TW202233653A

TW202233653A - 大腸桿菌fimh突變體及其用途

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Publication number: TW202233653A
Application number: TW110148059A
Authority: TW
Inventors: 曄車; 勞倫特奧利佛丘洛; 羅伯特喬治康瑞德唐納; 馬修克堤斯葛里佛; 迪蒙奈里娜塔莉克萊兒席爾蒙
Original assignee: 美商輝瑞大藥廠
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-09-01
Also published as: JP2024503792A; WO2022137078A1; KR20230110580A; US20220202923A1; CO2023008151A2; WO2022137078A9; CA3205927A1; AU2021404946A1; AU2021404946A9; EP4267597A1; JP2024063158A; PE20231660A1; MX2023007506A; IL303981A

Abstract

本發明係關於具有經改良生物化學特性及免疫原性的經突變大腸桿菌( E. coli) FimH多肽之設計，以及包含此類多肽之組合物及其用途。

Description

大腸桿菌FIMH突變體及其用途

本發明係關於經突變之大腸桿菌( Escherichia coli) FimH多肽及其使用方法。

每5名女性中便有1名會在其一生中至少受到一次泌尿道感染(UTI)影響，且引起顯著的發病率及死亡率，從而給保健系統帶來很大負擔。雖然若干種不同的細菌可引起UTI，但最常見的原因(90-95%之病例)為革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)大腸桿菌。大部分大腸桿菌UTI係由泌尿致病性大腸桿菌(UPEC)引起，其在胃腸道中繁殖且自糞便菌群遷移至泌尿生殖道，其在泌尿生殖道中黏附於宿主泌尿上皮細胞，由此形成可造成泌尿道感染增加之儲集器。該黏附由包括1型繖毛之繖毛黏附素促進，該等繖毛黏附素結合於上皮層中或分泌至尿液中之甘露糖基化醣蛋白。1型繖毛在臨床UPEC分離株中具有高保守性且由稱為 fim之基因叢集編碼，該等基因編碼輔助蛋白(FimC、FimD)、各種結構子單元(FimE、FimF、FimG)及稱為FimH之黏附素。FimH對於模擬人類膀胱感染態樣的小鼠模型中之UTI感染之所有特徵而言為至關重要的(Hannan等人, PLoS Pathog. 2010年8月12日;6(8):e1001042; doi: 10.1371/journal.ppat.1001042；Schwartz等人, Infect Immun. 2011年10月;79(10):4250-9. doi: 10.1128/IAI.05339-11)。藉由模擬甘露糖基化受體靶向FimH之小分子抑制劑進一步證實FimH在UTI中之作用，且在動物模型中顯示作為療法的前景(Cusumano CK等人, Sci Transl Med. 2011;3(109):109ra115. doi:10.1126/scitranslmed.3003021)。此外，FimH在大腸桿菌人類膀胱炎分離株下進行陽性選擇(Chen SL等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009年12月29日;106(52):22439-44. doi: 10.1073/pnas.0902179106)，且陽性選擇之殘基可能影響膀胱炎小鼠模型中之毒性(Schwartz, D. J.等人, Proc Natl Acad Sci U S A 110, 15530-15537, doi:10.1073/pnas.1315203110 (2013))。

FimH由兩個結構域構成，即，負責結合於甘露糖基化醣蛋白之凝集素結合域(FimH _LD)，及菌毛蛋白域。菌毛蛋白域用以經由稱為供體股交換之機制，使FimH與菌毛之其他結構子單元(諸如FimG)連接(Le Trong, I等人, J . Struct Biol. 2010年12月;172(3):380-8. doi: 10.1016/j.jsb.2010.06.002)。FimH菌毛蛋白域形成不完全免疫球蛋白摺疊，產生提供FimG之N端β股之結合位點之凹槽，從而形成FimH與FimG之間的強分子間連接。雖然FimH _LD可以可溶的穩定形式表現，但除非與伴隨蛋白FimC形成複合物或以肽形式與FimG之供體股肽互補或作為融合蛋白(Barnhart MM等人, Proc Natl Acad SciU S A. (2000年) 7月5日;97(14):7709-14；Sauer MM等人, Nat Commun .(2016年) 3月7日;7:10738；Barnhart MM等人, J Bacteriol .2003年5月;185(9):2723-30)，否則單獨的全長FimH係不穩定的(Vetsch, M.等人, J . Mol . Biol .322:827-840 (2002)；Barnhart MM等人, Proc Natl Acad SciU S A. (2000年) 7月5日;97(14):7709-14)。先前已描述藉由使FimG供體肽經由甘胺酸-絲胺酸連接子與全長FimH連接來設計及表現全長FimH分子(PCT國際公開案第WO2021/084429號，2021年5月6日公開)，且將其命名為FimH-DSG。

FimH _LD在其刺激功能性免疫原性之能力方面被視為弱免疫原。一些研究表明，雖然可在存在及不存在佐劑之情況下用FimH _LD引發結合抗體效價，但僅在存在佐劑之情況下觀測到功能性中和效價(PCT國際公開案第WO2021/084429號，2021年5月6日公開)。研究表明，將FimH鎖定於開放構形中同時降低對甘露糖苷配位體之親和力可改良功能性免疫原性(Kisiela, D. I.等人, Proc Natl Acad SciU S A 110, 19089-19094 (2013))。因此，在此項技術中需要新穎的FimH突變體，其具有降低之針對甘露糖苷配位體之親和力及改良之生物化學特性，使得相對於野生型FimH而言，具有改良之功能性免疫原性。

本發明係關於設計經突變之大腸桿菌FimH多肽，使其具有改良之生物化學特性及免疫原性，以及包含此類多肽之組合物及其用途。舉例而言，在一個態樣中，本發明提供經突變之FimH多肽，其相對於野生型FimH多肽之胺基酸序列包含至少一個胺基酸突變，其中該突變位置選自由以下組成之群：F1、P12、G14、G15、G16、A18、P26、V27、V28、Q32、N33、L34、V35、R60、S62、Y64、G65、L68、F71、T86、L107、Y108、L109、V112、S113、A115、G116、V118、A119、A127、L129、Q133、F144、V154、V155、V156、P157、T158、V163及V185，其中胺基酸位置係根據SEQ ID NO: 59編號。

在另一態樣中為包含至少一個選自由以下組成之群之突變的經突變之FimH多肽：F1I；F1L；F1V；F1M；F1Y；F1W；P12C；G14C；G15A；G15P；G16A；G16P；A18C；P26C；V27A；V27C；V28C；Q32C；N33C；L34C；L34N；L34S；L34T；L34D；L34E；L34K；L34R；V35C；R60P；S62C；Y64C；G65A；L68C；F71C；T86C；L107C；Y108C；L109C；V112C；S113C；A115V；G116C；V118C；A119C；A119N；A119S；A119T；A119D；A119E；A119K；A119R；A127C；L129C；Q133K；F144C；V154C；V156C；P157C；T158C；V163I；及V185I，或其任何組合。例如，包含突變G15A及G16A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變P12C及A18C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G14C及F144C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變P26C及V35C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變P26C及V154C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變P26C及V156C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V27C及L34C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V28C及N33C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V28C及P157C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變Q32C及Y108C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變N33C及L109C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變N33C及P157C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V35C及L107C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V35C及L109C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變S62C及T86C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變S62C及L129C的經突變之FimH多肽Y64C及L68C。此外例如，包含突變Y64C及A127C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L68C及F71C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V112C及T158C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變S113C及G116C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變S113C及T158C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V118C及V156C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119C及V155C的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L34N及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L34S及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L34T及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L34D及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L34E及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L34K及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變L34R及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119N及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119S及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119T及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119D及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119E及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119K及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變A119R及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G15A及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G16A及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G15P及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G16P及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G15A、G16A及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G65A及V27A的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變V27A及Q133K的經突變之FimH多肽。此外例如，包含突變G15A、G16A、V27A及Q133K的經突變之FimH多肽。此外例如，包含SEQ ID NO: 2-58及60-64中之任一者之序列的經突變之FimH多肽。此外例如，本文中所揭示之經突變之FimH多肽，其中該多肽經分離。

在另一實例中，本發明提供醫藥組合物，其包含(i)如本文中所揭示之經突變之FimH多肽，及(ii)醫藥學上可接受之載劑。

在另一實例中，本發明提供包含如本文中所揭示之經突變之FimH多肽的免疫原性組合物。舉例而言，免疫原性組合物進一步包含至少一種額外抗原，諸如多醣或醣結合物或蛋白。此外例如，免疫原性組合物進一步包含至少一種佐劑。

在另一實例中，本發明提供核酸分子，其包含編碼如本文中所揭示之經突變之FimH多肽之胺基酸序列的核苷酸序列。

在另一實例中，本發明提供如本文中所揭示之經突變之FimH多肽，其中該多肽為免疫原性的。

本發明亦提供重組哺乳動物細胞，其包含編碼如本文中所揭示之經突變之FimH多肽的聚核苷酸。

本發明亦提供包含如本文中所揭示之重組細胞的培養物，其中該培養物之規格為至少5公升、至少10公升、至少20公升、至少50公升、至少100公升、至少200公升、至少500公升、至少1000公升或至少2000公升。

本發明亦提供產生如本文中所揭示之經突變之FimH多肽的方法，該方法包含在適合的條件下培養如本文中所揭示之重組哺乳動物細胞，藉此表現該多肽；及收集該多肽。

本發明亦提供用於以下目的之方法：(i)在個體中誘導針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，或(ii)在個體中誘導調理吞噬活性抗體及/或中和抗體之產生，該等抗體對腸外病原性大腸桿菌具有特異性，其中該方法包含向個體投與有效量的如本文中所揭示之組合物。在一個實例中，個體具有發展泌尿道感染之風險。在另一實例中，個體具有發展菌血症之風險。在另一實例中，個體具有發展敗血症之風險。在另一實例中，個體具有發展克隆氏病(Crohn's disease)之風險。

本發明進一步提供在哺乳動物中引發針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向哺乳動物投與有效量的如本文中所揭示之組合物。在一個實例中，免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體及/或中和抗體。在另一實例中，免疫反應保護哺乳動物免受大腸桿菌感染。

本發明進一步提供預防、治療或改善個體中之細菌感染、疾病或病狀的方法，其包含向個體投與免疫有效量的如本文中所揭示之組合物。

相關申請案本申請案主張2020年12月23日提交之美國臨時申請案第63/130,153號、2021年5月7日提交之美國臨時申請案第63/185,425號及2021年11月23日提交之美國臨時申請案第63/282,244號的優先權。前述申請案中之每一者之全部內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明係關於經突變之大腸桿菌FimH多肽(突變體)、包含FimH突變體之組合物、用於產生及純化FimH突變體之方法、編碼FimH突變體之核酸、包含此類核酸之宿主細胞及使用包含FimH突變體之組合物的方法。

本文中之值的範圍之敍述僅意欲充當個別地提及屬於該範圍內之各單獨值的簡寫方法。除非本文中另外指示，否則每一個別值均併入本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。除非本文另外指示或在其他方面與上下文明顯矛盾，否則本文中所描述之所有方法均可以任何適合的次序執行。使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲進一步說明本發明且不對申請專利範圍之範疇造成限制。本說明書中之語言不應解釋為指示任何未主張之要素對於實踐本發明而言為必不可少的。

在本發明之整個文本中引用若干文獻。本文引用之文獻(包括所有專利、專利申請案、科學公開案、製造商之說明書、說明等)中之各者，無論在上文或下文中，均在此以全文引用之方式併入。不應將本文中之任何內容解釋為承認本發明無權在此類揭示內容之前進行。

定義如本文中所使用，術語「約(about)」意謂大約或幾乎，且在本文中所闡述之數值或範圍之情形下，在一個實施例中意謂所敍述或所主張之數值或範圍±20%、±10%、±5%或±3%。

除非本文另外指示或明顯與上下文相矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)使用之術語「一(a/an)」及「該」以及類似參考物應解釋為涵蓋單數與複數兩者。

關於胺基酸序列(肽或蛋白)之「片段」係指胺基酸序列之一部分，亦即，表示在N端及/或C端處縮短之胺基酸序列的序列。在C端處縮短之片段(N端片段)可例如藉由截短的開放閱讀框架之轉譯獲得，該截短的開放閱讀框架不具有開放閱讀框架之3'端。在N端處縮短之片段(C端片段)可例如藉由不具有開放閱讀框架之5'端的截短的開放閱讀框架之轉譯獲得，只要該截短的開放閱讀框架包含用以起始轉譯之起始密碼子即可。胺基酸序列之片段包含例如來自胺基酸序列之至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%之胺基酸殘基。胺基酸序列之片段較佳包含來自胺基酸序列之至少6個，特定言之，至少8個，至少12個、至少15個、至少20個、至少30個、至少50個或至少100個連續胺基酸。

如本文中所使用，術語「野生型」或「WT」或「原生」係指在自然界中發現之胺基酸序列，包括對偶基因變異體。野生型胺基酸序列、肽或蛋白具有未經有意修飾之胺基酸序列。

如本文中所使用，胺基酸序列(肽、蛋白或多肽)之「變異體」或「突變體」或對「經突變之」多肽之參考包含胺基酸插入變異體/突變體、胺基酸添加變異體/突變體、胺基酸缺失變異體/突變體及/或胺基酸取代變異體/突變體。術語「變異體」或「突變體」包括所有突變體、剪接變異體、轉譯後修飾變異體、構形、同功異型物、對偶基因變異體、物種變異體及物種同源物，特定言之，天然存在之上述物質。特定言之，術語「變異體」或「突變體」包括胺基酸序列之片段。

胺基酸插入變異體包含在特定胺基酸序列中插入一個或兩個或更多個胺基酸。在具有插入之胺基酸序列變異體之情況下，一或多個胺基酸殘基被插入胺基酸序列之特定位點中，但亦可能進行隨機插入且適當篩選所得產物。胺基酸添加變異體包含一或多個胺基酸，諸如1、2、3、5、10、20、30、50個或更多個胺基酸的胺基端及/或羧基端融合物。胺基酸缺失變異體之特徵在於自序列中移除一或多個胺基酸，諸如移除1、2、3、5、10、20、30、50個或更多個胺基酸。缺失可位於蛋白之任何位置。包含蛋白之N端及/或C端處之缺失的胺基酸缺失變異體亦稱為N端及/或C端截短變異體。胺基酸取代變異體之特徵在於自序列中移除至少一個殘基且在該位置插入另一殘基。優先考慮胺基酸序列中之在同源蛋白或肽之間不具有保守性的位置中的修飾及/或用具有類似特性之其他胺基酸來置換胺基酸。較佳地，肽及蛋白變異體中之胺基酸變化為保守性胺基酸變化，亦即，類似地帶電或不帶電胺基酸之取代。保守性胺基酸變化涉及側鏈具有相關性之胺基酸家族中之一者的取代。天然存在之胺基酸通常分成四個家族：酸性(天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)及不帶電極性(甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)胺基酸。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時聯合分類為芳族胺基酸。在一個實施例中，保守性胺基酸取代包括以下群組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸；天冬醯胺、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。

較佳地，給定胺基酸序列與作為該給定胺基酸序列之變異體的胺基酸序列之間的相似性(較佳為一致性)程度將為至少約60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。較佳提供占參考胺基酸序列之全長的至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%的胺基酸區域之相似性或一致性程度。舉例而言，若參考胺基酸序列由200個胺基酸組成，則較佳提供至少約20個、至少約40個、至少約60個、至少約80個、至少約100個、至少約120個、至少約140個、至少約160個、至少約180個或約200個胺基酸(在一些實施例中，連續胺基酸)之相似性或一致性程度。在一些實施例中，提供全長參考胺基酸序列之相似性或一致性程度。用於測定序列相似性，較佳序列一致性之比對可使用此項技術中已知之工具，較佳使用最佳序列比對，例如使用Align (其使用標準設定，較佳為EMBOSS::needle，矩陣：Blosum62，間隙開口10.0，間隙延伸0.5)進行。

如本文中所使用，「序列相似性」指示一致的或表示保守性胺基酸取代之胺基酸之百分比。兩個胺基酸序列之間的「序列一致性」指示序列之間一致的胺基酸之百分比。兩個核酸序列之間的「序列一致性」指示序列之間一致的核苷酸之百分比。

特定言之，術語「一致%」、「一致性%」或類似術語意欲指在所比較之序列之間的最佳比對中一致的核苷酸或胺基酸之百分比。該百分比純粹為統計學上的，且兩個序列之間的差異可能但未必隨機分佈於所比較之序列的整個長度上。兩個序列之比較通常藉由在最佳比對之後相對於片段或「比較窗」比較序列來進行，以便鑑別對應序列之局部區域。用於比較之最佳比對可手動地或藉助於Smith及Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482之局部同源性演算法、藉助於Neddleman及Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443之局部同源性演算法、藉助於Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444之相似性搜尋演算法或藉助於使用該等演算法之電腦程式(在Wisconsin遺傳學套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)進行。在一些實施例中，兩個序列之一致性百分比係使用如在美國國家生物技術資訊中心(United States National Center for Biotechnology Information；NCBI)網站上(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE= BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq上)可獲得之BLASTN或BLASTP演算法測定。在一些實施例中，用於NCBI網站上之BLASTN演算法的演算法參數包括：(i)期望臨限值設定為10；(ii)字長設定為28；(iii)查詢範圍中之最大匹配數設定為0；(iv)匹配/錯配評分設定為1、-2；(v)間隙成本設定為線性的；及(vi)用於所使用之低複雜度區的過濾器。在一些實施例中，用於NCBI網站上之BLASTP演算法的演算法參數包括：(i)期望臨限值設定為10；(ii)字長設定為3；(iii)查詢範圍中之最大匹配數設定為0；(iv)矩陣設定為BLOSUM62；(v)間隙成本設定為存在：11，延伸：1；及(vi)條件性組合評分矩陣調節。

一致性百分比係藉由測定所比較之序列中之對應的相同位置之數目，將此數值除以所比較之位置數(例如，參考序列中之位置數)且將此結果乘以100來獲得。

在一些實施例中，提供占參考序列之全長的至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%的區域之相似性或一致性程度。舉例而言，若參考核酸序列由200個核苷酸組成，則提供至少約100個、至少約120個、至少約140個、至少約160個、至少約180個或約200個核苷酸(在一些實施例中，連續核苷酸)之一致性程度。在一些實施例中，提供全長參考序列之相似性或一致性程度。

根據本發明，同源胺基酸序列展現出胺基酸殘基之至少40%，特定言之，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，且較佳至少95%、至少98%或至少99%一致性。本文中所描述之胺基酸序列變異體/突變體可由熟習此項技術者容易地製備，例如藉由重組DNA操縱。用於製備具有取代、添加、插入或缺失之肽或蛋白之DNA序列的操縱詳細描述於例如Sambrook等人(1989)中。此外，本文中所描述之肽及胺基酸變異體可藉助於已知肽合成技術容易地製備，諸如藉由固相合成及類似方法。

在一個態樣中，胺基酸序列(肽或蛋白)之片段或變異體/突變體較佳為「功能片段」或「功能變異體」。術語胺基酸序列之「功能片段」或「功能變異體/突變體」係指展現出與衍生其之胺基酸序列相同或類似之一或多種功能特性，亦即，在功能上等效的任何片段或變異體/突變體。關於抗原或抗原序列，一種特定功能為由衍生片段或變異體之胺基酸序列呈現的一或多種免疫原性活性。如本文中所使用，術語「功能片段」或「功能變異體/突變體」尤其係指包含胺基酸序列之變異體/突變體分子或序列，該胺基酸序列與親體分子或序列相比具有一或多個胺基酸之變化且仍能夠滿足親體分子或序列之一或多種功能，例如誘導免疫反應。在一個態樣中，親體分子或序列之胺基酸序列中之修飾未顯著影響或改變該分子或序列之特徵。在不同實施例中，功能片段或功能變異體之功能可能降低但仍顯著存在，例如功能變異體之免疫原性可為親體分子或序列之至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。然而，在其他實施例中，功能片段或功能變異體之免疫原性與親體分子或序列相比可得到增強。

如本文中所使用，「經分離的」意謂自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活的動物中之核酸或肽並非「經分離的」，但自其天然狀態之共存物質部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離的」。經分離之核酸或蛋白可以實質上經純化之形式存在，或可存在於諸如宿主細胞之非原生環境中。

I. 大腸桿菌 FimH 多肽包括1型繖毛之繖毛黏附素結合於上皮層中或分泌至尿液中之甘露糖基化醣蛋白。1型繖毛在臨床UPEC分離株中具有高保守性且由稱為 fim之基因叢集編碼，該等基因編碼輔助蛋白(FimC、FimD)、各種結構子單元(FimE、FimF、FimG)及稱為FimH之黏附素。FimH由兩個結構域構成，即，負責結合於甘露糖基化醣蛋白之凝集素結合域(FimH _LD)，及菌毛蛋白域。菌毛蛋白域用以經由稱為供體股交換之機制，使FimH與菌毛之其他結構子單元(諸如FimG)連接FimH菌毛蛋白域形成不完全免疫球蛋白摺疊，產生提供FimG之N端β股之結合位點之凹槽，從而形成FimH與FimG之間的強分子間連接。雖然FimH _LD可以可溶的穩定形式表現，但除非與伴隨蛋白FimC形成複合物或以肽形式與FimG之供體股肽互補或作為融合蛋白，否則單獨的全長FimH係不穩定的。因此，藉由使FimG供體肽經由甘胺酸-絲胺酸連接子與全長FimH之C端連接且將其命名為FimH-DSG，可實現全長FimH分子之穩定表現。

在一個態樣中，本發明提供經突變之FimH多肽，諸如表 1中所示之多肽。此類突變體提供與對應野生型(WT) FimH多肽之胺基酸序列相比，胺基酸序列中之突變。在一些態樣中，此類突變體針對野生型FimH蛋白或針對表現野生型FimH多肽之細菌具有免疫原性。在某些態樣中，FimH突變體具有某些有益特徵，諸如與對應野生型FimH多肽相比增加的免疫原性特性。

如本文中所使用，術語「FimH多肽」係指全長野生型大腸桿菌FimH多肽之任何結構域、全長野生型大腸桿菌FimH多肽之結構域的任何組合或全長大腸桿菌FimH多肽或其任何片段。舉例而言，在一個實施例中，本發明提供經突變之FimH多肽，其為經突變之FimH _LD多肽或FimH-DSG多肽。本發明係關於新穎的FimH _LD及FimH-DSG突變體，其具有降低之針對甘露糖苷配位體之親和力(藉由生物化學及生物物理學分析證實)，由此改良功能性免疫原性，且相對於野生型FimH _LD描述此等突變體之中和反應之評估。

FimH突變體多肽中所引入之胺基酸突變可包括胺基酸取代、缺失或添加。在一些態樣中，FimH多肽突變體之胺基酸序列中僅有的突變為相對於野生型FimH蛋白之胺基酸取代。表 1 ： FimH 野生型及突變體序列

SEQ ID NO:1 ＞FimHLD_WT FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:2 ＞FimHLD_G65A_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYAGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:3 ＞FimHLD_F1I IACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:4 ＞FimHLD_F1L LACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:5 ＞FimHLD_F1V VACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:6 ＞FimHLD_F1M MACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:7 ＞FimHLD_F1Y YACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:8 ＞FimHLD_F1W WACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:9 ＞FimHLD_Q133K FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRKTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:10 ＞FimHLD_G15A FACKTASGTAIPIGAGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:11 ＞FimHLD_G15P FACKTASGTAIPIGPGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:12 ＞FimHLD_G16A FACKTASGTAIPIGGASANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:13 ＞FimHLD_G16P FACKTASGTAIPIGGPSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:14 ＞FimHLD_G15A_G16A FACKTASGTAIPIGAASANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:15 ＞FimHLD_R60P FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQPGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:16 ＞FimHLD_G65A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYAGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:17 ＞FimHLD_P12C_A18C FACKTASGTAICIGGGSCNVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:18 ＞FimHLD_G14C_F144C FACKTASGTAIPICGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQCVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:19 ＞FimHLD_P26C_V35C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLACVVNVGQNLCVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:20 ＞FimHLD_P26C_V154C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLACVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDCVVPTGG

SEQ ID NO:21 ＞FimHLD_P26C_V156C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLACVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVCPTGG

SEQ ID NO:22 ＞FimHLD_V27C_L34C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPCVNVGQNCVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:23 ＞FimHLD_V28C_N33C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVCNVGQCLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:24 ＞FimHLD_V28C_P157C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVCNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVCTGG

SEQ ID NO:25 ＞FimHLD_Q32C_Y108C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGCNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALCLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:26 ＞FimHLD_N33C_L109C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQCLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYCTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:27 ＞FimHLD_N33C_P157C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQCLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVCTGG

SEQ ID NO:28 ＞FimHLD_V35C_L107C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLCVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVACYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:29 ＞FimHLD_V35C_L109C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLCVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYCTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:30 ＞FimHLD_S62C_T86C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGCAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPCTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:31 ＞FimHLD_S62C_L129C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGCAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVCILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:32 ＞FimHLD_Y64C_L68C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSACGGVCSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:33 ＞FimHLD_Y64C_A127C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSACGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLICVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:34 ＞FimHLD_L68C_F71C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVCSSCSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:35 ＞FimHLD_V112C_T158C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPCSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPCGG

SEQ ID NO:36 ＞FimHLD_S113C_G116C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVCSACGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:37 ＞FimHLD_S113C_T158C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVCSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPCGG

SEQ ID NO:38 ＞FimHLD_V118C_V156C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGCAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVCPTGG

SEQ ID NO:39 ＞FimHLD_A119C_V155C FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVCIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVCVPTGG

SEQ ID NO:40 ＞FimHLD_L34N_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNNVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:41 ＞FimHLD_L34S_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNSVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:42 ＞FimHLD_L34T_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNTVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:43 ＞FimHLD_A119N_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVNIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:44 ＞FimHLD_A119S_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVSIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:45 ＞FimHLD_A119T_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVTIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:46 ＞FimH-DSG_A115V FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSVGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:47 ＞FimH-DSG_V163I FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDISARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:48 ＞FimH-DSG_V185I FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTIYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:49 ＞FimH-DSG_DSG_V3I FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADITITVNGKVVAK

SEQ ID NO:50 ＞FimHLD_G15A_V27A FACKTASGTAIPIGAGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:51 ＞FimHLD_G16A_V27A FACKTASGTAIPIGGASANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:52 ＞FimHLD_G15P_V27A FACKTASGTAIPIGPGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:53 ＞FimHLD_G16P_V27A FACKTASGTAIPIGGPSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:54 ＞FimHLD_G15A_G16A_V27A FACKTASGTAIPIGAASANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:55 ＞FimHLD_V27A_R60P FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQPGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:56 ＞FimHLD_G65A_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYAGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:57 ＞FimHLD_V27A_Q133K FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRKTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:58 ＞FimHLD_G15A_G16A_V27A_Q133K FACKTASGTAIPIGAASANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRKTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGG

SEQ ID NO:59 ＞FimH-DSG_WT FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPVVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:60 ＞FimH-DSG_V27A FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:61 ＞FimH-DSG_G15A_V27A FACKTASGTAIPIGAGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:62 ＞FimH-DSG_G15A_G16A_V27A FACKTASGTAIPIGAASANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRQTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:63 ＞FimH-DSG_V27A_Q133K FACKTASGTAIPIGGGSANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRKTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:64 ＞FimH-DSG_G15A_G16A_V27A_Q133K FACKTASGTAIPIGAASANVYVNLAPAVNVGQNLVVDLSTQIFCHNDYPETITDYVTLQRGSAYGGVLSSFSGTVKYSGSSYPFPTTSETPRVVYNSRTDKPWPVALYLTPVSSAGGVAIKAGSLIAVLILRKTNNYNSDDFQFVWNIYANNDVVVPTGGCDVSARDVTVTLPDYPGSVPIPLTVYCAKSQNLGYYLSGTTADAGNSIFTNTASFSPAQGVGVQLTRQGTIIPANNTVSLGAVGTSAVSLGLTANYARTGGQVTAGNVQSIIGVTFVYQGGSSGGGADVTITVNGKVVAK

SEQ ID NO:65 ＞小鼠Ig κ信號肽 ETDTLLLWVLLLWVPGSTG

野生型FimH多肽之胺基酸序列為此項技術中所熟知的。舉例而言，FimHLD結構域之胺基酸序列在本文中提供為SEQ ID NO: 1。全長野生型FimH多肽，包括經由甘胺酸-絲胺酸連接子連接至全長FimH之C端的FimG供體肽，在本文中提供為SEQ ID NO: 59。編碼此類胺基酸序列之核酸序列亦為此項技術中所熟知的。

在本發明之一個態樣中，某些經突變之FimH多肽引起鎖定的開放構形，此引起對甘露糖苷配位體之親和力降低且引起功能性免疫原性改良。因此，此類FimH突變體可適用作針對大腸桿菌感染之免疫原性組合物(諸如疫苗)中之抗原。因為野生型FimH _LD在其刺激功能性免疫原性之能力方面被視為弱免疫原，所以此類FimH突變體可提供待用於此類免疫原性組合物中之改良抗原。

在一個態樣中，如實例1中所描述，FimH突變體經設計以試圖將FimH凝集素域鎖定於開放構形中，以降低對甘露糖苷配位體之親和力。此類突變體可包括至少1、2、3、4、5個或更多個突變。突變可包括：泌尿道感染分離物中常見的天然存在之胺基酸取代(諸如V27A)；FimH _LD配位體結合側中之取代(諸如在位置F1及Q133)；FimH _LD中之甘胺酸交換突變(諸如在位置G15、G16及G65)；在FimH _LD中引入半胱胺酸以用於穩定雙硫鍵(諸如位置對P12-A18；G14-F144；P26-V35；P26-V154；P26-V156；V27-L34；V28-N33；V28-P157；Q32-Y108；N33-L109；N33-P157；V35-L107；V35-L109；S62-T86；S62-L129；Y64-A127；L68-F71；V112-T158；S113-T158；V118-V 156；及/或A119-V155)；FimH _LD中之非極性至極性突變(諸如在位置V27、L34、A119或其任何組合)；在FimH-DSG之菌毛蛋白-凝集素界面之空腔填充突變(諸如在DSG序列內之位置A115、V163、V185或V3)；或在上述胺基酸位置及突變類型之任何組合。在另一態樣中，本發明提供如SEQ ID NO: 2-58及60-64中提供之FimH突變體，或此類序列中之任一者中提及之突變體的任何組合。在另一態樣中，本發明提供根據SEQ ID NO: 23、50、51、52、53、54、60及62中之任一者之FimH突變體。在另一態樣中，本發明提供根據SEQ ID NO: 62之FimH突變體。

在另一態樣中，本發明提供如SEQ ID NO: 2-58及60-64中提供之任何FimH突變體，其中該等突變體經分離。舉例而言，在一個態樣中，本發明提供根據SEQ ID NO: 23、50、51、52、53、54、60及62中之任一者之FimH突變體，其中該FimH突變體經分離。在另一態樣中，本發明提供根據SEQ ID NO: 62之FimH突變體，其中該FimH突變體經分離。

因此，在一些特定態樣中，本發明提供包含引入之突變之組合的FimH突變體，其中該突變體包含表 1(亦即，SEQ ID NO: 2-58及60-64中)中所提供之突變體中之任一者中所闡述之突變之組合。可對野生型FimH多肽序列進行表 1中之每一突變體中提供的胺基酸取代之任何組合，以獲得不同的FimH突變體。基於任何其他亞型或菌株之原生FimH多肽序列的及包含本文中所描述之突變之組合中之任一者的FimH突變體亦在本發明之範疇內。

本發明之另一態樣為與SEQ ID NO: 1-64中之任一者至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致的多肽。在較佳態樣中，多肽與SEQ ID NO: 62至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。在本發明之另一態樣中，為與SEQ ID NO: 1-64至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致的多肽。在較佳態樣中，多肽與SEQ ID NO: 62至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致。

本發明所提供之FimH突變體可藉由此項技術中已知之常規方法，諸如藉由在重組宿主系統中使用適合的載體表現來製備。適合的重組宿主細胞包括例如昆蟲細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、細菌及酵母細胞。適合的昆蟲細胞之實例包括例如Sf9細胞、Sf21細胞、Tn5細胞、施耐德S2細胞(Schneider S2 cell)及High Five細胞(衍生自親本粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) BTI-TN-5B1-4細胞株(Invitrogen)之純系分離株)。適合的哺乳動物細胞之實例包括中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞、人類胚胎腎細胞(HEK293或Expi 293細胞，通常藉由經剪切之腺病毒5型DNA來轉型)、NIH-3T3細胞、293-T細胞、非洲綠猴腎細胞(Vero cell)及海拉細胞(HeLa cell)。適合的禽類細胞包括例如雞胚胎幹細胞(例如，EBx®細胞)、雞胚胎纖維母細胞、雞胚胎生殖細胞、鵪鶉纖維母細胞(例如，ELL-O)及鴨細胞。適合的昆蟲細胞表現系統，諸如桿狀病毒載體化系統為熟習此項技術者已知的，且描述於例如Summers及Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555號(1987)中。用於桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統之材料及方法可呈套組形式且尤其自Invitrogen (San Diego Calif.)購得。禽類細胞表現系統亦為熟習此項技術者已知的，且描述於例如美國專利第5,340,740號；5,656,479號；5,830,510號；6,114,168號；及6,500,668號中。類似地，細菌及哺乳動物細胞表現系統亦為此項技術中已知的，且描述於例如Yeast Genetic Engineering (Barr等人編, 1989) Butterworths, London中。

用於在昆蟲或哺乳動物細胞中表現重組蛋白之多種適合的載體為此項技術中熟知及習知的。適合的載體可含有多種成分，包括(但不限於)以下中之一或多者：複製起點；可選標記基因；一或多種表現控制元件，諸如轉錄控制元件(例如啟動子、強化子、終止子)及/或一或多種轉譯信號；及用於靶向所選宿主細胞(例如哺乳動物來源或來自異源哺乳動物或非哺乳動物物種)中之分泌路徑的信號序列或前導序列。舉例而言，對於昆蟲細胞中之表現，使用適合的桿狀病毒表現載體，諸如pFastBac (Invitrogen)以產生重組桿狀病毒粒子。桿狀病毒粒子經擴增且用於感染昆蟲細胞以表現重組蛋白。對於哺乳動物細胞中之表現，使用將驅動構築體在所需哺乳動物宿主細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞)中之表現的載體。

可使用任何適合的方法分離FimH突變體多肽。舉例而言，用於藉由免疫親和層析法純化FimH蛋白突變體多肽之方法為此項技術中已知的。Ruiz-Arguello等人, J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004)。適用於純化所需蛋白的方法為此項技術中熟知的，包括沈澱及各種類型之層析法，諸如疏水性相互作用、離子交換、親和、螯合及尺寸排阻。可使用此等或其他適合的方法中之兩者或更多者產生適合的純化流程。若需要，FimH突變體多肽可包括有助於純化之「標記」，諸如抗原決定基標記或組胺酸(His)標記。此類經標記之多肽可方便地例如藉由螯合層析法或親和層析法自改良性培養基分離。

如本文中所使用，術語「抗原」係指可由抗體識別之分子。抗原之實例包括含有抗原決定子(諸如免疫細胞所識別之抗原決定子)之多肽、肽、脂質、多醣及核酸。

II. 編碼 FimH 突變體之核酸在另一態樣中，本發明提供編碼如本文所揭示之FimH突變體的核酸分子。此類核酸分子包括DNA、cDNA及RNA序列。在一個實施例中，核酸分子可併入載體，諸如表現載體中。

在一個態樣中，揭示編碼經突變之大腸桿菌FimH多肽或其任何片段的核酸。一或多種編碼FimH突變體多肽或其片段之核酸構築體可用於多肽之基因體整合及後續表現。舉例而言，可將編碼FimH突變體多肽或其片段之單一核酸構築體引入宿主細胞中。或者，多肽之編碼序列可由兩個或更多個核酸構築體攜帶，其隨後同時或依次引入宿主細胞中。

舉例而言，在一個例示性實施例中，單一核酸構築體編碼大腸桿菌FimH之凝集素域及菌毛蛋白域。在另一例示性實施例中，一個核酸構築體編碼凝集素域，且第二核酸構築體編碼大腸桿菌FimH之菌毛蛋白域。在一些態樣中，達成基因體整合。

核酸構築體可包含基因體DNA，其包含一或多個內含子或cDNA。當存在內含子時，一些基因可更有效地表現。在一些態樣中，核酸序列適用於在該哺乳動物細胞中表現外源性多肽。

在一些態樣中，編碼多肽或其片段之核酸經密碼子最佳化以增加任何特定細胞中之表現量。

在一些態樣中，核酸構築體包括編碼引導衍生自大腸桿菌之多肽或其片段分泌之肽的信號序列。在一些態樣中，核酸包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽的原生信號序列。在衍生自大腸桿菌之多肽或其片段包括內源性信號序列的一些態樣中，編碼信號序列之核酸序列可經密碼子最佳化以增加蛋白在宿主細胞中之表現量。

在一些態樣中，信號序列為以下長度中之任一者：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30個胺基酸長。在一些態樣中，信號序列為20個胺基酸長。在一些態樣中，信號序列為21個胺基酸長。

在一些態樣中，在多肽或其片段包括信號序列之情況下，與多肽天然相關之內源性信號序列可用與野生型多肽不相關之信號序列置換，以改良多肽或其片段在經培養之細胞中之表現量。因此，在一些態樣中，核酸不包括衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的原生信號序列。在一些態樣中，核酸不包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽的原生信號序列。在一些態樣中，衍生自大腸桿菌之多肽或其片段可由異源肽表現，該異源肽較佳為在成熟蛋白或衍生自大腸桿菌之多肽或其片段之N端具有特異性裂解位點的信號序列或其他肽。舉例而言，衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段可由異源肽(例如IgK信號序列)表現，該異源肽較佳為在成熟大腸桿菌FimH蛋白之N端具有特異性裂解位點的信號序列或其他肽。在較佳態樣中，成熟蛋白大腸桿菌FimH之N端處的特定裂解位點緊接著在成熟大腸桿菌FimH蛋白之初始苯丙胺酸殘基之前出現。所選擇之異源序列較佳為經宿主細胞識別且處理(亦即，藉由信號肽酶裂解)之序列。

在較佳態樣中，信號序列為IgK信號序列。在一些態樣中，核酸編碼具有SEQ ID NO: 1-64中之任一者中所闡述之胺基酸序列的多肽。在一些態樣中，核酸編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 23、50、51、52、53、54、60、61或62。在一些態樣中，核酸編碼具有SEQ ID NO: 62中所闡述之胺基酸序列的多肽。在較佳態樣中，信號序列為小鼠IgK信號序列。

用於產生FimH突變體多肽或其片段之適合的哺乳動物表現載體為此項技術中已知的且可商購的，諸如來自Invitrogen™之pSecTag2表現載體。例示性小鼠Ig κ信號肽序列包括序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 65)。在一些態樣中，載體包括來自Thermo Fisher之pBudCE4.1哺乳動物表現載體。其他例示性及適合的載體包括pcDNA™3.1哺乳動物表現載體(Thermo Fisher)。

在一些態樣中，信號序列不包括紅血球凝集素信號序列。

在一些態樣中，核酸包括FimH多肽或其片段之原生信號序列。在一些態樣中，信號序列不為IgK信號序列。在一些態樣中，信號序列包括紅血球凝集素信號序列。

在一個態樣中，本文中所揭示為包括FimH突變體多肽或其片段之編碼序列的載體。例示性載體包括能夠在哺乳動物細胞中自主複製或被複製的質體。典型表現載體含有適合的啟動子、強化子及終止子，其適用於調節表現構築體中之一或多個編碼序列之表現。載體亦可包括選擇標記物，以提供用於選擇經轉型之宿主細胞之表型特點(諸如賦予對抗生素，諸如安比西林(ampicillin)或新黴素之抗性)。

適合啟動子為此項技術中已知的。例示性啟動子包括例如CMV啟動子、腺病毒、EF1 a、GAPDH金屬硫蛋白啟動子、SV-40早期啟動子、SV-40晚期啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子、多角體蛋白啟動子等。啟動子可為構成性或誘導性的。可使用一或多種載體(例如編碼所有子單元或結構域或其片段之一種載體，或共同編碼子單元或結構域或其片段之多種載體)。

亦可使用內部核糖體入口位點(IRES)及2A肽序列。IRES及2A肽提供用於共同表現多個序列之替代性方法。IRES為允許在信使RNA (mRNA)序列中間起始轉譯，作為蛋白合成之較大過程之一部分的核苷酸序列。通常，在真核生物中，轉譯可僅在mRNA分子之5'端處起始。IRES元件允許一種轉錄物中之多種基因之表現。基於IRES之多順反子載體(其自一種轉錄物表現多種蛋白)可減少非表現純系自選擇之逃逸。2A肽允許多個蛋白在單個開放閱讀框架中轉譯為聚合蛋白，其隨後經由核糖體跳躍機制裂解為個別蛋白。2A肽可提供多重蛋白產物之更平衡的表現。例示性IRES序列包括例如EV71 IRES、EMCV IRES、HCV IRES。對於基因體整合，整合可為定點的或隨機的。定點重組可藉由將同源序列引入本文中所描述之核酸構築體中達成。此類同源序列實質上匹配宿主基因體中之特定標靶位點處的內源性序列。或者，可使用隨機整合。有時，蛋白之表現量可視整合位點而變化。因此，可能需要根據重組蛋白表現量選擇多個純系以鑑別達成所需表現量之純系。

例示性核酸構築體進一步描述於圖中，例如PCT國際公開案第WO2021/084429號之圖2A-圖2T中，2021年5月6日公開，其以引用之方式併入本文中。

在一個態樣中，核酸序列編碼與SEQ ID NO: 1-64中之任一者至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致的胺基酸序列。在較佳態樣中，核酸序列編碼與SEQ ID NO: 62至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。在本發明之另一態樣中，核酸序列編碼與SEQ ID NO: 1-64至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致的胺基酸序列。在較佳態樣中，核酸序列編碼與SEQ ID NO: 62至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致的胺基酸序列。

