JPH119285A

JPH119285A - Ｔｂｐと複合体を形成する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドおよび該蛋白質を認識する抗体

Info

Publication number: JPH119285A
Application number: JP9187398A
Authority: JP
Inventors: Toshihiko Kishimoto; 利彦岸本; Takaaki Tamura; 隆明田村; Yasutaka Makino; 泰孝牧野
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 1999-01-19
Also published as: EP0926157A1; WO1999000419A1

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、遺伝子転写における中心的な因
子であるＴＢＰと複合体を形成する新規な蛋白質並びに
該蛋白質をコードする遺伝子を提供する。【解決手段】本発明は、配列表の配列番号１又は配列
番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、その変異
体及びそのホモログ蛋白質である。本発明の蛋白質は、
ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、さらには、Ａ
ＴＰｓａｅ活性並びにＤＮＡヘリケース活性を有する。
本発明はまた、上記蛋白質をコードする遺伝子である。
本発明はまた、上記蛋白質に特異的に結合する抗体であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物の各組織
に広く存在し、ＴＢＰと複合体を形成する蛋白質、該蛋
白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチ
ドのアンチセンスポリヌクレオチドおよび該蛋白質を認
識する抗体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】癌の発症は遺伝子の何らかの異常によっ
て起こることが知られており、特に、遺伝子の転写レベ
ルでの変動異常が癌の発症の主たる原因となると考えら
れている。癌の原因遺伝子の究明は、癌の発症機構の解
明や癌の診断法、治療法の開発等を実現するために不可
欠な重要課題であり、該遺伝子の探索は１９８０年頃よ
り盛んに行われてきた。

【０００３】一方、遺伝子転写における中心的な因子と
しては、ＴＢＰ（ＴＡＴＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔ
ｅｉｎ）が、生物の全遺伝子の転写に関わっていること
が知られている。具体的には、ＤＮＡからｍＲＮＡへの
転写が行われるときにＴＢＰが該ＤＮＡのプロモーター
領域に結合することで遺伝子の転写制御が行われている
と報告されている。そうすると、各遺伝子のそれぞれ異
なる転写制御に対応するだけの機能をＴＢＰは持つこと
になるが、これはＴＢＰが他の多様な蛋白質と複合体を
形成することで、その相手の蛋白質や複合体の構造によ
り、それぞれの機能を持つことになると考えられてい
る。

【０００４】上記のＴＢＰと複合体を形成する蛋白質と
しては、これまでにＴＡＦｓ（ＴＢＰａｓｓｏｃｉ
ａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ）やＤｒ１、Ｄｒ２といっ
た遺伝子の転写に関連すると考えられるものから、Ｔａ
ｔ、ｐ５３、Ｒｂ等の癌関連遺伝子等まで幅広く同定さ
れている。

【０００５】一方、本発明者らのうちの田村、牧野によ
って、微量しか発現されない蛋白質または抗原性の低い
蛋白質およびそれらをコードする遺伝子の取得方法が明
らかにされた（『バイオマニュアルシリーズ５転写因
子研究法』ｐｐ１１〜１６、ｐｐ２７〜３７、ｐｐ１８
９〜１９６及びｐｐ２１５〜２１９（羊土社、１９９３
年））。

【０００６】本発明者らは、上記の方法を用いて、ＴＢ
Ｐと結合しかつ癌で特異的に発現が増加する蛋白質とし
て、ＴＩＰ１２０蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子
および該蛋白質に対する抗体を、特開平９−７７７９２
号公報に開示した。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子転写
における中心的な因子であるＴＢＰと複合体を形成する
新規な蛋白質の取得を目的とするものである。また、本
発明は、前記蛋白質をコードする遺伝子または前記蛋白
質を認識する抗体を提供することを目的とするものであ
る。さらに、本発明は、該抗体を用いて該蛋白質の検出
を可能ならしめることを目的とするものである。さら
に、本発明は、前記のＴＢＰと複合体を形成する蛋白質
のホモログの取得方法ならびに該方法により取得された
ホモログ蛋白質およびそれらの蛋白質をコードする遺伝
子を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の田
村、牧野の方法を改良した方法を用いて、ＴＢＰと複合
体を形成する蛋白質であってその分子量が４９ｋＤであ
る蛋白質（ＴＩＰ４９と命名した。）の遺伝子（ＴＩＰ
４９遺伝子）の塩基配列を決定した。そして、該遺伝子
がコードするアミノ酸配列を決定した。さらに、ＴＩＰ
４９遺伝子がコードする組み換え蛋白質を作製し、該組
み換え蛋白質が天然に存するＴＩＰ４９と同じ性質を有
することを確認した。また、ＴＩＰ４９遺伝子の一部の
ＤＮＡをプローブとして用い、そして該プローブである
ＤＮＡが得られたｃＤＮＡライブラリーとは別のｃＤＮ
Ａライブラリーから、該プローブがハイブリダイズする
ｃＤＮＡ（ＴＩＰ４９遺伝子のホモログ）を取得し、該
ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定した。また、
ＴＩＰ４９蛋白質を該蛋白質が由来する動物以外の動物
に免疫することにより、該蛋白質を認識する抗体を得、
該蛋白質の抗原性を確認した。

【０００９】すなわち、本発明は、以下の蛋白質を提供
する。１．以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質、（ａ）配列表の
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において一また
は複数のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ
酸配列からなる蛋白質。２．以下の（ｃ）又は（ｄ）の蛋白質、（ｃ）配列表の
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｄ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において一また
は複数のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ
酸配列からなる蛋白質。３．さらに、ＡＴＰｓａｅ活性を有する前記１又は２に
記載の蛋白質。４．さらに、ＤＮＡヘリケース活性を有する前記１ない
し３のいずれか一つに記載の蛋白質。５．以下の（ｅ）又は（ｆ）に記載の蛋白質、（ｅ）Ｔ
ＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列の一部からなる蛋白質、
（ｆ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部において
一または複数のアミノ酸が置換、欠失または付加された
アミノ酸配列からなる蛋白質。６．以下の（ｇ）又は（ｈ）に記載の蛋白質、（ｇ）Ｔ
ＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配列表の配
列番号３に記載のアミノ酸配列の一部からなる蛋白質、
（ｈ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の一部において
一または複数のアミノ酸が置換、欠失または付加された
アミノ酸配列からなる蛋白質。７．さらに、ＡＴＰｓａｅ活性を有する前記５又は６に
記載の蛋白質。８．さらに、ＤＮＡヘリケース活性を有する前記５ない
し７のいずれか一つに記載の蛋白質。

【００１０】また、本発明は、以下のポリヌクレオチド
を提供するものである。９．前記１ないし８のいずれか一つに記載の蛋白質をコ
ードするＤＮＡ。１０．配列表の配列番号２又は配列番号４に記載の塩基
配列からなるＤＮＡ。１１．前記９又は１０に記載のＤＮＡがコードするＲＮ
Ａ。１２．前記９又は１０に記載のＤＮＡのアンチセンスＤ
ＮＡ或いは前記１１に記載のＲＮＡのアンチセンスＲＮ
Ａ、又はそれらの誘導体からなるアンチセンスポリヌク
レオチド。１３．前記９ないし１２のいずれか一つに記載のポリヌ
クレオチドのうちの一部であって、連続する１２塩基以
上からなるポリヌクレオチド。１４．前記９ないし１２のいずれか一つに記載のポリヌ
クレオチドのうちの一部であって、連続する１６塩基以
上からなるポリヌクレオチド。１５．前記５ないし８のいずれか一つに記載の蛋白質を
コードするＤＮＡのアンチセンスＤＮＡ、或いは前記５
ないし８のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするＤ
ＮＡがコードするＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ、又はそ
れらの誘導体からなるアンチセンスポリヌクレオチドで
あって、ＧＣ含有率が３０〜７０％であるポリヌクレオ
チド。１６．化学修飾された前記９ないし１５のいずれか一つ
に記載のポリヌクレオチド。

【００１１】１７．本発明は、前記１０に記載のＤＮＡ
のホモログであるｃＤＮＡを取得する方法であって、前
記１３ないし１５のいずれか一つに記載のポリヌクレオ
チドをプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーから該ポ
リヌクレオチドとハイブリダイズするｃＤＮＡを取得す
る方法を提供するものである。

【００１２】１８．また、本発明は、配列表の配列番号
２または配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡの
ホモログであって、前記のｃＤＮＡの取得方法によって
取得されたｃＤＮＡを提供するものである。

【００１３】１９．また、本発明は、配列表の配列番号
１又は３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモロ
グであって、前記のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列
からなる蛋白質を提供するものである。

【００１４】２０．また、本発明は、前記１ないし８又
は１９のいずれか一つに記載の蛋白質を認識する抗体
（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）を提供
するものである。

【００１５】２１．また、本発明は、前記１ないし８又
は１９のいずれか一つに記載の蛋白質を認識するモノク
ローナル抗体の活性フラグメントを提供するものであ
る。

【００１６】２２．また、本発明は、前記１ないし８又
は１９のいずれか一つに記載の蛋白質を検出する方法で
あって、該蛋白質を認識する抗体を用いることを特徴と
する検出方法に関するものである。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明では、後述するように、実
施例としてラットの肝臓から、ＴＢＰと複合体を形成す
るＴＩＰ４９を単離し、さらに実施例１０で示したよう
にヒトＴＩＰ４９遺伝子を取得した。ＴＢＰが生物の全
ての遺伝子の転写の中心因子であることから、ラットや
ヒト以外の生物が、今回単離した蛋白質と同じ機能をも
つ蛋白質を有していることが非常に高い可能性をもって
考えられる。それゆえ、実施例１０で開示した方法によ
り、ヒト又はラット以外の他の生物からＴＩＰ４９のホ
モログが得られる。また、実施例４で実証したようにＴ
ＩＰ４９遺伝子が各組織に広く存在することおよび実施
例２で示したようにＴＩＰ４９遺伝子がＤＮＡ障害に関
与する遺伝子であることから、ＴＩＰ４９遺伝子は肝臓
だけではなく各組織でのＤＮＡ障害に関与する遺伝子で
あることが強く示唆される。もちろん、種によってその
アミノ酸配列にいくらかの相違はあるが、一般的には異
種間の同一機能の蛋白質については３０％〜４０％以上
のホモロジーがあると言われている。ここでいうホモロ
ジーがあるということは、一般に言われているのと同じ
く、同族アミノ酸をポジティブとカウントする算出法に
よるものであり、アミノ酸鎖の長さが異なる場合は、ア
ミノ酸鎖が短い方の蛋白質の長さに対して、ホモロジー
がある部分の割合がいくらかを表す。ＴＩＰ４９をラッ
トとヒトとの間において比較すると、アミノ酸レベルで
はわずかに１アミノ酸が異なるだけであり、種間におい
てアミノ酸配列が非常によく保存された蛋白質である。

