖共軛物製劑的兔抗體反應。用經藻紅素(PE)-標記的抗IgG二級抗體，來偵測血清樣本中之O25b特異性IgG抗體的存在。在第0週(免疫前)、第6週(給藥後2，PD2)、的8週(給藥後3，PD3)及第12週(給藥後4，PD4)取樣之最佳反應兔(一個來自各四隻群組)中之血清中觀測到之免疫反應的型態顯示於圖14中。在12隻兔中之任一者中未偵測到顯著的免疫前血清IgG效價。相比之下，在來自所有三個群組中之兔之疫苗接種後血清中偵測到O25b抗原特異性抗體反應，其中低活化糖共軛物群組反應傾向於略微高於中等或高活化糖共軛物群組。在給藥後3時間點，觀測到最大反應。低活化群組中之一隻兔及來自高活化群組中之一隻兔未能對疫苗接種起反應(無反應者)。

為了評定CRM ₁₉₇載體蛋白質共軛對於長O25b OAg多醣之免疫原性之影響，將來自疫苗接種未共軛多醣之兔的血清與來自疫苗接種低活化CRM ₁₉₇糖共軛物之兔的血清中的抗體存在進行比較，圖15。顯著地，游離多醣不為免疫原性的，在免疫血清與免疫前血清中幾乎不引起IgG反應(A圖)。相比之下，在來自四隻疫苗接種O25b OAg-CRM ₁₉₇之兔的三隻的PD4血清中，在一系列血清稀釋液(1:100至1:6400)中，觀測到比免疫前血清含量高大致十倍的O25b OAg特異性IgG平均螢光強度值(MFI)。此等結果表明載體蛋白質共軛以在10微克劑量水準下產生對於O25b OAg多醣之IgG抗體的必要性。

將在TSA培養盤上生長之細菌懸浮於PBS中，調節至2.0之OD ₆₀₀，且固定在含4%多聚甲醛之PBS中。在於4% BSA/PBS中阻斷1 h之後，將細菌與含免疫前及PD3免疫血清之2% BSA/PBS之連續稀釋液一起培育，且用經PE標記之二級F(ab)抗體偵測經結合的IgG。

在用完整細菌之流式細胞測量術實驗中，證實藉由O25b OAg-CRM ₁₉₇引起之O25b抗體之特異性。在Accuri流式細胞儀中，用PE共軛的F(ab') ₂片段山羊抗兔IgG偵測IgG與全細胞之結合。

如圖 16中所示，免疫前兔抗體未能與野生型血清型O25b分離株GAR2831及GAR2401結合或未能與K-12大腸桿菌菌株結合，而匹配的PD3抗體以濃度依賴性方式對O25b細菌進行染色。缺乏表現OAg之能力之陰性對照K-12菌株顯示僅極弱的PD3抗體結合，最可能係由於其表面上之暴露的內部核心寡醣抗原決定基的存在。將沙門氏菌 fepE質體引入至野生型O25b分離株中引起染色顯著地增強，與較高密度之由較長OAg多醣提供的免疫原性抗原決定基一致。

結論：所描述之結果顯示，不僅沙門氏菌 fepE，沙門氏菌物種中之極長O-抗原多醣之決定因素，且其亦可賦予不同O-抗原血清型之大腸桿菌菌株製備極長OAg的能力。可採用此特性，以藉由促進純化及與適當載體蛋白質之化學共軛，及藉由經由形成較高分子量複合物而潛在地增強免疫原性，來產生對於生物工藝發展具有改良特性之O-抗原疫苗多醣。

實例6：初始兔研究產生第一多株抗體試劑及對於RAC O25b OAg-CRM ₁₉₇之IgG反應使用過碘酸鹽氧化，隨後使用還原胺化化學方法(RAC)共軛，產生長鏈O25b多醣-CRM ₁₉₇共軛物( 表 7)。亦參見表 17。表 7

CRM ₁₉₇ 共軛物	132242-28 中等 5.5% 活化	132242-27 低 4.5% 活化	132242-29 高 8.3% 活化	709766-29 游離 O25b 多醣
多醣濃度 (mg/mL)	0.7	0.6	0.67	1
內毒素 (EU/ μg )	0.02	0.02	0.02	＜0.6 EU
基質	5 μm丁二酸鹽緩衝液/鹽水，pH 6.0

在兔研究1 (VAC-2017-PRL-EC-0723) (亦在上文實例5中描述)中，五(5) 隻兔/群組，其中10 μg L-、M-或H-活化RAC (+QS21)，根據顯示於圖 13A中之時程接受組合物。在追蹤兔研究(VAC-2017-PRL-GB-0698)中觀測到未共軛游離O25b多醣不為免疫原性的(參見圖 18)。

在兔研究2 (VAC-2018-PRL-EC-077)中，2隻兔/群組，其中L-RAC (AlOH ₃，QS21或無佐劑)，根據顯示於圖 13b中之時程接受組合物。

兔4-1、4-2、5-1、5-2、6-1及6-2接受描述於實例5中之極長未共軛O25b多醣，且測試第18週血清。

更具體言之，向兔4-1投與包括50 μg未共軛O25b、100 μg AlOH ₃佐劑之組合物。向兔4-2投與包括50 μg未共軛O25b、100 μg AlOH ₃佐劑之組合物。向兔5-1投與包括50 μg未共軛O25b、50 μg QS-21佐劑之組合物。向兔5-2投與包括50 μg未共軛O25b、50 μg QS-21佐劑之組合物。向兔6-1投與包括50 μg未共軛O25b、無佐劑之組合物。向兔6-2投與包括50 μg未共軛O25b、無佐劑之組合物。

實例 7 ：用 O25b RAC 共軛物進行之兔研究 ： dLIA 血清稀釋液效價兔研究2 (VAC-2018-PRL-EC-077) O25b dLIA血清稀釋液效價與來自研究1 (VAC-2017-PRL-EC-0723)之最佳反應兔. 對於此等實驗，實施經調節的直接結合Luminex分析，其中O25b長抗原之聚離胺酸共軛物被動地吸附至Luminex羧基珠粒而非先前描述之甲基化血清白蛋白長O-抗原混合物上。聚離胺酸-O25b共軛物之使用改良分析之敏感度及IgG濃度依賴性反應之品質，准許經由使用曲線擬合(四參數非線性方程式)測定血清稀釋液效價。將來自第一研究之最高效價兔之血清中之O25b IgG效價與來自表8中之第二研究兔之血清進行比較。表 8

	具有明礬佐劑之 O25b-CRM 低活化共軛物 ( 當血清稀釋時之 EC ₅₀ )	具有QS21 佐劑之O25b-CRM 低活化共軛物( 當血清稀釋時之 EC ₅₀)	不具有佐劑之O25b-CRM 低活化共軛物( 當血清稀釋時之 EC ₅₀)
	兔1-1	兔1-2	兔2-1	兔2-2	兔3-1	兔3-2
第3 週抗血清( 在初次之3 週之後)	~1:200	~1:200	＜1:100	＜1:100	~1:200	~1:200
第7 週抗血清( 在加強1 之1 週之後)	1:1600	1:4000	1:250	1:500	1:250	1:1500
第10 週抗血清( 在加強2 之1 週之後)	1:1100	1:1900	1:250	1:500	1:800	1:1200
第18 週抗血清( 在加強4 之1 週之後)	1:1600	1:4000	1:1300	1:1200	1:1400	1:1600
	來自兔2-3 ( 來自第一研究之分析標準) 之最佳抗血清之6 個重複之平均值 EC ₅₀= 1:1700

第二兔研究中之較高劑量(50/20 μg與10 μg)不改良IgG效價。

其餘兩個月增強IgG反應(未以較短間隔觀測到)。

相較於QS21或無佐劑，明礬似乎增強兔中之IgG反應。

確立用幼兔補體(BRC)及作為嗜中性白血球源之HL60細胞之調理吞噬活性分析(OPA)，以量測O-抗原糖共軛物之功能免疫原性。使大腸桿菌GAR2831之冷凍前細菌儲備液在37℃下在Luria培養液(LB)介質中生長。將細胞集結(pelleted)，且懸浮於補充有20%甘油之PBS中至1 OD ₆₀₀單位/毫升之濃度，並冷凍。將滴定前解凍的細菌稀釋於具有1%明膠之HBSS (漢克氏(Hank's)平衡鹽溶液)中至0.5× 10 ⁵CFU/ml，且將10 μL (10 ³CFU)與20 μL連續稀釋血清合併在U形底組織培養微量盤中，且混合物在700 rpm (BELLCO振盪器)下在37℃下於5% CO ₂培育箱中振盪30 min。將10 μl 2.5%補體(幼兔血清，PEL-FREEZ 31061-3，預稀釋於HBG中)及20 μL HL-60細胞(0.75X 10 ⁷個/ml)及40 μL HBG添加至U形底組織培養微量盤，且混合物在700 rpm (BELLCO振盪器)下在37℃下於5% CO ₂培育箱中振盪45 min。隨後，將各100 反應物μL之10 μL轉移至藉由施加100 μL水、真空過濾及施加150 μL 50% LB製備之預潤濕的MILLIPORE MULTISCREENHTS HV過濾盤之對應孔中。真空過濾過濾盤，且在37℃下於5% CO ₂培育箱中培育隔夜。次日，在固定、用庫馬斯(COOMASSIE)染料及Destain溶液染色及去染之後，使用IMMUNOSPOT®分析器及IMMUNOCAPTURE軟體對群落進行計數。為了確立OPA活性之特異性，在與OPA反應中之其他分析組分組合之前，將免疫血清與100 μg/mL經純化的長O25b O-抗原一起預培育。OPA分析包括不具有HL60細胞或補體之對照反應，以表明任何觀測到之殺傷對於此等組分之依賴性。

在該分析中評價來自兩個兔研究之代表性兔之匹配的免疫前及疫苗接種後血清樣本，且測定血清稀釋液效價(表9，圖 19A 至圖 19B)。與未共軛O25b長O-抗原多醣之預培育阻斷殺菌活性，表明OPA之特異性(圖19C)。表9，OPA效價

如下對兔2-3給藥：兔2-3給藥：10/10/10/10 μg RAC共軛物+ QS21，給藥後(PD) 4放血。如下對兔1-2給藥：50/20/20/20 μg RAC共軛物+ Al(OH) ₃，PD4放血。

表 9
樣本	效價
兔2-3免疫前血清	537
兔2-3 wk13血清(最終放血)	13686
兔1-2免疫前血清	＜200
兔1-2 wk19血清(最終放血)	22768