在本發明之某些態樣中，RNA為信使RNA (mRNA)，其係關於編碼肽或蛋白之RNA轉錄物。如此項技術中所確立，mRNA通常含有5'非轉譯區(5'-UTR)、肽編碼區及3'非轉譯區(3'-UTR)。在一些實施例中，RNA藉由活體外轉錄或化學合成產生。在一個實施例中，mRNA藉由使用DNA模板進行活體外轉錄而產生，其中DNA係指含有去氧核糖核苷酸之核酸。在一個態樣中，本文中所描述之RNA可具有經修飾之核苷。在一些態樣中，RNA包含經修飾之核苷來代替至少一個(例如每一個)尿苷。

在一些實施例中，本文中所描述之組合物或醫學製劑包含編碼包含FimH突變體多肽之胺基酸序列的RNA。同樣地，本文中所描述之方法包含投與此類RNA。供本文中所用之一種可能的平台係基於編碼抗原之RNA疫苗以誘導穩固的中和抗體及伴隨/隨附T細胞反應，從而較佳以最小疫苗劑量達成保護性免疫接種。所投與之RNA較佳為活體外經轉錄之RNA。三種不同的RNA平台尤其較佳，亦即含有mRNA (uRNA)的未經修飾之尿苷、經核苷修飾之mRNA (modRNA)及自擴增RNA (saRNA)。在一個尤其較佳的態樣中，RNA為活體外經轉錄之RNA。

III. 宿主細胞在一個態樣中，本發明係關於編碼FimH突變體多肽或其片段之序列在哺乳動物宿主細胞中表現的細胞。在一個實施例中，多肽在宿主細胞中暫時表現。在另一實施例中，多肽穩定整合至宿主細胞之基因體中，且當在適合的條件下培養時，表現多肽或其片段。在一個較佳實施例中，聚核苷酸序列以高效率及基因體穩定性表現。

適合的哺乳動物宿主細胞為此項技術中已知的。較佳地，宿主細胞適用於在工業製造規模下產生蛋白。例示性哺乳動物宿主細胞包括以下中之任一者及其衍生物：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞(衍生自猴(非洲綠猴)腎之細胞株)、非洲綠猴腎細胞、海拉細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、人類胚腎(HEK)細胞、NSO細胞(鼠類骨髓瘤細胞株)及C127細胞(無致瘤性小鼠細胞株)。其他例示性哺乳動物宿主細胞包括小鼠賽特利氏(mouse Sertoli) (TM4)、水牛鼠肝(BRL 3A)、小鼠乳房腫瘤(MMT)、大鼠肝癌(HTC)、小鼠骨髓瘤(NSO)、鼠類融合瘤(Sp2/0)、小鼠胸腺瘤(EL4)、中國倉鼠卵巢(CHO)及CHO細胞衍生物、鼠類胚胎(NIH/3T3，3T3 Li)、大鼠心肌(H9c2)、小鼠成肌細胞(C2C12)及小鼠腎(miMCD-3)。哺乳動物細胞株之其他實例包括NS0/1、Sp2/0、Hep G2、PER.C6、COS-7、TM4、CV1、VERO-76、MDCK、BRL 3A、W138、MMT 060562、TR1、MRC5及FS4。

可根據本發明使用對細胞培養敏感之任何細胞。在一些態樣中，細胞為哺乳動物細胞。可根據本發明使用之哺乳動物細胞之非限制性實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤細胞株(NSO/l，ECACC第85110503號)；人類視網膜母細胞(PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands)；經SV40轉型之猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(經次選殖以便在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人, J. Gen Virol., 36:59,1977)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR (CHO, Urlaub及Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980)；小鼠28yophil細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人類子宮頸癌細胞(海拉，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株(Hep G2)。在一些較佳實施例中，細胞為CHO細胞。在一些較佳態樣中，細胞為GS細胞。

此外，可根據本發明使用任何數目之市售及非市售融合瘤細胞株。如本文中所使用之術語「融合瘤」係指由永生化細胞與產生抗體之細胞融合產生之細胞或細胞子代。此類所得融合瘤為產生抗體之永生化細胞。用於產生融合瘤之個別細胞可來自任何哺乳動物來源，包括(但不限於)大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊及人類。在一些態樣中，融合瘤為三源融合瘤細胞株，其在雜交骨髓瘤融合物之子代隨後與漿細胞融合時產生，該雜交骨髓瘤融合物為人類細胞與鼠類骨髓瘤細胞株之間的融合產物。在一些態樣中，融合瘤為產生抗體(諸如四源瘤)之任何永生化雜交細胞株(參見例如Milstein等人, Nature537:3053 (1983))。熟習此項技術者應瞭解，融合瘤細胞株可能有不同營養需求及/或可能需要不同培養條件以實現最佳生長，且能夠視需要修改條件。

在一些態樣中，細胞包含第一相關基因，其中第一相關基因經染色體整合。在一些態樣中，第一相關基因包含報導基因、選擇基因、相關基因(例如編碼衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些態樣中，治療相關基因包含編碼難以表現(DtE)蛋白之基因。

在一些態樣中，第一相關基因位於定點整合(SSI)哺乳動物細胞中之兩個不同重組標靶位點(RTS)之間，其中兩個RTS經染色體整合於NL1基因座或NL2基因座內。關於NL1基因座、NL2基因座、NL3基因座、NL4基因座、NL5基因座及NL6基因座之描述參見例如美國專利申請公開案第20200002727號。在一些態樣中，第一相關基因位於NL1基因座內。在一些態樣中，細胞包含第二相關基因，其中第二相關基因經染色體整合在一些態樣中，第二相關基因包含報告基因、選擇基因、治療相關基因(諸如FimH突變體多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些態樣中，治療相關基因包含編碼DtE蛋白之基因。在一些態樣中，第二相關基因位於兩個RTS之間。在一些態樣中，第二相關基因位於NL1基因座或NL2基因座內。在一些態樣中，第一相關基因位於NL1基因座內，且第二相關基因位於NL2基因座內。在一些態樣中，細胞包含第三相關基因，其中第三相關基因經染色體整合。在一些態樣中，第三相關基因包含報告基因、選擇基因、治療相關基因(諸如衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些態樣中，治療相關基因包含編碼DtE蛋白之基因。在一些態樣中，第三相關基因位於兩個RTS之間。在一些態樣中，第三相關基因位於NL1基因座或NL2基因座內。在一些態樣中，第三相關基因位於與NL1基因座及NL2基因座不同之基因座內。在一些態樣中，第一相關基因、第二相關基因及第三相關基因在三個獨立的基因座內。在一些態樣中，第一相關基因、第二相關基因及第三相關基因中之至少一者在NL1基因座內，且第一相關基因、第二相關基因及第三相關基因中之至少一者在NL2基因座內。在一些態樣中，細胞包含定點重組酶基因。在一些態樣中，定點重組酶基因經染色體整合。

在另一態樣中，本發明提供包含至少四個不同RTS之哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩個不同RTS，其經染色體整合於NL1基因座或NL2基因座內；(b)第一相關基因，其整合於(a)之至少二個RTS之間，其中該第一相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白之基因、輔助基因或其組合；(c)及第二相關基因，其整合於不同於(a)之基因座的第二染色體基因座內，其中該第二相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白之基因(諸如衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。在一些態樣中，本發明提供包含至少四個不同RTS之哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩個不同RTS，其經染色體整合於Fer1L4基因座內；(b)至少兩個不同RTS，其經染色體整合於NL1基因座或NL2基因座內；(c)第一相關基因，其經染色體整合於Fer1L4基因座內，其中該第一相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白之基因、輔助基因或其組合；及(d)第二相關基因，其經染色體整合於(b)之NL1基因座或NL2基因座內，其中該第二相關基因包含報導基因、編碼DtE蛋白之基因(諸如衍生自大腸桿菌之多肽或其片段)、輔助基因或其組合。

在一些態樣中，本發明提供包含至少六個不同RTS之哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩個不同RTS及第一相關基因，其經染色體整合於Fer1L4基因座內；(b)至少兩個不同RTS及第二相關基因，其經染色體整合於NL1基因座內；及(c)至少兩個不同RTS及第三相關基因，其經染色體整合於NL2基因座內。

如本文中所提及，術語「以可操作組合形式」、「以可操作次序」及「可操作地連接」係指核酸序列以使得產生能夠引導給定基因之轉錄及/或所需蛋白分子之合成的核酸分子之此類方式連接。該術語亦指胺基酸序列以使得產生功能蛋白之此類方式連接。在一些態樣中，相關基因可操作地連接至啟動子，其中該相關基因經染色體整合至宿主細胞中。在一些態樣中，相關基因可操作地連接至異源啟動子；其中該相關基因經染色體整合至宿主細胞中。在一些態樣中，輔助基因可操作地連接至啟動子，其中該輔助基因經染色體整合至宿主細胞基因體中。在一些態樣中，輔助基因可操作地連接至異源啟動子；其中該輔助基因經染色體整合至宿主細胞基因體中。在一些態樣中，編碼DtE蛋白之基因可操作地連接至啟動子，其中該編碼DtE蛋白之基因經染色體整合至宿主細胞基因體中。在一些態樣中，編碼DtE蛋白之基因可操作地連接至異源啟動子；其中該編碼DtE蛋白之基因經染色體整合至宿主細胞基因體中。在一些態樣中，重組酶基因可操作地連接至啟動子，其中該重組酶基因經染色體整合至宿主細胞中。在一些態樣中，重組酶基因可操作地連接至啟動子，其中該重組酶基因未整合至宿主細胞基因體中。在一些態樣中，重組酶基因可操作地連接至異源啟動子，其中該重組酶基因未經染色體整合至宿主細胞基因體中。在一些態樣中，重組酶基因可操作地連接至異源啟動子，其中該重組酶基因未經染色體整合至於宿主細胞基因體中。

如本文中所提及，術語「經染色體整合」或「染色體整合」係指核酸序列穩定併入宿主細胞(例如哺乳動物細胞)之染色體中，亦即核酸序列經染色體整合至宿主細胞(例如哺乳動物細胞)之基因體DNA (gDNA)中。在一些態樣中，經染色體整合之核酸序列為穩定的。在一些態樣中，經染色體整合之核酸序列不位於質體或載體上。在一些態樣中，未切除經染色體整合之核酸序列。在一些態樣中，染色體整合藉由成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關蛋白(Cas)基因編輯系統(CRISPR/CAS)介導。

IV. 組合物及調配物在一個態樣中，本發明包括組合物，其包含至少一種本文中所描述之FimH突變體多肽或其片段。在一些態樣中，組合物引發可針對大腸桿菌病原性物種賦予免疫力之免疫反應，包括抗體。

在一些態樣中，組合物包含FimH突變體多肽作為唯一抗原。在一些態樣中，組合物不包括結合物。

在一些態樣中，組合物包含FimH突變體多肽及至少一種額外抗原。在一些態樣中，組合物包含FimH突變體多肽及額外大腸桿菌抗原。在一些態樣中，組合物包含FimH突變體多肽及來自大腸桿菌之醣結合物。

在一些態樣中，組合物包含FimH突變體多肽及衍生自大腸桿菌FimC之多肽或其片段。

在一個實施例中，本發明包括組合物，其包含FimH突變體多肽及醣，該醣包含選自以下中所揭示之醣結構中之任一者的結構：PCT國際公開案第WO2021/084429號，2021年5月6日公開；及第WO2020/039359號公開，2020年2月27日公開；以及美國公開案第US2020/0061177號，2020年2月27日公開，其各自以全文引用之方式併入本文中。在一個態樣中，本發明包括組合物，其包含FimH突變體多肽；及包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100，較佳為31至90之整數。

在一些實施例中，組合物包括本文中所揭示之醣中之任一者。在較佳實施例中，組合物包括本文中所揭示之結合物中之任一者。

在一些實施例中，組合物包括至少一種來自大腸桿菌血清型O25 (較佳為血清型O25b)之醣結合物。在一個實施例中，組合物包括至少一種來自大腸桿菌血清型O1 (較佳為血清型O1a)之醣結合物。在一個實施例中，組合物包括至少一種來自大腸桿菌血清型O2之醣結合物。在一個實施例中，組合物包括至少一種來自大腸桿菌血清型O6之醣結合物。

在一個實施例中，組合物包含至少一種選自以下大腸桿菌血清型中之任一者的醣結合物：O25、O1、O2及O6，較佳為O25b、O1a、O2及O6。在一個實施例中，組合物包含至少兩種選自以下大腸桿菌血清型中之任一者的醣結合物：O25、O1、O2及O6，較佳為O25b、O1a、O2及O6。在另一實施例中，組合物包含至少三種選自以下大腸桿菌血清型中之任一者的醣結合物：O25、O1、O2及O6，較佳為O25b、O1a、O2及O6。在其他實施例中，組合物包含來自以下大腸桿菌血清型中之每一者的醣結合物：O25、O1、O2及O6，較佳為O25b、O1a、O2及O6。

在一個較佳實施例中，以上組合物中之任一者之醣結合物個別地與CRM ₁₉₇結合。在另一較佳實施例中，以上組合物中之任一者之醣結合物個別地與SCP結合。

因此，在一些實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自至少一種大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個較佳實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自超過1種大腸桿菌血清型之O-抗原。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型(或「v」，價數)至12種不同血清型(12v)之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自3種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自4種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自5種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自6種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自7種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自8種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自9種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自10種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自11種不同大腸桿菌血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自12種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自13種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自14種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自15種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自16種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自17種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自18種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自19種不同血清型之O-抗原。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自20種不同血清型之O-抗原。

較佳地，大腸桿菌醣之數目可在1種血清型(或「v」，價數)至26種不同血清型(26v)之範圍內。在一個實施例中，存在一種血清型。在一個實施例中，存在2種不同血清型。在一個實施例中，存在3種不同血清型。在一個實施例中，存在4種不同血清型。在一個實施例中，存在5種不同血清型。在一個實施例中，存在6種不同血清型。在一個實施例中，存在7種不同血清型。在一個實施例中，存在8種不同血清型。在一個實施例中，存在9種不同血清型。在一個實施例中，存在10種不同血清型。在一個實施例中，存在11種不同血清型。在一個實施例中，存在12種不同血清型。在一個實施例中，存在13種不同血清型。在一個實施例中，存在14種不同血清型。在一個實施例中，存在15種不同血清型。在一個實施例中，存在16種不同血清型。在一個實施例中，存在17種不同血清型。在一個實施例中，存在18種不同血清型。在一個實施例中，存在19種不同血清型。在一個實施例中，存在20種不同血清型。在一個實施例中，存在21種不同血清型。在一個實施例中，存在22種不同血清型。在一個實施例中，存在23種不同血清型。在一個實施例中，存在24種不同血清型。在一個實施例中，存在25種不同血清型。在一個實施例中，存在26種不同血清型。醣與載體蛋白結合以形成如本文中所描述之醣結合物。

在一個態樣中，組合物包括FimH突變體多肽；及包括來自至少一種大腸桿菌血清群之O-抗原的醣結合物，其中該O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽；及來自超過1種大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自2種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自3種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自4種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自5種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自6種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自7種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自8種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自9種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自FimH突變體多肽及10種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自FimH突變體多肽及11種不同大腸桿菌血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自12種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自13種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自14種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自15種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自16種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自17種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自18種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自19種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自20種不同血清型之O-抗原，其中各O-抗原與載體蛋白結合。

在另一態樣中，組合物包括來自至少一種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個較佳實施例中，組合物包括來自超過1種大腸桿菌血清型之O-多醣。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型至12種不同大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自3種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自4種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自5種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自6種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自7種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自8種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自9種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自10種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自11種大腸桿菌血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自12種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自13種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自14種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自15種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自16種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自17種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自18種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自19種血清型之O-多醣。在一個實施例中，組合物包括來自20種血清型之O-多醣。

在一個較佳實施例中，組合物包括來自至少一種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中該O-多醣與載體蛋白結合。在一個較佳實施例中，組合物包括來自超過1種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型至12種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自3種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自4種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自5種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自6種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自7種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自8種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自9種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自10種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自11種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自12種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自13種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自14種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自15種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自16種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自17種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自18種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自19種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。在一個實施例中，組合物包括來自20種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合。

在一最佳實施例中，組合物包括來自至少一種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個較佳實施例中，組合物包括來自超過1種大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。舉例而言，組合物可包括來自兩種不同大腸桿菌血清型至12種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自3種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自4種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自5種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自6種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自7種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自8種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自9種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自10種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自11種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自12種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自13種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自14種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自15種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自16種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自17種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自18種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自19種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括來自20種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與載體蛋白結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個較佳實施例中，載體蛋白為CRM ₁₉₇。

在另一較佳實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O25a及核心醣，其中 n為至少30。在一個較佳實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O25b及核心醣，其中 n為至少40。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O1a及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O2及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O6及核心醣，其中 n為至少30。

在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O17及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O15及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O18A及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O75及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O4及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O16及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O13及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O7及核心醣，其中 n為至少30。

在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O8及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，O-多醣包括式O8，其中 n為1-20，較佳為2-5，更佳為3。在另一實施例中，組合物進一步包括與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O9及核心醣，其中 n為至少30。在另一實施例中，O-多醣包括式O9，其中 n為1-20，較佳為4-8，更佳為5。在另一實施例中，O-多醣包括式O9a，其中 n為1-20，較佳為4-8，更佳為5。

在一些實施例中，O-多醣係選自式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101中之任一者，其中 n為1-20，較佳為4-8，更佳為5。

如上文所描述，組合物可包括FimH突變體多肽及結合之O-多醣(抗原)之任何組合。在一例示性實施例中，組合物包括有包括式O25b之多醣、包括式O1a之多醣、包括式O2之多醣及包括式O6之多醣。更特定言之，諸如包括以下之組合物：(i)與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O25b及核心醣，其中 n為至少30；(ii)與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O1a及核心醣，其中 n為至少30；(iii)與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O2及核心醣，其中 n為至少30；及(iv)與CRM ₁₉₇結合之O-多醣，其中O-多醣包括式O6及核心醣，其中 n為至少30。

在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及至少一種衍生自任何大腸桿菌血清型之O-多醣，其中血清型不為O25a。舉例而言，在一個實施例中，組合物不包括：包括式O25a之醣。此類組合物可包括：例如包括式O25b之O-多醣、包括式O1a之O-多醣、包括式O2之O-多醣及包括式O6之O-多醣。

在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自2種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自3種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自4種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自5種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自6種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自7種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自8種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自9種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自10種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自11種不同大腸桿菌血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自12種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自13種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自14種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自15種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自16種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自17種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自18種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自19種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。在一個實施例中，組合物包括FimH突變體多肽及來自20種不同血清型之O-多醣，其中各O-多醣與CRM ₁₉₇結合，且其中O-多醣包括O-抗原及核心醣。

在一個態樣中，本發明提供組合物，其包含FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O25b，其中 n為15±2。在一個態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O25b，其中 n為17±2。在一個態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O25b，其中 n為55±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O25b，其中 n為51±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O25b，其中 n為大於30之整數，較佳地， n為31至100之整數。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌K12核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接之結合來製備結合物。在一個實施例中，藉由還原胺化化學方法來製備結合物，且較佳在DMSO緩衝液中。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白結合。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個態樣中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O25b多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析法所測定。因此，可對用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清之OPA活性進行比較，且比較其對血清型O25b之反應，以評估反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O25b，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O25b，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O25b之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O25b的至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O25b之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O25b之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加人類個體針對大腸桿菌血清型O25b之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O1a，其中 n為大於30之整數，較佳地， n為31至100之整數。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O1a，其中 n為39±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O1a，其中 n為13±2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接之結合來製備結合物。在一個實施例中，藉由還原胺化化學方法來製備結合物，且較佳在DMSO緩衝液中。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白結合。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O1a多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析法所測定。因此，可對用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清之OPA活性進行比較，且比較其對血清型O1a之反應，以評估反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O1a，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O1a，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O1a之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O1a的至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O1a之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O1a之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加人類個體針對大腸桿菌血清型O1a之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O2，其中 n為大於30之整數，較佳地， n為31至100之整數。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O2，其中 n為43±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O2，其中 n為47±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O2，其中 n為17±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O2，其中 n為18±2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R4核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接之結合來製備結合物。在一個實施例中，藉由還原胺化化學方法來製備結合物，且較佳在DMSO緩衝液中。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白結合。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O2多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析法所測定。因此，可對用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清之OPA活性進行比較，且比較其對血清型O2之反應，以評估反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O2，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O2，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O2之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O2的至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O2之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O2之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加人類個體針對大腸桿菌血清型O2之OPA效價。

在一個態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O6，其中 n為大於30之整數，較佳地， n為31至100之整數。在一個態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O6，其中 n為42±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O6，其中 n為50±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O6，其中 n為17±2。在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括式O6，其中 n為18±2。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接之結合來製備結合物。在一個實施例中，藉由還原胺化化學方法來製備結合物，且較佳在DMSO緩衝液中。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白結合。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。

在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠在以下之濃度下結合大腸桿菌血清型O6多醣：至少0.2 pg/ml、0.3 pg/ml、0.35 pg/ml、0.4 pg/ml或0.5 pg/ml，如藉由ELISA分析法所測定。因此，可對用本發明之免疫原性組合物免疫接種前及免疫接種後血清之OPA活性進行比較，且比較其對血清型O6之反應，以評估反應者之潛在增加。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發IgG抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O6，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，免疫原性組合物在人類中引發功能抗體，該等抗體能夠殺傷大腸桿菌血清型O6，如藉由活體外調理吞噬活性分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物增加針對大腸桿菌血清型O6之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，免疫原性組合物在至少50%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O6的至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，本發明之免疫原性組合物在至少60%、70%、80%或至少90%之個體中引發針對大腸桿菌血清型O6之至少1:8之效價，如藉由活體外調理吞噬活性殺傷分析法所測定。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加針對大腸桿菌血清型O6之反應者(亦即，如藉由活體外OPA所測定，血清效價為至少1:8之個人)的比例。在一個實施例中，與免疫接種前之群體相比，本發明之免疫原性組合物顯著增加人類個體針對大腸桿菌血清型O6之OPA效價。

在一個態樣中，組合物包括FimH突變體多肽及包括與載體蛋白共價結合之醣的結合物，其中醣包括選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100，較佳為31至90之整數。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R1核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R2核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R3核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括大腸桿菌R4核心醣部分。在一個實施例中，醣進一步包括大腸桿菌K12核心醣部分。在另一實施例中，醣進一步包括KDO部分。較佳地，載體蛋白為CRM ₁₉₇。在一個實施例中，藉由單端連接之結合來製備結合物。在一個實施例中，藉由還原胺化化學方法來製備結合物，且較佳在DMSO緩衝液中。在一個實施例中，醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白結合。較佳地，組合物進一步包括醫藥學上可接受之稀釋劑。在一個實施例中，組合物進一步包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個額外結合物至至多30個額外結合物，各結合物包括與載體蛋白共價結合之醣，其中醣包括選自該等調配物中之任一者的結構。

A. 醣 1. 醣及 O - 多醣在一個實施例中，藉由表現(未必過度表現)不同Wzz蛋白(例如WzzB)以控制醣之尺寸，來產生醣。

如本文所用，術語「醣」係指單糖部分或單醣單元，以及經共價連接以形成雙醣、寡醣及多醣之兩個或更多個單糖部分或單醣單元的組合。醣可為直鏈或分支鏈的。

在一個實施例中，醣產生於重組革蘭氏陰性細菌中。在一個實施例中，醣產生於重組大腸桿菌細胞中。在一個實施例中，醣產生於重組沙門氏菌細胞中。例示性細菌包括大腸桿菌O25K5H1、大腸桿菌BD559、大腸桿菌GAR2831、大腸桿菌GAR865、大腸桿菌GAR868、大腸桿菌GAR869、大腸桿菌GAR872、大腸桿菌GAR878、大腸桿菌GAR896、大腸桿菌GAR1902、大腸桿菌O25a ETC NR-5、大腸桿菌O157:H7:K-、腸道沙門氏菌血清變型鼠傷寒菌株LT2、大腸桿菌GAR2401、腸道沙門氏菌血清型腸炎CVD 1943、腸道沙門氏菌血清型鼠傷寒CVD 1925、腸道沙門氏菌血清型副傷寒A CVD 1902及弗氏志賀菌( Shigella flexneri) CVD 1208S。在一個實施例中，細菌不為大腸桿菌GAR2401。此針對產生醣之遺傳學方法允許有效產生作為疫苗成分之O-多醣及O-抗原分子。

如本文中所使用，術語「wzz蛋白」係指鏈長決定子多肽，諸如wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzzl及wzz2。例示性wzz基因序列之GenBank寄存編號為：對於E4991/76，為AF011910；對於F186，為AF011911；對於M70/1-1，為AF011912；對於79/311，為AF011913；對於Bi7509-41，為AF011914；對於C664-1992，為AF011915；對於C258-94，為AF011916；對於C722-89，為AF011917；及對於EDL933，為AF011919。G7及Bi316-41 wzz基因序列之GenBank寄存編號分別為U39305及U39306。例示性wzz基因序列之其他GenBank寄存編號為：對於腸道沙門氏菌亞種腸道血清變型鼠傷寒菌株LT2 FepE，為NP_459581；對於大腸桿菌O157:H7菌株EDL933 FepE，為AIG66859；對於腸道沙門氏菌亞種腸道血清變型鼠傷寒菌株LT2 WzzB，為NP_461024；對於大腸桿菌K-12亞種菌株MG1655 WzzB，為NP_416531；對於大腸桿菌K-12亞種菌株MG1655 FepE，為NP_415119。在較佳態樣中，wzz家族蛋白為以下中之任一者：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2，最佳為wzzB，更佳為fepE。

例示性wzzB序列包括SEQ ID No: 112-116中所闡述之序列。例示性FepE序列包括SEQ ID No: 117-121中所闡述之序列。

在一些態樣中，經修飾之醣(與對應野生型醣相比經修飾)可藉由以下方式產生：在革蘭氏陰性細菌中表現(未必過度表現)來自革蘭氏陰性細菌之wzz家族蛋白(例如fepE)及/或藉由切斷(亦即抑制、缺失、移除)第二wzz基因(例如wzzB)以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣(諸如脂多醣)，其與對應野生型O-多醣相比重複單元數目增加。舉例而言，經修飾之醣可藉由表現(未必過度表現) wzz2且切斷wzzl來產生。或者在替代方案中，經修飾之醣可藉由表現(未必過度表現) wzz/fepE且切斷wzzB來產生。在另一實施例中，經修飾之醣可藉由表現(未必過度表現) wzzB但切斷wzz/fepE來產生。在另一實施例中，經修飾之醣可藉由表現fepE來產生。較佳地，wzz家族蛋白係衍生自對於宿主細胞而言異源的菌株。測定醣長度之方法為此項技術中已知的。此類方法包括(但不限於)核磁共振、質譜分析及尺寸排阻層析法。用於產生本文中所描述之含有中等或長O-抗原鏈的高分子量醣(諸如脂多醣)的方法描述於PCT國際公開案第WO2020/039359及對應美國公開案第US2020/0061177號中，其各自以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，醣藉由表現具有與以下中之任一者具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列之wzz家族蛋白來產生：SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120及SEQ ID NO: 121。在一個實施例中，wzz家族蛋白包括選自以下中之任一者的序列：SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120及SEQ ID NO: 121。較佳地，wzz家族蛋白與SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，醣藉由表現具有與fepE蛋白具有至少30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列之蛋白來產生。

在一個態樣中，本發明係關於藉由在革蘭氏陰性細菌中表現wzz家族蛋白(較佳為fepE)以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣所產生的醣，該等醣與對應野生型O-多醣相比，增加至少1、2、3、4或5個重複單元。在一個態樣中，本發明係關於由培養物中之革蘭氏陰性細菌所產生之醣，該等培養物表現(未必過度表現)來自革蘭氏陰性細菌之wzz家族蛋白(例如wzzB)以產生含有中等或長O-抗原鏈的高分子量醣，該等醣與對應野生型O-抗原相比，增加至少1、2、3、4或5個重複單元。對於與對應野生型醣相比重複單元之數目增加的其他例示性醣，參見下文對O-多醣及O-抗原之描述。所需鏈長為在給定疫苗構築體之情形下產生改良或最大免疫原性之鏈長。

在另一實施例中，醣包括選自表A之任一式，其中醣中之重複單元之數目n比對應野生型O-多醣中之重複單元之數目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多個重複單元。較佳地，與對應野生型O-多醣相比，醣包括增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元。測定醣長度之方法為此項技術中已知的。此類方法包括核磁共振、質譜分析及尺寸排阻層析法。

在一個較佳實施例中，本發明係關於在重組大腸桿菌宿主細胞中產生之醣，其中將內源性wzz O-抗原長度調節子(例如wzzB)之基因缺失且用來自對重組大腸桿菌宿主細胞而言為異源的革蘭氏陰性細菌之(第二) wzz基因(例如沙門氏菌fepE)置換，以產生含有中等或長O-抗原鏈之高分子量醣，諸如脂多醣。在一些實施例中，重組大腸桿菌宿主細胞包括來自沙門氏菌，較佳為來自腸道沙門氏菌之wzz基因。

在一個實施例中，宿主細胞包括wzz家族蛋白之異源基因作為穩定維持的質體載體。在另一實施例中，宿主細胞包括wzz家族蛋白之異源基因作為宿主細胞之染色體DNA中之經整合之基因。在大腸桿菌宿主細胞中穩定表現質體載體之方法及將異源基因整合至大腸桿菌宿主細胞之染色體中之方法為此項技術中已知的。在一個實施例中，宿主細胞包括O-抗原之異源基因作為穩定維持的質體載體。在另一實施例中，宿主細胞包括O-抗原之異源基因作為宿主細胞之染色體DNA中之經整合之基因。在大腸桿菌宿主細胞及沙門氏菌宿主細胞中穩定表現質體載體之方法為此項技術中已知的。將異源基因整合至大腸桿菌宿主細胞及沙門氏菌宿主細胞之染色體中之方法為此項技術中已知的。

在一個態樣中，在包含碳源之培養基中培養重組宿主細胞。用於培養大腸桿菌之碳源為此項技術中已知的。例示性碳源包括糖醇、多元醇、醇醛糖或酮糖，包括(但不限於)阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麥芽糖、甘露糖醇、甘露糖、鼠李糖、棉籽糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸酯、丁二酸酯及甲胺。在一個較佳實施例中，培養基包括葡萄糖。在一些實施例中，培養基包括多元醇或醇醛糖作為碳源，例如甘露糖醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨糖醇、乳糖及阿拉伯糖。可在開始培養之前，向培養基中添加全部碳源，或可在培養期間逐步地或連續添加碳源。

用於重組宿主細胞之例示性培養基包括選自以下中之任一者之成分(element)：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。較佳地，培養基包括KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。

本文中所使用之培養基可為固體或液體、合成(亦即，人造)或天然的，且可包括用於培養重組宿主細胞之足夠的營養物質。較佳地，培養基為液體培養基。

在一些實施例中，培養基可進一步包括適合的無機鹽。在一些實施例中，培養基可進一步包括微量營養物質。在一些實施例中，培養基可進一步包括生長因子。在一些實施例中，培養基可進一步包括額外碳源。在一些實施例中，培養基可進一步包括適合的無機鹽、微量營養物質、生長因子及補充碳源。適合於培養大腸桿菌之無機鹽、微量營養物質、生長因子及補充碳源為此項技術中已知的。

在一些實施例中，培養基可視需要包括額外成分，諸如蛋白腖、N-Z胺、酶促大豆水解產物、額外酵母提取物、麥芽提取物、補充碳源及多種維生素。在一些實施例中，培養基不包括此類額外成分，諸如蛋白腖、N-Z胺、酶促大豆水解產物、額外酵母提取物、麥芽提取物、補充碳源及多種維生素。

適合的補充碳源之說明性實例包括(但不限於)其他碳水化合物，諸如葡萄糖、果糖、甘露糖醇、澱粉或澱粉水解產物、纖維素水解產物及糖蜜；有機酸，諸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸及反丁烯二酸；及醇類，諸如甘油、肌醇、甘露糖醇及山梨糖醇。

在一些實施例中，培養基進一步包括氮源。適合於培養大腸桿菌之氮源為此項技術中已知的。適合之氮源之說明性實例包括(但不限於)氨，包括氨氣及氨水；無機酸或有機酸之銨鹽，諸如氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、硫酸銨及乙酸銨；尿素；硝酸鹽或亞硝酸鹽及其他含氮材料，包括呈純的或粗製劑形式之胺基酸、肉提取物、蛋白腖、魚粉、魚水解產物、玉米漿、酪蛋白水解產物、大豆餅水解產物、酵母提取物、脫水酵母、乙醇-酵母餾出物、大豆粉、棉籽粉及其類似物。

在一些實施例中，培養基包括無機鹽。適合的無機鹽之說明性實例包括(但不限於)鉀、鈣、鈉、鎂、錳、鐵、鈷、鋅、銅、鉬、鎢及其他微量元素之鹽及磷酸鹽。

在一些實施例中，培養基包括適當的生長因子。適當的微量營養物質、生長因子及其類似物之說明性實例包括(但不限於)輔酶A、泛酸、吡哆醇-HCl、生物素、硫胺素、核黃素、黃素單核苷酸、黃素腺二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、葉酸、維生素B12、其他維生素、胺基酸(諸如半胱胺酸及羥脯胺酸)、鹼基(諸如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶)、硫代硫酸鈉、對胺基苯甲酸或r-胺基苯甲酸、菸鹼醯胺、次氮基乙酸鹽及其類似物，其呈純的或部分純化的化合物形式或存在於天然材料中。量可由熟習此項技術者根據此項技術中已知之方法及技術憑經驗測定。

在另一實施例中，本文中所描述之經修飾之醣(與對應野生型醣相比)以合成方式例如活體外產生。醣之合成產生或合成可有助於避免成本及時間密集型生產製程。在一個實施例中，醣以合成方式自適當保護之單醣中間產物合成，諸如藉由使用依序糖基化策略或依序糖基化與[3+2]阻斷合成策略之組合。舉例而言，硫苷及糖基三氯乙醯亞胺酯衍生物可用作糖基化中之糖基供體。在一個實施例中，以合成方式活體外合成之醣與藉由重組手段(諸如藉由操縱上文所描述之wzz家族蛋白)所產生之醣具有一致的結構。

(藉由重組或合成方式)所產生之醣包括衍生自任何大腸桿菌血清型之結構，包括(例如)以下大腸桿菌血清型中之任一者：O1 (例如O1A、O1B及O1C)、O2、O3、O4 (例如O4:K52及O4:K6)、O5 (例如O5ab及O5ac (菌株180/C3))、O6 (例如O6:K2; K13; K15及O6:K54)、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18 (例如O18A、O18ac、O18A1、O18B及O18B1)、O19、O20、O21、O22、O23 (例如O23A)、O24、O25 (例如O25a及O25b)、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45 (例如O45及O45rel)、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、62D1、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73 (例如O73 (菌株73-1))、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、0111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186及O187。

個別多醣通常經由此項技術中已知之方法來純化(與多醣-蛋白結合物之量相比增濃)，該等方法諸如透析、濃縮操作、透濾操作、切向流過濾、沈澱、溶離、離心、沈澱、超濾、深度過濾及/或管柱層析法(離子交換層析法、多模式離子交換層析法、DEAE及疏水性相互作用層析法)。較佳地，多醣經由包括切向流過濾之方法來純化。

經純化之多醣可經活化(例如化學活化)以使其能夠反應(例如直接與載體蛋白反應或經由諸如eTEC間隔子之連接子反應)，且隨後併入本發明之醣結合物中，如本文進一步描述。

在一個較佳實施例中，本發明之醣衍生自大腸桿菌血清型，其中血清型為O25a。在另一較佳實施例中，血清型為O25b。在另一較佳實施例中，血清型為O1A。在另一較佳實施例中，血清型為O2。在另一較佳實施例中，血清型為O6。在另一較佳實施例中，血清型為O17。在另一較佳實施例中，血清型為O15。在另一較佳實施例中，血清型為O18A。在另一較佳實施例中，血清型為O75。在另一較佳實施例中，血清型為O4。在另一較佳實施例中，血清型為O16。在另一較佳實施例中，血清型為O13。在另一較佳實施例中，血清型為O7。在另一較佳實施例中，血清型為O8。在另一較佳實施例中，血清型為O9。

如本文中所使用，提及上文所列之血清型中之任一者係指涵蓋此項技術中已知之重複單元結構(O-單元，如下文所描述)且對於對應血清型特有的血清型。舉例而言，術語「O25a」血清型(在此項技術中亦稱為血清型「O25」)係指涵蓋表 A中所顯示之式O25之血清型。作為另一實例，術語「O25b」血清型係指涵蓋表 A中所顯示之式O25b之血清型。

如本文中所使用，除非另外規定，否則血清型在本文中為一般所提及的，例如術語式「O18」一般係指涵蓋式O18A、式O18ac、式18A1、式O18B及式O18B1。

如本文中所使用，術語「O1」一般係指涵蓋包括根據表A之式名稱中的通用術語「O1」之式的物種，諸如式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C中之任一者，其中各者顯示於表A中。因此，「O1血清型」一般係指涵蓋式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C中之任一者之血清型。

如本文中所使用，術語「O6」一般係指包括根據表A之式名稱中的通用術語「O6」之式的物種，諸如式O6:K2；K13；K15；及O6:K54中之任一者，其中各者顯示於表A中。因此，「O6血清型」一般係指涵蓋式O6:K2；K13；K15；及O6:K54中之任一者之血清型。

術語之其他實例包括「O4」、「O5」、「O18」及「O45」，該等術語一般係指包括根據表A之式名稱中的通用術語之式的種類。

如本文中所使用，術語「O2」係指表A中所示之式O2。術語「O2 O-抗原」係指涵蓋表A中所示之式O2的醣。

如本文中所使用，提及來自上文所列之血清型之O-抗原係指涵蓋用對應血清型名稱標記之式的醣。舉例而言，術語「O25B O-抗原」係指涵蓋表A中所示之式O25B的醣。

作為另一實例，術語「O1 O-抗原」一般係指涵蓋包括術語「O1」，諸如式O1A、式O1A1、式O1B及式O1C (其中各者顯示於表A中)之式的醣。

作為另一實例，術語「O6 O-抗原」一般係指涵蓋包括術語「O6」，諸如式O6:K2；式O6:K13；式O6:K15及式O6:K54 (其中各者顯示於表A中)之式的醣。

如本文中所使用，術語「O-多醣」係指包括O-抗原之任何結構，其限制條件為該結構不包括全細胞或脂質A。舉例而言，在一個實施例中，O-多醣包括脂多醣，其中未結合脂質A。移除脂質A之步驟為此項技術中已知的，且舉例而言，包括在添加酸之情況下進行熱處理。例示性方法包括在100℃下用1%乙酸處理90分鐘。將此方法與分離已移除之脂質A的方法組合。用於分離脂質A之例示性方法包括超速離心。

在一個實施例中，O-多醣係指由O-抗原組成之結構，在此情況下，O-多醣與術語O-抗原同義。在一個較佳實施例中，O-多醣係指包括O-抗原之重複單元而不具有核心醣之結構。因此，在一個實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌K12核心部分。在另一較佳實施例中，O-多醣係指包括O-抗原及核心醣之結構。在另一實施例中，O-多醣係指包括O-抗原、核心醣及KDO部分之結構。

自LPS純化出包括核心寡醣之O-多醣的方法為此項技術中已知的。舉例而言，在純化LPS之後，經純化之LPS可藉由以下步驟來進行水解：在攝氏100度下於1% (v/v)乙酸中加熱90分鐘，隨後在攝氏4度下以142,000×g超速離心5小時。將含有O-多醣之上清液冷凍乾燥且儲存於攝氏4度下。在某些實施例中，描述使得能夠簡化O-多醣之純化的莢膜合成基因之缺失。

O-多醣可藉由包括(但不限於)弱酸水解以自LPS移除脂質A之方法來進行分離。其他實施例可包括使用肼作為用於製備O-多醣之試劑。可藉由此項技術中已知的方法來實現LPS之製備。

在某些實施例中，提供由表現(未必過度表現)Wzz蛋白(例如wzzB)之野生型、經修飾或滅毒革蘭氏陰性菌株純化之O-多醣，以用於結合物疫苗中。在較佳實施例中，自表現(未必過度表現) wzz蛋白之革蘭氏陰性菌株中純化出O-多醣鏈，以用作呈結合物或複合疫苗形式之疫苗抗原。

在一個實施例中，與對應野生型O-多醣相比，O-多醣之分子量增加約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多倍。在一個較佳實施例中，與對應野生型O-多醣相比，O-多醣之分子量增加至少1倍及至多5倍。在另一實施例中，與對應野生型O-多醣相比，O-多醣之分子量增加至少2倍及至多4倍。與對應野生型O-多醣相比，O-多醣之分子量增加較佳與O-抗原重複單元之數目增加相關。在一個實施例中，O-多醣之分子量增加係歸因於wzz家族蛋白。

在一個實施例中，與對應野生型O-多醣相比，O-多醣之分子量增加約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 kDa或更多。在一個實施例中，與對應野生型O-多醣相比，本發明之O-多醣之分子量增加至少1 kDa及至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少5 kDa及至多200 kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少18及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少21及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少22及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少30及至多200kDa。在一個實施例中，分子量增加至少1及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少5及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多100kDa。在一個實施例中，分子量增加至少1及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少5及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少15及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少18及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少30及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多90kDa。在一個實施例中，分子量增加至少12及至多85kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多75kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多70kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多60kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多50kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多49kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多48kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多47kDa。在一個實施例中，分子量增加至少10及至多46kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多45kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多44kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多43kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多42kDa。在一個實施例中，分子量增加至少20及至多41kDa。與對應野生型O-多醣相比，O-多醣之分子量之此種增加較佳與O-抗原重複單元之數目增加相關。在一個實施例中，O-多醣之分子量增加係歸因於wzz家族蛋白。

在另一實施例中，O-多醣包括選自表 A之任一式，其中O-多醣中之重複單元之數目 n比對應野生型O-多醣中之重複單元之數目多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多個重複單元。較佳地，與對應野生型O-多醣相比，醣包括增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元。

