JP2024503792A - 大腸菌ＦｉｍＨ変異体およびその使用 - Google Patents

大腸菌ＦｉｍＨ変異体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、改善された生化学的特性および免疫原性をもたらす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異ＦｉｍＨポリペプチドの設計、そのようなポリペプチドを含む組成物、ならびにこれらの使用に関する。【図１】TIFF2024503792000045.tif138135

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１２月２３日に出願された米国仮出願第６３／１３０，１５３号、２０２１年５月７日に出願された米国仮出願第６３／１８５，４２５号、および２０２１年１１月２３日に出願された米国仮出願第６３／２８２，２４４号に基づく優先権を主張する。前述の出願のそれぞれの全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願され、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは２０２１年１１月１７日に作成され、２２０ＫＢのサイズを有する、「ＰＣ０７２７１３＿ＳＴ２５＿１７Ｎｏｖ２０２１．ｔｘｔ」の表題の配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の技術分野
本開示は、突然変異した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドおよびその使用方法に関する。
尿路感染（ＵＴＩ）は、女性の５人に１人が、その生涯で少なくとも１回は罹り、著しい罹患率（ｍｏｂｉｄｉｔｙ）および死亡率の原因となり、医療制度に相当な負担をかける。いくつかの異なる細菌が、ＵＴＩを引き起こし得るが、最も一般的な原因（症例の９０～９５％）は、グラム陰性細菌大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））である。大部分の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＵＴＩは、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）によって引き起こされ、ＵＰＥＣは、胃腸管に定着し、糞便細菌叢から尿生殖路に移動し、そこで宿主尿路上皮細胞に接着し、これにより、尿路の上行性感染のためのレザーバーを確立する。接着は、上皮層におけるマンノシル化糖タンパク質に結合する、または尿中に分泌される、１型フィムブリエを含む線毛アドヘシンによって容易となる。１型フィムブリエは、臨床ＵＰＥＣ単離物の間で高度に保存されており、アクセサリータンパク質（ＦｉｍＣ、ＦｉｍＤ）、様々な構造サブユニット（ＦｉｍＥ、ＦｉｍＦ、ＦｉｍＧ）およびＦｉｍＨと呼ばれるアドヘシンをコードするｆｉｍと呼ばれる遺伝子のクラスターによってコードされる。ＦｉｍＨは、ヒト膀胱感染の側面を模倣するマウスモデルにおけるＵＴＩ感染の全ての特徴に必須である（Ｈａｎｎａｎら、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１０ Ａｕｇ １２；６（８）：ｅ１００１０４２；ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００１０４２；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２０１１ Ｏｃｔ；７９（１０）：４２５０～９．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＩＡＩ．０５３３９－１１）。マンノシル化受容体を模倣することによりＦｉｍＨを標的とする低分子阻害剤は、ＵＴＩにおけるＦｉｍＨの役割をさらに実証し、動物モデルにおける治療薬としての見込みを示している（Ｃｕｓｕｍａｎｏ ＣＫら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１１；３（１０９）：１０９ｒａ１１５．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００３０２１）。加えて、ＦｉｍＨは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヒト膀胱炎単離物において正の選択下にあり（Ｃｈｅｎ ＳＬら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９ Ｄｅｃ ２９；１０６（５２）：２２４３９～４４．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０２１７９１０６）、正に選択された残基は、膀胱炎のマウスモデルにおいてビルレンスに影響を与え得る（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、１５５３０～１５５３７、ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１５２０３１１０（２０１３））。
ＦｉｍＨは、２つのドメインである、マンノシル化糖タンパク質への結合の原因となるレクチン結合ドメイン（ＦｉｍＨＬＤ）と、ピリンドメインで構成される。ピリンドメインは、ドナー鎖交換と呼ばれる機構により、ＦｉｍＨを、ＦｉｍＧなどの線毛の他の構造サブユニットに連結するように機能する（Ｌｅ Ｔｒｏｎｇ、Ｉら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ；１７２（３）：３８０～８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｂ．２０１０．０６．００２）。ＦｉｍＨピリンドメインは、ＦｉｍＧのＮ末端β鎖のための結合部位を提供する溝を生じる不完全免疫グロブリンフォールドを形成し、ＦｉｍＨおよびＦｉｍＧの間に強い分子間連結を形成する。ＦｉｍＨＬＤは、可溶性の安定した形態で発現され得るが、全長ＦｉｍＨは、ペプチド形態でまたは融合タンパク質として、シャペロンＦｉｍＣと複合体形成しない限り、またはＦｉｍＧのドナー鎖ペプチドで補完されない限り（Ｂａｒｎｈａｒｔ ＭＭら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２０００）Ｊｕｌ ５；９７（１４）：７７０９～１４；Ｓａｕｅｒ ＭＭら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１６）Ｍａｒ ７；７：１０７３８；Ｂａｒｎｈａｒｔ ＭＭら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３ Ｍａｙ；１８５（９）：２７２３～３０）、単独では不安定である（Ｖｅｔｓｃｈ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２２：８２７～８４０（２００２）；Ｂａｒｎｈａｒｔ ＭＭら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２０００）Ｊｕｌ ５；９７（１４）：７７０９～１４）。グリシン－セリンリンカーを介してＦｉｍＧドナーペプチドを全長ＦｉｍＨに連結することによる全長ＦｉｍＨ分子の設計および発現は、以前に記載されており（２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９）、これは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧと命名された。
ＦｉｍＨＬＤは、機能的免疫原性を刺激するその能力の観点から、不十分な免疫原であると考えられる。いくつかの研究は、結合抗体価は、アジュバントありおよびなしでＦｉｍＨＬＤにより惹起され得るが、機能的中和力価は、アジュバントの存在下でのみ観察されたことを示唆する（２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９）。研究は、マンノシドリガンドに対して低減した親和性を有するオープンコンフォメーションでＦｉｍＨをロックすることが、機能的免疫原性を改善することを示唆する（Ｋｉｓｉｅｌａ、Ｄ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、１９０８９～１９０９４（２０１３）。したがって、野生型ＦｉｍＨと比べて改善された機能的免疫原性をもたらす、マンノシドリガンドに対する低減した親和性および改善された生化学的特性を有する新規ＦｉｍＨ変異体の必要性が当業界にはある。
本開示は、改善された生化学的特性および免疫原性をもたらす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ突然変異ポリペプチドの設計、そのようなポリペプチドを含む組成物、ならびにこれらの使用に関する。例えば、一態様では、本開示は、野生型ＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列と比べた少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドであって、突然変異位置が、Ｆ１、Ｐ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ａ１８、Ｐ２６、Ｖ２７、Ｖ２８、Ｑ３２、Ｎ３３、Ｌ３４、Ｖ３５、Ｒ６０、Ｓ６２、Ｙ６４、Ｇ６５、Ｌ６８、Ｆ７１、Ｔ８６、Ｌ１０７、Ｙ１０８、Ｌ１０９、Ｖ１１２、Ｓ１１３、Ａ１１５、Ｇ１１６、Ｖ１１８、Ａ１１９、Ａ１２７、Ｌ１２９、Ｑ１３３、Ｆ１４４、Ｖ１５４、Ｖ１５５、Ｖ１５６、Ｐ１５７、Ｔ１５８、Ｖ１６３およびＶ１８５からなる群から選択され、アミノ酸位置が、配列番号５９に従ってナンバリングされる、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを提供する。
さらなる態様では、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、Ｆ１Ｉ；Ｆ１Ｌ；Ｆ１Ｖ；Ｆ１Ｍ；Ｆ１Ｙ；Ｆ１Ｗ；Ｐ１２Ｃ；Ｇ１４Ｃ；Ｇ１５Ａ；Ｇ１５Ｐ；Ｇ１６Ａ；Ｇ１６Ｐ；Ａ１８Ｃ；Ｐ２６Ｃ；Ｖ２７Ａ；Ｖ２７Ｃ；Ｖ２８Ｃ；Ｑ３２Ｃ；Ｎ３３Ｃ；Ｌ３４Ｃ；Ｌ３４Ｎ；Ｌ３４Ｓ；Ｌ３４Ｔ；Ｌ３４Ｄ；Ｌ３４Ｅ；Ｌ３４Ｋ；Ｌ３４Ｒ；Ｖ３５Ｃ；Ｒ６０Ｐ；Ｓ６２Ｃ；Ｙ６４Ｃ；Ｇ６５Ａ；Ｌ６８Ｃ；Ｆ７１Ｃ；Ｔ８６Ｃ；Ｌ１０７Ｃ；Ｙ１０８Ｃ；Ｌ１０９Ｃ；Ｖ１１２Ｃ；Ｓ１１３Ｃ；Ａ１１５Ｖ；Ｇ１１６Ｃ；Ｖ１１８Ｃ；Ａ１１９Ｃ；Ａ１１９Ｎ；Ａ１１９Ｓ；Ａ１１９Ｔ；Ａ１１９Ｄ；Ａ１１９Ｅ；Ａ１１９Ｋ；Ａ１１９Ｒ；Ａ１２７Ｃ；Ｌ１２９Ｃ；Ｑ１３３Ｋ；Ｆ１４４Ｃ；Ｖ１５４Ｃ；Ｖ１５６Ｃ；Ｐ１５７Ｃ；Ｔ１５８Ｃ；Ｖ１６３Ｉ；およびＶ１８５Ｉ、またはこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を含む。例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１５ＡおよびＧ１６Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｐ１２ＣおよびＡ１８Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１４ＣおよびＦ１４４Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ３５Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ１５４Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ１５６Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ２７ＣおよびＬ３４Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ２８ＣおよびＮ３３Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ２８ＣおよびＰ１５７Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｑ３２ＣおよびＹ１０８Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｎ３３ＣおよびＬ１０９Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｎ３３ＣおよびＰ１５７Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ３５ＣおよびＬ１０７Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ３５ＣおよびＬ１０９Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｓ６２ＣおよびＴ８６Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｓ６２ＣおよびＬ１２９Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｙ６４ＣおよびＬ６８Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｙ６４ＣおよびＡ１２７Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ６８ＣおよびＦ７１Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ１１２ＣおよびＴ１５８Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｓ１１３ＣおよびＧ１１６Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｓ１１３ＣおよびＴ１５８Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ１１８ＣおよびＶ１５６Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＣおよびＶ１５５Ｃを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ３４ＮおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ３４ＳおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ３４ＴおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ３４ＤおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ３４ＥおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ３４ＫおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｌ３４ＲおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＮおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＳおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＴおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＤおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＥおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＫおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ａ１１９ＲおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１５ＡおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１６ＡおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１５ＰおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１６ＰおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１５Ａ、Ｇ１６ＡおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ６５ＡおよびＶ２７Ａを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｖ２７ＡおよびＱ１３３Ｋを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、突然変異Ｇ１５Ａ、Ｇ１６Ａ、Ｖ２７ＡおよびＱ１３３Ｋを含む。さらに、例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、配列番号２～５８および６０～６４のうちいずれか１つの配列を含む。さらに、例えば、本明細書に開示されている突然変異したＦｉｍＨポリペプチドであって、単離されたポリペプチドが提供される。
さらなる例では、本開示は、（ｉ）本明細書に開示されている突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
さらなる例では、本開示は、本明細書に開示されている突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。例えば、免疫原性組成物は、多糖または糖コンジュゲートまたはタンパク質などの少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む。さらに、例えば、免疫原性組成物は、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。
さらなる例では、本開示は、本明細書に開示されている突然変異したＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
さらなる例では、本開示は、本明細書に開示されている突然変異したＦｉｍＨポリペプチドであって、免疫原性であるポリペプチドを提供する。
本開示は、本明細書に開示されている突然変異したＦｉｍＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞をさらに提供する。
本開示は、本明細書に開示されている組換え細胞を含む培養物であって、少なくとも５リットル、少なくとも１０リットル、少なくとも２０リットル、少なくとも５０リットル、少なくとも１００リットル、少なくとも２００リットル、少なくとも５００リットル、少なくとも１０００リットルまたは少なくとも２０００リットルのサイズである培養物をさらに提供する。
本開示は、好適な条件下で、本明細書に開示されている組換え哺乳動物細胞を培養し、これにより、ポリペプチドを発現させること；およびポリペプチドを収集することを含む、本明細書に開示されている突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを産生するための方法をさらに提供する。
本開示は、（ｉ）腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する対象における免疫応答を誘導するための、または（ｉｉ）腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的な対象におけるオプソニン貪食作用および／もしくは中和抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の本明細書に開示されている組成物を投与することを含む方法をさらに提供する。一例では、対象は、尿路感染を発症するリスクがある。さらなる例では、対象は、菌血症を発症するリスクがある。さらなる例では、対象は、敗血症を発症するリスクがある。別の例では、対象は、クローン病を発症するリスクがある。
本開示は、哺乳動物に、有効量の本明細書に開示されている組成物を投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法をさらに提供する。一例では、免疫応答は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用および／または中和抗体を含む。さらなる例では、免疫応答は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する。
本開示は、対象に、免疫学的有効量の本明細書に開示されている組成物を投与することを含む、対象における細菌感染、疾患または状態を防止、処置または改善する方法をさらに提供する。
図１Ａ～図１Ｂは、ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体の円二色性スペクトルを示す。図１Ａは、近ＵＶにおける円二色性スペクトルを示し、図１Ｂは、遠ＵＶ領域における円二色性スペクトルを示す。 図２は、ＰＤ３における、酵母マンナン中和アッセイにおけるＦｉｍＨＬＤ変異体の相対的な免疫原性を示す。 図３Ａ～図３Ｂは、ＰＤ２（図３Ａ）およびＰＤ３（図３Ｂ）における、酵母マンナン中和アッセイにおけるＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体の免疫原性を示す。 図４は、野生型および突然変異した形態のＨｉｓタグを付けたＦｉｍＨ－ＤｓＧの単離に利用される、主要な精製ステップを示す図表である。 図５Ａ～図５Ｂは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴの精製プロファイルを示す。図５Ａは、ＳＰ－セファロースカラムにおけるＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴの溶出プロファイルであり、図５Ｂは、溶出された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。 図６Ａ～図６Ｂは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体の精製プロファイルを示す。図６Ａは、ＳＰ－セファロースカラムにおけるＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体の溶出プロファイルを示し、図６Ｂは、溶出された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 図７Ａ～図７Ｂは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧタンパク質の分析的ＳＥＣを示す。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａの分析的ＳＥＣは、図７Ａに示されており、野生型ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴの分析的ＳＥＣは、図７Ｂに示されている。 図８は、ＦｉｍＨ ＨＭＷ複合体形成の機構の略図を示す。 図９は、本明細書の実施例２１に記載されている、非ヒト霊長類の免疫化スケジュールおよびその後の負荷を示す。 図１０は、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体＋４価大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原（Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂ）によるＮＨＰのワクチン接種後の、Ｏ抗原血清型特異的抗体の上昇を示す。凡例：プラセボ（丸）；ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ（四角）；ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋４価Ｏ抗原（三角）。 図１１Ａ～図１１Ｂは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋／－４個の要素を持つ（４ｐｌｅｘ）Ｏ抗原による免疫化が、強力な機能的抗ＦｉｍＨ抗体応答を惹起することを示す。図１１Ａは、直接ルミネックスＦｉｍＨ ＩｇＧアッセイの結果を示し、図１１Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）結合阻害アッセイの結果を示す。本明細書で使用される場合、用語「４個の要素を持つ」は、用語「４価」と同じ意義を有し、これと互換的である。 図１２は、細菌尿が、実施例２１に記載される通り、負荷後に、ワクチン接種された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において低減されることを示す。凡例：プラセボ（丸）；ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ（四角）；ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋４価Ｏ抗原（三角）；＊プラセボ群と比較してｐ≦０．００７。 図１３Ａ～図１３Ｃは、感染のバイオマーカーが、実施例２１に記載される通り、３群：プラセボ、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ単独およびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋４価Ｏ抗原の負荷後に、ワクチン接種されたＮＨＰにおいて低減されることを示す。図１３Ａは、尿におけるＭＰＯの定量化を示し、図１３Ｂは、尿におけるＩＬ－８の定量化を示し、図１３Ｃは、尿沈渣において増大したＰＭＮを有する動物のパーセンテージを示す。凡例：プラセボ（丸）；ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ（四角）；ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋４価Ｏ抗原（三角）。
配列識別子
配列番号１は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ（ＦｉｍＨＬＤ＿ＷＴ）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ６５Ａ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｆ１Ｉのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｆ１Ｌのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｆ１Ｖのアミノ酸配列を記載する。
配列番号６は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｆ１Ｍのアミノ酸配列を記載する。
配列番号７は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｆ１Ｙのアミノ酸配列を記載する。
配列番号８は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｆ１Ｗのアミノ酸配列を記載する。
配列番号９は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｑ１３３Ｋのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１０は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１５Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１５Ｐのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１２は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１６Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１３は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１６Ｐのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１４は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１５Ａ＿Ｇ１６Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１５は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｒ６０Ｐのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１６は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ６５Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１７は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｐ１２Ｃ＿Ａ１８Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１８は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１４Ｃ＿Ｆ１４４Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１９は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｐ２６Ｃ＿Ｖ３５Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２０は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｐ２６Ｃ＿Ｖ１５４Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２１は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｐ２６Ｃ＿Ｖ１５６Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２２は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ２７Ｃ＿Ｌ３４Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２３は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ２８Ｃ＿Ｎ３３Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２４は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ２８Ｃ＿Ｐ１５７Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２５は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｑ３２Ｃ＿Ｙ１０８Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２６は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｎ３３Ｃ＿Ｌ１０９Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２７は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｎ３３Ｃ＿Ｐ１５７Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２８は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ３５Ｃ＿Ｌ１０７Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２９は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ３５Ｃ＿Ｌ１０９Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３０は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｓ６２Ｃ＿Ｔ８６Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３１は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｓ６２Ｃ＿Ｌ１２９Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３２は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｙ６４Ｃ＿Ｌ６８Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３３は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｙ６４Ｃ＿Ａ１２７Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３４は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｌ６８Ｃ＿Ｆ７１Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３５は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ１１２Ｃ＿Ｔ１５８Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３６は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｓ１１３Ｃ＿Ｇ１１６Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３７は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｓ１１３Ｃ＿Ｔ１５８Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３８は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ１１８Ｃ＿Ｖ１５６Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３９は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ａ１１９Ｃ＿Ｖ１５５Ｃのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４０は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｌ３４Ｎ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４１は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｌ３４Ｓ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４２は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｌ３４Ｔ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４３は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ａ１１９Ｎ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４４は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ａ１１９Ｓ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４５は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ａ１１９Ｔ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４６は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧ＿Ａ１１５Ｖのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４７は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧ＿Ｖ１６３Ｉのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４８は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧ＿Ｖ１８５Ｉのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４９は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧ＿ＤＳＧ＿Ｖ３Ｉのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５０は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１５Ａ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５１は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１６Ａ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５２は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１５Ｐ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５３は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１６Ｐ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５４は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１５Ａ＿Ｇ１６Ａ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５５は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ２７Ａ＿Ｒ６０Ｐのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５６は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ６５Ａ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５７は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｖ２７Ａ＿Ｑ１３３Ｋのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５８は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨＬＤ＿Ｇ１５Ａ＿Ｇ１６Ａ＿Ｖ２７Ａ＿Ｑ１３３Ｋのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５９は、リンカーを介して接続されたドナー鎖ＦｉｍＧペプチドを含む野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）全長ＦｉｍＨ（ＦｉｍＨ－ＤＳＧ＿ＷＴ）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号６０は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号６１は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧ＿Ｇ１５Ａ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号６２は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ ＤＳＧ＿Ｇ１５Ａ＿Ｇ１６Ａ＿Ｖ２７Ａのアミノ酸配列を記載する。
配列番号６３は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ ＤＳＧ＿Ｖ２７Ａ＿Ｑ１３３Ｋのアミノ酸配列を記載する。
配列番号６４は、変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ ＤＳＧ＿Ｇ１５Ａ＿Ｇ１６Ａ＿Ｖ２７Ａ＿Ｑ１３３Ｋのアミノ酸配列を記載する。
配列番号６５は、マウスＩｇカッパーシグナルペプチド配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号６６～１０８は、ナノ構造関連ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸および核酸配列を記載する。
配列番号１０９ － ＰＣＲ用プライマー。
配列番号１１０ － ＰＣＲ用プライマー。
配列番号１１１ － ＰＣＲ用プローブ。
配列番号１１２は、Ｏ２５ｂ ２４０１ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１３は、Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１４は、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１５は、Ｋ１２ Ｗ３１１０ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１６は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１７は、Ｏ２５ｂ ２４０１ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１８は、Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１９は、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１２０は、Ｏ１５７ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１２１は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号１２２は、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿Ｓのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１２３は、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿ＡＳのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１２４は、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ｓのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１２５は、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ａのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１２６は、ｗｚｚＢ Ｐ１＿Ｓのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１２７は、ｗｚｚＢ Ｐ２＿ＡＳのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１２８は、ｗｚｚＢ Ｐ３＿Ｓのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１２９は、ｗｚｚＢ Ｐ４＿ＡＳのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１３０は、Ｏ１５７ ＦｅｐＥ＿Ｓのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１３１は、Ｏ１５７ ＦｅｐＥ＿ＡＳのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１３２は、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿Ｓのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１３３は、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿ＡＳのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１３４は、ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ＿ｒのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１３５は、ｇｎｄ＿ｆのためのプライマー配列を記載する。
配列番号１３６は、ヒトＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１３７は、ヒトＩＬ１０タンパク質シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１３８は、ヒト呼吸系発疹ウイルスＡ（Ａ２株）融合糖タンパク質Ｆ０シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１３９は、インフルエンザＡ血球凝集素シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１４０～１４７は、シグナルペプチド予測のために使用される様々な種からのシグナルＰ ４．１（ＤＴＵ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）配列を記載する。
詳細な説明
本開示は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ突然変異ポリペプチド（変異体）、ＦｉｍＨ変異体を含む組成物、ＦｉｍＨ変異体を産生および精製するための方法、ＦｉｍＨ変異体をコードする核酸、そのような核酸を含む宿主細胞、ならびにＦｉｍＨ変異体を含む組成物を使用する方法に関する。
本明細書における値の範囲の列挙は、単に、この範囲内に収まる別々の値のそれぞれを個々に参照する簡単な方法として機能すること意図する。本明細書において他に指示がなければ、個々の値のそれぞれは、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているあらゆる方法は、本明細書において他に指示がなければまたは他に文脈と明らかに矛盾しなければ、いずれか好適な順序で実行することができる。本明細書に提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本開示をさらに説明することを単に意図するものであり、特許請求の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書におけるいかなる言語も、本開示の実施に必須であるといずれかの請求されていない要素を示すと解釈するべきではない。
いくつかの文書が、本開示のテキスト全体を通して引用されている。本明細書に引用されている文書（あらゆる特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の明細書、説明書等を含む）のそれぞれは、上記であれ下記であれ、これにより、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいずれも、本開示が、そのような開示に先行することの資格を有しないことの承認として解釈するべきではない。
定義
本明細書で使用される場合、用語「約」は、およそまたはほとんどを意味し、本明細書に記載される数的な値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または請求されている数的な値または範囲の±２０％、±１０％、±５％または±３％を意味する。
本開示を記載する文脈において（特に、特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」および同様の参照は、本明細書において他に指示がなければまたは文脈と明らかに矛盾しなければ、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されたい。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）を参照した「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわち、Ｎ末端および／またはＣ末端において短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端において短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’端を欠如するトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって入手可能である。Ｎ末端において短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが、翻訳を開始するように機能する開始コドンを含む限りにおいて、オープンリーディングフレームの５’端を欠如するトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって入手可能である。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列由来のアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくは、アミノ酸配列由来の少なくとも６、特に、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０または少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」または「ＷＴ」または「ネイティブ」は、アレル変種を含む、自然界で見出されるアミノ酸配列を指す。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列を有する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「バリアント」、または「変異体」、または「突然変異した」ポリペプチドの参照は、アミノ酸挿入バリアント／変異体、アミノ酸付加バリアント／変異体、アミノ酸欠失バリアント／変異体および／またはアミノ酸置換バリアント／変異体を含む。用語「バリアント」または「変異体」は、あらゆる変異体、スプライスバリアント、翻訳後修飾されたバリアント、コンフォメーション、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアントおよび種ホモログ、特に、天然起源のそれらを含む。用語「バリアント」または「変異体」は、特に、アミノ酸配列の断片を含む。
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列における単一のまたは２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１個または複数のアミノ酸残基が、アミノ酸配列における特定の部位に挿入されるが、その結果生じる産物の適切なスクリーニングによるランダム挿入も可能である。アミノ酸付加バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個以上のアミノ酸などの１個または複数のアミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合体を含む。アミノ酸欠失バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個以上のアミノ酸の除去など、配列からの１個または複数のアミノ酸の除去によって特徴付けされる。欠失は、タンパク質のいずれかの位置において為すことができる。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端の端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端トランケーションバリアントとも呼ばれる。アミノ酸置換バリアントは、除去されている配列中の少なくとも１個の残基、およびその場所に挿入されている別の残基によって特徴付けされる。相同タンパク質もしくはペプチドの間で保存されていないアミノ酸配列中の位置にある改変に対して、および／またはアミノ酸を、同様の特性を有する他のアミノ酸に置き換えることに対して優先が生じる。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは無電荷のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖に関連性があるアミノ酸のファミリーの１つの置換が関与する。天然起源のアミノ酸は一般に、次の４つのファミリーへと分けられる：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および無電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。一実施形態では、保存的アミノ酸置換は、次の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、スレオニン；
リシン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と、前記所与のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは、同一性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％となるであろう。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の長さ全体の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域についてもたらされる。例えば、参照アミノ酸配列が、２００アミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００アミノ酸の、一部の実施形態では、連続的なアミノ酸についてもたらされる。一部の実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の長さ全体についてもたらされる。配列類似性、好ましくは、配列同一性を決定するための整列は、当業界で公知のツールを用いて、好ましくは、最良の配列整列を使用して、例えば、Ａｌｉｇｎを使用して、標準設定、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。
本明細書で使用される場合、「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」は、これらの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つの核酸配列の間の「配列同一性」は、これらの配列の間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。
用語「％同一」、「％同一性」または同様の用語は、特に、比較されるべき配列の間の最適な整列において同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すことを意図する。前記パーセンテージは、純粋に統計的であり、２つの配列の間の差は、比較されるべき配列の長さ全体にわたってランダムに分布され得るが、必ずしもそうである必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、セグメントまたは「比較のウィンドウ」に関して、最適な整列の後に、これらの配列を比較することにより実行される。比較のための最適な整列は、手作業で、またはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２、４８２による局所相同性アルゴリズムの助けにより、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３による局所相同性アルゴリズムの助けにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８、２４４４による類似性検索アルゴリズムの助けにより、または前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）の助けにより実行することができる。一部の実施形態では、２つの配列のパーセント同一性は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑにおける）において入手できる、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。一部の実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトにおけるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのために使用されるアルゴリズムパラメータは、（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）２８に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリー範囲における最大マッチ；（ｉｖ）１、－２に設定されたマッチ／ミスマッチスコア；（ｖ）線形に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）使用されている低複雑性領域のためのフィルターを含む。一部の実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトにおけるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのために使用されるアルゴリズムパラメータは、（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）３に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリー範囲における最大マッチ；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたマトリックス；（ｖ）存在：１１ 伸長：１に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）コンディショナル組成スコアマトリックス調整を含む。