【００１８】本発明のＴＩＰ４９の機能は、ＴＢＰと複
合体を形成すること、ＡＴＰａｓｅ活性を有することま
たはＤＮＡヘリケース活性を有することを特徴とする
が、これらについては、例えば実施例７ないし９で開示
した方法をそれぞれの場合で用いて確認すればよい。本
発明は、ＴＩＰ４９蛋白質の変異体として、上記機能を
有し、且つ配列表の配列番号１または３に記載のアミノ
酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失ま
たは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質を含むもの
である。

【００１９】アミノ酸の置換、欠失又は付加は、たとえ
ば部位特異的突然変異誘発(site directed mutagenesi
s)によって塩基配列に変異を起こさせることにより行う
ことができる。具体的には、所望の変異（ミスマッチン
グ）を有する他は変異を受けるべきＤＮＡに相補的な合
成オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡの塩基配列の一
部を所望の配列に置換させること、所望の配列を欠失又
は付加することが可能である。更には、部位特異的突然
変異誘発を２ないし３回繰り返すことにより、より大き
な範囲の塩基配列を置換、欠失または付加することも可
能であり、又は塩基配列の離れた部位に同時に変異を起
こさせることも可能である。また、塩基配列の置換、欠
失又は付加は、遺伝子を突然変異誘発剤で処理する方
法、又は、遺伝子を選択的に開裂し次いで選択されたヌ
クレオチドを除去及び／又は付加しそして遺伝子を連結
する方法により行うことも可能である。

【００２０】本発明のＴＩＰ４９またはＴＩＰ４９の変
異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、縮重による全
ての塩基配列からなるものである。ＤＮＡのセンス鎖ま
たはＲＮＡについては、その塩基配列と相補な塩基配列
からなるアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ
がそれぞれ存在する。本明細書では、特に断りがない限
り、ＤＮＡまたはｃＤＮＡとはセンス鎖とアンチセンス
鎖の二本鎖からなるものを指し、ＲＮＡとは一本鎖を指
し、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡとは
一本鎖を指す。

【００２１】本明細書においては、ポリヌクレオチドと
は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、またはそれらにさらに塩基、リ
ン酸、糖からなるヌクレオチドが１又は複数結合したも
のをいい、天然に存在するもの又は天然に存在しないも
ののいずれも含む。アンチセンスポリヌクレオチドにつ
いても同様である。本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チドには、その立体構造や機能がポリヌクレオチドと類
似する誘導体が全て含まれる。例えば、ポリヌクレオチ
ドの３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合したも
のやポリヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくとも
いずれか一部において置換や欠失や付加の修飾が生じた
もの、天然に存在しないような塩基、糖、リン酸を有す
るものや、糖−リン酸骨格以外の骨格を有するものであ
る。該アンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体
は、ＴＩＰ４９またはＴＩＰ４９の変異体をコードする
ポリヌクレオチドのコード領域のいかなる部分にハイブ
リダイズするものであってもよい。なお、ｍＲＮＡの一
部に対して相補的な塩基配列を有し、該ｍＲＮＡにハイ
ブリダイズするものが好ましい。

【００２２】アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシン
グ段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝情報を担うＤＮＡ又はｍＲＮＡに結
合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白
質の生合成を阻害することにより該蛋白質の発現を調節
すると考えられている。ハイブリダイズのし易さの点で
は、一般的には、ステムループを形成している領域の塩
基配列に相補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌク
レオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド誘導体を設
計するとよいとされている（『臨床免疫２５巻』１２０
０〜１２０６頁、１９９３年）。

【００２３】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなポリヌクレオチドは、一般に
高い発現抑制効果が期待できる（『癌と化学療法２０
巻１３号』１８９９〜１９０７頁）。したがって、本発
明のアンチセンスポリヌクレオチド又はその誘導体であ
って、ＴＩＰ４９遺伝子又はＴＩＰ４９をコードするｍ
ＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キ
ャッピング部位、スプライス部位の相補的な配列を含む
ものは、高い発現抑制効果が期待される。誘導体として
は、現在一般に知られている誘導体のうち、ヌクレアー
ゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも
一つが高められた誘導体であることが好ましく、特に好
ましくは、当該誘導体は、フォスフォロチオエート結合
を骨格構造として有する誘導体である。本発明のアンチ
センスポリヌクレオチド及びその誘導体についても、こ
れらの機能又は構造を有する誘導体が含まれる。

【００２４】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及
びその誘導体の製造は慣用の方法を用いて行うことがで
きる。例えば、天然型のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学
合成機を使用して合成したり、ＴＩＰ４９遺伝子を鋳型
としてＰＣＲ法を行うことにより本発明のアンチセンス
ポリヌクレオチドを得ることができる。また、メチルフ
ォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導
体の中には、化学合成機（例えば、パーキンエルマージ
ャパン社製３９４型）を使用して合成できるものもあ
る。この場合には、化学合成機に添付されている説明書
にしたがって操作を行い、得られた合成産物を逆相クロ
マトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製するこ
とによって、目的のアンチセンスポリヌクレオチド又は
その誘導体を得ることができる。本発明のポリヌクレチ
ドまたはアンチセンスポリヌクレオチドの全長またはそ
の一部はＴＩＰ４９遺伝子を検出するためのプローブと
して用いることができる。

【００２５】さて、ヒトの蛋白質の種類は３×１０⁹個
といわれている。１６塩基のＤＮＡは４¹⁶種類存在する
ので、この長さのＤＮＡであればヒトの全ての蛋白質を
特異的に識別できると考えられる。すなわち、プローブ
として必要な長さは理論的には１６塩基である。実用上
もこの長さ以上であることが望ましいことは言うまでも
ないが、実用的には１２塩基以上で用いられることが多
い。また、プローブとして用いる箇所は、非コード領
域、コード領域のいずれも使用可能である。ポリヌクレ
オチドの立体構造によりＧＣ含有率が３０ないし７０％
であるものがハイブリダイズし易い点で好ましい。プロ
ーブとして用いる本発明のポリヌクレオチド又はアンチ
センスポリヌクレオチドは、標識化しておくことで、該
ポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドを
検出することが可能となる。標識の手段としては、放射
性同位元素（ＲＩ）、蛍光物質（ＦＩＴＣやローダミン
等）、酵素又はアビジン若しくはビオチンを用いること
が好ましい。特に、ＲＩを用いることが好ましい。

【００２６】ＴＩＰ４９遺伝子を検出する方法としては
具体的には、ノーザンブロットハイブリダイゼーション
法やＲＴ−ＰＣＲ法（『ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ』
（ＧｒｅｅｕｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−ＪｕｔｅｒＳｃｉｅ
ｎｃｅ）Ｃｈａｐｔｅｒ１５）又はインサイチュハイブ
リダイゼーション法（同書Ｃｈａｐｔｅｒ１４）が挙げ
られる。なお、ハイブリダイズの条件は、プローブの長
さや使用するメンブランにより最適な条件が異なる。つ
まり、ハイブリダイズ条件は自ずから或る幅をもつもの
である。本発明の実施例では、使用したメンブランの性
質と得ようとしたプローブの長さにおける最適な条件を
開示するものであり、メンブランやプローブの長さが異
なれば当然異なるハイブリダイズ条件でもハイブリダイ
ズし得る。例えば、ピロリン酸ナトリウムがなくてもハ
イブリダイズする場合もある。その範囲としては、目安
として以下の条件が挙げられる。

【００２７】ハイブリダイズ条件：プレハイブリダイゼーション６以上１０以下ｘＳＳＣ５以上１０以下ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ０．１％以下ピロリン酸ナトリウム約１００μｇ／ｍｌ熱変性ＤＮＡ０．１以上１％以下ＳＤＳ総液量約５０ｍｌ反応温度３５以上３７℃以下反応時間５０以上７０分間ハイブリダイゼーション６以上１０以下ｘＳＳＣ５以上１０以下ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ０．１％以下ピロリン酸ナトリウム約１００μｇ／ｍｌ熱変性ＤＮＡ１ｘ１０⁵以上２ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ以下ｃＤＮＡプロ
ーブ反応温度３５以上４２℃以下反応時間１２時間以上２０時間以下

【００２８】ＤＮＡ又はＲＮＡを化学合成するときに、
側鎖をメチル化すること、あるいはビオチン化するこ
と、またはリン酸基部分のＯをＳ置換すること等の化学
的に修飾することはよく知られている。例えば、配列表
の配列番号２又は４に記載のＤＮＡを化学合成するとき
に、該化学修飾を行い、配列表に示されたＤＮＡそのも
のとは異なるＤＮＡ（誘導体）を合成することが可能で
ある。したがって、本発明のＤＮＡ及びＲＮＡは、上記
の化学修飾された、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはアンチセンス
ポリヌクレオチドをその範囲に含むものである。本発明
においては、化学修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡは、蛋
白質をコードする機能またはプローブとしての機能のい
ずれかを発揮可能なものであれば特に問題なく、また化
学修飾されたアンチセンスポリヌクレオチドは、プロー
ブまたは蛋白質の生合成を阻害する機能またはプローブ
としての機能のいずれかを発揮可能なものであれば特に
問題なく使用可能である。なお、標識化は化学修飾に含
まれる。

【００２９】本発明は、ＴＩＰ４９の抗原性について、
実施例５に例示するように、該ＴＩＰ４９が由来する動
物以外の動物に免疫することで容易に抗体が得られるも
のであることを明らかにするものである。したがって、
本発明のＴＩＰ４９を認識する抗体は、ＴＩＰ４９を該
ＴＩＰ４９が由来する動物以外の動物に免疫感作するこ
とにより得られる抗血清及びポリクローナル抗体であっ
て、該抗体が本発明のＴＩＰ４９を認識することがウェ
スタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法や免疫染色法（例えば
ＦＡＣＳでの測定）等により確認されるものをその範囲
内に含む。

【００３０】また、免疫原として、蛋白質の一部、又は
該蛋白質の一部をウシ血清アルブミンなどの他のキャリ
アー蛋白質に結合させたものを用いることはよく行われ
る方法である。該蛋白質の一部は、例えばペプチド合成
機を用いて合成してもよい。なお、蛋白質の一部として
は、８アミノ酸残基以上であることが好ましい。抗原性
が明らかとなった物質については、免疫感作によってポ
リクローナル抗体が得られるならば、該免疫した動物の
リンパ球を用いたハイブリドーマによりモノクローナル
抗体が産生されることはよく知られている（『Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８８）Ｃｈａｐｔｅｒ
６）。したがって本発明のＴＩＰ４９を認識する抗体は
モノクローナル抗体もその範囲内に含むものである。

