KR20220128372A - Fimh 돌연변이체, 이를 갖는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

FimH 렉틴 도메인이 만노스에 대해 저친화도 입체형태가 되도록 하는 아미노산 돌연변이를 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 기재된다. 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물, 및 폴리펩타이드의 투여에 의해 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 추가로 기재된다.

Description

FIMH 돌연변이체, 이를 갖는 조성물 및 이의 용도

본 발명은 의약 미생물학, 면역학 및 백신 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 FimH 렉틴 도메인이 만노스에 대해 저친화도를 갖는 입체형태가 되도록 하는 아미노산 돌연변이를 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하고 대상체에 투여할 시 방광 상피 세포에 대한 이. 콜라이(E. coli) 접착의 고수준 항체-매개 억제를 유도하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 및 면역원성 폴리펩타이드의 투여에 의해 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법에 관한 것이다.

장외 감염의 원인인 이. 콜라이 균주는 장 질환을 야기하는 것들과 유전적으로 구별되며 장외 병원성 이. 콜라이(ExPEC)로 명명되어 있다. ExPEC는 보행 가능, 장기 케어, 및 병원 환경에서 장외 감염을 야기하는 가장 일반적인 장 그람-음성 유기체이다. 이. 콜라이로 인한 전형적인 장외 감염에는 요로 감염(UTI), 다양한 복강내 감염(IAI), 폐렴, 수술 부위 감염, 수막염, 혈관내 장치 감염, 골수염, 및 연조직 감염이 포함되며, 이는 모두 균혈증을 동반할 수 있다. 이. 콜라이는 중증 패혈증의 주요 원인이며 높은 이환률 및 사망률의 원인이다.

엔테로박테리아과의 다른 구성원으로서의 ExPEC는 I형 섬모를 생성하고, 이는 점막 상피 표면으로의 부착을 보조한다. 이들 I형 섬모는 엔테로박테리아과의 표면 구성원으로부터 발산되는 털-모양 구조이다. I형 섬모의 주요 구성성분은, 오른쪽 방향 나선으로 배열되어, 중앙 축 구멍을 가지며 대략 길이 1 μm 및 지름 7 nm의 필라멘트를 형성하는 FimA의 반복 서브유닛이다(Brinton, 1965). 주요 서브유닛으로서의 FimA와 함께, 섬모 필라멘트는 FimF, FimG 및 FimH도 소량 단백질 서브유닛으로서 함유한다. 소량 단백질 서브유닛 FimH는 진핵 세포 표면 상의 만노스-함유 당단백질에 대한 I형-섬모체 박테리아의 접착을 촉진하는 만난-결합 부착소(adhesin)이며, 만난 및 파이브로넥틴을 포함하는 다양한 표적에 결합하는 단백질 패밀리를 나타낸다. 면역 전자 현미경 연구는 FimH가 I형 섬모의 원위 선단(distal tip)에 전략적으로 배치된다는 것을 밝혀냈고, 여기서 이는 FimG와 복합체화되어 가요성 피브릴룸(fibrillum) 구조를 형성하는 것으로 나타나고, 또한 필라멘트를 따라 다양한 간격을 두고 길이방향으로 배치된다.

FimH 부착소 단백질은 UTI에 대해 다양한 전임상 모델에서 백신으로 사용되는 경우 보호를 유도하는 것으로 나타났다(Langermann S, et al., 1997, Science, 276: 607-611; Langermann S, et al., 2000, J Infect Dis, 181: 774-778; O'Brien VP et al., 2016, Nat Microbiol, 2:16196). 1999년에, Medimmune은 FimH-함유 서브유닛 백신을 II상 시험으로 끌고갔으나, 백신 개발은 UTI 방지에서의 유효성 부재로 2003년에 중단되었다(예를 들어, 문헌[Brumbaugh AR and Mobley HLT, 2012, Expert Rev Vaccines, 11: 663-676] 참고). 그럼에도 불구하고, Sequoia Sciences사는 재발성 UTI에 대한 백신을 현재 임상 개발 중인 것으로 나타나 있으며, 이 백신은, FimC 단백질과 복합체화되고 새로운 아주반트 제형과 조합된 FimH 단백질로 구성된다. 이 회사는 이 백신이 고도로 면역원성이며 잘-관용되었고, UTI의 빈도를 감소시킬 수 있다고 보고하였지만, 여전히 안전성 및 유효성이 확립될 필요가 있다(https://www.sequoiasciences.com/uti-vaccine-program).

이. 콜라이 감염 동안, 만노실화 수용체에 결합하는, 부착소 FimH의 렉틴 도메인은 다음의 2개의 구별되는 입체형태를 취할 수 있는 것으로 나타났다: 만노스에 대해 저-친화도(긴장) 및 만노스에 대해 고-친화도(연신/이완)(Kalas et al, 2017, Sci Adv 10;3(2)). 저친화도 입체형태는 박테리아 운동성 및 새로운 조직의 집락화를 촉진한다. 고-친화도 입체형태는 소변 배출의 기계력 하에 탄탄한 박테리아 접착을 보장한다(상기 문헌[Kalas et al, 2017]). 또한, 저-친화도 변이체에 대한 항체는 요로상피 세포에 대한 박테리아 결합을 차단하고 방광에서의 CFU 수를 감소시키는 것으로 나타났다(Tchesnokoca, 2011 Infect Immun. 79(10):3895-904; Kisiela, 2013 Proc Natl Acad Sci, 19;110(47):19089-94).

WO02102974는 모두 분자의 협곡 영역에 아미노산 변형을 포함하는 여러 FimH 돌연변이체를 기재한다. 구체적으로, WO02102974는 결합 포켓에서 만노스 상호작용 잔기가 돌연변이되는 변이체를 기재한다. 돌연변이의 이러한 위치는, 이것이 보다 개방된 입체형태로 FimH 돌연변이체를 유지하고 이에 의해 야생형 단백질에서 접근 가능성이 불량한 에피토프를 노출시킬 것이므로 선택된다. 그러나, 현재까지, 본 발명자들이 아는 한, 이들 돌연변이체 중 어느 것도 백신 후보로서 추가로 추진된 적은 없다. 임상 시험에서는, 야생형 FimH만 사용되었다.

따라서, 당분야에는, 이. 콜라이에 의해 야기된 박테리아 감염에 대해 고도로 억제성인 항체를 유도할 수 있는 백신에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

제1 양태에서, 본 발명은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하며, FimH 렉틴 도메인은 SEQ ID NO: 1에서 위치 144에 대응하는 위치에 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함한다.

제2 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 전장-FimH 폴리펩타이드 및 FimC를 포함하는 복합체(FimCH)를 제공한다.

제3 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

제4 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 복합체 또는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

제5 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 복합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 제공한다.

제6 양태에서, 본 발명은 엔테로박테리아과의 박테리아에 대한 면역 반응 유도에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 복합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 엔테로바실러스(enterobacillus)-관련 질병의 치료 및 방지를 필요로 하는 대상체에서 엔테로바실러스-관련 질병을 치료하거나 방지하는 방법으로서, 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

제6 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.

제7 양태에서 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명의 벡터를 함유하는 재조합 세포로부터 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 임의로 방법은 폴리펩타이드를 회수하는 단계, 그 후 임의로 폴리펩타이드의 약학 조성물로의 제형화를 추가로 포함한다.

도 1: 상이한 FimH 변이체에 의해 유도된 FimH 혈청 항체(총 IgG) 수준. 위스타 래트(n = 2)는 비-프로인드 아주반트(스피디(Speedy)-래트 모델, Eurogentec)와 조합된 60 ug/용량의 상이한 FimH 변이체로 제0일, 제7일, 제10일 및 제18일에 4회 근육내 면역화를 제공받았다. 항-FimH 항체 수준은 면역화-전(제0일, 비어있는 원) 및 면역화-후(제28일, 채워진 원) ELISA에 의해 측정되었다. 데이터는 2마리 동물/군으로부터의 이중 혈청 샘플의 평균을 나타낸다. 항체 역가(EC50)는 12-단계 희석 곡선 상에 피팅된 4-파라미터 로지스틱 회귀 모델에 기반하여 계산되었다.

본 발명은 본원에서 '저친화도 입체형태'로도 지칭되는, 만노스에 대해 저친화도를 갖는 입체형태로 "잠긴", FimH 렉틴 도메인을 포함하는 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 부분적으로 만노스 입체형태에 대해 저친화도인 FimH 항원이 만노시드-매개 접착을 억제할 수 있는 항체를 유도할 수 있다는 관찰에 기반한다. 이들 항체는 고도로 억제성이며 박테리아 감염의 방지 또는 치료에서 증강된 효과를 갖는다. 본원에서는 F144V 돌연변이를 갖는 FimH 렉틴 도메인은 놀랍게도 이를 UTI에 대한, 예를 들어 재발성 UTI를 방지하거나 감소시키기 위한 백신에서 사용하기 매우 적합하게 만드는 요망되는 특성의 우수한 조합을 가짐이 확인되었다.

따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 면역원성 폴리펩타이드를 제공하며, FimH 렉틴 도메인은 SEQ ID NO: 1에서 위치 144에 대응하는 위치에 발린(V), 이소류신(I), 류신(L) 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함한다.

