ES2606563T3 - Adyuvantes lipídicos de glucopiranosilo sintéticos y composiciones de vacuna que contienen los mismos - Google Patents

Adyuvantes lipídicos de glucopiranosilo sintéticos y composiciones de vacuna que contienen los mismos Download PDF

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Abstract

Compuesto de GLA que tiene la siguiente estructura (I):**Fórmula** o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que: L1, L2, L3 y L4 son iguales o diferentes e independientemente -O-, -NH- o -(CH2)-; L5 y L6 son -O-; L7, L8, L9 y L10 son -C(>=O)-; Y1 es -OP(>=O)(OH)2; Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH; R1, R3, R5 y R6 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C8-13; y R2 y R4 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C6-11.

Description

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DESCRIPCION
Adyuvantes lip^dicos de glucopiranosilo sinteticos y composiciones de vacuna que contienen los mismos Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio segun 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/184.703 presentada el 5 de junio de 2009.
Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de las composiciones farmaceuticas y de vacunas. Mas espedficamente, las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a composiciones farmaceuticas y de vacuna, asf como a metodos profilacticos y terapeuticos relacionados, en los que las composiciones comprenden un adyuvante lipfdico de glucopiranosilo (GLA, glucopyranosyl lipid adjuvant) tal como se describe en el presente documento.
Descripcion de la tecnica relacionada
El sistema inmunitario de los organismos superiores se ha caracterizado mediante la distincion entre agentes foraneos (o no propios, “non-self”) de los componentes familiares o propios (“self”), de tal manera que los agentes foraneos provocan respuestas inmunitarias, mientras que los componentes propios se ignoran o toleran. Las respuestas inmunitarias se han caracterizado tradicionalmente o bien como respuestas humorales, en las que se producen anticuerpos espedficos para los antfgenos por linfocitos B diferenciados conocidos como celulas plasmaticas, o bien como respuestas mediadas por celulas, en las que diversos tipos de linfocitos T actuan para eliminar los antigenos mediante varios mecanismos. Por ejemplo, las celulas T auxiliares CD4+, que pueden reconocer antigenos espedficos, pueden responder liberando mediadores solubles, tales como las citocinas, para reclutar celulas del sistema inmunitario adicionales para que participen en una respuesta inmunitaria. Tambien las celulas T citotoxicas CD8+, que tambien pueden reconocer un antfgeno espedfico, pueden responden uniendose a y destruyendo o danando una celula o partmula que porte el antigeno. En las tecnicas inmunologicas, se sabe proporcionar determinadas vacunas segun varias formulaciones, habitualmente con el proposito de inducir una respuesta inmunitaria deseada en un huesped.
Varias estrategias para provocar respuestas inmunitarias espedficas mediante la administracion de una vacuna a un huesped incluyen la inmunizacion con patogenos infecciosos muertos por calor o vivos pero atenuados, tales como virus, bacterias o determinados patogenos eucariotas; la inmunizacion con un agente infeccioso no virulento que puede dirigir la expresion del material genetico que codifica para el/los antfgeno(s) para los que se desea una respuesta inmunitaria; y la inmunizacion con vacunas de subunidades que contienen inmunogenos (tales como protemas) aislados a partir de un patogeno particular con el fin de inducir inmunidad frente al patogeno (vease, por ejemplo, Liu, 1998, Nature Medicine 4 (supl. 5): 515). Para determinados antfgenos, puede haber uno o mas tipos de inmunidades deseadas para las que ninguno de estos enfoques ha sido particularmente eficaz, incluyendo el desarrollo de vacunas que son eficaces para proteger inmunologicamente al huesped frente a virus de la inmunodeficiencia humana u otros patogenos infecciosos, cancer, enfermedad autoinmunitaria u otros estados clmicos.
Se sabe desde hace mucho tiempo, que el lipopolisacarido (LPS) enterobacteriano es un estimulador potente del sistema inmunitario, aunque su uso en adyuvantes se ha restringido por sus efectos toxicos. Un derivado no toxico del LPS, el monofosforil-lfpido A (MPL), producido mediante la eliminacion del grupo hidrato de carbono y del grupo fosfato centrales de la glucosamina de extremo reductor, se ha descrito por Ribi et al. (1986, Inmunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp. NY, pags. 407-419).
Una version desintoxicada adicional del MPL resulta de eliminar la cadena de acilo de la posicion 3 de la estructura principal de disacarido, y se denomina monofosforil-lfpido A 3-O-desacilado (3D-MPL). Puede purificarse y prepararse mediante metodos que se ensenan en el documento GB 2122204B, referencia que tambien describe la preparacion del difosforil-lfpido A y sus variantes 3-O-desaciladas. Por ejemplo, se ha preparado el 3D-MPL en forma de una emulsion que tiene un tamano de partmula pequeno de menos de 0,2 |im de diametro, y su metodo de fabricacion se describe en el documento WO 94/21292. En el documento WO 9843670A2 se han descrito formulaciones acuosas que comprenden monofosforil-lfpido A y un tensioactivo. El documento WO 2009/035528 A2 describe monosacaridos y disacaridos funcionalizados adecuados para su uso en la smtesis de moleculas de lfpido A, que pueden modular la respuesta inmunologica innata. Montminy S. et al, “Virulence factors of Yersinia pestis are overcome by a strong lipopolisaccharide response”, NATURE IMMUNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, (20061001), vol. 7, n.° 10, paginas 1066 - 1073, describe el papel del lfpido A en la respuesta inmunitaria mediada por TLR 4. El documento EP 0 172 581 A2 describe derivados de disacarido que tienen actividades similares al ifpido A natural. Yoshiyuki F. et al, “Synthesis of Rubrivivax gelatinosus Lipid A and Analogues for Investigation of the Structural Basis for Immunostimulating and Inhibidory Activities”, BULLETIN OF THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 81, n.° 7, paginas 796 - 819, describe la smtesis de lfpido A de Rubrivivax gelatinosus y derivados del mismo, que mostraron una potente actividad inmunoestimuladora. Los coadyuvantes derivados de lipopolisacarido
bacteriano para formularse en combinaciones adyuvantes pueden purificarse y procesarse a partir de fuentes bacterianas, o alternativamente pueden ser sinteticos. Por ejemplo, en Ribi et al. 1986 (citado anteriormente) se describe el monofosforil-Kpido A purificado, y el monofosforil- o difosforil-Kpido A 3-O-desacilado derivado de Salmonella sp. se describe en el documento GB 2220211 y en la patente estadounidense n.° 4.912.094. Se han 5 descrito el 3D-MPL y los disacaridos de glucosamina p(1-6) as^ como otros lipopolisacaridos purificados y sinteticos (documento WO 98/01139; patente estadounidense n.° 6.005.099 y documento EP 0 729 473 B1; Hilgers et al. 1986 Int. Arch. Allergy Immunol. 79 (4): 392-6; Hilgers et al.1987, Immunology 60 (1): 141-6; y el documento EP 0 549 074 B1). Se han descrito combinaciones de 3D-MPL y adyuvantes de saponina derivados de la corteza de Quillaja Saponaria molina en el documento EP 0 761 231B. El documento WO 95/17210 da a conocer una sistema de
10 adyuvante en emulsion basado en escualeno, a-tocoferol y monooleato de polioxietileno-sorbitano (TWEENtm-80), formulado con el inmunoestimulante QS21 e incluyendo opcionalmente 3D-MPL. A pesar de la accesibilidad de tales combinaciones, el uso de adyuvantes derivados de productos naturales esta acompanado por costes de produccion elevados, incoherencias entre lotes, dificultades asociadas con la produccion a gran escala, e incertidumbre con respecto a la presencia de impurezas en la composicion de cualquier preparacion dada.
15 Por consiguiente, hay una necesidad clara de vacunas mejoradas y, en particular, de vacunas que contengan de forma beneficiosa componentes adyuvantes qmmicamente definidos, de alta pureza, que presenten coherencia entre lotes y que puedan fabricarse de forma eficaz a escala industrial sin introducir contaminantes no deseados o estructuralmente no definidos. La presente invencion proporciona composiciones y metodos para tales vacunas, y ofrece otras ventajas asociadas.
20 Breve sumario de la invencion
La presente invencion en sus diversos aspectos se refiere a compuestos, composiciones y metodos que emplean ventajosamente determinados adyuvantes lipidicos de glucopiranosilo sinteticos (GLA) como inmunomoduladores o adyuvantes. Por tanto, la invencion describe las siguientes realizaciones tal como se definen en los puntos 1-13:
1. Un compuesto de GLA que tiene la siguiente estructura (I):
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que:
L1, L2, L3 y L4 son iguales o diferentes e independientemente -O-, -NH-o -(CH2)-;
L5 y L6 son -O-;
L7, La, Lg y L10 son -C(=O)-;
30 Y1 es -OP(=O)(OH)2;
Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH;
R1, R3, R5 y R6 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C8-13; y R2 y R4 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C6.11.
2. Un compuesto de GLA segun el punto 1, en el que R1, R3, R5 y R6 son cada uno alquilo Cx, en el que x es 35 constante y se selecciona de un numero entero de 8-13, y R2 y R4 son ambos alquilo Cx-2, y el compuesto de GLA tiene la siguiente formula (III):
imagen1
imagen2
3. Un compuesto de GLA segun el punto 2, en el que x se selecciona de un numero entero de 10-12.
4. Un compuesto de GLA segun el punto 3, en el que x es 11, y el compuesto de GLA tiene la siguiente estructura (IV):
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imagen3
5. Un compuesto de GLA segun el punto 1, en el que L1 y L3 son ambos -O-y L2 y L4 son ambos -NH-, y el compuesto de GLA tiene la siguiente formula (VI):
imagen4
6. Un compuesto de GLA segun el punto 1, en el que Y1 es -OP(O)(OH)2, Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH, L1 y L3 son 10 ambos -O-, L2 y L4 son ambos -NH-, R1, R3, R5 y R6 cada uno son alquilo Cx en el que x es constante y se selecciona de un numero entero de 8-13, y R2 y R4 son ambos alquilo Cx-2, y el compuesto de GLA tiene la siguiente formula (VIII):
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7. Un compuesto de GLA segun el punto 6, en la que x es 11, y el compuesto de GLA tiene la siguiente estructura (IX):
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8. Una composicion de vacuna que comprende un compuesto de uno cualquiera de los puntos 1-7, en combinacion con un antigeno o un vector de expresion recombinante que codifica para un antigeno.
9. La composicion de vacuna del punto 8, en la que el constructo de expresion recombinante es un vector viral.
10. La composicion de vacuna del punto 9, en la que el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector de adenovirus, un vector de virus adenoasociado, un vector de herpesvirus , un vector de lentivirus, un vector de poxvirus y un vector de retrovirus .
11. Una composicion de vacuna del punto 8, para su uso en la produccion o potenciacion de una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno en un sujeto.
12. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de uno cualquiera de los puntos 1-7, y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.
13. Una composicion farmaceutica del punto 12, para estimular una respuesta inmunitaria inespedfica en un sujeto.
Los compuestos de GLA de la presente invencion tienen utilidad en una amplia gama de aplicaciones terapeuticas en las que se desea la induccion de respuestas inmunitarias espedficas o inespedficas. Por ejemplo, en determinados aspectos de la invencion, se proporcionan composiciones de vacuna que comprenden uno o mas compuestos de GLA tal como se expone en el presente documento en combinacion con un antigeno. Tales composiciones de vacuna pueden usarse ventajosamente en metodos para estimular respuestas inmunitarias espedficas de antigeno en sujetos que lo necesitan. En otros aspectos de la invencion, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas compuestos de GLA tal como se expone en el presente documento, en las que las composiciones carecen sustancialmente de antigeno. Tales composiciones farmaceuticas pueden usarse ventajosamente en metodos para estimular respuestas inmunitarias inespedficas en sujetos que lo necesitan, por ejemplo en el tratamiento de infeccion, rinitis estacional y similares.
Estos y otros aspectos de la presente invencion resultaran evidentes con referencia a la siguiente descripcion detallada y los dibujos adjuntos. Ademas, en el presente documento se exponen diversas referencias que describen con mas detalle determinados aspectos de esta invencion.
Breve descripcion de las diversas vistas del/de los dibujos(s)
La figura 1 demuestra la produccion de la citocina IFN-y inducida in vivo tras la vacunacion de ratones con composiciones de la invencion que comprenden antigeno y GLA.
Las figuras 2A-2F muestran respuestas de anticuerpos inducidas in vivo tras la vacunacion de ratones con composiciones de la invencion que comprenden antigeno y GLA.
La figura 3 muestra la potenciacion de NF-kB observada a diferentes concentraciones de un compuesto de GLA ilustrativo de la invencion (compuesto IX).
Las figuras 4A-4D muestran la induccion de citocinas inmunoestimuladoras (MIP-1b y TNFa) a diferentes concentraciones de un compuesto de GLA ilustrativo de la invencion (compuesto IX).
Descripcion detallada de la invencion
Se sabe que el monofosforil-lipido A (MPL) y otros adyuvantes relacionados median en sus efectos, al menos en parte, actuando como agonistas de receptores de tipo toll (TLR). Los compuestos de adyuvante lipidico de glucopiranosilo (GLA) de la presente invencion se disenaron de manera racional basandose en consideraciones de estructura 3D en relacion con la estimulacion de receptores TLR. Mas espedficamente, segun la presente invencion, definiendo selectivamente las longitudes de cadena de acilo de los compuestos de GLA de la invencion de tal manera que logren una parte inferior “plana” en la estructura tridimensional de los compuestos, puede lograrse un encaje mejorado dentro del sitio de union de un receptor TLR, dando como resultado de ese modo propiedades
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inmunoestimuladoras potenciadas y estimulacion potenciada de TLR. Ademas, la solubilidad de los compuestos de GLA de la invencion (por ejemplo, en disoluciones acuosas) se mejora ventajosamente debido a las longitudes de cadena de acilo acortadas, facilitando de ese modo una formulacion de compuestos eficiente y eficaz. Ademas, dado que las longitudes de cadena de acilo se adaptan a medida para hacer que la molecula sea “plana” de manera tridimensional a lo largo de la parte inferior de la molecula, los compuestos pueden incorporarse mas eficazmente dentro de vesfculas, por ejemplo, para formulaciones liposomicas.
Todavfa mas, los compuestos de la invencion proporcionan perfiles ventajosos de potencia con respecto a toxicidad. Por ejemplo, los compuestos de la invencion pueden usarse en un intervalo amplio y relativamente alto de dosificaciones para lograr un nivel de actividad deseado (por ejemplo, actividad adyuvante), y que sigan siendo al mismo tiempo sustancialmente no toxicos para celulas humanas y para pacientes humanos, tal como se someten a ensayo, por ejemplo, mediante los niveles de factor de necrosis tumoral producido a partir de celulas humanas en un intervalo de concentraciones, que se eleva rapidamente y se equilibra a diferencia de otros agonistas de TLR4 mas toxicos tales como lipopolisacarido. Este ensayo basado en celulas debe ser predictivo de marcadores inflamatorios inferiores como la protema C-reactiva implicada en acontecimientos adversos en la farmacologfa de seres humanos. El perfil favorable de potencia frente a toxicidad para los compuestos de la invencion puede ser particularmente importante, por ejemplo, cuando se administran a ninos cuya tolerancia a citocinas puede ser menor, o cuando los compuestos se usan en formulaciones dirigidas a una poblacion grande en la que respuestas mas niveladas se traduciran en desenlaces clmicos mas constantes para personas con una capacidad de respuesta variada al agonismo de TLR. De manera similar, se simplificara la aprobacion normativa puesto que la dosificacion objetivo sera mas flexible y se simplificara la fabricacion cuando no sea necesario controlar el intervalo de principio activo farmaceutico a un nivel de tolerancia estricto.
Por tanto, la presente invencion en sus multiples realizaciones proporciona compuestos, composiciones de vacuna, composiciones de adyuvante, composiciones farmaceuticas y formulaciones relacionadas y metodos relacionados que incluyen compuestos de GLA sinteticos tal como se describe en el presente documento. Los compuestos de GLA representan inmunomoduladores sinteticos que, ventajosamente con respecto a adyuvantes de la tecnica anterior, y en particular con respecto a adyuvantes de productos naturales, pueden prepararse en una forma esencialmente homogenea. Ademas, los compuestos de GLA de la invencion pueden prepararse de manera eficaz y economica mediante fabricacion qmmica de smtesis a gran escala, a diferencia de los adyuvantes derivados de productos naturales. Dado que un adyuvante sintetico que se sintetiza qmmicamente a partir de materiales de partida definidos para obtener un producto definido qmmicamente presenta coherencia cualitativa y cuantitativa entre lotes, los compuestos de GLA de la invencion ofrecen beneficios que incluyen un control de calidad del producto mejorado.
Tal como se describe en el presente documento, las composiciones y los metodos para su uso incluyen en algunas realizaciones el uso del gLa por sf mismo con un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable para su actividad como adyuvante inmunologico (por ejemplo, actividad inmunoestimuladora inespedfica), incluyendo “como adyuvante” cuando la administracion del GLA a un sujeto puede ser totalmente independiente de, y/o separada temporal y/o espacialmente de, la administracion al sujeto de uno o mas antfgenos frente a los que se desea la produccion o la potenciacion de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta espedfica de antfgeno) en el sujeto. Otras realizaciones incluyen el uso del GLA en una composicion de vacuna que tambien incluye uno o varios antfgenos para los que se desea que la vacuna produzca o potencie una respuesta inmunitaria.
Tal como se describe en el presente documento, estas composiciones de vacuna tambien pueden incluir en determinadas realizaciones relacionadas uno o mas agonistas del receptor de tipo toll (TLR) y/o uno o varios de uno o mas coadyuvantes, un modificador de respuesta inmunitaria de imidazoquinolina o un modificador inmunitario de doble tallo-bucle (dSLIM). En otras realizaciones relacionadas, una composicion de vacuna tal como se proporciona en la presente memoria puede comprender GLA y uno o mas constructos de expresion recombinantes, comprendiendo cada uno de ellos un promotor operativamente unido a una secuencia de acido nucleico que codifica para el antfgeno frente al que se desea la produccion o la potenciacion de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta espedfica de antfgeno) en el sujeto.
GLA
Tal como se indico anteriormente, dado que el GLA es un adyuvante sintetizado qmmicamente, el GLA puede prepararse en una forma esencialmente homogenea, lo que se refiere a una preparacion de GLA que es puro en al menos el 80%, preferiblemente al menos el 85%, mas preferiblemente al menos el 90%, mas preferiblemente al menos el 95% y todavfa mas preferiblemente al menos el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con respecto a la molecula de GLA.
Los compuestos de GLA dados a conocer en el presente documento tienen la siguiente formula (A):
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o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, en la que:
Li, L2, L3, L4, L5 y L6 son iguales o diferentes e independientemente -O-, -NH- o -(CH2)-;
L7, L8, L9 y L10 son iguales o diferentes e independientemente ausentes o -C(=O)-;
Yi es un grupo funcional acido;
Y2 e Y3 son iguales o diferentes e independientemente -OH, -SH, o un grupo funcional acido; Y4 es -OH o -SH;
Ri, R3, R5 y R6 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C8-13; y R2 y R4 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C6-11.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos anteriores tienen el siguiente significado:
"Alquilo” significa un hidrocarburo alifatico de cadena lineal o ramificado, no dclico o dclico, saturado o insaturado, que contiene desde 1 hasta 20 atomos de carbono, y en determinadas realizaciones preferidas que contiene desde 11 hasta 20 atomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, n- propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares, incluyendo undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, etc.; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec- butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo y similares. Los alquilos dclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que los alquilos dclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares. Los alquilos dclicos tambien se denominan en el presente documento "homociclos” o "anillos homodclicos”. Los alquilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre dos atomos de carbono adyacentes (denominados "alquenilo” o "alquinilo” respectivamente). Los alquenilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2- pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo y similares; mientras que los alquinilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2- pentinilo, 3-metil-1 -butinilo y similares.
"Alquilo C8-13” y "alquilo C6-11” significan un alquilo tal como se definio anteriormente, que contienen 8-13 o 6-11 atomos de carbono, respectivamente.
"Grupo funcional acido” significa un grupo funcional que puede donar un proton en medios acuosos (es decir, un acido de Br0nsted-Lowry). Despues de donar un proton, el grupo funcional acido se convierte en una especie cargada negativamente (es decir, la base conjugada del grupo funcional acido). Los ejemplos de grupos funcionales acido incluyen pero no se limitan a: -OP(=O)(OH)2 (fosfato), -OS(=O)(OH)2 (sulfato), -oS(OH)2 (sulfito), -C(=O)OH (carboxilato), -OC(=O)CH(NH2)CH2C(=O)OH (aspartato), -OC(=O)CH2CH2C(=O)OH (succinato) y
-OC(=O)CH2OP(=O)(0h)2 (carboximetilfosfato).
En realizaciones mas espedficas, se dan a conocer compuestos de GLA de formula (A), en los que L5 y L6 son ambos -O y L7, L8, L9 y L10 son cada uno -C(=O)-, y los compuestos de GLA tienen la siguiente formula (II):
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En realizaciones mas espedficas, se dan a conocer compuestos de GLA de formula (II), en los que Ri, R3, R5 y R6 son cada uno alquilo Cx, en el que x es constante y se selecciona de un numero entero de 8-13, y R2 y R4 son ambos alquilo Cx-2, y los compuestos de GLA tienen la siguiente formula (B):
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En otras realizaciones mas espedficas, se dan a conocer compuestos de GLA de formula (B), en los que x se selecciona de un numero entero de 10-12.
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En otras realizaciones mas espedficas, se dan a conocer compuestos de GLA de formula (B), en los que x es 11, y los compuestos de GLA tienen la siguiente estructura (C)
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Se dan a conocer ademas en el presente documento compuestos de GLA de formula (II), en los que Y1 es -OP(=O)(OH)2 e Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH, y los compuestos de GLA tienen la siguiente formula (I):
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En otras realizaciones espedficas, se dan a conocer compuestos de GLA de formula (II), en los que Li y L3 son ambos -O y L2 y L4 son ambos -NH-, y los compuestos de Gla tienen la siguiente formula (D):
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5 Se dan a conocer ademas en el presente documento compuestos de GLA de formula (II), en los que Yi es -OP(O)(OH)2, Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH, Li y L3 son ambos -O-, y L2 y L4 son ambos -NH-, y los compuestos de GLA tienen la siguiente formula (VI):
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En todavia otras realizaciones espedficas, la presente invencion proporciona compuestos de GLA de formula (II), en 10 los que Yi es -OP(O)(OH)2, Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH, Li y L3 son ambos -O-, L2 y L4 son ambos -NH-, Ri, R3, R5
y R6 cada son alquilo Cx en el que x es constante y se selecciona de un numero entero de 8-i3, y R2 y R4 son ambos alquilo Cx-2, y los compuestos de GLA tienen la siguiente formula (VIII):
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En realizaciones mas espedficas de formula (VIII), x es 11, y la invencion proporciona un compuesto de GLA que tiene la siguiente estructura (IX):
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5 Compuestos de GLA
Tal como se menciono anteriormente, la presente invencion proporciona compuestos de GLA. Los compuestos de GLA de la presente invencion pueden prepararse mediante tecnicas de smtesis organica conocidas, incluyendo los metodos descritos con mas detalle en los ejemplos. En general, los compuestos de GLA de estructura (I) pueden prepararse mediante los siguientes esquemas de reaccion, en los que todos los sustituyentes son tal como se 10 definio anteriormente a menos que se indique de otro modo.
Esquema de reaccion 1
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La estructura principal de azucar de compuestos de GLA representativos puede prepararse generalmente segun el esquema de reaccion 1, en el que G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9 y G10 son o bien iguales o bien diferentes e
15 independientemente un grupo protector apropiado o hidrogeno. Un azucar apropiado, tal como (i), puede adquirirse o prepararse segun metodos que conocen los expertos en la tecnica. Los grupos funcionales de azucar (i) pueden protegerse entonces por completo usando metodos que conocen los expertos en la tecnica para obtener (ii). A este respecto, un experto en la tecnica reconocera que puede emplearse una estrategia con grupos protectores ortogonales apropiados que permita la desproteccion selectiva de los grupos funcionales de azucar. Los grupos
protectores adecuados incluyen pero no se limitan a silil eteres, bencil eteres, aliloxicarbonilo, acetales, Fmoc, azida, y similares. La desproteccion de Gi da como resultado el alcohol libre (iii) que puede acoplarse entonces con el azucar protegido (iv) usando condiciones acoplamiento de apropiadas, por ejemplo CCl3CN/NaH, para obtener la estructura principal de azucar (v) deseada.
5 Esquema de reaccion 2
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Pueden prepararse fragmentos de cola de compuestos de GLA representativos, en los que L5 y L6 son ambos -O- y L7, La, L9 y L10 son cada uno -C(=O)-, generalmente segun el esquema de reaccion 2, en el que G11 representa un grupo protector apropiado. Pueden adquirirse o prepararse compuestos de acido de estructura (vi) segun metodos 10 que conocen los expertos en la tecnica. La reaccion de (vi) con un reactivo apropiado, tal como hidrogenomalonato de metilo, proporciona el cetoester (vii). La reduccion de (vii) proporciona el alcohol (viii). Un experto en la tecnica reconocera que en condiciones apropiadas el grupo ceto de (vii) puede reducirse de manera estereoespedfica tal como se ejemplifica en los ejemplos. La saponificacion de (viii) proporciona el acido (ix) que puede protegerse posteriormente para proporcionar (x). El tratamiento de (x) con el cloruro de acido (xi) proporciona (xii) que tras 15 desproteccion proporciona (xiii). Los compuestos (ix) y (xiii) pueden convertirse ambos en un derivado de cloruro de acido protegido de manera adecuada mediante metodos que conocen los expertos en la tecnica y unirse a la estructura principal de azucar del compuesto de GLA tal como se muestra en el esquema de reaccion 3 a continuation. Aunque el esquema de reaccion 2 representa la smtesis de un fragmento de cola de compuesto de GLA que comprende R1 y R2, debe entenderse que tambien pueden prepararse otros fragmentos de cola que 20 comprenden otros grupos alquilo (por ejemplo R3, R4, R5, y R6) mediante un metodo analogo. Tambien pueden prepararse otros fragmentos de cola con diferentes grupos L5, L6, L7, La, L9 y L10 mediante metodos analogos.
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Esquema de reaccion 3
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Pueden prepararse compuestos de GLA representativos generalmente segun el esquema de reaccion 3, en el que G12 y G13 son iguales o diferentes e independientemente representan un grupo protector apropiado. La retirada del grupo protector G5 de (v) seguido por la reaccion con el cloruro de acido (xiv) produce (xv). De manera similar, la retirada del grupo protector G8 de (xv) seguido por la reaccion con el cloruro de acido (xvi) da como resultado (xvii). La desproteccion de (xvii) y la reaccion con el cloruro de acido (xviii) proporciona (xix). La retirada de Gg y la reaccion con (xx) produce entonces el compuesto de GLA protegido (xxi). La desproteccion global de (xxi) da como resultado un compuesto de estructura (II). Aunque el esquema de reaccion 3 representa la smtesis de un compuesto de estructura (II), un experto en la tecnica reconocera que pueden emplearse metodos analogos para producir cualquier compuesto de estructura (I). Ademas, un experto en la tecnica tambien reconocera que con la seleccion de los grupos protectores apropiados, la desproteccion final da como resultado el compuesto deseado.
Los compuestos de la presente invencion pueden utilizarse generalmente como la base libre o el acido libre.
Alternativamente, los compuestos de esta invencion pueden usarse en forma de sales de adicion de acido o de
base. Las sales de adicion de acido de los compuestos de amino libre de la presente invencion pueden prepararse mediante metodos bien conocidos en la tecnica, y pueden formarse a partir de acidos organicos e inorganicos. Los acidos organicos adecuados incluyen acidos maleico, fumarico, benzoico, ascorbico, succmico, metanesulfonico, acetico, oxalico, propionico, tartarico, salicilico, citrico, gluconico, lactico, mandelico, cinamico, aspartico, estearico, palmftico, glicolico, glutamico y bencenosulfonico. Los acidos inorganicos adecuados incluyen clorhfdrico, bromtndrico, sulfurico, fosforico y mtrico.
De manera similar, las sales de adicion de base de los compuestos de acido de la presente invencion pueden prepararse mediante metodos bien conocidos en la tecnica, y pueden formarse a partir de bases organicas e
inorganicas. Las bases organicas adecuadas incluyen pero no se limitan a, trietilamina y piridina. Las bases
inorganicas adecuadas incluyen pero no se limitan a, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, carbonato de sodio, carbonato de potasio y amoniaco. Por tanto, el termino “sal farmaceuticamente aceptable” de estructura (I) pretende englobar todas y cada una de las formas de sal aceptables.