パーセンテージ同一性は、比較されるべき配列が対応する同一位置の数を決定し、この数を、比較される位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で割り、この結果に１００を掛けることにより得られる。
一部の実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の長さ全体の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域についてもたらされる。例えば、参照核酸配列が、２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００ヌクレオチドの、一部の実施形態では、連続的なヌクレオチドについてもたらされる。一部の実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の長さ全体についてもたらされる。
相同アミノ酸配列は、本開示に従って、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％同一性を呈する。本明細書に記載されているアミノ酸配列バリアント／変異体は、例えば、組換えＤＮＡ操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載されているペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成および同様の方法等により、公知ペプチド合成技法の助けにより容易に調製され得る。
一態様では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片またはバリアント／変異体は、好ましくは、「機能的断片」または「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的バリアント／変異体」という用語は、それが派生したアミノ酸配列のものと同一または同様の１種または複数の機能的特性を呈する、すなわち、機能的に等価である、いずれかの断片またはバリアント／変異体に関する。抗原または抗原性配列に関して、特定の機能の１つは、断片またはバリアントが派生したアミノ酸配列によって表示される１種または複数の免疫原性活性である。用語「機能的断片」または「機能的バリアント／変異体」は、本明細書で使用される場合、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１個または複数のアミノ酸が変更されたアミノ酸配列を含み、依然として、親分子または配列の機能のうち１種または複数、例えば、免疫応答の誘導を果たすことができる、バリアント／変異体分子または配列を指す。一態様では、親分子または配列のアミノ酸配列における改変は、分子または配列の特徴を有意に影響または変更しない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的バリアントの機能は、低減され得るが、依然として有意に存在し得る、例えば、機能的バリアントの免疫原性は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり得る。しかし、他の実施形態では、機能的断片または機能的バリアントの免疫原性は、親分子または配列と比較して増強され得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」は、天然状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存する材料から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができる、または例えば、宿主細胞などの非ネイティブ環境で存在することができる。
Ｉ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチド
１型フィムブリエを含む線毛アドヘシンは、上皮層におけるマンノシル化糖タンパク質に結合する、または尿中に分泌される。１型フィムブリエは、臨床ＵＰＥＣ単離物の間で高度に保存されており、アクセサリータンパク質（ＦｉｍＣ、ＦｉｍＤ）、様々な構造サブユニット（ＦｉｍＥ、ＦｉｍＦ、ＦｉｍＧ）およびＦｉｍＨと呼ばれるアドヘシンをコードするｆｉｍと呼ばれる遺伝子のクラスターによってコードされる。ＦｉｍＨは、２つのドメインである、マンノシル化糖タンパク質への結合の原因となるレクチン結合ドメイン（ＦｉｍＨＬＤ）、およびピリンドメインで構成される。ピリンドメインは、ドナー鎖交換と呼ばれる機構により、ＦｉｍＨをＦｉｍＧなどの線毛の他の構造サブユニットに連結するように機能する。ＦｉｍＨピリンドメインは、不完全免疫グロブリンフォールドを形成し、ＦｉｍＧのＮ末端β鎖のための結合部位を提供する溝をもたらし、ＦｉｍＨおよびＦｉｍＧの間に強い分子間連結を形成する。ＦｉｍＨＬＤは、可溶性の安定した形態で発現され得るが、全長ＦｉｍＨは、ペプチド形態でまたは融合タンパク質として、シャペロンＦｉｍＣと複合体形成しない限り、またはＦｉｍＧのドナー鎖ペプチドで補完されない限り、単独では不安定である。したがって、安定な全長ＦｉｍＨ分子の発現は、グリシン－セリンリンカーを介してＦｉｍＧドナーペプチドを全長ＦｉｍＨのＣ末端に連結することにより可能となり、これは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧと命名される。
一態様では、本開示は、表１に示されるものなど、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを提供する。そのような変異体は、対応する野生型（ＷＴ）ＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列と比べた、アミノ酸配列における突然変異を提供する。一部の態様では、そのような変異体は、野生型ＦｉｍＨタンパク質に対して、または野生型ＦｉｍＨポリペプチドを発現する細菌に対して免疫原性である。ある特定の態様では、ＦｉｍＨ変異体は、対応する野生型ＦｉｍＨポリペプチドと比較して増大した免疫原性特性など、ある特定の有益な特徴を保有する。
本明細書で使用される場合、用語「ＦｉｍＨポリペプチド」は、全長野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのいずれかのドメイン、全長野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのドメインのいずれかの組合せ、もしくは全長大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチド、またはこれらのいずれかの断片を指す。例えば、一実施形態では、本開示は、突然変異したＦｉｍＨＬＤポリペプチドまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧポリペプチドである突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを提供する。本開示は、機能的免疫原性を改善する、マンノシドリガンドに対して低減した親和性を有する（生化学的および生物物理学的分析によって検証）新規ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体に関し、野生型ＦｉｍＨＬＤと比べた、これらの変異体の中和応答の評価について記載する。
ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドにおける導入されたアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。一部の態様では、ＦｉｍＨポリペプチド変異体のアミノ酸配列における唯一の突然変異は、野生型ＦｉｍＨタンパク質と比べたアミノ酸置換である。
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野生型ＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列は、当業界で周知である。例えば、ＦｉｍＨＬＤドメインのアミノ酸配列は、配列番号１として本明細書に提供される。グリシン－セリンリンカーを介して全長ＦｉｍＨのＣ末端に連結されたＦｉｍＧドナーペプチドを含む全長野生型ＦｉｍＨポリペプチドは、配列番号５９として本明細書に提供される。そのようなアミノ酸配列をコードする核酸配列も、当業界で周知である。
本開示の一態様では、ある特定の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドは、マンノシドリガンドに対する低減された親和性をもたらし、改善された機能的免疫原性を生じる、ロックされたオープンコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）をもたらす。したがって、そのようなＦｉｍＨ変異体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染に対するワクチンなどの免疫原性組成物における抗原として有用となり得る。野生型ＦｉｍＨＬＤは、機能的免疫原性を刺激するその能力の観点から不十分な免疫原と考慮されるため、そのようなＦｉｍＨ変異体は、そのような免疫原性組成物において使用されるべき改善された抗原を提供することができる。
一態様では、実施例１に記載されている通り、ＦｉｍＨ変異体は、マンノシドリガンドに対する親和性を低減させるために、ＦｉｍＨレクチンドメインをオープンコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）にロックする試みにおいて設計された。そのような変異体は、少なくとも１、２、３、４、５個以上の突然変異を含むことができる。突然変異は、尿路感染単離物の間で共通の天然起源のアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｉｏｎ）（Ｖ２７Ａなど）；ＦｉｍＨＬＤのリガンド結合側における置換（位置Ｆ１およびＱ１３３におけるものなど）；ＦｉｍＨＬＤにおけるグリシンスイッチ突然変異（位置Ｇ１５、Ｇ１６およびＧ６５におけるものなど）；ＦｉｍＨＬＤにおけるジスルフィド結合安定化のためのシステイン対の導入（位置対Ｐ１２－Ａ１８；Ｇ１４－Ｆ１４４；Ｐ２６－Ｖ３５；Ｐ２６－Ｖ１５４；Ｐ２６－Ｖ１５６；Ｖ２７－Ｌ３４；Ｖ２８－Ｎ３３；Ｖ２８－Ｐ１５７；Ｑ３２－Ｙ１０８；Ｎ３３－Ｌ１０９；Ｎ３３－Ｐ１５７；Ｖ３５－Ｌ１０７；Ｖ３５－Ｌ１０９；Ｓ６２－Ｔ８６；Ｓ６２－Ｌ１２９；Ｙ６４－Ａ１２７；Ｌ６８－Ｆ７１；Ｖ１１２－Ｔ１５８；Ｓ１１３－Ｔ１５８；Ｖ１１８－Ｖ１５６；および／またはＡ１１９－Ｖ１５５におけるものなど）；ＦｉｍＨＬＤにおける非極性から極性への突然変異（位置Ｖ２７、Ｌ３４、Ａ１１９またはこれらのいずれかの組合せにおけるものなど）；ＦｉｍＨ－ＤＳＧのピリン－レクチン界面における空洞充填突然変異（ＤＳＧ配列内の位置Ａ１１５、Ｖ１６３、Ｖ１８５またはＶ３におけるものなど）；または上に記すアミノ酸位置における突然変異の型のいずれかの組合せを含むことができる。別の態様では、本開示は、配列番号２～５８および６０～６４において提供されるＦｉｍＨ変異体、またはそのような配列のいずれかにおいて記す変異体のいずれかの組合せを提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２３、５０、５１、５２、５３、５４、６０および６２のいずれかに従ったＦｉｍＨ変異体を提供する。さらなる態様では、本開示は、配列番号６２に従ったＦｉｍＨ変異体を提供する。
さらなる態様では、本開示は、単離された、配列番号２～５８および６０～６４に提供されているＦｉｍＨ変異体のいずれかを提供する。例えば、一態様では、本開示は、単離された、配列番号２３、５０、５１、５２、５３、５４、６０および６２のいずれかに従ったＦｉｍＨ変異体を提供する。さらなる態様では、本開示は、単離された、配列番号６２に従ったＦｉｍＨ変異体を提供する。
したがって、一部の特異的な態様では、本開示は、導入された突然変異の組合せを含むＦｉｍＨ変異体であって、表１に提供される変異体（すなわち、配列番号２～５８および６０～６４における）のいずれかに記載される突然変異の組合せを含む変異体を提供する。表１における変異体のそれぞれに提供されるアミノ酸置換のいずれかの組合せを野生型ＦｉｍＨポリペプチド配列に作製して、異なるＦｉｍＨ変異体に到達することができる。他のいずれかのサブタイプまたは株のネイティブＦｉｍＨポリペプチド配列に基づき、本明細書に記載されている突然変異の組合せのいずれかを含むＦｉｍＨ変異体もまた、本開示の範囲内にある。
本開示のさらなる態様は、配列番号１～６４のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるポリペプチドである。好まれる態様では、ポリペプチドは、配列番号６２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。本発明の別の態様は、配列番号１～６４のいずれかと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％同一であるポリペプチドである。好まれる態様では、ポリペプチドは、配列番号６２と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％同一である。
本開示によって提供されるＦｉｍＨ変異体は、好適なベクターを使用した組換え宿主系における発現などにより、当業界で公知のルーチン方法によって調製することができる。好適な組換え宿主細胞は、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、細菌および酵母細胞を含む。好適な昆虫細胞の例は、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（親イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するクローナル単離物）を含む。好適な哺乳動物細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって典型的に形質転換された、ＨＥＫ２９３またはＥｘｐｉ ２９３細胞）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、２９３－Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＨｅＬａ細胞を含む。好適な鳥類細胞は、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、ウズラ類線維芽細胞（例えば、ＥＬＬ－Ｏ）およびアヒル細胞を含む。バキュロウイルスベクターの系などの好適な昆虫細胞発現系は、当業者にとって公知であり、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．からキット形態で市販されている。鳥類細胞発現系もまた、当業者にとって公知であり、例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号に記載されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系もまた、当業界で公知であり、例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。
昆虫または哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現のための多数の好適なベクターは、当業界で周知かつ従来のものである。好適なベクターは、次のうち１つまたは複数を含むがこれらに限定されない、多数の構成成分を含有することができる：複製起点；選択可能マーカー遺伝子；転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または１つもしくは複数の翻訳シグナルなどの１つまたは複数の発現制御エレメント；ならびに選択された宿主細胞における分泌経路へと標的化するためのシグナル配列またはリーダー配列（例えば、哺乳動物起源のまたは異種哺乳動物もしくは非哺乳動物種に由来する）。例えば、昆虫細胞における発現のため、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの好適なバキュロウイルス発現ベクターが、組換えバキュロウイルス粒子の産生に使用される。バキュロウイルス粒子は、増幅され、昆虫細胞に感染させて組換えタンパク質を発現させるために使用される。哺乳動物細胞における発現のため、所望の哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）における構築物の発現を駆動するであろうベクターが使用される。
ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドは、いずれか好適な方法を使用して単離することができる。例えば、免疫親和性クロマトグラフィーによってＦｉｍＨタンパク質変異体ポリペプチドを精製するための方法が、当業界で公知である。Ｒｕｉｚ－Ａｒｇｕｅｌｌｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８５：３６７７～３６８７（２００４）。沈殿、ならびに様々な種類のクロマトグラフィー、例えば、疎水性相互作用、イオン交換、親和性、キレート化およびサイズ排除を含む、所望のタンパク質を精製するための好適な方法が、当業界で周知である。上述または他の好適な方法のうち２つ以上を使用して、好適な精製スキームを創出することができる。所望であれば、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドは、エピトープタグまたはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグなど、精製を容易にする「タグ」を含むことができる。そのようなタグを付けたポリペプチドは、例えば、馴化培地から、キレート化クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによって、簡便に単離することができる。
用語「抗原」は、本明細書で使用される場合、抗体によって認識され得る分子を指す。抗原の例は、免疫細胞によって認識されるものなど、抗原決定基を含有する、ポリペプチド、ペプチド、脂質、多糖および核酸を含む。
ＩＩ．ＦｉｍＨ変異体をコードする核酸
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されているＦｉｍＨ変異体をコードする核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。
一態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ突然変異ポリ（ｐｏｌ）ペプチドまたはそのいずれかの断片をコードする核酸が開示されている。ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドまたはその断片をコードする１つまたは複数の核酸構築物を、ゲノム組込みおよびその後のポリペプチド発現のために使用することができる。例えば、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドまたはその断片をコードする単一の核酸構築物を宿主細胞に導入することができる。あるいは、ポリペプチドのためのコード配列は、２つ以上の核酸構築物によって担持されていてよく、それらが次いで、宿主細胞に同時に、または連続的に導入される。
例えば、例示的な一実施形態では、単一の核酸構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのレクチンドメインおよびピリンドメインをコードする。別の例示的な実施形態では、１つの核酸構築物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのレクチンドメインをコードし、第２の核酸構築物がピリンドメインをコードする。一部の態様では、ゲノム組込みが達成される。
核酸構築物は、１つまたは複数のイントロンを含むゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含んでよい。一部の遺伝子は、イントロンが存在する場合に、より効率的に発現される。一部の態様では、核酸配列は、前記哺乳動物細胞における外因性ポリペプチドの発現に好適である。
一部の態様では、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸は、任意の特定の細胞において発現のレベルを上昇させるように最適化されているコドンである。
一部の態様では、核酸構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の分泌を指示するペプチドをコードするシグナル配列を含む。一部の態様では、核酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片が内因性シグナル配列を含む一部の態様では、シグナル配列をコードする核酸配列は、宿主細胞においてタンパク質の発現のレベルを上昇させるように最適化されているコドンであり得る。
一部の態様では、シグナル配列は、次の長さ：１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０アミノ酸長のいずれか１つである。一部の態様では、シグナル配列は、２０アミノ酸長である。一部の態様では、シグナル配列は２１アミノ酸長である。
一部の態様では、ポリペプチドまたはその断片がシグナル配列を含む場合、培養細胞においてポリペプチドまたはその断片の発現のレベルを向上させるために、ポリペプチドと天然に会合している内因性シグナル配列を、野生型ポリペプチドと会合していないシグナル配列と置き換えることができる。したがって、一部の態様では、核酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含まない。一部の態様では、核酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含まない。一部の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくは、シグナル配列である異種ペプチド、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはその断片に由来する成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のペプチドと共に発現され得る。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくはシグナル配列である異種ペプチド（例えば、ＩｇＫシグナル配列）、または成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨタンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する他のペプチドと共に発現され得る。好ましい態様では、成熟タンパク質大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのＮ末端での特異的切断は、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨタンパク質の最初のフェニルアラニン残基の直前で生じる。選択される異種配列は好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。
好まれる態様では、シグナル配列は、ＩｇＫシグナル配列である。一部の態様では、核酸は、配列番号１～６４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一部の態様では、核酸は、アミノ酸配列の配列番号２３、５０、５１、５２、５３、５４、６０、６１または６２をコードする。一部の態様では、核酸は、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。好まれる態様では、シグナル配列は、マウスＩｇＫシグナル配列である。
ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドまたはその断片を産生するための好適な哺乳動物発現ベクターは、当業界で公知であり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）からのｐＳｅｃＴａｇ２発現ベクターなど、市販することができる。例示的なマウスＩｇカッパーシグナルペプチド配列は、配列ＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号６５）を含む。一部の態様では、ベクターは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のｐＢｕｄＣＥ４．１哺乳動物発現ベクターを含む。追加の例示的で好適なベクターには、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１哺乳動物発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が含まれる。
一部の態様では、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含まない。
一部の態様では、核酸は、ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含む。一部の態様では、シグナル配列は、ＩｇＫシグナル配列ではない。一部の態様では、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含む。
一態様では、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドまたはその断片のコード配列を含むベクターを本明細書において開示する。例示的なベクターは、自律複製し得るか、または哺乳動物細胞において複製し得るプラスミドを含む。典型的な発現ベクターは、発現構築物においてコード配列の発現を調節するために有用である好適なプロモーター、エンハンサー、およびターミネーターを含む。ベクターは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質（アンピシリンまたはネオマイシンなどの抗生物質に対する耐性の付与など）を得るための選択マーカーを含んでもよい。
好適なプロモーターは当業界で公知である。例示的なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス、ＥＦ１ ａ、ＧＡＰＤＨメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターなどが含まれる。プロモーターは、構成的でも、または誘導性プロモーターでもよい。１つまたは複数のベクターを用いることができる（例えば、全てのサブユニットもしくはドメインもしくはその断片をコードする１つのベクター、またはサブユニットもしくはドメインもしくはその断片を総合してコードする複数のベクター）。
配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および２Ａペプチド配列も用いることができる。ＩＲＥＳおよび２Ａペプチドは、複数の配列の共発現に関して代替のアプローチを提供する。ＩＲＥＳは、タンパク質合成のさらに大きなプロセスのうちの一部分として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の途中での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。通常は、真核生物では、翻訳はｍＲＮＡ分子の５’末端のみで開始することができる。ＩＲＥＳエレメントは、１つの転写物での複数の遺伝子の発現を可能にする。１つの転写物から複数のタンパク質を発現する、ＩＲＥＳに基づくポリシストロン性ベクターは、選択から非発現クローンが漏れることを減少させることができる。２Ａペプチドは、１個のオープンリーディングフレーム中の複数のタンパク質をポリタンパク質へと翻訳することを可能にし、このポリタンパク質は続いて、リボソームをスキップする機構を介して個別のタンパク質へと切断される。２Ａペプチドは、複数のタンパク質生成物のよりバランスの取れた発現を提供することができる。例示的なＩＲＥＳ配列には、例えば、ＥＶ７１ ＩＲＥＳ、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳが含まれる。ゲノム組込みに関して、組込みは、部位特異的であるかまたはランダムであり得る。部位特異的組換えは、本明細書に記載の核酸構築物へと相同性配列を導入することにより実現することができる。そのような相同性配列は、宿主ゲノム中の特異的標的部位での内在性配列と実質的にマッチする。あるいは、ランダムな組込みを用いることができる。時には、タンパク質の発現レベルは組込み部位に応じて変化することがある。したがって、所望の発現レベルを達成するクローンを特定するために、組換えタンパク質の発現レベルに従って、多数のクローンを選択することが望ましいことがある。
例示的な核酸構築物は、図に、例えば、参照により本明細書に組み込まれる２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９の図２Ａ～図２Ｔにさらに記載されている。
一態様では、核酸配列は、配列番号１～６４のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。好まれる態様では、核酸配列は、配列番号６２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。本発明の別の態様では、核酸配列は、配列番号１～６４のいずれかと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。好まれる態様では、核酸配列は、配列番号６２と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
本開示のある特定の態様では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当業界で確立される通り、ｍＲＮＡは一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含有する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写または化学合成によって産生される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生され、この場合、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含有する核酸を指す。一態様では、本明細書に記載されているＲＮＡは、改変されたヌクレオシドを有することができる。一部の態様では、ＲＮＡは、少なくとも１個の（例えば、全ての）ウリジンの代わりに改変されたヌクレオシドを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物または医療用調製物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む。同様に、本明細書に記載されている方法は、そのようなＲＮＡの投与を含む。本明細書における使用のための可能なプラットフォームの１つは、好ましくは最小のワクチン用量による保護的免疫化を達成するための頑強な中和抗体および付随する／随伴性のＴ細胞応答を誘導するための抗原コードＲＮＡワクチンに基づく。投与されるＲＮＡは、好ましくは、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡである。３種の異なるＲＮＡプラットフォーム、すなわち、非改変ウリジン含有ｍＲＮＡ（ｕＲＮＡ）、ヌクレオシド改変ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）および自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）が、特に好まれる。特に好まれる一態様では、ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡである。
ＩＩＩ．宿主細胞
一態様では、本開示は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドまたはその断片をコードする配列が哺乳動物宿主細胞で発現される細胞に関する。一実施形態では、ポリペプチドは、宿主細胞で一過性に発現される。別の実施形態では、ポリペプチドは、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれて、好適な条件下で培養されるとき、ポリペプチドまたはその断片を発現する。好ましい一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、高い効率およびゲノム安定性で発現される。
好適な哺乳動物宿主細胞は当業界で公知である。好ましくは、宿主細胞は、工業的製造スケールでタンパク質を生産するために好適である。例示的な哺乳動物宿主細胞には、次のものおよびその誘導体のいずれか１つが含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞（サル腎臓（アフリカミドリザル）に由来する細胞系、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＮＳＯ細胞（マウス骨髄腫細胞系）、およびＣ１２７細胞（非腫瘍発生性マウス細胞系）。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、マウスセルトリ（ＴＭ４）、バッファローラット肝臓（ＢＲＬ ３Ａ）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ）、ラット肝細胞癌（ＨＴＣ）、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）、マウスハイブリドーマ（Ｓｐ２／０）、マウス胸腺腫（ＥＬ４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＣＨＯ細胞誘導体、マウス胚性（ＮＩＨ／３Ｔ３、３Ｔ３ Ｌｉ）、ラット心筋（Ｈ９ｃ２）、マウス筋原細胞（Ｃ２Ｃ１２）、およびマウス腎臓（ｍｉＭＣＤ－３）が含まれる。哺乳動物細胞系のさらなる例には、ＮＳ０／１、Ｓｐ２／０、Ｈｅｐ Ｇ２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ－７、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ－７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、ＭＭＴ ０６０５６２、ＴＲ１、ＭＲＣ５、およびＦＳ４が含まれる。
細胞培養が可能ないずれの細胞も、本発明に従って用いることができる。一部の態様では、細胞は哺乳動物細胞である。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞の非限定的例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、Ｃｒｕ細胞、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児由来腎臓系（２９３細胞または懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングさせた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウス２８ｙｏｐｈｉｌ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３～２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４～６８、１９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれる。一部の好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の好ましい態様では、細胞は、ＧＳ細胞である。
加えて、任意の数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞系を本発明に従って用いることができる。用語「ハイブリドーマ」は、本明細書で使用される場合、不死化細胞および抗体産生細胞の融合から生じる細胞または後代の細胞を指す。そのように得られたハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを作製するために使用される個々の細胞は、限定されるものではないが、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびヒトを含む、任意の哺乳動物源由来であってよい。一部の態様では、ハイブリドーマは、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞系との間の融合の産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合の後代がその後、形質細胞と融合するときに生じるトリオーマ細胞系である。一部の態様では、ハイブリドーマは、例えば、クアドローマなど、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞系である（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、５３７：３０５３（１９８３）を参照されたい）。当業者は、ハイブリドーマ細胞系が異なる栄養要件を有し得、かつ／または最適な増殖のために異なる培養条件を要求し得ることが分かるであろうし、必要に応じて、条件を改変することができるであろう。
一部の態様では、細胞は、第１の目的遺伝子を含み、その際、第１の目的遺伝子は、染色体組込みされている。一部の態様では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、目的の遺伝子（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコード）、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、治療目的の遺伝子は、難発現（ＤｔＥ）タンパク質をコードする遺伝子を含む。
一部の態様では、第１の目的遺伝子は、部位特異的組込み（ＳＳＩ）哺乳動物細胞における２つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）の間に位置し、その際、２つのＲＴＳは、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている。例えば、ＮＬ１遺伝子座、ＮＬ２遺伝子座、ＮＬ３遺伝子座、ＮＬ４遺伝子座、ＮＬ５遺伝子座、およびＮＬ６遺伝子座の記載については、米国特許出願第２０２００００２７２７号を参照されたい。一部の態様では、第１の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座内に位置する。一部の態様では、細胞は、第２の目的遺伝子を含み、その際、第２の目的遺伝子は染色体組込みされている。一部の態様では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子（ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドまたはその断片など）、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、治療目的の遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。一部の態様では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。一部の態様では、第２の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内に位置する。一部の態様では、第１の目的遺伝子はＮＬ１遺伝子座内に位置し、第２の目的遺伝子はＮＬ２遺伝子座内に位置する。一部の態様では、細胞は、第３の目的遺伝子を含み、その際、第３の目的遺伝子は染色体組込みされている。一部の態様では、第３の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片など）、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、治療目的の遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。一部の態様では、第３の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。一部の態様では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内に位置する。一部の態様では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座およびＮＬ２遺伝子座とは別個の遺伝子座内に位置する。一部の態様では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子、および第３の目的遺伝子は、３つの別々の遺伝子座内にある。一部の態様では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子、および第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ１遺伝子座内にあり、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子、および第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ２遺伝子座内にある。一部の態様では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。一部の態様では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は染色体組込みされている。
別の態様では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、その際、細胞は、（ａ）ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳ；（ｂ）レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、（ａ）の少なくとも２つのＲＴＳの間に組み込まれている第１の目的遺伝子；（ｃ）およびレポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片など）をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、（ａ）の遺伝子座とは別個の第２の染色体遺伝子座内に組み込まれた第２の目的遺伝子を含む。一部の態様では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、その際、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳ；（ｂ）ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳ；（ｃ）レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子座内で染色体組込みされている第１の目的遺伝子；および（ｄ）レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片など）をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、（ｂ）のＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている第２の目的の遺伝子を含む。
一部の態様では、本開示は、少なくとも６つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、その際、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳおよび第１の目的遺伝子；（ｂ）ＮＬ１遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳおよび第２の目的遺伝子；および（ｃ）ＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳおよび第３の目的遺伝子を含む。
本明細書において言及される場合、用語「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結された」は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示し得る核酸分子が産生されるような手法での核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能性タンパク質が産生されるような手法でのアミノ酸配列の連結を指す。一部の態様では、目的遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されていて、その際、目的遺伝子は、宿主細胞に染色体組込みされている。一部の態様では、目的遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており；その際、目的遺伝子は、宿主細胞に染色体組込みされている。一部の態様では、従属遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、従属遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の態様では、従属遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており；その際、従属遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の態様では、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の態様では、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており、その際、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の態様では、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞に染色体組込みされている。一部の態様では、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の態様では、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされていない。一部の態様では、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされていない。
本明細書において言及される場合、用語「染色体組込みされている」または「染色体組込み」は、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞の染色体への核酸配列の安定な組込み、すなわち、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に染色体組込みされた核酸配列を指す。一部の態様では、染色体組込みされている核酸配列は安定している。一部の態様では、染色体組込みされている核酸配列は、プラスミドまたはベクター上に位置しない。一部の態様では、染色体組込みされている核酸配列は切除されない。一部の態様では、染色体組込みは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ；ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）遺伝子編集システム（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ）により媒介される。
ＩＶ．組成物および製剤
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている少なくとも１つのＦｉｍＨ変異体ポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。一部の態様では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の病原性の種に対する免疫を与えることができる、抗体を含む免疫応答を惹起する。
一部の態様では、組成物は、唯一の抗原としてＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを含む。一部の態様では、組成物は、コンジュゲートを含まない。
一部の態様では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、少なくとも１つの追加の抗原とを含む。一部の態様では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原とを含む。一部の態様では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の糖コンジュゲートとを含む。
一部の態様では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片とを含む。
一実施形態では、本開示は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９および２０２０年２月２７日に発表されたＷＯ２０２０／０３９３５９ならびに２０２０年２月２７日に発表された米国特許出願公開番号ＵＳ２０２０／００６１１７７に開示されている糖構造のうちいずれか１つから選択される構造を含む糖とを含む組成物を含む。一態様では、本開示は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド；および糖を含む組成物を含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中で、ｎは、１～１００、好ましくは３１～９０の整数である）のいずれかから選択される構造を含む。
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に開示の糖のいずれか１つを含む。好ましい実施形態では、組成物は、本明細書に開示のコンジュゲートのいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、好ましくは血清型Ｏ２５ｂからの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１、好ましくは血清型Ｏ１ａからの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２からの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６からの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。
一実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２およびＯ６のいずれか１種から選択される少なくとも２種の糖コンジュゲートを含む。別の実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２およびＯ６のいずれか１種から選択される少なくとも３種の糖コンジュゲートを含む。さらなる実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２およびＯ６のそれぞれに由来する糖コンジュゲートを含む。
好ましい一実施形態では、上の組成物のいずれかの糖コンジュゲートは個別に、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。別の好まれる実施形態では、上述の組成物のいずれかの糖コンジュゲートは、ＳＣＰに個々にコンジュゲートされている。
したがって、一部の実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。好ましい一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１つよりも多いより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。例えば、前記組成物は、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型（または「ｖ」、価数）から１２の異なる血清型（１２ｖ）からのＯ抗原を含み得る。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および３つの異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ抗原とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１２の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１３の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１４の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１５の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１６の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１７の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１８の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および１９の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および２０の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。
好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖の数は、１種の血清型（または「ｖ」、価数）から２６種の異なる血清型（２６ｖ）までの範囲であってよい。一実施形態では、１種の血清型が存在する。一実施形態では、２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、６種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、７種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、８種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、９種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１０種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１１種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１６種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１７種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１８種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１９種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２０種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２１種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２６種の異なる血清型が存在する。糖を担体タンパク質にコンジュゲートして、本明細書に記載の糖コンジュゲートを形成させる。
一態様では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド；およびＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清群からのＯ抗原を含む糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１つよりも多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドからのＯ抗原、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１２の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１３の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１４の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１５の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１６の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１７の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１８の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１９の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２０の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。
別の態様では、組成物は、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい一実施形態では、組成物は、１つよりも多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、前記組成物は、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含み得る。一実施形態では、組成物は、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１２の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１３の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１４の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１５の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１６の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１７の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１８の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１９の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、２０の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。