2. O - 抗原O-抗原為革蘭氏陰性細菌外膜中之脂多醣(LPS)之一部分。O-抗原在細胞表面上且為一種可變的細胞組份。O-抗原之可變性為革蘭氏陰性細菌之血清分型提供基礎。當前大腸桿菌血清分型方案包括O-多醣1至181。

O-抗原包括寡醣重複單元(O-單元)，其野生型結構通常含有來自大範圍糖之兩個至八個殘基。例示性大腸桿菌O-抗原之O-單元描述於表 A及PCT國際公開案第WO2021/084429號中，2021年5月6日公開，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本發明包括組合物，其包含如表 A中及PCT國際公開案第WO2021/084429號(2021年5月6日公開，其以全文引用之方式併入本文中)中所描述之至少一種FimH突變體多肽及至少一種O-抗原。

在一個實施例中，本發明之醣可為一個寡醣單元。在一個實施例中，本發明之醣為相關血清型之一個重複寡醣單元。在此類實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97及式O101中之任一者的結構。在另一實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6及式O25b中之任一者的結構。

在一個實施例中，本發明之醣可為寡醣。寡醣具有較低數目之重複單元(通常為5-15個重複單元)且通常以合成方式或藉由多醣之水解得到。在此類實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6、式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O25b、式O52、式O97及式O101中之任一者的結構。在另一實施例中，醣可包括選自式O1a、式O2、式O6及式O25b中之任一者的結構。

較佳地，本發明及本發明之免疫原性組合物中之所有醣為多醣。高分子量多醣可由於存在於抗原表面上之抗原決定基而誘導某些抗體免疫反應。較佳地涵蓋高分子量多醣之分離及純化，以用於本發明之結合物、組合物及方法中。

在一些實施例中，各個別O-抗原聚合物中之重複O單元之數目(且因此聚合物鏈之長度及分子量)視wzz鏈長調節子(一種內膜蛋白)而定。不同wzz蛋白賦予不同範圍之模態長度(4至＞100個重複單元)。術語「模態長度」係指重複O-單元之數目。革蘭氏陰性細菌通常具有賦予兩種不同OAg模態鏈長(一個較長且一個較短)之兩種不同Wzz蛋白。革蘭氏陰性細菌中之wzz家族蛋白(例如wzzB)之表現(未必過度表現)可允許操縱O-抗原長度，以轉變或改變某些長度範圍之O-抗原之細菌產生及以增強高產率大分子量脂多醣之產生。在一個實施例中，如本文中所使用之「短」模態長度係指較低數目之重複O-單元，例如1-20個。在一個實施例中，如本文中所使用之「長」模態長度係指大於20個且至多最大為40個之重複O-單元之數目。在一個實施例中，如本文中所使用之「極長」模態長度係指大於40個重複O-單元。

在一個實施例中，與對應野生型O-多醣相比，所產生之醣增加至少10個重複單元、15個重複單元、20個重複單元、25個重複單元、30個重複單元、35個重複單元、40個重複單元、45個重複單元、50個重複單元、55個重複單元、60個重複單元、65個重複單元、70個重複單元、75個重複單元、80個重複單元、85個重複單元、90個重複單元、95個重複單元或100個重複單元。

在另一實施例中，與對應野生型O-多醣相比，本發明之醣增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多個重複單元。較佳地，與對應野生型O-多醣相比，醣包括增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個重複單元。參見例如表 21。測定醣長度之方法為此項技術中已知的。此類方法包括核磁共振、質譜分析及尺寸排阻層析法，如實例 13中所描述。

測定醣中之重複單元數目之方法亦為此項技術中已知的。舉例而言，重複單元數目(或式中之「 n」)可藉由以下來計算：將多醣之分子量(不含核心醣或KDO殘基之分子量)除以重複單元之分子量(亦即例如表 1中所示之對應式中之結構之分子量，其可理論上計算為式內各單醣之分子量之總和)。式內各單醣之分子量為此項技術中已知的。式O25b之重複單元之分子量例如為約862 Da。式O1a之重複單元之分子量例如為約845 Da。式O2之重複單元之分子量例如為約829 Da。式O6之重複單元之分子量例如為約893 Da。當測定結合物中之重複單元之數目時，將載體蛋白分子量及蛋白:多醣比率納入計算中。如本文所定義，「 n」係指多醣分子中之重複單元( 表 1中之括號中所表示)之數目。如此項技術中已知，在生物學大分子中，重複結構中可穿插有不完全重複區，諸如遺失分支。另外，此項技術中已知，自天然來源(諸如細菌)分離及純化出之多醣在尺寸上及在分支上可為異質的。在此情況下， n可表示群體中之分子之 n之平均值或中位值。

在一個實施例中，與對應野生型O-多醣相比，O-多醣具有O-抗原之至少一個重複單元之增加。O-抗原之重複單元顯示於表 1中。在一個實施例中，O-多醣總共包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多個重複單元。較佳地，醣總共具有至少3個至至多80個重複單元。在另一實施例中，與對應野生型O-多醣相比，O-多醣具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或更多個重複單元之增加。

在一個實施例中，醣包括O-抗原，其中任何O-抗原式(諸如表1中所示之式(亦參見圖9A-圖9C及圖10A-圖10B))中之n為整數，且至少為1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40，且至多為200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。例示性範圍包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；及至少20至至多80，較佳為至多90。在一個較佳實施例中，n為至少31至至多90。在一個較佳實施例中，n為40至90，更佳為60至85。

在一個實施例中，醣包括O-抗原，其中O-抗原式中之任一者中之n為至少1且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少5且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少10且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少25且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少50且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少75且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少100且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少125且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少150且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少175且至多200。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少1且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少5且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少10且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之n為至少25且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少75且至多100。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少1且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少5且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少10且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少20且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少25且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少30且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少40且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少50且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少30且至多90。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多85。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多75。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多70。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多60。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多50。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多49。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多48。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多47。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少35且至多46。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少36且至多45。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少37且至多44。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少38且至多43。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少39且至多42。在一個實施例中，O-抗原式中之任一者中之 n為至少39且至多41。

舉例而言，在一個實施例中，醣中之 n為31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90，最佳為40。在另一實施例中， n為至少35至至多60。舉例而言，在一個實施例中， n為以下中之任一者：35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59及60，較佳為50。在另一較佳實施例中， n為至少55至至多75。舉例而言，在一個實施例中， n為55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69，最佳為60。

醣結構可藉由此項技術中已知之方法及工具測定，諸如NMR，包括1D、1H及/或13C、2D TOCSY、DQF-COSY、NOESY及/或HMQC。

在一些實施例中，在結合之前經純化之多醣具有5 kDa至400 kDa之分子量。在其他此類實施例中，醣具有以下之分子量：10 kDa至400 kDa；5 kDa至400 kDa；5 kDa至300 kDa；5 kDa至200 kDa；5 kDa至150 kDa；10 kDa至100 kDa；10 kDa至75 kDa；10 kDa至60 kDa；10 kDa至40 kDa；10 kDa至100 kDa；10 kDa至200 kDa；15 kDa至150 kDa；12 kDa至120 kDa；12 kDa至75 kDa；12 kDa至50 kDa；12至60 kDa；35 kDa至75 kDa；40 kDa至60 kDa；35 kDa至60 kDa；20 kDa至60 kDa；12 kDa至20 kDa；或20 kDa至50 kDa。在其他實施例中，多醣具有以下之分子量：7 kDa至15 kDa；8 kDa至16 kDa；9 kDa至25 kDa；10 kDa至100；10 kDa至60 kDa；10 kDa至70 kDa；10 kDa至160 kDa；15 kDa至600 kDa；20 kDa至1000 kDa；20 kDa至600 kDa；20 kDa至400 kDa；30 kDa至1,000 Kda；30 kDa至60 kDa；30 kDa至50 kDa or 5 kDa至60 kDa。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

如本文中所使用，多醣或載體蛋白-多醣結合物之術語「分子量」係指藉由尺寸排阻層析法(SEC)與多角度雷射光散射偵測器(MALLS)組合所計算之分子量。

多醣之尺寸在正常純化程序期間可變得略微減小。另外，如本文中所描述，可在結合之前對多醣進行尺寸測定技術。可採用機械或化學尺寸測定。可使用乙酸進行化學水解。可使用高壓均質化剪切來進行機械尺寸測定。上文提及之分子量範圍係指在結合之前(例如在活化之前)之經純化之多醣。

表 A ：大腸桿菌血清組 / 血清型及 O - 單元部分

血清組 / 血清型	部分結構 (O - 單元 )	部分結構在本文中被稱為：
O1A、O1A1	[→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1A
O1B	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→\|β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1B
O1C	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→\|β-D-ManNAc-(1→2) ] _n	式O1C
O2	[→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Fuc3Nac-(1→2) ] _n	式O2
O3	[β-L-RhaNAc(1→4)α-D-Glc-(1→4)\| \| →3)-β-D-GlcNAc-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O3
O4:K52	[→2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O4:K52
O4:K6	[α-D-Glc-(1→3) \| →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O4:K6
O5ab	[→4)-β-D-Qui3Nac-(1→3)-β-D-Rib f-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc(1→] _n	式O5ab
O5ac (菌株180/C3)	[→2)-β-D-Qui3Nac-(1→3)-β-D-Rib f-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc(1→ ] _n	式O5ac (菌株180/C3)
O6:K2；K13；K15	[→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→2) ] _n	式O6:K2；K13；K15
O6:K54	[→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→\|β-D-GlcNAc-(1→2) ] _n	式O6:K54
O7	[α-L-Rha-(1→3) \| →3)-β-D-Qui4Nac-(1→2)-α-D-Man-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O7
O10	[→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Fuc4Nacyl-(1→2) Acyl=acetyl (60%) or I-3-羥丁醯基(40%) ] _n	式O10
O16	[→2)-β-D-Gal f-(1→6)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-Rha2Ac-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O16
O17	[α-D-Glc-(1→6) \| →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O17
O18A、O18ac	[→2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O18A、式O18ac
O18A1	[α-D-Glc-(1→6) \| →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O18A1
O18B	[→3)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→3) ] _n	式O18B
O18B1	[α-D-Glc-(1→4) \| →3)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Glc-(1→3) ] _n	式O18B1
O21	[β-D-Gal-(1→4) \| →3)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→2) ] _n	式O21
O23A	[α-D-Glc-(1→6) \| →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc(1→3) ] _n	式O23A
O24	[→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-D-Glc-(1→2) ] _n	式O24
O25/O25a	[β-D-Glc-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-L-Rha-(1→3) ] _n	式O25a
O25b	β-Glc p- 1 ↓ 6 [α-Rha p-(1→3)-α-Glc p-(1→3)-α-Rha p2Oac-(1→3)-β-Glc pNAc-] _n	式O25b
O26	[ →3)-α-L-Rha-(1→4)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O26
O28	[ →2)-I-Gro-1- P→4)-β-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-Gal f2Ac-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O28
O36	[α-L-Rha p-(1→2)-α-L-Fuc p1 ↓ 3 →4)-α-D-Man p-(1→3)-α-L-Fuc p-(1→3)-β-D-Glc pNAc-(1→] n	式O36
O44	[ α-D-Glc-(1→4) \| →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O44
O45	[ →2)-β-D-Glc-(1→3)-α-L-6dTal2Ac-(1→3)-α-D-FucNAc-(1→ ] _n	式O45
O45rel	[ →2)-β-D-Glc-(1→3)-α-L-6dTal2Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O45rel
O54	[→4)-α-d-Gal pA-(1 → 2)-α-l-Rha p-(1 → 2)-β-d-Rib f-(1 → 4)-β-d-Gal p-(1 → 3)-β-d-Glc pNAc-(1→] n	式O54
O55	[ →6)-β-D-GlcNAc-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-Col-(1→2)-β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O55
O56	[ →7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-Gal-(1→2) ] _n	式O56
O57	[→3)-α-D-Gal p-(1→3)-α-L-Fuc pNAc-(1→3)-α-D-Glc pNAc-(1→] n	式O57
O58	[ 3- O-[I-1-羧乙基]-α-L-Rha -(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man2Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O58
O64	[ β-D-Gal-(1→6) \| →3)-α-D-ManNAc-(1→3)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O64
O68	→6)-α-D-Man p-(1→2)-α-D-Man p-(1→2)-α-D-Man p-(1→2)-β-D-Man p-(1→3)-α-D-Glc pNAC-(1→] n	式O68
O69	[ →2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O69
O73 (菌株73-1)	[ α-D-Glc-(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GalNAc(1→ ] _n	式O73 (菌株73-1)
O74		式O74
O75	[ β-D-Man-(1→4) \| →3)-α-D-Gal-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O75
O76	[→4)-β-D-Glc pA-(1→4)-β-D-Gal pNAc3Ac-(1→4)-α-D-Gal pNAc-(1→3)-β-D-Gal pNAc-(1→] n	式O76
O77	[ →6)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O77
O78	[ →4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O78
O86	[ α-D-Gal-(1→3) \| →4)-α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O86
O88	[ α-L-6dTal-(1→3) \| →4)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O88
O90	[ →4)-α-L-Fuc2/3Ac-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O90
O98	[ →3)-α-L-QuiNAc-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-α-L-QuiNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O98
O104	[ →4)-α-D-Gal-(1→4)-α-Neu5,7,9Ac ₃-(2→3)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] _n	式O104
O111	[ α-Col-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-Col-(1→3) ] _n	式O111
O113	[ →4)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O113
O114	[ →4)-β-D-Qui3N( N-乙醯基-L-絲胺醯基)-(1→3)-β-D-Rib f-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O114
O119	[ β-D-RhaNAc3Nfo-(1→3) \| →2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-Gal-(1→4)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O119
O121	[ →3)-β-D-Qui4N( N-乙醯基-甘胺醯基)-(1→4)-α-D-GalNAc3AcA6N-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O121
O124	[ 4- O-[I-1-羧乙基]-β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc(1→4) \|→3)-α-D-Gal-(1→6)-β-D-Gal f-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O124
O125	[ α-D-Glc-(1→3) \| →4)-β-D-GalNAc-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ \| β-D-Gal-(1→3) ] _n	式O125
O126	[ →2)-β-D-Man-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-L-Fuc-(1→2) ] _n	式O126
O127	[ →2)-α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O127
O128	[ α-L-Fuc-(1→2) \| →6)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O128
O136	[ →4)-β-Pse5Ac7Ac-(2→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→β-Pse5Ac7Ac=5,7-二乙醯胺基-3,5,7,9-四去氧-L- 甘油-β-L- 甘露-尤羅索尼克酸(nonulosonic acid) ] _n	式O136
O138	[ →2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O138
O140	[α-D-Gal f-(1→2)-α-L-Rha p1 ↓ 4 →3)-β-D-Gal p-(1→4)-α-D-Glc p-(1→4)-β-D-Glc pA-(1→3)-β-D-Gal pNAc-(1→] n	式O140
O141	[ α-L-Rha-(1→3) \|→4)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man6Ac-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| β-D-GlcA-(1→2) ] _n	式O141
O142	[ →2)-α-L-Rha-(1→6)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ \| β-D-GlcNAc-(1→3) ] _n	式O142
O143	[ →2)-β-D-GalA6R3,4Ac-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ R=1,3-二羥基-2-丙胺基] _n	式O143
O147	[ →2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→4)-β-D-GalA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O147
O149	[ →3)-β-D-GlcNAc-( S)-4,6Py-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ ( S)-4,6Py=4,6- O-[( S)-1-羧基亞乙基]- ] _n	式O149
O152	[ β-L-Rha-(1→4) \| →3)-α-D-GlcNAc-(1- P→6)-α-D-Glc-(1→2)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O152
O157	[ →2)-α-D-Rha4Nac-(1→3)-α-L-Fuc-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O157
O158	[ α-D-Glc-(1→6) \| →4)-α-D-Glc-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ \| α-L-Rha-(1→3) ] _n	式O158
O159	[ α-L-Fuc-(1→4) \| →3)-β-D-GlcNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O159
O164	[ β-D-Glc-(1→6)-α-D-Glc(1→4) \| →3)-β-D-Gal-(1→6)-β-D-Gal f-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→ ] _n	式O164
O173	[ α-L-Fuc-(1→4) \| →3)-α-D-Glc-(1- P→6)-α-D-Glc-(1→2)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→] _n	式O173
62D ₁建議為歐文氏菌( Erwinia herbicola)	[ α-D-Gal(1→6) \| →2)-β-D-Qui3Nac-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-FucNAc-(1→ ] _n	式62D ₁
O22	[ →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-GalNAc3Ac-(1→3)-α-D-Gal-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→] _n	式O22
O35	[ →3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ \| α-D-GalNAcA6N-(1→2) ] _n	式O35
O65	[ →2)-β-D-Qui3Nac-(1→4)-α-D-GalA6N-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GalA-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O65
O66	[ →2)-β-D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→2)-β-D-Glc3Ac-(1→3)-α-L-6dTal-(1→3)-α-D-GlcNAc(1→ ] _n	式O66
O83	[ →6)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→6)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O83
O91	[ →4)-α-D-Qui3Nacyl-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-GlcA6Ngly-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ Acyl=I-3-羥丁醯基] _n	式O91
O105	[ β-D-Rib f-(1→3) \|→4)-α-D-GlcA2Ac3Ac-(1→2)-α-L-Rha4Ac-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc6Ac-(1→ ] _n	式O105
O116	[ →2)-β-D-Qui4Nac-(1→6)-α-D-GlcNAc-(1→4)-α-D-GalNAc-(1→4)-α-D-GalA-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O116
O117	[ →4)-β-D-GalNAc-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-Glc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GalNAc-(1→] _n	式O117
O139	[ β-D-Glc-(1→3) \| →3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalA-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O139
O153	[ →2)-β-D-Rib f-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-α-D-GlcNAc-(1→4)-β-D-Gal-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O153
O167	[ α-D-Gal f-(1→4) \| →2)-β-D-GalA6N(L)Ala-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→2)-β-D-Gal f-(1→5)-β-D-Gal f-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O167
O172	[ →3)-α-L-FucNAc-(1→4)-α-D-Glc6Ac-(1- P→4)-α-D-Glc-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→ ] _n	式O172
O8	[ →2)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-β-D-Man-(1→ ] _n	式O8
O9a	[ →2)-α-D-Man-(1→2)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→ ] _n	式O9a
O9	[ →2)-[α-D-Man-(1→2)] ₂-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→ ] _n	式O9
O20ab	[ →2)-β-D-Rib f-(1→4)-α-D-Gal-(1→ ] _n	式O20ab
O20ac	[ α-D-Gal-(1→3) \| →2)-β-D-Rib f-(1→4)-α-D-Gal-(1→ ] _n	式O20ac
O52	[ →3)-β-D-Fuc f-(1→3)-β-D-6d manHep2Ac-(1→ ] _n	式O52
O97	[ →3)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→ \|\| β-D-Xul f-(2→2)β-D-Xul f-(2→2) ] _n	式O97

† β-D-6d manHep2Ac為2- O-乙醯基-6-去氧-β-D- 甘露-哌喃庚糖基。 ‡ β-D-Xul f為β-D- 蘇-呋喃戊糖基。

3. 核心寡醣核心寡醣位於野生型大腸桿菌LPS中之脂質A與O-抗原外區之間。更特定言之，核心寡醣為多醣之一部分，其包括野生型大腸桿菌中之O-抗原與脂質A之間的鍵。此鍵包括最內3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基之半縮酮官能基與脂質A之GlcNAc-殘基之羥基之間的酮糖鍵。在野生型大腸桿菌菌株中，核心寡醣區顯示較高程度之相似性。其通常包括有限數目之糖。核心寡醣包括內部核心區及外部核心區。

更特定言之，內部核心主要由L-甘油-D-甘露-庚醣(庚醣)及KDO殘基構成。內部核心具有高保守性。KDO殘基包括以下式KDO：

。

核心寡醣之外區比內部核心區展示更多變化，此區域中之差異區分大腸桿菌中之五種化學型：R1、R2、R3、R4及K-12。五種已知化學型之外部核心寡醣之碳水化合物主鏈的一般結構為此項技術中熟知的。HepII為內部核心寡醣之最後一個殘基。儘管所有外部核心寡醣共用結構主體，具有(己醣) ₃碳水化合物主鏈及兩個側鏈殘基，但主鏈中之己醣之次序及側鏈殘基之性質、位置及連接全部均可變化。R1與R4外部核心寡醣之結構高度相似，僅相差單個β-連接之殘基。

在此項技術中，基於遠端寡醣之結構，將野生型大腸桿菌之核心寡醣分成五種不同化學型：大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12。

在一個較佳實施例中，本文中所描述之組合物包括醣結合物，其中O-多醣包括與O-抗原結合之核心寡醣。在一個實施例中，組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者的免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少兩種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少三種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對至少四種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。在另一實施例中，組合物誘導針對全部五種核心大腸桿菌化學型之免疫反應。

在另一較佳實施例中，本文中所描述之組合物包括醣結合物，其中O-多醣不包括與O-抗原結合之核心寡醣。在一個實施例中，即使醣結合物具有不包括核心寡醣之O-多醣，此種組合物仍誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者之免疫反應。

可根據五種化學型中之一者來表徵大腸桿菌血清型。表B列舉根據化學型表徵之例示性血清型。呈粗體形式之血清型表示最常與所指示核心化學型相關之血清型。因此，在一個較佳實施例中，組合物誘導針對核心大腸桿菌化學型大腸桿菌R1、大腸桿菌R2、大腸桿菌R3、大腸桿菌R4及大腸桿菌K12中之至少任一者的免疫反應，該免疫反應包括分別針對對應大腸桿菌血清型中之任一者的免疫反應。表 B ：核心化學型及相關大腸桿菌血清型

核心化學型	血清型
R1	O25a、O6、 O2、 O1、O75、O4、 O16、O8、O18、O9、O13、O20、O21、O91及O163。
R2	O21、O44、O11、O89、O162、O9
R3	O25b、O15、O153、O21、O17、O11、O159、O22、O86、O93
R4	O2、O1、O86、O7、O102、O160、O166
K-12	O25b、O16

在一些實施例中，組合物包括醣，該醣包括衍生自具有R1化學型之血清型的結構，例如選自具有式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O8、式O18、式O9、式O13、式O20、式O21、式O91及式O163之醣，其中n為1至100。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括大腸桿菌R1核心部分。

在一些實施例中，組合物包括醣，該醣包括衍生自具有R1化學型之血清型的結構，例如選自具有式O25a、式O6、式O2、式O1、式O75、式O4、式O16、式O18、式O13、式O20、式O21、式O91及式O163之醣，其中n為1至100，較佳為31至100，較佳為31至90，更佳為35至90，最佳為35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括醣中之大腸桿菌R1核心部分。

在一些實施例中，組合物包括醣，該醣包括衍生自具有R2化學型之血清型的結構，例如選自具有式O21、式O44、式O11、式O89、式O162及式O9之醣，其中n為1至100，較佳為31至100，較佳為31至90，更佳為35至90，最佳為35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括大腸桿菌R2核心部分。

在一些實施例中，組合物包括醣，該醣包括衍生自具有R3化學型之血清型的結構，例如選自具有式O25b、式O15、式O153、式O21、式O17、式O11、式O159、式O22、式O86及式O93之醣，其中 n為1至100，較佳為31至100，較佳為31至90，更佳為35至90，最佳為35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括大腸桿菌R3核心部分。

在一些實施例中，組合物包括醣，該醣包括衍生自具有R4化學型之血清型的結構，例如選自具有式O2、式O1、式O86、式O7、式O102、式O160及式O166之醣，其中 n為1至100，較佳為31至100，較佳為31至90，更佳為35至90，最佳為35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括大腸桿菌R4核心部分。

在一些實施例中，組合物包括醣，該醣包括衍生自具有K12化學型之血清型的結構(例如，選自具有式O25b之醣及具有式O16之醣)，其中 n為1至1000，較佳為31至100，較佳為31至90，更佳為35至90，最佳為35至65。在一些實施例中，該組合物中之醣進一步包括大腸桿菌K-12核心部分。

在一些實施例中，醣包括核心醣。因此，在一個實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣進一步包括大腸桿菌K12核心部分。

在一些實施例中，醣不包括核心醣。因此，在一個實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R1核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R2核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R3核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌R4核心部分。在另一實施例中，O-多醣不包括大腸桿菌K12核心部分。

4. 結合之 O - 抗原O-抗原或較佳為O-多醣與蛋白載體之化學連接可提高O-抗原或O-多醣之免疫原性。然而，聚合物尺寸之可變性對生產造成實踐難題。在商業用途中，醣之尺寸可影響與不同結合合成策略之相容性、產物均一性及結合物免疫原性。經由操縱O-抗原合成路徑控制Wzz家族蛋白鏈長調節子之表現允許在多種革蘭氏陰性菌株(包括大腸桿菌)中產生所需長度之O-抗原鏈。

在一個實施例中，經純化之醣經化學活化以產生能夠與載體蛋白反應之經活化之醣。一旦活化，則各醣分別與載體蛋白結合，形成結合物，即醣結合物。如本文中所使用，術語「醣結合物」係指與載體蛋白共價連接之醣。在一個實施例中，醣直接與載體蛋白連接。在另一實施例中，醣經由間隔子/連接子與蛋白連接。

可藉由在沿O-抗原之一個位點處或在多個位點處將載體與O-抗原結合之方案，或藉由活化核心寡醣之至少一個殘基之方案，來製備結合物。

在一個實施例中，各醣與同一載體蛋白結合。若組合物中之2種或更多種醣之蛋白載體相同，則該等醣可與載體蛋白之同一分子結合(例如載體分子具有與其結合之2種或更多種醣)。

在一個較佳實施例中，醣各自獨立地與蛋白載體之不同分子結合(蛋白載體之各分子僅具有與其結合之一種類型的醣)。在該實施例中，醣被稱為獨立地與載體蛋白結合。

醣之化學活化及與載體蛋白之後續結合可藉由本文中所揭示之活化及結合方法來達成。在多醣與載體蛋白結合之後，藉由多種技術來純化(與多醣-蛋白結合物之量相比增濃)醣結合物。此等技術包括濃縮/透濾操作、沈澱/溶離、管柱層析法及深度過濾。在將個別醣結合物純化之後，將其進行混配以調配本發明之免疫原性組合物。

a. 活化 .本發明進一步係關於根據本文中所描述之任一實施例產生之經活化之多醣，其中用化學試劑對多醣進行活化以產生用於與連接子或載體蛋白結合之反應性基團。在一些實施例中，本發明之醣在與載體蛋白結合之前進行活化。在一些實施例中，活化程度不會顯著降低多醣之分子量。舉例而言，在一些實施例中，活化程度不會使多醣主鏈裂解。在一些實施例中，活化程度不會顯著影響結合程度，如藉由載體蛋白(諸如CRM ₁₉₇)中經修飾之離胺酸殘基之數目(如藉由胺基酸分析所測定)所量測。舉例而言，在一些實施例中，與在相同活化程度下在與參考多醣之結合物之載體蛋白中的經修飾之離胺酸殘基之數目相比，活化程度不會使載體蛋白中經修飾之離胺酸殘基之數目顯著增加3倍(如藉由胺基酸分析所測定)。在一些實施例中，活化程度不會增加未結合之游離醣之水準。在一些實施例中，活化程度不會降低最佳醣/蛋白比率。

在一些實施例中，經活化之醣具有活化百分比，其中硫醇莫耳數/經活化之醣之醣重複單元莫耳數在1-100%之間，諸如在2-80%之間，在2-50%之間，在3-30%之間及在4-25%之間。活化程度為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%或≥ 90%，或約100%。較佳地，活化程度為至多50%，更佳為至多25%。在一個實施例中，活化程度為至多20%。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。

在一個實施例中，多醣用1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)活化，形成氰酸酯。隨後，將經活化之多醣直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白(較佳為CRM ₁₉₇或破傷風類毒素)上之胺基偶合。

舉例而言，間隔子可為產生硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該硫醇化多醣可經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白(例如使用N-[Y-順丁烯二醯亞胺丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵基乙醯化之載體蛋白(例如使用76yophilized76e、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後獲得之硫醚鍵，而與載體偶合。在一個實施例中，將氰酸酯(視情況藉由CDAP化學方法製備)與己烷二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學方法，經由蛋白載體上之羧基，將胺基衍生醣與載體蛋白(例如CRM ₁₉₇)結合。

用於結合之其他適合的技術使用碳二醯亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣之游離羥基與CDI反應，隨後與蛋白反應以形成胺基甲酸酯鍵來形成。此可涉及將變旋異構端還原為一級羥基，視情況對該一級羥基進行保護/去除保護基，該一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間產物，且將CDI胺基甲酸酯中間產物與蛋白上之胺基偶合(CDI化學方法)。

b. 分子量.在一些實施例中，醣結合物包含具有10 kDa至2,000 kDa之分子量的醣。在其他實施例中，醣具有50 kDa至1,000 kDa之分子量。在其他實施例中，醣具有70 kDa至900 kDa之分子量。在其他實施例中，醣具有100 kDa至800 kDa之分子量。在其他實施例中，醣具有200 kDa至600 kDa之分子量。在其他實施例中，醣具有以下之分子量：100 kDa至1000 kDa；100 kDa至900 kDa；100 kDa至800 kDa；100 kDa至700 kDa；100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；150 kDa至1,000 kDa；150 kDa至900 kDa；150 kDa至800 kDa；150 kDa至700 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；200 kDa至1,000 kDa；200 kDa至900 kDa；200 kDa至800 kDa；200 kDa至700 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；200 kDa至300；250 kDa至1,000 kDa；250 kDa至900 kDa；250 kDa至800 kDa；250 kDa至700 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至1,000 kDa；300 kDa至900 kDa；300 kDa至800 kDa；300 kDa至700 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至1,000 kDa；400 kDa至900 kDa；400 kDa至800 kDa；400 kDa至700 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa。在一個實施例中，藉由單端結合產生具有此種分子量之醣結合物。在另一實施例中，藉由在水性緩衝液中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生具有此種分子量之醣結合物。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

在一些實施例中，本發明之醣結合物具有以下之分子量：400 kDa至15,000 kDa；500 kDa至10,000 kDa；2,000 kDa至10,000 kDa；3,000 kDa至8,000 kDa；或3,000 kDa至5,000 kDa。在其他實施例中，醣結合物具有500 kDa至10, 000 kDa之分子量。在其他實施例中，醣結合物具有1,000 kDa至8,000 kDa之分子量。在其他實施例中，醣結合物具有2,000 kDa至8,000 kDa或3,000 kDa至7,000 kDa之分子量。在其他實施例中，本發明之醣結合物具有以下之分子量：200 kDa至20,000 kDa；200 kDa至15,000 kDa；200 kDa至10,000 kDa；200 kDa至7,500 kDa；200 kDa至5,000 kDa；200 kDa至3,000 kDa；200 kDa至1,000 kDa；500 kDa至20,000 kDa；500 kDa至15,000 kDa；500 kDa至12,500 kDa；500 kDa至10,000 kDa；500 kDa至7,500 kDa；500 kDa至6,000 kDa；500 kDa至5,000 kDa；500 kDa至4,000 kDa；500 kDa至3,000 kDa；500 kDa至2,000 kDa；500 kDa至1,500 kDa；500 kDa至1,000 kDa；750 kDa至20,000 kDa；750 kDa至15,000 kDa；750kDa至12,500 kDa；750kDa至10,000 kDa；750kDa至7,500 kDa；750 kDa至6,000 kDa；750 kDa至5,000 kDa；750 kDa至4,000 kDa；750 kDa至3,000 kDa；750 kDa至2,000 kDa；750 kDa至1,500 kDa；1,000 kDa至15,000 kDa；1,000 kDa至12,500 kDa；1,000 kDa至10,000 kDa；1,000 kDa至7,500 kDa；1,000 kDa至6,000 kDa；1,000 kDa至5,000 kDa；1,000 kDa至4,000 kDa；1,000 kDa至2,500 kDa；2,000 kDa至15,000 kDa；2,000 kDa至12,500 kDa；2,000 kDa至10,000 kDa；2,000 kDa至7,500 kDa；2,000 kDa至6,000 kDa；2,000 kDa至5,000 kDa；2,000 kDa至4,000 kDa；或2,000 kDa至3,000 kDa。在一個實施例中，藉由本文中所描述之eTEC結合產生具有此種分子量之醣結合物。在另一實施例中，藉由還原胺化化學方法(RAC)產生具有此種分子量之醣結合物。在另一實施例中，藉由在DMSO中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生具有此種分子量之醣結合物。

在其他實施例中，本發明之醣結合物具有以下之分子量：1,000 kDa至20,000 kDa；1,000 kDa至15,000 kDa；2,000 kDa至10,000 kDa；2000 kDa至7,500 kDa；2,000 kDa至5,000 kDa；3,000 kDa至20,000 kDa；3,000 kDa至15,000 kDa；3,000 kDa至12,500 kDa；4,000 kDa至10,000 kDa；4,000 kDa至7,500 kDa；4,000 kDa至6,000 kDa；或5,000 kDa至7,000 kDa。在一個實施例中，藉由還原胺化化學方法(RAC)產生具有此種分子量之醣結合物。在另一實施例中，藉由在DMSO中進行之還原胺化化學方法(RAC)產生具有此種分子量之醣結合物。在另一實施例中，藉由本文中所描述之eTEC結合產生具有此種分子量之醣結合物。

在其他實施例中，本發明之醣結合物具有以下之分子量：5,000 kDa至20,000 kDa；5,000 kDa至15,000 kDa；5,000 kDa至10,000 kDa；5,000 kDa至7,500 kDa；6,000 kDa至20,000 kDa；6,000 kDa至15,000 kDa；6,000 kDa至12,500 kDa；6,000 kDa至10,000 kDa或6,000 kDa至7,500 kDa。

醣結合物之分子量可藉由SEC-MALLS來量測。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。本發明之醣結合物亦可由醣與載體蛋白之比率(重量/重量)表徵。在一些實施例中，醣結合物中之多醣與載體蛋白之比率(w/w)為0.5至3 (例如，約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0)。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為0.5至2.0、0.5至1.5、0.8至1.2、0.5至1.0、1.0至1.5或1.0至2.0。在其他實施例中，醣與載體蛋白之比率(w/w)為0.8至1.2。在一個較佳實施例中，結合物中之多醣與載體蛋白之比率為0.9至1.1。在一些此類實施例中，載體蛋白為CRM197。

醣結合物亦可由其分子尺寸分佈(Kd)表徵。可使用尺寸排阻層析培養基(CL-4B)測定結合物之相對分子尺寸分佈。在重力饋送柱中使用尺寸排阻層析法(SEC)以得到結合物之分子尺寸分佈概況。自培養基之孔中排除之大分子比小分子溶離得更快。使用溶離份收集器以收集管柱溶離液。藉由醣分析法來對溶離份進行比色測試。為了測定Kd，校準管柱以確立完全排除分子之分數(V0)，(Kd=0)；及表示最大保留之分數(vi)，(Kd=1)。達到指定樣品屬性之分數(Ve)係關於藉由以下表述之Kd：Kd = (Ve - Vo)/ (Vi - V0)。

c. 游離醣 .本發明之醣結合物及免疫原性組合物可包括未與載體蛋白共價結合但仍存在於醣結合物組合物中之游離醣。游離醣可未與醣結合物共價結合(亦即未共價結合於、吸附或包覆於其中)。在一個較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含至多50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之游離多醣。在一個較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含少於約25%之游離多醣。在一個較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含至多約20%之游離多醣。在一個較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含至多約15%之游離多醣。在另一較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含至多約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之游離多醣。在一個較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含少於約8%之游離多醣。在一個較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含至多約6%之游離多醣。在一個較佳實施例中，與多醣之總量相比，醣結合物包含至多約5%之游離多醣。

d. 共價連接.在其他實施例中，對於每5至10個醣重複單元；每2至7個醣重複單元；每3至8個醣重複單元；每4至9個醣重複單元；每6至11個醣重複單元；每7至12個醣重複單元；每8至13個醣重複單元；每9至14個醣重複單元；每10至15個醣重複單元；每2至6個醣重複單元；每3至7個醣重複單元；每4至8個醣重複單元；每6至10個醣重複單元；每7至11個醣重複單元；每8至12個醣重複單元；每9至13個醣重複單元；每10至14個醣重複單元；每10至20個醣重複單元；每4至25個醣重複單元或每2至25個醣重複單元，結合物在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。在常見實施例中，載體蛋白為CRM197。在另一實施例中，對於多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個醣重複單元，在載體蛋白與醣之間存在至少一個連接。在一個實施例中，載體蛋白為CRM197。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。

e. 離胺酸殘基 .表徵本發明之醣結合物之另一方式為藉由在載體蛋白(例如CRM ₁₉₇)中變得與醣結合之離胺酸殘基之數目來表徵，此可表徵為結合之離胺酸之範圍(結合程度)。可藉由胺基酸分析且使用熟習此項技術者已知之常規方法來獲得載體蛋白之離胺酸修飾(歸因於與多醣之共價連接)之證據。與用於產生結合物材料之載體蛋白起始物質相比，結合引起所回收之離胺酸殘基之數目減少。在一個較佳實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為：2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15或10至12。在一個實施例中，本發明之醣結合物的結合程度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在一個較佳實施例中，本發明之醣結合物之結合程度為4至7。在一些此類實施例中，載體蛋白為CRM ₁₉₇。

醣鏈與載體蛋白上之離胺酸之連接之頻率為表徵本發明之醣結合物之另一參數。舉例而言，在一些實施例中，對於多醣之每4個醣重複單元，在載體蛋白與多醣之間有至少一個共價連接。在另一實施例中，載體蛋白與多醣之間的共價連接在多醣之每10個醣重複單元中發生至少一次。在另一實施例中，載體蛋白與多醣之間的共價連接在多醣之每15個醣重複單元中發生至少一次。在另一實施例中，載體蛋白與多醣之間的共價連接在多醣之每25個醣重複單元中發生至少一次。

f. O - 乙醯化.在一些實施例中，本發明之醣為O-乙醯化的。在一些實施例中，醣結合物包含具有以下之O-乙醯化程度之醣：10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、75-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在其他實施例中，O-乙醯化程度為≥ 10%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%或≥ 90%，或約100%。O-乙醯化之%意謂給定醣相對於100% (其中各重複單元相對於其經乙醯化之結構為完全乙醯化的)之百分比。

在一些實施例中，藉由還原胺化來製備醣結合物。在一些實施例中，醣結合物為單端連接之結合醣，其中醣直接與載體蛋白共價結合。在一些實施例中，醣結合物經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白共價結合。

g. 還原胺化.在一個實施例中，醣藉由還原胺化與載體蛋白結合(諸如描述於美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2007/0231340號、第2007/0184071號及第2007/0184072號、WO 2006/110381、WO 2008/079653及WO 2008/143709中)。

還原胺化包括(1)醣之氧化以及(2)經活化之醣及載體蛋白之還原，以形成結合物。在氧化之前，視情況對醣進行水解。可採用機械或化學水解。可使用乙酸進行化學水解。

氧化步驟可涉及與過碘酸鹽反應。如本文中所使用之術語「過碘酸鹽/過碘酸(periodate)」係指過碘酸鹽(periodate)與過碘酸(periodic acid)兩者。該術語亦包括偏過碘酸根(IO4-)及原過碘根(IO65-)以及過碘酸之各種鹽(例如過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在一個實施例中，多醣係在存在偏過碘酸(鹽)之情況下，較佳在存在過碘酸鈉(NalO4)之情況下氧化。在另一實施例中，多醣係在存在原過碘酸(鹽)之情況下，較佳在存在過碘酸之情況下氧化。

在一個實施例中，氧化劑為穩定的硝醯基或氮氧自由基化合物，諸如哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物，在存在氧化劑之情況下選擇性氧化一級羥基。在該反應中，在催化循環中，實際氧化劑為N-氧銨鹽。在一個態樣中，該穩定的硝醯基或氮氧自由基化合物為哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物。在一個態樣中，該穩定的硝醯基或氮氧自由基化合物攜有TEMPO (2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL (2,2,5,5-四甲基-1-吡咯啶氧基)部分。在一個態樣中，該穩定的硝醯自由基化合物為TEMPO或其衍生物。在一個態樣中，該氧化劑為攜有N-鹵基部分之分子。在一個態樣中，該氧化劑係選自以下中之任一者：N-氯代琥珀醯亞胺、N-溴代琥珀醯亞胺、N-碘代琥珀醯亞胺、二氯異三聚氰酸(1,3,5-三氯-1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮)、二溴異三聚氰酸(1,3,5-三溴-1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮)及二碘異三聚氰酸(1,3,5-三碘-l,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮)。較佳地，該氧化劑為N-氯代琥珀醯亞胺。

在醣之氧化步驟之後，醣稱為經活化的且在本文之下文中被稱為「經活化」。經活化之醣及載體蛋白可獨立凍乾(冷凍乾燥)或一起凍乾(共同冷凍乾燥)。在一個實施例中，經活化之醣及載體蛋白為共同凍乾的。在另一實施例中，經活化之多醣及載體蛋白為獨立凍乾的。

在一個實施例中，凍乾在存在非還原糖之情況下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、海藻糖、棉籽糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖、甘露糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖醇。

結合程序之下一步驟為使用還原劑來還原經活化之醣及載體蛋白，以形成結合物(所謂的還原胺化)。適合的還原劑包括氰基硼氫化物，諸如氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉或硼氫化鈉或硼氫化鋅(在存在布朗斯特酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)之情況下)；胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe'PrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)、硼烷-吡啶或硼氫化物交換樹脂。在一個實施例中，還原劑為氰基硼氫化鈉。

在一實施例中，在水性溶劑(例如在6.0至8.5、7.0至8.0或7.0至7.5之pH下，選自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、二甘胺酸或HEPB)中進行還原反應；在另一實施例中，在非質子性溶劑中進行反應。在一實施例中，還原反應在DMSO (二甲亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。DMSO或DMF溶劑可用於將已凍乾之經活化之多醣及載體蛋白復原。