【００３１】本発明においては、抗体は活性フラグメン
トをも包含するものである。活性フラグメントとは、抗
原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、
具体的には、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ
などを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をペ
プシンで分解するとＦ（ａｂ’）₂が得られ、パパイン
で分解するとＦａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）₂を２−
メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノヨー
ド酢酸でアルキル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた
一価の抗体活性フラグメントである。これらの活性フラ
グメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメ
ントに置換することでキメラ抗体が得られる。

【００３２】ＴＩＰ４９の検出については、抗体を用い
る方法、酵素反応を利用する方法が挙げられる。抗体を
用いる方法としては具体的には、ＴＩＰ４９を認識す
る抗体を用いてＴＩＰ４９を検出する方法、ＴＩＰ４
９を認識する抗体および該抗体の標識二次抗体を用いて
ＴＩＰ４９を検出する方法が挙げられる。標識として
は、例えば放射性同位元素（ＲＩ）、酵素、アビジン又
はビオチン、もしくは蛍光物質（ＦＩＴＣやローダミン
等）が利用される。

【００３３】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ＥＬＩＳＡが挙げられる。

【００３４】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。＜実施例１＞ＴＩＰ４９遺伝子の単離及びＴＩＰ４９の
アミノ酸配列の決定１．ラット核抽出液の調製『バイオマニュアルシリーズ５転写因子研究法』ｐｐ
２７〜３７（１９９３年、羊土社）に記載の方法の通り
にラット肝細胞核抽出液を２５ｍｌ調製した。具体的に
は、以下のようにして行った。各操作は、４℃にて行っ
た。ラットより肝臓（２０ｇ）を摘出し、冷ＰＢＳにつ
け、その後ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、組織をハサ
ミできざみ、ホモジェナイザーに移した後、ショ糖溶液
Ｉ（１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１５ｍＭ
ＫＣｌ、０．１５ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペ
ルミジン、１ｍＭＥＤＴＡ、２．２Ｍショ糖、５％
グリセリン、０．５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭ
ＳＦ、１４μｇ／ｍｌアプロチニン）を６０ｍｌ加え
ホモジェナイズした。遠心チューブにショ糖溶液ＩＩ
（１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１５ｍＭＫ
Ｃｌ、０．１５ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペル
ミジン、１ｍＭＥＤＴＡ、２Ｍショ糖、１０％グリ
セリン、０．５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭＳＦ、
１４μｇ／ｍｌアプロチニン）を１０ｍｌ入れ、その
上にホモジェナイズして得た試料を重層し、２４，００
０ｒｐｍで５０分間遠心した。沈殿を５ｍｌの核溶解液
（１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ
ＫＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセリン、
３ｍＭＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭ
ＰＭＳＦ、１４μｇ／ｍｌアプロチニン）に懸濁
し、全容量を測定した。この液の２６０ｎｍの吸光度を
測定し、ＤＮＡ濃度を、０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌに調
製した。ＫＣｌを終濃度が０．５５Ｍになるように加
え、ゆっくり混合した後、１５分間振とうし、核を溶解
した。次いで、４０，０００ｒｐｍで６０分間遠心し
た。遠心上清を回収し、硫酸アンモニウムを液量１ｍｌ
に対し０．３ｇ加えて硫安沈殿を行い、３５，０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心した。上清を捨て、沈殿を少量
（０．２〜０．５ｍｌ）の透析液（２５ｍＭＨｅｐｅ
ｓ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、４０ｍＭ
ＫＣｌ、１０％グリセリン、１ｍＭＤＴＴ）に溶か
し、溶解液をさらに上記の透析液に透析した。透析終了
後、再び遠心（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を行い、
上清を回収し、蛋白質濃度を２６０ｎｍ及び２３０ｎｍ
の吸光度を測定することにより１０ｍｇ／ｍｌに調節し
て核抽出液を得た。得られた核抽出液は、使用まで−８
０℃にて保存した。

【００３５】『バイオマニュアルシリーズ５転写因子
研究法』ｐｐ２１５〜２１９（１９９３年、羊土社）に
記載の方法を基としてラット肝細胞核抽出液から蛋白質
を単離した。実際には、ＴＦＩＩＤ画分の代わりにラッ
ト肝細胞核抽出液を用いた。２．二次元電気泳動１）上記ラット肝細胞核抽出液をニッケルカラム（Ｎｉ
−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）１ｍｌをプレップ
カラム（バイオラッド社製）に詰めたもの）に通すこと
で処理したもの８００μｌとＨＸｍＴＢＰ−Ｃ（ヒスチ
ジンを６コつないだタグを有するマウスＴＢＰのＣ末端
部分蛋白質（Nucleic Acids Res. 22, 1179-1185(1994
年）参照）２４０μｌを４℃で１２時間反応させた後、
反応液に５０％スラリーのニッケルＮＴＡＰアガロース
（キアゲン社製）８０μｌを加え、４℃で１時間反応さ
せた。２）上記で生成した反応物質（ゲル）を取り、ＮＰ０．
１（２０）（２５ｍＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．
９）、１０％グリセロール、０．１ＭＫＣｌ、０．５
ＭＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、２０ｍＭイミダゾ
ール塩酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭＰＭＳＦ、０．５ｍ
Ｍ２ＭＥ）緩衝液で洗浄した後、８Ｍ尿素溶液（８Ｍ
尿素、０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０．０１ＭＴｒｉ
ｓ）１００μｌで２０分間溶出することを４回繰り返し
た。３）溶出液に１／４容量のＴＣＡ溶液（１００％（ｗ／
ｖ）ＴＣＡ、４ｍｇ／ｍｌデオキシコール酸）を加え４
℃で３０分間放置した後、１５０００ｒｐｍで３０分間
遠心した。４）遠心分離後、上清を取り除き、沈殿を１００％のア
セトン１ｍｌで３回洗浄した。５）アセトンを真空ポンプを用いて吸引して取り除いた
後、５μｌの８Ｍ尿素溶液と１μｌの２Ｄサンプル溶液
（１．７％ＳＤＳ、３．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、
２．４Ｍ２−メルカプトエタノール、１／３容量のＢ
ｉｏ−Ｌｙｔｅ３／１０（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））で沈
殿を懸濁し、これをサンプルとして等電点電気泳動用の
チューブゲルに乗せた。６）サンプルにサンプル保護溶液（２％ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００、１／２０容量のＢｉｏ−Ｌｙｔｅ３／１０）
を５μｌ重層した。上部泳動液として０．１ＮＮａＯＨ
溶液、下部泳動液として０．０６％Ｈ₃ＰＯ₄溶液を用
い、４００Ｖで１０分間、８００Ｖで４５分間泳動し
た。７）泳動後、ゲルを取り出しＳＤＳ還元溶液（１２５ｍ
ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロ
ール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．７２Ｍ２−メルカ
プトエタノール、０．００１２５％（ｗ／ｖ）ブロモフ
ェノールブルー）に１０分間浸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ用スラブゲルに乗せて、３５ｍＡで３時間、電気泳動
を行った。８）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、エレクトロブロッティング
装置（日本エイドー製）を用いて、常法によりゲルから
メンブラン（ミリポア製）に蛋白質を転写した。その後
クマシーブリリアントブルー染色した。二次元電気泳動
の結果を図１に示す。

【００３６】３．ラット核抽出液中蛋白質の部分アミノ
酸配列の決定メンブランに転写された各ドットの部分をカッターナイ
フを用いて切り出し、これをリジルペプチダーゼ消化
後、高速液体クロマトグラフィーで各ペプチド断片に分
画し、そのうち一つをプロテインシークエンサー（ベッ
クマン製）で解析した。図１において矢印で指し示した
ドットから未知のアミノ酸配列（下記配列ないし）
からなるペプチド断片が４つ得られた。ＭＫＩＥＥＶＫＳＴＴＫＱＡＡＳＧＬＶＧＱＥＮＡＥＶＹＥＧＥＶＴＥＬＩＬＡＤＱＱＤ

【００３７】４．ラット肝細胞核抽出液中蛋白質に対応
するＤＮＡプローブの合成１）上記のアミノ酸配列に基づいて下記配列又は
の塩基配列で表されるＤＮＡプローブを、上記のアミ
ノ酸配列に基づいて下記配列の塩基配列で表されるＤ
ＮＡプローブを、ＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ製）を用いて
合成した。 GCIGATCAIC AIGATCGITA CATG GCICATCAIC AIGATAGRTA CATG GAIGTITATG AIGGIGAIGT なお、A はアデニン、T はチミン、G はグアニン、C は
シトシン、I はイノシン、R はアデニンまたはグアニン
である各塩基を表す。

【００３８】２）上記配列ないしで表されるＤＮＡ
プローブをＴａｋａｒａＭＥＧＡＬＡＢＥＬキット
（登録商標、宝酒造社製）を用いて取扱説明書の通りに
標識した。３）次に、下記の組成のＤＮＡ反応液を調製し、この液
を３７℃で３０分間インキュベートした後、７０℃で１
０分間熱処理し、酵素を失活させた。ＤＮＡプローブ（２ｐｍｏｌ／μｌ）３μｌ１０倍ホスホライレイション緩衝液３μｌ〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（３７０ＭＢｑ／ｍｌ）（アマシャム製）５μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌ合計１０μｌ４）Ｔ５０Ｅ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．
０，１ｍＭＥＤＴＡ）で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５（登録商標、ファルマシア社製）を１．５ｍ
ｌポリプレップカラム（バイオラッド社製）にベッドボ
リュームが１ｍｌになるように詰め、３）で熱処理をし
たＤＮＡ反応液を該カラムに載せた。５）その後、２００μｌのＴ５０Ｅをカラムに４回流
し、２回目の２００μｌで溶出してきた画分をＤＮＡプ
ローブ画分として以後の操作に用いた。

【００３９】５．ラット肝細胞核抽出液中蛋白質に対応
するＤＮＡプローブを用いたラット肝臓ｃＤＮＡライブ
ラリーからの遺伝子の取得１）ウィスター系ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、
タイムセイバーｃＤＮＡシンセシスキット（登録商標、
ファルマシア社製）を用いて常法により作製した。該ｃ
ＤＮＡライブラリーを用いて１０⁶程度のプラークをＮ
ＺＹ寒天培地上に作製した。このｃＤＮＡライブラリー
を『ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎ
ｄＥｄｉｔｉｏｎ』（１９８９年、ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ）Ｃｈａｐｔｅｒ９に記載の方法に従ってニトロセル
ロース膜（ミリポア社製）上に固定した。その後、この
膜を２×ＳＳＣで６０℃で洗浄した。