好ましい一実施形態では、組成物は、Ｏ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１つよりも多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、前記組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含んでよい。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１２の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１３の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１４の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１５の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１６の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１７の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１８の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１９の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２０の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。
最も好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含み、その際、Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１種より多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型のＯ多糖を含み得る。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１２種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１３種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１４種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１５種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１６種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１７種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１８種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１９種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、２０種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい一実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
別の好まれる実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖とを含み、Ｏ多糖は、式Ｏ２５ａ（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。好まれる実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、少なくとも４０である）と、コア糖とを含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ１ａ（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ２（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ６（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。
別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ１７（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ１５（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ１８Ａ（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ７５（式中、ｎは少なくとも３０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ４（式中、ｎは少なくとも３０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１６（式中、ｎは少なくとも３０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１３（式中、ｎは少なくとも３０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖をさらに含み、Ｏ多糖は、式Ｏ７（式中、ｎは、少なくとも３０である）と、コア糖とを含む。
別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ８（式中、ｎは少なくとも３０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ８（式中、ｎは、１～２０、好ましくは２～５、より好ましくは３である）を含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ９（式中、ｎは少なくとも３０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ９（式中、ｎは、１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）を含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ９ａ（式中、ｎは、１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）を含む。
一部の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）のいずれか１つから選択される。
前記の通り、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびコンジュゲートされているＯ多糖（抗原）の任意の組合せを含み得る。１つの例示的な実施形態では、組成物は、式Ｏ２５ｂを含む多糖、式Ｏ１Ａを含む多糖、式Ｏ２を含む多糖、および式Ｏ６を含む多糖を含む。より具体的には、そのような組成物は、（ｉ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは少なくとも３０である）とコア糖とを含むＯ多糖；（ｉｉ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１ａ（式中、ｎは少なくとも３０である）とコア糖とを含むＯ多糖；（ｉｉｉ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２（式中、ｎは少なくとも３０である）とコア糖とを含むＯ多糖；および（ｉｖ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ６（式中、ｎは少なくとも３０である）とコア糖とを含むＯ多糖を含む。
一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびＯ２５ａではない、いずれかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する少なくとも１つのＯ多糖を含む。例えば、一実施形態では、組成物は、式Ｏ２５ａを含む糖を含まない。そのような組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂを含むＯ多糖、式Ｏ１Ａを含むＯ多糖、式Ｏ２を含むＯ多糖、および式Ｏ６を含むＯ多糖を含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原とコア糖とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、５種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原とコア糖とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、６種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原とコア糖とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、７種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原とコア糖とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原とコア糖とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原とコア糖とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、１２種の異なる血清型由来のＯ多糖とを含み、各Ｏ多糖は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原とコア糖とを含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１３の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１４の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１５の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１６の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１７の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１８の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１９の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、２０の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。
一態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、１５±２である）を含む、組成物を提供する。一態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および糖が、ｎが１７±２である式Ｏ２５ｂを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および糖が、ｎが５５±２である式Ｏ２５ｂを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および糖が、ｎが５１±２である式Ｏ２５ｂを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質と共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、３０より大きい整数であり、好ましくは、ｎは、３１～１００の整数である）を含む、組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一態様では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ２５Ｂに対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ１ａ（式中、ｎは、３０より大きい整数であり、好ましくは、ｎは、３１～１００の整数である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質と共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ１ａ（式中、ｎは、３９±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨポリペプチド、および糖が、ｎが１３±２である式Ｏ１ａを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ１Ａに対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ２（式中、ｎは、３０より大きい整数であり、好ましくは、ｎは、３１～１００の整数である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ２（式中、ｎは、４３±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ２（式中、ｎは、４７±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質と共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ２（式中、ｎは、１７±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ２（式中、ｎは、１８±２である）を含む、組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ２に対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２を殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２を殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ６（式中、ｎは、３０より大きい整数であり、好ましくは、ｎは、３１～１００の整数である）を含む、組成物に関する。一態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートとを含む組成物であって、糖が、式Ｏ６（式中、ｎは、４２±２である）を含む、組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および糖が、ｎが５０±２である式Ｏ６を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および糖が、ｎが１７±２である式Ｏ６を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および糖が、ｎが１８±２である式Ｏ６を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ６に対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６を殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６を殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、組成物は、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、および担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００、好ましくは３１～９０の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのコンジュゲートが担体タンパク質に共有結合した糖を含み、糖が前記式のいずれか１つから選択される構造を含む、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のさらなるコンジュゲートから、最大でも３０のさらなるコンジュゲートをさらに含む。
Ａ．糖
１．糖およびＯ多糖
一実施形態では、糖は、糖のサイズを制御するために、異なるＷｚｚタンパク質（例えば、ＷｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現ではない）によって産生される。
本明細書で使用される場合、用語「糖」は、単一の糖部分または単糖単位ならびに二糖、オリゴ糖、および多糖を形成するように共有結合した２つ以上の単一の糖部分または単糖単位の組合せを指す。糖は、線状または分枝状であってもよい。
一実施形態では、糖は、組換えグラム陰性細菌中で産生される。一実施形態では、糖は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で産生される。一実施形態では、糖は、組換えサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細胞中で産生される。例示的な細菌としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＤ５５９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２８３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８９６、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ１９０２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａ ＥＴＣ ＮＲ－５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７：Ｋ－、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ＣＶＤ１９４３、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＣＶＤ１９２５、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型パラティフィ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ）Ａ ＣＶＤ１９０２、およびシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＣＶＤ１２０８Ｓが挙げられる。一実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１ではない。糖産生に対するこの遺伝的手法は、ワクチン成分としてのＯ多糖およびＯ抗原分子の効率的な産生を可能にする。
本明細書で使用される用語「ｗｚｚタンパク質」とは、例えば、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２などの、鎖長決定因子ポリペプチドを指す。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、Ｅ４９９１／７６についてはＡＦ０１１９１０、Ｆ１８６についてはＡＦ０１１９１１、Ｍ７０／１－１についてはＡＦ０１１９１２、７９／３１１についてはＡＦ０１１９１３、Ｂｉ７５０９－４１についてはＡＦ０１１９１４、Ｃ６６４－１９９２についてはＡＦ０１１９１５、Ｃ２５８－９４についてはＡＦ０１１９１６、Ｃ７２２－８９についてはＡＦ０１１９１７、およびＥＤＬ９３３についてはＡＦ０１１９１９である。Ｇ７およびＢｉ３１６－４１ ｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれ、Ｕ３９３０５およびＵ３９３０６である。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するさらなるＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４５９５８１；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３ ＦｅｐＥについてはＡＩＧ６６８５９；サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４６１０２４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４１６５３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４１５１１９である。好ましい態様では、ｗｚｚファミリータンパク質は、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つ、最も好ましくは、ｗｚｚＢ、より好ましくは、ｆｅｐＥである。
例示的なｗｚｚＢ配列は、配列番号１１２～１１６に記載の配列を含む。例示的なＦｅｐＥ配列は、配列番号１１７～１２１に記載の配列を含む。
一部の態様では、グラム陰性細菌においてグラム陰性細菌からｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｆｅｐＥ）を発現させることにより（必ずしも過剰発現させるとは限らない）、および／または第２のｗｚｚ遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）のスイッチをオフにして（すなわち、これを抑圧、欠失、除去して）、対応する野生型Ｏ多糖と比較して増大した数の反復単位を有する中間のまたは長いＯ抗原鎖を含有するリポ多糖などの高分子量の糖を生成することにより、改変された糖（対応する野生型糖と比較して改変された）を産生することができる。例えば、改変された糖を、ｗｚｚ２を発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚ１のスイッチを切ることによって産生させることができる。または、別の方法では、改変された糖を、ｗｚｚ／ｆｅｐＥを発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚＢのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｗｚｚＢを発現させる（必ず祖も過剰発現させない）が、ｗｚｚ／ｆｅｐＥのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｆｅｐＥを発現させることによって産生させることができる。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、宿主細胞にとって異種である株に由来する。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法は、核磁気共鳴、質量分析およびサイズ排除クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない。中間のまたは長いＯ抗原鎖を含有するリポ多糖などの本明細書に記載されている高分子量の糖を産生するための方法は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２０／０３９３５９および対応する米国特許出願公開番号ＵＳ２０２０／００６１１７７に記載されている。
一部の実施形態では、糖は、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１のいずれか１つに対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって産生される。一実施形態においては、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１のいずれか１つから選択される配列を含む。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、および配列番号１１６に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、糖は、ｆｅｐＥタンパク質に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることによって産生される。
一態様では、本発明は、グラム陰性細菌中で、ｗｚｚファミリータンパク質、好ましくは、ｆｅｐＥを発現させて、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させることによって産生される糖に関する。一態様では、本発明は、グラム陰性細菌から、対応する野生型Ｏ抗原と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させるように、培養物中でｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現するものではない）グラム陰性細菌によって産生される糖に関する。対応する野生型糖と比較して、反復単位の数が増加したさらなる例示的な糖については、以下のＯ多糖およびＯ抗原の記載を参照されたい。望ましい鎖長は、所与のワクチン構築物との関連で改善された、または最大の免疫原性をもたらすものである。
別の実施形態では、糖は、表Ａから選択されるいずれか１つの式を含み、糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法としては、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
好ましい実施形態では、本発明は、内因性ｗｚｚ Ｏ抗原長調節因子の遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）が欠失し、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞にとって異種のグラム陰性細菌に由来する（第２の）ｗｚｚ遺伝子（例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ）で置き換えられ、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する、リポ多糖などの高分子量糖を生成する、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で産生される糖に関する。一部の実施形態では、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、好ましくは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来するｗｚｚ遺伝子を含む。
一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法は、当業界で公知である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。
一態様では、組換え宿主細胞は、炭素源を含む培地中で培養される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための炭素源は、当業界で公知である。例示的な炭素源としては、限定されるものではないが、アラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルベート、スクシネートおよびメチルアミンなどの、糖アルコール、ポリオール、アルドール糖またはケト糖が挙げられる。好ましい実施形態では、培地は、グルコースを含む。一部の実施形態では、培地は、炭素源として、ポリオールまたはアルドール糖、例えば、マンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースおよびアラビノースを含む。培養を開始する前に、全ての炭素源を培地に添加するか、または培養中に少しずつ、もしくは連続的に添加してもよい。
組換え宿主細胞のための例示的な培養培地は、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む。好ましくは、培地は、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏを含む。
本明細書で使用される培地は、固体または液体、合成（すなわち、人工）または天然であってよく、組換え宿主細胞の培養のための十分な栄養素を含んでもよい。好ましくは、培地は、液体培地である。
一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、微量栄養素をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、増殖因子をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、さらなる炭素源をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および追加炭素源をさらに含んでもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するのに好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補助炭素源は、当業界で公知である。
一部の実施形態では、培地は、必要に応じて、ペプトン、Ｎ－Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、さらなる成分を含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、必要に応じて、ペプトン、Ｎ－Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、そのようなさらなる成分を含まない。
好適な補助炭素源の実例としては、限定されるものではないが、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解物、セルロース加水分解物および糖蜜などの他の炭水化物；酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸などの有機酸；ならびにグリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトールなどのアルコールが挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、窒素源をさらに含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための好適な窒素源は、当業界で公知である。好適な窒素源の実例としては、限定されるものではないが、アンモニアガスおよび水性アンモニアを含むアンモニア；塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムなどの無機または有機酸のアンモニウム塩；尿素；硝酸または亜硝酸塩、および純粋な、または未精製の調製物としてのアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚粉、魚加水分解物、コーン浸出液、カゼイン加水分解物、大豆かす加水分解物、酵母抽出物、ドライイースト、エタノール－酵母蒸留物、大豆粉、綿実粉などを含む、他の窒素含有材料が挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、無機塩を含む。好適な無機塩の実例としては、限定されるものではないが、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素、ならびにリン酸の塩が挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、好適な増殖因子を含む。好適な微量栄養素、増殖因子などの実例としては、限定されるものではないが、純粋な、もしくは部分的に精製された化合物として、または天然材料中に存在するものとしての、コエンザイムＡ、パントテン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＤＬ－６，８－チオクト酸、葉酸、ビタミンＢ１２、他のビタミン、システインおよびヒドロキシプロリンなどのアミノ酸、アデニン、ウラシル、グアニン、チミンおよびシトシンなどの塩基、チオ硫酸ナトリウム、ｐ－またはｒ－アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトリロアセテートなどが挙げられる。当業者であれば、当業界で公知の方法および技術に従って、経験的にその量を決定することができる。
別の実施形態では、本明細書に記載の改変された糖（対応する野生型糖と比較した場合）は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成的に生産される。糖の合成的生産または合成は、費用および時間集約的な生産プロセスの回避を容易にし得る。一実施形態では、糖は、例えば、逐次的グリコシル化戦略または逐次的グリコシル化戦略と、好適に保護された単糖中間体からの［３＋２］ブロック合成戦略との組合せを使用するなどによって合成される。例えば、チオールグリコシドおよびグリコシルトリクロロアセトイミデート誘導体を、グリコシル化におけるグリコシルドナーとして使用することができる。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される糖は、上記のｗｚｚファミリータンパク質の操作などの組換え手段によって産生される糖と同一の構造を有する。
産生される糖（組換えまたは合成手段による）は、例えば、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型：Ｏ１（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ１Ｂ、およびＯ１Ｃ）、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４（例えば、Ｏ４：Ｋ５２およびＯ４：Ｋ６）、Ｏ５（例えば、Ｏ５ａｂおよびＯ５ａｃ（１８０／Ｃ３株））、Ｏ６（例えば、Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５およびＯ６：Ｋ５４）、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８（例えば、Ｏ１８Ａ、Ｏ１８ａｃ、Ｏ１８Ａ１、Ｏ１８Ｂ、およびＯ１８Ｂ１）、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３（例えば、Ｏ２３Ａ）、Ｏ２４、Ｏ２５（例えば、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ）、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５（例えば、Ｏ４５およびＯ４５ｒｅｌ）、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３（例えば、Ｏ７３（７３－１株））、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７のうちのいずれか１つを含む、任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する構造を含む。
個々の多糖は、典型的には、例えば、透析、濃縮操作、透析濾過操作、接線流濾過、沈降、溶出、遠心分離、沈降、限外濾過、深層濾過、および／またはカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）などの当業界で公知の方法によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。好ましくは、多糖は、接線流濾過を含む方法によって精製される。
精製された多糖を活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらが反応することができるようにし（例えば、担体タンパク質に直接的に、またはｅＴＥＣスペーサーなどのリンカーを介して）、次いで、本明細書にさらに記載されるように、本発明の糖コンジュゲートに組み入れることができる。
１つの好ましい実施形態では、本発明の糖は、血清型がＯ２５ａである、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２５ｂである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１８Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ４である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１３である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ８である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ９である。
本明細書で使用される場合、上記の血清型のいずれかに対する参照は、当業界で公知であり、対応する血清型にとって独特である、反復単位構造（以下に記載されるようなＯ単位）を包含する血清型を指す。例えば、用語「Ｏ２５ａ」血清型（当業界では血清型「Ｏ２５」としても公知である）は、表Ａに示される式Ｏ２５を包含する血清型を指す。別の例として、用語「Ｏ２５ｂ」血清型とは、表Ａに示される式Ｏ２５ｂを包含する血清型を指す。
本明細書で使用される場合、血清型は、別途特定されない限り、例えば、式「Ｏ１８」という用語が、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１を包含すると一般的に指すように、本明細書で一般的に称される。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ１」とは、それぞれ、表Ａに示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つなどの、表Ａに記載の式名に総称「Ｏ１」を含む式の種を包含することを一般的に指す。したがって、「Ｏ１血清型」とは、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ６」とは、それぞれ、表Ａに示される式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つなどの、表Ａに記載の式名に総称「Ｏ６」を含む式の種を一般的に指す。したがって、「Ｏ６血清型」とは、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。
表Ａに記載の式名中に総称を含む式の種を一般的に指す用語の他の例としては、「Ｏ４」、「Ｏ５」、「Ｏ１８」、および「Ｏ４５」を含む。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ２」とは、表Ａに示される式Ｏ２を指す。用語「Ｏ２ Ｏ抗原」とは、表Ａに示される式Ｏ２を包含する糖を指す。
本明細書で使用される場合、上記の血清型に由来するＯ抗原に対する参照は、対応する血清型名と共に標識された式を包含する糖を指す。例えば、用語「Ｏ２５Ｂ Ｏ抗原」とは、表Ａに示される式Ｏ２５Ｂを包含する糖を指す。
別の例として、用語「Ｏ１ Ｏ抗原」は、それぞれ表Ａに示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃなどの、用語「Ｏ１」を含む式を包含する糖を一般的に指す。
別の例として、用語「Ｏ６ Ｏ抗原」は、それぞれ表Ａに示される式Ｏ６：Ｋ２；式Ｏ６：Ｋ１３；式Ｏ６：Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４などの、用語「Ｏ６」を含む式を包含する糖を一般的に指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ多糖」とは、その構造が全細胞またはリピドＡを含まないという条件で、Ｏ抗原を含む任意の構造を指す。例えば、一実施形態では、Ｏ多糖は、リピドＡが結合していないリポ多糖を含む。リピドＡを除去するステップは当業界で公知であり、例として、酸を添加する熱処理を含む。例示的なプロセスは、１００℃で９０分間の１％酢酸による処理を含む。このプロセスは、除去されるリピドＡを単離するプロセスと組み合わされる。リピドＡを単離するための例示的プロセスとしては、超遠心分離が挙げられる。
一実施形態では、Ｏ多糖とは、Ｏ抗原からなる構造を指し、その場合、Ｏ多糖は、Ｏ抗原という用語と同義である。１つの好ましい実施形態では、Ｏ多糖とは、コア糖を含まない、Ｏ抗原の反復単位を含む構造を指す。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。別の好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原と、コア糖とを含む構造を指す。別の実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原、コア糖、およびＫＤＯ部分を含む構造を指す。
ＬＰＳから、コアオリゴ糖を含むＯ多糖を精製する方法は、当業界で公知である。例えば、ＬＰＳの精製後、精製されたＬＰＳを、１００℃で９０分間にわたって１％（ｖ／ｖ）酢酸中で加熱することによって加水分解した後、４℃で５時間にわたって１４２，０００ｘｇで超遠心分離することができる。Ｏ多糖を含有する上清を凍結乾燥し、４℃で保存する。ある特定の実施形態では、Ｏ多糖の単純な精製を可能にするための莢膜合成遺伝子の欠失が記載される。
Ｏ多糖を、限定されるものではないが、ＬＰＳからリピドＡを除去するための弱酸加水分解を含む方法によって単離することができる。他の実施形態は、Ｏ多糖調製のための薬剤としてヒドラジンの使用を含んでもよい。ＬＰＳの調製を、当業界で公知の方法によって達成することができる。
ある特定の実施形態では、Ｗｚｚタンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現しない）野生型、改変された、または弱毒化されたグラム陰性細菌株から精製されたＯ多糖が、コンジュゲートワクチンにおける使用のために提供される。好ましい実施形態では、Ｏ多糖鎖は、コンジュゲートまたは複合体化ワクチンとしてのワクチン抗原としての使用のためにｗｚｚタンパク質を発現する（必ずしも過剰発現しない）グラム陰性細菌株から精製される。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５１倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、５７倍、５８倍、５９倍、６０倍、６１倍、６２倍、６３倍、６４倍、６５倍、６６倍、６７倍、６８倍、６９倍、７０倍、７１倍、７２倍、７３倍、７４倍、７５倍、７６倍、７７倍、７８倍、７９倍、８０倍、８１倍、８２倍、８３倍、８４倍、８５倍、８６倍、８７倍、８８倍、８９倍、９０倍、９１倍、９２倍、９３倍、９４倍、９５倍、９６倍、９７倍、９８倍、９９倍、１００倍以上増加した分子量を有する。好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１倍かつ最大でも５倍増加した分子量を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２倍かつ最大でも４倍増加した分子量を有する。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量の増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｋＤａ以上増加した分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも1ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加した分子量を有する。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２１ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも９０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも８５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも６０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも５０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４９ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４８ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４７ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４６ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４４ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４３ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４２ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４１ｋＤａ増加している。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量のそのような増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。
別の実施形態では、Ｏ多糖は、表Ａから選択されるいずれか１つの式を含み、Ｏ多糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。
２．Ｏ抗原
Ｏ抗原は、グラム陰性細菌の外膜中のリポ多糖（ＬＰＳ）の一部である。Ｏ抗原は、細胞表面上にあり、可変性細胞構成要素である。Ｏ抗原の可変性は、グラム陰性細菌の血清型決定のための基礎を提供する。現在の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型決定スキームは、Ｏ多糖１～１８１を含む。
Ｏ抗原は、オリゴ糖反復単位（Ｏ単位）を含み、その野生型構造は、通常、広範囲の糖に由来する２～８個の残基を含有する。例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のＯ単位は、表Ａに、およびその全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９に記載されている。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＦｉｍＨ変異体ポリペプチドと、表Ａに、およびその全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９に記載されているＯ抗原のうち少なくとも１つとを含む組成物を含む。
一実施形態では、本発明の糖は、１個のオリゴ糖単位であってもよい。一実施形態では、本発明の糖は、関連する血清型の１つの反復オリゴ糖単位である。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ１ａ、式Ｏ２、式Ｏ６、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ５２、式Ｏ９７および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含むことができる。さらなる実施形態では、糖は、式Ｏ１ａ、式Ｏ２、式Ｏ６および式Ｏ２５ｂのいずれか１つから選択される構造を含むことができる。
一実施形態では、本発明の糖は、オリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、少数の反復単位（典型的には、５～１５の反復単位）を有し、典型的には、合成的に、または多糖の加水分解によって誘導される。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ１ａ、式Ｏ２、式Ｏ６、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ５２、式Ｏ９７および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含むことができる。さらなる実施形態では、糖は、式Ｏ１ａ、式Ｏ２、式Ｏ６および式Ｏ２５ｂのいずれか１つから選択される構造を含むことができる。
好ましくは、本発明の、および本発明の免疫原性組成物中の全ての糖は、多糖である。高分子量の多糖は、抗原性表面上に存在するエピトープのため、ある特定の抗体免疫応答を誘導することができる。高分子量の多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲート、組成物および方法における使用のために企図される。
一部の実施形態では、それぞれ個々のＯ抗原ポリマー中の反復Ｏ単位の数（したがって、ポリマー鎖の長さおよび分子量）は、ｗｚｚ鎖長調節因子、内膜タンパク質に依存する。異なるｗｚｚタンパク質は、異なる範囲のモード長（４～１００超の反復単位）をもたらす。用語「モード長」とは、反復Ｏ単位の数を指す。グラム陰性細菌は、一方は長く、一方は短い、２つの異なるＯＡｇモード鎖長をもたらす２つの異なるＷｚｚタンパク質を有することが多い。グラム陰性細菌中でのｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現ではない）は、ある特定の長さ範囲のＯ抗原の細菌産生にシフトさせる、もしくは偏らせる、および高収率の高分子量リポ多糖の産生を増強させる、Ｏ抗原長の操作を可能にし得る。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「短い」モード長とは、少数、例えば、１～２０の反復Ｏ単位を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「長い」モード長とは、２０より大きく、最大で４０までの反復Ｏ単位の数を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「非常に長い」モード長とは、４０より大きい反復Ｏ単位を指す。
一実施形態では、産生される糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１０反復単位、１５反復単位、２０反復単位、２５反復単位、３０反復単位、３５反復単位、４０反復単位、４５反復単位、５０反復単位、５５反復単位、６０反復単位、６５反復単位、７０反復単位、７５反復単位、８０反復単位、８５反復単位、９０反復単位、９５反復単位、または１００反復単位の増加を有する。
別の実施形態では、本発明の糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。例えば、表２１を参照されたい。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法としては、実施例１３に記載されるような、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
糖中の反復単位の数を決定する方法も、当業界で公知である。例えば、多糖の分子量（コア糖またはＫＤＯ残基の分子量を含まない）を、反復単位の分子量（すなわち、式内のそれぞれの単糖の分子量の和として理論的に算出することができる、例えば、表１に示される対応する式中の構造の分子量）で除算することによって、反復単位の数（または式中の「ｎ」）を算出することができる。式内のそれぞれの単糖の分子量は、当業界で公知である。例えば、式Ｏ２５ｂの反復単位の分子量は、約８６２Ｄａである。例えば、式Ｏ１ａの反復単位の分子量は、約８４５Ｄａである。例えば、式Ｏ２の反復単位の分子量は、約８２９Ｄａである。例えば、式Ｏ６の反復単位の分子量は、約８９３Ｄａである。コンジュゲート中の反復単位の数を決定する場合、担体タンパク質の分子量およびタンパク質：多糖比を考慮に入れる。本明細書で定義される場合、「ｎ」とは、多糖分子中の反復単位の数（表１中で括弧内に示される）を指す。当業界で公知のように、生体高分子中で、反復構造は、例えば、失われる分枝などの、不完全な反復の領域が組み入れられていてもよい。さらに、細菌などの天然供給源から単離および精製された多糖は、サイズおよび分枝において不均一であり得ることが当業界で公知である。そのような場合、ｎは、集団中の分子のｎに関する平均値または中央値を表してもよい。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、Ｏ抗原の少なくとも１の反復単位の増加を有する。Ｏ抗原の反復単位は、表１に示される。一実施形態では、Ｏ多糖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の合計反復単位を含む。好ましくは、糖は、合計で少なくとも３から、最大でも８０の反復単位を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。
一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式（例えば、表１に示される式など（図９Ａ～９Ｃおよび図１０Ａ～１０Ｂも参照されたい））のいずれかにおけるｎが、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および最大でも２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０の整数である、Ｏ抗原を含む。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。例示的な範囲としては、例えば、少なくとも１～最大でも１０００；少なくとも１０～最大でも５００；および少なくとも２０～最大でも８０、好ましくは、最大でも９０が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも３１～最大でも９０である。好ましい実施形態では、ｎは、４０～９０、より好ましくは、６０～８５である。
一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎが少なくとも１であり、最大でも２００である、Ｏ抗原を含む。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１００であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも４０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも９０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも８５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも６０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも５０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４９である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４８である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４７である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４６である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３６であり、最大でも４５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３７であり、最大でも４４である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３８であり、最大でも４３である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４２である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４１である。
例えば、一実施形態では、糖におけるｎは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０、最も好ましくは４０である。別の実施形態では、ｎは、少なくとも３５～最大でも６０である。例えば、一実施形態では、ｎは、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０のいずれか１つ、好ましくは５０である。別の好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも５５～最大でも７５である。例えば、一実施形態では、ｎは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９、最も好ましくは６０である。
糖構造を、例えば、１Ｄ、１Ｈ、および／もしくは１３Ｃを含むＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの、当業界で公知の方法および手段によって決定することができる。
一部の実施形態では、コンジュゲーション前の精製された多糖は、５ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、糖は、１０ｋＤａ～４００ｋＤａ；５ｋＤａ～４００ｋＤａ；５ｋＤａ～３００ｋＤａ；５ｋＤａ～２００ｋＤａ；５ｋＤａ～１５０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～７５ｋＤａ；１０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１０ｋＤａ～４０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～２００ｋＤａ；１５ｋＤａ～１５０ｋＤａ；１２ｋＤａ～１２０ｋＤａ；１２ｋＤａ～７５ｋＤａ；１２ｋＤａ～５０ｋＤａ；１２～６０ｋＤａ；３５ｋＤａ～７５ｋＤａ；４０ｋＤａ～６０ｋＤａ；３５ｋＤａ～６０ｋＤａ；２０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１２ｋＤａ～２０ｋＤａ；または２０ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、多糖は、７ｋＤａ～１５ｋＤａ；８ｋＤａ～１６ｋＤａ；９ｋＤａ～２５ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１０ｋＤａ～７０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１６０ｋＤａ；１５ｋＤａ～６００ｋＤａ；２０ｋＤａ～１０００ｋＤａ；２０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２０ｋＤａ～４００ｋＤａ；３０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３０ｋＤａ～６０ｋＤａ；３０ｋＤａ～５０ｋＤａまたは５ｋＤａ～６０ｋＤａの分子量を有する。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