在還原反應結束時，結合物中可存在剩餘未反應之醛基，可使用適合的封端劑對此等醛基進行封端。在一個實施例中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH4)。在結合(還原反應及視情況存在之封端)之後，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術，來純化(與多醣-蛋白結合物之量相比增濃)醣結合物。此等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沈澱/溶離、管柱層析法(DEAE或疏水性相互作用層析法)及深度過濾。醣結合物可能藉由透濾及/或離子交換層析法及/或尺寸排阻層析法來純化。在一實施例中，醣結合物藉由透濾或離子交換層析法或尺寸排阻層析法來純化。在一個實施例中，對醣結合物進行無菌過濾。

在一個較佳實施例中，藉由還原胺化來製備來自選自O25b、O1a、O2及O6中之任一者之大腸桿菌血清型的醣結合物。在一個較佳實施例中，藉由還原胺化來製備來自大腸桿菌血清型O25b、O1a、O2及O6之醣結合物。

在一個態樣中，本發明係關於結合物，其包括與式O25B之醣連接之載體蛋白(例如CRM197)，該醣以下式表示：

，其中n為大於或等於1之任何整數。在一個較佳實施例中，n為至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40且至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50之整數。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。例示性範圍包括例如至少1至至多1000；至少10至至多500；及至少20至至多80。在一個較佳實施例中，n為至少31至至多90，更佳為40至90，最佳為60至85。

在另一態樣中，本發明係關於結合物，其包括與具有表A中所示之以下結構中之任一者之醣的載體蛋白，例如CRM197，其中n為大於或等於1之整數。

在不受理論或機制束縛之情況下，在一些實施例中，咸信穩定結合物需要一定水準之醣抗原修飾，該醣抗原修飾針與保持抗原之關鍵免疫原性抗原決定基之結構完整性進行平衡。

h. 醛之活化及形成.在一些實施例中，本發明之醣經活化且使得形成醛。在其中醣經活化之此類實施例中，活化百分比(%) (或氧化程度(DO))係指莫耳數醣重複單元莫耳數/經活化之多醣之醛。舉例而言，在一些實施例中，醣藉由多醣之重複單元上之鄰二醇之過碘酸氧化而經活化，從而使得形成醛。使過碘酸鈉相對於醣重複單元之莫耳當量(meq)及使氧化期間之溫度變化，引起氧化程度(DO)之水準變化。

醣及醛濃度通常藉由比色分析法來測定。替代性試劑為TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶1-烴氧基)與N-氯代琥珀醯亞胺(NCS)之組合，其引起自一級醇基形成醛。

在一些實施例中，經活化之醣具有氧化程度，其中經活化之醣之醛莫耳數/醣重複單元莫耳數為1-100，諸如2-80、2-50、3-30及4-25。活化程度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、≥ 20、≥ 30、≥ 40、≥ 50、≥ 60、≥ 70、≥ 80或≥ 90，或約100。較佳地，氧化程度(DO)為至少5且至多50，更佳為至少10且至多25。在一個實施例中，活化程度為至少10且至多25。可將任何最小值及任何最大值進行組合以界定範圍。氧化程度值可表示為活化百分比(%)。舉例而言，在一個實施例中，DO值為10係指在經活化之醣中，總共10個醣重複單元中有一個經活化之醣重複單元，在此情況下，DO值為10可表示為10%活化。

在一些實施例中，藉由還原胺化化學方法製備之結合物包括載體蛋白及醣，其中醣包括選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (株系180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (株系73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，結合物中之醣包括式，其中n為1至1000、5至1000，較佳為31至100或31至90，更佳為35至90，最佳為35至65之整數。

i. 單端連接之結合物.在一些實施例中，結合物為單端連接之結合醣，其中醣在醣之一端與載體蛋白共價結合。在一些實施例中，單端連接之結合多醣具有末端醣。舉例而言，若多醣之末端(末端醣殘基)中之一者與載體蛋白共價結合，則結合物為單端連接的。在一些實施例中，若多醣之末端醣殘基經由連接子與載體蛋白共價結合，則結合物為單端連接的。此類連接子可包括例如胱胺連接子(A1)、3,3'-二硫基雙(丙酸二醯肼)連接子(A4)及2,2'-二硫基-N,N'-雙(乙烷-2,1-二基)雙(2-(胺氧基)乙醯胺)連接子(A6)。

在一些實施例中，醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與載體蛋白結合，形成單端連接之結合物。

在一些實施例中，結合物較佳不為生物結合物。術語「生物結合物」係指蛋白(例如載體蛋白)與抗原，例如在宿主細胞背景中製備之O-抗原(例如O25B)之間的結合物，其中宿主細胞機制將抗原與蛋白連接(例如N-連接)。醣結合物包括生物結合物，以及藉由不需要在宿主細胞中製備結合物之方式(例如藉由蛋白與醣之化學連接來結合)來製備之糖抗原(例如寡醣及多醣)-蛋白結合物。

j. 經硫醇活化之醣 .在一些實施例中，本發明之醣為經硫醇活化的。在其中醣為經硫醇活化之此類實施例中，活化百分比(%)係指硫醇莫耳數/經活化之多醣之醣重複單元。醣及硫醇濃度通常藉由用於硫氫基定量之埃爾曼分析法(Ellman's assay)來測定。舉例而言，在一些實施例中，醣包括用二硫化胺連接子活化2-酮-3-去氧辛酸(KDO)。在一些實施例中，醣經由二價異雙官能連接子(在本文中亦稱為「間隔子」)與載體蛋白共價結合。連接子較佳在醣與載體蛋白之間提供硫醚鍵，從而產生在本文中稱為「硫醚醣結合物」之醣結合物。在一些實施例中，連接子進一步提供胺基甲酸酯及醯胺鍵，諸如(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)。

在一些實施例中，單端連接之結合物包括載體蛋白及醣，其中醣包括選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (株系180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (株系73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，結合物中之醣包括式，其中n為1至1000、5至1000，較佳為31至100，更佳為35至90，最佳為35至65之整數。

舉例而言，在一個實施例中，單端連接之結合物包括載體蛋白及醣，且醣具有選自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101之結構，其中n為1至10之整數。

5. eTEC 結合物在一個態樣中，本發明大體上係關於醣結合物，其包含衍生自上文所描述之大腸桿菌之醣，該醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子(例如，如在美國專利9517274及國際專利申請公開案WO2014027302中所描述，其以全文引用之方式併入本文中)與載體蛋白共價結合，包括包含此類醣結合物之免疫原性組合物；及用於製備此類醣結合物及免疫原性組合物之方法以及其用途。該等醣結合物包含經由一或多個eTEC間隔子與載體蛋白共價結合之醣，其中醣經由胺基甲酸酯鍵與eTEC間隔子共價結合，且其中載體蛋白經由醯胺鍵與eTEC間隔子共價結合。eTEC間隔子包括七個線性原子(亦即-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)，且在醣與載體蛋白之間提供穩定硫醚及醯胺鍵。

本發明之eTEC連接之醣結合物可由以下通式(I)表示：

(I)，其中包含eTEC間隔子之原子含於中心方框中。

在本發明之該等醣結合物中，醣可為多醣或寡醣。

併入本發明之醣結合物中之載體蛋白係選自一般適合於此類目的之如本文進一步描述或熟習此項技術者已知之載體蛋白的群組。在特定實施例中，載體蛋白為CRM197。

在另一態樣中，本發明提供製備包含本文中所描述之經由eTEC間隔子與載體蛋白結合之醣的醣結合物之方法，該方法包含以下步驟：a)在有機溶劑中，使醣與碳酸衍生物反應以產生經活化之醣；b)使經活化之醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使硫醇化醣與還原劑反應，以產生包含一或多個游離硫氫基殘基的經活化之硫醇化醣；d)使經活化之硫醇化醣與包含一或多個α-鹵乙醯胺基的經活化之載體蛋白反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白結合物；及e)使硫醇化醣-載體蛋白結合物與以下物質反應：(i)能夠對經活化之載體蛋白的未結合之α-鹵乙醯胺基團封端的第一封端試劑；及/或(ii)能夠對經活化之硫醇化醣的未結合之游離硫氫基殘基封端的第二封端試劑；由此產生eTEC連接之醣結合物。

在常見實施例中，碳酸衍生物為1,1'-羰基-二(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)。較佳地，碳酸衍生物為CDT，且有機溶劑為極性非質子溶劑，諸如二甲亞碸(DMSO)。在較佳實施例中，藉由經活化之醣與雙功能對稱硫烷基胺試劑、胱胺或其鹽反應，來產生硫醇化醣。或者，可藉由經活化之醣與半胱胺或其鹽反應，來形成硫醇化醣。藉由本發明之方法產生的eTEC連接之醣結合物可由通式(I)表示。

在常見實施例中，第一封端試劑為N-乙醯基-L-半胱胺酸，其與載體蛋白之離胺酸殘基上的未結合之α-鹵乙醯胺基團反應，形成經由硫醚鍵與經活化之離胺酸殘基共價連接的S-羧甲基半胱胺酸(CMC)殘基。

在其他實施例中，第二封端試劑為碘乙醯胺(IAA)，其與經活化之硫醇化醣的未結合之游離硫氫基反應，得到經封端之硫代乙醯胺。常見地，步驟e)包含用第一封端試劑及第二封端試劑進行封端。在某些實施例中，步驟e)包含用作為第一封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸及作為第二封端試劑之IAA進行封端。

在一些實施例中，封端步驟e)進一步包含在與第一及/或第二封端試劑反應之後，與還原劑(例如DTT、TCEP或巰基乙醇)反應。

本發明之eTEC連接之醣結合物及免疫原性組合物可包括游離硫氫基殘基。在一些情況下，藉由本文中所提供之方法形成的經活化之硫醇化醣將包括多個游離硫氫基殘基，其中一些可能在結合步驟期間不經歷與載體蛋白之共價結合。藉由與硫醇反應性封端試劑(例如碘乙醯胺(IAA))反應，對此類殘餘游離硫氫基殘基進行封端，以將潛在反應性官能基封端。亦涵蓋其他硫醇反應性封端試劑，例如含有順丁烯二醯亞胺之試劑及其類似試劑。

另外，本發明之eTEC連接之醣結合物及免疫原性組合物可包括殘餘的未結合之載體蛋白，其可包括已在封端處理步驟期間經受修飾之經活化之載體蛋白。

在一些實施例中，步驟d)進一步包含在使經活化之硫醇化醣與經活化之載體蛋白反應之前，提供包含一或多個α-鹵乙醯胺基團的經活化之載體蛋白。在常見實施例中，經活化之載體蛋白包含一或多個α-溴乙醯胺基團。

在另一態樣中，本發明提供一種eTEC連接之醣結合物，其包含本文中所描述之經由根據本文中所揭示之方法中之任一者產生的eTEC間隔子與載體蛋白結合的醣。

在一些實施例中，載體蛋白為CRM197，且經由eTEC間隔子在CRM197與多醣之間的共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中發生至少一次。

對於本發明之態樣中之各者，在本文中所描述之方法及組合物之特定實施例中，eTEC連接之醣結合物包含本文中所描述之醣，諸如衍生自大腸桿菌之醣。

在另一態樣中，本發明提供預防、治療或改善個體中之細菌感染、疾病或病狀之方法，其包含向個體投與免疫有效量的本發明之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含有包含本文中所描述之醣的eTEC連接之醣結合物。在一些實施例中，醣衍生自大腸桿菌。

在一些實施例中，eTEC連接之醣結合物包含載體蛋白及醣，其中該醣包含選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，結合物中之醣包括式，其中n為1至1000、5至1000，較佳為31至100，更佳為35至90，最佳為35至65之整數。

變為與醣結合之載體蛋白中之離胺酸殘基的數目可表徵為結合之離胺酸之範圍。舉例而言，在免疫原性組合物之一些實施例中，CRM ₁₉₇可包含39個離胺酸殘基中有4至16個與醣共價連接之殘基。表述此參數之另一方式為約10%至約41%之CRM ₁₉₇離胺酸與醣共價連接。在其他實施例中，CRM ₁₉₇可包含39個離胺酸殘基中有2至20個與醣共價連接之殘基。表述此參數之另一方式為約5%至約50%之CRM ₁₉₇離胺酸與醣共價連接。

在常見實施例中，載體蛋白為CRM ₁₉₇，且經由eTEC間隔子在CRM ₁₉₇與多醣之間的共價連接在多醣之每4、10、15或25個醣重複單元中發生至少一次。

在其他實施例中，對於每5至10個醣重複單元；每2至7個醣重複單元；每3至8個醣重複單元；每4至9個醣重複單元；每6至11個醣重複單元；每7至12個醣重複單元；每8至13個醣重複單元；每9至14個醣重複單元；每10至15個醣重複單元；每2至6個醣重複單元；每3至7個醣重複單元；每4至8個醣重複單元；每6至10個醣重複單元；每7至11個醣重複單元；每8至12個醣重複單元；每9至13個醣重複單元；每10至14個醣重複單元；每10至20個醣重複單元；或每4至25個醣重複單元，結合物在載體蛋白與醣之間包含至少一個共價連接。

在另一實施例中，對於多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個醣重複單元，在載體蛋白與醣之間存在至少一個連接。

6. 載體蛋白本發明之醣結合物之成分為與醣結合之載體蛋白。術語「蛋白載體」或「載體蛋白」或「載體」可在本文中互換使用。對於標準結合程序而言，載體蛋白應為可改善的。

結合物之一個成分為與O-多醣結合之載體蛋白。在一個實施例中，結合物包括與O-多醣之核心寡醣結合之載體蛋白。在一個實施例中，結合物包括與O-多醣之O-抗原結合之載體蛋白。

術語「蛋白載體」或「載體蛋白」或「載體」可在本文中互換使用。對於標準結合程序而言，載體蛋白應為可改善的。

在一個較佳實施例中，結合物之載體蛋白係獨立地選自以下中之任一者：TT、DT、DT突變體(諸如CRM197)；流感嗜血桿菌(H.influenzae)蛋白D；PhtX、PhtD、PhtDE融合物(尤其WO 01/98334及WO 03/54007中所描述之彼等)；經解毒之肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin)；PorB、N19蛋白；PspA；OMPC；艱難梭菌(C. Difficile)之毒素A或毒素B及PsaA。在一實施例中，本發明之結合物之載體蛋白為DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明之結合物之載體蛋白為TT (破傷風類毒素)。在另一實施例中，本發明之結合物之載體蛋白為PD (流感嗜血桿菌蛋白D-參見例如EP 0 594 610 B)。在一些實施例中，載體蛋白包括聚(L-離胺酸) (PLL)。

在一個較佳實施例中，醣與CRM197蛋白結合。CRM197蛋白為一種無毒性形式之白喉毒素，但在免疫學上與白喉毒素無法區分。CRM197由受藉由產毒棒狀桿菌噬菌體β之亞硝基胍突變誘發產生之無毒噬菌體β197tox感染的棒狀白喉桿菌(C. diphtheriae)產生。CRM197蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但因結構基因中之單個鹼基變化(鳥嘌呤變為腺嘌呤)而與白喉毒素不同。此單個鹼基變化引起成熟蛋白中之胺基酸取代(麩胺酸取代甘胺酸)，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM197蛋白為醣之安全且有效的T細胞依賴性載體。

因此，在一些實施例中，本發明之結合物包括作為載體蛋白之CRM ₁₉₇，其中醣與CRM ₁₉₇共價連接。

在一個較佳實施例中，醣結合物之載體蛋白係選自由以下組成之群：DT (白喉毒素)、TT (破傷風類毒素)或TT之片段C、CRM197 (白喉毒素之無毒性但抗原相同之變異體)、其他DT突變體(諸如CRM176、CRM228、CRM 45 (Uchida等人, J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103或CRM107；及由Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins, Frankel編, Maecel Dekker Inc, 1992中描述之其他突變；Glu-148缺失或突變成Asp、Gln或Ser及/或Ala 158缺失或突變成GIy及US 4709017或US 4950740中所揭示之其他突變；至少一個或更多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變及US 5917017或US 6455673中所揭示之其他突變；或US 5843711中所揭示之片段；肺炎鏈球菌溶血素(Kuo等人(1995), Infect Immun 63; 2706-13)，包括以某種方式ply解毒，例如dPLY-GMBS (WO 04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-formol；PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE (WO 00/37105或WO 00/39299中所揭示之PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列)及Pht蛋白之融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E (WO 01/98334、WO 03/54007、WO2009/000826)、OMPC (腦膜炎球菌外膜蛋白-通常提取自奈瑟氏腦膜炎菌(N. meningitidis)血清群B-EP0372501)、PorB (來自奈瑟氏腦膜炎菌)、PD (流感嗜血桿菌蛋白D-參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫學上之功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471 177)、細胞介素、淋巴介質、生長因子或激素(WO 91/01146)、包含來自各種病原體衍生之抗原的多種人類CD4+ T細胞抗原決定基之人工蛋白(Falugi等人(2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824)，諸如N19蛋白(Baraldoi等人(2004) Infect lmmun 72; 4884-7)肺炎鏈球菌表面蛋白PspA (WO 02/091998)、鐵吸收蛋白(WO 01/72337)、艱難梭菌之毒素A或B (WO 00/61761)、運鐵蛋白結合蛋白、肺炎鏈球菌黏附蛋白(PsaA)、重組綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A (特定言之其無毒性突變體(諸如攜有麩胺酸553處之取代的外毒素A (Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971))。其他蛋白，諸如卵白蛋白、匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin；KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之純化蛋白衍生物(PPD)亦可用作載體蛋白。其他適合的載體蛋白包括滅活細菌毒素，諸如霍亂類毒素(例如，如國際專利申請案第WO 2004/083251號中所描述)，即大腸桿菌LT、大腸桿菌ST及來自綠膿桿菌之外毒素A。

在一些實施例中，載體蛋白選自以下中之任一者：例如CRM197、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、鞭毛蛋白、金黃色葡萄球菌(S. aureus)之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B子單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌(C. jejuni) AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。在一個實施例中，載體蛋白為經解毒之綠膿桿菌外毒素(EPA)。在另一實施例中，載體蛋白不為經解毒之綠膿桿菌外毒素(EPA)。在一個實施例中，載體蛋白為鞭毛蛋白。在另一實施例中，載體蛋白不為鞭毛蛋白。

在一個較佳實施例中，醣結合物之載體蛋白係獨立地選自由以下組成之群：TT、DT、DT突變體(諸如CRM197)、流感嗜血桿菌蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(尤其WO 01/98334及WO 03/54007中所描述之彼等)、經解毒之肺炎鏈球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、艱難梭菌之毒素A或毒素B及PsaA。在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為TT (破傷風類毒素)。在另一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為PD (流感嗜血桿菌蛋白D-參見例如EP 0 594 610 B)。

在一個較佳實施例中，本發明之莢膜醣與CRM197蛋白結合。CRM197蛋白為一種無毒性形式之白喉毒素，但在免疫學上與白喉毒素無法區分。CRM197由受藉由產毒棒狀桿菌噬菌體β之亞硝基胍突變誘發產生之無毒噬菌體β197tox感染的棒狀白喉桿菌產生(Uchida, T.等人, 1971, Nature New Biology 233:8-11)。CRM197蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但因結構基因中之單個鹼基變化(鳥嘌呤變為腺嘌呤)而與其不同。此單個鹼基變化引起成熟蛋白中之胺基酸取代(麩胺酸取代甘胺酸)，且消除白喉毒素之毒性特性。CRM197蛋白為醣之安全且有效的T細胞依賴性載體。關於CRM197及其產生之其他細節可例如見於US 5,614,382中。

因此，在常見實施例中，本發明之醣結合物包含作為載體蛋白之CRM197，其中莢膜多醣與CRM197共價連接。

在另一實施例中，醣結合物之載體蛋白為SCP (鏈球菌C5a肽酶)。β-溶血性鏈球菌之所有人類分離株產生尤其使C5a不活化之具有高保守性的細胞壁蛋白SCP (鏈球菌C5a肽酶)。scp基因編碼含有1,134至1,181個胺基酸之多肽(Brown等人, PNAS, 2005, 第102卷, 第51號, 第18391-18396頁)。前31個殘基為輸出信號前序列且在穿過細胞質膜時被移除。隨後68個殘基充當後序列且必須經移除以產生活性SCP。隨後10個殘基可在不存在蛋白酶活性損失之情況下移除。在另一端，自Lys-1034開始為四個連續的17個殘基模體，隨後為細胞分選及細胞壁連接信號。此組合之信號由含有LPTTND序列之20個殘基親水性序列、17個殘基疏水性序列及較短的鹼性羧基端構成。

SCP可分為不同域(參見Brown等人, PNAS, 2005, 第102卷, 第51號, 第18391-18396頁之圖1B)。此等域為前域/後域(其包含輸出信號前序列(通常為前31個殘基)及後序列(通常為後68個殘基))、蛋白酶域(其分為兩部分(蛋白酶部分1，通常為殘基89-333/334；及蛋白酶域部分2，且通常為殘基467/468-583/584)、蛋白酶相關域(PA域)(通常為殘基333/334-467/468)、三個纖維結合蛋白III型(Fn)域(Fn1，通常為殘基583/584-712/713；Fn2，通常為殘基712/713-928/929/930；Fn3，通常為殘基929/930-1029/1030/1031)及細胞壁錨定域(通常為C端之殘基1029/1030/1031)。

在一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為來自GBS之SCP (SCPB)。SCPB之實例提供於WO97/26008之SEQ.ID.NO: 3。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 3。

在另一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為來自GAS之SCP (SCPA)。SCPA之實例可見於WO97/26008之SEQ.ID.NO:1及SEQ.ID.NO:2。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 1、2及23。

在另一實施例中，本發明之醣結合物之載體蛋白為如WO2014/136064之SEQ ID NO: 150或151中所闡述之SCP。

B. 佐劑在一些態樣中，本文中所揭示之免疫原性組合物可進一步包含至少一種、兩種或三種佐劑。術語「佐劑」係指增強針對抗原之免疫反應之化合物或混合物。抗原可主要充當遞送系統、主要充當免疫調節劑或具有兩者之強烈特徵。適合的佐劑包括適用於哺乳動物(包括人類)之佐劑。

已知可用於人類中之適合的遞送系統類型佐劑之實例包括(但不限於)明礬(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)、磷酸鈣、脂質體、水包油乳液(諸如MF59)(4.3% w/v角鯊烯、0.5% w/v聚山梨醇酯80 (Tween 80)、0.5% w/v脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、油包水乳液(諸如孟塔納(Montanide))及聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微米粒子或奈米粒子。

在一個態樣中，本文中所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之鋁鹽(明礬)(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)。在另一態樣中，本文中所揭示之免疫原性組合物包含作為佐劑之磷酸鋁或氫氧化鋁。在一個態樣中，本文中所揭示之免疫原性組合物包含0.1 mg/mL至1 mg/mL或0.2 mg/mL至0.3 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。在一個態樣中，本文中所揭示之免疫原性組合物包含約0.25 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。

已知可用於人類中之適合的免疫調節類型佐劑之實例包括(但不限於)來自阿奎拉(Aquilla)樹之樹皮之皂素提取物(QS21，Quil A)、TLR4促效劑(諸如MPL (單磷醯基脂質A)、3DMPL (3-O-去醯化MPL)或GLA-AQ)、LT/CT突變體、細胞介素(諸如多種介白素(例如IL-2、IL-12))或GM-CSF、AS01及其類似物。

已知可用於人類中之具有遞送及免疫調節特徵之適合的免疫調節類型佐劑之實例包括(但不限於)ISCOMS (參見例如Sjölander等人(1998) J. Leukocyte Biol. 64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 2006/134423及WO 2007/026190)或GLA-EM (其為TLR4促效劑與水包油乳液之組合)。

對於包括(但不限於)動物實驗之獸醫學應用，可使用弗氏完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant；CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)、Emulsigen、N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，被稱為去甲MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(CGP 19835A，被稱為MTP-PE)及RIBI，其在2%角鯊烯/Tween 80乳液中含有自細菌提取之三種成分(單磷醯基脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁構架(MPL+TDM+CWS))。

增強本文中所揭示之免疫原性組合物之效力的其他例示性佐劑包括(但不限於)(1)水包油乳液調配物(含或不含其他特異性免疫刺激劑，諸如胞壁醯基肽(參見下文)或細菌細胞壁成分)，諸如(a) SAF，含有10%角鯊烷、0.4% Tween 80、5%普洛尼克(pluronic)阻斷之聚合物L121及thr-MDP (微流化至次微米級乳液中或渦旋以產生較大粒度乳液)及(b) RIBI™佐劑系統(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.)，含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種細菌細胞壁成分(諸如單磷醯基脂質A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁構架(CWS)，較佳為MPL+CWS (DETOX™)；(2)可使用皂素佐劑，諸如QS21、STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.)、ABISCO® (Isconova, Sweden)或ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia)或自其產生之粒子，諸如ISCOM (免疫刺激複合物)，其中ISCOMS可不含額外清潔劑(例如WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐劑(CFA)及弗氏不完全佐劑(IFA)；(4)細胞介素，諸如介白素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 (例如，WO 99/44636))、干擾素(例如，γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯基脂質A (MPL)或3-O-去醯化MPL (3dMPL)(參見例如，GB2220211、EP0689454)(參見例如，WO 00/56358)；(6)3dMPL與以下之組合，例如QS21及/或水包油乳液(參見例如EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(參見例如，WO 99/52549)；(8)聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑與辛苯聚醇之組合(例如WO 01/21207)或聚環氧乙烷烷基醚或酯界面活性劑與至少一種額外的非離子型界面活性劑之組合(例如，WO 01/21152)；(9)皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(例如，WO 00/62800)；(10)免疫刺激劑及金屬鹽粒子(參見例如，WO 00/23105)；(11)皂素及水包油乳液(例如，WO 99/11241)；(12)皂素(例如，QS21)+3dMPL+IM2 (視情況+固醇)(例如，WO 98/57659)；(13)充當免疫刺激劑以增強組合物之功效的其他物質。胞壁醯基肽包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺MTP-PE)等。

在另一實施例中，佐劑為包含5.1 mg/mL QS-21、5 mM丁二酸鹽、60 mM NaCl、0.1% PS80 (pH 5.6)之脂質體皂皮樹-21 (Quillaja Saponaria-21；QS21)調配物。在另一實施例中，佐劑為脂質體單磷醯基脂質A (MPLA，合成，PHAD®，Avanti)調配物，其包含15 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.1)、4 mg/mL 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1 mg/mL膽固醇、0.2 mg/mL MPLA (批號00714551-0018-2XLipoMPL)，且具有藉由動態光散射測定之71 nm脂質體粒度。在另一實施例中，佐劑為脂質體MPLA/QS21調配物，其包含15 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.1)、4 mg/mL DOPC、1 mg/mL膽固醇、0.2 mg/mL MPLA及0.2 mg/mL QS-21 (批號00714551-0018-2XlipoMQ)，且具有藉由動態光散射測定的MPLA-QS21之75 nm粒度。

在本發明之另一態樣中，如本文中所揭示之免疫原性組合物包含CpG寡核苷酸作為佐劑。如本文中所使用之CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)，且因此除非另外指示，否則此等術語可互換使用。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有一或多個免疫刺激性CpG模體，其為未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸，視情況在某些較佳的鹼基背景內。CpG免疫刺激性模體之甲基化狀態通常係指二核苷酸中之胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸為含有藉由磷酸酯鍵與3'鳥嘌呤連接之5'未甲基化胞嘧啶且經由與Toll樣受體9 (TLR-9)結合而活化免疫系統的寡核苷酸。在另一實施例中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多個甲基化CpG二核苷酸，其將經由TLR9活化免疫系統但不如CpG模體之未甲基化強烈。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多個回文序列，其亦可涵蓋CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已在多個頒佈專利、公開專利申請案及其他公開案中描述，包括美國專利第6,194,388號；第6,207,646號；第6,214,806號；第6,218,371號；第6,239,116號；及第6,339,068號。

已鑑別出不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸。此等被稱為A、B、C及P類，且更詳細地描述於WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行。本發明之方法包括使用此等不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸。

V. 純化及產生方法在一個態樣中，本發明係關於產生經突變之FimH多肽之方法。此類方法可包括例如在適合的條件下培養哺乳動物細胞，藉此表現Fim H突變體多肽。方法可進一步包括自培養物收集多肽。方法可進一步包括純化多肽。

在一些態樣中，方法以約0.1 g/L至0.5 g/L之產率產生FimH突變體多肽。在一些態樣中，經突變之FimH多肽之產率為至少約1 mg/L、至少約2 mg/L、至少約3 mg/L、至少約4 mg/L、至少約5 mg/L、至少約6 mg/L、至少約7 mg/L、至少約8 mg/L、至少約9 mg/L、至少約10 mg/L、至少約11 mg/L、至少約12 mg/L、至少約13 mg/L、至少約14 mg/L、至少約15 mg/L、至少約16 mg/L、至少約17 mg/L、至少約18 mg/L、至少約19 mg/L、至少約20 mg/L、至少約25 mg/L、至少約30 mg/L、至少約35 mg/L、至少約40 mg/L、至少約45 mg/L、至少約50 mg/L、至少約55 mg/L、至少約60 mg/L、至少約65 mg/L、至少約70 mg/L、至少約75 mg/L、至少約80 mg/L、至少約85 mg/L、至少約90 mg/L、至少約95 mg/L或至少約100 mg/L。

在一些態樣中，適合於本發明之細胞培養為饋料批式培養。如本文中所使用，術語「饋料批式培養」係指培養細胞之方法，其中在培養過程開始之後某時或有時向培養物提供額外成分。此類所提供之成分通常包含用於在培養過程期間已經耗乏之細胞的營養成分。通常在某一時刻停止饋料批式培養且收集培養基中之細胞及/或成分且視情況進行分離。在一些態樣中，饋料批式培養包含補充有饋料培養基之基礎培養基。

在一些態樣中，細胞可在批式或饋料批式培養中生長，其中在足夠表現多肽之後終止培養，其後收集表現之多肽且視情況進行分離。在一些態樣中，細胞可在灌注培養中生長，其中培養並不終止且將新的營養物質及其他成分定期或連續添加至培養物中，在此期間定期或連續收集表現之多肽。

在一些態樣中，與細菌細胞中(諸如大腸桿菌宿主細胞)之FimH突變體多肽之表現相比，FimH突變體多肽之表現量或活性增加至少2-fold、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍。

在一些態樣中，細胞可在小規模反應容器中生長，以形成體積範圍為數毫升至數公升之細胞培養物。在一些態樣中，細胞可在大規模商業生物反應器中生長以形成細胞培養物，其中細胞培養物之體積範圍可為大致至少1公升至10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000公升或更多，或在其間之任何體積。在一些實施例中，細胞培養物之尺寸範圍可為10 L至5000 L、10 L至10,000 L、10 L至20,000 L、10 L至50,000 L、40 L至50,000 L、100 L至50,000 L、500 L至50,000 L、1000 L至50,000 L、2000 L至50,000 L、3000 L至50,000 L、4000 L至50,000 L、4500 L至50,000 L、1000 L至10,000 L、1000 L至20,000 L、1000 L至25,000 L、1000 L至30,000 L、15 L至2000 L、40 L至1000 L、100 L至500 L、200 L至400 L或在其之間的任何整數。

細胞培養物之溫度將主要基於使細胞培養物保持活力(此時產生高含量多肽)的溫度範圍、使代謝廢料產物之產生或積累減至最少的溫度範圍及/或此等或被從業者認為重要的其他因素之任何組合來選擇。作為一個非限制性實例，CHO細胞生長良好且在約37℃下產生較高含量之蛋白或多肽。一般而言，大部分哺乳動物細胞在約25℃至42℃範圍內生長良好及/或可產生較高含量的蛋白或多肽，但由本發明教示之方法不限於此等溫度。某些哺乳動物細胞生長良好及/或可在約35℃至40℃範圍內產生較高含量之蛋白或多肽。在某些態樣中，細胞培養物在細胞培養過程期間一或多次在20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃之溫度下生長。

如本文中所使用，術語「培養物」及「細胞培養物」係指在適合於細胞群體之存活及/或生長之條件下懸浮於培養基中之細胞群體。如一般熟習此項技術者將瞭解，在一些態樣中，如本文中所使用之此等術語係指包含細胞群體及該群體懸浮於其中之培養基的組合。在一些態樣中，細胞培養物之細胞包含哺乳動物細胞。

在一些態樣中，細胞可在多種化學成分確定的培養基中之一者中生長，其中該培養基之成分為已知的且受控制的。在一些態樣中，細胞可在並非培養基之所有成分為已知的及/或受控制的複合培養基中生長。在過去的幾十年裏，已廣泛研發且公開了用於哺乳動物細胞培養之化學成分確定的生長培養基。成分確定的培養基之所有成分經充分表徵，且因此成分確定的培養基不含有複合添加劑，諸如血清或水解產物。早期培養基調配物係為了准許細胞生長且維持活力而研發，而很少或根本不考慮蛋白產生。近年來，已出於支持高產率重組蛋白產生細胞培養物之明確目的研發出培養基調配物。此類培養基較佳用於本發明之方法中。此類培養基通常包含大量營養物質且尤其係胺基酸，以支持細胞生長及/或維持細胞之高密度。必要時，此等培養基可由熟習此項技術者修改以用於本發明之方法。舉例而言，熟習此項技術者可減少此等培養基中之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及/或甲硫胺酸之量，以在如本文中所揭示之方法中使其用作基礎培養基或饋料培養基。

並非複雜培養基之所有成分均得到充分表徵，且因此除其他成分外，複合培養基可含有添加劑，尤其諸如簡單及/或複合碳源、簡單及/或複合氮源及血清。在一些態樣中，除本文中所描述之成分確定的培養基之其他成分以外，適用於本發明之複合培養基含有添加劑，諸如水解產物。在一些態樣中，成分確定的培養基通常包括在水中已知濃度下之大致五十種化學實體。其中大部分培養基亦含有一或多種充分表徵之蛋白，諸如胰島素、IGF-1、運鐵蛋白或BSA，但其他培養基不需要蛋白成分且因此稱為不含蛋白之成分確定的培養基。培養基之典型化學成分分為五種廣泛類別：胺基酸、維生素、無機鹽、微量元素及難以分離之雜類。

細胞培養基可視情況補充有補充成分。如本文中所使用，術語「補充成分」係指促使生長及/或存活率增長超過最低速率之成分，包括(但不限於)激素及/或其他生長因子、特定離子(諸如鈉、氯、鈣、鎂及磷酸根)、緩衝液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低最終濃度存在之無機化合物)、胺基酸、脂質及/或葡萄糖或其他能量來源。在一些態樣中，補充成分可添加至初始細胞培養物中。在一些態樣中，補充成分可在細胞培養開始之後添加。通常，微量元素係指包含呈微莫耳或更低含量之多種無機鹽。舉例而言，通常包括之微量元素為鋅、硒、銅及其他元素。在一些態樣中，鐵(二價鹽或三價鹽)可在微莫耳濃度下作為微量元素包括於初始細胞培養基中。錳亦常以奈莫耳至微莫耳之濃度範圍作為二價陽離子(MnCl ₂或MnSO ₄)包括於微量元素當中。許多不太常見的微量元素通常以奈莫耳濃度添加。

在一些態樣中，用於本發明方法之培養基為適合於在細胞培養中支持高細胞密度之培養基，諸如1×10 ⁶個細胞/毫升、5×10 ⁶個細胞/毫升、1×10 ⁷個細胞/毫升、5×10 ⁷個細胞/毫升、1×10 ⁸個細胞/毫升或5×10 ⁸個細胞/毫升。在一些態樣中，細胞培養為哺乳動物細胞饋料批式培養，較佳為CHO細胞饋料批式培養。

在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之色胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之白胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之絲胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之蘇胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之甘胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之兩種，其濃度為2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸及酪胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸及色胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸及甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸及色胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸及甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之色胺酸及甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之三種，其濃度為2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸及甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。

在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之酪胺酸、色胺酸及甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。

在一些態樣中，細胞培養基包含苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之四種，其濃度為2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。

在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及甲硫胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之五種，其濃度為2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之六種，其濃度為2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸中之七種，其濃度為2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甘胺酸：2 mM以下、1mM以下、0.1至2 mM、0.1至1mM、0.5至1.5 mM或0.5至1mM。在一些態樣中，細胞培養基進一步包含甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及天冬醯胺中之至少1、2、3、4、5、6、7、11、12或13種，其濃度為2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM以上，較佳為2 mM。在一些態樣中，細胞培養基進一步包含甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及天冬醯胺中之至少5種，其濃度為2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM以上，較佳為2 mM。在一些態樣中，細胞培養基進一步包含濃度為以下之甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及天冬醯胺：2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM以上，較佳為2 mM。在一些態樣中，細胞培養基進一步包含纈胺酸、異白胺酸、脯胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及天冬醯胺中之至少1、2、3、4、5、6、7、8或9種，其濃度為2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM以上，較佳為2 mM。在一些態樣中，細胞培養基進一步包含纈胺酸、異白胺酸、脯胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及天冬醯胺中之至少5種，其濃度為2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM以上，較佳為2 mM。在一些態樣中，細胞培養基進一步包含濃度為以下之纈胺酸、異白胺酸、脯胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸及天冬醯胺：2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、10 mM、15 mM以上，較佳為2 mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之絲胺酸：3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM以上，較佳為10 mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之纈胺酸：3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM以上，較佳為10 mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之半胱胺酸：3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM以上，較佳為10 mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之異白胺酸：3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM以上，較佳為10 mM。在一些態樣中，細胞培養基包含濃度為以下之白胺酸：3 mM、5 mM、7 mM、10 mM、15 mM或20 mM以上，較佳為10 mM。在一些態樣中，以上細胞培養基用於如本文中所揭示之方法中。在一些態樣中，以上細胞培養基在如本文中所揭示之方法中用作基礎培養基。在一些態樣中，以上細胞培養基在如本文中所揭示之方法中用作饋料培養基。

本發明之方法可與適合於所需方法(例如產生重組蛋白)之任何細胞培養方法一起使用。作為非限制性實例，細胞可在批式或饋料批式培養中生長，其中在足夠表現重組蛋白(例如抗體)之後終止培養，其後收集表現之蛋白。或者，作為另一非限制性實例，細胞可在批式再饋料培養中生長，其中培養並不終止且將新的營養物質及其他成分定期或連續添加至培養物中，在此期間定期或連續收集表現之重組蛋白。其他適合的方法(例如旋轉管培養)為此項技術中已知的且可用於實踐本發明。

細胞可以由從業者選擇之任何適宜的體積生長。舉例而言，細胞可在體積範圍為數毫升至數公升之小規模反應容器中生長。在一些實施例中，細胞可生長於大規模商業生物反應器中，其體積範圍為約至少1公升至10、50、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000、15000、20000或25000公升或更多，或其間之任何體積。

細胞培養物之溫度將主要基於使細胞培養物保持活力之溫度範圍及產生高含量所需產物(例如重組蛋白)之範圍來選擇。一般而言，大部分哺乳動物細胞生長良好且可在約25℃至42℃範圍內產生所需產物(例如重組蛋白)，但由本發明教示之方法不限於此等溫度。某些哺乳動物細胞生長良好且可在約35℃至40℃範圍內產生所需產物(例如重組蛋白或抗體)。在某些態樣中，細胞培養物在細胞培養過程期間一或多次在20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃之溫度下生長。一般熟習此項技術者將能夠選擇使細胞生長之適當溫度，且視細胞之特定需求及從業者之特定生產要求而定。視從業者之需求及細胞自身之要求而定，細胞可以任何時間量生長。在一些實施例中，細胞在37℃下生長。在一些態樣中，細胞在36.5℃下生長。

在一些態樣中，視從業者之需求及細胞自身之要求而定，細胞可在初始生長階段(或生長階段)期間生長更長或更短時間量。在一些態樣中，細胞生長足以達成預定細胞密度之時段。在一些態樣中，細胞生長足以達成如下之細胞密度的時段，該細胞密度為若使細胞不受干擾地生長，則細胞最終將達至之最大細胞密度的給定百分比。舉例而言，細胞可生長足以達成以下所需活細胞密度之時段：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%之最大細胞密度。在一些態樣中，細胞生長直至細胞密度每天增加不超過培養物之15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一些態樣中，細胞生長直至細胞密度每天增加不超過培養物之5%。

在一些態樣中，使細胞在限定時段內生長。舉例而言，視細胞培養物之起始濃度、細胞生長之溫度及細胞之固有生長速率而定，細胞可生長0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天，較佳為4至10天。在一些情況下，可使細胞生長一個月或更久。本發明之從業者將能夠視蛋白生產要求及細胞自身之需求而定選擇初始生長階段之持續時間。

可在初始培養階段期間攪動或振盪細胞培養物，以增加氧合及營養物至細胞之分散。根據本發明，一般熟習此項技術者應瞭解，在初始生長階段期間控制或調節生物反應器之某些內部條件可為有益的，包括(但不限於)pH值、溫度、氧合等。

在初始生長階段結束時，可改變培養條件中之至少一者，從而應用第二組培養條件且在培養物中發生代謝轉變。代謝轉變可藉由例如細胞培養物之溫度、pH值、重量莫耳滲透濃度或化學誘導水準之變化來實現。在一個非限制性實施例中，培養條件藉由改變培養物之溫度而改變。然而，如此項技術中已知，改變溫度並非可達成適當代謝轉變之唯一機制。舉例而言，此類代謝轉變亦可藉由改變其他培養條件(包括(但不限於)pH值、重量莫耳滲透濃度及丁酸鈉含量)來達成。改變培養之時機將由本發明之從業者基於蛋白生產要求或細胞自身之需求而測定。

當改變培養物之溫度時，溫度變化可為相對漸進的。舉例而言，可能要耗費數小時或數天才能完成溫度變化。或者，溫度變化可為相對突然的。舉例而言，溫度變化可在少於幾個小時內完成。倘若有適當的生產及控制設備，諸如在多肽或蛋白之商業大規模生產中之標準設備，溫度變化甚至可在少於一小時內完成。

在一些態樣中，一旦細胞培養物之條件已如上文所論述而變化，則在有助於細胞培養物之存活及活力且適合於以商業上適當之水準表現所需多肽或蛋白的第二組培養條件下，維持細胞培養物用於後續生產階段。

