KR20230110580A - 이. 콜라이 FimH 돌연변이체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 개선된 생화학적 특성 및 면역원성을 초래하는 이. 콜라이 돌연변이된 FimH 폴리펩티드의 설계, 이러한 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

이. 콜라이 FimH 돌연변이체 및 그의 용도
관련 출원
본 출원은 2020년 12월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 63/130,153, 2021년 5월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 63/185,425 및 2021년 11월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 63/282,244를 우선권 주장한다. 각각의 상기 출원의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 출원되며, .txt 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2021년 11월 17일에 생성되고 220 KB의 크기를 갖는 "PC072713_ST25_17Nov2021.txt" 명칭의 서열 목록을 포함한다. 이 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이며 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 기술분야
본 개시내용은 돌연변이된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) FimH 폴리펩티드 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
요로 감염 (UTI)은 여성 5명 중 1명에게 일생 동안 적어도 한 번 영향을 미치며, 상당한 이환율 및 사망률을 초래하여 의료 시스템에 상당한 부담을 준다. 여러 상이한 박테리아가 UTI를 야기할 수 있지만, 가장 흔한 원인 (사례의 90-95%)은 그람-음성 박테리아 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이(E. coli))이다. 대부분의 이. 콜라이 UTI는 요로병원성 이. 콜라이 (UPEC)에 의해 야기되고, 이는 위장관에서 집락화하고 대변 세균총으로부터 비뇨생식기로 이동하며, 숙주 요로상피 세포에 접착하여 요로의 상행 감염을 위한 저장소를 확립한다. 접착은 상피층의 만노실화된 당단백질에 결합하거나 소변으로 분비되는 유형 1 핌브리아를 포함하는 핌브리아 어드헤신에 의해 촉진된다. 유형 1 핌브리아는 임상 UPEC 분리주 중에서 고도로 보존되어 있고, fim이라고 하는 유전자 클러스터에 의해 코딩되며, 이는 부속 단백질 (FimC, FimD), 다양한 구조적 서브유닛 (FimE, FimF, FimG) 및 FimH라고 하는 어드헤신을 코딩한다. FimH는 인간 방광 감염의 측면을 모방하는 마우스 모델에서 UTI 감염의 모든 특징에 필수적이다 (Hannan et al. PLoS Pathog. 2010 Aug 12;6(8):e1001042; doi: 10.1371/journal.ppat.1001042; Schwartz et al. Infect Immun. 2011 Oct;79(10):4250-9. doi: 10.1128/IAI.05339-11). 만노실화된 수용체를 모방함으로써 FimH를 표적화하는 소분자 억제제는 UTI에서 FimH의 역할을 추가로 검증하고, 동물 모델에서 치료제로서의 가능성을 보여주고 있다 (Cusumano CK, et al. Sci Transl Med. 2011;3(109):109ra115. doi:10.1126/scitranslmed.3003021). 또한, FimH는 이. 콜라이 인간 방광염 분리주에서 양성 선택 하에 있고 (Chen SL, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Dec 29;106(52):22439-44. doi: 10.1073/pnas.0902179106), 양성으로 선택된 잔기는 방광염의 마우스 모델에서 유독성에 영향을 미칠 수 있다 (Schwartz, D. J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 15530-15537, doi:10.1073/pnas.1315203110 (2013)).
FimH는 만노실화된 당단백질에 대한 결합을 담당하는 렉틴 결합 도메인 (FimHLD) 및 필린 도메인의 2개 도메인으로 구성된다. 필린 도메인은 공여자 가닥 교환이라고 하는 메커니즘을 통해 FimH를 FimG와 같은 필루스의 다른 구조적 서브유닛에 연결시키는 역할을 한다 (Le Trong, I et al., J. Struct Biol. 2010 Dec;172(3):380-8. doi: 10.1016/j.jsb.2010.06.002). FimH 필린 도메인은 불완전한 이뮤노글로불린 폴딩을 형성하여, FimG의 N-말단 β-가닥에 대한 결합 부위를 제공하는 홈을 생성하여 FimH와 FimG 사이에 강한 분자간 연결을 형성한다. FimHLD는 가용성의 안정한 형태로 발현될 수 있지만, 전장 FimH는 샤페론 FimC와 복합체가 아니거나 펩티드 형태 또는 융합 단백질로서 FimG의 공여자 가닥 펩티드로 보완되지 않는 한 단독으로 불안정하다 (Vetsch, M., et al. J. Mol. Biol. 322:827-840 (2002); Barnhart MM, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2000) Jul 5;97(14):7709-14) (Barnhart MM, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2000) Jul 5;97(14):7709-14; Sauer MM, et al. Nat Commun. (2016) Mar 7;7:10738; Barnhart MM, et al. J Bacteriol. 2003 May;185(9):2723-30). FimG 공여자 펩티드를 글리신-세린 링커를 통해 전장 FimH에 연결시킴으로써 전장 FimH 분자의 설계 및 발현은 이전에 기술되었으며 (PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429, 2021년 5월 6일 공개), FimH-DSG로 명명된다.
FimHLD는 기능적 면역원성을 자극하는 그의 능력 면에서 불량한 면역원으로 생각된다. 일부 연구는 결합 항체 역가가 아주반트와 함께 및 그 없이 FimHLD로 도출될 수 있지만, 기능적 중화 역가는 아주반트의 존재 하에서만 관찰되었음을 시사한다 (PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429, 2021년 5월 6일 공개). 연구는 만노시드 리간드에 대한 감소된 친화성을 갖는 개방형 입체형태로 FimH를 잠그는 것이 기능적 면역원성을 개선시킴을 시사한다 (Kisiela, D. I. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 110, 19089-19094 (2013). 따라서, 야생형 FimH에 비해 개선된 기능적 면역원성을 초래하는 개선된 생화학적 특성 및 만노시드 리간드에 대한 감소된 친화성을 갖는 신규 FimH 돌연변이체가 관련 기술분야에 필요하다.
본 개시내용은 개선된 생화학적 특성 및 면역원성을 초래하는 이. 콜라이 FimH 돌연변이된 폴리펩티드의 설계, 이러한 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 한 측면에서 본 개시내용은 야생형 FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 돌연변이 위치는 F1, P12, G14, G15, G16, A18, P26, V27, V28, Q32, N33, L34, V35, R60, S62, Y64, G65, L68, F71, T86, L107, Y108, L109, V112, S113, A115, G116, V118, A119, A127, L129, Q133, F144, V154, V155, V156, P157, T158, V163 및 V185로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 아미노산 위치는 서열식별번호(SEQ ID NO): 59에 따라 넘버링된다.
추가 측면에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드이다: F1I; F1L; F1V; F1M; F1Y; F1W; P12C; G14C; G15A; G15P; G16A; G16P; A18C; P26C; V27A; V27C; V28C; Q32C; N33C; L34C; L34N; L34S; L34T; L34D; L34E; L34K; L34R; V35C; R60P; S62C; Y64C; G65A; L68C; F71C; T86C; L107C; Y108C; L109C; V112C; S113C; A115V; G116C; V118C; A119C; A119N; A119S; A119T; A119D; A119E; A119K; A119R; A127C; L129C; Q133K; F144C; V154C; V156C; P157C; T158C; V163I; 및 V185I, 또는 이들의 임의의 조합. 예를 들어, 돌연변이 G15A 및 G16A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 P12C 및 A18C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G14C 및 F144C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 P26C 및 V35C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 P26C 및 V154C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 P26C 및 V156C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V27C 및 L34C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V28C 및 N33C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V28C 및 P157C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 Q32C 및 Y108C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 N33C 및 L109C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 N33C 및 P157C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V35C 및 L107C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V35C 및 L109C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 S62C 및 T86C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 S62C 및 L129C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 Y64C 및 L68C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 Y64C 및 A127C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L68C 및 F71C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V112C 및 T158C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 S113C 및 G116C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 S113C 및 T158C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V118C 및 V156C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119C 및 V155C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L34N 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L34S 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L34T 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L34D 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L34E 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L34K 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 L34R 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119N 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119S 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119T 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119D 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119E 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119K 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 A119R 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G15A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G16A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G15P 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G16P 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G15A, G16A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G65A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 V27A 및 Q133K를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 돌연변이 G15A, G16A, V27A 및 Q133K를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어, 서열식별번호: 2-58 및 60-64 중 어느 하나의 서열을 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드. 추가로 예를 들어 본원에 개시된 돌연변이된 FimH 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 단리된다.
추가 예에서, 본 개시내용은 (i) 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이된 FimH 폴리펩티드 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
추가 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 적어도 하나의 추가 항원, 예컨대 폴리사카라이드, 또는 당접합체, 또는 단백질을 추가로 포함한다. 추가로 예를 들어, 면역원성 조성물은 적어도 하나의 아주반트를 추가로 포함한다.
추가 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이된 FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
추가 예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 면역원성이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 포유동물 세포를 추가로 제공한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 세포를 포함하는 배양물을 추가로 제공하며, 여기서 상기 배양물은 크기가 적어도 5 리터, 적어도 10 리터, 적어도 20 리터, 적어도 50 리터, 적어도 100 리터, 적어도 200 리터, 적어도 500 리터, 적어도 1000 리터, 또는 적어도 2000 리터이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 포유동물 세포를 적합한 조건 하에 배양하여, 이에 의해 폴리펩티드를 발현하는 단계; 및 폴리펩티드를 수확하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 생산하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 (i) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 유도하거나, 또는 (ii) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대해 특이적인 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체의 생성을 유도하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 방법은 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 예에서, 대상체는 요로 감염이 발병할 위험이 있다. 추가 예에서, 대상체는 균혈증이 발병할 위험이 있다. 추가 예에서, 대상체는 패혈증이 발병할 위험이 있다. 또 다른 예에서, 대상체는 크론병이 발병할 위험이 있다.
본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 도출하는 방법을 추가로 제공한다. 한 예에서, 면역 반응은 이. 콜라이에 대한 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체를 포함한다. 추가 예에서, 면역 반응은 이. 콜라이 감염으로부터 포유동물을 보호한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 호전시키는 방법을 추가로 제공한다.
도 1a - 1b는 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체의 원형 이색성 스펙트럼을 보여준다. 도 1a는 근자외선에서의 원형 이색성 스펙트럼을 보여주고, 도 1b는 원자외선 영역에서의 원형 이색성 스펙트럼을 보여준다.
도 2는 PD3에서 효모 만난 중화 검정에서 FimHLD 돌연변이체의 상대적 면역원성을 보여준다.
도 3a - 3b는 PD2 (도 3a) 및 PD3 (도 3b)에서 효모 만난 중화 검정에서 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체의 면역원성을 보여준다.
도 4는 His-태그부착된 FimH-DsG의 야생형 및 돌연변이된 형태의 단리에 활용되는 주요 정제 단계를 보여주는 다이어그램이다.
도 5a - 5b는 FimH-DSG WT의 정제 프로파일을 보여준다. 도 5a는 SP-세파로스 칼럼 상의 FimH-DSG WT의 용리 프로파일이고, 도 5b는 용리된 분획의 SDS-PAGE 분석이다.
도 6a - 6b는 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체의 정제 프로파일을 보여준다. 도 6a는 SP-세파로스 칼럼 상의 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체의 용리 프로파일을 보여주고, 도 6b는 용리된 분획의 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
도 7a - 7b는 FimH-DSG 단백질의 분석용 SEC를 보여준다. FimH-DSG G15A G16A V27A의 분석용 SEC는 도 7a에 나타내며, 야생형 FimH-DSG WT의 분석용 SEC는 도 7b에 나타낸다.
도 8은 FimH HMW 복합체 형성 메커니즘의 개략도를 보여준다.
도 9는 본원의 실시예 21에 기재된 비인간 영장류 및 후속 시험감염의 면역화 스케줄을 보여준다.
도 10은 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체 + 4가 이. 콜라이 O-항원 (O1a, O2, O6 및 O25b)을 사용한 NHP의 백신접종 후 O-항원 혈청형-특이적 항체의 상승을 보여준다. 범례: 위약 (원); FimH-DSG G15A G16A V27A (사각형); FimH-DSG G15A G16A V27A + 4가 O-항원 (삼각형).
도 11a - 11b는 FimH-DSG G15A G16A V27A +/- 4plex O-항원을 사용한 면역화가 강력한 기능적 항-FimH 항체 반응을 도출함을 보여준다. 도 11a는 직접 루미넥스 FimH IgG 검정의 결과를 보여주고, 도 11b는 이. 콜라이 결합 억제 검정의 결과를 보여준다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "4plex"는 동일한 의미를 가지며, 용어 "4가"와 상호교환가능하다.
도 12는 실시예 21에 기재된 바와 같이 시험감염 후 백신접종된 비인간 영장류 (NHP)에서 세균뇨가 감소됨을 보여준다. 범례: 위약 (원); FimH-DSG G15A G16A V27A (사각형); FimH-DSG G15A G16A V27A + 4가 O-항원 (삼각형); * p ≤ 0.007 위약 그룹과 비교하여.
도 13a - 13c는 실시예 21에 기재된 바와 같이 3개의 그룹: 위약, FimH-DSG G15A G16A V27A 단독 및 FimH-DSG G15A G16A V27A + 4가 O-항원의 시험감염 후 백신접종된 NHP에서 감염의 바이오마커가 감소됨을 보여준다. 도 13a는 소변 내 MPO의 정량화를 보여주고, 도 13b는 소변 내 IL-8의 정량화를 보여주고, 도 13c는 소변 침강물 내 증가된 PMN을 갖는 동물의 백분율을 보여준다. 범례: 위약 (원); FimH-DSG G15A G16A V27A (사각형); FimH-DSG G15A G16A V27A + 4가 O-항원 (삼각형).
서열 식별자
서열식별번호: 1은 야생형 이. 콜라이 FimHLD (FimHLD_WT)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 2는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G65A_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 3은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_F1I에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 4는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_F1L에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 5는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_F1V에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 6은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_F1M에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 7은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_F1Y에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 8은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_F1W에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 9는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_Q133K에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 10은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G15A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 11은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G15P에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 12는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G16A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 13은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G16P에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 14는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G15A_G16A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 15는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_R60P에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 16은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G65A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 17은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_P12C_A18C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 18은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G14C_F144C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 19는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_P26C_V35C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 20은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_P26C_V154C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 21은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_P26C_V156C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 22는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V27C_L34C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 23은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V28C_N33C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 24는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V28C_P157C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 25는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_Q32C_Y108C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 26은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_N33C_L109C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 27은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_N33C_P157C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 28은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V35C_L107C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 29는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V35C_L109C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 30은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_S62C_T86C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 31은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_S62C_L129C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 32는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_Y64C_L68C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 33은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_Y64C_A127C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 34는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_L68C_F71C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 35는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V112C_T158C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 36은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_S113C_G116C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 37은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_S113C_T158C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 38은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V118C_V156C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 39는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_A119C_V155C에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 40은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_L34N_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 41은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_L34S_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 42는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_L34T_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 43은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_A119N_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 44는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_A119S_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 45는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_A119T_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 46은 돌연변이체 이. 콜라이 FimH-DSG_A115V에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 47은 돌연변이체 이. 콜라이 FimH-DSG_V163I에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 48은 돌연변이체 이. 콜라이 FimH-DSG_V185I에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 49는 돌연변이체 이. 콜라이 FimH-DSG_DSG_V3I에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 50은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G15A_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 51은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G16A_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 52는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G15P_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 53은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G16P_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 54는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G15A_G16A_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 55는 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V27A_R60P에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 56은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G65A_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 57은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_V27A_Q133K에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 58은 돌연변이체 이. 콜라이 FimHLD_G15A_G16A_V27A_Q133K에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 59는 링커를 통해 연결된 공여자 가닥 FimG 펩티드를 포함하는 야생형 이. 콜라이 전장 FimH (FimH-DSG_WT)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 60은 돌연변이체 이. 콜라이 FimH-DSG_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 61은 돌연변이체 이. 콜라이 FimH-DSG_G15A_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 62는 돌연변이체 이. 콜라이 FimH DSG_G15A_G16A_V27A에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 63은 돌연변이체 이. 콜라이 FimH DSG_V27A_Q133K에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 64는 돌연변이체 이. 콜라이 FimH DSG_G15A_G16A_V27A_Q133K에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 65는 마우스 Ig 카파 신호 펩티드 서열에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 66 - 108은 나노구조-관련 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 109 - PCR용 프라이머.
서열식별번호: 110 - PCR용 프라이머.
서열식별번호: 111 - PCR용 프로브.
서열식별번호: 112는 O25b 2401 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 113은 O25a:K5:H1 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 114는 O25a ETEC ATCC WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 115는 K12 W3110 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 116은 살모넬라 LT2 WzzB 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 117은 O25b 2401 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 118은 O25a:K5:H1 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 119는 O25a ETEC ATCC FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 120은 O157 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 121은 살모넬라 LT2 FepE 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 122는 LT2wzzB_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 123은 LT2wzzB_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 124는 O25bFepE_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 125는 O25bFepE_A에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 126은 wzzB P1_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 127은 wzzB P2_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 128은 wzzB P3_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 129는 wzzB P4_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 130은 O157 FepE_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 131은 O157 FepE_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 132는 pBAD33_adaptor_S에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 133은 pBAD33_adaptor_AS에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 134는 JUMPSTART_r에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 135는 gnd_f에 대한 프라이머 서열을 제시한다.
서열식별번호: 136은 인간 IgG 수용체 FcRn 대형 서브유닛 p51 신호 펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 137은 인간 IL10 단백질 신호 펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 138은 인간 호흡기 세포융합 바이러스 A (균주 A2) 융합 당단백질 F0 신호 펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 139는 인플루엔자 A 혈구응집소 신호 펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 140-147은 신호 펩티드 예측에 사용되는 다양한 종으로부터의 SignalP 4.1 (DTU Bioinformatics) 서열을 제시한다.
상세한 설명
본 개시내용은 이. 콜라이 FimH 돌연변이된 폴리펩티드 (돌연변이체), FimH 돌연변이체를 포함하는 조성물, FimH 돌연변이체의 생산 및 정제 방법, FimH 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 FimH 돌연변이체를 포함하는 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 값의 범위의 인용은 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 역할을 할 뿐이다. 본원에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 표시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 개시내용을 추가로 설명하기 위한 것이며 청구범위의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 개시내용의 실행에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 개시내용의 본문 전체에 걸쳐 여러 문헌이 인용된다. 상기 또는 하기에서 본원에 인용된 각 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등 포함)은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 내용도 본 개시내용이 이러한 개시내용보다 선행할 자격이 없었다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 대략 또는 거의를 의미하고, 한 실시양태에서 본원에 제시된 수치 값 또는 범위의 맥락에서 인용되거나 청구된 수치 값 또는 범위의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, 또는 ± 3%를 의미한다.
본 개시내용을 기술하는 맥락에서 (특히 청구범위의 맥락에서) 사용된 단수 용어 및 유사한 지시어는 본원에 달리 표시되지 않는 한 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 단수형 및 복수형 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
아미노산 서열 (펩티드 또는 단백질)과 관련하여 "단편"은 아미노산 서열의 일부, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된 아미노산 서열을 나타내는 서열에 관한 것이다. C-말단에서 단축된 단편 (N-말단 단편)은 예를 들어 오픈 리딩 프레임의 3'-단부가 결여되어 있는 말단절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득가능하다. N-말단에서 단축된 단편 (C-말단 단편)은 예를 들어 말단절단된 오픈 리딩 프레임이 번역을 개시하는 역할을 하는 시작 코돈을 포함하는 한, 오픈 리딩 프레임의 5'-단부가 결여되어 있는 말단절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득가능하다. 아미노산 서열의 단편은 예를 들어 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은 바람직하게는 아미노산 서열로부터 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 연속 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연"은 대립유전자 변이를 포함하여 자연에서 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 야생형 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 서열 (펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드)의 "변이체", 또는 "돌연변이체", 또는 "돌연변이된" 폴리펩티드에 대한 언급은 아미노산 삽입 변이체/돌연변이체, 아미노산 부가 변이체/돌연변이체, 아미노산 결실 변이체/돌연변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체/돌연변이체를 포함한다. 용어 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 모든 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 번역후 변형된 변이체, 입체형태, 이소형, 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 자연적으로 발생하는 것을 포함한다. 용어 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 특히, 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 생성된 생성물의 적절한 스크리닝과 함께 무작위 삽입이 또한 가능하다. 아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다. 아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 제거에 의해 특징화된다. 결실은 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 단부에 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 또한 N-말단 및/또는 C-말단 말단절단 변이체로 지칭된다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 또 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것에 의해 특징화된다. 상동성 단백질 또는 펩티드 사이에 보존되지 않은 아미노산 서열의 위치에 있는 변형 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 대체하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 펩티드 및 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전된 또는 비하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 이들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4개의 패밀리로 나뉜다: 산성 (아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성 (리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 (알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비하전된 극성 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 함께 방향족 아미노산으로 분류된다. 한 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 하기 그룹 내의 치환을 포함한다:
글리신, 알라닌;
발린, 이소류신, 류신;
아스파르트산, 글루탐산;
아스파라긴, 글루타민;
세린, 트레오닌;
리신, 아르기닌; 및
페닐알라닌, 티로신.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 바람직하게는 동일성의 정도는 적어도 약 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 참조 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 200개 아미노산으로 이루어진 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 바람직하게는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 아미노산, 일부 실시양태에서 연속 아미노산에 대해 제공된다. 일부 실시양태에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 제공된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야에 공지된 도구를 사용하여, 바람직하게는 최상의 서열 정렬을 사용하여, 예를 들어 Align을 사용하여, 표준 설정, 바람직하게는 EMBOSS::needle, 매트릭스: Blosum62, 갭 개방 10.0, 갭 연장 0.5를 사용하여 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 핵산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다.
용어 "% 동일한", "% 동일성" 또는 유사한 용어는 특히, 비교될 서열 간의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율을 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 백분율은 순전히 통계적이며, 두 서열 간의 차이는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 두 서열의 비교는 일반적으로 상응하는 서열의 국소 영역을 식별하기 위해 세그먼트 또는 "비교 창"에 대해 최적 정렬 후 서열을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동으로, 또는 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국소 상동성 알고리즘의 도움으로, 문헌 [Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국소 상동성 알고리즘의 도움으로, 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444]의 유사성 검색 알고리즘의 도움으로, 또는 상기 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) (미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA)의 도움으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 두 서열의 퍼센트 동일성은 미국 국립 생명공학 정보 센터 (NCBI) 웹사이트 (예를 들어, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq)에서 이용가능한 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, NCBI 웹사이트의 BLASTN 알고리즘에 사용되는 알고리즘 파라미터는 하기를 포함한다: (i) 예상 임계값이 10으로 설정됨; (ii) 단어 크기가 28로 설정됨; (iii) 쿼리 범위의 최대 일치는 0으로 설정됨; (iv) 일치/불일치 스코어는 1, -2로 설정됨; (v) 갭 비용은 선형으로 설정됨; 및 (vi) 저복잡도 영역에 대한 필터가 사용됨. 일부 실시양태에서, NCBI 웹사이트의 BLASTP 알고리즘에 사용되는 알고리즘 파라미터는 하기를 포함한다: (i) 예상 임계값이 10으로 설정됨; (ii) 단어 크기가 3으로 설정됨; (iii) 쿼리 범위의 최대 일치는 0으로 설정됨; (iv) 매트릭스는 BLOSUM62로 설정됨; (v) 갭 비용은 존재: 11 연장: 1로 설정됨; 및 (vi) 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정.
백분율 동일성은 비교될 서열이 상응하는 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 숫자를 비교될 위치의 수 (예를 들어, 참조 서열의 위치의 수)로 나누고, 이 결과에 100을 곱함으로써 수득된다.
일부 실시양태에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 참조 서열의 전체 길이의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 핵산 서열이 200개 뉴클레오티드로 이루어진 경우, 동일성의 정도는 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 뉴클레오티드, 일부 실시양태에서 연속 뉴클레오티드에 대해 제공된다. 일부 실시양태에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 참조 서열의 전체 길이에 대해 제공된다.
상동성 아미노산 서열은 본 개시내용에 따라 아미노산 잔기의 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다. 본원에 기재된 아미노산 서열 변이체/돌연변이체는 통상의 기술자에 의해, 예를 들어 재조합 DNA 조작에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결실을 갖는 펩티드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (1989)]에 상세히 기재되어 있다. 또한, 본원에 기재된 펩티드 및 아미노산 변이체는 예를 들어, 고체상 합성 및 유사한 방법과 같은 공지된 펩티드 합성 기술의 도움으로 용이하게 제조될 수 있다.
한 측면에서, 아미노산 서열 (펩티드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체/돌연변이체는 바람직하게는 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체/돌연변이체"라는 용어는 그것이 유래된 아미노산 서열의 것과 동일하거나 유사한 하나 이상의 기능적 특성 (즉, 기능적으로 동등함)을 나타내는 임의의 단편 또는 변이체/돌연변이체에 관한 것이다. 항원 또는 항원성 서열과 관련하여, 하나의 특정 기능은 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열에 의해 표시되는 하나 이상의 면역원성 활성이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체/돌연변이체"는 특히 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산 서열, 및 모 분자 또는 서열의 기능 중 하나 이상을 여전히 수행할 수 있는, 예를 들어 면역 반응을 유도할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 변이체/돌연변이체 분자 또는 서열을 지칭한다. 한 측면에서, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열의 변형은 분자 또는 서열의 특징에 유의한 영향을 미치거나 변경하지 않는다. 상이한 실시양태에서, 기능적 단편 또는 기능적 변이체의 기능은 감소될 수 있지만 여전히 유의하게 존재할 수 있으며, 예를 들어 기능적 변이체의 면역원성은 모 분자 또는 서열의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%일 수 있다. 그러나, 다른 실시양태에서, 기능적 단편 또는 기능적 변이체의 면역원성은 모 분자 또는 서열과 비교하여 향상될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"되지 않지만, 그의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
I. 이. 콜라이 FimH 폴리펩티드
유형 1 핌브리아를 포함한 핌브리아 어드헤신은 상피층의 만노실화된 당단백질에 결합하거나 소변으로 분비된다. 유형 1 핌브리아는 임상 UPEC 분리주 중에서 고도로 보존되어 있으며, fim이라고 하는 유전자 클러스터에 의해 코딩되며, 이는 부속 단백질 (FimC, FimD), 다양한 구조적 서브유닛 (FimE, FimF, FimG) 및 FimH라고 하는 어드헤신을 코딩한다. FimH는 만노실화된 당단백질에 대한 결합을 담당하는 렉틴 결합 도메인 (FimHLD) 및 필린 도메인의 2개 도메인으로 구성된다. 필린 도메인은 공여자 가닥 교환이라고 하는 메커니즘을 통해 FimH를 FimG와 같은 필루스의 다른 구조적 서브유닛에 연결시키는 역할을 한다. FimH 필린 도메인은 불완전한 이뮤노글로불린 폴딩을 형성하여, FimG의 N-말단 β-가닥에 대한 결합 부위를 제공하는 홈을 생성하여 FimH와 FimG 사이에 강한 분자간 연결을 형성한다. FimHLD는 가용성의 안정한 형태로 발현될 수 있지만, 전장 FimH는 샤페론 FimC와 복합체가 아니거나 펩티드 형태 또는 융합 단백질로서 FimG의 공여자 가닥 펩티드로 보완되지 않는 한 단독으로 불안정하다. 따라서, FimG 공여자 펩티드를 글리신-세린 링커를 통해 전장 FimH의 C-말단에 연결시킴으로써 안정적인 전장 FimH 분자의 발현이 가능하며, 이는 FimH-DSG로 명명된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 표 1에 나타낸 것과 같은 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 돌연변이체는 상응하는 야생형 (WT) FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열 대비 아미노산 서열의 돌연변이를 제공한다. 일부 측면에서, 이러한 돌연변이체는 야생형 FimH 단백질에 대해 또는 야생형 FimH 폴리펩티드를 발현하는 박테리아에 대해 면역원성이다. 특정 측면에서, FimH 돌연변이체는 상응하는 야생형 FimH 폴리펩티드와 비교하여 증가된 면역원성 특성과 같은 특정 유익한 특징을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "FimH 폴리펩티드"는 전장 야생형 이. 콜라이 FimH 폴리펩티드의 임의의 도메인, 전장 야생형 이. 콜라이 FimH 폴리펩티드의 도메인의 임의의 조합, 또는 전장 이. 콜라이 FimH 폴리펩티드, 또는 그의 임의의 단편을 지칭한다. 예를 들어, 한 실시양태에서 본 개시내용은 돌연변이된 FimHLD 폴리펩티드 또는 FimH-DSG 폴리펩티드인 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시내용은 기능적 면역원성을 개선시키고 야생형 FimHLD에 비해 이들 돌연변이체의 중화 반응의 평가를 설명하는, 만노시드 리간드에 대한 감소된 친화성 (생화학적 및 생물물리학적 분석에 의해 확인됨)을 갖는 신규 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체에 관한 것이다.
FimH 돌연변이체 폴리펩티드에 도입된 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, FimH 폴리펩티드 돌연변이체의 아미노산 서열의 유일한 돌연변이는 야생형 FimH 단백질 대비 아미노산 치환이다.
표 1: FimH 야생형 및 돌연변이체 서열
야생형 FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, FimHLD 도메인의 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 1로서 제공된다. 글리신-세린 링커를 통해 전장 FimH의 C-말단에 연결된 FimG 공여자 펩티드를 포함하는 전장 야생형 FimH 폴리펩티드는 본원에서 서열식별번호: 59로서 제공된다. 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본 개시내용의 한 측면에서, 특정 돌연변이된 FimH 폴리펩티드는 만노시드 리간드에 대한 감소된 친화성을 초래하고 개선된 기능적 면역원성을 유도하는 잠금, 공개 확인을 초래한다. 따라서, 이러한 FimH 돌연변이체는 이. 콜라이 감염에 대한 백신과 같은 면역원성 조성물에서 항원으로서 유용할 수 있다. 야생형 FimHLD는 기능적 면역원성을 자극하는 그의 능력의 면에서 불량한 면역원으로 간주되기 때문에, 이러한 FimH 돌연변이체는 이러한 면역원성 조성물에 사용되는 개선된 항원을 제공할 수 있다.
한 측면에서, 실시예 1에 기재된 바와 같이, FimH 돌연변이체는 만노시드 리간드에 대한 친화성을 감소시키기 위해 공개 확인에서 FimH 렉틴 도메인을 잠그려는 시도로 설계되었다. 이러한 돌연변이체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 하기를 포함할 수 있다: 요로 감염 분리주 중에서 흔한 자연 발생 아미노산 치환 (예컨대 V27A); FimHLD의 리간드 결합 측에서의 치환 (예컨대 위치 F1 및 Q133에서); FimHLD의 글리신 스위치 돌연변이 (예컨대 위치 G15, G16 및 G65에서); FimHLD에서 디술피드 결합 안정화를 위한 시스테인 쌍의 도입 (예컨대 위치 쌍 P12 - A18; G14 - F144; P26 - V35; P26 - V154; P26 - V156; V27 - L34; V28 - N33; V28 - P157; Q32 - Y108; N33 - L109; N33 - P157; V35 - L107; V35 - L109; S62 - T86; S62 - L129; Y64 - A127; L68 - F71; V112 - T158; S113 - T158; V118 - V 156; 및/또는 A119 - V155에서); FimHLD에서의 비극성에서-극성으로의 돌연변이 (예컨대 위치 V27, L34, A119, 또는 이들의 임의의 조합에서); FimH-DSG의 필린-렉틴 계면에서의 공동 충전 돌연변이 (예컨대 DSG 서열 내의 위치 A115, V163, V185 또는 V3에서); 또는 상기 언급된 아미노산 위치에서의 돌연변이 유형의 임의의 조합. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2-58 및 60-64에 제공된 바와 같은 FimH 돌연변이체, 또는 임의의 이러한 서열에서 언급된 돌연변이체의 임의의 조합을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 23, 50, 51, 52, 53, 54, 60 및 62 중 어느 하나에 따른 FimH 돌연변이체를 제공한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 62에 따른 FimH 돌연변이체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2-58 및 60-64에 제공된 바와 같은 임의의 FimH 돌연변이체를 제공하며, 여기서 상기 돌연변이체는 단리된다. 예를 들어, 한 측면에서 본 개시내용은 서열식별번호: 23, 50, 51, 52, 53, 54, 60 및 62 중 어느 하나에 따른 FimH 돌연변이체를 제공하며, 여기서 상기 FimH 돌연변이체는 단리된다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 62에 따른 FimH 돌연변이체를 제공하며, 여기서 상기 FimH 돌연변이체는 단리된다.
따라서, 일부 특정 측면에서, 본 개시내용은 도입된 돌연변이의 조합을 포함하는 FimH 돌연변이체를 제공하며, 여기서 돌연변이체는 표 1에 제공된 돌연변이체 중 임의의 것에 제시된 돌연변이의 조합을 포함한다 (즉 서열식별번호: 2-58 및 60-64에서). 표 1의 돌연변이체 각각에 제공된 아미노산 치환의 임의의 조합은 상이한 FimH 돌연변이체에 도달하도록 야생형 FimH 폴리펩티드 서열에 만들어질 수 있다. 임의의 다른 하위유형 또는 균주의 천연 FimH 폴리펩티드 서열에 기초하고 본원에 기재된 돌연변이의 임의의 조합을 포함하는 FimH 돌연변이체는 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 개시내용의 추가 측면은 서열식별번호: 1-64 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드이다. 바람직한 측면에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 62와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 본 발명의 또 다른 측면은 서열식별번호: 1-64 중 어느 하나와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일한 폴리펩티드이다. 바람직한 측면에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 62와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하다.
본 개시내용에 의해 제공되는 FimH 돌연변이체는 관련 기술분야에 공지된 일상적인 방법에 의해, 예컨대 적합한 벡터를 사용하는 재조합 숙주 시스템에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 적합한 재조합 숙주 세포는 예를 들어, 곤충 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 박테리아 및 효모 세포를 포함한다. 적합한 곤충 세포의 예는 예를 들어, Sf9 세포, Sf21 세포, Tn5 세포, 슈나이더 S2 세포, 및 하이 파이브 세포 (모 트리코플루시아 ni BTI-TN-5B1-4 세포주 (인비트로젠(Invitrogen))로부터 유래된 클로날 분리주)를 포함한다. 적합한 포유동물 세포의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 세포 (HEK293 또는 Expi 293 세포, 전형적으로 전단된 아데노바이러스 유형 5 DNA에 의해 형질전환됨), NIH-3T3 세포, 293-T 세포, Vero 세포, 및 HeLa 세포를 포함한다. 적합한 조류 세포는 예를 들어, 닭 배아 줄기 세포 (예를 들어, EBx® 세포), 닭 배아 섬유모세포, 닭 배아 생식 세포, 메추라기 섬유모세포 (예를 들어 ELL-O), 및 오리 세포를 포함한다. 적합한 곤충 세포 발현 시스템, 예컨대 바큘로바이러스-벡터 시스템은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)]에 기재되어 있다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료 및 방법은 특히, 인비트로젠 (미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 키트 형태로 상업적으로 입수가능하다. 조류 세포 발현 시스템은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,340,740; 5,656,479; 5,830,510; 6,114,168; 및 6,500,668에 기재되어 있다. 유사하게, 박테리아 및 포유동물 세포 발현 시스템이 또한 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London]에 기재되어 있다.
곤충 또는 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현을 위한 다수의 적합한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적이다. 적합한 벡터는 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 성분을 함유할 수 있다: 복제 기점; 선택가능한 마커 유전자; 하나 이상의 발현 제어 요소, 예컨대 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결자), 및/또는 하나 이상의 번역 신호; 및 선택된 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물 기원 또는 이종 포유동물 또는 비-포유동물 종 유래)에서 분비 경로를 표적화하기 위한 신호 서열 또는 리더 서열. 예를 들어, 곤충 세포에서의 발현을 위해, 적합한 바큘로바이러스 발현 벡터, 예컨대 pFastBac (인비트로젠)가 재조합 바큘로바이러스 입자를 생성하는데 사용된다. 바큘로바이러스 입자는 증폭되고, 곤충 세포를 감염시켜 재조합 단백질을 발현하는데 사용된다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해, 원하는 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포)에서 구축물의 발현을 구동할 벡터가 사용된다.
FimH 돌연변이체 폴리펩티드는 임의의 적합한 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 FimH 단백질 돌연변이체 폴리펩티드를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004). 침전 및 다양한 유형의 크로마토그래피, 예컨대 소수성 상호작용, 이온 교환, 친화성, 킬레이트화 및 크기 배제를 포함하는, 원하는 단백질을 정제하기 위한 적합한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 또는 다른 적합한 방법 중 2개 이상을 사용하여 적합한 정제 계획을 생성할 수 있다. 원하는 경우, FimH 돌연변이체 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 "태그", 예컨대 에피토프 태그 또는 히스티딘 (His) 태그를 포함할 수 있다. 이러한 태그부착된 폴리펩티드는 예를 들어 조건화된 배지로부터 킬레이트화 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 편리하게 단리될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 항체에 의해 인식될 수 있는 분자를 지칭한다. 항원의 예는 폴리펩티드, 펩티드, 지질, 폴리사카라이드, 및 면역 세포에 의해 인식되는 것과 같은 항원성 결정기를 함유하는 핵산을 포함한다.
II. FimH 돌연변이체를 코딩하는 핵산
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 FimH 돌연변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 벡터, 예컨대 발현 벡터로 혼입될 수 있다.
한 측면에서, 이. 콜라이 FimH 돌연변이된 폴리펩티드 또는 그의 임의의 단편을 코딩하는 핵산이 개시되어 있다. FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 핵산 구축물이 폴리펩티드의 게놈 통합 및 후속 발현을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 단일 핵산 구축물은 숙주 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드에 대한 코딩 서열은 2개 이상의 핵산 구축물에 의해 운반될 수 있으며, 이는 이어서 숙주 세포에 동시에 또는 순차적으로 도입된다.
예를 들어, 한 예시적인 실시양태에서, 단일 핵산 구축물은 이. 콜라이 FimH의 렉틴 도메인 및 필린 도메인을 코딩한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 하나의 핵산 구축물은 렉틴 도메인을 코딩하고, 제2 핵산 구축물은 이. 콜라이 FimH의 필린 도메인을 코딩한다. 일부 측면에서, 게놈 통합이 달성된다.
핵산 구축물은 하나 이상의 인트론을 포함하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 일부 유전자는 인트론이 존재할 때 더 효율적으로 발현된다. 일부 측면에서, 핵산 서열은 상기 포유동물 세포에서 외인성 폴리펩티드의 발현에 적합하다.
일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산은 임의의 특정 세포에서 발현 수준을 증가시키도록 코돈 최적화된다.
일부 측면에서, 핵산 구축물은 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편의 분비를 지시하는 펩티드를 코딩하는 신호 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 이. 콜라이 FimH로부터 유래된 폴리펩티드의 천연 신호 서열을 포함한다. 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편이 내인성 신호 서열을 포함하는 일부 측면에서, 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에서 단백질의 발현 수준을 증가시키도록 코돈 최적화될 수 있다.
일부 측면에서, 신호 서열은 하기 길이 중 어느 하나이다: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30개 아미노산 길이. 일부 측면에서, 신호 서열은 20개 아미노산 길이이다. 일부 측면에서, 신호 서열은 21개 아미노산 길이이다.
일부 측면에서, 폴리펩티드 또는 그의 단편이 신호 서열을 포함하는 경우, 폴리펩티드와 자연적으로 회합된 내인성 신호 서열은 배양된 세포에서 폴리펩티드 또는 그의 단편의 발현 수준을 개선시키기 위해 야생형 폴리펩티드와 회합되지 않은 신호 서열로 대체될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 핵산은 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편의 천연 신호 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 핵산은 이. 콜라이 FimH로부터 유래된 폴리펩티드의 천연 신호 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편은 이종 펩티드로 발현될 수 있으며, 이는 바람직하게는 이. 콜라이로부터 유래된 성숙 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그의 단편의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 펩티드이다. 예를 들어, 이. 콜라이 FimH로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편은 이종 펩티드 (예를 들어, IgK 신호 서열)로 발현될 수 있으며, 이는 바람직하게는 성숙 이. 콜라이 FimH 단백질의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 펩티드이다. 바람직한 측면에서, 성숙 단백질 이. 콜라이 FimH의 N-말단에서의 특이적 절단 부위는 성숙 이. 콜라이 FimH 단백질의 초기 페닐알라닌 잔기 직전에 발생한다. 선택된 이종 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 것이다 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨).
바람직한 측면에서, 신호 서열은 IgK 신호 서열이다. 일부 측면에서, 핵산은 서열식별번호: 1-64 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 측면에서, 핵산은 서열식별번호: 23, 50, 51, 52, 53, 54, 60, 61 또는 62의 아미노산 서열을 코딩한다. 일부 측면에서, 핵산은 서열식별번호: 62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직한 측면에서, 신호 서열은 마우스 IgK 신호 서열이다.
FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편을 생산하기 위한 적합한 포유동물 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 인비트로젠™으로부터의 pSecTag2 발현 벡터와 같이 상업적으로 입수가능할 수 있다. 예시적인 마우스 Ig 카파 신호 펩티드 서열은 서열 ETDTLLLWVLLLWVPGSTG (서열식별번호: 65)를 포함한다. 일부 측면에서, 벡터는 써모 피셔(Thermo Fisher)로부터의 pBudCE4.1 포유동물 발현 벡터를 포함한다. 추가의 예시적이고 적합한 벡터는 pcDNA™3.1 포유동물 발현 벡터 (써모 피셔)를 포함한다.
