JPH05328975A - Ｅ１ａ−ｆ遺伝子 - Google Patents
Ｅ１ａ−ｆ遺伝子Info
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- JPH05328975A JPH05328975A JP16545392A JP16545392A JPH05328975A JP H05328975 A JPH05328975 A JP H05328975A JP 16545392 A JP16545392 A JP 16545392A JP 16545392 A JP16545392 A JP 16545392A JP H05328975 A JPH05328975 A JP H05328975A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 がん遺伝子研究、及びＥ１Ａ−Ｆの工業的製
造に有用なＥ１Ａ−Ｆ遺伝子を特定し、提供する。 【構成】 配列表の配列番号１で表されるＤＮＡを分子
内に含有する、単離されたＥ１Ａ−Ｆ遺伝子。本発明に
おける遺伝子は、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子上流のエ
ンハンサーコア配列に結合する能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、ヒト培養細胞遺伝子から単
離することができる。
造に有用なＥ１Ａ−Ｆ遺伝子を特定し、提供する。 【構成】 配列表の配列番号１で表されるＤＮＡを分子
内に含有する、単離されたＥ１Ａ−Ｆ遺伝子。本発明に
おける遺伝子は、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子上流のエ
ンハンサーコア配列に結合する能力を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、ヒト培養細胞遺伝子から単
離することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規がん遺伝子に関
し、がん研究、遺伝子診断等の分野において有用であ
る。
し、がん研究、遺伝子診断等の分野において有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子はウイルス
が細胞に感染したときに、最初に転写される初期遺伝子
であり、その迅速な転写をつかさどる特異的な転写因子
の存在が示唆されている。本発明者らは、該Ｅ１Ａ遺伝
子の上流のエンハンサー領域のエンハンサーコア配列
（５′Ａ／Ｃ ＧＧＡ Ａ／Ｔ ＧＴ３′）に結合する
タンパク質をヒーラ（Ｈｅｌａ）細胞抽出液より見出
し、該タンパク質をＥ１Ａ−Ｆと命名した〔ヌクレイッ
ク アシッズ リサーチ（ Nucleic Acids Research)
、第１７巻、第１００１５頁（１９８９）〕。
が細胞に感染したときに、最初に転写される初期遺伝子
であり、その迅速な転写をつかさどる特異的な転写因子
の存在が示唆されている。本発明者らは、該Ｅ１Ａ遺伝
子の上流のエンハンサー領域のエンハンサーコア配列
（５′Ａ／Ｃ ＧＧＡ Ａ／Ｔ ＧＴ３′）に結合する
タンパク質をヒーラ（Ｈｅｌａ）細胞抽出液より見出
し、該タンパク質をＥ１Ａ−Ｆと命名した〔ヌクレイッ
ク アシッズ リサーチ（ Nucleic Acids Research)
、第１７巻、第１００１５頁（１９８９）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】Ｅ１Ａ−ＦはＥ１Ａ遺
伝子の発現調節に関与する新規タンパク質であるが、そ
の詳細についてはいまだ不明であり、その構造や遺伝子
配列については知られていない。本発明の目的はＥ１Ａ
−Ｆをコードする遺伝子配列を特定し、がん遺伝子研究
や、Ｅ１Ａ−Ｆの工業的製造に有用なＥ１Ａ−Ｆ遺伝子
を提供することにある。
伝子の発現調節に関与する新規タンパク質であるが、そ
の詳細についてはいまだ不明であり、その構造や遺伝子
配列については知られていない。本発明の目的はＥ１Ａ
−Ｆをコードする遺伝子配列を特定し、がん遺伝子研究
や、Ｅ１Ａ−Ｆの工業的製造に有用なＥ１Ａ−Ｆ遺伝子
を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は単離されたＥ１Ａ−Ｆ遺伝子に関し、配列表の配
列番号１で表されるＤＮＡを分子内に含有することを特
徴とする。
発明は単離されたＥ１Ａ−Ｆ遺伝子に関し、配列表の配
列番号１で表されるＤＮＡを分子内に含有することを特
徴とする。
【０００５】なお、本発明において、Ｅ１Ａ−Ｆ遺伝子
とは、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子上流のエンハンサー
コア配列に結合する能力を有するタンパク質をコードす
る遺伝子を意味する。
とは、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子上流のエンハンサー
コア配列に結合する能力を有するタンパク質をコードす
る遺伝子を意味する。
【０００６】Ｅ１Ａ−Ｆ遺伝子は、例えばヒト培養細胞
遺伝子より単離することができる。ヒト培養細胞遺伝子
としては、例えばＨｅｌａ Ｓ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
２．２）細胞、あるいはヒト咽頭扁平上皮がん由来の培
養細胞であるＫＢ（ＡＴＣＣＣＣＬ１７）細胞などから
ｃＤＮＡライブラリーを調製して用いてもよく、また、
市販のヒーラ細胞のｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社）を用いてもよい。ライブ
ラリーからの目的遺伝子のスクリーニングは、例えば前
出のエンハンサーコア配列をプローブとして用いればよ
く、該配列を繰返した配列を有するプローブを作製して
用いてもよい。例えば、後述するプローブ（ｗｔ）を作
成し、32Ｐで標識した該プローブを用いてサウス ウエ
スタン法を行うことにより、ライブラリーより、目的の
遺伝子を含有するクローンを得ることができる。
遺伝子より単離することができる。ヒト培養細胞遺伝子
としては、例えばＨｅｌａ Ｓ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
２．２）細胞、あるいはヒト咽頭扁平上皮がん由来の培
養細胞であるＫＢ（ＡＴＣＣＣＣＬ１７）細胞などから
ｃＤＮＡライブラリーを調製して用いてもよく、また、
市販のヒーラ細胞のｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社）を用いてもよい。ライブ
ラリーからの目的遺伝子のスクリーニングは、例えば前
出のエンハンサーコア配列をプローブとして用いればよ
く、該配列を繰返した配列を有するプローブを作製して
用いてもよい。例えば、後述するプローブ（ｗｔ）を作
成し、32Ｐで標識した該プローブを用いてサウス ウエ
スタン法を行うことにより、ライブラリーより、目的の
遺伝子を含有するクローンを得ることができる。
【０００７】本発明者らによって単離された目的の遺伝
子を含有するクローンはλ３−１６と命名され、該クロ
ーン中には配列表の配列番号１で表される約５００ｂｐ
のＥ１Ａ−Ｆ遺伝子が挿入されている。クローンλ３−
１６中のＥ１Ａ−Ｆ遺伝子のコードするタンパク質は、
例えば該クローンを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させるこ
とにより、β−ガラクトシダーゼ由来のポリペプチドと
の融合ポリペプチドとして発現させることができる。発
現させたポリペプチドの活性は、前出ヌクレイック ア
シッズ リサーチに記載のゲルシフト法及びメチル化阻
害実験により確認することができ、遺伝子への結合位置
はヒーラ細胞から得た、Ｅ１Ａ−Ｆの結合位置とよく一
致する。
子を含有するクローンはλ３−１６と命名され、該クロ
ーン中には配列表の配列番号１で表される約５００ｂｐ
のＥ１Ａ−Ｆ遺伝子が挿入されている。クローンλ３−
１６中のＥ１Ａ−Ｆ遺伝子のコードするタンパク質は、
例えば該クローンを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させるこ
とにより、β−ガラクトシダーゼ由来のポリペプチドと
の融合ポリペプチドとして発現させることができる。発
現させたポリペプチドの活性は、前出ヌクレイック ア