實例 8 ： 藉由未共軛 O25b 長 O- 抗原多醣及衍生 O25b RAC/DMSO 長 O- 抗原糖共軛物引起之 O- 抗原 O25b IgG 水準 .藉由在第0、5及13週，以0.2或2.0微克/動物皮下注射O25b RAC/DMSO長O-抗原糖共軛物，對十隻CD-1小鼠之群組進行給藥，其中在第3週(給藥後1，PD1)、第6週(給藥後2，PD2)及第13週(給藥後3，PD3)時間點進行放血以用於免疫原性測試。藉由定量Luminex分析(詳情參見實例7)，其中用O25b特異性小鼠mAb作為內部標準物，來測定抗原特異性IgG之水準。在自20×隨機選擇的未經疫苗接種小鼠之合併血清中，測定基線IgG水準(虛線)。游離未共軛O25b長O-抗原多醣免疫原未在任何時間點誘導出高於基線水準之IgG。相比之下，在兩次劑量之O25b-CRM197 RAC長共軛物糖共軛物之後觀測到IgG反應：在PD3觀測到穩固均一反應，其中在PD2觀測到中等及更可變IgG水準。GMT IgG值(ng/ml)用95% CI誤差杠指示。參見圖 20。

實例 9 ： O25b 幼兔補體 (BRC) OPA 之特異性 .A-B)來自兔2-3及1-2之O25b RAC/DMSO長O-抗原免疫後血清(但非匹配的免疫前對照血清)顯示殺細菌OPA活性。C)藉由與100 µg/mL長O-抗原O25b多醣一起預培育，阻斷來自兔1-2之免疫血清之OPA活性。將菌株GAR2831細菌與HL60、2.5% BRC及血清之連續稀釋液在37℃下一起培育1 h，且藉由計數過濾板上之微群落(CFU)來對存活細菌計數。參見圖 19。

實例 10 ： RAC 及 eTEC O25b 長糖共軛物比單端糖共軛物更具免疫原性。用碳青黴烯類耐受性氟喹諾酮(fluoroquinlone)耐受性MDR菌株Atlas187913進行BRC OPA分析。根據與圖 21中所示之相同的時程，對20隻CD-1小鼠群組疫苗接種2 µg糖共軛物，且在給藥後2 (PD2) (A圖)及給藥後3 (PD3) (B圖)時間點測定OPA反應。杠指示具有95% CI之GMT。指示高於未經疫苗接種基線之反應者率。評價來自不同群組之對數轉化資料，以使用未配對的t測試，用Welch's校正(Graphpad Prism)，評定差異是否為統計學上顯著的。結果概述於表10中。參見圖 21。在疫苗接種有2 µg eTEC O1a長糖共軛物之小鼠中，觀測到針對O1a、PD2及PD3之OPA效價(資料未顯示)分別比表10中顯示之針對O25b、PD2及PD3之OPA效價大。表 10

描述	反應者% (n/N)*	幾何平均效價PD2	反應者% (n/N)*	幾何平均效價PD3
單端短，2 µg	45 (9/20)	1,552	85 (17/20)	17,070
單端長，2 µg	30 (6/20)	763	85 (17/20)	10,838
RAC/DMSO長，2 µg	65 (13/20)	8,297	95 (19/20)	163,210
eTEC (10%)長，2 µg	90 (18/20)	27,368	100 (19/19)	161,526

實例 11 ： 可藉由調節多醣活化之水準來改良 eTEC 化學物質之 OPA 免疫原性。用碳青黴烯類耐受性氟喹諾酮耐受性MDR菌株Atlas187913進行BRC OPA分析。對20隻CD-1小鼠群組疫苗接種0.2 µg或2 µg所指示長O25b eTEC糖共軛物，且在PD2時間點測定OPA反應。評價來自4%活化與17%活化群組之彙總對數轉化資料，以使用未配對t-測試，用Welch's校正(Graphpad Prism)，確認OPA反應差異為統計學上顯著的。個別群組之GMT及反應者率概述於表11中。參見圖 22。表 11

描述	反應者% (n/N)	幾何平均效價
eTEC長4%活化(0.2 µg)	35 (7/20)	628
eTEC長4%活化(0.2 µg)	65 (13/20)	8,185
eTEC長10%活化(0.2 µg)	45 (9/20)	1,085
eTEC長10%活化(0.2 µg)	90 (18/20)	27,368
eTEC長17%活化(0.2 µg)	70 (14/20)	3,734
eTEC長17%活化(0.2 µg)	80 (16/20)	25,461

實例 12 ： 刺激研究指示長大腸桿菌 O25b eTEC 共軛物在三次劑量之後引起保護。用1 × 10 ⁹個細菌菌株GAR2831，IP刺激根據所指示時程用2 µg劑量免疫之20× CD-1小鼠群組。監測後續存活六天。保護用在4%、10%或17%水準下經活化之eTEC糖共軛物疫苗接種之小鼠群組免於致死性感染，而未經疫苗接種對照小鼠或疫苗接種2 µg未共軛O25b長多醣之小鼠則不。參見圖 23。

實例 13 ：用於製備 eTEC 連接的糖共軛物之方法 醣之活化及用胱胺二鹽酸鹽硫醇化.將醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。藉由Karl Fischer (KF)分析來測定溶液之水分含量，且將其調節至達到0.1及1.0%之水分含量，通常0.5%。

為了起始活化，新鮮製備在100 mg/mL濃度下之1,1'-羰基-二1,2,4-三唑(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)於DMSO中之溶液。醣用多種量之CDT/CDI (1-10莫耳當量)活化，且允許反應在rt或35℃下進行1-5小時。添加水以淬滅活化反應溶液中之任何殘餘CDI/CDT。進行計算以判定添加之水量，且以使得最終水分含量為總水溶液之2-3%。使反應在rt下進行0.5小時。在無水DMSO中新鮮製備在50 mg/mL濃度下之胱胺二鹽酸鹽。使經活化醣與1-2莫耳當量之胱胺二鹽酸鹽反應。可替代地，使經活化醣與1-2莫耳當量之半胱胺鹽酸鹽反應。使硫醇化反應在rt下進行5-20小時，以產生經硫醇化之醣。藉由所添加之CDT/CDI量來測定硫醇化水準。

經活化之經硫醇化的醣的還原及純化.向經硫醇化之醣反應混合物中，添加3-6莫耳當量之三(2-羧基乙基)膦(TCEP)之溶液，且使其在rt下進行3-5小時。隨後，藉由添加至預冷卻的10 mM磷酸二氫鈉中，將反應混合物稀釋5-10倍，且經由5 μm過濾器過濾。相對於30-40倍透濾體積之預冷卻的10 mM磷酸二氫鈉，進行經硫醇化醣之透濾。抽吸經活化之經硫醇化的醣保留物之等分試樣，以測定醣濃度及硫醇含量(艾爾曼(Ellman))分析。

經溴乙醯化載體蛋白質之活化及純化 .載體蛋白質之游離胺基藉由與溴乙醯化藥劑，諸如溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)、溴乙醯溴或另一適合的試劑反應，而經溴乙醯化。

在活化之前，首先將載體蛋白質(於0.1M磷酸鈉，pH 8.0 ± 0.2中)保持在8 ± 3℃下、在約pH 7下。向蛋白溶液中，以0.25-0.5 BAANS:蛋白質(w/w)之比率，添加呈二甲亞碸(DMSO)儲備液(20 mg/mL)形式之溴乙酸(BAANS)之N-羥基丁二醯亞胺酯。在5 ± 3℃下，將反應物平緩地混合30-60分鐘。例如藉由超過濾/透濾，使用10 kDa MWCO膜，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液，來純化所得經溴乙醯化(經活化)蛋白質。在純化之後，藉由Lowry蛋白質分析，來評估經溴乙醯化載體蛋白質之蛋白質濃度。

藉由與抑制導電性偵測(離子層析法)偶聯之利用離子交換液相層析進行總溴化物分析，來測定活化程度。經活化之經溴乙醯化蛋白質上之結合的溴化物在分析樣本製備中自蛋白質裂解，且與可存在之任何游離溴化物一起進行定量。藉由加熱鹼性2-巰基乙醇中之樣本轉化為離子溴化物，來釋放蛋白質上之任何殘餘共價結合的溴。

經溴乙醯化 CRM ₁₉₇ 之活化及純化 .CRM ₁₉₇用10 mM磷酸鹽緩衝的0.9% NaCl pH 7 (PBS)稀釋至5 mg/mL，且隨後使用1 M儲備溶液製成0.1 M NaHCO ₃pH 7.0。以1:0.35 (w:w)之CRM ₁₉₇:BAANS比率，使用20 mg/mL DMSO之BAANS儲備溶液，添加BAANS。在3℃與11℃之間培育反應混合物30分鐘至1小時，隨後藉由超過濾/透濾，使用10K MWCO膜及10mM磷酸鈉/0.9% NaCl pH 7.0來純化。藉由Lowry分析來分析經純化之經活化的CRM ₁₉₇以測定蛋白濃度，且隨後用PBS稀釋至5 mg/mL。添加蔗糖至5% wt/vol作為低溫保護劑，且將經活化蛋白質冷凍且儲存在-25℃下，直至共軛需要為止。

CRM ₁₉₇之離胺酸殘基之溴乙醯化極其一致，引起來自39個可用離胺酸中之15至25個離胺酸活化。該反應產生高產量之經活化蛋白質。

經活化硫醇化醣與經溴乙醯化載體蛋白質之共軛 .隨後添加經溴乙醯化載體蛋白質及經活化硫醇化醣。醣/蛋白質輸入比率為0.8 ± 0.2。用1 M NaOH溶液，將反應pH調整至9.0 ± 0.1。使共軛反應在5℃下進行20 ± 4小時。

殘餘反應性官能基之封端 .藉由在5℃下與作為封端試劑之2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時，來淬滅載體蛋白質上之未反應之經溴乙醯化殘基。殘餘游離氫硫基在5℃下用4莫耳當量之碘乙醯胺(IAA)封端20-24小時。

eTEC 連接的糖共軛物之純化 .共軛反應(IAA後封端的)混合物經由0.45 µm過濾器過濾。相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%鹽水pH 6.0進行糖共軛物之超過濾/透濾。隨後，糖共軛物保留物經由0.2 µm過濾器過濾。抽吸糖共軛物之等分試樣用於分析。將殘餘糖共軛物儲存在5℃下。參見表14、表15、表16、表17及表18。

實例 14 ： 大腸桿菌 -O25B ETEC 共軛物之製備 活化方法 ： 大腸桿菌 -O25b 脂多醣之活化 .將凍乾的大腸桿菌-O25b多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。藉由Karl Fischer (KF)分析，來測定凍乾的O25b/DMSO溶液之水分含量。水分含量藉由向O25b/DMSO溶液添加WFI來調整，以達到0.5%之水分含量。

為了起始活化，在DMSO溶液中新鮮製備1,1'-羰基二咪唑(CDI)為100 mg/mL。在硫醇化步驟之前，大腸桿菌-O25b多醣用各種量之CDI進行活化。在rt或35℃下進行CDI活化1-3小時。添加水以淬滅活化反應溶液中之任何殘餘CDI。進行計算以判定添加之水量，且以使得最終水分含量為總水溶液之2-3%。使反應在rt下進行0.5小時。