일부 측면에서, 신호 서열은 혈구응집소 신호 서열을 포함하지 않는다.
일부 측면에서, 핵산은 FimH 폴리펩티드 또는 그의 단편의 천연 신호 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 IgK 신호 서열이 아니다. 일부 측면에서, 신호 서열은 혈구응집소 신호 서열을 포함한다.
한 측면에서, FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 벡터가 본원에 개시되어 있다. 예시적인 벡터는 자율적으로 복제할 수 있거나 포유동물 세포에서 복제될 수 있는 플라스미드를 포함한다. 전형적인 발현 벡터는 발현 구축물에서 코딩 서열(들)의 발현 조절에 유용한 적합한 프로모터, 인핸서 및 종결자를 함유한다. 벡터는 또한 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 형질을 제공하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있다 (예컨대 항생제, 예컨대 암피실린 또는 네오마이신에 대한 내성을 부여함).
적합한 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 프로모터는 예를 들어, CMV 프로모터, 아데노바이러스, EF1 a, GAPDH 메탈로티오닌 프로모터, SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 뮤린 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 등을 포함한다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 하나 이상의 벡터가 사용될 수 있다 (예를 들어, 모든 서브유닛 또는 도메인 또는 그의 단편을 코딩하는 하나의 벡터, 또는 서브유닛 또는 도메인 또는 그의 단편을 함께 코딩하는 다중 벡터).
내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 2A 펩티드 서열이 또한 사용될 수 있다. IRES 및 2A 펩티드는 다중 서열의 공동-발현을 위한 대안적인 접근법을 제공한다. IRES는 단백질 합성의 더 큰 프로세스의 일부로서 전령 RNA (mRNA) 서열의 중간에서 번역 개시를 허용하는 뉴클레오티드 서열이다. 대개, 진핵생물에서, 번역은 mRNA 분자의 5' 단부에서만 개시될 수 있다. IRES 요소는 하나의 전사체에서 다중 유전자의 발현을 허용한다. 하나의 전사체로부터 다중 단백질을 발현하는 IRES-기반 폴리시스트론 벡터는 선택으로부터 비발현 클론의 탈출을 감소시킬 수 있다. 2A 펩티드는 단일 오픈 리딩 프레임에 있는 다중 단백질의 폴리단백질로의 번역을 허용하며, 이는 후속적으로 리보솜-스킵 메커니즘을 통해 개별 단백질로 절단된다. 2A 펩티드는 다중 단백질 생성물의 보다 균형 잡힌 발현을 제공할 수 있다. 예시적인 IRES 서열은 예를 들어, EV71 IRES, EMCV IRES, HCV IRES를 포함한다. 게놈 통합의 경우, 통합은 부위-특이적 또는 무작위일 수 있다. 부위-특이적 재조합은 상동성 서열(들)을 본원에 기재된 핵산 구축물에 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 상동성 서열은 숙주 게놈의 특이적 표적 부위에서 내인성 서열과 실질적으로 일치한다. 대안적으로, 무작위 통합이 사용될 수 있다. 때때로, 단백질의 발현 수준은 통합 부위에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 원하는 발현 수준을 달성하는 클론을 식별하기 위해 재조합 단백질 발현 수준에 따라 다수의 클론을 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
예시적인 핵산 구축물은 본원에 참조로 포함된 PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429 (2021년 5월 6일 공개)의 도면, 예를 들어 도 2a-2t에 추가로 기재되어 있다.
한 측면에서, 핵산 서열은 서열식별번호: 1-64 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직한 측면에서, 핵산 서열은 서열식별번호: 62와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 핵산 서열은 서열식별번호: 1-64 중 어느 하나와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직한 측면에서, 핵산 서열은 서열식별번호: 62와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
본 개시내용의 특정 측면에서, RNA는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 RNA 전사체와 관련된 전령 RNA (mRNA)이다. 관련 기술분야에 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 펩티드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR)을 함유한다. 일부 실시양태에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 생산된다. 한 실시양태에서, mRNA는 DNA가 데옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 핵산을 지칭하는 DNA 주형을 사용하는 시험관내 전사에 의해 생산된다. 한 측면에서, 본원에 기재된 RNA는 변형된 뉴클레오시드를 가질 수 있다. 일부 측면에서, RNA는 적어도 하나의 (예를 들어, 모든) 우리딘 대신 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 의학 제제는 FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA를 포함한다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법은 이러한 RNA의 투여를 포함한다. 본원에서 사용하기 위한 하나의 가능한 플랫폼은 강력한 중화 항체 및 동반/수반 T 세포 반응을 유도하여 바람직하게는 최소 백신 용량으로 보호 면역화를 달성하기 위한 항원-코딩 RNA 백신에 기초한다. 투여되는 RNA는 바람직하게는 시험관내 전사된 RNA이다. 3개의 상이한 RNA 플랫폼, 즉 비변형된 우리딘 함유 mRNA (uRNA), 뉴클레오시드 변형된 mRNA (modRNA) 및 자기-증폭 RNA (saRNA)가 특히 바람직하다. 하나의 특히 바람직한 측면에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
III. 숙주 세포
한 측면에서, 본 개시내용은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 서열이 포유동물 숙주 세포에서 발현되는 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 숙주 세포에서 일시적으로 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 숙주 세포의 게놈에 안정하게 통합되고, 적합한 조건 하에 배양될 때, 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 높은 효율 및 게놈 안정성으로 발현된다.
적합한 포유동물 숙주 세포는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 산업적 제조 규모로 단백질을 생산하는데 적합하다. 예시적인 포유동물 숙주 세포는 하기 중 어느 하나 및 그의 유도체를 포함한다: 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, COS 세포 (원숭이 신장 (아프리카 녹색 원숭이)으로부터 유래된 세포주, Vero 세포, Hela 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포, NSO 세포 (뮤린 골수종 세포주), 및 C127 세포 (비종양유도성 마우스 세포주). 추가의 예시적인 포유동물 숙주 세포는 하기를 포함한다: 마우스 세르톨리 (TM4), 버팔로 래트 간 (BRL 3A), 마우스 유선 종양 (MMT), 래트 간종양 (HTC), 마우스 골수종 (NSO), 뮤린 하이브리도마 (Sp2/0), 마우스 흉선종 (EL4), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 CHO 세포 유도체, 뮤린 배아 (NIH/3T3, 3T3 Li), 래트 심근 (H9c2), 마우스 근육모세포 (C2C12), 및 마우스 신장 (miMCD-3). 포유동물 세포주의 추가 예에는 NS0/1, Sp2/0, Hep G2, PER.C6, COS-7, TM4, CV1, VERO-76, MDCK, BRL 3A, W138, MMT 060562, TR1, MRC5, 및 FS4가 포함된다.
세포 배양에 민감한 임의의 세포가 본 발명에 따라 활용될 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: BALB/c 마우스 골수종 계통 (NSO/l, ECACC No: 85110503); 인간 망막모세포 (PER.C6, CruCell, Leiden, 네덜란드); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통 (현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 yophil 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 계통 (Hep G2). 일부 바람직한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 일부 바람직한 측면에서, 세포는 GS-세포이다.
추가로, 임의의 수의 상업적으로 및 비상업적으로 입수가능한 하이브리도마 세포주가 본 발명에 따라 활용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "하이브리도마"는 불멸화 세포 및 항체-생산 세포의 융합체로부터 생성된 세포 또는 세포의 자손을 지칭한다. 이러한 생성된 하이브리도마는 항체를 생산하는 불멸화 세포이다. 하이브리도마를 생성하기 위해 사용되는 개별 세포는 래트, 돼지, 토끼, 양, 돼지, 염소 및 인간을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 측면에서, 하이브리도마는 인간 세포 및 뮤린 골수종 세포주 간의 융합의 생성물인 이종혼성 골수종 융합체의 자손이 후속적으로 형질 세포와 융합될 때 생성되는 트리오마 세포주이다. 일부 측면에서, 하이브리도마는 예를 들어, 쿼드로마와 같은 항체를 생산하는 임의의 불멸화 하이브리드 세포주이다 (예를 들어, 문헌 [Milstein et al., Nature 537:3053 (1983)] 참조). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하이브리도마 세포주가 상이한 영양 요구사항을 가질 수 있고/거나 최적 성장을 위해 상이한 배양 조건을 요구할 수 있고 필요에 따라 조건을 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다.
일부 측면에서, 세포는 제1 관심 유전자를 포함하고, 여기서 제1 관심 유전자는 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 제1 관심 유전자는 리포터 유전자, 선택 유전자, 관심 유전자 (예를 들어, 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩함), 보조 유전자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 치료 관심 유전자는 발현하기 어려운 (DtE) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.
일부 측면에서, 제1 관심 유전자는 부위-특이적 통합 (SSI) 포유동물 세포에서 2개의 별개의 재조합 표적 부위 (RTS) 사이에 위치되며, 여기서 2개의 RTS는 NL1 유전자좌 또는 NL2 유전자좌 내에 염색체-통합된다. 예를 들어, NL1 유전자좌, NL2 유전자좌, NL3 유전자좌, NL4 유전자좌, NL5 유전자좌 및 NL6 유전자좌의 설명에 대해 미국 특허 출원 공개 번호 20200002727을 참조한다. 일부 측면에서, 제1 관심 유전자는 NL1 유전자좌 내에 위치된다. 일부 측면에서, 세포는 제2 관심 유전자를 포함하고, 여기서 제2 관심 유전자는 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 제2 관심 유전자는 리포터 유전자, 선택 유전자, 치료 관심 유전자 (예컨대 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편), 보조 유전자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 치료 관심 유전자는 DtE 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 관심 유전자는 2개의 RTS 사이에 위치된다. 일부 측면에서, 제2 관심 유전자는 NL1 유전자좌 또는 NL2 유전자좌 내에 위치된다. 일부 측면에서, 제1 관심 유전자는 NL1 유전자좌 내에 위치되고, 제2 관심 유전자는 NL2 유전자좌 내에 위치된다. 일부 측면에서, 세포는 제3 관심 유전자를 포함하고, 여기서 제3 관심 유전자는 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 제3 관심 유전자는 리포터 유전자, 선택 유전자, 치료 관심 유전자 (예컨대 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편), 보조 유전자, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 치료 관심 유전자는 DtE 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 제3 관심 유전자는 2개의 RTS 사이에 위치된다. 일부 측면에서, 제3 관심 유전자는 NL1 유전자좌 또는 NL2 유전자좌 내에 위치된다. 일부 측면에서, 제3 관심 유전자는 NL1 유전자좌 및 NL2 유전자좌와 구별되는 유전자좌 내에 위치된다. 일부 측면에서, 제1 관심 유전자, 제2 관심 유전자 및 제3 관심 유전자는 3개의 별도의 유전자좌 내에 있다. 일부 측면에서, 제1 관심 유전자, 제2 관심 유전자 및 제3 관심 유전자 중 적어도 하나는 NL1 유전자좌 내에 있고, 제1 관심 유전자, 제2 관심 유전자 및 제3 관심 유전자 중 적어도 하나는 NL2 유전자좌 내에 있다. 일부 측면에서, 세포는 부위-특이적 레콤비나제 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 부위-특이적 레콤비나제 유전자는 염색체-통합된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 적어도 4개의 별개의 RTS를 포함하는 포유동물 세포를 제공하며, 여기서 세포는 하기를 포함한다: (a) NL1 유전자좌 또는 NL2 유전자좌 내에 염색체-통합된 적어도 2개의 별개의 RTS; (b) (a)의 적어도 2개의 RTS 사이에 통합된 제1 관심 유전자, 여기서 제1 관심 유전자는 리포터 유전자, DtE 단백질을 코딩하는 유전자, 보조 유전자 또는 이들의 조합을 포함함; 및 (c) (a)의 유전자좌와 구별되는 제2 염색체 유전자좌 내에 통합된 제2 관심 유전자, 여기서 제2 관심 유전자는 리포터 유전자, DtE 단백질 (예컨대 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편)을 코딩하는 유전자, 보조 유전자 또는 이들의 조합을 포함함. 일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 4개의 별개의 RTS를 포함하는 포유동물 세포를 제공하며, 여기서 세포는 하기를 포함한다: (a) Fer1L4 유전자좌 내에 염색체-통합된 적어도 2개의 별개의 RTS; (b) NL1 유전자좌 또는 NL2 유전자좌 내에 염색체-통합된 적어도 2개의 별개의 RTS; (c) Fer1L4 유전자좌 내에 염색체-통합된 제1 관심 유전자, 여기서 제1 관심 유전자는 리포터 유전자, DtE 단백질을 코딩하는 유전자, 보조 유전자 또는 이들의 조합을 포함함; 및 (d) (b)의 NL1 유전자좌 또는 NL2 유전자좌 내에 염색체-통합된 제2 관심 유전자, 여기서 제2 관심 유전자는 리포터 유전자, DtE 단백질 (예컨대 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편)을 코딩하는 유전자, 보조 유전자 또는 이들의 조합을 포함함.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 6개의 별개의 RTS를 포함하는 포유동물 세포를 제공하며, 여기서 세포는 하기를 포함한다: (a) Fer1L4 유전자좌 내에 염색체-통합된 적어도 2개의 별개의 RTS 및 제1 관심 유전자; (b) NL1 유전자좌 내에 염색체-통합된 적어도 2개의 별개의 RTS 및 제2 관심 유전자; 및 (c) NL2 유전자좌 내에 염색체-통합된 적어도 2개의 별개의 RTS 및 제3 관심 유전자.
본원에서 언급된 바와 같은 용어 "작동가능한 조합으로," "작동가능한 순서로," 및 "작동가능하게 연결된"은 주어진 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생산되도록 하는 방식으로 핵산 서열의 연결을 지칭한다. 용어는 또한 기능적 단백질이 생산되도록 하는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 지칭한다. 일부 측면에서, 관심 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 관심 유전자는 숙주 세포에 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 관심 유전자는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되고; 여기서 관심 유전자는 숙주 세포에 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 보조 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 보조 유전자는 숙주 세포 게놈에 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 보조 유전자는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되고; 여기서 보조 유전자는 숙주 세포 게놈에 염색체-통합된다. 일부 측면에서, DtE 단백질을 코딩하는 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 DtE 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주 세포 게놈에 염색체-통합된다. 일부 측면에서, DtE 단백질을 코딩하는 유전자는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 DtE 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주 세포 게놈에 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 레콤비나제 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 레콤비나제 유전자는 숙주 세포에 염색체-통합된다. 일부 측면에서, 레콤비나제 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 레콤비나제 유전자는 숙주 세포 게놈에 통합되지 않는다. 일부 측면에서, 레콤비나제 유전자는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 레콤비나제 유전자는 숙주 세포 게놈에 염색체-통합되지 않는다. 일부 측면에서, 레콤비나제 유전자는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 레콤비나제 유전자는 숙주 세포 게놈에 염색체-통합되지 않는다.
본원에서 언급된 바와 같은 용어 "염색체-통합된" 또는 "염색체 통합"은 핵산 서열의 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포의 염색체로의 안정한 혼입을 지칭한다. 즉, 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포의 게놈 DNA (gDNA)에 염색체-통합된 핵산 서열. 일부 측면에서, 염색체-통합된 핵산 서열은 안정하다. 일부 측면에서, 염색체-통합된 핵산 서열은 플라스미드 또는 벡터 상에 위치되지 않는다. 일부 측면에서, 염색체-통합된 핵산 서열은 절제되지 않는다. 일부 측면에서, 염색체 통합은 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복부 (CRISPR) 및 CRISPR 연관 단백질 (Cas) 유전자 편집 시스템 (CRISPR/CAS)에 의해 매개된다.
IV. 조성물 및 제형
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 이. 콜라이의 병원성 종에 면역성을 부여할 수 있는 항체를 포함하는 면역 반응을 도출한다.
일부 측면에서, 조성물은 유일한 항원으로서 FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 접합체를 포함하지 않는다.
일부 측면에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 및 적어도 하나의 추가 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 및 추가의 이. 콜라이 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 및 이. 콜라이로부터의 당접합체를 포함한다.
일부 측면에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 및 이. 콜라이 FimC로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429 (2021년 5월 6일 공개) 및 WO2020/039359 (2020년 2월 27일 공개) 및 US 공개 번호 US2020/0061177 (2020년 2월 27일 공개) (이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 사카라이드 구조 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드; 및 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하는 조성물을 포함한다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90의 정수이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 사카라이드 중 어느 하나를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 접합체 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 이. 콜라이 혈청형 O25, 바람직하게는 혈청형 O25b로부터의 적어도 하나의 당접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 이. 콜라이 혈청형 O1, 바람직하게는 혈청형 O1a로부터의 적어도 하나의 당접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 이. 콜라이 혈청형 O2로부터의 적어도 하나의 당접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 이. 콜라이 혈청형 O6으로부터의 적어도 하나의 당접합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 하기 이. 콜라이 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 하나의 당접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 하기 이. 콜라이 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 2개의 당접합체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기 이. 콜라이 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 3개의 당접합체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 조성물은 하기 이. 콜라이 혈청형 O25, O1, O2 및 O6, 바람직하게는 O25b, O1a, O2 및 O6 각각으로부터의 당접합체를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 조성물 중 어느 하나의 당접합체는 CRM197에 개별적으로 접합된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물 중 어느 하나의 당접합체는 SCP에 개별적으로 접합된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 1개 초과의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 이. 콜라이 혈청형 (또는 "v", 원자가) 내지 12개의 상이한 혈청형 (12v)으로부터의 O-항원을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 3개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 4개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 5개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 6개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 7개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 8개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 9개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 10개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 11개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함한다.
바람직하게는, 이. 콜라이 사카라이드의 수는 1개의 혈청형 (또는 "v", 원자가) 내지 26개의 상이한 혈청형 (26v)의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서 1개의 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 2개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 3개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 4개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 5개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 6개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 7개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 8개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 9개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 10개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 11개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 12개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 13개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 14개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 15개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 16개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 17개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 18개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 19개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 20개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 21개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 22개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 23개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 24개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 25개의 상이한 혈청형이 있다. 한 실시양태에서 26개의 상이한 혈청형이 있다. 사카라이드는 담체 단백질에 접합되어 본원에 기재된 바와 같은 당접합체를 형성한다.
한 측면에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드; 및 적어도 하나의 이. 콜라이 혈청군으로부터의 O-항원을 포함하는 당접합체를 포함하며, 여기서 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드; 및 1개 초과의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 2개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 3개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 4개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 5개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 6개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 7개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 8개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 9개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 10개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 11개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-항원을 포함하고, 여기서 각각의 O-항원은 담체 단백질에 접합된다.
또 다른 측면에서, 조성물은 적어도 하나의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 1개 초과의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 이. 콜라이 혈청형 내지 12개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 3개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 4개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 5개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 6개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 7개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 8개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 9개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 10개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 11개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 1개 초과의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 이. 콜라이 혈청형 내지 12개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 3개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 4개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 5개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 6개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 7개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 8개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 9개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 10개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 11개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다. 한 실시양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합된다.
가장 바람직한 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 1개 초과의 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 2개의 상이한 이. 콜라이 혈청형 내지 12개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 3개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 4개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 5개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 6개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 7개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 8개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 9개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 10개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 11개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 담체 단백질에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O25a (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O25b (여기서 n은 적어도 40임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O1a (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O2 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O6 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O17 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O15 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O18A (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O75 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O4 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O16 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O13 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O7 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O8 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 화학식 O8을 포함하고, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 2-5, 보다 바람직하게는 3이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드를 추가로 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O9 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 화학식 O9를 포함하고, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 4-8, 보다 바람직하게는 5이다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 화학식 O9a를 포함하고, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 4-8, 보다 바람직하게는 5이다.
일부 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 화학식 O20ab, 화학식 O20ac, 화학식 O52, 화학식 O97 및 화학식 O101 중 어느 하나로부터 선택되고, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 4-8, 보다 바람직하게는 5이다.
상기 기재된 바와 같이, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 접합된 O-폴리사카라이드 (항원)의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 예시적인 실시양태에서, 조성물은 화학식 O25b를 포함하는 폴리사카라이드, 화학식 O1a를 포함하는 폴리사카라이드, 화학식 O2를 포함하는 폴리사카라이드, 및 화학식 O6을 포함하는 폴리사카라이드를 포함한다. 보다 구체적으로, 예컨대 조성물은 하기를 포함한다: (i) CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O25b (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함함; (ii) CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O1a (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함함; (iii) CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O2 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함함; 및 (iv) CRM197에 접합된 O-폴리사카라이드, 여기서 O-폴리사카라이드는 화학식 O6 (여기서 n은 적어도 30임) 및 코어 사카라이드를 포함함.
한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 임의의 이. 콜라이 혈청형으로부터 유래된 적어도 하나의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 혈청형은 O25a가 아니다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 조성물은 화학식 O25a를 포함하는 사카라이드를 포함하지 않는다. 이러한 조성물은 예를 들어, 화학식 O25b를 포함하는 O-폴리사카라이드, 화학식 O1a를 포함하는 O-폴리사카라이드, 화학식 O2를 포함하는 O-폴리사카라이드, 및 화학식 O6을 포함하는 O-폴리사카라이드를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 2개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 3개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 4개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 5개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 6개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 7개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 8개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 9개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 10개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 11개의 상이한 이. 콜라이 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 12개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 13개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 14개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 15개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 16개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 17개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 18개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 19개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 20개의 상이한 혈청형으로부터의 O-폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 각각의 O-폴리사카라이드는 CRM197에 접합되고, 여기서 O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 사카라이드는 화학식 O25b를 포함하고, 여기서 n은 15 ± 2이다. 한 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O25b를 포함하고, 여기서 n은 17 ± 2이다. 한 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O25b를 포함하고, 여기서 n은 55 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O25b를 포함하고, 여기서 n은 51 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O25b를 포함하고, 여기서 n은 30 초과의 정수이고, 바람직하게는 n은 31 내지 100의 정수이다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 K12 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 실시양태에서, 접합체는 단일 단부 연결 접합에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 접합체는 환원성 아민화 화학에 의해, 바람직하게는 DMSO 완충액에서 제조된다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸) 카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 제약상 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml 또는 0.5 pg/ml의 농도에서 이. 콜라이 혈청형 O25b 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용한 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 혈청형 O25b에 대한 이들의 반응에 대해 비교하여 반응자의 잠재적인 증가를 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O25b를 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능적 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O25b를 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O25b에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 50%에서 이. 콜라이 혈청형 O25b에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%에서 이. 콜라이 혈청형 O25b에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O25b에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O25b에 대한 인간 대상체의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O1a를 포함하고, 여기서 n은 30 초과의 정수이고, 바람직하게는 n은 31 내지 100의 정수이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O1a를 포함하고, 여기서 n은 39 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O1a를 포함하고, 여기서 n은 13 ± 2이다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 실시양태에서, 접합체는 단일 단부 연결 접합에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 접합체는 환원성 아민화 화학에 의해, 바람직하게는 DMSO 완충액에서 제조된다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸) 카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 제약상 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml 또는 0.5 pg/ml의 농도에서 이. 콜라이 혈청형 O1a 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용한 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 혈청형 O1a에 대한 이들의 반응에 대해 비교하여 반응자의 잠재적인 증가를 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O1a를 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능적 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O1a를 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O1a에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 50%에서 이. 콜라이 혈청형 O1a에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%에서 이. 콜라이 혈청형 O1a에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O1a에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O1a에 대한 인간 대상체의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O2를 포함하고, 여기서 여기서 n은 30 초과의 정수이고, 바람직하게는 n은 31 내지 100의 정수이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O2를 포함하고, 여기서 n은 43 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O2를 포함하고, 여기서 n은 47 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O2를 포함하고, 여기서 n은 17 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O2를 포함하고, 여기서 n은 18 ± 2이다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R4 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 실시양태에서, 접합체는 단일 단부 연결 접합에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 접합체는 환원성 아민화 화학에 의해, 바람직하게는 DMSO 완충액에서 제조된다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 제약상 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml 또는 0.5 pg/ml의 농도에서 이. 콜라이 혈청형 O2 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용한 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 혈청형 O2에 대한 이들의 반응에 대해 비교하여 반응자의 잠재적인 증가를 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O2를 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능적 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O2를 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O2에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 50%에서 이. 콜라이 혈청형 O2에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%에서 이. 콜라이 혈청형 O2에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O2에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O2에 대한 인간 대상체의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O6을 포함하고, 여기서 n은 30 초과의 정수이고, 바람직하게는 n은 31 내지 100의 정수이다. 한 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O6을 포함하고, 여기서 n은 42 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O6을 포함하고, 여기서 n은 50 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O6을 포함하고, 여기서 n은 17 ± 2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 사카라이드는 화학식 O6을 포함하고, 여기서 n은 18 ± 2이다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 실시양태에서, 접합체는 단일 단부 연결 접합에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 접합체는 환원성 아민화 화학에 의해, 바람직하게는 DMSO 완충액에서 제조된다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸) 카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 제약상 허용되는 희석제를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 ELISA 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml 또는 0.5 pg/ml의 농도에서 이. 콜라이 혈청형 O6 폴리사카라이드에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용한 면역화 전 및 후 혈청의 OPA 활성의 비교를 수행하고, 혈청형 O6에 대한 이들의 반응에 대해 비교하여 반응자의 잠재적인 증가를 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 IgG 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O6을 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인간에서 기능적 항체를 도출하고, 상기 항체는 시험관내 옵소닌식세포성 검정에 의해 결정된 바와 같이 이. 콜라이 혈청형 O6을 사멸시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O6에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 50%에서 이. 콜라이 혈청형 O6에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 시험관내 옵소닌식세포성 사멸 검정에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%에서 이. 콜라이 혈청형 O6에 대해 적어도 1:8의 역가를 도출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O6에 대한 반응자 (즉, 시험관내 OPA에 의해 결정된 바와 같이 적어도 1:8의 역가를 갖는 혈청을 갖는 개체)의 비율을 유의하게 증가시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 사전-면역화된 집단과 비교하여 이. 콜라이 혈청형 O6에 대한 인간 대상체의 OPA 역가를 유의하게 증가시킨다.
한 측면에서, 조성물은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하고, 여기서 사카라이드는 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함한다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90의 정수이다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R2 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R3 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 R4 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이 K12 코어 사카라이드 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 KDO 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 한 실시양태에서, 접합체는 단일 단부 연결 접합에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 접합체는 환원성 아민화 화학에 의해, 바람직하게는 DMSO 완충액에서 제조된다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된다. 바람직하게는, 조성물은 제약상 허용되는 희석제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29개의 추가 접합체 내지 최대 30개의 추가 접합체를 추가로 포함하고, 각각의 접합체는 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하고, 여기서 사카라이드는 상기 화학식들 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함한다.
A. 사카라이드
1. 사카라이드 및 O-폴리사카라이드
한 실시양태에서, 사카라이드는 사카라이드의 크기를 제어하기 위해 상이한 Wzz 단백질 (예를 들어, WzzB)의 발현 (반드시 과발현은 아님)에 의해 생산된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "사카라이드는"는 단일 당 모이어티 또는 모노사카라이드 단위, 뿐만 아니라 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 형성하도록 공유결합으로 연결된 2개 이상의 단일 당 모이어티 또는 모노사카라이드 단위의 조합을 지칭한다. 사카라이드는 선형 또는 분지형일 수 있다.
한 실시양태에서, 사카라이드는 재조합 그람-음성 박테리아에서 생산된다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 재조합 이. 콜라이 세포에서 생산된다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 재조합 살모넬라 세포에서 생산된다. 예시적인 박테리아는 이. 콜라이 O25K5H1, 이. 콜라이 BD559, 이. 콜라이 GAR2831, 이. 콜라이 GAR865, 이. 콜라이 GAR868, 이. 콜라이 GAR869, 이. 콜라이 GAR872, 이. 콜라이 GAR878, 이. 콜라이 GAR896, 이. 콜라이 GAR1902, 이. 콜라이 O25a ETC NR-5, 이. 콜라이 O157:H7:K-, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피무리움 균주 LT2, 이. 콜라이 GAR2401, 살모넬라 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 CVD 1943, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 CVD 1925, 살모넬라 엔테리카 혈청형 파라티피 A CVD 1902, 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) CVD 1208S를 포함한다. 한 실시양태에서, 박테리아는 이. 콜라이 GAR2401이 아니다. 사카라이드 생산에 대한 이러한 유전적 접근법은 백신 성분으로서 O-폴리사카라이드 및 O-항원 분자의 효율적인 생산을 허용한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "wzz 단백질"은 예를 들어, wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzzl 및 wzz2와 같은 쇄 길이 결정기 폴리펩티드를 지칭한다. 예시적인 wzz 유전자 서열에 대한 진뱅크(GenBank) 수탁 번호는 E4991/76의 경우 AF011910, F186의 경우 AF011911, M70/1-1의 경우 AF011912, 79/311의 경우 AF011913, Bi7509-41의 경우 AF011914, C664-1992의 경우 AF011915, C258-94의 경우 AF011916, C722-89의 경우 AF011917, 및 EDL933의 경우 AF011919이다. G7 및 Bi316-41 wzz 유전자 서열에 대한 진뱅크 수탁 번호는 각각 U39305 및 U39306이다. 예시적인 wzz 유전자 서열에 대한 추가 진뱅크 수탁 번호는 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피무리움 균주 LT2 FepE의 경우 NP_459581; 이. 콜라이 O157:H7 균주 EDL933 FepE의 경우 AIG66859; 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 티피무리움 균주 LT2 WzzB의 경우 NP_461024; 이. 콜라이 K-12 하위균주 MG1655 WzzB의 경우 NP_416531; 이. 콜라이 K-12 하위균주 MG1655 FepE의 경우 NP_415119이다. 바람직한 측면에서, wzz 패밀리 단백질은 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나, 가장 바람직하게는 wzzB, 보다 바람직하게는 fepE이다.
예시적인 wzzB 서열은 서열식별번호: 112-116에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 FepE 서열은 서열식별번호: 117-121에 제시된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 변형된 사카라이드 (상응하는 야생형 사카라이드와 비교하여 변형된)는 그람-음성 박테리아에서 그람-음성 박테리아로부터의 wzz 패밀리 단백질 (예를 들어, fepE)을 발현함으로써 (반드시 과발현은 아님), 및/또는 제2 wzz 유전자 (예를 들어, wzzB)를 스위치 오프 (즉, 억압, 결실, 제거)하여 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 증가된 반복 단위의 수를 갖는 중간 또는 긴 O-항원 쇄를 함유하는 리포폴리사카라이드와 같은 고분자량 사카라이드를 생성함으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, 변형된 사카라이드는 wzz2를 발현하고 (반드시 과발현은 아님) wzzl을 스위치 오프 함으로써 생산될 수 있다. 또는, 대안으로, 변형된 사카라이드는 wzz/fepE를 발현하고 (반드시 과발현은 아님) wzzB를 스위치 오프 함으로써 생산될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 사카라이드는 wzzB를 발현하지만 (반드시 과발현은 아님) wzz/fepE를 스위치 오프 함으로써 생산될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 사카라이드는 fepE를 발현함으로써 생산될 수 있다. 바람직하게는, wzz 패밀리 단백질은 숙주 세포에 대해 이종인 균주로부터 유래된다. 사카라이드의 길이를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 핵 자기 공명, 질량 분광법 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 고분자량 사카라이드, 예컨대 중간 또는 긴 O-항원 쇄를 함유하는 리포폴리사카라이드를 생산하는 방법은 PCT 국제 공개 번호 WO2020/039359 및 대응 US 공개 번호 US2020/0061177에 기재되어 있으며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 사카라이드는 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 121 중 어느 하나와 적어도 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 wzz 패밀리 단백질을 발현함으로써 생산된다. 한 실시양태에서, wzz 패밀리 단백질은 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 121 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함한다. 바람직하게는, wzz 패밀리 단백질은 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116과 적어도 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 사카라이드는 fepE 단백질과 적어도 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현함으로써 생산된다.
한 측면에서, 본 발명은 그람-음성 박테리아에서 wzz 패밀리 단백질, 바람직하게는 fepE를 발현하여, 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개 반복 단위의 증가를 갖는 중간 또는 긴 O-항원 쇄를 함유하는 고분자량 사카라이드를 생성함으로써 생성되는 사카라이드에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 상응하는 야생형 O-항원과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개 반복 단위의 증가를 갖는 중간 또는 긴 O-항원 쇄를 함유하는 고분자량 사카라이드를 생성하기 위해 그람-음성 박테리아로부터의 wzz 패밀리 단백질 (예를 들어, wzzB)을 발현하는 (반드시 과발현은 아님) 배양물에서 그람-음성 박테리아에 의해 생산되는 사카라이드에 관한 것이다. 상응하는 야생형 사카라이드와 비교하여 증가된 반복 단위의 수를 갖는 추가의 예시적인 사카라이드에 대해서는 하기 O-폴리사카라이드 및 O-항원에 대한 설명을 참조한다. 원하는 쇄 길이는 주어진 백신 구축물의 맥락에서 개선된 또는 최대 면역원성을 생성하는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 표 A로부터 선택된 어느 하나의 화학식을 포함하고, 여기서 사카라이드 내의 반복 단위의 수 n은 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드 내의 반복 단위의 수보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위만큼 더 크다. 바람직하게는, 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 반복 단위의 증가를 포함한다. 사카라이드의 길이를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 핵 자기 공명, 질량 분광법 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 이. 콜라이 숙주 세포에서 생산되는 사카라이드에 관한 것이며, 여기서 내인성 wzz O-항원 길이 조절인자 (예를 들어, wzzB)에 대한 유전자는 결실되고, 재조합 이. 콜라이 숙주 세포에 대해 이종인 그람-음성 박테리아로부터의 (제2) wzz 유전자 (예를 들어, 살모넬라 fepE)에 의해 대체되어, 고분자량 사카라이드, 예컨대 중간 또는 긴 O-항원 쇄를 함유하는 리포폴리사카라이드를 생성한다. 일부 실시양태에서, 재조합 이. 콜라이 숙주 세포는 살모넬라, 바람직하게는 살모넬라 엔테리카로부터의 wzz 유전자를 포함한다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 안정하게 유지되는 플라스미드 벡터로서 wzz 패밀리 단백질에 대한 이종 유전자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 염색체 DNA에서 통합된 유전자로서 wzz 패밀리 단백질에 대한 이종 유전자를 포함한다. 이. 콜라이 숙주 세포에서 플라스미드 벡터를 안정하게 발현하는 방법 및 이종 유전자를 이. 콜라이 숙주 세포의 염색체에 통합하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 안정하게 유지되는 플라스미드 벡터로서 O-항원에 대한 이종 유전자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 염색체 DNA에서 통합된 유전자로서 O-항원에 대한 이종 유전자를 포함한다. 이. 콜라이 숙주 세포 및 살모넬라 숙주 세포에서 플라스미드 벡터를 안정하게 발현하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이종 유전자를 이. 콜라이 숙주 세포 및 살모넬라 숙주 세포의 염색체에 통합하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 측면에서, 재조합 숙주 세포는 탄소 공급원을 포함하는 배지에서 배양된다. 이. 콜라이 배양용 탄소 공급원은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 탄소 공급원은 당 알콜, 폴리올, 알돌 당 또는 케토 당 (아라비노스, 셀로비오스, 프룩토스, 글루코스, 글리세롤, 이노시톨, 락토스, 말토스, 만니톨, 만노스, 람노스, 라피노스, 소르비톨, 소르보스, 수크로스, 트레할로스, 피루베이트, 숙시네이트 및 메틸아민을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 배지는 글루코스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 탄소 공급원으로서 폴리올 또는 알돌 당, 예를 들어, 만니톨, 이노시톨, 소르보스, 글리세롤, 소르비톨, 락토스 및 아라비노스를 포함한다. 모든 탄소 공급원은 배양 시작 전에 배지에 첨가될 수 있거나, 또는 배양 동안 단계적으로 또는 연속적으로 첨가될 수 있다.
재조합 숙주 세포를 위한 예시적인 배양 배지는 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 시트르산나트륨, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O 중 어느 하나로부터 선택된 요소를 포함한다. 바람직하게는, 배지는 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 시트르산나트륨, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O를 포함한다.
본원에서 사용된 배지는 고체 또는 액체, 합성 (즉 인공) 또는 천연일 수 있고, 재조합 숙주 세포의 배양을 위한 충분한 영양소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배지는 액체 배지이다.
일부 실시양태에서, 배지는 적합한 무기 염을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 미량 영양소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 추가의 탄소 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 적합한 무기 염, 미량 영양소, 성장 인자 및 보충 탄소 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 이. 콜라이 배양에 적합한 무기 염, 미량 영양소, 성장 인자 및 보충 탄소 공급원은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 펩톤, N-Z 아민, 효소적 대두 가수분해물, 추가의 효모 추출물, 맥아 추출물, 보충 탄소 공급원 및 다양한 비타민과 같은 적절한 추가 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 이러한 추가 성분, 예컨대 펩톤, N-Z 아민, 효소적 대두 가수분해물, 추가의 효모 추출물, 맥아 추출물, 보충 탄소 공급원 및 다양한 비타민을 포함하지 않는다.
적합한 보충 탄소 공급원의 예시적인 예는 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 만니톨, 전분 또는 전분 가수분해물, 셀룰로스 가수분해물 및 당밀; 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산 및 푸마르산; 및 알콜, 예컨대 글리세롤, 이노시톨, 만니톨 및 소르비톨을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 배지는 질소 공급원을 추가로 포함한다. 이. 콜라이 배양에 적합한 질소 공급원은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 질소 공급원의 예시적인 예는 암모니아 가스 및 수성 암모니아를 포함하는 암모니아; 무기산 또는 유기산의 암모늄 염, 예컨대 염화암모늄, 질산암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄 및 아세트산암모늄; 우레아; 질산염 또는 아질산염, 및 순수한 또는 조질 제제로서의 아미노산, 육류 추출물, 펩톤, 어분, 생선 가수분해물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두 케이크 가수분해물, 효모 추출물, 건조 효모, 에탄올-효모 증류물, 대두분, 면실 가루 등을 포함하는 기타 질소-함유 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 배지는 무기 염을 포함한다. 적합한 무기 염의 예시적인 예는 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 망가니즈, 철, 코발트, 아연, 구리, 몰리브데넘, 텅스텐 및 기타 미량 원소, 및 인산의 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 배지는 적절한 성장 인자를 포함한다. 적절한 미량 영양소, 성장 인자 등의 예시적인 예는 코엔자임 A, 판토텐산, 피리독신-HCl, 비오틴, 티아민, 리보플라빈, 플라빈 모노뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드, DL-6,8-티옥트산, 엽산, 비타민 B12, 기타 비타민, 아미노산, 예컨대 시스테인 및 히드록시프롤린, 염기, 예컨대 아데닌, 우라실, 구아닌, 티민 및 시토신, 나트륨 티오술페이트, p- 또는 r-아미노벤조산, 니아신아미드, 니트릴로아세테이트 등 (순수한 또는 부분적으로 정제된 화합물로서 또는 천연 물질에 존재하는 것으로서)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 양은 관련 기술분야에 공지된 방법 및 기술에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 사카라이드 (상응하는 야생형 사카라이드와 비교하여)는 예를 들어 시험관내에서 합성적으로 생산된다. 사카라이드의 합성적 생산 또는 합성은 비용- 및 시간-집약적인 생산 공정의 회피를 용이하게 할 수 있다. 한 실시양태에서, 사카라이드는 예를 들어, 적합하게 보호된 모노사카라이드 중간체로부터 순차 글리코실화 전략 또는 순차 글리코실화 및 [3+2] 블록 합성 전략의 조합을 사용함으로써 합성적으로 합성된다. 예를 들어, 티오글리코시드 및 글리코실 트리클로로아세트이미데이트 유도체가 글리코실화에서 글리코실 공여자로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 시험관내에서 합성적으로 합성된 사카라이드는 재조합 수단에 의해, 예컨대 상기 기재된 wzz 패밀리 단백질의 조작에 의해 생산된 사카라이드와 동일한 구조를 갖는다.
(재조합 또는 합성 수단에 의해) 생산된 사카라이드는 예를 들어, 하기 이. 콜라이 혈청형 중 어느 하나를 포함하는 임의의 이. 콜라이 혈청형으로부터 유래된 구조를 포함한다: O1 (예를 들어, O1A, O1B 및 O1C), O2, O3, O4 (예를 들어, O4:K52 및 O4:K6), O5 (예를 들어, O5ab 및 O5ac (균주 180/C3)), O6 (예를 들어, O6:K2; K13; K15 및 O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18 (예를 들어, O18A, O18ac, O18A1, O18B, 및 O18B1), O19, O20, O21, O22, O23 (예를 들어, O23A), O24, O25 (예를 들어, O25a 및 O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45 (예를 들어, O45 및 O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D1, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73 (예를 들어, O73 (균주 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 및 O187.
개별 폴리사카라이드는 전형적으로 예를 들어, 투석, 농축 작업, 투석여과 작업, 접선 유동 여과, 침전, 용리, 원심분리, 침전, 한외여과, 심층 여과, 및/또는 칼럼 크로마토그래피 (이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 이온 교환 크로마토그래피, DEAE, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피)와 같은 관련 기술분야에 공지된 방법을 통해 정제된다 (폴리사카라이드-단백질 접합체의 양과 관련하여 풍부화). 바람직하게는, 폴리사카라이드는 접선 유동 여과를 포함하는 방법을 통해 정제된다.