シッズ リサーチに記載のゲルシフト法及びメチル化阻
害実験により確認することができ、遺伝子への結合位置
はヒーラ細胞から得た、Ｅ１Ａ−Ｆの結合位置とよく一
致する。
【０００８】次にλ３−１６よりＥｃｏＲＩ断片を調製
し、該断片をプローブとして用いることにより、例えば
ＫＢ細胞より調製したｃＤＮＡライブラリーより、より
長鎖のｃＤＮＡを得ることができる。配列表の配列番号
２に約２．１ｋｂｐのｃＤＮＡ配列を示す。
し、該断片をプローブとして用いることにより、例えば
ＫＢ細胞より調製したｃＤＮＡライブラリーより、より
長鎖のｃＤＮＡを得ることができる。配列表の配列番号
２に約２．１ｋｂｐのｃＤＮＡ配列を示す。
【０００９】配列表の配列番号１、２でそれぞれ表され
る上記の遺伝子は、それぞれ適当なベクターに組込み、
それぞれ適当な宿主を形質転換することにより、そのコ
ードするタンパク質を発現することができる。発現され
たタンパク質は、例えば宿主細胞を破砕し、塩析、イオ
ン交換、ゲルろ過法等の通常精製に用いられる方法によ
り精製することができる。
る上記の遺伝子は、それぞれ適当なベクターに組込み、
それぞれ適当な宿主を形質転換することにより、そのコ
ードするタンパク質を発現することができる。発現され
たタンパク質は、例えば宿主細胞を破砕し、塩析、イオ
ン交換、ゲルろ過法等の通常精製に用いられる方法によ
り精製することができる。
【００１０】配列表の配列番号１に示されるクローンλ
３−１６中のｃＤＮＡのコードするアミノ酸配列のうち
アミノ酸番号が８番のＡｒｇから９２番のＶａｌまでで
表される部分のアミノ酸配列は、ｅｔｓ−プロトがん遺
伝子群が共有するＤＮＡ結合ドメイン（ＥＴＳ−ドメイ
ン）に高い相同性を示し、共通配列の２９個のアミノ酸
の中の２７か所が一致した。また、該部分配列は、特に
従来ｅｔｓオンコジーンとして知られているｅｔｓ−１
やｅｔｓ−２〔ワトソン（ Watson ) ら、プロシーディ
ングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
ンエンシーズオブ ザ ＵＳＡ（ Proc.Natl.Acad.Sci.
USA. )、第８５巻、第７８６２頁（１９８８）〕のコー
ドするアミノ酸配列と、約６２％の相同性を示した。以
上のことから、本発明の遺伝子は新規ｅｔｓ型がん遺伝
子と決定した。なお、クローンλ３−１６中のｃＤＮＡ
をプローブとして用いたノザン法でヒーラ細胞中に約
２．５ｋｂ ｍＲＮＡが検出され、Ｅ１Ａ−Ｆはヒーラ
細胞中でよく発現されていることが確認される。またア
デノウイルスの感染により、該ｍＲＮＡ量の増大がみら
れる。
３−１６中のｃＤＮＡのコードするアミノ酸配列のうち
アミノ酸番号が８番のＡｒｇから９２番のＶａｌまでで
表される部分のアミノ酸配列は、ｅｔｓ−プロトがん遺
伝子群が共有するＤＮＡ結合ドメイン（ＥＴＳ−ドメイ
ン）に高い相同性を示し、共通配列の２９個のアミノ酸
の中の２７か所が一致した。また、該部分配列は、特に
従来ｅｔｓオンコジーンとして知られているｅｔｓ−１
やｅｔｓ−２〔ワトソン（ Watson ) ら、プロシーディ
ングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
ンエンシーズオブ ザ ＵＳＡ（ Proc.Natl.Acad.Sci.
USA. )、第８５巻、第７８６２頁（１９８８）〕のコー
ドするアミノ酸配列と、約６２％の相同性を示した。以
上のことから、本発明の遺伝子は新規ｅｔｓ型がん遺伝
子と決定した。なお、クローンλ３−１６中のｃＤＮＡ
をプローブとして用いたノザン法でヒーラ細胞中に約
２．５ｋｂ ｍＲＮＡが検出され、Ｅ１Ａ−Ｆはヒーラ
細胞中でよく発現されていることが確認される。またア
デノウイルスの感染により、該ｍＲＮＡ量の増大がみら
れる。
【００１１】以上、詳細に説明した様に、本発明によ
り、新規がん遺伝子が提供される。該遺伝子はがん研
究、がんの遺伝子診断等において有用であり、また、該
遺伝子の塩基配列より作製されたポリペプチド、あるい
は遺伝子工学的に発現されたタンパク質も、がん研究用
試薬や、抗体作製のための抗原として有用である。
り、新規がん遺伝子が提供される。該遺伝子はがん研
究、がんの遺伝子診断等において有用であり、また、該
遺伝子の塩基配列より作製されたポリペプチド、あるい
は遺伝子工学的に発現されたタンパク質も、がん研究用
試薬や、抗体作製のための抗原として有用である。
【００１２】
【実施例】以下に本発明を実施例を用いて示すが、本発
明はこれらの実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
明はこれらの実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
【００１３】実施例１ Ｅ１Ａ−ＦのｃＤＮＡのクロー
ニング （スクリーニング用プローブの作成）配列表の配列番号
３で示される、Ｅ１Ａエンハンサーコア配列を繰返した
配列を有するオリゴヌクレオチド（Ａ）及び配列表の配
列番号４に示される、（Ａ）に相補的な配列を有するオ
リゴヌクレオチド（Ｂ）、及び配列表の配列番号５で示
される、Ｅ１Ａエンハンサーコア配列内の２つ並んだグ
アニンをシトシンに置換した配列を有するオリゴヌクレ
オチド（Ｃ）、及び配列表の配列番号６で示される、
（Ｃ）に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
（Ｄ）をそれぞれデザインし合成した。
ニング （スクリーニング用プローブの作成）配列表の配列番号
３で示される、Ｅ１Ａエンハンサーコア配列を繰返した
配列を有するオリゴヌクレオチド（Ａ）及び配列表の配
列番号４に示される、（Ａ）に相補的な配列を有するオ
リゴヌクレオチド（Ｂ）、及び配列表の配列番号５で示
される、Ｅ１Ａエンハンサーコア配列内の２つ並んだグ
アニンをシトシンに置換した配列を有するオリゴヌクレ
オチド（Ｃ）、及び配列表の配列番号６で示される、
（Ｃ）に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
（Ｄ）をそれぞれデザインし合成した。
【００１４】次に（Ａ）及び（Ｂ）それぞれ２０ｐｍｏ
ｌずつを混合し、７０℃で１０分間熱処理したのち徐々
に冷却し、相補的配列同志のアニーリングを行い、ここ
に１０×ライゲーション緩衝液〔６６ｍＭトリス（ｔｒ
ｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、１０ｍＭ ＤＴＴ〕、０．１ｍＭ ＡＴＰ、Ｔ４リ
ガーゼを加え、全量を１０μｌとして一晩反応させ、２
本鎖オリゴマー同志を連結した。次にＤＮＡブランティ
ングキット（宝酒造社製）によりＤＮＡの末端を平滑化
し、該連結オリゴマーをプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉ
ｎｃ II サイトにサブクローニングした。このプラスミ
ドによって形質転換したコンピテントセルＪＭ１０９を
アンピシリンを含むＬ−ブロス培地プレートで３７℃で
一晩培養し、組換体を含むコロニーからプラスミドを調
製した。このプラスミドを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＢａ
ｍＨＩを用いて連結オリゴマーを含む２本鎖ＤＮＡフラ
グメントを得た。得られた２本鎖ＤＮＡフラグメント
は、配列表の配列番号７で示される、（Ａ）を３連結し
た配列を含有するＤＮＡ鎖と配列表の配列番号８で示さ
れる、（Ｂ）を３連結した配列を含有するＤＮＡ鎖が相
補的配列同志アニーリングした構造を有しており、この
２本鎖ＤＮＡフラグメントをプローブ（ｗｔ）と命名
し、５′末端をメガラベルキット（宝酒造社製）を用い
て32Ｐで標識した。
ｌずつを混合し、７０℃で１０分間熱処理したのち徐々
に冷却し、相補的配列同志のアニーリングを行い、ここ
に１０×ライゲーション緩衝液〔６６ｍＭトリス（ｔｒ
ｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、１０ｍＭ ＤＴＴ〕、０．１ｍＭ ＡＴＰ、Ｔ４リ
ガーゼを加え、全量を１０μｌとして一晩反応させ、２
本鎖オリゴマー同志を連結した。次にＤＮＡブランティ
ングキット（宝酒造社製）によりＤＮＡの末端を平滑化
し、該連結オリゴマーをプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉ
ｎｃ II サイトにサブクローニングした。このプラスミ
ドによって形質転換したコンピテントセルＪＭ１０９を
アンピシリンを含むＬ−ブロス培地プレートで３７℃で
一晩培養し、組換体を含むコロニーからプラスミドを調
製した。このプラスミドを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＢａ
ｍＨＩを用いて連結オリゴマーを含む２本鎖ＤＮＡフラ
グメントを得た。得られた２本鎖ＤＮＡフラグメント
は、配列表の配列番号７で示される、（Ａ）を３連結し
た配列を含有するＤＮＡ鎖と配列表の配列番号８で示さ
れる、（Ｂ）を３連結した配列を含有するＤＮＡ鎖が相
補的配列同志アニーリングした構造を有しており、この
２本鎖ＤＮＡフラグメントをプローブ（ｗｔ）と命名
し、５′末端をメガラベルキット（宝酒造社製）を用い
て32Ｐで標識した。
【００１５】（Ｃ）及び（Ｄ）の組合せについても同様
の操作を行い、配列表の配列番号９で示される、（Ｃ）
を２連結した配列を含有するＤＮＡ鎖と配列表の配列番
号１０で示される、（Ｄ）を２連結した配列を含有する
ＤＮＡ鎖が相補的配列同志アニーリングしている２本鎖
ＤＮＡフラグメントを得た。この２本鎖ＤＮＡフラグメ
ントをプローブ（ｍｔ）と命名し、５′末端をメガラベ
ルキット用いて32Ｐで標識した。
の操作を行い、配列表の配列番号９で示される、（Ｃ）
を２連結した配列を含有するＤＮＡ鎖と配列表の配列番
号１０で示される、（Ｄ）を２連結した配列を含有する
ＤＮＡ鎖が相補的配列同志アニーリングしている２本鎖
ＤＮＡフラグメントを得た。この２本鎖ＤＮＡフラグメ
ントをプローブ（ｍｔ）と命名し、５′末端をメガラベ
ルキット用いて32Ｐで標識した。
【００１６】（ヒーラ細胞ｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニング）５０μｇ／ｍｌアンピシリンと０．２％マ
ルトースを含むＬ−ブロス培地３０ｍｌに大腸菌Ｙ１０
９０株（ストラタジーン社製）を植菌し、３７℃にて一
晩振とう培養した。培養液を遠心して菌体を回収し、こ
れを１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 の１５ｍｌ中に懸濁した。
リーニング）５０μｇ／ｍｌアンピシリンと０．２％マ
ルトースを含むＬ−ブロス培地３０ｍｌに大腸菌Ｙ１０
９０株（ストラタジーン社製）を植菌し、３７℃にて一
晩振とう培養した。培養液を遠心して菌体を回収し、こ
れを１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 の１５ｍｌ中に懸濁した。
【００１７】ヒーラ細胞のｍＲＮＡより調製した市販の
λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリー液（クローンテック社
製、１〜９×１０9 ｐｆｕ／ｍｌを有する）を１００倍
希釈し、その６０μｌを上記の大腸菌懸濁液の３００μ
ｌと混合した。この混合液を３７℃で１５分間静置し、
０．５ｍｌを７．５ｍｌのＬＢトップ アガー（ topag
ar ) と混合し、角シャーレ（１３．５×９．５ｃｍ）
上のＬ−ブロス培地に注ぎ込み、４２℃で６時間静置培
養を行った。３７℃の恒温室で、このプレートの上に、
あらかじめ２０ｍＭ ＩＰＴＧ（和光純薬製、４８０ｍ
ｇ／１００ｍｌＨ2 Ｏ）に浸した後３７℃で乾燥させた
ニトロセルスースフィルター〔シュライヘル ウント
シュネル（ Schleicher & Schnell ) 社製、ＢＡ８５
１３．２×９．２ｃｍ〕をのせ、一晩プラークの培養を
行った。翌日、プレートを４℃に冷却した後、ニトロセ
ルロースフィルターをはがし、直ちに５％スキムミルク
入り１×ＴＮＥ２５緩衝液〔１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ〕５００ｍｌに入れ、１時間室温に
てゆっくりと振とうした。その後１×ＴＮＥ２５緩衝液
で１分間フィルターを洗浄した。この操作を２度繰返
し、ハイブリダイゼーションに供した。それぞれ５μｇ
／ｍｌになるように変性サケ精子ＤＮＡと変性子ウシ胸
腺ＤＮＡを加えた１×ＴＮＥ２５緩衝液３０ｍｌに、32
Ｐで標識したプローブ（ｗｔ）２５μｌ（反応液全量）
を加え、この液の中でフィルターを室温で６０分間ゆっ
くりと振とうしながらハイブリダイゼーションを行っ
た。その後フィルターは１×ＴＮＥ２５緩衝液３００ｍ
ｌで室温で１０分間洗浄した。これを３回繰返し、フィ
ルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムにて−８０℃でオート
ラジオグラフを確認した。
λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリー液（クローンテック社
製、１〜９×１０9 ｐｆｕ／ｍｌを有する）を１００倍
希釈し、その６０μｌを上記の大腸菌懸濁液の３００μ
ｌと混合した。この混合液を３７℃で１５分間静置し、
０．５ｍｌを７．５ｍｌのＬＢトップ アガー（ topag
ar ) と混合し、角シャーレ（１３．５×９．５ｃｍ）
上のＬ−ブロス培地に注ぎ込み、４２℃で６時間静置培
養を行った。３７℃の恒温室で、このプレートの上に、
あらかじめ２０ｍＭ ＩＰＴＧ（和光純薬製、４８０ｍ
ｇ／１００ｍｌＨ2 Ｏ）に浸した後３７℃で乾燥させた
ニトロセルスースフィルター〔シュライヘル ウント
シュネル（ Schleicher & Schnell ) 社製、ＢＡ８５
１３．２×９．２ｃｍ〕をのせ、一晩プラークの培養を
行った。翌日、プレートを４℃に冷却した後、ニトロセ
ルロースフィルターをはがし、直ちに５％スキムミルク
入り１×ＴＮＥ２５緩衝液〔１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ〕５００ｍｌに入れ、１時間室温に
てゆっくりと振とうした。その後１×ＴＮＥ２５緩衝液
で１分間フィルターを洗浄した。この操作を２度繰返
し、ハイブリダイゼーションに供した。それぞれ５μｇ
／ｍｌになるように変性サケ精子ＤＮＡと変性子ウシ胸
腺ＤＮＡを加えた１×ＴＮＥ２５緩衝液３０ｍｌに、32
Ｐで標識したプローブ（ｗｔ）２５μｌ（反応液全量）
を加え、この液の中でフィルターを室温で６０分間ゆっ
くりと振とうしながらハイブリダイゼーションを行っ
た。その後フィルターは１×ＴＮＥ２５緩衝液３００ｍ
ｌで室温で１０分間洗浄した。これを３回繰返し、フィ
ルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムにて−８０℃でオート
ラジオグラフを確認した。
【００１８】以上の操作によって１．２×１０6 個のプ
ラークをスクリーニングし、１個の陽性クローンを得
た。なお、この陽性クローンを用いて、32Ｐで標識した
プローブ（ｍｔ）を用いてハイブリダイゼーション操作
を行ったが、シグナルを発するプラークは全く得られな
かった。こうして単離した、λｇｔ１１をベクターとす
るクローンを〔λ３−１６〕と命名した。
ラークをスクリーニングし、１個の陽性クローンを得
た。なお、この陽性クローンを用いて、32Ｐで標識した
プローブ（ｍｔ）を用いてハイブリダイゼーション操作
を行ったが、シグナルを発するプラークは全く得られな
かった。こうして単離した、λｇｔ１１をベクターとす
るクローンを〔λ３−１６〕と命名した。
【００１９】（ｃＤＮＡ配列の決定）大腸菌Ｙ１０９０
株のＯＤ６００が０．１〜０．２としたＬ−ブロス培地
１０ｍｌにλ３−１６を植菌し、４２℃で６時間激しく
振とう培養した。この上清にＰＥＧ６０００（ナカライ
テスク社製）とＮａＣｌ粉末を加えることによりファー
ジ粒子を沈殿させ、フェノールとクロロホルムによりフ
ァージ由来のタンパク質を除去し、ＤＮＡを回収した。
このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース
電気泳動を行ったところ、約５００ｂｐのフラグメント
が確認された。このフラグメントをアガロースゲルより
回収、精製し、大腸菌のプラスミドベクターｐＵＣ１１
９のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。このク
ローンを鋳型として、サンガー法により、７−ＤＥＡＺ
Ａシークエンシング キット（ Sequencing Kit ) （宝
酒造社製）を用いて塩基配列の決定を行い、配列表の配
列番号１に示す配列を得た。