아미노산 위치 144는 SEQ ID NO: 1의 FimH 렉틴 도메인의 참조 아미노산 서열에서의 위치 144를 나타낸다. SEQ ID NO: 1 이외의 본 발명의 아미노산 서열에서, 바람직하게는, 아미노산 위치 144는 바람직하게는 디폴트 설정을 사용하여 ClustalW(1.83) 서열 정렬에서, SEQ ID NO: 1의 위치 144에 대응하는 아미노산 위치에 존재한다. 당업자는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 아미노산 서열 정렬 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO: 1 이외의 FimH 렉틴 도메인 아미노산 서열에서 대응하는 아미노산 위치를 어떻게 확인하는지 알 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 FimH 렉틴 도메인이 만노스 입체형태에 대해 저친화도이도록 하는 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1에서 위치 144에 대응하는 위치에서 돌연변이되었다. 돌연변이는 단일 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환 중 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 단일 아미노산 잔기의 치환이다. 돌연변이는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 위치 144에 대응하는 아미노산 잔기의 치환이다. 바람직하게는, 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 위치 144에 대응하는 위치에서 페닐알라닌(F) 아미노산 잔기의 치환이다. 본 발명의 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에서, SEQ ID NO: 1의 위치 144에 대응하는 위치는 바람직하게는 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 이러한 맥락에서 용어 '돌연변이', '돌연변이된' 또는 '치환', '치환된'은 또 다른 아미노산이, 본원에서 위치 144에 F를 갖는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드인, 대응하는 모체 분자에서 나타낸 위치 상에 존재함을 의미한다. 이러한 모체 분자는 폴리펩타이드로서 또는 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 형태로 물리적으로 존재할 수 있을 뿐만 아니라, 단순히 인 실리코(in silico) 또는 종이 상에서 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열을 인코딩하는 대응하는 핵산 서열로 존재할 수 있다. 따라서 이러한 맥락에서 돌연변이 또는 치환은, 또한, 예를 들어 대응하는 모체 분자를 인코딩하는 핵산이 공정 동안 처음에 실제 제조되지 않았더라도, 예를 들어 핵산 분자가 전적으로 화학적 합성에 의해 제조되었더라도, 단백질이 돌연변이 또는 치환을 인코딩하도록 합성된 핵산으로부터 발현되는 경우, 존재하는 것으로 간주된다.

하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 위치 144에 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환을 포함한다. 소정 구현예에서, 본 발명의 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 위치 144에 발린을 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드이다. 소정 구현예에서, 본 발명의 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 자연 발생 페닐알라닌 대신 위치 144에 발린을 갖는다.

하나의 구현예에서, FimH 렉틴 도메인은 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게는, FimH 렉틴 도메인은 본 발명의 FimH 렉틴 도메인에 있어서 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 또는 알라닌(A)에 의해 치환되는 위치 144를 제외하고, SEQ ID NO: 1을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

전장 FimH(FimH_FL)는 2개의 도메인으로 이루어진다: 짧은 테트라-펩타이드 루프 링커에 의해 C-말단 필린 도메인(FimH_PD)에 연결된 N-말단 렉틴 도메인(FimH_LD). 본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 FimH 필린 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 전장 FimH 폴리펩타이드이며, FimH 렉틴 도메인은 SEQ ID NO: 1에서 위치 144에 대응하는 위치에 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함한다.

하나의 구현예에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 전장 FimH이다. 바람직하게는, 전장 FimH 폴리펩타이드는 본원에서 기재된 바와 같은 F144V 치환을 제외하고, SEQ ID NO: 2를 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4 또는 바람직하게는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 전장 FimH이다. 바람직하게는, 전장 FimH 폴리펩타이드는 본원에서 기재된 바와 같은 F144V 치환을 제외하고, SEQ ID NO: 4를 갖는 서열 또는 보다 바람직하게는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300을 포함할 수 있다.

소정 구현예에서, 폴리펩타이드는 그 전체가 본원에 포함되는 US6,737,063에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO: 23 내지 45 및 55와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 전장 FimH이다.

FimH 폴리펩타이드는 다양한 이. 콜라이 균주 간에 고도로 보존되어 있을 뿐만 아니라, 광범위한 그람-음성 박테리아 중에 고도로 보존되어 있다. 또한, 균주 간에 발생하는 아미노산 변화는 일반적으로 유사한 아미노산 위치에서 생긴다. 이. 콜라이 균주 간 FimH의 고도 보존의 결과, 하나의 균주로부터의 FimH 폴리펩타이드는 FimH 렉틴에 의해 세포에 다른 이. 콜라이 균주가 결합하는 것을 억제하거나 방지하는 항체 반응을 유도할 수 있고/있거나 다른 이. 콜라이 균주에 의해 야기되는 감염에 대한 보호 및/또는 치료를 제공한다. 따라서, 하나의 구현예에서 전장 FimH는 SEQ ID NO: 5, 또는 바람직하게는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 전장 FimH 폴리펩타이드는 본원에서 기재된 바와 같은 F144V 치환을 제외하고, SEQ ID NO: 5를 갖는 서열 또는 보다 바람직하게는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 전장 FimH는 SEQ ID NO: 6과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 전장 FimH 폴리펩타이드는 본원에서 기재된 바와 같은 F144V 치환을 제외하고, SEQ ID NO: 6을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "원형질막주위 샤페론"은 공통 결합 에피토프(또는 에피토프들)의 인식을 통해 다양한 샤페론-결합 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 박테리아의 원형질막주위에 편재된 단백질로 정의된다. 샤페론은 박테리아 세포로부터 원형질막주위 내로 외수송된 단백질이 이의 천연 입체형태로 폴딩되는 주형으로 작용한다. 샤페론과 샤페론-결합 단백질의 회합은 또한 결합 단백질을 원형질막주위 내에 편재된 프로테아제에 의한 분해로부터 보호하고, 수용액 중 이의 용해도를 증가시키고, 이의 어셈블링 섬모로의 순차적이고 정확한 혼입을 야기하는 작용을 한다. 샤페론 단백질은 이러한 어셈블리의 매개에 의한 섬모의 어셈블리에 관여되지만 구조 내로 혼입되지 않는, 그람-음성 박테리아에서의 단백질의 한 클래스이다. FimC는 FimH의 원형질막주위 샤페론 단백질이다. FimC는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 소정 구현예에서, FimC는 그 전체가 본원에 포함되는 US6,737,063에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO: 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. FimC 및 FimH의 비-공유 복합체는 FimCH로 명명된다.

따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하고 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 필린 도메인 또는 전장 FimH 및 FimC를 추가로 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 복합체를 제공한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 FimH 필린 도메인을 추가로 포함하며, FimC와 복합체화되어 FimCH 복합체를 형성한다.

본 출원의 발명자들은 상이한 아미노산 변화를 갖는 몇몇 FimH 렉틴 도메인 변이체를 생성하였고 다양한 검정에서의 유효성에 대해 이를 시험하였다(실시예 참고). 놀랍게도, 렉틴 도메인 돌연변이를 갖는 시험된 모든 FimH 단백질이, 요망되는 특성을 갖는, 즉 충분한 순도(단백질 농도 및 순도의 정도), 온전성 및 기능성을 갖는 FimCH 복합체로 혼입될 수 있는 것은 아니었다.

SEQ ID NO: 1에서 위치 144에 대응하는 위치에 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는, 본원에서 기재된 FimH 렉틴 도메인은 요망되는 특성을 갖는 FimCH 복합체를 형성할 수 있었다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 전장 FimH이며, FimC와 복합체화되어 FimCH 복합체를 형성한다. 그 최종 형태의 전장 FimH에는 전형적으로, 예를 들어 SEQ ID NO: 4 및 5의 아미노산 1 내지 21로 나타나는 신호 펩타이드가 포함되지 않으며, 즉 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 전장 FimH는 이들 서열의 아미노산 22 내지 300을 포함하는 한편, 전형적으로 이의 아미노산 1 내지 21을 결여하는 것으로 이해된다. 전장 FimH의 재조합 제조를 위해, 폴리펩타이드의 원형질막주위 위치로 이어지는 일반 분비 경로를 통해 내(세포질)막을 가로지르는 수송(때때로 '원형질막주위 발현'으로 지칭됨)을 얻기 위해, 재조합 숙주 세포에서는 신호 펩타이드를 포함하지만 최종 FimH 폴리펩타이드에서는 단리되는 FimH를 인코딩하는 것이 유용하며, 예를 들어 약학 조성물에서 사용되는 경우, 폴리펩타이드를 발현하고 있는 재조합 세포에 의한 가공의 결과, 신호 펩타이드는 전형적으로 더 이상 존재하지 않는다.

보다 바람직한 구현예에서, FimCH 복합체는 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 적어도 약 100% 서열 동일성을 갖는 FimC 단백질, 및 SEQ ID NO: 1에서 위치 144에 대응하는 위치에 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는 렉틴 도메인을 포함하는 FimH 단백질을 포함하거나 이로 구성된다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, FimCH 복합체는 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 적어도 약 100% 서열 동일성을 갖는 FimC 단백질, 및 렉틴 도메인에 F144V 치환을 포함하는 FimH 단백질, 또는 F165V 치환을(예를 들어 여전히 신호 펩타이드가 포함되는 SEQ ID NO: 4 또는 5에) 포함하는 전장 FimH 단백질을 포함하거나 이로 구성된다. 여전히 신호 펩타이드가 포함될 전장 FimH에서 아미노산 위치 165는 FimH 렉틴 도메인에서의 아미노산 위치 144에 대응한다. 당업자는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 아미노산 서열 정렬 알고리즘을 사용하여 전장 FimH 아미노산 서열 및 FimH 렉틴 도메인 아미노산 서열에서 대응하는 아미노산 위치를 어떻게 확인하는지 알 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 이. 콜라이 샤페론 FimC 및 FimH 렉틴 도메인 변이체를 포함하는 복합체는 재조합 세포로부터, FimC와 더불어 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인 변이체 폴리펩타이드를 공동-발현함으로써 형성될 수 있다.