정제된 폴리사카라이드는 활성화 (예를 들어, 화학적으로 활성화)되어 반응할 수 있게 만든 후 (예를 들어, 담체 단백질에 직접 또는 링커, 예컨대 eTEC 스페이서를 통해), 본원에 추가로 기재된 바와 같이 본 발명의 당접합체에 혼입될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 이. 콜라이 혈청형으로부터 유래되고, 여기서 혈청형은 O25a이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O25b이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O1A이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O2이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O6이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O17이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O15이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O18A이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O75이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O4이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O16이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O13이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O7이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O8이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 O9이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상기 나열된 임의의 혈청형에 대한 언급은 관련 기술분야에 공지된 반복 단위 구조 (O-단위, 하기 기재된 바와 같음)를 포함하고 상응하는 혈청형에 고유한 혈청형을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "O25a" 혈청형 (또한 관련 기술분야에 혈청형 "O25"로 공지됨)은 표 A에 표시된 화학식 O25를 포함하는 혈청형을 지칭한다. 또 다른 예로서, 용어 "O25b" 혈청형은 표 A에 표시된 화학식 O25b를 포함하는 혈청형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 혈청형은 달리 명시되지 않는 한, 예를 들어, 용어 화학식 "O18"이 총칭적으로 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 18A1, 화학식 O18B 및 화학식 O18B1을 포함하는 것을 지칭하는 것처럼 본원에서 총칭적으로 언급된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "O1"은 총칭적으로 화학식 O1A, 화학식 O1A1, 화학식 O1B 및 화학식 O1C (이들 각각은 표 A에 표시됨) 중 어느 하나와 같이 표 A에 따른 화학식 명칭에 총칭적 용어 "O1"을 포함하는 화학식의 종을 포함하는 것을 지칭한다. 따라서, "O1 혈청형"은 총칭적으로 화학식 O1A, 화학식 O1A1, 화학식 O1B 및 화학식 O1C 중 어느 하나를 포함하는 혈청형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "O6"은 총칭적으로 화학식 O6:K2; K13; K15; 및 O6:K54 (이들 각각은 표 A에 표시됨) 중 어느 하나와 같이 표 A에 따른 화학식 명칭에 총칭적 용어 "O6"을 포함하는 화학식의 종을 지칭한다. 따라서, "O6 혈청형"은 총칭적으로 화학식 O6:K2; K13; K15; 및 O6:K54 중 어느 하나를 포함하는 혈청형을 지칭한다.
표 A에 따른 화학식 명칭에 총칭적 용어를 포함하는 화학식의 종을 총칭적으로 지칭하는 용어의 다른 예는 "O4", "O5", "O18" 및 "O45"를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "O2"는 표 A에 표시된 화학식 O2를 지칭한다. 용어 "O2 O-항원"은 표 A에 표시된 화학식 O2를 포함하는 사카라이드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상기 나열된 혈청형으로부터의 O-항원에 대한 언급은 상응하는 혈청형 명칭으로 표지된 화학식을 포함하는 사카라이드를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "O25B O-항원"은 표 A에 표시된 화학식 O25B를 포함하는 사카라이드를 지칭한다.
또 다른 예로서, 용어 "O1 O-항원"은 총칭적으로 화학식 O1A, 화학식 O1A1, 화학식 O1B 및 화학식 O1C (이들 각각은 표 A에 표시됨)와 같이 용어 "O1"을 포함하는 화학식을 포함하는 사카라이드를 지칭한다.
또 다른 예로서, 용어 "O6 O-항원"은 총칭적으로 화학식 O6:K2; 화학식 O6:K13; 화학식 O6:K15 및 화학식 O6:K54 (이들 각각은 표 A에 표시됨)와 같이 용어 "O6"을 포함하는 화학식을 포함하는 사카라이드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "O-폴리사카라이드"는 구조가 전체 세포 또는 지질 A를 포함하지 않는다면, O-항원을 포함하는 임의의 구조를 지칭한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 리포폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 지질 A는 결합되지 않는다. 지질 A를 제거하는 단계는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예로서, 산 첨가에 의한 열 처리를 포함한다. 예시적인 공정은 100℃에서 90분 동안 1% 아세트산으로 처리하는 것을 포함한다. 이 공정은 제거된 지질 A를 단리하는 공정과 조합된다. 지질 A를 단리하기 위한 예시적인 공정은 초원심분리를 포함한다.
한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 O-항원으로 이루어진 구조를 지칭하며, 이 경우 O-폴리사카라이드는 용어 O-항원과 동의어이다. 한 바람직한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 코어 사카라이드 없이 O-항원의 반복 단위를 포함하는 구조를 지칭한다. 따라서, 한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R2 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R3 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R4 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 K12 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 O-항원 및 코어 사카라이드를 포함하는 구조를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 O-항원, 코어 사카라이드 및 KDO 모이어티를 포함하는 구조를 지칭한다.
LPS로부터 코어 올리고사카라이드를 포함하는 O-폴리사카라이드를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, LPS의 정제 후, 정제된 LPS는 90분 동안 100℃에서 1% (v/v) 아세트산에서 가열한 후, 5시간 동안 4℃에서 142,000 x g에서 초원심분리함으로써 가수분해될 수 있다. O-폴리사카라이드를 함유하는 상청액을 동결-건조하고 4℃에서 저장한다. 특정 실시양태에서, O-폴리사카라이드의 단순 정제를 가능하게 하는 캡슐 합성 유전자의 결실이 기재되어 있다.
O-폴리사카라이드는 LPS로부터 지질 A를 제거하기 위한 약한 산 가수분해를 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법에 의해 단리될 수 있다. 다른 실시양태는 O-폴리사카라이드 제조를 위한 작용제로서 히드라진의 사용을 포함할 수 있다. LPS의 제조는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 성취될 수 있다.
특정 실시양태에서, Wzz 단백질 (예를 들어, wzzB)을 발현하는 (반드시 과발현은 아님) 야생형, 변형된 또는 약독화된 그람-음성 박테리아 균주로부터 정제된 O-폴리사카라이드가 접합체 백신에 사용하기 위해 제공된다. 바람직한 실시양태에서, O-폴리사카라이드 쇄는 접합체 또는 복합체 백신으로서 백신 항원으로 사용하기 위해 wzz 단백질을 발현하는 (반드시 과발현은 아님) 그람-음성 박테리아 균주로부터 정제된다.
한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배, 40배, 41배, 42배, 43배, 44배, 45배, 46배, 47배, 48배, 49배, 50배, 51배, 52배, 53배, 54배, 55배, 56배, 57배, 58배, 59배, 60배, 61배, 62배, 63배, 64배, 65배, 66배, 67배, 68배, 69배, 70배, 71배, 72배, 73배, 74배, 75배, 76배, 77배, 78배, 79배, 80배, 81배, 82배, 83배, 84배, 85배, 86배, 87배, 88배, 89배, 90배, 91배, 92배, 93배, 94배, 95배, 96배, 97배, 98배, 99배, 100배 또는 그 이상만큼 증가된 분자량을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 1배 및 최대 5배만큼 증가된 분자량을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 2배 및 최대 4배만큼 증가된 분자량을 갖는다. 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 O-폴리사카라이드의 분자량의 증가는 바람직하게는 O-항원 반복 단위의 수의 증가와 연관된다. 한 실시양태에서, O-폴리사카라이드의 분자량의 증가는 wzz 패밀리 단백질로 인한 것이다.
한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 kDa 또는 그 이상만큼 증가된 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 1 및 최대 200 kDa만큼 증가된 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 5 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 12 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 15 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 18 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 21 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 22 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 30 및 최대 200kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 1 및 최대 100kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 5 및 최대 100kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 100kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 12 및 최대 100kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 15 및 최대 100kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 100kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 1 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 5 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 12 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 15 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 18 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 30 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 90kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 12 및 최대 85kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 75kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 70kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 60kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 50kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 49kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 48kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 47kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 10 및 최대 46kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 45kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 44kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 43kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 42kDa만큼 증가된다. 한 실시양태에서, 분자량은 적어도 20 및 최대 41kDa만큼 증가된다. 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 O-폴리사카라이드의 분자량의 이러한 증가는 바람직하게는 O-항원 반복 단위의 수의 증가와 연관된다. 한 실시양태에서, O-폴리사카라이드의 분자량의 증가는 wzz 패밀리 단백질로 인한 것이다.
또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 표 A로부터 선택된 어느 하나의 화학식을 포함하고, 여기서 O-폴리사카라이드 내의 반복 단위의 수 n은 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드 내의 반복 단위의 수보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위만큼 더 크다. 바람직하게는, 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 반복 단위의 증가를 포함한다.
2. O-항원
O-항원은 그람-음성 박테리아의 외막에 있는 리포폴리사카라이드 (LPS)의 일부이다. O-항원은 세포 표면에 있으며 가변적인 세포 구성요소이다. O-항원의 가변성은 그람-음성 박테리아의 혈청형결정에 대한 기초를 제공한다. 현재 이. 콜라이 혈청형결정 계획은 O-폴리사카라이드 1 내지 181을 포함한다.
O-항원은 올리고사카라이드 반복 단위 (O-단위)를 포함하며, 이의 야생형 구조는 대개 광범위한 당으로부터 2 내지 8개의 잔기를 함유한다. 예시적인 이. 콜라이 O-항원의 O-단위는 표 A 및 PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429 (2021년 5월 6일 공개) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 및 표 A 및 PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429 (2021년 5월 6일 공개) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 O-항원 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 하나의 올리고사카라이드 단위일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 관련 혈청형의 하나의 반복 올리고사카라이드 단위이다. 이러한 실시양태에서, 사카라이드는 화학식 O1a, 화학식 O2, 화학식 O6, 화학식 O8, 화학식 O9a, 화학식 O9, 화학식 O20ab, 화학식 O20ac, 화학식 O25b, 화학식 O52, 화학식 O97 및 화학식 O101 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 사카라이드는 화학식 O1a, 화학식 O2, 화학식 O6 및 화학식 O25b 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 올리고사카라이드일 수 있다. 올리고사카라이드는 적은 반복 단위의 수 (전형적으로 5-15개 반복 단위)를 갖고, 전형적으로 합성적으로 또는 폴리사카라이드의 가수분해에 의해 유도된다. 이러한 실시양태에서, 사카라이드는 화학식 O1a, 화학식 O2, 화학식 O6, 화학식 O8, 화학식 O9a, 화학식 O9, 화학식 O20ab, 화학식 O20ac, 화학식 O25b, 화학식 O52, 화학식 O97 및 화학식 O101 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 사카라이드는 화학식 O1a, 화학식 O2, 화학식 O6 및 화학식 O25b 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 사카라이드 및 본 발명의 면역원성 조성물 내의 사카라이드는 모두 폴리사카라이드이다. 고분자량 폴리사카라이드는 항원 표면에 존재하는 에피토프로 인해 특정 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. 고분자량 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 바람직하게는 본 발명의 접합체, 조성물 및 방법에 사용하기 위해 고려된다.
일부 실시양태에서, 각각의 개별 O-항원 중합체 내의 반복 O 단위의 수 (및 따라서 중합체 쇄의 길이 및 분자량)는 내막 단백질인 wzz 쇄 길이 조절인자에 의존한다. 상이한 wzz 단백질은 다양한 범위의 모달 길이 (4 내지 >100개 반복 단위)를 부여한다. 용어 "모달 길이"는 반복 O-단위의 수를 지칭한다. 그람-음성 박테리아는 종종 2개의 별개의 Oag 모달 쇄 길이 (하나는 더 길고 하나는 더 짧음)를 부여하는 2개의 상이한 Wzz 단백질을 갖는다. 그람-음성 박테리아에서 wzz 패밀리 단백질 (예를 들어, wzzB)의 발현 (반드시 과발현은 아님)은 O-항원 길이의 조작을 허용하여, 특정 길이 범위의 O-항원의 박테리아 생산을 이동 또는 편향시키고, 고수율의 고분자량 리포폴리사카라이드의 생산을 향상시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 사용된 바와 같은 "짧은" 모달 길이는 적은 반복 O-단위의 수, 예를 들어 1-20을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본원에서 사용된 바와 같은 "긴" 모달 길이는 20 초과 및 최대 40까지의 반복 O-단위의 수를 지칭한다. 한 실시양태에서, 본원에서 사용된 바와 같은 "매우 긴" 모달 길이는 40개 초과의 반복 O-단위를 지칭한다.
한 실시양태에서, 생산된 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 10개 반복 단위, 15개 반복 단위, 20개 반복 단위, 25개 반복 단위, 30개 반복 단위, 35개 반복 단위, 40개 반복 단위, 45개 반복 단위, 50개 반복 단위, 55개 반복 단위, 60개 반복 단위, 65개 반복 단위, 70개 반복 단위, 75개 반복 단위, 80개 반복 단위, 85개 반복 단위, 90개 반복 단위, 95개 반복 단위, 또는 100개 반복 단위의 증가를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위의 증가를 갖는다. 바람직하게는, 사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 반복 단위의 증가를 포함한다. 예를 들어, 표 21을 참조한다. 사카라이드의 길이를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 실시예 13에 기재된 바와 같은 핵 자기 공명, 질량 분광법 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다.
사카라이드 내의 반복 단위의 수를 결정하는 방법은 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 반복 단위의 수 (또는 화학식에서 "n")는 폴리사카라이드의 분자량 (코어 사카라이드 또는 KDO 잔기의 분자량 제외)을 반복 단위의 분자량 (즉, 예를 들어 표 1에 표시된 상응하는 화학식 내의 구조의 분자량, 이는 이론적으로 화학식 내의 각 모노사카라이드가 분자량의 합으로서 계산될 수 있음)으로 나눔으로써 계산될 수 있다. 화학식 내의 각 모노사카라이드의 분자량은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 화학식 O25b의 반복 단위의 분자량은 약 862 Da이다. 예를 들어, 화학식 O1a의 반복 단위의 분자량은 약 845 Da이다. 예를 들어, 화학식 O2의 반복 단위의 분자량은 약 829 Da이다. 예를 들어, 화학식 O6의 반복 단위의 분자량은 약 893 Da이다. 접합체 내의 반복 단위의 수를 결정하는 경우, 담체 단백질 분자량 및 단백질:폴리사카라이드 비율이 계산에 포함된다. 본원에 정의된 바와 같이, "n"은 폴리사카라이드 분자 내의 반복 단위 (표 1에서 괄호로 표시됨)의 수를 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 생물학적 거대분자에서, 반복 구조는 예를 들어 누락된 분지와 같은 불완전한 반복부의 영역과 함께 산재될 수 있다. 또한, 박테리아와 같은 천연 공급원으로부터 단리 및 정제된 폴리사카라이드는 크기 및 분지의 면에서 불균일할 수 있음이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 경우, n은 집단의 분자에 대한 n의 평균 또는 중위수 값을 나타낼 수 있다.
한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 O-항원의 적어도 하나의 반복 단위의 증가를 갖는다. O-항원의 반복 단위는 표 1에 나타낸다. 한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 총 반복 단위를 포함한다. 바람직하게는, 사카라이드는 총 적어도 3개 내지 최대 80개 반복 단위를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 상응하는 야생형 O-폴리사카라이드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 이상의 반복 단위의 증가를 갖는다.
한 실시양태에서, 사카라이드는 O-항원을 포함하고, 여기서 O-항원 화학식 (예컨대, 예를 들어, 표 1에 표시된 화학식 (또한 도 9a-9c 및 도 10a-10b 참조)) 중 임의의 것에서 n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 및 최대 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50의 정수이다. 임의의 최소값 및 임의의 최대값을 조합하여 범위를 정의할 수 있다. 예시적인 범위는 예를 들어, 적어도 1 내지 최대 1000; 적어도 10 내지 최대 500; 및 적어도 20 내지 최대 80, 바람직하게는 최대 90을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, n은 적어도 31 내지 최대 90이다. 바람직한 실시양태에서, n은 40 내지 90, 보다 바람직하게는 60 내지 85이다.
한 실시양태에서, 사카라이드는 O-항원을 포함하고, 여기서 O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 1 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 5 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 10 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 25 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 50 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 75 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 100 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 125 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 150 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 175 및 최대 200이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 1 및 최대 100이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 5 및 최대 100이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 10 및 최대 100이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 25 및 최대 100이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 50 및 최대 100이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 75 및 최대 100이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 1 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 5 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 10 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 20 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 25 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 30 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 40 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 50 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 30 및 최대 90이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 85이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 75이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 70이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 60이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 50이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 49이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 48이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 47이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 35 및 최대 46이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 36 및 최대 45이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 37 및 최대 44이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 38 및 최대 43이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 39 및 최대 42이다. 한 실시양태에서, O-항원 화학식 중 어느 하나에서 n은 적어도 39 및 최대 41이다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 사카라이드에서 n은 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 또는 90, 가장 바람직하게는 40이다. 또 다른 실시양태에서, n은 적어도 35 내지 최대 60이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, n은 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60 중 어느 하나, 바람직하게는 50이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, n은 적어도 55 내지 최대 75이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, n은 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 또는 69, 가장 바람직하게는 60이다.
사카라이드 구조는 예를 들어, 1D, 1H 및/또는 13C, 2D TOCSY, DQF-COSY, NOESY 및/또는 HMQC를 포함하는 NMR과 같은 관련 기술분야에 공지된 방법 및 도구에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 접합 전에 정제된 폴리사카라이드는 5 kDa 내지 400 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 이러한 실시양태에서, 사카라이드는 10 kDa 내지 400 kDa; 5 kDa 내지 400 kDa; 5 kDa 내지 300 kDa; 5 kDa 내지 200 kDa; 5 kDa 내지 150 kDa; 10 kDa 내지 100 kDa; 10 kDa 내지 75 kDa; 10 kDa 내지 60 kDa; 10 kDa 내지 40 kDa; 10 kDa 내지 100 kDa; 10 kDa 및 200 kDa; 15 kDa 내지 150 kDa; 12 kDa 내지 120 kDa; 12 kDa 내지 75 kDa; 12 kDa 내지 50 kDa; 12 내지 60 kDa; 35 kDa 내지 75 kDa; 40 kDa 내지 60 kDa; 35 kDa 내지 60 kDa; 20 kDa 내지 60 kDa; 12 kDa 내지 20 kDa; 또는 20 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드는 7 kDa 내지 15 kDa; 8 kDa 내지 16 kDa; 9 kDa 내지 25 kDa; 10 kDa 내지 100; 10 kDa 내지 60 kDa; 10 kDa 내지 70 kDa; 10 kDa 내지 160 kDa; 15 kDa 내지 600 kDa; 20 kDa 내지 1000 kDa; 20 kDa 내지 600 kDa; 20 kDa 내지 400 kDa; 30 kDa 내지 1,000 Kda; 30 kDa 내지 60 kDa; 30 kDa 내지 50 kDa 또는 5 kDa 내지 60 kDa의 분자량을 갖는다. 상기 범위 중 임의의 것 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 실시양태로서 고려된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리사카라이드 또는 담체 단백질-폴리사카라이드 접합체의 "분자량"이라는 용어는 다각 레이저 광 산란 검출기 (MALLS)와 조합된 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계산된 분자량을 지칭한다.
폴리사카라이드는 정상적인 정제 절차 동안 크기가 약간 줄어들 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같이, 폴리사카라이드는 접합 전에 사이징 기술을 거칠 수 있다. 기계적 또는 화학적 사이징이 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다. 기계적 사이징은 고압 균질화 전단을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 언급된 분자량 범위는 접합 전에 (예를 들어, 활성화 전에) 정제된 폴리사카라이드를 지칭한다.
표 A: 이. 콜라이 혈청군/혈청형 및 O-단위 모이어티
† β-D-6dmanHep2Ac는 2-O-아세틸-6-데옥시-β-D-만노-헵토피라노실이다.
‡ β-D-Xulf는 β-D-트레오-펜토푸라노실이다.
3. 코어 올리고사카라이드
코어 올리고사카라이드는 야생형 이. 콜라이 LPS에서 지질 A 및 O-항원 외부 영역 사이에 위치된다. 보다 구체적으로, 코어 올리고사카라이드는 야생형 이. 콜라이에서 O-항원 및 지질 A 사이의 결합을 포함하는 폴리사카라이드의 일부이다. 이 결합은 가장 안쪽에 있는 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산 (KDO)) 잔기의 헤미케탈 기능 및 지질 A의 GlcNAc-잔기의 히드록실기 사이의 케토시드 결합을 포함한다. 코어 올리고사카라이드 영역은 야생형 이. 콜라이 균주 중에서 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 이는 대개 제한된 수의 당을 포함한다. 코어 올리고사카라이드는 내부 코어 영역 및 외부 코어 영역을 포함한다.
보다 구체적으로, 내부 코어는 주로 L-글리세로-D-만노-헵토스 (헵토스) 및 KDO 잔기로 구성된다. 내부 코어는 고도로 보존되어 있다. KDO 잔기는 하기 화학식 KDO를 포함한다:
코어 올리고사카라이드의 외부 영역은 내부 코어 영역보다 더 많은 변이를 나타내고, 이 영역의 차이는 이. 콜라이의 5개 화학형: R1, R2, R3, R4 및 K-12를 구별한다. 5개의 공지된 화학형의 외부 코어 올리고사카라이드의 탄수화물 백본의 일반화된 구조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. HepII는 내부 코어 올리고사카라이드의 마지막 잔기이다. 모든 외부 코어 올리고사카라이드는 (헥소스)3 탄수화물 백본 및 2개의 측쇄 잔기를 갖는 구조적 테마를 공유하지만, 백본 내의 헥소스의 순서 및 측쇄 잔기의 성질, 위치 및 연결은 모두 다를 수 있다. R1 및 R4 외부 코어 올리고사카라이드에 대한 구조는 고도로 유사하며, 단일 β-연결 잔기만이 상이하다.
야생형 이. 콜라이의 코어 올리고사카라이드는 관련 기술분야에서 원위 올리고사카라이드의 구조에 기초하여 5개의 상이한 화학형으로 분류된다: 이. 콜라이 R1, 이. 콜라이 R2, 이. 콜라이 R3, 이. 콜라이 R4, 및 이. 콜라이 K12.
바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 O-폴리사카라이드가 O-항원에 결합된 코어 올리고사카라이드를 포함하는 당접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 코어 이. 콜라이 화학형 이. 콜라이 R1, 이. 콜라이 R2, 이. 콜라이 R3, 이. 콜라이 R4, 및 이. 콜라이 K12 중 적어도 어느 하나에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 2개의 코어 이. 콜라이 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 3개의 코어 이. 콜라이 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 4개의 코어 이. 콜라이 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 5개의 코어 이. 콜라이 화학형 모두에 대한 면역 반응을 유도한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 O-폴리사카라이드가 O-항원에 결합된 코어 올리고사카라이드를 포함하지 않는 당접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 조성물은 코어 올리고사카라이드를 포함하지 않는 O-폴리사카라이드를 갖는 당접합체에도 불구하고, 코어 이. 콜라이 화학형 이. 콜라이 R1, 이. 콜라이 R2, 이. 콜라이 R3, 이. 콜라이 R4, 및 이. 콜라이 K12 중 적어도 어느 하나에 대한 면역 반응을 유도한다.
이. 콜라이 혈청형은 5개 화학형 중 하나에 따라 특징화될 수 있다. 표 B는 화학형에 따라 특징화된 예시적인 혈청형을 나열한다. 굵게 표시된 혈청형은 표시된 코어 화학형과 가장 일반적으로 연관된 혈청형을 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 조성물은 코어 이. 콜라이 화학형 이. 콜라이 R1, 이. 콜라이 R2, 이. 콜라이 R3, 이. 콜라이 R4, 및 이. 콜라이 K12 중 적어도 어느 하나에 대한 면역 반응을 유도하며, 이는 각각의 상응하는 이. 콜라이 혈청형 중 어느 하나에 대한 면역 반응을 포함한다.
표 B: 코어 화학형 및 연관 이. 콜라이 혈청형
일부 실시양태에서, 조성물은 R1 화학형 (예를 들어, 화학식 O25a, 화학식 O6, 화학식 O2, 화학식 O1, 화학식 O75, 화학식 O4, 화학식 O16, 화학식 O8, 화학식 O18, 화학식 O9, 화학식 O13, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O91 및 화학식 O163을 갖는 사카라이드로부터 선택됨)을 갖는 혈청형으로부터 유래된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 내의 사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 R1 화학형 (예를 들어, 화학식 O25a, 화학식 O6, 화학식 O2, 화학식 O1, 화학식 O75, 화학식 O4, 화학식 O16, 화학식 O18, 화학식 O13, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O91 및 화학식 O163을 갖는 사카라이드로부터 선택됨)을 갖는 혈청형으로부터 유래된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 내의 사카라이드는 사카라이드에 이. 콜라이 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 R2 화학형 (예를 들어, 화학식 O21, 화학식 O44, 화학식 O11, 화학식 O89, 화학식 O162 및 화학식 O9를 갖는 사카라이드로부터 선택됨)을 갖는 혈청형으로부터 유래된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 내의 사카라이드는 이. 콜라이 R2 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 R3 화학형 (예를 들어, 화학식 O25b, 화학식 O15, 화학식 O153, 화학식 O21, 화학식 O17, 화학식 O11, 화학식 O159, 화학식 O22, 화학식 O86 및 화학식 O93을 갖는 사카라이드로부터 선택됨)을 갖는 혈청형으로부터 유래된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 내의 사카라이드는 이. 콜라이 R3 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 R4 화학형 (예를 들어, 화학식 O2, 화학식 O1, 화학식 O86, 화학식 O7, 화학식 O102, 화학식 O160 및 화학식 O166을 갖는 사카라이드로부터 선택됨)을 갖는 혈청형으로부터 유래된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 내의 사카라이드는 이. 콜라이 R4 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 K-12 화학형 (예를 들어, 화학식 O25b를 갖는 사카라이드 및 화학식 O16을 갖는 사카라이드로부터 선택됨)을 갖는 혈청형으로부터 유래된 구조를 포함하는 사카라이드를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 1000, 바람직하게는 31 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 내의 사카라이드는 이. 콜라이 K-12 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 사카라이드는 코어 사카라이드를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R2 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R3 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R4 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 K12 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 사카라이드는 코어 사카라이드를 포함하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R1 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R2 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R3 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 R4 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, O-폴리사카라이드는 이. 콜라이 K12 코어 모이어티를 포함하지 않는다.
4. 접합된 O-항원
단백질 담체에 대한 O-항원 또는 바람직하게는 O-폴리사카라이드의 화학적 연결은 O-항원 또는 O-폴리사카라이드의 면역원성을 개선시킬 수 있다. 그러나, 중합체 크기의 가변성은 생산에 있어 실질적인 문제를 나타낸다. 상업적 사용에서, 사카라이드의 크기는 다양한 접합 합성 전략과의 호환성, 제품 균일성, 및 접합체 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. O-항원 합성 경로의 조작을 통해 Wzz 패밀리 단백질 쇄 길이 조절인자의 발현을 제어하는 것은 이. 콜라이를 포함한 다양한 그람-음성 박테리아 균주에서 원하는 길이의 O-항원 쇄의 생산을 허용한다.
한 실시양태에서, 정제된 사카라이드는 화학적으로 활성화되어 담체 단백질과 반응할 수 있는 활성화된 사카라이드를 생성한다. 활성화되면, 각 사카라이드는 담체 단백질에 별도로 접합되어 접합체, 즉 당접합체를 형성한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "당접합체"는 담체 단백질에 공유결합으로 연결된 사카라이드를 지칭한다. 한 실시양태에서 사카라이드는 담체 단백질에 직접 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 사카라이드는 스페이서/링커를 통해 단백질에 연결된다.
접합체는 O-항원을 따라 하나 또는 다중 부위에서 O-항원에 담체를 결합시키는 방식에 의해, 또는 코어 올리고사카라이드의 적어도 하나의 잔기를 활성화시키는 방식에 의해 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 각 사카라이드는 동일한 담체 단백질에 접합된다.
단백질 담체가 조성물 내의 2개 이상의 사카라이드에 대해 동일한 경우, 사카라이드는 담체 단백질의 동일한 분자 (예를 들어, 이에 접합된 2개 이상의 상이한 사카라이드를 갖는 담체 분자)에 접합될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 각각 단백질 담체의 상이한 분자에 개별적으로 접합된다 (단백질 담체의 각 분자는 이에 접합된 한 유형의 사카라이드만을 가짐). 상기 실시양태에서, 사카라이드는 담체 단백질에 개별적으로 접합된 것으로 언급된다.
사카라이드의 화학적 활성화 및 담체 단백질에 대한 후속 접합은 본원에 개시된 활성화 및 접합 방법에 의해 달성될 수 있다. 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 접합 후, 당접합체는 다양한 기술에 의해 정제된다 (폴리사카라이드-단백질 접합체의 양과 관련하여 풍부화). 이들 기술은 농축/투석여과 작업, 침전/용리, 칼럼 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함한다. 개별 당접합체를 정제한 후, 이들을 배합하여 본 발명의 면역원성 조성물을 제형화한다.
a. 활성화. 본 발명은 추가로 폴리사카라이드가 링커 또는 담체 단백질에 대한 접합을 위한 반응성 기를 생성하기 위해 화학 시약으로 활성화된, 본원에 기재된 임의의 실시양태로부터 생성된 활성화된 폴리사카라이드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 담체 단백질에 대한 접합 전에 활성화된다. 일부 실시양태에서, 활성화 정도는 폴리사카라이드의 분자량을 유의하게 감소시키지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 활성화 정도는 폴리사카라이드 백본을 절단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화 정도는 (아미노산 분석에 의해 결정된 바와 같은) 담체 단백질, 예컨대 CRM197에서 변형된 리신 잔기의 수에 의해 측정된 바와 같은 접합 정도에 유의한 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 활성화 정도는 동일한 활성화 정도에서 참조 폴리사카라이드와 접합체의 담체 단백질에서 변형된 리신 잔기의 수와 비교하여 (아미노산 분석에 의해 결정된 바와 같은) 담체 단백질에서 변형된 리신 잔기의 수를 3배만큼 유의하게 증가시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화 정도는 비접합된 유리 사카라이드의 수준을 증가시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화 정도는 최적 사카라이드/단백질 비율을 감소시키지 않는다.
일부 실시양태에서, 활성화된 사카라이드는 활성화 백분율을 가지며, 여기서 활성화된 사카라이드의 사카라이드 반복 단위당 티올의 몰수는 1 내지 100%, 예컨대, 예를 들어, 2 내지 80%, 2 내지 50%, 3 내지 30%, 및 4 내지 25%이다. 활성화 정도는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ≥ 20%, ≥ 30%, ≥ 40%, ≥ 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, 또는 ≥ 90%, 또는 약 100%이다. 바람직하게는, 활성화 정도는 최대 50%, 보다 바람직하게는 최대 25%이다. 한 실시양태에서, 활성화 정도는 최대 20%이다. 임의의 최소값 및 임의의 최대값을 조합하여 범위를 정의할 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)로 활성화되어 시아네이트 에스테르를 형성한다. 그 후, 활성화된 폴리사카라이드는 직접 또는 스페이서 (링커) 기를 통해 담체 단백질 (바람직하게는 CRM197 또는 파상풍 톡소이드) 상의 아미노 기에 커플링된다.
예를 들어, 스페이서는 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들어 N-[Y-말레이미도부티르옥시]숙신이미드 에스테르 (GMBS) 사용) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질 (예를 들어 동결건조된 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 (SBA; SIB), N-숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), 술포숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트 (술포-SIAB), N-숙신이미딜 아이오도아세테이트 (SIA), 또는 숙신이미딜 3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트 (SBAP) 사용)과의 반응 후 수득되는 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있는 티올화된 폴리사카라이드를 제공하기 위해 시스타민 또는 시스테아민일 수 있다. 한 실시양태에서, 시아네이트 에스테르 (임의로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드 (ADH)와 커플링되고, 아미노-유도체화된 사카라이드는 단백질 담체 상의 카르복실 기를 통해 카르보디이미드 (예를 들어, EDAC 또는 EDC) 화학을 사용하여 담체 단백질 (예를 들어, CRM197)에 접합된다.
접합을 위한 다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 접합은 사카라이드의 유리 히드록실 기와 CDI의 반응에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 포함할 수 있으며, 이는 이어서 단백질과의 반응에 의해 카르바메이트 연결을 형성한다. 이는 아노머 말단의 1차 히드록실 기로의 환원, 1차 히드록실 기의 임의의 보호/탈보호, 1차 히드록실 기와 CDI의 반응을 포함하여 CDI 카르바메이트 중간체를 형성하고 CDI 카르바메이트 중간체를 단백질 (CDI 화학) 상의 아미노 기와 커플링시킬 수 있다.
b. 분자량. 일부 실시양태에서, 당접합체는 10 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는 사카라이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 사카라이드는 50 kDa 내지 1,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 사카라이드는 70 kDa 내지 900 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 사카라이드는 100 kDa 내지 800 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 사카라이드는 200 kDa 내지 600 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 실시양태에서, 사카라이드는 100 kDa 내지 1000 kDa; 100 kDa 내지 900 kDa; 100 kDa 내지 800 kDa; 100 kDa 내지 700 kDa; 100 kDa 내지 600 kDa; 100 kDa 내지 500 kDa; 100 kDa 내지 400 kDa; 100 kDa 내지 300 kDa; 150 kDa 내지 1,000 kDa; 150 kDa 내지 900 kDa; 150 kDa 내지 800 kDa; 150 kDa 내지 700 kDa; 150 kDa 내지 600 kDa; 150 kDa 내지 500 kDa; 150 kDa 내지 400 kDa; 150 kDa 내지 300 kDa; 200 kDa 내지 1,000 kDa; 200 kDa 내지 900 kDa; 200 kDa 내지 800 kDa; 200 kDa 내지 700 kDa; 200 kDa 내지 600 kDa; 200 kDa 내지 500 kDa; 200 kDa 내지 400 kDa; 200 kDa 내지 300; 250 kDa 내지 1,000 kDa; 250 kDa 내지 900 kDa; 250 kDa 내지 800 kDa; 250 kDa 내지 700 kDa; 250 kDa 내지 600 kDa; 250 kDa 내지 500 kDa; 250 kDa 내지 400 kDa; 250 kDa 내지 350 kDa; 300 kDa 내지 1,000 kDa; 300 kDa 내지 900 kDa; 300 kDa 내지 800 kDa; 300 kDa 내지 700 kDa; 300 kDa 내지 600 kDa; 300 kDa 내지 500 kDa; 300 kDa 내지 400 kDa; 400 kDa 내지 1,000 kDa; 400 kDa 내지 900 kDa; 400 kDa 내지 800 kDa; 400 kDa 내지 700 kDa; 400 kDa 내지 600 kDa; 500 kDa 내지 600 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 단일-단부 접합에 의해 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 수성 완충액에서 제조된 환원성 아민화 화학 (RAC)에 의해 생성된다. 상기 범위 중 임의의 것 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 실시양태로서 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 당접합체는 400 kDa 내지 15,000 kDa; 500 kDa 내지 10,000 kDa; 2,000 kDa 내지 10,000 kDa; 3,000 kDa 내지 8,000 kDa; 또는 3,000 kDa 내지 5,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 당접합체는 500 kDa 내지 10,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 당접합체는 1,000 kDa 내지 8,000 kDa의 분자량을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 당접합체는 2,000 kDa 내지 8,000 kDa 또는 3,000 kDa 내지 7,000 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 당접합체는 200 kDa 내지 20,000 kDa; 200 kDa 내지 15,000 kDa; 200 kDa 내지 10,000 kDa; 200 kDa 내지 7,500 kDa; 200 kDa 내지 5,000 kDa; 200 kDa 내지 3,000 kDa; 200 kDa 내지 1,000 kDa; 500 kDa 내지 20,000 kDa; 500 kDa 내지 15,000 kDa; 500 kDa 내지 12,500 kDa; 500 kDa 내지 10,000 kDa; 500 kDa 내지 7,500 kDa; 500 kDa 내지 6,000 kDa; 500 kDa 내지 5,000 kDa; 500 kDa 내지 4,000 kDa; 500 kDa 내지 3,000 kDa; 500 kDa 내지 2,000 kDa; 500 kDa 내지 1 ,500 kDa; 500 kDa 내지 1,000 kDa; 750 kDa 내지 20,000 kDa; 750 kDa 내지 15,000 kDa; 750 kDa 내지 12,500 kDa; 750 kDa 내지 10,000 kDa; 750 kDa 내지 7,500 kDa; 750 kDa 내지 6,000 kDa; 750 kDa 내지 5,000 kDa; 750 kDa 내지 4,000 kDa; 750 kDa 내지 3,000 kDa; 750 kDa 내지 2,000 kDa; 750 kDa 내지 1,500 kDa; 1,000 kDa 내지 15,000 kDa; 1,000 kDa 내지 12,500 kDa; 1,000 kDa 내지 10,000 kDa; 1,000 kDa 내지 7,500 kDa; 1,000 kDa 내지 6,000 kDa; 1,000 kDa 내지 5,000 kDa; 1,000 kDa 내지 4,000 kDa; 1,000 kDa 내지 2,500 kDa; 2,000 kDa 내지 15,000 kDa; 2,000 kDa 내지 12,500 kDa; 2,000 kDa 내지 10,000 kDa; 2,000 kDa 내지 7,500 kDa; 2,000 kDa 내지 6,000 kDa; 2,000 kDa 내지 5,000 kDa; 2,000 kDa 내지 4,000 kDa; 또는 2,000 kDa 내지 3,000 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 본원에 기재된 eTEC 접합에 의해 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 환원성 아민화 화학 (RAC)에 의해 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 DMSO에서 제조된 환원성 아민화 화학 (RAC)에 의해 생성된다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 당접합체는 1,000 kDa 내지 20,000 kDa; 1,000 kDa 내지 15,000 kDa; 2,000 kDa 내지 10,000 kDa; 2000 kDa 내지 7,500 kDa; 2,000 kDa 내지 5,000 kDa; 3,000 kDa 내지 20,000 kDa; 3,000 kDa 내지 15,000 kDa; 3,000 kDa 내지 12,500 kDa; 4,000 kDa 내지 10,000 kDa; 4,000 kDa 내지 7,500 kDa; 4,000 kDa 내지 6,000 kDa; 또는 5,000 kDa 내지 7,000 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 환원성 아민화 화학 (RAC)에 의해 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 DMSO에서 제조된 환원성 아민화 화학 (RAC)에 의해 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 분자량을 갖는 당접합체는 본원에 기재된 eTEC 접합에 의해 생성된다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 당접합체는 5,000 kDa 내지 20,000 kDa; 5,000 kDa 내지 15,000 kDa; 5,000 kDa 내지 10,000 kDa; 5,000 kDa 내지 7,500 kDa; 6,000 kDa 내지 20,000 kDa; 6,000 kDa 내지 15,000 kDa; 6,000 kDa 내지 12,500 kDa; 6,000 kDa 내지 10,000 kDa 또는 6,000 kDa 내지 7,500 kDa의 분자량을 갖는다.