Ademas, tambien estan incluidos profarmacos dentro del contexto de esta invencion. Los profarmacos son cualquier portador unido covalentemente que libera un compuesto de estructura (I) in vivo cuando tal profarmaco se administra a un paciente. Los profarmacos se preparan generalmente modificando grupos funcionales de tal manera que la modificacion se escinde, o bien mediante manipulacion de rutina o bien in vivo, proporcionando el compuesto
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original. Los profarmacos incluyen, por ejemplo, compuestos de esta invencion en los que se unen grupos hidroxilo, amina o sulfhidrilo a cualquier grupo que, cuando se administra a un paciente, se escinde para formar los grupos hidroxilo, amina o sulfhidrilo. Por tanto, los ejemplos representativos de profarmacos incluyen (pero no se limitan a) derivados de acetato, formato y benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de los compuestos de estructura (I). Ademas, en el caso de un acido carboxflico (COOH), pueden emplearse esteres, tales como esteres metilicos, esteres etilicos, y similares.
Con respecto a los estereoisomeros, los compuestos de estructura (I) pueden tener centros quirales y pueden aparecer como racematos, mezclas racemicas y como enantiomeros o diastereomeros individuales. Todas de tales formas isomericas estan incluidas dentro de la presente invencion, incluyendo mezclas de las mismas. Ademas, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de estructura (I) pueden existir como polimorfos, que estan incluidos en la presente invencion. Ademas, algunos de los compuestos de estructura (I) tambien pueden formar solvatos con agua u otros disolventes organicos. Tales solvatos estan incluidos de manera similar dentro del alcance de esta invencion.
Antigeno
Un antigeno para su uso en determinadas realizaciones de las composiciones de vacuna y metodos que emplean GLA descritos en el presente documento, puede ser cualquier epftopo diana, molecula (incluyendo una biomolecula), complejo molecular (incluyendo complejos moleculares que contienen biomoleculas), conjuntos subcelulares, celulas o tejidos frente a los que se desea una produccion o potenciacion de la inmunorreactividad en un sujeto. Frecuentemente, el termino antigeno se refiere a un antigeno polipeptidico de interes. Sin embargo, antigeno, tal como se usa en el presente documento, tambien puede referirse a un constructo recombinante que codifica para un antigeno polipeptidico de interes (por ejemplo, un constructo de expresion). En determinadas realizaciones preferidas, el antigeno puede ser, o puede derivarse de, o puede presentar reactividad inmunologica cruzada con, un patogeno infeccioso y/o un epftopo, biomolecula, celula o tejido que esta asociado con una infeccion, cancer, enfermedad autoinmunitaria, alergia, asma o cualquier otro estado en el que seria deseable o beneficiosa la estimulacion de una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno.
Preferiblemente y en determinadas realizaciones, las formulaciones de vacuna de la presente invencion contienen un antigeno o una composicion antigenica que puede producir una respuesta inmunitaria frente a un patogeno humano o de otro mairftfero, antigeno o composicion antigenica que puede incluir una composicion derivada de un virus, tal como el VIH-1 (tal como tat, nef, gp120 o gp160), virus del herpes humano, tal como gD o derivados del mismo o una protema de expresion precoz tal como ICP27 de VHS1 o VHS2, citomegalovirus ((esp. humano) (tal como gB o derivados del mismo), rotavirus (incluyendo virus vivos atenuados), virus de Epstein-Barr (tal como gp350 o derivados del mismo), virus de la varicela zoster (tal como gpl, II e IE63), o de un virus de la hepatitis tal como el virus de la hepatitis B (por ejemplo antigeno de superficie de la hepatitis B o un derivado del mismo), virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C y virus de la hepatitis E, o de otros patogenos virales, tales como paramixovirus: virus respiratorio sincitial (tal como las protemas F y G o derivados de las mismas), virus paragripal, virus del sarampion, virus de las paperas, virus del papiloma humano (por ejemplo, VPH6, 11, 16, 18, etc.), flavivirus (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus de la gripe (virus completamente vivos o inactivados, virus de la gripe fraccionado, cultivado en huevos o celulas MDCK, o virosomas de gripe completos (tal como se ha descrito por Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o protemas purificadas o recombinantes de los mismos, tales como las protemas HA, NP, NA o M o combinaciones de las mismas).
En algunas otras realizaciones preferidas, las formulaciones de vacuna de la presente invencion contienen un antigeno o una composicion antigenica que puede producir una respuesta inmunitaria frente a un patogeno humano o de otro mairftfero, antigeno o composicion antigenica que puede incluir una composicion derivada de uno o mas patogenos bacterianos, tales como Neisseria spp., incluyendo N. gonorrhea y N. meningitidis (por ejemplo polisacaridos capsulares y conjugados de los mismos, protemas de union a transferina, protemas de union a lactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo, protemas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, acidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi; Moraxella spp., incluyendo M. catarrhalis, tambien conocido como Branhamella catarrhalis (por ejemplo, adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp., incluyendo B. pertussis (por ejemplo pertactina, toxina pertussis o derivados de la misma, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, antigeno 85-A, -B o -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegnatis; Legionella spp., incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp., incluyendo E. coli enterotoxica (por ejemplo, factores de colonizacion, toxina labil frente al calor o derivados de la misma, toxina estable frente al calor o derivados de la misma), E. coli enterohemorragica, E. coli enteropatogenica (por ejemplo toxina tipo Shiga o derivados de la misma); Vibrio spp., incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina del colera y derivados de la misma); Shigella spp., incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo, la protema Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., incluyendo C. jejuni (por ejemplo, toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp., incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp., incluyendo H. pylori (por ejemplo, ureasa, catalasa, toxina vacuolizante); Pseudomonas spp., incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epiderimids; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp.,
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incluyendo C. tetani (por ejemplo, toxina del tetanos y derivados de la misma), C. botulinum (por ejemplo, toxina botulmica y derivados de la misma), C. difficile (por ejemplos toxinas A o B de Clostridium y derivados de las mismas); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo, toxina botulmica y derivados de la misma); Corynebacterium spp., incluyendo C. diphteriae (por ejemplo, toxina de la difteria y derivados de la misma); Borelia spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo, OspA, OIPC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la ehrlichiosis granulodtica humana; Rickettsia spp., incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp. Incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, protemas de union a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo, MOMp, protemas de union a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum (por ejemplo las protemas de membrana exterior raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; u otros patogenos bacterianos.
En algunas otras realizaciones preferidas, las formulaciones de vacuna de la presente invencion contienen un antfgeno o una composicion antigenica que puede producir una respuesta inmunitaria frente a un patogeno humano o de otro mairnfero, antigeno o composicion antigenica que puede incluir una composicion derivada de uno o mas parasitos (vease, por ejemplo, John, D. T. y Petri, W. A., Markell and Voge's Medical Parasitology, 9a ed., 2006, WB Saunders, Filadelfia; Bowman, D. D., Georgi's Parasitology for Veterinarians - 8a ed., 2002, WB Saunders, Filadelfia), tales como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por ejemplo, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; Leshmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; o a partir de un helminto que puede infectar a un mai^ero, tales como: (i) infecciones por nematodos (incluyendo, pero sin limitarse a, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wucheria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis y Strongyloides stercoralis; (ii) infecciones por trematodos (incluyendo, pero sin limitarse a, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp., Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); y (iii) infecciones por cestodos (incluyendo, pero sin limitarse a, Taenia saginata y Taenia solium). Determinadas realizaciones pueden contemplar por tanto composiciones de vacuna que incluyen un antfgeno derivado de Schisostoma spp., Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium y/o Schistosoma japonicum, o derivado de levaduras, tales como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans.
Otros antfgenos espedficos preferidos para M. tuberculosis son, por ejemplo, Th Ra12, Tb H9, Tb Ra 35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCCI (documento WO 99/51748). Las protemas para M. tuberculosis tambien incluyen protemas de fusion y variantes de las mismas, en las que al menos dos polipeptidos, preferiblemente tres, de M. tuberculosis se fusionan para dar una protema mayor. Las fusiones preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9- DPV-MTI (documento WO 99151748).
Determinados antfgenos preferidos para Chlamydia incluyen, por ejemplo, las protemas de alto peso molecular (HWMP) (documento WO 99/17741), ORF3 (documento EP 366 412) CT622, CT610, pmpD, UVEB y supuestas protemas de membrana (Pmp). Otros antfgenos de Chlamydia de la formulacion para vacuna pueden seleccionarse del grupo descrito en el documento WO 99128475. Las vacunas bacterianas preferidas comprenden los antfgenos derivados de Streptococcus spp., incluyendo S. pneumoniae (por ejemplo, polisacaridos capsulares y conjugados de los mismos, PsaA, PspA, PdB, estreptolisina, protemas de union a colina) y el antfgeno de protema pneumolisina (Biochem. Biophys. Acta, 1989, 67, 1007); Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) y derivados mutantes destoxificados del mismo (documentos WO 90/06951; WO 99/03884). Otras vacunas bacterianas preferidas comprenden antfgenos derivados de Haemophilus spp., incluyendo H. influenza tipo B (por ejemplo PRP y conjugados del mismo), H. influenza no tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, protema D y lipoprotema D, y fimbrina y peptidos derivados de fimbrina (patente estadounidense n.° 5.843.464) o variantes de multiples copias o protemas de fusion de las mismas.
Se conocen bien en la tecnica derivados del antfgeno de superficie de la hepatitis B e incluyen, entre otros, los antfgenos PreS1 y Pars2 S descritos en las solicitudes de patente europea EP-A414 374; EP-A-0304 578 y EP 198474. En un aspecto preferido, la formulacion de vacuna de la invencion comprende el antfgeno de VIH-1, gp120, especialmente cuando se expresa en celulas CHO. En una realizacion adicional, la formulacion de vacuna de la invencion comprende gD2t tal como se definio anteriormente en el presente documento.
En una realizacion preferida de la presente invencion, las vacunas que contienen el adyuvante reivindicado comprenden un antfgeno derivado del virus del papiloma humano (VPH) considerado responsable de las verrugas genitales (VPH 6 o VPH 11 y otros), y los virus VPH responsables del cancer de cuello uterino (VPH 16, VPH 18 y otros). Formas particularmente preferidas de vacuna profilactica o terapeutica contra las verrugas genitales comprenden partfculas L1 o capsomeros, y protemas de fusion que comprenden uno o mas antfgenos seleccionados de las protemas de VPH 6 y VPH 11, E6, E7, L1 y L2. Determinadas formas preferidas de protemas de fusion incluyen la L2E7 tal como se da a conocer en el documento WO 96/26277 y la protema D(1/3)-E7 dada a conocer en el documento GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285). Una composicion para la profilaxis o vacuna terapeutica preferida frente a la infeccion o el cancer de cuello uterino por VPH puede comprender antfgenos de
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VPH 16 o VPH 18. Por ejemplo, los monomeros de antigeno L1 o L2, o los antfgenos L1 o L2 presentados juntos como una partteula pseudoviral (VLP, virus like particle) o la protema L1 sola presentada sola en una VLP o estructura de capsomero. Dichos antfgenos, partteulas pseudovirales y capsomeros se conocen per se. Veanse, por ejemplo, los documentos WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 y WO 93/02184.
Pueden incluirse protemas de expresion temprana adicionales solas o como protemas de fusion, tales como E7, E2 o preferiblemente F5, por ejemplo; las realizaciones preferidas incluyen una VLP que comprende protemas de fusion L1E7 (documento WO 96/11272). Antigenos de VpH 16 particularmente preferidos comprenden las protemas de expresion temprana E6 o F7 en fusion con un transportador de protema D para formar fusiones protema D-E6 o E7 a partir de VPH 16, o combinaciones de los mismos; o combinaciones de e6 o E7 con L2 (documento WO 96/26277). Alternativamente, las protemas de expresion temprana E6 o E7 de VPH 16 o VPH 18 pueden presentarse en una sola molecula, preferiblemente en una fusion protema D-E6/E7. Tal vacuna puede contener opcionalmente cualquiera de las protemas E6 y E7 de VPH 18 o ambas, preferiblemente en forma de una protema de fusion protema D-E6 o protema D-E7 o una protema de fusion protema D-E6/E7. La vacuna de la presente invencion puede comprender adicionalmente antfgenos de otras cepas de VPH, preferiblemente de las cepas VPH 31 o 33.
Las vacunas de la presente invencion pueden comprender ademas antigenos derivados de parasitos que producen la malaria. Por ejemplo, los antfgenos preferidos de Plamodia falciparum incluyen el, S y TRAP. RTS es una protema hterida que comprende esencialmente toda la parte C-terminal de la protema del circumsporozoito (CS) de P. falciparum unida, mediante cuatro aminoacidos de la parte preS2 del antfgeno de superficie de la hepatitis B, al antfgeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se da a conocer en la solicitud de patente internacional n.° PCT/EP92/02591, publicada como el documento WO 93/10152 y que reivindica la prioridad de la solicitud de patente britanica n.° 9124390.7. Cuando se expresa en hongos, se produce RTS como una partteula de lipoprotema y cuando se coexpresa con el antigeno S de VHB produce una partteula mixta denominada RTS,S.
Los anrtgenos TRAP se describen en la solicitud de patente internacional n.° PCT/GB89/00895 publicada como el documento WO 90/01496. Una realizacion preferida de la presente invencion es una vacuna contra la malaria en la que la preparacion antigenica comprende una combinacion de los anrtgenos RTS,S y TRAP. Otros anrtgenos de plasmodios que son probables candidates a ser componentes de una vacuna contra la malaria multiestadio son los MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum y sus analogos en Plasmodium spp.
Por consiguiente, determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento contemplan un anrtgeno que se deriva de al menos un patogeno infeccioso, tal como una bacteria, un virus o un hongo, incluyendo una actinobacteria, tal como M. tuberculosis o M. leprae u otra micobacteria; una bacteria tal como un miembro de los generos Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia o Bordetella; un virus, tal como un virus del herpes simple, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), citomegalovirus, virus de varicela zoster, virus de la hepatitis, virus de Epstein Barr (VEB), virus respiratorio sincitial, virus del papiloma humano (VPH) y un citomegalovirus; VIH, tal como VIH-1 o VIH-2; un hongo, tal como Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides y Pneumocystis, o una levadura incluyendo especies de Candida, tales como C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tripicalis y C. parpasilosis; un parasito, tal como un protozoo por ejemplo una especie de Plasmodium, incluyendo P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale; u otro parasito, tal como uno o mas de Acanthamoeba, Entamoeba hisolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia y Leishmania.
Por ejemplo, en las realizaciones de la vacuna que contiene GLA y que contiene anrtgenos derivados de Borrelia sp., los anrtgenos pueden incluir un acido nucleico, anrtgeno o preparaciones antigenicas derivadas de un patogeno, protemas o peptidos producidos de forma recombinante, y protemas de fusion quimericas. Uno de tales anrtgenos es OspA. OspA puede ser una protema madura completa en forma lipidada por medio de su biosmtesis en una celula huesped (Lipo-OspA) o alternativamente puede ser un derivado no lipidado. Tales derivados no lipidados incluyen la protema de fusion NS1-OspA no lipidada que tiene los primeros 81 aminoacidos N-terminales de la protema no estructural (NS1) del virus de la gripe, y la protema OspA completa, y otra MDP-OspA es una forma no lipidada de OspA que porta 3 aminoacidos N-terminales adicionales.
En la tecnica se conocen composiciones y metodos para identificar sujetos que tienen, o que se sospecha que estan en riesgo de tener, una infeccion con un patogeno infeccioso tal como se ha descrito en el presente documento.
Por ejemplo, la bacteria Mycobacterium tuberculosis produce la tuberculosis (TB). La bacteria ataca generalmente a los pulmones, pero tambien puede atacar al rinon, la medula espinal y el cerebro. Si no se trata de una forma apropiada, la enfermedad TB puede ser mortal. La enfermedad se transmite de una persona a otra por el aire cuando una persona infectada estornuda o tose. En 2003, se registraron mas de 14.000 casos de TB en los Estados Unidos.
Aunque la tuberculosis puede controlarse generalmente usando terapia con antibioticos prolongada, tal tratamiento no es suficiente para prevenir la transmision de la enfermedad, por lo que existe preocupacion con respecto a la
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seleccion potencial de cepas resistentes a antibioticos. Los individuos infectados pueden ser asintomaticos pero contagiosos durante un tiempo. Ademas, aunque el cumplimiento con el regimen de tratamiento es cntico, el comportamiento del paciente es difmil de monitorizar. Algunos pacientes no completan el ciclo de tratamiento, lo que puede conducir a que el tratamiento no sea eficaz y al desarrollo de resistencia a farmacos (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 7.087.713).
En la actualidad, la vacunacion con bacterias vivas es el metodo mas eficaz para inducir inmunidad protectora frente a la tuberculosis. La micobacteria empleada mas comunmente con este objetivo es el bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Sin embargo, la seguridad y eficacia del BCG es una fuente de controversia y en algunos pafses, como en los Estados Unidos, no se vacuna al publico en general. El diagnostico se obtiene habitualmente usando una prueba cutanea que implica la exposicion intradermica a la tuberculina DPP (derivado de la protema purificada). Las respuestas de celulas T espedficas de antfgeno, producen una induracion medible en el lugar de la inyeccion durante las 48-72 horas despues de la inyeccion, lo que indica que ha habido exposicion a los antfgenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad han sido un problema con este analisis, ya que los individuos vacunados con BCG no pueden distinguirse de los individuos infectados (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 7.087.713).
Aunque se ha demostrado que los macrofagos actuan como los principales efectores de la inmunidad frente a M. tuberculosis, las celulas T son los inductores predominantes de dicha inmunidad. El papel esencial de las celulas T en la proteccion frente a la infeccion por M. tuberculosis se ilustra mediante la frecuente incidencia de M. tuberculosis en pacientes con SIDA, debido a la disminucion de las celulas T CD4 asociadas con la infeccion por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se ha demostrado que las celulas T CD4 reactivas a las micobacterias son unas potentes productoras de interferon gamma (IFN-gamma) lo que, a su vez, se ha demostrado que desencadena efectos antimicobacterianos de los macrofagos en ratones. Aunque el papel del IFN-gamma en los seres humanos esta menos claro, estudios han demostrado que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, tanto sola como combinada con IFN-gamma o factor de necrosis tumoral-alfa, activa los macrofagos humanos para que inhiban la infeccion por M. tuberculosis. Ademas, se sabe que IFN-gamma estimula a los macrofagos humanos para que produzcan 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De forma similar, se ha demostrado que IL-12 desempena un papel en la estimulacion de la resistencia a la infeccion por M. tuberculosis. Para una revision de la inmunologfa de la infeccion por M. tuberculosis, vease Chan y Kaufmann en Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Ed. Bloom, ASM Press. Washington D.C. (1994).
Los compuestos y metodos existentes para el diagnostico de la tuberculosis o para inducir inmunidad protectora frente a la tuberculosis incluyen el uso de uno o mas polipeptidos que contienen al menos una parte inmunogenica de una o mas protemas de micobacterias y de moleculas de ADN que codifican para tales polipeptidos. Pueden usarse kits de diagnostico que contienen dichos polipeptidos o secuencias de ADN y un reactivo de deteccion adecuado para la deteccion de la infeccion por micobacterias en pacientes y en muestras biologicas. Tambien se proporcionan anticuerpos dirigidos contra tales polipeptidos. Ademas, tales compuestos pueden formularse en vacunas y/o en composiciones farmaceuticas para la inmunizacion frente a la infeccion por micobacterias (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.949.246 y 6.555.653).
La malaria se elimino en muchas partes del mundo en la decada de 1960, pero la enfermedad todavfa persiste y hay nuevas cepas emergentes de la enfermedad que son resistentes a los farmacos existentes. La malaria es un problema de salud publica importante en mas de 90 pafses. Nueve de cada diez casos de malaria se producen en el Africa subsahariana. Mas de la tercera parte de la poblacion esta en riesgo, y cada ano se infectan con malaria entre 350 y 500 millones de personas. Cuarenta y cinco millones de mujeres embarazadas estan en riesgo de contraer la malaria este ano. Entre los individuos ya infectados, mas de 1 millon de los infectados mueren cada ano debido a una enfermedad que es posible prevenir. La mayona de estas muertes se producen en ninos en Africa.
La malaria se transmite generalmente cuando a una persona le pica un mosquito anofeles hembra infectado. Para transmitirla, el mosquito debe haber sido infectado por haber extrafdo sangre de una persona ya infectada con malaria. La malaria la produce un parasito y los smtomas clmicos de la enfermedad incluyen fiebre y smtomas pseudogripales, tales como escalofnos, dolor de cabeza, dolor muscular y cansancio. Estos smtomas pueden estar acompanados por nauseas, vomitos y diarrea. La malaria tambien puede producir anemia e ictericia debido a la perdida de globulos rojos. La infeccion con un tipo de malaria, Plasmodium falciparum, si no se trata con prontitud, puede producir fallo renal, convulsiones, confusion mental, coma y la muerte.
Se conoce un metodo in vitro para el diagnostico de la malaria en un individuo que comprende poner en contacto un tejido o un lfquido biologico tomado de un individuo con una molecula o una composicion polipeptfdica, en el que dicha molecula o composicion polipeptfdica comprende una o mas secuencias peptfdicas que portan la totalidad o una parte de uno o mas epftopos T de las protemas que resultan de la actividad infecciosa de P. falciparum, en condiciones que permiten que se produzca una reaccion inmunologica in vitro entre dicha composicion y los anticuerpos que pueden estar presentes en el tejido o el lfquido biologico, y la deteccion in vitro de los complejos antfgeno-anticuerpo formados (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 7.087.231).
Se han descrito la expresion y purificacion de un ectodominio AMA-1 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante. Los metodos anteriores han producido una protema altamente purificada que conserva el plegamiento
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y los puentes disulfuro de la molecula nativa. El AMA-1 recombinante es util como reactivo de diagnostico asf como para la produccion de anticuerpos, y como protema para su uso sola, o como parte de una vacuna para prevenir la malaria (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 7.029.685).
En la tecnica se han descrito polinucleotidos que codifican para anffgenos pepffdicos de malaria P. vivax espedficos de especie que son protemas o fragmentos de protemas secretados en el plasma de un mairnfero huesped susceptible despues de la infeccion, ya que tienen anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra estos anffgenos. Los anffgenos pepffdicos, anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos policlonales se utilizan en los analisis usados para diagnosticar la malaria, asf como para determinar si Plasmodium vivax es la especie responsable de la infeccion (patente estadounidense 6.706.872). Tambien se ha informado de que los anffgenos pepffdicos de malaria P. vivax espedficos de especie son protemas o fragmentos de protemas secretados en el plasma de un mai^ero huesped susceptible despues de la infeccion, ya que tienen anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra estos anffgenos. Los anffgenos pepffdicos, anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos policlonales se utilizan en los ensayos usados para diagnosticar la malaria, asf como para determinar si Plasmodium vivax es la especie responsable de la infeccion (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 6.231.861).
Un ectodominio AMA-1 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante tambien se ha expresado mediante un metodo que produce una protema altamente purificada que conserva el plegamiento y los puentes disulfuro de la molecula nativa. El AMA-1 recombinante es util como reactivo de diagnostico, para su uso en la produccion de anticuerpos, y como vacuna (patente estadounidense 7.060.276). De forma similar, se conocen la expresion y la purificacion de una MSP-142 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante que conserva el plegado y los puentes disulfuro de la molecula nativa. El MSP-142 recombinante es util como reactivo de diagnostico, para su uso en la produccion de anticuerpos, y como vacuna (patente estadounidense 6.855.322).
Los metodos de diagnostico para la deteccion de infecciones de malaria en seres humanos para identificar un sujeto que tiene o que se sospecha que esta en riesgo de tener una infeccion con un patogeno infeccioso de malaria son los conocidos segun estas memorias descriptivas y otras relacionadas. Espedficamente, por ejemplo, se combinan muestras de sangre con un reactivo que contiene 2-acetilpiridina-adenina dinucleotido (APAD), un sustrato (por ejemplo, una sal de lactato o acido lactico) y un tampon. El reactivo se disena para detectar la presencia de una enzima glicolffica unica producida por el parasito de la malaria. La enzima se conoce como acido lactico deshidrogenasa parasitaria (PLDH). La PLDH es facilmente distinguible de LDH del huesped usando el reactivo descrito anteriormente. La combinacion del reactivo con una muestra de sangre parasitada da como resultado la reduccion de APAD. Sin embargo, el APAD no se reduce por la LDH del huesped. El APAD reducido puede detectarse entonces mediante varias tecnicas, incluyendo analisis espectral, fluorimetrico, electroforetico o colorimetrico. La deteccion del APAD reducido de la manera anterior proporciona una indicacion positiva de infeccion por malaria (por ejemplo, vease la patente estadounidense 5.124.141). En otra metodologfa para el diagnostico de la malaria, un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos caracteffstica derivada del anffgeno GLURP de Plasmodium falciparum, se reconoce en una muestra de prueba por un anticuerpo espedfico producido frente a, o reactivo con, el polipeptido (patente estadounidense 5.231.168).
La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria extendida con epidemias frecuentes en el subcontinente indio, Africa y America Latina y el desarrollo de una vacuna es una prioridad de la Organizacion Mundial de la Salud. Un complejo de diferentes enfermedades, los parasitos de Leishmania producen infecciones gravfsimas de los organos internos, asf como enfermedades de la piel graves. Una de las formas mas devastadoras de la leishmaniasis es una infeccion que desfigura la nariz y la boca. El numero de casos de leishmaniasis esta en aumento y en la actualidad esta fuera de control de muchas areas. La leishmaniasis tambien esta en aumento en algunos pafses desarrollados, espedficamente en el sur de Europa, como resultado de la infeccion por VIH. Los farmacos disponibles son toxicos, caros y requieren inyecciones diarias durante un largo periodo de tiempo.
Leishmania son parasitos protozoarios que habitan en los macrofagos o en los globulos blancos del sistema inmunitario. Los parasitos se transmiten por la mordedura de pequenos insectos chupadores de sangre (simulidos) que son diffciles de controlar ya que habitan en amplias areas del planeta.
La leishmaniasis visceral es la mas peligrosa de las tres manifestaciones de la enfermedad. Se calcula que se producen aproximadamente 500.000 nuevos casos de la forma visceral (kala-azar o “la enfermedad asesina”) cada ano. En la actualidad hay mas de 200 millones de personas en riesgo de contraer la leishmaniasis visceral. Mas del 90 por ciento de los casos de leishmaniasis visceral se producen en la India, Bangladesh, Sudan, Brasil y Nepal. La mayoffa de las muertes se producen en ninos. Los que padecen la forma cutanea, a menudo quedan desfigurados de forma permanente.
Las infecciones por Leishmania son diffciles de diagnosticar y normalmente implican el analisis histopatologico de muestras de biopsia de tejidos. Sin embargo, se han desarrollado varios ensayos de diagnostico serologicos e inmunologicos. (patente estadounidense 7.008.774; Senaldi et al. (1996) J. Immunol. Methods 193: 9 5; Zijlstra et al. (1997) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91: 671 673; Badaro et al. (1996) J. Inf. Dis. 173: 758 761; Choudhary, S. et al. (1992) J. Comm. Dis. 24: 32 36; Badaro R. et al. (1986) Am. J. Trop. Med. Hyg. 35: 72 78; Choudhary, A. et al. (1990) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84: 363 366; y Reed, S. G. et al. (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 43: 632 639). Los promastigotes liberan productos metabolicos en el medio de cultivo para producir un medio condicionado. Estos
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productos metabolicos son inmunogenicos para el huesped. Veanse los documentos: Schnur, L. F. et al. (1972) Isrl. J. Med. Sci. 8: 932 942; Sergeiev, V. P. et al. (1969) Med. Parasitol. 38: 208 212; El-On, J. et al. (1979) Exper. Parasitol. 47: 254 269; y Bray, R. S. et al. (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60: 605 609; patente estadounidense n.° 6.846.648; patente estadounidense n.° 5.912.166; patente estadounidense n.° 5.912.263; y patente estadounidense n.° 5.411.865).
Aproximadamente 40 millones de personas en todo el mundo estan infectadas con VIH, el virus que produce el SIDA. Aproximadamente 3 millones de personas mueren debido a la enfermedad cada ano, el 95 por ciento de ellas en los pafses en vfas de desarrollo. Cada ano, cerca de 5 millones de personas se infectan con el VIH. En la actualidad, los pafses del Africa subsahariana soportan la mayor carga de la enfermedad, pero esta expandiendose rapidamente a otros pafses, tales como India, China o Rusia. La epidemia esta creciendo mas rapidamente entre las poblaciones minoritarias. En los Estados Unidos ha habido mas de 950.000 casos de SIDA notificados desde 1981. El SIDA golpea a la gente durante sus anos mas productivos. Las mujeres, por razones tanto biologicas como sociales, presentan un riesgo aumentado de VIH/SIDA.