本明細書で使用される場合、多糖または担体タンパク質－多糖コンジュゲートの用語「分子量」とは、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって算出される分子量を指す。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけることができる。機械的または化学的サイジングを用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。機械的サイジングを、高圧ホモジェナイゼーション剪断を使用して行うことができる。上記の分子量範囲は、コンジュゲーション前（例えば、活性化前）の精製された多糖を指す。
Figure 2024503792000008
Figure 2024503792000009
Figure 2024503792000010
Figure 2024503792000011
Figure 2024503792000012
Figure 2024503792000013
Figure 2024503792000014
Figure 2024503792000015
Figure 2024503792000016
３．コアオリゴ糖
コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ中のリピドＡとＯ抗原外側領域との間に位置する。より具体的には、コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＯ抗原とリピドＡとの間に結合を含む多糖の部分である。この結合は、最深部の３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基のヘミケタール機能と、リピドＡのＧｌｃＮＡｃ残基のヒドロキシル基との間のケトシド結合を含む。コアオリゴ糖領域は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株間で高い類似度を示す。それは通常、限られた数の糖を含む。コアオリゴ糖は、内側コア領域と、外側コア領域とを含む。
より具体的には、内側コアは、主にＬ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース（ヘプトース）およびＫＤＯ残基から構成される。内側コアは、高度に保存されている。ＫＤＯ残基は、以下の式ＫＤＯ：
Figure 2024503792000017
 を含む。
コアオリゴ糖の外側領域は、内側コア領域よりも大きな変化を示し、この領域の差異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における５つのケモタイプ：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＫ－１２を区別する。５つの公知ケモタイプの外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般化された構造は、当業界で周知である。ＨｅｐＩＩは、内側コアオリゴ糖の最後の残基である。外側コアオリゴ糖は全て、（ヘキソース）３炭水化物骨格および２つの側鎖残基と共に、構造テーマを共有するが、骨格中のヘキソースの順序ならびに側鎖残基の性質、位置、および結合は全て変化し得る。Ｒ１およびＲ４外側コアオリゴ糖の構造は、非常に類似しており、単一のβ結合残基においてのみ異なっている。
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコアオリゴ糖は、遠位オリゴ糖の構造に基づいて、当業界では５つの異なるケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に分類される。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含む糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも２つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも３つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも４つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、５つ全部のコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。
別の好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含まない糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、そのような組成物は、Ｏ多糖を有する糖コンジュゲートがコアオリゴ糖を含まないにも拘わらず、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型は、５つのケモタイプの１つに従って特徴付けることができる。表Ｂは、ケモタイプに従って特徴付けられる例示的な血清型を列挙する。太字の血清型は、示されたコアケモタイプと最も一般的に関連する血清型を表す。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、それぞれの対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型のいずれか１つに対する免疫応答を含む、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。
Figure 2024503792000018
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ８、式Ｏ１８、式Ｏ９、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１～１００である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ１８、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、好ましくは３１～９０、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、糖中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２１、式Ｏ４４、式Ｏ１１、式Ｏ８９、式Ｏ１６２、および式Ｏ９（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、好ましくは３１～９０、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ２ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ１５、式Ｏ１５３、式Ｏ２１、式Ｏ１７、式Ｏ１１、式Ｏ１５９、式Ｏ２２、式Ｏ８６、および式Ｏ９３（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、好ましくは３１～９０、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ３ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ８６、式Ｏ７、式Ｏ１０２、式Ｏ１６０、および式Ｏ１６６（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、好ましくは３１～９０、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ４ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、Ｋ－１２ケモタイプ（例えば、式Ｏ２５ｂを有する糖および式Ｏ１６（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、好ましくは３１～９０、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される）を有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、糖は、コア糖を含む。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、糖は、コア糖を含まない。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。
４．コンジュゲート化Ｏ抗原
Ｏ抗原、または好ましくはＯ多糖の、タンパク質担体への化学的結合は、Ｏ抗原またはＯ多糖の免疫原性を改善し得る。しかしながら、ポリマーサイズの可変性が、生産に関する現実的課題である。商業的使用では、糖のサイズは、様々なコンジュゲーション合成戦略、製品の均一性、およびコンジュゲートの免疫原性との適合性に影響し得る。Ｏ抗原合成経路の操作によるＷｚｚファミリータンパク質鎖長調節因子の発現の制御は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む種々のグラム陰性細菌株における所望の長さのＯ抗原鎖の産生を可能にする。
一実施形態では、精製された糖は、担体タンパク質と反応することができる活性化された糖を産生するように化学的に活性化される。活性化されたら、それぞれの糖は、担体タンパク質に別々にコンジュゲートされて、コンジュゲート、すなわち、糖コンジュゲートを形成する。本明細書で使用される場合、用語「糖コンジュゲート」とは、担体タンパク質に共有結合した糖を指す。一実施形態では、糖は、担体タンパク質に直接結合する。別の実施形態では、糖は、スペーサー／リンカーを介して担体タンパク質に結合する。
Ｏ抗原に沿った１つもしくは複数の部位で担体をＯ抗原に結合させるスキームによって、またはコアオリゴ糖の少なくとも１つの残基を活性化するスキームによって、コンジュゲートを調製することができる。
一実施形態では、それぞれの糖は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。
タンパク質担体が組成物中の２個以上の糖について同じである場合、糖を、担体タンパク質の同じ分子（例えば、２個以上の異なる糖がコンジュゲートされた担体分子）にコンジュゲートすることができる。
好ましい実施形態では、糖は、タンパク質担体の異なる分子にそれぞれ個別にコンジュゲートされる（タンパク質担体の各分子は、それにコンジュゲートされた１つの型の糖だけを有する）。前記実施形態では、糖は、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされると言われる。
糖の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションを、本明細書に開示される活性化およびコンジュゲーション方法によって達成することができる。多糖の担体タンパク質へのコンジュゲーション後、糖コンジュゲートは、様々な技術によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。これらの技術としては、濃縮／透析濾過操作、沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過が挙げられる。個々の糖コンジュゲートを精製した後、それらを混合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。
ａ．活性化。本発明はさらに、多糖がリンカーまたは担体タンパク質へのコンジュゲーションのための反応基を産生する化学試薬で活性化される、本明細書に記載の実施形態のいずれかから産生される活性化された多糖に関する。一部の実施形態では、本発明の糖は、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に活性化される。一部の実施形態では、活性化度は、多糖の分子量を実質的に減少させない。例えば、一部の実施形態では、活性化度は、多糖骨格を切断しない。一部の実施形態では、活性化度は、ＣＲＭ１９７などの担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数（アミノ酸分析によって決定される）によって測定された場合、コンジュゲーション度に有意に影響しない。例えば、一部の実施形態では、活性化度は、同じ活性化度で参照多糖を有するコンジュゲートの担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数と比較して、担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数（アミノ酸分析によって決定される）を３倍有意に増加させない。一部の実施形態では、活性化度は、非コンジュゲート化遊離糖のレベルを増加させない。一部の実施形態では、活性化度は、最適な糖／タンパク質比を低下させない。
一部の実施形態では、活性化された糖は、活性化された糖の糖反復単位あたりのチオールのモル数が、１～１００％、例えば、２～８０％、２～５０％、３～３０％、および４～２５％などである、活性化のパーセンテージを有する。活性化度は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。好ましくは、活性化度は、最大でも５０％、より好ましくは最大でも２５％である。一実施形態では、活性化度は、最大でも２０％である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。
一実施形態では、多糖を、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて活性化して、シアン酸エステルを形成させる。次いで、活性化された多糖を、担体タンパク質（好ましくは、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）上のアミノ基に直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせる。
例えば、スペーサーは、マレイミド活性化された担体タンパク質（例えば、Ｎ－［γ－マレイミドブチリロキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用する）またはハロアセチル化された担体タンパク質（例えば、７６ｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ７６ｅ、Ｎ－スクシンイミジルブロモ酢酸（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（スルホ－ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルヨード酢酸（ＳＩＡ）、もしくはスクシンイミジル３－［ブロモアセトアミド］プロピオン酸（ＳＢＡＰ）を使用する）との反応後に得られるチオエーテル結合によって担体にカップリングすることができるチオール化された多糖を得るためのシスタミンまたはシステアミンであってよい。一実施形態では、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応によって作製してもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を使用して担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートする。
コンジュゲーションのための他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基の、ＣＤＩとの反応、次いで、カルバメート結合を形成するタンパク質との反応によって形成することができるカルボニルリンカーを含んでもよい。これは、第一ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、第一ヒドロキシル基の任意選択の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する第一ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体と、タンパク質上のアミノ基とのカップリング（ＣＤＩ化学反応）を含んでもよい。
ｂ．分子量。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖を含む。他の実施形態では、糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、２００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、糖は、１００ｋＤａ～１０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８００ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、単一末端コンジュゲーションによって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、水性緩衝剤中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
一部の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、４００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａ；または３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖コンジュゲートは、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖コンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態では、糖コンジュゲートは、２，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａまたは３，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。
さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または５，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生産される。
さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは６，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。
糖コンジュゲートの分子量を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによって測定することができる。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。本発明の糖コンジュゲートを、糖の担体タンパク質に対する比（重量／重量）によって特徴付けることもできる。一部の実施形態では、糖コンジュゲート中の多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～３（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０）である。他の実施形態では、糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．８～１．２、０．５～１．０、１．０～１．５または１．０～２．０である。さらなる実施形態では、糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８～１．２である。好ましい実施形態では、コンジュゲート中の多糖の担体タンパク質に対する比は、０．９～１．１である。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
また、糖コンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を使用して、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、コンジュゲートの分子サイズ分布をプロファイリングするために重力送りのカラム中で使用される。媒体中の小孔から排除される大きい分子は、低分子よりも迅速に溶出する。画分収集装置を使用して、カラム溶出液を収集する。画分を、糖アッセイによる比色分析で試験する。Ｋｄの決定のために、分子が完全に排除される画分（Ｖ０）、（Ｋｄ＝０）、および最大保持を示す画分（Ｖｉ）、（Ｋｄ＝１）を確立するために、カラムを較正する。特定の試料特性に達する画分（Ｖｅ）を、式Ｋｄ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）によってＫｄと関連させる。
ｃ．遊離糖。本発明の糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートしていないが、それにも拘わらず、糖コンジュゲート組成物中に存在する遊離糖を含んでもよい。遊離糖は、糖コンジュゲートと非共有的に結合していてもよい（すなわち、非共有的に結合する、吸着する、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉される）。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約２０％の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約１５％の遊離多糖を含む。別の好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、約８％未満の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約６％の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約５％の遊離多糖を含む。
ｄ．共有結合。他の実施形態では、コンジュゲートは、５～１０糖反復単位毎に；２～７糖反復単位毎に；３～８糖反復単位毎に；４～９糖反復単位毎に；６～１１糖反復単位毎に；７～１２糖反復単位毎に；８～１３糖反復単位毎に；９～１４糖反復単位毎に；１０～１５糖反復単位毎に；２～６糖反復単位毎に；３～７糖反復単位毎に；４～８糖反復単位毎に；６～１０糖反復単位毎に；７～１１糖反復単位毎に；８～１２糖反復単位毎に；９～１３糖反復単位毎に；１０～１４糖反復単位毎に；１０～２０糖反復単位毎に；４～２５糖反復単位毎に、または２～２５糖反復単位毎に、担体タンパク質と糖との間に少なくとも１個の共有結合を含む。よくある実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。別の実施形態では、担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５糖反復単位毎に存在する。一実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
ｅ．リシン残基。本発明の糖コンジュゲートを特徴付ける別の方法は、コンジュゲート化リシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる糖にコンジュゲートされるようになる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数による。多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変に関する証拠を、当業者には公知の日常的な方法を使用するアミノ酸分析によって取得することができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基数の減少をもたらす。好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、４～７である。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
糖鎖の担体タンパク質上のリシンへの結合の頻度は、本発明の糖コンジュゲートを特徴付けるための別のパラメーターである。例えば、一部の実施形態では、担体タンパク質と、多糖との間の少なくとも１つの共有結合は、多糖の４糖反復単位毎に存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の２５糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。
ｆ．Ｏアセチル化。一部の実施形態では、本発明の糖は、Ｏアセチル化されている。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、１０～１００％、２０～１００％、３０～１００％、４０～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、７５～１００％、８０～１００％、９０～１００％、５０～９０％、６０～９０％、７０～９０％または８０～９０％のＯアセチル化度を有する糖を含む。他の実施形態では、Ｏアセチル化度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。Ｏアセチル化の％とは、１００％に対する所与の糖のパーセンテージを意味する（それぞれの反復単位はそのアセチル化された構造と比較して完全にアセチル化されている）。
一部の実施形態では、糖コンジュゲートを、還元的アミノ化によって調製する。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、糖が担体タンパク質に直接的に共有結合された、単一末端結合コンジュゲート化糖である。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合されている。
ｇ．還元的アミノ化。一実施形態では、糖は、還元的アミノ化（米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００７／０２３１３４０号、第２００７／０１８４０７１号および第２００７／０１８４０７２号、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、およびＷＯ２００８／１４３７０９などに記載されている）によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
還元的アミノ化は、（１）糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された糖および担体タンパク質の還元を含む。酸化の前に、糖を加水分解してもよい。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。
酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本明細書で使用される用語「過ヨウ素酸塩」とは、過ヨウ素酸塩と、過ヨウ素酸との両方を指す。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。一実施形態では、多糖は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化される。別の実施形態では、多糖は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化される。
一実施形態では、酸化剤は、第一ヒドロキシルを選択的に酸化するための酸化剤の存在下の、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物などの安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物である。前記反応において、実際の酸化剤は、触媒サイクルにおける、Ｎ－オキソアンモニウム塩である。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物である。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を担持する。ある態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。ある態様では、前記酸化剤は、Ｎ－ハロ部分を担持する分子である。ある態様では、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシアヌル酸および１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオンのいずれか１つから選択される。好ましくは、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミドである。
糖の酸化ステップの後、糖は活性化されると言われ、本明細書の以下で「活性化された」と称される。活性化された糖および担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。一実施形態では、活性化された糖および担体タンパク質は、同時凍結乾燥される。別の実施形態では、活性化された多糖および担体タンパク質は、独立に凍結乾燥される。
一実施形態では、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行い、あり得る非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットが挙げられる。
コンジュゲーションプロセスの次のステップは、還元剤を使用した、コンジュゲートを形成させるための活性化された糖および担体タンパク質の還元（いわゆる還元的アミノ化）である。好適な還元剤としては、ＢｒｏｎｓｔｅｄまたはＬｅｗｉｓ酸の存在下のシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは水素化ホウ素亜鉛などのシアノ水素化ホウ素、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ’ＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）、ボラン－ピリジン、またはホウ化水素交換樹脂などのアミンボランが挙げられる。一実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
ある実施形態では、還元反応は、水性溶媒（例えば、ｐＨ６．０～８．５、７．０～８．０または７．０～７．５の、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ－トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される）中で実行され、別の実施形態では、反応は非プロトン性溶媒中で実行される。ある実施形態では、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を使用して、凍結乾燥された活性化された糖および担体タンパク質を復元することができる。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基があってもよく、これらのものを、好適なキャッピング剤を使用してキャップすることができる。一実施形態では、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。コンジュゲーション（還元反応および必要に応じて、キャッピング）の後、糖コンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術によって精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。糖コンジュゲートを、透析濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ある実施形態では、糖コンジュゲートは、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。一実施形態では、糖コンジュゲートは、滅菌濾過される。
好ましい実施形態では、Ｏ２５Ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する糖コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される。好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６に由来する糖コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される。
一態様では、本発明は、担体タンパク質、例えば、
Figure 2024503792000019
 ［式中、ｎは、１以上の任意の整数である］
によって表される、式Ｏ２５Ｂの糖に連結されているＣＲＭ１９７を含むコンジュゲートに関する。好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および最大でも２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０の整数である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。例示的な範囲としては、例えば、少なくとも１～最大でも１０００；少なくとも１０～最大でも５００；および少なくとも２０～最大でも８０が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、ｎは少なくとも３１～最大でも９０、より好ましくは４０～９０、最も好ましくは６０～８５である。
別の態様では、本発明は、表Ａに示される以下の構造のいずれか１つ（式中、ｎは１より大きい整数であるか、または１に等しい）を有する糖に結合した、担体タンパク質、例えば、ＣＲＭ１９７を含むコンジュゲートに関する。
理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、一部の実施形態では、安定なコンジュゲートは、抗原の重要な免疫原性エピトープの構造的完全性の保持とのバランスを保つレベルの抗原改変を必要とすると考えられる。
ｈ．アルデヒドの活性化および形成。一部の実施形態では、本発明の糖は、活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖が活性化されるそのような実施形態では、活性化のパーセンテージ（％）（または酸化度（ＤＯ））とは、活性化された多糖のアルデヒドのモルあたりの糖反復単位のモルを指す。例えば、一部の実施形態では、糖は、多糖の反復単位上の隣接ジオールの過ヨウ素酸塩酸化によって活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖反復単位に対する過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量（ｍｅｑ）および酸化中の温度を変化させることにより、酸化度（ＤＯ）のレベルの変化が得られる。
糖およびアルデヒド濃度は、典型的には、比色アッセイによって決定される。代替試薬は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン１－オキシルラジカル）－Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）混合物であり、第一アルコール基からのアルデヒドの形成をもたらす。
一部の実施形態では、活性化された糖は、活性化された糖のアルデヒドのモルあたりの糖反復単位のモルが、例えば、２～８０、２～５０、３～３０、および４～２５などの、１～１００である酸化度を有する。活性化度は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、もしくは９０以上、または約１００である。好ましくは、酸化度（ＤＯ）は、少なくとも５、かつ最大でも５０、より好ましくは、少なくとも１０、かつ最大でも２５である。一実施形態では、活性化度は、少なくとも１０、かつ最大でも２５である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。酸化度の値は、活性化のパーセンテージ（％）として表すことができる。例えば、一実施形態では、１０のＤＯ値は、活性化された糖中の合計１０の糖反復単位のうち、１の活性化された糖反復単位を指し、その場合、１０のＤＯ値は、１０％の活性化と表すことができる。
一部の実施形態では、還元的アミノ化化学反応によって調製されたコンジュゲートは、担体タンパク質と糖とを含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。一部の実施形態では、コンジュゲート中の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは３１～１００または３１～９０、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５の整数である式を含む。
ｉ．単一末端結合コンジュゲート。一部の実施形態では、コンジュゲートは、糖が、糖の一方の末端で担体タンパク質に共有結合した、単一末端結合コンジュゲート化糖である。一部の実施形態では、単一末端結合コンジュゲート化多糖は、末端糖を有する。例えば、コンジュゲートは、多糖の一方の末端（末端糖残基）が担体タンパク質に共有結合する場合、単一末端結合している。一部の実施形態では、コンジュゲートは、多糖の末端糖残基がリンカーを介して担体タンパク質に共有結合する場合、単一末端結合している。そのようなリンカーは、例えば、シスタミンリンカー（Ａ１）、３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカー（Ａ４）、および２，２’－ジチオ－Ｎ，Ｎ’－ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（アミノオキシ）アセタミド）リンカー（Ａ６）を含んでもよい。
一部の実施形態では、糖は、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートして、単一末端結合コンジュゲートを形成している。
一部の実施形態では、コンジュゲートは好ましくは、バイオコンジュゲートではない。用語「バイオコンジュゲート」とは、宿主細胞バックグラウンドで調製された、タンパク質（例えば、担体タンパク質）と、抗原、例えば、Ｏ抗原（例えば、Ｏ２５Ｂ）とのコンジュゲートを指し、ここで、宿主細胞機構が、抗原をタンパク質に結合する（例えば、Ｎ結合）。糖コンジュゲートは、宿主細胞中でのコンジュゲートの調製を必要としない手段、例えば、タンパク質と糖との化学的結合によるコンジュゲーションによって調製されたバイオコンジュゲート、ならびに糖抗原（例えば、オリゴ糖および多糖）－タンパク質コンジュゲートを含む。
ｊ．チオール活性化された糖。一部の実施形態では、本発明の糖は、チオール活性化されている。糖がチオール活性化されているそのような実施形態では、活性化のパーセンテージ（％）は、活性化された多糖の糖反復単位あたりのチオールのモルを指す。糖およびチオール濃度は、典型的には、スルフヒドリルの定量化のためのエルマンアッセイによって決定される。例えば、一部の実施形態では、糖は、ジスルフィドアミンリンカーを用いた２－ケト－３－デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）の活性化を含む。一部の実施形態では、糖は、二価ヘテロ二官能性リンカー（本明細書では「スペーサー」とも称される）を介して担体タンパク質に共有結合している。リンカーは、好ましくは、糖と担体タンパク質との間のチオエーテル結合を提供し、本明細書では「チオエーテル糖コンジュゲート」と称される糖コンジュゲートをもたらす。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）などの、カルバメートおよびアミド結合をさらに提供する。
一部の実施形態では、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質および糖を含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。一部の実施形態では、コンジュゲート内の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは、３１～１００、より好ましくは、３５～９０、最も好ましくは、３５～６５の整数である式を含む。
例えば、一実施形態では、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質と、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～１０の整数である）から選択される構造を有する糖とを含む。
５．ｅＴＥＣコンジュゲート
一態様では、本発明は一般に、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサー（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９５１７２７４号および国際特許出願公開ＷＯ２０１４０２７３０２に記載されている）を介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた上記の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む糖コンジュゲート、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物の調製および使用のための方法に関する。前記糖コンジュゲートは、１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた糖であって、糖が、カルバメート結合によってｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされ、担体タンパク質が、アミド結合によってｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされている、糖を含む。ｅＴＥＣスペーサーは、７個の線状原子（すなわち、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）を含み、糖と担体タンパク質との間に安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。
本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、一般式（Ｉ）：
Figure 2024503792000020
 ［式中、ｅＴＥＣスペーサーを構成する原子は、中央のボックス内に含まれる］
によって表され得る。
本発明の前記糖コンジュゲートにおいて、糖は、多糖またはオリゴ糖であってもよい。
本発明の糖コンジュゲート中に組み入れられる担体タンパク質は、本明細書にさらに記載されるように、または当業者には公知のように、そのような目的にとって一般的に好適な担体タンパク質群から選択される。特定の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
別の態様では、本発明は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）有機溶媒中で糖と炭酸誘導体とを反応させて、活性化された糖を生産するステップ；ｂ）活性化された糖と、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩とを反応させて、チオール化された糖を生産するステップ；ｃ）チオール化された糖と、還元剤とを反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む、活性化されたチオール化された糖を生産するステップ；ｄ）活性化されたチオール化された糖と、１つまたは複数のα－ハロアセタミド基を含む活性化された担体タンパク質とを反応させて、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートを生産するステップ；ならびにｅ）チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）活性化された担体タンパク質の非コンジュゲート化α－ハロアセタミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化されたチオール化された糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬とを反応させるステップを含み、それによって、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートが生産される、方法を提供する。
よくある実施形態では、炭酸誘導体は、１，１’－カルボニル－ジ－（１，２，４－トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）である。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態では、チオール化された糖は、活性化された糖と、二官能性対称性チオアルキルアミン試薬、シスタミンまたはその塩との反応によって生産される。あるいは、チオール化された糖を、活性化された糖と、システアミンまたはその塩との反応によって形成させることもできる。本発明の方法によって生産されるｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを、一般式（Ｉ）によって表すことができる。
よくある実施形態では、第１のキャッピング試薬は、担体タンパク質のリシン残基上の非コンジュゲート化α－ハロアセタミド基と反応して、チオエーテル結合によって活性化されたリシン残基に共有結合するＳ－カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）残基を形成する、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインである。
他の実施形態では、第２のキャッピング試薬は、活性化されたチオール化された糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル基と反応して、キャッピングされたチオアセタミドを提供するヨードアセタミド（ＩＡＡ）である。ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬と第２のキャッピング試薬との両方を用いてキャッピングすることを含むことが多い。ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬としてのＮ－アセチル－Ｌ－システインおよび第２のキャッピング試薬としてのＩＡＡを用いてキャッピングすることを含む。
一部の実施形態では、キャッピングステップｅ）は、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。
本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒドリル残基を含んでもよい。一部の例では、本明細書に提供される方法によって形成される活性化されたチオール化された糖は、複数の遊離スルフヒドリル残基を含み、その一部は、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質への共有的コンジュゲーションを受けない場合がある。そのような残留する遊離スルフヒドリル残基は、アチオール反応キャッピング試薬、例えば、ヨードアセタミド（ＩＡＡ）との反応によってキャッピングされ、潜在的に反応性の官能基をキャッピングする。他のチオール反応性キャッピング試薬、例えば、マレイミド含有試薬なども企図される。
さらに、本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、残留する非コンジュゲート化担体タンパク質を含んでもよく、キャッピングプロセスステップ中に改変を受けた活性化された担体タンパク質を含んでもよい。
一部の実施形態では、ステップｄ）は、活性化されたチオール化された糖と、活性化された担体タンパク質とを反応させる前に、１つまたは複数のα－ハロアセタミド基を含む活性化された担体タンパク質を提供することをさらに含む。よくある実施形態では、活性化された担体タンパク質は、１つまたは複数のα－ブロモアセタミド基を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産されたｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖を含むｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを提供する。
一部の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５糖反復単位あたり少なくとも１回存在する。
本発明の態様のそれぞれ、特に、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態について、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖などの、本明細書に記載の糖を含む。
別の態様では、本発明は、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含み、前記免疫原性組成物が、本明細書に記載の糖を含むｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する。
一部の実施形態では、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、担体タンパク質と、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む糖とを含む。一部の実施形態では、コンジュゲート中の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５の整数である式を含む。
糖にコンジュゲートされるようになる担体タンパク質中のリシン残基の数を、コンジュゲートされるリシンの範囲として特徴付けることができる。例えば、免疫原性組成物の一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、糖に共有結合した３９のうちの４～１６個のリシン残基を含んでもよい。このパラメーターを表現するための別の方法は、ＣＲＭ１９７リシンの約１０％～約４１％が糖に共有結合しているというものである。他の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、糖に共有結合した３９のうちの２～２０個のリシン残基を含んでもよい。このパラメーターを表現するための別の方法は、ＣＲＭ１９７リシンの約５％～約５０％が糖に共有結合しているというものである。
よくある実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５糖反復単位あたり少なくとも１回存在する。
他の実施形態では、コンジュゲートは、５～１０糖反復単位毎に；２～７糖反復単位毎に；３～８糖反復単位毎に；４～９糖反復単位毎に；６～１１糖反復単位毎に；７～１２糖反復単位毎に；８～１３糖反復単位毎に；９～１４糖反復単位毎に；１０～１５糖反復単位毎に；２～６糖反復単位毎に；３～７糖反復単位毎に；４～８糖反復単位毎に；６～１０糖反復単位毎に；７～１１糖反復単位毎に；８～１２糖反復単位毎に；９～１３糖反復単位毎に；１０～１４糖反復単位毎に；１０～２０糖反復単位毎に；または４～２５糖反復単位毎に、担体タンパク質と糖との間に少なくとも１個の共有結合を含む。
別の実施形態では、担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５糖反復単位毎に存在する。
６．担体タンパク質
本発明の糖コンジュゲートの成分は、糖がコンジュゲートされている担体タンパク質である。用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に使用することができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。
コンジュゲートの１つの成分は、Ｏ多糖がコンジュゲートされている担体タンパク質である。一実施形態では、コンジュゲートは、Ｏ多糖のコアオリゴ糖にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む。一実施形態では、コンジュゲートは、Ｏ多糖のＯ抗原にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む。
用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に使用することができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。
好ましい実施形態では、コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡのいずれか１つから独立に選択される。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ－例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。一部の実施形態では、担体タンパク質は、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）を含む。
好ましい実施形態では、糖は、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされる。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不可能である。ＣＲＭ１９７は、毒素産生コリネファージベータのニトロソグアニジン突然変異誘発によって作出された非毒素産生ファージβ１９７ｔｏｘ－によって感染したクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって産生される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一の塩基変化（グアニンからアデニンへの）によってそれと異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒性を除去する。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。
したがって、一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、糖がＣＲＭ１９７に共有結合している、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含む。
好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の非毒性的であるが、抗原的に同一のバリアント）、他のＤＴ変異体（ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：３８３８～３８４４、１９７３）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３またはＣＲＭ１０７；ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．１９９２により記載された他の突然変異；Ｇｌｕ－１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒおよび／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または突然変異ならびに米国特許第４，７０９，０１７号および第４，９５０，７４０号に開示された他の突然変異；Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つまたは複数の残基の突然変異ならびに米国特許第５，９１７，０１７号もしくは第６，４５５，６７３号に開示された他の突然変異；または米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片）、一部の様式で解毒されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）またはｄＰＬＹ－ホルモル、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含むＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５もしくはＷＯ００／３９２９９に開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えば、ＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物、ＰｈｔＡ－Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）を含む、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ６３：２７０６～１３）、ＯＭＰＣ（通常、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出される髄膜炎菌外膜タンパク質－ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ－例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）、またはその免疫学的機能等価物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６～３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２：４８８４～７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（特に、その非毒性変異体（グルタミン酸５５３に置換を担持する外毒素Ａなど（Ｕｃｈｉｄａ Ｃａｍｅｒｏｎ ＤＭ、ＲＪ Ｃｏｌｌｉｅｒ．１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４９６７～４９７１））からなる群から選択される。オブアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用することができる。他の好適な担体タンパク質としては、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載されている）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａなどの不活化細菌毒素が挙げられる。