經活化大腸桿菌 -O25b 多醣之硫醇化 .在無水DMSO中新鮮製備胱胺二鹽酸鹽，且向經活化多醣反應溶液中添加1-2莫耳當量之胱胺二鹽酸鹽。使反應在rt下進行20 ± 4小時。

經活化之經硫醇化大腸桿菌 -O25b 多醣之還原及純化 .向經硫醇化之醣反應混合物中，添加3-6莫耳當量之三(2-羧基乙基)膦(TCEP)之溶液，且使其在rt下進行3-5小時。隨後，藉由添加至預冷卻的10 mM磷酸二氫鈉中，將反應混合物稀釋5-10倍，且經由5 μm過濾器過濾。用5K MWCO超濾器膜盒，相對於40倍透濾體積之預冷卻的10 mM磷酸二氫鈉進行經硫醇化醣之透濾。抽吸經O25b多醣保留物用於醣濃度及硫醇(艾爾曼(Ellman))分析。活化方法之流程圖提供於圖 25A中。

共軛方法 ： 經硫醇化大腸桿菌 -O25b 多醣與經溴乙醯化 CRM ₁₉₇ 之共軛 .CRM ₁₉₇載體蛋白質單獨地藉由溴乙醯化進行活化，如實例 13中所描述，且隨後與經活化之大腸桿菌-O25b多醣反應以進行共軛反應。將經溴乙醯化CRM ₁₉₇及經硫醇化O25b多醣一起混合在反應容器中。醣/蛋白質輸入比率為0.8 ± 0.2。將反應pH調節至8.0-10.0。使共軛反應在5℃下進行20 ± 4小時。

經溴乙醯化 CRM ₁₉₇ 及經硫醇化大腸桿菌 -O25b 多醣上之反應性基團之封端 .CRM ₁₉₇蛋白上之未反應之經溴乙醯化殘基藉由以下來進行封端：在5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時，隨後在5℃下用4莫耳當量之碘乙醯胺(IAA)封端經硫醇化O25b-多醣之任何殘餘游離氫硫基20-24小時。

eTEC 連接的大腸桿菌 -O25b 糖共軛物之純化 .共軛溶液經由0.45 µm或5 µm過濾器過濾。用100K MWCO超濾器膜盒進行O25b糖共軛物之透濾。相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%鹽水pH 6.0進行透濾。隨後，大腸桿菌-O25b糖共軛物100K保留物經由0.22 µm過濾器過濾，且儲存在5℃下。

共軛方法之流程圖提供於圖 25B中。

結果若干批次之大腸桿菌-O25b eTEC糖共軛物之反應參數及特徵資料顯示於表12中。利用胱胺二鹽酸鹽進行之CDI活化-硫醇化產生具有41至92%醣產率及＜5至14%游離醣之糖共軛物。亦參見表14、表15、表16、表17及表18。表 12 ： 大腸桿菌 -O25b eTEC 共軛物之實驗參數及特徵資料

共軛物批次	O25b-1A	O25b-2B	O25b-3C	O25b-4D	O25b-5E	O25b-6F
活化水準(硫醇之mol/多醣之mol)，%	10	20	22	17	25	24
輸入醣/蛋白比率	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
醣產率(%)	56	57	79	92	41	59
輸出醣/蛋白比率	0.88	1	1.18	1.32	2.9	1.4
游離醣，%	8	＜5	6	5	14	5
游離蛋白質，%	＜ 1	＜ 1	＜ 1	＜ 1	＜ 1	＜ 1
共軛物Mw，kDa	1057	4124	2259	2306	1825	1537
總CMCA	3	na	na	7.2	na	na

實例 15 ： 用於製備大腸桿菌 O- 抗原多醣 -CRM197 eTEC 共軛物 ( 塗覆於來自 大腸桿菌血清型 O25b 、 O1a 、 O2 及 O6 之 O- 抗原 ) 之程序 多醣之活化 .將大腸桿菌O-抗原多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。為了起始活化，向多醣溶液中添加各種量之1,1'-羰基二咪唑(CDI) (1-10莫耳當量)，且使反應在rt或35℃下進行1-5小時。隨後，添加水(2-3%，v/v)以淬滅活化反應溶液中之任何殘餘CDI。在使反應在rt下進行0.5小時之後，添加1-2莫耳當量之胱胺二鹽酸鹽。使反應在rt下進行5-20小時，且隨後用3-6莫耳當量之三(2-羧基乙基)膦(TCEP)處理，產生經硫醇化醣。藉由所添加之CDT量來測定硫醇化水準。

隨後，藉由添加至預冷卻的10 mM磷酸二氫鈉中，將反應混合物稀釋5-10倍，且經由5 μm過濾器過濾。相對於30-40倍透濾體積之預冷卻的10 mM磷酸二氫鈉，進行經硫醇化醣之透濾。抽吸經活化之經硫醇化的醣保留物之等分試樣，以測定醣濃度及硫醇含量(艾爾曼(Ellman))分析。

載體蛋白質 (CRM ₁₉₇) 之活化在活化之前，首先將CRM ₁₉₇(於0.1M磷酸鈉pH 8.0 ± 0.2中)保持在8 ± 3℃、約pH 8下。向蛋白溶液中，以0.25-0.5 BAANS:蛋白質(w/w)之比率，添加呈二甲亞碸(DMSO)儲備液(20 mg/mL)形式之溴乙酸(BAANS)之N-羥基丁二醯亞胺酯。在5 ± 3℃下，將反應物平緩地混合30-60分鐘。例如藉由超過濾/透濾，使用10 kDa MWCO膜，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液，來純化所得經溴乙醯化(經活化)蛋白質。在純化之後，藉由Lowry蛋白質分析，來評估經溴乙醯化載體蛋白質之蛋白質濃度。

共軛隨後向反應器中添加經活化的CRM ₁₉₇及經活化的大腸桿菌O-抗原多醣，且混合。醣/蛋白質輸入比率為1 ± 0.2。用1 M NaOH溶液，將反應pH調整至9.0 ± 0.1。使共軛反應在5℃下進行20 ± 4小時。藉由在5℃下與作為封端試劑之2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時，來淬滅載體蛋白質上之未反應之經溴乙醯化殘基。殘餘游離氫硫基在5℃下用4莫耳當量之碘乙醯胺(IAA)封端20-24小時。隨後，使用相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%鹽水pH 6.0進行之超過濾/透濾，來純化反應混合物。隨後，經純化的共軛物經由0.2 µm過濾器過濾。參見表14、表15、表16、表17及表18。

實例 16 ： 通用程序 ： 藉由還原胺化化學方法 (RAC) 進行 O- 抗原 ( 來自 大腸桿菌血清型 O1 、 O2 、 O6 、 25b) 多醣之共軛

在二甲亞碸 (RAC/DMSO) 中之共軛

活化多醣藉由依序添加計算量之500 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)及注射用水(WFI)，在100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.0 ± 0.2)中進行多醣氧化，得到2.0 g/L之最終多醣濃度。必要時，將反應pH調節至大致pH 6.0。在pH調節之後，將反應溫度冷卻至4℃。藉由添加大致0.09-0.13莫耳當量之過碘酸鈉起始氧化。在5 ± 3℃下進行氧化反應大致20 ± 4小時。

使用5K MWCO超過濾盒，濃縮及透濾經活化多醣。相對於20倍透濾體積之WFI，進行透濾。隨後，將經純化之經活化的多醣儲存在5 ± 3℃下。經純化之經活化的醣之特徵尤其在於：(i)藉由比色分析測定之醣濃度；(ii)藉由比色分析測定之醛濃度；(iii)氧化程度；及(iv)藉由SEC-MALLS測定之分子量。

將經活化的多醣與蔗糖賦形劑混配 ， 且凍乾將經活化的多醣與蔗糖混配至25公克蔗糖/公克經活化的多醣的比率。隨後，凍乾混配混合物之瓶子。在凍乾之後，將含有經凍乾之經活化的多醣的瓶子儲存在-20 ± 5℃下。將計算量之CRM ₁₉₇蛋白進行殼式冷凍且單獨地凍乾。將經凍乾的CRM ₁₉₇儲存在-20 ± 5℃下。

復原經凍乾之經活化的多醣及載體蛋白質將經凍乾之經活化的多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中復原。在多醣完全溶解後，向經凍乾的CRM ₁₉₇中添加等量之無水DMSO以進行復原。

共軛及封端在起始與氰基硼氫化鈉共軛之前，將經復原之經活化的多醣與經復原的CRM ₁₉₇合併在反應容器中，隨後充分地混合，得到澄清溶液。反應溶液中之最終多醣濃度為大致1 g/L。藉由向反應混合物中添加0.5-2.0 MEq氰基硼氫化鈉及在23 ± 2℃下培育20-48小時，來起始共軛。藉由添加2 MEq硼氫化鈉(NaBH ₄)終止共軛反應，以封端未反應之醛。此封端反應在23 ± 2℃下繼續3 ± 1小時。

純化共軛物共軛物溶液用準備好的冷卻的5 mM丁二酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)以1:10稀釋，以用於藉由切向流過濾，使用100-300K MWCO膜進行純化。將經稀釋的共軛物溶液通過5 µm過濾器，且使用5 mM丁二酸鹽/0.9%鹽水(pH 6.0)作為介質，進行透濾。在完成透濾之後，經由0.22 μm過濾器，轉移共軛物保留物。共軛物用5 mM丁二酸鹽/0.9%鹽水(pH 6)進一步稀釋至大致0.5 mg/mL之目標醣濃度。可替代地，使用20 mM組胺酸-0.9%鹽水(pH 6.5)，藉由切向流過濾，使用100-300K MWCO膜，來純化共軛物。完成最終0.22 μm過濾步驟，得到免疫原性結合物。參見表14、表15、表16、表17及表18。

實例 17 ： 適用於來自大腸桿菌血清型 O25B 、 O1A 、 O2 及 O6 之 水性緩衝液 (RAC/ 水溶液 ) 中之共軛以與基於DMSO之共軛之多醣活化及透濾相同的方式進行多醣活化及透濾。

視血清型而定，以在0.4至2 w/w範圍內之多醣與蛋白質質量比，將經過濾之經活化的醣與CRM ₁₉₇混配。選擇此輸入比率來控制所得共軛物中之多醣與CRM ₁₉₇之比率。

隨後，凍乾混配混合物。在共軛後，視血清型而定，以在5至25 g/L範圍內之多醣濃度，將多醣及蛋白質混合物溶解於0.1M磷酸鈉緩衝液中，視血清型而定，將pH調整在6.0至8.0之間。藉由向反應混合物中添加0.5-2.0 MEq氰基硼氫化鈉及在23 ± 2℃下培育20-48小時，來起始共軛。藉由添加1-2 MEq硼氫化鈉(NaBH ₄)終止共軛反應，以封端未反應之醛。