El SIDA esta producido por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que destruye y dana las celulas del sistema inmunitario corporal y destruye progresivamente la capacidad del cuerpo para luchar contra las infecciones y determinados canceres. El VIH se extiende mas comunmente por practicar sexo sin proteccion con una pareja infectada. La mejor solucion para el problema es prevenir la propagacion del virus. Preparar una vacuna contra el VIH segura, eficaz y asequible es una manera de alcanzar este objetivo. En todo el mundo, solo una de cada cinco personas en riesgo elevado de padecer infeccion por VIH tiene acceso a una proteccion eficaz.
Se conocen metodos para diagnosticar infecciones por VIH, incluyendo el cultivo del virus, PCR de secuencias de acido nucleicos definitivas de muestras de pacientes, y analisis de anticuerpos para detectar la presencia de anticuerpos anti-VIH en sueros de pacientes (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.979.535, 6.544.728, 6.316.183, 6.261.762 y 4.743.540).
Segun algunas otras realizaciones tal como se ha dado a conocer en el presente documento, las composiciones de vacuna y las formulaciones y metodos de uso relacionados pueden incluir un antfgeno que se deriva de una celula cancerosa, ya que puede ser util para el tratamiento inmunoterapeutico de canceres. Por ejemplo, la formulacion de adyuvante puede encontrar utilidad con antfgenos de rechazo tumoral, tales como los de los canceres de prostata, de mama, colorrectal, de pulmon, de pancreas, renal o de melanoma. Los ejemplos antfgenos derivados de de canceres o celulas cancerosas incluyen MAGE 1, 3 y MAGE 4 u otros antfgenos MAGE tales como los dados a conocer en el documento WO 99/40188, PRAME, BaGe, Lage (tambien conocido como NY Eos 1), SAGE y HAGE (documento WO 99/53061) o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pags. 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 y 1998); Correale et al. (1997) Journal of the National Cancer Institute 89, pag. 293. Estos ejemplos no limitativos de antfgenos de cancer se expresan en una amplia gama de tipos de tumor, tales como melanoma, carcinoma de pulmon, sarcoma y carcinoma de vejiga. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.544.518.
Otros antfgenos espedficos de tumor son adecuados para su uso con GLA segun determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, gangliosidos espedficos de tumor o asociados a tumor, tales como GM2 y GM3 o conjugados de los mismos con protemas transportadoras; o un antfgeno para su uso en una composicion de vacuna con GLA para producir o potenciar una respuesta autoinmunitaria contra el cancer puede ser una hormona autopeptfdica, tal como la hormona liberadora de la hormona gonadotropina de longitud completa (GnRH, documento WO 95/20600), un peptido corto de 10 aminoacidos de largo, util en el tratamiento de muchos canceres. En otra realizacion, se usan antfgenos prostaticos, tales como el antfgeno prostatico espedfico (PSA), PAP, PSCA (por ejemplo, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 (4) 1735-1740, 1998); PSMA o, en una realizacion preferida un antfgeno conocido como prostasa (por ejemplo, Nelson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96, 3114-3119; el documento WO 98/12302; la patente estadounidense n.° 5.955.306; el documento WO 98/20117; patentes estadounidenses n.os 5.840.871 y 5.786.148; el documento WO 00/04149. Otros antfgenos prostaticos espedficos se conocen a partir de los documentos WO 98/137418 y WO/004149. Otro es STEAP (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).
Otros antfgenos asociados a tumor utiles en el contexto de la presente invencion incluyen: Plu-1 (J. Biol. Chem. 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al. Bioassays 199, 21: 61-70; patente estadounidense n.° 5.654.140) y Criptin (patente estadounidense n.° 5.981.215). Adicionalmente, antfgenos particularmente relevantes para vacunas en la terapia del cancer tambien comprenden tirosinasa y survivina.
Las realizaciones dadas a conocer en el presente documento que se refieren a composiciones de vacuna que contienen GLA que comprenden un antfgeno de cancer seran utiles frente a cualquier cancer caracterizado por la expresion de un antfgeno asociado a tumor, tal como la expresion de HER-2/neu o de otros antfgenos espedficos de cancer o asociados a cancer.
El diagnostico de cancer en un sujeto que tiene o se sospecha que esta en riesgo de tener cancer puede realizarse mediante cualquiera de una amplia gama de metodologfas aceptadas en la tecnica, que pueden variar dependiendo de una variedad de factores que incluyen la presentacion clmica, el grado de progresion del cancer, el tipo de cancer
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y otros factores. Los ejemplos de diagnostico de cancer incluyen examen histopatologico, histocitoqmmico, inmunohistocitoqmmico e inmunohistopatologico de muestras de pacientes (por ejemplo, sangre, biopsia de piel, biopsia distinta de la de tejidos, muestras quirurgicas, etc.), pruebas de PCR para marcadores geneticos definidos (por ejemplo, acido nucleico), pruebas serologicas de antfgenos asociados a cancer circulantes o celulas que portan tales antfgenos, o de anticuerpos de especificidad definida, u otras metodologfas con las que estan familiarizados los expertos en la tecnica. Veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.734.172; 6.770.445; 6.893.820; 6.979.730; 7.060.802; 7.030.232; 6.933.123; 6.682.901; 6.587.792; 6.512.102; 7.078.180; 7.070.931; el documento JP5-328975; Waslylyk et al., 1993 Eur. J. Bioch. 211 (7) 18.
Las composiciones de vacuna y los metodos segun determinadas realizaciones de la presente divulgacion tambien pueden usarse para la profilaxis o la terapia de enfermedades autoinmunitarias, incluyendo enfermedades, estados o trastornos en los que el sistema inmunitario del huesped o el sujeto media de forma perjudicial en una respuesta inmunitaria que esta dirigida contra los tejidos “propios”, celulas, biomoleculas (por ejemplo, peptidos, polipeptidos, protemas, glicoprotemas, lipoprotemas, proteolfpidos, lfpidos, glicolfpidos, acidos nucleicos tales como ARN y ADN, oligosacaridos, polisacaridos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos o similares, y otros componentes moleculares de las celulas y los tejidos de los sujetos) o epttopos (por ejemplo, estructuras de reconocimiento espedficas definidas inmunologicamente, tales como las reconocidas por una region determinante de la complementariedad (CDR) de una region variable del anticuerpo o una CDR de receptor de celular T.
Las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan por tanto por una respuesta inmunitaria anomala que implica bien celulas o bien anticuerpos que se dirigen en cualquier caso contra tejidos autologos normales. Las enfermedades autoinmunitarias en mairnferos pueden clasificarse de forma general en una de dos categonas diferentes: enfermedad mediada por celulas (es decir, celulas T) o trastornos mediados por anticuerpos. Los ejemplos no limitativos de enfermedades autoinmunitarias mediadas por celulas incluyen esclerosis multiple, artritis reumatoide, tiroiditis de Hashimoto, diabetes mellitus tipo I (diabetes juvenil) y uveorretinitis autoinmunitaria. Los trastornos autoinmunitarios mediados por anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, miastenia grave, lupus eritematoso sistemico (o LES), enfermedad de Grave, anemia hemolttica autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, asma autoinmunitaria, crioglobulinemia, purpura trombocitopenica trombotica, esclerosis biliar primaria y anemia perniciosa. El/los antfgeno(s) asociado(s) con: lupus eritematoso sistemico son las protemas de acido ribonucleico nuclear pequeno (snRNP); la enfermedad de Grave es el receptor de tirotropina, tiroglobulina y otros componentes de las celulas epiteliales de la tiroides (Akamizu et al., 1996; Kellerman et al., 1995; Raju et al., 1997 y Texier et al., 1992); el penfigo son antfgenos del penfigo similares a cadherina, tales como desmoglema 3 y otras moleculas de adhesion (Memar et al.,1996; Stanley, 1995; Plott et al. 1994; y Hashimoto, 1993); y la purpura trombocitopenica trombotica son las plaquetas. (Vease la patente estadounidense 6.929.796; Gorski et al. (eds) Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publisher, Norwell, MA; Radbruch y Lipsky, P. E. (eds) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY).
La autoinmunidad desempena un papel en mas de 80 enfermedades diferentes, incluyendo la diabetes tipo 1, esclerosis multiple, lupus, artritis reumatoide, esclerodermia y enfermedades de la tiroides. Faltan estimaciones cuantitativas rotundas de la morbilidad para la mayona de las enfermedades autoinmunitarias. Los estudios mas recientes realizados al final de la decada de 1990 revelan que las enfermedades autoinmunitarias son la tercera enfermedad mas comun en los Estados Unidos; y las enfermedades autoinmunitarias mas comunes afectan a mas de 8,5 millones de estadounidenses. Las estimaciones actuales sobre la prevalencia de la enfermedad oscilan entre el 5 y el 8 por ciento de la poblacion de los Estados Unidos. La mayona de las enfermedades autoinmunitarias afectan desproporcionadamente a las mujeres. Las mujeres tienen 2,7 veces mas probabilidad de adquirir una enfermedad autoinmunitaria. Las mujeres son mas susceptibles de padecer enfermedades autoinmunitarias; los hombres tienen mayores niveles de actividad de los linfocitos citoltticos naturales que las mujeres. (Jacobsen et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 84: 223-243, 1997).
Las enfermedades autoinmunitarias se producen cuando el sistema inmunitario confunde los tejidos propios como no propios y lanza un ataque inapropiado. El cuerpo puede verse afectado de diferentes maneras por las enfermedades autoinmunitarias, incluyendo, por ejemplo, el intestino (enfermedad de Crohn) y el cerebro (esclerosis multiple). Se sabe que un autoanticuerpo ataca celulas propias o tejidos propios para danar su funcion y como resultado produce enfermedades autoinmunitarias, y que el autoanticuerpo puede detectarse en el suero de los pacientes antes de la existencia real de la enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, aparicion de signos y smtomas clmicos). La deteccion de un autoanticuerpo permite, por tanto, el descubrimiento o el reconocimiento temprano de la presencia o el riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria. Basandose en estos descubrimientos, se han descubierto una variedad de autoanticuerpos contra autoantfgenos y los autoanticuerpos contra autoantfgenos se han medido en pruebas clmicas (por ejemplo, patentes estadounidenses 6.919.210, 6.596.501, 7.012.134 y 6.919.078), mientras que otros diagnosticos autoinmunitarios pueden implicar la deteccion de un metabolito relacionado (por ejemplo, la patente estadounidense 4.659.659) o reactividad inmunologica (por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.614.722 y 5.147.785, 4.420.558, 5.298.396, 5.162.990, 4.420.461, 4.595.654, 5.846.758 y 6.660.487).
En determinadas realizaciones, las composiciones de la invencion seran particularmente aplicables para su uso en el tratamiento de pacientes ancianos y/o inmunodeprimidos, incluyendo sujetos en dialisis renal, sujetos en quimioterapia y/o radioterapia, receptores de trasplantes y similares. Generalmente tales individuos presentan
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respuestas inmunitarias a las vacunas disminuidas y, por tanto, el uso de las composiciones de la invencion puede potenciar las respuestas inmunitarias obtenidas en estos sujetos.
En otras realizaciones, el antigeno o antfgenos usados en las composiciones de la invencion incluyen antfgenos asociados con enfermedades respiratorias, tales como las producidas o agravadas por infeccion bacteriana (por ejemplo, por neumococos), para la profilaxis y la terapia de estados tales como la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC). La EPOC se define fisiologicamente por la presencia de obstruccion de las vfas respiratorias irreversible o parcialmente reversible en pacientes con bronquitis cronica y/o enfisema (Am. J. Respir. Crit. Care Med. Noviembre de 1995; 152 (5 Pt 2): S77-121). El agravamiento de la EPOC esta provocado a menudo por infeccion bacteriana (por ejemplo, por neumococos) (Clin. Microbiol. Rev. Abril de 2001; 14 (2): 236-63. En una realizacion particular, una composicion de la invencion comprende un adyuvante GLA, tal como se describe en el presente documento, en combinacion con la vacuna neumococica Prevnar® (Wyeth).
Todavfa en otras realizaciones, las composiciones de la invencion, que comprenden GLA tal como se describe en el presente documento, son para su uso en el tratamiento de estados alergicos. Por ejemplo, en una realizacion particular, las composiciones se usan en la terapia de desensibilizacion alergica. Tal terapia implica la estimulacion del sistema inmunitario con dosis gradualmente crecientes de las sustancias a la que es alergica una sustancia, en la que se formulan las sustancias en composiciones que comprenden GLA. En realizaciones espedficas, las composiciones se usan en el tratamiento de alergias a productos alimenticios, polen, acaros, gatos o insectos que pican por ejemplo, abejas, avispones, avispas amarillas, avispas, hormigas de felpa, hormigas de fuego).
TLR
Tal como se describe en el presente documento, determinadas realizaciones de la presente invencion contemplan composiciones de vacuna y composiciones de adyuvante inmunologico, incluyendo composiciones farmaceuticas, que incluyen, ademas del/de los compuesto(s) de GLA de la invencion, uno o mas agonistas de receptor de tipo toll (agonista de TLR). Los receptores de tipo toll (TLR) incluyen receptores transmembrana de superficie celular del sistema inmunitario innato que confieren capacidad de reconocimiento en fase temprana a las celulas huesped para una variedad de estructuras moleculares microbianas conservadas, tales como las que pueden estar presentes en un gran numero de agentes patogenos (por ejemplo, Armant et al., 2002, Genome Biol. 3 (8): revisiones 3011.13011.6; Fearon et al., 1996 Science 272: 50; Medzhitov et al. 1997 Curr. Opin. Immunol. 9: 4; Luster 2002, Curr. Opin. Immunol. 14: 129; Lien et al. 2003 Nat. Immunol. 4: 1162; Medzhitov 2001 Nat. Rev. Immunol. 1: 135, Takeda et al. 2003 Ann. Rev Immunol. 21: 335; Takeda et al. 2005 Int. Immunol. 17: 1; Kaisho et al. 2004 Microbe Infect. 6: 1388; Datta et al. 2003 J. Immunol. 170: 4102).
La induccion de la transduccion de senales mediada por TLR para potenciar la iniciacion de respuestas inmunitarias a traves del sistema inmunitario innato puede realizarse por agonistas de TLR, que se acoplan a los TLR de superficie celular. Por ejemplo, los lipopolisacaridos (LPS) pueden ser agonistas de TLR a traves de TLR2 o TLR4 (Tsan et al. 2004 J. Leuk. Biol. 76: 514; Tsan et al. 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286: C739; Lin et al. 2005 Shock 24: 206); la poli(inosina-citidina) (poliI:C) puede ser un agonista de TLR a traves de TLR3 (Salem et al. 2006 Vaccine 24: 5119); las secuencias de CpG (oligodesoxinucleotidos que contienen citosina-guanosina no metilada o motivos de dinucleotido “CpG”, por ejemplo, CpG 7909, Cooper et al. 2005, AIDS 19: 1473; CpG 10101 Bayes et al. Methods Find Exp. Clin. Pharmacol. 27: 193;Vollmer et al. Expert Opinion on Biological Therapy 5: 673; Vollmer et al. 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48: 2314; Deng et al. 2004 J. Immunol. 173: 5148) pueden ser agonistas de TLR a traves de TLR9 (Andaloussi et al. 2006 Glia 54: 526; Chen et al. 2006 J. Immunol., 177: 2373); Los peptidoglicanos pueden ser agonistas de TLR2 y/o de TLR6 (Soboll et al., Biol. Reprod. 75: 131; Nakao et al. 2005 J. Immunol. 174: 1566); 3M003 (4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-6,7,8,9-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]-quinolin-1-etanol hidratado, peso molecular de 318 Da, de 3M Pharmaceuticals, St Paul, MN, que tambien es una fuente de los compuestos relacionados 3M001 y 3M002; Gorden et al. 2005 J. Immunol. 174: 1259) puede ser un agonista de TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35: 1591) y/o un agonista de TLR8 (Johansen 2005); la flagelina puede ser un agonista de TLR5 (Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103: 12487); y los antfgenos de la hepatitis C pueden actuar como agonistas a traves de TLR7 y/o TLR9 (Lee et al. 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 1828; Horsmans et al. 2005 Hepatol. 42: 724). Se conocen otros agonistas de TLR (por ejemplo, Schirmbeck et al. 2003 J. Immunol. 171: 5198) y pueden usarse segun determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento.
Por ejemplo, y como antecedentes (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.544.518) se sabe que los oligonucleotidos inmunoestimuladores que contienen dinucleotidos de CpG no metilados (“CpG”) son adyuvantes cuando se administran tanto por via sistemica como por via mucosa (documentos WO 96/02555; EP 0 468 520; Davis et al. J. Immunol. 1998 160 (2): 870-876; McCluskie y Davis, J. Immunol. 1998 161 (9): 4463-6). CpG es una abreviatura para los motivos de dinucleotido de citosina-guanosina presentes en el ADN. El papel central del motivo CG en la inmunoestimulacion lo explico Krieg, Nature 374, pag. 546, 1995. Un analisis detallado ha mostrado que el motivo CG debe estar en cierto contexto de secuencia y que dichas secuencias son comunes en el ADN bacteriano, pero son raras en el ADN de los vertebrados. La secuencia inmunoestimuladora es a menudo: purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en la que el motivo CG del dinucleotido no esta metilado, pero se conocen otras secuencias CpG no metiladas que son inmunoestimuladoras y que pueden usarse en determinadas realizaciones de la presente invencion. Cuando el CpG se formula en vacunas, puede administrarse en una disolucion libre junto con antfgeno libre (documento WO 96/02555; McCluskie y Davis, citado anteriormente) o conjugarse covalentemente con un
antfgeno (publicacion PCT n.° WO 98/16247) o formularse con un vehnculo, tal como hidroxido de aluminio (por ejemplo, Davis et al. citado anteriormente, Brazolot-Millan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95 (26) 15553-8).
Los oligonucleotidos preferidos para su uso en adyuvantes o vacunas de la presente invencion contienen preferiblemente dos o mas motivos CpG de dinucleotido separados por al menos tres nucleotidos, mas 5 preferiblemente al menos seis o mas. Los oligonucleotidos de la presente invencion son normalmente desoxinucleotidos. En una realizacion preferida, el internucleotido en el oligonucleotido es fosforoditioato, o mas preferiblemente un enlace fosforoditioato, aunque los enlaces fosfodiester y otros enlaces internucleotfdicos tambien estan dentro del alcance de la invencion, incluyendo oligonucleotidos con uniones internucleotfdicas mixtas. Los metodos para producir oligonucleotidos con fosforotioato o fosforoditioato se describen en las patentes 10 estadounidenses n.os 5.666.153; 5.278.302 y en el documento WO 95/26204.
Los ejemplos de oligonucleotidos preferidos tienen secuencias que se dan a conocer en las siguientes publicaciones; para determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento las secuencias contienen preferiblemente uniones internucleotidicas de fosforotioato modificado:
CPG 7909: Cooper et al., “CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in 15 antirretroviral-treated HIV-infected adults” AIDS 23 de septiembre de 2005; 19 (14): 1473-9.
CPG 10101: Bayes et al. “Gateways to clinical trials”. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 27 de abril de 2005
(3): 193-219.
Vollmer J. “Progress in drug development of immunostilatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9”.
Expert Opinion on Biological Therapy 5 de mayo de 2005 (5): 673-682.
20 Oligonucleotidos con CpG alternativos pueden comprender variantes de las secuencias preferidas descritas en las publicaciones citadas anteriormente que difieren en que tienen sustituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones de secuencias de nucleotidos sin consecuencias. Los oligonucleotidos con CpG usados en determinadas realizaciones de la presente invencion pueden sintetizarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica (por ejemplo, el documento EP 0 468 520). De forma conveniente, dichos oligonucleotidos pueden sintetizarse usando un 25 sintetizador automatico. Los oligonucleotidos son normalmente desoxinucleotidos. En una realizacion preferida, el enlace internucleotfdico en el oligonucleotido es fosforoditioato, o mas preferiblemente un enlace fosforotioato, aunque los fosfodiesteres tambien estan dentro del alcance de las realizaciones contempladas en el presente documento. Tambien se contemplan oligonucleotidos que comprenden diferentes uniones internucleotfdicas, por ejemplo, mezcla de fosforotioato y fosfodiesteres. Tambien pueden usarse otros enlaces internucleotidicos que 30 estabilicen el oligonucleotido.
Coadyuvante
Determinadas realizaciones proporcionadas en el presente documento incluyen composiciones de vacuna y composiciones de adyuvante inmunologico, incluyendo composiciones farmaceuticas, que contienen, ademas de compuesto(s) de GLA, al menos un coadyuvante, que se refiere a un componente de tales composiciones que tiene 35 actividad como adyuvante pero que no es GLA. Un coadyuvante que tiene tal actividad como adyuvante incluye una composicion que, cuando se administra a un sujeto tal como un ser humano (por ejemplo, un paciente humano), un primate no humano, un mairnfero u otro organismo eucariota superior que tiene un sistema inmunitario reconocido, puede alterar (es decir, aumentar o disminuir de manera estadfsticamente significativa y, en determinadas realizaciones, potenciar o aumentar) la potencia y/o la duracion de una respuesta inmunitaria. (Vease, por ejemplo, 40 Powell y Newman, “Vaccine desing - The Subunit and Adjuvant Approach”, 1995, Plenum Press, Nueva York). En determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento, GLA y un antfgeno adecuado, y opcionalmente uno o mas coadyuvantes, pueden alterar de esta manera, por ejemplo, producir o potenciar, una respuesta inmunitaria que se dirige contra el antfgeno deseado que puede administrarse al mismo tiempo que GLA o puede administrarse por separada en el tiempo y/o el espacio (por ejemplo, en un lugar anatomico diferente), pero 45 determinadas realizaciones de la invencion no pretenden ser tan limitadas y por tanto tambien contemplan la administracion de GLA en una composicion que no incluye un antfgeno especificado sino que pueden incluir tambien uno o mas agonistas de TLR, un coadyuvante, un modificador de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina y un modificador inmunitario de doble tallo-bucle (dSLIM).
Por consiguiente, y tal como se ha indicado anteriormente, los coadyuvantes incluyen composiciones distintas a GLA 50 que tienen efectos como adyuvante, tales como las saponinas y los mimeticos de saponina, incluyendo l QS21 y mimeticos de QS21 (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.057.540; documentos EP 0 362 279 B1; WO 95/17210), alumbre, alcaloides de plantas, tales como tomatina, detergentes tales como (pero sin limitarse a) saponina, polisorbato 80, Span 85 y estearil-tirosina, una o mas citocinas (por ejemplo GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-alfa, IFN-gamma), un modificador de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina, y un modificador inmunitario 55 de doble tallo-bucle (dSLIM, por ejemplo Weeratna et al. 2005, Vaccine 23: 5263).
Se ensenan detergentes incluyendo saponina, por ejemplo, en la patente estadounidense 6.544.518; Lacaille- Dubois, M. y Wagner H. (1996, Phytomedicine 2: 363-386), la patente estadounidense n.° 5.057.540; Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; y en el documento EP 0 362 279 B1. Las estructuras en
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partmulas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), que comprenden fracciones de Quil A (saponina) son hemoltticos y se han usado en la fabricacion de vacunas (Morein, B. EP 0 109 942 B1). Se ha publicado que estas estructuras tienen actividad como adyuvantes (documentos EP 0 109 942 B1; WO 96/11711). Se ha descrito que las saponinas hemoltticas QS21 y QS17 (fracciones purificadas por HPLC de Quil A) son adyuvantes sistemicos potentes y el metodo para producirlas se da a conocer en la patente estadounidense n.° 5.057.540 y en el documento EP 0 362 279 B1. En estas referencias tambien se describe el uso de QS7 (una fraccion no hemolftica de Quil-A) que actua como un potente adyuvante para vacunas sistemicas. El uso de QS21 se describe ademas en Kensil et al. (1991, J. Immunology 146: 431-437). Tambien se conocen combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina (documento WO 99/10008). Los sistemas adyuvantes en partmulas que comprenden fracciones de QuilA, tales como QS21 y QS27, se describen en los documentos WO 96/33739 y Wo 96/11711. Otras saponinas que se han usado en estudios de vacunacion sistemica incluyen las derivadas de otras especies de plantas como Gypsophila y Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10 (9): 572-577, 1992).
La escina es otro detergente relacionado con las saponinas para su uso en las composiciones de adyuvante de las realizaciones dadas a conocer en el presente documento. La escina se describe en el mdice Merck (12a ed.: entrada 3737) como una mezcla de saponina que se encuentra en las semillas del arbol castano de indias, Aesculus hippocastanum. Se ha descrito su aislamiento y purificacion por cromatograffa (Fiedler, Arzneimittel-Forsch 4, 213 (1953)) y mediante resinas de intercambio ionico (Erbring et al., patente estadounidense n.° 3.238.190). Se han purificado fracciones de escina y se ha demostrado que son biologicamente activas (Yoshikawa M. et al. (Chem. Pharm. Bull. (Tokio) agosto de 1996; 44 (8) 1454-1464)). La digitonina es otro detergente que tambien se describe en el mdice Merck (12a ed.: entrada 3204) como una saponina que se deriva de las semillas de Digitalis purpurea y se purifica segun el procedimiento descrito por Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc. 1934, 23, 664; y Rubenstroth- Bauer, Physiol. Chem. 1955, 301, 621.
Otros coadyuvantes para su uso segun determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento incluyen un copolfmero de bloques o un polfmero biodegradable, que se refiere a un tipo de compuestos polimericos con los que estan familiarizaros los expertos en la tecnica relevante. Los ejemplos de copolfmero de bloques o de polfmero biodegradable que pueden incluirse en una composicion de vacuna con GLA o un adyuvante inmunologico de GLA incluyen Pluronic® L121 (BASF Corp., Mount Olive, N. J.; vease, por ejemplo, Yeh et al., 1996, Pharm. Res. 13: 1693; y la patente estadounidense n.° 5.565.209); CRL 1005 (por ejemplo, Triozzi et al., 1997, Clin. Canc. Res. 3. 2355); poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), poli(acido lactico) (PLA), poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG) y poliI:C. (Vease, por ejemplo, Powell y Newman, “Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach”, 1995, Plenum Press, Nueva York).
Determinadas realizaciones se refieren a vacunas con GLA y adyuvantes inmunologicos con GLA que incluyen un aceite, que en algunas de tales realizaciones pueden contribuir a la actividad coadyuvante y en otras de tales realizaciones pueden proporcionar adicional o alternativamente un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable. Se conocen muchos aceites adecuados y pueden seleccionarse para incluirlos en la composicion de vacuna y en composiciones de adyuvante inmunologico basadas en la presente divulgacion. Los ejemplos de tales aceites incluyen, a modo de ilustracion y no de limitacion, escualeno, escualano, aceite mineral, aceite de oliva, colesterol y un monooleato de manida.
Tambien se conocen en la tecnica modificadores de la respuesta inmunitaria, tales como modificadores de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina y tambien pueden incluirse como coadyuvantes en determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento. Algunos de los modificadores de respuesta inmunitaria de imidazoquinolilna preferidos incluyen, a modo de ejemplos no limitativo, resiquimod (R848), imiquimod y gardiquimod (Hemmi et al., 2002 Nat. Immunol. 3: 196; Gibson et al. 2002 Cell. Immunol. 218: 74; Gorden et al. 2005 J. Immunol. 174: 1259); estos y otros modificadores de respuesta inmunitaria de imidazoquinolina tambien pueden tener, en condiciones adecuadas, actividad agonista de TLR tal como se describe en el presente documento. Otros modificadores de la respuesta inmunitaria son los modificadores inmunitarios de doble tallo-bucle (dSLIM) basados en acidos nucleicos. Ejemplos espedficos de dSLIM que se contemplan para su uso en determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento pueden encontrarse en Schmidt et al. 2006, Allergy 61: 56; Weihrauch et al. 2005 Clin. Cancer Res. 11 (16): 5993-6001; Modern Biopharmaceuticals, J. Knablein (editor). John Wiley & Sons, 6 de diciembre de 2005 (los dSLIM se presentan en las paginas 183 a ~200) y de Mologen AG (Berlin, FRG: [obtenido en lmea el 18/08/06 en
http://www.mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtml].