하나의 구현예에서, FimCH 복합체는 하나의 박테리아 균주로부터 기원하는 FimC를 포함하는 반면 FimH는 상이한 박테리아 균주로부터 기원한다. 또 다른 구현예에서, FimCH 복합체는 FimC 및 FimH(이들 둘 모두는 동일한 박테리아 균주로부터 기원함)를 포함한다. 소정 구현예에서, FimH 또는 FimC 또는 FimH와 FimC 둘 모두는 자연에 존재하는 실제 박테리아 단리물로부터가 아닌 인공 서열일 수 있고, 예를 들어 이들은 또한 공통 서열 또는 천연 단리물의 조합에 기반할 수 있다.

하나의 구현예에서, FimCH 복합체는 His-태그를 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 전장 FimH가 His-태그를 포함하거나, 본원에서 기재된 바와 같은 FimC가 His-태그를 포함한다. 바람직하게는, FimCH 복합체에서, FimC는 His-태그를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 His-태그는 히스티딘(His) 잔기, 예를 들어 6개 His 잔기의 연신물이며, 이는 내부적으로 또는 바람직하게는 단백질의 N- 또는 C-말단에 부가될 수 있다. 이러한 태그는 정제의 용이성을 위한 잘 알려진 용도를 갖는다.

추가 양태에서, 본 발명은 본원에서 상기 정의된 바와 같은 FimH 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드에는 이에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 선행될 수 있다. 소정 구현예에서, 프로모터는 FimH 코딩 서열에 대해 내인성이다. 소정 구현예에서, 프로모터는 엔테로박테리아과의 박테리아에서 FimH의 발현을 유도하는 내인성 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 FimH 코딩 서열에 대해 이종성이며, 예를 들어 재조합 발현 시스템에서 사용하기 위한, 당업자에게 알려진 강력한 프로모터가 사용된다. 예를 들어, 유도성 Lac 프로모터를 포함하는 pET-DUET 벡터가 FimH 및/또는 FimC 발현을 위해 사용될 수 있다. 유도성 프로모터의 경우, IPTG가 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 그 천연 환경으로부터 단리된다. 소정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리펩타이드는 재조합, 합성 또는 인공 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA의 임의의 형태일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 FimH 인코딩 폴리뉴클레오타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 그 5'-단부 및/또는 3'-단부에서 자연 발생 FimH-인코딩 폴리뉴클레오타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다. 인코딩된 성숙 FimC 및/또는 FimH의 서열에는 바람직하게는 각각의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드에 신호 펩타이드가 선행될 수 있고, 신호 펩타이드는 각각 FimC 및/또는 FimH 폴리펩타이드에 대한 내인성 신호 펩타이드(즉, 이들 단백질에 대한, 자연에서 발생하는 신호 펩타이드)일 수 있거나, 이들은 이종성 신호 펩타이드, 즉 다른 단백질로부터의 신호 펩타이드 또는 합성 신호 펩타이드일 수 있다. 신호 펩타이드는 원형질막주위 발현에 유용하지만, 전형적으로 절단 제거되며, 최종적으로 생성되고 정제된 FimC 및/또는 FimH 각각에 존재하지 않는다.

요구되는 경우 및/또는 요망되는 경우, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 약학적으로 허용 가능한 담체를 첨가함으로써 약학적으로 활성인 혼합물 내로 포함될 수 있다.

따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인 또는 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 (약학) 조성물은 담체, 충전제, 보존제, 가용화제 및/또는 희석제가 포함되는 임의의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도, 특히 주사제 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌["Remington's pharmaceutical sciences," XIII ed. Editor-in-Chief Eric W. Martin. Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2013]에 기재된다.

소정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 완충액, 예를 들어, 트리스-완충 식염수, 인산염 완충액, 및 수크로스 포스페이트 글루타메이트 완충액을 추가로 포함한다.

소정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 염, 예를 들어, 트리스-하이드로클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 포스페이트, 모노나트륨 글루타메이트, 및 알루미늄 염(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 칼륨 알루미늄 설페이트, 또는 이러한 알루미늄 염의 혼합물)을 추가로 포함한다.

본 발명의 조성물은 조성물이 투여되는 숙주에서 면역 반응을 유발하기 위해 사용될 수 있다(즉, 면역원성이다). 따라서, 본 발명의 조성물은 엔테로박테리아과의 박테리아에 의해 야기된 감염에 대한, 바람직하게는 클렙시엘라(Klebsiella), 보다 바람직하게는 이. 콜라이에 의해 야기된 감염에 대한 백신으로 사용될 수 있고, 이에 따라 백신에서 사용하기 적합한 임의의 추가 구성성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물의 추가 구성성분은 본원에서 기재된 바와 같은 아주반트이다.

소정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 보존제, 예컨대 페놀, 벤제토늄 클로라이드, 2-페녹시에탄올, 또는 티메로살을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 (약학) 조성물은 0.001% 내지 0.01% 보존제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 (약학) 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.

소정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체로의 의도된 투여 경로에 적합하게 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 피하, 비경구, 경구, 피내, 경피, 결장직장, 복강내, 질내, 또는 직장 투여에 적합하게 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 정맥내, 경구, 협측, 복강내, 비강내, 기관내, 피하, 근육내, 국소, 피내, 경피 또는 폐 투여, 바람직하게는 근육내 투여를 위해 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

소정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 사용 전에 보관될 수 있으며, 예를 들어, 조성물은 냉동 보관되거나(예를 들어, 약 -20℃ 또는 약 -70℃에서); 냉장 조건에서 보관되거나(예를 들어, 약 2 내지 8℃, 예를 들어 약 4℃에서); 실온에서 보관될 수 있다. 대안적으로, 구성성분 (i), (ii), 및 (iii) 중 하나 이상을 포함하는 별도 조성물이 보관되고, 사용 전에 (i), (ii) 및 (iii) 3개 모두를 포함하는 백신 조합 조성물로 혼합될 수 있다. 또 다른 대안에서, 별도 조성물이 조합 투여 일정에서 제공된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 하나 이상의 다당류를 포함하는 조성물과 함께 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조성물은, 예를 들어 그 전체가 본원에 포함되는 WO2019/175145에 기재된 것과 같은, 담체 단백질에 공유 결합된 이. 콜라이 O-항원 다당류의 하나 이상의 바이오콘주게이트를 포함한다.

하나의 구현예에서, 본원에서 본 발명의 약학 조성물은 아주반트를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아주반트"는 본 발명의 조성물과 함께 또는 이의 일부로 투여되는 경우 FimH에 대한 면역 반응을 강화하고/하거나, 증강시키고/시키거나 부스팅하는 화합물을 나타내지만, 아주반트 화합물은 단독으로 투여되는 경우 콘주게이트 및/또는 FimH에 대한 면역 반응을 생성하지 않는다. 아주반트는, 예를 들어 림프구 모집, B 및/또는 T 세포의 자극, 그리고 항원 제시 세포의 자극을 포함하는 몇몇 기전에 의해 면역 반응을 증강시킬 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 아주반트를 포함하거나, 이와 조합되어 투여된다. 본 발명의 조성물과의 조합 투여를 위한 아주반트는 면역원성 조성물의 투여 전에, 이와 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 FimH 및 아주반트는 단일 조성물 형태로 투여된다.