如上文所論述，培養物可藉由改變多種培養條件(包括(但不限於)溫度、pH值、重量莫耳滲透濃度及丁酸鈉含量)中之一或多者而變化。在一些態樣中，培養物之溫度經改變。根據此實施例，在後續生產階段期間，將培養物維持在低於初始生長階段之溫度或溫度範圍的溫度或溫度範圍下。如上文所論述，可採用多重離散溫度轉變以增加細胞密度或活力或增加重組蛋白之表現。

如本文中所使用，術語「效價」係指例如細胞培養物在給定量之培養基體積中產生之重組表現蛋白的總量。效價通常以每公升培養基之蛋白公克數之單位表述。

在一些態樣中，與對照培養物相比，細胞生長增加至少5%、10%、15%、20%或25%。在一些態樣中，與對照培養物相比，細胞生長增加至少10%。在一些態樣中，與對照培養物相比，細胞生長增加至少20%。

在一些態樣中，藉由效價及/或體積產率來測定產率。在一些態樣中，藉由效價測定產率。在一些態樣中，與對照培養物相比，產率增加至少5%、10%、15%、20%或25%。在一些態樣中，與對照培養物相比，產率增加至少10%。在一些態樣中，與對照培養物相比，產率增加至少20%。

純化在一些態樣中，用於產生FimH突變體多肽之方法包括分離及/或純化多肽。在一些態樣中，所表現之多肽分泌至培養基中且因此可藉由離心及/或過濾移除細胞及其他固體。在一個較佳實施例中，多肽或其片段為可溶的。

根據本文中所描述之方法產生的經突變之FimH多肽可自宿主細胞收集且使用任何適合的方法分離，且方法一般為此項技術中已知的(例如Ruiz-Arguello等人, J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004))。用於純化多肽之適合的方法包括沈澱及各種類型之層析法，諸如疏水性相互作用、離子交換、親和、螯合及尺寸排阻，其均為此項技術中已知的。適合的純化流程可包括兩種或更多種此等或其他適合的方法。在一些態樣中，多肽中之一或多者可包括促進純化或偵測之「標記」。實例包括例如His標記(結合於金屬離子，例如六組胺酸)、抗體、麥芽糖結合蛋白(MBP)(結合於直鏈澱粉)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)(結合於麩胱甘肽)、FLAG標記(結合於抗flag抗體)、Strep標記(結合於鏈黴抗生物素蛋白或其衍生物)。此類經標記之多肽可方便地例如藉由螯合層析法或親和層析法自改良性培養基分離。視情況，標記序列可在純化後裂解。在一個態樣中，FimH突變體多肽不包括純化標記。

在一個態樣中，FimH突變體多肽可藉由以下來分離：首先獲得細胞培養物上清液，且接著對上清液進行超濾及透濾方法。此類過濾方法為熟習此項技術者已知的。在超濾及透濾之後，接著對所得不含細胞之溶液進行層析步驟，諸如使用例如鎳親和樹脂之Ni-NTA層析法。此步驟之後可為透析，其隨後可接著為陽離子交換層析法，諸如用SP管柱。在某些條件下，在SP-sepharose上之純化期間使用酸性pH值(例如小於約6.0、小於約5.5、小於約5.0、小於約4.5、約4.4、約4.3、約4.2、約4.1或約4.0或更低)為可取的。

雖然本文中可能提及大腸桿菌之特定菌株，但應理解，除非指明，否則衍生自大腸桿菌之多肽或其片段不限於特定菌株。

VI. 組合物之用途在一個態樣中，本發明提供FimH突變體多肽、編碼此類突變體之核酸、用於表現此類突變體之載體、包含此類突變體或核酸之組合物作為藥劑之用途，或在製造藥劑中之用途，該藥劑用以引發針對大腸桿菌感染之免疫反應或預防個體中之大腸桿菌感染。

在其他態樣中，本發明提供在個體(諸如人類)中引發針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向個體投與有效量的FimH突變體多肽、編碼FimH突變體多肽之核酸分子或包含FimH突變體多肽或核酸分子之組合物。本發明亦提供預防個體中之大腸桿菌感染之方法，其包含向個體投與有效量之醫藥組合物，諸如包含FimH突變體多肽、編碼FimH突變體多肽之核酸或表現FimH突變體多肽之載體的疫苗。在一些特定態樣中，醫藥組合物包含如本文中所揭示之FimH突變體多肽。在上文所提供之方法之一些態樣中，個體為人類。

在其他態樣中，本發明提供用於以下之方法：在個體中誘導針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，或在個體中誘導調理吞噬活性抗體及/或中和抗體之產生，該等抗體對腸外病原性大腸桿菌具有特異性，其中該方法包含向個體投與有效量的本文中所描述之組合物中之任一者，諸如包含如本文中所描述之FimH突變體多肽的組合物。在此類方法之另一態樣中，個體具有發展泌尿道感染之風險及/或具有發展菌血症之風險及/或具有發展敗血症之風險。

在另一態樣中，本發明提供在哺乳動物中引發針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向哺乳動物投與有效量的本文中所描述之組合物中之任一者。舉例而言，在一個態樣中，免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體及/或中和抗體。在另一態樣中，免疫反應保護哺乳動物免受大腸桿菌感染。

在另一態樣中，本發明提供預防、治療或改善個體中之細菌感染、疾病或病狀的方法，其包含向個體投與免疫有效量的本文中所描述之組合物中之任一者。

在本發明之方法中，可在投與或不投與佐劑之情況下向個體投與組合物。向個體投與之有效量為足以在個體中引發針對大腸桿菌抗原(諸如FimH蛋白)之免疫反應的量。可選擇用於治療之個體包括具有發展大腸桿菌感染之風險的個體，諸如具有發展泌尿道感染之風險的個體及/或具有發展菌血症之風險的個體及/或具有發展敗血症之風險的個體，因為該等個體暴露於或有可能暴露於大腸桿菌。

如本文中所使用，「個體」意謂哺乳動物，較佳為人類。在一個實施例中，個體面臨選自由以下組成之群之病狀中之任一種的風險：泌尿道感染、膽囊炎、膽管炎、腹瀉、溶血性尿毒症候群、新生兒腦膜炎、尿路敗血症(urosepsis)、腹內感染、腦膜炎、複雜性肺炎、傷口感染、前列腺活檢後相關感染、新生兒/嬰兒敗血症、嗜中性白血球減少性發熱及其他血流感染；肺炎、菌血症及敗血症。

可使用標準投藥途徑投與由本發明提供之組合物，諸如醫藥組合物。非限制性實施例包括腸胃外投藥，諸如皮內、肌肉內、皮下、經皮、經黏膜或經口投藥。

如熟習此項技術者已知，在一次投藥期間向個體提供之組合物的總劑量可變化。

亦有可能提供一或多種免疫原性組合物之一或多次加打投藥。若進行加打疫苗接種，則通常此類加打疫苗接種將在向個體首次投與組合物(其在此類情況下，稱為「初打疫苗接種」)之後的一週與10年之間，較佳為兩週與六個月之間的某一時刻向同一個體投與。在替代性加打方案中，亦有可能在初打疫苗接種之後向該個體投與不同載體，例如一或多種腺病毒，或其他載體，諸如安卡拉(Ankara)之經修飾痘瘡病毒(MVA)，或DNA或蛋白。本發明提供之免疫原性組合物可與一或多種其他免疫原性組合物一起使用。

組合物之劑量可調節劑量方案以提供最佳所需反應。舉例而言，可投與單次劑量之經突變之FimH多肽，可隨時間推移投與若干分次劑量，或劑量可如情形之緊急程度所指示按比例減少或增加。應注意，劑量值可隨待緩解之病狀的類型及嚴重程度而變化，且可包括單次或多次劑量。應進一步瞭解，對於任何特定個體而言，特定劑量方案應根據個人需要及投與組合物或監督組合物投與之人員的專業判斷而隨時間調整，且本文中所闡述之劑量範圍僅為例示性的且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實踐。

在一些態樣中，組合物中之FimH突變體多肽之量可在各蛋白抗原之約10 μg至約300 μg範圍內。在一些態樣中，組合物中之FimH突變體多肽之量可在各蛋白抗原之約20 μg至約200 μg範圍內。

各劑量中之醣結合物之量經選擇為誘導免疫保護性反應而無典型疫苗中之明顯不良副作用之量。此種量將視採用何種特定免疫原及其呈現方式而變化。

免疫原性組合物中之特定醣結合物之量可基於該結合物之總多醣(結合及未結合)來計算。舉例而言，在100 g多醣劑量中，具有20%游離多醣之醣結合物將具有約80 g之結合多醣及約20 g之未結合多醣。醣結合物之量可視大腸桿菌血清型而變化。可藉由醣醛酸分析法來測定醣濃度。

免疫原性組合物中之不同多醣成分之「免疫原性量」可為不同的，且各自可包含約1.0 g、約2.0 g、約3.0 g、約4.0 g、約5.0 g、約6.0 g、約7.0 g、約8.0 g、約9.0 g、約10.0 g、約15.0 g、約20.0 g、約30.0 g、約40.0 pg、約50.0 pg、約60.0 pg、約70.0 pg、約80.0 pg、約90.0 pg或約100.0 g之任何特定多醣抗原。一般而言，對於給定血清型，各劑量將包含0.1 g至100 g之多醣，特定言之0.5 g至20 g，更特定言之1 g至10 g，且甚至更特定言之2 g至5 g。作為本發明之一實施例，涵蓋以上範圍中之任一者內之任何全數整數。在一個實施例中，對於給定血清型，各劑量將包含1 g、2 g、3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g、10 g、15 g或20 g之多醣。

VII. 與醣及 / 或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌 ( KLEBSIELLA PNEUMONIAE ) 之多肽或其片段組合肺炎克雷伯氏桿菌( K . pneumoniae)為已知會引起泌尿道感染、菌血症及敗血症之革蘭氏陰性病原體。多重抗藥性肺炎克雷伯氏桿菌感染為引起具有風險之易感群體中之死亡率增加的原因。O-抗原血清型在全球引起侵襲性疾病之菌株中非常普遍，且衍生之O-抗原醣結合物作為疫苗抗原具有吸引力。

在一個態樣中，本文中所揭示之組合物中之任一者可進一步包含至少一種醣，該醣為或衍生自選自以下之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型：O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12。在一個較佳實施例中，本文中所揭示之組合物中之任一者可進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽，該多肽選自以下：衍生自肺炎克雷伯氏桿菌I型繖毛蛋白之多肽或其免疫原性片段；或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌III型繖毛蛋白之多肽或其免疫原性片段；或其組合。

如此項技術中已知，肺炎克雷伯氏桿菌O1及O2 O-抗原及其對應v1及v2亞型為在其重複單元之結構方面不同的聚合半乳聚糖。肺炎克雷伯氏桿菌O1及O2抗原含有均聚物半乳糖單元(或半乳聚糖)。肺炎克雷伯氏桿菌O1及O2抗原各自含有D-半乳聚糖I單元(有時稱為O2a重複單元)，但O1抗原的不同之處在於O1抗原具有D-半乳聚糖II封端結構。D-半乳聚糖III (d-Gal-III)為D-半乳聚糖I之變異體。界定兩種不同血清型O2亞型(O2v1及O2v2)之鹼基半乳聚糖I及III的結構；及由產生亞型O1v1及O1v2之半乳聚糖II封端產生的衍生之嵌合體的結構展示於Kelly SD等人, J Biol Chem 2019; 294:10863-76；及Clarke BR等人, J Biol Chem 2018; 293:4666-79中。

在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括[→3)-β-D-Galf -(1→3)-α-D-Galp-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括[→3)-α-D- Galp-(1→3)- β-D-Galp-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括[→3)-β-D-Galf -(1→3)-α-D-Galp-(1→]之重複單元及[→3)-α-D- Galp-(1→3)- β-D-Galp-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O1之醣包括→3)-β-D-Galf -(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-(1→]之重複單元(稱為D-Gal-III重複單元)。(Kol O.等人, (1992) Carbohydr. Res. 236, 339-344；Whitfield C.等人, (1991) J. Bacteriol. 173, 1420-1431)。

在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括[→3)-α-ᴅ-Galp-(1→3)-β-ᴅ-Galf-(1→]之重複單元(其可為肺炎克雷伯氏桿菌血清型O2a抗原之元素)。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括[→3)-β-ᴅ-GlcpNAc-(1→5)-β-ᴅ-Galf-(1→]之重複單元(其可為肺炎克雷伯氏桿菌血清型O2c抗原之元素)。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括藉由側鏈添加(1→4)連接之Galp殘基(其可為肺炎克雷伯氏桿菌O2afg抗原之元素)而對O2a重複單元之修飾。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O2之醣包括藉由側鏈添加(1→2)連接之Galp殘基(其可為肺炎克雷伯氏桿菌O2aeh抗原之元素)而對O2a重複單元之修飾。(Whitfield C.等人, (1992) J. Bacteriol. 174, 4913-4919)。

在不受機制或理論束縛之情況下，此項技術中所揭示之肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3及O5之O-抗原多醣結構分別與大腸桿菌血清型O9a (式O9a)及O8 (式O8)之彼等結構相同。

在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O4之醣包括[→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O7之醣包括[→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf- (1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]之重複單元。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O8血清型之醣包括與肺炎克雷伯氏桿菌O2a相同之重複單元結構，但未經化學計量之O-乙醯化。在一些實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌O12血清型之糖包括[α-Rhap-(1 →3)-β-GlcpNAc]雙醣重複單元之重複單元。

在一個態樣中，本發明包括組合物，其包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；及至少一種醣，該醣為或衍生自選自以下之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型：O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12。在一些實施例中，組合物包括來自或衍生自血清型O1、O2、O3及O5中之一或多者之醣或其組合。在一些實施例中，組合物包括來自或衍生自血清型O1、O2、O3及O5中之每一者之醣。

在另一態樣中，本發明包括組合物，其包括至少一種醣，該醣為或衍生自選自以下之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型：O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12；以及衍生自具有選自以下中之任一者之結構之大腸桿菌O-抗原的醣：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中n為1至100之整數。在一些實施例中，組合物包括來自或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O1、O2、O3及O5中之一或多者之醣或其組合。在一些實施例中，組合物包括來自或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O1、O2、O3及O5中之每一者之醣。在一些實施例中，組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。在一些實施例中，組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。

在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；至少一種衍生自選自以下之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型的醣：O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12；及具有選自以下中之任一者之結構的醣：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2; K13; K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中n為1至100，較佳為31至90之整數。在一些實施例中，組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。在一些實施例中，組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。

在一些實施例中，組合物包括至少一種衍生自任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣，該肺炎克雷伯氏桿菌類型選自由O1、O2、O3及O5組成之群。

在一些實施例中，組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原係選自亞型v1 (O1v1)或亞型v2 (O1v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原係選自亞型v1 (O1v1)及亞型v2 (O1v2)。在一些實施例中，組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原係選自亞型v1 (O2v1)或亞型v2 (O2v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原係選自亞型v1 (O2v1)及亞型v2 (O2v2)。在另一態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原選自由以下組成之群：a)血清型O1亞型v1 (O1v1)；b)血清型O1亞型v2 (O1v2)；c)血清型O2亞型v1 (O2v1)；及d)血清型O2亞型v2 (O2v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v1 (O1v1)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v2 (O1v2)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v1 (O2v1)。在此實施例之一個態樣中，肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原為亞型v2 (O2v2)。在此實施例之另一態樣中，組合物包含選自由以下組成之群的一種、兩種、三種或四種肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原：a)血清型O1亞型v1 (O1v1)；b)血清型O1亞型v2 (O1v2)；c)血清型O2亞型v1 (O2v1)；及d)血清型O2亞型v2 (O2v2)。在一些實施例中，組合物包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之醣的組合，其中第一醣衍生自選自由O1、O2、O3及O5組成之群的肺炎克雷伯氏桿菌類型中之任一者；且第二醣衍生自醣，該醣衍生自選自由以下組成之群的肺炎克雷伯氏桿菌類型中之任一者：O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12。舉例而言，在一些實施例中，組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣及至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。在一個較佳實施例中，衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之醣與載體蛋白結合；且衍生自大腸桿菌之醣與載體蛋白結合。

在另一個態樣中，本發明包括組合物，其包括衍生自大腸桿菌FimH之多肽或其片段；及至少一種衍生自任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣，該肺炎克雷伯氏桿菌類型選自由O1、O2、O3及O5組成之群。

在另一態樣中，本發明包括至少一種衍生自任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之醣，該肺炎克雷伯氏桿菌類型選自由O1、O2、O3及O5組成之群；及至少一種衍生自大腸桿菌之醣，該大腸桿菌具有選自以下中之任一者之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187。在一些實施例中，組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。在一些實施例中，組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。

在一些實施例中，組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣；及至少一種衍生自大腸桿菌之醣，該大腸桿菌具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。在另一實施例中，組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣；及至少一種衍生自大腸桿菌之醣，該大腸桿菌具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。在另一實施例中，組合物包括至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣；至少一種衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣；及至少一種衍生自大腸桿菌之醣，該大腸桿菌具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。

在一個實施例中，本發明提供在個體中誘導對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的方法，該方法包含向個體投與免疫有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含至少一種來自大腸桿菌血清型O8或O9之醣結合物，其中該免疫原性組合物不包含來自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5或O3之醣結合物。在一個態樣中，組合物包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣。在另一態樣中，組合物包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣，且不包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣。

在另一實施例中，本發明提供在個體中誘導個體對大腸桿菌之免疫反應的方法，該方法包含向個體投與免疫有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含至少一種來自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5或O3之醣結合物或其變異體，其中該免疫原性組合物不包含來自大腸桿菌血清型O8或O9之醣結合物。在一個態樣中，組合物包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O5之醣，且不包括衍生自具有式O8之大腸桿菌O-抗原之醣。在另一態樣中，組合物包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌血清型O3之醣，且不包括衍生自具有式O9之大腸桿菌O-抗原之醣。

在一些實施例中，組合物包括至少一種醣，該醣為或衍生自至少一種選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之肺炎克雷伯氏桿菌血清型；至少一種衍生自大腸桿菌之醣，該大腸桿菌具有選自由式O8及式O9組成之群之結構。在一些實施例中，組合物包括至少一種醣，其為或衍生自選自O1 (及d-Gal-III變異體)、O2 (及d-Gal-III變異體)、O2ac、O3、O4、O5、O7、O8及O12之至少一種肺炎克雷伯氏桿菌血清型；至少一種衍生自大腸桿菌之醣，該大腸桿菌具有選自由式O1A、式O1B、式O2、式O6及式O25B組成之群的結構。

在一些實施例中，組合物進一步包括衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之多肽，該多肽選自以下：衍生自肺炎克雷伯氏桿菌I型繖毛蛋白之多肽或其免疫原性片段；或衍生自肺炎克雷伯氏桿菌III型繖毛蛋白之多肽或其免疫原性片段；或其組合。該等多肽之序列為此項技術中已知的。

VIII. 奈米粒子在另一態樣中，本文揭示免疫原性複合物，其包括1)奈米結構；及2)至少一種繖毛多肽抗原或其片段。較佳地，繖毛多肽或其片段衍生自大腸桿菌繖毛H (fimH)。在一個較佳實施例中，繖毛多肽選自上文所描述之繖毛多肽中之任一者。舉例而言，繖毛多肽可包含選自SEQ ID NO: 1-65之任一胺基酸序列。

在一些實施例中，抗原與奈米結構外部融合或結合，以刺激針對所呈現之抗原決定基之適應性免疫反應的發展。在一些實施例中，免疫原性複合物進一步包括佐劑或其他連接至外部及/或囊封於籠內部之免疫調節化合物，以幫助調整針對各病原體產生之免疫反應的類型。

在一些實施例中，奈米結構包括單一組裝體，該組裝體包括複數個相同第一奈米結構相關多肽。

在替代性實施例中，奈米結構包括複數個組裝體，其包括複數個相同第一奈米結構相關多肽；及複數個第二組裝體，各第二組裝體包含複數個相同第二奈米結構相關多肽。

各種奈米結構平台可用於產生本文中所描述之免疫原性組合物。在一些實施例中，所採用之奈米結構由單一子單元之多個複本形成。在一些實施例中，所採用之奈米結構由多個不同子單元之多個複本形成。

奈米結構通常為球狀，及/或具有旋轉對稱性(例如具有3倍軸及5倍軸)，例如具有本文中所例示之二十面體結構。

在一些實施例中，抗原呈現於自組裝奈米粒子上，諸如衍生自鐵蛋白(FR)、E2p、Qβ及I3-01之自組裝奈米結構。E2p為來自嗜熱脂肪芽孢桿菌之二氫硫辛酸醯基轉移酶的重新設計之變異體。I3-01為可自組裝成超穩定奈米粒子之經工程改造之蛋白。此等蛋白之子單元的序列為此項技術中已知的。在第一態樣中，本文揭示包含胺基酸序列之奈米結構相關多肽，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NOS: 66-105組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列在其長度上至少75%一致，且在至少一個經鑑別之界面位置上一致。奈米結構相關多肽可用於例如製備奈米結構。奈米結構相關多肽係針對其成對自組裝形成奈米結構(諸如二十面體奈米結構)之能力來設計。

在一些實施例中，奈米結構包括(a)複數個第一組裝體，各第一組裝體包含複數個相同第一奈米結構相關多肽，其中該等第一奈米結構相關多肽包含選自由SEQ ID NO: 66-105組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列；及(b)複數個第二組裝體，各第二組裝體包含複數個相同第二奈米結構相關多肽，其中第二奈米結構相關多肽包含選自由SEQ ID NO: 66-105組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列，且其中第二奈米結構相關多肽與第一奈米結構相關多肽不同；其中該複數個第一組裝體與該複數個第二組裝體非共價相互作用以形成奈米結構。

奈米結構包括對稱重複的、非天然的、非共價多肽-多肽界面，其將第一組裝體及第二組裝體定向為奈米結構，諸如具有二十面體對稱性之奈米結構。

SEQ ID NO: 66-105提供例示性奈米結構相關多肽之胺基酸序列。SEQ ID NO: 66-105之例示性奈米結構相關多肽的界面殘基數目在4-13個殘基範圍內。在各種實施例中，奈米結構相關多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 66-105組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列在其長度上至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致，且在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個經鑑別之界面位置上一致(視給定奈米結構相關多肽之界面殘基之數目而定)。在其他實施例中，奈米結構相關多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 66-105組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列在其長度上至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致，且在至少20%、25%、33%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或100%之經鑑別之界面位置上一致。在其他實施例中，奈米結構相關多肽包括奈米結構相關多肽，其具有選自由SEQ ID NO: 66-105組成之群的奈米結構相關多肽之胺基酸序列。

在一個非限制性實施例中，奈米結構相關多肽可經修飾以有助於與相關「貨物(cargo)」之共價連接。在一個非限制性實例中，奈米結構相關多肽可經修飾，諸如藉由在限定位置處引入各種半胱胺酸殘基以促進與一或多種相關抗原之連接，使得奈米結構相關多肽之奈米結構將提供架構以提供大量抗原作為疫苗遞送，以產生經改良之免疫反應。

在一些實施例中，存在於奈米結構相關多肽中但不意欲用於結合之一些或所有原生半胱胺酸殘基可突變成其他胺基酸以促進限定位置處之結合。在另一非限制性實施例中，奈米結構相關多肽可藉由與部分之連接(共價或非共價)來修飾以有助於促進「胞內體逃逸」。對於涉及將相關分子遞送至標靶細胞之應用，諸如靶向遞送，關鍵步驟可為自胞內體(膜結合之細胞器，其為遞送媒劑進入細胞中之入口點)逃逸。胞內體成熟為溶酶體，此降解其之內容物。因此，若在胞內體變為溶酶體之前，遞送媒劑未以某種方式自胞內體「逃逸」，則該遞送媒劑將降解且將不執行其功能。存在多種脂質或有機聚合物可破壞胞內體且允許逸出至胞溶質中。因此，在此實施例中，奈米結構相關多肽可例如藉由引入半胱胺酸殘基來修飾，該等半胱胺酸殘基將允許此種脂質或有機聚合物化學結合於單體或產生組裝體表面。在另一非限制性實例中，奈米結構相關多肽可例如藉由引入半胱胺酸殘基來修飾，該等半胱胺酸殘基將允許螢光團或其他成像劑之化學結合，從而允許在活體外或活體內觀測奈米結構。

奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可經突變以改良蛋白子單元或組裝之奈米結構的穩定性或溶解度。如熟習此項技術者已知，若奈米結構相關多肽與現有蛋白家族具有顯著序列同源性，則來自該家族之其他蛋白的多重序列比對可用於引導在非保守位置選擇可增加蛋白穩定性及/或溶解度之胺基酸突變，該方法稱為共有蛋白設計(9)。

奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可突變成帶正電(Arg、Lys)或帶負電(Asp、Glu)之胺基酸，以對蛋白表面賦予總體正電荷或總體負電荷。在一個非限制性實施例中，奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可經突變以對自組裝奈米結構之內表面賦予較高淨電荷。歸因於奈米結構內表面與貨物分子之間的靜電相互作用，此種奈米結構可隨後用於封裝或囊封具有相反淨電荷之貨物分子。在一個非限制性實施例中，奈米結構相關多肽上之表面胺基酸殘基可主要突變成精胺酸或離胺酸殘基，以對自組裝奈米結構之內表面賦予淨正電荷。含有奈米結構相關多肽之溶液隨後可在存在核酸貨物分子之情況下混合，諸如dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA、cDNA、miRNA、siRNA、shRNA、piRNA或其他核酸，以便將核酸囊封於自組裝奈米結構內部。此類奈米結構可用於例如保護、遞送或濃縮核酸。

在一個實施例中，奈米結構具有二十面體對稱性。在此實施例中，奈米結構可包含第一奈米結構相關多肽之60個複本及第二奈米結構相關多肽之60個複本。在一個此類實施例中，各第一組裝體中相同第一奈米結構相關多肽的數目與各第二組裝體中相同第二奈米結構相關多肽的數目不同。舉例而言，在一個實施例中，奈米結構包含十二個第一組裝體及二十個第二組裝體；在此實施例中，各第一組裝體可例如包含相同第一奈米結構相關多肽之五個複本，且各第二組裝體可例如包含相同第二奈米結構相關多肽之三個複本。在另一實施例中，奈米結構包含十二個第一組裝體及三十個第二組裝體；在此實施例中，各第一組裝體可例如包含相同第一奈米結構相關多肽之五個複本，且各第二組裝體可例如包含相同第二奈米結構相關多肽之兩個複本。在另一實施例中，奈米結構包含二十個第一組裝體及三十個第二組裝體；在此實施例中，各第一組裝體可例如包含相同第一奈米結構相關多肽之三個複本，且各第二組裝體可例如包含相同第二奈米結構相關多肽之兩個複本。所有此等實施例能夠形成具有規則二十面體對稱性之合成奈米材料。

實例為了能更好地理解本發明，闡述以下實例。此等實例僅為達成說明之目的，且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。

實例 1 ： 抗原設計FimH _LD或FimH-DSG中之突變經設計以將FimH凝集素域鎖定於開放構形中，其目的為改良功能性免疫原性。突變具有不同類別，且描述於以下表2-表9中。各種經突變之FimH多肽之胺基酸序列顯示於表1中。表 2 ：包括 UTI 臨床分離株中常見的天然存在之胺基酸取代之引入的野生型 FimH _LD 構築體

SEQ ID NO:	蛋白ID	取代
1	FimHLD_WT	WT
	FimHLD_V27A	V27A

表 3 ： FimH _LD 之配位體結合位點中之取代

SEQ ID NO:	蛋白 ID	取代
3	FimHLD_F1I	F1I
4	FimHLD_F1L	F1L
5	FimHLD_F1V	F1V
6	FimHLD_F1M	F1M
7	FimHLD_F1Y	F1Y
8	FimHLD_F1W	F1W
9	FimHLD_Q133K	Q133K

表 4 ： FimH _LD 中之甘胺酸交換突變

SEQ ID NO:	蛋白 ID	取代
10	FimHLD_G15A	G15A
11	FimHLD_G15P	G15P
12	FimHLD_G16A	G16A
13	FimHLD_G16P	G16P
14	FimHLD_G15A_G16A	G15A G16A
15	FimHLD_R60P	R60P
16	FimHLD_G65A	G65A

表 5 ： FimH _LD 中之用於使雙硫鍵穩定的半胱胺酸對

SEQ ID NO:	蛋白 ID	取代
17	FimHLD_P12C_A18C	P12C A18C
18	FimHLD_G14C_F144C	G14C F144C
19	FimHLD_P26C_V35C	P26C V35C
20	FimHLD_P26C_V154C	P26C V154C
21	FimHLD_P26C_V156C	P26C V156C
22	FimHLD_V27C_L34C	V27C L34C
23	FimHLD_V28C_N33C	V28C N33C
24	FimHLD_V28C_P157C	V28C P157C
25	FimHLD_Q32C_Y108C	Q32C Y108C
26	FimHLD_N33C_L109C	N33C L109C
27	FimHLD_N33C_P157C	N33C P157C
28	FimHLD_V35C_L107C	V35C L107C
29	FimHLD_V35C_L109C	V35C L109C
30	FimHLD_S62C_T86C	S62C T86C
31	FimHLD_S62C_L129C	S62C L129C
32	FimHLD_Y64C_L68C	Y64C L68C
33	FimHLD_Y64C_A127C	Y64C A127C
34	FimHLD_L68C_F71C	L68C F71C
35	FimHLD_V112C_T158C	V112C T158C
36	FimHLD_S113C_G116C	S113C G116C
37	FimHLD_S113C_T158C	S113C T158C
38	FimHLD_V118C_V156C	V118C V156C
39	FimHLD_A119C_V155C	A119C V155C

表 6 ： FimH _LD 中之非極性至極性突變

SEQ ID NO:	蛋白 ID	取代
40	FimHLD_L34N_V27A	V27A L34N
41	FimHLD_L34S_V27A	V27A L34S
42	FimHLD_L34T_V27A	V27A L34T
43	FimHLD_A119N_V27A	V27A A119N
44	FimHLD_A119S_V27A	V27A A119S
45	FimHLD_A119T_V27A	V27A A119T
	FimHLD_L34D_V27A	V27A L34D
	FimHLD_L34E_V27A	V27A L34E
	FimHLD_L34K_V27A	V27A L34K
	FimHLD_L34R_V27A	V27A L34R
	FimHLD_A119D_V27A	V27A A119D
	FimHLD_A119E_V27A	V27A A119E
	FimHLD_A119K_V27A	V27A A119K
	FimHLD_A119R_V27A	V27A A119R

表 7 ： FimH - DSG 之 菌毛蛋白 - 凝集素界面處之 空腔填充 突變

SEQ ID NO:	蛋白 ID	取代
46	FimH-DSG_A115V	A115V
47	FimH-DSG_V163I	V163I
48	FimH-DSG_V185I	V185I
49	FimH-DSG_DSG_V3I	DSG V3I

表 8 ： FimH _LD 中之代表性突變之組合

SEQ ID NO:	蛋白 ID	取代
50	FimHLD_G15A_V27A	G15A V27A
51	FimHLD_G16A_V27A	G16A V27A
52	FimHLD_G15P_V27A	G15P V27A
53	FimHLD_G16P_V27A	G16P V27A
54	FimHLD_G15A_G16A_V27A	G15A G16A V27A
55	FimHLD_V27A_R60P	V27A R60P
56	FimHLD_V27A_G65A	V27A G65A
57	FimHLD_V27A_Q133K	V27A Q133K
58	FimHLD_G15A_G16A_V27A_Q133K	G15A G16A V27A Q133K

表 9 ： FimH - DSG 中之代表性突變之組合

SEQ ID NO:	蛋白 ID	取代
59	FimH-DSG_WT	WT / none
60	FimH-DSG_V27A	V27A
61	FimH-DSG_G15A_V27A	G15A V27A
62	FimH-DSG_G15A_G16A_V27A	G15A G16A V27A
63	FimH-DSG_V27A_Q133K	V27A Q133K
64	FimH-DSG_G15A_G16A_V27A_Q133K	G15A G16A V27A Q133K

實例 2 ： 抗原表現及純化如先前所描述(PCT國際公開案第WO2021/084429號，2021年5月6日公開)，將編碼FimH _LD及FimH-DSG突變體之DNA選殖至含有小鼠IgK信號肽之pcDNA3.1中且表現於Expi293™細胞中。對於蛋白表徵及免疫原性研究，使用鎳親和樹脂及尺寸排阻層析法來分離蛋白，如PCT國際公開案第WO2021/084429號(2021年5月6日公開)中所描述。

實例 3 ： 螢光偏振分析法為測定FimH突變體針對甘露糖苷配位體之解離常數，使用與對FimH具有高親和力之甘露糖苷配位體結合的螢光素，基於Rabbani等人( J . Biol . Chem .293:1835-1849 (2018))所描述之方法來研發螢光偏振分析法。在黑色平底96孔聚丙烯盤(Greiner)中，在11點三倍滴定中，將FimH蛋白稀釋於20 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl (0.05 mg/mL)加BSA (0.05%)中，最終體積為50 μL。將50 μL之含0.7 nM螢光素辛基聯苯甘露哌喃糖苷配位體之相同緩衝液添加至各孔中。在室溫下培育盤隔夜，同時在100 rpm下振盪。20-24小時後，在ClarioStar Plus讀盤器中讀取盤，其中螢光素激發波長為488 nm且發射波長為530 nm。

實例 4 ： 熱穩定性分析法 ( 熱螢光分析法 ( ThermoFluor Assay ))研發使用SYPRO橙之384孔熱穩定性分析法，以測定呈APO (未結合)形式及在存在配位體之情況下的經分離之蛋白之解構溫度。模擬FimH之天然配位體(甘露糖)的甘露糖苷化合物(甲基α-D-甘露哌喃糖苷(Sigma M6882))用於分析與蛋白之結合。藉由將蛋白在40 mM Tris (pH 8)、400 mM NaCl (分析法緩衝液)中稀釋至4 μM來製備FimH蛋白儲備溶液；將SYPRO橙染料(Invitrogen S6650)以1:10稀釋於分析法緩衝液中。在MicroAmp EnduraPlate光學384孔盤(Applied Biosystems 4483285)中，將4 μM FimH突變體(5 μL)與1:10 SYPRO橙染料(0.1 μL)及分析法緩衝液或稀釋於分析法緩衝液中之配位體(5 μL)混合，以得到10 μL之最終反應體積。在QuantStudio 5 即時PCR系統(ThermoFisher)中使用自20℃至98℃，0.05℃/秒之解離方案對盤進行解構曲線分析。指定TAMRA作為標靶及報導子，ROX作為被動參考物(但不用於任何分析)。資料繪製為馬克士威-波子曼分佈，X軸上為溫度(自20℃至98℃)，且Y軸上標繪來自TAMRA通道之螢光(對解構曲線期間之各溫度點讀數指定TAMRA報導子之特定螢光激發值)。確立標準化演算法以等化孔與樣品之間的螢光強度，由此可以0 (無螢光)至1 (最高記錄之螢光)之標度比較Y軸上之各盤之螢光。此等式示於下文中。使用Microsoft Excel中之搜尋功能(亦示於下文中)，記錄0.5之相對螢光(標準化後)值(指示大致一半之蛋白已解離)，與特定溫度相關。因此，計算此溫度，即所獲取之蛋白之解構溫度(T _m)。藉由自apo條件減去蛋白+配位體之T _m來計算解構溫度之偏移(ΔT _m)。Microsoft Excel中之透視表用於組織來自盤佈局之T _m。用於標準化TAMRA螢光信號之等式：標準化值(0至1)= 原始螢光值 - 來自全部孔之最低螢光值 ( 自 20 ℃ 至 98 ℃ )來自全部孔之最大螢光值-來自全部孔之最小螢光值用於鑑別T _m之Excel搜尋函數(0.5標準化螢光或50%蛋白解構)： =LOOKUP (0.5，標準化螢光值之起始位置:值之結束位置，$溫度值之起始位置:$值之結束位置)

實例 5 ：用 FimH 特異性中和單株抗體確認 FimH 突變體之構形狀態中和單株抗體299-3、304-1及440-2 (自製)用於確認FimH突變體之構形狀態；229-3及304-1結合於與MAb 475及926類似之抗原決定基(Kisiela, D. I.等人, Proc Natl Acad SciU S A 110, 19089-19094 (2013))，而440-2識別不同的抗原決定基且似乎優先結合呈開放構形狀態之FimH _LD。預期維持與野生型類似之結構完整性的變異體結合所有抗體。使用來自ForteBio之Octet HTX進行所有動力學即時生物分子相互作用實驗，以量測各突變體之抗體反應性。在含有240微升/孔之96孔黑色盤中，在30℃下在1000 rpm攪拌下進行實驗。將Ni-NTA生物感測器在含有1×PBS緩衝液的緩衝液中平衡，該緩衝液含有0.5% BSA及0.05% Tween 20 (PBT)，隨後使其以5 μg/mL負載His標記之FimH突變體蛋白5分鐘。使負載FimH之生物感測器在PBT中重建基線歷時3分鐘，隨後使其以5 μg/mL與來自不同分組之抗體結合5分鐘。使用Octet資料分析軟體進行結合步驟之動力分析，且獲得呈奈米遷移形式之反應(列表)。

實例 6 ： 圓二色性光譜分析使用配備有JASCO PTC-424S/15 (Jasco)溫度控制器及Isotemp水浴(Fisher Scientific)單元的JASCO J-810分光光度計(Jasco)，記錄FimH _LD及FimH-DSG突變體之遠UV (320-250 nm)及近UV (260-200 nm)圓二色性光譜。對於遠UV，使用1 mm細胞，且對於近UV，使用10 mm細胞。蛋白在PBS中稀釋至0.3 mg/mL，且使用細胞及1 mm (遠UV)或10 mm (近UV)路徑長度，在20℃下記錄光譜。以100 nm/min進行掃描，DIT設定為1 s，頻寬設定為3 s，且資料間距設定為0.1 nm。靈敏度設定為標準。對於近UV量測值，將十個光譜相加且取平均值，且對於遠UV量測值，將五個光譜相加且取平均值。使用由空白PBS輪次產生之CD光譜針對背景手動校正光譜，且使用EQ. 1轉換為平均殘基橢圓率。其中𝚹MRE為所計算之平均殘基橢圓率，𝚹EXP為以實驗方式量測之CD信號，MW為蛋白分子量，N為胺基酸殘基之數目，C為以mg/mL為單位之蛋白濃度，l為以cm為單位之光學路徑長度。 EQ. 1 ϴ _MRE=(ϴ _EXP•MW)/(10•N•C•l)

實例 7 ： 動物免疫原性研究 EC - 1678自Charles River Laboratories獲得6-8週齡之CD1小鼠。對於各組，在第0週、第4週及第8週，用與20 μg皂皮樹-21 (QS-21)混合之10 μg FimH蛋白對20隻動物進行皮下免疫接種，該QS-21來自含有5 mM丁二酸鹽、60 mM NaCl、0.1% PS80 (pH 5.6)的5.1 mg/mL QS-21儲備溶液。

實例 8 ： FimH 全細胞中和分析法為了評估來自經疫苗接種之動物之血清抑制繖毛化大腸桿菌與甘露糖基化受質結合的能力，採用使用酵母甘露聚糖之全細胞中和分析法，如PCT國際公開案第WO2021/084429 (2021年5月6日公開)中所描述。

實例 9 ： FimH - DSG WT 及來自 CHO 細胞之 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體之純化蛋白在CHO細胞中表現為具有C端His標記之分泌蛋白。收集細胞培養物上清液，且添加1 M Tris (pH 7.4)及5 M NaCl分別達到20 mM之最終濃度及150 mM最終濃度。在含有500 mM NaCl及40 mM咪唑之20 mM Tris (pH 7.5)中沖洗且平衡5 kDa TFF卡匣緩衝液。將上清液濃縮2倍，且相對於6倍體積之20 mM Tris (pH 7.5)、500 mM NaCl及40 mM咪唑進行透濾。收集滲餘物且用50-100 mL之20 mM Tris (pH 7.5)、500 mM NaCl及40 mM咪唑進行沖洗。用0.2 μm瓶頂過濾器過濾且沖洗滲餘物。向XK26/20管柱中裝填Ni-Sepharose 6快速流動樹脂(Cytiva Life Sciences)且用5倍管柱體積之20 mM Tris (pH 7.5)、500 mM NaCl及40 mM咪唑平衡。在一半流動速率下施用滲餘物，且洗滌直至達到穩定基線(約55倍管柱體積)。結合之蛋白用20 mM Tris、500 mM NaCl、500 mM咪唑(pH 7.5)溶離。合併含有相關蛋白之溶離份，且在4℃下在2 kDa透析卡匣中針對20 mM乙酸鈉(pH 4.3)進行透析，其間更換兩次緩衝液。將蛋白施用於已用相同緩衝液平衡之SP-Sepharose陽離子交換管柱(Cytiva Life Sciences)。結合於陽離子交換樹脂之材料用NaCl之線性梯度使用20 mM乙酸鈉(pH 4.3)、1 M NaCl緩衝液溶離。合併溶離份，且針對TBS (pH 7.4)進行透析。

實例 10 ：對 FimH - DSG WT 及 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體進行之分析型尺寸排阻層析法 ( SEC )使用Waters X bridge蛋白BEH SEC 125 Å 2.5 μm，4.6×300 mm管柱，在25℃下在含有10 mM EDTA之TBS (pH 7.4)緩衝液中進行分析型SEC。注射體積為10 μl且流動速率為0.5 mL/min。

實例 11 ： 藉由使用脈衝式電流分析偵測之高 pH 陰離子交換層析法 ( HPAEC - PAD ) 進行的單醣分析在120℃下，將FimH-DSG野生型及FimH-DSG三重突變體(G15A、G16A、V27A)之水性樣品在2 N三氟乙酸中消化2小時。此後，在45℃下在真空下將樣品蒸發至乾燥保持6小時。樣品在Milli-Q H ₂O中復原且用DIONEX ICS 3000離子層析系統藉由HPAEC-PAD進行評估。使用Dionex CarboPac PA1管柱(4×250 mm)，且使用H ₂O及200 mM NaOH之混合物進行等度溶離。藉由比較在FimH樣品與已知單醣標準物之溶液中偵測到之峰的滯留時間來確認單醣組合物。