Tal como se indico tambien anteriormente, un tipo de coadyuvante para su uso con GLA tal como se ha descrito en el presente documento pueden ser los coadyuvantes de aluminio que se denominan generalmente “alumbre”. Los coadyuvantes de alumbre se basan en: oxi-hidroxido de aluminio; hidroxifosfoato de aluminio; o varias sales registradas. Las vacunas que usan coadyuvantes de alumbre pueden incluir vacunas para cepas del tetanos, VPH, hepatitis A, virus de la polio inactivado, y otros antfgenos tal como se ha descrito en el presente documento. Los coadyuvantes de alumbre son ventajosos porque tienen un buen registro de seguridad, aumentan las respuestas de anticuerpos, estabilizan los antfgenos, y su produccion a gran escala es relativamente sencilla. (Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21: 129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2: 370-383).
Otros coadyuvantes que pueden combinarse con GLA para una estimulacion inmunitaria eficaz incluyen las saponinas y los mimeticos de saponina, incluyendo QS21 y compuestos estructuralmente relacionados que
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confieren efectos similares y se denominan en el presente documento mimeticos de QS21. Se ha reconocido QS21 como un coadyuvante preferido. QS21 puede comprender una fraccion no toxica purificada por HPLC derivada de corteza de Quillaja Saponaria Molina. La produccion de QS21 se describe en la patente estadounidense n.° 5.057.540. (Veanse tambien las patentes estadounidenses n.os 6.936.255, 7.029.678 y 6.932.972).
GLA tambien puede combinarse en determinadas realizaciones con “complejos inmunoestimuladores” conocidos como ISCOmS (por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.869.607, 6.846.489, 6.027.732, 4.981.684), incluyendo el ISCOMATriX® derivado de saponina, que esta disponible comercialmente, por ejemplo, de Iscotec (Estocolmo, Suecia) y CSL Ltd. (Parkville, Victoria, Australia).
Constructo de expresion recombinante
Segun determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento, la composicion de vacuna con GLA puede contener al menos un constructo de expresion recombinante que comprende un promotor operativamente unido a una secuencia de acido nucleico que codifica para un antigeno. En determinadas realizaciones adicionales, el constructo de expresion recombinante esta presente en un vector viral, tal como un adenovirus, virus adenoasociado, herpesvirus, lentivirus, poxvirus o retrovirus. Las composiciones y los metodos para producir y usar tales constructos de expresion y vectores se conocen en la tecnica, para la expresion de antigenos polipeptfdicos tal como se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, segun Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology 2006 John Wiley & Sons, NY. Ejemplos no limitativos de constructos de expresion recombinante pueden encontrarse generalmente en las patentes estadounidenses n.os 6.844.192; 7.037.712; 7.052.904; 7.001.770; 6.106.824; 5.693.531; 6.613.892; 6.875.610; 7.067.310; 6.218.186; 6.783.981; 7.052.904; 6.783.981; 6.734.172; 6.713.068; 5.795.577 y 6.770.445 y en otras, con ensenanzas que pueden adaptarse a la expresion de antfgenos polipeptfdicos tal como se proporcionan en el presente documento, para su uso en determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento.
Respuesta inmunitaria
La invencion proporciona por tanto composiciones para su uso para alterar (es decir, aumentar o disminuir de manera estadfsticamente significativa, por ejemplo, respecto a un control apropiado tal como resultara evidente para los expertos en la tecnica) respuestas inmunitarias en un huesped que puede producir una respuesta inmunitaria. Como sabran los expertos en la tecnica, una respuesta inmunitaria puede ser cualquier alteracion activa del estatus inmunitario de un huesped, lo que puede incluir cualquier alteracion en la estructura o funcion de uno o mas tejidos, organos, celulas o moleculas que participan en el mantenimiento y/o la regulacion del estatus inmunitario del huesped. Normalmente, pueden detectarse respuestas inmunitaria mediante cualquiera de una variedad de parametros bien conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, la determinacion in vivo o in vitro de: inmunoglobulinas o anticuerpos solubles; mediadores solubles, tales como citocinas, linfocinas, quimiocinas, hormonas, factores de crecimiento y similares, asf como otros peptidos pequenos, hidratos de carbono, nucleotidos y/o mediadores lipfdicos solubles; cambios de estado de activacion celular tal como se determina por propiedades funcionales o estructurales alteradas de las celulas del sistema inmunitario, por ejemplo, proliferacion celular, motilidad alterada, induccion de actividades especializadas, tales como expresion genica espedfica o comportamiento citolttico; diferenciacion celular por celulas del sistema inmunitario, incluyendo perfiles de expresion de antfgeno de superficie alterados o el inicio de apoptosis (muerte celular programada); o cualquier otro criterio mediante el que puede detectarse la presencia de una respuesta inmunitaria.
Las respuestas inmunitarias pueden considerarse a menudo, por ejemplo, como la discriminacion entre las estructuras propias y las que no son propias por las celulas y los tejidos del sistema inmunitario de un huesped a nivel molecular y celular, pero la invencion no debe limitarse por esto. Por ejemplo, las respuestas inmunitarias tambien pueden incluir cambios en el estado del sistema inmunitario que se producen por reconocimiento inmunitario de moleculas, celulas o tejidos propios, tal como puede acompanar a multiples estados normales, tales como la regulacion tfpica de componentes del sistema inmunitario, o que pueden estar presentes en estados patologicos, tales como las respuestas autoinmunitarias inapropiadas observadas en enfermedades autoinmunitarias y degenerativas. Como otro ejemplo, ademas de la induccion mediante regulacion por incremento de actividades del sistema inmunitario particulares (tales como produccion de anticuerpos y/o citocinas, o activacion de la inmunidad mediada por celulas), las respuestas inmunitarias tambien pueden incluir supresion, atenuacion o cualquier otra regulacion por disminucion de la inmunidad detectable, que puede ser la consecuencia del antfgeno seleccionado, la via de administracion del antfgeno, la induccion de tolerancia espedfica u otros factores.
La determinacion de la induccion de una respuesta inmunitaria por las vacunas de la presente invencion puede establecerse mediante multiples analisis inmunologicos bien conocidos con los que estan familiarizados los expertos en la tecnica. Tales analisis incluyen, pero sin que sea necesario limitarse a ellos, la determinacion in vivo o in vitro de: mediadores solubles, tales como citocinas, linfocinas, quimiocinas, hormonas, factores de crecimiento y similares, asf como otros peptidos pequenos, hidratos de carbono, nucleotidos y/o mediadores lipfdicos solubles; cambios de estado de activacion celular determinados por propiedades funcionales o estructurales alteradas de las celulas del sistema inmunitario, por ejemplo, proliferacion celular, motilidad alterada, induccion de actividades especializadas, tales como expresion genica espedfica o comportamiento citolftico; diferenciacion celular por celulas del sistema inmunitario, incluyendo perfiles alterados de la expresion de antfgeno de superficie o inicio de apoptosis
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(muerte celular programada). Los procedimientos para realizar estos analisis y otros similares se conocen ampliamente y pueden encontrarse por ejemplo en Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; vease tambien Current Protocols in Immunology; vease tambien, por ejemplo, Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell y Shigii (eds) Selected Methods in Cellular Immunology; 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green y Reed, 1998 Science 281: 1309 y las referencias citadas en esos documentos).
La deteccion de la proliferacion de celulas T reactivas con antfgeno puede realizarse mediante una variedad de tecnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferacion de celulas T puede detectarse midiendo la tasa de smtesis de ADN y la especificidad de antigeno puede determinarse controlando los estfmulos (tales como, por ejemplo, celulas presentadoras de antigeno de forma pulsada por un antfgeno espedfico deseado o por un antfgeno de control) a los que se exponen las celulas T reactivas con el antfgeno candidato. Las celulas T que se han estimulado para proliferar presentan una tasa aumentada de smtesis de ADN. Un forma tfpica de medir la tasa de smtesis de ADN es, por ejemplo, mediante cultivos de celulas T marcadas con pulsos de trimidina tritiada, un precursor nucleosfdico que se incorpora en el ADN recien sintetizado. La cantidad de timidina tritiada incorporada puede determinarse usando un espectrofotometro de centelleo lfquido. Otras formas de detectar la proliferacion de celulas T incluyen medir el aumento de la produccion de interleucina 2 (IL-2), el flujo de Ca2+ o la captacion de colorante, tal como 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Alternativamente, puede medirse la smtesis de linfocinas (tales como interferon gamma) o puede determinarse la cantidad relativa de celulas T que pueden responder a un antigeno particular.
La deteccion de la produccion de anticuerpos espedficos de antfgeno puede obtenerse, por ejemplo, sometiendo a ensayo una muestra (por ejemplo, una muestra que contiene inmunoglobulina, tal como una muestra de suero, plasma o sangre) de un huesped tratado con una vacuna segun la presente invencion usando metodologfas in vitro, tales como radioinmunoanalisis (RIA), ensayo de inmunosorcion ligado a enzimas (ELISA), dialisis de equilibrio o inmunotransferencia en fase solida, incluyendo inmunotransferencia de tipo Western. En realizaciones preferidas, los ensayos ELISA pueden incluir ademas la inmovilizacion por captura de antfgeno diana con un anticuerpo monoclonal en fase solida espedfico para el antfgeno, por ejemplo, para aumentar la sensibilidad del ensayo. La elaboracion de mediadores solubles (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, linfocinas, prostaglandinas, etc.) tambien puede determinarse facilmente mediante el ensayo de inmunosorcion ligado a enzimas (ELISA), por ejemplo usando los metodos, aparatos y reactivos que estan disponibles facilmente a partir de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma, St. Louis, MO; vease tambien el catalogo 2006 de R & D Systems, Minneapolis, MN).
Otros multiples parametros inmunologicos pueden controlarse usando ensayos rutinarios que se conocen bien en la tecnica. Estos pueden incluir, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC), respuestas de anticuerpos in vitro secundarias, analisis de inmunocitofluorimetna de flujo de diversas subpoblaciones de celulas mononucleares linfoides o de sangre periferica usando sistemas de antfgenos marcadores bien establecidos, inmunohistoqmmica u otros ensayos relevantes. Estos y otros ensayos pueden encontrarse, por ejemplo, en Rose et al. (eds) Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5a ed. 1997, American Society of Microbiology, Washington DC.
Por consiguiente, se contempla que las composiciones de vacuna y de adyuvante proporcionadas en el presente documento podran producir o potenciar en un huesped al menos una respuesta inmunitaria que se selecciona de una respuesta de linfocitos T de tipo Th1, una respuesta de linfocitos T de tipo Th2, una respuesta de linfocitos T citotoxicos (CTL), una respuesta de anticuerpos, una respuesta de citocina, una respuesta de linfocina, una respuesta de quimiocina, una respuesta inflamatoria. En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria puede comprender al menos uno de la produccion de una o varias citocinas en las que la citocina se selecciona de interferon gamma (IFN-y), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a); la produccion de una o varias interleucinas en las que la interleucina se selecciona de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 e IL-23; la produccion de una o varias quimiocinas, en las que la quimiocina se selecciona de MIP-1a, MIP-1 p, RANTES, CCL4 y CCL5; y una respuesta de linfocitos que se selecciona de una respuesta de celulas T de memoria, una respuesta de celulas B de memoria, una respuesta de celulas T efectoras, una respuesta de celulas T citotoxicas y una respuesta de celulas B efectoras. Veanse, por ejemplo, los documentos WO94/00153, WO 95/17209, WO 96/02555, U.S. 6.692.752, U.S. 7.084.256, U.S. 6.977.073, U.S. 6.749.856, U.S. 6.733.763, U.S. 6.797.276, U.S. 6.752.995, U.S. 6.057.427, U.S. 6.472.515, U.S. 6.309.847, U.S. 6.969.704, U.S. 6.120.769, U.S. 5.993.800, U.S. 5.585.888; Smith et al. 1987 J. Biol. Chem. 262: 6951; Kriegler et al. 1988 Cell 53: 45-53; Beutler et al., 1986 Nature 320: 584; y los documentos U.S. 6.991.791, U.S. 6.654.462 y U.S. 6.375.944.
Composiciones farmaceuticas
Las composiciones farmaceuticas comprenden generalmente al menos un compuesto de GLA y pueden comprender ademas uno o mas componentes tal como se proporcionan en el presente documento que se seleccionan de antfgeno, agonista de TLR, coadyuvante (incluyendo opcionalmente una citocina, un modificador de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina y/o un dSLIM) y/o un constructo de expresion recombinante, en combinacion con un portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptables.
Por tanto, en algunos aspectos, la presente invencion se refiere a “monoterapia” con GLA, en la que GLA, tal como
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se describe en el presente documento, se formula en una composicion que carece esencialmente de otros antfgenos y que se administra a un sujeto con el fin de estimular una respuesta inmunitaria, por ejemplo una respuesta inmunitaria inespedfica, con el proposito de tratar o prevenir una enfermedad u otro estado, tal como tratar una infeccion por un organismo, tratar rinitis estacional o similar. En una realizacion, por ejemplo, las composiciones y los metodos de la invencion emplean un compuesto de GLA para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto. En otra realizacion, la GLA esta en forma de una pulverizacion, opcionalmente proporcionada en un kit.
GLA puede formularse preferiblemente en una emulsion estable. En una realizacion particular, por ejemplo, se proporciona una composicion que comprende un compuesto de GLA de la invencion en una emulsion estable que carece esencialmente de otros antfgenos.
En algunas otras realizaciones, la composicion farmaceutica es una composicion de vacuna que comprende tanto GLA como un antfgeno y que puede comprender ademas uno o mas componentes, tal como se proporcionan en el presente documento, que se seleccionan de un agonista de TLR, un coadyuvante (incluyendo por ejemplo una citocina, un modificador de la respuesta inmunitaria de imidazoquinolina y/o un dSLIM) y similares y/o un constructo de expresion recombinante, en combinacion con un portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptables.
Los ejemplos ilustrativos de veldculos seran no toxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Para vacunas basadas en GLA mas acido nucleico, o para vacunas que comprenden GLA mas un antfgeno, se administrara aproximadamente de 0,01 |ig/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, normalmente por via intradermica, subcutanea, intramuscular o intravenosa, o por otras vfas.
En una realizacion mas espedfica, la dosificacion es de aproximadamente 0,001 |ig/kg a aproximadamente 1 mg/kg. En otra realizacion espedfica, la dosificacion es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 50 |ig/kg. En otra realizacion espedfica, la dosificacion es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 15 |ig/kg.
En otra realizacion espedfica, la cantidad de GLA administrada es de aproximadamente 0,01 |ig/dosis a aproximadamente 5 mg/dosis. En otra realizacion espedfica, la cantidad de GLA administrada es de aproximadamente 0,1 |ig/dosis a aproximadamente 1 mg/dosis. En otra realizacion espedfica, la cantidad de GLA administrada es de aproximadamente 0,1 |ig/dosis a aproximadamente 100 |ig/dosis. En otra realizacion espedfica, la cantidad de GLA administrada es de aproximadamente 0,1 |ig/dosis a aproximadamente 10 |ig/dosis.
Resultara evidente para los expertos en la tecnica que el numero y la frecuencia de administracion dependeran de la respuesta del huesped. Los “portadores farmaceuticamente aceptables” para uso terapeutico se conocen bien en la tecnica farmaceutica y se describen, por ejemplo, en Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (Ed. A. R. Gennaro, 1985). Por ejemplo, pueden usarse solucion salina esteril y solucion salina tamponada con fosfato a pH fisiologico. En la composicion farmaceutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes saborizantes. Por ejemplo, pueden anadirse como conservantes benzoato de sodio, acido sorbico y esteres del acido p-hidroxibenzoico, ibid. en 1449. Ademas, pueden usarse antioxidantes o agentes de suspension, fd.
La expresion “sal farmaceuticamente aceptable” se refiere a sales de los compuestos de la presente invencion derivados de la combinacion de tales compuestos con un acido organico o inorganico (sales de adicion de acido) o con una base organica o inorganica (sales de adicion de base). Las composiciones de la presente invencion pueden usarse o bien en forma de base libre o bien en forma de sal, y se considera que ambas formas estan dentro del alcance de la presente invencion.
Las composiciones farmaceuticas pueden estar en cualquier forma que permita que la composicion se administre al paciente. Por ejemplo, la composicion puede estar en forma de un solido, lfquido o gas (aerosol). Las vfas de administracion tfpicas incluyen, sin limitacion, oral, topica, parenteral (por ejemplo, por via sublingual o por via bucal), sublingual, rectal, vaginal e intranasal (por ejemplo, como pulverizacion). El termino parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye la administracion iontoforetica (por ejemplo, los documentos U.S. 7.033.598, 7.018.345, 6.970.739), sonoforetica (por ejemplo, los documentos U.S. 4.780.212, 4.767.402, 4.948.587, 5.618.275, 5.656.016, 5.722.397, 6.322.532, 6.018.678), termica (por ejemplo, los documentos U.S. 5.885.211 y 6.685.699), transdermica pasiva (por ejemplo, los documentos U.S. 3.598.122, 3.598.123, 4.286.592, 4.314.557, 4.379.454, 4.568.343, 5.464.387, la memoria descriptiva de patente britanica n.° 2232802, y los documentos U.S. 6.871.477, 6.974.588 y 6.676.961), microaguja (por ejemplo, los documentos U.S. 6.908.453, 5.457.041, 5.591.139 y 6.033.928) y tambien las inyecciones subcutaneas, la inyeccion intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavernosa, intratecal, intrameatal, intrauretral o tecnicas de infusion. En una realizacion particular, una composicion tal como se describe en el presente documento (incluyendo las composiciones de vacuna y composiciones farmaceuticas) se administra por via intradermica mediante una tecnica seleccionada de iontoforesis, microcavitacion, sonoforesis o microagujas.
La composicion farmaceutica se formula de forma que permita que los principios activos contenidos en la misma esten biodisponibles tras la administracion de la composicion al paciente. Las composiciones que se administraran a un paciente tendran la forma de una o mas unidades de dosificacion, en las por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificacion individual, y un recipiente con uno o mas compuestos segun la invencion en forma de
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aerosol puede contener multiples unidades de dosificacion.
Para la administracion oral, puede haber presente un excipiente y/o un aglutinante. Ejemplos son sacarosa, caolm, glicerina, dextrinas de almidon, alginato de sodio, carboximetilcelulosa y etilcelulosa. Tambien pueden estar presentes agentes colorantes y/o saborizantes. Tambien puede emplearse una cubierta de recubrimiento.
La composicion puede estar en forma de un lfquido, por ejemplo un elixir, jarabe, disolucion, emulsion o suspension. Como dos ejemplos, el lfquido puede ser para la administracion oral o para administrarse como inyeccion. Cuando se preve la administracion oral, las composiciones preferidas contienen uno o mas de un agente edulcorante, conservantes, colorante/tinte y potenciador del sabor. En una composicion prevista para administrarse mediante inyeccion, pueden incluirse uno o mas de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspension, tampon, estabilizante o agente isotonico.
Una composicion farmaceutica lfquida tal como se usa en el presente documento, ya sea en forma de disolucion, suspension o similar, puede incluir uno o mas de los siguientes portadores o excipientes: diluyentes esteriles, tales como agua para inyeccion, solucion salina, preferiblemente solucion salina fisiologica, solucion de Ringer, cloruro de sodio isotonico, aceites fijos tales como escualeno, escualano, aceite mineral, un monooleato de manida, colesterol y/o mono o digliceridos sinteticos que pueden servir como disolvente o medio de suspension, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos, tales como alcohol bendlico o metilparabeno; antioxidantes, tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tal como el acido etilendiaminotetraacetico; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparacion parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o frascos para varias dosis compuestos por cristal o plastico. Una composicion farmaceutica inyectable es preferiblemente esteril.
En una realizacion particular, una composicion farmaceutica o de vacuna segun la invencion comprende una suspension acuosa estable de menos de 0,2 |im y comprende ademas al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en fosfolfpidos, acidos grasos, tensioactivos, detergentes, saponinas, lfpidos fluorados y similares.
En otra realizacion, una composicion de la invencion se formula de manera que pueda prepararse en forma de aerosol.
Tambien puede ser deseable incluir otros componentes en la composicion farmaceutica o para vacunas, tal como vetuculos de administracion incluyendo, pero sin limitarse a, sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vetuculos oleosos biodegradables, emulsiones de aceite en agua, microcapsulas biodegradables y liposomas. Los ejemplos de sustancias inmunoestimuladoras (coadyuvantes) adicionales para su uso en tales vetuculos tambien se han descrito anteriormente y pueden incluir N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), glucano, IL-12, GM- CSF, interferon gamma e IL-12.
Aunque en las composiciones farmaceuticas segun la invencion puede emplearse cualquier portador adecuado conocido por los expertos en la tecnica, el tipo de portador variara dependiendo del modo de administracion o de si se desea una liberacion prolongada. Para la administracion parenteral, tal como inyeccion subcutanea, el portador puede comprender preferiblemente agua, solucion salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampon. Para la administracion oral, pueden emplearse cualquiera de los portadores anteriores o un portador solido, tal como manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Tambien pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, poli(lactida-galactida)) como portadores para las composiciones farmaceuticas de esta invencion. Se dan a conocer microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 4.897.268 y 5.075.109. A este respecto, es preferible que la microesfera sea mayor de aproximadamente 25 micrometros.
Las composiciones farmaceuticas (incluyendo vacunas con GLA y adyuvantes inmunologicos de GLA) tambien pueden contener diluyentes como tampones, antioxidantes, tales como acido ascorbico, polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), protemas, aminoacidos, hidratos de carbono incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutation y otros estabilizantes y excipientes. Ejemplos de diluyentes apropiados son la solucion salina tamponada neutra o solucion salina mezclada con albumina serica inespedfica. Preferiblemente, el producto puede formularse como un liofilizado usando disoluciones de excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.
Tal como se describio anteriormente, en determinadas realizaciones, la invencion objeto incluye composiciones que pueden suministrar moleculas del acido nucleico que codifican para los antfgenos deseados. Tales composiciones incluyen vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus (veanse los documentos WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 y WO 94/03622), adenovirus (vease Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4: 403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130-134, 1993; y Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1993), poxvirus (veanse las patentes estadounidenses n.os 4.769.330, 5.017.487 y el documento WO 89/1973)); moleculas de acido nucleico constructo de expresion recombinante complejadas con una molecula policationica (vease el documento WO 93/03709) y acidos nucleicos asociados con liposomas (vease
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Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851, 1987). En determinadas realizaciones, el ADN puede estar unido a adenovirus muertos o inactivados (vease Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6094, 1992). Otras composiciones adecuadas incluyen combinaciones de ADN-ligando (vease Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989) y de ADN-lfpido (vease Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-1417, 1989).
Ademas de los procedimientos in vivo directos, pueden usarse procedimientos ex vivo en los que las celulas se retiran del huesped, se modifican y se colocan en el mismo animal huesped o en otro. Resultara evidente que pueden utilizarse cualquiera de las composiciones indicadas anteriormente para la introduccion de moleculas de acido nucleico que codifican para antfgeno en celulas de tejido en un contexto ex vivo. Los protocolos para los metodos de captacion viral, ffsica y qmmica se conocen bien en la tecnica.
Por consiguiente, la presente invencion es util para potenciar o producir una respuesta inmunitaria en un huesped, un paciente o en cultivo celular. Tal como se usa en el presente documento, el termino “paciente” se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede estar afectado con una enfermedad infecciosa, cancer, tal como cancer de mama, o una enfermedad autoinmunitaria, o puede ser normal (es decir, estar libre de cualquier enfermedad y/o infeccion detectable). Un “cultivo celular” es cualquier preparacion que contiene celulas inmunocompetentes o celulas aisladas del sistema inmunitario (incluyendo, pero sin limitarse a, celulas T, macrofagos, monocitos, celulas B y celulas dendnticas). Tales celulas pueden aislarse mediante cualquiera de una variedad de tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica (por ejemplo, centrifugacion por gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque). Las celulas pueden (pero no necesariamente) haberse aislado de un paciente afectado con cancer y pueden ser volver a introducirse en el paciente despues del tratamiento.
En determinadas realizaciones, una composicion lfquida para la administracion o bien parenteral o bien oral debe contener una cantidad de composicion de vacuna con GLA de manera que se obtenga una dosis adecuada. Normalmente, esta cantidad es de al menos el 0,01% en peso de un antfgeno en la composicion. Cuando se pretende que sea para la administracion oral, esta cantidad puede variar entre el 0,1 y aproximadamente el 70% del peso de la composicion. Las composiciones orales preferidas contienen entre aproximadamente el 4% y aproximadamente el 50% del antfgeno. Las composiciones y preparaciones preferidas se preparan de modo que una unidad de dosificacion parenteral contiene entre el 0,01 y el 1% en peso de la composicion de agente activo.
La composicion farmaceutica puede estar prevista para la administracion topica en cuyo caso el vehnculo puede comprender adecuadamente una disolucion, emulsion, base de gel o pomada. La base, por ejemplo, puede comprender uno o mas de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abejas, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizadores. En una composicion farmaceutica para la administracion topica puede haber presentes agentes espesantes. Si esta prevista para la administracion transdermica, la composicion puede incluir un parche transdermico o un dispositivo para iontoforesis. Las formulaciones topicas pueden contener una concentracion del antfgeno (por ejemplo, una composicion de vacuna con GLA-antigeno) o GLA (por ejemplo, una composicion de adyuvante inmunologico; GLA esta disponible en Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, aL; por ejemplo el numero de producto 699800) o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 10% p/v (peso por volumen unitario).
La composicion puede estar prevista para la administracion rectal en forma, por ejemplo, de un supositorio que se fundira en el recto y liberara el farmaco. La composicion para la administracion rectal puede contener una base oleaginosa, tal como un excipiente no irritante adecuado. Tales bases incluyen, sin limitacion, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol. En los metodos de la invencion, las composiciones de vacuna/adyuvantes pueden administrarse mediante el uso de inserto(s), perla(s), formulacion/formulaciones de liberacion retardada, parche(s) o formulacion/formulaciones de liberacion rapida.
En determinadas realizaciones tambien se contemplan kits que comprenden las composiciones de vacuna con GLA y/o las composiciones de adyuvante inmunologico de gLa descritas en el presente documento, que pueden proporcionarse en uno o mas recipientes. En una realizacion todos los componentes de las composiciones de vacuna con GLA y/o las composiciones de adyuvante inmunologico estan presentes juntos en un unico recipiente, pero se pretende que se limiten las realizaciones de la invencion y tambien se contemplan dos o mas recipientes en los que, por ejemplo, una composicion de adyuvante inmunologico de GLA esta separada de, y no esta en contacto con, el componente antigenico. Como teona no limitante, se cree que en algunos casos puede realizarse de forma beneficiosa la administracion solo de la composicion de adyuvante inmunologico de gLa, mientras que en otros casos tal administracion puede ser beneficiosa si esta separada temporal y/o espacialmente (por ejemplo, en lugares anatomicos diferentes) de la administracion del antfgeno, mientras que todavfa en otros casos, la administracion al sujeto se realiza de forma beneficiosa mediante la composicion de vacuna con GLA tal como se ha descrito en el presente documento y que contiene tanto el antfgeno como GLA y opcionalmente otros de los componentes descritos en el presente documento igualmente.
Un recipiente segun tales realizaciones para un kit puede ser cualquier recipiente, vasija, vial, ampolla, tubo, copa, caja, botella, frasco, jarra, plato, pocillo de un aparato con un solo pocillo o con varios pocillos, deposito, tanque o similar, o cualquier otro dispositivo en el que las composiciones descritas en el presente documento se puedan colocar, almacenar y/o transportar y al que pueda accederse para retirar el contenido. Normalmente un recipiente de
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este tipo puede estar compuesto por un material que es compatible con el uso previsto y del que la recuperacion del contenido del recipiente puede obtenerse facilmente. Los ejemplos preferidos de tales contendores incluyen tubos y ampollas de vidrio y/o plastico sellados o resellables, incluyendo los que tienen un septo de goma u otro medio de sellado que sea compatible con la retirada del contenido usando una aguja y una jeringa. Tales recipientes pueden, por ejemplo, estar compuestos por vidrio o un plastico o una resina qmmicamente compatibles, que puede estar compuesto por, o puede recubrirse con, un material que permita la recuperacion eficaz del material del recipiente y/o proteger el material frente a, por ejemplo, condiciones degradantes tales como la luz ultravioleta o temperaturas extremas, o frente a la introduccion de contaminantes no deseados, incluyendo contaminantes microbianos. Los recipientes son preferiblemente esteriles o esterilizables, y estan compuestos por materiales que sean compatibles con cualquier portador, excipiente, disolvente, vetuculo o similar, de manera que puedan usarse para suspender o disolver las composiciones de vacuna y/o composiciones de adyuvante inmunologico y/o antigenos y/o constructos de expresion recombinante, etc. descritos en el presente documento.