可替代地，將經過濾之經活化的醣及計算量之CRM ₁₉₇蛋白進行殼式冷凍且單獨地凍乾，且隨後在溶解於0.1M磷酸鈉緩衝液中後合併，隨後可如上文所描述進行後續共軛。表 13 概述在 DMSO 及水性緩衝液中製備之兩個共軛之結果

	RAC/DMSO	RAC/水溶液
聚合物MW (kDa)	48K	46K
氧化程度(DO)	12	12
醣/蛋白質比率	0.8	1.0
游離醣%	＜5%	32%
藉由SEC-MALLS測定之共軛物MW，kDa	7950	260

實例 18 ： 用於製備大腸桿菌 O- 抗原多醣 -CRM ₁₉₇ 單端共軛物之程序脂多醣(LPS)其為革蘭氏陰性細菌之外膜之常見組分，包含脂質A、核心區及O-抗原(亦稱作O-特異性多醣或O-多醣)。O-抗原重複單元之不同血清型在其組成、結構及血清學特徵上不同。將本發明中使用之O-抗原與在其鏈端含有稱為2-酮-3-去氧辛酸(KDO)之糖單元之核心域連接。不同於基於多醣鏈之無規活化(例如用過碘酸鈉或碳化二亞胺活化)之一些共軛方法。本發明揭示一種涉及用二硫化胺連接子選擇性活化KDO之共軛方法，在揭露硫醇官能基後，隨後如圖 24(單端共軛物之製備)中所描繪，將其與經溴活化之CRM ₁₉₇蛋白共軛。

基於胱胺連接子 (A1) 之共軛將O-抗原多醣及胱胺(50-250莫耳當量之KDO)混合在磷酸鹽緩衝液中，將pH調整至6.0-7.0。向混合物中添加氰基硼氫化鈉(NaCNBH ₃) (5-30莫耳當量之KDO)，且在37℃下攪拌混合物48-72小時。在冷卻至室溫且用等體積之磷酸鹽緩衝液稀釋後，混合物用三(2-羧基乙基)膦(TCEP) (1.2莫耳當量之所添加胱胺)處理。隨後，經由相對於10 mM磷酸二氫鈉溶液透濾，使用5 KDa MWCO膜，來純化混合物，得到含有硫醇之O-抗原多醣。可藉由艾爾曼(Ellman)分析來測定硫醇含量。

隨後，藉由將以上經硫醇活化之O-抗原多醣與經溴活化之CRM ₁₉₇蛋白以0.5-2.0之比率混合，進行共軛。用1 M NaOH溶液，將反應混合物之pH調節至8.0-10.0。在5℃下進行共軛反應24 ± 4小時。藉由在5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時，來淬滅載體蛋白質上之未反應之溴殘基。隨後，添加3莫耳當量之碘乙醯胺(與所添加之N-乙醯基-L-半胱胺酸相關)，以封端殘餘游離氫硫基。在5℃下再進行此封端反應3-5小時，且藉由添加1M NaOH，將兩個封端步驟之pH維持在8.0-10.0下。在使用30 KDa MWCO膜，相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%鹽水pH 6.0進行超過濾/透濾之後，獲得所得共軛物。參見表14、表15、表16、表17及表18。

實例 19 ：基於 3,3'- 二硫基雙 ( 丙酸二醯肼 ) 連接子 (A4) 之共軛將O-抗原多醣及3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼) (5-50莫耳當量之KDO)混合在乙酸鹽緩衝液中，將pH調整至4.5-5.5。向混合物中添加氰基硼氫化鈉(NaCNBH ₃) (5-30莫耳當量之KDO)，且在23-37℃下攪拌混合物24-72小時。隨後，混合物用三(2-羧基乙基)膦(TCEP) (1.2莫耳當量之所添加之3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼)連接子)處理。隨後，經由相對於10 mM磷酸二氫鈉溶液透濾，使用5 KDa MWCO膜，來純化混合物，得到含有硫醇之O-抗原多醣。可藉由艾爾曼(Ellman)分析來測定硫醇含量。

隨後，藉由將以上經硫醇活化之O-抗原多醣與經溴活化之CRM ₁₉₇蛋白以0.5-2.0之比率混合，進行共軛。用1 M NaOH溶液，將反應混合物之pH調節至8.0-10.0。在5℃下進行共軛反應24 ± 4小時。藉由在5℃下與2莫耳當量之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3-5小時，來淬滅載體蛋白質上之未反應之溴殘基。隨後，添加3莫耳當量之碘乙醯胺(與所添加之N-乙醯基-L-半胱胺酸相關)，以封端殘餘游離氫硫基。在5℃下再進行此封端反應3-5小時，且藉由添加1M NaOH，將兩個封端步驟之pH維持在8.0-10.0下。在使用30 KDa MWCO膜，相對於5 mM丁二酸鹽-0.9%鹽水pH 6.0進行超過濾/透濾之後，獲得所得共軛物。

實例 20 ：基於 2,2'- 二硫基 -N,N'- 雙 ( 乙烷 -2,1- 二基 ) 雙 (2-( 胺氧基 ) 乙醯胺 ) 連接子 (A6) 之共軛將O-抗原多醣及2,2'-二硫基-N,N'-雙(乙烷-2,1-二基)雙(2-(胺氧基)乙醯胺) (5-50莫耳當量之KDO)混合在乙酸鹽緩衝液中，將pH調整至4.5-5.5。隨後，在23-37℃下攪拌混合物24-72小時，隨後添加氰基硼氫化鈉(NaCNBH ₃) (5-30莫耳當量之KDO)，且再攪拌混合物3-24小時。隨後，混合物用三(2-羧基乙基)膦(TCEP) (1.2莫耳當量之所添加之連接子)處理。隨後，經由相對於10 mM磷酸二氫鈉溶液透濾，使用5 KDa MWCO膜，來純化混合物，得到含有硫醇之O-抗原多醣。可藉由艾爾曼(Ellman)分析來測定硫醇含量。

實例 21 ： 經溴活化之 CRM ₁₉₇ 之製備在0.1M磷酸鈉pH 8.0 ± 0.2溶液中製備CRM ₁₉₇，且將其冷卻至5 ± 3℃。向蛋白溶液中，以0.25-0.5 BAANS:蛋白質(w/w)之比率，添加呈二甲亞碸(DMSO)儲備液(20 mg/mL)形式之溴乙酸(BAANS)之N-羥基丁二醯亞胺酯。在5 ± 3℃下，將反應物平緩地混合30-60分鐘。例如藉由超過濾/透濾，使用10 kDa MWCO膜，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液，來純化所得經溴乙醯化(經活化)蛋白質。在純化之後，藉由Lowry蛋白質分析，來評估經溴乙醯化載體蛋白質之蛋白質濃度。表 14 ： O1a 共軛物

共軛物批次號	132240-112-2	132242-106	132242-124	132242-127	132242-130
聚合物批次號	709756-160	709756-160	709756-160	710958-116	710958-116
聚合物類型	長鏈	短鏈
聚合物 MW (kDa)	33	33	33	11	11
變體	eTEC	單端	RAC/DMSO	單端	RAC/DMSO
活化	8% SH	2.1% SH	DO：13	6.4% SH	DO：16
共軛物資料
產率 (%)	30	26	77	45	35
SP 比率	0.6	0.5	1.0	0.7	0.6
游離醣 (%)	9	9	20	5	6
MW (kDa)	1035	331	1284	280	2266
醣濃度 (mg.mL)	0.31	0.37	0.58	0.59	0.37
內毒素 (Eu/ μg )	0.03	0.02	0.01	0.01	0.01
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表 15 ： O2 共軛物

共軛物批次號	00709749-0003-1	132242-161	132242-152	132242-159	132242-157
聚合物批次號	709766-33	709766-65	710958-141-2
聚合物類型	長鏈	短鏈
聚合物 MW (kDa)	36	39	14
變體	eTEC	單端	RAC/DMSO	單端	RAC/DMSO
活化	6.8% SH	1.6% SH	DO：17	6.3% SH	DO：19
共軛物資料
產率 (%)	26	33	50	38	36
SP 比率	1.5	0.8	0.8	1.0	0.6
游離醣 (%)	11	24%	＜5	＜5	6
MW (kDa)	1161	422	3082	234	1120
內毒素 (Eu/μg)	0.025	0.02	0.01	0.01	0.01
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表 16 ： O6 共軛物

共軛物批次號	132240-117-1	132242-134	132242-137	132242-146	132242-145
聚合物批次號	710958-121-1	710958-143-3
聚合物類型	長鏈	短鏈
聚合物MW (kDa)	44	15
變體	eTEC	單端	RAC/DMSO	單端	RAC/DMSO
活化	18% SH	2.2% SH	DO：16.5	6.1% SH	DO：22
共軛物資料
產率(%)	27	23	58	48	30
SP 比率	0.78	0.6	0.82	0.7	0.6
游離醣(%)	9	4	4	＜5	8
MW (kDa)	1050	340	1910	256	2058
醣濃度(mg.mL)	0.39	0.45	0.59	0.88	0.41
內毒素(Eu/μg)	0.03	0.02	0.01	0.004	0.005
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表 17 ： O25b 共軛物

共軛物批次號	132242-28	132242-98	132240-73-1-1	132240-62-1	132240-81	132242-116	132242-121	132242-27	132242-29
聚合物批次號	709766-28	709766-29	709766-30	709766-30	709766-30	710958-117/118	710958-117/118	709766-28	709766-28
聚合物類型	長鏈	短鏈	長鏈	長鏈
聚合物 MW (kDa)	51	48	48	48	48	14	14	51	51
變體	RAC/DMSO	單端	eTEC	eTEC	eTEC	單端	RAC/DMSO	RAC/DMSO	RAC/DMSO
活化	DO：18	2.4% SH	10% SH	4% SH	17% SH	6.6% SH	DO：17	21	12
共軛物資料
產率 (%)	82	26	56	32	92	28	18	71	80
SP 比率	0.9	0.82	0.88	0.64	1.32	0.7	0.36	0.81	0.84
游離醣 (%)	7.2	5	＜ 5	11	＜ 5	＜ 5	＜ 5	8.3	＜5
共軛物 MW (kDa)	4415	840	1057	1029	2306	380	9114	3303	7953
醣濃度 (mg.mL)	0.7	0.4	0.43	0.36	0.9	0.45	0.19	0.6	0.67
內毒素 (Eu/μg)	0.01	0.02	0.08	0.08	0.01	0.01	0.01	0.02	0.22
共軛物 (DS) 緩衝液基質	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