【００４０】２）４．で得られた標識化ＤＮＡプローブ
画分のうち１５０μｌを、該膜上に固定したプラークの
ｃＤＮＡプローブと以下の条件でハイブリダイズさせ
た。プレハイブリダイゼーション６×ＳＳＣ５×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ０．０５％ピロリン酸ナトリウム１００μｇ／ｍｌｄｅｎａｔｕｒｅｄｈｅｒｒｉｎ
ｇｓｐｅｒｍＤＮＡ０．５％ＳＤＳ総液量５０ｍｌ反応温度３７℃ 反応時間１時間ハイブリダイゼーション６×ＳＳＣ１×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ０．０５％ピロリン酸ナトリウム１００μｇ／ｍｌｄｅｎａｔｕｒｅｄｈｅｒｒｉｎ
ｇｓｐｅｒｍＤＮＡ１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌｃＤＮＡプローブ総液量５０ｍｌ反応温度４２℃ 反応時間１８時間

【００４１】３）ハイブリダイズの終了したニトロセル
ロース膜を以下の条件で１回ずつ洗浄した。６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ５００ｍｌ温度４０℃ 時間２０分間３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ５００ｍｌ時間４２℃ 時間２０分間４）洗浄したニトロセルロース膜はＫＯＤＡＫＸＡＲ
５フィルムに−８０℃で一晩露光し、オートラジオグラ
フとした。５）得られたオートラジオグラフから、陽性のプラーク
の位置を決定し、対応する寒天上のプラークをＳＭ溶液
（０．１ＭＮａＣｌ、０．１６ＭＭｇＳＯ₄、５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼ
ラチン）に回収した。６）回収したプラークは、常法により再度ＮＺＹ寒天培
地上にプラーク形成を行わせ、ニトロセルロース膜上に
固定した。７）２）〜６）の過程を３回繰り返した。その結果、陽
性のプラークは単一なものとなった。該プラークを回収
し、１００μｌのＳＭ溶液に懸濁し、ファージを安定化
させた。該プラークから単離した遺伝子をＴＩＰ４９遺
伝子と名付けた。

【００４２】６．ＴＩＰ４９遺伝子の大量調製１）ＳＭ溶液に懸濁したプラークのファージ５０μｌと
Ｙ１０９０ｒ−大腸菌２０μｌを混合し、３７℃、１５
分間放置した。２）その後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１０
ｍｌＮＺＹ培地に１）で混合した溶液を移し、３７℃で
６時間培養した。３）８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を回収し
た。４）該上清に、５ＭＮａＣｌを１ｍｌ、ポリエチレン
グリコール６０００を１．１ｇを加え、溶かした。５）該溶液を氷上に１時間置き、その後１００００ｒｐ
ｍ、４℃で２０分間遠心分離を行った。６）沈殿を回収し、７００μｌのＳＭ溶液に懸濁した。７）クロロホルムを５００μｌ加えて攪拌し、残った大
腸菌を溶かした。８）５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、水層を回収
した。

【００４３】９）これに、１ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ
Ａ、５ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ（共にシグマ製）を各
１μｌずつ加え、３７℃で１時間放置したのち、２０％
ポリエチレングリコール６０００（０．８ＭＮａＣ
ｌ）を６００μｌ加え、氷上に３０分間放置した。１０）４℃で、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し
た後、沈殿を回収した。１１）この沈殿に５００μｌのＳＭ溶液、５０μｌの５
ＭＮａＣｌ、５０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加え、
更に、４００μｌのフェノールを加えて攪拌し、ファー
ジを溶かしてｃＤＮＡを遊離させた。１２）該溶液を室温で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分
離した後、水層を回収した。これに１ｍｌのエタノール
を加え、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、液層
を捨てた。１３）７０％エタノール１ｍｌで沈殿を洗浄し、１００
μｌのＴＥ溶液（Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．０１０ｍ
Ｍ、１ｍＭＥＤＴＡ）に沈殿を溶かし、ＤＮＡ溶液を
得た。

【００４４】７．ＴＩＰ４９遺伝子のベクターへの挿入１）ＤＮＡ切断の系を以下のようにし、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造製）によるＤＮＡ切断を行った。ＤＮＡ溶液（６．で調製したもの）２０μｌＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ社製）２μｌＲＮａｓｅＡ（日本ジーン社製）１μｌ１０×Ｈｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）１０μｌ滅菌水６７μｌ合計１００μｌ反応温度３７℃ 反応時間４時間２）その後、０．７％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース
（登録商標、宝酒造社製）電気泳動を行い、１．６ｋｂ
ｐ付近のＤＮＡを切り出し、このＤＮＡをＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮＩＩ（登録商標、フナコシ社製）を用いて取
扱説明書の通りにＤＮＡを回収した。

【００４５】３）ＤＮＡを組み込むｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩ（ストラタジーン社製）をＥｃｏＲＩで切断後
脱リン酸化を行った。ＥｃｏＲＩでの切断は、以下の系で行った。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（１μｇ／μｌ）３μｌ１０×Ｈｂｕｆｆｅｒ２μｌＥｃｏＲＩ２μｌ滅菌水１３μｌ合計２０μｌ反応温度３７℃ 反応時間一晩

【００４６】その後、２μｌ１ＭＴｒｉｓｐＨ
８．０を加え、１μｌＢａｃｔｅｒｉａｌＡｌｋａ
ｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を加
え、６５ ℃で１時間放置し、脱リン酸化した。その後、フェノール／ＣＨＣｌ₃抽出を常法に従い２
回行い酵素を失活させた後、エタノール沈殿により精製
し、ＴＥ溶液にて１００μｇ／μｌに溶かした。２）で得られたＤＮＡと、で得られたｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩを、以下の系で反応させ、ＤＮＡをベク
ターに挿入した。ＤＮＡ（１．６ｋｂｐ、２）で調製したもの）５μｌｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＮｏｔＩ切断物（で調製したもの）１μｌ１０倍ライゲーションバッファー（日本ジーン社製）２μｌＴ４リガーゼ（日本ジーン社製）１μｌ滅菌水１１μｌ合計２０μｌ反応温度１６℃ 反応２時間

【００４７】８．ＴＩＰ４９遺伝子の大腸菌への導入常法に従い反応液を全て、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９コン
ピテントセル（宝酒造社製）に混合し、氷上で３０分
間、４２℃で４５秒間、氷上で３分間反応させた後、Ｓ
ＯＣ培地９００μｌを加え、３７℃で１時間置き、ベク
ターをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に導入した。その後、
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を回収した。なお、このＴＩＰ
４９遺伝子を導入した組み換え体大腸菌を工業技術院生
命科学研究所に寄託した（受託番号ＦＥＲＭＰ−１６
２８２）。

【００４８】９．ＴＩＰ４９遺伝子の塩基配列の決定１）８．で回収したＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９をＬＢ寒天
培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭＩＰ
ＴＧ、０．００４％Ｘ−ｇａｌ含有）に撒き、３７℃で
１６時間培養した。２）形成されたコロニーのうち、白色のコロニーを２ｍ
ｌＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植
え、３７℃で１６時間培養した３）その後、１２０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して集
菌し、ＭａｇｉｃＭｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標、プロ
メガ社製）に従いプラスミドＤＮＡ溶液を回収した。４）回収したＤＮＡをダイターミネータＦＳシークエン
スキット（パーキンエルマー社製）およびオートシーク
エンサーＡＢＩ３７３９を用いて、シークエンスし、全
塩基配列を決定した。結果を配列表の配列番号２に示
す。

【００４９】１０．ＴＩＰ４９のアミノ酸配列の決定９．で決定した塩基配列から、ＴＩＰ４９のアミノ酸配
列を決定した。結果を配列表の配列番号１に示す。ま
た、図２にＴＩＰ４９蛋白質のアミノ酸配列およびＴＩ
Ｐ４９遺伝子の塩基配列を示す。図２中、下線を付した
部位が３．でペプチドシークエンスした配列ないし
の部位である。また、枠で囲った部位が、ＡＴＰａｓｅ
およびＤＮＡヘリケース（ｈｅｌｉｃａｓｅ）に特徴的
な配列の部位である。さらに、ＴＩＰ４９蛋白質は原核
生物が発現するＲｕｖＢ蛋白質と高いホモロジーを有す
ることが分かった。ＲｕｖＢ蛋白質はＤＮＡを組み換え
および修復する蛋白質である。図３にＴＩＰ４９蛋白質
および遺伝子とＲｕｖＢ蛋白質および遺伝子とのホモロ
ジーを示す。図中のかっこ内の数字は蛋白質のホモロジ
ーを示し、かっこのつかない数字は遺伝子のホモロジー
を示す。動物細胞由来の蛋白質が原核生物の蛋白質と高
いホモロジーを有する前例はほとんどない。また、４．
で用いたないしのプローブが結合した部位は、それ
ぞれ、及びが塩基配列の１３７２番〜１３９５番、
が４１５番〜４３４番の相補鎖の配列部位であると推
測される。

【００５０】＜実施例２＞ＴＩＰ４９遺伝子のラット肝
臓癌発癌状態での発現の確認１．各種ラット肝臓の調製１）５週齢のウィスター系ラット１０匹を購入し、うち
７匹にＤＮＡ障害性薬物であるＤＥＮ（ジエチルニトロ
ソアミン）を０．２ｍｇ／ｇラットの濃度で腹腔内投与
し、１２，２４，４８時間後に各１匹ずつラットを殺
し、肝臓を採取し、液体窒素中で保存した。２）残りのＤＥＮ投与ラットは、２週間後、ＡＡＦ（ア
ミノアセチルフルオレン）を０．０２％含むエサの継続
的経口投与（１回／日）を開始した。ＤＥＮを投与して
いないラット３匹について、再生肝手術を行い、１２，
２４，４８時間後に肝臓を採取し、液体窒素中で保存し
た。

【００５１】２．ＲＮＡの調製『ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８９）
ｐｐ７．３−７．８４に記載のチオシアン酸グアニジン
法に従い、各種ラット肝臓のＲＮＡを調製した。実際に
は、各種ラット肝臓１ｇをそれぞれ液体窒素中で粉砕し
た後、５０ｍｌの５．５Ｍチオシアン酸グアニジン液に
加えホモジナイズした後、プロトコール通りに超遠心分
離を行い、さらに精製を行いＲＮＡ標品を得た。また得
られたＲＮＡ標品は、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３ｓｕ
ｐｅｒ（登録商標、宝酒造社製）を用いて製品説明書の
方法に従い、ｐｏｌｙＡＲＮＡに精製した。