당접합체의 분자량은 SEC-MALLS에 의해 측정될 수 있다. 상기 범위 중 임의의 것 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 실시양태로서 고려된다. 본 발명의 당접합체는 또한 담체 단백질에 대한 사카라이드의 비율 (중량/중량)에 의해 특징화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 당접합체 내의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비율 (w/w)은 0.5 내지 3 (예를 들어, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 또는 약 3.0)이다. 다른 실시양태에서, 담체 단백질에 대한 사카라이드의 비율 (w/w)은 0.5 내지 2.0, 0.5 내지 1.5, 0.8 내지 1.2, 0.5 내지 1.0, 1.0 내지 1.5 또는 1.0 내지 2.0이다. 추가 실시양태에서, 담체 단백질에 대한 사카라이드의 비율 (w/w)은 0.8 내지 1.2이다. 바람직한 실시양태에서, 접합체 내의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비율은 0.9 내지 1.1이다. 일부 이러한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
당접합체는 또한 이들의 분자 크기 분포 (Kd)에 의해 특징화될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 매질 (CL-4B)을 사용하여 접합체의 상대적 분자 크기 분포를 결정할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 접합체의 분자 크기 분포를 프로파일링하기 위해 중력 공급 칼럼에서 사용된다. 매질에서 기공으로부터 배제된 큰 분자는 작은 분자보다 더 빨리 용리된다. 분획 수집기는 칼럼 용리액을 수집하는데 사용된다. 분획은 사카라이드 검정에 의해 비색적으로 시험된다. Kd의 결정을 위해, 칼럼을 보정하여 분자가 완전히 배제된 분획 (V0), (Kd=0), 및 최대 체류 (Vi), (Kd=1)를 나타내는 분획을 확립한다. 특정된 샘플 속성에 도달된 분획 (Ve)은 Kd = (Ve - Vo)/ (Vi - V0) 표현에 의해 Kd와 관련된다.
c. 유리 사카라이드. 본 발명의 당접합체 및 면역원성 조성물은 담체 단백질에 공유결합으로 접합되지 않지만 그럼에도 불구하고 당접합체 조성물에 존재하는 유리 사카라이드를 포함할 수 있다. 유리 사카라이드는 당접합체와 비공유결합으로 회합될 수 있다 (즉, 이에 비공유결합으로 결합되거나, 흡착되거나 또는 포획됨). 바람직한 실시양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 최대 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% 또는 15%의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 25% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 최대 약 20%의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 최대 약 15%의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 최대 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 8% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 최대 약 6%의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 최대 약 5%의 유리 폴리사카라이드를 포함한다.
d. 공유결합적 연결. 다른 실시양태에서, 접합체는 5 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 9개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 15개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 6개의 사카라이드 반복 단위마다, 3 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 20개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 25개의 사카라이드 반복 단위마다 또는 2 내지 25개의 사카라이드 반복 단위마다 담체 단백질과 사카라이드 사이에 적어도 하나의 공유결합적 연결을 포함한다. 빈번한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다. 또 다른 실시양태에서, 담체 단백질과 사카라이드 사이의 적어도 하나의 연결은 폴리사카라이드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 사카라이드 반복 단위마다 발생한다. 한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다. 상기 범위 중 임의의 것 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 실시양태로서 고려된다.
e. 리신 잔기. 본 발명의 당접합체를 특징화하는 또 다른 방법은 접합된 리신의 범위 (접합 정도)로서 특징화될 수 있는 사카라이드에 접합되는 담체 단백질 (예를 들어, CRM197) 내의 리신 잔기의 수에 의한 것이다. 폴리사카라이드에 대한 공유결합적 연결로 인한 담체 단백질의 리신 변형에 대한 증거는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 아미노산 분석에 의해 수득될 수 있다. 접합은 접합체 물질을 생성하는데 사용된 담체 단백질 출발 물질과 비교하여 회수된 리신 잔기의 수의 감소를 초래한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합 정도는 2 내지 15, 2 내지 13, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 15, 3 내지 13, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 5 내지 15, 5 내지 10, 8 내지 15, 8 내지 12, 10 내지 15 또는 10 내지 12이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합 정도는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합 정도는 4 내지 7이다. 일부 이러한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
담체 단백질 상의 리신에 대한 사카라이드 쇄의 부착 빈도는 본 발명의 당접합체를 특징화하기 위한 또 다른 파라미터이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드의 4개 사카라이드 반복 단위마다 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 적어도 하나의 공유결합적 연결. 또 다른 실시양태에서, 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유결합적 연결은 폴리사카라이드의 10개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 발생한다. 또 다른 실시양태에서, 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유결합적 연결은 폴리사카라이드의 15개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 발생한다. 추가 실시양태에서, 담체 단백질과 폴리사카라이드 사이의 공유결합적 연결은 폴리사카라이드의 25개 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 발생한다.
f. O-아세틸화. 일부 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 O-아세틸화된다. 일부 실시양태에서, 당접합체는 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% 또는 80-90%의 O 아세틸화 정도를 갖는 사카라이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, O 아세틸화 정도는 ≥ 10%, ≥ 20%, ≥ 30%, ≥ 40%, ≥ 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, 또는 ≥ 90%, 또는 약 100%이다. O-아세틸화 %는 100% 대비 주어진 사카라이드의 백분율을 의미한다 (여기서 각 반복 단위는 그의 아세틸화된 구조에 비해 완전히 아세틸화됨).
일부 실시양태에서, 당접합체는 환원성 아민화에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 당접합체는 단일-단부-연결 접합된 사카라이드이고, 여기서 사카라이드는 담체 단백질에 직접 공유결합으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 당접합체는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸) 카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 공유결합으로 결합된다.
g. 환원성 아민화. 한 실시양태에서, 사카라이드는 환원성 아민화에 의해 담체 단백질에 접합된다 (예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 및 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653, 및 WO 2008/143709에 기재되어 있음).
환원성 아민화는 (1) 사카라이드의 산화, (2) 접합체를 형성하기 위한 활성화된 사카라이드 및 담체 단백질의 환원을 포함한다. 산화 전에 사카라이드는 임의로 가수분해된다. 기계적 또는 화학적 가수분해가 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다.
산화 단계는 과아이오딘산염과의 반응을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "과아이오딘산염"은 과아이오딘산염 및 과아이오딘산 둘 다를 지칭한다. 상기 용어는 또한 메타과아이오딘산염 (IO4-) 및 오르토과아이오딘산염 (IO65-) 및 과아이오딘산염의 다양한 염 (예를 들어, 과아이오딘산나트륨 및 과아이오딘산칼륨) 둘 다를 포함한다. 한 실시양태에서 폴리사카라이드는 메타과아이오딘산염의 존재 하에, 바람직하게는 과아이오딘산나트륨 (NalO4)의 존재 하에 산화된다. 또 다른 실시양태에서 폴리사카라이드는 오르토과아이오딘산염의 존재 하에, 바람직하게는 과아이오딘산의 존재 하에 산화된다.
한 실시양태에서, 산화제는 1차 히드록실을 선택적으로 산화시키는 산화제의 존재 하에 안정한 니트록실 또는 니트록시드 라디칼 화합물, 예컨대 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물이다. 상기 반응에서, 실제 산화제는 촉매 사이클에서 N-옥소암모늄 염이다. 한 측면에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록시드 라디칼 화합물은 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물이다. 한 측면에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록시드 라디칼 화합물은 TEMPO (2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시) 또는 PROXYL (2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시) 모이어티를 보유한다. 한 측면에서, 상기 안정한 니트록실 라디칼 화합물은 TEMPO 또는 그의 유도체이다. 한 측면에서, 상기 산화제는 N-할로 모이어티를 보유하는 분자이다. 한 측면에서, 상기 산화제는 N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, N-아이오도숙신이미드, 디클로로이소시아누르산, 1,3,5-트리클로로-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온, 디브로모이소시아누르산, 1,3,5-트리브로모-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온, 디아이오도이소시아누르산 및 1,3,5-트리아이오도-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온 중 어느 하나로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 산화제는 N-클로로숙신이미드이다.
사카라이드의 산화 단계 후, 사카라이드는 활성화된 것이라고 하고, 본원에서 이하 "활성화된" 것으로 지칭된다. 활성화된 사카라이드 및 담체 단백질은 독립적으로 (별개의 동결건조) 또는 함께 (공동-동결건조) 동결건조 (동결-건조)될 수 있다. 한 실시양태에서 활성화된 사카라이드 및 담체 단백질은 공동-동결건조된다. 또 다른 실시양태에서 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질은 독립적으로 동결건조된다.
한 실시양태에서 동결건조는 비환원당의 존재 하에 일어나고, 가능한 비환원당은 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨 및 팔라티니트를 포함한다.
접합 프로세스의 다음 단계는 환원제를 사용하여 활성화된 사카라이드 및 담체 단백질을 환원시켜 접합체를 형성하는 것이다 (소위 환원성 아민화). 적합한 환원제는 시아노보로히드라이드, 예컨대 나트륨 시아노보로히드라이드, 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 또는 나트륨 또는 아연 보로히드라이드 (브론스테드 또는 루이스 산의 존재 하에), 아민 보란, 예컨대 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-디보란-메탄올, 디메틸아민-보란, t-BuMe'PrN-BH3, 벤질아민-BH3 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란 (PEMB), 보란-피리딘, 또는 보로히드라이드 교환 수지를 포함한다. 한 실시양태에서 환원제는 나트륨 시아노보로히드라이드이다.
한 실시양태에서, 환원 반응은 수성 용매 (예를 들어, PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, 비신 또는 HEPB로부터 선택됨, pH 6.0 내지 8.5, 7.0 내지 8.0, 또는 7.0 내지 7.5)에서 수행되고, 또 다른 실시양태에서 반응은 비양성자성 용매에서 수행된다. 한 실시양태에서, 환원 반응은 DMSO (디메틸술폭시드) 또는 DMF (디메틸포름아미드) 용매에서 수행된다. DMSO 또는 DMF 용매는 동결건조된 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 재구성하는데 사용될 수 있다
환원 반응의 종료시, 접합체에 미반응 알데히드 기가 남아있을 수 있으며, 이들은 적합한 캡핑제를 사용하여 캡핑될 수 있다. 한 실시양태에서 이러한 캡핑제는 나트륨 보로히드라이드 (NaBH4)이다. 접합 (환원 반응 및 임의로 캡핑) 후, 당접합체는 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 의해 정제될 수 있다 (폴리사카라이드-단백질 접합체의 양과 관련하여 풍부화). 이들 기술은 투석, 농축/투석여과 작업, 접선 유동 여과 침전/용리, 칼럼 크로마토그래피 (DEAE 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피), 및 심층 여과를 포함한다. 당접합체는 투석여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 한 실시양태에서, 당접합체는 투석여과 또는 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된다. 한 실시양태에서 당접합체는 멸균 여과된다.
바람직한 실시양태에서, O25b, O1a, O2 및 O6 중 어느 하나로부터 선택된 이. 콜라이 혈청형으로부터의 당접합체는 환원성 아민화에 의해 제조된다. 바람직한 실시양태에서, 이. 콜라이 혈청형 O25b, O1a, O2 및 O6으로부터의 당접합체는 환원성 아민화에 의해 제조된다.
한 측면에서, 본 발명은 하기로 표시되는 화학식 O25B의 사카라이드에 연결된 담체 단백질, 예를 들어 CRM197을 포함하는 접합체에 관한 것이며,
여기서 n은 1 이상의 임의의 정수이다. 바람직한 실시양태에서, n은 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 및 최대 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50의 정수이다. 임의의 최소값 및 임의의 최대값을 조합하여 범위를 정의할 수 있다. 예시적인 범위는 예를 들어, 적어도 1 내지 최대 1000; 적어도 10 내지 최대 500; 및 적어도 20 내지 최대 80을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, n은 적어도 31 내지 최대 90, 보다 바람직하게는 40 내지 90, 가장 바람직하게는 60 내지 85이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 A에 표시된 하기 구조 중 어느 하나를 갖는 사카라이드에 연결된 담체 단백질, 예를 들어 CRM197을 포함하는 접합체에 관한 것이며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다.
이론 또는 메커니즘에 얽매이지 않고, 일부 실시양태에서, 안정한 접합체는 항원의 중요한 면역원성 에피토프의 구조적 완전성을 보존하는 것과 균형을 이루는 수준의 사카라이드 항원 변형을 필요로 하는 것으로 여겨진다.
h. 알데히드의 활성화 및 형성. 일부 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 활성화되어 알데히드의 형성을 초래한다. 사카라이드가 활성화된 이러한 실시양태에서, 활성화 백분율 (%) (또는 산화 정도 (DO))은 활성화된 폴리사카라이드의 알데히드의 몰당 사카라이드 반복 단위의 몰을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 사카라이드는 폴리사카라이드의 반복 단위 상의 인접 디올의 과아이오딘산염 산화에 의해 활성화되어, 알데히드의 형성을 초래한다. 사카라이드 반복 단위에 대한 과아이오딘산나트륨의 몰 당량 (meq) 및 산화 동안의 온도를 변화시키는 것은 다양한 수준의 산화 정도 (DO)를 초래한다.
사카라이드 및 알데히드 농도는 전형적으로 비색 검정에 의해 결정된다. 대안적인 시약은 TEMPO (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 1-옥실 라디칼)-N-클로로숙신이미드 (NCS) 조합이며, 이는 1차 알콜 기로부터 알데히드의 형성을 초래한다.
일부 실시양태에서, 활성화된 사카라이드는 산화 정도를 가지며, 여기서 활성화된 사카라이드의 알데히드의 몰당 사카라이드 반복 단위의 몰은 1-100, 예컨대, 예를 들어, 2-80, 2-50, 3-30, 및 4-25이다. 활성화 정도는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ≥ 20, ≥ 30, ≥ 40, ≥ 50, ≥ 60, ≥ 70, ≥ 80, 또는 ≥ 90, 또는 약 100이다. 바람직하게는, 산화 정도 (DO)는 적어도 5 및 최대 50, 보다 바람직하게는 적어도 10 및 최대 25이다. 한 실시양태에서, 활성화 정도는 적어도 10 및 최대 25이다. 임의의 최소값 및 임의의 최대값을 조합하여 범위를 정의할 수 있다. 산화 정도 값은 활성화 백분율 (%)로 표시될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 10의 DO 값은 활성화된 사카라이드 내의 총 10개의 사카라이드 반복 단위 중 1개의 활성화된 사카라이드 반복 단위를 지칭하며, 이 경우 10의 DO 값은 10% 활성화로 표시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 환원성 아민화 화학에 의해 제조된 접합체는 담체 단백질 및 사카라이드를 포함하고, 여기서 사카라이드는 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함한다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187. 일부 실시양태에서, 접합체 내의 사카라이드는 n이 1 내지 1000, 5 내지 1000, 바람직하게는 31 내지 100 또는 31 내지 90, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65의 정수인 화학식을 포함한다.
i. 단일-단부 연결된 접합체. 일부 실시양태에서, 접합체는 단일-단부-연결 접합된 사카라이드이고, 여기서 사카라이드는 사카라이드의 한쪽 단부에서 담체 단백질에 공유결합으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 단일-단부-연결 접합된 폴리사카라이드는 말단 사카라이드를 갖는다. 예를 들어, 접합체는 폴리사카라이드의 단부 중 하나 (말단 사카라이드 잔기)가 담체 단백질에 공유결합으로 결합되는 경우 단일-단부 연결된다. 일부 실시양태에서, 접합체는 폴리사카라이드의 말단 사카라이드 잔기가 링커를 통해 담체 단백질에 공유결합으로 결합되는 경우 단일-단부 연결된다. 이러한 링커는 예를 들어, 시스타민 링커 (A1), 3,3'-디티오 비스(프로판산 디히드라지드) 링커 (A4), 및 2,2'-디티오-N,N'-비스(에탄-2,1-디일)비스(2-(아미노옥시)아세트아미드) 링커 (A6)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 사카라이드는 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산 (KDO) 잔기를 통해 담체 단백질에 접합되어 단일-단부 연결된 접합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 접합체는 바람직하게는 생체접합체가 아니다. 용어 "생체접합체"는 단백질 (예를 들어, 담체 단백질) 및 항원, 예를 들어 숙주 세포 배경에서 제조된 O 항원 (예를 들어, O25B) 사이의 접합체를 지칭하고, 여기서 숙주 세포 기구는 항원을 단백질에 연결시킨다 (예를 들어, N-연결). 당접합체는 생체접합체, 뿐만 아니라 숙주 세포에서 접합체의 제조, 예를 들어, 단백질 및 사카라이드의 화학적 연결에 의한 접합을 필요로 하지 않는 수단에 의해 제조된 당 항원 (예를 들어, 올리고- 및 폴리사카라이드)-단백질 접합체를 포함한다.
j. 티올 활성화된 사카라이드. 일부 실시양태에서, 본 발명의 사카라이드는 티올 활성화된다. 사카라이드가 티올 활성화된 이러한 실시양태에서, 활성화 백분율 (%)은 활성화된 폴리사카라이드의 사카라이드 반복 단위당 티올의 몰을 지칭한다. 사카라이드 및 티올 농도는 전형적으로 술프히드릴의 정량을 위한 엘만(Ellman)의 검정에 의해 결정된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 사카라이드는 디술피드 아민 링커를 사용한 2-케토-3-데옥시옥탄산 (KDO)의 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사카라이드는 2가 이종이관능성 링커 (본원에서 "스페이서"로도 지칭됨)를 통해 담체 단백질에 공유결합으로 결합된다. 링커는 바람직하게는 사카라이드와 담체 단백질 사이에 티오에테르 결합을 제공하여, 본원에서 "티오에테르 당접합체"로 지칭되는 당접합체를 생성한다. 일부 실시양태에서, 링커는 예를 들어, (2-((2-옥소에틸)티오)에틸) 카르바메이트 (eTEC)와 같은 카르바메이트 및 아미드 결합을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 단일-단부 연결된 접합체는 담체 단백질 및 사카라이드를 포함하고, 여기서 사카라이드는 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함한다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187. 일부 실시양태에서, 접합체 내의 사카라이드는 n이 1 내지 1000, 5 내지 1000, 바람직하게는 31 내지 100, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65의 정수인 화학식을 포함한다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 단일-단부 연결된 접합체는 화학식 O8, 화학식 O9a, 화학식 O9, 화학식 O20ab, 화학식 O20ac, 화학식 O52, 화학식 O97 및 화학식 O101로부터 선택된 구조를 갖는 사카라이드 및 담체 단백질을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이다.
5. eTEC 접합체
한 측면에서, 본 발명은 일반적으로 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 공유결합으로 접합된 상기 기재된 이. 콜라이로부터 유래된 사카라이드를 포함하는 당접합체 (예를 들어, 미국 특허 9517274 및 국제 특허 출원 공개 WO2014027302 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같음), 및 이러한 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이러한 당접합체 및 면역원성 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 상기 당접합체는 하나 이상의 eTEC 스페이서를 통해 담체 단백질에 공유결합으로 접합된 사카라이드를 포함하고, 여기서 사카라이드는 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 접합되고, 여기서 담체 단백질은 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 접합된다. eTEC 스페이서는 7개의 선형 원자 (즉, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)- )를 포함하고, 사카라이드와 담체 단백질 사이에 안정한 티오에테르 및 아미드 결합을 제공한다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 하기 일반 화학식 (I)으로 표시될 수 있다:
여기서 eTEC 스페이서를 포함하는 원자는 중앙 상자에 함유된다.
본 발명의 상기 당접합체에서, 사카라이드는 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드일 수 있다.
본 발명의 당접합체에 혼입된 담체 단백질은 본원에 추가로 기재되거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 일반적으로 이러한 목적에 적합한 담체 단백질의 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 eTEC 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 본원에 기재된 사카라이드를 포함하는 당접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 a) 사카라이드를 유기 용매 중에서 탄산 유도체와 반응시켜, 활성화된 사카라이드를 생성하는 단계; b) 활성화된 사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 그의 염과 반응시켜, 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; c) 티올화된 사카라이드를 환원제와 반응시켜, 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; d) 활성화된 티올화된 사카라이드를 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화된 담체 단백질과 반응시켜, 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 생성하는 단계; 및 e) 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 (i) 활성화된 담체 단백질의 비접합된 α-할로아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약; 및/또는 (ii) 활성화된 티올화된 사카라이드의 비접합된 유리 술프히드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약과 반응시켜; 이에 의해 eTEC 연결된 당접합체를 생성하는 단계를 포함한다.
빈번한 실시양태에서, 탄산 유도체는 1,1'-카르보닐-디-(1,2,4-트리아졸) (CDT) 또는 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI)이다. 바람직하게는, 탄산 유도체는 CDT이고, 유기 용매는 극성 비양성자성 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO)이다. 바람직한 실시양태에서, 티올화된 사카라이드는 활성화된 사카라이드와 이관능성 대칭 티오알킬아민 시약, 시스타민 또는 그의 염의 반응에 의해 생성된다. 대안적으로, 티올화된 사카라이드는 활성화된 사카라이드와 시스테아민 또는 그의 염의 반응에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 eTEC 연결된 당접합체는 일반 화학식 (I)로 표시될 수 있다.
빈번한 실시양태에서, 제1 캡핑 시약은 N-아세틸-L-시스테인이며, 이는 담체 단백질의 리신 잔기 상의 비접합된 α-할로아세트아미드 기와 반응하여, 티오에테르 연결을 통해 활성화된 리신 잔기에 공유결합으로 연결된 S-카르복시메틸시스테인 (CMC) 잔기를 형성한다.
다른 실시양태에서, 제2 캡핑 시약은 아이오도아세트아미드 (IAA)이며, 이는 활성화된 티올화된 사카라이드의 비접합된 유리 술프히드릴 기와 반응하여 캡핑된 티오아세트아미드를 제공한다. 빈번하게, 단계 e)는 제1 캡핑 시약 및 제2 캡핑 시약 둘 다로 캡핑하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단계 e)는 제1 캡핑 시약으로서 N-아세틸-L-시스테인 및 제2 캡핑 시약으로서 IAA로 캡핑하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 캡핑 단계 e)는 제1 및/또는 제2 캡핑 시약과의 반응 후에 환원제, 예를 들어, DTT, TCEP 또는 머캅토에탄올과의 반응을 추가로 포함한다.
본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 유리 술프히드릴 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법에 의해 형성된 활성화된 티올화된 사카라이드는 다중 유리 술프히드릴 잔기를 포함할 것이며, 그 중 일부는 접합 단계 동안 담체 단백질에 대한 공유결합적 접합을 거치지 않을 수 있다. 이러한 잔류 유리 술프히드릴 잔기는 티올-반응성 캡핑 시약, 예를 들어, 아이오도아세트아미드 (IAA)와의 반응에 의해 캡핑되어 잠재적으로 반응성 관능기를 캡핑한다. 다른 티올-반응성 캡핑 시약, 예를 들어 말레이미드 함유 시약 등이 또한 고려된다.
또한, 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체 및 면역원성 조성물은 캡핑 공정 단계 동안 변형을 거친 활성화된 담체 단백질을 포함할 수 있는 잔류 비접합된 담체 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 d)는 활성화된 티올화된 사카라이드를 활성화된 담체 단백질과 반응시키기 전에 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화된 담체 단백질을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 빈번한 실시양태에서, 활성화된 담체 단백질은 하나 이상의 α-브로모아세트아미드 기를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 따라 생성된, eTEC 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 본원에 기재된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이고, CRM197과 폴리사카라이드 사이의 eTEC 스페이서를 통한 공유결합적 연결은 폴리사카라이드의 4, 10, 15 또는 25개의 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 발생한다.
본 발명의 각각의 측면에 대해, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 본원에 기재된 사카라이드, 예컨대 이. 콜라이로부터 유래된 사카라이드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 호전시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 본원에 기재된 사카라이드를 포함하는 eTEC 연결된 당접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사카라이드는 이. 콜라이로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, eTEC 연결된 당접합체는 담체 단백질 및 사카라이드를 포함하고, 여기서 상기 사카라이드는 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함한다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187. 일부 실시양태에서, 접합체 내의 사카라이드는 n이 1 내지 1000, 5 내지 1000, 바람직하게는 31 내지 100, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65의 정수인 화학식을 포함한다.
사카라이드에 접합되는 담체 단백질 내의 리신 잔기의 수는 접합된 리신의 범위로서 특징화될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물의 일부 실시양태에서, CRM197은 사카라이드에 공유결합으로 연결된 39개 중 4 내지 16개의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이 파라미터를 표현하는 또 다른 방법은 CRM197 리신의 약 10% 내지 약 41%가 사카라이드에 공유결합으로 연결되어 있다는 것이다. 다른 실시양태에서, CRM197은 사카라이드에 공유결합으로 연결된 39개 중 2 내지 20개의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이 파라미터를 표현하는 또 다른 방법은 CRM197 리신의 약 5% 내지 약 50%가 사카라이드에 공유결합으로 연결되어 있다는 것이다.
빈번한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이고, CRM197과 폴리사카라이드 사이의 eTEC 스페이서를 통한 공유결합적 연결은 폴리사카라이드의 4, 10, 15 또는 25개의 사카라이드 반복 단위마다 적어도 1회 발생한다.
다른 실시양태에서, 접합체는 5 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 3 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 9개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 15개의 사카라이드 반복 단위마다; 2 내지 6개의 사카라이드 반복 단위마다, 3 내지 7개의 사카라이드 반복 단위마다; 4 내지 8개의 사카라이드 반복 단위마다; 6 내지 10개의 사카라이드 반복 단위마다; 7 내지 11개의 사카라이드 반복 단위마다; 8 내지 12개의 사카라이드 반복 단위마다; 9 내지 13개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 14개의 사카라이드 반복 단위마다; 10 내지 20개의 사카라이드 반복 단위마다; 또는 4 내지 25개의 사카라이드 반복 단위마다 담체 단백질과 사카라이드 사이에 적어도 하나의 공유결합적 연결을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 담체 단백질과 사카라이드 사이의 적어도 하나의 연결은 폴리사카라이드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 사카라이드 반복 단위마다 발생한다.
6. 담체 단백질
본 발명의 당접합체의 성분은 사카라이드가 접합된 담체 단백질이다. 용어 "단백질 담체" 또는 "담체 단백질" 또는 "담체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 담체 단백질은 표준 접합 절차에 따라 수정가능해야 한다.
접합체의 한 성분은 O-폴리사카라이드가 접합된 담체 단백질이다. 한 실시양태에서, 접합체는 O-폴리사카라이드의 코어 올리고사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 접합체는 O-폴리사카라이드의 O-항원에 접합된 담체 단백질을 포함한다.
용어 "단백질 담체" 또는 "담체 단백질" 또는 "담체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 담체 단백질은 표준 접합 절차에 따라 수정가능해야 한다.
바람직한 실시양태에서, 접합체의 담체 단백질은 TT, DT, DT 돌연변이체 (예컨대 CRM197), 에이치. 인플루엔자에 단백질 D, PhtX, PhtD, PhtDE 융합체 (특히 WO 01/98334 및 WO 03/54007에 기재된 것들), 해독된 뉴몰리신, PorB, N19 단백질, PspA, OMPC, 씨. 디피실레의 독소 A 또는 B 및 PsaA 중 어느 하나로부터 독립적으로 선택된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 접합체의 담체 단백질은 DT (디프테리아 톡소이드)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 접합체의 담체 단백질은 TT (파상풍 톡소이드)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 접합체의 담체 단백질은 PD (헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D - 예를 들어, EP 0 594 610 B 참조)이다. 일부 실시양태에서, 담체 단백질은 폴리(L-리신) (PLL)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 CRM197 단백질에 접합된다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 무독성 형태이지만 디프테리아 독소와 면역학적으로 구별할 수 없다. CRM197은 독소발생 코리네파지 베타의 니트로소구아니딘 돌연변이유도에 의해 생성된 비독소발생 파지 β197tox-에 의해 감염된 C. 디프테리아에에 의해 생성된다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 동일한 분자량을 갖지만 구조적 유전자의 단일 염기 변화 (구아닌에서 아데닌으로)가 이와 상이하다. 이러한 단일 염기 변화는 성숙 단백질에서 아미노산 치환 (글리신을 글루탐산으로)을 야기하고, 디프테리아 독소의 독성 특성을 제거한다. CRM197 단백질은 사카라이드에 대한 안전하고 효과적인 T-세포 의존적 담체이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 담체 단백질로서 CRM197을 포함하고, 여기서 사카라이드는 CRM197에 공유결합으로 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 당접합체의 담체 단백질은 DT (디프테리아 독소), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, CRM197 (디프테리아 독소의 무독성이지만 항원적으로 동일한 변이체), 다른 DT 돌연변이체 (예컨대 CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973), CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 또는 CRM107; 및 문헌 [Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기재된 다른 돌연변이; Glu-148에서 Asp, Gln 또는 Ser로의 및/또는 Ala 158에서 Giy로의 돌연변이 또는 결실 및 US 4709017 또는 US 4950740에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 하나 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 US 5917017 또는 US 6455673에 개시된 다른 돌연변이; 또는 US 5843711에 개시된 단편), 일부 방식으로 해독된 ply를 포함하는 폐렴쌍구균 뉴몰리신 (Kuo et al (1995) Infect lmmun 63; 2706-13), 예를 들어 dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) 또는 dPLY-formol, PhtX, 예를 들어 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE의 서열은 WO 00/37105 또는 WO 00/39299에 개시됨) 및 Pht 단백질의 융합체, 예를 들어 PhtDE 융합체, PhtBE 융합체, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/54007, WO2009/000826), OMPC (수막구균 외막 단백질 - 대개 엔. 메닝기티디스 혈청군 B로부터 추출됨 - EP0372501 ), PorB (엔. 메닝기티디스 유래), PD (헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D - 예를 들어, EP 0 594 610 B 참조), 또는 그의 면역학적 기능적 등가물, 합성 펩티드 (EP0378881, EP0427347), 열 충격 단백질 (WO 93/17712, WO 94/03208), 백일해 단백질 (WO 98/58668, EP0471 177), 시토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬 (WO 91/01146), 다양한 병원체 유래된 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (Falugi et al (2001 ) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824), 예컨대 N19 단백질 (Baraldoi et al (2004) Infect lmmun 72; 4884-7) 폐렴쌍구균 표면 단백질 PspA (WO 02/091998), 철 흡수 단백질 (WO 01/72337), 씨. 디피실레의 독소 A 또는 B (WO 00/61761), 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴쌍구균 접착 단백질 (PsaA), 재조합 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A (특히 그의 무독성 돌연변이체 (예컨대 글루탐산 553에서 치환을 보유하는 외독소 A (Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971))로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 단백질, 예컨대 오발부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)가 또한 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 다른 적합한 담체 단백질은 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 콜레라 톡소이드 (예를 들어, 국제 특허 출원 번호 WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이 LT, 이. 콜라이 ST, 및 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A를 포함한다.
일부 실시양태에서, 담체 단백질은 예를 들어, CRM197, 디프테리아 독소 단편 B (DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 또는 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A; 피. 아에루기노사의 해독된 외독소 A (EPA), 말토스 결합 단백질 (MBP), 플라젤린, 에스. 아우레우스의 해독된 헤몰리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 뉴몰리신 및 그의 해독된 변이체, 씨. 제주니(C. jejuni) AcrA, 씨. 제주니 천연 당단백질 및 연쇄상구균 C5a 펩티다제 (SCP) 중 어느 하나로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 담체 단백질은 해독된 슈도모나스 외독소 (EPA)이다. 또 다른 실시양태에서, 담체 단백질은 해독된 슈도모나스 외독소 (EPA)가 아니다. 한 실시양태에서, 담체 단백질은 플라젤린이다. 또 다른 실시양태에서, 담체 단백질은 플라젤린이 아니다.
바람직한 실시양태에서, 당접합체의 담체 단백질은 TT, DT, DT 돌연변이체 (예컨대 CRM197), 에이치. 인플루엔자에 단백질 D, PhtX, PhtD, PhtDE 융합체 (특히 WO 01/98334 및 WO 03/54007에 기재된 것들), 해독된 뉴몰리신, PorB, N19 단백질, PspA, OMPC, 씨. 디피실레의 독소 A 또는 B 및 PsaA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 DT (디프테리아 톡소이드)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 TT (파상풍 톡소이드)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 PD (헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D - 예를 들어, EP 0 594 610 B 참조)이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 캡슐형 사카라이드는 CRM197 단백질에 접합된다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 무독성 형태이지만 디프테리아 독소와 면역학적으로 구별할 수 없다. CRM197은 독소발생 코리네파지 베타의 니트로소구아니딘 돌연변이유도에 의해 생성된 비독소발생 파지 β197tox-에 의해 감염된 C. 디프테리아에에 의해 생성된다 (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 동일한 분자량을 갖지만 구조적 유전자의 단일 염기 변화 (구아닌에서 아데닌으로)가 이와 상이하다. 이러한 단일 염기 변화는 성숙 단백질에서 아미노산 치환 (글리신을 글루탐산으로)을 야기하고, 디프테리아 독소의 독성 특성을 제거한다. CRM197 단백질은 사카라이드에 대한 안전하고 효과적인 T-세포 의존적 담체이다. CRM197 및 그의 생산에 대한 추가 세부사항은 예를 들어 US 5,614,382에서 찾을 수 있다.
따라서, 빈번한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체는 담체 단백질로서 CRM197을 포함하며, 여기서 캡슐형 폴리사카라이드는 CRM197에 공유결합으로 연결된다.
추가 실시양태에서, 당접합체의 담체 단백질은 SCP (연쇄상구균 C5a 펩티다제)이다. β-용혈성 연쇄상구균의 모든 인간 분리주는 C5a를 특이적으로 불활성화시키는 고도로 보존된 세포벽 단백질 SCP (연쇄상구균 C5a 펩티다제)를 생성한다. scp 유전자는 1,134 내지 1,181개 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 코딩한다 (Brown et al., PNAS, 2005, vol. 102, no. 51 pages 18391-18396). 처음 31개 잔기는 외수송 신호 프리-시퀀스이며 세포질 막을 통해 통과시 제거된다. 다음 68개 잔기는 프로-시퀀스 역할을 하며 활성 SCP를 생산하기 위해 제거되어야 한다. 다음 10개 잔기는 프로테아제 활성의 손실 없이 제거될 수 있다. 다른 단부에는 Lys-1034로 시작하여 4개의 연속 17-잔기 모티프에 이어서, 세포 분류 및 세포벽 부착 신호가 있다. 이러한 조합된 신호는 LPTTND 서열을 함유하는 20-잔기 친수성 서열, 17-잔기 소수성 서열, 및 짧은 염기성 카르복실 말단으로 구성된다.
SCP는 도메인으로 나눌 수 있다 (문헌 [Brown et al., PNAS, 2005, vol. 102, no. 51 pages 18391-18396]의 도 1b 참조). 이들 도메인은 Pre/Pro 도메인 (외수송 신호 프리-시퀀스 (일반적으로 처음 31개 잔기) 및 프로-시퀀스 (일반적으로 다음 68개 잔기) 포함), 프로테아제 도메인 (두 부분으로 분할됨 (프로테아제 파트 1 (일반적으로 잔기 89-333/334) 및 프로테아제 도메인 파트 2 (일반적으로 잔기 467/468-583/584)), 프로테아제-연관 도메인 (PA 도메인) (일반적으로 잔기 333/334-467/468), 3개의 피브로넥틴 유형 III (Fn) 도메인 (Fn1, 일반적으로 잔기 583/584-712/713; Fn2, 일반적으로 잔기 712/713-928/929/930; 일반적으로 Fn3, 잔기 929/930-1029/1030/1031) 및 세포벽 앵커 도메인 (일반적으로 C-말단에 잔기 1029/1030/1031)이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 GBS로부터의 SCP (SCPB)이다. SCPB의 예는 WO97/26008의 서열식별번호: 3에 제공된다. 또한 WO00/34487의 서열식별번호: 3을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 GAS로부터의 SCP (SCPA)이다. SCPA의 예는 WO97/26008의 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2에서 찾을 수 있다. 또한 WO00/34487의 서열식별번호: 1, 2 및 23을 참조한다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 담체 단백질은 WO2014/136064의 서열식별번호: 150 또는 151에 제시된 바와 같은 SCP이다.
B. 아주반트
일부 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 적어도 1, 2 또는 3개의 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "아주반트"는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 항원은 주로 전달 시스템, 주로 면역 조정제로 작용하거나 둘 다의 강한 특색을 가질 수 있다. 적합한 아주반트는 인간을 포함하는 포유동물에서 사용하기에 적합한 것을 포함한다.
인간에서 사용될 수 있는 공지된 적합한 전달-시스템 유형 아주반트의 예는 명반 (예를 들어, 인산알루미늄, 황산알루미늄 또는 수산화알루미늄), 인산칼슘, 리포솜, 수중유 에멀젼, 예컨대 MF59 (4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리소르베이트 80 (Tween 80), 0.5% w/v 소르비탄 트리올레에이트 (Span 85)), 유중수 에멀젼, 예컨대 몬타니드, 및 폴리(D,L-락티드-공동-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자 또는 나노입자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 아주반트로서 알루미늄 염 (명반) (예를 들어, 인산알루미늄, 황산알루미늄 또는 수산화알루미늄)을 포함한다. 추가 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 아주반트로서 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄을 포함한다. 한 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 인산알루미늄 형태의 원소 알루미늄 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL 또는 0.2 mg/mL 내지 0.3 mg/mL를 포함한다. 한 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 인산알루미늄 형태의 원소 알루미늄 약 0.25 mg/mL를 포함한다.
인간에서 사용될 수 있는 공지된 적합한 면역 조정 유형 아주반트의 예는 아퀼라 나무의 껍질로부터의 사포닌 추출물 (QS21, Quil A), TLR4 효능제, 예컨대 MPL (모노포스포릴 지질 A), 3DMPL (3-O-탈아실화된 MPL) 또는 GLA-AQ, LT/CT 돌연변이체, 시토카인, 예컨대 다양한 인터류킨 (예를 들어, IL-2, IL-12) 또는 GM-CSF, AS01 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
인간에서 사용될 수 있는 전달 및 면역 조정 특색 둘 다를 갖는 공지된 적합한 면역 조정 유형 아주반트의 예는 ISCOMS (예를 들어, 문헌 [Sjoelander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713]; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 및 WO 2007/026190 참조), 또는 TLR4 효능제 및 수중유 에멀젼의 조합물인 GLA-EM을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
동물 실험을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수의학적 적용의 경우, 완전 프로인트 아주반트 (CFA), 프로인트 불완전 아주반트 (IFA), 에멀시겐, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-nor-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, nor-MDP로 지칭됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE로 지칭됨), 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 중 박테리아로부터 추출된 세 가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI를 사용할 수 있다.
본원에 개시된 면역원성 조성물의 유효성을 향상시키기 위한 추가 예시적인 아주반트는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: (1) 수중유 에멀젼 제형 (다른 특정 면역자극제, 예컨대 무라밀 펩티드 (하기 참조) 또는 박테리아 세포벽 성분 포함 또는 불포함), 예컨대 예를 들어 (a) 10% 스쿠알란, 0.4% Tween 80, 5% 플루로닉-차단 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, 서브마이크론 에멀젼으로 미세유동화되거나 더 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하기 위해 볼텍싱됨, 및 (b) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS)을 함유하는 RIBI™ 아주반트 시스템 (RAS), (리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem), 미국 몬태나주 해밀턴), 바람직하게는 MPL+CWS (DETOX™); (2) 사포닌 아주반트, 예컨대 QS21, 스티뮬론(STIMULON)™ (캠브릿지 바이오사이언스(Cambridge Bioscience), 미국 매사추세츠주 우스터), 아비스코(ABISCO)® (이스코노바(Isconova), 스웨덴), 또는 이소코매트릭스(ISCOMATRIX)® (커먼웰스 세럼 래보러토리즈(Commonwealth Serum Laboratories), 호주)(사용될 수 있음) 또는 이로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOM (면역자극 복합체) (ISCOMS는 추가 세제가 없을 수 있음) (예를 들어, WO 00/07621); (3) 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아주반트 (IFA); (4) 시토카인, 예컨대 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (예를 들어, WO 99/44636)), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF) 등; (5) 모노포스포릴 지질 A (MPL) 또는 3-O-탈아실화된 MPL (3dMPL) (예를 들어, GB2220211, EP0689454 참조) (예를 들어, WO 00/56358 참조); (6) 3dMPL과 예를 들어 QS21 및/또는 수중유 에멀젼의 조합 (예를 들어, EP0835318, EP0735898, EP0761231 참조); (7) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르 (예를 들어, WO 99/52549 참조); (8) 옥톡시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (예를 들어, WO 01/21207) 또는 적어도 하나의 추가 비이온성 계면활성제, 예컨대 옥톡시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제 (예를 들어, WO 01/21152); (9) 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드) (예를 들어, WO 00/62800); (10) 면역자극물질 및 금속 염의 입자 (예를 들어, WO 00/23105 참조); (11) 사포닌 및 수중유 에멀젼 (예를 들어, WO 99/11241); (12) 사포닌 (예를 들어, QS21)+3dMPL+IM2 (임의로+스테롤) (예를 들어, WO 98/57659); (13) 조성물의 효능을 향상시키는 면역자극제로 작용하는 기타 물질. 무라밀 펩티드는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-25 아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타르니닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE) 등을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 아주반트는 5.1 mg/mL QS-21, 5 mM 숙시네이트, 60 mM NaCl, 0.1% PS80, pH 5.6을 포함하는 리포솜 퀼라야 사포나리아(Quillaja Saponaria)-21 (QS21) 제형이다. 추가 실시양태에서, 아주반트는 15 mM 포스페이트 완충제, pH 6.1, 4 mg/mL 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1 mg/mL 콜레스테롤, 0.2 mg/mL MPLA (Lot 00714551-0018-2XLipoMPL)를 포함하는 리포솜 모노포스포릴 지질 A (MPLA, 합성, PHAD®, 아반티(Avanti)) 제형 (동적 광 산란에 의해 결정된 71 nm의 리포솜 입자 크기를 가짐)이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 아주반트는 15 mM 포스페이트 완충제, pH 6.1, 4 mg/mL DOPC, 1 mg/mL 콜레스테롤, 0.2 mg/mL MPLA, 및 0.2 mg/mL QS-21 (Lot 00714551-0018-2XlipoMQ)을 포함하는 리포솜 MPLA/QS21 제형 (동적 광 산란에 의해 결정된 MPLA-QS21 리포솜의 경우 75 nm의 입자 크기를 가짐)이다.
본 개시내용의 추가 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 면역원성 조성물은 아주반트로서 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 CpG 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)를 지칭하고, 따라서 이들 용어는 달리 표시되지 않는 한 상호교환가능하게 사용된다. 면역자극성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 임의로 특정 바람직한 염기 상황 내에서 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드인 하나 이상의 면역자극성 CpG 모티프를 함유한다. CpG 면역자극성 모티프의 메틸화 상태는 일반적으로 디뉴클레오티드의 시토신 잔기를 지칭한다. 적어도 하나의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스페이트 결합에 의해 3' 구아닌에 연결된 5' 메틸화되지 않은 시토신을 함유하고 Toll-유사 수용체 9 (TLR-9)에 대한 결합을 통해 면역계를 활성화시키는 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 이는 TLR9를 통해 면역계를 활성화시키지만 CpG 모티프(들)가 메틸화되지 않은 것만큼 강하지는 않을 것이다. CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 차례로 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있는 하나 이상의 회문구조를 포함할 수 있다. CpG 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 번호 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; 및 6,339,068을 포함하는 다수의 허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 기타 간행물에 기재되어 있다.
상이한 클래스의 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 식별되었다. 이들은 A, B, C 및 P 클래스로 지칭되고, WO 2010/125480의 3면 22행 내지 12면 36행에 더 자세히 기재되어 있다. 본 개시내용의 방법은 이들 상이한 클래스의 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.