株のＯＤ６００が０．１〜０．２としたＬ−ブロス培地
１０ｍｌにλ３−１６を植菌し、４２℃で６時間激しく
振とう培養した。この上清にＰＥＧ６０００（ナカライ
テスク社製）とＮａＣｌ粉末を加えることによりファー
ジ粒子を沈殿させ、フェノールとクロロホルムによりフ
ァージ由来のタンパク質を除去し、ＤＮＡを回収した。
このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース
電気泳動を行ったところ、約５００ｂｐのフラグメント
が確認された。このフラグメントをアガロースゲルより
回収、精製し、大腸菌のプラスミドベクターｐＵＣ１１
９のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。このク
ローンを鋳型として、サンガー法により、７−ＤＥＡＺ
Ａシークエンシング キット（ Sequencing Kit ) （宝
酒造社製）を用いて塩基配列の決定を行い、配列表の配
列番号１に示す配列を得た。
【００２０】（λ３−１６に組込まれたｃＤＮＡがコー
ドするタンパク質を含む融合タンパク質の発現）λ３−
１６にクローニングされているｃＤＮＡ断片がコードす
るタンパク質を、大腸菌によりλｇｔ１１バクテリオフ
ァージのβ−ガラクトシダーゼ由来のポリペプチドとの
融合タンパク質として発現させた。Ｌ−ブロス培地（５
０μｇ／ｍｌアンピシリン、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．２％マルトースを含む）に大腸菌Ｙ１０９０株を植
菌し、３７℃で１晩培養した。この１０μｌをＬ−ブロ
ス培地１０ｍｌ（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）で希釈
した。その１００μｌにλ３−１６を２×１０8 ｐｆｕ
／ｍｌになるように植菌し、３２℃で２０分間吸着反応
を行った。ここに９００μｌのＬ−ブロス培地を加えて
希釈して、１０μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを
含むＬ−ブロス培地プレート上に平板し、３２℃で一晩
培養した。得られたコロニーを２枚の５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬ−ブロス培地プレート上に平板
し、それぞれ３２℃及び４２℃で培養した。３２℃では
コロニーが大きくなるが、４２℃では全く成育しないコ
ロニーを溶原菌として選択し、この溶原菌を５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロス培地２０ｍｌに植
えつけ、３２℃で一晩振とう培養した。培養液１００μ
ｌを４ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む）に混合し、ＯＤ６００が０．４５となった時点
で４２℃、１０分間振とう培養し、１０ｍＭになるよう
ＩＰＴＧを添加し、３７℃で２０分間〜３０分間インキ
ュベートした。この培養液を遠心して菌体を回収し、５
０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ α−ＰＭＳＦを含
む緩衝液に懸濁した。これを３回凍結融解を繰返して菌
体を破砕したあと、４℃で１５，０００ｒｐｍで３０分
間遠心して上清を回収し、タンパク質試料溶液とした。
ドするタンパク質を含む融合タンパク質の発現）λ３−
１６にクローニングされているｃＤＮＡ断片がコードす
るタンパク質を、大腸菌によりλｇｔ１１バクテリオフ
ァージのβ−ガラクトシダーゼ由来のポリペプチドとの
融合タンパク質として発現させた。Ｌ−ブロス培地（５
０μｇ／ｍｌアンピシリン、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．２％マルトースを含む）に大腸菌Ｙ１０９０株を植
菌し、３７℃で１晩培養した。この１０μｌをＬ−ブロ
ス培地１０ｍｌ（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）で希釈
した。その１００μｌにλ３−１６を２×１０8 ｐｆｕ
／ｍｌになるように植菌し、３２℃で２０分間吸着反応
を行った。ここに９００μｌのＬ−ブロス培地を加えて
希釈して、１０μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを
含むＬ−ブロス培地プレート上に平板し、３２℃で一晩
培養した。得られたコロニーを２枚の５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬ−ブロス培地プレート上に平板
し、それぞれ３２℃及び４２℃で培養した。３２℃では
コロニーが大きくなるが、４２℃では全く成育しないコ
ロニーを溶原菌として選択し、この溶原菌を５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロス培地２０ｍｌに植
えつけ、３２℃で一晩振とう培養した。培養液１００μ
ｌを４ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む）に混合し、ＯＤ６００が０．４５となった時点
で４２℃、１０分間振とう培養し、１０ｍＭになるよう
ＩＰＴＧを添加し、３７℃で２０分間〜３０分間インキ
ュベートした。この培養液を遠心して菌体を回収し、５
０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ α−ＰＭＳＦを含
む緩衝液に懸濁した。これを３回凍結融解を繰返して菌
体を破砕したあと、４℃で１５，０００ｒｐｍで３０分
間遠心して上清を回収し、タンパク質試料溶液とした。
【００２１】（ゲルシフト法）上述したタンパク質試料
溶液を用いて、ゲルシフト法（前出のヌクレイックアシ
ッズ リサーチ）を行った。５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．
５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロ
ール、ポリｄＩ−ｄＣ／ｄＩ−ｄＣ２μｇを含む２０ｍ
Ｍヘペス（ＨＥＰＥＳ）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．
８）中に、32Ｐでラベルしたプローブ（ｗｔ）を０．１
〜０．５ｎｇ加え、更にタンパク質試料溶液６μｌを加
え、全量を２５μｌとした。室温で１５分間静置した
後、変性剤を含まない４％ポリアクリルアミドゲル（ア
クリルアミド：ビスアクリルアミド＝４０：１）中で電
気泳動し、オートラジオグラフィーに供した。32Ｐでラ
ベルしたプローブ（ｗｔ）由来のバンドよりも高分子側
に、タンパク質試料と32Ｐでラベルしたプローブ（ｗ
ｔ）との複合体由来のバンドが観察された。前出のヌク
レイック アシッズ リサーチに記載の方法に従い調製
したＥ１Ａ上流ＤＮＡ断片（−第１５８番〜−第３０４
番）及びラベルしないプローブ（ｗｔ）を競合物として
添加し、同様にゲルシフト法を行うと、競合物の添加量
に応じて上記のバンドが薄くなった。しかし、プラスミ
ドｐＵＣ１１９のＨｉｎｆＩ断片及びプローブ（ｍｔ）
を競合物として添加しても、該バンドの濃さに変化は生
じなかった。
溶液を用いて、ゲルシフト法（前出のヌクレイックアシ
ッズ リサーチ）を行った。５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．
５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロ
ール、ポリｄＩ−ｄＣ／ｄＩ−ｄＣ２μｇを含む２０ｍ
Ｍヘペス（ＨＥＰＥＳ）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．
８）中に、32Ｐでラベルしたプローブ（ｗｔ）を０．１
〜０．５ｎｇ加え、更にタンパク質試料溶液６μｌを加
え、全量を２５μｌとした。室温で１５分間静置した
後、変性剤を含まない４％ポリアクリルアミドゲル（ア
クリルアミド：ビスアクリルアミド＝４０：１）中で電
気泳動し、オートラジオグラフィーに供した。32Ｐでラ
ベルしたプローブ（ｗｔ）由来のバンドよりも高分子側
に、タンパク質試料と32Ｐでラベルしたプローブ（ｗ
ｔ）との複合体由来のバンドが観察された。前出のヌク
レイック アシッズ リサーチに記載の方法に従い調製