【００５２】３．プローブＤＮＡの調整ＴＩＰ４９遺伝子を用いてハイブリダイゼーション用の
プローブを作製した。作製方法は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩ上にのせたＴＩＰ４９遺伝子を制限酵素処理に
て、ＴＩＰ４９遺伝子部分を切り出し、アガロースゲル
電気泳動にて目的遺伝子を分離後、ＧＥＮＥＣＬＥＡ
ＮＩＩ（登録商標、フナコシ社製）を用いてＴＩＰ４
９遺伝子を精製した。精製したＴＩＰ４９遺伝子を１０
０ｎｇ用いて、ランダムプライムドＤＮＡラベリングキ
ット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて製品取扱
説明書に従いα−Ｐ³²ｄＣＴＰ（アマシャム社製）を用
いてＤＮＡプローブを作製し、次のノーザンブロットハ
イブリダイゼーションに用いた。

【００５３】４．ノーザンブロットハイブリダイゼーシ
ョン１）『ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏ
ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８
９）ｐｐ７．３−７．８４に記載のノーザンブロット法
（ホルムアルデヒド法）に従いノーザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。ＤＮＡプローブとして３．
で調整したものを用いた。実際には、サンプル調製時の
ＲＮＡはｐｏｌｙＡＲＮＡ３００ｎｇを用いた。ま
た、オートラジオクラフィーの感光時間は４８時間とし
た。２）１．〜４．１）の操作により図４に示すＴＩＰ４９
遺伝子発現のパターンが得られた。図４から、ＤＥＮ投
与したラットの肝臓のみが正常ラットの肝臓に比してド
ットが濃くなっている（ｍＲＮＡの発現量が増加してい
る）ことが判明した。ＤＥＮはＤＮＡ障害を引き起こす
物質であることからＴＩＰ４９遺伝子はＤＮＡ障害時に
増加する遺伝子であることが分かった。したがって、Ｔ
ＩＰ４９遺伝子を用いてＤＮＡ障害を検出すること可能
であると考えられる。

【００５４】＜実施例３＞ＴＩＰ４９遺伝子の組織間分
布の確認組織間分布の確認には、ＲａｔＭＴＮＢｌｏｔ（登
録商標、クローンテック社製）を用いた。この製品は、
上述のノーザンブロットハイブリダイゼーションを行う
ために市販されている、ラット各組織のｐｏｌｙＡＲ
ＮＡをブロットしたメンブランである。このメンブラン
を実施例２と同様にしてノーザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行った。オートラジオクラフィーの感光時
間は９６時間とした。その結果を図５に示す。結果から
明らかなように、ＴＩＰ４９遺伝子は精巣（Ｔｅｓｔｉ
ｓ）、骨格筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ）、心
臓（Ｈｅａｒｔ）および腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）で強く発
現しているが、全組織で発現がみられる普遍的な遺伝子
であることが判明した。

【００５５】＜実施例４＞ＴＩＰ４９の大量調整１．ＴＩＰ４９遺伝子の大量調整１）組み換えベクターの作製ＴＩＰ４９遺伝子を図６に示されるヒスチジンタグを導
入したｐＥＴ３ａ−Ｈｉｓベクター（インビトロゲン社
製）に組み込んだ。以下に、その詳細を記す。まず、実施例１の７．で作製したＴＩＰ４９遺伝子を
挿入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを、ＰＣ
Ｒ法（『Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｇｒｅｅｎｅ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）
ｃｈａｐｔｅｒ１５に記載）により、次の配列および
配列の塩基配列のプライマーを用いて、該ＴＩＰ４９
遺伝子部分を増幅した。配列CGAATTCATG AAGATTGAGG AGGTGAAGAG CACC 配列CATACCCACC CATGGGGTTC TCTGTCTCAC 配列の５’端からの７塩基はＥｃｏＲＩサイトであ
る。増幅された遺伝子をＮｃｏＩ，ＥｃｏＲＩで切断し
た。別に、実施例１の７．で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩ上のＴＩＰ４９遺伝子のＣ末端側に存在する部
分をＥｃｏＲＩで切断し、遺伝子を切り出した。で切り出した遺伝子とで切り出した遺伝子とを、
ＬｉｇａｔｉｏｎＰａｃｋ（日本ジーン社製）を用い
てその取扱説明書に従い連結し、ＴＩＰ４９遺伝子を作
製した。ヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａ−Ｈｉｓベクタ
ーのＥｃｏＲＩ部位に、で作製したＴＩＰ４９遺伝子
を組み込んだ（図６）。

【００５６】２）ＴＩＰ４９遺伝子の大量調整ＴＩＰ４９遺伝子を組み込んだプラスミドを『Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔ
ｉｏｎ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９）ｃｈａｐ
ｔｅｒ１に記載の方法で大量調製した。プラスミドはＪ
Ｍ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）に取扱説明書
に従って導入し、８００ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
培地で一晩培養し、回収したＪＭ１０９よりアルカリ法
（『ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎ
ｄＥｄｉｔｉｏｎ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８
９）１．３３−１．４３に記載）によりプラスミドを回
収した。なお、プラスミドの精製には同書記載の超遠心
分離を用いたが、その回数は３回行った。

【００５７】２．ＴＩＰ４９の発現（１）大量調製したプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳに導入した。（２）該大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ培地で培養し、分光光度計（ベックマン製）で濁度
が６００ｎｍの波長で０．５になった時点でＩＰＴＧを
０．５ｍＭになるように加え、ＴＩＰ４９の発現誘導を
行った。対照として、ＩＰＴＣを添加しない場合も行っ
た。

【００５８】３．ＴＩＰ４９の精製（１）２時間後、大腸菌を回収し、ＬｙｓｉｓＢｕｆ
ｆｅｒに懸濁した後４℃でソニュケーションし、Ｂｅｃ
ｋｍａｎＯｐｔｉｍａＸＬ−８０を使用し、５０．
２Ｔｉローターで１８００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心
分離した。（２）その後、上清を取り、１Ｍイミダゾール（ｐＨ
７．５）を終濃度１０ｍＭになるように加え、Ｎｉ−Ｎ
ＴＡアガロースカラム（キアゲン製）を用いて非変性条
件で取扱い説明書の通りに精製した。これとは別に、イ
オン交換カラムＭｏｎｏＱ（登録商標、ファーミンゲン
社製）を用いた液体クロマトグラフィー｛ベースの緩衝
液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０
％グリセロール、５ｍＭ２−ＭＥ、０．５ｍＭＰＭ
ＳＦ）、溶出液（ＫＣｌ０．０４−０．４Ｍのグラジ
ェント）｝にて、製品説明書記載の方法に準じてＴＩＰ
４９の精製を行った。（３）精製された標品を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動にかけ、クマシーブリリアントブルーで染色した。
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムによる精製の結果を図７
に示す。図７中、ｌｙｓａｔｅ（−）はＩＰＴＣを添加
しなかった細胞溶解液を電気泳動したものであり、ｌｙ
ｓａｔｅ（＋）はＩＰＴＣを添加した細胞溶解液を電気
泳動したものである。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム、
ＭｏｎｏＱのいずれにも４９ｋＤの位置にＴＩＰ４９の
バンドが確認された。また、ＭｏｎｏＱのカラムパター
ンと精製蛋白質の電気泳動（クマシー染色）の結果を図
８に示す。図８（ａ）に溶出パターンを、図８（ｂ）に
精製蛋白質の電気泳動の結果を示す。ＫＣｌ濃度が約
０．２Ｍ（第４３画分）でＴＩＰ４９が溶出されること
が分かった。

【００５９】＜実施例５＞抗ＴＩＰ４９抗体の作製（１）抗体の作製は、実施例４で得た精製ＴＩＰ４９
１ｍｇを用いて、『ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ』（ＣｏｌｄＳｐｒｏｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）
ｃｈａｐｔｅｒ５に記載の方法に従い、ウサギに免疫
し、抗血清を回収した。（２）ラット肝細胞核抽出液、該核抽出液から精製した
ＴＩＰ４９および実施例４でＮｉ−ＮＴＡアガロースカ
ラムで精製した組み換えＴＩＰ４９について、それぞれ
抗ＴＩＰ４９抗体を用いてウェスタンブロット法による
解析を行った。結果を図９に示す。図９中、Ｎｕｃｌｅ
ａｒｅｘｔｒａｃｔは核抽出液のレーンであり、ＴＩ
Ｐｓは核抽出液を精製したＴＩＰ４９のバンドである。
コントロールはＴＩＰ４９を溶出した後のＮｉ−ＮＴＡ
アガロースカラムのビーズのバンドである。４９ｋＤの
位置にＴＩＰ４９のバンドが確認された。ｒＴＩＰ４９
は組み換えＴＩＰ４９のバンドであり、ヒスチジンタグ
の分だけ分子量が大きくなっている。この結果、抗原抗
体反応の確認及び核抽出液から精製したＴＩＰ４９と遺
伝子工学的に発現させたＴＩＰ４９が同じものであるこ
との確認がなされた。

【００６０】＜実施例６＞ＴＩＰ４９がＴＢＰと複合体
を形成することの確認ＨＡタグ付のＴＢＰを動物細胞内で発現させ、ＴＩＰ４
９がＴＢＰと複合体を形成することの確認試験を行っ
た。１．核抽出液の作製１）マウス細胞株ＦＭ３Ａ（理研ジーンバンクＲＣＢ０
０８６）にレトロウィルスベクターを用いてＨＡ−ＴＢ
Ｐ遺伝子を導入し、組み換えＦＭ３Ａ細胞を作製した。２）組み換えＦＭ３Ａ細胞をＥＳ培地（ニッスイ社製）
にＦＣＳを１０％になるように加えた培地１ｌで７×１
０⁵個／ｍｌになるように調製した。３）『バイオマニュアルシリーズ５転写因子研究法』
ｐｐ２７〜３７（１９９３年、羊土社）に記載の方法に
したがって培養したＦＭ３Ａから核抽出液を４ｍｌ
（３．５ｍｇ／ｍｌ）調製した。具体的には、ＦＭ３Ａ
１リットルの培養液を遠心し細胞を回収した後、前記
『バイオマニュアルシリーズ５転写因子研究法』ｐｐ
２７〜３７（１９９３年、羊土社）に記載の条件に準じ
て行った。