아주반트의 구체예에는 비제한적으로 알루미늄 염(알룸)(예컨대 알룸 또는 나노알룸 제형을 포함하는 나노입자를 포함하는, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트, 및 알루미늄 옥사이드), 칼슘 포스페이트(예를 들어 문헌[Masson JD et al, 2017, Expert Rev Vaccines 16: 289-299]), 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(예를 들어, 영국 특허 GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919 참고), AS01, AS02, AS03 및 AS04(모두 GlaxoSmithKline; 예를 들어 AS04에 대해 EP1126876, US7357936, AS02에 대해 EP0671948, EP0761231, US5750110 참고), 이미다조피리딘 화합물(WO2007/109812 참고), 이미다조퀴녹살린 화합물(WO2007/109813 참고), 델타-이눌린(예를 들어 문헌[Petrovsky N and PD Cooper, 2015, Vaccine 33: 5920-5926]), STING-활성화 합성 사이클릭-디-뉴클레오타이드(예를 들어 US20150056224), 레시틴과 카보머 동종중합체의 조합(예를 들어 US6676958), 및 사포닌, 예컨대 Quil A 및 QS21이, 임의로 QS7과의 조합으로(문헌[Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US 5,057,540] 참고) 포함된다(문헌[Zhu D and W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113] 참고). 일부 구현예에서, 아주반트는 프로인드 아주반트(완전 또는 불완전)이다. 소정 구현예에서, 아주반트는 예를 들어 Brenntag(현재 Croda) 또는 Invivogen으로부터 상업적으로 입수 가능한 것과 같은 Quil-A를 포함한다. QuilA는 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina) 나무로부터의 사포닌의, 물로-추출 가능한 분획을 함유한다. 이들 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌 그룹에 속하며, 이는 공통 트리테르페노이드 골격 구조를 갖는다. 사포닌은 T-의존적 및 T-독립적 항원에 대해 강력한 아주반트 반응뿐만 아니라 강력한 세포독성 CD8+ 림프구 반응을 유도하고, 점막 항원에 대한 반응을 강화하는 것으로 알려져 있다. 이들은 또한 콜레스테롤 및 인지질과 조합되어 면역자극 복합체(ISCOM)를 형성할 수 있고, QuilA 아주반트는 상이한 기원으로부터의 광범위한 항원에 대해 항체-매개 및 세포-매개 면역 반응 둘 모두를 활성화할 수 있다. 소정 구현예에서, 아주반트는 AS01, 바람직하게는 AS01B이다. S01은 MPL(3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A), QS21(퀼라자 사포나리아 몰리나, 분획 21) 및 리포좀을 함유하는 아주반트 시스템이다. 소정 구현예에서, AS01은 상업적으로 이용 가능하거나(GSK), 본원에 참고로 포함되는 WO 96/33739에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 소정 아주반트는 2개의 비혼화성 유체, 예를 들어 오일과 물의 혼합물(그 중 하나는 다른 하나의 내부에 작은 액적으로 현탁됨)이며, 표면-활성 제제에 의해 안정화되는 에멀젼을 포함할 수 있다. 수중유 에멀젼은 작은 오일 액적을 둘러싸는, 연속상을 형성하는 물을 갖는 반면, 유중수 에멀젼은 연속상을 형성하는 오일을 갖는다. 소정 에멀젼은 스쿠알렌(대사 가능 오일)을 포함한다. 소정 아주반트는 블록 공중합체를 포함하며, 이는 2개의 단량체가 함께 클러스터링되어 반복 단위의 블록을 형성하는 경우 형성되는 공중합체이다. 블록 공중합체, 스쿠알렌 및 마이크로입자 안정화제를 포함하는 유중수 에멀젼의 일례는 TiterMax®이며, 이는 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 입수 가능하다. 임의로 에멀젼은 추가 면역자극 구성성분, 예컨대 TLR4 작용제와 조합되거나 이를 포함할 수 있다. 소정 아주반트는 임의로 면역 자극제, 예컨대 AS02(문헌[Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91] 참고)에서와 같이 모노포스포릴 지질 A 및/또는 QS21과의 조합으로, MF59(예를 들어 EP0399843, US 6299884, US6451325 참고) 및 AS03에서도 사용되는 수중유 에멀젼(예컨대 스쿠알렌 또는 땅콩 오일)이다. 아주반트의 추가 예는 면역 자극제, 예컨대 AS01E 및 AS01B에서와 같이 MPL 및 QS21을 함유하는 리포좀이다(예를 들어 US 2011/0206758). 아주반트의 다른 예는 CpG(Bioworld Today, Nov. 15, 1998) 및 이미다조퀴놀린(예컨대 이미퀴모드 및 R848)이다. 예를 들어, 문헌[Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608]을 참고한다.

소정의 바람직한 구현예에서, 아주반트는 사포닌, 바람직하게는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)로부터 수득된 사포닌의 물로-추출 가능한 분획을 포함한다. 소정 구현예에서, 아주반트는 QS-21을 포함한다.

소정의 바람직한 구현예에서, 아주반트는 톨(toll)-유사 수용체 4(TLR4) 작용제를 함유한다. TLR4 작용제는 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807]을 참고한다. 소정의 바람직한 구현예에서, 아주반트는 지질 A를 포함하는 TLR4 작용제, 또는 이의 유사체 또는 유도체이다.

바람직하게는 TLR4 작용제를 포함하는 아주반트는 다양한 방식으로, 예를 들어 아주반트에서 면역조절 분자에 대한 및/또는 면역원에 대한 다양한 전달 시스템을 나타내는, 에멀젼, 예컨대 유중수(w/o) 에멀젼 또는 수중유(o/w) 에멀젼(예는 MF59, AS03임), 안정한 (나노-)에멀젼(SE), 지질 현탁액, 리포좀, (중합체성) 나노입자, 바이로좀, 흡착된 알룸, 수성 제형(AF) 등으로 제형화될 수 있다(예를 들어 상기 문헌[Reed et al, 2013]; 문헌[Alving CR et al, 2012, Curr Opin Immunol 24: 310-315] 참고).

면역자극 TLR4 작용제는 임의로 다른 면역조절 구성성분, 예컨대 사포닌(예를 들어 QuilA, QS7, QS21, 매트릭스(Matrix) M, 이스콤(Iscom), 이스코마트릭스(Iscomatrix) 등), 알루미늄 염, 다른 TLR에 대한 활성화제(예를 들어 이미다조퀴놀린, 플라겔린, CpG, dsRNA 유사체 등) 등과 조합될 수 있다(예를 들어 상기 문헌[Reed et al, 2013] 참고).

본원에서 사용되는 용어 "지질 A"는, 글루코사민을 포함하고, LPS 분자를 그람-음성 박테리아의 외막의 외부 첨판에서 고정하는, 케토시드계 결합을 통해 LPS 분자의 내부 코어에서 케토-데옥시옥툴로소네이트에 결합되는 LPS 분자의 소수성 지질 모이어티를 나타낸다. LPS 및 지질 A 구조의 합성의 개요에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Raetz, 1993, J. Bacteriology 175:5745-5753, Raetz CR and C Whitfield, 2002, Annu Rev Biochem 71: 635-700]; US 5,593,969 및 US 5,191,072을 참고한다. 본원에서 사용된 바와 같은 지질 A에는 자연 발생 지질 A, 이의 혼합물, 유사체, 유도체 및 전구체가 포함된다. 이 용어에는 단당류, 예를 들어, 지질 X로 지칭되는, 지질 A의 전구체; 이당류 지질 A; 헵타-아실 지질 A; 헥사-아실 지질 A; 펜타-아실 지질 A; 테트라-아실 지질 A, 예를 들어, 지질 IVA로 지칭되는 지질 A의 테트라-아실 전구체; 탈인산화 지질 A; 모노포스포릴 지질 A; 디포스포릴 지질 A, 예컨대 에스케리키아 콜라이 및 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 지질 A가 포함된다. 몇몇 면역 활성화 지질 A 구조는 6개의 아실쇄를 함유한다. 글루코사민 당에 직접 부착된 4개의 일차 아실쇄는 보통 10개 내지 16개 탄소 길이의 3-하이드록시 아실쇄이다. 2개의 추가적인 아실쇄는 대개 일차 아실쇄의 3-하이드록시기에 부착된다. 일례로서, 이. 콜라이 지질 A는 전형적으로 당에 부착된 4개의 C14 3-하이드록시 아실쇄 및 각각 2' 및 3' 위치에서 일차 아실쇄의 3-하이드록시기에 부착된 1개의 C12 및 1개의 C14를 갖는다.

본원에서 사용되는 용어 "지질 A 유사체 또는 유도체"는 지질 A의 구조 및 면역학적 활성과 유사하지만 반드시 자연에서 자연 발생하는 것은 아닌 분자를 나타낸다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어 단축되거나 축합되도록, 및/또는 또 다른 아민 당 잔기로 치환된 이의 글루코사민 잔기, 예를 들어 갈락토사민 잔기를 갖도록, 환원성 단부에서 글루코사민-1-포스페이트 대신 2-데옥시-2-아미노글루코네이트를 함유하도록, 위치 4'에서 포스페이트 대신 갈락투론산 모이어티를 보유하도록 변형될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어, 화학적 유도에 의해, 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조될 수 있거나, 예를 들어, 먼저 바람직한 지질 A의 구조를 결정하고 이의 유사체 또는 유도체를 합성함으로써, 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 또한 TLR4 작용제 아주반트로서 유용하다(예를 들어 문헌[Gregg KA et al, 2017, MBio 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17] 참고). 예를 들어, 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어 알칼리 처리에 의해, 야생형 지질 A 분자의 탈아실화에 의해 수득될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 예를 들어 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조될 수 있다. 이러한 분자는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체의 또 다른 예는 지질 A 생합성 및/또는 지질 A 변형에 관여되는 효소에 돌연변이, 또는 효소의 결실 또는 삽입을 보유하는 박테리아 세포로부터 단리된 지질 A 분자이다. MPL 및 3D-MPL은 지질 A 독성을 약화하도록 변형된 지질 A 유사체 또는 유도체이다. 지질 A, MPL 및 3D-MPL은 지방산 장쇄가 부착되는 당 골격을 가지며, 골격은 글리코시드계 결합에 2개의 6-탄당, 및 4 위치에 포스포릴 모이어티를 함유한다. 전형적으로, 5개 내지 8개의 장쇄 지방산(보통 12개 내지 14개 탄소 원자)이 당 골격에 부착된다. 천연원의 유래로 인해, MPL 또는 3D-MPL은 여러 지방산 치환 패턴, 예를 들어 다양한 지방산 길이를 갖는, 헵타-아실, 헥사-아실, 펜타-아실 등의 복합물 또는 혼합물로 존재할 수 있다. 이는 또한 본원에서 기재된 다른 지질 A 유사체 또는 유도체 중 일부에 있어서 사실이지만, 합성 지질 A 변이체가 또한 정의될 수 있고 동종성일 수 있다. MPL 및 그 제조는 예를 들어 US 4,436,727에 기재되어 있다. 3D-MPL은 예를 들어 US 4,912,094B1에 기재되어 있으며, 위치 3에서 환원성-단부 글루코사민에 결합된 에스테르인 3-하이드록시미리스트산 아실 잔기의 선택적 제거에 의해 MPL과 상이하다(예를 들어 US 4,912,094B1의 칼럼 1의 MPL 대 칼럼 6의 3D-MPL의 구조를 비교). 당분야에서는 때때로 MPL로 지칭되는 3D-MPL이 대개 사용된다(예를 들어 상기 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013]의 표 1의 첫 번째 구조는 이러한 구조를 MPL®로 나타내지만, 실제로는 3D-MPL의 구조를 도시함). 본 발명에 따른 지질 A(유사체, 유도체)의 예에는 MPL, 3D-MPL, RC529(예를 들어 EP1385541), PET-지질 A, GLA(글리코피라노실 지질 아주반트, 합성 이당류 당지질; 예를 들어 US20100310602, US8722064), SLA(예를 들어 인간 백신을 위해 TLR4 리간드를 최적화하는 구조-기능 접근을 기재하는 문헌[Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: e108 (doi: 10.1038/cti.2016.63)]), PHAD(인산화 헥사아실 이당류; 그 구조는 GLA의 구조와 동일함), 3D-PHAD, 3D-(6-아실)-PHAD (3D(6A)-PHAD)(PHAD, 3D-PHAD, 및 3D(6A)PHAD는 합성 지질 A 변이체임, 예를 들어 이들 분자의 구조도 제공하는, avantilipids.com/divisions/adjuvants 참고), E6020(CAS Number 287180-63-6), ONO4007, OM-174 등이 포함된다. 3D-MPL, RC529, PET-지질 A, GLA/PHAD, E6020, ONO4007, 및 OM-174의 예시적 화학 구조에 대해서는, 예를 들어 상기 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013]의 표 1을 참고한다. SLA의 구조에 대해서는, 예를 들어 문헌[Reed SG et al, 2016, Curr Opin Immunol 41: 85-90]의 도 1을 참고한다. 소정의 바람직한 구현예에서, TLR4 작용제 아주반트는 3D-MPL, GLA, 또는 SLA로부터 선택되는 지질 A 유사체 또는 유도체를 포함한다.