實例 12 ： 偵測結合於 FimH - DSG WT 及 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體之 O - 抗原糖部分使用來自ForteBio之Octet HTX進行所有動力學即時生物分子相互作用實驗，以量測與FimH-DSG WT及FimH-DSG G15A G16A V27A突變體之可能的O-抗原相互作用。在含有240微升/孔之96孔黑色盤中，在30℃下在1000 rpm攪拌下進行實驗。將Ni-NTA生物感測器在含有1×PBS緩衝液的緩衝液中平衡，該緩衝液含0.5% BSA及0.05% Tween 20 (PBT)，隨後使其以5 μg/mL負載His標記之FimH-DSG WT或FimH-DSG G15A G16A V27A突變體5分鐘。使負載FimH-DSG WT或FimH-DSG G15A G16A V27A之生物感測器在PBT中重建基線歷時3分鐘，隨後使其負載O-抗原多醣CRM結合物(O9或O25b或O1a或O2)之2倍滴定物(200-3.125 μg/ml)。不含任何多醣的負載抗原之生物感測器用作參考物。將負載FimH及O-抗原滴定物之生物感測器浸沒於PBT中3分鐘以建立新基線。用5 μg/mL O-抗原特異性mAb在結合步驟中歷時5分鐘測試對結合於突變體之O-抗原之偵測(MAb 601用於O9，MAb ECO-80-11用於O25b，MAb ECO-48-2用於O1a，及MAb ECO-172-13用於O2)。使用Octet資料分析軟體進行減去參考物之結合步驟之動力學分析，且獲得呈奈米偏移形式之反應(列表)。

實例 13 ： 蛋白表現及純化FimH _LD及FimH-DSG突變體表現於Expi293細胞中，且藉由鎳親和力捕獲及隨後之尺寸排阻層析法自上清液分離。注意，一些突變體之表現量不佳且未進行生物化學或生物物理學評估(例如FimH _LDP26C V35C、N33C P157C、N33C L109C、V35C L107C、V35C L109C、S113C T158C)。在熱穩定性及配位體結合分析法中評估可獲得足夠產率之突變體。

實例 14 ： 鑑別在存在甘露糖苷配位體之情況下具有改良之熱穩定性及減少之解構溫度偏移的 FimH _LD 及 FimH - DSG 突變體使用基於SYPRO橙熱偏移之差示掃描螢光測定分析法來測定FimH突變體蛋白之解構溫度，其中T _m表示50%蛋白未摺疊時之溫度。非共價配位體通常在特異性結合時使蛋白標靶穩定，引起蛋白解構溫度升高。因此，在存在甲基α-D-甘露哌喃糖苷之情況下測定解構溫度，甲基α-D-甘露哌喃糖苷為α-D-甘露糖之衍生物且對FimH具有微莫耳親和力(Bouckaert, J.等人, Mol Microbiol .55, 441-455 (2005))，且計算蛋白在存在配位體之情況下與apo形式之解構溫度差異(∆T _m)。

與FimH _LDWT相比，野生型(WT) FimH-DSG蛋白相展現出明顯較高的解構溫度且在存在配位體之情況下具有較低的∆T _m(表10、表11)。FimH-DSG WT之解構溫度為71.66℃，而FimH _LDWT之解構溫度顯著較低(61.54℃)。在存在甲基α-D-甘露哌喃糖苷之情況下，FimH _LDWT之解構溫度偏移10.99℃，而FimH-DSG之溫度在存在配位體之情況下僅偏移2.13℃。此表明與FimH-DSG相比，配位體可更有效地使FimH _LD穩定，此可能反映FimH-DSG之配位體結合減少。

突變影響FimH蛋白在apo狀態下及在存在配位體之情況下的解構溫度。與野生型FimH _LD(61.54℃)相比，先前描述之FimH _LD鎖定突變體V27C L34C (Kisiela, D. I.等人, Proc Natl Acad Sci U S A110, 19089-19094 (2013)；Rodriguez, V. B.等人, J Biol Chem288, 24128-24139 (2013))展現出較低的解構溫度(51.42℃)，與已公開之資料一致(Kisiela, D. I.等人, Proc Natl Acad Sci U S A110, 19089-19094 (2013)；Rodriguez, V. B.等人, J Biol Chem288, 24128-24139 (2013))。與apo形式相比，將FimH _LDV27C L34C與甲基α-D-甘露哌喃糖苷一起培育使解構溫度升高7.27℃，表明配位體部分地使此突變體穩定且可具有殘餘配位體結合效率。在FimH-DSG之情形下，與WT相比，V27C L34C突變體之熱穩定性較差(T _m=63.29℃)，且與WT相比，在存在配位體之情況下V27C L34C突變體中之溫度偏移略微減小(∆T _m=1.29℃)。與WT FimH _LD相比，除F1L具有類似的解構溫度以外，六種Phe1 FimH _LD突變體中之五種之解構溫度降低。在存在配位體之情況下，六種FimH _LDPhe1突變體中之四種顯示出較小的∆Tm，表明配位體之穩定作用不佳。相比之下，與Phe1野生型FimH _LD相比，保守性最高的胺基酸取代F1W及F1Y分別展現中等及類似的∆Tm值。在整體熱穩定性方面，與V27C L34C相比，R60P參考突變(先前已描述-Rabbani等人, J . Biol . Chem .293:1835-1849 (2018)；Rodriguez, V. B.等人, J Biol Chem288, 24128-24139 (2013))及若干自行設計之新穎突變具有顯著升高之解構溫度。有趣的是，FimH _LDV28C N33C (兩個位點僅自參考物FimH _LDV27C L34C偏移一個殘基)在所有FimH _LD突變體中具有最高解構溫度(T _m=65.77℃)，且在存在甲基α-D-甘露哌喃糖苷之情況下具有2.81℃之∆T _m，表明配位體之親和力降低。與V27C L34C相比，FimH _LD中之甘胺酸環區中之突變(G15A、G16A)顯著提高熱穩定性，且在存在配位體之情況下觀測到極小的解構溫度偏移。甘胺酸環突變亦略微提高FimH-DSG之熱穩定性，且在存在配位體之情況下未觀測到溫度偏移，共同表明配位體未使FimH _LD及FimH-DSG突變體穩定，且因此相對於野生型可具有降低之結合效率。

FimH _LDWT之序列係衍生自大腸桿菌UTI分離株J96 (Hull, R.A.等人, Infect Immun33, 933-938 (1981))。V27A為天然變異體，其與毒性UTI分離株及與克隆氏病相關之分離株相關(Schwartz, D.J.等人, Proc Natl Acad Sci USA110, 15530-15537 (2013)；Cespedes等人, Front Microbiol8:639 (2017))。將V27A併入FimH _LD中可略微降低FimH _LDWT之解構溫度，且在存在甲基α-D-甘露哌喃糖苷之情況下，在V27A之情況下觀測到與WT相比較小之變化。另一方面，V27A似乎在FimH _LD中之甘胺酸環突變體G15A、G16A、G15P、G16P之情形下具有穩定作用，與不存在V27A之情況相比，該等突變體在存在V27A之情況下之解構溫度較高，且在存在V27A之情況下具有＜2℃之∆Tm，而在不存在此突變之情況下，∆Tm高達6.05℃ (G16P)。此外，含有V27A之FimH-DSG突變體的熱穩定性略微提高，且在存在配位體之情況下不存在可偵測之溫度偏移。總之，此表明V27A對FimH之解構溫度具有穩定作用且降低配位體結合效率。

若干種FimH _LD二硫化物及非極性至極性殘基突變體之表現量較低，且熱穩定性差或在存在甘露糖苷化合物之情況下展現顯著溫度偏移，此表明其保持配位體結合效率(表12)。此等物質在單一複製物中進行測試且被排除在進一步分析之外。類似地，分析若干種其他FimH-DSG突變體之熱穩定性，其中兩種在存在配位體之情況下具有改良之熱穩定性及減小之偏移(FimH-DSG V27A Q133K及FimH-DSG G15A G16A V27A Q133K)(表13)。Q133K突變為FimH之結合袋中之消除配位體結合的突變，且先前已描述(Schwartz等人, Proc Natl Acad Sci USA110:15530-15537 (2013))。未進一步分析此等突變體。表 10 ：在 apo 狀態下及在存在甲基 α - D - 甘露哌喃糖苷之情況下的 FimH _LD 突變體之解構溫度

FimH 變異體	複製物	Tm ( 平均 ) / ℃	標準方差 (Tm) / ℃	Δ Tm ( 平均 ) / ℃	標準方差 ( Δ Tm) / ℃
FimH _LDWT	11	61.54	0.81	10.99	0.84
FimH _LDV27C L34C	7	51.42	0.81	7.27	0.57
FimH _LDV27A	6	59.87	0.88	9.95	0.57
FimH _LDG15A	3	56.16	0.13	3.81	0.39
FimH _LDG15P	2	55.99	1.05	2.86	0.06
FimH _LDG16A	2	54.59	0.25	6.05	0.33
FimH _LDG16P	2	55.34	0.62	1.53	0.25
FimH _LDG15A V27A	4	57.77	0.54	1.45	0.51
FimH _LDG15P V27A	2	58.2	0.56	1.26	0.55
FimH _LDG16A V27A	6	57.65	0.45	1.84	0.97
FimH _LDG16P V27A	5	58.19	0.52	0.81	0.76
FimH _LDR60P	2	56.25	0.21	8.4	1.7
FimH _LDV27A R60P	3	60.1	0.44	3.12	0.45
FimH _LDG15A G16A V27A	3	59.14	0.43	0.42	0.5
FimH _LDV28C N33C	5	65.77	1.13	2.81	0.21
FimH _LDP26C V154C	4	60.41	1.79	5.74	1.05
FimH _LDF1I	2	55.18	0.04	0.34	1.16
FimH _LDF1L	2	60.07	0.23	0.78	0.54
FimH _LDF1M	3	52.68	1.52	1.1	1.63
FimH _LDF1V	3	52.4	0.05	0.74	0.93
FimH _LDF1W	3	52.82	0.6	4.51	0.64
FimH _LDF1Y	3	54.17	0.18	10.09	0.32

表 11 ：在 apo 狀態下及在存在甲基 α - D - 甘露哌喃糖苷之情況下的 FimH - DSG 突變體之解構溫度

FimH 變異體	複製物	T _m( 平均 ) / ℃	標準方差 (T _m) / ℃	∆T _m/ ℃	標準方差 ( Δ T _m) / ℃
FimH-DSG WT	11	71.66	0.48	2.13	0.17
FimH-DSG V27C L34C	6	63.29	1.24	1.29	0.49
FimH-DSG V27A	5	72.56	0.55	-0.35	0.22
FimH-DSG G15A V27A	5	73.02	0.64	-0.14	0.29
FimH-DSG G16A V27A	5	72.27	0.48	-0.04	0.06
FimH-DSG G15A G16A V27A	10	73.42	0.52	0.04	0.12

表 12 ：在 apo 狀態下及在存在甲基 α - D - 甘露哌喃糖苷之情況下的 FimH _LD 突變體之解構溫度 ， 單一複製物

FimH 變異體	T _m/ ℃	∆T _m/ ℃
FimH _LDP26C V156C	58.86	5.42
FimH _LDQ32C Y108C	61.09	9.77
FimH _LDP26C V154C	62.51	4.65
FimH _LDV28C P157C	59.61	7.16
FimH _LDS62C T86C	58.28	11.71
FimH _LDS62C L129C	57.12	12.77
FimH _LDY64C A127C	60.22	12.87
FimH _LDV112C T158C	59.64	15.2
FimH _LDV118C V156C	56.7	12.89
FimH _LDP12C A18C	54.47	5.23
FimH _LDG14C F144C	49.24	-0.1
FimH _LDL68C F71C	49.92	12.2
FimH _LDS113C G116C	59.8	9.29
FimH _LDA119C V155C	59.12	14.52
FimH _LDL34S V27A	48.86	12.78
FimH _LDL34T V27A	53.22	10.46
FimH _LDL34N V27A	47.31	13.07
FimH _LDA119S V27A	59.8	8.52
FimH _LDA119T V27A	59.51	9.19
FimH _LDA119N V27A	57.87	7.55
FimH _LDV27A G65A	59.8	10.85

表 13 ：在 apo 狀態下及在存在甲基 α - D - 甘露哌喃糖苷之情況下的 FimH - DSG 突變體之解構溫度 ， 限定複製物

FimH 變異體	複製物	T _m( 平均 ) / ℃	標準方差 (T _m) / ℃	∆T _m/ ℃	標準方差 ( Δ T _m) / ℃
FimH-DSG A115I	2	68.51	0	4.07	0
FimH-DSG V185I	2	71.37	0.48	2.51	0.41
FimH-DSG DSG V3I	1	70.74	N/A	3.09	N/A
FimH-DSG V163I	1	70.36	N/A	3.48	N/A
FimH-DSG Q133K	1	71.61	N/A	1.74	N/A
FimH-DSG V27A Q133K	1	75.1	N/A	0.1	N/A
FimH-DSG G15A G16A V27A Q133K	1	73.93	N/A	1.27	N/A

實例 15 ： 鑑別對甘露糖苷配位體之親和力降低的 FimH 突變體使用直接結合螢光偏振分析法，用螢光素結合之辛基聯苯甘露哌喃糖苷(BPMP)配位體測定FimH突變體針對甘露糖苷配位體之解離常數(K _d)。表14中顯示FimH _LD突變體相對於WT之K _d值。FimH _LDWT及V27A顯示針對BPMP之類似的高親和力。與FimH _LDWT相比，參考鎖定突變體FimH _LDV27C L34C (Kisiela, D. I.等人, Proc Natl Acad Sci USA110, 19089-19094 (2013)；Rodriguez, V.V. 等人, J Biol Chem288:24128-24139 (2013))對配位體之親和力低91倍，而FimH _LDR60P V27A (Rabbani等人, J Biol Chem293:1835-1849 (2018))之親和力低179倍。將本文中所揭示之突變體與參考鎖定突變體進行比較。對於甘胺酸環突變體FimH _LDG15A V27A、G15P V27A、G16P V27A及G16A G16A V27A未偵測到結合，而與WT相比，G16A V27A之K _d增加156倍。甘胺酸環突變與V27A之組合均展現比單獨的甘胺酸環突變體顯著更高之K _d，此表明V27A具有不確定之穩定作用，但其對FimH _LDWT之K _d影響極小。包括V27A亦進一步降低FimH _LDR60P之結合親和力。

在此分析法中測試三種新穎的二硫化物鎖定突變體，與FimH _LDWT相比，所有突變體之配位體結合親和力均適度降低(親和力降低33-43倍)。與FimH _LDWT類似，含有非極性至極性突變之FimH _LD突變體(A119T V27A、A119N V27A、L34T V27A、L34N V27A)對BPMP具有高親和力。除具有與FimH _LDWT類似之結合親和力的F1Y以外，FimH _LDF1突變體展現不良的結合。

FimH-DSG構築體之配位體結合親和力顯示於表15中。FimH-DSG WT之K _d比FimH _LDWT之K _d大超過100倍，此可能反映兩種形式之FimH的不同構形狀態。與FimH-DSG WT相比，FimH-DSG V27A亦具有更低的親和力。此與先前資料一致，該資料顯示與FimH V27相比，具有A27的全長FimH與FimC與FimG之複合物對甘露糖苷之結合親和力降低(Schwartz等人, Proc Natl Acad Sci USA110:15530-15537 (2013))。將鎖定突變V27C L34C引入FimH-DSG中可使對BPMP之親和力降低2.5倍，而與FimH-DSG WT相比，甘胺酸環突變體FimH-DSG G15A G16A V27A之親和力降低28倍。無法計算FimH-DSG G15A V27A及FimH-DSG G16A V27A之K _d，表明此等突變體不能結合BPMP。如由熱穩定性資料(實例14)所表明，與FimH-DSG WT相比，經設計以經由改變菌毛蛋白-凝集素域界面(A115I、V185I)而使開放構形中之FimH-DSG穩定的突變可改良結合親和力。

總之，鑑別FimH _LD或FimH-DSG蛋白中之甘胺酸環突變對BPMP具有極低結合親和力。基於此等及熱穩定性資料，選擇甘胺酸突變體用於評估小鼠中之功能性免疫原性研究。表 14 ： FimH _LD 突變體與辛基聯苯甘露哌喃糖苷配位體之結合 K _d

FimH 變異體	複製物	平均 K _d/ nM	標準方差 / nM
FimH _LDWT	10	0.193	0.041
FimH _LDV27A	3	0.213	0.034
FimH _LDV27C L34C	7	17.706	3.052
FimH _LDG15P	1	＞2000	N/A
FimH _LDG15P V27A	4	＞2000	N/A
FimH _LDG15A	1	46.74	N/A
FimH _LDG15A V27A	4	＞2000	N/A
FimH _LDG16P	1	＞2000	N/A
FimH _LDG16P V27A	4	＞2000	N/A
FimH _LDG16A	1	9.588	N/A
FimH _LDG16A V27A	3	30.177	0.8
FimH _LDR60P	1	4.46	N/A
FimH _LDV27A R60P	6	34.555	8.232
FimH _LDG15A G16A V27A	2	＞2000	N/A
FimH _LDV27A G65A	1	4.6	N/A
FimH _LDV28C N33C	2	6.465	2.128
FimH _LDV28C P157C	1	7.68	N/A
FimH _LDP26C V154C	1	8.4	N/A
FimH _LDL34T V27A	1	0.4	N/A
FimH _LDL34N V27A	1	1.7	N/A
FimH _LDA119T V27A	1	0.4	N/A
FimH _LDA119N V27A	1	1	N/A
FimH _LDF1Y	2	0.317	N/A
FimH _LDF1W	1	48.4	N/A
FimH _LDF1M	1	＞2000	N/A
FimH _LDF1L	1	534	N/A
FimH _LDF1I	1	＞2000	N/A
FimH _LDF1V	1	472	N/A

表 15 ： FimH - DSG 突變體與辛基聯苯甘露哌喃糖苷配位體之結合 K _d

FimH 變異體	複製物	平均 K _d/ nM	標準方差 / nM
FimH-DSG WT	10	23.384	8.197
FimH-DSG V27A	2	53.545	8.973
FimH-DSG V27C L34C	3	59.927	28.187
FimH-DSG G15A V27A	2	＞2000	N/A
FimH-DSG G16A V27A	2	＞2000	N/A
FimH-DSG G15A G16A V27A	1	667.9	N/A
FimH-DSG A115I	1	9.8	N/A
FimH-DSG V185I	1	21	N/A

實例 16 ： 藉由圓二色性光譜分析確認 FimH 突變體之構形狀態藉由圓二色性(CD)對展現出改良之熱穩定性及降低之針對甘露糖苷配位體之結合親和力的FimH _LD及FimH-DSG突變體(實例14及15)進行二級及三級結構分析。野生型及構形鎖定之FimH _LD突變體具有不同的三級CD曲線(Rabbani等人, J Biol Chem293:1835-1849 (2018))。藉由遠UV CD (二級結構)及近UV CD (三級結構)檢測所選擇之FimH _LD及FimH-DSG野生型及突變體蛋白之二級及三級結構(參見圖1)。FimH _LD之遠UV CD光譜與先前公開之資料一致(Rabbani等人, J Biol Chem293:1835-1849 (2018))，且FimH _LD及FimH-DSG之遠UV光譜均表徵具有高β摺疊含量之蛋白。與野生型FimH _LD相比，FimH _LDV27C L34C之遠UV光譜稍有不同，如由其他人所觀測到(Rabbani等人, J Biol Chem293:1835-1849 (2018))，此反映開放的構形狀態。天然存在之FimH _LDV27A突變體之二級結構曲線亦略有變化。總體而言，FimH _LD或FimH-DSG突變體之二級結構與野生型蛋白高度類似(圖1)，表明此等突變體中之整體二級結構並未改變。FimH _LD突變體之三級結構曲線與在開放構形狀態下穩定的FimH _LDV27 L34C及V27A R60P之自製及公開的CD光譜極相似(Rabbani等人, J Biol Chem293:1835-1849 (2018))。與野生型FimH _LD或FimH _LDV27A相比，本文所描述之突變體之曲線亦顯著不同。總之，此等資料表明所引入之突變使FimH _LD之構形轉變為開放構形，而FimH-DSG三級結構在引入本文中評估之可使構形穩定之突變之後保持基本不變。

實例 17 ： 使用中和單株抗體表徵 FimH 突變體使用凝集素域特異性單株抗體299-3、304-1及440-2，藉由生物層干涉量測分析法表徵若干所選擇之FimH抗原之構形。競爭實驗(未示出)證實抗體229-3及304-1結合於與MAb 475及926類似之配位體結合位點抗原決定基(Kisiela等人, Proc Natl Acad Sci USA110:19089-19094 (2013))。單株抗體440-2結合於不同抗原決定基且似乎優先結合於呈開放構形之FimH _LD。儘管針對FimH _LDV27A之結合減少，但抗體229-3及304-1仍能夠識別所有FimH _LD(表16)及FimH-DSG (表17)變異體。相比之下，與WT或V27A相比，所有FimH _LD或FimH-DSG突變體對抗體440-2之反應均較高。此與圖1中所示之CD光譜分析曲線一致，表明FimH _LD突變體呈開放構形。FimH-DSG WT中之對440-2之反應亦增加，此與FimH-DSG突變體及WT之重疊CD光譜分析曲線(實例16)共同表明，無論存在或不存在穩定突變，此蛋白均呈開放構形狀態。表 16 ：結合於 FimH _LD 變異體之 MAb

FimH 變異體	反應 (nm)
單株抗體
299-3	304-1	440-2
FimH _LDWT	3.1034	3.0195	0.0427
FimH _LDV27A	0.4378	0.5354	0.0595
FimH _LDV27A R60P	3.1921	3.0254	0.8483
FimH _LDV27A G15A	3.3127	3.0286	0.7799
FimH _LDV27A G15P	3.0686	2.9482	0.6242
FimH _LDV27A G16A	3.438	3.1974	0.7486
FimH _LDV27A G16P	3.255	3.1626	0.8816
FimH _LDG15A G16A V27A	3.3359	3.0596	0.7854
FimH _LDV27C L34C	3.107	2.7702	0.8063
FimH _LDV28C N33C	3.0536	2.7444	0.7231
FimH _LDP26C V154C	3.1056	2.8871	0.8254

表 17 ：結合於 FimH - DSG 變異體之 MAb

FimH 變異體	反應 (nm)
單株抗體
299-3	304-1	440-2
FimH-DSG WT	2.4379	2.2184	0.3763
FimH-DSG V27A	2.4802	2.1687	0.3516
FimH-DSG V27C L34C	2.3477	2.2249	0.3329
FimH-DSG V27A G15A	2.5204	2.2999	0.3707
FimH-DSG V27A G16A	2.6876	2.4157	0.4183
FimH-DSG G15A G16A V27A	2.6765	2.3015	0.4926

實例 18 ： FimH 突變體中和資料為評估所選擇之突變體之相關免疫原性，用FimH突變體對小鼠進行疫苗接種。使用上文及先前所描述之全細胞酵母甘露聚糖中和分析法(PCT國際公開案第WO2021/084429號，2021年5月6日公開)來定量FimH突變體引發功能性抗體效價之效能。簡言之，將繖毛化大腸桿菌與血清一起培育且使其結合於經酵母甘露聚糖塗佈之微量滴定盤。洗滌盤且使用螢光探針偵測結合於盤之活的大腸桿菌之數目。抑制繖毛化細菌與酵母甘露聚糖結合之血清中和效價係由對來自經疫苗接種小鼠之血清進行一系列八點兩倍稀釋測定。效價表示使50%細菌保持結合於盤之血清稀釋度的倒數。平均效價及反應之概述顯示於表18中。劑量2及3後之個別小鼠IC ₅₀反應的圖顯示於圖2及圖3中。表 18 ： VAC - 2020 - PRL - EC - 1678 FimH _LD 及 FimH - DSG 突變體酵母甘露聚糖結合中和分析法反應者比率及 GMT

蛋白	IC ₅₀GMT	反應者比率 (%)	反應者 (n)	小鼠 (n)
PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3
FimH _LDWT	89	191	20	40	4	8	20	20
FimH _LDV27A	104	439	26	61	5	11	19	18
FimH-DSG V27A	1175	6102	78	100	14	18	18	18
FimH _LDG15A V27A	57	683	5	53	1	10	20	19
FimH-DSG G15A V27A	1740	3400	84	100	16	19	19	19
FimH _LDG15P V27A	58	346	5	42	1	8	20	19
FimH _LDG16A V27A	93	1193	13	69	2	11	16	16
FimH _LDG16P V27A	91	352	10	45	2	9	20	20
FimH _LDG15A G16A V27A	111	1307	26	63	5	12	19	19
FimH-DSG G15A G16A V27A	1869	2386	84	95	16	18	19	19
FimH _LDV27A R60P	212	1056	32	63	6	12	19	19
FimH _LDV28C N33C	103	461	16	53	3	10	19	19

先前研究(PCT國際公開案第WO2021/084429號，2021年5月6日公開)顯示，與FimH _LDWT相比，先前所描述之二硫化物鎖定突變體FimH _LDV27C L34C (Kisiela等人, Proc Natl Acad Sci USA110:19089-19094 (2013))未改良功能性免疫原性。圖2中直接比較新穎的FimH _LD突變體及另一先前所描述之構形限定之突變體FimH _LDV27A R60P (Rabbani等人, J Biol Chem293:1835-1849 (2018))的功能性免疫原性。與FimH _LDWT相比，突變體FimH _LDG16A V27A、FimH _LDG15A G16A V27A及FimH _LDV27A R60P產生較高的反應者數目及較高效價(p值＜0.05)。雖然在起反應之小鼠中觀測到高效價，但其他突變(G15A V27A、G16P V27A、V28C N33C)未顯著增強功能性免疫原性，此等組中之反應者之數目與FimH _LDWT組之數目類似。因此，與FimH _LDWT相比，經設計以藉由將FimH _LD鎖定為開放構形來增強FimH _LD之功能性免疫原性之若干突變體改良功能性免疫原性。在用2個劑量之FimH _LD及FimH-DSG突變體進行疫苗接種之後，與FimH _LD相比，在用FimH-DSG進行疫苗接種之組中產生中和效價之動物明顯更多(圖3)。此趨勢維持至劑量3後，其中用FimH-DSG V27A、FimH-DSG G15A V27A及FimH-DSG G15A G16A V27A進行疫苗接種之組中之95%-100%小鼠起反應。在劑量3後，用FimH-DSG突變體進行疫苗接種之所有組中的IC ₅₀幾何平均效價(GMT)亦顯著較高。與FimH _LD突變體相比，類似的FimH-DSG突變體(V27A、G15A V27A、G15A G16A V27A)產生更高的GMT (p值＜0.05)。

實例 19 ： FimH - DSG G15A G16A V27A 不與宿主聚醣結合且可分離成均質FimH-DSG WT及FimH-DSG G15A G16A V27A突變體蛋白在CHO細胞中表現為含有C端His標記之分泌蛋白。如圖4中所示對FimH-DSG之重組His標記之形式進行純化。

在超濾及透濾之後，在鎳親和樹脂上分離含有FimH-DSG WT之不含細胞的培養基且對其進行陽離子交換層析。溶離峰極寬且展現若干獨特的肩部區域，表明FimH-DSG WT物種之可能的異質性(圖5)。有趣的是，當藉由SDS-PAGE分析溶離份時，在各溶離份中僅偵測到對應於FimH-DSG WT之單一譜帶。

在純化過程期間，FimH-DSG展現出之特性表明其溶解度較差。特定言之，藉由目視檢查，FimH-DSG WT Ni-Sepharose溶離液始終看起來混濁。在SP-Sepharose上進行之後續純化中的向酸性pH值(4.3)之偏移引起蛋白溶液之澄清。然而，在將分離之蛋白轉移(透析)至TBS (pH 7.4)中後，再次觀測到FimH-DSG WT製劑之較差溶解度及聚集傾向。此引起蛋白之由聚集及沈澱導致之漸進性損失。藉由離心移除沈澱物未能終止或減緩聚集過程，儘管此時之蛋白濃度通常將降低至0.2-0.4 mg/mL。可藉由將10%甘油併入儲存(TBS，pH 7.4)緩衝液中來控制由聚集引起之蛋白損失。然而，甘油之存在未能阻止HMW可溶性聚集物之形成，該等聚集物係藉由在350 nm下監測光散射而以分光光度法偵測到。

當使用相同方法分離FimH-DSG G15A G16A V27A突變體時，觀測到若干差異。首先，此等差異包括在自Ni-Sepharose管柱溶離蛋白時不存在任何混濁跡象。其次，自SP-Sepharose管柱溶離之曲線峰不如在WT FimH-DSG之情況下(圖6)觀測到之曲線峰寬。最後，在轉移至生理pH緩衝液(TBS pH 7.4)中之後，FimH-DSG G15A G16A V27A突變體仍保持完全可溶。在高達5-6 mg/mL之濃度下，FimH-DSG G15A G16A V27A突變體未顯示任何聚集或沈澱跡象。

對經分離之FimH-DSG WT及FimH-DSG G15A G16A V27A突變體之分析進一步揭露FimH-DSG之此兩種變異體之間的顯著差異。分析型尺寸排阻層析法(SEC)表明，FimH-DSG G15A G16A V27A突變體以單峰形式溶離，其滯留時間與其分子量一致。相比之下，野生型FimH-DSG之溶離曲線由若干峰構成，其中主峰之滯留時間小於圖7中所示之突變體之滯留時間。此等資料清楚地表明FimH-DSG WT形成可藉由SEC偵測之高分子量複合物。由FimH-DSG WT形成之HMW複合物之存在及聚集傾向可能與其N端凝集素結合域之功能活性相關。假設在CHO醱酵期間及在分泌至培養基中之後，FimH-DSG WT與自宿主CHO細胞表面釋放之聚醣分子結合。由於聚醣之分支鏈性質，各聚醣可容納超過一個FimH-DSG分子之複本。藉由增加FimH-DSG之數目而進行的聚醣之持續「裝飾」將引起各種HMW複合物之形成，且最終引起溶解度及沈澱物之損失(參見圖8)。為測試此假設，用脈衝式電流分析(電化學)偵測(HPAEC-PAD)分析對經分離之野生型及突變型FimH-DSG (及FimH _LD)物種進行高pH陰離子交換層析。此方法允許鑑別蛋白樣品中之寡醣或聚醣以及提供關於此等寡醣之組合物的資訊。簡言之，進行酸水解以釋放單醣，隨後相對於單醣標準物分析各峰。HPAEC-PAD分析之結果表明，經分離之FimH-DSG WT (經糖基化)及FimH _LD(未經糖基化，資料未示出)製劑含有大量單醣。FimH-DSG WT及FimH-DSG G15A G16A V27A突變體中鑑別之單醣的概述顯示於表19中。FimH-DSG G15A G16A V27A突變體中之單醣之含量顯著小於FimH-DSG WT中之含量。此外，所偵測之低單醣含量完全有可能表示預測將修飾N235的N-聚醣之糖部分。表 19 ：經 標準化之藉由 HPAEC - PAD 偵測的來自 FimH - DSG WT 及 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體之主峰之各種 SP - Sepharose 溶離份中之單醣之量 ( 微克 / 毫克蛋白 )

糖	FimH-DSG WT	總計
鼠李糖	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Nac Gal	0	0	0	99	73	0	52	0	177	401
Nac Glu	133	190	9	0	0	0	0	44	0	376
半乳糖	24	21	6	0	0	0	41	33	35	160
葡萄糖	8	3	0	19	25	62	34	52	33	236
甘露糖	47	35	10	0	0	0	34	59	56	241
糖	FimH-DSG G15A G16A V27A	總計
Nac-葡萄糖	0	0	20	0	0	0	0	0	0	20
半乳糖	0	0	7	0	0	0	0	0	0	7
甘露糖	0	0	17	0	0	0	0	0	0	17

實例 20 ： FimH _LD 及 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體不與大腸桿菌 O - 抗原結合大腸桿菌O-抗原O8及O9之重複單元由聚甘露糖殘基構成。此引起FimH是否可以FimH-O-抗原結合物組合疫苗形式結合O-抗原結合物之問題。設計生物層干涉量測實驗以測試FimH _LDWT是否可結合於游離O9多醣或CRM結合之O9多醣，及FimH _LDG15A G16A V27A突變體(其在結合分析法中證實對甘露糖苷配位體不具有可偵測之親和力)是否可結合。O-抗原結合資料顯示於表20中。在高濃度之游離多醣情況下，觀測到FimH _LDWT之反應。在CRM結合之多醣之情況下觀測到更多的反應。然而，在突變型蛋白FimH _LDG15A G16A V27A之情況下，可偵測之結合消失。對FimH-DSG進行類似實驗，其中測試FimH-DSG WT或FimH-DSG G15A G16A V27A突變體結合於不同血清型(O9、O25b、O1a及O2)之游離或CRM結合之O-抗原之能力(表21)。如自其甘露糖苷配位體結合特性所預期，FimH-DSG WT之總結合親和力顯著低於對應的FimH _LD變異體。在最高濃度之CRM結合物之情況下，觀測到FimH-DSG WT之一些可滴定之結合，且觀測到游離多醣之僅略微高於背景水準之結合。如同FimH _LDG15A G16A V27A突變體，FimH-DSG G15A G16A V27A蛋白不與任何游離或CRM結合之多醣結合。總之，與親本WT FimH _LD或WT FimH-DSG抗原不同，衍生之G15A G16A V27A突變體未能結合O-抗原，此提供用於研發組合型FimH及O-抗原疫苗的潛在方法。表 20 ： FimH _LD G15A G16A V27A 突變體不與游離或 CRM 結合之 O - 抗原 O9 多醣結合

O- 抗原 (µg/ml)	反應 (nm)
FimH _LDWT	FimH _LDG15A G16A V27A
游離 O9 多醣	O9-CRM	游離 O9 多醣	O9-CRM
200	0.765	0.988	0.019	0.017
100	0.349	0.466	-0.007	0.020
50	0.162	0.253	0.023	0.018
25	0.074	0.131	0.024	0.022
12.5	0.035	0.074	0.024	0.005
6.25	0.013	0.036	0.021	0.003
3.13	0.004	0.02	0.027	0.013

表 21 ： FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體不與游離或 CRM 結合之 O - 抗原多醣結合

O- 抗原血清型	O- 抗原 (µg/ml)	反應 (nm)
FimH-DSG WT	FimH-DSG G15A G16A V27A
游離多醣	CRM 結合物	游離多醣	CRM 結合物
O9	200	0.039	0.248	-0.008	-0.028
O9	100	0.037	0.134	-0.002	-0.028
O9	50	0.033	0.094	-0.019	-0.021
O9	25	0.050	0.062	-0.009	-0.029
O9	12.5	0.039	0.06	-0.021	-0.027
O9	6.25	0.030	0.048	-0.012	-0.023
O9	3.13	0.032	0.046	-0.018	-0.029
O25b	200	-0.009	0.179	-0.051	-0.043
O25b	100	-0.006	0.072	-0.025	-0.045
O25b	50	-0.007	0.039	-0.027	-0.045
O25b	25	-0.004	0.026	-0.029	-0.043
O25b	12.5	-0.002	0.019	-0.028	-0.046
O25b	6.25	0.000	0.013	-0.028	-0.045
O25b	3.13	-0.006	0.011	-0.03	-0.048
O1a	200	0.011	0.401	-0.02	-0.048
O1a	100	0.018	0.160	-0.021	-0.051
O1a	50	0.009	0.072	-0.025	-0.042
O1a	25	0.014	0.031	-0.024	-0.050
O1a	12.5	0.009	0.006	-0.029	-0.047
O1a	6.25	0.013	-0.005	-0.032	-0.05
O1a	3.13	0.008	-0.008	-0.030	-0.053
O2	200	0.032	0.510	-0.011	-0.039
O2	100	0.029	0.240	-0.046	-0.051
O2	50	0.029	0.119	-0.032	-0.048
O2	25	0.025	0.066	-0.032	-0.048
O2	12.5	0.028	0.035	-0.023	-0.040
O2	6.25	0.029	0.017	-0.024	-0.052
O2	3.13	0.028	0.006	-0.023	-0.049

實例 21 ： 在存在或不存在 O - 抗原之情況下用 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體進行疫苗接種的非人類靈長類動物 A. 方法 1. FimH IgG dLIA在室溫下，將與在光譜上不同的MagPlex-C微球(Luminex)偶合的大腸桿菌突變體繖毛抗原FimH-DSG G15A G16A V27A在阻斷緩衝液中稀釋至50,000個珠粒/毫升之濃度持續1-2小時，同時在即將進行分析法初級培育之前振盪。將經稀釋之微球混合物添加至含有經適當稀釋之非人類靈長類動物血清樣品、對照物及參考標準物之分析盤中，參考標準物為結合FimH-DSG之菌毛蛋白域的自製人類化單株抗體(FimH Y202)，且在2-8℃下振盪培育隔夜。在洗去未結合之成分之後，將經純化之R-藻紅素山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch Labortories，109-116-170)添加至微球混合物中且在室溫下振盪培育90分鐘。藉由Luminex FLEXMAP 3D讀取器量測之螢光PE信號之量值與結合於蛋白偶合之微球的抗FimH-DSG IgG之量成正比。使用定製SAS應用來分析資料，其使用標準曲線之對數/對數線性回歸模型以自中值螢光強度內插抗原特異性抗體濃度(μg/mL)。由標準曲線偏差計算出定量下限(LLOQ)為0.763 μg/mL。

2. 4 價 O - Ag IgG dLIA血清型O25b、O1a、O2及O6之大腸桿菌長O-抗原多醣與聚-L-離胺酸共價結合，且衍生之結合物由標準EDC/NHS介導之偶合方案與在光譜上不同的MagPlex-C微球(微球)偶合。將微球與連續稀釋之非人類靈長類動物血清樣品、對照物及多株標準物一起培育，在2-8℃下振盪培育隔夜。在洗滌之後，在室溫下振盪培育90分鐘之後，用PE結合之山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch Labortories，109-115-098)偵測結合之血清型特異性IgG。對於四個在光譜上不同的區域中之每一者，藉由Luminex 200讀取器來量測螢光且表示為中值螢光強度。多株標準物滴定之標準曲線圖產生具有任意賦值之線性斜率曲線，可由其將信號內插為血清型特異性抗體水準(U/mL)。

3. 非人類靈長類動物 ( NHP )最初自Charles River Laboratories (Houston, TX)獲得雌性食蟹獼猴( Macaca fasicularis)，隨後轉移至Pfizer, Pearl River, NY (年齡範圍：4-5歲，體重範圍：3.1-5.9 kg)。NHP圈養在標準四方籠中且隨意取食水及食物。將動物皮下植入微晶片以監測內部溫度。基於陰性尿液qPCR結果，僅募集未經大腸桿菌感染之NHP (參見下文方法章節10)。

4. 疫苗接種及血液收集在第0週、第4週及第14週用媒劑對照物(PBS，pH 6.2)、單體繖毛抗原FimH-DSG G15A G16A V27A (50微克/劑量)或用4價O25b、O1a、O2及O6 O-抗原多醣結合物(1微克/劑量)與單體繖毛抗原FimH-DSG G15A G16A V27A (50微克/劑量)之混合物對食蟹獼猴進行肌肉內免疫接種(0.55 mL)。用AS01b作為疫苗抗原之佐劑(每劑量50 μg MPL及50 μg QS-21)。

在第0週、第6週及第16週，使用21g安全針頭/真空管，經由股靜脈將10 mL血液收集至1個血清分離管(BD真空管)中。收集管在室溫下靜置30分鐘且在3000 g下離心10分鐘。收集上清液中之血清，等分且儲存於-80℃下。

5. 大腸桿菌臨床分離株基於患者年齡及樣品收集之來源(PFEEC0578，男性，38歲，膀胱來源)自UPEC菌株中選擇一種代表性ST131 O25b臨床分離株，該等UPEC菌株係作為Pfizer贊助之抗菌測試領導及監督(Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance；ATLAS)資料庫之一部分收集，該資料庫由國際衛生管理協會(International Health Management associate；IHMA)臨床實驗室維護。菌株攜帶編碼未知類型之莢膜多醣產物的基因。

6. 製備 UPEC 菌株儲備液藉由接種12 mL LB培養液(Teknova，#L8198)，隨後在37℃下，在275 rpm攪拌下培育隔夜來製備大腸桿菌儲備液。在18小時之後，在250 mL燒瓶(Corning，#431407)中，在113 mL LB培養液中稀釋12 mL培養物。培養物在37℃下，在約275 rpm下培育2至3小時，直至OD ₆₀₀為2.1至2.7。將二十五毫升甘油(80%，MP，#3055-044)混合至培養物中。在-80℃下冷凍5 mL等分試樣以用於長期儲存。藉由將儲備液之連續稀釋液塗佈於TSA盤(BD，BBL Trypticase大豆瓊脂(大豆酪蛋白消化物瓊脂)目錄號B21283X)上，且在30℃下培育18小時後進行分析來確認每瓶之活細菌之濃度。

7. 膀胱炎之非人類靈長類動物模型藉由肌肉內投與之氯胺酮/得麻效(Dexdomitor)混合物來麻醉NHP。為防止尿道插管引起膀胱污染，用蘸有無菌生理鹽水之無菌紗布及/或含有苯紮氯銨之消毒濕巾擦拭肛門與生殖器區域。將預先塗佈有Surgi Lube以預防組織刺激之無菌5 French紅色橡膠導管經由尿道平緩地引入膀胱中。接著經由自然流動或藉由注射器抽吸來排出膀胱中之任何尿液。經由導管，將含有10 ⁸CFU之UPEC菌株PFEEC0578之1 mL體積直接投與膀胱。

8. 攻擊後之動物監測在攻擊之後，在第1週期間一天檢測兩次動物，且在隨後數週期間一天監測一次。監測NHP直至攻擊後30天。監測包括觀測排出尿液之外觀、行為或食慾之變化、疼痛/不適跡象及體溫量測。