【００６１】２．ＴＩＰ４９−ＴＢＰ複合体形成の確認１）抗ＨＡ抗体（バブコ社製）をプロテインＡセファロ
ースビーズ（ファルマシア社製）に結合させ、抗ＨＡ抗
体−ビーズを作製した。２）１．で作製した核抽出液と抗ＨＡ抗体−ビーズを混
合し、『ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ』ｃｈａｐｔｅｒ１１に記載の方法
にしたがって免疫沈降を行った。３）２）で沈降したビーズをＩＰ緩衝液（１ｍｇ／ｍｌ
ＨＡペプチドを含む）で溶出した。４）ＦＭ３Ａ核抽出液（Ｎ．Ｅ）、２）で免疫沈降した
ビーズを遠心分離した上清（ＩＰｓｕｐ．）および
３）で作製した溶出液（Ｅｌｕｔｅ）について、それぞ
れ抗ＴＢＰ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ＴＩＰ４９抗体を用い
て、『Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｇｒｅｅｎｅ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）
ｃｈａｐｔｅｒ１に記載の方法に準じてウェスタンブロ
ット法による解析を行った。なお、ウェスタンブロット
法による解析は、具体的には以下のウエスタンブロッテ
ィングにより行なった。すなわち、トランスファーバッ
ファー（125mM Tris-base, 960mM glycine, 20% methan
ol）に浸したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルと、メタノール
に浸した後トランスファーバッファーに浸したＰＶＤＦ
膜（ミリボア社製、Immobilon）をトランスファーバッ
ファーに浸した３ＭＭ濾紙（ワットマン社製）ではさ
み、平板型転写装置（日本エイドー社製）を用いて１７
０ｍＡで６０分間蛋白質の膜への転写を行った。転写後
の膜を３％スキムミルク（雪印社製）／ＴＢＳＴ（20mM
Tris-Cl pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween20）でブロ
ッキングした。一次抗体には、抗ＴＢＰ抗体、抗ＨＡ抗
体、抗ＴＩＰ４９抗体を、二次抗体にはアルカリフォス
ファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（プロメガ社製）を
用いた。発色反応は、ProtoBlot Western Blot AP Syst
em（プロメガ社製）を用いた。各抗体をアルカリフォス
ファターゼで標識した二次抗体と反応させ、アルカリフ
ォスファターゼを基質（ＮＢＴ、ＢＣＩＤ（共にプロメ
ガ社製））と反応させて、ゲル上に各バンドを呈色させ
た。抗ＴＢＰ抗体は、『ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ』ｃｈａｐｔｅｒ５
に記載の方法にしたがってウサギに免疫して作製した。

【００６２】結果を図１０に示す。図１０中、Ｎ．Ｅ．
（１レーンおよび４レーン）はＦＭ３Ａ核抽出液のレー
ン、ＩＰｓｕｐ．（２レーンおよび５レーン）は免疫
沈降したときの上清、Ｅｌｕｔｅ（３レーンおよび６レ
ーン）は免疫沈降物の溶出液を表す。図１０（ａ）は一
次抗体に抗ＴＢＰ抗体を用いた結果を表し、図１０
（ｂ）は一次抗体に抗ＨＡ抗体を用いた結果を表し、図
１０（ｃ）は一次抗体に抗ＴＩＰ４９抗体を用いた結果
を表す。図１０の右端のレーン（６レーン）にＴＢＰお
よびＴＩＰ４９のレーンが見られ、ＴＩＰ４９とＴＢＰ
が複合体を形成して、抗ＨＡ抗体−ビーズにより免疫沈
降されたことが確認された。

【００６３】＜実施例７＞ＴＩＰ４９のＡＴＰａｓｅ活
性の確認１１）ＭｏｎｏＱで精製した第３８画分から第４７画分の
各画分の溶出液と、γ位のリン（Ｐ）を³²Ｐとして標識
したＡＴＰ（γ−³²ＰＡＴＰ）とを、以下の組成の反
応液で３７℃で６０分間反応させた。２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ７０ｍＭＫＣｌ２．５ｍＭＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）０．１ｍＭＡＴＰ γ−³²ＰＡＴＰ０．１２５μｌＳＰ（滅菌蒸留水）で２０μｌに調製また、別に、Ｍ１３ｓｓＤＮＡを添加して上記反応をさ
せることも行った。

【００６４】２）反応液に、０．１ＮＨＣｌを１００
μｌ、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡを１００μｌ、１０％（Ｗ
／Ｖ）活性炭を２５０μｌ加え、撹拌し、１５分間氷上
に静置した。３）その後、４℃において１５０００ｒｐｍで１５分間
遠心分離し、上清２００μｌを新しいチューブに取り分
けた。４）この上清を４℃において１５０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、上清１００μｌを新しいＰＣＲチューブ
（パーキンエルマー社製）に取り分けた。５）この上清の放射線濃度を、液体シンチレーションカ
ウンター（ベックマン社製）にて、製品の説明書にした
がって測定した。結果を図１１に示す。ＴＩＰ４９によりＡＴＰのγ位の
³²Ｐが切断され遊離し、その放射線が測定されることが
分かる。図１１中白抜きのグラフがＭ１３ｓｓＤＮＡを
添加しなかった場合であり、遊離する³²Ｐが、反応液中
のＴＩＰ４９の量に依存することが分かった。また、Ｍ
１３ｓｓＤＮＡの添加により、ＴＩＰ４９のＡＴＰａｓ
ｅ活性が高くなることが分かった。

【００６５】＜実施例８＞ＴＩＰ４９のＡＴＰ活性の確
認２ＭｏｎｏＱにより精製されたＴＩＰ４９（第４３画分）
とＡＴＰとを実施例７と同様にして反応させ、添加する
核酸を、Ｍ１３ｓｓＤＮＡ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、
ラット肝癌細胞由来の全ＲＮＡ（ＴｏｔａｌＲＮＡ
０、ＰｏｌｙＡ、ＰｏｌｙＧ、ＰｏｌｙＵ、Ｐｏｌｙ
Ｃ、無添加として、液体シンチレーションカウンターに
より、ＴＩＰ４９のＡＴＰａｓｅ活性を調べた。結果を
図１２に示す。図１２から、ＴＩＰ４９のＡＴＰａｓｅ
活性は核酸の添加によりいくらか活性化され、Ｍ１３ｓ
ｓＤＮＡで特によく活性化されることが分かった。

【００６６】＜実施例９＞ＴＩＰ４９のＤＮＡのヘリケ
ース（ｈｅｌｉｃａｓｅ）活性の確認１）ＭｏｎｏＱで精製した第３８画分から第４７画分の
溶出液と、³²Ｐで標識した３０ｂの一本差ＤＮＡ（CAGT
CACGAC GTTGTAAAAC GACGGCCAGT）をＭ１３ｓｓＤＮＡと
ハイブリダイズさせたサンプルＤＮＡを、ＡＴＰを添加
して以下の組成の反応液で３７℃において３０分間反応
させた。対照として、ＡＴＰを添加しない場合、ＡＤＰ
を添加した場合、ＭｇＣｌ₂ を添加しない場合について
も同様にＭｏｎｏＱで精製した溶出液とサンプルＤＮＡ
とを反応させた。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５２ｍＭＤＴＴ５０μｇ／μｌＢＳＡ０．５ｍＭＭｇＣｌ₂ ８０ｍＭＫＣｌ１ｍＭＡＴＰ１０−１５ｎｇ（１５００ｃｐｍ）基質（Ｍ１３ｓｓＤ
ＮＡ）酵素（ＭｏｎｏＱ精製溶出液）ＳＰで２０μｌに調製

【００６７】２）５μｌの下記組成の停止液を加え、反
応を停止させた。６０ｍＭＥＤＴＡ０．７５％ＳＤＳ０．１％ＢＰＢ５０％グリセロール３）反応液を１０％アクリルアミド／０．５×ＴＢＥ
（Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ／ＥＤＴＡ）上で１２０Ｖの
電圧をかけて電気泳動した。４）電気泳動終了後、ゲルを乾燥させ、オートラジオグ
ラフィー（感光時間１２時間）を行った。

【００６８】結果を図１３に示す。図１３からＴＩＰ４
９が多く含まれる画分（第４２ないし第４５画分）で
は、サンプルＤＮＡから解離された３０ｂの一本鎖ＤＮ
Ａのバンドが検出されることから、該画分のＴＩＰ４９
がＭ１３と３０ｂの一本鎖ＤＮＡの会合を解離すること
すなわちＤＮＡヘリケース活性を有することが分かっ
た。また、ＡＴＰを添加しない場合、Ｍｇ²⁺を添加しな
い場合は、ＴＩＰ４９のＤＮＡヘリケース活性がないこ
とが分かった。

【００６９】＜実施例１０＞ヒトＴＩＰ４９遺伝子の取
得１．ヒトｃＤＮＡライブラリーの作製ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社製）
を用いて、１０⁶程度のプラークをＮＺＹ寒天培地上に
作製した。このｃＤＮＡライブラリーを『Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏ
ｎ』（１９８９年、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）Ｃｈａｐｔ
ｅｒ９に記載の方法に従ってニトロセルロース膜（ミリ
ポア社製）上に固定した。その後、この膜を２×ＳＳＣ
で６０℃で洗浄した。

【００７０】２．ヒトＴＩＰ４９遺伝子の取得プローブとしてＴＩＰ４９ＤＮＡ（全長）を用いて、実
施例１の５．と同様にしてヒトｃＤＮＡライブラリーか
ら全長のヒトＴＩＰ４９遺伝子を得た。

【００７１】３．ヒトＴＩＰ４９遺伝子の大腸菌への導
入実施例１の８．と同様にして上記で得たヒトＴＩＰ４９
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に導入した。その後、
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を回収した。なお、このＴＩＰ
４９遺伝子を導入した組み換え体大腸菌を工業技術院生
命科学研究所に寄託した（受託番号ＦＥＲＭＰ−１６
２８１）。

【００７２】４．ヒトＴＩＰ４９遺伝子の塩基配列の決
定実施例１の９．と同様にしてダイターミネーターＦＳシ
ークエンスキット（パーキンエルマー社製）およびオー
トシークエンサーＡＢＩ３７３９を用いてヒトＴＩＰ４
９遺伝子の全塩基配列を決定した。結果を配列表の配列
番号４に示す。

【００７３】５．ヒトＴＩＰ４９のアミノ酸配列の決定４．で決定した塩基配列から、ヒトＴＩＰ４９のアミノ
酸配列を決定した。結果を配列表の配列番号３に示す。
ラットＴＩＰ４９遺伝子とヒトＴＩＰ４９遺伝子のホモ
ロジーは、蛋白質のコード領域において９０．３％であ
り、ラットＴＩＰ４９蛋白質とヒトＴＩＰ４９蛋白質は
２９１位のアミノ酸のみが異なり、種間で大変よく保存
された蛋白質である。このことは、ＴＩＰ４９が生物に
とって必須の物質であることを示唆する。

【００７４】

【発明の効果】本発明のＴＩＰ４９蛋白質、ＴＩＰ４９
蛋白質の変異体、それらをコードするポリヌクレオチ
ド、該ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチ
ド、前記蛋白質を認識する抗体により、生物の全遺伝子
の転写に関わっているＴＢＰの転写制御機能の究明の一
手段が供せられる。

【００７５】また、本発明のＴＩＰ４９は、ＤＮＡヘリ
ケース、ＡＴＰａｓｅとして使用可能である。また、本
発明のＴＩＰ４９遺伝子は、ＤＮＡ障害の検出に使用可
能である。