지질 A 유사체 또는 유도체를 포함하는 예시적 아주반트에는 GLA-LSQ(합성 MPL[GLA], QS21, 리포좀으로 제형화된 지질), SLA-LSQ(합성 MPL[SLA], QS21, 지질, 리포좀으로 제형화됨), GLA-SE(합성 MPL[GLA], 스쿠알렌 오일/물 에멀젼), SLA-SE(합성 MPL[SLA], 스쿠알렌 오일/물 에멀젼), SLA-나노알룸(합성 MPL[SLA], 알루미늄 염), GLA-나노알룸(합성 MPL[GLA], 알루미늄 염), SLA-AF(합성 MPL[SLA], 수성 현탁액), GLA-AF(합성 MPL[GLA], 수성 현탁액), SLA-알룸(합성 MPL[SLA], 알루미늄 염), GLA-알룸(합성 MPL[GLA], 알루미늄 염), 및 AS01(MPL, QS21, 리포좀), AS02(MPL, QS21, 오일/물 에멀젼), AS25(MPL, 오일/물 에멀젼), AS04(MPL, 알루미늄 염), 및 AS15(MPL, QS21, CpG, 리포좀)를 포함하는 몇몇 GSK ASxx 시리즈의 아주반트가 포함된다. 예를 들어, WO 2013/119856, WO 2006/116423, US 4,987,237, U.S. 4,436,727, US 4,877,611, US 4,866,034, US 4,912,094, US 4,987,237, US5191072, US5593969, US 6,759,241, US 9,017,698, US 9,149,521, US 9,149,522, US 9,415,097, US 9,415,101, US 9,504,743, 상기 문헌[Reed G, et al., 2013], 문헌[Johnson et al., 1999, J Med Chem, 42:4640-4649, 및 Ulrich and Myers, 1995, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell and Newman, Eds.; Plenum: New York, 495-524]을 참고한다.

비-당지질 분자, 예를 들어 합성 분자, 예컨대 네오셉틴(Neoseptin)-3 또는 천연 분자, 예컨대 LeIF가 또한 TLR4 작용제 아주반트로 사용될 수 있으며, 예를 들어 상기 문헌[Reed SG et al, 2016]을 참고한다.

또 다른 양태에서 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다.

추가 양태에서 본 발명은 엔테로박테리아과의 그람 음성 박테리아에 대한 면역 반응 유도용 약제로서 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에서 기재된 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "면역원" 또는 "면역원성" 또는 "항원"은 상호 교환적으로 사용되어 단독으로, 또는 아주반트와 함께 수여체에 대한 투여 시, 또는 디스플레이 비히클 상에서 제시되어 자신에 대해 면역학적 반응을 유도할 수 있는 분자를 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같이, 항원 또는 조성물에 대한 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 대상체에서 항원 또는 조성물에 존재하는 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생을 나타낸다.

추가 양태에서 본 발명은 엔테로박테리아과의 그람 음성 박테리아에 의해 야기되는 박테리아 감염에 대한 면역 반응 유도에서 사용하기 위한 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에서 기재된 약학 조성물에 관한 것이다. 소정 구현예에서, 박테리아 감염은 스타필로코커스 사프로파이티쿠스(Staphylococcus saprophyticus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로테우스(Proteus) 종들, 세라티아(Serratia) 종들, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종들에 의해 야기된다. 바람직한 구현예에서 박테리아 감염은 클렙시엘라 종들, 또는 이. 콜라이에 의해 야기된다. 가장 바람직한 구현예에서, 박테리아 감염은 이. 콜라이에 의해 야기된다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 이. 콜라이 또는 클렙시엘라, 바람직하게는 이. 콜라이에 대한 면역 반응 유도용 약제로서 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에서 기재된 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, 엔테로박테리아과의 그람 음성 박테리아에 의해 야기되는 박테리아 감염은 이. 콜라이, 예를 들어 ExPEC에 의한 감염, 보다 구체적으로 요로 감염(UTI)이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 UTI와 연관된 증상 및/또는 후유증의 치료, 방지 또는 억제에서 사용하기 위한 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에서 기재된 약학 조성물에 관한 것이다. 소정 구현예에서, 상기 UTI는 rUTI이다. 이. 콜라이는 젊은 여성 및 고령 성인에서 중요한 헬스 케어 문제인 UTI 및 rUTI의 주요 원인 제제 중 하나이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 박테리아 감염은 이. 콜라이에 의해 야기되는 UTI 또는 rUTI이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 엔테로바실러스-관련 질병과 연관된 증상 및/또는 후유증의 치료, 방지 또는 억제를 필요로 하는 대상체에서 엔테로바실러스-관련 질병과 연관된 증상 및/또는 후유증의 치료, 방지 또는 억제 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유효량의 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에서 기재된 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 투여는 엔테로바실러스-관련 질병의 치료 또는 방지에 효과적인 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 엔테로바실러스-관련 질병은 비뇨생식기 감염, 보다 구체적으로 UTI 또는 rUTI이다.

본 발명은 또한 엔테로박테리아과의 그람 음성 박테리아에 의해 야기되는 박테리아 감염, 바람직하게는 이. 콜라이에 의해 야기되는 박테리아 감염의 치료, 방지 또는 억제용 약제의 제조를 위한 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 본원에서 기재된 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 박테리아 감염은 이. 콜라이에 의해 야기되는 UTI 또는 rUTI이다.

추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 소정 구현예에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 바람직하게는 플라스미드이다. 벡터는 바람직하게는 DNA 형태, 예를 들어 DNA 플라스미드이다. 소정 구현예에서, 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 이는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 프로모터는, 예를 들어 플라스미드의 발현 카세트에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 상류에 배치될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본원에서 기재된 바와 같은 벡터를 함유하는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이며, 배양은 폴리펩타이드의 제조에 적합한 조건 하에 일어난다.

소정 구현예에서, 방법은 폴리펩타이드를 회수하는 단계, 그 후 임의로 약학 조성물로의 제형화를 추가로 포함한다.

바람직하게는 이. 콜라이 세포, 예를 들어 이. 콜라이 BL21 유도체 세포가 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 방법에서 사용된다.

폴리펩타이드의 회수에는 바람직하게는 당분야에 잘 알려진 통상적인 단백질 정제 방법을 사용하여 수행될 수 있는 정제 및/또는 단리 단계가 포함된다. 이러한 방법에는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피가 포함될 수 있다.

이러한 정제 및/또는 단리를 위한 전형적인 예는 단백질에 대한 또는 단백질 구조의 일부로서 발현하는 His 태그 또는 절단 가능한 리더 또는 테일에 대한 항체를 이용할 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 기재된 폴리펩타이드에는 His-태그가 포함되며 IMAC 친화도 정제와 같은 방법에 의해 정제된다. 소정 구현예에서, 본원에서 기재된 폴리펩타이드는 정제가 양이온 교환 크로마토그래피(cIEX) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 수행되는 경우, His-태그를 포함하지 않는다.