Los sistemas de emulsion tambien pueden usarse en la formulacion de las composiciones de la presente invencion. Por ejemplo, se han descrito muchos sistemas de emulsion monofasicos o multifasicos. Se han sugerido adyuvantes de emulsion de aceite en agua que son utiles por sf mismos como composicion de adyuvante (documento EP 0 399 843 B), tambien se han descrito combinaciones de emulsiones de aceite en agua y otros agentes activos como adyuvantes para vacunas (documentos WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Tambien se han descritos otros adyuvantes de emulsion de aceite, tales como emulsiones de agua en aceite (veanse la patente estadounidense n.° 5.422.109; el documento EP 0 480 982 B2) y emulsiones de aceite en agua (veanse la patente estadounidense n.° 5.424.067 y el documento EP 0 480 981 B). Los adyuvantes de emulsion de aceite para su uso en la presente invencion pueden ser naturales o sinteticos y pueden ser minerales u organicos. Los ejemplos de aceites minerales y organicos resultaran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica.
En una realizacion particular, una composicion de la invencion comprende una emulsion de aceite en agua en la que se incorpora GLA en la fase de aceite. En otra realizacion, una composicion de la invencion comprende una emulsion de aceite en agua en la que se incorpora GLA en la fase de aceite y en la que hay un componente adicional presente, tal como un coadyuvante, un agonista de TLR o similar, tal como se describe en el presente documento.
Con el fin de que cualquier composicion de aceite en agua sea adecuada para la administracion a seres humanos, la fase de aceite del sistema de emulsion comprende preferiblemente un aceite metabolizable. El significado del termino aceite metabolizable se conoce bien en la tecnica. Metabolizable puede definirse como “que puede transformarse por el metabolismo” (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Saunders Company, 25a ed. (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite sintetico, que sea no toxico para el receptor y que pueda transformarse por el metabolismo. Los frutos secos (tales como el aceite de cacahuete), semillas y granos son fuentes comunes de aceites vegetales. Los aceites sinteticos tambien forman parte de esta invencion y pueden incluir aceites disponibles comercialmente, tales como NEOBEE® y otros.
El escualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno), por ejemplo, es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en el aceite de tHgado de tiburon y, en menores cantidades en el aceite de oliva, aceite de germen de trigo, aceite de salvado de arroz, y en levaduras, y es un aceite particularmente preferido para su uso en esta invencion. El escualeno es un aceite metabolizable debido al hecho de que es un producto intermedio en la biosmtesis del colesterol (mdice Merck, 10a edicion, entrada n.° 8619). Emulsiones de aceite particularmente preferidas son las emulsiones de aceite en agua y, en particular, las emulsiones de escualeno en agua. Ademas, los adyuvantes de emulsion de aceite de la presente invencion mas preferidos comprenden un antioxidante, que es preferiblemente el aceite alfa-tocoferol (vitamina E, documento EP 0 382 271 B1). Los documentos WO 95/17210 y WO 99/11241 dan a conocer adyuvantes de emulsion basados en escualeno, alfa- tocoferol y TWEEN® 80, formulados opcionalmente con los inmunoestimulantes QS21 y/o 3D-MPL (que se han descrito anteriormente). El documento Wo 99/12565 da a conocer una mejora en estas emulsiones de escualeno con la adicion de un esterol en la fase de aceite. Adicionalmente, puede anadirse un triglicerido, tal como la tricaprilina (C27H50O6), a la fase de aceite con el fin de estabilizar la emulsion (documento WO 98/56414).
El tamano de las gotas de aceite que se encuentran en la emulsion de aceite en agua estable es preferiblemente menor de 1 micrometro, sustancialmente puede estar en el intervalo de 30-600 nm, de manera sustancialmente preferible de aproximadamente 30-500 nm de diametro, y los mas preferible de sustancialmente 150-500 nm de diametro, y particularmente de aproximadamente 150 nm de diametro, medido mediante espectroscopfa de correlacion fotonica. En este sentido, el 80% de las gotas de aceite en numero debe estar dentro de los intervalos preferidos, mas preferiblemente mas del 90% y lo mas preferible mas del 95% de las gotas de aceite en numero estan dentro de los intervalos de tamano definidos. Las cantidades de los componentes presentes en las emulsiones de aceite de la presente invencion estan convencionalmente en el intervalo de desde el 2 hasta el 10% de aceite, tal como escualeno; y, si esta presente, desde el 2 hasta el 10% de alfatocoferol; y desde el 0,3 hasta el 3% de tensioactivo, tal como monooleato de polioxietileno-sorbitano. Preferiblemente, la razon de aceite:alfa-tocoferol es igual o menor de 1 ya que esto proporciona una emulsion mas estable. El Span 85 tambien puede estar presente, en una cantidad de aproximadamente el 1%. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invencion contengan adicionalmente un estabilizador.
El metodo para producir emulsiones de aceite en agua lo conocen bien conocido los expertos en la tecnica. Generalmente, el metodo comprende el mezclado de la fase de aceite con un tensioactivo, tal como una disolucion de PBS/TWEEN 80®, seguido por homogeneizacion usando un homogeneizador. Por ejemplo, un metodo que comprende hacer pasar la mezcla una vez, dos veces o mas veces a traves de una aguja de jeringa sena adecuado 5 para homogeneizar pequenos volumenes de Kquido. De igual forma, el procedimiento de emulsionamiento en un microfluidizador (maquina microflmdica M110S, con un maximo de 50 pasadas durante un periodo de 2 minutos con una entrada de presion maxima de 6 bares (presion de salida de aproximadamente 850 bares)) podna adaptarse para producir volumenes de emulsion menores o mayores. Esta adaptacion podna lograrse mediante experimentacion de rutina que comprenda la medida de la emulsion resultante hasta que se obtenga una 10 preparacion con las gotas de aceite del diametro requerido.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no de limitacion. Solo los ejemplos cubiertos por el alcance de las reivindicaciones adjuntas forman parte de la invencion.
Ejemplos
EJEMPLO 1
15 2-AZIDO-2-DESOXI-D-GLUCOPIRAN6SIDO (2)
imagen19
Se disolvio azida de sodio (2,78 g, 42,7 mmol) en agua (7 ml) y tolueno (7 ml). Se enfrio la mezcla hasta 0°C con agitacion vigorosa. Se anadio gota a gota antudrido tnflico (4,57 ml, 27,2 mmol), y se agito la mezcla durante 30 min a 0°C. Se elevo la temperatura hasta 10°C, y se agito la mezcla bifasica durante 2 h. Se anadio gota a gota una 20 disolucion acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio hasta que hubo cesado el desprendimiento de gas. Se separaron las dos fases, y se extrajo la fase acuosa con tolueno (2 x 7 ml). Se usaron las fases organicas combinadas en la posterior reaccion de transferencia de diazo.
Se disolvieron glucosamina 1 (2,04 g, 9,45 mmol), hidrogenocarbonato de sodio (3,21 g, 38,22 mmol) y sulfato de cobre (II) pentahidratado (90,5 mg, 0,362 mmol) en agua (12,3 ml). Se anadio la disolucion madre de azida tnflica 25 preparada anteriormente (21 ml), seguido por la adicion de metanol (81 ml) para proporcionar un sistema homogeneo. Se agito vigorosamente la mezcla de color azul a temperatura ambiente. Se monitorizo el consumo completo de la amina mediante CCF (tincion con ninhidrina) y tambien se indica por un cambio de color de la mezcla de azul a verde. Se eliminaron los disolventes a vacfo con un evaporador rotatorio manteniendo la temperatura estrictamente por debajo de 25°C. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna 30 RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de metanol a del 0% al 40%/diclorometano a lo largo de 50 min, 85 ml/min) para dar el producto 2 (1,93 g, 99%) como un lfquido incoloro. 1H-RMN (300 MHz, CD3OD (mezcla de diastereomeros 1/1) 8 5,18 (d, J= 3,4 Hz, 0,5H), 4,51 (d, J= 8,0 Hz, 0,5H), 3,89-3,63 (m, 3H), 3,32-3,26 (m, 2H), 3,113,06 (m, 1H).
EJEMPLO 2
35 2-AZIDO-2-DESOXI-46-O-BENCILlDEN-D-GLUCOPIRAN6SIDO (3)
imagen20
A una disolucion del compuesto 2 (2,00 g, 9,75 mmol) en DMF (40 ml) se le anadio dimetil acetal de benzaldehfdo (1,65 g, 10,8 mmol) y acido canforsulfonico (90 mg). Se conecto el matraz a un sistema de vacfo, y se calento la mezcla a 50°C en un bano de aceite. Despues de 3 h, se concentro la mezcla usando un evaporador rotatorio. Se 40 redisolvio el residuo en dietil eter (50 ml) y Et3N (2 ml) seguido por bicarbonato de sodio saturado (50 ml). Se extrajo la fase acuosa con dietil eter (3 x 50 ml). Se secaron los extractos organicos combinados sobre sulfato de sodio y se filtraron. Despues de la eliminacion de los disolventes usando un evaporador rotatorio, se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 100%/hexanos a lo largo de 50 min, 85 ml/min) para dar el producto 3 (2,58 g, 90%) como un lfquido 45 incoloro. 1H-RMN (300 MHz, CD3OD 8 7,49-7,32 (m, 5H), 5,58 (s, 1H), 4,64 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 4,25-341 (m, 5H), 3,23-3,20 (m, 1H).
EJEMPLO 3
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-2-AZID0-4,6-0-BENCILIDEN-2-DES0XI-B-D-GLUC0PIRAN6SID0 (4)
imagen21
Se anadio cloruro de f-butildimetilsililo (820 mg, 5,44 mmol) a una mezcla del compuesto 3 (1,45 g, 4,94 mmol) e 5 imidazol (768 mg, 11,3 mmol) en CH2Cl2 (40 ml) a 0°C. Despues de que se agitase la disolucion durante la noche, se anadio bicarbonato de sodio saturado (20 ml), y se extrajo la mezcla con dietil eter (3 x 30 ml). Se secaron las fases organicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (columna Redisep, 80 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 70%/hexanos a lo largo de 40 min, 60 ml/min) para proporcionar el producto 4 (1,5 g, 74%) como un solido 10 incoloro. 1H-RMN (300 MHz, CDCIs) 8 7,46-7.43 (m, 2H), 7,35-7,32 (m, 3H), 5.48 (s, 1H), 4.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 10,2, 5,0 Hz, 1H), 3,73 (t, J = 10,2 Hz, 1H), 3,56-3,51 (m, 2H), 3,31-3,28 (m, 2H), 2,72 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 0,91 (s, 9H), 0,14 (s, 3H), 0,13 (s, 3H).
EJEMPLO4
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-3-0-ALIL0XICARB0NIL-2-AZID0-4,6-0-BENCILDIDIN-2-DES0XI-D- 15 GLUCOPIRAN6SIDO (5)
imagen22
A una disolucion del compuesto 4 (1,50 g, 3,68 mmol) y tetrametiletilendiamina (TMEDA) (0,78 ml, 5.2 mmol) en diclorometano (DCM) (50 ml) a 0°C se le anadio cloroformiato de alilo (0,78 ml, 7,3 mmol) gota a gota. Se permitio que se calentase la mezcla hasta temperatura ambiente, y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante 10 h. 20 Se diluyo la mezcla con DCM (50 ml) y se lavo con NaHCOa acuoso saturado (2 x 100 ml) y salmuera (2 x 50 ml). Se
secaron las fases organicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (columna Redisep, 80 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 50%/hexanos a lo largo de 40 min, 60 ml/min) para proporcionar el producto 5 (1,57 g, 87%) como un solido incoloro. Rf = 0,40 (hexanos/acetato de etilo, 3/1, v/v). 1H-RMN (300 MHz, CDCI3) 8 7,44-7.41 (m, 2H), 25 7,35-7,32 (m, 3H), 5,98-5,85 (m, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,38-5,22 (m, 2H), 4,88 (t, J = 11,4 Hz, 1H), 4,72-4,64 (m, 3H),
4,32-4,27 (m, 1H), 3,81-3,65 (m, 2H), 3,50-3,42 (m, 2H), 0,94 (s, 9H), 0,18 (s, 3H), 0,17 (s, 3H).
EJEMPLO 5
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-3-0-ALIL0XICARB0NIL-2-AZID0-6-0-BENCIL-2-DES0XI-D-GLUC0PIRAN6SID0 (6)
imagen23
30 Se agito una suspension del compuesto 5 (320 mg, 0,651 mmol) y tamices moleculares (4 A, 200 mg) en THF (5 ml) a temperatura ambiente durante 1 h, y luego se le anadio NaCNBH3 (246 mg, 3,91 mmol). Se anadio gota a gota una disolucion de cloruro de hidrogeno (2 M en dietil eter) a esta mezcla hasta que la mezcla se volvio acida (~ 5 ml, pH = 5). Despues de agitarse otras 0,5 h, se extinguio la mezcla de reaccion con NaHCO3 solido diluido con dietil eter (100 ml), y se lavo con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 100 ml) y salmuera (2 x 50 ml). Se seco la fase organica sobre 35 Na2SO4, se filtro, se concentro a vado, y se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (columna Redisep, 40 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 100%/hexanos a lo largo de 40 min, 40 ml/min) para proporcionar el producto 6 (273 mg, 85%) como un solido incoloro. Rf = 0,42 (hexanos/acetato de etilo, 4/1, v/v). 1H-RMN (300 MHz, CDCI3) 8 7,39-7,34 (m, 5H), 5,99-5,89 (m, 1H), 5,40-5.26 (m, 2H), 4,67-4,56 (m, 5H), 3,72-3,70 (m, 3H), 3,48-3.46 (m, 2H), 3,37 (dd, J = 9,6, 8,4 Hz, 1 H), 3,01 (s ancho, 1H), 0,94 (s, 9H), 0,17 40 (s, 6H).
EJEMPLO 6
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-3-0-ALIL0XICARB0NIL-2-AZID0-6-0-BENCIL-2-DES0XI-4-0-(1,5-DIHIDR0-3-0X0- 3X5-3H-2,4.3-BENZ0DI0XAF0SFEPIN-3-IL)-D-GLUC0PIRAN6SID0 (7)
imagen24
A una disolucion del compuesto 6 (5,47 g, 11,1 mmol) y 1H-tetrazol (al 3% en peso en acetonitrilo, 35,5 mmol, 104 ml) se le anadio N,N-dietil-1,5-dihidro-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-amina (5,3 g, 22 mmol). Despues de agitarse la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 15 min, se enfrio hasta -20°C, se agito durante otros 10 min a 5 esa temperatura, y luego se le anadio mCPBA (8,40 g, al 50-55% en peso, 24,4 mmol). Se agito la mezcla de reaccion a -20°C durante 20 min, y se concentro a vado. Se redisolvio el residuo en DCM (30 ml) y se lavo con NaHCO3 acuoso saturado (40 ml). Se extrajo la fase acuosa con DCM (3 x 50 ml). Se secaron las fases organicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 10 100%/hexanos a lo largo de 60 min, 85 ml/min) para proporcionar el producto 7 (4,85 g, 65%) como un aceite de color amarillo palido. Rf = 0,40 (hexanos/acetato de etilo, 1/1, v/v). 1H-RMN (300 MHz, CDCh) 8 7,35-7,18 (m, 9H), 5,98-5,85 (m, 1H), 5,41-5,05 (m, 6H), 4,64 (t, J = 10,1 Hz, 1H), 4,58-4,52 (m, 6H), 3,83 (d, J= 9,0 Hz, 1H), 3,72-3,61 (m, 2H), 3,41 (dd, J = 10,5, 7,4 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,16 (s, 3H), 0,15 (s, 3H).
EJEMPLO 7
15 7ERC-BUTILDIMETILSILIL-3-0-ALIL0XICARB0NIL-6-0-BENCIL-2-DES0XI-4-0-(1.5-DIHIDR0-3-0X0-3X5-3H-
2.4.3-BENZ0DI0XAF0SFEPIN-3-IL-2-(9-FLU0RENILMET0XICARB0NILAMIN0)-D-GLUC0PIRAN6SID0 (8)
imagen25
Se anadio gota a gota acido acetico (0,30 ml, 5,2 mmol) a una suspension con agitacion de 7 (700 mg, 1,04 mmol) y polvo de zinc (676 mg, 10,4 mmol) en DCM (15 ml). Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 20 4 h, despues de lo cual se diluyo con acetato de etilo (50 ml). Se retiraron los solidos por filtracion y se lavaron con
acetato de etilo (2 x 10 ml). Se lavaron los filtrados combinados con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 40 ml) y salmuera (2 x 40 ml). Se seco la fase organica (MgSO4) y se filtro, y se concentro el filtrado a vado para proporcionar la amina intermedia en bruto como un aceite de color amarillo palido. Rf = 0,21 (hexanos/acetato de etilo, 1/1, v/v). Se anadio cloruro de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc-Cl) (323 mg, 1,25 mmol) a una disolucion con 25 agitacion de la amina en bruto y diisopropiletilamina (DIPEA) (0,22 ml, 1,3 mmol) en DCM (15 ml) a 0°C. Se calento y se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 5 h, despues de lo cual se diluyo con DCM (40 ml) y se lavo con salmuera (2 x 50 ml). Se seco la fase organica (MgSO4) y se filtro. Se concentro el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (columna Redisep, 40 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 100%/hexanos a lo largo de 30 min, 40 ml/min) para dar el producto 8 (337 30 mg, 73% a lo largo de dos etapas) como un solido blanco. Rf = 0,54 (hexanos/acetato de etilo, 1/1, v/v). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) 8 7,78-7,20 (m, 17H), 5,92-5,82 (m, 1H), 5,49-5,16 (m, 8H), 4,69-4,06 (m, 5H), 4,49-4,28 (m, 2H), 3,88-3,61 (m, 3H), 3,60-3,51 (m, 2H), 3,32 (s ancho, 1H), 0,94 (s, 9H), 0,14 (s, 3H), 0,10 (s, 3H).
EJEMPLO 8
3-0-ALIL0XICARB0NIL-6-0-BENCIL-2-DES0XI-4-0-(1.5-DIHIDR0-3-0X0-3X5-3H-2.4.3- 35 BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-(9-FLUORENILMETOXICARBONILAMINO)-D-GLUCOPIRAN6SIDO (9)
imagen26
Se anadio gota a gota fluoruro de hidrogeno/piridina (6 ml, 0,2 mol) a una disolucion con agitacion de 8 (6,00 g, 6,88 mmol) en THF (50 ml). Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 12 h, despues de lo cual se diluyo con dietil eter (100 ml), y luego se lavo con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 40 ml) y salmuera (2 x 40 ml). 40 Se seco la fase organica (MgSO4) y se filtro. Se concentro el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante
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cromatografia en columna sobre gel de sHice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 80%/hexanos a lo largo de 60 min, 85 ml/min) para dar el producto 9 (4,34 g, 83%) como un aceite de color amarillo palido. 1H-RMN (300 MHz, CDCb) 8 7,75-7,20 (m, 17H), 5,92-5,82 (m, 1H), 5,27-5,06 (m, 9H), 4,594,55 (m, 5H), 4,41-4,39 (m, 1H), 4,25-4,01 (m, 5H), 3,85-3,65 (m, 2H).
EJEMPLO 9
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-(3-O-ALILOXICARBONIL-6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1.5-DIHIDRO-3-OXO-3X5- 3H-2,4,3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DODECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-B-D- GLUCOPIRANOSIL}-2-AZIDO-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-DODECANOIL1-2-DESOXI-B-D- GLUCOPIRANOSIDO (11)
imagen27
Se agito una suspension de 10 (vease la preparacion a continuacion) (350 mg, 0,172 mmol), zinc (1,3 g, 21 mmol) y acido acetico (0,70 ml, 12 mmol) en DCM (20 ml) a temperatura ambiente durante 12 h. Se diluyo la mezcla con dietil eter. Se retiraron los solidos por filtracion, y se lavo el residuo con dietil eter (2 x 10 ml). Se lavaron los filtrados combinados con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 15 ml) y salmuera (2 x 15 ml). Se seco la fase organica (MgSO4) y se filtro. Se concentro el filtrado a vado, y se purifico el residuo mediante cromatografia en columna sobre gel de sHice (columna Redisep, 12 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 60%/hexanos a lo largo de 35 min, 30 ml/min) para proporcionar el producto 11 (220 mg, 64%) como un sirope de color amarillo palido. Rf = 0,29 (hexanos/acetato de etilo, 5/2, v/v). 1H-RMN (300 MHz, CDCh) 8 7,37-7,24 (m, 20H), 6,20 (d, J= 7,2 Hz, 1H), 5,59 (t, J= 9,6 Hz, 1H), 5,31 (m, 1H), 5,12-4,97 (m, 6H), 4,62-4,44 (m, 7H), 4,05-3,24 (m, 9H), 2,68-2,12 (m, 9H), 1,64-1,59 (m, 13H), 1,27 (m ancho, 95H), 0,94 (m, 25H), 0,13 (s, 6H). EMAR (m/z) (pos.) calc. para C117H193N2O20PSi, 2005,37; hallado, 2006,3729 [M + H]+.
EJEMPLO 10
TERC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-(3-O-ALILOXICARBONIL-6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1 ■5-DIHIDRO-3-OXO-3X5- 3H-2,4,3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)1-3-DODECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-B-D- GLUCOPIRANOSIL}-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-DODECANOIL1-2-[(R)-3-4-METOXIBENCILOXI- TETRADECANOIL1-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (12)
imagen28
A una disolucion de la amina 11 (93 mg, 0,046 mmol) en DCM (10 ml) se le anadio piridina (21 mg, 0,27 mmol), cloruro de (R)-3-(4-metoxibenciloxi)tetradecanono (vease la preparacion a continuacion, compuesto 35) (40 mg, 0,12 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (1 mg) a temperatura ambiente, y se agito la mezcla durante la noche. se transfirio la mezcla a un embudo de decantacion y se diluyo con dietil eter (20 ml) y bicarbonato de sodio saturado (20 ml). Se extrajo la fase acuosa con dietil eter (3 x 20 ml). Se secaron los extractos organicos combinados sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a presion reducida. Se purifico el residuo mediante cromatografia sobre gel de sflice (columna Redisep, 12 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 80%/hexanos a lo largo de 35 min, 30 ml/min) para dar el producto 12 (81 mg, 74%) como un fiquido incoloro. Rf = 0,34 (hexanos/acetato de etilo, 3/2, v/v). 1H-RMN (300 MHz, CDCh) 8 7,34-7,20 (m, 20H), 6,89-6,86 (m, 4H), 6,15 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 5,57-5,55 (m, 1H), 5,31-4,99 (m, 8H), 4,57-4,44 (m, 11H), 4,06-3,33 (m, 15H), 2,63-2,57 (m, 5H), 2,33-2,27 (m, 9H), 1,57 (m, 8H), 1,27 (m ancho, 112H), 0,88-0,82 (m, 27H), 0,08 (s, 3H), 0,04 (s, 3H). EMAR (m/z) (pos.) calc. para C-,39H227N2O23PSi, 2351,62; hallado, 2352,6343 [M + H]+.
5
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EJEMPLO 11 LIPIDO A (13a)
imagen29
Se agito una suspension de 12 (10 mg, 0,0042 mmol) y negro de Pd (15,0 mg) en THF anhidro (5 ml) bajo una atmosfera de H2 (50 psi) a temperatura ambiente durante 30 h. Se retiro el catalizador por filtracion. Se lavo el residuo con THF (2 x 1 ml). Se enfrio la disolucion hasta -40°C y se neutralizo con amoniaco en metanol (0,1 ml, 7 M) y se concentro sin calentar a vado. Se purifico el residuo mediante cromatografia (columna Redisep, 12 g, eluyendo con cloroformo/metanol/agua 8/2/0,1 durante 30 min, 30 ml/min) para proporcionar 13a (4 mg, 54%) como una pelicula incolora. Se redisolvio el producto en agua y metanol (v/v, 1/1, 2 ml) y se liofilizo para obtener el producto 13a como un polvo blanco. 1H-RMN (500 MHz, CDCb) 8 6,00-5,00 (m, 1H), 4,50-3,50 (m, 2H), 3,00-2,00 (m, 3H), 2,00-1,00 (m, 50H), 0,81 (m, 18H). EM (multimodal, neg.) calc. para C96H181N2O22P, 1745,28; hallado, 1745,0 [M - H]-.
EJEMPLO 12
LIPIDO A (13b)
imagen30
Se agito una suspension de 12 (27 mg, 0,011 mmol) y negro de Pd (41,0 mg) en THF anhidro (12 ml) bajo una atmosfera de H2 (50 psi) a temperatura ambiente durante 30 h. Se retiro el catalizador por filtracion. Se lavo el residuo con THF (2 x 3 ml). Se neutralizo la disolucion con trietilamina (TEA) (0,1 ml) y se concentro sin calentar a vado. Se concentraron a vado los filtrados combinados y se purificaron mediante cromatografia sobre sflice (columna Redisep, 12 g, eluyendo con cloroformo/metanol/agua 8/2/0,1 30 min, 30 ml/min) para proporcionar 13b (5 mg, 25%) como una peficula incolora. Se redisolvio el producto en agua y metanol (v/v, 1/1, 2 ml) y se liofilizo para obtener el producto 13b como un polvo blanco. 1H-RMN (500 MHz, CDCb) 8 5,17 (ancho, 2H), 4,23-3,62 (m, 5H), 3,11-3,07 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 2,51-2,12 (m, 6H), 1,56-1,00 (m, 69H), 0,92-0,84 (m, 18H). EM (multimodal, neg.) calc. para C96H181N2O22P, 1745,28; hallado, 1744,1 [M - H]-.
EJEMPLO 13
TERC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-[3-O-ALILOXICARBONIL-6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1.5-DIHIDRO-3-OXO-375- 3H-2.4.3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-(9-FLUORENILMETOXICARBONILAMINO)-B-D-GLUCOPIRANOSIL1-2- AZIDO-4-O-BENCIL-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (15)
imagen31
Se disolvio el compuesto 9 (89 mg, 0,12 mmol) en DCM anhidro (3 ml). Se anadio tricloroacetonitrilo (1,0 ml) seguido por hidruro de sodio (1,0 mg, al 60% en aceite mineral). Despues de 15 min, la CCF indico la presencia de 9, de
modo que se anadio una cantidad adicional de hidruro de sodio (1 mg, al 60% en aceite mineral). Despues de 15 min, la CCF indico que la reaccion era completa. Se concentro la mezcla a vado y se cargo sobre una columna de SiO2 que se pretrato con Et3N y se eluyo con acetato de etilo al 50%/hexanos para proporcionar el producto intermedio de tricloroacetimidato (76,9 mg, 7l%) que se uso sin purificacion adicional. Se agito una suspension de 5 tricloroacetimidato (76,9 mg, 0,0852 mmol), el aceptor 14 (vease la preparacion a continuacion) (52,34 mg, 0,1277 mmol) y tamices moleculares (4 A, 500 mg) en DCM (5,0 ml) a temperatura ambiente durante 1 h. Se enfrio la mezcla (-60°C) y se le anadio TMSOTf (1,54 |il, 0,0851 mmol). Despues de agitarse la mezcla de reaccion durante 30 min, se extinguio con NaHCO3 solido. Se retiraron los solidos por filtracion, y se concentro el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 2:1 (v/v)) para 10 dar 15 (55 mg, 40%) como un solido incoloro. 1H-RMN (500 MHz, CD3COCD3) 8 7,86-7,22 (m, 22H), 6,98 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 5,85 (m, 1H), 5,41 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 5,38-5,21 (m, 3H), 5,10-5,02 (m, 3H), 4,91 (d, J = 11,0 Hz, 2H), 4,724,46 (m, 7H), 4,23-4,15 (m, 4H), 3,93-3,80 (m, 4H), 3,69-3,66 (m, 1H), 3,54 (s a, 3H), 3,20 (dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 8,0 Hz, 1H), 0,95 (s, 9H), 0,17 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CD3COCD3) 8 207,00, 156,61, 155,51, 145,22, 144,82, 142,06, 142,01, 139,98, 139,57, 136,68, 136,62, 133,02, 132,94, 129,85, 129,83, 129,15, 129,05, 128,95, 128,91, 15 128,82, 128,61, 128,49, 128,41, 128,21, 128,17, 128,0, 127,92, 126,19, 126,09, 125,98, 120,79, 118,60, 118,52,
101,41, 97,57, 78,78, 78,10, 76,84, 75,98, 75,88, 75,43, 75,30, 75,17, 74,70, 74,07, 70,63, 69,76, 69,64, 69,27, 69,15, 69,10, 69,02, 68,97, 67,73, 67,17, 57,29, 54,94, 26,11, 18,51; EMAR (m/z) calc. para CssHNO^PSi [M + H]+, 1149,4293; hallado, 1149,4238.