したＥ１Ａ上流ＤＮＡ断片（−第１５８番〜−第３０４
番）及びラベルしないプローブ（ｗｔ）を競合物として
添加し、同様にゲルシフト法を行うと、競合物の添加量
に応じて上記のバンドが薄くなった。しかし、プラスミ
ドｐＵＣ１１９のＨｉｎｆＩ断片及びプローブ（ｍｔ）
を競合物として添加しても、該バンドの濃さに変化は生
じなかった。
【００２２】一方、外来ＤＮＡが挿入されないλｇｔ１
１バクテリオファージを上述と同様の方法で培養し、β
−ガラクトシダーゼの一部を発現させて同様のゲルシフ
ト法を行ったところ、複合体の形成は観察されず、以上
より、タンパク質試料溶液中のλ３−１６に組込まれた
ｃＤＮＡがコードするタンパク質が、アデノウイルスＥ
１Ａ上流のエンハンサーコア配列に特異的に結合するこ
とが確認された。
１バクテリオファージを上述と同様の方法で培養し、β
−ガラクトシダーゼの一部を発現させて同様のゲルシフ
ト法を行ったところ、複合体の形成は観察されず、以上
より、タンパク質試料溶液中のλ３−１６に組込まれた
ｃＤＮＡがコードするタンパク質が、アデノウイルスＥ
１Ａ上流のエンハンサーコア配列に特異的に結合するこ
とが確認された。
【００２３】（メチル化阻害実験）λ３−１６に組込ま
れたｃＤＮＡがコードするタンパク質を含む融合タンパ
ク質について、Ｅ１Ａエンハンサーコア配列中のどの部
位が結合に必須であるかを調べるため、グアニンを部分
的にメチル化したプローブを用いて、メチル化阻害実験
（前出のヌクレイック アシッズ リサーチ）を行っ
た。メチル化プローブは、カコジル緩衝液２００μｌに
５′末端を32Ｐで標識したプローブ（ｗｔ）５μｌとジ
メチルサルファイト（ＤＭＳ）１μｌを加え、室温で３
分間静置することにより作製した。その後、ＤＭＳの反
応停止液５０μｌとｔＲＮＡ（１００ｍｇ／ｍｌ）１μ
ｌを加え、エタノール沈殿を２回繰返してプローブを精
製した。
れたｃＤＮＡがコードするタンパク質を含む融合タンパ
ク質について、Ｅ１Ａエンハンサーコア配列中のどの部
位が結合に必須であるかを調べるため、グアニンを部分
的にメチル化したプローブを用いて、メチル化阻害実験
（前出のヌクレイック アシッズ リサーチ）を行っ
た。メチル化プローブは、カコジル緩衝液２００μｌに
５′末端を32Ｐで標識したプローブ（ｗｔ）５μｌとジ
メチルサルファイト（ＤＭＳ）１μｌを加え、室温で３
分間静置することにより作製した。その後、ＤＭＳの反
応停止液５０μｌとｔＲＮＡ（１００ｍｇ／ｍｌ）１μ
ｌを加え、エタノール沈殿を２回繰返してプローブを精
製した。
【００２４】次にゲルシフト法を行い、タンパク質試料
と32Ｐでラベルしたプローブ（ｗｔ）との複合体由来の
バンド、及び複合体を形成しなかったプローブ由来のバ
ンドをゲルから切り出し、ゲル断片からプローブＤＮＡ
を抽出した。このプローブＤＮＡにピペリジンを加え、
９０℃で３０分間熱処理することにより、メチル化した
グアニン塩基を特異的に切断した後、電気泳動を行っ
た。その結果32Ｐでラベルしたプローブ（ｗｔ）中のＥ
１Ａエンハンサーコア配列部分の２つ並んだグアニンが
どちらもメチル化されていないプローブのみが融合タン
パク質と結合することが確認され、この２つ並んだグア
ニンがＥ１Ａ−Ｆとの結合に必須であることが確認され
た。
と32Ｐでラベルしたプローブ（ｗｔ）との複合体由来の
バンド、及び複合体を形成しなかったプローブ由来のバ
ンドをゲルから切り出し、ゲル断片からプローブＤＮＡ
を抽出した。このプローブＤＮＡにピペリジンを加え、
９０℃で３０分間熱処理することにより、メチル化した
グアニン塩基を特異的に切断した後、電気泳動を行っ
た。その結果32Ｐでラベルしたプローブ（ｗｔ）中のＥ
１Ａエンハンサーコア配列部分の２つ並んだグアニンが
どちらもメチル化されていないプローブのみが融合タン
パク質と結合することが確認され、この２つ並んだグア
ニンがＥ１Ａ−Ｆとの結合に必須であることが確認され
た。
【００２５】実施例２ 約２．１ｋｂのＥ１Ａ−Ｆ ｃ
ＤＮＡのクローニング ヒト培養細胞ＫＢｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７）か
らｍＲＮＡを精製し、岡山−バーグ法〔岡山（ Okayama
)ら、モレキュラー アンド セルラー バイオロジー
（ Mol.Cell.Biol. ) 第２巻、第１６１頁（１９８
２）〕を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。実施
例１で得られた配列表の配列番号１で示すｃＤＮＡ断片
を、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒
造社）を用いて32Ｐにより標識し、標識プローブを作製
した。次に、上記のｃＤＮＡライブラリーから約１．５
×１０5 個のコロニーをＬ−ブロス培地プレート上に平
板し、該標識プローブを用いてコロニーハイブリダイゼ
ーションを行い、３個の陽性クローンを得た。このう
ち、最長の約２．１ｋｂの挿入断片を有するクローンに
ついて、キロシークエンス用デレーションキット（宝酒
造製）を用いて、挿入断片のｃＤＮＡ塩基配列を決定
し、配列表の配列番号２に示すｃＤＮＡ配列を得た。
ＤＮＡのクローニング ヒト培養細胞ＫＢｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７）か
らｍＲＮＡを精製し、岡山−バーグ法〔岡山（ Okayama
)ら、モレキュラー アンド セルラー バイオロジー
（ Mol.Cell.Biol. ) 第２巻、第１６１頁（１９８
２）〕を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。実施
例１で得られた配列表の配列番号１で示すｃＤＮＡ断片
を、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒
造社）を用いて32Ｐにより標識し、標識プローブを作製
した。次に、上記のｃＤＮＡライブラリーから約１．５
×１０5 個のコロニーをＬ−ブロス培地プレート上に平
板し、該標識プローブを用いてコロニーハイブリダイゼ
ーションを行い、３個の陽性クローンを得た。このう
ち、最長の約２．１ｋｂの挿入断片を有するクローンに
ついて、キロシークエンス用デレーションキット（宝酒
造製）を用いて、挿入断片のｃＤＮＡ塩基配列を決定
し、配列表の配列番号２に示すｃＤＮＡ配列を得た。
【００２６】
【発明の効果】以上詳細に説明した様に、本発明によっ
てアデノウイルスＥ１Ａ上流のエンハンサーコア配列に
特異的に結合するタンパク質をコードするＥ１Ａ−Ｆ遺
伝子が得られる。該遺伝子は、Ｅ１Ａ−Ｆの工業的生産
や、がん遺伝子の作用機構の研究等において有用であ
る。
てアデノウイルスＥ１Ａ上流のエンハンサーコア配列に
特異的に結合するタンパク質をコードするＥ１Ａ−Ｆ遺
伝子が得られる。該遺伝子は、Ｅ１Ａ−Ｆの工業的生産
や、がん遺伝子の作用機構の研究等において有用であ
る。
配列番号：１ 配列の長さ：473 配列の型： 核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 配列： CGA GAG GGG CCG CCC TAC CAG CGC CGG GGT GCC CTG CAG CTG TGG 45 Arg Glu Gly Pro Pro Tyr Gln Arg Arg Gly Ala Leu Gln Leu Trp 1 5 10 15 CAA TTT CTG GTG GCC TTG CTG GAT GAC CCA ACA AAT GCC CAT TTC 90 Gln Phe Leu Val Ala Leu Leu Asp Asp Pro Thr Asn Ala His Phe 20 25 30 ATT GCC TGG ACG GGC CGG GGA ATG GAG TTC AAG CTC ATT GAG CCT 135 Ile Ala Trp Thr Gly Arg Gly Met Glu Phe Lys Leu Ile Glu Pro 35 40 45 GAG GAG GTC GCC AGG CTC TGG GGC ATC CAG AAG AAC CGG CCA GCC 180 Glu Glu Val Ala Arg Leu Trp Gly Ile Gln Lys Asn Arg Pro Ala 50 55 60 ATG AAT TAC GAC AAG CTG AGC CGC TCG CTC CGA TAC TAT