정의

다양한 간행물, 논문 및 특허가 배경기술에, 그리고 명세서 전체에 걸쳐 인용되거나 기재되며; 이들 참고문헌 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 물질, 장치, 물품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 사항 중 임의의 것 또는 전부가 개시되거나 청구되는 임의의 발명에 대해 선행 기술의 일부를 형성한다는 인정이 아니다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다른 경우, 본원에서 인용되는 소정 용어는 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에서 인용되는 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 공보는 마치 본원에 전체가 제시된 바와 같이 참고로 포함된다. 본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 용어는 맥락상 명확히 달리 기재되지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다.

본 기재 및 이후의 청구범위에 걸쳐서, 맥락상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 내포하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때 용어 "포함하는(comprising)"은 용어 "함유하는(containing)" 또는 "포함되는(including)"으로 또는 때때로, 본원에서 사용될 때 용어 "갖는(having)"으로 치환될 수 있다.

본원에서 사용될 때 "구성되는(consisting of)"은 청구범위 요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용될 때, "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 청구범위의 기본적이고 새로운 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 임의의 전술한 용어 "포함하는(comprising)", "함유하는(containing)", "포함되는(including)" 및 "갖는(having)"은, 본 발명의 양태 또는 구현예의 맥락에서 본원에서 사용될 때마다, 용어 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"으로 대체되어 본 개시의 범위를 변화시킬 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 다수의 열거된 요소 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 및 조합 옵션 둘 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 첫번째 옵션은 제2 요소없이 제1 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 두 번째 옵션은 제1 요소 없이 제2 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은 제1 및 제2 요소 둘 다의 적용 가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 것이든 그 의미 내에 속하며 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족하는 것으로 이해된다. 옵션 중 하나 초과의 동시 적용 가능성도 그 의미 내에 속하며 따라서 용어 "및/또는"의 요건을 충족하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 본 발명에 따른 조성물의 효과 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비독성 물질을 나타낸ㄴ다. "약학적으로 허용 가능한 담체"에는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 소수포, 마이크로스피어, 리포좀 캡슐화 또는 약학 제형에서 사용하기 위해 당분야에 잘 알려진 다른 물질이 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 특징은 특정 적용을 위한 투여 경로에 좌우될 것임이 이해될 것이다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시를 고려하여, 백신에서 사용하기에 적합한 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 적합한 부형제에는 비제한적으로 멸균수, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 조합뿐만 아니라 안정화제, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 적합한 단백질 및 환원성 당이 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 대상체에서 요망되는 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 활성 성분 또는 구성성분의 양을 나타낸다. 유효량은 명시된 목적과 관련하여 경험적으로 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 최적 투여량 범위의 확인을 돕기 위하여 시험관 내 검정이 임의로 이용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 구현예에 따른 방법 또는 조성물에 의해 백신접종될 또는 백신접종된 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "포유류"는 임의의 포유류를 포괄한다. 포유류의 예에는 비제한적으로 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간 등, 가장 바람직하게는 인간이 포함된다. 소정 구현예에서, 대상체는 인간 성인이다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 성인"은 18세 이상인 인간을 나타낸다. 소정 구현예에서, 대상체는 18세 미만, 예를 들어 0세 내지 18세, 예를 들어 9세 내지 18세, 또는 12세 내지 18세이다. 소정 구현예에서, 대상체는 약 18세 내지 약 50세의 인간 대상체이다. 소정 구현예에서, 대상체는 약 50세 내지 약 100세, 예를 들어 50세 내지 85세, 60세 내지 80세, 50세 이상, 55세 이상, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상, 80세 이상, 85세 이상의 인간이다. 본원의 일부 구현예에서 대상체는 85세 이하, 80세 이하, 75세 이하이다. 소정 구현예에서, 인간 대상체는 남성이다. 소정 구현예에서, 인간 대상체는 여성이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "UTI"는 신장, 방광, 요관, 또는 요도의 감염을 의미한다. UTI의 증상에는 배뇨 시 작열감, 빈번하거나 강한 요의, 불완전한 방광 비움, 비정상적인 외관 및/또는 냄새를 갖는 소변, 소변 중 상승된 백혈구, 피로감 또는 떨리는 느낌, 방향 감각 상실, 열 또는 오한, 불쾌감, 허리, 하복부, 골반 또는 방광의 통증 또는 압력 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 그러나, 일부 환자에서는 증상이 부재하거나 비구체적일 수 있다. UTI의 후유증에는 전신 합병증, 예컨대 침습성 질환 및 패혈증이 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, UTI는 임상적으로 및/또는 미생물학적으로 보고된다(예를 들어 소변의 박테리아 배양 및/또는 분자적 또는 다른 방법으로 확인된다). 소정 구현예에서, 대상체는 UTI를 이전에 가졌었거나 현재 갖고 있는 인간 대상체이다. 소정 구현예에서, 대상체는 최근 2년, 최근 1년, 또는 최근 6개월 내에 UTI를 가졌었다. 소정 구현예에서, 대상체는 재발성 UTI(rUTI)를 가졌었거나 현재 갖고 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "rUTI"는 6개월 내 적어도 2회 감염 또는 1년 내 적어도 3회 UTI를 의미한다. 소정 구현예에서, 본 발명의 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본 발명의 FimCH 복합체, 또는 본 발명의 조성물이 투여되는 대상체는 최근 2년 내에, 최근 1년 내에, 또는 최근 6개월 내에 적어도 2회 UTI를 앓았다. 소정 구현예에서, 대상체는 합병 UTI를 앓았다. 본원에서 사용된 바와 같은 '합병 UTI'는 질병, 예컨대 비뇨생식기의 구조적 또는 기능적 비정상 또는 기저 질환의 존재와 연관된 UTI를 의미한다. 소정 구현예에서, UTI는 소변 중 상승된 백혈구 수 또는 다른 소변 비정상을 야기한다. 소정 구현예에서, UTI를 갖는 대상체는 소변 중 다수의 박테리아를 갖는다, 즉 소변은 멸균이 아니며, 예를 들어 박테리아 세포수는 적어도 약 10 세포/mL, 적어도 약 100 세포/mL, 적어도 약 10³ 세포/mL, 예를 들어 적어도 약 10⁴ 세포/mL, 예를 들어 적어도 약 10⁵ 세포/mL이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 항원 또는 조성물에 대한 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 대상체에서 항원 또는 조성물에 존재하는 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생을 나타낸다.

달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 그 시리즈 내의 모든 요소를 나타내는 것으로 이해되어야 한다.

단어 "약" 또는 "대략"은 수치 값(예를 들어 약 10)과 연관되어 사용되는 경우, 바람직하게는 그 값이 주어진 값의(10의) 10% 초과 또는 미만, 바람직하게는 그 값의 5% 초과 또는 미만일 수 있음을 의미한다.

용어 "상동성", "서열 동일성" 등은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 서열 동일성은 본원에서, 서열을 비교하여 결정되는, 2개 이상의 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열 간 관계로 정의된다. 당분야에서, "동일성"은 또한 이러한 서열 스트링 간 매치에 의해 결정되는, 가능할 수 있는 아미노산 또는 핵산 서열 간 서열 관련성 정도를 의미한다. 두 아미노산 서열 간 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 보존된 아미노산 치환을 두 번째 폴리펩타이드 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 알려진 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다.

"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 두 서열의 길이에 따라, 전체 또는 국소 정렬 알고리즘을 사용하여 두 펩타이드 또는 두 뉴클레오타이드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적 정렬하는 전체 정렬 알고리즘(예를 들어 Needleman Wunsch)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국소 정렬 알고리즘(예를 들어 Smith Waterman)을 사용하여 정렬된다. 이어서 서열은 이들이 (예를 들어 디폴트 파라미터를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적 정렬되는 경우) 적어도 소정 최소 백분율의 서열 동일성을 공유하는 경우 (아래에 정의된 바와 같이) "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한"으로 지칭될 수 있다. GAP은 이의 전체 길이(전장)에 걸쳐 2개 서열을 정렬하기 위해 Needleman 및 Wunsch 전체 정렬 알고리즘을 사용하여, 매치 수를 최대화하고 갭 수를 최소화한다. 전체 정렬은 2개 서열이 유사한 길이를 갖는 경우 서열 동일성을 결정하기 위해 적합하게 사용된다. 일반적으로, 갭 생성 페널티 = 50(뉴클레오타이드) / 8(단백질) 및 갭 연장 페널티 = 3(뉴클레오타이드) / 2(단백질)를 포함하는 GAP 디폴트 파라미터가 사용된다. 뉴클레오타이드에 대해 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 nwsgapdna이며 단백질에 대한 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). 서열 정렬 및 서열 동일성 백분율에 대한 스코어는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA에서 이용 가능한 GCG 위스콘신 패키지, 버전 10.3을 사용하여, 또는 오픈 소스 소프트웨어, 예컨대 EmbossWIN 버전 2.10.0의 프로그램 "needle"(전체 Needleman Wunsch 알고리즘 사용) 또는 "water"(국소 Smith Waterman 알고리즘 사용)를 사용하여, 상기 GAP에 대한 것과 동일한 파라미터를 사용하여, 또는 디폴트 설정을 사용하여 결정될 수 있다('needle' 및 'water' 둘 모두에 대해 및 단백질 및 DNA 정렬 둘 모두에 대해, 디폴트 Gap 개방 페널티는 10.0이고 디폴트 갭 연장 페널티는 0.5이며; 디폴트 스코어링 매트릭스는 단백질에 대해 Blosum62 및 DNA에 대해 DNAFull임). 서열이 실질적으로 상이한 전체 길이를 갖는 경우, 국소 정렬, 예컨대 Smith Waterman 알고리즘을 사용하는 것들이 바람직하다.