一部の実施形態では、担体タンパク質は、例えば、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、フラゲリン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質、ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される。一実施形態では、担体タンパク質は、解毒されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＥＰＡ）である。別の実施形態では、担体タンパク質は、解毒されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＥＰＡ）ではない。一実施形態では、担体タンパク質は、フラゲリンである。別の実施形態では、担体タンパク質は、フラゲリンではない。
好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡからなる群から独立に選択される。ある実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ－例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。
好ましい実施形態では、本発明の莢膜糖は、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされる。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不可能である。ＣＲＭ１９７は、毒素産生コリネファージベータ（Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ.ら、１９７１、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３３：８～１１）のニトロソグアニジン突然変異誘発によって創出された非毒素産生ファージβ１９７ｔｏｘ－により感染したコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一の塩基変化（グアニンからアデニンへの）によってそれと異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒性を除去する。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。ＣＲＭ１９７およびその産生に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許第５，６１４，３８２号に見出すことができる。
したがって、よくある実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、莢膜多糖がＣＲＭ１９７に共有結合している、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含む。
さらなる実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＳＣＰ（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ）である。β－溶血性連鎖球菌の全てのヒト単離物は、Ｃ５ａを特異的に不活性化する、高度に保存された細胞壁タンパク質ＳＣＰ（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ）を産生する。ｓｃｐ遺伝子は、１，１３４～１，１８１アミノ酸を含有するポリペプチドをコードする（Ｂｒｏｗｎら、ＰＮＡＳ、２００５年、１０２巻、５１号、１８３９１～１８３９６頁）。最初の３１残基は、搬出シグナルプレ配列であり、細胞膜通過の際に除去される。次の６８残基は、プロ配列として機能し、活性ＳＣＰを産生するために除去される必要がある。次の１０残基は、プロテアーゼ活性を損失することなく除去することができる。他方の端において、Ｌｙｓ－１０３４から開始して、４個の連続した１７残基モチーフに続いて、細胞選別および細胞壁付着シグナルがある。この組み合わされたシグナルは、ＬＰＴＴＮＤ配列を含有する２０残基親水性配列、１７残基疎水性配列および短い塩基性カルボキシル末端で構成される。
ＳＣＰは、ドメインに分けることができる（Ｂｒｏｗｎら、ＰＮＡＳ、２００５年、１０２巻、５１号、１８３９１～１８３９６頁の図１Ｂを参照）。そのようなドメインは、プレ／プロドメイン（搬出シグナルプレ配列（一般的に、最初の３１残基）およびプロ配列（一般的に、次の６８残基）を含む）、プロテアーゼドメイン（２個の部分（プロテアーゼ部分１は一般的に、残基８９～３３３／３３４であり、プロテアーゼドメイン部分２は一般的に、残基４６７／４６８～５８３／５８４である）に分割される）、プロテアーゼ関連ドメイン（ＰＡドメイン）（一般的に、残基３３３／３３４～４６７／４６８）、３個のフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ）ドメイン（Ｆｎ１、一般的に、残基５８３／５８４～７１２／７１３；Ｆｎ２、一般的に、残基７１２／７１３～９２８／９２９／９３０；一般的に、Ｆｎ３、残基９２９／９３０～１０２９／１０３０／１０３１）および細胞壁アンカードメイン（一般的に、残基１０２９／１０３０／１０３１～Ｃ末端）である。
ある実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＧＢＳ由来のＳＣＰ（ＳＣＰＢ）である。ＳＣＰＢの例は、ＷＯ９７／２６００８の配列番号３に提供される。ＷＯ００／３４４８７の配列番号３も参照されたい。
別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＧＡＳ由来のＳＣＰ（ＳＣＰＡ）である。ＳＣＰＡの例は、ＷＯ９７／２６００８の配列番号１および配列番号２に見出すことができる。ＷＯ００／３４４８７の配列番号１、２および２３も参照されたい。
さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲート（ｇｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の担体タンパク質は、ＷＯ２０１４／１３６０６４の配列番号１５０または１５１に記載されるＳＣＰである。
Ｂ．アジュバント
一部の態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも１、２または３つのアジュバントをさらに含んでもよい。用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。抗原は、主に送達系として、主に免疫モジュレーターとして作用するか、または両方の強力な特徴を有してもよい。好適なアジュバントとしては、ヒトを含む哺乳動物中での使用にとって好適なものが挙げられる。
ヒトにおいて使用することができる公知の好適な送達系型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５））などの水中油エマルジョン、モンタニドなどの油中水エマルジョン、およびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子またはナノ粒子が挙げられる。
一態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてアルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）を含む。さらなる態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムを含む。一態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムの形態で、０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬまたは０．２ｍｇ／ｍＬ～０．３ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む。一態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムの形態で約０．２５ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む。
ヒトにおいて使用することができる公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、アクイラ（Ａｑｕｉｌｌａ）樹皮からのサポニン抽出物（ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ）またはＧＬＡ－ＡＱなどのＴＬＲ４アゴニスト、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）またはＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカイン、ＡＳ０１などが挙げられる。
ヒトにおいて使用することができる送達特性と免疫調節特性との両方を示す公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ２００６／１３４４２３およびＷＯ２００７／０２６１９０を参照されたい）またはＴＬＲ４アゴニストと水中油エマルジョンとの組合せであるＧＬＡ－ＥＭが挙げられる。
限定されるものではないが、動物実験などの獣医学的適用のために、当業者であれば、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＦＡ）、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル－ＭＤＰと称される）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥと称される）、および２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に細菌から抽出される３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する、ＲＩＢＩを使用することができる。
本明細書に開示される免疫原性組成物の有効性を増強するためのさらなる例示的なアジュバントとしては、限定されるものではないが、（１）例えば、（ａ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック（登録商標）遮断ポリマーＬ１２１、およびマイクロメートル以下のエマルジョンにマイクロ流体化された、またはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされたｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｂ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）などの、水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照されたい）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤を含む、または含まない）；（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）、ＡＢＩＳＣＯ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、または使用することができるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）もしくはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの、それから生成される粒子（ＩＳＣＯＭはさらなる洗剤を含まなくてもよい（例えば、ＷＯ００／０７６２１））などのサポニンアジュバント；（３）完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（例えば、ＷＯ９９／４４６３６））、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ２２２０２１１、ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）（例えば、ＷＯ００／５６３５８を参照されたい）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ（例えば、ＥＰ０８３５３１８、ＥＰ０７３５８９８、ＥＰ０７６１２３１を参照されたい）；（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）；（８）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）；（９）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、ＷＯ００／６２８００）；（１０）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５を参照されたい）；（１１）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により、＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１３）組成物の効能を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられる。ムラミルペプチドとしては、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－２５アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ノル－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などが挙げられる。
別の実施形態では、アジュバントは、５．１ｍｇ／ｍＬ ＱＳ－２１、５ｍＭスクシネート、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＰＳ８０、ｐＨ５．６を含むリポソームキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ）－２１（ＱＳ２１）製剤である。さらなる実施形態では、アジュバントは、動的光散乱によって決定された７１ｎｍのリポソーム粒子径を有する、１５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．１、４ｍｇ／ｍＬ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１ｍｇ／ｍＬコレステロール、０．２ｍｇ／ｍＬ ＭＰＬＡ（ロット００７１４５５１－００１８－２ＸＬｉｐｏＭＰＬ）を含むリポソームモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ、ＰＨＡＤ（登録商標）、Ａｖａｎｔｉ）製剤である。またさらなる実施形態では、アジュバントは、動的光散乱によって決定されるＭＰＬＡ－ＱＳ２１リポソームの７５ｎｍの粒子径を有する、１５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．１、４ｍｇ／ｍＬ ＤＯＰＣ、１ｍｇ／ｍＬコレステロール、０．２ｍｇ／ｍＬ ＭＰＬＡおよび０．２ｍｇ／ｍＬ ＱＳ－２１（ロット００７１４５５１－００１８－２ＸｌｉｐｏＭＱ）を含むリポソームＭＰＬＡ／ＱＳ２１製剤である。
本開示のさらなる態様では、本明細書に開示されている免疫原性組成物は、アジュバントとしてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）を指し、したがって、これらの用語は、別途指摘しない限り、互換的に使用される。免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、場合により、ある特定の好ましい塩基の文脈内で、非メチル化シトシン－グアニンジヌクレオチドである、１つまたは複数の免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有する。ＣｐＧ免疫刺激モチーフのメチル化状態は一般に、ジヌクレオチド中のシトシン残基を指す。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激オリゴヌクレオチドは、３’グアニンにリン酸結合によって連結された５’非メチル化シトシンを含有し、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ－９）への結合によって免疫系を活性化するオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を介して免疫系を活性化するが、あたかもＣｐＧモチーフが非メチル化されたかのように強力ではない、１つまたは複数のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有してもよい。ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のパリンドロームを含んでもよく、次いで、ＣｐＧジヌクレオチドを包含してもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を含む、いくつかの発行された特許、公開特許出願、および他の刊行物に記載されている。
様々なクラスのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドが同定されている。これらのものは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＰクラスと呼ばれ、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁、２２行目～１２頁、３６行目により詳細に記載されている。本開示の方法は、ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドのこれらの異なるクラスの使用を含む。
Ｖ．精製および産生の方法
一態様では、本開示は、ＦｉｍＨ突然変異ポリペプチドを産生する方法に関する。そのような方法は、例えば、好適な条件下で哺乳動物細胞を培養し、これにより、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを発現させることを含むことができる。方法は、培養物からポリペプチドを収集することをさらに含むことができる。プロセスは、ポリペプチドを精製することをさらに含むことができる。
一部の態様では、方法は、約０．１ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌの収率でＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを産生する。一部の態様では、ＦｉｍＨ突然変異ポリペプチドの収率は、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９５ｍｇ／Ｌまたは少なくとも約１００ｍｇ／Ｌである。
一部の態様では、本開示に好適な細胞培養は、流加培養である。用語「加流培養」は、本明細書で使用される場合、培養プロセスの開始後に、追加の成分が１回または複数回培養物に供給される、細胞を培養する方法を指す。そのような供給成分は典型的には、培養プロセス中に枯渇する細胞のための栄養成分を含む。流加培養は、典型的に、ある時点で停止され、培地中の細胞および／または構成成分が収集および場合により単離される。一部の態様では、流加培養は、フィード培地を補充された基礎培地を含む。
一部の態様では、細胞は、バッチまたは流加培養で増殖させることができ、この場合、培養は、ポリペプチドの十分な発現の後に終結され、その後に、発現されたポリペプチドは、収集および場合により単離される。一部の態様では、細胞は、灌流培養で増殖させることができ、この場合、培養は終結されず、新たな栄養素および他の構成成分が、定期的にまたは連続的に培養物に添加され、その間に、発現されたポリペプチドは、定期的にまたは連続的に収集される。
一部の態様では、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドの発現レベルまたは活性は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞などの細菌細胞におけるＦｉｍＨ変異体ポリペプチドの発現と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍増大する。
一部の態様では、細胞は、小規模反応器において増殖させて、数ミリリットル～数リットルの範囲に及ぶ体積の細胞培養物を形成することができる。一部の態様では、細胞は、大規模商業用バイオリアクターにおいて増殖させて、細胞培養物を形成することができ、細胞培養物は、およそ少なくとも１リットル～１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上のまたはそれらの間のいずれかの体積の範囲に及ぶ体積であり得る。一部の実施形態では、細胞培養物サイズは、１０Ｌ～５０００Ｌ、１０Ｌ～１０，０００Ｌ、１０Ｌ～２０，０００Ｌ、１０Ｌ～５０，０００Ｌ、４０Ｌ～５０，０００Ｌ、１００Ｌ～５０，０００Ｌ、５００Ｌ～５０，０００Ｌ、１０００Ｌ～５０，０００Ｌ、２０００Ｌ～５０，０００Ｌ、３０００Ｌ～５０，０００Ｌ、４０００Ｌ～５０，０００Ｌ、４５００Ｌ～５０，０００Ｌ、１０００Ｌ～１０，０００Ｌ、１０００Ｌ～２０，０００Ｌ、１０００Ｌ～２５，０００Ｌ、１０００Ｌ～３０，０００Ｌ、１５Ｌ～２０００Ｌ、４０Ｌ～１０００Ｌ、１００Ｌ～５００Ｌ、２００Ｌ～４００Ｌ、またはそれらの間のいずれかの整数の範囲に及ぶことができる。
細胞培養物の温度は、細胞培養物が生存を維持し、高レベルのポリペプチドが産生される温度の範囲、代謝老廃物の産生もしくは蓄積が最小化される温度、および／または技術者によって重要と思われる上述もしくは他の因子のいずれかの組合せに主に基づき選択されるであろう。非限定的な一例として、ＣＨＯ細胞は、およそ３７℃で良好に増殖し、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生する。一般に、大部分の哺乳動物細胞は、約２５℃～４２℃の範囲内で良好に増殖するおよび／または高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生することができるが、本開示によって教示される方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約３５℃～４０℃の範囲内で良好に増殖するおよび／または高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生することができる。ある特定の態様では、細胞培養物は、細胞培養プロセス中の１つまたは複数の時点において、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃の温度で増殖させられる。
用語「培養物」および「細胞培養物」は、本明細書で使用される場合、細胞集団の生存および／または増殖に好適な条件下で培地中に懸濁された細胞集団を指す。当業者には明らかな通り、一部の態様では、これらの用語は、本明細書で使用される場合、細胞集団およびこの集団が懸濁された培地を含む組合せを指す。一部の態様では、細胞培養物の細胞は、哺乳動物細胞を含む。
一部の態様では、細胞は、種々の化学的に規定された培地のうち１つにおいて増殖させることができ、培地の構成成分は、既知でありかつ制御されている。一部の態様では、細胞は、培地の構成成分の全てが既知であるおよび／または制御されている訳ではない、複合培地において増殖させることができる。哺乳動物細胞を培養するための化学的に規定された増殖培地は、広く開発されており、直近数十年にわたって公開されている。規定された培地の全ての成分が十分に特徴づけられており、そのように規定された培地は、血清または加水分解物などの複雑な添加剤を含有しない。初期の培地配合物は、タンパク質生産に関する懸念をほとんど、またはまったく伴わずに細胞増殖および生存維持を可能にするように開発された。最近では、培地配合物は、高増殖性組換えタンパク質産生細胞の培養を支持することを明白な目的として開発されている。そのような培地が、本発明の方法において使用するために好ましい。そのような培地は一般に、高密度での細胞の増殖および／または維持を支持する多量の栄養素、特にアミノ酸を含む。必要な場合には、本発明の方法で使用するために、これらの培地を当業者は改変することができる。例えば、当業者は、本明細書に開示の通りの方法で基礎培地または供給培地として使用するために、これらの培地中のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび／またはメチオニンの量を減少させることができる。
複合培地の構成成分の全てが、十分に特徴付けられている訳ではなく、よって、複合培地は、とりわけ、単純および／または複合炭素源、単純および／または複合窒素源、ならびに血清などの添加物を含有することができる。一部の態様では、本発明に好適な複合培地は、本明細書に記載されている規定された培地の他の構成成分に加えて、加水分解物などの添加物を含有する。一部の態様では、既定の培地は典型的には、およそ５０種の化学的実体を水中に既知の濃度で含む。それらの多くが、インスリン、ＩＧＦ－１、トランスフェリンまたはＢＳＡなどの１種または複数の十分に特徴づけられているタンパク質も含有するが、他のものは、タンパク質成分を必要とせず、したがって、タンパク質非含有規定培地と称される。培地の典型的な化学的成分は、５つの広いカテゴリーに該当する：アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および簡潔に分類することができない種々雑多なカテゴリー。
細胞培養培地は任意選択で、補充成分を補充されていてよい。用語「補充成分」は、本明細書で使用される場合、限定されるものではないが、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（ナトリウム、クロリド、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースまたは他のエネルギー源を含む、最小限の割合を超えて増殖および/または生存を増強する成分を指す。一部の態様では、補足構成成分を初期細胞培養物に添加することができる。一部の態様では、細胞培養の開始後に、補足構成成分を添加することができる。典型的には、微量元素は、マイクロモルまたはそれより低いレベルで含まれる様々な無機塩を指す。例えば、一般的に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。一部の態様では、鉄（第一鉄または第二鉄塩）が微量元素として、当初細胞培養培地中にマイクロモル濃度で含まれてよい。微量元素のうち、マンガンも多くの場合に、二価カチオン（ＭｎＣｌ２またはＭｎＳＯ４）としてナノモルからマイクロモル濃度の範囲で含まれる。多数の、あまり一般的ではない微量元素が通常、ナノモル濃度で添加される。
一部の態様では、本発明の方法において使用される培地は、細胞培養において例えば、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬまたは５×１０８細胞／ｍＬなどの高い細胞密度を支持するのに好適な培地である。一部の態様では、細胞培養は、哺乳動物細胞流加培養、好ましくは、ＣＨＯ細胞流加培養である。
一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、チロシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、トリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、メチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、ロイシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、セリンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、スレオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、グリシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニンおよびグリシンのうち２つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニンおよびチロシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニンおよびトリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、チロシンおよびトリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、チロシンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニンおよびグリシンのうち３つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。
一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。
一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンのうちの４つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。
一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニンおよびグリシンのうち５つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニンおよびグリシンのうち６つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニンおよびグリシンのうち７つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、スレオニンおよびグリシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１～２ｍＭの間、０．１～１ｍＭの間、０．５～１．５ｍＭの間、または０．５～１ｍＭの間の濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３種を、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは、２ｍＭを超える濃度でさらに含む。一部の態様では、細胞培養培地は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうち少なくとも５つを、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは、２ｍＭを超える濃度でさらに含む。一部の態様では、細胞培養培地は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンを、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは、２ｍＭを超える濃度でさらに含む。一部の態様では、細胞培養培地は、バリン、イソロイシン、プロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８または９種を、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは、２ｍＭを超える濃度でさらに含む。一部の態様では、細胞培養培地は、バリン、イソロイシン、プロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうち少なくとも５つを、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは、２ｍＭを超える濃度でさらに含む。一部の態様では、細胞培養培地は、バリン、イソロイシン、プロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンを、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは、２ｍＭを超える濃度でさらに含む。一部の態様では、細胞培養培地は、セリンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭを超える濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、バリンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭを超える濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、システインを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭを超える濃度で含む。一部の態様では、細胞培養培地は、イソロイシンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭを超える濃度で含む。
一部の態様では、細胞培養培地は、ロイシンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭを超える濃度で含む。一部の態様では、上述の細胞培養培地は、本明細書に開示されている方法における使用のためのものである。一部の態様では、上述の細胞培養培地は、本明細書に開示されている方法において、基礎培地として使用される。一部の態様では、上述の細胞培養培地は、本明細書に開示されている方法において、フィード培地として使用される。
本開示の方法は、所望のプロセス（例えば、組換えタンパク質の産生）に適しているいずれかの細胞培養方法と共に使用することができる。非限定的な例として、細胞は、バッチまたは流加培養において増殖させることができ、この場合、培養は、組換えタンパク質（例えば、抗体）の十分な発現の後に終結され、その後に、発現されたタンパク質が収集される。その代わりに、別の非限定的な例として、細胞は、バッチ－リフィードにおいて増殖させることができ、この場合、培養は、終結されず、新たな栄養素および他の構成成分が、培養物に定期的にまたは連続的に添加され、その間に、発現された組換えタンパク質が、定期的にまたは連続的に収集される。他の好適な方法（例えば、スピンチューブ培養）が、当業界で公知であり、本発明を実施するために使用することができる。
細胞を、実行者によって選択される任意の便利な体積で増殖させることができる。例えば、細胞を、体積が数ミリリットルから数リットルの範囲の小規模反応容器内で増殖させることができる。あるいは、細胞を、体積がおよそ少なくとも１リットルから１０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５０００、２００００または２５０００リットル以上の範囲であるか、またはそれらの間の任意の体積の大規模商業用バイオリアクター内で増殖させることができる。
細胞培養の温度は主に、細胞培養が依然として実行可能である温度範囲、および高レベルの所望の産物（例えば、組換えタンパク質）が産生される範囲に基づき選択されることとなる。一般に、大部分の哺乳動物細胞は、約２５℃～４２℃の範囲内で良好に増殖し、所望の産物（例えば、組換えタンパク質）を産生し得るが、本開示が教示する方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約３５℃から４０℃の範囲内で良好に増殖し、所望の産物（例えば、組換えタンパク質または抗体）を産生し得る。ある特定の態様では、細胞培養物は、細胞培養プロセス中の１つまたは複数の時点において、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃または４５℃の温度で増殖させられる。当業者は、好適な温度、または細胞の特定の必要性および実行者の特定の生産要求に応じて、細胞を増殖させるために温度を選択することができるであろう。細胞は、実行者の必要性および細胞自体の要求に応じて、任意の時間量にわたって増殖させることができる。一部の実施形態では、細胞を、３７℃で増殖させる。一部の態様では、細胞は、３６．５℃で増殖させられる。
一部の態様では、細胞は、技術者の必要および細胞自身の要求に応じて、より多いまたは少ない時間量にわたり初期増殖相（または増殖相）において増殖させることができる。一部の態様では、細胞は、予め規定された細胞密度を達成するのに十分な期間にわたり増殖させられる。一部の態様では、妨害せずに増殖させたら細胞が最終的に達するであろう最大細胞密度に対する所与のパーセンテージである細胞密度を達成するために十分な期間にわたって、細胞を増殖させる。例えば、最大細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの所望の生細胞密度を達成するために十分な期間にわたって、細胞を増殖させることができる。一部の態様では、細胞は、細胞密度が、培養１日あたり１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％を超えて増大しなくなるまで増殖させられる。一部の態様では、細胞は、細胞密度が、培養１日あたり５％を超えて増大しなくなるまで増殖させられる。
一部の態様では、細胞を規定の期間にわたって増殖させる。例えば、細胞培養の出発濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、細胞を０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日以上、好ましくは４～１０日増殖させる。場合によっては、細胞を１カ月以上増殖させることができる。本発明の実行者は、タンパク質生産要求および細胞自体の要求に応じて、初期増殖相の期間を選択することができるであろう。
酸素化および細胞への栄養素の分散を増加させるために、細胞培養物を初期培養相の間に撹拌または振盪することができる。本発明では、当業者は、限定されるものではないが、ｐＨ、温度、酸素化などを含めて、初期増殖相中のバイオリアクターのある特定の内部条件を制御または調節することが有利であり得ることを理解するであろう。
初期増殖相の終了時に、第２セットの培養条件を適用して、その培養物で代謝シフトが生じるように、培養条件の少なくとも１つをシフトさせることができる。代謝シフトは、例えば、細胞培養物の温度、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度または化学的誘導レベルの変化によって達成することができる。１つの非限定的実施形態では、培養物の温度をシフトさせることによって、培養条件をシフトさせる。しかしながら、当業界で公知である通り、温度のシフトは、好適な代謝シフトが達成され得る唯一の機構ではない。例えば、そのような代謝シフトは、限定されるものではないが、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度、および酪酸ナトリウムレベルを含む他の培養条件をシフトさせることによっても達成することもできる。培養シフトのタイミングは、タンパク質生産要求または細胞自体の要求に基づき、本発明の実行者によって決定されるであろう。
培養物の温度をシフトさせる場合、温度シフトは、比較的段階的であってよい。例えば、温度変化を完了するには、数時間または数日かかってよい。あるいは、温度シフトは比較的突然であってよい。例えば、温度変化を、数時間未満で完了してよい。ポリペプチドまたはタンパク質の商業的大規模生産において標準であるような好適な生産および制御装置を考慮すると、温度変化は１時間未満内でも完了し得る。
一部の態様では、細胞培養の条件が、上で記述される通りにシフトされたら、細胞培養物は、細胞培養物の生存および生存率を促し、商業的に適切なレベルでの所望のポリペプチドまたはタンパク質の発現に適切な、第２のセットの培養条件下でその後の産生相にわたり維持される。
上で記述される通り、培養は、温度、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度および酪酸ナトリウムレベルを含むがこれらに限定されない、多数の培養条件のうち１つまたは複数をシフトすることによりシフトさせることができる。一部の態様では、培養物の温度をシフトさせる。この実施形態では、後続の産生相中に、培養物を初期増殖相の温度または温度範囲よりも低い温度または温度範囲で維持する。上に論述した通り、細胞密度または生存度を上昇させるために、または組換えタンパク質の発現を増大させるために、複数の別個の温度シフトを使用することができる。
用語「力価」は、本明細書で使用される場合、例えば、所与の量の培地体積において細胞培養によって産生される組換えで発現されたタンパク質の全量を指す。力価は典型的には、培地１リットルあたりのタンパク質のグラム単位で表される。
一部の態様では、細胞増殖は、対照培養物と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％増大する。一部の態様では、細胞増殖は、対照培養物と比較して、少なくとも１０％増大する。一部の態様では、細胞増殖は、対照培養物と比較して、少なくとも２０％増大する。
一部の態様では、生産性は、力価および／または容積測定による生産性によって決定される。一部の態様では、生産性は、力価によって決定される。一部の態様では、生産性は、対照培養物と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％増大する。一部の態様では、生産性は、対照培養物と比較して、少なくとも１０％増大する。一部の態様では、生産性は、対照培養物と比較して、少なくとも２０％増大する。
精製
一部の態様では、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドを単離および／または精製することを含む。一部の態様では、発現されたポリペプチドは、培地中に分泌され、よって、細胞および他の固形物は、遠心分離および／または濾過によって除去することができる。好まれる実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、可溶性である。
本明細書に記載されている方法に従って産生されたＦｉｍＨ突然変異ポリペプチドは、宿主細胞から収集し、いずれか好適な方法を使用して単離することができ、一般に当業界で公知である（例えば、Ｒｕｉｚ－Ａｒｇｕｅｌｌｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８５：３６７７～３６８７（２００４））。ポリペプチドを精製するための好適な方法は、沈殿、および様々な種類のクロマトグラフィー、例えば、疎水性相互作用、イオン交換、親和性、キレート化およびサイズ排除を含み、これらは全て、当業界で公知である。好適な精製スキームは、これらの、または他の好適な方法の２つ以上を含んでもよい。一部の態様では、ポリペプチドのうち１つまたは複数は、精製または検出を容易にする「タグ」を含むことができる。例は、例えば、Ｈｉｓタグ（金属イオンに結合する、例えば、ヘキサヒスチジン）、抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（アミロースに結合する）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（グルタチオンに結合する）、ＦＬＡＧタグ（抗ｆｌａｇ抗体に結合する）、Ｓｔｒｅｐタグ（ストレプトアビジンまたはその誘導体に結合する）を含む。そのようなタグを付けたポリペプチドは、例えば、馴化培地から、キレート化クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによって簡便に単離することができる。場合により、タグ配列は、精製後に切断することができる。一態様では、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドは、精製タグを含まない。
一態様では、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドは、先ず細胞培養物上清を得て、次いで上清を限外濾過および透析濾過方法の両方に供することにより単離することができる。そのような濾過方法は、当業者にとって公知である。限外濾過および透析濾過の後に、その結果生じた無細胞溶液を次いで、例えば、ニッケル親和性樹脂を使用したＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップに供する。次いで、このステップに続いて、透析を行うことができ、次いで、これに続いて、ＳＰカラムなどを用いたカチオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。ＳＰ－セファロースにおける精製の際に酸性ｐＨ（例えば、約６．０未満、約５．５未満、約５．０未満、約４．５未満、約４．４、約４．３、約４．２、約４．１または約４．０以下）を使用することが、ある特定の条件下で望ましい可能性がある。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の具体的な株が本明細書において言及されることがあるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、指定がない限り、具体的な株に限定されないことは理解されるべきである。
ＶＩ．組成物の使用
一態様では、本開示は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染に対する免疫応答を惹起するためのまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を防止するための、医薬としてのまたは医薬の製造における、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、そのような変異体をコードする核酸、そのような変異体を発現するためのベクター、そのような変異体または核酸を含む組成物の使用を提供する。
他の態様では、本開示は、対象に、有効量の、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドをコードする核酸分子、またはＦｉｍＨ変異体ポリペプチドもしくは核酸分子を含む組成物を投与することを含む、ヒトなどの対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法を提供する。本開示はまた、対象に、有効量の、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチド、ＦｉｍＨ変異体ポリペプチドをコードする核酸、またはＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを発現するベクターを含むワクチンなどの医薬組成物を投与することを含む、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を防止する方法を提供する。一部の特定の態様では、医薬組成物は、本明細書に開示されているＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを含む。本明細書の上述に提供される方法の一部の態様では、対象は、ヒトである。
他の態様では、本開示は、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する対象における免疫応答を誘導するための、または腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的な対象におけるオプソニン貪食作用および／もしくは中和抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載されているＦｉｍＨ変異体ポリペプチドを含む組成物など、本明細書に記載されている組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。そのような方法のさらなる態様では、対象は、尿路感染を発症するリスクがある、および／または菌血症を発症するリスクがある、および／または敗血症を発症するリスクがある。
さらなる態様では、本開示は、哺乳動物に、有効量の本明細書に記載されている組成物のいずれかを投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法を提供する。例えば、一態様では、免疫応答は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用および／または中和抗体を含む。さらなる態様では、免疫応答は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する。
さらなる態様では、本開示は、対象に、免疫学的有効量の本明細書に記載されている組成物のいずれかを投与することを含む、対象における細菌感染、疾患または状態を防止、処置または改善する方法を提供する。
本開示の方法において、組成物は、アジュバントの投与ありまたはなしで、対象に投与することができる。対象に投与される有効量は、対象におけるＦｉｍＨタンパク質などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原に対する免疫応答を惹起するのに十分な量である。処置のために選択することができる対象は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への曝露または曝露の可能性が原因で、尿路感染を発症するリスクがある、および／または菌血症を発症するリスクがある、および／または敗血症を発症するリスクがある対象など、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染を発症するリスクがある対象を含む。
本明細書で使用される場合、「対象」は、哺乳動物、好ましくは、ヒトを意味する。一実施形態では、対象は、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿路性敗血症、腹腔内感染、髄膜炎、複雑性肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／乳児敗血症、好中球減少性発熱および他の血流感染；肺炎、菌血症、ならびに敗血症からなる群から選択される状態のうちいずれか１つのリスクがある。
医薬組成物など、本開示によって提供される組成物の投与は、標準投与経路を使用して実行することができる。非限定的な実施形態は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、皮下、経皮、粘膜、または経口投与を含む。
１回の投与において対象に提供される組成物の総用量は、当業者にとって公知の通り、変動され得る。
免疫原性組成物のうち１つまたは複数の１回または複数のブースター投与を提供することも可能である。ブースティングワクチン接種が実行される場合、典型的に、そのようなブースティングワクチン接種は、対象への初めての組成物の投与（そのような場合、「プライミングワクチン接種」と称される）後の１週間～１０年間の間、好ましくは、２週間～６カ月間の間の時点で、同じ対象に投与されるであろう。代替ブースティングレジメンにおいて、プライミングワクチン接種後に、対象に、異なるベクター、例えば、１つもしくは複数のアデノウイルスもしくは他のベクター、例えば、改変されたアンカラのワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、またはＤＮＡ、またはタンパク質を投与することも可能である。本開示によって提供される免疫原性組成物は、１つまたは複数の他の免疫原性組成物と一緒に使用することができる。
組成物の投薬量
投薬量レジメンは、最適な所望の応答を生じるように調整することができる。例えば、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドの単一用量を投与することができる、いくつかの分割用量を経時的に投与することができる、または状況の緊急事態によって示される通り、用量を比例的に低減もしくは増大させることができる。投薬量の値は、緩和される状態の種類および重症度で変化し得て、単回または複数回の用量を含み得ることに注意すべきである。さらに、任意の特定の対象について、個体の必要性および組成物を投与するか、または投与を管理する人の専門的判断に従って、具体的な投与レジメンを経時的に調節すべきこと、ならびに本明細書に記載の投薬量範囲は例示に過ぎず、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実行を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。
一部の態様では、組成物におけるＦｉｍＨ変異体ポリペプチドの量は、約１０μｇ～約３００μｇの各タンパク質抗原の範囲に及ぶことができる。一部の態様では、組成物におけるＦｉｍＨ変異体ポリペプチドの量は、約２０μｇ～約２００μｇの各タンパク質抗原の範囲に及ぶことができる。
各用量中の糖コンジュゲートの量は、典型的なワクチンにおいて有意で有害な副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が用いられ、およびそれがどのように提供されるかに応じて変化するであろう。免疫原性組成物中の特定の糖コンジュゲートの量を、そのコンジュゲート（コンジュゲート化および非コンジュゲート化）に関する全多糖に基づいて算出することができる。例えば、２０％遊離多糖を含む糖コンジュゲートは、１００ｇの多糖用量中に約８０ｇのコンジュゲート化多糖と、約２０ｇの非コンジュゲート化多糖を有するであろう。糖コンジュゲートの量は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に応じて変化し得る。糖濃度は、ウロン酸アッセイによって決定することができる。
免疫原性組成物における異なる多糖構成成分の「免疫原性量」は、異なる場合があり、それぞれは、約１．０ｇ、約２．０ｇ、約３．０ｇ、約４．０ｇ、約５．０ｇ、約６．０ｇ、約７．０ｇ、約８．０ｇ、約９．０ｇ、約１０．０ｇ、約１５．０ｇ、約２０．０ｇ、約３０．０ｇ、約４０．０ｐｇ、約５０．０ｐｇ、約６０．０ｐｇ、約７０．０ｐｇ、約８０．０ｐｇ、約９０．０ｐｇまたは約１００．０ｇのいずれか特定の多糖抗原を含むことができる。一般に、それぞれの用量は、所与の血清型について、０．１ｇ～１００ｇ、特に、０．５ｇ～２０ｇ、より特には、１ｇ～１０ｇ、さらにより特には、２ｇ～５ｇの多糖を含むであろう。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。一実施形態では、それぞれの用量は、所与の血清型について、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇまたは２０ｇの多糖を含むであろう。
ＶＩＩ．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖および／またはポリペプチドまたはその断片との組合せ
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））は、尿路感染、菌血症および敗血症を引き起こすことが公知のグラム陰性病原体である。多剤耐性クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染は、リスクがある脆弱集団における死亡率のますます増大する原因である。Ｏ抗原血清型は、世界的に侵襲性疾患を引き起こす株の間で高度に普及しており、派生したＯ抗原糖コンジュゲートは、ワクチン抗原として魅力的である。
一態様では、本明細書に開示の組成物のいずれかは、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、それに由来する少なくとも１つの糖をさらに含んでよい。好ましい一実施形態では、本明細書に開示の組成物のいずれかは、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｉ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドもしくはその免疫原性断片；またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＩＩ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドもしくはその免疫原性断片；あるいはそれらの組合せから選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含んでよい。
当業界で公知の通り、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１およびＯ２ Ｏ抗原ならびにそれらの対応するｖ１およびｖ２サブタイプは、それらの反復単位の構造が異なるポリマー型ガラクタンである。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１およびＯ２抗原は、ホモポリマーガラクトース単位（またはガラクタン）を含有する。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１およびＯ２抗原はそれぞれ、Ｄ－ガラクタンＩ単位（時に、Ｏ２ａ反復単位と称される）を含有するが、Ｏ１抗原は、Ｏ１抗原が、Ｄ－ガラクタンＩＩキャップ構造を有するという点で異なる。Ｄ－ガラクタンＩＩＩ（ｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩ）は、Ｄ－ガラクタンＩのバリアントである。２つの別個の血清型Ｏ２サブタイプ、Ｏ２ｖ１およびＯ２ｖ２を定義する基礎ガラクタンＩおよびＩＩＩの構造；ならびにサブタイプＯ１ｖ１およびＯ１ｖ２を生じるガラクタンＩＩによるキャッピングに起因する派生したキメラの構造は、Ｋｅｌｌｙ ＳＤら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１９；２９４：１０８６３～７６；およびＣｌａｒｋｅ ＢＲら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１８；２９３：４６６６～７９に示されている。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位、および［→３）－α－Ｄ－ Ｇａｌｐ－（１→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→３）－［α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→４）］－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位（Ｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩ反復単位と称される）を含む（Ｋｏｌ Ｏ．ら（１９９２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．２３６、３３９～３４４；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ Ｃ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３、１４２０～１４３１）。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、［→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→］（これはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ２ａ抗原の要素であり得る）の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、［→３）－β－Ｄ－ＧｌｃｐＮＡｃ－（１→５）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→］（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ２ｃ抗原の要素であり得る）の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、（１→４）－連結Ｇａｌｐ残基の側鎖付加によるＯ２ａ反復単位の改変を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａｆｇ抗原の要素であり得る）。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、（１→２）－結合Ｇａｌｐ残基の側鎖付加によるＯ２ａ反復単位の改変を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａｅｈ抗原の要素であり得る）。（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ Ｃ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、４９１３～４９１９）。