9. 經由導管置放進行之尿液收集為了收集乾淨的尿液樣品，如上文所描述將導管插入經麻醉之NHP之膀胱。在導管置放之後，經由自然流動或藉由注射器抽吸來排出膀胱中之尿液。當膀胱不含尿液時，輸注10 mL生理鹽水且經由導管重複抽吸。將所收集之所有樣品立即儲存於冰上。

10. DNA 提取使用Qiagen Minelute DNA提取套組(Qiagen，參考號51306，數量有時受所收集之樣品體積限制)自NHP尿液樣品之至多三份複製物提取大腸桿菌DNA。遵循製造商之血液及體液旋轉方案(Blood and Body Fluid Spin protocol)，其中進行以下修改：樣品起始體積增加至500 μL (若樣品體積允許)，緩衝液AL體積增加至500 μL，蛋白酶K體積增加至50 μL，50 μL分子生物等級用水(Corning Inc.，參考號46-000-CM)升溫至37℃且用於代替溶離緩衝液EB。最後，在添加37℃分子生物等級用水之後，在室溫下培育旋轉管柱5分鐘，隨後進行最終旋轉。

11. 定量即時 PCR ( qPCR )使用定量即時PCR (qPCR)評估NHP尿液樣品中之細菌負荷。使用以下引子藉由qPCR擴增大腸桿菌O25b血清型特異性DNA：正向，TTGAAAGTGATGGTTTGGTAAGAAAT (SEQ ID NO: 109)；反向，TGCAGCACGTATGATAACTTCAAAG (SEQ ID NO: 110)，且使用具有Fam螢光報導子及序列AGGATATTTTACCCAGCAGTGCCCCGT (SEQ ID NO: 111)之探針來定量複製。

O25b血清型特異性擴增子與O25b血清型orf10區域之各部分對應。引子及探針為定製設計的，以凍乾形式自Integrated DNA Technologies購得且在緩衝液TE (Corning Inc.，參考號46-009-CM)中復原至100 nmol/mL之濃度。

在96孔Applied Biosystems MicroAmp光學96孔反應盤(Applied Biosystems，參考號N8010560)中分析來自上文所描述之DNA提取程序的DNA樣品。qPCR反應以25 μl之總體積進行，使用12.5 μL Applied Biosystems 2X Taqman快速高級主混合物(Applied Biosystems，參考號4444554)、0.125 μL各復原之引子、0.5 μL探針、1.75 μL分子生物等級用水(Corning Inc.，參考號46-000-CM)及每孔10 μL樣品。

用於擴增DNA之反應條件為50℃持續2分鐘，隨後為95℃持續2分鐘，以及40個95℃持續3秒及60℃持續30秒之循環，在Applied Biosystems 7500即時PCR系統或Biosystems QuantStudio 6即時PCR系統(Applied Biosystems)上操作。

為了進行定量，研發線性標準曲線。將與各攻擊實驗中所使用相同之大腸桿菌之冷凍儲備液的等分試樣(如上文所描述製備)在無菌PBS (Corning，21-040-CM)中稀釋至1×10 ⁹CFU/mL。隨後進行連續稀釋以產生含有濃度為1×10 ⁸、1×10 ⁷、1×10 ⁶、1×10 ⁵、1×10 ⁴、1000、100及10 CFU/mL之大腸桿菌的溶液。在無菌PBS (Corning，21-040-CM)中或在接種前自個體收集之NHP尿液(合併、兩次過濾)中製備連續稀釋液。隨後發現在PBS及合併、兩次過濾之NHP尿液中的稀釋液係等效物。藉由塗佈於TSA盤(BD，BBL Trypticase大豆瓊脂(大豆酪蛋白消化物瓊脂)目錄號B21283X)上來確認在各稀釋度下存在之活細菌的數量。如上文所描述，使用與用於自樣品提取DNA之方法相同的方法，對各連續稀釋物進行DNA提取。在每個qPCR分析盤上一式兩份地操作此等qPCR標準物。

使用Applied Biosystems QuantStudio軟體進行線性回歸分析。統計分析確定所產生之標準曲線在100與1×10 ⁸個細菌/毫升之間呈線性。因此，測定定量下限(LLOQ)為100個細菌/毫升。在一些情況下，樣品達到螢光臨界值，但在對應於低於LLOQ之量的循環中，在其他情況下，完全未達到螢光臨界值(未測定之值)。當此等條件中之任一者出現時，值在此處報導為LLOQ之值(100個細菌/毫升)。

12. 髓過氧化酶 ( MPO ) ELISA使用Invitrogen髓過氧化酶即時ELISA套組(Invitrogen，參考號BMS2038INST)定量NHP尿液中之髓過氧化酶(MPO)。將PIPES緩衝液添加至純的尿液樣品中直至0.5 M PIPES緩衝液(pH 6.8) (Alfa Aesar，參考號J61786-AK)之最終濃度為5%。將樣品渦旋15秒且接著用製造商供應之樣品稀釋劑進行1:1稀釋。一式兩份地分析樣品且遵循製造商之說明進行分析法之其餘部分。在最終終點，在Spectramax Plus儀器(Molecular Devices)上量測450 nm下之色彩強度。使用分析法套組中所包括之標準物產生標準曲線。關於分析，將分析法套組之低標準(156.25 pg/mL)作為偵測下限(LLOD)。Spectramax儀器之配套軟體(Softmax, Molecular Devices)可外推超出低標準之值。對於任何低於LLOD值的二分之一(78.125 pg/mL)的外推值或當任何分析法結果完全低於偵測極限時，使用LLOD值的二分之一取代該外推值。

13. IL-8 Luminex 分析法使用定製Bio-Rad IL-8人類細胞介素篩選板Luminex分析法套組(BioRad Laboratories Inc.，參考號17005177)來量測介白素-8 (IL-8)。將PIPES緩衝液添加至純的尿液樣品中直至0.5 M PIPES緩衝液(pH 6.8) (Alfa Aesar，參考號J61786-AK)之最終濃度為5%。將樣品渦旋15秒且接著用50%經修飾之LXA-4緩衝液(PBS 1×、0.5% BSA、0.025%疊氮化鈉)以1:1進行稀釋。一式兩份地分析樣品且遵循製造商之說明進行分析法之其餘部分。在BioPlex 200 Luminex儀器(BioRad Laboratories Inc.)上讀取分析盤。使用Bio-Plex 200 Luminex儀器之配套軟體(「BioPlex Manager」)及分析法套組中所包括之標準物來產生標準曲線且自螢光強度外推樣品濃度。BioPlex Manager軟體測定定量下限(LLOQ)。

14. 尿液沈積物之全部有核細胞計數及光學顯微術分析在收集後之1小時內，用福馬林(formalin)固定尿液樣品(500 μl至1 mL)達到最終濃度為1%，且在冰上隔夜運送至Pfizer Groton, CT。在接收之後，用血球計對全部有核細胞(上皮細胞及多形核細胞)進行計數。將總共約300 μL裝載至Thermo Scientific Shandon EZ雙細胞學漏斗中，其中100 μL裝載至一個漏斗中且200 μL裝載至另一漏斗中。使用Thermo Scientific CytoSpin 4細胞離心機，將樣品以750 rpm在Shandon Double Cytoslide顯微鏡塗佈玻璃載片上進行細胞離心5分鐘。對於具有高細胞計數之樣品，在進行細胞離心之前首先用0.9%生理鹽水以1:10稀釋尿液。使用Sysmex SP-10儀器，接著將cytoprep載片用甲醇簡單固定且用吉姆薩(Giemsa)及邁格林華(May-Grunwald)染液染色。對於各尿液樣品，以上文所列之兩種樣品體積製備各尿液樣品之一個載片。

藉由光顯微術評估含有經濃縮及染色之尿液沈積物之CytoSpin載片中存在或不存在增加的多形核細胞(PMN，亦即，具有多節段或腎狀核之粒細胞，通常由嗜中性球構成，但亦包括嗜酸性球及嗜鹼性球)。基於未觀測到PMN或觀測到極少的PMN來確定不存在增加之PMN細胞。基於相對於背景上皮細胞群體，觀測到多於極少的PMN來測定存在增加之PMN。

B. 結果 1. 在存在或不存在 O - 抗原之情況下用 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體進行之疫苗接種引發非人類靈長類動物中之強效全抗體及中和抗體在存在或不存在4價O-抗原結合物(O25b、O6、O1a、O2)及AS01b佐劑的情況下，用FimH-DSG G15A G16A V27A突變體對非人類靈長類動物進行疫苗接種(圖9)。在用FimH-DSG G15A G16A V27A及4價O-抗原進行疫苗接種之組中，O-抗原血清型特異性抗體效價在疫苗接種後6週上升約400倍(圖10及表22)。使用正向Luminex免疫分析法(dLIA)定量總抗FimH抗體效價(圖11A及表23)。安慰劑組中之動物具有低於分析法定量極限之效價。在兩個疫苗接種組中，效價在兩個劑量後上升且可加打第三劑量。總體而言，與單獨的FimH-DSG G15A G16A V27A相比，在存在O-抗原之情況下用FimH-DSG G15A G16A V27A進行疫苗接種之動物的效價略低。表 22 ： 在存在 4 價 O - 抗原之情況下用 FimH - DSG G15A G16A V27A 進行疫苗接種之非人類靈長類動物中的 O - 抗原血清型特異性效價

血清型	週數	GMT
O1a	0	3.842
6	2903.324
16	3446.427
O2	0	4.318
6	5449.571
16	5696.599
O6	0	5.093
6	2412.359
16	1686.817
O25b	0	2.636
6	3483.843
16	4028.502

表 23 ：非人類靈長類動物中之 FimH IgG 幾何平均效價

組	安慰劑	FimH-DSG G15A G16A V27A	FimH-DSG G15A G16A V27A + 4 價 O 抗原
時間點	PD2	PD3	PD2	PD3	PD2	PD3
GMT	0.76	0.76	1965.69	4500.47	951.61	1457.49

在大腸桿菌結合抑制分析法中評估血清，以便評估抗FimH抗體阻斷大腸桿菌與酵母甘露聚糖之結合的能力(圖11B及表24)。來自用單獨的FimH-DSG G15A G16A V27A進行疫苗接種之動物的血清之平均IC ₅₀在劑量2後上升至293.65且在劑量3後上升至1698.39，而用FimH-DSG G15A G16A V27A與O-抗原之組合進行疫苗接種之動物的平均IC ₅₀在劑量2後為480.12且在劑量3後為756.45。表 24 ：非人類靈長類動物血清之大腸桿菌中和分析法IC ₅₀

組	安慰劑			FimH-DSG G15A G16A V27A		FimH-DSG G15A G16A V27A + 4 價 O- 抗原
時間點	放血前	PD2	PD3	放血前	PD2	PD3	放血前	PD2	PD3
幾何平均 IC ₅₀	50	50	50	50	293.65	1698.39	50	480.12	756.45

總之，此等資料顯示FimH-DSG G15A G16A V27A在非人類靈長類動物中引發強效抗體反應，且與O-抗原之組合會引起高效價，但略低於單獨的FimH。

2. 在存在或不存在 O - 抗原之情況下用 FimH - DSG G15A G16A V27A 突變體進行之疫苗接種減少非人類靈長類動物模型中之細菌尿及感染之生物標記物最終加打之後五週，經由膀胱內插管用108 CFU之UPEC分離株PFEEC0578對經疫苗接種及經安慰劑處理之NHP進行接種。在28天之時段內在導管收集之尿液中監測細菌尿。在所有經安慰劑處理之動物中，在攻擊後第2天及第7天滴注活細菌引起高水準之細菌尿(幾何平均值為約10 ⁶個細菌/毫升尿液)。與安慰劑組相比，用FimH-DSG G15A G16A V27A或FimH-DSG G15A G16A V27A + 4價O-抗原進行疫苗接種之動物在感染後第2天及第7天分別展現出細菌尿幾何平均值減少300倍或1000倍。

在第14天，約50%的經安慰劑疫苗接種之動物仍然展現細菌尿＞10 ⁵個細菌/毫升尿液。最後，大部分安慰劑NHP在第21天及第28天清除感染。相比之下，大部分用FimH-DSG G15A G16A V27A或FimH-DSG G15A G16A G27A + 4價O-抗原進行疫苗接種之動物在第14天清除感染(圖12)。

隨後，在受攻擊之NHP之尿液中監測到多種發炎性生物標記物。在攻擊後第7天，所有經安慰劑處理之動物展現尿液沈積物中之多形核(PMN)細胞含量升高，如藉由細胞學分析所證實。相比之下，小於25%的經FimH-DSG G15A G16A V27A疫苗接種之NHP的尿液沈積物中之PMN細胞含量增加且經FimH-DSG G15A G16A V27A + 4價O-抗原免疫接種之動物中均未出現此增加(圖13C)。同時，在7天時段內，量測尿液樣品中之髓過氧化酶(MPO)及介白素8 (IL-8)之含量。在攻擊後第2天，與安慰劑組(幾何平均值為470 pg/mL)相比，兩個疫苗接種組均展現MPO含量減少2倍(幾何平均值為約200 pg/mL)(圖13A)。

此外，在感染後第2天及第7天，與在經安慰劑處理之NHP之尿液中所量測之含量(幾何平均值為54.2 pg/mL及32.7 pg/mL)相比，用FimH-DSG G15A G16A V27A進行疫苗接種之動物之尿液中之IL-8濃度分別降低約10倍及5倍(幾何平均值為5.9 pg/mL及9.8 pg/mL)。在類似趨勢下，與在經安慰劑處理之動物中所觀測到之IL-8濃度相比，用FimH-DSG G15A G16A V27A與O-抗原之組合進行免疫接種的NHP之尿液中之IL-8含量在第2天及第7天分別減少約5倍及3倍(幾何平均值為11.3 pg/mL)(圖13B)。

C. 結論FimH-DSG G15A G16A V27A突變體在可進行第3劑量加打之NHP中誘導較高的抗FimH IgG效價。用FimH-DSG G15A G16A V27A突變體與4價O-抗原之組合進行疫苗接種之動物顯示較高的O-抗原IgG效價。

FimH-DSG G15A G16A V27A在非人類靈長類動物中引發強效中和抗體。與4價O-抗原之組合具有類似的免疫原性。

在食蟹獼猴中之泌尿道感染模型中，在存在或不存在4價O-抗原之情況下，FimH-DSG G15A G16A V27A突變體減少細菌尿及感染之生物標記物。

以下條項描述本發明之其他態樣 ：C1. 一種經突變之FimH多肽，其相對於野生型FimH多肽之胺基酸序列包含至少一個胺基酸突變，其中該突變位置選自由以下組成之群：F1、P12、G14、G15、G16、A18、P26、V27、V28、Q32、N33、L34、V35、R60、S62、Y64、G65、L68、F71、T86、L107、Y108、L109、V112、S113、A115、G116、V118、A119、A127、L129、Q133、F144、V154、V155、V156、P157、T158、V163及V185，其中該等胺基酸位置係根據SEQ ID NO: 59編號。 C2. 如條項1之經突變之FimH多肽，其包含至少一個選自由以下組成之群的突變：F1I；F1L；F1V；F1M；F1Y；F1W；P12C；G14C；G15A；G15P；G16A；G16P；A18C；P26C；V27A；V27C；V28C；Q32C；N33C；L34C；L34N；L34S；L34T；L34D；L34E；L34K；L34R；V35C；R60P；S62C；Y64C；G65A；L68C；F71C；T86C；L107C；Y108C；L109C；V112C；S113C；A115V；G116C；V118C；A119C；A119N；A119S；A119T；A119D；A119E；A119K；A119R；A127C；L129C；Q133K；F144C；V154C；V156C；P157C；T158C；V163I；及V185I，或其任何組合。 C3. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G15A及G16A。 C4. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變P12C及A18C。 C5. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G14C及F144C。 C6. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變P26C及V35C。 C7. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變P26C及V154C。 C8. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變P26C及V156C。 C9. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V27C及L34C。 C10. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V28C及N33C。 C11. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V28C及P157C。 C12. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變Q32C及Y108C。 C13. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變N33C及L109C。 C14. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變N33C及P157C。 C15. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V35C及L107C。 C16. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V35C及L109C。 C17. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變S62C及T86C。 C18. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變S62C及L129C。 C19. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變Y64C及L68C。 C20. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變Y64C及A127C。 C21. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L68C及F71C。 C22. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V112C及T158C。 C23. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變S113C及G116C。 C24. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變S113C及T158C。 C25. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V118C及V156。 C26. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119C及V155C。 C27. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L34N及V27A。 C28. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L34S及V27A。 C29. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L34T及V27A。 C30. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L34D及V27A。 C31. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L34E及V27A。 C32. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L34K及V27A。 C33. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變L34R及V27A。 C34. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119N及V27A。 C35. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119S及V27A。 C36. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119T及V27A。 C37. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119D及V27A。 C38. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119E及V27A。 C39. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119K及V27A。 C40. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變A119R及V27A。 C41. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G15A及V27A。 C42. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G16A及V27A。 C43. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G15P及V27A。 C44. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G16P及V27A。 C45. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G15A、G16A及V27A。 C46. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G65A及V27A。 C47. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變V27A及Q133K。 C48. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含突變G15A、G16A、V27A及Q133K。 C49. 如條項C2之經突變之FimH多肽，其包含SEQ ID NO: 2-58及60-64中之任一者之序列 C50. 如條項C1至C49中任一項之經突變之FimH多肽，其中該多肽經分離。 C51. 一種醫藥組合物，其包含(i)如條項C1至C50中任一項之經突變之FimH多肽，及(ii)醫藥學上可接受之載劑。 C52. 一種免疫原性組合物，其包含如條項C1至C50中任一項之經突變之FimH多肽。 C53. 如條項C52之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種額外抗原。 C54. 如條項C53之免疫原性組合物，其中該至少一種額外抗原為醣或多醣或醣結合物或蛋白。 C55. 如條項C52之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種佐劑。 C56. 一種核酸分子，其包含編碼如條項C1至C49中任一項之經突變之FimH多肽之胺基酸序列的核苷酸序列。 C57. 如條項C1至C50中任一項之經突變之FimH多肽，其中該多肽為免疫原性的。 C58. 一種重組哺乳動物細胞，其包含編碼如條項C1至C50中任一項之經突變之FimH多肽的聚核苷酸。 C59. 一種培養物，其包含如條項C58之重組細胞，其中該培養物之規格為至少5公升。 C60. 一種用於產生如條項C1至C50中任一項之經突變之FimH多肽的方法，該方法包含在適合的條件下培養如條項C58之重組哺乳動物細胞，藉此表現該多肽；及收集該多肽。 C61. 一種用於以下目的之方法：(i)在個體中誘導針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，或(ii)在個體中誘導調理吞噬活性抗體及/或中和抗體之產生，該等抗體對腸外病原性大腸桿菌具有特異性，其中該方法包含向該個體投與有效量的如條項C51至C55中任一項之組合物。 C62. 如條項C61之方法，其中該個體具有發展泌尿道感染之風險。 C63. 如條項C61之方法，其中該個體具有發展菌血症之風險。 C64. 如條項C61之方法，其中該個體具有發展敗血症之風險。 C65. 一種在哺乳動物中引發針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量的如條項C51至C55中任一項之組合物。 C66. 如條項C65之方法，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體及/或中和抗體。 C67. 如條項C65之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。 C68. 一種預防、治療或改善個體中之細菌感染、疾病或病狀的方法，其包含向該個體投與免疫有效量的如條項C51至C55中任一項之組合物。 C69. 如條項C54之免疫原性組合物，其中該額外抗原為包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D ₁、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186及式O187，其中 n為1至100之整數。 C70. 如條項C69之免疫原性組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173、式62D ₁、式O22、式O35、式O65、式O66、式O83、式O91、式O105、式O116、式O117、式O139、式O153、式O167及式O172，其中 n為31至100之整數。 C71. 如條項C70之免疫原性組合物，其中該醣包含選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O3、式O4 (例如式O4:K52及式O4:K6)、式O5 (例如式O5ab及式O5ac (菌株180/C3))、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O7、式O10、式O16、式O17、式O18 (例如式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B及式O18B1)、式O21、式O23 (例如式O23A)、式O24、式O25 (例如式O25a及式O25b)、式O26、式O28、式O44、式O45 (例如式O45及式O45rel)、式O55、式O56、式O58、式O64、式O69、式O73 (例如式O73 (菌株73-1))、式O75、式O77、式O78、式O86、式O88、式O90、式O98、式O104、式0111、式O113、式O114、式O119、式O121、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O136、式O138、式O141、式O142、式O143、式O147、式O149、式O152、式O157、式O158、式O159、式O164、式O173及式62D ₁，其中n為31至100之整數。 C72. 如條項C70之免疫原性組合物，其包含選自以下之結構：式O1 (例如式O1A、式O1B及式O1C)、式O2、式O6 (例如式O6:K2；K13；K15及式O6:K54)、式O15、式O16、式O21、式O25 (例如式O25a及式O25b)及式O75。 C73. 如條項C70之免疫原性組合物，其包含選自式O4、式O11、式O21及式O75之結構。 C74. 如條項C69之免疫原性組合物，其中該醣不包含選自以下之結構：式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101。 C75. 如條項C69之免疫原性組合物，其中該醣不包含選自式O12之結構。 C76. 如條項C72之免疫原性組合物，其中該醣藉由在革蘭氏陰性細菌中表現wzz家族蛋白以生成該醣而產生。 C77. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白係選自由以下組成之群：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。 C78. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白為wzzB。 C79. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白為fepE。 C80. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白為wzzB及fepE。 C81. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白衍生自腸道沙門氏菌。 C82. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白包含選自SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120及SEQ ID NO: 121中之任一者的序列。 C83. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白包含與SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116中之任一者具有至少90%序列一致性的序列。 C84. 如條項C76之免疫原性組合物，其中該wzz家族蛋白包含選自SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120及SEQ ID NO: 121中之任一者的序列。 C85. 如條項C69之免疫原性組合物，其中該醣係以合成方式合成的。 C86. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R1部分。 C87. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R2部分。 C88. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R3部分。 C89. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌R4部分。 C90. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣進一步包含大腸桿菌K-12部分。 C91. 如條項C69至C90中任一項之免疫原性組合物，其中該醣進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。 C92. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R1部分。 C93. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R2部分。 C94. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R3部分。 C95. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌R4部分。 C96. 如條項C69至C85中任一項之免疫原性組合物，其中該醣不進一步包含大腸桿菌K-12部分。 C97. 如條項C69至C90中任一項之免疫原性組合物，其中該醣不進一步包含3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)部分。 C98. 如條項C69至C91中任一項之免疫原性組合物，其中該醣不包含脂質A。 C99. 如條項C69至C98中任一項之免疫原性組合物，其中該多醣之分子量為10 kDa至2,000 kDa或50 kDa至2,000 kDa。 C100. 如條項C69至C99中任一項之免疫原性組合物，其中該醣之平均分子量為20-40 kDa。 C101. 如條項C69至C100中任一項之免疫原性組合物，其中該醣之平均分子量為40,000至60,000 kDa。 C102. 如條項C69至C101中任一項之免疫原性組合物，其中 n為31至90之整數。 C103. 一種免疫原性組合物，其包含如條項C69至C50中任一項之經突變之FimH多肽及包含共價結合載體蛋白之醣的結合物，其中該醣衍生自大腸桿菌。 C104. 一種免疫原性組合物，其包含如條項C69至C50中任一項之經突變之FimH多肽及結合物，該結合物包含與載體蛋白共價結合的如條項C69至C102中任一項之醣。 C105. 一種免疫原性組合物，其包含如條項C69至C50中任一項之經突變之FimH多肽或其片段；及如條項C69至條項C102中任一項之結合物，其中該載體蛋白係選自以下中之任一者：聚(L-離胺酸)、CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B子單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。 C106. 如條項C103至條項C105中任一項之免疫原性組合物，其中該載體蛋白為CRM ₁₉₇。 C107. 如條項C103至條項C105中任一項之免疫原性組合物，其中該載體蛋白為破傷風類毒素(TT)。 C108. 如條項C103至條項C105中任一項之免疫原性組合物，其中該載體蛋白為聚(L-離胺酸)。 C109. 如條項C103至條項C107中任一項之免疫原性組合物，其中該結合物藉由還原胺化來製備。 C110. 如條項C103至條項C107中任一項之免疫原性組合物，其中該結合物藉由CDAP化學方法來製備。 C111. 如條項C103至條項C107中任一項之免疫原性組合物，其中該結合物為單端連接之結合醣。 C112. 如條項C103至條項C107中任一項之免疫原性組合物，其中該醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與該載體蛋白結合。 C113. 如條項C112之免疫原性組合物，其中該醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白共價結合，其中該醣經由胺甲酸酯鍵與該eTEC間隔子共價連接，且其中該載體蛋白經由醯胺鍵與該eTEC間隔子共價連接。 C114. 如條項C112至條項C113中任一項之免疫原性組合物，其中該CRM ₁₉₇包含經由eTEC間隔子與該多醣共價連接的2至20個或4至16個離胺酸殘基。 C115. 如條項C103至條項C114中任一項之免疫原性組合物，其中該醣:載體蛋白之比率(w/w)為0.2至4。 C116. 如條項C103至條項C114中任一項之免疫原性組合物，其中該醣與蛋白之比率為至少0.5且至多2。 C117. 如條項C103至條項C114中任一項之免疫原性組合物，其中該醣與載體蛋白之比率為0.4至1.7。 C118. 如條項C111至條項C117中任一項之免疫原性組合物，其中該醣經由3-去氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)殘基與該載體蛋白結合。 C119. 如條項C69之免疫原性組合物，其中該結合物包含與載體蛋白共價結合之醣，其中該醣包含選自式O8、式O9a、式O9、式O20ab、式O20ac、式O52、式O97及式O101之結構，其中 n為1至10之整數。 C120. 一種免疫原性組合物，其包含經突變之FimH多肽及如條項C69至條項C102中任一項之醣，以及醫藥學上可接受之稀釋劑。 C121. 一種免疫原性組合物，其包含經突變之FimH多肽及如條項C103至條項C119中任一項之醣結合物，以及醫藥學上可接受之稀釋劑。 C122. 如條項C121之免疫原性組合物，其包含與該組合物中之醣總量相比至多約25%之游離醣。 C123. 如條項C120至條項C121中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。 C124. 如條項C120至條項C121中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含鋁。 C125. 如條項C120至條項C121中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含QS-21。 C126. 如條項C120至條項C121中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含CpG寡核苷酸。 C127. 如條項C120至條項C121中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物不包括佐劑。 C128. 一種免疫原性組合物，其包含如條項C69至C118中任一項之經突變之FimH多肽，及衍生自大腸桿菌且經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白結合之醣，其中該多醣經由胺甲酸酯鍵與該eTEC間隔子共價連接，且其中該載體蛋白經由醯胺鍵與該eTEC間隔子共價連接。 C129. 如條項C128之免疫原性組合物，其中該醣為衍生自大腸桿菌之O-抗原。 C130. 如條項C128之免疫原性組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。 C131. 如條項C128之免疫原性組合物，其中該醣為衍生自大腸桿菌之O-抗原。 C132. 一種免疫原性組合物，其包含經突變之FimH多肽及如條項C69至條項C85中任一項之醣，且該醣經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白共價結合，其中該多醣經由胺甲酸酯鍵與該eTEC間隔子共價連接，且其中該載體蛋白經由醯胺鍵與該eTEC間隔子共價連接。 C133. 一種免疫原性組合物，其包含經突變之FimH多肽，及(i)與載體蛋白共價偶合之大腸桿菌O25B抗原的結合物；(ii)與載體蛋白共價偶合之大腸桿菌O1A抗原的結合物；(iii)與載體蛋白共價偶合之大腸桿菌O2抗原的結合物；及(iv)與載體蛋白共價偶合之O6抗原的結合物，其中該大腸桿菌O25B抗原包含式O25B之結構，其中n為大於30之整數。 C134. 如條項C133之免疫原性組合物，其中該載體蛋白係選自以下中之任一者：聚(L-離胺酸)、CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B子單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。 C135. 一種免疫原性組合物，其包含如條項C69至C118中任一項之經突變之FimH多肽，及(i)與載體蛋白共價偶合之大腸桿菌O25B抗原的結合物；(ii)與載體蛋白共價偶合之大腸桿菌O4抗原的結合物；(iii)與載體蛋白共價偶合之大腸桿菌O11抗原的結合物；及(iv)與載體蛋白共價偶合之O21抗原的結合物，其中該大腸桿菌O25B抗原包含式O75之結構，其中n為大於30之整數。 C136. 如條項C135之免疫原性組合物，其中該載體蛋白係選自以下中之任一者：聚(L-離胺酸)、CRM ₁₉₇、白喉毒素片段B (DTFB)、DTFB C8、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素或來自綠膿桿菌之外毒素A；綠膿桿菌之解毒外毒素A (EPA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、金黃色葡萄球菌之解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、霍亂毒素B子單元(CTB)、肺炎鏈球菌溶血素及其解毒變異體、空腸彎曲桿菌AcrA、空腸彎曲桿菌天然醣蛋白及鏈球菌C5a肽酶(SCP)。 C137. 一種製備免疫原性組合物之方法，該免疫原性組合物包含經突變之FimH多肽及結合物，該結合物包含經由(2-((2-側氧基乙基)硫基)乙基)胺基甲酸酯(eTEC)間隔子與載體蛋白結合之醣，該方法包含以下步驟：a)使醣與1,1'-羰基-二(1,2,4-三唑)(CDT)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)在有機溶劑中反應，以產生經活化之醣；b)使該經活化之醣與胱胺或半胱胺或其鹽反應，以產生硫醇化醣；c)使該硫醇化醣與還原劑反應，以產生包含一或多個游離硫氫基殘基的經活化之硫醇化醣；d)使該經活化之硫醇化醣與包含一或多個α-鹵乙醯胺基的經活化之載體蛋白反應，以產生硫醇化醣-載體蛋白結合物；及e)使該硫醇化醣-載體蛋白結合物與以下物質反應：(i)能夠對該經活化之載體蛋白的未結合之α-鹵乙醯胺基團封端的第一封端試劑；及/或(ii)能夠對該經活化之硫醇化醣的未結合之游離硫氫基殘基封端的第二封端試劑；由此產生eTEC連接之醣結合物，其中該醣衍生自大腸桿菌；且該免疫原性組合物進一步包含在重組哺乳動物細胞中表現聚核苷酸，該聚核苷酸編碼衍生自FimH之多肽或其片段，及分離該多肽或其片段。 C138. 如條項C137之方法，其包含製備如條項C69至條項C102中任一項之免疫原性組合物。 C139. 如條項C137至條項C138中任一項之方法，其中該封端步驟e)包含使該硫醇化醣-載體蛋白結合物與以下物質反應：(i)作為第一封端試劑之N-乙醯基-L-半胱胺酸，及/或(ii)作為第二封端試劑之碘乙醯胺。 C140. 如條項C137至條項C139中任一項之方法，其進一步包含如下步驟：藉由與三唑或咪唑反應而使醣混配以得到混配醣，其中該混配醣經殼凍、凍乾且在步驟a)之前在有機溶劑中復原。 C141. 如條項C137至條項C140中任一項之方法，其進一步包含純化該產生於步驟c)中之硫醇化多醣，其中純化步驟包含透濾。 C142. 如條項C137至條項C141中任一項之方法，其中該方法進一步包含藉由透濾來純化該eTEC連接之醣結合物。 C143. 如條項C137至條項C142中任一項之方法，其中該步驟a)中之有機溶劑為選自以下中之任一者的極性非質子溶劑：二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、乙腈、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)及六甲基磷醯胺(HMPA)或其混合物。 C144. 如條項C137至條項C142中任一項之方法，其中培養基包含選自以下中之任一者之元素：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。 C145. 如條項C144之培養基，其中該培養基用於培養大腸桿菌。 C146. 一種用於產生如條項C69至條項C102中任一項之醣的方法，其包含在培養基中培養重組大腸桿菌；藉由在該培養基中培養該細胞來產生該醣；由此該細胞產生該醣。 C147. 如條項C146之方法，其中該培養基包含選自以下中之任一者之元素：KH ₂PO ₄、K ₂HPO ₄、(NH ₄) ₂SO ₄、檸檬酸鈉、Na ₂SO ₄、天冬胺酸、葡萄糖、MgSO ₄、FeSO ₄-7H ₂O、Na ₂MoO ₄-2H ₂O、H ₃BO ₃、CoCl ₂-6H ₂O、CuCl ₂-2H ₂O、MnCl ₂-4H ₂O、ZnCl ₂及CaCl ₂-2H ₂O。 C148. 如條項C146之方法，其中該培養基包含大豆水解產物。 C149. 如條項C146之方法，其中該培養基包含酵母提取物。 C150. 如條項C146之方法，其中該培養基不進一步包含大豆水解產物及酵母提取物。 C151. 如條項C146之方法，其中該大腸桿菌細胞包含選自以下中之任一者之異源wzz家族蛋白：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。 C152. 如條項C146之方法，其中該大腸桿菌細胞包含選自以下中之任一者之腸道沙門氏菌wzz家族蛋白：wzzB、wzz、wzz _SF、wzz _ST、fepE、wzz _fepE、wzz1及wzz2。 C153. 如條項C152之方法，其中該wzz家族蛋白包含選自SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116中之任一者的序列。 C154. 如條項C146之方法，其中該培養產生＞ 120 OD ₆₀₀/mL之產率。 C155. 如條項C146之方法，其進一步包含純化該醣。 C156. 如條項C146之方法，其中該純化步驟包含以下中之任一者：透析、濃縮操作、透濾操作、切向流過濾、沈澱、溶離、離心、沈澱、超濾、深度過濾及管柱層析法(離子交換層析法、多模式離子交換層析法、DEAE及疏水性相互作用層析法)。 C157. 一種用於在個體中誘導免疫反應之方法，其包含向該個體投與如條項C69至條項C136中任一項之組合物。 C158. 如條項C157之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體。 C159. 如條項C157之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌IgG抗體。 C160. 如條項C157之方法，其中該免疫反應包含誘導針對大腸桿菌之殺菌活性。 C161. 如條項C157之方法，其中該免疫反應包含誘導針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。 C162. 如條項C157之方法，其中該免疫反應包含在初始給藥之後至少1,000至200,000之幾何平均效價(GMT)水準。 C163. 如條項C157之方法，其中該組合物包含：包含式O25之醣，其中 n為40至100之整數，其中該免疫反應包含在初始給藥後至少1,000至200,000之幾何平均效價(GMT)水準。 C164. 如條項C157之方法，其中該個體面臨選自以下之病狀中之任一種的風險：泌尿道感染、膽囊炎、膽管炎、腹瀉、溶血性尿毒症候群、新生兒腦膜炎、尿路敗血症、腹內感染、腦膜炎、複雜性肺炎、傷口感染、前列腺活檢後相關感染、新生兒/嬰兒敗血症、嗜中性白血球減少性發熱及其他血流感染；肺炎、菌血症及敗血症。 C165. 如條項C157之方法，其中該個體為哺乳動物。 C166. 一種用於以下目的之方法：(i)在個體中誘導針對腸外病原性大腸桿菌之免疫反應，或(ii)在個體中誘導調理吞噬活性抗體之產生，該等抗體對腸外病原性大腸桿菌具有特異性，其中該方法包含向該個體投與有效量的如條項C69至條項C136中任一項之組合物。 C167. 如條項C166之方法，其中該個體具有發展泌尿道感染之風險。 C168. 如條項C166之方法，其中該個體具有發展菌血症之風險。 C169. 如條項C166之方法，其中該個體具有發展敗血症之風險。 C170. 一種用於在個體中誘導免疫反應之方法，其包含向該個體投與如條項C69至條項C136中任一項之組合物。 C171. 如條項C170之方法，其中該免疫反應包含誘導抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體。 C172. 如條項C170之方法，其中該抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體為IgG抗體。 C173. 如條項C170之方法，其中該抗大腸桿菌O-特異性多醣血清抗體為具有針對大腸桿菌之殺細菌活性的IgG抗體。 C174. 如條項C69之免疫原性組合物，其中 n大於對應野生型大腸桿菌多醣中之重複單元之數目。 C175. 如條項C174之組合物，其中 n為31至100之整數。 C176. 如條項C174之組合物，其中該醣包含根據式O1A、式O1B及式O1C、式O2、式O6及式O25B中之任一者之結構。 C177. 如條項C174之組合物，其中該醣係在重組宿主細胞中產生，該細胞表現與以下中之任一者具有至少90%序列一致性的wzz家族蛋白：SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120及SEQ ID NO: 121。 C178. 如條項C177之組合物，其中該蛋白包含SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116中之任一者。 C179. 如條項C174之醣，其中該醣係以合成方式合成的。 C180. 一種免疫原性組合物，其包含如條項C1至C55中任一項之經突變之FimH多肽，及(a)包含與包含式O25b之醣共價結合之載體蛋白的結合物，其中 n為31至90之整數；(b)包含與包含式O1A之醣共價結合之載體蛋白的結合物，其中 n為31至90之整數；(c)包含與包含式O2之醣共價結合之載體蛋白的結合物，其中 n為31至90之整數；及(d)包含與包含式O6之醣共價結合之載體蛋白的結合物，其中 n為31至90之整數。 C181. 如條項C180之免疫原性組合物，其進一步包含：包含與醣共價結合之載體蛋白的載體蛋白，該醣包含選自以下中之任一者之結構：式O15、式O16、式O17、式O18及式O75，其中 n為31至90之整數。 C182. 如條項C180之免疫原性組合物，其包含與該組合物中之醣總量相比至多25%之游離醣。 C183. 一種在哺乳動物中引發針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量的如條項C180至C182中任一項之組合物。 C184. 如條項C183之方法，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。 C185. 如條項C183之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。 C186. 一種重組哺乳動物細胞，其包含(a)編碼如條項C1至C55中任一項之經突變之FimH多肽的第一相關基因，其中該基因整合於至少兩個重組標靶位點(RTS)之間。 C187. 如條項C186之實施例，其中該兩個RTS經染色體整合於NL1基因座或NL2基因座內。 C188. 如條項C186之實施例，其中該第一相關基因進一步包含報導基因、編碼難以表現之蛋白的基因、輔助基因或其組合。 C189. 如條項C186之實施例，其進一步包含整合於與(a)之基因座不同的第二染色體基因座內之第二相關基因，其中該第二相關基因包含報導基因、編碼難以表現之蛋白的基因、輔助基因或其組合。 C190. 如C186之重組細胞，其中聚核苷酸序列整合於該哺乳動物細胞之基因體DNA中。 C191. 如C186之重組細胞，其中該聚核苷酸序列經密碼子最佳化以在該細胞中表現。 C192. 如C186之重組細胞，其中該細胞為人類胚胎腎細胞。 C193. 如C192之重組細胞，其中該人類胚胎腎細胞包含HEK293細胞。 C194. 如C193之重組細胞，其中該HEK293細胞係選自HEK293T細胞、HEK293TS細胞及HEK293E細胞中之任一者。 C195. 如C186之重組細胞，其中該細胞為CHO細胞。 C196. 如C195之重組細胞，其中該CHO細胞為CHO-K1細胞、CHO-DUXB11、CHO-DG44細胞或CHO-S細胞。 C197. 如C186之重組細胞，其中該多肽為可溶的。 C198. 如C186之重組細胞，其中該多肽係分泌自該細胞。 C199. 一種培養物，其包含如C186之重組細胞，其中該培養物之規格為至少5公升。 C200. 如C199之培養物，其中該多肽或其片段之產率為至少0.05 g/L。 C201. 如C199之培養物，其中該多肽或其片段之產率為至少0.10 g/L。 C202. 一種用於產生衍生自大腸桿菌之多肽或其片段的方法，其包含在適合的條件下培養如C186之重組哺乳動物細胞，藉此表現該多肽或其片段；及收集該多肽或其片段。 C203. 如C202之方法，其進一步包含純化該多肽或其片段。 C204. 如條項C54之免疫原性組合物，其進一步包含衍生自任一種肺炎克雷伯氏桿菌類型之至少一種醣，該肺炎克雷伯氏桿菌類型選自由O1、O2、O3及O5組成之群。 C205. 如條項C204之免疫原性組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣。 C206. 如條項C204之免疫原性組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。 C207. 如條項C204之組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O3之醣。 C208. 如條項C204之免疫原性組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O5之醣。 C209. 如條項C204之免疫原性組合物，其進一步包含衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O1之醣及衍生自肺炎克雷伯氏桿菌類型O2之醣。 C210. 如條項C204至C209中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種包含選自以下中之任一者之結構的醣：式O1、式O1A、式O1B、式O1C、式O2、式O3、式O4、式O4:K52、式O4:K6、式O5、式O5ab、式O5ac、式O6、式O6:K2; K13; K15、式O6:K54、式O7、式O8、式O9、式O10、式O11、式O12、式O13、式O14、式O15、式O16、式O17、式O18、式O18A、式O18ac、式O18A1、式O18B、式O18B1、式O19、式O20、式O21、式O22、式O23、式O23A、式O24、式O25、式O25a、式O25b、式O26、式O27、式O28、式O29、式O30、式O32、式O33、式O34、式O35、式O36、式O37、式O38、式O39、式O40、式O41、式O42、式O43、式O44、式O45、式O45、式O45rel、式O46、式O48、式O49、式O50、式O51、式O52、式O53、式O54、式O55、式O56、式O57、式O58、式O59、式O60、式O61、式O62、式62D1、式O63、式O64、式O65、式O66、式O68、式O69、式O70、式O71、式O73、式O73、式O74、式O75、式O76、式O77、式O78、式O79、式O80、式O81、式O82、式O83、式O84、式O85、式O86、式O87、式O88、式O89、式O90、式O91、式O92、式O93、式O95、式O96、式O97、式O98、式O99、式O100、式O101、式O102、式O103、式O104、式O105、式O106、式O107、式O108、式O109、式O110、式0111、式O112、式O113、式O114、式O115、式O116、式O117、式O118、式O119、式O120、式O121、式O123、式O124、式O125、式O126、式O127、式O128、式O129、式O130、式O131、式O132、式O133、式O134、式O135、式O136、式O137、式O138、式O139、式O140、式O141、式O142、式O143、式O144、式O145、式O146、式O147、式O148、式O149、式O150、式O151、式O152、式O153、式O154、式O155、式O156、式O157、式O158、式O159、式O160、式O161、式O162、式O163、式O164、式O165、式O166、式O167、式O168、式O169、式O170、式O171、式O172、式O173、式O174、式O175、式O176、式O177、式O178、式O179、式O180、式O181、式O182、式O183、式O184、式O185、式O186、式O187，其中 n為1至100，更佳為31至90之整數。 C211. 如條項C210之免疫原性組合物，其中該衍生自肺炎克雷伯氏桿菌之醣與載體蛋白結合；且該衍生自大腸桿菌之醣與載體蛋白結合。 C212. 一種在哺乳動物中引發針對大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量的如條項C204至C211中任一項之組合物。 C213. 如條項C212之方法，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體。 C214. 如條項C212之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。 C215. 一種在哺乳動物中引發針對肺炎克雷伯氏桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量的如條項C204至C211中任一項之組合物。 C216. 如條項C215之方法，其中該免疫反應包含針對肺炎克雷伯氏桿菌之調理吞噬活性抗體。 C217. 如條項C215之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受肺炎克雷伯氏桿菌感染。 C218. 如條項C204至C217中任一項之組合物及方法，其中該肺炎克雷伯氏桿菌血清型O1包含變異體O1V1或O1V2。 C219. 如條項C204至C217中任一項之組合物及方法，其中該肺炎克雷伯氏桿菌血清型O2包含變異體O2V1或O2V2。 C220. 一種如條項C1至C219中任一項所闡述之組合物的用途，如本文中所闡述。 C221. 如條項C211之組合物，其中肺炎克雷伯氏桿菌O-抗原係選自由以下組成之群：a)血清型O1亞型v1 (O1v1)；b)血清型O1亞型v2 (O1v2)；c)血清型O2亞型v1 (O2v1)；及d)血清型O2亞型v2 (O2v2)。 C222. 一種核酸，其包含編碼如條項C1至C221中任一項之多肽的核苷酸。 C223. 如條項C222之核酸，其中該核酸為RNA。 C224. 一種奈米粒子，其包含如條項C222或C223之核酸。 C225. 一種本發明之免疫原性組合物，其進一步包含一或多種具有醣之結合物，該醣選自由式O4、式O11、式O13、式O21及式O86組成之群，其中n為1至100，較佳為31至90之整數。 C226. 一種本發明之免疫原性組合物，其進一步包含一或多種具有醣之結合物，該醣選自由式O1a、式O2、式O6及式O25b組成之群，其中n為1至100，較佳為31至90之整數。