대안적으로, 유사성 또는 동일헝 백분율은 알고리즘, 예컨대 FASTA, BLAST 등을 사용하여 공개 데이터베이스에 대해 검색함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 추가로 "쿼리 서열"로서 사용되어, 예를 들어 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해, 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행할 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색이 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색이 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 BLASTx 프로그램, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST가 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTx 및 BLASTn)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 국립 생물공학 정보 센터의 홈페이지를 참고한다.

서열 설명

[표 1]

서열

FimH 폴리펩타이드에 대한 서열의 다른 예는 US6,737,063, 예를 들어 여기서의 SEQ ID NO: 23 내지 45 또는 55 중 어느 하나에 기재되며, 이들은 모두 본원에서 참고로 포함된다.

실시예

본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 결정되어야 함이 이해되어야 한다.

실시예 1: 신규한 변이체의 설계 - SPR 데이터

백신 유효성에서 FimH 입체형태 변화의 영향을 이해하기 위해, 방광의 박테리아 접착 및 집락화를 감소시킬 수 있는 기능적 항체를 유도하는 최고의 FimH 변이체를 확인하는 것을 목표로, 잠재적으로 단백질을 저친화도 상태로 잠글 수 있는 상이한 돌연변이를 함유하는 FimH의 몇몇 변이체를 설계하였다.

물질 및 방법

FimH 설계 및 발현

고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)를 사용하는 친화도 정제를 위해 FimC 상에 C-말단 His-태그 및 원형질막주위에서의 발현을 위한 이종성 신호 서열을 사용하여 FimC 및 FimH를 pET-DUET 벡터에서 발현시켰다. IPTG를 사용하여 발현을 유도하고 단백질을 추출하고 IMAC 정제(Talon)를 사용하여 정제하였다.

SPR

FimH 렉틴 도메인 변이체와 n헵틸-α-D-만노피라노시드 리간드의 결합 친화도 및 상호작용의 동역학에 대한 상세한 식견을 얻기 위해, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 측정을 수행하였다. 간략하게, 모든 FimH 변이체를 만노시드 리간드 5 표면 내로 HBS-N(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20) 중 3 또는 10 μM의 최고 농도로 적정하였다(Rabbani S et al, J Biol. Chem., 2018, 293(5):1835-1849). 단백질을 단일 사이클 동역학 주입을 사용하여 0.12 μM부터 10 μM까지 또는 0.036 μM부터 3.0 μM까지 주입하였다.

결과

기능적 억제 항체를 유도함으로써 광범위한 커버리지를 제공하면서 방광 세포에 대한 박테리아 결합을 방지할 수 있는 FimH 렉틴 도메인 변이체를 확인하는 것을 목표로 몇몇 FimH 변이체를 설계하였다. 적합한 FimH 렉틴 도메인 변이체의 발견 확률을 최적화하기 위해, 상이한 예측 작용 방식을 갖는 변이체를 선택하였다.

이전에 기재된 돌연변이체 FimH_Q133K 및 FimH_R60P는 결합 포켓에서의 만노스 상호작용 잔기에 돌연변이를 갖는다. 이들 돌연변이는 만노스와의 결합 상호작용에 직접적으로 영향을 미칠 것으로 예측된다. 이들 돌연변이체를 양성 대조군으로 취했다. 이중 돌연변이체 R60P_Q133K를 잠재적으로 증강된 효과에 대해 확인하기 위해 함께 취했다. 또한, 야생형(WT) FimH 렉틴 도메인을 음성 대조군으로 함께 취했다. 몇몇 추가 FimH 돌연변이체(본원에서 '돌연변이체 1' 및 '돌연변이체 2'로 지칭되는 것들을 포함)를 생성하고, 기능적 억제 항체를 수득하는 것을 목표로 하여 패널에서 후보로서 시험하였다.

먼저 만노스로의 결합에 대한 변이체 친화도를 SPR을 사용하여 평가하였다. 결과를 표 2에 제시한다. 예상된 바와 같이, FimH의 만노스 결합 포켓에서 돌연변이(Q133K 및 R60P_Q133K)를 갖는 렉틴 도메인 변이체는 만노시드에 전혀 결합하지 않았다. R60P 돌연변이체는 예상된 바와 같이, 만노시드에 대해 저친화도를 나타내었다.

F142V는 여전히 만노시드에 대해 다소간의 친화도를 나타내었고, 이는 이러한 돌연변이가 만노시드에 대한 결합을 완전히 제거하는 것은 아님을 시사하였다. F144V 치환을 포함하는 FimH 렉틴 도메인 변이체에서는 만노시드에 대한 결합이 완전히 제거되었다. 놀랍게도, F144V 돌연변이와 비교하여 아미노산 서열에서 위치가 매우 가까이 인접해 있음을 고려해보았을 때, F142V 및 F144V 간의 만노시드에 대한 결합에 차이가 존재함이 확인되었다.

[표 2]

만노시드에 대한 FimH-LD 변이체의 친화도 측정

* 저친화도 KD>1000 nm; 중간 친화도 KD 100 내지 1000 nM; 고친화도 KD <100 nM

실시예 2: 억제 항체를 유도하는 능력

저친화도 입체형태로 FimH에 대해 생성된 항체는 방광에서 박테리아 세포를 차단하고 집락 형성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 저친화도 입체형태로 잠긴 FimH의 상이한 변이체에 의해 유도된 항체의 기능성을 평가하기 위해 접착 억제 검정(AIA)을 사용하였다.

물질 및 방법

면역화

위스타 래트에 비-프로인드 아주반트와 조합된, 본원에서 상기 기재된 FimH 변이체(60 μg 각 변이체/용량)로 제0일, 제7일, 제10일 및 제18일에 4회 근육내(i.m.) 면역화를 제공하였다(스피디 래트 28일 모델, Eurogentec). 혈청 항체의 기능성을 후술된 바와 같이 접착 억제 검정(AIA)에 의해 제0일(면역화-전) 및 제28일(면역화-후)에 조사하였다.

접착 억제 검정(AIA)

박테리아(이. 콜라이 J96)를 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)로 표지하였다. 표지된 박테리아를 37℃에서 1 h 동안 방광 요로상피 세포(5637 세포주)와 인큐베이션하였다. 접착 박테리아%를 유세포 측정에 의해 측정하였다. 혈청 억제의 평가를 위해, 박테리아를 37℃에서 30분 동안 혈청 샘플과 사전에 인큐베이션한 후, 5637 세포와 혼합하였다.

ELISA

96-웰 플레이트를 1 ug/mL의 FimH로 하룻밤 코팅한다. 세척 후, 코팅된 웰을 실온에서 1시간 동안 차단 완충액[포스페이트-완충 식염수(PBS) + 2% 소 혈청 알부민(BSA)]과 인큐베이션한다. PBS + 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 혈청을 플레이트에 첨가한 뒤 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 2% BSA를 갖는 PBS 중 희석된 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 콘주게이션된 염소 항-래트 항체를 실온에서 1시간 동안 각각의 웰에 첨가한다. 최종 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질로 반응을 발색시킨다. 1 M 인산으로 반응을 중단시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정한다.

결과

혈청 항체 억제 역가를 4-파라미터 로지스틱 회귀 모델에 기반하여 절반 최대 억제 농도(IC50)로 계산하였다. 또한, 상이한 FimH 변이체(총 IgG)에 의해 유도된 혈청 항체의 수준을 ELISA에 의해 평가하였다. 절반 최대 유효 농도로 정의되는 EC50 역가를 4PL 비선형 회귀 모델로 분석된 이중 12-단계 적정 곡선에 기반하여 계산하였다.

FimH 변이체 각각에 의해 유도된 억제 항체의 크기 평가는, FimH-23-10_F144V가 최고 수준의 기능적 항체를 유도할 수 있음을 나타내었고(도 1), 이는 놀라운 것이었으며, 본 발명 전에는 전적으로 예측 불가능하였다. 이러한 결과에 기반하여 F144V 치환을 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 선도 후보로 선택하였다.

실시예 3: 항체의 기능성

억제 항체가 존재하는지를 평가하기 위해 정제된 IgG 조제물을 사용하는 바이오레이어 간섭측정 분석(Octet, Pall Fortebio)에서 항체의 기능성을 평가하였다. 간략하게, 4개의 상이한 농도의 정제된 IgG(0 내지 125 마이크로그램/ml)를 본원에서 기재된 바와 같은 FimH 변이체와 혼합하였다. 혼합 후, FimH 렉틴 도메인 단백질을 바이오틴-표지 모노만노시드로 사전-고정화된 바이오센서로의 결합 능력에 대해 평가하였다(바이오틴 스트렙타비딘 화학을 사용). 600초 동안 회합 및 해리를 측정하였고 회합 동안의 반응(나노미터(nm))을 계산하고 비교하였다. 이를 만노스에 대한 FimH의 결합을 억제하는 FimH 변이체 능력을 평가하기 위해 블랭크 대조군과 비교하여 만노시드로 수행하였다.