TAT GAG 225 Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Glu 65 70 75 AAA GGC ATC ATG CAG AAG GTG GCT GGT GAG CGT TAC GTG TAC AAG 270 Lys Gly Ile Met Gln Lys Val Ala Gly Glu Arg Tyr Val Tyr Lys 80 85 90 TTT GTG TGT GAG CCC GAG GCC CTC TTC TCT TTG GCC TTC CCG GAC 315 Phe Val Cys Glu Pro Glu Ala Leu Phe Ser Leu Ala Phe Pro Asp 95 100 105 AAT CAG CGT CCA GCT CTC AAG GCT GAG TTT GAC CGG CCT GTC AGT 360 Asn Gln Arg Pro Ala Leu Lys Ala Glu Phe Asp Arg Pro Val Ser 110 115 120 GAG GAG GAC ACA GTC CCT TTG TCC CAC TTG GAT GAG AGC CCC GCC 405 Glu Glu Asp Thr Val Pro Leu Ser His Leu Asp Glu Ser Pro Ala 125 130 135 TAC CTC CCA GAG CTG GCT GGC CCC GCC CAG CCA TTT GGC CCC AAG 450 Tyr Leu Pro Glu Leu Ala Gly Pro Ala Gln Pro Phe Gly Pro Lys 140 145 150 GGT GGC TAC TCT TAC TAGCCCCC 473 Gly Gly Tyr Ser Tyr 155 配列番号：２ 配列の長さ：2073 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GACTCTGAAG ATCTCTTCCA GGATCTAAGT CACTTCCAGG AGACGTGGCN CGCTGAAGCT 60 CAGGTACCAG ACAGTGATGA GCAGTTTGTT CCTGATTTCC ATTCAGAAAA CCTAGCTTTC 120 CACAGCCCCA CCACCAGGAT CAAGAAGGAG CCCCAGAGTC CCCGCACAGA CCCGGCCCTG 180 TCCTGCAGCA GGAAGCCGCC ACTCCCCTAC CACCATGGCG AGCAGTGCCT TTACTCCAGT 240 GCCTATGACC CCCCCAGACA AATCGCCATC AAGTCCCCTG CCCCTGGTGC CCTTGGACAG 300 TCGCCCCTAC AGCCCTTTCC CCGGGCAGAG CAACGGAATT TCCTGAGATC CTCTGGCACC 360 TCCCAGCCCC ACCCTGGCCA TGGGTACCTC GGGGAACATA GCTCCGTCTT CCAGCAGCCC 420 CTGGACATTT GCCACTCCTT CACATCTCAG GGAGGGGGCC GGGAACCCCT CCCAGCCCCC 480 TACCAACACC AGCTGTCGGA GCCCTGCCCA CCCTATCCCC AGCAGAGCTT TAAGCAAGAA 540 TACCATGATC CCCTGTATGA ACAGGCGGGC CAGCCAGCCG TGGACCAGGG TGGGGTCAAT 600 GGGCACAGGT ACCCAGGGGC GGGGGTGGTG ATCAAACAGG AACAGACGGA CTTCGCCTAC 660 GACTCAGATG TCACCGGGTG CGCATCAATG TACCTCCACA CAGAGGGCTT CTCTGGGCCC 720 TCTCCAGGTG ACGGGGCCAT GGGCTATGGC TATGAGAAAC CTCTGCGACC ATTCCCAGAT 780 GATGTCTGCG TTGTCCCTGA GAAATTTGAA GGAGACATCA AGCAGGAAGG GGTCGGTGCA 840 TTTCGAGAGG GGCCGCCCTA CCAGCGCCGG GGTGCCCTGC AGCTGTGGCA ATTTCTGGTG 900 GCCTTGCTGG ATGACCCAAC AAATGCCCAT TTCATTGCCT GGACGGGCCG GGGAATGGAG 960 TTCAAGCTCA TTGAGCCTGA GGAGGTCGCC AGGCTCTGGG GCATCCAGAA GAACCGGCCA 1020 GCCATGAATT ACGACAAGCT GAGCCGCTCG CTCCGATACT ATTATGAGAA AGGCATCATG 1080 CAGAAGGTGG CTGGTGAGCG TTACGTGTAC AAGTTTGTGT GTGAGCCCGA GGCCCTCTTC 1140 TCTTTGGCCT TCCCGGACAA TCAGCGTCCA GCTCTCAAGG CTGAGTTTGA CCGGCCTGTC 1200 AGTGAGGAGG ACACAGTCCC TTTGTCCCAC TTGGATGAGA GCCCCGCCTA CCTCCCAGAG 1260 CTGGCTGGCC CCGCCCAGCC ATTTGGCCCC AAGGGTGGCT ACTCTTACTA GCCCCCAGCG 1320 GCTGTTCCCC CTGCCGCAGG TGGGTGCTGC CCTGTGTACA TATAAATGAA TCTGGTGTTG 1380 GGGAAACCTT CATCTGAAAC CCACAGATGT CTCTGGGGCA GATCCCCACT GTCCTACCAG 1440 TTGCCCTAGC CCAGACTCTG AGCTGCTCAC CGGAGTCATT GGGAAGGAAA AGTGGAGAAA 1500 TGGCAAGTCT AGAGTCTCAG AAACTCCCCT GGGGGTTTCA CCTGGGCCCT GGAGGAATTC 1560 AGCTCAGCTT CTTCCTAGGT CCAAGCCCCC CACACCTTTT CCCCAACCAC AGAGAACAAG 1620 AGTTTGTTCT GTTCTGGGGG ACAGAGAAGG CGCTTCCCAA CTTCATACTG GCAGGAGGGT 1680 GAGGAGGTTC ACTGAGCTCC CCAGATCTCC CACTGCGGGG AGACAGAAGC CTGGACTCTG 1740 CCCCACGCTG TGGCCCTGGA GGGTCCCGGT TTGTCAGTTC TTGGTGCTCT GTGTTCCCAG 1800 AGGCAGGCGG AGGTTGAAGA AAGGAACCTG GGATGAGGGG TGCTGGGTAT AAGCAGAGAG 1860 GGATGGGTTC CTGCTCCAAG GGACCCTTTG CCTTTCTTCT GCCCTTTCCT AGGCCCAGGC 1920 CTGGGTTTGT ACTTCCACCT CCACCACATC TGCCAGACCT TAATAAAGGC CCCCACTTCT 1980 CCCATTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGTACC TTCTGAGGCG GAAAGAACCA 2040 GGCGGATCGG GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCA 2073 配列番号：３ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： ACAGGAAGTG ACACGGATGT GGC 23 配列番号：４ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： CCACATCCGT GTCACTTCCT GTG 23 配列番号：５ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： ACACCAAGTG ACACCCATGT GGC 23 配列番号：６ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： CCACATGGGT GTCACTTGGT GTG 23 配列番号：７ 配列の長さ：98 