圖 1A - 圖 1B顯示FimH _LD及FimH-DSG突變體之圓二色性光譜。圖1A顯示近UV區中之圓二色性光譜，且圖1B顯示在遠UV區中之圓二色性光譜。圖 2顯示PD3處之酵母甘露聚糖中和分析法中之FimH _LD突變體的相對免疫原性。圖 3A - 圖 3B顯示PD2處( 圖 3A)及PD3處( 圖 3B)之酵母甘露聚糖中和分析法中之FimH _LD及FimH-DSG突變體的免疫原性。圖 4為顯示用於分離野生型及突變形式之經His標記之FimH-DSG之主要純化步驟的圖式。圖 5A - 圖 5B顯示FimH-DSG WT之純化概況。圖 5A為SP-Sepharose管柱上之FimH-DSG WT之溶離曲線，且圖 5B為溶離份之SDS-PAGE分析。圖 6A - 圖 6B顯示FimH-DSG G15A G16A V27A突變體之純化概況。圖 6A顯示SP-Sepharose管柱上之FimH-DSG G15A G16A V27A突變體之溶離曲線，且圖 6B顯示溶離份之SDS-PAGE分析。圖 7A - 圖 7B顯示FimH-DSG蛋白之分析型SEC。FimH-DSG G15A G16A V27A之分析型SEC顯示於圖 7A中，且野生型FimH-DSG WT顯示於圖 7B中。圖 8顯示FimH HMW複合物形成之機制之示意性圖式。圖 9顯示本文中之實例21中所描述之非人類靈長類動物之免疫接種時程及後續攻擊。圖 10顯示在用FimH-DSG G15A G16A V27A突變體+4價大腸桿菌O-抗原(O1a、O2、O6及O25b)對NHP進行疫苗接種之後的O-抗原血清型特異性抗體之增加。圖例：安慰劑(圓形)；FimH-DSG G15A G16A V27A (方形)；FimH-DSG G15A G16A V27A + 4價O-抗原(三角形)。圖 11A - 圖 11B顯示用FimH-DSG G15A G16A V27A +/- 4價O-抗原進行之免疫接種引發強效功能性抗FimH抗體反應。圖 11A顯示來自正向Luminex FimH IgG分析法之結果，且圖 11B顯示來自大腸桿菌結合抑制分析法之結果。如本文中所使用，術語「4價(4plex)」與術語「4價(4-valent)」具有相同含義且可互換。圖 12顯示在如實例21中所描述之攻擊之後，經疫苗接種之非人類靈長類動物(NHP)中之細菌尿減少。圖例：安慰劑(圓形)；FimH-DSG G15A G16A V27A (方形)；FimH-DSG G15A G16A V27A + 4價O-抗原(三角形)；* p≤0.007 (與安慰劑組相比)。圖 13A - 圖 13C顯示在三組攻擊之後經疫苗接種之NHP中之感染的生物標記物減少：安慰劑、單獨的FimH-DSG G15A G16A V27A及FimH-DSG G15A G16A V27A + 4價O-抗原，如實例21中所描述。圖 13A顯示尿液中MPO之定量，圖 13B顯示尿液中之IL-8之定量，且圖 13C顯示尿液沈積物中之PMN增加之動物的百分比。圖例：安慰劑(圓形)；FimH-DSG G15A G16A V27A (方形)；FimH-DSG G15A G16A V27A + 4價O-抗原(三角形)。

序列識別符SEQ ID NO: 1闡述野生型大腸桿菌FimH _LD(FimHLD_WT)之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 2闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G65A_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 3闡述突變型大腸桿菌FimHLD_F1I之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 4闡述突變型大腸桿菌FimHLD_F1L之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 5闡述突變型大腸桿菌FimHLD_F1V之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 6闡述突變型大腸桿菌FimHLD_F1M之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 7闡述突變型大腸桿菌FimHLD_F1Y之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 8闡述突變型大腸桿菌FimHLD_F1W之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 9闡述突變型大腸桿菌FimHLD_Q133K之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 10闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G15A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 11闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G15P之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 12闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G16A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 13闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G16P之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 14闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G15A_G16A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 15闡述突變型大腸桿菌FimHLD_R60P之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 16闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G65A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 17闡述突變型大腸桿菌FimHLD_P12C_A18C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 18闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G14C_F144C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 19闡述突變型大腸桿菌FimHLD_P26C_V35C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 20闡述突變型大腸桿菌FimHLD_P26C_V154C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 21闡述突變型大腸桿菌FimHLD_P26C_V156C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 22闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V27C_L34C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 23闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V28C_N33C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 24闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V28C_P157C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 25闡述突變型大腸桿菌FimHLD_Q32C_Y108C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 26闡述突變型大腸桿菌FimHLD_N33C_L109C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 27闡述突變型大腸桿菌FimHLD_N33C_P157C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 28闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V35C_L107C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 29闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V35C_L109C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 30闡述突變型大腸桿菌FimHLD_S62C_T86C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 31闡述突變型大腸桿菌FimHLD_S62C_L129C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 32闡述突變型大腸桿菌FimHLD_Y64C_L68C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 33闡述突變型大腸桿菌FimHLD_Y64C_A127C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 34闡述突變型大腸桿菌FimHLD_L68C_F71C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 35闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V112C_T158C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 36闡述突變型大腸桿菌FimHLD_S113C_G116C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 37闡述突變型大腸桿菌FimHLD_S113C_T158C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 38闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V118C_V156C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 39闡述突變型大腸桿菌FimHLD_A119C_V155C之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 40闡述突變型大腸桿菌FimHLD_L34N_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 41闡述突變型大腸桿菌FimHLD_L34S_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 42闡述突變型大腸桿菌FimHLD_L34T_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 43闡述突變型大腸桿菌FimHLD_A119N_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 44闡述突變型大腸桿菌FimHLD_A119S_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 45闡述突變型大腸桿菌FimHLD_A119T_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 46闡述突變型大腸桿菌FimH-DSG_A115V之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 47闡述突變型大腸桿菌FimH-DSG_V163I之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 48闡述突變型大腸桿菌FimH-DSG_V185I之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 49闡述突變型大腸桿菌FimH-DSG_DSG_V3I之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 50闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G15A_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 51闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G16A_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 52闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G15P_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 53闡述突變型之胺基酸序列大腸桿菌FimHLD_G16P_V27A。 SEQ ID NO: 54闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G15A_G16A_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 55闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V27A_R60P之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 56闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G65A_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 57闡述突變型大腸桿菌FimHLD_V27A_Q133K之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 58闡述突變型大腸桿菌FimHLD_G15A_G16A_V27A_Q133K之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 59闡述野生型大腸桿菌全長FimH之胺基酸序列，包括經由連接子連接之供體股FimG肽(FimH-DSG_WT)。 SEQ ID NO: 60闡述突變型大腸桿菌FimH-DSG_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 61闡述突變型大腸桿菌FimH-DSG_G15A_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 62闡述突變型大腸桿菌FimH DSG_G15A_G16A_V27A之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 63闡述突變型大腸桿菌FimH DSG_V27A_Q133K之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 64闡述突變型大腸桿菌FimH DSG_G15A_G16A_V27A_Q133K之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 65闡述小鼠Ig κ信號肽序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 66-108闡述奈米結構相關多肽或其片段的胺基酸及核酸序列。 SEQ ID NO: 109 - PCR之引子。 SEQ ID NO: 110 - PCR之引子。 SEQ ID NO: 111 - PCR之探針。 SEQ ID NO: 112闡述O25b 2401 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 113闡述O25a:K5:H1 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 114闡述O25a ETEC ATCC WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 115闡述K12 W3110 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 116闡述沙門氏菌(Salmonella) LT2 WzzB胺基酸序列。 SEQ ID NO: 117闡述O25b 2401 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 118闡述O25a:K5:H1 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 119闡述O25a ETEC ATCC FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 120闡述O157 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 121闡述沙門氏菌LT2 FepE胺基酸序列。 SEQ ID NO: 122闡述LT2wzzB_S之引子序列。 SEQ ID NO: 123闡述LT2wzzB_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 124闡述O25bFepE_S之引子序列。 SEQ ID NO: 125闡述O25bFepE_A之引子序列。 SEQ ID NO: 126闡述wzzB P1_S之引子序列。 SEQ ID NO: 127闡述wzzB P2_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 128闡述wzzB P3_S之引子序列。 SEQ ID NO: 129闡述wzzB P4_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 130闡述O157 FepE_S之引子序列。 SEQ ID NO: 131闡述O157 FepE_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 132闡述pBAD33_轉接子_S之引子序列。 SEQ ID NO: 133闡述pBAD33_轉接子_AS之引子序列。 SEQ ID NO: 134闡述JUMPSTART_r之引子序列。 SEQ ID NO: 135闡述gnd_f之引子序列。 SEQ ID NO: 136闡述人類IgG受體FcRn大型子單元p51信號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 137闡述人類IL10蛋白信號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 138闡述人類呼吸道融合性病毒A (菌株A2)融合醣蛋白F0信號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 139闡述A型流感紅血球凝集素信號肽之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 140-147闡述用於信號肽預測之不同物種的SignalP 4.1 (DTU Bioinformatics)序列。

                         
          <![CDATA[<110>  美商輝瑞大藥廠(Pfizer Inc.)]]>
          <![CDATA[<120>  大腸桿菌FIMH突變體及其用途]]>
          <![CDATA[<130>  PC072713]]>
          <![CDATA[<160>  147   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ala Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Ile Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  4]]>
          Leu Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  5]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Val Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  6]]>
          Met Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Tyr Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Trp Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                      100                 105                 110         
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
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          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Ala 
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                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Pro 
          1               5                   10                  15      
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Pro Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ala Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Cys Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                          85                  90                  95      
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Cys Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
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                          85                  90                  95      
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
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          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
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          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Cys Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Cys Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Cys Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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              50                  55                  60                  
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          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Cys Leu Thr Pro Val 
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                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
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                          85                  90                  95      
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
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          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
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          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Cys Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Cys Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
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          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Cys Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
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              50                  55                  60                  
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          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Cys Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Cys Ser Ala Cys Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Cys Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
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                          85                  90                  95      
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                      20                  25                  30          
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                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
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          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Thr Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
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          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
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          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
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          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
              290                 295                 300 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Ile Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
              290                 295                 300 
          <![CDATA[<210>  48]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  48]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Ile Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
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          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
              290                 295                 300 
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          <![CDATA[<400>  49]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
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              290                 295                 300 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
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          <![CDATA[<400>  51]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Ala Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
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          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
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          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Ala Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
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                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
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          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
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          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
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              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
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          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
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          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
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          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
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          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
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          145                 150                 155                 160 
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          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
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              50                  55                  60                  
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                      180                 185                 190         
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          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
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          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
              290                 295                 300 
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  300]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Lys Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
              290                 295                 300 
          <![CDATA[<210>  64]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  64]]>
          Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Ala Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Leu Arg Lys Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 
              130                 135                 140                 
          Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 
                      180                 185                 190         
          Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys 
              290                 295                 300 
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Gly 
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  207]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Met Glu Gly Met Asp Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Pro Leu Leu Thr Val Arg Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Leu Ala Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Glu Leu Met Gly Val Gly Ala Leu Glu Ile Thr Leu Arg Thr 
                  35                  40                  45              
          Glu Lys Gly Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ser Gly Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Gly Ala Gly Thr Val Arg Ser Pro Lys Glu Ala Glu Ala Ala Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ser Pro Gly Leu Leu Glu Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Ala Ala Leu Ala Gln Ala Arg Gly Val Pro Tyr Leu Pro Gly Val Leu 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Pro Phe Gln Gly Val Arg Val Leu Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Tyr Ala Glu Val Phe Pro Glu Val Arg Phe Leu Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Glu His Leu Pro His Tyr Ala Ala Leu Pro Asn Leu Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Gly Ser Trp Leu Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ala Val Met Lys 
                      180                 185                 190         
          Lys Val Lys Ala Ala Lys Ala Leu Leu Ser Pro Gln Ala Pro Gly 
                  195                 200                 205         
          <![CDATA[<210>  67]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Glu Ala Ala Ile Arg Thr Leu Lys Ala Leu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Asp Glu Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Leu Val Arg Ala Ile Glu His Ala Ala Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Arg Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  156]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  209]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Met Ser Thr Ile Asn Asn Gln Leu Lys Ala Leu Lys Val Ile Pro Val 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu 
                      20                  25                  30          
          Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Gly Ala Thr Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn 
                      100                 105                 110         
          Asn Pro Ser Thr Val Glu Ala Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Pro Ser Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Thr Asn Gly Glu 
                      180                 185                 190         
          Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn 
                  195                 200                 205             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  70]]>
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          <![CDATA[<400>  70]]>
          Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Gly Ile Glu Pro Ser Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe 
          <![CDATA[<210>  71]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Ala Glu His His Arg 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
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          <![CDATA[<400>  72]]>
          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
          <![CDATA[<210>  73]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ala Ala Met Ala Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Met Phe Thr Lys Ser Gly Asp Asp Gly Asn Thr Asn Val Ile Asn Lys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Val Gly Lys Asp Ser Pro Leu Val Asn Phe Leu Gly Asp Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Glu Leu Asn Ser Phe Ile Gly Phe Ala Ile Ser Lys Ile Pro Trp Glu 
                  35                  40                  45              
          Asp Met Lys Lys Asp Leu Glu Arg Val Gln Val Glu Leu Phe Glu Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Glu Asp Leu Ser Thr Gln Ser Ser Lys Lys Lys Ile Asp Glu Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Val Leu Trp Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Arg Ile Glu Ser 
                          85                  90                  95      
          Gly Pro Val Lys Leu Phe Val Ile Pro Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ser 
                      100                 105                 110         
          Val Leu His Val Thr Arg Ser Val Ala Arg Arg Val Glu Arg Asn Ala 
                  115                 120                 125             
          Val Lys Tyr Thr Lys Glu Leu Pro Glu Ile Asn Arg Met Ile Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Tyr Leu Asn Arg Leu Ser Ser Leu Leu Phe Ala Met Ala Leu Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Lys Arg Arg Asn Gln Ser Glu Lys Ile Tyr Glu Ile Gly Lys Ser 
                          165                 170                 175     
          Trp 
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Gln Cys Val Arg Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Ser Ser Arg Glu His His Glu 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Arg Glu His Phe Met Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Thr Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  201]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Met Gly His Thr Lys Gly Pro Thr Pro Gln Gln His Asp Gly Ser Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Arg Ile Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Ile Ile Met 
                      20                  25                  30          
          Pro Leu Leu Ile Gly Thr Ile Ala Lys Leu Leu Glu Cys Gly Val Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Ser Asn Ile Val Val Gln Ser Val Pro Gly Ser Trp Glu Leu Pro 
              50                  55                  60                  
          Ile Ala Val Gln Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Gln Leu Gln Thr Pro Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Gly Pro Ser Leu Ser Ala Gly Asp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Thr 
                          85                  90                  95      
          Asp Leu Thr Ala Leu Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ser Thr Gly Pro Phe 
                      100                 105                 110         
          Asp Ala Leu Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Glu Thr Met His 
                  115                 120                 125             
          Phe Glu Tyr Ile Ala Asp Ser Val Ser His Gly Leu Met Arg Val Gln 
              130                 135                 140                 
          Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Val Leu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Asp Gln Ala Lys Ala Arg Ala Gly Val Ile Glu Gly Ser His Asn 
                          165                 170                 175     
          His Gly Glu Asp Trp Gly Leu Ala Ala Val Glu Met Gly Val Arg Arg 
                      180                 185                 190         
          Arg Asp Trp Ala Ala Gly Lys Thr Glu 
                  195                 200     
          <![CDATA[<210>  77]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  77]]>
          Met Tyr Glu Val Asp His Ala Asp Val Tyr Asp Leu Phe Tyr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ser Asp Ile Ala Asp Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Ser Arg Thr Pro Glu Ala Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Thr His Leu Glu His Phe Thr Lys Glu Phe Gly Asp Thr Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Leu Glu Leu Ser Glu Asp Met Leu Thr His Ala Arg Lys Arg Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Asp Ala Thr Leu His Gln Gly Asp Met Arg Asp Phe Gln Leu Gly 
                          85                  90                  95      
          Arg Lys Phe Ser Ala Val Val Ser Met Phe Ser Ser Val Gly Tyr Leu 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Ala Val Ala Ser Phe Ala Glu His 
                  115                 120                 125             
          Leu Glu Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu 
              130                 135                 140                 
          Thr Phe Ala Asp Gly Trp Val Ser Ala Asp Val Val Arg Arg Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Thr Val Ala Arg Val Ser His Ser Val Arg Glu Gly Asn Ala Thr 
                          165                 170                 175     
          Arg Met Glu Val His Phe Thr Val Ala Asp Pro Gly Lys Gly Val Arg 
                      180                 185                 190         
          His Phe Ser Asp Val His Leu Ile Thr Leu Phe His Gln Arg Glu Tyr 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Ala Phe Met Ala Ala Gly Leu Arg Val Glu Tyr Leu Glu Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Pro Ala 
          225                 230                 235         
          <![CDATA[<210>  78]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  78]]>
          Met Gly Met Lys Glu Lys Phe Val Leu Ile Ile Thr His Gly Asp Phe 
          1               5                   10                  15      
          Gly Lys Gly Leu Leu Ser Gly Ala Glu Val Ile Ile Gly Lys Gln Glu 
                      20                  25                  30          
          Asn Val His Thr Val Gly Leu Asn Leu Gly Asp Asn Ile Glu Lys Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Lys Glu Val Met Arg Ile Ile Ile Ala Lys Leu Ala Glu Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Ile Ile Ile Val Val Asp Leu Phe Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Glu Met Met Lys Thr Phe Asp Val Lys Val Ile Thr Gly Ile 
                          85                  90                  95      
          Asn Met Pro Met Leu Val Glu Leu Leu Thr Ser Ile Asn Val Tyr Asp 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ser Lys Ile Gly Lys Asp Gly Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Ile Glu Lys Ser Ser Leu Lys Met 
              130                 135             
          <![CDATA[<210>  79]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Met Lys Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg 
          1               5                   10                  15      
          Trp Asn Leu Glu Ile Ile Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ile Lys Arg 
                      20                  25                  30          
          Leu Gln Glu Phe Gly Val Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val 
                  35                  40                  45              
          Pro Gly Ser Phe Glu Leu Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys 
              50                  55                  60                  
          Gln Lys Arg Leu Gly Lys Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ile Lys Gly Ser Thr Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Thr His Gln Leu Met Lys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile 
                      100                 105                 110         
          Phe Gly Val Leu Thr Cys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala 
                  115                 120                 125             
          Gly Leu Ile Glu Gly Lys Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Val Glu Met Ala Thr Lys Phe Asn 
          145                 150                 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          Met Ala Val Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Lys Tyr Asp Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp Asn Arg Lys Ile Ile 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Gly Val 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro Gly Ser Phe Glu Leu 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln Lys Arg Leu Gly Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr His Gln Leu Met Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly Leu Ile Glu Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Lys Phe Asn 
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  175]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  81]]>
          Met Gly Ala Asn Trp Tyr Leu Asp Asn Glu Ser Ser Arg Leu Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ser Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ala Glu Val His Arg Phe Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Leu His Gly Lys Val Asp Pro Lys Gly Leu Ala Glu Val Glu Val Glu 
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Ser Ile Ser Thr Gly Ile Pro Leu Arg Asp Met Leu Leu Arg 
              50                  55                  60                  
          Val Leu Val Phe Gln Val Ser Lys Phe Pro Val Ala Gln Ile Asn Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Asp Met Arg Pro Ile Asn Asn Leu Ala Pro Gly Ala Gln Leu 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Arg Leu Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg Gly Lys Ser His Ser 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ala Thr Arg Leu Asp Glu Arg Arg Phe Gln 
                  115                 120                 125             
          Val Val Thr Leu Glu Pro Leu Val Ile His Ala Gln Asp Phe Asp Met 
              130                 135                 140                 
          Val Arg Ala Phe Asn Ala Leu Arg Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Ser Val Pro Val Gly Ala Val Leu Ile Phe Thr Ala Arg 
                          165                 170                 175 
          <![CDATA[<210>  82]]>
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          <![CDATA[<400>  82]]>
          Met Thr Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Ser Ala Ile Lys Ala Leu Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ile Ile Leu Ala Glu Ala Asp Leu Arg His Ile Pro Gln Asp Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Arg Leu Ala Val Arg Val Ile His Ala Cys Gly Met Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Asn Asp Leu Ala Phe Ser Glu Gly Ala Gly Lys Ala Gly Arg Asn 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Leu Ala Gly Ala Pro Ile Leu Cys Asp Ala Arg Met Val Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Gly Ile Thr Arg Ser Arg Leu Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Ser Asp Pro Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Gly Asn 
                      100                 105                 110         
          Thr Arg Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Trp Leu Pro His Ile Glu Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Ile Val Ala Ile Gly Asn Ala Pro Thr Ala Leu Phe Arg Leu Phe 
              130                 135                 140                 
          Glu Leu Leu Asp Ala Gly Ala Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ile Gly Met 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Gly Phe Val Gly Ala Ala Glu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Arg Gly Val Pro Tyr Val Ile Val Arg Gly Arg Arg Gly Gly 
                      180                 185                 190         
          Ser Ala Met Thr Ala Ala Ala Val Asn Ala Leu Ala Ser Glu Arg Glu 
                  195                 200                 205             
          <![CDATA[<210>  83]]>
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          <![CDATA[<400>  83]]>
          Met Ile Thr Val Phe Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ala Pro Arg Arg Glu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Ala Glu Val Ile Tyr Ser Ser Leu His Leu Gly Leu Asp Ile 
                      20                  25                  30          
          Pro Lys Gly Lys His Ala Ile Arg Phe Leu Cys Leu Glu Lys Glu Asp 
                  35                  40                  45              
          Phe Tyr Tyr Pro Phe Asp Arg Ser Asp Asp Tyr Thr Val Ile Glu Ile 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Met Ala Gly Arg Ser Glu Glu Thr Lys Met Leu Leu Ile Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Leu Phe Ile Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Ala His Asp 
                          85                  90                  95      
          Val Glu Ile Thr Ile Lys Glu Gln Pro Ala His Cys Trp Gly Phe Arg 
                      100                 105                 110         
          Gly Arg Thr Gly Asp Ser Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Val 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210>  84]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Met Gly Ser Asp Leu Gln Lys Leu Gln Arg Phe Ser Thr Cys Asp Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Gly Leu Leu Asn Val Tyr Asn Ile Pro Thr Gly Gly Tyr Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Asn Leu Thr Ala Ile Ser Pro Pro Gln Asn Ser Ser Ile Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Thr Ala Tyr Thr Val Leu Phe Ala Pro Ile Asp Asp Pro Arg Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Tyr Ile Asp Ser Val Pro Pro Asn Ser Ile Leu Val Leu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Pro His Leu Gln Ser Gln Phe His Pro Phe Ile Lys Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Gln Ala Met Tyr Gly Gly Leu Met Ser Thr Arg Ala Gln Tyr Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ser Asn Gly Thr Val Val Phe Gly Arg Ile Arg Asp Val Asp Glu His 
                  115                 120                 125             
          Arg Thr Leu Asn His Pro Val Phe Ala Tyr Gly Val Gly Ser Cys Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Lys Ala Val Val Lys Ala Val Gly Thr Asn Val Gln Leu Lys Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Asp Gly Val Thr Gln Thr Ile Cys Pro Gly Asp Tyr Ile 
                          165                 170                 175     
          Ala Gly Asp Asn Asn Gly Ile Val Arg Ile Pro Val Gln Glu Thr Asp 
                      180                 185                 190         
          Ile Ser Lys Leu Val Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Ile Glu Val Asp Arg 
                  195                 200                 205             
          Leu Val Ser Glu Ala Ile Lys Asn Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Arg Arg Met Val Leu Lys Asp Tyr Ile 
          225                 230                 235 
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  162]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Met Ser Gly Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly Tyr Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Phe Leu Lys Met Thr Gly His Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Ile Asp Cys Gly Ala Leu Arg Tyr Asp Ala Asp Asp Asp Tyr Pro Ala 
                  35                  40                  45              
          Phe Cys Ile Ala Ala Ala Thr Arg Thr Val Ala Asp Pro Gly Ser Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Ile Val Leu Gly Gly Ser Gly Asn Gly Glu Gln Ile Ala Ala Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Val Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Ala Trp Ser Val Gln Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Ala Arg Glu His Asn Asn Ala Gln Leu Ile Gly Ile Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Arg Met His Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Ile Val Lys Ala Phe Val 
                  115                 120                 125             
          Thr Thr Pro Trp Ser Lys Ala Gln Arg His Gln Arg Arg Ile Asp Ile 
              130                 135                 140                 
          Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Thr His Glu Ala Pro Pro Val Pro Gly Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala 
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          Met Gly Asp Asp Ala Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Val Asp Glu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ser Gln Ile Gly Val Leu Leu Ala Glu Pro Leu Pro Asp Asp Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ile Gln His Asp Leu Phe Asp Leu Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Glu Leu Cys Ile Pro Gly His Ala Ala Ile Thr Glu Asp His Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Ala Leu Trp Leu Val His Tyr Asn Gly Gln Leu Pro Pro Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Phe Ile Leu Pro Gly Gly Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala His 
                          85                  90                  95      
          Val Cys Arg Thr Val Cys Arg Arg Ala Glu Arg Ser Ile Lys Ala Leu 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Ser Glu Pro Leu Asn Ile Ala Pro Ala Ala Tyr Val Asn Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ala Arg Val Leu Asn Arg Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Ala Asp Val Leu Trp Asp Arg Thr Arg Ala His 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Met Ile Leu Ser Ala Glu Gln Ser Phe Thr Leu Arg His Pro His Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Ala Leu Ala Phe Val Arg Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Gln Arg Leu Arg Gly Leu Asp Ser Asp Gly Glu Gln Val Trp 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Leu Leu Val Arg Val Pro Leu Leu Gly Glu Val Asp Leu Pro 
              50                  55                  60                  
          Phe Arg Ser Glu Ile Val Arg Thr Pro Gln Gly Ala Glu Leu Arg Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Thr Leu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Val Ala Val Ser Gly Gln Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Ala Ala Glu Gly Gly Glu Met Ala Phe Ala Phe Gln Phe Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          His Leu Ala Thr Pro Glu Ala Glu Gly Glu Gly Gly Ala Ala Phe Glu 
                  115                 120                 125             
          Val Met Val Gln Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ala Ala Gly Leu Pro Pro Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  156]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Lys Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  209]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Met Asp Asp Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Leu Lys Val Ile Pro Val 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu 
                      20                  25                  30          
          Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Gly Ala Asp Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn 
                      100                 105                 110         
          Asn Pro Ser Thr Val Glu Gln Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Pro Asp Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Arg Asn Gly Glu 
                      180                 185                 190         
          Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn 
                  195                 200                 205             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
          Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe 
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  114]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Glu Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Glu Asp His Ser Ala Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile His Phe Val Asp Leu Asp Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Phe 
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  157]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Glu His His Arg 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
          <![CDATA[<210>  93]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
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          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
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          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Glu Phe Val Glu Ala Met 
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          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asp 
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          Leu Asp Asp Val Cys Glu Trp Phe Asp Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Asp Ala Leu Val Glu Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Asp 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Glu Phe Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
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          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
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              130                 135                 140                 
          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp Asn Val Cys Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly 
                          165                 170                 175     
          Val Gly Lys Ala Leu Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          Ala Lys Lys Phe Val Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu 
                  195                 200                 205 
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          Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
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          Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp 
                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
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                          85                  90                  95      
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          Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val 
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              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
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          Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu 
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          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
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          Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala 
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          Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Met Pro Gly Lys Xaa Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala 
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          Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu 
          145                 150                 155     
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          Met Xaa Xaa Ile Asn Asn Gln Leu Lys Xaa Leu Lys Val Ile Pro Val 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala 
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              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                  115                 120                 125             
          Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Xaa Asn Gly Glu 
                      180                 185                 190         
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          Pro 
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          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                      100                 105                 110         
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Asp Ser Xaa Glu Xaa His Xaa 
                  115                 120                 125             
          Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Cys Ile Glu Ile Leu Xaa Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala 
          145                 150                 155         
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          Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile 
              50                  55                  60                  
          Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val 
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                          85                  90                  95      
          Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Xaa Ile Leu 
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          Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Xaa Phe Val Xaa Ala Met 
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          Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Xaa 
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          Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala 
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          acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta      120
          agtataagaa ggagatatac tt                                               142
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          taaagaagga gatatcat                                                     18
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          tgagaaggag atatcat                                                      17
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          ttgaaagtga tggtttggta agaaat                                            26
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          tgcagcacgt atgataactt caaag                                             25
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          aggatatttt acccagcagt gccccgt                                           27
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          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
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                      100                 105                 110         
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          Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
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                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
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          Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Gln 
                          245                 250                 255     
          Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Leu 
                      260                 265                 270         
          Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 
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          Asn Tyr Asn Ala Lys 
                          325 
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          <![CDATA[<400>  113]]>
          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
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          Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Asp Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 
                  115                 120                 125             
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          Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 
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          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
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                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
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                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 
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          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
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          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
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          Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
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          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile 
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                          85                  90                  95      
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          Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
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                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
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          Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
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          Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr 
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          Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
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                          165                 170                 175     
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          Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 
          225                 230                 235                 240 
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                          245                 250                 255     
          Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile 
                  275                 280                 285             
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          Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn 
                      100                 105                 110         
          Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln 
                          245                 250                 255     
          Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp 
                      260                 265                 270         
          Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu 
                          325         
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          <![CDATA[<400>  117]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
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          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
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          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
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          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe 
                          165                 170                 175     
          Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln 
              210                 215                 220                 
          Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu 
              290                 295                 300                 
          Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val 
                      340                 345                 350         
          Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  378]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met 
                  115                 120                 125             
          Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr 
                          165                 170                 175     
          Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn 
                  195                 200                 205             
          Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp 
              210                 215                 220                 
          Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val 
              290                 295                 300                 
          Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly 
                          325                 330                 335     
          Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala 
                      340                 345                 350         
          Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu 
                  355                 360                 365             
          Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val 
              370                 375             
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  122]]>
          gaagcaaacc gtacgcgtaa ag                                                22
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          cgaccagctc ttacacggcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  124]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
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          gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac                                 36
          <![CDATA[<210>  125]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          ataattgacg atccggttgc c                                                 21
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          gctatttacg ccctgattgt cttttgt                                           27
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<400>  127]]>
          attgagaacc tgcgtaaacg gc                                                22
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          tgaagagcgg ttcagataac ttcc                                              24
          <![CDATA[<210>  129]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  129]]>
          cgatccggaa acctcctaca c                                                 21
          <![CDATA[<210>  130]]>
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          <![CDATA[<400>  130]]>
          gattattcgc gcaacgctaa acagat                                            26
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          tgatcattga cgatccggta gcc                                               23
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          cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg       60
          tcggtatgga                                                              70
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          <![CDATA[<400>  133]]>
          agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg       60
          ctttacagct accgagct                                                     78
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          <![CDATA[<400>  134]]>
          ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg                                        30
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          ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg                                        30
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          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  136]]>
          Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly 
                      20              
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  137]]>
          Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala 
          <![CDATA[<210>  138]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類呼吸道融合性病毒A (菌株A2)]]>
          <![CDATA[<400>  138]]>
          Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  139]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類呼吸道融合性病毒A (菌株A2)]]>
          <![CDATA[<400>  139]]>
          Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  140]]>
          Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 
                      20                  25                  30          
          His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 
                  35                  40                  45              
          Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 
                      180                 185                 190         
          Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 
                  195                 200                 205             
          Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 
              210                 215                 220                 
          Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 
                          245                 250                 255     
          Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 
                      260                 265                 270         
          Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val 
              290                 295                 300                 
          Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg 
                          325                 330                 335     
          Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp 
                      340                 345                 350         
          Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala 
                  355                 360                 365 
          <![CDATA[<210>  141]]>
          <![CDATA[<211>  62]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  141]]>
          Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr 
                      20                  25                  30          
          Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala 
                  35                  40                  45              
          Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50                  55                  60          
          <![CDATA[<210>  142]]>
          <![CDATA[<211>  574]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類呼吸道融合性病毒A (菌株A2)]]>
          <![CDATA[<400>  142]]>
          Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 
                  35                  40                  45              
          Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 
              50                  55                  60                  
          Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 
                          85                  90                  95      
          Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 
                  115                 120                 125             
          Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 
              130                 135                 140                 
          Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 
              210                 215                 220                 
          Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 
                          245                 250                 255     
          Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 
                      260                 265                 270         
          Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 
                  275                 280                 285             
          Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 
              290                 295                 300                 
          Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 
                          325                 330                 335     
          Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 
                  355                 360                 365             
          Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val 
              370                 375                 380                 
          Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 
                          405                 410                 415     
          Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 
                      420                 425                 430         
          Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 
                  435                 440                 445             
          Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 
              450                 455                 460                 
          Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 
                          485                 490                 495     
          Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 
                      500                 505                 510         
          Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 
                  515                 520                 525             
          Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 
                          565                 570                 
          <![CDATA[<210>  143]]>
          <![CDATA[<211>  64]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人類呼吸道融合性病毒A (菌株A2)]]>
          <![CDATA[<400>  143]]>
          Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn 
                      20                  25                  30          
          Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50                  55                  60                  
          <![CDATA[<210>  144]]>
          <![CDATA[<211>  178]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  144]]>
          Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 
                          85                  90                  95      
          Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 
                      100                 105                 110         
          Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 
                  115                 120                 125             
          Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 
                          165                 170                 175     
          Arg Asn 
          <![CDATA[<210>  145]]>
          <![CDATA[<211>  57]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  145]]>
          Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50                  55          
          <![CDATA[<210>  146]]>
          <![CDATA[<211>  562]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  A型流感病毒(菌株A/日本/305/1957 H2N2)]]>
          <![CDATA[<400>  146]]>
          Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp 
                      20                  25                  30          
          Thr Asn Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu 
                  35                  40                  45              
          Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp 
                      100                 105                 110         
          Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys 
                  115                 120                 125             
          Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly 
              130                 135                 140                 
          Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Met Val Trp Leu Thr Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly 
                          165                 170                 175     
          Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val 
                      180                 185                 190         
          His His Pro Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val 
                  195                 200                 205             
          Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu 
                          245                 250                 255     
          Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys 
                      260                 265                 270         
          Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys 
                  275                 280                 285             
          Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro 
              290                 295                 300                 
          Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly 
                      340                 345                 350         
          Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn 
                  355                 360                 365             
          Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala 
              370                 375                 380                 
          Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Arg Arg 
                          405                 410                 415     
          Leu Glu Asn Leu Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp 
                      420                 425                 430         
          Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu 
                  435                 440                 445             
          Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met 
              450                 455                 460                 
          Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe 
          465                 470                 475                 480 
          Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr 
                          485                 490                 495     
          Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala 
                  515                 520                 525             
          Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala 
              530                 535                 540                 
          Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Cys Ile 
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  A型流感病毒(菌株A/日本/305/1957 H2N2)]]>
          <![CDATA[<400>  147]]>
          Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Phe 
          1               5                   10                  15      
          Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser 
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Val Val Asp Leu Ser 
              50

Claims

一種經突變之FimH多肽，其相對於野生型FimH多肽之胺基酸序列包含至少一個胺基酸突變，其中該突變位置選自由以下組成之群：F1、P12、G14、G15、G16、A18、P26、V27、V28、Q32、N33、L34、V35、R60、S62、Y64、G65、L68、F71、T86、L107、Y108、L109、V112、S113、A115、G116、V118、A119、A127、L129、Q133、F144、V154、V155、V156、P157、T158、V163及V185，其中該等胺基酸位置係根據SEQ ID NO: 59編號。
如請求項1之經突變之FimH多肽，其包含至少一個選自由以下組成之群的突變：F1I；F1L；F1V；F1M；F1Y；F1W；P12C；G14C；G15A；G15P；G16A；G16P；A18C；P26C；V27A；V27C；V28C；Q32C；N33C；L34C；L34N；L34S；L34T；L34D；L34E；L34K；L34R；V35C；R60P；S62C；Y64C；G65A；L68C；F71C；T86C；L107C；Y108C；L109C；V112C；S113C；A115V；G116C；V118C；A119C；A119N；A119S；A119T；A119D；A119E；A119K；A119R；A127C；L129C；Q133K；F144C；V154C；V156C；P157C；T158C；V163I；及V185I，或其任何組合。
如請求項2之經突變之FimH多肽，其中該經突變之FimH多肽包含選自由以下組成之群的突變： a) 突變G15A及G16A； b) 突變P12C及A18C； c) 突變G14C及F144C； d) 突變P26C及V35C； e) 突變P26C及V154C； f) 突變P26C及V156C； g) 突變V27C及L34C； h) 突變V28C及N33C； i) 突變V28C及P157C； j) 突變Q32C及Y108C； k) 突變N33C及L109C； l) 突變N33C及P157C； m) 突變V35C及L107C； n) 突變V35C及L109C； o) 突變S62C及T86C； p) 突變S62C及L129C； q) 突變Y64C及L68C； r) 突變Y64C及A127C； s) 突變L68C及F71C； t) 突變V112C及T158C； u) 突變S113C及G116C； v) 突變S113C及T158C； w) 突變V118C及V156C； x) 突變A119C及V155C； y) 突變L34N及V27A； z) 突變L34S及V27A； aa) 突變L34T及V27A； ab) 突變L34D及V27A； ac) 突變L34E及V27A； ad) 突變L34K及V27A； ae) 突變L34R及V27A； af) 突變A119N及V27A； ag) 突變A119S及V27A； ah) 突變A119T及V27A； ai) 突變A119D及V27A； aj) 突變A119E及V27A； ak) 突變A119K及V27A； al) 突變A119R及V27A； am) 突變G15A及V27A； an) 突變G16A及V27A； ao) 突變G15P及V27A； ap) 突變G16P及V27A； aq) 突變G15A、G16A及V27A； ar) 突變G65A及V27A； as) 突變V27A及Q133K；及 at) 突變G15A、G16A、V27A及Q133K。
如請求項2之經突變之FimH多肽，其包含SEQ ID NO: 2至58及60至64中之任一者之序列。
如請求項1至4中任一項之經突變之FimH多肽，其中該多肽經分離。
一種醫藥組合物，其包含(i)如請求項1至4中任一項之經突變之FimH多肽，及(ii)醫藥學上可接受之載劑。
一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至4中任一項之經突變之FimH多肽。
如請求項7之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種額外抗原。
如請求項8之免疫原性組合物，其中該至少一種額外抗原為多醣或蛋白。
如請求項7之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種佐劑。
一種核酸分子，其包含編碼如請求項1至4中任一項之經突變之FimH多肽之胺基酸序列的核苷酸序列。
如請求項1至4中任一項之經突變之FimH多肽，其中該多肽為免疫原性的。
一種重組哺乳動物細胞，其包含編碼如請求項1至4中任一項之經突變之FimH多肽的聚核苷酸。
一種培養物，其包含如請求項13之重組細胞，其中該培養物之體積大小為至少5公升。
一種用於產生如請求項1至4中任一項之經突變之FimH多肽的方法，該方法包含在適合的條件下培養如請求項13之重組哺乳動物細胞，藉此表現該多肽；及收集該多肽。
一種方法，該方法係用於(i)誘導個體中對抗腸外病原性大腸桿菌( E . coli)之免疫反應，或(ii)誘導個體中產生調理吞噬活性抗體(opsonophagocytic antibody)及/或中和抗體，該等抗體對腸外病原性大腸桿菌具有特異性，其中該方法包含向該個體投與有效量的如請求項6至10中任一項之組合物。
如請求項16之方法，其中該個體具有發展泌尿道感染之風險。
如請求項16之方法，其中該個體具有發展菌血症之風險。
如請求項16之方法，其中該個體具有發展敗血症之風險。
一種引發哺乳動物中對抗大腸桿菌之免疫反應的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量的如請求項6至10中任一項之組合物。
如請求項20之方法，其中該免疫反應包含針對大腸桿菌之調理吞噬活性抗體及/或中和抗體。
如請求項20之方法，其中該免疫反應保護該哺乳動物免受大腸桿菌感染。
一種預防、治療或改善個體中細菌感染、疾病或病狀的方法，其包含向該個體投與免疫有效量的如請求項6至10中任一項之組合物。