결과

FimH 결합 포켓 입체형태의 변화(만노시드에 대한 FimH의 저- 중간- 또는 고-친화도 결합을 초래)는 요로상피 세포에 대한 박테리아 결합에서 중요한 역할을 담당한다. 만노스에 대해 저-친화도를 갖는 입체형태에 대한 항체는 박테리아 접착에 대한 억제 효과를 가질 것으로 제시되었다. 이러한 제시를 분석하기 위해 그리고 백신 유효성에 대한 FimH 입체형태 변화의 영향을 추가로 이해하기 위해, FimH 렉틴 도메인 변이체로 면역화된 래트의 혈청으로부터 정제된 IgG를 바이오레이어 간섭측정(BLI)에 의해 단순 만노시드(모노만노스-바이오틴)에 대한 FimH의 결합을 감소시키는 능력에 대해 스크리닝하였다.

FimH 렉틴 도메인 변이체로 면역화된 래트로부터의 혈청에서 억제 항체의 존재에 대한 BLI-스크리닝은 FimH-23-10_F144V가, 고정화된 모노-만노시드에 대한 저- 및 고-친화도 FimH 렉틴 도메인 단백질 둘 모두의 결합을 억제할 수 있음을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 4: 특성규명된 억제 mAb 475 및 926에 결합하는 능력

FimH의 렉틴 도메인에서의 돌연변이는 강력하고 기능적인 면역 반응의 유발에서 중추적인 에피토프, 예컨대 FimH의 결합 포켓에 존재하는 에피토프의 손실을 야기할 수 있다. 결합 포켓의 온전성이 본원에서 기재된 돌연변이에서 손상되지 않았음을 확실히 하기 위해, 모노클로날 항체(mAb) mAb475 및 mAb926의, 돌연변이체 FimH 렉틴 도메인에 대한 결합을 평가하였다. mAb475 및 mAb926은, FimH의 만노스-결합 포켓 내의 FimH 렉틴 도메인 상에서 중복되지만 구별되는 에피토프를 인식한다(Kisiela et al. 2013 & 2015).

결과

돌연변이된 FimH 렉틴 도메인은 이전에 WO02102974에 기재되었다. WO02102974는 대부분의 특정되지 않은 돌연변이의 가능한 돌연변이의 광범위한 목록을 기재한다(대략 159개 아미노산 길이인 FimH의 렉틴 도메인에서 65개의 상이한 돌연변이 부위가 제시됨). 그러나, WO02102974는 위치 54, 133 또는 135에 아미노산 치환을 갖는 FimH 렉틴 도메인이 가장 유망한 후보임을 시사하며, FimH_Q133K를 고도로 바람직한 옵션으로서 명시적으로 언급한다. 따라서 FimH-23-10_Q133K가 기능적 mAb475에 의해 인식되지 않았다는 것은 매우 놀라운 것이었으며, 이는 결합 포켓의 온전성 문제를 시사한다(표 3). 대조적으로, FimH-23-10_F144V는 mAb475 및 mAb926 둘 모두에 의해 인식되었고, 이는 결합 포켓이 완전히 온전하게 유지되었음을 시사하였다(표 3).

[표 3]

특성규명된 억제 mAb 475 및 926에 결합하는 능력

따라서, 결론적으로, 모든 FimH 변이체 중에서, FimH_F144V가 만노스에 대해 강력히 감소된 친화도를 나타내었으며(이는 변이체가 만노스 입체형태에 대해 저친화도에 있었음을 시사함) 고정화된 모노-만노시드에 대해 저- 및 고-친화도 FimH 렉틴 도메인 단백질 둘 모두의 결합을 억제할 수 있었다. 또한, FimH_F144V는 시험한 모든 돌연변이 중 가장 높은 수준의 기능적 항체를 유도하였고, 온전한 결합 포켓을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 돌연변이체는 또한 FimCH 복합체로 제조 가능하였다. 결론적으로, 위치 144에 발린을 갖는 FimH 렉틴 도메인은 이를 백신 구성성분으로 매우 적합하게 만드는, 즉 현재까지 FimH-기반 백신을 개발하기 위한 노력이 집중되어 왔던 야생형보다 우수하고, 본원에서 시험한 다른 변이체보다 우수한, 특징의 놀라운 조합을 갖는다.

<110> Janssen Pharmaceuticals, Inc. Janssen Vaccines & Prevention B.V <120> FimH mutant, compositions therewith and use thereof. <130> CRU6033WOPCT1 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimHLD 23-10 <400> 1 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimHt <400> 2 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160 Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 165 170 175 Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 180 185 190 Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 195 200 205 Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 210 215 220 Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 225 230 235 240 Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 245 250 255 Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 260 265 270 Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 275 <210> 3 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimC <400> 3 Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro Ala Gly Gln Lys 1 5 10 15 Gln Val Gln Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn Ser Thr Tyr Leu 20 25 30 Ile Gln Ser Trp Val Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys Asp Gly Arg Phe 35 40 45 Ile Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Met Lys Gly Lys Lys Glu Asn Thr 50 55 60 Leu Arg Ile Leu Asp Ala Thr Asn Asn Gln Leu Pro Gln Asp Arg Glu 65 70 75 80 Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala Ile Pro Ser Met Asp Lys Ser 85 90 95 Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gln Leu Ala Ile Ile Ser Arg Ile Lys 100 105 110 Leu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro Asp Gln Ala Ala 115 120 125 Glu Lys Leu Arg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu Thr Leu Ile Asn 130 135 140 Pro Thr Pro Tyr Tyr Leu Thr Val Thr Glu Leu Asn Ala Gly Ala Arg 145 150 155 160 Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro Pro Met Gly Glu Ser Thr Val Lys 165 170 175 Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn Ile Thr Tyr Arg Thr Ile Asn Asp 180 185 190 Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met Glu 195 200 205 <210> 4 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example of FimH 23-10 <400> 4 Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 1 5 10 15 Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile 20 25 30 Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala 35 40 45 Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe 50 55 60 Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80 Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val 85 90 95 Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro 100 105 110 Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu 115 120 125 Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly 130 135 140 Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser 145 150 155 160 Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val 165 170 175 Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr 180 185 190 Leu Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys 195 200 205 Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp 210 215 220 Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln 225 230 235 240 Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn 245 250 255 Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly 260 265 270 Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn 275 280 285 Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 290 295 300 <210> 5 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 2 of US 6,500,434 - FimH <400> 5 Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 1 5 10 15 Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile 20 25 30 Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val 35 40 45 Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe 50 55 60 Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80 Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val 85 90 95 Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro 100 105 110 Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu 115 120 125 Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly 130 135 140 Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser 145 150 155 160 Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val 165 170 175 Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr 180 185 190 Leu Pro Asp Tyr Arg Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys 195 200 205 Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp 210 215 220 Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln 225 230 235 240 Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn 245 250 255 Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly 260 265 270 Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn 275 280 285 Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Thr Gln 290 295 300 <210> 6 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimH sequence with truncation at N-terminus <400> 6 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Leu Val Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160 Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Arg 165 170 175 Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 180 185 190 Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 195 200 205 Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 210 215 220 Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Thr Asn Asn Thr Val Ser Leu 225 230 235 240 Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 245 250 255 Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 260 265 270 Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 275 <210> 7 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimHLD <400> 7 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Leu Val Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160

Claims (16)

1. FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, FimH 렉틴 도메인이 SEQ ID NO: 1에서 위치 144에 대응하는 위치에 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는, 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 돌연변이를 포함하며 돌연변이가 F144V 치환인, 폴리펩타이드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, FimH 렉틴 도메인이 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 바람직하게는 FimH 렉틴 도메인이 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 위치 144에서 페닐알라닌 잔기가 발린에 의해 치환되는, 폴리펩타이드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, FimH 필린 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 전장 FimH이며, 바람직하게는 FimH가 SEQ ID NO: 2를 포함하고, 위치 144에서 페닐알라닌 잔기가 발린에 의해 치환되는, 폴리펩타이드.
6. 제4항 또는 제5항에 따른 폴리펩타이드 및 FimC를 포함하는 복합체(FimCH).
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제6항에 따른 복합체, 또는 제7항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물.
9. 제8항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 약학 조성물.
10. 제1항 내지 제5항, 제6항, 제7항, 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 폴리펩타이드, 복합체, 폴리뉴클레오타이드 또는 약학 조성물.
11. 제1항 내지 제5항, 제6항, 제7항, 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로박테리아과의 박테리아에 대한 면역 반응 유도에서 사용하기 위한 폴리펩타이드, 복합체, 폴리뉴클레오타이드 또는 약학 조성물.
12. 제11항에 있어서, 박테리아가 이. 콜라이(E.coli) 또는 클렙시엘라(Klebsiella), 바람직하게는 이. 콜라이인, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 복합체 또는 약학 조성물.
13. 제1항 내지 제5항, 제6항, 제7항, 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 이. 콜라이에 의해 야기되는 요로 감염의 방지 또는 치료에서 사용하기 위한 폴리펩타이드, 복합체, 폴리뉴클레오타이드 또는 약학 조성물.
14. 엔테로바실러스(enterobacillus)-관련 질병의 치료 또는 방지를 필요로 하는 대상체에서 엔테로바실러스-관련 질병을 치료하거나 방지하는 방법으로서, 대상체에 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제6항에 따른 복합체, 제7항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제8항 또는 제9항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
15. 제7항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
16. 제7항의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제15항의 벡터를 함유하는 재조합 세포로부터 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하고, 임의로 폴리펩타이드를 회수하고 정제하는 단계, 그 후 임의로 폴리펩타이드의 약학 조성물로의 제형화를 추가로 포함하는, FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 방법.

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