EJEMPLO 14
20 7ERC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-{3-O-ALILOXICARBONIL-6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-
3H-2,4,3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DODECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO-B-D- GLUCOPIRANOSU-2-AZIDO-4-O-BENCIL-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (16)
imagen32
Se anadio gota a gota 1,8-diazabicilco[5.4.0]undec-7-eno (220 |il, 1,47 mmol) a una disolucion de 15 (800 mg, 25 0,696 mmol) en DCM (10 ml). Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 1 h, despues de lo
cual se concentro a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (DCM/metanol, de 100:1 a 100:3 (v/v)) para proporcionar la amina libre (648 mg, 99%) como un sirope incoloro. 1H- RMN (500 MHz, CDCla) 8 7,36-7,17 (m, 14H), 5,96-5,88 (m, 1H), 5,40-5,06 (m, 7H), 4,84-4,50 (m, 9H), 4,21 (d, J =
13.5 Hz, 1H), 4,15-4,11 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,79-3,42 (m, 5H), 3,34-3,19 (m, 2H), 2,96-2,90 (m, 1H), 2,34 (d, J = 30 4,5 Hz, 1H), 0,90 (s, 9H), 0,13 (s, 6H). EMAR (m/z) calc. para C44HagN4O14PSi [M + H]+, 927,3613; hallado,
927,3569.
Se anadio N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (230 mg, 1,11 mmol) a una disolucion con agitacion de acido (R)-3- dodecanoiltetradecanoico (vease la preparacion a continuacion, compuesto 40) (381 mg, 0,81 mmol) en DCM (10 ml). Despues de agitarse la mezcla de reaccion durante 10 min, se anadio la amina libre (648 mg, 0,699 mmol) 35 en DCM (10 ml), y se continuo con la agitacion durante otras 12 h. Se retiraron los materiales insolubles por
filtracion, y se lavo el residuo con DCM (2 x 2 ml). se concentraron a vado los filtrados combinados, y se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 2:1 (v/v)) para dar 16 (450 mg, 47%) como un solido blanco. 1H-RMN (500 MHz, CDCla) 8 7,35-7,17 (m, 14H), 5,94-5,86 (m, 2H), 5,47 (t, J= 9,0,
10.5 Hz, 1H), 5,37 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,34 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 5,13-4,97 (m, 6H), 4,75 (d,
40 J = 11,0 Hz, 1H), 4,66-4,49 (m, 7H), 4,00 (d, J= 17,0 Hz, 2H), 3,83 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 3,75-3,56 (m, 4H), 3,49-3,36
(m, 5H), 3,20 (m, 1H), 2,42-2,17 (m, 4H), 1,93 (d, J= 11,5 Hz, 1H), 1,70 (m, 2H), 1,23 (s a, 36H), 0,92 (s, 9H), 0,89
0,86 (m, 6H), 0,14 (s, 6H); EMAR (m/z) calc. para C72HmN4O^PSi [M + H]+, 1363,7529; hallado, 1363,7487.
EJEMPLO 15
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-(3-O-ALILOXICARBONIL-6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5- 45 3H-2,4,3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DODECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-B-D-
GLUCOPIRANOSIL}-2-AZIDO-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-TETRADECANOIL1-2-DESOXI-B-D- GLUCOPIRAN6SIDO (17)
imagen33
Se agito una mezcla de acido (R)-3-benciloxitetradecanoico (vease la preparacion a continuacion, compuesto 33) (120 mg, 0,540 mmol) y DCC (171 mg, 0,830 mmol) en DCM (5 ml) a temperature ambiente durante 10 min, y luego se anadieron el disacarido 16 (451 mg, 0,331 mmol) en DCM (5 ml) y DmAp (25 mg, 0,21 mmol). Se agito la mezcla 5 de reaccion a temperatura ambiente durante 14 h, despues de lo cual se retiraron los solidos por filtracion. Se lavo el residuo con DCM (2 x 4 ml). Se concentraron a vado los filtrados combinados, y se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 4:1 (v/v)) para dar 17 (540 mg, 97%) como un solido blanco. Rf = 0,41 (hexanos/acetato de etilo, 2:1(v/v)). 1H-RMN (500 MHz, CDCIs) 8 7,33-7,15 (m, 19H), 5,94-5,85 (m, 2H), 5,47(t, J = 9,5 Hz, 1H), 5,37 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,10-4,95 (m, 7H), 10 4,62-4,43 (m, 10H), 4,0-3,96 (m, 3H), 3,90-3,81 (m, 2H), 3,74-3,67 (m, 3H), 3,56-3,42 (m, 6H), 3,33-3,27 (m, 1H),
2,60-2,21 (m, 6H), 1,24 (s a, 54H), 0,91 (s, 9H), 0,87-0,84 (m, 9H), 0,14 (s, 6H). EMAR (m/z) calc. para C93H143N4O19PSi [M + H]+, 1679,9931; hallado, 1679,9934.
EJEMPLO 16
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-6-0-(6-0-BENCIL-2-DES0XI-4-0-(1.5-DIHIDR0-3-0X0-3X5-3H-2.4.3- 15 BENZ0DI0XAF0SFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-D0DECAN0IL0XI-TETRADECAN0ILAMIN01-B-D-GLUC0PIRAN0SIL}-2-
AZID0-4-0-BENCIL-3-0-[(R)-3-BENCIL0XI-TETRADECAN0IL1-2-DES0XI-B-D-GLUC0PIRAN6SID0 (18)
imagen34
Se anadio tetrakis(trifenilfosfina)paladio (228 mg, 0,198 mmol) a una disolucion de 17 (1,66 g, 0,980 mmol), h-BuNH (0,19 ml, 1,97 mmol) y HCOOH (74,5 |il, 1,98 mmol) en THF (20 ml). Despues de agitarse la mezcla de reaccion a 20 temperatura ambiente durante 20 min, se diluyo con DCM (40 ml) y se lavo sucesivamente con agua (40 ml),
NaHCO3 acuoso saturado (2 x 40 ml) y salmuera (40 ml). Se seco la fase organica (MgSO4) y se filtro. Se concentro
el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 4:3 (v/v)) para dar compuesto 18 (1,43 g, 91%). Rf = 0,5 (hexanos/acetato de etilo, 1:1 (v/v)). 1H-RMN (500 MHz, CDCIs) 8 7,33-7,11 (m, 19H), 6,2 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,46 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 5,04-4,90 (m, 9H), 4,55-4,38 (m,
25 8H), 3,92 (d, J= 10,0 Hz, 1H), 3,84-3,76 (m, 1H), 3,75-3,7 (m, 4H), 3,53-3,44 (m, 2H), 3,43-3,32 (m, 2H), 3,25-3,20
(m, 1H), 2,61-2,10 (m, 12H), 1,23 (s a, 54H), 0,90 (s, 9H), 0,88-0,84 (m, 9H), 0,12 (s, 6H). EMAR (m/z) calc. para Cs9H139N4O17PSi [M + H]+, 1595,972; hallado, 1595,9713.
EJEMPLO 17
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-6-0-{6-0-BENCIL-2-DES0XI-4-0-(1,5-DIHIDR0-3-0X0-3X5-3H-2.4.3- 30 BENZODIOXAFOSFEPIN-3IL)-2-[(R)-3-DODECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-3-O-[(R)-3-(P-
metoxi)benciloxitetradecanoili-b-d-glucopiranosil}-2-azido-4-o-bencil-3-o-[(R)-3-benciloxi-
TETRADECANOIL1-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (19)
imagen35
Se agito una disolucion de acido (R)-3-(p-metoxi)benciloxi-tetradecanoico (vease la preparacion a continuacion, compuesto 34, 424 mg, 1,16 mmol) y DcC (369 mg, 1,79 mmol) en DCM (15 ml) a temperature ambiente durante 10 min, y se anadieron el alcohol 18 (1,43 g, 0,896 mmol) en DCM (10 ml) y DMAP (54,72 mg, 0,4479 mmol). Se 5 agito la mezcla de reaccion durante otras 14 h, despues de lo cual se retiraron los solidos por filtracion y se lavo con
DCM (2 x 5 ml). Se concentraron a vado los filtrados combinados. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 4:1 (v/v)) para proporcionar 19 (1,15 g, 66%) como un solido blanco. Rf = 0,46 (hexanos/acetato de etilo, 2:1 (v/v)). 1H-RMN (500 MHz, CDCh) 8 7,38-6,79 (m, 23H), 5,73 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,55 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 5,20-4,88 (m, 8H), 4,66-4,47 (m, 12H), 4,33 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,0-3,66 (m, 10 12H), 3,61-3,40 (m, 5H), 3,36-3,27 (m, 3H), 2,67 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 2,60-2,22 (m, 6H), 1,27 (s a, 72H), 0,93 (s, 9H),
0,92-0,87 (m, 12H), 0,16 (s, 6H). EMAR (mlz) calc. para C1nH173N4O20PSi [M + H]+, 1942,2228; hallado, 1942,2289.
EJEMPLO 18
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-(6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-3H-2.4.3- BENZODIOXAFOSFEPIN-3IL)-2-[(R)-3-DODECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-3-O-[(R)-3- 15 TETRADECANOILOXI-TETRADECANOIL1-B-D-GLUCOPIRANOSIL}-2-AZIDO-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-
TETRADECANOIL1-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (10)
imagen36
A una disolucion con agitacion de 19 (1,15 g, 0,592 mmol) en una mezcla de DCM y H2O (11 ml, 10:1 (v/v)) Se anadio 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ) (202 mg, 0,890 mmol). Se agito la mezcla de reaccion a 20 temperatura ambiente durante 1 h, despues de lo cual se diluyo con DCM. Se lavo la mezcla con salmuera (20 ml), se seco (MgSO4), y se concentro a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 3:1 (v/v)) para dar el alcohol como un sirope incoloro (1,01 g, 94%). Rf = 0,50 (hexanos/acetato de etilo, 5:3 (v/v)). Se anadio cloruro de miristoflo (0,74 ml, 2,7 mmol) a una disolucion del alcohol (1,01 g, 0,554 mmol) y piridina (0,35 ml, 4,33 mmol) en DCM (20 ml). Despues de agitarse la mezcla de reaccion a
25 temperatura ambiente durante 12 h, se diluyo con DCM y se lavo con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 40 ml) y
salmuera (40 ml). Se seco la fase organica (MgSO4) y se filtro. Se concentro el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 4:1 (v/v)) para proporcionar 10 (680 mg, 57%) como un solido blanco. Rf = 0,46 (hexanos/acetato de etilo, 5:2 (v/v)). 1H-RMN (500 MHz, CDCla) 8 7,37-7,24 (m, 19H), 6,23 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,58 (t, J1 = J2 = 9,5 Hz, 1H), 5,32-5,27 (m, 1H), 5,16-4,99 (m, 6H), 4,7830 4,44 (m, 7H), 4,03 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 3,99-3,20 (m, 10H), 2,65-2,21 (m, 10H), 1,61-1,51 (m, 10H), 1,27 (s a, 94H),
1,21 (s a, 25H), 0,12 (s, 6H).
EJEMPLO 19
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-{3-O-ALILOXICARBONIL-6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5- 3H-2.4.3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-B-D- 35 GLUCOPIRANOSIL}-2-AZIDO-4-O-BENCIL-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (20)
imagen37
Se acilo el compuesto 15 (1,23 g, 1,07 mmol) de manera similar a la smtesis del compuesto 16 (ejemplo 14) usando (DCC, 430 mg, 2,08 mmol), el lfpido requerido (compuesto 40, ejemplo 36, 630 mg, 1,59 mmol) y trietilamina (161 mg, 1,59 mmol) para proporcionar 20 (1,05 g, 81%) como un aceite incoloro. 1H-RMN (500 MHz, CDCh) 8 7,355 7,17 (m, 14H), 5,91-5,86 (m, 2H), 5,47 (t, J= 9,0, 10,5 Hz, 1H), 5,34 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 10,5 Hz, 1H),
5,10-4,98 (m, 8H), 4,75 (d, J= 11,5 Hz, 1H), 4,66-4,49 (m, 8H), 4,00 (d, J = 11,0 Hz, 2H), 3,83 (d, J= 11,0 Hz, 1H), 3,75-3,69 (m, 2H), 3,49-3,36 (m, 4H), 3,20 (m, 1H), 2,40-2,26 (m, 4H), 1,24 (s a, 32H), 0,92 (s, 9H), 0,89-0,86 (m, 6H), 0,14 (s, 6H); EM (multimodal, pos.) m/z = 1307 [M + H]+.
EJEMPLO 20
10 7EEC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-{3-O-ALILOXICARBONIL-6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-
3H-2,4,3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-B-D- GLUCOPIRANOSIL}-2-AZIDO-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-TETRADECANOIL1-2-DESOXI-B-D- GLUCOPIRANOSIDO (21)
imagen38
15 Se acilo el compuesto 20 (1,43 g, 1,18 mmol) de manera similar a la smtesis del compuesto 17 (ejemplo 15) usando (DCC, 453 mg, 2,20 mmol), el lfpido requerido (477 mg, 1,43 mmol) y N,N-dimetil-4-aminopiridina (67 mg, 0,548 mmol) para proporcionar 21 (1,60 g, 83%) como un aceite incoloro. 1H-RMN (500 MHz, CDCh) 8 7,33-7,15 (m, 19H), 5,94-5,85 (m, 2H), 5,48 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 5,34 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,12-4,96 (m, 7H), 4,63-4,46 (m, 11H), 3,97 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 3,89-3,85 (m, 2H), 3,74-3,68 (m, 3H), 3,55-3,52 (m, 2H), 3,47-3,41 (m, 20 1H), 3,28 (m, 1H), 2,61-2,22 (m, 8H), 1,59-1,52 (m, 6H), 1,98 (m, 2H), 1,23 (s a, 44H), 0,90 (s, 9H), 0,88-0,84 (m,
9H), 0,12 (s, 6H); EM (multimodal, pos.) m/z = 1625 [M + H]+.
EJEMPLO 21
7EEC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-(6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-3H-2A3- BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DODECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-B-D-GLUCOPIRANOSIL}-2- 25 AZIDO-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-TETRADECANOIL1-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (22)
imagen39
Se hizo reaccionar el compuesto 21 (1,60 g, 0,985 mmol) de manera analoga a la smtesis del compuesto 18 (ejemplo 16). Por consiguiente, tetrakis(trifenilfosfina)paladio, (227 mg, 0,196 mmol), acido formico (74 |il,
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1,97 mmol) y n-butilamina (144 mg, 1,97 mmol) para proporcionar 22 (1,25 g, 82%) como un solido amarillo. 1H-RMN (500 MHz, CDCh) 8 7,33-7,15 (m, 19H), 6,20 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,38-4,95 (m, 6H), 4,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,604,46 (m, 10H), 3,97-3,71 (m, 8H), 3,68-3,48 (m, 5H), 3,31-3,27 (m, 3H), 2,62-2,55 (m, 2H), 2,50-2,42 (m, 3H), 2,402,22 (m, 5H), 1,23 (s a, 44H), 0,90 (s, 9H), 0,88-0,84 (m, 9H), 0,12 (s, 6H); EM (multimodal, pos.) m/z = 1539 [M+H]+.
EJEMPLO 22
-BUTILDIMETILSILIL-6-O-{6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-3H-2.4.3- BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-3-O-[(R)-3-(P- METOXI)BENCILOXITETRADECANOIL1-B-D-GLUCOPIRANOSIL}-2-AZIDO-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI- TETRADECANOIL1-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (23)
imagen40
Se acilo el compuesto 22 (1,25 g, 0,811 mmol) de manera similar a la smtesis del compuesto 19 (ejemplo 17) usando (DCC, 335 mg, 1,62 mmol), el lfpido requerido (compuesto 34, ejemplo 32, 386 mg, 1,06 mmol) y N,N- dimetil-4-aminopiridina (50 mg, 0,41 mmol) para proporcionar 23 (440 mg, 29%) como un aceite incoloro. 1H-RMN (500 MHz, CDCla) 8 7,38-6,79 (m, 23H), 5,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,55 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 5,06-4,85 (m, 9H), 4,664,45 (m, 12H), 3,97 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 3,90-3,69 (m, 9H), 3,60-3,55 (m, 3H), 3,37-3,29 (m, 2H), 2,65 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 2,61-2,55 (m, 1H), 2,48-2,42 (m, 1H), 2,35-2,21 (m, 3H), 2,11-2,05 (m, 1H),1,62-1,59 (m, 8H), 1,27 (s a, 62H), 0,93 (s, 9H), 0,92-0,87 (m, 12H), 0,16 (s, 6H); EM (multimodal, pos.) m/z = 1886[M+H]+.
EJEMPLO 23
7EEC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-{6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-3H-2,4,3- BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-3-O-[(R)-3-DECANOILOXI- TETRADECANOIL1-B-D-GLUCOPIRANOSIL}-2-AZIDO-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-TETRADECANOIL1-2- DESOXI-B-D-GLUCOPIRANOSIDO (24)
imagen41
En primer lugar se desprotegio el compuesto 23 (446 mg, 0,236 mmol) usando DDQ (80 mg, 0,35 mmol) siguiendo el procedimiento para el producto intermedio 10 para el objetivo A. Luego se acilo este producto intermedio (343 mg, 0,194 mmol) de manera similar a la smtesis del compuesto 10 para el objetivo A usando cloruro de decanoflo (185 mg, 0,970 mmol) y piridina (123 mg, 1,55 mmol) para proporcionar 24 (343 mg, 76%) como un aceite incoloro. ^H-RMN (500 MHz, CDCh) 8 7,39-7,22 (m, 14H), 6,15 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 5,54 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 5,28-5,24 (m, 1H), 5,14-4,96 (m, 8H), 4,60-4,45 (m, 10H), 3,99 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 3,90-3,85 (m, 1H), 3,80-3,65 (m, 4H), 3,55 (m, 3H), 3,46-3,39 (m, 1H), 3,32-3,27 (m, 1H), 2,66-2,53 (m, 3H), 2,46-2,41 (m, 1H), 2,35-2,18 (m, 7H), 1,61-1,51 (m, 10H), 1,26 (s a, 78H), 0,95 (s, 9H), 0,92-0,90 (m, 15H), 0,19 (s, 3H), 0,18 (s, 3H).
EJEMPLO 24
7EEC-BUTILDIMETILSILIL-6-O-{6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1,5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-3H-2,4,3- BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-[(R)-3-DECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-3-O-[(R)-3-DECANOILOXI- TETRADECANOIL1-B-D-GLUCOPIRANOSIL}-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXITETRADECANOIL1-2-[(R)-3- BENCILOXI-TETRADECANOILAMINO1-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (25)
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imagen42
Se agito una suspension de 24 (296 mg, 0,154 mmol), zinc (100 mg, 1,52 mmol) y acido acetico (53 |il, 0,93 mmol) en DCM (10 ml) a temperature ambiente durante 12 h, despues de lo cual se diluyo con acetato de etilo (25 ml). Se retiraron los solidos por filtracion y se lavo con acetato de etilo (2 x 25 ml), y se lavaron los filtrados combinados con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 100 ml) y salmuera (200 ml). Se seco la fase organica (Na2SO4) y se filtro. Se concentro el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 2,5:1 (v/v)) para proporcionar la amina como un sirope de color amarillo palido (245 mg, 84%). 1H-RMN (500 MHz, CDCla) 8 7,39-7,22 (m, 14H), 6,15 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,54 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 5,29-5,23 (m, 1H), 5,13-4,93 (m, 8H), 4,62-4,30 (m, 9H), 4,00 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 3,88-3,65 (m, 6H), 3,56-3,53 (m, 2H), 3,463,41 (m, 1H), 2,66-2,58 (m, 4H), 2,54-2,45 (m, 2H), 2,35-2,17 (m, 7H), 1,64-1,42 (m, 12H), 1,26 (s a, 78H), 0,87 (s, 24H), 0,13 (s, 6H).
Se anadio la amina a una disolucion con agitacion de cloruro de (R)-3-benciloxitetradecanoMo (228 mg, 0,646 mmol), DMAP (15,79 mg, 0,1292 mmol) y piridina (83 |il, 1,0 mmol) en DCM (5,0 ml). Se agito la mezcla de reaccion durante 14 h. Se diluyo la mezcla con C^Ch y se lavo con NaHCO3 saturado/salmuera, se seco bajo Na2SO4 y se concentro a vado. Se purifico el residuo mediante gel de sflice CCF cromatograffa (hexanos/acetato de etilo, 3,5:1 (v/v)) para dar 25 (450 mg, >100%) como un solido blanco. Rf = 0,54 (hexanos/acetato de etilo, 2:1 (v/v)). 1H-RMN (500 Mhz, CDCl3) 8 7,39-7,22 (m, 19H), 6,14-6,10 (m, 2H), 5,57 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 5,29-5,24 (m, 1H), 5,13-4,93 (m, 7H), 4,614,41 (m, 10H), 4,00 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 3,89-3,79 (m, 8H), 3,72-3,66 (m, 4H), 3,57-3,35 (m, 3H), 2,73-2,57 (m, 10H), 2,39-2,15 (m, 10H), 1,71-1,64 (m, 7H), 1,26 (s a, 93H), 0,88 (s, 24H), 0,83 (s, 9H).
EJEMPLO 25
6-O-(6-O-BENCIL-2-DESOXI-4-O-(1.5-DIHIDRO-3-OXO-3X5-3H-2.4.3-BENZODIOXAFOSFEPIN-3-IL)-2-r(R)-3- DECANOILOXI-TETRADECANOILAMINO1-3-O4(R)-3-DECANOILOXI-TETRADECANOIL1-B-D- GLUCOPIRANOSIL}-4-O-BENCIL-3-O-[(R)-3-BENCILOXI-TETRADECANOIL1-2-[(R)-3-BENCILOXI- TETRADECANOILAMINO1-2-DESOXI-a-D-GLUCOPIRANOSA (26)
imagen43
Se anadio gota a gota fluoruro de hidrogeno/piridina (1,12 ml, 43,1 mmol) a una disolucion con agitacion de 25 (450 mg, 0,204 mmol) en THF (5 ml). Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 14 h. Se diluyo la mezcla con acetato de etilo (100 ml) y se lavo con NaHCO3 acuoso saturado (2 x 80 ml) y salmuera. Se seco la fase organica (Na2SO4) y se filtro. Se concentro el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, de 3:1 a 4:3 (v/v)) para dar 26 (180 mg, 42%) como un solido blanco. 1H-RMN (500 MHz, CDCh) 8 7,39-7,19 (m, 19H), 6,31 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 6,24 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 5,57-5,48 (m, 2H), 5,40 (t, J = 9,5 Hz, 1H), 5,28-5,21 (m, 1H), 5,14-4,96 (m, 8H), 4,68-4,41 (m, 12H), 4,23-4,19 (m, 1H), 4,134,06 (m, 1H), 3,94-3,66 (m, 9H), 3,38-3,28 (m, 2H), 2,67-2,58 (m, 3H), 2,44-2,20 (m, 11H), 1,58 (s a, 12H), 1,26 (s a, 93H), 0,91-0,81 (m, 18H).
EJEMPLO 26
(3R)-((2R.3S.4R.5S)-3-(DECANOILOXI)TETRADECANOATO DE 3-((R)-3-(DECANOILOXI)TETRADECANAMIDO)-
2-(((3S,4R,5S)-3,6-DIHIDROXI-5-((R)-3-HIDROXITETRADECANAMIDO)-4-((R)-3-
HIDROXITETRADECANOILOXI)TETRAHIDRO-2H-PIRAN-2-IL)METOXI)-6-(HIDROXIMETIL)-5-
(FOSFONOOXI)TETRAHI DRO-2H-PIRAN-4-ILO) (IX)
imagen44
Se disolvio el compuesto 26 (180 mg, 0,0858 mmol) en THF anhidro (15 ml). Se anadio negro de paladio (0,225 g) a la mezcla y se hidrogeno bajo una atmosfera de hidrogeno a 50 psi durante la noche. Se filtro la mezcla a traves de 5 un lecho de tierra de diatomeas. Se enfrio el filtrado hasta -40°C y se anadio una disolucion de amoniaco en metanol
(1,8 ml, 4 M). Se concentro la mezcla a vado sin calentar. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice eluyendo con una mezcla de cloroformo/metanol/agua, 80:20:1 (v/v) para dar el compuesto (IX) deseado (102 mg, 73%). El analisis mediante CCF y 1H-RMN mostro la presencia de grasa y una mancha debil que discurria proxima (CCF en CH2O2/CMA, 4:1). Se sometio el residuo a cromatograffa (columna Redisep, 12 g, se eluyo con un 10 gradiente de CH2Cl2 isocratico para 5 volumenes de columna (VC), un gradiente hasta CMA al 25% a lo largo de
10 VC, isocratico para 10 VC, un gradiente hasta CMA al 100% a lo largo de 10 VC, isocratico para CMA al 100% para 10 VC, 20 ml/min) para dar el producto deseado (57 mg, 25%). El analisis mediante CCF de las fracciones combinadas y concentradas todavia indico una cantidad muy pequena de impureza que discurria justo por encima del producto deseado. Se purifico de nuevo el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (dos columnas 15 Redisep, 12 g en serie, mismo gradiente que anteriormente) para proporcionar 8,9 mg del producto deseado puro mediante CCF y 11,9 mg de producto ligeramente impuro despues de disolverlo en metanol/agua/cloroformo y someterlo a liofilizacion. Rendimiento total (20,8 mg, 14%) como un solido blanquecino. Rf = 0,40 CMA. 1H-RMN (500 MHz, CDCla) 8 5,40-5,30 (s a, 2H), 4,10-4,00 (m, 4H), 3,70-3,60 (m, 4H), 2,83-2,76 (m, 1H), 2,75-2,20 (m, 13H), 2,10-1,90 (ancho, 9H), 1,40-1,00 (ancho, 106H), 0,90-0,70 (ancho, 18H). EM (multimodal, neg.) m/z = 1632 [M - H]-.
20 EJEMPLO 27
3-OXOTETRADECANOATO DE METILO (29)
imagen45
A una suspension de etoxido de magnesio (10,82 g, 94,61 mmol) en 1,4-dioxano (100 ml) se le anadio hidrogenomalonato de metilo (25,0 g, 189 mmol) en 1,4-dioxano (100 ml). Se agito la suspension espesa resultante 25 durante la noche. Se concentro la mezcla a vado. En un matraz independiente, se disolvio acido laurico (28, 20,85 g, 104,1 mmol) en 1,4-dioxano (50 ml) y se anadio una disolucion de CDI (16,88 g, 104,1 mmol) en 1,4-dioxano (150 ml) a temperatura ambiente. S agito la disolucion resultante durante la noche. Luego se transfirio la mezcla al matraz con malonato de metilmagnesio. Se puso a reflujo la suspension resultante durante la noche. Se concentro la mezcla a vado. Se redisolvio el residuo en DCM (300 ml) y se filtro a traves de una capa de sflice (10 g). Se evaporo 30 el disolvente a presion reducida. Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (columna RediSep, 360 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 30%/hexanos a lo largo de 80 min, 100 ml/min) para proporcionar el producto 29 (17 g, 61%) como un sirope de color amarillo palido.
EJEMPLO 28
(R)-3-HIDROXITETRADECANOATO DE METILO (30)
OO OH O
imagen46
Se purgo con N2 una suspension espesa de 3-oxotetradecanoato de metilo (29, 29,0 g, 113 mmol) en metanol (120 ml) en una camisa de vidrio de reactor de alta presion de 300 ml durante 10 minutos. Se anadio dicloro-R-2,2'- bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftil-rutenio (897 mg, 1,10 mmol). Se puso la mezcla en un reactor compacto de la serie 5500 de Parr. Se cargo el reactor con H2 (60 psi) y se ventilo 3 veces. Se cargo el reactor con H2 (60 psi) y se agito
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(1200 rpm) y se calento hasta 50°C durante 20 h. Se enfrio el reactor hasta temperatura ambiente, y se concentro a vado la disolucion de color naranja resultante. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de s^lice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 40%/hexanos a lo largo de 60 min, 85 ml/min) para proporcionar el producto 30 (28,5 g, rendimiento del 97%) como un solido blanco.