V. 정제 및 생산 방법
한 측면에서, 본 개시내용은 FimH 돌연변이된 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 예를 들어, 포유동물 세포를 적합한 조건 하에 배양하여, 이에 의해 Fim H 돌연변이체 폴리펩티드를 발현하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 배양물로부터 폴리펩티드를 수확하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 공정은 폴리펩티드를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 방법은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 약 0.1 g/L 내지 0.5 g/L의 수율로 생산한다. 일부 측면에서, FimH 돌연변이된 폴리펩티드의 수율은 적어도 약 1 mg/L, 적어도 약 2 mg/L, 적어도 약 3 mg/L, 적어도 약 4 mg/L, 적어도 약 5 mg/L, 적어도 약 6 mg/L, 적어도 약 7 mg/L, 적어도 약 8 mg/L, 적어도 약 9 mg/L, 적어도 약 10 mg/L, 적어도 약 11 mg/L, 적어도 약 12 mg/L, 적어도 약 13 mg/L, 적어도 약 14 mg/L, 적어도 약 15 mg/L, 적어도 약 16 mg/L, 적어도 약 17 mg/L, 적어도 약 18 mg/L, 적어도 약 19 mg/L, 적어도 약 20 mg/L, 적어도 약 25 mg/L, 적어도 약 30 mg/L, 적어도 약 35 mg/L, 적어도 약 40 mg/L, 적어도 약 45 mg/L, 적어도 약 50 mg/L, 적어도 약 55 mg/L, 적어도 약 60 mg/L, 적어도 약 65 mg/L, 적어도 약 70 mg/L, 적어도 약 75 mg/L, 적어도 약 80 mg/L, 적어도 약 85 mg/L, 적어도 약 90 mg/L, 적어도 약 95 mg/L, 또는 적어도 약 100 mg/L이다.
일부 측면에서, 본 개시내용에 적합한 세포 배양은 유가식 배양이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유가식 배양"은 배양 프로세스의 시작 이후의 시간 또는 시간들에 추가 성분이 배양물에 제공되는 세포 배양 방법을 지칭한다. 이러한 제공된 성분은 전형적으로 배양 프로세스 동안 고갈된 세포에 대한 영양 성분을 포함한다. 유가식 배양은 전형적으로 일부 시점에서 중단되고, 배지 내의 세포 및/또는 성분이 수확되고 임의로 단리된다. 일부 측면에서, 유가식 배양은 공급 배지로 보충된 기본 배지를 포함한다.
일부 측면에서, 세포는 회분식 또는 유가식 배양으로 성장될 수 있으며, 여기서 배양은 폴리펩티드의 충분한 발현 후에 종결되고, 그 후에 발현된 폴리펩티드가 수확되고 임의로 단리된다. 일부 측면에서, 세포는 관류 배양으로 성장될 수 있으며, 여기서 배양이 종결되지 않고 새로운 영양소 및 다른 성분이 배양물에 주기적으로 또는 연속적으로 첨가되며, 그 동안 발현된 폴리펩티드가 주기적으로 또는 연속적으로 수확된다.
일부 측면에서, FimH 돌연변이체 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성은 예를 들어, 이. 콜라이 숙주 세포와 같은 박테리아 세포에서의 FimH 돌연변이체 폴리펩티드의 발현과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배만큼 증가된다.
일부 측면에서, 세포는 수 밀리리터에서 수 리터에 이르는 부피 범위의 세포 배양물을 형성하기 위해 소규모 반응 용기에서 성장될 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 세포 배양물을 형성하기 위해 대규모 상업적 생물반응기에서 성장될 수 있으며, 여기서 세포 배양물은 대략 적어도 1 리터 내지 10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000 리터 또는 그 이상의 부피, 또는 그 사이의 임의의 부피의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물 크기는 10 L 내지 5000 L, 10 L 내지 10,000 L, 10 L 내지 20,000 L, 10 L 내지 50,000 L, 40 L 내지 50,000 L, 100 L 내지 50,000 L, 500 L 내지 50,000 L, 1000 L 내지 50,000 L, 2000 L 내지 50,000 L, 3000 L 내지 50,000 L, 4000 L 내지 50,000 L, 4500 L 내지 50,000 L, 1000 L 내지 10,000 L, 1000 L 내지 20,000 L, 1000 L 내지 25,000 L, 1000 L 내지 30,000 L, 15 L 내지 2000 L, 40 L 내지 1000 L, 100 L 내지 500 L, 200 L 내지 400 L, 또는 그 사이의 임의의 정수의 범위일 수 있다.
세포 배양물의 온도는 주로 세포 배양물이 생존가능한 상태로 유지되는 온도 범위, 높은 수준의 폴리펩티드가 생성되는 온도 범위, 대사 폐기물의 생산 또는 축적이 최소화되는 온도, 및/또는 전문가가 중요한 것으로 간주하는 이들 또는 다른 인자의 임의의 조합에 기초하여 선택될 것이다. 하나의 비제한적인 예로서, CHO 세포는 잘 성장하고 대략 37℃에서 높은 수준의 단백질 또는 폴리펩티드를 생성한다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 잘 성장하고/거나 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 높은 수준의 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있지만, 본 개시내용에 의해 교시된 방법은 이들 온도에 제한되지 않는다. 특정 포유동물 세포는 잘 성장하고/거나 약 35℃ 내지 40℃의 범위 내에서 높은 수준의 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 배양물은 세포 배양 프로세스 동안 한 번 이상 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃ 또는 45℃의 온도에서 성장된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "배양물" 및 "세포 배양물"은 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건 하에 배지에 현탁된 세포 집단을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본원에서 사용된 바와 같은 이들 용어는 세포 집단 및 집단이 현탁된 배지를 포함하는 조합을 지칭한다. 일부 측면에서, 세포 배양물의 세포는 포유동물 세포를 포함한다.
일부 측면에서, 세포는 화학적으로 정의된 다양한 배지 중 하나에서 성장될 수 있으며, 여기서 배지의 성분은 공지되어 있으며 또한 제어된다. 일부 측면에서, 세포는 배지의 모든 성분이 공지 및/또는 제어되는 것은 아닌 복합 배지에서 성장될 수 있다. 포유동물 세포 배양을 위한 화학적으로 정의된 성장 배지는 지난 수십 년에 걸쳐 광범위하게 개발되고 공개되었다. 정의된 배지의 모든 성분은 잘 특징화되어 있으므로, 정의된 배지는 복합 첨가제, 예컨대 혈청 또는 가수분해물을 함유하지 않는다. 초기 배지 제형은 단백질 생산에 대한 우려가 거의 또는 전혀 없이 세포 성장 및 생존력 유지를 허용하도록 개발되었다. 보다 최근에는, 배지 제형은 세포 배양물을 생산하는 고도로 생산적인 재조합 단백질을 지원하기 위한 명시적 목적으로 개발되었다. 이러한 배지는 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직하다. 이러한 배지는 일반적으로 고밀도에서 세포의 성장 및/또는 유지를 지원하기 위해 다량의 영양소 및 특히 아미노산을 포함한다. 필요한 경우, 이들 배지는 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 통상의 기술자에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 통상의 기술자는 본원에 개시된 바와 같은 방법에서 기본 배지 또는 공급 배지로서 사용하기 위해 이들 배지에서 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및/또는 메티오닌의 양을 감소시킬 수 있다.
복합 배지의 모든 성분이 잘 특징화되는 것은 아니므로, 복합 배지는 무엇보다도 첨가제, 예컨대 단순 및/또는 복합 탄소 공급원, 단순 및/또는 복합 질소 공급원, 및 혈청을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명에 적합한 복합 배지는 본원에 기재된 바와 같은 정의된 배지의 다른 성분에 더하여 가수분해물과 같은 첨가제를 함유한다. 일부 측면에서, 정의된 배지는 전형적으로 물에 공지된 농도의 대략 50개의 화학적 실체를 포함한다. 이들 대부분은 또한 하나 이상의 잘 특징화된 단백질, 예컨대 인슐린, IGF-1, 트랜스페린 또는 BSA를 함유하지만, 다른 것들은 단백질 성분을 필요로 하지 않으므로 단백질-비함유 정의된 배지로 지칭된다. 배지의 전형적인 화학적 성분은 5가지 광범위한 범주에 속한다: 아미노산, 비타민, 무기 염, 미량 원소 및 깔끔한 범주화를 무시하는 기타 범주.
세포 배양 배지는 임의로 보충 성분으로 보충될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "보충 성분"은 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (대개 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 및/또는 글루코스 또는 기타 에너지 공급원을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 최소 비율 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 성분을 지칭한다. 일부 측면에서, 보충 성분은 초기 세포 배양물에 첨가될 수 있다. 일부 측면에서, 보충 성분은 세포 배양의 시작 후에 첨가될 수 있다. 전형적으로, 미량 원소는 마이크로몰 또는 그 이하의 수준으로 포함된 다양한 무기 염을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로 포함되는 미량 원소는 아연, 셀레늄, 구리 등이다. 일부 측면에서, 철 (제1철 또는 제2철 염)은 마이크로몰 농도로 초기 세포 배양 배지에 미량 원소로서 포함될 수 있다. 망가니즈는 또한 나노몰 내지 마이크로몰 농도의 범위로 2가 양이온 (MnCl2 또는 MnSO4)으로서 미량 원소에 빈번하게 포함된다. 수많은 덜 흔한 미량 원소는 대개 나노몰 농도로 첨가된다.
일부 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 배지는 세포 배양에서 예를 들어 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL, 1X108 세포/mL 또는 5X108 세포/mL와 같은 높은 세포 밀도를 지원하기에 적합한 배지이다. 일부 측면에서, 세포 배양은 포유동물 세포 유가식 배양, 바람직하게는 CHO 세포 유가식 배양이다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 티로신을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 트립토판을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 류신을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 세린을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 트레오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 글리신을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 류신, 세린, 트레오닌 및 글리신 중 2종을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌 및 티로신을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌 및 트립토판을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌 및 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 티로신 및 트립토판을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 티로신 및 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 트립토판 및 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 류신, 세린, 트레오닌 및 글리신 중 3종을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신 및 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 티로신, 트립토판 및 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 류신, 세린, 트레오닌 및 글리신 중 4종을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 메티오닌을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 류신, 세린, 트레오닌 및 글리신 중 5종을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 류신, 세린, 트레오닌 및 글리신 중 6종을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 류신, 세린, 트레오닌 및 글리신 중 7종을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 류신, 세린, 트레오닌 및 글리신을 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.1 내지 2 mM, 0.1 내지 1 mM, 0.5 내지 1.5 mM 또는 0.5 내지 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 아스파라긴 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13종을 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 바람직하게는 2 mM 초과의 농도로 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 아스파라긴 중 적어도 5종을 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 바람직하게는 2 mM 초과의 농도로 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 아스파라긴을 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 바람직하게는 2 mM 초과의 농도로 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 발린, 이소류신, 프롤린, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 아스파라긴 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종을 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 바람직하게는 2 mM 초과의 농도로 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 발린, 이소류신, 프롤린, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 아스파라긴 중 적어도 5종을 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 바람직하게는 2 mM 초과의 농도로 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 발린, 이소류신, 프롤린, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 및 아스파라긴을 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 바람직하게는 2 mM 초과의 농도로 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 세린을 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM, 바람직하게는 10 mM 초과의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 발린을 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM, 바람직하게는 10 mM 초과의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 시스테인을 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM, 바람직하게는 10 mM 초과의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 이소류신을 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM, 바람직하게는 10 mM 초과의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 류신을 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM, 바람직하게는 10 mM 초과의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 세포 배양 배지는 본원에 개시된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 상기 세포 배양 배지는 본원에 개시된 바와 같은 방법에서 기본 배지로서 사용된다. 일부 측면에서, 상기 세포 배양 배지는 본원에 개시된 바와 같은 방법에서 공급 배지로서 사용된다.
본 개시내용의 방법은 원하는 공정 (예를 들어, 재조합 단백질의 생산)에 적합한 임의의 세포 배양 방법과 함께 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포는 회분식 또는 유가식 배양으로 성장될 수 있으며, 여기서 배양은 재조합 단백질 (예를 들어, 항체)의 충분한 발현 후에 종결되고, 그 후에 발현된 단백질이 수확된다. 대안적으로, 또 다른 비제한적인 예로서, 세포는 회분식-재공급으로 성장될 수 있으며, 여기서 배양이 종결되지 않고 새로운 영양소 및 다른 성분이 배양물에 주기적으로 또는 연속적으로 첨가되며, 그 동안 발현된 재조합 단백질이 주기적으로 또는 연속적으로 수확된다. 다른 적합한 방법 (예를 들어, 스핀-튜브 배양)이 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다.
세포는 전문가가 선택한 임의의 편리한 부피로 성장될 수 있다. 예를 들어, 세포는 수 밀리리터에서 수 리터에 이르는 부피 범위의 소규모 반응 용기에서 성장될 수 있다. 대안적으로, 세포는 대략 적어도 1 리터 내지 10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000, 15000, 20000 또는 25000 리터 또는 그 이상의 부피, 또는 그 사이의 임의의 부피의 범위의 대규모 상업적 생물반응기에서 성장될 수 있다.
세포 배양물의 온도는 주로 세포 배양물이 생존가능한 상태로 유지되는 온도 범위, 및 높은 수준의 원하는 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질)이 생성되는 온도 범위에 기초하여 선택될 것이다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 잘 성장하고 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 원하는 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질)을 생성할 수 있지만, 본 개시내용에 의해 교시된 방법은 이들 온도에 제한되지 않는다. 특정 포유동물 세포는 잘 성장하고 약 35℃ 내지 40℃의 범위 내에서 원하는 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질 또는 항체)을 생성할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 배양물은 세포 배양 프로세스 동안 한 번 이상 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃ 또는 45℃의 온도에서 성장된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포의 특정 필요 및 전문가의 특정 생산 요구사항에 따라 세포를 성장시키는 적절한 온도 또는 온도들을 선택할 수 있을 것이다. 세포는 전문가의 필요 및 세포 자체의 요구사항에 따라 임의의 양의 시간 동안 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 37℃에서 성장된다. 일부 측면에서, 세포는 36.5℃에서 성장된다.
일부 측면에서, 세포는 전문가의 필요 및 세포 자체의 요구사항에 따라 더 많거나 더 적은 양의 시간 동안 초기 성장 단계 (또는 성장 단계) 동안 성장될 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 미리 정의된 세포 밀도를 달성하기에 충분한 기간 동안 성장된다. 일부 측면에서, 세포는 방해받지 않고 성장하도록 허용된다면 세포가 궁극적으로 도달하게 될 최대 세포 밀도의 주어진 백분율인 세포 밀도를 달성하기에 충분한 기간 동안 성장된다. 예를 들어, 세포는 최대 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 퍼센트의 원하는 생존가능한 세포 밀도를 달성하기에 충분한 기간 동안 성장될 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 세포 밀도가 배양일당 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 초과만큼 증가하지 않을 때까지 성장된다. 일부 측면에서, 세포는 세포 밀도가 배양일당 5% 초과만큼 증가하지 않을 때까지 성장된다.
일부 측면에서 세포는 정의된 기간 동안 성장하도록 허용된다. 예를 들어, 세포 배양의 시작 농도, 세포가 성장되는 온도, 및 세포의 고유 성장 속도에 따라, 세포는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 이상 동안, 바람직하게는 4 내지 10일 동안 성장될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 1개월 이상 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 본 발명의 전문가는 단백질 생산 요구사항 및 세포 자체의 필요에 따라 초기 성장 단계의 지속시간을 선택할 수 있을 것이다.
세포 배양물은 산소화 및 세포로의 영양소의 분산을 증가시키기 위해 초기 배양 단계 동안 교반되거나 진탕될 수 있다. 본 발명에 따라, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 pH, 온도, 산소화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 초기 성장 단계 동안 생물반응기의 특정 내부 조건을 제어 또는 조절하는 것이 유익할 수 있음을 이해할 것이다.
초기 성장 단계의 종료시, 배양 조건 중 적어도 하나는 제2 세트의 배양 조건이 적용되고 배양물에서 대사 이동이 일어나도록 이동될 수 있다. 대사 이동은 예를 들어, 세포 배양물의 온도, pH, 삼투몰랄농도 또는 화학적 인덕턴스 수준의 변화에 의해 성취될 수 있다. 한 비제한적인 실시양태에서, 배양 조건은 배양물의 온도를 이동시킴으로써 이동된다. 그러나, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 온도 이동이 적절한 대사 이동이 달성될 수 있는 유일한 메커니즘은 아니다. 예를 들어, 이러한 대사 이동은 또한 pH, 삼투몰랄농도 및 부티르산나트륨 수준을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 배양 조건을 이동시킴으로써 달성될 수 있다. 배양 이동의 시기는 단백질 생산 요구사항 또는 세포 자체의 필요에 기초하여 본 발명의 전문가에 의해 결정될 것이다.
배양물의 온도를 이동시킬 때, 온도 이동은 상대적으로 점진적일 수 있다. 예를 들어, 온도 변화를 완료하는데 수 시간 또는 수 일이 걸릴 수 있다. 대안적으로, 온도 이동은 상대적으로 급격할 수 있다. 예를 들어, 온도 변화는 수 시간 이내에 완료될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질의 상업적 대규모 생산에서 표준과 같은 적절한 생산 및 제어 장비가 주어지면, 온도 변화는 심지어 1시간 미만 내에 완료될 수 있다.
일부 측면에서, 일단 세포 배양의 조건이 상기 논의된 바와 같이 이동되면, 세포 배양물은 세포 배양물의 생존 및 생존력에 도움이 되고 상업적으로 적절한 수준에서 원하는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 적절한 제2 세트의 배양 조건 하에 후속 생산 단계를 위해 유지된다.
상기 논의된 바와 같이, 배양은 온도, pH, 삼투몰랄농도 및 부티르산나트륨 수준을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 배양 조건 중 하나 이상을 이동시킴으로써 이동될 수 있다. 일부 측면에서, 배양물의 온도가 이동된다. 이 실시양태에 따라, 후속 생산 단계 동안, 배양물은 초기 성장 단계의 온도 또는 온도 범위보다 낮은 온도 또는 온도 범위에서 유지된다. 상기 논의된 바와 같이, 세포 밀도 또는 생존력을 증가시키거나 재조합 단백질의 발현을 증가시키기 위해 다중 별개의 온도 이동이 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "역가"는 예를 들어 주어진 양의 배지 부피에서 세포 배양에 의해 생산된 재조합적으로 발현된 단백질의 총량을 지칭한다. 역가는 전형적으로 배지 1 리터당 단백질 그램 단위로 표현된다.
일부 측면에서, 세포 성장은 대조군 배양물과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%만큼 증가된다. 일부 측면에서, 세포 성장은 대조군 배양물과 비교하여 적어도 10%만큼 증가된다. 일부 측면에서, 세포 성장은 대조군 배양물과 비교하여 적어도 20%만큼 증가된다.
일부 측면에서, 생산성은 역가 및/또는 부피측정 생산성에 의해 결정된다.
일부 측면에서, 생산성은 역가에 의해 결정된다. 일부 측면에서, 생산성은 대조군 배양물과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%만큼 증가된다. 일부 측면에서, 생산성은 대조군 배양물과 비교하여 적어도 10%만큼 증가된다. 일부 측면에서, 생산성은 대조군 배양물과 비교하여 적어도 20%만큼 증가된다.
정제
일부 측면에서, FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 생산하는 방법은 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 발현된 폴리펩티드는 배지로 분비되고 그러므로 세포 및 기타 고체는 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 그의 단편은 가용성이다.
본원에 기재된 방법에 따라 생산된 FimH 돌연변이된 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 수확되고 임의의 적합한 방법을 사용하여 단리될 수 있으며, 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004)]). 폴리펩티드를 정제하기 위한 적합한 방법은 침전 및 다양한 유형의 크로마토그래피 (예컨대 소수성 상호작용, 이온 교환, 친화성, 킬레이트화 및 크기 배제)를 포함하며, 이들 모두는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 정제 계획은 이들 또는 다른 적합한 방법 중 2개 이상을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 중 하나 이상은 정제 또는 검출을 용이하게 하는 "태그"를 포함할 수 있다. 예로는 예를 들어, His 태그 (금속 이온에 결합, 예를 들어 헥사히스티딘), 항체, 말토스-결합 단백질 (MBP) (아밀로스에 결합), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) (글루타티온에 결합), FLAG 태그 (항-flag 항체에 결합), Strep 태그 (스트렙타비딘 또는 그의 유도체에 결합)가 포함된다. 이러한 태그부착된 폴리펩티드는 예를 들어 조건화된 배지로부터 킬레이트화 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 편리하게 단리될 수 있다. 임의로, 태그 서열은 정제 후 절단될 수 있다. 한 측면에서, FimH 돌연변이체 폴리펩티드는 정제 태그를 포함하지 않는다.
한 측면에서, FimH 돌연변이체 폴리펩티드는 먼저 세포 배양물 상청액을 수득한 후, 상청액을 한외여과 및 투석여과 방법 둘 다에 적용함으로써 단리될 수 있다. 이러한 여과 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 한외여과 및 투석여과 후, 생성된 무세포 용액은 그 다음 예를 들어, 니켈 친화성 수지를 사용하는 Ni-NTA 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계를 거친다. 이 단계 다음에는 투석이 뒤따를 수 있으며, 그 다음에는 SP 칼럼과 같은 양이온 교환 크로마토그래피가 뒤따를 수 있다. SP-세파로스 상의 정제 동안 산성 pH (예를 들어 약 6.0 미만, 약 5.5 미만, 약 5.0 미만, 약 4.5 미만, 약 4.4, 약 4.3, 약 4.2, 약 4.1 또는 약 4.0 또는 그 미만)의 사용이 특정 조건 하에 바람직할 수 있다.
이. 콜라이의 특정 균주가 본원에서 언급될 수 있지만, 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편은 특정되지 않는 한 특정 균주에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
VI. 조성물의 용도
한 측면에서, 본 개시내용은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, 이러한 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 이러한 돌연변이체를 발현하기 위한 벡터, 의약으로서 이러한 돌연변이체 또는 핵산을 포함하는 조성물의 용도, 또는 대상체에서 이. 콜라이 감염에 대한 면역 반응을 도출하거나 이. 콜라이 감염을 예방하기 위한 의약의 제조에서의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는 FimH 돌연변이체 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체, 예컨대 인간에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 도출하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 FimH 돌연변이체 폴리펩티드, FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 발현하는 벡터를 포함하는 제약 조성물, 예컨대 백신의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 이. 콜라이 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 특정 측면에서, 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 포함한다. 상기 본원에 제공된 방법의 일부 측면에서, 대상체는 인간이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 유도하거나, 또는 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대해 특이적인 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체의 생성을 유도하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 FimH 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 추가 측면에서, 대상체는 요로 감염이 발병할 위험이 있고/거나 균혈증이 발병할 위험이 있고/거나 패혈증이 발병할 위험이 있다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 도출하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서 면역 반응은 이. 콜라이에 대한 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체를 포함한다. 추가 측면에서, 면역 반응은 이. 콜라이 감염으로부터 포유동물을 보호한다.
추가 측면에서 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 호전시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법에서, 조성물은 아주반트의 투여와 함께 또는 그 없이 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체에게 투여되는 유효량은 대상체에서 이. 콜라이 항원, 예컨대 FimH 단백질에 대한 면역 반응을 도출하기에 충분한 양이다. 치료를 위해 선택될 수 있는 대상체는 이. 콜라이에 대한 노출 또는 노출 가능성 때문에, 이. 콜라이 감염이 발병할 위험이 있는 대상체, 예컨대 요로 감염이 발병할 위험이 있는 대상체, 및/또는 균혈증이 발병할 위험이 있는 대상체, 및/또는 패혈증이 발병할 위험이 있는 대상체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "대상체"는 포유동물, 바람직하게는 인간을 의미한다. 한 실시양태에서, 대상체는 요로 감염, 담낭염, 담관염, 설사, 용혈성 요독 증후군, 신생아 수막염, 요로성 패혈증, 복강내 감염, 수막염, 합병 폐렴, 상처 감염, 전립선 생검 후-관련 감염, 신생아/유아 패혈증, 호중구감소성 발열, 및 기타 혈류 감염; 폐렴, 균혈증, 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태 중 어느 하나의 위험에 있다.
본 개시내용에 의해 제공되는 조성물, 예컨대 제약 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 비제한적인 실시양태는 비경구 투여, 예컨대 피내, 근육내, 피하, 경피, 점막 또는 경구 투여를 포함한다.
1회 투여 동안 대상체에게 제공되는 조성물의 총 용량은 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이 달라질 수 있다.
하나 이상의 면역원성 조성물의 하나 이상의 부스터 투여를 제공하는 것이 또한 가능하다. 부스팅 백신접종이 수행되는 경우, 전형적으로 이러한 부스팅 백신접종은 처음으로 대상체에게 조성물을 투여한 후 1주 내지 10년, 바람직하게는 2주 내지 6개월 사이의 시점에 동일한 대상체에게 투여될 것이다 (이러한 경우에 "프라이밍 백신접종"으로 지칭됨). 대안적인 부스팅 레지멘에서, 프라이밍 백신접종 후 대상체에게 상이한 벡터, 예를 들어 하나 이상의 아데노바이러스, 또는 다른 벡터, 예컨대 앙카라의 변형된 백시니아 바이러스 (MVA), 또는 DNA, 또는 단백질을 투여하는 것이 또한 가능하다. 본 개시내용에 의해 제공되는 면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있다.
조성물의 투여량
투여량 레지멘은 최적의 원하는 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 FimH 폴리펩티드의 단일 용량이 투여될 수 있거나, 시간이 지남에 따라 여러 분할 용량이 투여될 수 있거나, 또는 상황의 긴급성에 의해 표시된 바와 같이 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있고 단일 또는 다중 용량을 포함할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여량 레지멘은 개별적 필요 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정되어야 하며, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것이 아님을 추가로 이해해야 한다.
일부 측면에서, 조성물 내의 FimH 돌연변이체 폴리펩티드의 양은 각 단백질 항원 약 10 μg 내지 약 300 μg의 범위일 수 있다. 일부 측면에서, 조성물 내의 FimH 돌연변이체 폴리펩티드의 양은 각 단백질 항원 약 20 μg 내지 약 200 μg의 범위일 수 있다.
각 용량에서 당접합체(들)의 양은 전형적인 백신에서 유의한 유해 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 특정 면역원이 사용되고 그것이 어떻게 제시되는지에 따라 달라질 것이다.
면역원성 조성물 내의 특정 당접합체의 양은 해당 접합체 (접합 및 비접합)에 대한 총 폴리사카라이드를 기준으로 계산될 수 있다. 예를 들어, 20% 유리 폴리사카라이드를 갖는 당접합체는 100 g 폴리사카라이드 용량에서 약 80 g의 접합된 폴리사카라이드 및 약 20 g의 비접합된 폴리사카라이드를 가질 것이다. 당접합체의 양은 이. 콜라이 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 사카라이드 농도는 우론산 검정에 의해 결정될 수 있다.
면역원성 조성물 내의 상이한 폴리사카라이드 성분의 "면역원성 양"은 분기될 수 있고, 각각은 약 1.0 g, 약 2.0 g, 약 3.0 g, 약 4.0 g, 약 5.0 g, 약 6.0 g, 약 7.0 g, 약 8.0 g, 약 9.0 g, 약 10.0 g, 약 15.0 g, 약 20.0 g, 약 30.0 g, 약 40.0 pg, 약 50.0 pg, 약 60.0 pg, 약 70.0 pg, 약 80.0 pg, 약 90.0 pg, 또는 약 100.0 g의 임의의 특정 폴리사카라이드 항원을 포함할 수 있다. 일반적으로, 각 용량은 주어진 혈청형에 대해 0.1 g 내지 100 g, 특히 0.5 g 내지 20 g, 더욱 특히 1 g 내지 10 g, 및 더욱 더 특히 2 g 내지 5 g의 폴리사카라이드를 포함할 것이다. 상기 범위 중 임의의 것 내의 임의의 범자연수 정수가 본 개시내용의 실시양태로서 고려된다. 한 실시양태에서, 각 용량은 주어진 혈청형에 대해 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g, 10 g, 15 g 또는 20 g의 폴리사카라이드를 포함할 것이다.
VII. 클렙시엘라 뉴모니아에로부터 유래된 사카라이드 및/또는 폴리펩티드 또는 그의 단편과의 조합
클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) (케이. 뉴모니아에(K. pneumoniae))는 요로 감염, 균혈증 및 패혈증을 야기하는 것으로 공지된 그람-음성 병원체이다. 다제-내성 케이. 뉴모니아에 감염은 위험에 있는 취약 집단에서 증가하는 사망률 원인이다. O-항원 혈청형은 전 세계적으로 침습성 질환을 야기하는 균주 중에서 고도로 유행하고, 유래된 O-항원 당접합체는 백신 항원으로서 매력적이다.
한 측면에서, 본원에 개시된 임의의 조성물은 O1 (및 d-Gal-III 변이체), O2 (및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로부터 선택된 적어도 하나의 케이. 뉴모니아에 혈청형이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 I 핌브리아 단백질로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편; 또는 케이. 뉴모니아에 유형 III 핌브리아 단백질로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편; 또는 이들의 조합으로부터 선택된 케이. 뉴모니아에로부터 유래된 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 케이. 뉴모니아에 O1 및 O2 O-항원 및 이들의 상응하는 v1 및 v2 하위유형은 이들의 반복 단위의 구조가 상이한 중합체성 갈락탄이다. 케이. 뉴모니아에 O1 및 O2 항원은 단독중합체 갈락토스 단위 (또는 갈락탄)를 함유한다. 케이. 뉴모니아에 O1 및 O2 항원은 각각 D-갈락탄 I 단위 (때때로 O2a 반복 단위로 지칭됨)를 함유하지만, O1 항원은 O1 항원이 D-갈락탄 II 캡 구조를 갖는다는 점에서 상이하다. D-갈락탄 III (d-Gal-III)은 D-갈락탄 I의 변이체이다. 2개의 별개의 혈청형 O2 하위유형인 O2v1 및 O2v2를 정의하는 기본 갈락탄 I 및 III의 구조; 및 하위유형 O1v1 및 O1v2를 생성하는 갈락탄 II에 의한 캡핑으로 인한 유래된 키메라의 구조는 문헌 [Kelly SD, et al. J Biol Chem 2019; 294:10863-76]; 및 [Clarke BR, et al. J Biol Chem 2018; 293:4666-79]에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O1로부터 유래된 사카라이드는 [→3)-β-D-Galf -(1→3)-α-D-Galp-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O1로부터 유래된 사카라이드는 [→3)-α-D- Galp-(1→3)- β-D-Galp-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O1로부터 유래된 사카라이드는 [→3)-β-D-Galf -(1→3)-α-D-Galp-(1→]의 반복 단위, 및 [→3)-α-D- Galp-(1→3)- β-D-Galp-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O1로부터 유래된 사카라이드는 [→3)-β-D-Galf -(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-(1→]의 반복 단위를 포함한다 (D-Gal-III 반복 단위로 지칭됨). (Kol O., et al. (1992) Carbohydr. Res. 236, 339-344; Whitfield C., et al. (1991) J. Bacteriol. 173, 1420-1431).
일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O2로부터 유래된 사카라이드는 [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galf-(1→]의 반복 단위를 포함한다 (케이. 뉴모니아에 혈청형 O2a 항원의 요소일 수 있음). 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O2로부터 유래된 사카라이드는 [→3)-β-D-GlcpNAc-(1→5)-β-D-Galf-(1→]의 반복 단위를 포함한다 (케이. 뉴모니아에 혈청형 O2c 항원의 요소일 수 있음). 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O2로부터 유래된 사카라이드는 (1→4)-연결 Galp 잔기의 측쇄 부가에 의한 O2a 반복 단위의 변형을 포함한다 (케이. 뉴모니아에 O2afg 항원의 요소일 수 있음). 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O2로부터 유래된 사카라이드는 (1→2)-연결 Galp 잔기의 측쇄 부가에 의한 O2a 반복 단위의 변형을 포함한다 (케이. 뉴모니아에 O2aeh 항원의 요소일 수 있음). (Whitfield C., et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 4913-4919).
메커니즘 또는 이론에 얽매이지 않고, 케이. 뉴모니아에 혈청형 O3 및 O5의 O-항원 폴리사카라이드 구조는 각각 이. 콜라이 혈청형 O9a (화학식 O9a) 및 O8 (화학식 O8)의 구조와 동일한 것으로 관련 기술분야에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O4로부터 유래된 사카라이드는 [→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]의 반복 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O7로부터 유래된 사카라이드는 [→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf- (1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O8 혈청형으로부터 유래된 사카라이드는 케이. 뉴모니아에 O2a와 동일한 반복 단위 구조를 포함하지만, 비화학양론적으로 O-아세틸화된다. 일부 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에 O12 혈청형으로부터 유래된 사카라이드는 [α-Rhap-(1 →3)-β-GlcpNAc] 디사카라이드 반복 단위의 반복 단위를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 이. 콜라이 FimH로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편; 및 O1 (및 d-Gal-III 변이체), O2 (및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로부터 선택된 적어도 하나의 케이. 뉴모니아에 혈청형이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 혈청형 O1, O2, O3 및 O5 중 하나 이상, 또는 이들의 조합이거나 이로부터 유래된 사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 혈청형 O1, O2, O3 및 O5 각각이거나 이로부터 유래된 사카라이드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 O1 (및 d-Gal-III 변이체), O2 (및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로부터 선택된 적어도 하나의 케이. 뉴모니아에 혈청형이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 및 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하는 조성물을 포함한다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187, 여기서 n은 1 내지 100의 정수이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 혈청형 O1, O2, O3 및 O5 중 하나 이상, 또는 이들의 조합이거나 이로부터 유래된 사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 혈청형 O1, O2, O3 및 O5 각각이거나 이로부터 유래된 사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 O9를 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O3으로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 O8을 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O5로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이. 콜라이 FimH로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편; O1 (및 d-Gal-III 변이체), O2 (및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로부터 선택된 적어도 하나의 케이. 뉴모니아에 혈청형이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 및 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 갖는 사카라이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90의 정수이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 O9를 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O3으로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 O8을 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O5로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 O1, O2, O3 및 O5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 케이. 뉴모니아에 유형으로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 O1로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다. 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v1 (O1v1) 또는 하위유형 v2 (O1v2)로부터 선택된다. 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v1 (O1v1) 및 하위유형 v2 (O1v2)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 O2로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다. 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v1 (O2v1) 또는 하위유형 v2 (O2v2)로부터 선택된다. 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v1 (O2v1) 및 하위유형 v2 (O2v2)로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: a) 혈청형 O1 하위유형 v1 (O1v1), b) 혈청형 O1 하위유형 v2 (O1v2), c) 혈청형 O2 하위유형 v1 (O2v1), 및 d) 혈청형 O2 하위유형 v2 (O2v2). 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v1 (O1v1)이다. 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v2 (O1v2)이다. 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v1 (O2v1)이다. 이 실시양태의 한 측면에서, 케이. 뉴모니아에 O-항원은 하위유형 v2 (O2v2)이다. 이 실시양태의 또 다른 측면에서, 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 케이. 뉴모니아에 O-항원을 포함한다: a) 혈청형 O1 하위유형 v1 (O1v1), b) 혈청형 O1 하위유형 v2 (O1v2), c) 혈청형 O2 하위유형 v1 (O2v1), 및 d) 혈청형 O2 하위유형 v2 (O2v2). 일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에로부터 유래된 사카라이드의 조합을 포함하며, 여기서 제1 사카라이드는 O1, O2, O3 및 O5로 이루어진 군으로부터 선택된 케이. 뉴모니아에 유형 중 어느 하나로부터 유래되고; 제2 사카라이드는 O1 (및 d-Gal-III 변이체), O2 (및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로 이루어진 군으로부터 선택된 케이. 뉴모니아에 유형 중 어느 하나로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 O1로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드 및 케이. 뉴모니아에 유형 O2로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 케이. 뉴모니아에로부터 유래된 사카라이드는 담체 단백질에 접합되고; 이. 콜라이로부터 유래된 사카라이드는 담체 단백질에 접합된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이. 콜라이 FimH로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편; 및 O1, O2, O3 및 O5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 케이. 뉴모니아에 유형으로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함하는 조성물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 O1, O2, O3 및 O5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 케이. 뉴모니아에 유형으로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 및 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 갖는 이. 콜라이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187. 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 O9를 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O3으로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 O8을 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O5로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 O1로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 및 화학식 O8 및 화학식 O9로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 이. 콜라이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 O2로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 및 화학식 O8 및 화학식 O9로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 이. 콜라이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 O1로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 케이. 뉴모니아에 유형 O2로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 및 화학식 O8 및 화학식 O9로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 이. 콜라이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 이. 콜라이 혈청형 O8 또는 O9로부터의 적어도 하나의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 케이. 뉴모니아에에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 케이. 뉴모니아에 혈청형 O5 또는 O3으로부터의 당접합체를 포함하지 않는다. 한 측면에서, 조성물은 화학식 O8을 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O5로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 조성물은 화학식 O9를 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 케이. 뉴모니아에 혈청형 O3으로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 케이. 뉴모니아에 혈청형 O5 또는 O3으로부터의 적어도 하나의 당접합체, 또는 그의 변이체를 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 이. 콜라이 혈청형 O8 또는 O9로부터의 당접합체를 포함하지 않는다. 한 측면에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 혈청형 O5로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 화학식 O8을 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 혈청형 O3으로부터 유래된 사카라이드를 포함하고 화학식 O9를 갖는 이. 콜라이 O-항원으로부터 유래된 사카라이드를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 O1 (및 d-Gal-III 변이체), O2 (및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로부터 선택된 적어도 하나의 케이. 뉴모니아에 혈청형이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 화학식 O8 및 화학식 O9로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 이. 콜라이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 O1 (및 d-Gal-III 변이체), O2 (및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로부터 선택된 적어도 하나의 케이. 뉴모니아에 혈청형이거나 이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드; 화학식 O1A, 화학식 O1B, 화학식 O2, 화학식 O6 및 화학식 O25B로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 이. 콜라이로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 케이. 뉴모니아에 유형 I 핌브리아 단백질로부터 유래된 폴리펩티드로부터 선택된 케이. 뉴모니아에로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편; 또는 케이. 뉴모니아에 유형 III 핌브리아 단백질로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 상기 폴리펩티드의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
VIII. 나노입자
또 다른 측면에서, 1) 나노구조; 및 2) 적어도 하나의 핌브리아 폴리펩티드 항원 또는 그의 단편을 포함하는 면역원성 복합체가 본원에 개시되어 있다. 바람직하게는, 핌브리아 폴리펩티드 또는 그의 단편은 이. 콜라이 핌브리아 H (fimH)로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 핌브리아 폴리펩티드는 상기 기재된 핌브리아 폴리펩티드 중 어느 하나로부터 선택된다. 예를 들어, 핌브리아 폴리펩티드는 서열식별번호: 1-65로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원은 표시된 에피토프에 대한 적응 면역 반응의 발생을 자극하기 위해 나노구조 외부에 융합되거나 접합된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 복합체는 외부에 부착되고/거나 케이지 내부에 캡슐화되어 각 병원체에 대해 생성된 면역 반응의 유형을 맞추는 것을 돕도록 아주반트 또는 다른 면역조정 화합물을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노구조는 복수의 동일한 제1 나노구조-관련 폴리펩티드를 포함하는 단일 어셈블리를 포함한다.
대안적인 실시양태에서, 나노구조는 복수의 동일한 제1 나노구조-관련 폴리펩티드를 포함하는 복수의 어셈블리 및 복수의 제2 어셈블리를 포함하며, 각각의 제2 어셈블리는 복수의 동일한 제2 나노구조-관련 폴리펩티드를 포함한다.
다양한 나노구조 플랫폼이 본원에 기재된 면역원성 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용된 나노구조는 단일 서브유닛의 다중 카피에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 사용된 나노구조는 다중 상이한 서브유닛의 다중 카피에 의해 형성된다.
나노구조는 전형적으로 공-유사 모양이고/거나 회전 대칭 (예를 들어, 3-폴드 및 5-폴드 축을 가짐), 예를 들어 본원에 예시된 20면체 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원은 페리틴 (FR), E2p, Qβ 및 I3-01로부터 유래된 자기-어셈블리 나노구조와 같은 자기-어셈블리 나노입자 상에 제시된다. E2p는 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 디히드로리포일 아실트랜스퍼라제의 재설계된 변이체이다. I3-01은 초안정한 나노입자로 자기-어셈블리할 수 있는 조작된 단백질이다. 이들 단백질의 서브유닛의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 제1 측면에서, 서열식별번호: 66-105로 이루어진 군으로부터 선택된 나노구조-관련 폴리펩티드의 아미노산 서열과 그의 길이에 걸쳐 적어도 75% 동일하고 적어도 하나의 식별된 계면 위치에서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 나노구조-관련 폴리펩티드가 본원에 개시되어 있다. 나노구조-관련 폴리펩티드는 예를 들어 나노구조를 제조하는데 사용될 수 있다. 나노구조-관련 폴리펩티드는 쌍으로 자기-어셈블리하여 나노구조, 예컨대 20면체 나노구조를 형성하는 이들의 능력을 위해 설계되었다.