表 18 ： O25b K-12 共軛物

共軛物批次號	709749-015-2	709744-0016
聚合物批次號	710958-137
聚合物類型	長鏈 (K12)
聚合物 MW (kDa)	44
變體	eTEC	RAC/DMSO
活化	SH：24%	DO：19
共軛物資料
產率 (%)	59%	33%
SP 比率	1.4	0.83
游離醣 (%)	5%	5.2%
MW (kDa)	1537	4775
醣濃度 (mg.mL)	0.91	0.29
內毒素 (Eu/μg)	0.08	0.01
緩衝液	5 mM丁二酸鹽/鹽水，pH 6.0

實例 22 ： 大腸桿菌 O-Ag-TT 共軛物之製備將50 mg凍乾的大腸桿菌血清型O25b長多醣批次號709766-30 (約6.92 mg/mL，MW：約39 kDa)用於破傷風類毒素(TT)共軛。

將大腸桿菌血清型O1a長多醣710958-142-3 (約6.3 mg/mL，MW：約44.3 kDa) (50 mg，7.94 mL)凍乾。

將大腸桿菌血清型O6長多醣710758-121-1 (約16.8 mg/mL，MW：約44 kDa) (50 mg，2.98 mL)凍乾。

將上文所列之凍乾的多醣中之每一者溶解於WFI中，以製備大致5-10 mg/mL，向其中添加0.5 mL (100 mg (1-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)於1 mL乙腈中之溶液)，且在RT下攪拌。添加三乙胺(TEA) 0.2M (2 mL)，且在RT下攪拌。

破傷風類毒素(TT)之製備：將TT (100 mg，47 ml)濃縮至大致20 mL，且使用過濾管，用鹽水(2 × 50 mL)洗滌兩次。此後，其用HEPES及鹽水稀釋，以使得最終HEPES濃度為約0.25M。

如上文所描述製備TT，且將反應物之pH調節至約9.1-9.2。在RT下攪拌反應混合物。

在20-24小時之後，反應用甘胺酸(0.5 mL)淬滅。此後，使用MWCO再生纖維素膜將其濃縮，且相對於鹽水進行透濾。過濾及分析。參見表19。表 19例示性實施例：

大腸桿菌血清型 O25b-TT 共軛物

大腸桿菌血清型 O6-TT 共軛物

體積：41 mL 醣濃度 ( 蒽酮 ) ：1.122 mg/mL (92%產率) 蛋白質濃度 (Lowry)：1.133 mg/mL SP 比率：0.99 游離醣 (DOC)：74.7% 使用MWCO再生纖維素膜將所獲得之產物濃縮至15 mL，且相對於鹽水(40×透濾體積)進行透濾。經由0.22 μm過濾器過濾且進行分析。體積：27 mL 醣濃度 ( 蒽酮 ) ：1.041 mg/mL (56%產率) 蛋白質濃度 (Lowry)：1.012 mg/mL SP 比率: 1.03 游離醣 (DOC) ：60.6% (聚合物回收率100%)

體積：42 mL 醣濃度 ( 蒽酮 ) ：0.790 mg/mL (66%產率) 蛋白質濃度 (Lowry)：1.895 mg/mL SP 比率：0.42 游離醣 (DOC)：＜5% MW (kDa)：1192 內毒素 (EU/ μ g) ：0.022

實例 23 ： O- 抗原醱酵、純化及共軛之其他結果以下所描述之例示性方法一般適用於所有大腸桿菌血清型。每一多醣之產生包括批次產生醱酵，隨後在下游純化之前化學失活。

菌株及儲存 .用於生物合成短鏈O-抗原之菌株為大腸桿菌之臨床野生型菌株。用已經Wanner-Datsenko方法工程改造以擁有原生 wzzb基因缺失且由來自沙門氏菌之「長鏈」增鏈劑功能補充之短鏈產生者之衍生物，來產生長鏈O-抗原。自基於colE1之高複本「topo」載體或基於colE1之載體pET30a之低複本衍生物(其中已缺失T7啟動子)上之其原生啟動子，表現 fepE功能。

藉由在不含動物源之LB或基本培養基中生長細胞至至少3.0之OD ₆₀₀來製備細胞庫。隨後，將培養液稀釋在新鮮培養基中，且與80%甘油合併，得到20%甘油最終濃度，2.0 OD ₆₀₀/mL。

用於種細胞培養及醱酵之培養基 .所採用之種子及醱酵培養基共用以下配方：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。

種子及醱酵條件 .自單一種子小瓶，以0.1%，接種種子。在37℃下培育種子燒瓶16-18小時，且通常達到10-20 OD ₆₀₀/mL。

在10 L不鏽鋼原位蒸汽醱酵器中進行醱酵。

醱酵器之接種通常為自10 OD ₆₀₀種子，1:1000。該批次階段，其為在在10 g/L分批次葡萄糖上進行生長期間之時段，通常持續8小時。在葡萄糖耗盡後，溶解氧急劇上升，此時向醱酵液中饋入葡萄糖。隨後，醱酵通常進行16-18小時，其中得到收穫物＞ 120 OD ₆₀₀/mL。

血清型 O1a 、 O2 、 O6 及 O25b 之短 / 長鏈 O- 抗原產量之初始評價 .在補充基本培養基中，以分批次模式，醱酵O1a、O2、O6及O25b之野生型菌株至OD ₆₀₀= 15-20。在葡萄糖耗盡後，其引起氧消耗急劇降低，自葡萄糖溶液施加生長限制性葡萄糖饋料16-18小時。達到124-145 OD ₆₀₀單位/毫升之細胞密度。隨後，將收穫培養液之pH調節至約3.8，且加熱至95℃2小時。隨後，將經水解培養液冷卻至25℃，達至pH 6.0，且離心以移除固體。隨後，將所得上清液施加於SEC-HPLC管柱以進行O-抗原定量。獲得在2240-4180 mg/L範圍內之生產力。發現來自此等批次之經純化短鏈O-抗原之分子量係在10-15 kDa範圍內。亦指出，O2及O6水解產物之SEC層析顯示在O1a及O25b水解產物中不明顯的不同及可分離的雜質多醣。

O1a、O2、O6及O25b O-抗原之長鏈型式，其經由在高複本康黴素可選擇topo質體上攜載異源、互補 fepE基因之各菌株之 wzzb缺失型式醱酵獲得。如短鏈一樣進行醱酵，即使用康黴素選擇。觀測到在124-177 OD ₆₀₀/mL下之最終細胞密度與3500-9850 mg/L之O-抗原生產力相關。基於互補之長鏈O-抗原之合成至少如在親本短鏈菌株中一樣高產，且在一些情況下更為如此。經純化O-抗原多醣之分子量為33-49 kDa或約對應短鏈之大小之3倍。

指出，O2及O6之長鏈水解產物顯示雜質多醣峰之證據，在此情況下，觀測到長鏈抗原為主要O-抗原峰上之肩部；O1及O25b顯示無產生雜質多醣之證據，如先前對於短鏈母體所見。

發現生長速率抑制與topo複製子不存在 fepE之存在相關。另外，Δ wzzb突變自身對於生長速率無不良影響，指示受干擾的生長速率係由質體載體傳達。

用於生產 O11 、 O13 、 O16 、 O21 及 O75 O- 抗原之菌株之評價 .藉由SEC-HPLC，評價血清型O11、O13、O16、O21及O75之多個野生型菌株之其在醱酵中產生非所需多醣之傾向。O11、O13、O16、O21及O75之菌株經選擇為不存在雜質多醣，以及針對其產生＞ 1000 mg/L O-抗原之能力及允許Wanner-Datsenko重組工程以引入Δ wzzb性狀之抗生素敏感度量變曲線之呈現進行選擇。

構築允許將 fepE引入至一般而言發現為康黴素耐受性之O11、O13、O16、O21及O75 Δwzzb菌株中之topo- fepE及pET- fepE之氯黴素可選擇型式。將所得topo- fepE及pET- fepE攜帶菌株與氯黴素選擇物一起醱酵，且藉由SEC-HPLC評價來自經酸水解之培養液的上清液。高(topo)及低複本(pET) fepE構築體指導以各自等效於親本野生型之生產力合成O-抗原。未觀測到潛在地干擾多醣之表現。

wzzb質體攜帶菌株之生長速率之評價顯示，O11、O13及O21藉由topo-fepE但不藉由pET-fepE之存在而遲延；菌株O16及O75菌株顯示與複製子選擇無關之可接受的生長速率。表 20

O- 抗原類型	IHMA 類型	短鏈(SC) 或長鏈(LC)	fepE 質體類型	標記	最終細胞密度OD ₆₀₀	最終Oag 生產力(mg/L)	MW - kDa	SEC 雜質
O1a	wt	SC	無	無	125	2550	11	N
O1a	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	130	5530	33	N
O1a	Δwzzb/fepE	LC	pET	Kana	未進行(ND)	ND	ND	ND
O2	wt	SC	無	無	127	2240	13	Y
O2	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	177	3750	49	Y
O2	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O6	wt	SC	無	無	145	4180	16	Y
O6	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	124	9850	44	Y
O6	Δwzzb/fepE	LC	pET	Kana	ND	ND	ND	ND
O11	wt	SC	無	無	194	4720	x	N
O11	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	142	7220	x	N
O11	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O13	wt	SC	無	x	113	4770	x	N
O13	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	101	4680	x	N
O13	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	108	4600	x	N
O16	wt	SC	無	x	154	1870	x	N
O16	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	129	1180	x	N
O16	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	137	1280	x	N
O21	wt	SC	無	x	140	1180	x	N
O21	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	ND	ND	x	N
O21	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	131	820	x	N
O25b	2831	SC	無	無	126	3550	10	N
O25b	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	152	3500	49	N
O25b	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O75	wt	SC	無	x	149	1690	x	N
O75	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	132	1500	x	N
O75	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	138	1520	x	N

用於多醣之純化方法包括酸水解以釋放O-抗原。醱酵反應器中之血清型特異性大腸桿菌培養物之粗懸浮液直接用乙酸處理至最終3.5±0.5之pH，且將經酸化之培養液加熱至95±5℃之溫度，持續至少一小時。此處理裂解在寡醣之近端處之KDO與脂質A之間的不穩定鍵，因此釋放O-Ag鏈。在使用NH ₄OH中和至pH 7 ± 1.0之前，將含有經釋放之O-Ag之經酸化的培養液冷卻至20 ± 10℃。方法進一步包括若干離心、過濾及濃縮/透濾操作步驟。表 21