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： AGCTTGCATG CCTGCAGGTC ACAGGAAGTG ACACGGATGT GGCACAGGAA GTGACACGGA 60 TGTGGCACAG GAAGTGACAC GGATGTGGGA CTCTAGAG 98 配列番号：８ 配列の長さ：98 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GATCCTCTAG AGTCCCACAT CCGTGTCACT TCCTGTGCCA CATCCGTGTC ACTTCCTGTG 60 CCACATCCGT GTCACTTCCT GTGACCTGCA GGCATGCA 98 配列番号：９ 配列の長さ：75 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： AGCTTGCATG CCTGCAGGTC ACACCAAGTG ACACCCATGT GGCACACCAA GTGACACCCA 60 TGTGGGACTC TAGAG 75 配列番号：10 配列の長さ：75 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GATCCTCTAG AGTCCCACAT GGGTGTCACT TGGTGTGCCA CATGGGTGTC ACTTGGTGTG 60 ACCTGCAGGC ATGCA 75
Claims (1)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で表されるＤＮＡを
分子内に含有することを特徴とする単離されたＥ１Ａ−
Ｆ遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16545392A JPH05328975A (ja) | 1992-06-02 | 1992-06-02 | Ｅ１ａ−ｆ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16545392A JPH05328975A (ja) | 1992-06-02 | 1992-06-02 | Ｅ１ａ−ｆ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328975A true JPH05328975A (ja) | 1993-12-14 |
Family
ID=15812710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16545392A Pending JPH05328975A (ja) | 1992-06-02 | 1992-06-02 | Ｅ１ａ−ｆ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05328975A (ja) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996024379A1 (fr) * | 1995-02-08 | 1996-08-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Traitement du cancer |
| US7628989B2 (en) | 2001-04-10 | 2009-12-08 | Agensys, Inc. | Methods of inducing an immune response |
| WO2010141861A1 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| US7927597B2 (en) | 2001-04-10 | 2011-04-19 | Agensys, Inc. | Methods to inhibit cell growth |
| EP2486938A1 (en) | 2006-09-26 | 2012-08-15 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US8343512B2 (en) | 2006-09-26 | 2013-01-01 | Infectious Disease Research Institute | Treatment of allergic conditions using a composition containing synthetic adjuvant |
| WO2013119856A1 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Infectious Disease Research Institute | Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same |
| US9044420B2 (en) | 2011-04-08 | 2015-06-02 | Immune Design Corp. | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
| WO2015103167A2 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Infectious Disease Research Institute | Single vial vaccine formulations |
| WO2017210364A1 (en) | 2016-06-01 | 2017-12-07 | Infectious Disease Research Institute | Nanoalum particles containing a sizing agent |
| WO2019051149A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Infectious Disease Research Institute | LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SAPONIN AND METHODS OF USE |
| US10342815B2 (en) | 2013-04-18 | 2019-07-09 | Immune Design Corp. | GLA monotherapy for use in cancer treatment |
| WO2020243115A1 (en) | 2019-05-25 | 2020-12-03 | Infectious Disease Research Institute | Composition and method for spray drying an adjuvant vaccine emulsion |
-
1992
- 1992-06-02 JP JP16545392A patent/JPH05328975A/ja active Pending
Cited By (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6096542A (en) * | 1995-02-08 | 2000-08-01 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Cancer control |
| US6528310B1 (en) | 1995-02-08 | 2003-03-04 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Cancer control |
| US7070931B2 (en) | 1995-02-08 | 2006-07-04 | Takara Bio Inc. | Cancer control |
| WO1996024379A1 (fr) * | 1995-02-08 | 1996-08-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Traitement du cancer |
| US7951375B2 (en) | 2001-04-10 | 2011-05-31 | Agensys, Inc. | Methods of inducing an immune response |