일부 실시양태에서, 나노구조는 하기를 포함한다: (a) 복수의 제1 어셈블리, 각각의 제1 어셈블리는 복수의 동일한 제1 나노구조-관련 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 나노구조-관련 폴리펩티드는 서열식별번호: 66-105로 이루어진 군으로부터 선택된 나노구조-관련 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함함; 및 (b) 복수의 제2 어셈블리, 각각의 제2 어셈블리는 복수의 동일한 제2 나노구조-관련 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제2 나노구조-관련 폴리펩티드는 서열식별번호: 66-105로 이루어진 군으로부터 선택된 나노구조-관련 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 제2 나노구조-관련 폴리펩티드는 제1 나노구조-관련 폴리펩티드와 상이하고; 여기서 복수의 제1 어셈블리는 복수의 제2 어셈블리와 비공유결합으로 상호작용하여 나노구조를 형성함.
나노구조는 20면체 대칭을 갖는 것과 같은 나노구조로 제1 어셈블리 및 제2 어셈블리를 배향시키는, 대칭적으로 반복되는, 비천연, 비공유결합적 폴리펩티드-폴리펩티드 계면을 포함한다.
서열식별번호: 66-105는 예시적인 나노구조-관련 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제공한다. 서열식별번호: 66-105의 예시적인 나노구조-관련 폴리펩티드에 대한 계면 잔기의 수는 4-13개 잔기의 범위이다. 다양한 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는 서열식별번호: 66-105로 이루어진 군으로부터 선택된 나노구조-관련 폴리펩티드의 아미노산 서열과 그의 길이에 걸쳐 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 식별된 계면 위치 (주어진 나노구조-관련 폴리펩티드에 대한 계면 잔기의 수에 따라)에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는 서열식별번호: 66-105로 이루어진 군으로부터 선택된 나노구조-관련 폴리펩티드의 아미노산 서열과 그의 길이에 걸쳐 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고 적어도 식별된 계면 위치의 20%, 25%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 100%에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는 서열식별번호: 66-105로 이루어진 군으로부터 선택된 나노구조-관련 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 나노구조-관련 폴리펩티드를 포함한다.
한 비제한적인 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는 관심 "카고"에 대한 공유결합적 연결을 용이하게 하도록 변형될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는, 나노구조-관련 폴리펩티드의 나노구조가 스캐폴드를 제공하여 개선된 면역 반응을 생성하기 위한 백신으로서 전달하기 위한 많은 수의 항원을 제공하도록, 하나 이상의 관심 항원에 대한 연결을 용이하게 하도록 변형될 수 있다 (예컨대 정의된 위치에서 다양한 시스테인 잔기의 도입에 의해).
일부 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드에 존재하지만 접합에 사용되도록 의도되지 않은 일부 또는 모든 천연 시스테인 잔기는 정의된 위치에서 접합을 용이하게 하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 또 다른 비제한적인 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는 "엔도솜 탈출"을 용이하게 하는 것을 돕기 위해 모이어티와의 연결 (공유결합적 또는 비공유결합적)에 의해 변형될 수 있다. 표적화된 전달과 같이 관심 분자를 표적 세포에 전달하는 것을 포함하는 적용의 경우, 중요한 단계는 엔도솜 (세포로 전달 비히클의 진입 지점인 막-결합 소기관)으로부터의 탈출일 수 있다. 엔도솜은 리소좀으로 성숙하여 이들의 내용물을 분해한다. 그러므로, 전달 비히클이 리소좀이 되기 전에 엔도솜으로부터 어떻게든 "탈출"하지 않으면, 이는 분해되어 그의 기능을 수행하지 못할 것이다. 엔도솜을 파괴하고 시토졸로의 탈출을 허용하는 다양한 지질 또는 유기 중합체가 있다. 그러므로, 이 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는 예를 들어 이러한 지질 또는 유기 중합체의 단량체 또는 생성된 어셈블리 표면으로의 화학적 접합을 허용할 시스테인 잔기를 도입함으로써 변형될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 나노구조-관련 폴리펩티드는 예를 들어 형광단의 화학적 접합을 허용할 시스테인 잔기 또는 시험관내 또는 생체내 나노구조의 시각화를 허용하는 다른 영상화제를 도입함으로써 변형될 수 있다.
나노구조-관련 폴리펩티드 상의 표면 아미노산 잔기는 단백질 서브유닛 또는 어셈블리된 나노구조의 안정성 또는 용해성을 개선시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 나노구조-관련 폴리펩티드가 존재하는 단백질 패밀리에 대해 유의한 서열 상동성을 갖는 경우, 해당 패밀리로부터의 다른 단백질의 다중 서열 정렬은 단백질 안정성 및/또는 용해성을 증가시킬 수 있는 비-보존된 위치에서 아미노산 돌연변이의 선택을 가이드하기 위해 사용될 수 있으며, 이 프로세스는 컨센서스 단백질 설계로 지칭된다 (9).
나노구조-관련 폴리펩티드 상의 표면 아미노산 잔기는 단백질 표면에 전체 양전하 또는 전체 음전하를 부여하기 위해 양으로 하전된 (Arg, Lys) 또는 음으로 하전된 (Asp, Glu) 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 한 비제한적인 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드 상의 표면 아미노산 잔기는 자기-어셈블리 나노구조의 내부 표면에 높은 순 전하를 부여하도록 돌연변이될 수 있다. 그 후, 이러한 나노구조는 나노구조 내부 표면과 카고 분자 사이의 정전기적 상호작용으로 인해 반대 순 전하를 갖는 카고 분자를 패키지 또는 캡슐화하는데 사용될 수 있다. 한 비제한적인 실시양태에서, 나노구조-관련 폴리펩티드 상의 표면 아미노산 잔기는 자기-어셈블리 나노구조의 내부 표면에 순 양전하를 부여하기 위해 주로 아르기닌 또는 리신 잔기로 돌연변이될 수 있다. 그 후, 나노구조-관련 폴리펩티드를 함유하는 용액은 자기-어셈블리 나노구조 내부의 핵산을 캡슐화하기 위해 핵산 카고 분자, 예컨대 dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA, cDNA, miRNA., siRNA, shRNA, piRNA, 또는 기타 핵산의 존재 하에 혼합될 수 있다. 이러한 나노구조는 예를 들어 핵산을 보호, 전달 또는 농축하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 나노구조는 20면체 대칭을 갖는다. 이 실시양태에서, 나노구조는 제1 나노구조-관련 폴리펩티드의 60개 카피 및 제2 나노구조-관련 폴리펩티드의 60개 카피를 포함할 수 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, 각각의 제1 어셈블리 내의 동일한 제1 나노구조-관련 폴리펩티드의 수는 각각의 제2 어셈블리 내의 동일한 제2 나노구조-관련 폴리펩티드의 수와 상이하다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 나노구조는 12개의 제1 어셈블리 및 20개의 제2 어셈블리를 포함하고; 이 실시양태에서, 각각의 제1 어셈블리는 예를 들어 동일한 제1 나노구조-관련 폴리펩티드의 5개 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 어셈블리는 예를 들어 동일한 제2 나노구조-관련 폴리펩티드의 3개 카피를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 나노구조는 12개의 제1 어셈블리 및 30개의 제2 어셈블리를 포함하고; 이 실시양태에서, 각각의 제1 어셈블리는 예를 들어 동일한 제1 나노구조-관련 폴리펩티드의 5개 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 어셈블리는 예를 들어 동일한 제2 나노구조-관련 폴리펩티드의 2개 카피를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 나노구조는 20개의 제1 어셈블리 및 30개의 제2 어셈블리를 포함하고; 이 실시양태에서, 각각의 제1 어셈블리는 예를 들어 동일한 제1 나노구조-관련 폴리펩티드의 3개 카피를 포함할 수 있고, 각각의 제2 어셈블리는 예를 들어 동일한 제2 나노구조-관련 폴리펩티드의 2개 카피를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 모두는 규칙적인 20면체 대칭을 갖는 합성 나노물질을 형성할 수 있다.
실시예
본 개시내용이 더 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 항원 설계
FimHLD 또는 FimH-DSG의 돌연변이는 기능적 면역원성을 개선시키기 위한 목적으로 개방형 입체형태로 FimH 렉틴 도메인을 잠그도록 설계되었다. 돌연변이는 하기 표 2-9에 기재된 상이한 클래스의 것이었다. 다양한 돌연변이된 FimH 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열은 표 1에 나타내었다.
표 2: UTI 임상 분리주에서 흔한 자연 발생 아미노산 치환의 도입을 포함하는 야생형 FimHLD 구축물
표 3: FimHLD의 리간드 결합 부위에서의 치환
표 4: FimHLD에서의 글리신 스위치 돌연변이
표 5: FimHLD에서의 디술피드 결합 안정화를 위한 시스테인 쌍
표 6: FimHLD에서의 비극성에서-극성으로의 돌연변이
표 7: FimH-DSG의 필린-렉틴 계면에서의 공동-충전 돌연변이
표 8: FimHLD에서의 대표적인 돌연변이의 조합
표 9: FimH-DSG에서의 대표적인 돌연변이의 조합
실시예 2: 항원 발현 및 정제
FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체를 코딩하는 DNA를 마우스 IgK 신호 펩티드를 함유하는 pcDNA3.1에 클로닝하고, 이전에 기재된 바와 같이 Expi293™ 세포에서 발현하였다 (PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429, 2021년 5월 6일 공개). 단백질 특징화 및 면역원성 연구를 위해, PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429 (2021년 5월 6일 공개)에 기재된 바와 같이 니켈 친화성 수지 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 단리하였다.
실시예 3: 형광 편광 검정
만노시드 리간드에 대한 FimH 돌연변이체의 해리 상수를 결정하기 위해, FimH에 대해 높은 친화성을 갖는 만노시드 리간드에 접합된 플루오레세인을 사용하여 문헌 [Rabbani et al. (J. Biol. Chem. 293:1835-1849 (2018))]에 기재된 방법에 기초하여 형광 편광 검정을 개발하였다. FimH 단백질을 50 μL의 최종 부피로 검은색 평평한 바닥 96-웰 폴리프로필렌 플레이트 (그라이너(Greiner))에서 11-포인트 3배 적정으로 20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05 mg/mL + BSA 0.05%에서 희석하였다. 동일한 완충액 중 0.7 nM의 플루오레세인 옥틸바이페닐만노피라노시드 리간드 50 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 100 rpm에서 진탕하면서 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 20-24시간 후, 플레이트를 488 nm에서 플루오레세인 여기 및 530 nm에서 방출로 클라리오스타(ClarioStar) 플러스 플레이트 판독기에서 판독하였다.
실시예 4: 열 안정성 검정 (써모플루오르(ThermoFluor) 검정)
APO (결합되지 않은) 형태에서 및 리간드의 존재 하에 단리된 단백질의 용융 온도를 결정하기 위해, SYPRO 오렌지를 사용한 384-웰 열 안정성 검정을 개발하였다. FimH (만노스)의 천연 리간드를 모방한 만노시드 화합물 (메틸 α-D-만노피라노시드 (Sigma M6882))을 사용하여 단백질에 대한 회합을 분석하였다. 단백질을 40 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl (검정 완충액)에 4 μM로 희석함으로써 FimH 단백질 스톡 용액을 제조하고; SYPRO 오렌지 염료 (인비트로젠 S6650)를 검정 완충액에 1:10 희석하였다. 4 μM FimH 돌연변이체 (5 μL)를 1:10 SYPRO 오렌지 염료 (0.1μL)와 혼합하고, 검정 완충액 또는 리간드를 마이크로앰프 엔듀라플레이트 옵티칼(MicroAmp EnduraPlate Optical) 384-웰 플레이트 (어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 4483285)에서 10 μL 최종 반응 부피에 대해 검정 완충액 (5 μL)에 희석하였다. 플레이트를, 0.05℃/초로 20℃에서 98℃까지 해리 프로토콜을 사용하여 콴트스튜디오 5 실시간 PCR 시스템 (써모피셔)에서 용융 곡선 분석에 적용하였다. TAMRA는 표적 및 리포터로서, ROX는 수동 참조 (그러나 어떤 분석에도 사용되지 않음)로서 특정되었다. 데이터를 맥스웰-볼츠만 분포로서 플로팅하였으며, 온도 (20℃에서 98℃까지)는 X-축에 및 TAMRA 채널로부터의 형광은 Y-축에 차트로 표시하였다 (각 온도 포인트는 TAMRA 리포터에 대한 특정 형광 여기 값이 할당되는 용융 곡선 동안 판독됨). 웰과 샘플 간의 형광 강도를 균등화하기 위해 정규화 알고리즘을 확립하여, 형광의 Y-축을 0 (형광 없음)에서 1 (가장 높은 기록된 형광)까지의 척도로 플레이트마다 비교할 수 있었다. 이 방정식은 아래 나타내었다. 마이크로소프트 엑셀 (하기 참조)의 검색 기능을 사용하여, 0.5 (단백질의 대략 절반이 해리됨을 나타냄)의 상대적 형광 (정규화 후) 값을 기록하였으며, 이는 특정 온도와 상관관계가 있다. 그러므로, 이 온도, 즉 단백질의 취한 용융 온도 (Tm)를 계산하였다. 용융 온도의 이동 (ΔTm)은 apo 조건에서 단백질 + 리간드의 Tm을 차감하여 계산하였다. 마이크로소프트 엑셀의 피벗 테이블을 사용하여 플레이트 레이아웃으로부터 Tm을 구조화하였다.
TAMRA 형광 신호를 정규화하기 위한 방정식:
정규화 값 (0 내지 1) =
원시 형광 값 - 전체 웰로부터의 최소 형광 값 (20℃에서 98℃까지)
전체 웰로부터의 최대 형광 값 - 전체 웰로부터의 최소 형광 값
Tm을 식별하기 위한 엑셀 검색 기능 (0.5 정규화된 형광, 또는 50% 단백질 용융):
= LOOKUP (0.5, 정규화된 형광 값의 시작 : 값의 끝, $ 온도 값의 시작 : $ 값의 끝)
실시예 5: FimH-특이적 중화 모노클로날 항체를 사용한 FimH 돌연변이체의 입체형태 상태의 확인
중화 모노클로날 항체 299-3, 304-1 및 440-2 (사내 개발)를 사용하여 FimH 돌연변이체의 입체형태 상태를 확인하였으며; 229-3 및 304-1은 MAb 475 및 926과 유사한 에피토프에 결합하는 반면 (Kisiela, D. I. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 19089-19094 (2013)), 440-2는 상이한 에피토프를 인식하고 개방형 입체형태 상태의 FimHLD에 우선적으로 결합하는 것으로 보인다. 야생형과 유사한 구조적 완전성을 유지하는 변이체는 모든 항체에 결합할 것으로 예상된다. 포르테바이오(ForteBio)로부터의 옥텟(Octet) HTX는 각 돌연변이체와의 항체 반응성을 측정하기 위한 모든 역학 실시간 생체분자 상호작용 실험을 위해 사용되었다. 실험을 웰당 240 μL를 함유하는 96-웰 검은색 플레이트에서 1000 rpm 교반으로 30℃에서 수행하였다. Ni-NTA 바이오센서는 0.5% BSA 및 0.05% Tween 20을 함유하는 1x PBS 완충액 (PBT)을 함유하는 완충액에서 평형화된 후, 5분 동안 5 μg/mL에서 His-태그부착된 FimH 돌연변이체 단백질을 로딩하도록 허용하였다. FimH 로딩된 바이오센서는 3분 동안 PBT에서 기준선을 재확립하도록 허용한 후, 5분 동안 5 μg/mL에서 상이한 빈(bin)으로부터의 항체와 회합하도록 허용하였다. 옥텟 데이터 분석 소프트웨어는 회합 단계의 역학 분석을 위해 사용되었으며, 반응 (nm 이동)을 수득하였다 (표 작성).
실시예 6: 원형 이색성 분광법
자스코 PTC-424S/15 (자스코(Jasco)) 온도 제어 및 이소템프(Isotemp) 수조 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 유닛이 장착된 자스코 J-810 분광편광계 (자스코)를 사용하여 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체에 대해 원자외선 (320-250 nm) 및 근자외선 (260-200 nm) 원형 이색성 스펙트럼을 기록하였다. 원자외선의 경우 1 mm 셀을 사용하고, 근자외선의 경우 10 mm 셀을 사용하였다. 단백질을 PBS에서 0.3 mg/mL로 희석하고, 1 mm (원자외선) 또는 10 mm (근자외선) 경로 길이를 갖는 셀을 사용하여 20℃에서 스펙트럼을 기록하였다. 스캔을 100 nm/분으로 수행하고, DIT를 1s로 설정하고, 대역폭을 3s로 설정하고, 데이터 피치를 0.1 nm로 설정하였다. 민감도를 표준으로 설정하였다. 근자외선 측정의 경우 10개의 스펙트럼을 축적하고 평균화하였으며, 원자외선 측정의 경우 5개의 스펙트럼을 각각 축적하고 평균화하였다. 스펙트럼은 블랭크 PBS 실행에서 발생하는 CD 스펙트럼을 사용하여 수동으로 배경으로 수정하였고, EQ. 1을 사용하여 평균 잔기 타원율로 변환하였다. 여기서, θMRE는 계산된 평균 잔기 타원율이고, θEXP는 실험적으로 측정된 CD 신호이고, MW는 단백질 분자량이고, N은 아미노산 잔기의 수이고, C는 단백질 농도 (mg/mL)이고, l은 광학 경로 길이 (cm)이다.
EQ. 1
실시예 7: 동물 면역원성 연구 EC-1678
6-8주령 CD-1 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 얻었다. 각 그룹에 대해, 20마리의 동물을 5 mM 숙시네이트, 60 mM NaCl, 0.1% PS80, pH 5.6을 함유하는 5.1 mg/mL QS-21 스톡 용액으로부터 20 μg 퀼라야 사포나리아-21 (QS-21)과 혼합된 10 μg FimH 단백질로 0, 4 및 8주에 피하로 면역화하였다.
실시예 8: FimH 전체 세포 중화 검정
만노실화된 기질에 대한 핌브리아된 이. 콜라이의 결합을 억제하는 백신접종된 동물로부터의 혈청의 능력을 평가하기 위해, PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429 (2021년 5월 6일 공개)에 기재된 바와 같이 효모 만난을 사용한 전체 세포 중화 검정을 사용하였다.
실시예 9: CHO 세포로부터 FimH-DSG WT 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체의 정제
단백질을 C-말단 His 태그를 갖는 분비된 단백질로서 CHO 세포에서 발현하였다. 세포 배양물 상청액을 수확하고, 1 M Tris pH 7.4 및 5 M NaCl을 각각 20 mM 최종 농도 및 150 mM 최종 농도로 첨가하였다. 5 kDa TFF 카세트 완충액을 헹구고, 500 mM NaCl 및 40 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM Tris pH 7.5에서 평형화하였다. 상청액을 2배 농축하고, 6 부피의 20 mM Tris pH 7.5 500 mM NaCl 40 mM 이미다졸에 대해 투석여과하였다. 체류물을 수집하고, 50-100 mL의 20 mM Tris pH 7.5 500 mM NaCl 40 mM 이미다졸로 헹구었다. 체류물을 여과하고, 0.2 μm 보틀탑 필터로 헹구었다. XK26/20 칼럼을 Ni-세파로스 6 패스트 플로우 수지 (씨티바 라이프 사이언시스(Cytiva Life Sciences))로 패킹하고, 5 칼럼 부피의 20 mM Tris pH 7.5 500 mM NaCl 40 mM 이미다졸로 평형화하였다. 체류물을 유속의 절반으로 적용하고, 안정한 기준선에 도달할 때까지 (대략 55 칼럼 부피) 세척하였다. 결합된 단백질을 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 7.5로 용리하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 2개의 완충액 변화로 4℃에서 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.3에 대해 2 kDa 투석 카세트에서 투석하였다. 동일한 완충액으로 평형화된 SP-세파로스 양이온 교환 칼럼 (씨티바 라이프 사이언시스)에 단백질을 적용하였다. 양이온-교환 수지에 결합된 물질을 20 mM 아세트산나트륨, pH 4.3, 1 M NaCl 완충액을 사용하여 선형 구배의 NaCl로 용리하였다. 분획을 풀링하고, TBS, pH 7.4에 대해 투석하였다.
실시예 10: FimH-DSG WT 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
25℃에서 10 mM EDTA를 함유하는 TBS, pH 7.4 완충액에서 워터스(Waters) X 브릿지 단백질 BEH SEC 125Å 2.5 μm, 4.6 x 300 mm 칼럼을 사용하여 분석용 SEC를 수행하였다. 주입 부피는 10 μl이고 유속은 0.5 mL/분이었다.
실시예 11: 펄스된 전류측정 검출을 사용한 높은 pH 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC-PAD)에 의한 모노사카라이드 분석
FimH-DSG 야생형 및 FimH-DSG 삼중 돌연변이체 (G15A, G16A, V27A)의 수성 샘플을 2N 트리플루오로아세트산에서 120℃에서 2시간 동안 소화시켰다. 이 시간 후 샘플을 6시간 동안 45℃에서 진공 하에 증발 건조시켰다. 샘플을 Milli-Q H2O에서 재구성하고, 다이오넥스(DIONEX) ICS 3000 이온 크로마토그래피 시스템에서 HPAEC-PAD에 의해 평가하였다. 다이오넥스 카보팩(Dionex CarboPac) PA1 칼럼 (4 x 250 mm)은 H2O 및 200 mM NaOH의 혼합물을 사용하는 등용매 용리와 함께 사용되었다. FimH 샘플에서 검출된 피크의 체류 시간을 공지된 모노사카라이드 표준의 용액과 비교함으로써 모노사카라이드 조성을 확인하였다.
실시예 12: FimH-DSG WT 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체에 결합하는 O-항원 당 모이어티의 검출
포르테바이오로부터의 옥텟 HTX는 FimH-DSG WT 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체와의 가능한 O-항원 상호작용을 측정하기 위한 모든 역학 실시간 생체분자 상호작용 실험을 위해 사용되었다. 실험을 웰당 240 μl를 함유하는 96-웰 검은색 플레이트에서 1000 rpm 교반으로 30℃에서 수행하였다. Ni-NTA 바이오센서는 0.5% BSA 및 0.05% Tween 20을 함유하는 1x PBS 완충액 (PBT)을 함유하는 완충액에서 평형화된 후, 5분 동안 5 μg/ml에서 His-태그부착된 FimH-DSG WT 또는 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체를 로딩하도록 허용하였다. FimH-DSG WT 또는 FimH-DSG G15A G16A V27A-로딩된 바이오센서는 3분 동안 PBT에서 기준선을 재확립하도록 허용한 후, O-항원 폴리사카라이드 CRM 접합체, O9 또는 O25b 또는 O1a 또는 O2의 2배 적정 (200 - 3.125 μg/ml)으로 로딩하도록 허용하였다. 어떤 폴리사카라이드도 없는 항원 로딩된 바이오센서를 참조로서 사용하였다. FimH 및 O-항원 적정 로딩된 바이오센서를 3분 동안 PBT에 침지하여 새로운 기준선을 확립하였다. 돌연변이체에 결합하는 O-항원의 검출을 5분 동안 5 μg/mL O-항원 특이적 mAb와의 회합 단계에서 시험하였다 (O9의 경우 MAb 601, O25b의 경우 MAb ECO-80-11, O1a의 경우 MAb ECO-48-2 및 O2의 경우 MAb ECO-172-13). 옥텟 데이터 분석 소프트웨어는 참조 차감된 회합 단계의 역학 분석을 위해 사용되었으며, 반응 (nm 이동)을 수득하였다 (표 작성).
실시예 13: 단백질 발현 및 정제
FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체를 Expi293 세포에서 발현하고, 니켈 친화성 포획에 의해, 이어서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 상청액으로부터 단리하였다. 일부 돌연변이체는 불량한 발현 수준을 가졌고, 생화학적 또는 생물물리학적 평가로 진행되지 않았다는 점에 유의한다 (예를 들어 FimHLD P26C V35C, N33C P157C, N33C L109C, V35C L107C, V35C L109C, S113C T158C). 충분한 수율이 수득될 수 있는 돌연변이체를 열 안정성 및 리간드 결합 검정에서 평가하였다.
실시예 14: 만노시드 리간드의 존재 하에 개선된 열 안정성 및 용융 온도의 감소된 이동을 갖는 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체의 식별
FimH 돌연변이체 단백질의 용융 온도를 SYPRO 오렌지 열 이동-기반 시차 주사 형광측정법 검정을 사용하여 결정하였으며, 여기서 Tm은 단백질의 50%가 언폴딩되는 온도를 명명한다. 비공유결합적 리간드는 종종 특이적 결합 시 단백질 표적을 안정화시켜 단백질 용융 온도의 증가를 초래한다. 따라서, 알파-D-만노스의 유도체이고 FimH에 대한 마이크로몰 친화성을 갖는 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에 용융 온도를 결정하였으며 (Bouckaert, J. et al. Mol Microbiol. 55, 441-455 (2005)), apo 형태에 비해 리간드의 존재 하에 단백질의 용융 온도의 차이 (ΔTm)를 계산하였다.
야생형 (WT) FimH-DSG 단백질은 FimHLD WT와 비교하여 유의하게 더 높은 용융 온도를 나타내었고, 리간드의 존재 하에 더 낮은 ΔTm을 가졌다 (표 10, 표 11). FimH-DSG WT는 71.66℃의 용융 온도를 가진 반면, FimHLD WT의 용융 온도는 유의하게 더 낮았다 (61.54℃). 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에, FimHLD WT의 용융 온도는 10.99℃만큼 이동한 반면, 리간드의 존재 하에 FimH-DSG에 대한 온도는 오직 2.13℃만큼 이동하였다. 이는 FimHLD가 FimH-DSG에 의한 감소된 리간드 결합을 반영할 수 있는 FimH-DSG와 비교하여 리간드에 의해 더 효율적으로 안정화됨을 시사한다.
돌연변이는 apo 상태에서 및 리간드의 존재 하에 FimH 단백질의 용융 온도에 영향을 미쳤다. 이전에 기재된 FimHLD 잠금 돌연변이체 V27C L34C (Kisiela, D. I. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 19089-19094 (2013); Rodriguez, V. B. et al. J Biol Chem 288, 24128-24139 (2013))는 야생형 FimHLD (61.54℃)와 비교하여 더 낮은 용융 온도 (51.42℃)를 나타내었으며, 이는 공개된 데이터와 일치하였다 (Kisiela, D. I. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 19089-19094 (2013); Rodriguez, V. B. et al. J Biol Chem 288, 24128-24139 (2013)). 메틸 알파-D-만노피라노시드와 FimHLD V27C L34C의 인큐베이션은 용융 온도를 apo 형태와 비교하여 7.27℃만큼 증가시켰으며, 이는 이 돌연변이체가 리간드에 의해 부분적으로 안정화되고 잔류 리간드 결합 효율을 가질 수 있음을 시사한다. FimH-DSG의 맥락에서, V27C L34C 돌연변이체는 WT와 비교하여 덜 열안정하고 (Tm = 63.29℃), 리간드의 존재 하에 온도 이동은 WT와 비교하여 V27C L34C 돌연변이체에서 약간 감소되었다 (ΔTm = 1.29℃). 6개의 Phe1 FimHLD 돌연변이체 중 5개는 유사한 용융 온도를 갖는 F1L을 제외하고 WT FimHLD와 비교하여 감소된 용융 온도를 가졌다. 리간드의 존재 하에, 6개의 FimHLD Phe1 돌연변이체 중 4개는 작은 ΔTm을 나타내었으며, 이는 리간드에 의한 불량한 안정화를 시사한다. 대조적으로, 가장 보존적인 아미노산 치환 F1W 및 F1Y는 Phe1 야생형 FimHLD에 비해 각각 중간 및 필적할만한 ΔTm 값을 나타내었다. 전반적인 열 안정성과 관련하여, R60P 참조 돌연변이 (이전에 기재됨 - Rabbani et al. J. Biol. Chem. 293:1835-1849 (2018); Rodriguez, V. B. et al. J Biol Chem 288, 24128-24139 (2013)) 및 사내 설계된 여러 신규 돌연변이는 V27C L34C에 비해 유의하게 증가된 용융 온도를 가졌다. 흥미롭게도, FimHLD V28C N33C (부위 둘 다는 모두 참조 FimHLD V27C L34C로부터 1개 잔기만 이동됨)는 임의의 FimHLD 돌연변이체의 가장 높은 용융 온도를 가졌고 (Tm = 65.77℃), 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에 2.81℃의 ΔTm을 가졌으며, 이는 리간드에 대한 감소된 친화성을 시사한다. FimHLD의 글리신 루프 영역 (G15A, G16A)의 돌연변이는 V27C L34C에 비해 열 안정성을 유의하게 증가시켰고, 리간드의 존재 하에 용융 온도의 매우 낮은 이동이 관찰되었다. 글리신 루프 돌연변이는 또한 FimH-DSG의 열 안정성을 약간 증가시켰고, 리간드에서 온도 이동이 관찰되지 않았으며, 함께 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체가 리간드에 의해 안정화되지 않으며 따라서 야생형에 비해 감소된 결합 효율을 가질 수 있음을 시사한다.
FimHLD WT의 서열은 이. 콜라이 UTI 분리주 J96으로부터 유래된다 (Hull, R.A. et al., Infect Immun 33, 933-938 (1981)). V27A는 유독성 UTI 분리주 및 크론병과 연관된 분리주와 연관된 천연 변이체이다 (Schwartz, D.J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, 15530-15537 (2013); Cespedes et al., Front Microbiol 8:639 (2017)). V27A의 FimHLD로의 혼입은 FimHLD WT의 용융 온도를 약간 감소시켰으며, WT와 비교하여 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에 V27A에서 더 작은 이동이 관찰되었다. 한편, V27A는 FimHLD에서 글리신 루프 돌연변이체 G15A, G16A, G15P, G16P의 맥락에서 안정화 효과를 갖는 것으로 나타났으며, 이들은 모두 이 돌연변이가 없는 경우와 비교하여 V27A에서 더 높은 용융 온도를 가졌고, 이 돌연변이가 없는 경우 최대 6.05℃ (G16P)와 비교하여 V27A의 존재 하에 <2℃의 ΔTm을 가졌다. 또한, V27A를 함유하는 FimH-DSG 돌연변이체는 약간 증가된 열 안정성을 가졌고, 리간드의 존재 하에 검출가능한 온도 이동이 없었다. 함께, 이는 V27A가 FimH의 용융 온도에 대한 안정화 효과를 갖고 리간드 결합 효율을 감소시킨다는 것을 시사한다.
여러 FimHLD 디술피드 및 비극성에서 극성으로의 잔기 돌연변이체는 낮은 수준으로 발현되었고 열안정성이 불량하거나 만노시드 화합물의 존재 하에 유의한 온도 이동을 나타내었으며, 이는 이들이 리간드 결합 효율을 유지함을 시사한다 (표 12). 이들을 단일 복제에서 시험하였으며 추가 분석으로부터 배제하였다. 유사하게, 여러 다른 FimH-DSG 돌연변이체의 열 안정성을 분석하였으며, 그 중 2개는 리간드에서 개선된 열 안정성 및 감소된 이동을 가졌다 (FimH-DSG V27A Q133K 및 FimH-DSG G15A G16A V27A Q133K) (표 13). Q133K 돌연변이는 이전에 기재된 리간드 결합을 제거하는 FimH의 결합 포켓의 돌연변이이다 (Schwartz et al., Proc Natl Acad Sci USA 110:15530-15537 (2013)). 이들 돌연변이체는 더 이상 분석되지 않았다.
표 10: apo 상태에서 및 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에 FimHLD 돌연변이체의 용융 온도
표 11: apo 상태에서 및 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에 FimH-DSG 돌연변이체의 용융 온도
표 12: apo 상태에서 및 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에 FimHLD 돌연변이체의 용융 온도, 단일 복제
표 13: apo 상태에서 및 메틸 알파-D-만노피라노시드의 존재 하에 FimH-DSG 돌연변이체의 용융 온도, 제한된 복제
실시예 15: 만노시드 리간드에 대한 감소된 친화성을 갖는 FimH 돌연변이체의 식별
만노시드 리간드에 대한 FimH 돌연변이체의 해리 상수 (Kd)는 플루오레세인-접합 옥틸바이페닐만노피라노시드 (BPMP) 리간드를 사용한 직접 결합 형광 편광 검정을 사용하여 결정하였다. WT 대비 FimHLD 돌연변이체의 Kd 값은 표 14에 나타내었다. FimHLD WT 및 V27A는 BPMP에 대해 유사한 높은 친화성을 나타내었다. 참조 잠금 돌연변이체 FimHLD V27C L34C (Kisiela, D. I. et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, 19089-19094 (2013); Rodriguez, V.V. et al., J Biol Chem 288:24128-24139 (2013))는 FimHLD WT에 비해 리간드에 대한 91배 더 낮은 친화성을 가졌지만, FimHLD R60P V27A (Rabbani et al., J Biol Chem 293:1835-1849 (2018))는 179배 더 낮은 친화성을 가졌다. 본원에 개시된 돌연변이체를 참조 잠금 돌연변이체와 비교하였다. 글리신 루프 돌연변이체 FimHLD G15A V27A, G15P V27A, G16P V27A 및 G16A G16A V27A의 경우 결합이 검출되지 않은 반면, G16A V27A는 WT에 비해 Kd의 156배 증가를 가졌다. V27A와 조합된 글리신 루프 돌연변이는 모두 글리신 루프 돌연변이체 단독보다 유의하게 더 높은 Kd를 나타내었으며, 이는 V27A가 FimHLD WT의 Kd에 거의 영향을 미치지 않았지만 불확실한 안정화 효과를 갖는다는 것을 시사한다. V27A의 포함은 또한 FimHLD R60P의 결합 친화성을 추가로 감소시켰다.
3개의 신규 디술피드 잠금 돌연변이체를 이 검정에서 시험하였으며, 이들 모두는 FimHLD WT에 비해 리간드 결합 친화성의 약간 감소를 가졌다 (33 내지 43배 더 낮은 친화성). 비극성에서 극성으로의 돌연변이를 함유하는 FimHLD 돌연변이체 (A119T V27A, A119N V27A, L34T V27A, L34N V27A)는 FimHLD WT와 유사하게 BPMP에 대한 높은 친화성을 가졌다. FimHLD F1 돌연변이체는 FimHLD WT와 유사한 결합 친화성을 갖는 F1Y를 제외하고 불량한 결합을 나타내었다.
FimH-DSG 구축물의 리간드 결합 친화성은 표 15에 나타내었다. FimH-DSG WT의 Kd는 FimHLD WT의 Kd보다 100배 이상 더 높았으며, 이는 마찬가지로 FimH의 두 가지 형태의 상이한 입체형태 상태를 반영한다. FimH-DSG V27A는 또한 FimH-DSG WT에 비해 더 낮은 친화성을 가졌다. 이는 FimC 및 FimG와의 복합체에서 A27을 갖는 전장 FimH가 FimH V27에 비해 만노시드에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여주는 이전 데이터와 일치한다 (Schwartz et al., Proc Natl Acad Sci USA 110:15530-15537 (2013)). 잠금 돌연변이 V27C L34C의 FimH-DSG로의 도입은 BPMP에 대한 친화성을 2.5배 감소시킨 반면, 글리신 루프 돌연변이체 FimH-DSG G15A G16A V27A는 FimH-DSG WT에 비해 28배 더 낮은 친화성을 가졌다. FimH-DSG G15A V27A 및 FimH-DSG G16A V27A에 대해 Kd를 계산할 수 없었으며, 이는 이들 돌연변이체가 BPMP에 결합할 수 없음을 시사한다. 필린-렉틴 도메인 계면 (A115I, V185I)의 변경을 통해 개방형 입체형태에서 FimH-DSG를 안정화시키도록 설계된 돌연변이는 열 안정성 데이터로부터 시사된 바와 같이 FimH-DSG WT에 비해 결합 친화성을 개선시켰다 (실시예 14).
요약하면, FimHLD 또는 FimH-DSG 단백질의 글리신 루프 돌연변이는 BPMP에 대한 매우 낮은 결합 친화성을 갖는 것으로 확인되었다. 이들 및 열 안정성 데이터에 기초하여, 마우스의 기능적 면역원성 연구에서 평가를 위해 글리신 돌연변이체를 선택하였다.
표 14: 옥틸바이페닐만노피라노시드 리간드에 대한 FimHLD 돌연변이체의 결합 Kd
표 15: 옥틸바이페닐만노피라노시드 리간드에 대한 FimH-DSG 돌연변이체의 결합 Kd
실시예 16: 원형 이색성 분광법에 의한 FimH 돌연변이체의 입체형태 상태의 확인
개선된 열 안정성 및 만노시드 리간드에 대한 감소된 결합 친화성을 나타낸 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체 (실시예 14 및 15)는 원형 이색성 (CD)에 의한 2차 및 3차 구조 분석을 거쳤다. 야생형 및 입체형태적으로 잠긴 FimHLD 돌연변이체는 별개의 3차 CD 프로파일을 갖는다 (Rabbani et al., J Biol Chem 293:1835-1849 (2018)). 선택된 FimHLD 및 FimH-DSG 야생형 및 돌연변이체 단백질의 2차 및 3차 구조를 원자외선 CD (2차 구조) 및 근자외선 CD (3차 구조)에 의해 검사하였다 (도 1 참조). FimHLD의 원자외선 CD 스펙트럼은 이전에 공개된 데이터와 일치하고 (Rabbani et al. J Biol Chem 293:1835-1849 (2018)), FimHLD 및 FimH-DSG 둘 다의 원자외선 스펙트럼은 높은 베타-시트 함량을 갖는 단백질의 특징이다. FimHLD V27C L34C는 개방형 입체형태 상태를 반영하는 다른 사람들 (Rabbani et al. J Biol Chem 293:1835-1849 (2018))에 의해 관찰된 바와 같이 야생형 FimHLD와 비교하여 약간 상이한 원자외선 스펙트럼을 가졌다. 자연 발생 FimHLD V27A 돌연변이체의 2차 구조 프로파일은 또한 다소 다양하였다. 전반적으로, FimHLD 또는 FimH-DSG 돌연변이체의 2차 구조는 야생형 단백질과 고도로 유사하며 (도 1), 이는 이들 돌연변이체에서 전체 2차 구조가 변경되지 않음을 시사한다. FimHLD 돌연변이체의 3차 구조 프로파일은 FimHLD V27 L34C 및 V27A R60P의 사내 및 공개된 CD 스펙트럼과 매우 유사하며, 이는 개방형 입체형태 상태에서 안정화된다 (Rabbani et al. J Biol Chem 293:1835-1849 (2018)). 여기에 기재된 돌연변이체의 프로파일은 또한 야생형 FimHLD 또는 FimHLD V27A와 비교하여 유의하게 상이하다. 함께, 이들 데이터는 도입된 돌연변이가 FimHLD의 입체형태를 개방형 입체형태로 이동시키는 반면, FimH-DSG 3차 구조는 본원에서 평가된 입체형태 안정화 돌연변이의 도입시 크게 변하지 않은 상태로 남아있음을 시사한다.
실시예 17: 중화 모노클로날 항체를 사용한 FimH 돌연변이체의 특징화
여러 선택된 FimH 항원의 입체형태는 렉틴 도메인-특이적 모노클로날 항체 299-3, 304-1 및 440-2를 사용한 생물층 간섭계 검정에 의해 특징화되었다. 경쟁 실험 (나타내지 않음)은 항체 229-3 및 304-1이 MAb 475 및 926과 유사한 리간드 결합 부위 에피토프에 결합함을 입증하였다 (Kisiela et al., Proc Natl Acad Sci USA 110:19089-19094 (2013)). 모노클로날 항체 440-2는 상이한 에피토프에 결합하고 개방형 입체형태에서 FimHLD에 우선적으로 결합하는 것으로 보인다. 항체 229-3 및 304-1은 모든 FimHLD (표 16) 및 FimH-DSG (표 17) 변이체를 인식할 수 있었지만, FimHLD V27A에 대해 결합이 감소하였다. 대조적으로, 항체 440-2에 대한 반응은 WT 또는 V27A에 비해 모든 FimHLD 또는 FimH-DSG 돌연변이체에서 더 높았다. 이는 도 1에 표시된 CD 분광법 프로파일과 일치하며, 이는 FimHLD 돌연변이체가 개방형 입체형태임을 시사한다. 440-2에 대한 반응은 또한 FimH-DSG WT에서 증가하였으며, 이는 FimH-DSG 돌연변이체 및 WT의 중복되는 CD 분광법 프로파일 (실시예 16)과 조합하여 이 단백질이 안정화 돌연변이의 존재 또는 부재에 관계없이 개방형 입체형태 상태에 있음을 시사한다.
표 16: FimHLD 변이체에 대한 MAb 결합
표 17: FimH-DSG 변이체에 대한 MAb 결합
실시예 18: FimH 돌연변이체 중화 데이터
선택된 돌연변이체의 상대적 면역원성을 평가하기 위해, 마우스를 FimH 돌연변이체로 백신접종하였다. 기능적 항체 역가를 도출하는 FimH 돌연변이체의 효력을 상기 및 이전에 기재된 전체 세포 효모 만난 중화 검정을 사용하여 정량화하였다 (PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429, 2021년 5월 6일 공개). 간단히 말해서, 핌브리아된 이. 콜라이를 혈청과 함께 인큐베이션하고, 효모 만난 코팅된 미세역가 플레이트에 결합하도록 허용하였다. 플레이트를 세척하고, 플레이트에 결합된 생존가능한 이. 콜라이의 수를 발광 프로브를 사용하여 검출하였다. 효모 만난에 대한 핌브리아된 박테리아의 결합을 억제하는 혈청 중화 역가는 백신접종된 마우스로부터의 혈청의 8-포인트 2배 희석 시리즈로부터 결정하였다. 역가는 박테리아의 50%가 플레이트에 결합된 상태로 유지되는 혈청 희석의 역수를 나타낸다. 평균 역가 및 반응의 요약은 표 18에 나타내었다. 용량후 2 및 3에서의 개별 마우스 IC50 반응의 플롯은 도 2 및 도 3에 나타내었다.