血清型( 核心)	描述	預期聚合物大小	效價 (g/L)	經純化之聚合物 M.W. (kDa)	重複單元之數目	M.W. (kDa) 相對於短鏈之增加	NMR	經純化之共軛物 M.W. (kDa)	共軛批次號
O25b (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	5.3	47	55	34	ü	5365	132242-28 (RAC/DMSO)
1423	132242-98 (單端)
1258	132240-73-1-1 (eTEC)
ΔwzzB + O25a wzzB	短	2.3	13/14	15	NA	ü	380	132242-116 (單端)
9114	132242-121 (RAC/DMSO)
O25b (K12)	ΔwzzB+ LT2FepE	長	3.5	44	51	27	ü	1537	709749-015-2 (eTEC)
4775	709744-0016 (RAC/DMSO
wt	短	3.5	17	17	NA	ü
O1a (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	5.5	33	39		ü	1035	132240-112-2 (eTEC)
22	331	132242-106 (單端)
	1284	132242-124 (RAC/DMSO)
wt	短	2.5	11	13	NA	ü	280	132242-127 (單端)
2266	132242-130 (RAC/DMSO)
O2 (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	4.9	36	43	22	ü	1161	00707947-0003-1 (eTEC)
39	47	25		422	132242-161 (單端)
3082	132242-152 (RAC/DMSO)
wt	短	2.8	14	17	NA	ü	234	132242-159 (單端)
1120	1322421-157 (RAC/DMSO)
O2 (R4)	ΔwzzB + LT2FepE	長	5.1	NA	NA	NA	NA
wt	短	2.1	14.7	18	NA	ü
O6 (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	6.9	37.2	42	22.2	ü
wt	短	3.5	15	17	NA	ü	256	132242-146 (單端_
		2058	123342-145 (RAC/DMSO)
O6 (R1)	ΔwzzB + LT2FepE	長	8.4	44.4	50	28.2	ü	1050	132240-117-1 (eTEC)
340	132242-134 (單端) 132242-137
1910	(RAC/DMSO)
wt	短	3.6	16.2	18	NA	ü