【００７６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４５６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Met Lys Ile Glu Glu Val Lys Ser Thr Thr Lys Thr Gln Arg Ile Ala 1 5 10 15 Ser His Ser His Val Lys Gly Leu Gly Leu Asp Glu Ser Gly Leu Ala 20 25 30 Lys Gln Ala Ala Ser Gly Leu Val Gly Gln Glu Asn Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Cys Gly Val Ile Val Glu Leu Ile Lys Ser Lys Lys Met Ala Gly Arg 50 55 60 Ala Val Leu Leu Ala Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Ala Leu Ala 65 70 75 80 Leu Ala Ile Ala Gln Glu Leu Gly Ser Lys Val Pro Phe Cys Pro Met 85 90 95 Val Gly Ser Glu Val Tyr Ser Thr Glu Ile Lys Lys Thr Glu Val Leu 100 105 110 Met Glu Asn Phe Arg Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ile Lys Glu Thr Lys 115 120 125 Glu Val Tyr Glu Gly Glu Val Thr Glu Leu Thr Pro Cys Glu Thr Glu 130 135 140 Asn Pro Met Gly Gly Tyr Gly Lys Thr Ile Ser His Val Ile Ile Gly 145 150 155 160 Leu Lys Thr Ala Lys Gly Thr Lys Gln Leu Lys Leu Asp Pro Ser Ile 165 170 175 Phe Glu Ser Leu Gln Lys Glu Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Ile Tyr 180 185 190 Ile Glu Ala Asn Ser Gly Ala Val Lys Arg Gln Gly Arg Cys Asp Thr 195 200 205 Tyr Ala Thr Glu Phe Asp Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Val Pro Leu Pro 210 215 220 Lys Gly Asp Val His Lys Lys Lys Glu Ile Ile Gln Asp Val Thr Leu 225 230 235 240 His Asp Leu Asp Val Ala Asn Ala Arg Pro Gln Gly Gly Gln Asp Ile 245 250 255 Leu Ser Met Met Gly Gln Leu Met Lys Pro Lys Lys Thr Glu Ile Thr 260 265 270 Asp Lys Leu Arg Gly Glu Ile Asn Lys Val Val Asn Lys Tyr Ile Asp 275 280 285 Gln Gly Val Ala Glu Leu Val Pro Gly Val Leu Phe Val Asp Glu Val 290 295 300 His Met Leu Asp Ile Glu Cys Phe Thr Tyr Leu His Arg Ala Leu Glu 305 310 315 320 Ser Ser Ile Ala Pro Ile Val Ile Phe Ala Ser Asn Arg Gly Asn Cys 325 330 335 Val Ile Arg Gly Thr Glu Asp Ile Thr Ser Pro His Gly Ile Pro Leu 340 345 350 Asp Leu Leu Asp Arg Val Met Ile Ile Arg Thr Met Leu Tyr Thr Pro 355 360 365 Gln Glu Met Lys Gln Ile Ile Lys Ile Arg Ala Gln Thr Glu Gly Ile 370 375 380 Asn Ile Ser Glu Glu Ala Leu Asn His Leu Gly Glu Ile Gly Thr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Leu Arg Tyr Ser Val Gln Leu Leu Thr Pro Ala Asn Leu Leu 405 410 415 Ala Lys Ile Asn Gly Lys Asp Ser Ile Glu Lys Glu His Val Glu Glu 420 425 430 Ile Ser Glu Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Ser Ser Ala Lys Ile Leu Ala 435 440 445 Asp Gln Gln Asp Lys Tyr Met Lys 450 455

【００７７】配列番号：２配列の長さ：１５８７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 CGCAGGTTGT GGCTGCACAC ACTCGTCAAA ATG AAG ATT GAG GAG GTG AAG AGC ACC 57 ACG AAG ACG CAA CGC ATT GCC TCC CAC AGC CAC GTG AAG GGG CTG GGG 105 CTG GAT GAG AGC GGC CTG GCC AAG CAG GCG GCT TCG GGG CTC GTG GGC 153 CAG GAG AAC GCG AGA GAG GCA TGT GGT GTC ATA GTC GAA TTA ATC AAA 201 AGC AAG AAA ATG GCT GGA AGA GCT GTC TTG TTG GCA GGG CCT CCT GGA 249 ACT GGC AAG ACA GCC TTG GCC CTG GCT ATT GCT CAG GAA CTG GGC AGT 297 AAA GTC CCT TTC TGC CCG ATG GTG GGT AGT GAA GTA TAC TCA ACT GAG 345 ATC AAG AAG ACA GAG GTG CTG ATG GAG AAC TTC CGA AGG GCT ATT GGG 393 CTG CGG ATA AAG GAG ACT AAG GAG GTT TAT GAA GGG GAG GTG ACA GAG 441 CTC ACT CCC TGT GAG ACA GAG AAC CCC ATG GGT GGG TAT GGC AAA ACT 489 ATC AGC CAC GTG ATC ATA GGG CTC AAG ACT GCC AAA GGA ACC AAA CAG 537 CTG AAG CTG GAC CCC AGT ATT TTT GAA AGT TTG CAG AAA GAA CGA GTA 585 GAG GCT GGA GAT GTG ATT TAC ATT GAA GCA AAC AGT GGA GCT GTG AAG 633 AGG CAA GGC AGG TGT GAC ACC TAT GCC ACA GAG TTT GAC CTT GAG GCT 681 GAA GAG TAT GTC CCT TTG CCA AAG GGA GAT GTG CAC AAG AAG AAG GAA 729 ATC ATA CAG GAT GTG ACC TTG CAC GAC TTG GAC GTG GCC AAT GCG CGG 777 CCT CAG GGT GGG CAA GAT ATT CTG TCT ATG ATG GGC CAG TTG ATG AAG 825 CCA AAA AAG ACA GAG ATC ACA GAT AAA CTT CGA GGG GAG ATC AAC AAG 873 GTG GTG AAC AAA TAC ATT GAC CAG GGC GTT GCA GAG CTG GTC CCT GGA 921 GTG CTC TTT GTT GAC GAG GTC CAC ATG CTG GAT ATC GAG TGC TTT ACC 969 TAC CTG CAC CGA GCC CTG GAG TCC TCC ATC GCC CCC ATT GTC ATC TTT 1017 GCA TCC AAC CGA GGC AAC TGT GTC ATC AGG GGC ACC GAG GAC ATC ACT 1065 TCT CCA CAC GGC ATC CCG TTG GAC CTG CTG GAC CGG GTG ATG ATC ATC 1113 AGG ACC ATG CTG TAT ACG CCA CAG GAG ATG AAG CAG ATC ATT AAG ATC 1161 CGA GCC CAG ACG GAA GGC ATC AAC ATC AGT GAG GAG GCC CTA AAC CAC 1209 CTC GGG GAG ATT GGC ACC AAG ACC ACG CTG AGG TAT TCA GTG CAG CTG 1257 CTG ACC CCT GCC AAC CTG CTG GCC AAG ATC AAC GGG AAG GAC AGC ATT 1305 GAG AAG GAG CAC GTG GAG GAG ATC AGC GAG CTC TTC TAT GAC GCC AAG 1353 TCC TCC GCC AAG ATT CTG GCC GAC CAG CAG GAC AAG TAC ATG AAG TAA 1401 CGTAGGGTTT GGAGGTGCAC CCAGAGGACA GACCCCACAC CGAGGACAGG GTCTTGCGTT 1461 GAGCATGCTT TGCAGTGTTA CAGTTTGTTT GTAAATTATC AAACCTCCAA GGTTGTTTGG 1521 AAGGAACCCT TTCCCACCTA GCTTGTTTTT CTAATAAAAC TGAATCTTAT TTTGATGATA 1581 AAAAAA 1587

【００７８】配列番号：３配列の長さ：４５６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Met Lys Ile Glu Glu Val Lys Ser Thr Thr Lys Thr Gln Arg Ile Ala 1 5 10 15 Ser His Ser His Val Lys Gly Leu Gly Leu Asp Glu Ser Gly Leu Ala 20 25 30 Lys Gln Ala Ala Ser Gly Leu Val Gly Gln Glu Asn Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Cys Gly Val Ile Val Glu Leu Ile Lys Ser Lys Lys Met Ala Gly Arg 50 55 60 Ala Val Leu Leu Ala Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Ala Leu Ala 65 70 75 80 Leu Ala Ile Ala Gln Glu Leu Gly Ser Lys Val Pro Phe Cys Pro Met 85 90 95 Val Gly Ser Glu Val Tyr Ser Thr Glu Ile Lys Lys Thr Glu Val Leu 100 105 110 Met Glu Asn Phe Arg Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ile Lys Glu Thr Lys 115 120 125 Glu Val Tyr Glu Gly Glu Val Thr Glu Leu Thr Pro Cys Glu Thr Glu 130 135 140 Asn Pro Met Gly Gly Tyr Gly Lys Thr Ile Ser His Val Ile Ile Gly 145 150 155 160 Leu Lys Thr Ala Lys Gly Thr Lys Gln Leu Lys Leu Asp Pro Ser Ile 165 170 175 Phe Glu Ser Leu Gln Lys Glu Arg Val Glu Ala Gly Asp Val Ile Tyr 180 185 190 Ile Glu Ala Asn Ser Gly Ala Val Lys Arg Gln Gly Arg Cys Asp Thr 195 200 205 Tyr Ala Thr Glu Phe Asp Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Val Pro Leu Pro 210 215 220 Lys Gly Asp Val His Lys Lys Lys Glu Ile Ile Gln Asp Val Thr Leu 225 230 235 240 His Asp Leu Asp Val Ala Asn Ala Arg Pro Gln Gly Gly Gln Asp Ile 245 250 255 Leu Ser Met Met Gly Gln Leu Met Lys Pro Lys Lys Thr Glu Ile Thr 260 265 270 Asp Lys Leu Arg Gly Glu Ile Asn Lys Val Val Asn Lys Tyr Ile Asp 275 280 285 Gln Gly Ile Ala Glu Leu Val Pro Gly Val Leu Phe Val Asp Glu Val 290 295 300 His Met Leu Asp Ile Glu Cys Phe Thr Tyr Leu His Arg Ala Leu Glu 305 310 315 320 Ser Ser Ile Ala Pro Ile Val Ile Phe Ala Ser Asn Arg Gly Asn Cys 325 330 335 Val Ile Arg Gly Thr Glu Asp Ile Thr Ser Pro His Gly Ile Pro Leu 340 345 350 Asp Leu Leu Asp Arg Val Met Ile Ile Arg Thr Met Leu Tyr Thr Pro 355 360 365 Gln Glu Met Lys Gln Ile Ile Lys Ile Arg Ala Gln Thr Glu Gly Ile 370 375 380 Asn Ile Ser Glu Glu Ala Leu Asn His Leu Gly Glu Ile Gly Thr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Leu Arg Tyr Ser Val Gln Leu Leu Thr Pro Ala Asn Leu Leu 405 410 415 Ala Lys Ile Asn Gly Lys Asp Ser Ile Glu Lys Glu His Val Glu Glu 420 425 430 Ile Ser Glu Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Ser Ser Ala Lys Ile Leu Ala 435 440 445 Asp Gln Gln Asp Lys Tyr Met Lys 450 455