| US7628989B2 (en) | 2001-04-10 | 2009-12-08 | Agensys, Inc. | Methods of inducing an immune response |
| US7641905B2 (en) | 2001-04-10 | 2010-01-05 | Agensys, Inc. | Methods of inducing an immune response |
| US7736654B2 (en) | 2001-04-10 | 2010-06-15 | Agensys, Inc. | Nucleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers |
| US7927597B2 (en) | 2001-04-10 | 2011-04-19 | Agensys, Inc. | Methods to inhibit cell growth |
| EP3403667A1 (en) | 2006-09-26 | 2018-11-21 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US9907845B2 (en) | 2006-09-26 | 2018-03-06 | Infectious Disease Research Institute | Methods of using a vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US8343512B2 (en) | 2006-09-26 | 2013-01-01 | Infectious Disease Research Institute | Treatment of allergic conditions using a composition containing synthetic adjuvant |
| EP3795173A1 (en) | 2006-09-26 | 2021-03-24 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US8840908B2 (en) | 2006-09-26 | 2014-09-23 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US10792359B2 (en) | 2006-09-26 | 2020-10-06 | Infectious Disease Research Institute | Methods of using a vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US10765736B2 (en) | 2006-09-26 | 2020-09-08 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| EP2486938A1 (en) | 2006-09-26 | 2012-08-15 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US9987355B2 (en) | 2006-09-26 | 2018-06-05 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US9950063B2 (en) | 2006-09-26 | 2018-04-24 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| EP3251680A1 (en) | 2008-05-22 | 2017-12-06 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| US9480740B2 (en) | 2009-06-05 | 2016-11-01 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| US10632191B2 (en) | 2009-06-05 | 2020-04-28 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| US9814772B2 (en) | 2009-06-05 | 2017-11-14 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| EP3124491A1 (en) | 2009-06-05 | 2017-02-01 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants and vaccine compositions containing them |
| WO2010141861A1 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Infectious Disease Research Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
| US9044420B2 (en) | 2011-04-08 | 2015-06-02 | Immune Design Corp. | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
| EP3563834A1 (en) | 2012-02-07 | 2019-11-06 | Infectious Disease Research Institute | Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same |
| WO2013119856A1 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Infectious Disease Research Institute | Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same |
| US10342815B2 (en) | 2013-04-18 | 2019-07-09 | Immune Design Corp. | GLA monotherapy for use in cancer treatment |
| US10993956B2 (en) | 2013-04-18 | 2021-05-04 | Immune Design Corp. | GLA monotherapy for use in cancer treatment |
| WO2015103167A2 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Infectious Disease Research Institute | Single vial vaccine formulations |
| EP3915579A1 (en) | 2013-12-31 | 2021-12-01 | Infectious Disease Research Institute | Single vial vaccine formulations |
| WO2017210364A1 (en) | 2016-06-01 | 2017-12-07 | Infectious Disease Research Institute | Nanoalum particles containing a sizing agent |
| WO2019051149A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Infectious Disease Research Institute | LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SAPONIN AND METHODS OF USE |
| WO2020243115A1 (en) | 2019-05-25 | 2020-12-03 | Infectious Disease Research Institute | Composition and method for spray drying an adjuvant vaccine emulsion |
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