メカニズムまたは理論によって束縛されるものではないが、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３およびＯ５のＯ抗原多糖構造は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ９ａ（式Ｏ９ａ）およびＯ８（式Ｏ８）のものと同一であることが当業界で開示されている。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ４に由来する糖は、［→４）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→２）－β－Ｄ－Ｒｉｂｆ－（１→）］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ７に由来する糖は、［→２－ａ－Ｌ－Ｒｈａｐ－（１→２）－β－Ｄ－Ｒｉｂｆ－（１→３）－α－Ｌ－Ｒｈａｐ－（１→３）－α－Ｌ－Ｒｈａｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ８血清型に由来する糖は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａと同じ繰返し単位構造を含むが、非化学量論的にＯ－アセチル化されている。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１２血清型に由来する糖は、［α－Ｒｈａｐ－（１→３）－β－ＧｌｃｐＮＡｃ］二糖反復単位の反復単位を含む。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖を含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のうちの１つまた複数、またはそれらの組合せからの、またはそれに由来する糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のそれぞれからの、またはそれに由来する糖を含む。
別の態様では、本発明は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるかまたはこれに由来する少なくとも１つの糖；ならびに式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂおよび式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂおよび式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式０１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のうちの１つまたは複数、またはそれらの組合せからの、またはそれに由来する糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のそれぞれからの、またはそれに由来する糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ９を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含まない。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ８を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含まない。
別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００、好ましくは３１～９０の整数である）のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含む組成物に関する。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ９を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含まない。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ８を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含まない。
一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖を含む。
一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖を含む。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ１（Ｏ１ｖ１）またはサブタイプｖ２（Ｏ１ｖ２）から選択される。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ１（Ｏ１ｖ１）およびサブタイプｖ２（Ｏ１ｖ２）から選択される。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖を含む。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ１（Ｏ２ｖ１）またはサブタイプｖ２（Ｏ２ｖ２）から選択される。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ１（Ｏ２ｖ１）およびサブタイプｖ２（Ｏ２ｖ２）から選択される。別の態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、ａ）血清型Ｏ１サブタイプｖ１（Ｏ１ｖ１）、ｂ）血清型Ｏ１サブタイプｖ２（Ｏ１ｖ２）、ｃ）血清型Ｏ２サブタイプｖ１（Ｏ２ｖ１）およびｄ）血清型Ｏ２サブタイプｖ２（Ｏ２ｖ２）からなる群から選択される。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ１（Ｏ１ｖ１）である。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ２（Ｏ１ｖ２）である。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ１（Ｏ２ｖ１）である。本実施形態の一態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原は、サブタイプｖ２（Ｏ２ｖ２）である。本実施形態の別の態様では、組成物は、ａ）血清型Ｏ１サブタイプｖ１（Ｏ１ｖ１）、ｂ）血清型Ｏ１サブタイプｖ２（Ｏ１ｖ２）、ｃ）血清型Ｏ２サブタイプｖ１（Ｏ２ｖ１）およびｄ）血清型Ｏ２サブタイプｖ２（Ｏ２ｖ２）からなる群から選択される１、２、３または４種のクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原を含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖の組合せを含み、その際、第１の糖は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型のいずれか１つに由来し；第２の糖は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２からなる群から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型のいずれか１つから由来する糖に由来する。例えば、一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖と、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖を含む。好ましい一実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートしており；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。
別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖を含む組成物を含む。
別の態様では、本発明は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ９を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含まない。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ８を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含まない。
一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。別の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。別の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖；およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。
一実施形態では、本発明は、対象に、免疫学的有効量の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８またはＯ９由来の少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を投与することを含む、対象においてクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記免疫原性組成物が、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５またはＯ３由来の糖コンジュゲートを含まない、方法を提供する。一態様では、組成物は、式Ｏ８を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含まない。別の態様では、組成物は、式Ｏ９を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含まない。
別の実施形態では、本発明は、対象に、免疫学的有効量の、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５もしくはＯ３またはこれらのバリアント由来の少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を投与することを含む、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記免疫原性組成物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８またはＯ９由来の糖コンジュゲートを含まない、方法を提供する。一態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含み、式Ｏ８を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含まない。別の態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含み、式Ｏ９を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に由来する糖を含まない。
一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖；式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖；式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ２、式Ｏ６、および式Ｏ２５Ｂからなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。
一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｉ型線毛タンパク質もしくはその免疫原性断片に由来するポリペプチド；またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＩＩ型線毛タンパク質もしくはその免疫原性断片に由来するポリペプチド、またはこれらの組合せから選択される、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む。前記ポリペプチドの配列は、当業界で公知である。
ＶＩＩＩ．ナノ粒子
別の態様では、１）ナノ構造；および２）少なくとも１つの線毛ポリペプチド抗原またはその断片を含む免疫原性複合体が本明細書に開示されている。好ましくは、線毛ポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）線毛Ｈ（ｆｉｍＨ）に由来する。好まれる実施形態では、線毛ポリペプチドは、上に記載されている線毛ポリペプチドのいずれか１つから選択される。例えば、線毛ポリペプチドは、配列番号１～６５から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
一部の実施形態では、抗原は、提示エピトープに対する適応免疫応答の発生を刺激するために、ナノ構造外部に融合またはコンジュゲートされている。一部の実施形態では、それぞれの病原体で生成される免疫応答の種類を適合させるために役立つように、免疫原性複合体は、外部に付着している、および／またはケージ内部に封入されているアジュバントまたは他の免疫調節化合物をさらに含む。
一部の実施形態では、ナノ構造は、複数の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含む単一のアセンブリを含む。
代替実施形態では、ナノ構造は、複数の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドおよび複数の第２のアセンブリを含む複数のアセンブリを含み、第２のアセンブリのそれぞれは、複数の同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含む。
様々なナノ構造プラットフォームを、本明細書に記載の免疫原性組成物の生成において使用することができる。一部の実施形態では、使用されるナノ構造は、単一のサブユニットの複数のコピーによって形成される。一部の実施形態では、使用されるナノ構造は、複数の異なるサブユニットの複数のコピーによって形成される。
ナノ構造は典型的には、ボール様形状であり、および／または例えば、本明細書において例示される正二十面体構造を伴う、回転対称（例えば、３倍および５倍軸）を有する。
一部の実施形態では、抗原は、フェリチン（ＦＲ）、Ｅ２ｐ、Ｑβ、およびＩ３－０１に由来する自己集合性ナノ構造などの自己集合性ナノ粒子上で提示される。Ｅ２ｐは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼの再設計バリアントである。Ｉ３－０１は、超安定ナノ粒子に自己集合し得る操作タンパク質である。これらのタンパク質のサブユニットの配列は、当業界で公知である。第１の態様では、配列番号６６～１０５からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％同一であり、かつ少なくとも１つの同定されている界面位置において同一であるアミノ酸配列を含むナノ構造関連ポリペプチドを本明細書において開示する。ナノ構造関連ポリペプチドを使用して、例えば、ナノ構造を調製することができる。ナノ構造関連ポリペプチドは、それらが対で自己集合して正二十面体ナノ構造などのナノ構造を形成し得るように設計された。
一部の実施形態では、ナノ構造は、（ａ）複数の第１のアセンブリであって、第１のアセンブリのそれぞれが、複数の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含み、第１のナノ構造関連ポリペプチドが、配列番号６６～１０５からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、複数の第１のアセンブリ；および（ｂ）複数の第２のアセンブリであって、第２のアセンブリのそれぞれが、複数の同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含み、第２のナノ構造関連ポリペプチドが、配列番号６６～１０５からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、複数の第２のアセンブリを含み、第２のナノ構造関連ポリペプチドは、第１のナノ構造関連ポリペプチドと異なり、複数の第１のアセンブリは、複数の第２のアセンブリと非共有結合により相互作用して、ナノ構造を形成する。
ナノ構造は、第１のアセンブリおよび第２のアセンブリを、正二十面体対称性を有するナノ構造などのナノ構造へと方向付ける、対称的に反復した非天然非共有結合的ポリペプチド－ポリペプチド界面を含む。
配列番号６６～１０５は、例示的なナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。配列番号６６～１０５の例示的なナノ構造関連ポリペプチドの界面残基の数は、４～１３個の残基の範囲に及ぶ。様々な実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号６６～１０５からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列と、その長さにわたり少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の同定された界面位置（所与のナノ構造関連ポリペプチドの界面残基の数に応じて）において同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号６６～１０５からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列と、その長さにわたり少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、同定された界面位置の少なくとも２０％、２５％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または１００％において同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号６６～１０５からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を有するナノ構造関連ポリペプチドを含む。
１つの非限定的実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドを改変して、目的の「カーゴ」との共有結合を促進することができる。１つの非限定的例では、ナノ構造関連ポリペプチドを、様々なシステイン残基を規定の位置に導入することなどによって改変して、１種または複数の目的の抗原との結合を促進することができ、そうして、ナノ構造関連ポリペプチドのナノ構造が、ワクチンとして送達するための多数の抗原を提供する骨格を提供して、改善された免疫応答が生じるようにする。
一部の実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチド中に存在するが、コンジュゲーションに使用されることは意図されていない一部または全ての天然システイン残基を他のアミノ酸に突然変異させて、既定の位置でのコンジュゲーションを促進することができる。別の非限定的実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドを、「エンドソームエスケープ」の促進に役立つ部分との結合（共有結合または非共有結合）によって改変することができる。標的化送達など、目的の分子を標的細胞に送達することを伴う用途では、重要なステップは、細胞への送達ビヒクルの入り口であるエンドソーム（膜結合オルガネラ）からのエスケープであり得る。エンドソームはリソソームに成熟して、それらの内容物を分解する。したがって、エンドソームがリソソームになる前に、送達ビヒクルがエンドソームからどうにかして「エスケープ」しなければ、送達ビヒクルは分解されて、その機能を実行することはないであろう。エンドソームを破壊して、サイトゾルへのエスケープを可能にする様々な脂質または有機ポリマーが存在する。したがって、この実施形態では、例えば、そのような脂質または有機ポリマーのモノマーまたは生じたアセンブリ表面への化学的コンジュゲーションを可能にするシステイン残基を導入することにより、ナノ構造関連ポリペプチドを改変することができる。別の非限定的例では、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでナノ構造の可視化を可能にするフルオロフォアまたは他のイメージング剤の化学的コンジュゲーションを可能にするシステイン残基を導入することにより、ナノ構造関連ポリペプチドを改変することができる。
タンパク質サブユニットまたは集合したナノ構造の安定性または溶解性を改善するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を突然変異させることができる。当業者には分かるであろう通り、ナノ構造関連ポリペプチドが、既存のタンパク質ファミリーに対して有意な配列相同性を有するならば、そのファミリーに由来する他のタンパク質の複数の配列アラインメントを使用して、コンセンサスタンパク質設計と称されるプロセス（９）である、タンパク質安定性および／または溶解性を増大させ得る非保存位置でのアミノ酸突然変異の選択をガイドすることができる。
タンパク質表面に全陽電荷または全負電荷を付与するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を、正の電荷を持つ（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）または負の電荷を持つ（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）アミノ酸に突然変異させることができる。１つの非限定的実施形態では、自己集合性ナノ構造の内部表面に高い実効電荷を付与するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を突然変異させることができる。次いで、そのようなナノ構造を使用して、ナノ構造内部表面とカーゴ分子との間の静電相互作用により、逆の実効電荷を有するカーゴ分子をパッケージングまたは封入することができる。１つの非限定的実施形態では、自己集合性ナノ構造の内部表面に実効正電荷を付与するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を主に、アルギニンまたはリシン残基に突然変異させることができる。次いで、核酸を自己集合性ナノ構造内部に封入するために、ナノ構造関連ポリペプチドを含有する溶液を、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ．、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、または他の核酸などの核酸カーゴ分子の存在下で混合することができる。そのようなナノ構造を使用して、例えば、核酸を保護する、送達する、または濃縮することができるであろう。
一実施形態では、ナノ構造は正二十面体対称を有する。この実施形態では、ナノ構造は、６０コピーの第１のナノ構造関連ポリペプチドおよび６０コピーの第２のナノ構造関連ポリペプチドを含み得る。そのような実施形態の１つでは、それぞれの第１のアセンブリ中の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドの数は、それぞれの第２のアセンブリ中の同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドの数とは異なる。例えば、一実施形態では、ナノ構造は、１２の第１のアセンブリおよび２０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、それぞれの第１のアセンブリは、例えば、５コピーの同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよく、それぞれの第２のアセンブリは、例えば、３コピーの同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよい。別の実施形態では、ナノ構造は、１２の第１のアセンブリおよび３０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、それぞれの第１のアセンブリは、例えば、５コピーの同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよく、それぞれの第２のアセンブリは、例えば、２コピーの同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよい。さらなる実施形態では、ナノ構造は、２０の第１のアセンブリおよび３０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、それぞれの第１のアセンブリは、例えば、３コピーの同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよく、それぞれの第２のアセンブリは、例えば、２コピーの同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよい。これらの実施形態は全て、正二十面体対称を有する合成ナノ材料を形成し得る。
本開示をより良く理解することができるように、次の実施例を記載する。これらの実施例は、単なる説明を目的としており、いかなる様式においても、本開示の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
（実施例１）
抗原設計
機能的免疫原性を改善する目標で、ＦｉｍＨレクチンドメインをオープンコンフォメーションでロックするように、ＦｉｍＨＬＤまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧにおける突然変異を設計した。突然変異は、下の表２～９に記載されている異なるクラスのものであった。様々な突然変異したＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列は、表１に示されている。
Figure 2024503792000021
Figure 2024503792000022
Figure 2024503792000023
Figure 2024503792000024
Figure 2024503792000025
Figure 2024503792000026
Figure 2024503792000027
Figure 2024503792000028
（実施例２）
抗原発現および精製
ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体をコードするＤＮＡを、マウスＩｇＫシグナルペプチドを含有するｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、以前に記載された（２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９）Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現させた。タンパク質特徴付けおよび免疫原性研究のため、２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９に記載されているニッケル親和性樹脂およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、タンパク質を単離した。
（実施例３）
蛍光偏光アッセイ
マンノシドリガンドに対するＦｉｍＨ変異体の解離定数を決定するために、ＦｉｍＨに対して高い親和性を有するマンノシドリガンドにコンジュゲートされたフルオレセインを使用して、Ｒａｂｂａｎｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８））によって記載された方法に基づき蛍光偏光アッセイを開発した。５０μＬの最終体積により黒色平底９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）における１１ポイント３倍滴定で、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍＬプラスＢＳＡ０．０５％においてＦｉｍＨタンパク質を希釈した。同じ緩衝液における５０μＬの０．７ｎＭのフルオレセインオクチルビフェニルマンノピラノシドリガンドを各ウェルに添加した。１００ｒｐｍで振盪しつつ一晩室温でプレートをインキュベートした。２０～２４時間後に、４８８ｎｍのフルオレセイン励起および５３０ｎｍの発光により、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ Ｐｌｕｓプレートリーダーにおいてプレートを読み取った。
（実施例４）
熱安定性アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイ）
ＳＹＰＲＯオレンジを使用した３８４ウェル熱安定性アッセイを開発して、アポ（非結合）形態において、リガンドの存在下で、単離されたタンパク質の融解温度を決定した。ＦｉｍＨの天然リガンド（マンノース）を模倣するマンノシド化合物（メチルα－Ｄ－マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｍ６８８２））を使用して、タンパク質への会合を分析した。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、４００ｍＭ ＮａＣｌ（アッセイ緩衝液）においてタンパク質を４μＭに希釈することにより、ＦｉｍＨタンパク質ストック溶液を調製した；アッセイ緩衝液においてＳＹＰＲＯオレンジ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ６６５０）を１：１０希釈した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅ Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４４８３２８５）における１０μＬ最終反応体積のために、４μＭ ＦｉｍＨ変異体（５μＬ）を、１：１０ ＳＹＰＲＯオレンジ色素（０．１μＬ）およびアッセイ緩衝液において希釈されたアッセイ緩衝液またはリガンドのいずれか（５μＬ）と混合した。プレートを、０．０５℃／秒で２０℃から９８℃への解離プロトコールを使用したＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）における融解曲線分析に供した。ＴＡＭＲＡを標的およびレポーターとして、ＲＯＸを受動的参照として指定した（しかしいかなる分析のためにも使用されない）。Ｘ軸における温度（２０℃から９８℃）およびＹ軸に示すＴＡＭＲＡチャネルからの蛍光によるマクスウェル・ボルツマン分布としてデータをプロットした（ＴＡＭＲＡレポーターのための特異的蛍光励起値を割り当てられた、融解曲線において読み取られた各温度点）。ウェルおよび試料の間の蛍光強度を等しくするための正規化アルゴリズムを確立したため、蛍光のＹ軸は、０（蛍光なし）から１（最高記録蛍光）のスケールにて、プレート間で比較することができた。この方程式は下に示されている。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにおける検索関数（同様に下に示す）を使用して、０．５の相対的蛍光（正規化後）値（タンパク質のおよそ半分が解離したことを示す）を記録し、特異的温度に相関させた。このようにして、タンパク質のこの温度、すなわち、得られた融解温度（Ｔｍ）を計算した。アポ条件からタンパク質＋リガンドのＴｍを引くことにより、融解温度におけるシフト（ΔＴｍ）を計算した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにおけるピボットテーブルを使用して、プレートレイアウトからＴｍを組織化した。
ＴＡＭＲＡ蛍光シグナルを正規化するための方程式：
正規化値（０～１の間）＝
（未加工の蛍光値 － ウェル全体からの最小蛍光値（２０℃から９８℃））／
ウェル全体からの最大蛍光値 － ウェル全体からの最小蛍光値
Ｔｍを同定するためのＥｘｃｅｌ検索関数（０．５正規化蛍光、または５０％タンパク質融解）：
＝ＬＯＯＫＵＰ（０．５、正規化蛍光値の始まり：値の終わり、＄温度値の始まり：＄値の終わり）
（実施例５）
ＦｉｍＨ特異的中和モノクローナル抗体によるＦｉｍＨ変異体のコンフォメーション状態の確認
中和モノクローナル抗体２９９－３、３０４－１および４４０－２（インハウスで開発）を使用して、ＦｉｍＨ変異体のコンフォメーション状態を確認した；２２９－３および３０４－１は、ＭＡｂ ４７５および９２６と同様のエピトープに結合し（Ｋｉｓｉｅｌａ、Ｄ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、１９０８９～１９０９４（２０１３））、一方、４４０－２は、異なるエピトープを認識し、オープンコンフォメーション状態のＦｉｍＨＬＤに優先的に結合すると思われる。野生型と同様の構造的統合性を維持するバリアントは、全ての抗体に結合することが予想される。全ての動態学的リアルタイム生体分子相互作用実験について、ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ ＨＴＸを使用して、各変異体との抗体反応性を測定した。ウェルあたり２４０μＬを含有する９６ウェル黒色プレートにおける１０００ｒｐｍ撹拌により３０℃で実験を実行した。０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する１×ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＴ）を含有する緩衝液においてＮｉ－ＮＴＡバイオセンサーを平衡化し、その後、５分間にわたり５μｇ／ｍＬでＨｉｓタグを付けたＦｉｍＨ変異体タンパク質をロードさせた。ＦｉｍＨをロードされたバイオセンサーに、３分間にわたりＰＢＴにおいてベースラインを再確立させ、その後、５分間にわたり５μｇ／ｍＬで異なる瓶（ｂｉｎ）由来の抗体と会合させた。会合ステップの動態学的分析のために、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアを使用し、ｎｍシフトにおける応答を得る（作表）。
（実施例６）
円二色性分光法
ＪＡＳＣＯ ＰＴＣ－４２４Ｓ／１５（Ｊａｓｃｏ）温度制御およびＩｓｏｔｅｍｐウォーターバス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ユニットを備えたＪＡＳＣＯ Ｊ－８１０分光偏光計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｏｍｉｔｅｒ）（Ｊａｓｃｏ）を使用して、ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体について遠ＵＶ（３２０－２５０ｎｍ）および近ＵＶ（２６０－２００ｎｍ）円二色性スペクトルを記録した。遠ＵＶのために、１ｍｍセルを使用し、近ＵＶのために、１０ｍｍセルを使用した。タンパク質を０．３ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳにおいて希釈し、１ｍｍ（遠ＵＶ）または１０ｍｍ（近ＵＶ）路長を有するセルを使用して２０℃でスペクトルを記録した。スキャンを１００ｎｍ／分で実行し、ＤＩＴを１秒間に、バンド幅を３秒間に、データピッチを０．１ｎｍに設定した。感度を標準に設定した。それぞれ近ＵＶのために１０種のスペクトルを、遠ＵＶ測定のために５種を蓄積し平均した。スペクトルは、ブランクＰＢＳランから生じるＣＤスペクトルを使用して手作業でバックグラウンドに対して補正し、ＥＱ．１を使用して平均残基楕円率に変換した。式中、θＭＲＥは、計算された平均残基楕円率であり、θＥＸＰは、実験により測定されたＣＤシグナルであり、ＭＷは、タンパク質分子量であり、Ｎは、アミノ酸残基の数であり、Ｃは、ｍｇ／ｍＬ単位のタンパク質濃度であり、ｌは、ｃｍ単位の光路長である。
ＥＱ．１
θＭＲＥ＝（θＥＸＰ・ＭＷ）／（１０・Ｎ・Ｃ・ｌ）
（実施例７）
動物免疫原性研究ＥＣ－１６７８
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから６～８週齢ＣＤ－１マウスを得た。群毎に、２０匹の動物に、０、４および８週目に、５ｍＭスクシネート、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＰＳ８０、ｐＨ５．６を含有する５．１ｍｇ／ｍＬ ＱＳ－２１ストック溶液から得た２０μｇキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ）－２１（ＱＳ－２１）と混合した１０μｇ ＦｉｍＨタンパク質を皮下免疫化した。
（実施例８）
ＦｉｍＨホールセル中和アッセイ
マンノシル化基質への線毛保有（ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の結合を阻害するワクチン接種動物由来の血清の能力を評価するために、酵母マンナンを使用したホールセル中和アッセイを、２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９に記載されている通りに用いた。
（実施例９）
ＣＨＯ細胞からのＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体の精製
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する分泌されたタンパク質として、ＣＨＯ細胞においてタンパク質を発現させた。細胞培養物上清を収集し、それぞれ２０ｍＭの最終濃度および１５０ｍＭ最終濃度となるように１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４および５Ｍ ＮａＣｌを添加した。５ｋＤａ ＴＦＦカセット緩衝液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５と５００ｍＭ ＮａＣｌおよび４０ｍＭイミダゾールにおいてリンスおよび平衡化した。上清を２倍に濃縮し、６体積の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾールに対して透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）した。保持液（Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を採取し、５０～１００ｍＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾールでリンスした。０．２μｍボトルトップフィルターを用いて保持液を濾過およびリンスした。ＸＫ２６／２０カラムに、Ｎｉ－セファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填し、５カラム体積の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾールで平衡化した。保持液を半分の流速でアプライし、安定したベースラインに達するまで洗浄した（およそ５５カラム体積）。結合したタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５で溶出した。目的のタンパク質を含有する画分をプールし、２回緩衝液を交換して４℃で２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して２ｋＤａ透析カセットにおいて透析した。同じ緩衝液で平衡化されたＳＰ－セファロースカチオン交換カラム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にタンパク質をアプライした。カチオン交換樹脂に結合した材料を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３、１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を使用したＮａＣｌの線形勾配で溶出した。画分をプールし、ＴＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析した。
（実施例１０）
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体における分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
２５℃で１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴＢＳ、ｐＨ７．４緩衝液において、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ ｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ １２５Å ２．５μｍ、４．６×３００ｍｍカラムを使用して分析的ＳＥＣを行った。注入体積は１０μｌであり、流速は０．５ｍＬ／分であった。
（実施例１１）
アンペロメトリック電気化学検出を使用した高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）による単糖分析
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ野生型およびＦｉｍＨ－ＤＳＧ三重変異体（Ｇ１５Ａ、Ｇ１６Ａ、Ｖ２７Ａ）の水性試料を、２Ｎトリフルオロ酢酸において２時間１２０℃で消化した。その時間の後に、６時間４５℃の真空下で試料を蒸発乾固した。試料をＭｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏにおいて復元し、ＤＩＯＮＥＸ ＩＣＳ ３０００イオンクロマトグラフィーシステムにおけるＨＰＡＥＣ－ＰＡＤによって評価した。Ｈ２Ｏおよび２００ｍＭ ＮａＯＨの混合物を使用した均一濃度溶出によるＤｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）を使用した。ＦｉｍＨ試料において検出されたピークの保持時間を公知単糖標準の溶液と比較することにより、単糖組成を確認した。
（実施例１２）
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体へのＯ抗原糖部分結合の検出
全ての動態学的リアルタイム生体分子相互作用実験のためにＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ ＨＴＸを使用して、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体との可能なＯ抗原相互作用を測定した。ウェルあたり２４０μｌを含有する９６ウェル黒色プレートにおいて１０００ｒｐｍ撹拌により３０℃で実験を実行した。１×ＰＢＳ緩衝液と０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する緩衝液（ＰＢＴ）においてＮｉ－ＮＴＡバイオセンサーを平衡化し、その後そこに、５分間にわたり５μｇ／ｍｌでＨｉｓタグを付けたＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体をロードした。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａをロードしたバイオセンサーに、３分間にわたるＰＢＴにおいてベースラインを再確立させ、その後そこに、Ｏ抗原多糖ＣＲＭコンジュゲート、Ｏ９またはＯ２５ｂまたはＯ１ａまたはＯ２の２倍滴定（２００～３．１２５μｇ／ｍｌ）をロードした。いかなる多糖も用いない、抗原をロードしたバイオセンサーを参照として使用した。ＦｉｍＨおよびＯ抗原滴定をロードしたバイオセンサーを、新たなベースラインを確立するためにＰＢＴに３分間浸漬した。５分間にわたる５μｇ／ｍＬ Ｏ抗原特異的ｍＡｂを用いた会合ステップにおいて、変異体へのＯ抗原結合の検出を検査した（ＭＡｂ ６０１はＯ９に対し、ＭＡｂ ＥＣＯ－８０－１１はＯ２５ｂに対し、ＭＡｂ ＥＣＯ－４８－２はＯ１ａに対し、ＭＡｂ ＥＣＯ－１７２－１３はＯ２に対する）。Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアを、参照を引いた会合ステップの動態学的分析のために使用し、ｎｍシフトにおける応答を得る（作表）。
（実施例１３）
タンパク質発現および精製
ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体を、Ｅｘｐｉ２９３細胞において発現させ、ニッケル親和性捕捉とそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーによって上清から単離した。いくつかの変異体は、不十分な発現レベルを有しており、生化学的または生物物理学的評価に進まなかったことに留意されたい（例えば、ＦｉｍＨＬＤ Ｐ２６Ｃ Ｖ３５Ｃ、Ｎ３３Ｃ Ｐ１５７Ｃ、Ｎ３３Ｃ Ｌ１０９Ｃ、Ｖ３５Ｃ Ｌ１０７Ｃ、Ｖ３５Ｃ Ｌ１０９Ｃ、Ｓ１１３Ｃ Ｔ１５８Ｃ）。十分な収率を得ることができた変異体を、熱安定性およびリガンド結合アッセイにおいて評価した。
（実施例１４）
マンノシドリガンドの存在下で改善された熱安定性および低減された融解温度シフトを有するＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体の同定
ＳＹＰＲＯオレンジ熱シフトに基づく示差走査型蛍光定量アッセイを使用して、ＦｉｍＨ変異体タンパク質の融解温度を決定し、この場合、Ｔｍは、タンパク質の５０％がアンフォールドされる温度を命名する。非共有結合リガンドは、多くの場合、特異的結合によりタンパク質標的を安定化し、タンパク質融解温度の増大をもたらす。したがって、アルファ－Ｄ－マンノースの誘導体であり、ＦｉｍＨに対しマイクロモル濃度の親和性を有するメチルアルファ－Ｄ－マンノピラノシドの存在下で融解温度を決定し（Ｂｏｕｃｋａｅｒｔ、Ｊ．ら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５、４４１～４５５（２００５））、アポ形態と比べたリガンドの存在下でのタンパク質の融解温度の差（ΔＴｍ）を計算した。
野生型（ＷＴ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧタンパク質は、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴと比較して有意により高い融解温度を呈し、リガンドの存在下でより低いΔＴｍを有した（表１０、表１１）。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴは、７１．６６℃の融解温度を有し、一方、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴの融解温度は、有意により低かった（６１．５４℃）。メチルアルファ－Ｄ－マンノピラノシドの存在下で、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴの融解温度は、１０．９９℃シフトし、一方、リガンドの存在下でのＦｉｍＨ－ＤＳＧの温度は、２．１３℃だけシフトした。このことは、ＦｉｍＨＬＤが、ＦｉｍＨ－ＤＳＧと比較して、リガンドによってより効率的に安定化されることを示唆し、このことは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧによるリガンド結合低減を反映し得る。
突然変異は、アポ状態におけるおよびリガンドの存在下におけるＦｉｍＨタンパク質の融解温度に影響を与えた。以前に記載された（Ｋｉｓｉｅｌａ、Ｄ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、１９０８９～１９０９４（２０１３）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｖ．Ｂ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８、２４１２８～２４１３９（２０１３））ＦｉｍＨＬＤロック変異体Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃは、野生型ＦｉｍＨＬＤ（６１．５４℃）と比較して、より低い融解温度（５１．４２℃）を呈し、発表されたデータ（Ｋｉｓｉｅｌａ、Ｄ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、１９０８９～１９０９４（２０１３）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｖ．Ｂ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８、２４１２８～２４１３９（２０１３））と一致した。メチルアルファ－Ｄ－マンノピラノシドとＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃのインキュベーションは、アポ形態と比較して、融解温度を７．２７℃増大し、この変異体が、リガンドによって部分的に安定化され、残渣リガンド結合効率を有し得ることを示唆する。ＦｉｍＨ－ＤＳＧの文脈において、Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃ変異体は、ＷＴと比較してより低い熱安定性であり（Ｔｍ＝６３．２９℃）、リガンドの存在下での温度シフトは、ＷＴと比較してＶ２７Ｃ Ｌ３４Ｃ変異体においてわずかに低減された（ΔＴｍ＝１．２９℃）。同様の融解温度を有したＦ１Ｌを除いて、６種のＰｈｅ１ ＦｉｍＨＬＤ変異体のうち５種が、ＷＴ ＦｉｍＨＬＤと比較して減少した融解温度を有した。リガンドの存在下で、６種のＦｉｍＨＬＤ Ｐｈｅ１変異体のうち４種が、小さいΔＴｍを示し、リガンドによる不十分な安定化を示唆する。対照的に、最も保存的なアミノ酸置換Ｆ１ＷおよびＦ１Ｙは、Ｐｈｅ１野生型ＦｉｍＨＬＤに対して、それぞれ中間のおよび匹敵するΔＴｍ値を呈した。全体的な熱安定性に関して、Ｒ６０Ｐ参照突然変異（以前に記載された － Ｒａｂｂａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｖ．Ｂ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８、２４１２８～２４１３９（２０１３））およびインハウスで設計されたいくつかの新規突然変異は、Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃと比べて有意に増大した融解温度を有した。興味深いことに、ＦｉｍＨＬＤ Ｖ２８Ｃ Ｎ３３Ｃ（参照ＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃから離れてちょうど１残基シフトされた両方の部位）は、いずれかのＦｉｍＨＬＤ 変異体の最高の融解温度を有し（Ｔｍ＝６５．７７℃）、メチルアルファ－Ｄ－マンノピラノシドの存在下で２．８１℃のΔＴｍを有し、リガンドに対する低減された親和性を示唆する。ＦｉｍＨＬＤにおけるグリシンループ領域における突然変異（Ｇ１５Ａ、Ｇ１６Ａ）は、Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃと比べて熱安定性を有意に増大させ、リガンドの存在下で融解温度の非常に低いシフトが観察された。グリシンループ突然変異はまた、ＦｉｍＨ－ＤＳＧの熱安定性をわずかに増大させ、リガンドによる温度シフトは観察されず、ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体が、リガンドによって安定化されず、したがって、野生型と比べて低減された結合効率を有し得ることをまとめて示唆する。
ＦｉｍＨＬＤ ＷＴの配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＵＴＩ単離物Ｊ９６（Ｈｕｌｌ、Ｒ．Ａ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ３３、９３３～９３８（１９８１））に由来する。Ｖ２７Ａは、ビルレントなＵＴＩ単離物およびクローン病に関連する単離物に関連する天然のバリアントである（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０、１５５３０～１５５３７（２０１３）；Ｃｅｓｐｅｄｅｓら、Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：６３９（２０１７））。ＦｉｍＨＬＤへのＶ２７Ａの組込みは、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴの融解温度をわずかに低減させ、ＷＴと比較して、より小さいシフトが、メチルアルファ－Ｄ－マンノピラノシドの存在下でＶ２７Ａにより観察された。他方では、Ｖ２７Ａは、ＦｉｍＨＬＤにおけるグリシンループ変異体Ｇ１５Ａ、Ｇ１６Ａ、Ｇ１５Ｐ、Ｇ１６Ｐの文脈で安定化効果を有すると思われ、これらは全て、Ｖ２７Ａにより、それなしと比較して、より高い融解温度を有し、この突然変異なしの最大６．０５℃（Ｇ１６Ｐ）と比較して、Ｖ２７Ａの存在下で＜２℃のΔＴｍを有した。加えて、Ｖ２７Ａを含有する（ｃｏｎｔａｉｉｎｇ）ＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体は、わずかに増大した熱安定性を有し、リガンドの存在下で検出可能な温度シフトはなかった。まとめると、このことは、Ｖ２７Ａが、ＦｉｍＨの融解温度に安定化効果を有し、リガンド結合効率を低減させることを示唆する。
いくつかのＦｉｍＨＬＤジスルフィドおよび非極性から極性への残基変異体は、低レベルで発現され、不十分に熱安定性であるか、またはマンノシド化合物の存在下で有意な温度シフトを呈し、これらが、リガンド結合効率を保持したことを示唆する（表１２）。これらは、単一の複製で検査し、さらなる分析から除外した。同様に、いくつかの他のＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体の熱安定性を分析したところ、そのうち２種が、改善された熱安定性およびリガンドによる低減されたシフトを有した（ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｖ２７Ａ Ｑ１３３ＫおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ Ｑ１３３Ｋ）（表１３）。Ｑ１３３Ｋ突然変異は、以前に記載された（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０：１５５３０～１５５３７（２０１３））、リガンド結合を排除するＦｉｍＨの結合ポケットにおける突然変異である。これらの変異体は、さらに分析しなかった。
Figure 2024503792000029
Figure 2024503792000030
Figure 2024503792000031
Figure 2024503792000032
（実施例１５）
マンノシドリガンドに対する親和性が低減したＦｉｍＨ変異体の同定
フルオレセインコンジュゲートオクチルビフェニルマンノピラノシド（ＢＰＭＰ）リガンドを用いた直接結合蛍光偏光アッセイを使用して、マンノシドリガンドに対するＦｉｍＨ変異体の解離定数（Ｋｄ）を決定した。ＷＴと比べたＦｉｍＨＬＤ変異体のＫｄ値は、表１４に示されている。ＦｉｍＨＬＤ ＷＴおよびＶ２７Ａは、ＢＰＭＰに対して同様の高い親和性を示した。参照ロック変異体ＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃ（Ｋｉｓｉｅｌａ、Ｄ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０、１９０８９～１９０９４（２０１３）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｖ．Ｖ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８：２４１２８～２４１３９（２０１３））は、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴと比べて、リガンドに対して９１分の１の親和性を有し、一方、ＦｉｍＨＬＤ Ｒ６０Ｐ Ｖ２７Ａ（Ｒａｂｂａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８））は、１７９分の１の親和性を有した。本明細書に開示されている変異体は、参照ロック変異体と比較した。結合は、グリシンループ変異体ＦｉｍＨＬＤ Ｇ１５Ａ Ｖ２７Ａ、Ｇ１５Ｐ Ｖ２７Ａ、Ｇ１６Ｐ Ｖ２７ＡおよびＧ１６Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａについて検出されなかったが、一方、Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａは、ＷＴと比べてＫｄの１５６倍増大を有した。Ｖ２７Ａと組み合わせたグリシンループ突然変異は全て、グリシンループ変異体単独よりも有意に高いＫｄを呈し、Ｖ２７Ａが、明瞭でない安定化効果を有するが、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴのＫｄに影響がほとんどないことを示唆する。Ｖ２７Ａの包含はまた、ＦｉｍＨＬＤ Ｒ６０Ｐの結合親和性をさらに減少させた。
３種の新規ジスルフィドロック変異体を本アッセイにおいて検査したところ、これらは全て、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴと比べてリガンド結合親和性のわずかな低減を有した（３３～４３分の１の親和性）。非極性から極性への突然変異を含有するＦｉｍＨＬＤ変異体（Ａ１１９Ｔ Ｖ２７Ａ、Ａ１１９Ｎ Ｖ２７Ａ、Ｌ３４Ｔ Ｖ２７Ａ、Ｌ３４Ｎ Ｖ２７Ａ）は、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴと同様に、ＢＰＭＰに対して高い親和性を有した。ＦｉｍＨＬＤ Ｆ１変異体は、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴと同様の結合親和性を有したＦ１Ｙを除いて、不十分な結合を呈した。