【００７９】配列番号：４配列の長さ：１７３０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 CGGCGCACTG TCCTAGCTGC TGGTTTTCCA CGCTGGTTTT AGCTCCCGGC GTCTGCAAA 59 ATG AAG ATT GAG GAG GTG AAG AGC ACT ACG AAG ACG CAG CGC ATC GCC 107 TCC CAC AGC CAC GTG AAA GGG CTG GGG CTG GAC GAG AGC GGC TTG GCC 155 AAG CAG GCG GCC TCA GGG CTT GTG GGC CAG GAG AAC GCG CGA GAG GCA 203 TGT GGC GTC ATA GTA GAA TTA ATC AAA AGC AAG AAA ATG GCT GGA AGA 251 GCT GTC TTG TTG GCA GGA CCT CCT GGA ACT GGC AAG ACA GCT CTG GCT 299 CTG GCT ATT GCT CAG GAG CTG GGT AGT AAG GTC CCC TTC TGC CCA ATG 347 GTG GGG AGT GAA GTT TAC TCA ACT GAG ATC AAG AAG ACA GAG GTG CTG 395 ATG GAG AAC TTC CGC AGG GCC ATT GGG CTG CGA ATA AAG GAG ACC AAG 443 GAA GTT TAT GAA GGT GAA GTC ACA GAG CTA ACT CCG TGT GAG ACA GAG 491 AAT CCC ATG GGA GGA TAT GGC AAA ACC ATT AGC CAT GTG ATC ATA GGA 539 CTC AAA ACA GCC AAA GGA ACC AAA CAG TTG AAA CTG GAC CCC AGC ATT 587 TTT GAA AGT TTG CAG AAA GAG CGA GTA GAA GCT GGA GAT GTG ATT TAC 635 ATT GAA GCC AAC AGT GGG GCC GTG AAG AGG CAG GGC AGG TGT GAT ACC 683 TAT GCC ACA GAA TTC GAC CTT GAA GCT GAA GAG TAT GTC CCC TTG CCA 731 AAA GGG GAT GTG CAC AAA AAG AAA GAA ATC ATC CAA GAT GTG ACC TTG 779 CAT GAC TTG GAT GTG GCT AAT GCG CGG CCC CAG GGG GGA CAA GAT ATC 827 CTG TCC ATG ATG GGC CAG CTA ATG AAG CCA AAG AAG ACA GAA ATC ACA 875 GAC AAA CTT CGA GGG GAG ATT AAT AAG GTG GTG AAC AAG TAC ATC GAC 923 CAG GGC ATT GCT GAG CTG GTC CCG GGT GTG CTG TTT GTT GAT GAG GTC 971 CAC ATG CTG GAC ATT GAG TGC TTC ACC TAC CTG CAC CGC GCC CTG GAG 1019 TCT TCT ATC GCT CCC ATC GTC ATC TTT GCA TCC AAC CGA GGC AAC TGT 1067 GTC ATC AGA GGC ACT GAG GAC ATC ACA TCC CCT CAC GGC ATC CCT CTT 1115 GAC CTT CTG GAC CGA GTG ATG ATA ATC CGG ACC ATG CTG TAT ACT CCA 1163 CAG GAA ATG AAA CAG ATC ATT AAA ATC CGT GCC CAG ACG GAA GGA ATC 1211 AAC ATC AGT GAG GAG GCA CTG AAC CAC CTG GGG GAG ATT GGC ACC AAG 1259 ACC ACA CTG AGG TAC TCA GTG CAG CTG CTG ACC CCG GCC AAC TTG CTT 1307 GCT AAA ATC AAC GGG AAG GAC AGC ATT GAG AAA GAG CAT GTC GAA GAG 1355 ATC AGT GAA CTT TTC TAT GAT GCC AAG TCC TCC GCC AAA ATC CTG GCT 1403 GAC CAG CAG GAT AAG TAC ATG AAG TGA GATGGCTGAG GTTTTCAGCA 1450 GTAAGAGACT CCCCAGGTGT GCCTGGCCTG GGTCCAGCCT GTGGGCGCTT GCCCCTGGGC 1510 TTGGGGCTGC CGTCCCCACT CAGGCGTGGT CTGCAGCGCT GTCAGTTCAG TGTGGAAAGC 1570 ATTTCTTTTT AAGTTATCGT AACTGTTCCT GTGGTTGCTT TGAAAGAACC CTTCCTTACC 1630 TGGTGTGTTT TCTATAAATC TTCATAGGTT ATTTTGATTC TCTCTCTCTC TCTCTCTAAG 1690 TTTTTTAAAA ATAAACTTTT CAGAACAAAA AAAAAAACCG 1730

【図面の簡単な説明】

【図１】ラット肝細胞核抽出液の二次元電気泳動の結果
を示す電気泳動写真である。Ｍは分子量マーカーであ
る。矢印は、アミノ酸配列決定を行ったドットである。

【図２】ラットＴＩＰ４９蛋白質のアミノ酸配列および
ＴＩＰ４９遺伝子の塩基配列を示す図である。

【図３】ラットＴＩＰ４９蛋白質および遺伝子と原生動
物のＲｕｖＢ蛋白質および遺伝子とのホモロジーを蛋白
質間および遺伝子間それぞれについて示す図である。

【図４】ラット肝細胞由来のｐｏｌｙＡＲＮＡについ
てＴＩＰ４９遺伝子の一部をプローブとしてノーザンブ
ロットハイブリダイゼーションした結果を示す電気泳動
写真である。

【図５】ラット各組織由来のｐｏｌｙＡＲＮＡについ
てＴＩＰ４９遺伝子の一部をプローブとしてノーザンブ
ロットハイブリダイゼーションした結果を示す電気泳動
写真である。

【図６】実施例４でＴＩＰ４９遺伝子を導入するのに使
用したヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａ−Ｈｉｓベ
クターを示す図である。

【図７】組み換え体ＴＩＰ４９を発現させた大腸菌の溶
菌液およびその精製蛋白質について電気泳動を行った結
果を示す電気泳動写真である。

【図８】（ａ）はＴＩＩＰ４９蛋白質を精製したＭｏｎ
ｏＱのカラムパターンを示す図であり、図８（ｂ）はＴ
ＩＩＰ４９蛋白質を精製した精製蛋白質の電気泳動（ク
マシー染色）の結果を示す電気泳動写真である。

【図９】ラット肝細胞核抽出液、該核抽出液から粗精製
したＴＩＰ４９およびＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムで
精製した組み換えＴＩＰ４９について、それぞれ抗ＴＩ
Ｐ４９抗体を用いてウェスタンブロット法による解析を
行った結果を示す電気泳動写真である。

【図１０】（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、ＨＡ−ＴＢＰを
動物細胞内で発現させて、その核抽出液を抗ＨＡ抗体で
免疫沈降した沈降物および上清ならびにラット肝細胞核
抽出液についてウェスタンブロット法による解析を行っ
た結果を示す電気泳動写真である。なお、一次抗体とし
て、（ａ）は抗ＴＢＰ抗体を、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を、
（ｃ）は抗ＴＩＰ４９抗体をそれぞれ用いてウェスタン
ブロット法による解析を行った結果である。

【図１１】ＭｏｎｏＱで精製したＴＩＰ４９のＡＴＰａ
ｓｅ活性を、液体シンチレーションカウンターで測定し
た結果を示す図である。

【図１２】ＭｏｎｏＱで精製したＴＩＰ４９のＡＴＰａ
ｓｅ活性を、種々の核酸を添加して、液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定した結果を示す図である。

【図１３】ＭｏｎｏＱで精製したＴＩＰ４９とサンプル
ＤＮＡとを反応させた反応物を電気泳動した結果を示す
電気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質、（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からな
る蛋白質、（ｂ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において一また
は複数のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ
酸配列からなる蛋白質。
【請求項２】以下の（ｃ）又は（ｄ）の蛋白質、（ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からな
る蛋白質、（ｄ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において一また
は複数のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ
酸配列からなる蛋白質。
【請求項３】さらに、ＡＴＰｓａｅ活性を有する請求
項１又は２に記載の蛋白質。
【請求項４】さらに、ＤＮＡヘリケース活性を有する
請求項１ないし３のいずれか一つに記載の蛋白質。
【請求項５】以下の（ｅ）又は（ｆ）に記載の蛋白
質、（ｅ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部からなる
蛋白質、（ｆ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部において
一または複数のアミノ酸が置換、欠失または付加された
アミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項６】以下の（ｇ）又は（ｈ）に記載の蛋白
質、（ｇ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の一部からなる
蛋白質、（ｈ）ＴＢＰとの複合体を形成する能力を有し、かつ配
列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の一部において
一または複数のアミノ酸が置換、欠失または付加された
アミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項７】さらに、ＡＴＰｓａｅ活性を有する請求
項５又は６に記載の蛋白質。
【請求項８】さらに、ＤＮＡヘリケース活性を有する
請求項５ないし７のいずれか一つに記載の蛋白質。
【請求項９】請求項１ないし８のいずれか一つに記載
の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】配列表の配列番号２又は配列番号４に
記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１１】請求項９又は１０に記載のＤＮＡがコ
ードするＲＮＡ。
【請求項１２】請求項９又は１０に記載のＤＮＡのア
ンチセンスＤＮＡ或いは請求項１１に記載のＲＮＡのア
ンチセンスＲＮＡ、又はそれらの誘導体からなるアンチ
センスポリヌクレオチド。
【請求項１３】請求項９ないし１２のいずれか一項に
記載のポリヌクレオチドのうちの一部であって、連続す
る１２塩基以上からなるポリヌクレオチド。
【請求項１４】化学修飾された請求項９ないし１３の
いずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】請求項１０に記載のＤＮＡのホモログ
であるｃＤＮＡを取得する方法であって、請求項１２ま
たは１３に記載のポリヌクレオチドをプローブとして、
ｃＤＮＡライブラーから該ポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズするｃＤＮＡを取得する方法。
【請求項１６】請求項１０に記載のＤＮＡのホモログ
であって、請求項１５に記載の取得方法によって取得さ
れたｃＤＮＡ。
【請求項１７】配列表の配列番号１又は３に記載のア
ミノ酸配列からなる蛋白質のホモログであって、請求項
１６に記載のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列からな
る蛋白質。
【請求項１８】請求項１ないし８または１７のいずれ
か一つに記載の蛋白質を認識する抗体。