표 18: VAC-2020-PRL-EC-1678 FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체 효모 만난 결합 중화 검정 반응자 비율 및 GMT
이전 작업 (PCT 국제 공개 번호 WO2021/084429, 2021년 5월 6일 공개)은 이전에 기재된 디술피드 잠금 돌연변이체 FimHLD V27C L34C (Kisiela et al., Proc Natl Acad Sci USA 110:19089-19094 (2013))가 FimHLD WT에 비해 기능적 면역원성을 개선시키지 않았음을 나타내었다. 신규 FimHLD 돌연변이체 및 또 다른 이전에 기재된 입체형태적으로 구속된 돌연변이체 FimHLD V27A R60P (Rabbani et al., J Biol Chem 293:1835-1849 (2018))의 기능적 면역원성은 도 2에서 직접 비교된다. 돌연변이체 FimHLD G16A V27A, FimHLD G15A G16A V27A 및 FimHLD V27A R60P는 FimHLD WT보다 더 많은 수의 반응자 및 더 높은 역가 (p 값 <0.05)를 산출하였다. 다른 돌연변이 (G15A V27A, G16P V27A, V28C N33C)는 기능적 면역원성을 유의하게 향상시키지 않았지만, 반응하지 않은 마우스에 대해 높은 역가가 관찰되었으며, 이들 그룹의 반응자의 수는 FimHLD WT 그룹의 반응자의 수와 유사하였다. 그러므로, 개방형 입체형태에서 FimHLD 잠금에 의해 FimHLD의 기능적 면역원성을 향상시키도록 설계된 여러 돌연변이체는 FimHLD WT에 비해 기능적 면역원성을 개선시켰다. FimHLD 및 FimH-DSG 돌연변이체의 2회 용량으로 백신접종 후, FimHLD와 비교하여 FimH-DSG로 백신접종된 그룹에서 유의하게 더 많은 동물이 중화 역가를 나타내었다 (도 3). 이러한 경향은 용량후 3에서 지속되었으며, 여기서 FimH-DSG V27A, FimH-DSG G15A V27A 및 FimH-DSG G15A G16A V27A로 백신접종된 그룹에서 마우스의 95%-100%가 반응하였다. IC50 기하 평균 역가 (GMT)는 또한 용량후 3에서 FimH-DSG 돌연변이체로 백신접종된 모든 그룹에서 유의하게 더 높았다. 유사한 FimH-DSG 돌연변이체 (V27A, G15A V27A, G15A G16A V27A)는 FimHLD 돌연변이체에 비해 더 높은 GMT를 생성하였다 (<0.05의 p 값).
실시예 19: FimH-DSG G15A G16A V27A는 숙주 글리칸에 결합하지 않고 균질성으로 단리될 수 있다
FimH-DSG WT 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체 단백질을 C-말단 His 태그를 함유하는 분비된 단백질로서 CHO 세포에서 발현하였다. FimH-DSG의 재조합 His-태그부착된 형태의 정제를 도 4에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
한외여과 및 투석여과 후, FimH-DSG WT를 함유하는 무세포 배양 배지를 니켈 친화성 수지 상에서 단리하고, 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하였다. 용리된 피크는 다소 넓었고 여러 독특한 숄더를 나타내었으며, 이는 FimH-DSG WT 종의 가능한 이질성을 시사한다 (도 5). 흥미롭게도, 용리된 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였을 때, FimH-DSG WT에 상응하는 단일 밴드만이 각 분획에서 검출되었다.
정제 공정 동안, FimH-DSG는 불량한 용해성을 갖는다는 것을 시사하는 특성을 나타내었다. 특히, FimH-DSG WT Ni-세파로스 용리액은 육안 검사에 의해 항상 흐릿하게 보였다. SP-세파로스 상의 후속 정제를 위해 산성 pH (4.3)로의 이동은 단백질 용액의 청징화를 초래하였다. 그러나, FimH-DSG WT 제제의 불량한 용해성 및 응집에 대한 경향은 단리된 단백질의 TBS, pH 7.4로의 이동 (투석) 후에 다시 관찰되었다. 이는 응집 및 침전으로 인한 단백질의 점진적인 손실을 초래하였다. 이 시점에서 단백질 농도가 전형적으로 0.2 - 0.4 mg/mL로 감소되더라도 원심분리에 의한 침전물의 제거는 응집 공정을 종결시키거나 늦추지 않았다. 응집으로 인한 단백질의 손실은 저장 (TBS, pH 7.4) 완충액에 혼입된 10% 글리세롤의 존재 하에 제어될 수 있었다. 그러나, 글리세롤의 존재는 350 nm에서 광 산란을 모니터링함으로써 분광광도계로 검출된 HMW 가용성 응집물의 형성을 방지하지 않았다.
동일한 프로세스를 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체의 단리에 활용하였을 때, 여러 차이점이 관찰되었다. 첫째, 이들은 Ni-세파로스 칼럼으로부터 단백질의 용리시 흐릿함의 어떠한 징후도 없다는 것을 포함한다. 둘째, SP-세파로스 칼럼 피크로부터 용리된 프로파일은 WT FimH-DSG에서 관찰된 것만큼 넓지 않았다 (도 6). 그리고 최종적으로, FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체는 생리학적 pH 완충액 (TBS pH 7.4)으로 이동 후 완전히 가용성 상태를 유지하였다. 최대 5 - 6 mg/mL의 농도에서, FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체는 응집 또는 침전의 어떠한 징후도 나타내지 않았다.
단리된 FimH-DSG WT 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체의 분석은 FimH-DSG의 이들 2개 변이체 사이의 독특한 차이점을 추가로 밝혀내었다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체가 그의 분자량과 일치하는 체류 시간을 갖는 단일 피크로서 용리되었음을 입증하였다. 대조적으로, 야생형 FimH-DSG의 용리 프로파일은 주요 피크의 체류 시간이 도 7에 나타낸 돌연변이체의 체류 시간보다 짧은 여러 피크로 구성되었다. 이들 데이터는 FimH-DSG WT가 SEC에 의해 검출가능한 높은 분자 질량 복합체를 형성한다는 것을 명백히 입증한다. FimH-DSG WT에 의해 형성된 HMW 복합체의 존재 및 응집 경향은 그의 N-말단 렉틴-결합 도메인의 기능적 활성과 연결될 수 있었다. 본 발명자들은 CHO 발효 동안 및 배양 배지로의 분비시 FimH-DSG WT가 숙주 CHO 세포의 표면으로부터 방출된 글리칸 분자(들)에 결합한다고 가정하였다. 글리칸의 분지형 성질로 인해, FimH-DSG 분자의 1개 초과의 카피가 각 글리칸에 의해 수용될 수 있었다. FimH-DSG의 수의 증가에 의한 글리칸의 연속적인 "데코레이션"은 다양한 HMW 복합체의 형성을 초래하고, 궁극적으로 용해성 및 침전의 손실을 유발하였다 (도 8 참조). 이 가설을 시험하기 위해, 단리된 야생형 및 돌연변이체 FimH-DSG (및 FimHLD) 종을 펄스된 전류측정 (전기화학적) 검출 (HPAEC-PAD) 분석과 함께 고 pH 음이온-교환 크로마토그래피에 적용하였다. 이 방법은 단백질 샘플 내의 올리고사카라이드 또는 글리칸의 식별 뿐만 아니라 이들 올리고사카라이드의 조성에 대한 정보의 제공을 허용한다. 간단히 말해서, 산 가수분해를 수행하여 모노사카라이드를 방출한 후, 모노사카라이드 표준에 비해 피크를 분석하였다. HPAEC-PAD 분석의 결과는 단리된 FimH-DSG WT (글리코실화된) 및 FimHLD (글리코실화되지 않음, 데이터는 나타내지 않음) 제제가 유의한 양의 모노사카라이드를 함유한다는 것을 밝혀내었다. FimH-DSG WT 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체 내의 식별된 모노사카라이드의 요약은 표 19에 나타내었다. FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체 내의 모노사카라이드 함량은 FimH-DSG WT의 모노사카라이드 함량보다 유의하게 더 적었다. 또한, 검출된 낮은 모노사카라이드 함량이 N235를 변형시킬 것으로 예측된 N-글리칸의 당 모이어티를 나타낸다는 것이 전적으로 가능하다.
표 19: FimH-DSG WT로부터의 다양한 SP-세파로스 분획 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체의 주요 피크에서 HPAEC-PAD에 의해 검출된 모노사카라이드의 정규화된 양 (μg/mg 단백질)
실시예 20: FimHLD 및 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체는 이. 콜라이 O-항원에 결합하지 않는다
이. 콜라이 O-항원 O8 및 O9의 반복 단위는 폴리만노스 잔기로 구성된다. 이는 FimH가 FimH-O-항원 접합체 조합 백신에서 O-항원 접합체에 결합할 수 있는지 여부에 대한 질문을 제기하였다. 생물층 간섭계 실험은 FimHLD WT가 유리 O9 폴리사카라이드 또는 CRM-접합 O9 폴리사카라이드에 결합할 수 있는지 여부, 및 결합 검정에서 만노시드 리간드에 대해 검출불가능한 친화성을 갖는 것으로 나타난 FimHLD G15A G16A V27A 돌연변이체가 결합할 수 있는지 여부를 시험하기 위해 설계되었다. O-항원 결합 데이터는 표 20에 나타내었다. 유리 폴리사카라이드의 높은 농도에서, FimHLD WT에서 반응이 관찰되었다. CRM-접합 폴리사카라이드에서 더 높은 반응이 관찰되었다. 그러나, 검출가능한 결합은 돌연변이체 단백질 FimHLD G15A G16A V27A로 제거되었다. 유사한 실험이 FimH-DSG에 대해 설정되었으며, 여기서 상이한 혈청형 (O9, O25b, O1a 및 O2)의 유리 또는 CRM-접합 O-항원에 결합하는 FimH-DSG WT 또는 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체의 능력을 시험하였다 (표 21). 이들의 만노시드 리간드 결합 특성으로부터 예상되는 바와 같이, FimH-DSG WT의 전체 결합 친화성은 상응하는 FimHLD 변이체보다 유의하게 더 낮았다. CRM 접합체의 가장 높은 농도에서, FimH-DSG WT에서 일부 적정가능한 결합이 관찰되었으며, 유리 폴리사카라이드에 대해 보이는 결합의 배경 수준보다 약간만 더 높았다. FimHLD G15A G16A V27A 돌연변이체에서와 같이, FimH-DSG G15A G16A V27A 단백질은 유리 또는 CRM-접합 폴리사카라이드에 결합하지 않았다. 결론적으로, 모 WT FimHLD 또는 WT FimH-DSG 항원과 달리, 유래된 G15A G16A V27A 돌연변이체는 O-항원에 결합하지 못하여, 조합된 FimH 및 O-항원 백신의 개발을 위한 잠재적인 경로를 제공한다.
표 20: FimHLD G15A G16A V27A 돌연변이체는 유리 또는 CRM-접합 O-항원 O9 폴리사카라이드에 결합하지 않는다
표 21: FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체는 유리 또는 CRM-접합 O-항원 폴리사카라이드에 결합하지 않는다
실시예 21: O-항원과 함께 및 그 없이 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체로 백신접종된 비인간 영장류
A. 방법
1. FimH IgG dLIA
스펙트럼으로 구별되는 MagPlex-C 미소구체 (루미넥스)에 커플링된 이. 콜라이 돌연변이체 핌브리아 항원 FimH-DSG G15A G16A V27A를 검정 1차 인큐베이션 직전에 진탕하면서 실온에서 1-2시간 동안 농도 50,000 비드/mL로 차단 완충액에서 희석하였다. 희석된 미소구체 혼합물을 2-8℃에서 밤새 인큐베이션을 위해 진탕하면서 적절하게 희석된 비인간 영장류 혈청 샘플, 대조군 및 참조 표준, FimH-DSG의 필린 도메인에 결합하는 인간화 사내 모노클로날 항체 (FimH Y202)를 함유하는 검정 플레이트에 첨가하였다. 결합되지 않은 성분을 세척한 후, 정제된 R-피코에리트린 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 109-116-170)를 미소구체 혼합물에 첨가하고, 90분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 루미넥스 FLEXMAP 3D 판독기에 의해 측정된 형광 PE 신호의 크기는 단백질 커플링된 미소구체에 결합된 항-FimH-DSG IgG의 양에 정비례한다. 표준 곡선의 log/log 선형 회귀 모델을 사용하여 중위수 형광 강도로부터 항원-특이적 항체 농도 (μg/mL)를 내삽하는 맞춤형 SAS 어플리케이션을 사용하여 데이터를 분석하였다. 표준 곡선 편향으로부터 0.763 μg/mL의 정량 하한 (LLOQ)을 계산하였다.
2. 4가 O-Ag IgG dLIA
혈청형 O25b, O1a, O2 및 O6의 이. 콜라이 긴 O-항원 폴리사카라이드를 폴리-L-리신에 공유결합으로 접합시키고, 유래된 접합체를 표준 EDC/NHS 매개된 커플링 프로토콜로 스펙트럼으로 구별되는 MagPlex-C 미소구체 (루미넥스)에 커플링시켰다. 미소구체를 2-8℃에서 진탕하면서 밤새 인큐베이션을 위해 연속 희석된 비인간 영장류 혈청 샘플, 대조군 및 폴리클로날 표준과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 혈청형-특이적 IgG를 실온에서 진탕하면서 90분 동안 인큐베이션 후 PE-접합 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 109-115-098)로 검출하였다. 4개 스펙트럼으로 구별되는 영역 각각에 대해 루미넥스 200 판독기에 의해 형광을 측정하고 중위수 형광 강도로 표현하였다. 폴리클로날 표준 적정의 표준 곡선 플롯은 신호가 혈청형-특이적 항체 수준 (U/mL)으로 내삽될 수 있는 임의의 할당과 함께 선형 기울기 프로파일을 산출하였다.
3. 비인간 영장류 (NHP)
암컷 시노몰구스 마카크 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fasicularis))를 원래 찰스 리버 래보러토리즈 (미국 텍사스주 휴스턴)로부터 얻은 후, 화이자 (미국 뉴욕주 펄 리버) (연령 범위: 4-5세, 체중 범위: 3.1-5.9 kg)로 옮겼다. NHP는 물 및 음식이 임의로 제공되는 표준 쿼드 케이지에 수용되었다. 내부 온도를 모니터링하기 위해 동물을 피하로 마이크로칩화하였다. 이. 콜라이 감염이 없는 NHP만이 음성 소변 qPCR 결과에 기초하여 등록되었다 (하기 방법 섹션 10 참조).
4. 백신접종 및 혈액 수집
시노몰구스 마카크를 비히클 대조군 (PBS, pH 6.2), 단량체성 핌브리아 항원 FimH-DSG G15A G16A V27A (50 μg/용량)으로, 또는 단량체성 핌브리아 항원 FimH-DSG G15A G16A V27A (50 μg/용량)와 조합된 4가 O25b, O1a, O2 및 O6 O-항원 폴리사카라이드 접합체 (1 μg/용량)의 혼합물로 0, 4 및 14주차에 근육내로 (0.55 mL) 면역화하였다. 백신 항원을 AS01b (용량당 50 μg의 MPL 및 50 μg의 QS-21)로 아주반트화하였다.
0, 6 및 16주차에, 21g 안전 바늘/배큐테이너를 사용하여 10 mL의 혈액을 대퇴 정맥을 통해 1개 혈청 분리기 튜브 (BD 배큐테이너)에 수집하였다. 수집 튜브를 실온에서 30분 동안 방치하고, 3000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액의 혈청을 수집하고 분취하고 -80℃에서 저장하였다.
5. 이. 콜라이 임상 분리주
하나의 대표적인 ST131 O25b 임상 분리주는 국제 보건 관리 협회 (IHMA) 임상 랩에 의해 유지되는 화이자-후원 항미생물 시험 리더십 및 감시(Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance) (ATLAS) 데이터베이스의 일부로서 수집된 UPEC 균주로부터 환자의 연령 및 샘플 수집 기원 (PFEEC0578, 남성, 38세, 방광 기원)에 기초하여 선택되었다. 균주는 알려지지 않은 유형의 캡슐형 폴리사카라이드의 생성을 코딩하는 유전자를 보유한다.
6. UPEC 균주 스톡 제조
12 mL의 LB 브로쓰 (테크노바(Teknova), #L8198)를 접종한 후 275 rpm에서 교반 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 이. 콜라이 스톡을 제조하였다. 18시간 후, 12 mL 배양물을 250 mL 플라스크 (코닝(Corning), #431407)에서 113 mL의 LB 브로쓰에 희석하였다. 배양물을 OD600이 2.1 내지 2.7이 될 때까지 37℃에서 ~275 rpm에서 2 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 25 mL의 글리세롤 (80%, MP, #3055-044)을 배양물에 혼합하였다. 5 mL의 분취액을 장기간 저장을 위해 -80℃에서 동결하였다. 바이알당 생존가능한 박테리아의 농도는 TSA 플레이트 (BD, BBL 트립티카제 대두 한천 (대두 카제인 소화 한천) 카탈로그# B21283X)에 스톡의 연속 희석액을 플레이팅함으로써 확인하고, 30℃에서 18시간 인큐베이션 후 분석하였다.
7. 방광염의 비인간 영장류 모델
NHP를 케타민/덱스도미톨 혼합물을 근육내로 투여하여 마취하였다. 요도 카테터삽입으로부터 방광 오염을 방지하기 위해, 항문생식기 부위를 멸균 염수로 적신 멸균 거즈 및/또는 염화벤잘코늄을 함유하는 소독 와이프로 닦았다. 조직 자극을 방지하기 위해 써지 루브(Surgi Lube)로 이전에 코팅된 멸균 5 프랑스식 빨간색 고무 카테터를 요도를 통해 방광으로 부드럽게 도입하였다. 그 후, 방광은 자연적인 유동을 통해 또는 시린지를 사용한 흡인에 의해 임의의 소변을 배출하였다. 카테터를 통해, 108 CFU의 UPEC 균주 PFEEC0578을 함유하는 1 mL의 부피를 방광에 직접 투여하였다.
8. 시험감염 후 동물 모니터링
시험감염 후, 동물을 1주차 동안 1일 2회 및 후속 주 동안 1일 1회 모니터링하였다. NHP를 시험감염 후 30일까지 모니터링하였다. 모니터링은 소변 배출의 출현, 행동 또는 식욕의 변화, 통증/불편함의 징후 및 체온 측정의 관찰을 포함하였다.
9. 카테터 배치를 통한 소변 수집
깨끗한 소변 샘플을 수집할 수 있도록, 마취된 NHP의 방광을 상기 기재된 바와 같이 카테터삽입하였다. 카테터 배치 후, 방광은 자연적인 유동을 통해 또는 시린지를 사용한 흡인에 의해 소변을 배출하였다. 방광에 소변이 없을 때, 10mL의 염수를 주입하고, 카테터를 통한 흡인을 반복하였다. 수집된 모든 샘플을 즉시 얼음에 저장하였다.
10. DNA 추출
NHP 소변 샘플의 최대 3개 복제물로부터 이. 콜라이 DNA의 추출은 퀴아젠(Qiagen) 민엘루트(Minelute) DNA 추출 키트 (퀴아젠, Ref# 51306, 수량은 때때로 수집된 샘플 부피에 의해 제한됨)를 사용하여 수행하였다. 제조업체의 혈액 및 체액 스핀 프로토콜에 따라 하기와 같이 변형하였다: 샘플 시작 부피를 500 μL로 증가시키고 (샘플 부피가 허용된 경우), 완충액 AL 부피를 500 μL로 증가시키고, 프로테이나제 K 부피를 50 μL로 증가시키고, 50 μL의 분자 등급 물(Molecular Grade Water) (코닝 인크., Ref# 46-000-CM)을 37℃로 가온하고 용리 완충액 EB 대신 사용하였다. 최종적으로, 37℃ 분자 등급 물의 첨가 후, 스핀 칼럼을 최종 스핀 전에 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
11. 정량적 실시간 PCR (qPCR)
NHP 소변 샘플의 박테리아 로드를 평가하기 위해 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 사용하였다. 이. 콜라이 O25b 혈청형 특이적 DNA를 하기 프라이머: 정방향, TTGAAAGTGATGGTTTGGTAAGAAAT (서열식별번호: 109); 역방향, TGCAGCACGTATGATAACTTCAAAG (서열식별번호: 110)을 사용하여 qPCR로 증폭시키고, Fam 형광 리포터 및 서열 AGGATATTTTACCCAGCAGTGCCCCGT (서열식별번호: 111)를 갖는 프로브를 사용하여 복제를 정량화하였다.
O25b 혈청형 특이적 앰플리콘은 O25b 혈청형 orf10 영역의 일부에 상응한다. 프라이머 및 프로브는 맞춤 설계되었으며, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)로부터 동결건조된 제품을 구입하고, 완충액 TE (코닝 인크., Ref# 46-009-CM)에서 100 nmol/mL의 농도로 재구성하였다.
상기 기재된 DNA 추출 절차로부터의 DNA 샘플을 96 웰 어플라이드 바이오시스템스 마이크로앰프 옵티칼(MicroAmp Optical) 96 웰 반응 플레이트 (어플라이드 바이오시스템스, Ref# N8010560)에서 검정하였다. qPCR 반응은 12.5 μL 어플라이드 바이오시스템스 2X 태크만 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(Taqman Fast Advanced Master Mix) (어플라이드 바이오시스템스, Ref# 4444554), 0.125 μL의 각 재구성된 프라이머, 0.5 μL 프로브, 1.75 μL 분자 생물학 등급 물(Molecular Biology Grade Water) (코닝 인크., Ref# 46-000-CM), 및 웰당 10 μL의 샘플을 사용하여 25 μl의 총 부피로 수행하였다.
DNA 증폭을 위한 반응 조건은 2분 동안 50℃, 그 후 2분 동안 95℃였고, 3초 동안 95℃ 및 30초 동안 60℃의 40 사이클을 어플라이드 바이오시스템스 7500 실시간-PCR 시스템 또는 어플라이드 바이오시스템스 콴트스튜디오(QuantStudio) 6 실시간-PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템스)에서 실행하였다.
정량을 가능하게 하기 위해, 선형 표준 곡선을 개발하였다. 각 시험감염 실험 (상기 기재된 제조)에서 사용된 것과 동일한 이. 콜라이 동결된 스톡의 분취액을 멸균 PBS (코닝, 21-040-CM)에서 1x109 CFU/mL로 희석하였다. 후속 연속 희석을 수행하여 1x108, 1x107, 1x106, 1x105, 1x104, 1000, 100, 및 10 CFU/mL 농도의 이. 콜라이를 함유하는 용액을 생성하였다. 연속 희석물을 멸균 PBS (코닝, 21-040-CM)에서 제조하거나, 풀링된 2회 여과된 NHP 소변을 접종 전에 대상체로부터 수집하였다. PBS에서의 희석물 및 풀링된 2회 여과된 NHP 소변은 나중에 동등한 것으로 밝혀졌다. 각 희석물에 존재하는 생존가능한 박테리아의 수량은 TSA 플레이트 (BD, BBL 트립티카제 대두 한천 (대두 카제인 소화 한천) 카탈로그# B21283X)에 플레이팅함으로써 확인하였다. 상기 기재된 바와 같이 샘플로부터 DNA를 추출하는데 사용된 동일한 방법을 사용하여 각 연속 희석에 대해 DNA 추출을 수행하였다. 이들 qPCR 표준을 모든 qPCR 검정 플레이트에서 이중으로 실행하였다.
선형 회귀 분석은 어플라이드 바이오시스템스 콴트스튜디오 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 통계적 분석은 100 내지 1x108 박테리아/mL 사이에서 선형으로 거동하는 표준 곡선이 생성된 것을 결정하였다. 결과적으로, 정량 하한 (LLOQ)은 100 박테리아/mL로 결정되었다. 일부 경우에, 샘플이 형광 임계값에 도달하였지만, LLOQ 미만의 수량에 상응하는 사이클에서, 다른 경우에, 형광 임계값에 전혀 도달하지 않았다 (미결정 값). 이들 조건 중 하나가 발생될 때, 값은 LLOQ (100 박테리아/mL)의 값으로 여기에 보고된다.
12. 마이엘로퍼옥시다제 (MPO) ELISA
인비트로젠 마이엘로퍼옥시다제 인스턴트 ELISA 키트 (인비트로젠, Ref# BMS2038INST)를 사용하여 NHP 소변에서 마이엘로퍼옥시다제 (MPO)를 정량화하였다. PIPES 완충액을 5% 0.5M PIPES 완충액 pH 6.8 (알파 에이사(Alfa Aesar), Ref# J61786-AK)의 최종 농도로 순수한 소변 샘플에 첨가하였다. 샘플을 15초 동안 볼텍싱한 후, 제조업체 공급된 샘플 희석제로 1:1 희석하였다. 샘플을 이중으로 검정하고, 나머지 검정에 대해 제조업체의 지침을 따랐다. 최종 종점에서, 스펙트라맥스(Spectramax) 플러스 기기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))에서 450 nm의 색상 강도를 측정하였다. 검정 키트의 포함된 표준을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 분석을 위해, 검정 키트의 낮은 표준 (156.25 pg/mL)은 검출 하한 (LLOD)으로 이해되었다. 스펙트라맥스 기기의 동반 소프트웨어 (소프트맥스, 몰레큘라 디바이시스)는 낮은 표준 값 이상으로 외삽할 수 있다. LLOD의 절반 값 (78.125 pg/mL)은 해당 값 아래로 외삽된 임의의 값으로 치환되거나, 또는 임의의 검정 결과가 검출 한계 아래로 완전히 떨어졌을 때 치환되었다.
13. IL-8 루미넥스 검정
인터류킨-8 (IL-8)은 맞춤형 바이오-라드(Bio-Rad) IL-8 인간 시토카인 스크리닝 패널 루미넥스 검정 키트 (바이오라드 래보러토리즈 인크.(BioRad Laboratories Inc.), REF# 17005177)를 사용하여 측정하였다. PIPES 완충액을 5% 0.5M PIPES 완충액 pH 6.8 (알파 에이사, Ref# J61786-AK)의 최종 농도로 순수한 소변 샘플에 첨가하였다. 샘플을 15초 동안 볼텍싱한 후, 50%의 변형된 LXA-4 완충액 (PBS 1X, 0.5% BSA, 0.025% 아지드화 나트륨)로 1:1 희석하였다. 샘플을 이중으로 검정하고, 나머지 검정에 대해 제조업체의 지침을 따랐다. 바이오플렉스(BioPlex) 200 루미넥스 기기 (바이오라드 래보러토리즈 인크.)에서 검정 플레이트를 판독하였다. 바이오플렉스 200 루미넥스 기기의 동반 소프트웨어인 "바이오플렉스 매니저" 및 검정 키트의 포함된 표준을 사용하여 표준 곡선을 생성하고 형광 강도로부터 샘플 농도를 외삽하였다. 바이오플렉스 매니저 소프트웨어는 정량 하한 (LLOQ)을 결정한다.
14. 소변 침강물의 총 유핵 세포 수 및 광학 현미경법 분석
수집 1시간 이내에, 소변 샘플 (500 μl 내지 1 mL)을 포르말린으로 1%의 최종 농도로 고정하고, 밤새 얼음 위에서 화이자 (미국 코네팃컷주 그로톤)로 보냈다. 수령 시, 총 유핵 세포 (상피 세포 및 다형핵 세포)를 혈구계산기로 계수하였다. 대략 총 300 μL를 써모 사이언티픽 샌던(Thermo Scientific Shandon) EZ 이중 세포 깔때기에 로딩하였다 (100 μL를 하나의 깔때기에 로딩하고 200 μL를 다른 깔때기에 로딩하였다). 샘플을 써모 사이언티픽 사이토스핀 4 세포원심분리기를 사용하여 샌던 이중 사이토슬라이드 현미경 코팅된 유리 슬라이드 상에서 750 rpm에서 5분 동안 세포원심분리하였다. 높은 세포 수를 갖는 샘플의 경우, 세포원심분리 전에 소변을 먼저 0.9% 염수로 1:10 희석하였다. 그 후, 시스멕스(Sysmex) SP-10 기기를 사용하여, 사이토프렙(cytoprep) 슬라이드를 간단히 메탄올 고정하고, 김사 및 마이-그룬발드 염색으로 염색하였다. 각 소변 샘플에 대해, 소변 샘플당 하나의 슬라이드를 상기 나열된 2 샘플 부피로 제조하였다.
농축되고 염색된 소변 침강물을 함유하는 사이토스핀 슬라이드를 증가된 다형핵 세포 (PMN, 즉 분절 또는 재편형 핵이 있는 과립구, 일반적으로 호중구로 구성되지만 또한 호산구 및 호염기구 포함)의 존재 또는 부재에 대해 광학 현미경법에 의해 평가하였다. 증가된 PMN 세포의 부재는 PMN 없음 또는 드문 PMN의 관찰에 기초하여 결정되었다. 증가된 PMN의 존재는 배경 상피 세포 집단에 비해 드문 PMN 이상의 관찰에 기초하여 결정되었다.
B. 결과
1. O-항원과 함께 및 그 없이 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체를 사용한 백신접종은 비인간 영장류에서 강력한 전체 및 중화 항체를 도출한다
비인간 영장류를 4가 O-항원 접합체 (O25b, O6, O1a, O2) 및 AS01b 아주반트와 함께 또는 그 없이 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체로 백신접종하였다 (도 9). FimH-DSG G15A G16A V27A 및 4가 O-항원 백신접종된 그룹에서, O-항원 혈청형-특이적 항체 역가는 백신접종 후 6주에 ~400배 상승하였다 (도 10 및 표 22). 총 항-FimH 항체 역가는 직접 루미넥스 면역검정 (dLIA)을 사용하여 정량화하였다 (도 11a 및 표 23). 위약 그룹의 동물은 정량화의 검정 한계 미만의 역가를 가졌다. 백신접종된 둘 다에서, 역가는 2회 용량 후 상승하였고 제3 용량으로 부스팅될 수 있었다. 전반적으로, 역가는 FimH-DSG G15A G16A V27A 단독과 비교하여 O-항원과 함께 FimH-DSG G15A G16A V27A로 백신접종된 동물에서 약간 더 낮았다.
표 22: 4가 O-항원과 함께 FimH-DSG G15A G16A V27A로 백신접종된 비인간 영장류에서 O-항원 혈청형-특이적 역가
표 23: 비인간 영장류에서 FimH IgG 기하 평균 역가
효모 만난에 대한 이. 콜라이의 결합을 차단하는 항-FimH 항체의 능력을 평가하기 위해 이. 콜라이 결합 억제 검정에서 혈청을 평가하였다 (도 11b 및 표 24). FimH-DSG G15A G16A V27A 단독으로 백신접종된 동물로부터의 혈청의 평균 IC50은 용량 2 후 293.65 및 용량 3 후 1698.39로 상승한 반면, O-항원과 조합된 FimH-DSG G15A G16A V27A로 백신접종된 동물의 평균 IC50은 용량 2 후 480.12 및 용량 3 후 756.45였다.
표 24: 비인간 영장류 혈청에 대한 이. 콜라이 중화 검정 IC50
함께, 이들 데이터는 FimH-DSG G15A G16A V27A가 비인간 영장류에서 강력한 항체 반응을 도출하고 O-항원과 조합하는 것이 FimH 단독보다 약간 더 낮지만 높은 역가를 초래한다는 것을 보여준다.
2. O-항원과 함께 및 그 없이 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체를 사용한 백신접종은 비인간 영장류 모델에서 세균뇨 및 감염의 바이오마커를 감소시킨다
최종 부스팅 후 5주에, 백신접종되고 위약 처리된 NHP를 108 CFU의 UPEC 분리주 PFEEC0578로 방광내 카테터삽입을 통해 접종하였다. 28일의 기간에 걸쳐 카테터 수집된 소변에서 세균뇨를 모니터링하였다. 모든 위약 처리된 동물에서, 살아있는 박테리아의 점적주입은 시험감염 후 2 및 7일차에 높은 수준의 세균뇨를 유발하였다 (대략 106 박테리아/mL 소변의 기하 평균). 위약 그룹과 비교하여, FimH-DSG G15A G16A V27A 또는 FimH-DSG G15A G16A V27A + 4가 O-항원으로 백신접종된 동물은 감염 후 2 및 7일차에 각각 기하 평균 세균뇨의 300배 또는 1000배 감소를 나타내었다.
14일차에, 위약 백신접종된 동물의 대략 50%는 여전히 >105 박테리아/mL 소변의 세균뇨를 나타내었다. 최종적으로, 대부분의 위약 NHP는 21 및 28일차에 감염을 제거하였다. 대조적으로, 대부분의 FimH-DSG G15A G16A V27A 또는 FimH-DSG G15A G16A V27A + 4가 O-항원 백신접종된 동물은 14일차까지 감염을 제거하였다 (도 12).
다음으로, 시험감염된 NHP의 소변에서 다양한 염증성 바이오마커를 모니터링하였다. 시험감염 후 7일차에, 모든 위약 처리된 동물은 세포학 분석에 의해 확인된 바와 같이 소변 침강물에서 상승된 수준의 다형핵 (PMN) 세포를 나타내었다. 대조적으로, FimH-DSG G15A G16A V27A 백신접종된 NHP의 25% 미만은 소변 침강물에서 증가된 수준의 PMN 세포를 가졌고 FimH-DSG G15A G16A V27A + 4가 O-항원 면역화된 동물은 갖지 않았다 (도 13c). 동시에, 7일 기간에 걸쳐 소변 샘플에서 마이엘로퍼옥시다제 (MPO) 및 인터류킨 8 (IL-8)의 수준을 측정하였다. 시험감염 후 2일차에, 백신접종된 그룹 둘 다는 위약 그룹 (470 pg/mL의 기하 평균)과 비교하여 MPO 수준의 2배 감소를 나타내었다 (~200 pg/mL의 기하 평균) (도 13a).
또한, 감염 후 2일차 및 7일차에, FimH-DSG G15A G16A V27A 백신접종된 동물에서 IL-8의 소변 농도가 위약 처리된 NHP의 소변에서 측정된 수준 (54.2 pg/mL 및 32.7 pg/mL의 기하 평균)과 비교하여 각각 대략 10배 및 5배만큼 감소되었다 (5.9 pg/mL 및 9.8 pg/mL의 기하 평균). 유사한 경향으로, O-항원과 조합된 FimH-DSG G15A G16A V27A 면역화된 NHP에서 2일차 및 7일차에 IL-8의 소변 수준이 위약 처리된 동물에서 관찰된 IL-8 농도와 비교하여 각각 대략 5배 및 3배만큼 감소되었다 (11.3 pg/mL의 기하 평균) (도 13b).
C. 결론
FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체는 NHP에서 높은 항-FimH IgG 역가를 유도하며, 이는 제3 용량으로 부스팅될 수 있다. FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체 및 4가 O-항원의 조합으로 백신접종된 동물은 높은 O-항원 IgG 역가를 나타내었다.
FimH-DSG G15A G16A V27A는 비인간 영장류에서 강력한 중화 항체를 도출한다. 4가 O-항원과의 조합은 유사하게 면역원성이다.
4가 O-항원과 함께 또는 그 없이 FimH-DSG G15A G16A V27A 돌연변이체는 시노몰구스 마카크의 요로 감염 모델에서 세균뇨 및 감염의 바이오마커를 감소시킨다.
하기 항목들은 본 개시내용의 추가 측면을 기술한다:
C1. 야생형 FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드로서, 여기서 돌연변이 위치는 F1, P12, G14, G15, G16, A18, P26, V27, V28, Q32, N33, L34, V35, R60, S62, Y64, G65, L68, F71, T86, L107, Y108, L109, V112, S113, A115, G116, V118, A119, A127, L129, Q133, F144, V154, V155, V156, P157, T158, V163 및 V185로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 아미노산 위치는 서열식별번호: 59에 따라 넘버링되는 것인 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C2. 항목 C1에 있어서, F1I; F1L; F1V; F1M; F1Y; F1W; P12C; G14C; G15A; G15P; G16A; G16P; A18C; P26C; V27A; V27C; V28C; Q32C; N33C; L34C; L34N; L34S; L34T; L34D; L34E; L34K; L34R; V35C; R60P; S62C; Y64C; G65A; L68C; F71C; T86C; L107C; Y108C; L109C; V112C; S113C; A115V; G116C; V118C; A119C; A119N; A119S; A119T; A119D; A119E; A119K; A119R; A127C; L129C; Q133K; F144C; V154C; V156C; P157C; T158C; V163I; 및 V185I, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C3. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G15A 및 G16A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C4. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 P12C 및 A18C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C5. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G14C 및 F144C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C6. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 P26C 및 V35C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C7. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 P26C 및 V154C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C8. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 P26C 및 V156C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C9. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V27C 및 L34C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C10. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V28C 및 N33C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C11. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V28C 및 P157C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C12. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 Q32C 및 Y108C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C13. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 N33C 및 L109C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C14. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 N33C 및 P157C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C15. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V35C 및 L107C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C16. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V35C 및 L109C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C17. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 S62C 및 T86C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C18. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 S62C 및 L129C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C19. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 Y64C 및 L68C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C20. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 Y64C 및 A127C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C21. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L68C 및 F71C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C22. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V112C 및 T158C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C23. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 S113C 및 G116C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C24. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 S113C 및 T158C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C25. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V118C 및 V156C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C26. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119C 및 V155C를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C27. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L34N 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C28. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L34S 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C29. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L34T 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C30. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L34D 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C31. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L34E 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C32. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L34K 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C33. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 L34R 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C34. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119N 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C35. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119S 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C36. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119T 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C37. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119D 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C38. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119E 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C39. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119K 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C40. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 A119R 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C41. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G15A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C42. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G16A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C43. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G15P 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C44. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G16P 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C45. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G15A, G16A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C46. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G65A 및 V27A를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C47. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 V27A 및 Q133K를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C48. 항목 C2에 있어서, 돌연변이 G15A, G16A, V27A 및 Q133K를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C49. 항목 C2에 있어서, 서열식별번호: 2-58 및 60-64 중 어느 하나의 서열을 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C50. 항목 C1-C49 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 단리된 것인 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C51. (i) 항목 C1-C50 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
C52. 항목 C1-C50 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
C53. 항목 C52에 있어서, 적어도 하나의 추가 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C54. 항목 C53에 있어서, 적어도 하나의 추가 항원이 사카라이드, 또는 폴리사카라이드, 또는 당접합체, 또는 단백질인 면역원성 조성물.
C55. 항목 C52에 있어서, 적어도 하나의 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C56. 항목 C1-C49 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
C57. 항목 C1-C50 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 면역원성인 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
C58. 항목 C1-C50 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 포유동물 세포.
C59. 항목 C58의 재조합 세포를 포함하는 배양물로서, 여기서 상기 배양물은 크기가 적어도 5 리터인, 배양물.
C60. 항목 C58에 따른 재조합 포유동물 세포를 적합한 조건 하에 배양하여, 이에 의해 폴리펩티드를 발현하는 단계; 및 폴리펩티드를 수확하는 단계를 포함하는, 항목 C1-C50 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 생산하는 방법.
C61. (i) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 유도하거나, 또는 (ii) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대해 특이적인 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체의 생성을 유도하는 방법으로서, 여기서 방법은 항목 C51 내지 C55 중 어느 하나에 따른 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
C62. 항목 C61에 있어서, 대상체가 요로 감염이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
C63. 항목 C61에 있어서, 대상체가 균혈증이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
C64. 항목 C61에 있어서, 대상체가 패혈증이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
C65. 항목 C51-C55 중 어느 하나에 따른 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 도출하는 방법.
C66. 항목 C65에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이에 대한 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체를 포함하는 것인 방법.
C67. 항목 C65에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이 감염으로부터 포유동물을 보호하는 것인 방법.
C68. 항목 C51-C55 중 어느 하나에 따른 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 호전시키는 방법.
C69. 항목 C54에 있어서, 추가 항원이 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함하는 사카라이드인 면역원성 조성물: 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186 및 화학식 O187, 여기서 n은 1 내지 100의 정수이다.
C70. 항목 C69에 있어서, 사카라이드가 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O10, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O21, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O28, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O58, 화학식 O64, 화학식 O69, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O75, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O86, 화학식 O88, 화학식 O90, 화학식 O98, 화학식 O104, 화학식 0111, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O119, 화학식 O121, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O136, 화학식 O138, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O147, 화학식 O149, 화학식 O152, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O164, 화학식 O173, 화학식 62D1, 화학식 O22, 화학식 O35, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O83, 화학식 O91, 화학식 O105, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O139, 화학식 O153, 화학식 O167 및 화학식 O172로부터 선택된 구조를 포함하며, 여기서 n은 31 내지 100의 정수인 면역원성 조성물.