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ構築物のリガンド結合親和性は、表１５に示されている。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴのＫｄは、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴのＫｄよりも１００倍を超えて高く、ＦｉｍＨの２つの形態の異なるコンフォメーション状態を反映する可能性がある。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｖ２７Ａもまた、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴと比べてより低い親和性を有した。これは、ＦｉｍＣおよびＦｉｍＧと複合体形成したＡ２７を有する全長ＦｉｍＨが、ＦｉｍＨ Ｖ２７と比べて、マンノシドに対して低減された結合親和性を有することを示す以前のデータと一致する（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０：１５５３０～１５５３７（２０１３））。ＦｉｍＨ－ＤＳＧへのロック突然変異Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃの導入は、ＢＰＭＰに対する親和性を５分の２に低減させ、一方、グリシンループ変異体ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴと比べて２８分の１の親和性を有した。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｖ２７ＡおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１６Ａ Ｖ２７ＡのＫｄを計算することができず、これらの変異体が、ＢＰＭＰに結合できないことを示唆する。ピリン－レクチンドメイン界面（Ａ１１５Ｉ、Ｖ１８５Ｉ）の変更により、オープンコンフォメーションにおいてＦｉｍＨ－ＤＳＧを安定化するように設計された突然変異は、熱安定性データ（実施例１４）から示唆される通り、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴと比べて結合親和性を改善した。
要約すると、ＢＰＭＰに対して非常に低い結合親和性を有した、ＦｉｍＨＬＤまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧタンパク質のいずれかにおけるグリシンループ突然変異が同定された。これらおよび熱安定性データに基づき、マウスの機能的免疫原性研究における評価のためにグリシン変異体を選択した。
Figure 2024503792000033
Figure 2024503792000034
（実施例１６）
円二色性分光法によるＦｉｍＨ変異体のコンフォメーション状態の確認
改善された熱安定性およびマンノシドリガンドに対する低減された結合親和性を呈したＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体（実施例１４および１５）を、円二色性（ＣＤ）による二次および三次構造分析に供した。野生型およびコンフォメーションがロックされたＦｉｍＨＬＤ変異体は、別個の三次ＣＤプロファイルを有する（Ｒａｂｂａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８））。選択されたＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ野生型および変異体タンパク質の二次および三次構造を、遠ＵＶ ＣＤ（二次構造）および近ＵＶ ＣＤ（三次構造）によって試験した（図１を参照）。ＦｉｍＨＬＤの遠ＵＶ ＣＤスペクトルは、以前に発表されたデータ（Ｒａｂｂａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８））と一致し、ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧの両方の遠ＵＶスペクトルは、高いベータ－シート含有量を有するタンパク質に特徴的である。ＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃは、他の者によって観察された通り（Ｒａｂｂａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８））、野生型ＦｉｍＨＬＤと比較して、わずかに異なる遠ＵＶスペクトルを有し、オープンコンフォメーション状態を反映する。天然起源のＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ａ変異体の二次構造プロファイルもまた、若干変動した。全体的に見て、ＦｉｍＨＬＤまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体の二次構造は、野生型タンパク質と高度に同様であり（図１）、全体的な二次構造が、これらの変異体において変更されないことを示唆する。ＦｉｍＨＬＤ変異体の三次構造プロファイルは、オープンコンフォメーション状態において安定化されたＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７ Ｌ３４ＣおよびＶ２７Ａ Ｒ６０Ｐのインハウスのおよび発表されたＣＤスペクトルに密接に似ている（Ｒａｂｂａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８））。本明細書に記載されている変異体のプロファイルもまた、野生型ＦｉｍＨＬＤまたはＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ａと比較して有意に異なる。まとめると、これらのデータは、導入された突然変異が、ＦｉｍＨＬＤのコンフォメーションをオープンコンフォメーションにシフトし、一方、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ三次構造は、本明細書で評価されるコンフォメーション安定化突然変異の導入後に、大部分は未変化のままであることを示唆する。
（実施例１７）
中和モノクローナル抗体を使用したＦｉｍＨ変異体の特徴付け
レクチンドメイン特異的モノクローナル抗体２９９－３、３０４－１および４４０－２を使用したバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイによって、いくつかの選択されたＦｉｍＨ抗原のコンフォメーションを特徴付けた。競合実験（図示せず）は、抗体２２９－３および３０４－１が、ＭＡｂ ４７５および９２６（Ｋｉｓｉｅｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０：１９０８９～１９０９４（２０１３））と同様のリガンド結合部位エピトープに結合することを実証した。モノクローナル抗体４４０－２は、異なるエピトープに結合し、オープンコンフォメーションのＦｉｍＨＬＤに優先的に結合すると思われる。抗体２２９－３および３０４－１は、全てのＦｉｍＨＬＤ（表１６）およびＦｉｍＨ－ＤＳＧ（表１７）バリアントを認識することができたが、結合は、ＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ａについて低減された。対照的に、抗体４４０－２に対する応答は、ＷＴまたはＶ２７Ａと比べて、ＦｉｍＨＬＤまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体の全てにおいてより高かった。これは、図１に示されるＣＤ分光法プロファイルと一致し、ＦｉｍＨＬＤ変異体が、オープンコンフォメーションであることを示唆する。４４０－２による応答も、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴにおいて増大し、これは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体およびＷＴの重複するＣＤ分光法プロファイル（実施例１６）と組み合わせて、このタンパク質が、安定化突然変異の存在または非存在に関係なく、オープンコンフォメーション状態であることを示唆する。
Figure 2024503792000035
Figure 2024503792000036
（実施例１８）
ＦｉｍＨ変異体中和データ
選択された変異体の相対的な免疫原性を評価するために、マウスにＦｉｍＨ変異体をワクチン接種した。上述および以前（２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９）に記載されているホールセル酵母マンナン中和アッセイを使用して、機能的抗体価を惹起するＦｉｍＨ変異体の効力を定量化した。手短に説明すると、線毛保有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、血清と共にインキュベートし、酵母マンナンコーティングマイクロタイタープレートに結合させた。プレートを洗浄し、ルミネセントプローブを使用して、プレートに結合した生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の数を検出した。ワクチン接種されたマウス由来の血清の８ポイント２倍希釈系列から、酵母マンナンへの線毛保有細菌の結合を阻害する血清中和力価を決定した。力価は、細菌の５０％がプレートへの結合を維持する血清希釈度の逆数を表す。平均力価および応答の概要は、表１８に示されている。用量２および３の後における個々のマウスＩＣ５０応答のプロットは、図２および図３に示されている。
Figure 2024503792000037
以前の研究（２０２１年５月６日に発表されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０２１／０８４４２９）は、以前に記載されたジスルフィドロック変異体ＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ｃ Ｌ３４Ｃ（Ｋｉｓｉｅｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０：１９０８９～１９０９４（２０１３））が、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴと比べて機能的免疫原性を改善しなかったことを示した。新規ＦｉｍＨＬＤ変異体および別の以前に記載されたコンフォメーションが制約された変異体ＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ａ Ｒ６０Ｐ（Ｒａｂｂａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９３：１８３５～１８４９（２０１８）の機能的免疫原性は、図２において直接比較されている。変異体ＦｉｍＨＬＤ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ、ＦｉｍＨＬＤ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７ＡおよびＦｉｍＨＬＤ Ｖ２７Ａ Ｒ６０Ｐは、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴよりも多い数の応答者およびそれよりも高い力価（ｐ値＜０．０５）を生じた。他の突然変異（Ｇ１５Ａ Ｖ２７Ａ、Ｇ１６Ｐ Ｖ２７Ａ、Ｖ２８Ｃ Ｎ３３Ｃ）は、機能的免疫原性を有意に増強しなかったが、応答したマウスについて高い力価が観察されており、これらの群における応答者の数は、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴ群のそれと同様であった。よって、ＦｉｍＨＬＤをオープンコンフォメーションにロックすることにより、ＦｉｍＨＬＤの機能的免疫原性を増強するように設計されたいくつかの変異体は、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴと比べて機能的免疫原性を改善した。２用量のＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体によるワクチン接種後に、有意により多い動物が、ＦｉｍＨＬＤと比較して、ＦｉｍＨ－ＤＳＧをワクチン接種された群において中和力価を生じた（図３）。この傾向は、用量３の後に持続され、マウスの９５％～１００％が、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｖ２７Ａ、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｖ２７ＡおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａをワクチン接種された群において応答した。ＩＣ５０幾何平均力価（ＧＭＴ）もまた、用量３の後に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体をワクチン接種された全ての群において有意により高かった。類似のＦｉｍＨ－ＤＳＧ変異体（Ｖ２７Ａ、Ｇ１５Ａ Ｖ２７Ａ、Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ）は、ＦｉｍＨＬＤ変異体と比べてより高いＧＭＴを生成した（＜０．０５のｐ値）。
（実施例１９）
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａは、宿主グリカンに結合せず、均一になるよう単離することができる
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体タンパク質は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを含有する分泌されたタンパク質としてＣＨＯ細胞において発現させた。組換えＨｉｓタグを付けた形態のＦｉｍＨ－ＤＳＧの精製を図４に示す通りに実行した。
限外濾過および透析濾過の後に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴを含有する無細胞培養培地をニッケル親和性樹脂において単離し、カチオン交換クロマトグラフィーに供した。溶出ピークは、やや広く、いくつかの特徴的な肩を呈し、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴ種の不均一性の可能性を示唆する（図５）。興味深いことに、溶出された画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析すると、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴに対応する単一のバンドのみが、各画分において検出された。
精製プロセスにおいて、ＦｉｍＨ－ＤＳＧは、それが不十分な溶解性を有することを示唆する特性を呈した。特に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴ Ｎｉ－セファロース溶出液は、目視検査によって濁っていると常に思われた。ＳＰ－セファロースにおけるその後の精製のための酸性ｐＨ（４．３）へのシフトは、タンパク質溶液の清澄化をもたらした。しかし、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴ調製物の不十分な溶解性および凝集傾向は、ＴＢＳ、ｐＨ７．４への単離されたタンパク質の移動（透析）後に再度観察された。これは、凝集および沈殿によるタンパク質の漸進的な損失をもたらす。遠心分離による沈殿物の除去は、この時点におけるタンパク質濃度が典型的に０．２～０．４ｍｇ／ｍＬまでに低減されるとしても、凝集プロセスを終結することも減速することもない。凝集によるタンパク質の損失は、貯蔵（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）緩衝液に組み込まれた１０％グリセロールの存在下で制御することができる。しかし、グリセロールの存在は、３５０ｎｍで光散乱をモニタリングすることにより分光光度的に検出されたＨＭＷ可溶性凝集物の形成を防止しなかった。
同じプロセスをＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体の単離に利用する場合、いくつかの差が観察された。第一に、そのようなものは、Ｎｉ－セファロースカラムからのタンパク質の溶出後の、濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）の兆候の完全な欠如を含む。第二に、ＳＰ－セファロースカラムからの溶出ピークのプロファイルは、ＷＴ ＦｉｍＨ－ＤＳＧにより観察されたものほど広くなかった（図６）。そして最後に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体は、生理的ｐＨ緩衝液（ＴＢＳ ｐＨ７．４）への移動後に、完全に可溶性のままであった。最大５～６ｍｇ／ｍＬの濃度において、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体は、凝集または沈殿のいかなる兆候も示さなかった。
単離されたＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体の分析は、ＦｉｍＨ－ＤＳＧのこれら２種のバリアントの間の特徴的な差をさらに明らかにした。分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、その分子量と一致した保持時間で単一のピークとして溶出されたＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体を実証した。対照的に、野生型ＦｉｍＨ－ＤＳＧの溶出プロファイルは、いくつかのピークで構成され、主要ピークの保持時間は、図７に示す変異体のそれよりも少なかった。これらのデータは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴが、ＳＥＣによって検出可能な高分子質量複合体を形成することを明らかに実証する。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴによって形成されたＨＭＷ複合体の存在、および凝集する傾向は、そのＮ末端レクチン結合ドメインの機能的活性に関係付けることができる。本出願人らは、ＣＨＯ発酵中および培養培地への分泌後に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴが、宿主ＣＨＯ細胞の表面から放出されたグリカン分子（複数可）に結合すると仮定した。グリカンの分枝した性質により、２コピー以上のＦｉｍＨ－ＤＳＧ分子が、各グリカンによって収容（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）され得る。増大する数のＦｉｍＨ－ＤＳＧによるグリカンの連続的な「装飾」は、様々なＨＭＷ複合体の形成をもたらし、最終的に、溶解性の損失および沈殿を生じるであろう（図８を参照）。この仮説を検証するために、単離された野生型および変異体ＦｉｍＨ－ＤＳＧ（およびＦｉｍＨＬＤ）種を、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィーとアンペロメトリック電気化学（電気化学的）検出（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）分析に供した。この方法は、タンパク質試料におけるオリゴ糖またはグリカンの同定を可能にすると共に、これらのオリゴ糖の組成に関する情報を提供する。手短に説明すると、酸加水分解を実行して単糖を放出させ、続いて、単糖標準と比べたピークの分析を行う。ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ分析の結果は、単離されたＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴ（グリコシル化されている）およびＦｉｍＨＬＤ（グリコシル化されていない、データ図示せず）調製物が、有意な量の単糖を含有することを明らかにした。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体における同定された単糖の概要は、表１９に示されている。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体における単糖の含有量は、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴのそれよりも有意に少なかった。さらに、検出された低い単糖含有量が、Ｎ２３５を改変することが予測されるＮ－グリカンの糖部分を表すことが完全に可能である。
Figure 2024503792000038
（実施例２０）
ＦｉｍＨＬＤおよびＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に結合しない
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原Ｏ８およびＯ９の反復単位は、ポリマンノース残基で構成される。これは、ＦｉｍＨが、ＦｉｍＨ－Ｏ抗原コンジュゲート組合せワクチンにおけるＯ抗原コンジュゲートに結合することができるか否かという問いを生じた。バイオレイヤーインターフェロメトリー実験を設計して、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴが、遊離Ｏ９多糖またはＣＲＭコンジュゲートＯ９多糖のいずれかに結合することができるか否か、また、結合アッセイにおいてマンノシドリガンドに対して検出不能な親和性を有することが示されたＦｉｍＨＬＤ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体が結合することができるか否か検証した。Ｏ抗原結合データは、表２０に示されている。高濃度の遊離多糖において、応答は、ＦｉｍＨＬＤ ＷＴにより観察された。より高い応答は、ＣＲＭコンジュゲート多糖により観察された。しかし、検出可能な結合は、変異体タンパク質ＦｉｍＨＬＤ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａにより排除された。同様の実験がＦｉｍＨ－ＤＳＧのためにセットアップされ、異なる血清型（Ｏ９、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａおよびＯ２）の遊離またはＣＲＭコンジュゲートＯ抗原に結合するＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体の能力を検査した（表２１）。それらのマンノシドリガンド結合特性から予想される通り、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴの全体的な結合親和性は、対応するＦｉｍＨＬＤバリアントよりも有意に低かった。最高濃度のＣＲＭコンジュゲートにおいて、ある程度の滴定できる結合が、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴにより観察され、バックグラウンドレベルをごくわずかに上回る結合が、遊離多糖に見られた。ＦｉｍＨＬＤ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ 変異体と同様に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａタンパク質は、遊離またはＣＲＭコンジュゲート多糖のいずれにも結合しなかった。結論として、親ＷＴ ＦｉｍＨＬＤまたはＷＴ ＦｉｍＨ－ＤＳＧ抗原とは異なり、派生されたＧ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体は、Ｏ抗原に結合することができず、組み合わされたＦｉｍＨおよびＯ抗原ワクチンの開発を進める潜在的な道筋を提供する。
Figure 2024503792000039
Figure 2024503792000040
Figure 2024503792000041
（実施例２１）
Ｏ抗原ありおよびなしでＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体をワクチン接種された非ヒト霊長類
Ａ．方法
１．ＦｉｍＨ ＩｇＧ ｄＬＩＡ
スペクトル的に別個のＭａｇＰｌｅｘ－Ｃマイクロスフェア（ルミネックス）にカップリングされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異体線毛抗原ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａを、アッセイ一次インキュベーションの直前に、振盪しつつ室温で１～２時間にわたり濃度５０，０００ビーズ／ｍＬとなるようにブロッキング緩衝液において希釈した。振盪しつつ２～８℃で一晩のインキュベーションのため、希釈されたマイクロスフェア混合物を、適切に希釈された非ヒト霊長類血清試料、対照および参照標準である、ＦｉｍＨ－ＤＳＧのピリンドメインに結合するヒト化インハウスモノクローナル抗体（ＦｉｍＨ Ｙ２０２）を含有するアッセイプレートに添加した。非結合構成成分を洗い流した後に、精製されたＲ－フィコエリトリンヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ、１０９－１１６－１７０）をマイクロスフェア混合物に添加し、振盪しつつ室温で９０分間インキュベートした。ルミネックスＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄリーダーによって測定された蛍光ＰＥシグナルの大きさは、タンパク質カップリングマイクロスフェアに結合した抗ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＩｇＧの量に直接比例する。蛍光強度中央値から抗原特異的抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿するために標準曲線の対数／対数線形回帰モデルを使用するカスタムＳＡＳアプリケーションを使用して、データを分析した。標準曲線バイアスから０．７６３μｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）が計算された。
２．４価Ｏ－Ａｇ ＩｇＧ ｄＬＩＡ
血清型 Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２およびＯ６の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の長いＯ抗原多糖を、ポリ－Ｌ－リシンに共有結合によりコンジュゲートし、派生されたコンジュゲートを、標準ＥＤＣ／ＮＨＳ媒介性カップリングプロトコールにより、スペクトル的に別個のＭａｇＰｌｅｘ－Ｃマイクロスフェア（ルミネックス）にカップリングした。振盪しつつ２～８℃で一晩のインキュベーションのために、マイクロスフェアを、系列希釈された非ヒト霊長類血清試料、対照およびポリクローナル標準と共にインキュベートした。洗浄後に、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ、１０９－１１５－０９８）を用いて、振盪しつつ室温で９０分間のインキュベーションの後に、結合した血清型特異的ＩｇＧを検出した。４つのスペクトル的に別個の領域のそれぞれについて、ルミネックス２００リーダーによって蛍光を測定し、蛍光強度中央値として表した。ポリクローナル標準滴定の標準曲線プロットは、任意の割当てによる線形勾配プロファイルを生じ、そこから、シグナルを血清型特異的抗体レベル（Ｕ／ｍＬ）として内挿することができる。
３．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）
雌カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ））は元々、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から入手し、その後、Ｐｆｉｚｅｒ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ、ＮＹに移した（年齢範囲：４～５歳、体重範囲：３．１～５．９ｋｇ）。ＮＨＰは、標準クワッドケージ（ｑｕａｄ ｃａｇｉｎｇ）に収容し、水および食物は自由摂取させた。動物の皮下にマイクロチップを埋めて、内部温度をモニタリングした。陰性尿ｑＰＣＲ結果（下の方法セクション１０を参照）に基づき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染がないＮＨＰのみを登録した。
４．ワクチン接種および血液採取
ビヒクル対照（ＰＢＳ、ｐＨ６．２）、モノマー線毛抗原ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ（５０μｇ／用量）、またはモノマー線毛抗原ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ（５０μｇ／用量）と組み合わせた４価Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２およびＯ６ Ｏ抗原多糖コンジュゲート（１μｇ／用量）の混合物のいずれかで、０、４および１４週目にカニクイザルを筋肉内に免疫化した（０．５５ｍＬ）。ワクチン抗原に、ＡＳ０１ｂ（用量あたり５０μｇのＭＰＬおよび５０μｇのＱＳ－２１）をアジュバントとして加えた。
０、６および１６週目に、１０ｍＬの血液を、２１ｇ安全針付き／バキュテナーを使用して、大腿静脈経由で１個の血清分離チューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）内に採取した。採取チューブを室温で３０分間放置し、３０００ｇで１０分間遠心分離した。上清における血清を採取し、等分し、－８０℃で貯蔵した。
５．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床単離物
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＩＨＭＡ）によって維持されているＰｆｉｚｅｒ支援のＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｌｅａｄｅｒｓｈｉｐ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ（ＡＴＬＡＳ）データベースの一部として採取されたＵＰＥＣ株から、患者の年齢および試料採取の起源（ＰＦＥＥＣ０５７８、男性、年齢３８、膀胱起源）に基づき、１つの代表的なＳＴ１３１ Ｏ２５ｂ臨床単離物を選択した。この臨床研究室株は、未知の型の莢膜多糖の産生をコードする遺伝子を有する。
６．ＵＰＥＣ株ストック調製
１２ｍＬのＬＢブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ、＃Ｌ８１９８）への接種と、それに続く２７５ｒｐｍの撹拌下での３７℃における一晩インキュベーションによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ストックを調製した。１８時間後に、１２ｍＬ培養物を、２５０ｍＬフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１４０７）内の１１３ｍＬのＬＢブロス中に希釈した。ＯＤ６００が２．１～２．７の間になるまで、培養物を、ほぼ２７５ｒｐｍにて３７℃で２～３時間インキュベートした。２５ｍＬのグリセロール（８０％、ＭＰ、＃３０５５－０４４）を培養物へと混合した。長期貯蔵のために５ｍＬのアリコートを－８０℃で凍結した。ストックの系列希釈をＴＳＡプレート（ＢＤ、ＢＢＬトリプチケース（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）ダイズ寒天（ダイズ豆カゼイン消化寒天）カタログ＃Ｂ２１２８３Ｘ）上にプレーティングすることにより、バイアルあたりの生存細菌の濃度を確認し、３０℃における１８時間インキュベーションの後に分析した。
７．膀胱炎の非ヒト霊長類モデル
筋肉内投与されたケタミン／デクスドミトール（Ｄｅｘｄｏｍｉｔｏｒ）混合物でＮＨＰを麻酔した。尿道カテーテル留置からの膀胱汚染を防止するために、無菌生理食塩水で湿らせた無菌ガーゼおよび／または塩化ベンザルコニウムを含有する消毒拭き取り繊維で肛門生殖器区域をしっかりと拭いた。組織刺激作用を防止するためにＳｕｒｇｉ Ｌｕｂｅで以前にコーティングされた無菌５フレンチレッド（Ｆｒｅｎｃｈ ｒｅｄ）ゴムカテーテルを、尿道を通して膀胱内に穏やかに導入した。次に、自然な流れまたはシリンジによる吸引のいずれかにより、尿を完全に出して膀胱を空にした。カテーテルを通して、１０８ＣＦＵのＵＰＥＣ株ＰＦＥＥＣ０５７８を含有する１ｍＬの体積を膀胱内に直接投与した。
８．負荷後動物モニタリング
負荷後に、１週目は１日２回およびその後の週は１日１回動物をモニタリングした。負荷後最大３０日目までＮＨＰをモニタリングした。モニタリングは、尿量の外観の観察、行動または食欲の変化、疼痛／不快感の兆候および体温測定を含んだ。
９．カテーテル留置による尿採取
きれいな尿試料の採取を可能にするために、上に記載されている通りに、麻酔したＮＨＰの膀胱にカテーテル留置した。カテーテル留置後に、自然な流れまたはシリンジによる吸引のいずれかにより、尿を出して膀胱を空にした。膀胱が、尿を含有しなかった場合、１０ｍＬの生理食塩水を注入し、カテーテルを通した吸引を反復した。採取された全試料を氷上で直ちに貯蔵した。
１０．ＤＮＡ抽出
Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｅｌｕｔｅ ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｅｆ＃５１３０６、含量は、時に、採取された試料体積によって限定された）を使用して、ＮＨＰ尿試料の最大３回複製からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡの抽出を実行した。製造業者の血液および体液スピンプロトコールに、次の改変を加えて従った：試料出発体積を５００μＬに増大させた（試料体積が許容されるのであれば）、緩衝液ＡＬ体積を５００μＬに増大させた、プロテイナーゼＫ体積を５０μＬに増大させた、５０μＬの分子グレードの水（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｒｅｆ＃４６－０００－ＣＭ）を３７℃に温め、溶出緩衝液ＥＢの代わりに使用した。最後に、３７℃の分子グレードの水の添加後に、最終スピンに先立ち、スピンカラムを５分間室温でインキュベートした。
１１．定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、ＮＨＰ尿試料における細菌ロードを評価した。次のプライマー：フォワード、ＴＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴ（配列番号１０９）；リバース、ＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧ（配列番号１１０）を使用したｑＰＣＲにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ｂ血清型特異的ＤＮＡを増幅し、Ｆａｍ蛍光レポーターによるプローブおよび配列ＡＧＧＡＴＡＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＧＴ（配列番号１１１）を使用して、複製を定量化した。
Ｏ２５ｂ血清型特異的アンプリコンは、Ｏ２５ｂ血清型ｏｒｆ１０領域の部分に対応する。プライマーおよびプローブをカスタム設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから凍結乾燥状態で購入し、１００ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度となるように緩衝液ＴＥ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｒｅｆ＃４６－００９－ＣＭ）において復元した。
上に記載されているＤＮＡ抽出手順から得たＤＮＡ試料を、９６ウェルＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ９６ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｆ＃Ｎ８０１０５６０）においてアッセイした。ウェルあたり１２．５μＬ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２Ｘ Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｆ＃４４４４５５４）、０．１２５μＬの各復元プライマー、０．５μＬプローブ、１．７５μＬ分子生物学グレードの水（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｒｅｆ＃４６－０００－ＣＭ）および１０μＬの試料を使用して、２５μｌの総体積においてｑＰＣＲ反応を実行した。
ＤＮＡの増幅のための反応条件は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステムまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかにおいてランを行った、５０℃で２分間、次いで９５℃で２分間、ならびに４０サイクルの９５℃で３秒間および６０℃で３０秒間であった。
定量化を可能にするために、線形標準曲線を作成した。各負荷実験（上に記載されている調製）において使用されるものと同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の凍結ストックのアリコートを、無菌ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２１－０４０－ＣＭ）において１×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるように希釈した。その後の系列希釈を実行して、１×１０８、１×１０７、１×１０６、１×１０５、１×１０４、１０００、１００および１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する溶液を生成した。系列希釈は、無菌ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２１－０４０－ＣＭ）において、または接種に先立ち対象から採取された、プールされ２回濾過されたＮＨＰ尿において調製された。ＰＢＳおよびプールされ２回濾過されたＮＨＰ尿における希釈は、等価であることが後に見出された。各希釈に存在する生存細菌の含量は、ＴＳＡプレート（ＢＤ、ＢＢＬトリプチケースダイズ寒天（ダイズ豆カゼイン消化寒天）カタログ＃Ｂ２１２８３Ｘ）上にプレーティングすることにより確認された。上に記載されている通り、試料からのＤＮＡの抽出に用いられる同じ方法を使用して、各系列希釈においてＤＮＡ抽出を実行した。２回繰り返して、全てのｑＰＣＲアッセイプレートにおいてこれらのｑＰＣＲ標準をランした。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して、線形回帰分析を実行した。統計分析は、生成された標準曲線が、１００～１×１０８細菌／ｍＬの間で線形に挙動したことを決定した。結果的に、定量下限（ＬＬＯＱ）は、１００細菌／ｍＬであると決定された。一部の例では、試料は、蛍光閾値に達したが、ＬＬＯＱを下回る含量に対応するサイクルにおいて、他の例では、蛍光閾値に全く達しなかった（未決定値）。これらの条件のいずれかが起こった場合、値は、ＬＬＯＱの値（１００細菌／ｍＬ）として本明細書で報告される。
１２．ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）ＥＬＩＳＡ
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎミエロペルオキシダーゼインスタントＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ＃ＢＭＳ２０３８ＩＮＳＴ）を使用して、ＮＨＰ尿中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を定量化した。５％０．５Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．８（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｒｅｆ＃Ｊ６１７８６－ＡＫ）の最終濃度となるようにＰＩＰＥＳ緩衝液を純粋な尿試料に添加した。試料を１５秒間ボルテックスにかけ、次いで、製造業者供給の試料希釈剤で１：１希釈した。試料を２回繰り返してアッセイし、アッセイの残りについて製造業者の説明書に従った。最終エンドポイントにおいて、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４５０ｎｍにおける色強度を測定した。アッセイキットに含まれた標準を使用して、標準曲線を生成した。分析のため、アッセイキットの低標準（１５６．２５ｐｇ／ｍＬ）は、検出下限（ＬＬＯＤ）であることが理解された。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ装置のコンパニオンソフトウェア（Ｓｏｆｔｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）は、低標準の値を越えて外挿することができる。ＬＬＯＤの半分の値（７８．１２５ｐｇ／ｍＬ）を、当該値より下に外挿されたいずれかの値、またはいずれかのアッセイ結果が検出限界を完全に下回った場合に代えて置換した。
１３．ＩＬ－８ルミネックスアッセイ
カスタムＢｉｏ－Ｒａｄ ＩＬ－８ヒトサイトカインスクリーニングパネルルミネックスアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ＲＥＦ＃１７００５１７７）を使用して、インターロイキン－８（ＩＬ－８）を測定した。５％０．５Ｍ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．８（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｒｅｆ＃Ｊ６１７８６－ＡＫ）の最終濃度となるように、ＰＩＰＥＳ緩衝液を純粋な尿試料に添加した。試料を１５秒間ボルテックスにかけ、次いで、改変されたＬＸＡ－４緩衝液（ＰＢＳ １×、０．５％ＢＳＡ、０．０２５％アジ化ナトリウム）の５０％で１：１希釈した。試料を２回繰り返してアッセイし、アッセイの残りについて製造業者の説明書に従った。ＢｉｏＰｌｅｘ ２００ルミネックス装置（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）においてアッセイプレートを読み取った。Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００ルミネックス装置のコンパニオンソフトウェア「ＢｉｏＰｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ」およびアッセイキットに含まれた標準を使用して、標準曲線を生成し、蛍光強度から試料濃度を外挿した。ＢｉｏＰｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアは、定量下限（ＬＬＯＱ）を決定する。
１４．尿沈渣の総有核細胞計数および光学顕微鏡分析
採取の１時間以内に、尿試料（５００μｌ～１ｍＬ）を１％の最終濃度のホルマリンで固定し、一晩氷上でＰｆｉｚｅｒ Ｇｒｏｔｏｎ、ＣＴに送った。受け取り後に、血球計数器において総有核細胞（上皮細胞および多形核細胞）を計数した。合計およそ３００μＬを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｈａｎｄｏｎ ＥＺダブルサイト（ｄｏｕｂｌｅ ｃｙｔｏ）漏斗にロードしたが、１００μＬは一方の漏斗に、２００μＬは他方の漏斗に入れた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣｙｔｏＳｐｉｎ ４細胞遠心分離を使用して、Ｓｈａｎｄｏｎ Ｄｏｕｂｌｅ Ｃｙｔｏｓｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅコーティングガラススライド上で５分間７５０ｒｐｍにて試料を細胞遠心分離（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）した。高い細胞計数を有する試料のため、尿を先ず、細胞遠心分離前に０．９％生理食塩水で１：１０希釈した。Ｓｙｓｍｅｘ ＳＰ－１０装置を使用して、次に、ｃｙｔｏｐｒｅｐスライドを短時間メタノール固定し、ギムザおよびメイ・グリュンワルド（Ｍａｙ－Ｇｒｕｎｗａｌｄ）染色で染色した。尿試料毎に、上に収載されている２つの試料体積により、尿試料あたり１枚のスライドを調製した。
濃縮および染色された尿沈渣を含有するＣｙｔｏｓｐｉｎスライドを、増大した多形核細胞（ＰＭＮ、すなわち、一般に好中球で構成された、ただし、好酸球および好塩基球も含む、セグメント化されたまたは腎臓形の（ｒｅｎｉｆｏｒｍ）核を有する顆粒球）の存在または非存在について光学顕微鏡によって評価した。増大したＰＭＮ細胞の非存在は、ＰＭＮがないことまたはＰＭＮが稀少であることの観察に基づき決定された。増大したＰＭＮの存在は、バックグラウンド上皮細胞集団と比べて、ＰＭＮが稀少よりも多いことの観察に基づき決定された。
Ｂ．結果
１．Ｏ抗原ありおよびなしのＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体によるワクチン接種は、非ヒト霊長類において強力な総および中和抗体を惹起する
非ヒト霊長類に、４価Ｏ抗原コンジュゲート（Ｏ２５ｂ、Ｏ６、Ｏ１ａ、Ｏ２）およびＡＳ０１ｂアジュバントありまたはなしでＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体をワクチン接種した（図９）。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａおよび４価Ｏ抗原ワクチン接種群において、Ｏ抗原血清型特異的抗体価は、ワクチン接種後６週目にほぼ４００倍上昇した（図１０および表２２）。直接ルミネックスイムノアッセイ（ｄＬＩＡ）を使用して、総抗ＦｉｍＨ抗体価を定量化した（図１１Ａおよび表２３）。プラセボ群における動物は、アッセイの定量限界を下回る力価を有した。両方のワクチン接種群において、力価は、２用量の後に上昇し、第３の用量でブーストすることができた。全体的に見て、力価は、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ単独と比較して、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７ＡとＯ抗原をワクチン接種された動物においてわずかにより低かった。
Figure 2024503792000042
Figure 2024503792000043
酵母マンナンへの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の結合を遮断する抗ＦｉｍＨ抗体の能力を評価するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）結合阻害アッセイにおいて血清を評価した（図１１Ｂおよび表２４）。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ単独をワクチン接種された動物由来の血清の平均ＩＣ５０は、用量２の後に２９３．６５に、用量３の後に１６９８．３９に上昇し、一方、Ｏ抗原と組み合わされたＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａをワクチン接種された動物の平均ＩＣ５０は、用量２後に４８０．１２、用量３後に７５６．４５であった。
まとめると、これらのデータは、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａが、非ヒト霊長類において強力な抗体応答を惹起し、Ｏ抗原と組み合わせると、ＦｉｍＨ単独によるよりもわずかに低いが、高力価をもたらすことを示す。
２．Ｏ抗原ありおよびなしのＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体によるワクチン接種は、非ヒト霊長類モデルにおける細菌尿および感染のバイオマーカーを低減させる
最終ブーストの５週間後に、ワクチン接種およびプラセボ処置ＮＨＰに、膀胱内カテーテル留置（ｃａｔｈｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を経由して、１０８ＣＦＵのＵＰＥＣ単離物ＰＦＥＥＣ０５７８を接種した。２８日間の期間にわたり、カテーテル採取尿において細菌尿をモニタリングした。全てのプラセボ処置動物において、生きている細菌の滴下注入は、負荷後２および７日目に高レベルの細菌尿を生じた（近似で１０６細菌／尿１ｍＬの幾何平均）。プラセボ群と比較して、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７ＡまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋４価Ｏ抗原をワクチン接種された動物は、感染後２および７日目にそれぞれ幾何平均細菌尿の３００分の１または１０００分の１への低減を呈した。
１４日目に、プラセボワクチン接種動物のおよそ５０％は、依然として、細菌尿＞１０５細菌／尿１ｍＬを呈した。最後に、プラセボ ＮＨＰの大部分は、２１および２８日目に感染を排除した。対照的に、大部分のＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７ＡまたはＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋４価Ｏ抗原ワクチン接種動物は、１４日目までに感染を排除した（図１２）。
次に、負荷されたＮＨＰの尿において、様々な炎症性バイオマーカーをモニタリングした。負荷後７日目に、細胞学分析によって確認される通り、全てのプラセボ処置動物が、尿沈渣において上昇したレベルの多形核（ＰＭＮ）細胞を呈した。対照的に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａワクチン接種ＮＨＰの２５％未満が、尿沈渣において増大したレベルのＰＭＮ細胞を有し、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ＋４価Ｏ抗原免疫化動物は、尿沈渣において増大したレベルのＰＭＮ細胞を有しなかった（図１３Ｃ）。並行して、本出願人らは、７日間の期間にわたり、尿試料におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）およびインターロイキン８（ＩＬ－８）のレベルを測定した。負荷後２日目に、両方のワクチン接種群が、プラセボ群（４７０ｐｇ／ｍＬの幾何平均）と比較して、ＭＰＯレベルの２分の１への低減を呈した（ほぼ２００ｐｇ／ｍＬの幾何平均）（図１３Ａ）。
加えて、感染後２日目および７日目に、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａワクチン接種動物におけるＩＬ－８の尿濃度は、プラセボ処置ＮＨＰの尿において測定されたレベル（５４．２ｐｇ／ｍＬおよび３２．７ｐｇ／ｍＬの幾何平均）と比較して、それぞれ近似で１０分の１および５分の１に減少した（５．９ｐｇ／ｍＬおよび９．８ｐｇ／ｍＬの幾何平均）。同様の傾向で、Ｏ抗原と組み合わせたＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ免疫化ＮＨＰにおける２日目および７日目のＩＬ－８の尿レベルは、プラセボ処置動物において観察されたＩＬ－８濃度と比較して、それぞれ近似で５分の１および３分の１に低減された（１１．３ｐｇ／ｍＬの幾何平均）（図１３Ｂ）。
Ｃ．結論
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体は、第３の用量でブーストされ得るＮＨＰにおいて高い抗ＦｉｍＨ ＩｇＧ力価を誘導する。ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体および４価Ｏ抗原の組合せをワクチン接種された動物は、高いＯ抗原 ＩｇＧ力価を示した。
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａは、非ヒト霊長類において強力な中和抗体を惹起する。４価Ｏ抗原との組合せは、同様に免疫原性である。
４価Ｏ抗原ありまたはなしのＦｉｍＨ－ＤＳＧ Ｇ１５Ａ Ｇ１６Ａ Ｖ２７Ａ変異体は、カニクイザルの尿路感染モデルにおいて細菌尿および感染のバイオマーカーを低減させる。
次の項目は、本開示の追加の態様について記載する：
Ｃ１．野生型ＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列と比べた少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドであって、突然変異位置が、Ｆ１、Ｐ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ａ１８、Ｐ２６、Ｖ２７、Ｖ２８、Ｑ３２、Ｎ３３、Ｌ３４、Ｖ３５、Ｒ６０、Ｓ６２、Ｙ６４、Ｇ６５、Ｌ６８、Ｆ７１、Ｔ８６、Ｌ１０７、Ｙ１０８、Ｌ１０９、Ｖ１１２、Ｓ１１３、Ａ１１５、Ｇ１１６、Ｖ１１８、Ａ１１９、Ａ１２７、Ｌ１２９、Ｑ１３３、Ｆ１４４、Ｖ１５４、Ｖ１５５、Ｖ１５６、Ｐ１５７、Ｔ１５８、Ｖ１６３およびＶ１８５からなる群から選択され、アミノ酸位置が、配列番号５９に従ってナンバリングされる、突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２．Ｆ１Ｉ；Ｆ１Ｌ；Ｆ１Ｖ；Ｆ１Ｍ；Ｆ１Ｙ；Ｆ１Ｗ；Ｐ１２Ｃ；Ｇ１４Ｃ；Ｇ１５Ａ；Ｇ１５Ｐ；Ｇ１６Ａ；Ｇ１６Ｐ；Ａ１８Ｃ；Ｐ２６Ｃ；Ｖ２７Ａ；Ｖ２７Ｃ；Ｖ２８Ｃ；Ｑ３２Ｃ；Ｎ３３Ｃ；Ｌ３４Ｃ；Ｌ３４Ｎ；Ｌ３４Ｓ；Ｌ３４Ｔ；Ｌ３４Ｄ；Ｌ３４Ｅ；Ｌ３４Ｋ；Ｌ３４Ｒ；Ｖ３５Ｃ；Ｒ６０Ｐ；Ｓ６２Ｃ；Ｙ６４Ｃ；Ｇ６５Ａ；Ｌ６８Ｃ；Ｆ７１Ｃ；Ｔ８６Ｃ；Ｌ１０７Ｃ；Ｙ１０８Ｃ；Ｌ１０９Ｃ；Ｖ１１２Ｃ；Ｓ１１３Ｃ；Ａ１１５Ｖ；Ｇ１１６Ｃ；Ｖ１１８Ｃ；Ａ１１９Ｃ；Ａ１１９Ｎ；Ａ１１９Ｓ；Ａ１１９Ｔ；Ａ１１９Ｄ；Ａ１１９Ｅ；Ａ１１９Ｋ；Ａ１１９Ｒ；Ａ１２７Ｃ；Ｌ１２９Ｃ；Ｑ１３３Ｋ；Ｆ１４４Ｃ；Ｖ１５４Ｃ；Ｖ１５６Ｃ；Ｐ１５７Ｃ；Ｔ１５８Ｃ；Ｖ１６３Ｉ；およびＶ１８５Ｉ、またはこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を含む、項目Ｃ１に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３．突然変異Ｇ１５ＡおよびＧ１６Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４．突然変異Ｐ１２ＣおよびＡ１８Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ５．突然変異Ｇ１４ＣおよびＦ１４４Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ６．突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ３５Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ７．突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ１５４Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ８．突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ１５６Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ９．突然変異Ｖ２７ＣおよびＬ３４Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１０．突然変異Ｖ２８ＣおよびＮ３３Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１１．突然変異Ｖ２８ＣおよびＰ１５７Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１２．突然変異Ｑ３２ＣおよびＹ１０８Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１３．突然変異Ｎ３３ＣおよびＬ１０９Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１４．突然変異Ｎ３３ＣおよびＰ１５７Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１５．突然変異Ｖ３５ＣおよびＬ１０７Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１６．突然変異Ｖ３５ＣおよびＬ１０９Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１７．突然変異Ｓ６２ＣおよびＴ８６Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１８．突然変異Ｓ６２ＣおよびＬ１２９Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ１９．突然変異Ｙ６４ＣおよびＬ６８Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２０．突然変異Ｙ６４ＣおよびＡ１２７Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２１．突然変異Ｌ６８ＣおよびＦ７１Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２２．突然変異Ｖ１１２ＣおよびＴ１５８Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２３．突然変異Ｓ１１３ＣおよびＧ１１６Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２４．突然変異Ｓ１１３ＣおよびＴ１５８Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２５．突然変異Ｖ１１８ＣおよびＶ１５６Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２６．突然変異Ａ１１９ＣおよびＶ１５５Ｃを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２７．突然変異Ｌ３４ＮおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２８．突然変異Ｌ３４ＳおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ２９．突然変異Ｌ３４ＴおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３０．突然変異Ｌ３４ＤおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３１．突然変異Ｌ３４ＥおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３２．突然変異Ｌ３４ＫおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３３．突然変異Ｌ３４ＲおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３４．突然変異Ａ１１９ＮおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３５．突然変異Ａ１１９ＳおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３６．突然変異Ａ１１９ＴおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３７．突然変異Ａ１１９ＤおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３８．突然変異Ａ１１９ＥおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ３９．突然変異Ａ１１９ＫおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４０．突然変異Ａ１１９ＲおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４１．突然変異Ｇ１５ＡおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４２．突然変異Ｇ１６ＡおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４３．突然変異Ｇ１５ＰおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４４．突然変異Ｇ１６ＰおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４５．突然変異Ｇ１５Ａ、Ｇ１６ＡおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４６．突然変異Ｇ６５ＡおよびＶ２７Ａを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４７．突然変異Ｖ２７ＡおよびＱ１３３Ｋを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４８．突然変異Ｇ１５Ａ、Ｇ１６Ａ、Ｖ２７ＡおよびＱ１３３Ｋを含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ４９．配列番号２～５８および６０～６４のうちいずれか１つの配列を含む、項目Ｃ２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ５０．単離されている、項目Ｃ１～Ｃ４９のいずれかに記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ５１．（ｉ）項目Ｃ１～Ｃ５０のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