EJEMPLO 29
(R)-3-(BENCILOXI)TETRADECANOATO DE METILO (31)
OH O OBn O
imagen47
A una disolucion del compuesto 30 (2,8 g, 10,83 mmol) y tricloroacetimidato de bencilo (3,4 g, 14 mmol) en DCM (100 ml) se le anadio acido trifluorometanosulfonico (0,24 ml, 2,7 mmol) gota a gota a 0°C. Se agito la mezcla resultante a 0°C durante 6 h y se calento hasta temperatura ambiente. Se lavo la mezcla con una disolucion saturada de NaHCO3 (300 ml) y agua (300 ml) y se seco la fase organica sobre Na2SO4. Se retiro el agente de secado por filtracion, y se eliminaron los disolventes usando un evaporador rotatorio. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna Redisep, 80 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 30%/hexanos a lo largo de 60 min, 60 ml/min) para dar el producto 31 (1,2 g, 32%) como un lfquido incoloro. 1H- RMN (300 MHz, CDCl3) 8 7,30-7,05 (m, 5H), 4,51 (s, 2H), 3,90-3,80 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 2,58-2,45 (m, 2H), 1,801,60 (m, 2H), 1,50-1,20 (m, 18H), 0,85 (t, J = 5,8 Hz, 3H).
EJEMPLO 30
Acido (R)-3-(benciloxi)tetradecanoico (33)
imagen48
Se disolvio el ester 31 (1,3 g, 3,73 mmol) en una mezcla de THF/MeOH/CH3CN (v/v/v, 1/1/1, 90 ml). Se anadio hidroxido de litio monohidratado (235 mg, 5,6 mmol) como una disolucion en agua (30 ml), y se agito la mezcla durante la noche. Se redujo a vado la cantidad de disolvente hasta aproximadamente 30 ml. A la disolucion acuosa restante se le anadio acido clorddrico 1 M para reducir el pH hasta 3. Se extrajo la fase acuosa con dietil eter (3 x 40 ml). Se secaron los extractos organicos combinados sobre sulfato de sodio. Se retiro el agente de secado por filtracion, y se eliminaron los disolventes usando un evaporador rotatorio. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna Redisep, 40 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 50%/hexanos a lo largo de 40 min, 40 ml/min) para dar el producto 33 (990 mg, 79%) como un lfquido incoloro. 1H- RMN (300 MHz, CDCl3) 8 7,30-7,05 (m, 5H), 4,51 (s, 2H), 3,90-3,80 (m, 1H), 2,58-2,45 (m, 2H), 1,80-1,60 (m, 2H), 1,50-1,20 (m, 18H), 0,85 (t, J = 5,8 Hz, 3H).
EJEMPLO 31
(R)-3-(4-METOXIBENCILOXI)TETRADECANOATO DE METILO (32)
imagen49
30 32
A una disolucion del compuesto 30 (3,50 g, 12,9 mmol) y tricloroacetimidato de 4-metoxibencilo (4,65 g, 17,3 mmol) en DCM (100 ml) se le anadio acido canforsulfonico (450 mg, 1,92 mmol). Se agito la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Se lavo la mezcla con una disolucion saturada de NaHCO3 (300 ml) y agua (300 ml) y se seco sobre Na2SO4. Se retiro el agente de secado por filtracion y se eliminaron los disolventes usando un evaporador rotatorio. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 30%/hexanos a lo largo de 70 min, 85 ml/min) para dar el producto 32 (4,01 g, 81%) como un lfquido incoloro.
EJEMPLO 32
ACIDO (R)-3-(4-METOXIBENCILOXI)TETRADECANOICO (34)
imagen50
Se disolvio el ester 32 (4,01 g, 10,4 mmol) en una mezcla de THF/MeOH/CH3CN (v/v/v, 1/1/1, 90 ml). Se anadio hidroxido de litio monohidratado (874 mg, 20,8 mmol) como una disolucion en agua (30 ml), y se agito la mezcla durante la noche. Se redujo a vado la cantidad de disolvente hasta aproximadamente 30 ml. A la disolucion acuosa 5 restante se le anadio acido clorhffdrico (1 M) para reducir el pH hasta 3. Se extrajo la fase acuosa con dietil eter (3 x 40 ml). Se secaron los extractos organicos combinados sobre sulfato de sodio. Se retiro el agente de secado por filtracion y se eliminaron los disolventes usando un evaporador rotatorio. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 50%/hexanos a lo largo de 60 min, 85 ml/min) para dar el producto 34 (3,37 g, 89%) como un ffquido incoloro. 1H- 10 RMN (300 MHz, CDCl3) 8 7,22 (d, J = 6,1 Hz, 2H), 6,82 (d, J = 6,1 Hz, 2H), 4,46 (s, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 2,65-2,49 (m, 2H), 1,80-1,60 (m, 2H), 1,50-1,20 (m, 18 H), 0,85 (t, J = 5,8 Hz, 3H).
EJEMPLO 33
CLORURO DE (R)-3-(4-METOXIBENCILOXI)TETRADECANOILO (35)
imagen51
15 A una disolucion del acido 34 (500 mg, 1,37 mmol) en DCM (5 ml) se le anadio dimetilformamida (DMF) (100 mg,
1.37 mmol), y se enfrio la mezcla resultante hasta -10°C. Se anadio gota a gota cloruro de oxalilo (174 mg,
1.37 mmol) en DCM (5 ml). Se permitio que se calentase la disolucion hasta temperatura ambiente a lo largo de 1 h. Despues, el analisis mediante CCF no mostro acido presente, se concentro la mezcla a vado y se uso sin purificacion adicional.
20 EJEMPLO 34
3-HIDROXITETRADECANOATO DE (ft)-2-OXO-2-FENILETILO (37)
imagen52
A una disolucion de acido (R)-3-hidroxitetradecanoico (36, vease la preparacion a continuacion) (9,55 g, 39,1 mmol) y trietilamina (5,90 g, 58,6 mmol) en acetato de etilo (500 ml) se le anadio 2-bromoacetofenona (7,90 g, 39,1 mmol) a 25 temperatura ambiente. Se agito la mezcla a temperatura ambiente durante 14 h. Se retiro el precipitado por filtracion, y se concentro el filtrado a vado. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 30%/hexanos a lo largo de 50 min, 85 ml/min) para dar el producto 37 (10,2 g, rendimiento del 72%) como un solido blanco.
EJEMPLO 35
30 3-DECANOILOXITETRADECANOATO DE (R)-2-OXO-2-FENILETILO (39)
imagen53
A una disolucion de 37 (4,80 g, 13,2 mmol) y piridina (2,10 g, 26,5 mmol) en DCM (100 ml) a 0°C se le anadio cloruro de decanoflo (38, 2,8 g, 4,8 mmol). Se agito la mezcla durante 14 h permitiendo que se elevase la temperatura de la mezcla hasta temperatura ambiente. Se lavo la mezcla con una disolucion saturada de NaHCO3 (100 ml) y salmuera 35 (100 ml) y se seco sobre Na2SO4. Se retiro el agente de secado por filtracion y se eliminaron los disolventes usando
un evaporador rotatorio. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 40%/hexanos a lo largo de 50 min, 85 ml/min) para dar el producto 39 (6,68 g, 97%) como un ffquido incoloro.
EJEMPLO 36
40 ACIDO (R)-3-(DECANOILOXI)TETRADECANOICO (40)
5
10
15
20
25
30
imagen54
Se disolvio el ester 39 (10,15 g, 20,77 mmol) en acido acetico (100 ml). Se anadio zinc (15,5 g, 237 mmol), y se calento la mezcla hasta reflujo durante 4 h. Se elimino el acido acetico a vado y se sometio el residuo a destilacion azeotropica con tolueno hasta sequedad. Se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de s^lice (columna RediSep, 120 g, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 60%/hexanos a lo largo de 50 min, 85 ml/min) para dar el producto 40 (7,2 g, 89%) como un lfquido incoloro. 1H-RMN (300 MHz, CDCh) 8 5,23-5,19 (m, 1H), 2,62-2,55 (m, 2H), 2,34-2,25 (m, 2H), 1,65-1,58 (m, 2H), 1,28-1,20 (m, 32H), 0,85 (m, 6H).
EJEMPLO 37
(R)-3-HIDROXITETRADECANOATO DE METILO (39)
imagen55
Se purgo con N2 una suspension espesa de 3-oxotetradecanoato de metilo (41, 5,27 g, 20,6 mmol) en metanol (30 ml) en una camisa de vidrio de reactor de alta presion de 300 ml durante 10 minutos. Se anadio dicloro-R-2,2’- bis(difenilfosfino)-1, 1 '-binaftil-rutenio (142 mg, 1,1 mmol) y se puso la mezcla en un reactor compacto de la serie 5500 de Parr. Se cargo el reactor con H2 (60 psi) y se ventilo tres veces. Luego se cargo el reactor con una porcion final de H2 (60 psi), se agito (600 rpm) y se calento hasta 50°C durante 20 h. Luego se enfrio el reactor hasta temperatura ambiente y se concentro la mezcla a vado. Se purifico el residuo resultante mediante cromatograffa sobre gel de sflice, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 50%/hexanos para proporcionar 42 (3,97 g, 74%) como un solido blanquecino. 1H-RMN (CDCla) 8 4,00-3,98 (m, 1H), 3,71 (s, 3H), 2,82 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 2,62-2,30 (m, 2H), 1,54-1,39 (m, 3H), 1,27 (s a, 17H), (m, 20H), 0,86 (t, J = 7,0 Hz, 3H).
EJEMPLO 38
Acido (R)-3-hidroxitetradecanoico (36)
imagen56
Se anadio hidroxido de litio monohidratado (1,98 g, 47,2 mmol) a una disolucion de (R)-3-hidroxitetradecanoato de metilo (42, 8,17 g, 31,5 mmol) en THF (66 ml) y agua (66 ml) y se agito a temperatura ambiente durante 2 h. Luego se diluyo la mezcla con dietil eter (1 l) y se ajusto el pH a ~3 con una disolucion de acido clorlddrico (1 N). Luego se extrajo la disolucion con dietil eter (200 ml), y se combinaron las fracciones organicas y se secaron sobre Na2SO4. Se retiro el Na2SO4 por filtracion y se concentro el filtrado a vado para proporcionar el acido (R)-3- hidroxitetradecanoico (36, 7,59 g, 98%) como un solido blanquecino. 1H-RMN (CDCla) 8 3,99-3,94 (m, 1 H), 2,452,39 (m, 2H), 1,47 (s a, 3H), 1,29 (s a, 17H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H).
EJEMPLO 39
3-TETRADECANOILOXITETRADECANOATO DE (R)-2-OXO-2-FENILETILO (46)
imagen57
37 O
Se anadio cloruro de miristoMo (45, 8,83 g, 35,8 mmol) a una disolucion de 3-hidroxitetradecanoato de (R)-2-oxo-2- feniletilo (37, preparado segun el ejemplo 34, 10,8 g, 29,8 mmol) en piridina (40 ml). Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 14 h. Luego se concentro la mezcla a vado, y se elimino la piridina residual
disolviendo el residuo en tolueno (100 ml) y concentrando a vado. Se purifico el residuo resultante mediante cromatograffa sobre gel de s^lice, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 20%/hexanos, para proporcionar 46 (16,31 g, 83%) como un aceite incoloro. 1H-RMN (CDCl3) 8 7,90 (m, 2H), 7,64-7,57 (m, 1H), 7,507,45 (m, 2H), 5,33 (s, 2H), 5,31-5,27 (m, 1H), 2,80-2,70 (m, 2H), 2,33-2,26 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 1,65-1,58 (m, 2H), 5 1,31-1,21 (m, 40 H), 0,85 (t, J = 10,0 Hz, 6H).
EJEMPLO 40
ACIPO (R)-3-(TETRADECANOILOXI)TETRADECANOICO (47)
imagen58
Se anadio polvo fino de zinc (24,42 g, 373,3 mmol) a una disolucion de 46 (16,28 g, 28,42 mmol) en acido acetico 10 (150 ml). Luego se calento la mezcla hasta reflujo (115°C) durante 3 h. Luego se concentro la mezcla a vado, y se
elimino la piridina residual disolviendo el residuo en tolueno (100 ml) y concentrando a vado. Se sometio el residuo resultante a cromatograffa sobre gel de sflice, eluyendo con un gradiente de acetato de etilo a del 0% al 30%/hexanos para proporcionar acido (R)-bencil-3-(tetradecanoiloxi)tetradecanoico (47, 11,14 g, rendimiento del 86%) como un aceite incoloro. 1H-RMN (CDCh) 8 5,29-5,18 (m, 1H), 2,62-2,55 (m, 2H), 2,34-2,25 (m, 2H), 1,65-1,58 15 (m, 3H), 1,28-1,20 (m, 40 H), 0,85 (m, 6H).
EJEMPLO 41
7ERC-BUTILDIMETILSILIL-2-AZIDO-4-O-BENCIL-2-DESOXI-B-D-GLUCOPIRAN6SIDO (47)
imagen59
Se disolvio el compuesto 4 (preparado segun el ejemplo 3, 1,32 g, 3,36 mmol) en una disolucion de BH3 (1 M) en 20 THF (18,1 ml, 18,1 mmol). Despues de agitarse la mezcla a 0°C durante 5 min, se anadio gota a gota triflato de
dibutilboro (1 M en DCM, 3,62 ml, 3,62 mmol), y se agito la mezcla de reaccion a 0°C durante otra hora.
Posteriormente, se anadieron trietilamina (0,5 ml) y metanol (~0,5 ml) hasta que hubo cesado el desprendimiento de gas H2. Se evaporaron los disolventes a vado, y se evaporo el residuo conjuntamente con metanol (3 x 50 ml). Se purifico el residuo mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (hexanos/acetato de etilo, 8:1 (v/v)) para
25 dar 14 (0,67 g, 49%) como un aceite incoloro. Rf = 0,40 (hexanos/acetato de etilo, 3:1 (v/v)). 1H-RMN (500 Mhz,
CDCla) 8 7,32-7,31 (m, 5H), 4,81 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 3,84 (m,
1H), 3,70 (dd, 1H, J = 12,0, 1,5 Hz, 1H), 3,49-3,43 (m, 2H), 3,33 (s a, 1H), 3,22-3,17 (m, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,14 (s,
6H).
EJEMPLO 42
30 INDUCCI6N DE RESPUESTA INMUNITARIA DE TIPO TH1 IN VIVO
Este ejemplo demuestra la actividad inmunostimulante de tipo Th1 in vivo para un compuesto de GLA ilustrativo de la invencion que tiene la siguiente estructura (IX):
imagen60
Se uso el compuesto IX en una vacuna que contema un polipeptido antigenico de Mycobacterium tuberculosis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
denominado ID83. Se emplearon metodolog^as y reactivos inmunologicos convencionales (Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY). Se inmunizaron ratones (cuatro animales C57BL/6 por grupo) tres veces a intervalos de tres semanas con el antfgeno ID83 (8 |ig por animal para cada inmunizacion) en agua, el antfgeno ID83 (8 |ig por animal para cada inmunizacion) formulado en un veldculo de emulsion estable, o el antigeno ID83 (8 |ig por animal para cada inmunizacion) formulado en una emulsion estable que contiene (i) GLA-SE (10 |ig por animal para cada inmunizacion) o (ii) compuesto IX (10 |ig por animal para cada inmunizacion).
Una semana despues de cada inyeccion, se extrajo sangre de los ratones para evaluar respuestas de anticuerpos (IgG1 e IgG2c) espedficos de antigeno. Tres semanas despues de la ultima inmunizacion, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los bazos para analizar las respuestas de citocina IFN-y dependientes de celulas T para la estimulacion con antigeno in vitro mediante ELISPOT segun metodos publicados ^d.). Las respuestas de citocina IFN-y se han asociado con un fenotipo protector TH1 frente a la infeccion por M. tuberculosis.
La figura 1 muestra datos de ELISPOT de la produccion de citocina IFN-y anti-ID83 inducida en ratones tres semanas despues de la tercera inmunizacion usando el antigeno ID83 y antigenos componentes de ID83 (Rv2608, Rv1813 y Rv3620) formulados con una emulsion estable (SE) de 10 |ig de compuesto IX, en comparacion con ID83 formulado en GLA-SE, SE o agua. Se muestran las medias y el E.E.M. de celulas secretoras de IFN-y por millon de esplenocitos en cada grupo. “GLA-SE”, tal como se usa en los ejemplos del presente documento se refiere a una emulsion estable de un compuesto tal como se describe en la publicacion de patente estadounidense n.° 20080131466 de titularidad conjunta con la presente, en el que R1, R3, R5 y R6 son alquilo lineal C11; y R2 y R4 son alquilo lineal C13.
Todos los animales respondieron de manera equivalente a ConA, un potente mitogeno y activador celular. La vacunacion con ID83 + compuesto IX indujo respuestas de citocinas espedficas del antfgeno robustas, mientras que se observaron pocas o ninguna de tales respuestas en los grupos de control de ID83 + agua o ID83 + SE. Se produjeron niveles similares de celulas secretoras de IFN-y en esplenocitos purificados a partir de ratones inmunizados con ID83 + compuesto IX o ID83 + GLA-SE tras una nueva estimulacion con los antfgenos componentes de ID83, Rv2608, Rv1813 y Rv3620.
En conclusion, el compuesto IX en una formulacion en aceite estable con el candidato a antfgeno de vacuna frente a M. tuberculosis, ID83, indujo respuestas inmunitarias espedficas de antfgeno predominantemente del tipo celular (celulas T) asociadas con el fenotipo protector TH1.
EJEMPLO 43
INDUCCION DE RESPUESTAS INMUNITARIAS DE TIPO TH1 Y TH2 IN VIVO
Este ejemplo demuestra la actividad inmunoestimulante de tipo Th1 y Th2 in vivo del compuesto IX en una vacuna que contiene un antfgeno de Mycobacterium tuberculosis denominado ID83. Se emplearon metodologfas y reactivos inmunologicos convencionales (Current Protocols en Immunology, Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY).
Se inmunizaron ratones (cuatro animales C57BL/6 por grupo) tres veces a intervalos de tres semanas con el antfgeno ID83 (8 |ig por animal para cada inmunizacion) usado solo o formulado en una emulsion estable que contiene el compuesto IX (10 |ig por animal para cada inmunizacion). Se recogieron los sueros extrayendo sangre a los animales una semana despues de cada inmunizacion, y se examinaron los niveles en suero de los anticuerpos IgG1 e IgG2c espedficos para ID83 mediante ELISA segun metodos publicados ^d.) El predominio del isotipo de anticuerpo o bien IgG1 de o bien IgG2c se asocia con respuestas de tipo TH2 o TH1, respectivamente. Se ha demostrado que es necesaria una respuesta de tipo TH1 para la proteccion frente a la infeccion por Mycobacterium tuberculosis.
Tal como se muestra en la figura 2, la vacunacion con ID83 en agua indujo anticuerpo IgG1 espedfico de antfgeno predominantemente. En cambio, la vacunacion con ID83 + SE, ID83 + compuesto IX-SE o ID83 + GLA-SE indujo mayores tttulos de anticuerpos IgG2c, y convirtio el fenotipo en una respuesta de anticuerpos espedficos de antfgeno IgG1:IgG2c mixto.
EJEMPLO 44
INDUCCION DE INMUNOESTIMULACION DEPENDIENTE DE TLR4 EN CELULAS HUMANAS
Este ejemplo demuestra la actividad inmunoestimuladora del compuesto IX en celulas humanas. Se sometio a prueba el compuesto IX in vitro usando celulas HEK 293 (InvivoGen) con vectores de expresion que codifican para 1) TLR4, MD-2 y CD14, o 2) TLR2 y TLR6 para definir la actividad del compuesto y la dependencia de TLR4, y para excluir la activacion de TLR2. Se transfectaron de manera estable ademas estas lmeas celulares HEK 293 con el vector indicador de NF-kB, pNifty-2 de tal manera que se secreta fosfatasa alcalina en los medios de crecimiento con la activacion de la ruta de senalizacion de TLR. Se sembraron las lmeas celulares transfectadas a 5x104 celulas por pocillo en placas de 96 pocillos y se estimularon durante 16-24 horas cultivadas en medio que contiene diluciones en
5
10
15
20
25
30
serie del compuesto IX y otros adyuvantes. Se midio la actividad fosfatasa alcalina secretada en los medios de cultivo usando el ensayo QUANTIBlue® (InvivoGen). Se midieron los datos como potenciacion de NF-kB por encima del control negativo de PBS. Usando este ensayo, el compuesto IX mostro una potenciacion de NF-kB de mas de dos veces a concentraciones de tan solo 0,1 |ig/ml (figura 3). Los resultados de estos experimented demostraron una clara actividad agonista de TLR4 para el compuesto IX que no parecio estar asociada con la induccion de TLR2. Se diseno el compuesto IX basandose en consideraciones estructurales de la estructura atomica notificada de MD2 y TLR4. Como tal, el hecho de que se une y produce un perfil que es similar al de un agonista de TLR4 aprobado comercialmente (MPL®) es un resultado sorprendente e inesperado. Mas espedficamente, el perfil para el compuesto IX alcanza ventajosamente una meseta rapidamente a medida que se aumentan las concentraciones, antes de lo que se esperana que se elevasen los niveles de citocina hasta un punto en el que pueden ejercerse efectos secundarios negativos por sf mismos. Por tanto, se espera que el compuesto IX y otros compuestos ilustrativos de la invencion puedan administrarse de manera segura en un amplio intervalo de concentraciones, lo que se desea enormemente en el contexto de la reproducibilidad de los desenlaces clmicos entre pacientes y para la seguridad al variar la dosis para adultos y ninos. A este respecto, la menor actividad frente a citocina para el compuesto IX es un resultado sorprendente y deseado que facilitate adicionalmente su uso seguro en formulaciones clmicas.
EJEMPLO 45
INDUCCION DE CITOCINAS INMUNOESTIMULADORAS EN CELULAS SANGUINEAS HUMANAS
En este ejemplo, se estimularon celulas de sangre completa humanas con el compuesto IX y se realizaron ensayos ELISA para detectar la induccion de citocinas inmunoestimuladoras. Se realizaron diluciones en serie (1:5) del compuesto IX y otros adyuvantes con solucion salina tamponada con fosfato en una placa de 96 pocillos para un total de 7 diluciones. Se mezclaron 100 |il de sangre humana recien extrafda de dos donantes diferentes y se incubaron con 100 |il de diluciones de adyuvante. Tras una incubacion durante 20 horas, se centrifugaron las placas y se recogieron los sobrenadantes (~70 |il), evitando los globulos rojos, y se almacenaron a -20°C antes de realizar ELISA de MIP-1-a y TNF -a usando procedimientos bioqrnmicos convencionales. Los resultados de estos experimentos confirmaron adicionalmente que el compuesto IX tiene actividad inmunoestimuladora en celulas sangumeas humanas primarias (figura 4). Adicionalmente, estos resultados de donantes primarios imitaron los resultados observados en lmeas celulares humanas y extendieron estos importantes hallazgos en relacion con los posibles intervalos de dosis y perfiles de seguridad para este compuesto.
A partir de lo anterior se apreciara que, aunque se han descrito en el presente documento realizaciones espedficas de la invencion con fines de ilustracion, pueden realizarse diversas modificaciones. Por consiguiente, la invencion no esta limitada excepto segun las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

1.
5
10
2.
3.
4.
REIVINDICACIONES
Compuesto de GLA que tiene la siguiente estructura (I):
imagen1
Li, L2, L3 y L4 son iguales o diferentes e independientemente -O-, -NH- o -(CH2)-;
L5 y La son -O-;
L7, L8, L9 y L10 son -C(-O)-;
Y1 es -OP(-O)(OH)2;
Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH;
Ri, R3, R5 y R6 son iguales o diferentes e independientemente alquilo C8-13; y R2 y R4 son iguales o diferentes e independientemente alquilo Ca-11.
Compuesto de GLA segun la reivindicacion 1, en el que R1, R3, R5 y Ra son cada uno alquilo Cx, en el que x es constante y se selecciona de un numero entero de 8-13, y R2 y R4 son ambos alquilo Cx-2, y el compuesto de GLA tiene la siguiente formula (III):
imagen2
Compuesto de GLA segun la reivindicacion 2, en el que x se selecciona de un numero entero de 10-12.
Compuesto de GLA segun la reivindicacion 3, en el que x es 11, y el compuesto de GLA tiene la siguiente estructura (IV):
imagen3
5. Compuesto de GLA segun la reivindicacion 1, en el que Li y L3 son ambos -O- y L2 y L4 son ambos -NH-, y el compuesto de GLA tiene la siguiente formula (VI):
imagen4
5 6. Compuesto de GLA segun la reivindicacion 1, en el que Yi es -OP(O)(OH)2, Y2, Y3 e Y4 son cada uno -OH,
Li y L3 son ambos -O-, L2 y L4 son ambos -NH-, Ri, R3, R5 y R6 cada uno son alquilo Cx en el que x es constante y se selecciona de un numero entero de 8-13, y R2 y R4 son ambos alquilo Cx-2, y el compuesto de GLA tiene la siguiente formula (VIII):
imagen5
10 7. Compuesto de GLA segun la reivindicacion 6, en el que x es 11, y el compuesto de GLA tiene la siguiente
estructura (IX):
5
10
15
imagen6
8. Composicion de vacuna que comprende un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en combinacion con un antigeno o un vector de expresion recombinante que codifica para un antigeno.
9. Composicion de vacuna segun la reivindicacion 8, en la que el constructo de expresion recombinante es un vector viral.
10. Composicion de vacuna segun la reivindicacion 9, en la que el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector de adenovirus, un vector de virus adenoasociado, un vector de herpesvirus , un vector de lentivirus, un vector de poxvirus y un vector de retrovirus .
11. Composicion de vacuna segun la reivindicacion 8, para su uso en la produccion o potenciacion de una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno en un sujeto.
12. Composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.
13. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 12, para estimular una respuesta inmunitaria inespedfica en un sujeto.
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Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090181078A1 (en) * 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
EP2486938B1 (en) 2006-09-26 2018-05-09 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
SG171914A1 (en) 2008-12-02 2011-07-28 Chiralgen Ltd Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
TWI494125B (zh) * 2009-06-05 2015-08-01 Infectious Disease Res Inst 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑
KR101885383B1 (ko) 2009-07-06 2018-08-03 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 신규한 핵산 프로드러그 및 그의 사용 방법
EA201290897A1 (ru) 2010-03-11 2013-03-29 Иммьюн Дизайн Корп. Вакцины для пандемического гриппа
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
TW201309799A (zh) 2011-02-15 2013-03-01 Immune Design Corp 藉由載體化疫苗增強免疫原特異性免疫反應之方法
JP6054942B2 (ja) * 2011-04-08 2016-12-27 イミューン デザイン コーポレイション 免疫原性組成物、ならびに体液性および細胞性免疫応答を誘発するための該組成物の使用方法
WO2012149307A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Immune Design Corp. Synthetic long peptide (slp)-based vaccines
DK2734208T3 (en) 2011-07-19 2017-06-19 Wave Life Sciences Ltd PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS
US20140328876A1 (en) 2011-11-18 2014-11-06 Variation Biotechnologies Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
ES2894724T3 (es) 2011-12-02 2022-02-15 Rhode Island Hospital Vacuna contra la malaria falciparum
US11510875B2 (en) * 2012-02-07 2022-11-29 Access To Advanced Health Institute Adjuvant formulations comprising TLR4 agonists and methods of using the same
JP5650780B2 (ja) 2012-04-04 2015-01-07 日東電工株式会社 ワクチン組成物
BR112014028476A2 (pt) 2012-05-16 2017-08-01 Immune Design Corp fragmento imunogênico de um polipeptídeo, polinucleotídeo isolado, composição farmacêutica imunogênica, métodos para tratar uma infecção, para gerar uma resposta imune em um sujeito, e para imunizar um sujeito
SG10201610251PA (en) 2012-06-08 2017-01-27 Aduro Biotech Compositions and methods for cancer immunotherapy
CN104661664B (zh) 2012-07-13 2020-07-03 波涛生命科学有限公司 手性控制
KR101850319B1 (ko) 2012-07-13 2018-04-20 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 비대칭 보조 그룹
CN104684923B (zh) * 2012-07-13 2018-09-28 株式会社新日本科学 手性核酸佐剂
SI2931738T1 (sl) 2012-12-13 2019-05-31 Aduro Biotech, Inc. Sestave, ki vsebujejo ciklične purin dinukleotide z definirano stereokemijo, ter metode za njihovo pripravo in uporabo
EA032326B1 (ru) 2013-04-18 2019-05-31 Иммьюн Дизайн Корп. Монотерапия gla для применения в лечении рака
SG11201508165VA (en) 2013-04-29 2015-11-27 Sloan Kettering Inst Cancer Compositions and methods for altering second messenger signaling
EP2992000B1 (en) 2013-05-03 2020-07-08 The Regents of The University of California Cyclic di-nucleotide induction of type i interferon
PE20160080A1 (es) 2013-05-18 2016-02-21 Aduro Biotech Inc Composiciones y metodos para activar la senalizacion que depende del estimulador del gen de interferon
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
US9463198B2 (en) * 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
EP3027227A4 (en) 2013-07-31 2018-05-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Sting crystals and modulators
WO2015035010A1 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Immune Design Corp. Vaccine compositions for drug addiction
US9504743B2 (en) 2013-09-25 2016-11-29 Sequoia Sciences, Inc Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9149521B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9017698B2 (en) 2013-09-25 2015-04-28 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9149522B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
MX2016003325A (es) 2013-10-03 2016-07-06 Nitto Denko Corp Composicion de vacuna para mucosa.