C71. 항목 C70에 있어서, 사카라이드가 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4 (예를 들어, 화학식 O4:K52 및 화학식 O4:K6), 화학식 O5 (예를 들어, 화학식 O5ab 및 화학식 O5ac (균주 180/C3)), 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O7, 화학식 O10, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 (예를 들어, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 및 화학식 O18B1), 화학식 O21, 화학식 O23 (예를 들어, 화학식 O23A), 화학식 O24, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 화학식 O26, 화학식 O28, 화학식 O44, 화학식 O45 (예를 들어, 화학식 O45 및 화학식 O45rel), 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O58, 화학식 O64, 화학식 O69, 화학식 O73 (예를 들어, 화학식 O73 (균주 73-1)), 화학식 O75, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O86, 화학식 O88, 화학식 O90, 화학식 O98, 화학식 O104, 화학식 0111, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O119, 화학식 O121, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O136, 화학식 O138, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O147, 화학식 O149, 화학식 O152, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O164, 화학식 O173 및 화학식 62D1로부터 선택된 구조를 포함하며, 여기서 n은 31 내지 100의 정수인 면역원성 조성물.
C72. 항목 C70에 있어서, 화학식 O1 (예를 들어, 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C), 화학식 O2, 화학식 O6 (예를 들어, 화학식 O6:K2; K13; K15 및 화학식 O6:K54), 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O21, 화학식 O25 (예를 들어, 화학식 O25a 및 화학식 O25b), 및 화학식 O75로부터 선택된 구조를 포함하는 면역원성 조성물.
C73. 항목 C70에 있어서, 화학식 O4, 화학식 O11, 화학식 O21 및 화학식 O75로부터 선택된 구조를 포함하는 면역원성 조성물.
C74. 항목 C69에 있어서, 사카라이드가 화학식 O8, 화학식 O9a, 화학식 O9, 화학식 O20ab, 화학식 O20ac, 화학식 O52, 화학식 O97 및 화학식 O101로부터 선택된 구조를 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C75. 항목 C69에 있어서, 사카라이드가 화학식 O12로부터 선택된 구조를 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C76. 항목 C72에 있어서, 사카라이드가 그람-음성 박테리아에서 wzz 패밀리 단백질을 발현하여 상기 사카라이드를 생성함으로써 생성되는 것인 면역원성 조성물.
C77. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
C78. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 wzzB인 면역원성 조성물.
C79. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 fepE인 면역원성 조성물.
C80. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 wzzB 및 fepE인 면역원성 조성물.
C81. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 살모넬라 엔테리카로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
C82. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 하기 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물: 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 121.
C83. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115 및 서열식별번호: 116 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C84. 항목 C76에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 121 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C85. 항목 C69에 있어서, 사카라이드가 합성적으로 합성된 것인 면역원성 조성물.
C86. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R1 모이어티를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C87. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R2 모이어티를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C88. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R3 모이어티를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C89. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R4 모이어티를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C90. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 K-12 모이어티를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C91. 항목 C69 내지 C90 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산 (KDO) 모이어티를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C92. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R1 모이어티를 추가로 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C93. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R2 모이어티를 추가로 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C94. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R3 모이어티를 추가로 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C95. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 R4 모이어티를 추가로 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C96. 항목 C69 내지 C85 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이 K-12 모이어티를 추가로 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C97. 항목 C69 내지 C90 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산 (KDO) 모이어티를 추가로 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C98. 항목 C69 내지 C91 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 지질 A를 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C99. 항목 C69 내지 C98 중 어느 하나에 있어서, 폴리사카라이드가 10 kDa 내지 2,000 kDa, 또는 50 kDa 내지 2,000 kDa의 분자량을 갖는 것인 면역원성 조성물.
C100. 항목 C69 내지 C99 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 20-40 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인 면역원성 조성물.
C101. 항목 C69 내지 C100 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 40,000 내지 60,000 kDa의 평균 분자량을 갖는 것인 면역원성 조성물.
C102. 항목 C69 내지 C101 중 어느 하나에 있어서, n이 31 내지 90의 정수인 면역원성 조성물.
C103. 항목 C69 내지 C50 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 사카라이드는 이. 콜라이로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
C104. 항목 C69 내지 C50 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 담체 단백질에 공유결합으로 결합된, 항목 C69 내지 C102 중 어느 하나에 따른 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
C105. 항목 C69 내지 C50 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 또는 그의 단편; 및 항목 C69 내지 항목 C102 중 어느 하나에 따른 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 담체 단백질은 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물: 폴리(L-리신), CRM197, 디프테리아 독소 단편 B (DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 또는 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A; 피. 아에루기노사의 해독된 외독소 A (EPA), 말토스 결합 단백질 (MBP), 에스. 아우레우스의 해독된 헤몰리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 뉴몰리신 및 그의 해독된 변이체, 씨. 제주니 AcrA, 씨. 제주니 천연 당단백질 및 연쇄상구균 C5a 펩티다제 (SCP).
C106. 항목 C103 내지 항목 C105 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질이 CRM197인 면역원성 조성물.
C107. 항목 C103 내지 항목 C105 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드 (TT)인 면역원성 조성물.
C108. 항목 C103 내지 항목 C105 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질이 폴리(L-리신)인 면역원성 조성물.
C109. 항목 C103 내지 항목 C107 중 어느 하나에 있어서, 접합체가 환원성 아민화에 의해 제조된 것인 면역원성 조성물.
C110. 항목 C103 내지 항목 C107 중 어느 하나에 있어서, 접합체가 CDAP 화학에 의해 제조된 것인 면역원성 조성물.
C111. 항목 C103 내지 항목 C107 중 어느 하나에 있어서, 접합체가 단일-단부 연결된 접합된 사카라이드인 면역원성 조성물.
C112. 항목 C103 내지 항목 C107 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 것인 면역원성 조성물.
C113. 항목 C112에 있어서, 사카라이드가 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합되고, 여기서 사카라이드가 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 연결되고, 여기서 담체 단백질이 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 연결된 것인 면역원성 조성물.
C114. 항목 C112 내지 항목 C113 중 어느 하나에 있어서, CRM197이 eTEC 스페이서를 통해 폴리사카라이드에 공유결합으로 연결된 2 내지 20개, 또는 4 내지 16개의 리신 잔기를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
C115. 항목 C103 내지 항목 C114 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드:담체 단백질 비율 (w/w)이 0.2 내지 4인 면역원성 조성물.
C116. 항목 C103 내지 항목 C114 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드 대 단백질의 비율이 적어도 0.5 및 최대 2인 면역원성 조성물.
C117. 항목 C103 내지 항목 C114 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드 대 단백질의 비율이 0.4 내지 1.7인 면역원성 조성물.
C118. 항목 C111 내지 항목 C117 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드가 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산 (KDO) 잔기를 통해 담체 단백질에 접합된 것인 면역원성 조성물.
C119. 항목 C69에 있어서, 접합체가 담체 단백질에 공유결합으로 결합된 사카라이드를 포함하고, 여기서 사카라이드가 화학식 O8, 화학식 O9a, 화학식 O9, 화학식 O20ab, 화학식 O20ac, 화학식 O52, 화학식 O97 및 화학식 O101로부터 선택된 구조를 포함하고, 여기서 n이 1 내지 10의 정수인 면역원성 조성물.
C120. 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 항목 C69 내지 항목 C102 중 어느 하나에 따른 사카라이드, 및 제약상 허용되는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물.
C121. 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 항목 C103 내지 항목 C119 중 어느 하나에 따른 당접합체, 및 제약상 허용되는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물.
C122. 항목 C121에 있어서, 조성물 내의 사카라이드의 총량과 비교하여 최대 약 25% 유리 사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물.
C123. 항목 C120 내지 항목 C121 중 어느 하나에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C124. 항목 C120 내지 항목 C121 중 어느 하나에 있어서, 알루미늄을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C125. 항목 C120 내지 항목 C121 중 어느 하나에 있어서, QS-21을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C126. 항목 C120 내지 항목 C121 중 어느 하나에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C127. 항목 C120 내지 항목 C121 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 아주반트를 포함하지 않는 것인 면역원성 조성물.
C128. 항목 C69 내지 C118 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 이. 콜라이로부터 유래된 사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 폴리사카라이드는 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 연결되고, 여기서 담체 단백질은 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 연결된 것인 면역원성 조성물.
C129. 항목 C128에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이로부터 유래된 O-항원인 면역원성 조성물.
C130. 항목 C128에 있어서, 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C131. 항목 C128에 있어서, 사카라이드가 이. 콜라이로부터 유래된 O-항원인 면역원성 조성물.
C132. 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 항목 C69 내지 항목 C85 중 어느 하나에 따른 사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 폴리사카라이드는 카르바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 연결되고, 여기서 담체 단백질은 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유결합으로 연결된 것인 면역원성 조성물.
C133. 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 (i) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 이. 콜라이 O25B 항원의 접합체, (ii) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 이. 콜라이 O1A 항원의 접합체, (iii) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 이. 콜라이 O2 항원의 접합체, 및 (iv) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 O6 항원의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 이. 콜라이 O25B 항원은 화학식 O25B의 구조를 포함하고, 여기서 n은 30 초과의 정수인 면역원성 조성물.
C134. 항목 C133에 있어서, 담체 단백질이 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물: 폴리(L-리신), CRM197, 디프테리아 독소 단편 B (DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 또는 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A; 피. 아에루기노사의 해독된 외독소 A (EPA), 말토스 결합 단백질 (MBP), 에스. 아우레우스의 해독된 헤몰리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 뉴몰리신 및 그의 해독된 변이체, 씨. 제주니 AcrA, 씨. 제주니 천연 당단백질 및 연쇄상구균 C5a 펩티다제 (SCP).
C135. 항목 C69 내지 C118 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 (i) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 이. 콜라이 O25B 항원의 접합체, (ii) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 이. 콜라이 O4 항원의 접합체, (iii) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 이. 콜라이 O11 항원의 접합체, 및 (iv) 담체 단백질에 공유결합으로 커플링된 O21 항원의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 이. 콜라이 O25B 항원은 화학식 O75의 구조를 포함하고, 여기서 n은 30 초과의 정수인 면역원성 조성물.
C136. 항목 C135에 있어서, 담체 단백질이 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물: 폴리(L-리신), CRM197, 디프테리아 독소 단편 B (DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 또는 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A; 피. 아에루기노사의 해독된 외독소 A (EPA), 말토스 결합 단백질 (MBP), 에스. 아우레우스의 해독된 헤몰리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 뉴몰리신 및 그의 해독된 변이체, 씨. 제주니 AcrA, 씨. 제주니 천연 당단백질 및 연쇄상구균 C5a 펩티다제 (SCP).
C137. 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카르바메이트 (eTEC) 스페이서를 통해 담체 단백질에 접합된 사카라이드를 포함하는 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법으로서, 방법은 a) 사카라이드를 유기 용매 중에서 1,1'-카르보닐-디-(1,2,4-트리아졸) (CDT) 또는 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI)과 반응시켜, 활성화된 사카라이드를 생성하는 단계; b) 활성화된 사카라이드를 시스타민 또는 시스테아민 또는 그의 염과 반응시켜, 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; c) 티올화된 사카라이드를 환원제와 반응시켜, 하나 이상의 유리 술프히드릴 잔기를 포함하는 활성화된 티올화된 사카라이드를 생성하는 단계; d) 활성화된 티올화된 사카라이드를 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 포함하는 활성화된 담체 단백질과 반응시켜, 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 생성하는 단계; 및 e) 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 (i) 활성화된 담체 단백질의 비접합된 α-할로아세트아미드 기를 캡핑할 수 있는 제1 캡핑 시약; 및/또는 (ii) 비접합된 유리 술프히드릴 잔기를 캡핑할 수 있는 제2 캡핑 시약과 반응시켜; 이에 의해 eTEC 연결된 당접합체를 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 사카라이드는 이. 콜라이로부터 유래되고; FimH로부터 유래된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 재조합 포유동물 세포에서 발현하는 단계, 및 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
C138. 항목 C137에 있어서, 항목 C69 내지 항목 C102 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 것을 포함하는 방법.
C139. 항목 C137 내지 항목 C138 중 어느 하나에 있어서, 캡핑 단계 e)가 티올화된 사카라이드-담체 단백질 접합체를 (i) 제1 캡핑 시약으로서 N-아세틸-L-시스테인, 및/또는 (ii) 제2 캡핑 시약으로서 아이오도아세트아미드와 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
C140. 항목 C137 내지 항목 C139 중 어느 하나에 있어서, 사카라이드를 트리아졸 또는 이미다졸과의 반응에 의해 배합하여 배합된 사카라이드를 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 배합된 사카라이드는 단계 a) 전에 쉘 동결되고, 동결건조되고, 유기 용매 중에서 재구성되는 것인 방법.
C141. 항목 C137 내지 항목 C140 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)에서 생성된 티올화된 폴리사카라이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 정제 단계는 투석여과를 포함하는 것인 방법.
C142. 항목 C137 내지 항목 C141 중 어느 하나에 있어서, 방법이 투석여과에 의한 eTEC 연결된 당접합체의 정제를 추가로 포함하는 것인 방법.
C143. 항목 C137 내지 항목 C142 중 어느 하나에 있어서, 단계 a)의 유기 용매가 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 아세토니트릴, 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라히드로-2(1H)-피리미디논 (DMPU) 및 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA), 또는 이들의 혼합물 중 어느 하나로부터 선택된 극성 비양성자성 용매인 방법.
C144. 항목 C137 내지 항목 C142 중 어느 하나에 있어서, 배지가 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 시트르산나트륨, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O 중 어느 하나로부터 선택된 요소를 포함하는 것인 방법.
C145. 항목 C144에 있어서, 배지가 이. 콜라이 배양용으로 사용되는 것인 배지.
C146. 항목 C69 내지 항목 C102 중 어느 하나에 따른 사카라이드를 생산하는 방법으로서, 배지에서 재조합 이. 콜라이를 배양하는 단계; 상기 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 상기 사카라이드를 생성하는 단계를 포함하고; 이에 의해 상기 세포는 상기 사카라이드를 생성하는 것인 방법.
C147. 항목 C146에 있어서, 배지가 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 시트르산나트륨, Na2SO4, 아스파르트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O 중 어느 하나로부터 선택된 요소를 포함하는 것인 방법.
C148. 항목 C146에 있어서, 배지가 대두 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
C149. 항목 C146에 있어서, 배지가 효모 추출물을 포함하는 것인 방법.
C150. 항목 C146에 있어서, 배지가 대두 가수분해물 및 효모 추출물을 추가로 포함하지 않는 것인 방법.
C151. 항목 C146에 있어서, 이. 콜라이 세포가 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나로부터 선택된 이종 wzz 패밀리 단백질을 포함하는 것인 방법.
C152. 항목 C146에 있어서, 이. 콜라이 세포가 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나로부터 선택된 살모넬라 엔테리카 wzz 패밀리 단백질을 포함하는 것인 방법.
C153. 항목 C152에 있어서, wzz 패밀리 단백질이 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115 및 서열식별번호: 116 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 방법.
C154. 항목 C146에 있어서, 배양이 > 120 OD600/mL의 수율을 생성하는 것인 방법.
C155. 항목 C146에 있어서, 사카라이드를 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
C156. 항목 C146에 있어서, 정제 단계가 하기 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법: 투석, 농축 작업, 투석여과 작업, 접선 유동 여과, 침전, 용리, 원심분리, 침전, 한외여과, 심층 여과, 및 칼럼 크로마토그래피 (이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 이온 교환 크로마토그래피, DEAE, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피).
C157. 대상체에게 항목 C69 내지 항목 C136 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
C158. 항목 C157에 있어서, 면역 반응이 항-이. 콜라이 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체의 유도를 포함하는 것인 방법.
C159. 항목 C157에 있어서, 면역 반응이 항-이. 콜라이 IgG 항체의 유도를 포함하는 것인 방법.
C160. 항목 C157에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이에 대한 살균 활성의 유도를 포함하는 것인 방법.
C161. 항목 C157에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이에 대한 옵소닌식세포성 항체의 유도를 포함하는 것인 방법.
C162. 항목 C157에 있어서, 면역 반응이 초기 투여 후 적어도 1,000 내지 200,000의 기하 평균 역가 (GMT) 수준을 포함하는 것인 방법.
C163. 항목 C157에 있어서, 조성물이 화학식 O25를 포함하는 사카라이드를 포함하며, 여기서 n은 40 내지 100의 정수이고, 여기서 면역 반응은 초기 투여 후 적어도 1,000 내지 200,000의 기하 평균 역가 (GMT) 수준을 포함하는 것인 방법.
C164. 항목 C157에 있어서, 대상체가 요로 감염, 담낭염, 담관염, 설사, 용혈성 요독 증후군, 신생아 수막염, 요로성 패혈증, 복강내 감염, 수막염, 합병 폐렴, 상처 감염, 전립선 생검 후-관련 감염, 신생아/유아 패혈증, 호중구감소성 발열, 및 기타 혈류 감염; 폐렴, 균혈증, 및 패혈증으로부터 선택된 병태 중 어느 하나의 위험에 있는 것인 방법.
C165. 항목 C157에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
C166. (i) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 유도하거나, 또는 (ii) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 대해 특이적인 옵소닌식세포성 항체의 생성을 유도하는 방법으로서, 여기서 방법은 항목 C69 내지 항목 C136 중 어느 하나에 따른 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
C167. 항목 C166에 있어서, 대상체가 요로 감염이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
C168. 항목 C166에 있어서, 대상체가 균혈증이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
C169. 항목 C166에 있어서, 대상체가 패혈증이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
C170. 항목 C69 내지 항목 C136 중 어느 하나에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
C171. 항목 C170에 있어서, 면역 반응이 항-이. 콜라이 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체의 유도를 포함하는 것인 방법.
C172. 항목 C170에 있어서, 항-이. 콜라이 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체가 IgG 항체인 방법.
C173. 항목 C170에 있어서, 항-이. 콜라이 O-특이적 폴리사카라이드 혈청 항체가 이. 콜라이에 대한 살균 활성을 갖는 IgG 항체인 방법.
C174. 항목 C69에 있어서, n이 상응하는 야생형 이. 콜라이 폴리사카라이드 내의 반복 단위의 수보다 큰 것인 면역원성 조성물.
C175. 항목 C174에 있어서, n이 31 내지 100의 정수인 조성물.
C176. 항목 C174에 있어서, 사카라이드가 화학식 O1A, 화학식 O1B 및 화학식 O1C, 화학식 O2, 화학식 O6 및 화학식 O25B 중 어느 하나에 따른 구조를 포함하는 것인 조성물.
C177. 항목 C174에 있어서, 사카라이드가 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 121 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 wzz 패밀리 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포에서 생성되는 것인 조성물.
C178. 항목 C177에 있어서, 단백질이 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115 및 서열식별번호: 116 중 어느 하나를 포함하는 것인 조성물.
C179. 항목 C174에 있어서, 사카라이드가 합성적으로 합성되는 것인 조성물.
C180. 항목 C1 내지 C55 중 어느 하나에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드, 및 (a) 화학식 O25b (여기서 n은 31 내지 90의 정수임)를 포함하는 사카라이드에 공유결합으로 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체, (b) 화학식 O1A (여기서 n은 31 내지 90의 정수임)를 포함하는 사카라이드에 공유결합으로 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체, (c) 화학식 O2 (여기서 n은 31 내지 90의 정수임)를 포함하는 사카라이드에 공유결합으로 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체, 및 (d) 화학식 O6 (여기서 n은 31 내지 90의 정수임)을 포함하는 사카라이드에 공유결합으로 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
C181. 항목 C180에 있어서, 하기 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18 및 화학식 O75 (여기서 n은 31 내지 90의 정수임) 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함하는 사카라이드에 공유결합으로 결합된 담체 단백질을 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C182. 항목 C180에 있어서, 조성물 내의 사카라이드의 총량과 비교하여 최대 25% 유리 사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물.
C183. 항목 C180 내지 C182 중 어느 하나에 따른 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 도출하는 방법.
C184. 항목 C183에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이에 대한 옵소닌식세포성 항체를 포함하는 것인 방법.
C185. 항목 C183에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이 감염으로부터 포유동물을 보호하는 것인 방법.
C186. (a) 항목 C1 내지 C55 중 어느 하나의 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 코딩하는 제1 관심 유전자를 포함하는 재조합 포유동물 세포로서, 여기서 유전자는 적어도 2개의 재조합 표적 부위 (RTS) 사이에 통합된 것인 재조합 포유동물 세포.
C187. 항목 C186에 있어서, 2개의 RTS가 NL1 유전자좌 또는 NL2 유전자좌 내에 염색체-통합된 것인 실시양태.
C188. 항목 C186에 있어서, 제1 관심 유전자가 리포터 유전자, 발현하기 어려운 단백질을 코딩하는 유전자, 보조 유전자 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 실시양태.
C189. 항목 C186에 있어서, (a)의 유전자좌와 구별되는 제2 염색체 유전자좌 내에 통합된 제2 관심 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 제2 관심 유전자는 리포터 유전자, 발현하기 어려운 단백질을 코딩하는 유전자, 보조 유전자 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 실시양태.
C190. C186에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 포유동물 세포의 게놈 DNA에 통합된 것인 재조합 세포.
C191. C186에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 세포에서의 발현에 최적화된 코돈인 재조합 세포.
C192. C186에 있어서, 세포가 인간 배아 신장 세포인 재조합 세포.
C193. C192에 있어서, 인간 배아 신장 세포가 HEK293 세포를 포함하는 것인 재조합 세포.
C194. C193에 있어서, HEK293 세포가 HEK293T 세포, HEK293TS 세포 및 HEK293E 세포 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 재조합 세포.
C195. C186에 있어서, 세포가 CHO 세포인 재조합 세포.
C196. C195에 있어서, 상기 CHO 세포가 CHO-K1 세포, CHO-DUXB11, CHO-DG44 세포, 또는 CHO-S 세포인 재조합 세포.
C197. C186에 있어서, 폴리펩티드가 가용성인 재조합 세포.
C198. C186에 있어서, 폴리펩티드가 세포로부터 분비되는 것인 재조합 세포.
C199. C186의 재조합 세포를 포함하는 배양물로서, 여기서 상기 배양물은 크기가 적어도 5 리터인 배양물.
C200. C199에 있어서, 폴리펩티드 또는 그의 단편의 수율이 적어도 0.05 g/L인 배양물.
C201. C199에 있어서, 폴리펩티드 또는 그의 단편의 수율이 적어도 0.10 g/L인 배양물.
C202. C186에 따른 재조합 포유동물 세포를 적합한 조건 하에 배양하여, 이에 의해 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 단계; 및 폴리펩티드 또는 그의 단편을 수확하는 단계를 포함하는, 이. 콜라이로부터 유래된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 생산하는 방법.
C203. C202에 있어서, 폴리펩티드 또는 그의 단편을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
C204. 항목 C54에 있어서, O1, O2, O3 및 O5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 케이. 뉴모니아에 유형으로부터 유래된 적어도 하나의 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C205. 항목 C204에 있어서, 케이. 뉴모니아에 유형 O1로부터 유래된 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C206. 항목 C204에 있어서, 케이. 뉴모니아에 유형 O2로부터 유래된 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C207. 항목 C204에 있어서, 케이. 뉴모니아에 유형 O3으로부터 유래된 사카라이드를 추가로 포함하는 조성물.
C208. 항목 C204에 있어서, 케이. 뉴모니아에 유형 O5로부터 유래된 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C209. 항목 C204에 있어서, 케이. 뉴모니아에 유형 O1로부터 유래된 사카라이드 및 케이. 뉴모니아에 유형 O2로부터 유래된 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
C210. 항목 C204 내지 C209 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 어느 하나로부터 선택된 구조를 포함하는 적어도 하나의 사카라이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물: 화학식 O1, 화학식 O1A, 화학식 O1B, 화학식 O1C, 화학식 O2, 화학식 O3, 화학식 O4, 화학식 O4:K52, 화학식 O4:K6, 화학식 O5, 화학식 O5ab, 화학식 O5ac, 화학식 O6, 화학식 O6:K2; K13; K15, 화학식 O6:K54, 화학식 O7, 화학식 O8, 화학식 O9, 화학식 O10, 화학식 O11, 화학식 O12, 화학식 O13, 화학식 O14, 화학식 O15, 화학식 O16, 화학식 O17, 화학식 O18, 화학식 O18A, 화학식 O18ac, 화학식 O18A1, 화학식 O18B, 화학식 O18B1, 화학식 O19, 화학식 O20, 화학식 O21, 화학식 O22, 화학식 O23, 화학식 O23A, 화학식 O24, 화학식 O25, 화학식 O25a, 화학식 O25b, 화학식 O26, 화학식 O27, 화학식 O28, 화학식 O29, 화학식 O30, 화학식 O32, 화학식 O33, 화학식 O34, 화학식 O35, 화학식 O36, 화학식 O37, 화학식 O38, 화학식 O39, 화학식 O40, 화학식 O41, 화학식 O42, 화학식 O43, 화학식 O44, 화학식 O45, 화학식 O45, 화학식 O45rel, 화학식 O46, 화학식 O48, 화학식 O49, 화학식 O50, 화학식 O51, 화학식 O52, 화학식 O53, 화학식 O54, 화학식 O55, 화학식 O56, 화학식 O57, 화학식 O58, 화학식 O59, 화학식 O60, 화학식 O61, 화학식 O62, 화학식 62D1, 화학식 O63, 화학식 O64, 화학식 O65, 화학식 O66, 화학식 O68, 화학식 O69, 화학식 O70, 화학식 O71, 화학식 O73, 화학식 O73, 화학식 O74, 화학식 O75, 화학식 O76, 화학식 O77, 화학식 O78, 화학식 O79, 화학식 O80, 화학식 O81, 화학식 O82, 화학식 O83, 화학식 O84, 화학식 O85, 화학식 O86, 화학식 O87, 화학식 O88, 화학식 O89, 화학식 O90, 화학식 O91, 화학식 O92, 화학식 O93, 화학식 O95, 화학식 O96, 화학식 O97, 화학식 O98, 화학식 O99, 화학식 O100, 화학식 O101, 화학식 O102, 화학식 O103, 화학식 O104, 화학식 O105, 화학식 O106, 화학식 O107, 화학식 O108, 화학식 O109, 화학식 O110, 화학식 0111, 화학식 O112, 화학식 O113, 화학식 O114, 화학식 O115, 화학식 O116, 화학식 O117, 화학식 O118, 화학식 O119, 화학식 O120, 화학식 O121, 화학식 O123, 화학식 O124, 화학식 O125, 화학식 O126, 화학식 O127, 화학식 O128, 화학식 O129, 화학식 O130, 화학식 O131, 화학식 O132, 화학식 O133, 화학식 O134, 화학식 O135, 화학식 O136, 화학식 O137, 화학식 O138, 화학식 O139, 화학식 O140, 화학식 O141, 화학식 O142, 화학식 O143, 화학식 O144, 화학식 O145, 화학식 O146, 화학식 O147, 화학식 O148, 화학식 O149, 화학식 O150, 화학식 O151, 화학식 O152, 화학식 O153, 화학식 O154, 화학식 O155, 화학식 O156, 화학식 O157, 화학식 O158, 화학식 O159, 화학식 O160, 화학식 O161, 화학식 O162, 화학식 O163, 화학식 O164, 화학식 O165, 화학식 O166, 화학식 O167, 화학식 O168, 화학식 O169, 화학식 O170, 화학식 O171, 화학식 O172, 화학식 O173, 화학식 O174, 화학식 O175, 화학식 O176, 화학식 O177, 화학식 O178, 화학식 O179, 화학식 O180, 화학식 O181, 화학식 O182, 화학식 O183, 화학식 O184, 화학식 O185, 화학식 O186, 화학식 O187, 여기서 n은 1 내지 100, 보다 바람직하게는 31 내지 90의 정수이다.
C211. 항목 C210에 있어서, 케이. 뉴모니아에로부터 유래된 사카라이드가 담체 단백질에 접합되고; 이. 콜라이로부터 유래된 사카라이드가 담체 단백질에 접합된 것인 면역원성 조성물.
C212. 항목 C204-C211 중 어느 하나에 따른 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 도출하는 방법.
C213. 항목 C212에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이에 대한 옵소닌식세포성 항체를 포함하는 것인 방법.
C214. 항목 C212에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이 감염으로부터 포유동물을 보호하는 것인 방법.
C215. 항목 C204-C211 중 어느 하나에 따른 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 케이. 뉴모니아에에 대한 면역 반응을 도출하는 방법.
C216. 항목 C215에 있어서, 면역 반응이 케이. 뉴모니아에에 대한 옵소닌식세포성 항체를 포함하는 것인 방법.
C217. 항목 C215에 있어서, 면역 반응이 케이. 뉴모니아에 감염으로부터 포유동물을 보호하는 것인 방법.
C218. 항목 C204 내지 C217 중 어느 하나에 있어서, 케이. 뉴모니아에 혈청형 O1이 변이체 O1V1 또는 O1V2를 포함하는 것인 조성물 및 방법.
C219. 항목 C204 내지 C217 중 어느 하나에 있어서, 케이. 뉴모니아에 혈청형 O2가 변이체 O2V1 또는 O2V2를 포함하는 것인 조성물 및 방법.
C220. 본원에 제시된 바와 같은 항목 C1-C219 중 어느 하나에 제시된 조성물의 용도.
C221. 항목 C211에 있어서, 케이. 뉴모니아에 O-항원이 a) 혈청형 O1 하위유형 v1 (O1v1), b) 혈청형 O1 하위유형 v2 (O1v2), c) 혈청형 O2 하위유형 v1 (O2v1), 및 d) 혈청형 O2 하위유형 v2 (O2v2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
C222. 항목 C1-C221 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
C223. 항목 C222에 있어서, 핵산이 RNA인 핵산.
C224. 항목 C222 또는 C223의 핵산을 포함하는 나노입자.
C225. 화학식 O4, 화학식 O11, 화학식 O13, 화학식 O21 및 화학식 O86 (여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90의 정수임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 사카라이드를 갖는 하나 이상의 접합체를 추가로 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물.
C226. 화학식 O1a, 화학식 O2, 화학식 O6 및 화학식 O25b (여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 90의 정수임)로 이루어진 군으로부터 선택된 사카라이드를 갖는 하나 이상의 접합체를 추가로 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물.
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. Che, Ye Chorro, Laurent Oliver Donald, Robert George Konrad Griffor, Matthew Curtis Silmon de Monerri, Natalie Clare <120> E. coli FimH Mutants and Uses Thereof <130> PC072713 <160> 147 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr 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Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 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Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 50 55 60 <210> 142 <211> 574 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus A (strain A2) <400> 142 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 143 <211> 64 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus A (strain A2) <400> 143 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn 20 25 30 Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn 35 40 45 Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 50 55 60 <210> 144 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 145 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val 35 40 45 Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser 50 55 <210> 146 <211> 562 <212> PRT <213> Influenza A virus (strain A/Japan/305/1957 H2N2) <400> 146 Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp 1 5 10 15 Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp 20 25 30 Thr Asn Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu 35 40 45 Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro 65 70 75 80 Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu 85 90 95 Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp 100 105 110 Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys 115 120 125 Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly 130 135 140 Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn 145 150 155 160 Met Val Trp Leu Thr Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly 165 170 175 Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val 180 185 190 His His Pro Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val 195 200 205 Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr 210 215 220 Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met 225 230 235 240 Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu 245 250 255 Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys 260 265 270 Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys 275 280 285 Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro 290 295 300 Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val 305 310 315 320 Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln 325 330 335 Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly 340 345 350 Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn 355 360 365 Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala 370 375 380 Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn 385 390 395 400 Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Arg Arg 405 410 415 Leu Glu Asn Leu Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp 420 425 430 Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu 435 440 445 Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met 450 455 460 Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe 465 470 475 480 Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr 485 490 495 Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu 500 505 510 Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala 515 520 525 Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala 530 535 540 Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile 545 550 555 560 Cys Ile <210> 147 <211> 54 <212> PRT <213> Influenza A virus (strain A/Japan/305/1957 H2N2) <400> 147 Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Phe 1 5 10 15 Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn 35 40 45 Leu Val Val Asp Leu Ser 50

Claims (23)

  1. 야생형 FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열 대비 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드로서, 여기서 돌연변이 위치는 F1, P12, G14, G15, G16, A18, P26, V27, V28, Q32, N33, L34, V35, R60, S62, Y64, G65, L68, F71, T86, L107, Y108, L109, V112, S113, A115, G116, V118, A119, A127, L129, Q133, F144, V154, V155, V156, P157, T158, V163 및 V185로 이루어진 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 서열식별번호: 59에 따라 넘버링되는 것인 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, F1I; F1L; F1V; F1M; F1Y; F1W; P12C; G14C; G15A; G15P; G16A; G16P; A18C; P26C; V27A; V27C; V28C; Q32C; N33C; L34C; L34N; L34S; L34T; L34D; L34E; L34K; L34R; V35C; R60P; S62C; Y64C; G65A; L68C; F71C; T86C; L107C; Y108C; L109C; V112C; S113C; A115V; G116C; V118C; A119C; A119N; A119S; A119T; A119D; A119E; A119K; A119R; A127C; L129C; Q133K; F144C; V154C; V156C; P157C; T158C; V163I; 및 V185I, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드:
    a) 돌연변이 G15A 및 G16A;
    b) 돌연변이 P12C 및 A18C;
    c) 돌연변이 G14C 및 F144C;
    d) 돌연변이 P26C 및 V35C;
    e) 돌연변이 P26C 및 V154C;
    f) 돌연변이 P26C 및 V156C;
    g) 돌연변이 V27C 및 L34C;
    h) 돌연변이 V28C 및 N33C;
    i) 돌연변이 V28C 및 P157C;
    j) 돌연변이 Q32C 및 Y108C;
    k) 돌연변이 N33C 및 L109C;
    l) 돌연변이 N33C 및 P157C;
    m) 돌연변이 V35C 및 L107C;
    n) 돌연변이 V35C 및 L109C;
    o) 돌연변이 S62C 및 T86C;
    p) 돌연변이 S62C 및 L129C;
    q) 돌연변이 Y64C 및 L68C;
    r) 돌연변이 Y64C 및 A127C;
    s) 돌연변이 L68C 및 F71C;
    t) 돌연변이 V112C 및 T158C;
    u) 돌연변이 S113C 및 G116C;
    v) 돌연변이 S113C 및 T158C;
    w) 돌연변이 V118C 및 V156C;
    x) 돌연변이 A119C 및 V155C;
    y) 돌연변이 L34N 및 V27A;
    z) 돌연변이 L34S 및 V27A;
    aa) 돌연변이 L34T 및 V27A;
    ab) 돌연변이 L34D 및 V27A;
    ac) 돌연변이 L34E 및 V27A;
    ad) 돌연변이 L34K 및 V27A;
    ae) 돌연변이 L34R 및 V27A;
    af) 돌연변이 A119N 및 V27A;
    ag) 돌연변이 A119S 및 V27A;
    ah) 돌연변이 A119T 및 V27A;
    ai) 돌연변이 A119D 및 V27A;
    aj) 돌연변이 A119E 및 V27A;
    ak) 돌연변이 A119K 및 V27A;
    al) 돌연변이 A119R 및 V27A;
    am) 돌연변이 G15A 및 V27A;
    an) 돌연변이 G16A 및 V27A;
    ao) 돌연변이 G15P 및 V27A;
    ap) 돌연변이 G16P 및 V27A;
    aq) 돌연변이 G15A, G16A 및 V27A;
    ar) 돌연변이 G65A 및 V27A;
    as) 돌연변이 V27A 및 Q133K; 및
    at) 돌연변이 G15A, G16A, V27A 및 Q133K.
  4. 제2항에 있어서, 서열식별번호: 2-58 및 60-64 중 어느 하나의 서열을 포함하는 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
  6. (i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 추가 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 적어도 하나의 추가 항원이 폴리사카라이드 또는 단백질인 면역원성 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성인 돌연변이된 FimH 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 포유동물 세포.
  14. 제13항의 재조합 세포를 포함하는 배양물로서, 여기서 상기 배양물은 크기가 적어도 5 리터인 배양물.
  15. 제13항에 따른 재조합 포유동물 세포를 적합한 조건 하에 배양하여, 이에 의해 폴리펩티드를 발현하는 단계; 및 폴리펩티드를 수확하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 FimH 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  16. (i) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이(E. coli)에 대한 면역 반응을 유도하거나, 또는 (ii) 대상체에서 장외 병원성 이. 콜라이에 특이적인 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체의 생산을 유도하는 방법으로서, 여기서 방법은 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 대상체가 요로 감염이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 대상체가 균혈증이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 대상체가 패혈증이 발병할 위험이 있는 것인 방법.
  20. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 이. 콜라이에 대한 면역 반응을 도출하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이에 대한 옵소닌식세포성 및/또는 중화 항체를 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 면역 반응이 이. 콜라이 감염으로부터 포유동물을 보호하는 것인 방법.
  23. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 호전시키는 방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL313494A (en) 2021-12-17 2024-08-01 Pfizer Polynucleotide preparations and their uses
WO2023227608A1 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE68907045T2 (de) 1989-01-17 1993-12-02 Eniricerche Spa Synthetische Peptide und deren Verwendung als allgemeine Träger für die Herstellung von immunogenischen Konjugaten, die für die Entwicklung von synthetischen Impfstoffen geeignet sind.
AU651949B2 (en) 1989-07-14 1994-08-11 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
DE69113564T2 (de) 1990-08-13 1996-05-30 American Cyanamid Co Faser-Hemagglutinin von Bordetella pertussis als Träger für konjugierten Impfstoff.
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
WO1993021769A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
US5340740A (en) 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
JP3755890B2 (ja) 1992-06-25 2006-03-15 スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） アジュバント含有ワクチン組成物
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
EP0616034B1 (en) 1993-03-05 2004-10-20 Wyeth Holdings Corporation Plasmid for production of CRM protein and diphtheria toxin
ATE204762T1 (de) 1993-03-23 2001-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
FR2726003B1 (fr) 1994-10-21 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires
GB9513261D0 (en) 1995-06-29 1995-09-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5846547A (en) 1996-01-22 1998-12-08 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
AUPO517897A0 (en) 1997-02-19 1997-04-11 Csl Limited Chelating immunostimulating complexes
US6214806B1 (en) 1997-02-28 2001-04-10 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CPC dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders
CA2301575C (en) 1997-05-20 2003-12-23 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
GB9712347D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
DE69815692T2 (de) 1997-09-05 2004-04-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Öl in wasser emulsionen mit saponinen
US6303114B1 (en) 1998-03-05 2001-10-16 The Medical College Of Ohio IL-12 enhancement of immune responses to T-independent antigens
DE69935507T2 (de) 1998-04-03 2007-12-06 University Of Iowa Research Foundation Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
IL138000A0 (en) 1998-04-09 2001-10-31 Smithkline Beecham Biolog Adjuvant compositions
GB9817052D0 (en) 1998-08-05 1998-09-30 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2347099C (en) 1998-10-16 2014-08-05 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Adjuvant systems comprising an immunostimulant adsorbed to a metallic salt particle and vaccines thereof
ATE422899T1 (de) 1998-12-21 2009-03-15 Medimmune Inc Streptococcus pneumoniae proteine und immunogene fragmente für impstoffe
TR200200633T2 (tr) 1998-12-23 2002-06-21 Shire Biochem Inc. Yeni streptococcus antijenleri
AUPP807399A0 (en) 1999-01-08 1999-02-04 Csl Limited Improved immunogenic lhrh composition and methods relating thereto
AU783344B2 (en) 1999-02-17 2005-10-20 Csl Limited Immunogenic complexes and methods relating thereto
WO2000056360A2 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against antigens from bacteriae
WO2000061761A2 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
IL145982A0 (en) 1999-04-19 2002-07-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
AR025749A1 (es) 1999-09-24 2002-12-11 Smithkline Beecham Biolog Vacunas
CN1391483A (zh) 1999-09-24 2003-01-15 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 作为佐剂的聚氧乙烯脱水山梨醇酯和辛苯昔醇组合及其在疫苗中的应用
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
CA2413450C (en) 2000-06-20 2014-02-18 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
WO2002102974A2 (en) 2000-12-08 2002-12-27 Medimmune, Inc. Mutant proteins, high potency inhibitory antibodies and fimch crystal structure
AU2002309706A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
US7262024B2 (en) 2001-12-20 2007-08-28 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
EP1601689B1 (en) 2003-03-13 2007-11-28 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
EP1603950A2 (en) 2003-03-17 2005-12-14 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
WO2006134423A2 (en) 2004-07-18 2006-12-21 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Methods and compositions for inducing innate immune responses
CA2572427A1 (en) 2004-07-18 2006-01-18 Heather L. Davis Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
IL308456A (en) 2005-04-08 2024-01-01 Wyeth Llc A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation
WO2009000825A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
WO2010125480A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
MX363511B (es) 2012-08-16 2019-03-26 Pfizer Proceso de glucoconjugación y composiciones.
ES2685894T3 (es) 2013-03-08 2018-10-15 Pfizer Inc. Polipéptidos de fusión inmunogénicos
US9504743B2 (en) * 2013-09-25 2016-11-29 Sequoia Sciences, Inc Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
WO2016183501A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 University Of Washington Compositions and methods for treatment and prevention of uropathogenic e. coli infection
WO2018150269A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Lonza Ltd. Multi-site specific integration cells for difficult to express proteins
WO2019175147A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccines against intra-abdominal infections
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
WO2021084429A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3168108A1 (en) * 2020-01-16 2021-07-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutant, compositions therewith and use thereof
WO2021165928A2 (en) * 2020-02-23 2021-08-26 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof

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