Ｃ５２．項目Ｃ１～Ｃ５０のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを含む免疫原性組成物。
Ｃ５３．少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む、項目Ｃ５２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ５４．少なくとも１つの追加の抗原が、糖または多糖または糖コンジュゲートまたはタンパク質である、項目Ｃ５３に記載の免疫原性組成物。
Ｃ５５．少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、項目Ｃ５２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ５６．項目Ｃ１～Ｃ４９のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
Ｃ５７．免疫原性である、項目Ｃ１～Ｃ５０のいずれかに記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
Ｃ５８．項目Ｃ１～Ｃ５０のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞。
Ｃ５９．項目Ｃ５８に記載の組換え細胞を含む培養物であって、少なくとも５リットルのサイズである培養物。
Ｃ６０．項目Ｃ１～Ｃ５０のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを産生するための方法であって、好適な条件下で項目Ｃ５８に記載の組換え哺乳動物細胞を培養し、これにより、ポリペプチドを発現させること；およびポリペプチドを収集することを含む方法。
Ｃ６１．（ｉ）腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する対象における免疫応答を誘導するための、または（ｉｉ）腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的な対象におけるオプソニン貪食作用および／もしくは中和抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の項目Ｃ５１～Ｃ５５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
Ｃ６２．対象が、尿路感染を発症するリスクがある、項目Ｃ６１に記載の方法。
Ｃ６３．対象が、菌血症を発症するリスクがある、項目Ｃ６１に記載の方法。
Ｃ６４．対象が、敗血症を発症するリスクがある、項目Ｃ６１に記載の方法。
Ｃ６５．哺乳動物に、有効量の項目Ｃ５１～Ｃ５５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法。
Ｃ６６．免疫応答が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用および／または中和抗体を含む、項目Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ６７．免疫応答が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する、項目Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ６８．対象に、免疫学的有効量の項目Ｃ５１～Ｃ５５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、対象における細菌感染、疾患または状態を防止、処置または改善する方法。
Ｃ６９．追加の抗原が、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂおよび式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂおよび式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式０１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む糖である、項目Ｃ５４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７０．糖が、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、式Ｏ６２Ｄ１、式Ｏ２２、式Ｏ３５、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ８３、式Ｏ９１、式Ｏ１０５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１３９、式Ｏ１５３、式Ｏ１６７、および式Ｏ１７２（式中、ｎは３１～１００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ６９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７１．糖が、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、および式６２Ｄ１（式中、ｎは３１～１００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ７０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７２．式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ２１、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、および式Ｏ７５から選択される構造を含む、項目Ｃ７０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７３．式Ｏ４、式Ｏ１１、式Ｏ２１、および式Ｏ７５から選択される構造を含む、項目Ｃ７０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７４．式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１から選択される構造を含まない、項目Ｃ６９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７５．式Ｏ１２から選択される構造を含まない、項目Ｃ６９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７６．前記糖を生成するグラム陰性細菌中でｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって生産される、項目Ｃ７２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７７．ｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２からなる群から選択される、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７８．ｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢである、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７９．ｗｚｚファミリータンパク質がｆｅｐＥである、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８０．ｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢおよびｆｅｐＥである、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８１．ｗｚｚファミリータンパク質がサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来する、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８２．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８３．ｗｚｚファミリータンパク質が、１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、および配列番号１１６のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８４．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ７６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８５．糖が合成的に合成される、項目Ｃ６９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分をさらに含む、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分をさらに含む、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分をさらに含む、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８９．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分をさらに含む、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９０．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分をさらに含む、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９１．３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、項目Ｃ６９からＣ９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分をさらに含まない、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分をさらに含まない、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分をさらに含まない、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９５．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分をさらに含まない、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分をさらに含まない、項目Ｃ６９からＣ８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９７．３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含まない、項目Ｃ６９からＣ９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９８．リピドＡを含まない、項目Ｃ６９からＣ９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９９．多糖が１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ、または５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する、項目Ｃ６９からＣ９８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１００．２０～４０ｋＤａの平均分子量を有する、項目Ｃ６９からＣ９９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１０１．糖が、４０，０００～６０，０００ｋＤａの平均分子量を有する、項目Ｃ６９からＣ１００のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１０２．ｎが３１～９０の整数である、項目Ｃ６９からＣ１０１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１０３．項目Ｃ６９～Ｃ５０のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および担体タンパク質と共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、糖が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、免疫原性組成物。
Ｃ１０４．項目Ｃ６９～Ｃ５０のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および担体タンパク質に共有結合した項目Ｃ６９～Ｃ１０２のいずれか一項に記載の糖を含むコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
Ｃ１０５．項目Ｃ６９～Ｃ５０のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片；および項目Ｃ６９～項目Ｃ１０２のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒バリアント、ジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質、ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される、免疫原性組成物。
Ｃ１０６．担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、項目Ｃ１０３～項目Ｃ１０５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１０７．担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）である、項目Ｃ１０３～項目Ｃ１０５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１０８．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）である、項目Ｃ１０３～項目Ｃ１０５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１０９．コンジュゲートが還元的アミノ化によって調製される、項目Ｃ１０３から項目Ｃ１０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１０．ＣＤＡＰ化学反応によって調製されている、項目Ｃ１０３から項目Ｃ１０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１１．単一末端結合コンジュゲート化糖である、項目Ｃ１０３から項目Ｃ１０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１２．（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ１０３から項目Ｃ１０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１３．糖が（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされ、糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、項目Ｃ１１２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１４．ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合した２～２０個、または４～１６個のリシン残基を含む、項目Ｃ１１２から項目Ｃ１１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１５．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が０．２～４である、項目Ｃ１０３から項目Ｃ１１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１６．糖のタンパク質に対する比が少なくとも０．５であり、最大でも２である、項目Ｃ１０３から項目Ｃ１１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１７．糖のタンパク質に対する比が０．４～１．７である、項目Ｃ１０３から項目Ｃ１１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１８．糖が、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ１１１から項目Ｃ１１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１９．コンジュゲートが、担体タンパク質に共有結合した糖を含み、糖が、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７および式Ｏ１０１（式中、ｎは、１～１０の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ６９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２０．突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および項目Ｃ６９～項目Ｃ１０２のいずれか一項に記載の糖、および薬学的に許容できる希釈剤を含む免疫原性組成物。
Ｃ１２１．突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および項目Ｃ１０３～項目Ｃ１１９のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート、および薬学的に許容できる希釈剤を含む免疫原性組成物。
Ｃ１２２．組成物中の糖の総量と比較して最大でも約２５％の遊離糖を含む、項目Ｃ１２１に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２３．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ１２０から項目Ｃ１２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２４．アルミニウムをさらに含む、項目Ｃ１２０から項目Ｃ１２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２５．ＱＳ－２１をさらに含む、項目Ｃ１２０から項目Ｃ１２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２６．ＣｐＧオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目Ｃ１２０から項目Ｃ１２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２７．アジュバントを含まない、項目Ｃ１２０から項目Ｃ１２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２８．項目Ｃ６９～Ｃ１１８のいずれかに記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む免疫原性組成物であって、多糖が、カルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合により連結されており、担体タンパク質が、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合により連結されている、免疫原性組成物。
Ｃ１２９．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ１２８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１３０．薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１２８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１３１．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ１２８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１３２．突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および多糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、項目Ｃ６９から項目Ｃ８５のいずれか一項に記載の糖を含む免疫原性組成物。
Ｃ１３３．突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および（ｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有的にカップリングしたＯ６抗原のコンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原が式Ｏ２５Ｂ（式中、ｎは３０より大きい整数である）の構造を含む、免疫原性組成物。
Ｃ１３４．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される、項目Ｃ１３３に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１３５．項目Ｃ６９～Ｃ１１８のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、ならびに（ｉ）担体タンパク質に共有結合によりカップリングされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有結合によりカップリングされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有結合によりカップリングされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有結合によりカップリングされたＯ２１抗原のコンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原が、式Ｏ７５（式中、ｎは、３０より大きい整数である）の構造を含む、免疫原性組成物。
Ｃ１３６．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒バリアント、ジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質、ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される、項目Ｃ１３５に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１３７．突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むコンジュゲートを含む免疫原性組成物を作製する方法であって、ａ）有機溶媒において糖を１，１’－カルボニル－ジ－（１，２，４－トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と反応させて、活性化糖を産生するステップ；ｂ）活性化糖をシスタミンもしくはシステアミンまたはそれらの塩と反応させて、チオール化糖を産生するステップ；ｃ）チオール化糖を還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を産生するステップ；ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα－ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖－担体タンパク質コンジュゲートを産生するステップ；ならびにｅ）チオール化糖－担体タンパク質コンジュゲートを（ｉ）活性化担体タンパク質のコンジュゲートされていないα－ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）コンジュゲートされていない遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させ、それによって、ｅＴＥＣ連結糖コンジュゲートが産生され、糖が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、ステップを含み、組換え哺乳動物細胞においてＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを発現させるステップ、および前記ポリペプチドまたはその断片を単離するステップをさらに含む方法。
Ｃ１３８．項目Ｃ６９から項目Ｃ１０２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を作製することを含む、項目Ｃ１３７に記載の方法。
Ｃ１３９．キャッピングステップｅ）が、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）第１のキャッピング試薬としてのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、および／または（ｉｉ）第２のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドとを反応させることを含む、項目Ｃ１３７から項目Ｃ１３８のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ１４０．トリアゾールまたはイミダゾールとの反応によって糖を混合して、混合された糖を提供するステップをさらに含み、ステップａ）の前に、混合された糖がシェル凍結され、凍結乾燥され、有機溶媒中で復元される、項目Ｃ１３７から項目Ｃ１３９のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ１４１．ステップｃ）で生産されたチオール化された多糖の精製をさらに含み、精製ステップが透析濾過を含む、項目Ｃ１３７から項目Ｃ１４０のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ１４２．透析濾過によるｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートの精製をさらに含む、項目Ｃ１３７から項目Ｃ１４１のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ１４３．ステップａ）における有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）およびヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）のいずれか１つ、またはその混合物から選択される極性非プロトン性溶媒である、項目Ｃ１３７から項目Ｃ１４２のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ１４４．培地が、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む、項目Ｃ１３７～項目Ｃ１４２のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ１４５．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するために使用される、項目Ｃ１４４に記載の培地。
Ｃ１４６．培地中で組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養すること；前記培地中で前記細胞を培養することによって前記糖を生産することを含み、それによって、前記細胞が前記糖を産生する、項目Ｃ６９から項目Ｃ１０２のいずれか一項に記載の糖を生産するための方法。
Ｃ１４７．培地が、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１４８．培地が大豆加水分解物を含む、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１４９．培地が酵母抽出物を含む、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１５０．培地が大豆加水分解物および酵母抽出物をさらに含まない、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１５１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択される異種ｗｚｚファミリータンパク質を含む、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１５２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択されるサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｗｚｚファミリータンパク質を含む、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１５３．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、および配列番号１１６のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ１５２に記載の方法。
Ｃ１５４．培養が、１２０ＯＤ６００／ｍＬを超える収率をもたらす、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１５５．糖を精製することをさらに含む、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１５６．精製ステップが、以下のいずれか１つ：透析、濃縮操作、透析濾過操作、接線流濾過、沈降、溶出、遠心分離、沈降、限外濾過、深層濾過、およびカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）を含む、項目Ｃ１４６に記載の方法。
Ｃ１５７．対象に項目Ｃ６９から項目Ｃ１３６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘導するための方法。
Ｃ１５８．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１５９．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＩｇＧ抗体の誘導を含む、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１６０．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性の誘導を含む、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１６１．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体の誘導を含む、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１６２．免疫応答が、初回投与後に少なくとも１，０００～２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１６３．組成物が、式Ｏ２５（式中、ｎは４０～１００の整数である）を含む糖を含み、免疫応答が、初回投与後に少なくとも１，０００～２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１６４．対象が、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿性敗血症、腹腔内感染、髄膜炎、合併肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／幼児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染；肺炎、菌血症、および敗血症から選択される状態のいずれか１つのリスクがある、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１６５．対象が、哺乳動物である、項目Ｃ１５７に記載の方法。
Ｃ１６６．（ｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、または（ｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的である、対象におけるオプソニン貪食作用抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の項目Ｃ６９から項目Ｃ１３６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
Ｃ１６７．対象が尿路感染を発症するリスクがある、項目Ｃ１６６に記載の方法。
Ｃ１６８．対象が菌血症を発症するリスクがある、項目Ｃ１６６に記載の方法。
Ｃ１６９．対象が敗血症を発症するリスクがある、項目Ｃ１６６に記載の方法。
Ｃ１７０．対象に、項目Ｃ６９～項目Ｃ１３６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘導するための方法。
Ｃ１７１．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ１７０に記載の方法。
Ｃ１７２．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体がＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１７０に記載の方法。
Ｃ１７３．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性を有するＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１７０に記載の方法。
Ｃ１７４．ｎが、対応する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）多糖中の反復単位数よりも大きい、項目Ｃ６９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１７５．ｎが３１～１００の整数である、項目Ｃ１７４に記載の組成物。
Ｃ１７６．糖が、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ６、ならびに式Ｏ２５Ｂのいずれか１つに記載の構造を含む、項目Ｃ１７４に記載の組成物。
Ｃ１７７．糖が、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するｗｚｚファミリータンパク質を発現する組換え宿主細胞中で産生される、項目Ｃ１７４に記載の組成物。
Ｃ１７８．タンパク質が、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、および配列番号１１６のいずれか１つを含む、項目Ｃ１７７に記載の組成物。
Ｃ１７９．合成的に合成される、項目Ｃ１７４に記載の糖。
Ｃ１８０．項目Ｃ１～Ｃ５５のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、ならびに（ａ）式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｂ）式Ｏ１Ａ（式中、ｎは、３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｃ）式Ｏ２（式中、ｎは、３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、および（ｄ）式Ｏ６（式中、ｎは、３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
Ｃ１８１．式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８および式Ｏ７５（式中、ｎは３１～９０の整数である）のうちのいずれか１つから選択される構造を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートをさらに含む、項目Ｃ１８０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１８２．組成物中の糖の総量と比較して最大でも約２５％の遊離糖を含む、項目Ｃ１８０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１８３．哺乳動物に、有効量の項目Ｃ１８０からＣ１８２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法。
Ｃ１８４．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、項目Ｃ１８３に記載の方法。
Ｃ１８５．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する、項目Ｃ１８３に記載の方法。
Ｃ１８６．（ａ）項目Ｃ１～Ｃ５５のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドをコードする第１の目的の遺伝子を含む組換え哺乳動物細胞であって、遺伝子が、少なくとも２つの組換え標的部位（ＲＴＳ）の間に組み込まれている、組換え哺乳動物細胞。
Ｃ１８７．２つのＲＴＳが、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内に染色体的に組み込まれている、項目Ｃ１８６に記載の実施形態。
Ｃ１８８．第１の目的の遺伝子が、リポーター遺伝子、発現させるのが困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子またはその組合せをさらに含む、項目Ｃ１８６に記載の実施形態。
Ｃ１８９．（ａ）の遺伝子座とは異なる第２の染色体遺伝子座内に組み込まれている第２の目的の遺伝子をさらに含み、第２の目的の遺伝子が、リポーター遺伝子、発現させるのが困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子またはその組合せを含む、項目Ｃ１８６に記載の実施形態。
Ｃ１９０．ポリヌクレオチド配列が、前記哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる、Ｃ１８６に記載の組換え細胞。
Ｃ１９１．ポリヌクレオチド配列が、細胞中での発現のためにコドン最適化される、Ｃ１８６に記載の組換え細胞。
Ｃ１９２．ヒト胚性腎細胞である、Ｃ１８６に記載の組換え細胞。
Ｃ１９３．ヒト胚性腎細胞が、ＨＥＫ２９３細胞を含む、Ｃ１９２に記載の組換え細胞。
Ｃ１９４．ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３ＴＳ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｅ細胞のいずれか１つから選択される、Ｃ１９３に記載の組換え細胞。
Ｃ１９５．ＣＨＯ細胞である、Ｃ１８６に記載の組換え細胞。
Ｃ１９６．前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、またはＣＨＯ－Ｓ細胞である、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ１９７．ポリペプチドが可溶性である、Ｃ１８６に記載の組換え細胞。
Ｃ１９８．ポリペプチドが細胞から分泌される、Ｃ１８６に記載の組換え細胞。
Ｃ１９９．少なくとも５リットルのサイズである、Ｃ１８６に記載の組換え細胞を含む培養物。
Ｃ２００．ポリペプチドまたはその断片の収率が、少なくとも０．０５ｇ／Ｌである、Ｃ１９９に記載の培養物。
Ｃ２０１．ポリペプチドまたはその断片の収率が、少なくとも０．１０ｇ／Ｌである、Ｃ１９９に記載の培養物。
Ｃ２０２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を生産するための方法であって、好適な条件下でＣ１８６に記載の組換え哺乳動物細胞を培養することによって、ポリペプチドまたはその断片を発現させること；およびポリペプチドまたはその断片を収集することを含む方法。
Ｃ２０３．ポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含む、Ｃ２０２に記載の方法。
Ｃ２０４．Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む、項目Ｃ５４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２０５．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ１に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２０４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２０６．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ２に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２０４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２０７．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ３に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２０４に記載の組成物。
Ｃ２０８．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ５に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２０４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２０９．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ１に由来する糖、およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ２に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２０４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２１０．式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式０１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００、より好ましくは、３１～９０の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む少なくとも１つの糖をさらに含む、項目Ｃ２０４～Ｃ２０９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２１１．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされている；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ２１０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２１２．哺乳動物に、有効量の項目Ｃ２０４からＣ２１１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法。
Ｃ２１３．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、項目Ｃ２１２に記載の方法。
Ｃ２１４．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する、項目Ｃ２１２に記載の方法。
Ｃ２１５．哺乳動物に、有効量の項目Ｃ２０４からＣ２１１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物においてクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を惹起する方法。
Ｃ２１６．免疫応答がクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、項目Ｃ２１５に記載の方法。
Ｃ２１７．免疫応答がクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染から哺乳動物を保護する、項目Ｃ２１５に記載の方法。
Ｃ２１８．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１が、バリアントＯ１Ｖ１またはＯ１Ｖ２を含む、項目Ｃ２０４からＣ２１７のいずれかに記載の組成物および方法。
Ｃ２１９．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ２が、バリアントＯ２Ｖ１またはＯ２Ｖ２を含む、項目Ｃ２０４からＣ２１７のいずれかに記載の組成物および方法。
Ｃ２２０．本明細書に記載の項目Ｃ１からＣ２１９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
Ｃ２２１．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原が、ａ）血清型Ｏ１サブタイプｖ１（Ｏ１ｖ１）、ｂ）血清型Ｏ１サブタイプｖ２（Ｏ１ｖ２）、ｃ）血清型Ｏ２サブタイプｖ１（Ｏ２ｖ１）およびｄ）血清型Ｏ２サブタイプｖ２（Ｏ２ｖ２）からなる群から選択される、項目Ｃ２１１に記載の組成物。
Ｃ２２２．項目Ｃ１～Ｃ２２１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸。
Ｃ２２３．ＲＮＡである、項目Ｃ２２２に記載の核酸。
Ｃ２２４．項目Ｃ２２２またはＣ２２３に記載の核酸を含むナノ粒子。
Ｃ２２５．式Ｏ４、式Ｏ１１、式Ｏ１３、式Ｏ２１および式Ｏ８６（式中、ｎは、１～１００、好ましくは、３１～９０の整数である）からなる群から選択される糖を有する１つまたは複数のコンジュゲートをさらに含む、本発明の免疫原性組成物。
Ｃ２２６．式Ｏ１ａ、式Ｏ２、式Ｏ６および式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは、１～１００、好ましくは、３１～９０の整数である）からなる群から選択される糖を有する１つまたは複数のコンジュゲートをさらに含む、本発明の免疫原性組成物。

Claims (23)

  1. 野生型ＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列と比べた少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む、突然変異したＦｉｍＨポリペプチドであって、突然変異位置が、Ｆ１、Ｐ１２、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１６、Ａ１８、Ｐ２６、Ｖ２７、Ｖ２８、Ｑ３２、Ｎ３３、Ｌ３４、Ｖ３５、Ｒ６０、Ｓ６２、Ｙ６４、Ｇ６５、Ｌ６８、Ｆ７１、Ｔ８６、Ｌ１０７、Ｙ１０８、Ｌ１０９、Ｖ１１２、Ｓ１１３、Ａ１１５、Ｇ１１６、Ｖ１１８、Ａ１１９、Ａ１２７、Ｌ１２９、Ｑ１３３、Ｆ１４４、Ｖ１５４、Ｖ１５５、Ｖ１５６、Ｐ１５７、Ｔ１５８、Ｖ１６３およびＶ１８５からなる群から選択され、アミノ酸位置が、配列番号５９に従ってナンバリングされる、突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
  2. Ｆ１Ｉ；Ｆ１Ｌ；Ｆ１Ｖ；Ｆ１Ｍ；Ｆ１Ｙ；Ｆ１Ｗ；Ｐ１２Ｃ；Ｇ１４Ｃ；Ｇ１５Ａ；Ｇ１５Ｐ；Ｇ１６Ａ；Ｇ１６Ｐ；Ａ１８Ｃ；Ｐ２６Ｃ；Ｖ２７Ａ；Ｖ２７Ｃ；Ｖ２８Ｃ；Ｑ３２Ｃ；Ｎ３３Ｃ；Ｌ３４Ｃ；Ｌ３４Ｎ；Ｌ３４Ｓ；Ｌ３４Ｔ；Ｌ３４Ｄ；Ｌ３４Ｅ；Ｌ３４Ｋ；Ｌ３４Ｒ；Ｖ３５Ｃ；Ｒ６０Ｐ；Ｓ６２Ｃ；Ｙ６４Ｃ；Ｇ６５Ａ；Ｌ６８Ｃ；Ｆ７１Ｃ；Ｔ８６Ｃ；Ｌ１０７Ｃ；Ｙ１０８Ｃ；Ｌ１０９Ｃ；Ｖ１１２Ｃ；Ｓ１１３Ｃ；Ａ１１５Ｖ；Ｇ１１６Ｃ；Ｖ１１８Ｃ；Ａ１１９Ｃ；Ａ１１９Ｎ；Ａ１１９Ｓ；Ａ１１９Ｔ；Ａ１１９Ｄ；Ａ１１９Ｅ；Ａ１１９Ｋ；Ａ１１９Ｒ；Ａ１２７Ｃ；Ｌ１２９Ｃ；Ｑ１３３Ｋ；Ｆ１４４Ｃ；Ｖ１５４Ｃ；Ｖ１５６Ｃ；Ｐ１５７Ｃ；Ｔ１５８Ｃ；Ｖ１６３Ｉ；およびＶ１８５Ｉ、またはこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を含む、請求項１に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
  3. ａ）突然変異Ｇ１５ＡおよびＧ１６Ａ；
    ｂ）突然変異Ｐ１２ＣおよびＡ１８Ｃ；
    ｃ）突然変異Ｇ１４ＣおよびＦ１４４Ｃ；
    ｄ）突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ３５Ｃ；
    ｅ）突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ１５４Ｃ；
    ｆ）突然変異Ｐ２６ＣおよびＶ１５６Ｃ；
    ｇ）突然変異Ｖ２７ＣおよびＬ３４Ｃ；
    ｈ）突然変異Ｖ２８ＣおよびＮ３３Ｃ；
    ｉ）突然変異Ｖ２８ＣおよびＰ１５７Ｃ；
    ｊ）突然変異Ｑ３２ＣおよびＹ１０８Ｃ；
    ｋ）突然変異Ｎ３３ＣおよびＬ１０９Ｃ；
    ｌ）突然変異Ｎ３３ＣおよびＰ１５７Ｃ；
    ｍ）突然変異Ｖ３５ＣおよびＬ１０７Ｃ；
    ｎ）突然変異Ｖ３５ＣおよびＬ１０９Ｃ；
    ｏ）突然変異Ｓ６２ＣおよびＴ８６Ｃ；
    ｐ）突然変異Ｓ６２ＣおよびＬ１２９Ｃ；
    ｑ）突然変異Ｙ６４ＣおよびＬ６８Ｃ；
    ｒ）突然変異Ｙ６４ＣおよびＡ１２７Ｃ；
    ｓ）突然変異Ｌ６８ＣおよびＦ７１Ｃ；
    ｔ）突然変異Ｖ１１２ＣおよびＴ１５８Ｃ；
    ｕ）突然変異Ｓ１１３ＣおよびＧ１１６Ｃ；
    ｖ）突然変異Ｓ１１３ＣおよびＴ１５８Ｃ；
    ｗ）突然変異Ｖ１１８ＣおよびＶ１５６Ｃ；
    ｘ）突然変異Ａ１１９ＣおよびＶ１５５Ｃ；
    ｙ）突然変異Ｌ３４ＮおよびＶ２７Ａ；
    ｚ）突然変異Ｌ３４ＳおよびＶ２７Ａ；
    ａａ）突然変異Ｌ３４ＴおよびＶ２７Ａ；
    ａｂ）突然変異Ｌ３４ＤおよびＶ２７Ａ；
    ａｃ）突然変異Ｌ３４ＥおよびＶ２７Ａ；
    ａｄ）突然変異Ｌ３４ＫおよびＶ２７Ａ；
    ａｅ）突然変異Ｌ３４ＲおよびＶ２７Ａ；
    ａｆ）突然変異Ａ１１９ＮおよびＶ２７Ａ；
    ａｇ）突然変異Ａ１１９ＳおよびＶ２７Ａ；
    ａｈ）突然変異Ａ１１９ＴおよびＶ２７Ａ；
    ａｉ）突然変異Ａ１１９ＤおよびＶ２７Ａ；
    ａｊ）突然変異Ａ１１９ＥおよびＶ２７Ａ；
    ａｋ）突然変異Ａ１１９ＫおよびＶ２７Ａ；
    ａｌ）突然変異Ａ１１９ＲおよびＶ２７Ａ；
    ａｍ）突然変異Ｇ１５ＡおよびＶ２７Ａ；
    ａｎ）突然変異Ｇ１６ＡおよびＶ２７Ａ；
    ａｏ）突然変異Ｇ１５ＰおよびＶ２７Ａ；
    ａｐ）突然変異Ｇ１６ＰおよびＶ２７Ａ；
    ａｑ）突然変異Ｇ１５Ａ、Ｇ１６ＡおよびＶ２７Ａ；
    ａｒ）突然変異Ｇ６５ＡおよびＶ２７Ａ；
    ａｓ）突然変異Ｖ２７ＡおよびＱ１３３Ｋ；ならびに
    ａｔ）突然変異Ｇ１５Ａ、Ｇ１６Ａ、Ｖ２７ＡおよびＱ１３３Ｋ
    からなる群から選択される突然変異を含む、請求項２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
  4. 配列番号２～５８および６０～６４のうちいずれか１つの配列を含む、請求項２に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
  5. 単離されている、請求項１から４のいずれかに記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
  6. （ｉ）請求項１から４のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド、および（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
  7. 請求項１から４のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを含む免疫原性組成物。
  8. 少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
  9. 少なくとも１つの追加の抗原が、多糖またはタンパク質である、請求項８に記載の免疫原性組成物。
  10. 少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
  11. 請求項１から４のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  12. 免疫原性である、請求項１から４のいずれかに記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチド。
  13. 請求項１から４のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞。
  14. 請求項１３に記載の組換え細胞を含む培養物であって、少なくとも５リットルのサイズである培養物。
  15. 請求項１から４のいずれか一項に記載の突然変異したＦｉｍＨポリペプチドを産生するための方法であって、好適な条件下で請求項１３に記載の組換え哺乳動物細胞を培養し、これにより、ポリペプチドを発現させること；およびポリペプチドを収集することを含む方法。
  16. （ｉ）腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する対象における免疫応答を誘導するための、または（ｉｉ）腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的な対象におけるオプソニン貪食作用および／もしくは中和抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の請求項６から１０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  17. 対象が、尿路感染を発症するリスクがある、請求項１６に記載の方法。
  18. 対象が、菌血症を発症するリスクがある、請求項１６に記載の方法。
  19. 対象が、敗血症を発症するリスクがある、請求項１６に記載の方法。
  20. 哺乳動物に、有効量の請求項６から１０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法。
  21. 免疫応答が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用および／または中和抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 免疫応答が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する、請求項２０に記載の方法。
  23. 対象に、免疫学的有効量の請求項６から１０のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、対象における細菌感染、疾患または状態を防止、処置または改善する方法。

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