RU2016109368A (ru) 2013-10-03 2017-11-10 Нитто Денко Корпорейшн Мукозальная вакцинная композиция
CA2923030A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Nitto Denko Corporation Injectable vaccine composition
EP3053593A4 (en) 2013-10-03 2017-07-05 Nitto Denko Corporation Nasal mucosal vaccine composition
AU2014373928C1 (en) 2013-12-31 2020-12-17 Access To Advanced Health Institute Single vial vaccine formulations
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
EP3095460A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
SG10201912897UA (en) 2014-01-16 2020-02-27 Wave Life Sciences Ltd Chiral design
AU2015209575A1 (en) * 2014-01-21 2016-07-21 Immune Design Corp. Compositions for use in the treatment of allergic conditions
MX2016010565A (es) 2014-02-14 2017-05-10 Immune Design Corp Inmunoterapia del cancer a través de la combinacion de estimulacion inmunatoria local y sistemica.
WO2016011083A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
TN2017000375A1 (en) 2015-03-10 2019-01-16 Aduro Biotech Inc Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene" -dependent signalling
US10744197B2 (en) 2015-11-27 2020-08-18 Nitto Denko Corporation Vaccine pharmaceutical composition for oral administration and method for manufacturing vaccine pharmaceutical composition for oral administration
MX2018013640A (es) 2016-05-16 2019-08-01 Infectious Disease Res Inst Liposomas pegiladas y metodos de uso.
CN109310773B (zh) 2016-05-16 2022-04-26 传染病研究所 含有tlr激动剂的配制品和使用方法
CA3024313A1 (en) 2016-05-21 2017-11-30 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for treating secondary tuberculosis and nontuberculous mycobacterium infections
AU2017273650B2 (en) 2016-06-01 2022-08-18 Access To Advanced Health Institute Nanoalum particles containing a sizing agent
US11098077B2 (en) 2016-07-05 2021-08-24 Chinook Therapeutics, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
EP3522893A4 (en) * 2016-10-04 2020-08-26 University Of Maryland, Baltimore METHODS OF TREATMENT OF SEPTICEMIA USING LIPID A-BASED THERAPEUTIC AGENTS (ASLA) ANTISEPSY
EP3545972A4 (en) * 2016-11-25 2020-05-13 Mogam Institute For Biomedical Research VARICELLA AND ZONA VIRUS VACCINE
MX2019007288A (es) * 2016-12-26 2019-10-02 Mogam Inst Biomedical Res Composicion de vacuna para herpes zoster.
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
EP3638207A1 (en) 2017-06-15 2020-04-22 Infectious Disease Research Institute Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof
JP7339942B2 (ja) * 2017-09-08 2023-09-06 アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート サポニンを含むリポソーム製剤および使用方法
BR112020004747A2 (pt) 2017-09-13 2020-09-24 Sanofi Pasteur composição imunogênica de citomegalovírus humano
CA3090271A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Inimmune Corporation Toll-like receptor ligands
WO2019175147A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccines against intra-abdominal infections
TWI771663B (zh) 2019-03-18 2022-07-21 美商詹森藥物公司 E. coli O-抗原多醣生物結合物之製備方法、其組合物及其使用方法
CR20210522A (es) 2019-03-18 2021-12-17 Janssen Pharmaceuticals Inc Bioconjugados de antígenos–polisacáridos de e. coli, métodos de producción y métodos de utilización de los mismos
BR112021023726A2 (pt) 2019-05-25 2022-02-15 Infectious Disease Res Inst Composição e método para secagem por pulverização de uma emulsão de vacina adjuvante
US11679163B2 (en) 2019-09-20 2023-06-20 Hdt Bio Corp. Compositions and methods for delivery of RNA
BR112022005615A2 (pt) 2019-10-02 2022-07-12 Janssen Vaccines & Prevention Bv Peptídeos de staphylococcus e métodos de uso
WO2021097347A1 (en) 2019-11-15 2021-05-20 Infectious Disease Research Institute Rig-i agonist and adjuvant formulation for tumor treatment
JP2023500749A (ja) 2020-01-16 2023-01-10 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＦｉｍＨ変異体、その組成物、及びその使用
CA3172489A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Amit KHANDHAR Nanoemulsion compositions and methods for delivery of nra
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
US20230310323A1 (en) 2020-09-04 2023-10-05 Access To Advanced Health Institute Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier
JP2023539943A (ja) 2020-09-17 2023-09-20 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 多価ワクチン組成物及びその使用
EP4251170A1 (en) 2020-11-25 2023-10-04 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
CN117120087A (zh) 2020-12-23 2023-11-24 高级健康研究所 茄尼醇疫苗助剂及其制备方法
JP2024502854A (ja) 2021-01-12 2024-01-23 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＦｉｍＨ変異体、それを含む組成物、及びその使用
AU2022251305A1 (en) 2021-04-01 2023-09-07 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Production of e. coli o18 bioconjugates
WO2022256740A1 (en) 2021-06-04 2022-12-08 Curia Ip Holdings, Llc Polymeric fusion proteins and compositions for inducing an immune response against infection

Family Cites Families (244)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3598122A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US4029762A (en) 1971-11-17 1977-06-14 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Lipid A-preparation
US4286592A (en) 1980-02-04 1981-09-01 Alza Corporation Therapeutic system for administering drugs to the skin
US4314557A (en) 1980-05-19 1982-02-09 Alza Corporation Dissolution controlled active agent dispenser
US4420558A (en) 1981-02-12 1983-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors
US4379454A (en) 1981-02-17 1983-04-12 Alza Corporation Dosage for coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4420461A (en) 1982-05-26 1983-12-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Agglutination-inhibition test kit for detecting immune complexes
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4987237A (en) 1983-08-26 1991-01-22 Ribi Immunochem Research, Inc. Derivatives of monophosphoryl lipid A
US4743540A (en) 1983-09-27 1988-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Method for diagnosis of subclassifications of common varied immunodeficiency disease group
US4614722A (en) 1983-11-01 1986-09-30 Pasula Mark J Method and apparatus for measuring the degree of reaction between antigens and leukocyte cellular antibodies
US5147785A (en) 1983-11-01 1992-09-15 Amtl Corporation Method and apparatus for measuring the degree of reaction between a foreign entity and white blood cells
US4595654A (en) 1983-11-07 1986-06-17 Immunomedics Inc. Method for detecting immune complexes in serum
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4844894A (en) 1984-07-12 1989-07-04 Ribi Immunochem Research Inc. Method of inhibiting the onset of septicemia and endotoxemia
US4629722A (en) 1984-07-12 1986-12-16 Ribi Immunochem Research, Inc. Method of inhibiting the onset of acute radiation syndrome
US5612041A (en) 1984-07-17 1997-03-18 Chiron Corporation Recombinant herpes simplex gD vaccine
US5066794A (en) 1984-08-24 1991-11-19 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Process for preparing a disaccharide derivative
JPS6153295A (ja) * 1984-08-24 1986-03-17 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd ジサツカライド誘導体
US4568343A (en) 1984-10-09 1986-02-04 Alza Corporation Skin permeation enhancer compositions
US4659659A (en) 1985-01-22 1987-04-21 Monsanto Company Diagnostic method for diseases having an arthritic component
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4746742A (en) 1985-11-28 1988-05-24 Toho Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Analogs of nonreducing monosaccharide moiety of lipid A
US6514691B1 (en) 1986-01-22 2003-02-04 Institut Pasteur Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2
US5310651A (en) 1986-01-22 1994-05-10 Institut Pasteur DNA probes of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), and methods employing these probes for dectecting the presence of HIV-2
US5976785A (en) 1986-01-22 1999-11-02 Institut Pasteur Competitive assays for determining the effectiveness of a human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) antiviral agent, employing peptides and proteins of HIV-2
US6054565A (en) 1986-03-03 2000-04-25 Institut Pasteur Nucleic Acids of HIV-2, Diagnostic Test Kit and Method using Nucleic Acid Probes of HIV-2
US5169763A (en) 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
JPH0755906B2 (ja) 1986-07-01 1995-06-14 第一製薬株式会社 ジサツカライド誘導体含有鎮痛剤
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
US4948587A (en) 1986-07-08 1990-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transbuccal drug delivery
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
FR2672290B1 (fr) 1991-02-05 1995-04-21 Pasteur Institut Sequences peptidiques specifiques des stades hepatiques de p. falciparum porteuses d'epitopes capables de stimuler les lymphocytes t.
US5565209A (en) 1987-03-17 1996-10-15 Akzo Nobel N.V. Adjuvant mixture
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
US4780212A (en) 1987-07-31 1988-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enchancement of membrane permeability
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
EP0324455A3 (en) 1988-01-15 1991-03-27 Hans O. Ribi Novel polymeric immunological adjuvants
GB2232892B (en) 1988-02-23 1991-07-24 John Mark Tucker Occlusive body for administering a physiologically active substance
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5888519A (en) 1988-06-02 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Encapsulated high-concentration lipid a compositions as immunogenic agents to produce human antibodies to prevent or treat gram-negative bacterial infections
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
US5231168A (en) 1988-09-16 1993-07-27 Statens Seruminstitut Malaria antigen
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
JP3237842B2 (ja) 1988-12-16 2001-12-10 オランダ国 ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン
EP0454781B1 (en) 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
ES2068989T3 (es) 1989-02-04 1995-05-01 Akzo Nobel Nv Tocoles como adyuvante en vacunas.
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
ATE159031T1 (de) 1989-07-25 1997-10-15 Smithkline Biolog Antigene sowie verfahren zu deren herstellung
EP1001032A3 (en) 1989-08-18 2005-02-23 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US4981684A (en) 1989-10-24 1991-01-01 Coopers Animal Health Limited Formation of adjuvant complexes
US6120769A (en) 1989-11-03 2000-09-19 Immulogic Pharmaceutical Corporation Human T cell reactive feline protein (TRFP) isolated from house dust and uses therefor
US5298396A (en) 1989-11-15 1994-03-29 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Method for identifying T cells disease involved in autoimmune disease
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
US5124141A (en) 1990-06-14 1992-06-23 Flow Incorporated Method for diagnosing malaria
US5162990A (en) 1990-06-15 1992-11-10 The United States Of America As Represented By The United States Navy System and method for quantifying macrophage phagocytosis by computer image analysis
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
DE122007000018I1 (de) 1991-07-19 2007-05-24 Univ Queensland Polynukleotidabschnitt des HPV16-Genoms
US5464387A (en) 1991-07-24 1995-11-07 Alza Corporation Transdermal delivery device
US6197311B1 (en) 1991-07-25 2001-03-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
IE922436A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses
JPH06510036A (ja) 1991-08-16 1994-11-10 バイカル・インコーポレイテッド 嚢胞性線維症の治療のための組成物および方法
AU660325B2 (en) 1991-10-11 1995-06-22 Eisai Co. Ltd. Anti-endotoxin compounds and related molecules and methods
US5530113A (en) 1991-10-11 1996-06-25 Eisai Co., Ltd. Anti-endotoxin compounds
DE69228698T2 (de) 1991-11-16 1999-09-16 Smithkline Beecham Biolog HYBRIDES PROTEIN ZWISCHEN CS AUS PLASMODIUM UND HBsAG
US6057427A (en) 1991-11-20 2000-05-02 Trustees Of Dartmouth College Antibody to cytokine response gene 2(CR2) polypeptide
JP3723231B2 (ja) 1991-12-23 2005-12-07 ディミナコ アクチェンゲゼルシャフト アジュバント
US5286718A (en) 1991-12-31 1994-02-15 Ribi Immunochem Research, Inc. Method and composition for ameliorating tissue damage due to ischemia and reperfusion
JPH05328975A (ja) 1992-06-02 1993-12-14 Takara Shuzo Co Ltd Ｅ１ａ−ｆ遺伝子
WO1993025234A1 (en) 1992-06-08 1993-12-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting specific tissue
EP0644946A4 (en) 1992-06-10 1997-03-12 Us Health VECTOR PARTICLES RESISTANT TO HUMAN SERUM INACTIVATION.
EP0647140B1 (en) 1992-06-25 2007-12-12 Georgetown University Papillomavirus vaccines
EP0761231B1 (en) 1992-06-25 2000-01-12 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Vaccine composition containing adjuvants
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5411865A (en) 1993-01-15 1995-05-02 Iasys Corporation Method of detecting anti-leishmania parasite antibodies
ES2263405T3 (es) 1993-03-09 2011-04-20 The University Of Rochester Producción de proteína de capside del papilomavirus humano y partículas de tipo virus.
AU685443B2 (en) 1993-03-23 1998-01-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
US5532133A (en) 1993-06-02 1996-07-02 New York University Plasmodium vivax blood stage antigens, PvESP-1, antibodies, and diagnostic assays
US6106824A (en) 1993-08-13 2000-08-22 The Rockefeller University Expression of growth associated protein B-50/GAP-43 in vitro and in vivo
US5961970A (en) 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
EP0892444B1 (en) 1993-11-02 2004-04-21 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd Semiconductor device comprising an aggregate of semiconductor micro-needles
US5458140A (en) 1993-11-15 1995-10-17 Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers
US5885211A (en) 1993-11-15 1999-03-23 Spectrix, Inc. Microporation of human skin for monitoring the concentration of an analyte
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SK281944B6 (sk) 1993-11-17 2001-09-11 Laboratoires Om S. A. Beta(1->6)glukozamínové disacharidy, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje, a ich použitie
US5693531A (en) 1993-11-24 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector systems for the generation of adeno-associated virus particles
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5591139A (en) 1994-06-06 1997-01-07 The Regents Of The University Of California IC-processed microneedles
ES2267100T5 (es) 1994-07-15 2011-04-08 The University Of Iowa Research Foundation Oligonucleótidos inmunomoduladores.
US7037712B2 (en) 1994-07-26 2006-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation DNA encoding ovine adenovirus (OAV287) and its use as a viral vector
GB9415319D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council HSV viral vector
SE9403137D0 (sv) 1994-09-20 1994-09-20 Perstorp Ab Derivatives of carbohydrates and compositions containing them
PT809700E (pt) 1994-10-07 2006-09-29 Univ Loyola Chicago Particulas semelhantes ao papilomavirus e proteinas de fusao, assim como metodos para a sua producao
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
FR2727689A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-07 Transgene Sa Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral
WO1996024379A1 (fr) 1995-02-08 1996-08-15 Takara Shuzo Co., Ltd. Traitement du cancer
WO1996026277A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US5912166A (en) 1995-04-21 1999-06-15 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of leishmaniasis
US6846489B1 (en) 1995-04-25 2005-01-25 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines containing a saponin and a sterol
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5718904A (en) 1995-06-02 1998-02-17 American Home Products Corporation Adjuvants for viral vaccines
US6417172B1 (en) 1995-06-05 2002-07-09 Eisai Co., Ltd. Prevention and treatment of pulmonary bacterial infection or symptomatic pulmonary exposure to endotoxin by inhalation of antiendotoxin drugs
US5993800A (en) 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
US6309847B1 (en) 1995-07-05 2001-10-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for detecting or monitoring the effectiveness of treatment of T cell mediated diseases
US6458366B1 (en) 1995-09-01 2002-10-01 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
WO1997011708A1 (en) 1995-09-29 1997-04-03 Eisai Research Institute Method for treating alcoholic liver disease
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US5618275A (en) 1995-10-27 1997-04-08 Sonex International Corporation Ultrasonic method and apparatus for cosmetic and dermatological applications
US5846758A (en) 1995-11-30 1998-12-08 His Excellency Ghassan I. Shaker Method for diagnosing autoimmune diseases
US5843462A (en) 1995-11-30 1998-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Diphtheria toxin epitopes
SE9600648D0 (sv) 1996-02-21 1996-02-21 Bror Morein Receptorbimdande enhet
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
EP0909562B1 (en) 1996-07-03 2005-06-29 Eisai Co., Ltd. Injections containing lipid a analogues and process for the preparation thereof
ATE229073T1 (de) 1996-09-06 2002-12-15 Univ California Protein e25a, methoden zu dessen herstellung und anwendung
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US6610661B1 (en) 1996-10-11 2003-08-26 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
JPH10131046A (ja) 1996-10-29 1998-05-19 Nikka Chem Co Ltd 繊維の耐久性ｐＨ緩衝加工方法
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US7033598B2 (en) 1996-11-19 2006-04-25 Intrabrain International N.V. Methods and apparatus for enhanced and controlled delivery of a biologically active agent into the central nervous system of a mammal
DE19654221B4 (de) 1996-12-23 2005-11-24 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Leitungsanschlußschaltkreis
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
US6977073B1 (en) 1997-02-07 2005-12-20 Cem Cezayirli Method for stimulating an immune response
US6887660B2 (en) 1997-02-25 2005-05-03 Corixa Corporation Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
US6491919B2 (en) 1997-04-01 2002-12-10 Corixa Corporation Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A
BR9811262A (pt) 1997-04-01 2000-10-17 Ribi Immunochem Research Inc Composições auxiliares imunológicas aquosas de lipìdio de monofosforila a.
US7037510B2 (en) 1997-04-18 2006-05-02 Statens Serum Institut Hybrids of M. tuberculosis antigens
US6555653B2 (en) 1997-05-20 2003-04-29 Corixa Corporation Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6358508B1 (en) 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
WO1998058956A2 (en) 1997-06-23 1998-12-30 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for inducing an immune response involving prime-boost protocols
HUP0002475A3 (en) 1997-07-21 2002-01-28 Baxter Healthcare S A Wallisel Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2500490T3 (es) 1997-08-29 2014-09-30 Antigenics Inc. Composiciones que comprenden el adyuvante QS-21 y polisorbato o ciclodextrina como excipiente
ES2298316T3 (es) 1997-09-05 2008-05-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas.
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6749856B1 (en) 1997-09-11 2004-06-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US6368604B1 (en) 1997-09-26 2002-04-09 University Of Maryland Biotechnology Institute Non-pyrogenic derivatives of lipid A
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
KR100760221B1 (ko) 1997-11-28 2007-10-30 세로노 제네틱스 인스티튜트 에스.에이. 클라미디아 트라코마티스 게놈 서열과 폴리펩티드, 이의단편 및 이의 용도, 특히, 감염의 진단, 예방 및 치료 용도
US7012134B2 (en) 1998-01-26 2006-03-14 Human Genome Sciences, Inc. Dendritic enriched secreted lymphocyte activation molecule
DE19803453A1 (de) 1998-01-30 1999-08-12 Boehringer Ingelheim Int Vakzine
KR100633212B1 (ko) 1998-02-05 2006-10-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신접종을 위한 융합 단백질 및 조성물의 제조를 위해사용되는 ｍａｇｅ 군으로부터의 종양 관련 항원 유도체및 이들을 암호화하고 있는 핵산 서열
CA2320041A1 (en) 1998-02-12 1999-08-19 American Cyanamid Company Vaccines comprising interleukin-12 and herpes simplex viral antigen
US6596501B2 (en) 1998-02-23 2003-07-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of diagnosing autoimmune disease
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
KR20010041629A (ko) 1998-03-09 2001-05-25 장 스테판느 혼합 백신 조성물
JP4227302B2 (ja) 1998-04-07 2009-02-18 コリクサ コーポレイション Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質およびその使用
GB2336310B (en) 1998-04-14 2003-09-10 Stowic Resources Ltd Method of manufacturing transdermal patches
EP1073734B1 (en) 1998-04-15 2009-09-23 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Tumor associated nucleic acids and uses therefor
US6680175B2 (en) 1998-05-05 2004-01-20 Adherex Technologies, Inc. Methods for diagnosing and evaluating cancer
CA2330610A1 (en) 1998-05-07 1999-11-11 Corixa Corporation Adjuvant composition and methods for its use
US6322532B1 (en) 1998-06-24 2001-11-27 3M Innovative Properties Company Sonophoresis method and apparatus
CN100419079C (zh) 1998-07-14 2008-09-17 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断前列腺癌的组合物和方法
WO2000010375A1 (en) 1998-08-25 2000-03-02 Gallenberg Ronald J Beach cleaning apparatus and method
EP1111390A4 (en) 1998-09-01 2007-11-14 Eisai R&D Man Co Ltd METHOD FOR EVALUATING INJECTIONS CONTAINING LIPID A ANALOGS
US6692752B1 (en) 1999-09-08 2004-02-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Methods of treating human females susceptible to HSV infection
JP2000095694A (ja) * 1998-09-24 2000-04-04 Sankyo Co Ltd 新規な医療用薬剤
US6375944B1 (en) 1998-09-25 2002-04-23 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the immunostimulatory effect of interleukin-12
AU5980899A (en) 1998-09-25 2000-04-17 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Novel compounds
US7001770B1 (en) 1998-10-15 2006-02-21 Canji, Inc. Calpain inhibitors and their applications
PL201482B1 (pl) 1998-10-16 2009-04-30 Smithkline Beecham Biolog Sposoby wytwarzania kompozycji szczepionki oraz kompozycja szczepionki
US6261573B1 (en) 1998-10-30 2001-07-17 Avant Immunotherapeutics, Inc. Immunoadjuvants
US6734172B2 (en) 1998-11-18 2004-05-11 Pacific Northwest Research Institute Surface receptor antigen vaccines
US6512102B1 (en) 1998-12-31 2003-01-28 Chiron Corporation Compositions and methods of diagnosis and treatment using casein kinase I
WO2000042994A2 (en) 1999-01-21 2000-07-27 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Inhibition of bacterial dissemination
AU769539B2 (en) 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
US6599710B1 (en) 1999-03-10 2003-07-29 The General Hospital Corporation Treatment of autoimmune disease
GB9906177D0 (en) 1999-03-17 1999-05-12 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
EP1167974B1 (en) 1999-04-07 2006-09-13 Hiroshi Okamoto METHOD FOR JUDGING AUTOIMMUNE DISEASE, METHOD FOR DETECTING ANTI-Reg PROTEIN AUTOANTIBODY AND DIAGNOSTICS FOR AUTOIMMUNE DISEASES
PL203951B1 (pl) 1999-04-19 2009-11-30 Smithkline Beecham Biolog Kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki oraz sposób jej wytwarzania, szczepionka oraz zastosowanie
US6685699B1 (en) 1999-06-09 2004-02-03 Spectrx, Inc. Self-removing energy absorbing structure for thermal tissue ablation
WO2001014544A1 (en) 1999-08-26 2001-03-01 Biovitrum Ab Novel response element
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US7084256B2 (en) 1999-09-24 2006-08-01 Large Scale Biology Corporation Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
JP4162813B2 (ja) 1999-10-28 2008-10-08 久光製薬株式会社 イオントフォレーシス装置
US6218186B1 (en) 1999-11-12 2001-04-17 Trustees Of The University Of Pennsylvania HIV-MSCV hybrid viral vector for gene transfer
ES2370262T3 (es) 1999-11-15 2011-12-14 Oncothyreon Inc. Análogos del lípido a sintéticos y sus utilizaciones.
US20020064801A1 (en) 1999-12-01 2002-05-30 Ryan Jeffrey R. Novel and practical serological assay for the clinical diagnosis of leishmaniasis
US6974588B1 (en) 1999-12-07 2005-12-13 Elan Pharma International Limited Transdermal patch for delivering volatile liquid drugs
US6587792B1 (en) 2000-01-11 2003-07-01 Richard A. Thomas Nuclear packing efficiency
GB0000891D0 (en) 2000-01-14 2000-03-08 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
US7052904B2 (en) 2000-01-31 2006-05-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Hybrid adeno-retroviral vector for the transfection of cells
EP1122542A1 (en) 2000-02-01 2001-08-08 Anda Biologicals S.A. Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents
AU2001241738A1 (en) 2000-02-25 2001-09-03 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
PT1284740E (pt) 2000-05-19 2008-07-09 Corixa Corp Tratamento profiláctico e terapêutico de doenças infecciosas, autoimunes e alérgicas com compostos à base de monossacáridos
US6875610B2 (en) 2000-05-31 2005-04-05 Human Gene Therapy Research Institute Methods and compositions for efficient gene transfer using transcomplementary vectors
DE10041515A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Gerold Schuler Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, Antigen-beladener oder -unbeladener, kryokonservierter reifer dendritischer Zellen
US6969704B1 (en) 2000-08-25 2005-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for suppressing early growth response—1protein (Egr-1) to reduce vascular injury in a subject
US7060802B1 (en) 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
EP1341546B1 (en) 2000-10-06 2011-09-21 The Symbio Herborn Group GmbH u.Co Kyberdrug as autovaccines with immune-regulating effects
NZ525320A (en) 2000-10-18 2004-10-29 Glaxosmithkline Biolog S Combinations of immunostimulatory oligonucleotides (CpG), saponin and optionally lipopolysaccharides as potent vaccine adjuvants
CA2462946C (en) 2001-01-26 2014-04-29 Jeffrey A. Lyon Recombinant p. falciparum merozoite protein-142 vaccine
US6893820B1 (en) 2001-01-31 2005-05-17 The Ohio State University Research Foundation Detection of methylated CpG rich sequences diagnostic for malignant cells
AU2002306896B2 (en) 2001-03-26 2007-04-26 Walter Reed Army Institute Of Research Plasmodium falciparum AMA-1 protein and uses thereof
US7029685B2 (en) 2001-03-26 2006-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Plasmodium falciparum AMA-1 protein and uses thereof
US6933123B2 (en) 2001-04-05 2005-08-23 Yao Xiong Hu Peptides from the E2, E6, and E7 proteins of human papilloma viruses 16 and 18 for detecting and/or diagnosing cervical and other human papillomavirus associated cancers
US6844192B2 (en) 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US7727974B2 (en) 2001-08-10 2010-06-01 Eisai R & D Management Co., Ltd. Methods of reducing the severity of mucositis
AU2002339865A1 (en) 2001-09-05 2003-03-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions useful for diagnosis, staging, and treatment of cancers and tumors
US20040161776A1 (en) 2001-10-23 2004-08-19 Maddon Paul J. PSMA formulations and uses thereof
US6752995B2 (en) 2002-04-15 2004-06-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Nucleic acid and polypeptide sequences useful as adjuvants
US6908453B2 (en) 2002-01-15 2005-06-21 3M Innovative Properties Company Microneedle devices and methods of manufacture
US6911434B2 (en) 2002-02-04 2005-06-28 Corixa Corporation Prophylactic and therapeutic treatment of infectious and other diseases with immunoeffector compounds
RU2288723C2 (ru) * 2002-02-04 2006-12-10 Корикса Корпорейшн Профилактическое и терапевтическое лечение инфекционных и других заболеваний с помощью иммуноэффективных соединений
EP1482955B1 (en) 2002-02-04 2013-12-25 Corixa Corporation Prophylactic and therapeutic treatment of infectious and other diseases with immunoeffector compounds
US6676961B1 (en) 2002-03-06 2004-01-13 Automated Carrier Technologies, Inc. Transdermal patch assembly
CA2485253C (en) 2002-05-09 2012-07-10 Biomira, Inc. Lipid a and other carbohydrate ligand analogs
US7018345B2 (en) 2002-12-06 2006-03-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Iontophoresis system
US20050123550A1 (en) 2003-05-12 2005-06-09 Laurent Philippe E. Molecules enhancing dermal delivery of influenza vaccines
FR2862062B1 (fr) 2003-11-06 2005-12-23 Oreal Lipide a et composition topique, notamment cosmetique, le comprenant
EP2486938B1 (en) 2006-09-26 2018-05-09 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
CA2698668A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Synthetic lipid a derivative
KR101064518B1 (ko) 2007-09-21 2011-09-19 주식회사 운화 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법
US9930541B2 (en) 2007-12-27 2018-03-27 Nokia Technologies Oy Maintaining the integrity of configuration information of a network of access points for use in positioning an apparatus
TWI494125B (zh) 2009-06-05 2015-08-01 Infectious Disease Res Inst 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑
US11510875B2 (en) 2012-02-07 2022-11-29 Access To Advanced Health Institute Adjuvant formulations comprising TLR4 agonists and methods of using the same
JP5328975B2 (ja) 2012-12-19 2013-10-30 ルネサスエレクトロニクス株式会社 Ｒｆパワーモジュール
EA032326B1 (ru) * 2013-04-18 2019-05-31 Иммьюн Дизайн Корп. Монотерапия gla для применения в лечении рака
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis

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