以下條項描述本發明之其他實施例：C1.一種醣，其包含選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。 C2.如條項C1之醣，其包含選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D ₁、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167及式O172，其中 n為20至100之整數。 C3.如條項C2之醣，其包含選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173及式62D ₁，其中n為20至100之整數。 C4.如條項C2之醣，其包含選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O15、式O16、式O21、式O25 (例如式O25a及式O25b)及式O75。 C5.如條項C1之醣，其中該醣不包含選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101。 C6.如條項C1之醣，其中該醣不包含選自式O12之結構。 C7.如條項C4之醣，其中該醣係藉由在革蘭氏陰性細菌中表現wzz家族蛋白質以產生該醣來產生。 C8.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質係選自由以下組成之群：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。 C9.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質為wzzB。 C10.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質為fepE。 C11.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質為wzzB及fepE。 C12.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質係來源於腸沙門氏菌。 C13.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質包含選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。 C14.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質包含與以下中之任一者具有至少90%序列一致性之序列：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。 C15.如條項C7之醣，其中該wzz家族蛋白質包含選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。 C16.如條項C1之醣，其中該醣係以合成方式合成。 C17.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣進一步包含大腸桿菌R1部分。 C18.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣進一步包含大腸桿菌R2部分。 C19.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣進一步包含大腸桿菌R3部分。 C20.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣進一步包含大腸桿菌R4部分。 C21.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣進一步包含大腸桿菌K-12部分。 C22.如條項C1至C21中任一項之醣，其中該醣進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。 C23.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R1部分。 C24.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R2部分。 C25.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R3部分。 C26.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R4部分。 C27.如條項C1至C16中任一項之醣，其中該醣不進一步包含大腸桿菌K-12部分。 C28.如條項C1至C21中任一項之醣，其中該醣不進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。 C29.如條項C1至C22中任一項之醣，其中該醣不包含脂質A。 C30.如條項C1至C29中任一項之醣，其中該多醣具有在10 kDa與2,000 kDa之間或在50 kDa與2,000 kDa之間的分子量。 C31.如條項C1至C30中任一項之醣，其中該醣具有20-40 kDa之平均分子量。 C32.如條項C1至C31中任一項之醣，其中該醣具有40,000至60,000 kDa之平均分子量。 C33.如條項C1至C32中任一項之醣，其中 n為31至90之整數。 C34.一種共軛物，其包含共價結合載體蛋白質之醣，其中該醣係來源於大腸桿菌。 C35.一種共軛物，其包含共價結合載體蛋白質之如條項C1至條項C33中任一項之醣。 C36.如條項C34至條項C35中任一項之共軛物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之經解毒的外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌溶血素及其經解毒的變體、空腸彎麴菌AcrA及空腸彎麴菌天然醣蛋白。 C37.如條項C34至條項C36中任一項之共軛物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。 C38.如條項C34至條項C36中任一項之共軛物，其中該載體蛋白質為破傷風類毒素(TT)。 C39.如條項C34至條項C38中任一項之共軛物，其中該共軛物係藉由還原胺化來製備。 C40.如條項C34至條項C38中任一項之共軛物，其中該共軛物係藉由CDAP化學方法來製備。 C41.如條項C34至條項C38中任一項之共軛物，其中該共軛物為單端連接的經共軛醣。 C42.如條項C34至條項C38中任一項之共軛物，其中該醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與該載體蛋白質共軛。 C43.如條項C42之共軛物，其中該醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與該載體蛋白質共軛，其中該醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。 C44.如條項C42至條項C43中任一項之共軛物，其中該CRM ₁₉₇包含經由eTEC間隔基與該多醣共價連接之2至20或4至16個離胺酸殘基。 C45.如條項C34至條項C44中任一項之共軛物，其中醣:載體蛋白質比率(w/w)係在0.2與4之間。 C46.如條項C34至條項C44中任一項之共軛物，其中醣與蛋白質之比率為至少0.5且至多2。 C47.如條項C34至條項C44中任一項之共軛物，其中醣與載體蛋白質之比率係在0.4與1.7之間。 C48.如條項C41至條項C47中任一項之共軛物，其中該醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與該載體蛋白質共軛。 C49.一種共軛物，其包含共價結合載體蛋白質之醣，其中該醣包含選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101，其中 n為1至10之整數。 C50.一種組合物，其包含如條項C1至條項C33中任一項之醣，及醫藥學上可接受之稀釋劑。 C51.一種組合物，其包含如條項C34至條項C49中任一項之共軛物，及醫藥學上可接受之稀釋劑。 C52.如條項C51之組合物，相較於該組合物中之醣之總量，其包含至多約25%游離醣。 C53.如條項C50至條項C51中任一項之組合物，其進一步包含佐劑。 C54.如條項C50至條項C51中任一項之組合物，其進一步包含鋁。 C55.如條項C50至條項C51中任一項之組合物，其進一步包含QS-21。 C56.如條項C50至條項C51中任一項之組合物，其進一步包含CpG寡核苷酸。 C57.如條項C50至條項C51中任一項之組合物，其中該組合物不包括佐劑。 C58.一種組合物，其包含來源於大腸桿菌、經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛之醣，其中該多醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。 C59.如條項C58之組合物，其中該醣為來源於大腸桿菌之O-抗原。 C60.如條項C58之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。 C61.如條項C58之組合物，其中該醣為來源於大腸桿菌之O-抗原。 C62.一種組合物，其包含經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛之如條項C1至條項C16中任一項之醣，其中該多醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。 C63.一種組合物，其包含：(i)與載體蛋白質共價偶合之大腸桿菌O25B抗原之共軛物，(ii)與載體蛋白質共價偶合之大腸桿菌O1A抗原之共軛物，(iii)與載體蛋白質共價偶合之大腸桿菌O2抗原之共軛物，及(iv)與載體蛋白質共價偶合之O6抗原之共軛物，其中該大腸桿菌O25B抗原包含式O25B之結構，其中n為大於30之整數。 C64.如條項C63之組合物，其中該O1A抗原、O6抗原及O2抗原分別包含以下式： C65.如條項C63之組合物，其中該載體蛋白質係選自以下中之任一者：CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之經解毒的外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、金黃色葡萄球菌之經解毒的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌溶血素及其經解毒的變體、空腸彎麴菌AcrA及空腸彎麴菌天然醣蛋白。 C66.一種製備包含經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛之醣之共軛物的方法，該方法包含以下步驟：a)在有機溶劑中，使醣與1,1'-羰基-二(1,2,4-三唑) (CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)反應以產生經活化醣；b)使經活化醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生經硫醇化醣；c)使經硫醇化醣與還原劑反應，以產生包含一或多個游離硫醇基殘基之經活化硫醇化醣；d)使經活化硫醇化醣與包含一或多個α-鹵乙醯胺基之經活化載體蛋白質反應，以產生經硫醇化醣-載體蛋白質共軛物；及e)使經硫醇化醣-載體蛋白質共軛物與以下反應：(i)能夠對經活化載體蛋白質之未共軛α-鹵乙醯胺基團封端的第一封端試劑；及/或(ii)能夠對未共軛游離硫醇基殘基封端的第二封端試劑；由此產生eTEC連接的糖共軛物，其中該醣係來源於大腸桿菌。 C67.根據條項C66之方法，其中該醣包含如條項C1至條項C33中任一項之醣。 C68.如條項C66至條項C67中任一項之方法，其中該封端步驟e)包含使該經硫醇化醣-載體蛋白質共軛物與以下反應：(i)作為第一封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸，及/或(ii)作為第二封端試劑之碘乙醯胺。 C69.如條項C66至條項C68中任一項之方法，其進一步包含藉由與三唑或咪唑反應，將該醣混配以得到經混配醣之步驟，其中將該經混配醣進行殼式冷凍、凍乾及在步驟a)之前在有機溶劑中復原。 C70.如條項C66至條項C69中任一項之方法，其進一步包含純化在步驟c)中產生之經硫醇化多醣，其中該純化步驟包含透濾。 C71.如條項C66至條項C70中任一項之方法，其中該方法進一步包含藉由透濾純化該eTEC連接的糖共軛物。 C72.如條項C66至條項C71中任一項之方法，其中步驟a)中之有機溶劑為選自以下中之任一者之極性非質子溶劑：二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)及六甲基磷醯胺(HMPA)或其混合物。 C73.一種培養基，其包含KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。 C74.如條項C73之培養基，其中該培養基用於培養大腸桿菌。 C75.一種用於產生如條項C1至條項C33中任一項之醣之方法，其包含在培養基中培養重組大腸桿菌；藉由在該培養基中培養該細胞產生該醣；由此該細胞產生該醣。 C76.如條項C75之方法，其中該培養基包含選自以下中之任一者之成分：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。 C77.如條項C75之方法，其中該培養基包含大豆水解產物。 C78.如條項C75之方法，其中該培養基包含酵母提取物。 C79.如條項C75之方法，其中該培養基不進一步包含大豆水解產物及酵母提取物。 C80.如條項C75之方法，其中該大腸桿菌細胞包含選自以下中之任一者之異源wzz家族蛋白質：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。 C81.如條項C75之方法，其中該大腸桿菌細胞包含選自以下中之任一者之腸沙門氏菌wzz家族蛋白質：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。 C82.如條項C81之方法，其中該wzz家族蛋白質包含選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 19。 C83.如條項C75之方法，其中該培養產生＞ 120 OD ₆₀₀/mL之產量。 C84.如條項C75之方法，其進一步包含純化該醣。 C85.如條項C75之方法，其中該純化步驟包含以下中之任一者：透析、濃縮操作、透濾操作、切向流過濾、沈澱、溶離、離心、超過濾、深度過濾及管柱層析(離子交換層析、多模式離子交換層析、DEAE及疏水相互作用層析)。 C86.一種用於在哺乳動物中誘導免疫反應之方法，其包含向該個體投與如條項C50至條項C62中任一項之組合物。 C87.如條項C73之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體。 C88.如條項C73之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌IgG抗體。 C89.如條項C73之方法，其中該免疫反應包含誘導針對大腸桿菌之殺菌活性。 C90.如條項C73之方法，其中該免疫反應包含誘導針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。 C91.如條項C73之方法，其中該免疫反應包含在初始給藥之後至少1,000至200,000之幾何平均效價(GMT)水準。 C92.如條項C73之方法，其中該組合物包含含式O25之醣，其中 n為40至100之整數，其中該免疫反應在初始給藥之後包含至少1,000至200,000之幾何平均效價(GMT)水準。 C93.如條項C73之方法，其中該哺乳動物處於選自以下之病狀中之任一者之風險下：泌尿道感染、膽囊炎、膽管炎、腹瀉、溶血尿毒症候群、新生兒腦膜炎、尿路性敗血症、腹內感染、腦膜炎、複雜性肺炎、傷口感染、前列腺活檢後相關感染、新生兒/嬰兒敗血症、嗜中性粒細胞減少性發熱及其他血流感染；肺炎、菌血症及敗血症。 C94.如條項C73之方法，其中該哺乳動物患有選自以下之病狀中之任一者：泌尿道感染、膽囊炎、膽管炎、腹瀉、溶血尿毒症候群、新生兒腦膜炎、尿路性敗血症、腹內感染、腦膜炎、複雜性肺炎、傷口感染、前列腺活檢後相關感染、新生兒/嬰兒敗血症、嗜中性粒細胞減少性發熱及其他血流感染；肺炎、菌血症及敗血症。 C95.一種用於以下之方法：(i)誘導針對特級腸病原性大腸桿菌之個體之免疫反應，(ii)誘導針對特級腸病原性大腸桿菌之個體之免疫反應，或(iii)誘導在個體中產生對特級腸病原性大腸桿菌具有特異性之調理吞噬活性抗體，其中該方法包含向該個體投與有效量的如條項C50至條項C65中任一項的組合物。 C96.如條款C95之方法，其中該個體處於罹患泌尿道感染之風險下。 C97.如條款C95之方法，其中該個體處於罹患菌血症之風險下。 C98.如條款C95之方法，其中該個體處於罹患敗血症之風險下。 C99.一種組合物，其包含：(i)與載體蛋白質共價偶合之大腸桿菌O25B抗原之共軛物，(ii)與載體蛋白質共價偶合之大腸桿菌O1A抗原之共軛物，(iii)與載體蛋白質共價偶合之大腸桿菌O2抗原之共軛物，及(iv)與載體蛋白質共價偶合之O6抗原之共軛物，其中該大腸桿菌O25B抗原包含式O25B之結構，其中n為大於30之整數。 C100.如條項C1之組合物，其中該O1A抗原、O6抗原及O2抗原分別包含以下式： C101.如條項C1之組合物，其中該載體蛋白質係選自由以下組成之群：綠膿桿菌之經解毒的外毒素A(EPA)、CRM197、麥芽糖結合蛋白(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、金黃色葡萄球菌之經解毒的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B次單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之經解毒的變體、肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌溶血素及其經解毒的變體、空腸彎麴菌AcrA及空腸彎麴菌天然醣蛋白。 C102.一種用於以下之方法：(i)誘導針對特級腸病原性大腸桿菌之個體之免疫反應，(ii)誘導針對特級腸病原性大腸桿菌之個體之免疫反應，或(iii)誘導在個體中產生對特級腸病原性大腸桿菌具有特異性之調理吞噬活性抗體，其中該方法包含向該個體投與有效量的如條項C1的組合物。 C103.如條款C102之方法，其中該個體處於罹患泌尿道感染之風險下。 C104.如條款C102之方法，其中該個體處於罹患菌血症之風險下。 C105.如條款C102之方法，其中該個體處於罹患敗血症之風險下。 C106.一種醣，其相較於大腸桿菌之對應野生型O-多醣，包含至少5個重複單元之增加。 C107.如條項C106之醣，其中該醣包含式O25a，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O25a。 C108.如條項C106之醣，其中該醣包含式O25b，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O25b。 C109.如條項C106之醣，其中該醣包含式O2，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O2。 C110.如條項C106之醣，其中該醣包含式O6，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O6。 C111.如條項C106之醣，其中該醣包含式O1，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O1。 C112.如條項C106之醣，其中該醣包含式O17，且該大腸桿菌為大腸桿菌血清型O17。 C113.如條項C106之醣，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中n為5至1000之整數。 C114.如條項C106之醣，其中該大腸桿菌為選自由以下組成之群之大腸桿菌血清型：O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O25b、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。 C115.如條項C106之醣，其中該醣係藉由增加由培養物中之革蘭氏陰性細菌產生之O-多醣的重複單元來產生，其包含在革蘭氏陰性細菌中過度表現wzz家族蛋白質以產生該醣。 C116.如條項C115之醣，其中該過度表現的wzz家族蛋白質係選自由以下組成之群：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。 C117.如條項C115之醣，其中該過度表現的wzz家族蛋白質為wzzB。 C118.如條項C115之醣，其中該過度表現的wzz家族蛋白質為fepE。 C119.如條項C115之醣，其中該過度表現的wzz家族蛋白質為wzzB及fepE。 C120.如條項C106之醣，其中該醣係以合成方式合成。 C121.一種共軛物，其包含與載體蛋白質共價結合之如條項C106之醣。 C122.如條項C121之共軛物，其中該載體蛋白質為CRM ₁₉₇。 C123.如條項C121之醣，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中n為5至1000之整數。 C124.如條項C121之共軛物，其中相較於對應野生型O-多醣，該醣包含至少5個重複單元之增加。 C125.一種組合物，其包含如條項1之醣，其進一步包含醫藥學上可接受之稀釋劑。 C126.如條項C125之組合物，其進一步包含佐劑。 C127.如條項C125之組合物，其進一步包含鋁。 C128.如條項C125之組合物，其進一步包含QS-21。 C129.如條項C125之組合物，其中該組合物不包括佐劑。 C130.一種用於誘導個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投與如條項C125之組合物。 C131.一種組合物，其包含如條項C121之共軛物，其進一步包含醫藥學上可接受之稀釋劑。 C132.一種用於誘導個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投與如條項C131之組合物。 C133.如條項C130或C132之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體。 C134.如條項C133之方法，其中該抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體為IgG抗體。 C135.如條項C133之方法，其中該抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體為具有針對大腸桿菌之殺菌活性之IgG抗體。 C136.一種免疫原性組合物，其包含來源於大腸桿菌、經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔基與載體蛋白質共軛之醣，其中該多醣經由胺基甲酸酯鍵與該eTEC間隔基共價連接，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵與該eTEC間隔基共價連接。 C137.如條項C136之免疫原性組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。 C138.如條項C136之免疫原性組合物，其中該醣為來源於大腸桿菌之O-抗原。 C139.如條項C136之免疫原性組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中n為5至1000之整數。 C140.如條項C136之免疫原性組合物，其中該醣具有在75-100%之間的O-乙醯化程度。 C141.如條項C136之免疫原性組合物，其中該載體蛋白質為CRM197。 C142.如條項C141之免疫原性組合物，其中該CRM197包含經由eTEC間隔基與該多醣共價連接之2至20個離胺酸殘基。 C143.如條項C141之免疫原性組合物，其中該CRM197包含經由eTEC間隔基與該多醣共價連接之4至16個離胺酸殘基。 C144.如條項C136之免疫原性組合物，其進一步包含額外抗原。 C145.如條項C136之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。 C146.如條項C145之免疫原性組合物，其中該佐劑為選自由以下組成之群之基於鋁的佐劑：磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁。 C147.如條項C136之免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。 C148.一種免疫原性組合物，其包含含來源於大腸桿菌、與載體蛋白質共軛之醣的糖共軛物，其中該糖共軛物係使用還原胺化來製備。 C149.如條項C148之免疫原性組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。 C150.如條項C148之免疫原性組合物，其中該醣為來源於大腸桿菌之O-抗原。 C151.如條項C148之免疫原性組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1、式O2、式O3、式O4、式O5、式O6、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O24、式O25、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144,O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中n為5至1000之整數。 C152.如條項C148之免疫原性組合物，其中該醣具有在75-100%之間的O-乙醯化程度。 C153.如條項C148之免疫原性組合物，其中該載體蛋白質為CRM197。 C154.如條項C148之免疫原性組合物，其進一步包含額外抗原。 C155.如條項C148之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。 C156.如條項C155之免疫原性組合物，其中該佐劑為選自由以下組成之群之基於鋁的佐劑：磷酸鋁、硫酸鋁及氫氧化鋁。 C157.如條項C148之免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。 C158.一種用於誘導個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投與如條項C136至C157中任一項之組合物。 C159.如條項C158之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體。 C160.如條項C133之方法，其中該抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體為IgG抗體。 C161.如條項C133之方法，其中該抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體為具有針對大腸桿菌之殺菌活性之IgG抗體。

圖 1A 至圖 1B：圖1A描繪pUC複製子，500-700x複本/細胞，鏈長調節劑(圖1A)；及P15a複製子，10-12x複本/細胞，O-抗原操縱子(圖1B)質體。圖 2：WzzB胺基酸序列比對，顯示K12\W3110\WzzB (SEQ ID NO: 23)；O25a\ETEC\ATCC\WzzB (SEQ ID NO: 22)；O25a:K5:H1\WzzB (SEQ ID NO: 21)；O25b\2401\WzzB (SEQ ID NO: 20)；及O25b\2401\WzzB (SEQ ID NO: 20)。圖 3A 至圖 3B：血清型O25a及O25b菌株中之O-抗原鏈長由基於質體表現異源 wzzB及 fepE鏈長調節劑進行之調節。顯示wzzB基因剔除菌株O25K5H1 (O25a)及GAR2401 (O25b)之質體轉化體中之LPS表現之基因互補。圖 3A之左側，顯示O25a O25K5HΔwzzB之質體轉化體之LPS型態；及右側，O25b GAR 2401ΔwzzB轉化體之類似型態。用O25-特異性血清(國家血清研究所(Statens Serum Institut))探測之複製凝膠之免疫墨點顯示於圖 3B中。O25a Δ wxxB(基因剔除)背景與泳道1-7相關；O25b 2401 Δ wzzB(基因剔除)背景與泳道8-15相關。圖 4：在宿主O25K5H1ΔwzzB中由大腸桿菌及沙門氏菌fepE質體賦予之長鏈O-抗原表現。圖 5：FepE胺基酸序列比對。O157 FepE胺基酸序列為SEQ ID NO: 18；O25a ETEC ATCC FepE胺基酸序列為SEQ ID NO: 17；O25a:K5:H1 FepE胺基酸序列為SEQ ID NO: 16；O25b 2401 FepE胺基酸序列為SEQ ID NO: 15；沙門氏菌LT2 FepE胺基酸序列為SEQ ID NO: 19。圖 6：沙門氏菌fepE表現在多種臨床分離株中產生長O-抗原LPS。圖 7A 至圖 7B：在O25b O-抗原基因剔除宿主菌株中之O25b長O-抗原LPS之質體介導的阿拉伯糖誘導性表現。SPS PAGE之結果顯示於圖7A中，且O25免疫墨點之結果顯示於圖7B中，其中在圖7A及圖7B兩者中，泳道1係來自純系1，無阿拉伯糖；泳道2係來自純系1，0.2%阿拉伯糖；泳道3係來自純系9，無阿拉伯糖；泳道4係來自純系9，0.2%阿拉伯糖；泳道5係來自O55大腸桿菌LPS標準物；及泳道6係來自O111大腸桿菌LPS標準物。圖 8：在常見宿主菌株中之長O-抗原LPS之質體介導的阿拉伯糖誘導性表現。圖 9A 至圖 9C：藉由聚合酶依賴性路徑合成之在主鏈中具有四個或更少殘基之O-抗原之結構。圖 10A 至圖 10B：圖10A描繪藉由聚合酶依賴性路徑合成之在主鏈中具有五個或六個殘基之O-抗原之結構；圖10B描繪認為藉由ABC-轉運蛋白依賴性路徑合成之O-抗原。圖 11：在探索性生物工藝菌株中之O25 O-抗原LPS之表現。圖 12A 至圖 12B：自菌株GAR2831及'2401ΔwzzB/fepE純化出之短(圖12A，菌株1 O25b wt 2831)及長O25b O-抗原(圖12B，菌株2 O25b 2401Δ wzzB/LT2 FepE)之SEC型態及特性。圖 13A 至圖 13B：(圖13A)關於兔研究1 VAC-2017-PRL-EC-0723之疫苗接種時程之資訊；(圖13B)兔研究2 VAC-2018-PRL-EC-077之疫苗接種時程。圖 14A 至圖 14C：O25b糖共軛物IgG反應，其中-l-表示放血前之結果；-n-放血1 (6週)；-p-放血2 (8週)；-¿-放血3 (12週)。圖14A描繪兔1-3 (中等活化)之結果；圖14B描繪兔2-3 (低活化)之結果；圖14C描繪兔3-1 (高活化)之結果。圖 15A 至圖 15F：對於O25b長O-抗原糖共軛物，亦即低活化O25b-CRM ₁₉₇共軛物(圖15D至圖15F，其中-l-表示來自兔2-1之放血前的結果，-n-來自兔2-1之第12週抗血清)與未共軛多醣，亦即游離O25b多醣(圖A至圖C，其中-l-表示來自兔A-1之放血前的結果，-n-來自兔A-1之第6週抗血清，-p-來自兔A-1之第8週抗血清)。應注意，繪製相對於對數標度之MFI，以突出在＜1000 MFI範圍中，免疫前與免疫抗體之間的差異。圖15A描繪兔A-1 (未共軛聚合物)之結果；圖15B描繪兔A-3 (未共軛聚合物)之結果；圖15C描繪兔A-4 (未共軛聚合物)之結果；圖15D描繪兔2-1 (低活化)之結果；圖15E描繪兔2-2 (低活化)之結果；及圖15F描繪兔2-3 (低活化)之結果。圖 16A 至圖 16C：用O25b抗血清偵測之原生與長O25b O-抗原之表面表現。圖16A描繪結果，其中-l-表示O25b 2831相對於PD3抗血清之結果；-n- O25b 2831 wt相對於放血前；-p- O25b 2831/fepE相對於PD3抗血清；-q- O25b 2831/fepE相對於放血前。圖16B描繪結果，其中-l-表示O25b 2401相對於PD3抗血清之結果；-n- O25b 2401相對於放血前；-p- O25b 2401/fepE相對於PD3抗血清；-q- O25b 2401/fepE相對於放血前。圖16C描繪結果，其中-l-表示大腸桿菌K12相對於PD3抗血清之結果；-n-大腸桿菌K12相對於放血前。圖 17：五種已知化學型之外部核心寡醣之碳水化合物主鏈之一般化結構。除非另外指示，否則所有單醣均呈α-變旋異構構型。其產物催化形成各連接之基因用虛線箭頭指示。星號表示與O-抗原連接之核心寡醣之殘基。圖 18：未共軛游離O25b多醣不為免疫原性的(dLIA)，其中-l-表示來自4-1之第18週(1wk = PD4)抗血清之結果；-n-來自4-2之第18週(1wk = PD4)抗血清；-p-來自5-1之第18週(1wk = PD4)抗血清；-q-來自5-2之第18週(1wk = PD4)；-Ú-來自6-1之第18週(1wk = PD4)抗血清；--來自6-2之第18週(1wk = PD4)抗血清。圖 19A 至圖 19C：說明BRC兔O25b RAC共軛物免疫血清OPA效價之特異性之曲線。圖19A顯示兔2-3免疫前血清-l-及免疫後血清wk 13 -n-之OPA效價。圖19B顯示兔1-2免疫前血清-l-及免疫後血清wk 19 -n-之OPA效價。圖19C顯示兔1-2 wk 19 OPA效價特異性，其中兔1-2免疫血清之OPA活性藉由與100 μg/mL經純化之未共軛O25b長O-抗原多醣一起預培育來阻斷，其中-n-表示兔1-2免疫血清wk 19之結果；及-q-表示兔1-2 wk 19 w/R1長OAg之結果。圖 20A 至圖 20C：圖20A說明例示性投與時程。圖20B及圖20C顯示描繪由未共軛O25b長O-抗原多醣(圖20B，無O25b聚合物(2 µg))及所衍生O25b RAC/DMSO長O-抗原糖共軛物(圖20C，O25b-CRM ₁₉₇RAC長(2 µg))引起之O-抗原O25b IgG水準之曲線，其中-...- (虛線)表示原生CD1 O25b IgG水準。圖 21A 至圖 21B：描繪RAC、eTEC O25b長糖共軛物及給藥2後(圖21A)及給藥3後(圖21B)單端糖共軛物之OPA免疫原性之曲線，其中-¡-表示單端短2 µg的結果；-l-單端長2 µg；-p- RAC/DMSO長2 µg；-q- eTEC長2 µg；*背景對照(n=20)。應答速率為效價＞ 2×未經疫苗接種基線之小鼠%。圖 22：描繪eTEC化學物質及經提高水準之多醣活化之OPA免疫原性之曲線。應答速率為效價＞ 2×未經疫苗接種基線之小鼠%。圖 23A 至圖 23B：圖23A說明例示性投與時程，且圖23B顯示描繪保護用各劑量之大腸桿菌eTEC共軛物免疫之小鼠免於O25b分離株之致死性挑戰的曲線，其中-¯-表示eTEC長鏈17%活化；-r- eTEC長鏈10%活化；-s- eTEC長鏈4%活化；-¨- O25b多醣；未經疫苗接種對照。圖 24：說明單端共軛物之例示性製備之示意圖，其中共軛過程涉及在揭露硫醇官能基後，用二硫化胺連接子選擇性活化2-酮-3-去氧辛酸(KDO)。隨後，將KDO與溴活化的CRM ₁₉₇蛋白共軛，如圖 24(單端共軛物之製備)中所描繪。圖 25A 至圖 25B顯示用於製備與CRM ₁₉₇之大腸桿菌糖共軛物之活化(圖25A)及共軛(圖25B)工藝的例示性程序流程圖。


          <![CDATA[<110>  美商輝瑞大藥廠(Pfizer Inc.)]]>
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          cgatccggaa acctcctaca c                                                 21
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列； O157 FepE_S]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          gattattcgc gcaacgctaa acagat                                            26
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列； O157 FepE_AS]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          tgatcattga cgatccggta gcc                                               23
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  70]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg       60
          tcggtatgga                                                              70
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          <![CDATA[<211>  78]]>
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          <![CDATA[<223>  合成序列； pBAD33_銜接子_AS]]>
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          agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg       60
          ctttacagct accgagct                                                     78
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列； JUMPSTART_r]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg                                        30
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列； gnd_f]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg                                        30
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  378]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腸沙門氏菌(Salmonella enterica)]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr 
                          165                 170                 175     
          Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp 
              210                 215                 220                 
          Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val 
              290                 295                 300                 
          Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly 
                          325                 330                 335     
          Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala 
                      340                 345                 350         
          Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu 
                  355                 360                 365             
          Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val 
              370                 375             
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  325]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Glu Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Glu Gln Val Thr Lys Pro Gln Val Gln Gln Thr Glu Asp Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Gln 
                          245                 250                 255     
          Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Leu 
                      260                 265                 270         
          Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Asn Ala Lys 
                          325 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Asp Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
          Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 
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          Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Asn Tyr Asn Ala Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Lys Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Asp Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
          Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Asn Tyr Asn Ser Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  326]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌(Escherichia coli)]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Glu Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
          Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Asn Tyr Asn Ala Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腸沙門氏菌(Salmonella enterica)]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln 
                          245                 250                 255     
          Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp 
                      260                 265                 270         
          Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu 
                          325

Claims

一種組合物，其包含：(a)共軛物，其包含與含式O25b之醣共價結合的載體蛋白質，其中 n為31至90之整數；(b)共軛物，其包含與含式O1A之醣共價結合的載體蛋白質，其中 n為31至90之整數；(c)共軛物，其包含與含式O2之醣共價結合的載體蛋白質，其中 n為31至90之整數；及(d)共軛物，其包含與含式O6之醣共價結合的載體蛋白質，其中 n為31至90之整數。
如請求項1之組合物，其進一步包含含與醣共價結合之載體蛋白質之共軛物，該醣包含選自以下中之任一者的結構：式O15、式O16、式O17、式O18及式O75，其中 n為31至90之整數。
如請求項1之組合物，其包含相較於該組合物中之醣總量為至多25%游離醣。
一種如請求項1至3中任一項之組合物之用途，其用於製造用於引發針對哺乳動物中大腸桿菌( Escherichia coli)之免疫反應的藥劑。
如請求項4之用途，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。
如請求項4之用途，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。