JP3729924B2 - ｐ５３ 標的蛋白質ＧＭＬ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
癌抑制遺伝子ｐ53によって発現が誘導される新しい遺伝子に関し、医学の分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
ｐ53は腫瘍ウイルスの蛋白質と結合する細胞内蛋白質として1979年に発見された。1989年に大腸癌や肺癌で、ｐ53遺伝子の突然変異がみつかり、その後その変異が乳癌、膀胱癌、脳腫瘍をはじめ多種類の癌で見つかったことから、癌の発生、進展に関与していると考えられている。ｐ53の作用機構については長い間不明であったが、正常型ｐ53を強制発現させると癌細胞の増殖を抑制する能力があることから、癌抑制遺伝子として機能すると推測された。
【０００３】
このｐ53の生理機能として、細胞周期をＧ１期での停止作用およびＤＮＡ損傷によるアポトーシス作用などが知られているがその作用機構については長い間不明であった。しかし最近、ｐ53が転写因子としての活性を有することが判明し、ｐ53によって発現が誘導される遺伝子群が細胞増殖抑制というｐ53の生理機能に直接かかわっていることが推測された。その後の研究により、ｐ53によって発現が誘導される遺伝子としてｐ21／ＷＡＦ１、ＭＤＭ２、ＧＡＤＤ45、ＢＡＸ、サイクリンＧおよびＩＧＦ−ＢＰ３などが報告された（El-Deiry, W.S. et al., Cell, 75, 817-825,1993 . Wu, X. et al., Genes Dev., 7, 1126-1132,1993 . Kastan, M.B. et al., Cell, 71, 587-597,1992. Miyashita, T. & Reed, C.R. Cell, 80, 293-299,1995. Okamoto, K. & Beach, D. EMBO J., 13, 4816-4822,1994. Buckbinder, L. et al., Nature, 377, 646-649,1995. ）。これら遺伝子はプロモーター領域または隣接領域にｐ53結合性配列を有することが見い出され、それらの発現はｐ53蛋白質の発現と相関関係を有することが証明された。
【０００４】
これまでｐ53標的遺伝子を同定するために、正常型ｐ53が欠損した癌細胞に正常型ｐ53を導入し強制発現させて、発現量が増加しているｃＤＮＡをサブトラクション（消去）法でのスクリーニングやディフェレンシャルディスプレイ（differential display、分別増幅）法によるスクリーニング法が用いられてきた。これらの方法は比較的大量に発現される遺伝子については同定は可能であるが、微量に発現する遺伝子や臓器特異性を有する遺伝子の同定は困難である。
【０００５】
分子生物学の進展に伴い、癌の原因は細胞増殖制御などに関与する複数の遺伝子の変異が単一の体細胞に段階的に蓄積することであると考えられるに至っている。癌抑制遺伝子ｐ53の新規な標的遺伝子を解明し、癌化機構の解明および医学への応用が待望されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ｐ53の新しい標的遺伝子を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決しようとするための手段】
これまでに酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いるスクリーニング法により、ｐ53によって転写が促進されるヒトゲノム配列（ｐ53応答配列）が多数同定された（Tokino, T. et al., Hum. Mol. Genet., 3, 1537-1542, 1994 ）。これらの配列のほとんどはｐ53結合部位のコンセンサス配列である２コピーの5'-PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy-3'が存在していた（El-Deiry, W.S. et al., Nature Genet., 1, 45-49, 1992）。
【０００８】
そこで本発明者らは、ｐ53応答配列を含有し、ｐ53依存性に発現される遺伝子を同定することを目的として、ｐ53応答配列をプローブとしてヒトコスミドライブラリーを鋭意スクリーニングし、陽性クロ−ンを単離し、エクソン部を増幅、構造解析の結果、ｐ53の新しい標的遺伝子を同定することに成功し本発明を完成するに至った。本発明のＤＮＡから演繹されるアミノ酸配列はデータベースでの相同性検索の結果、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー分子（Brakenhoff, R.H. et al., J. Cell Biol., 129, 1677-1689, 1995）と顕著な類似性を有していたことからＧＭＬ（GPI anchor molecular like protein ）蛋白質と命名した。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含む蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ。該ＤＮＡ含有ベクター、形質転換体、該蛋白質の製造方法、該ＤＮＡに由来するＤＮＡプローブ、プライマー、該遺伝子の解析方法、該蛋白質に結合する抗体に関する。ＧＭＬ蛋白質のアミノ酸配列のうち、１もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含むもの、およびそれをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは酵母でのｐ53の転写活性化能を指標にして、ヒトゲノムＤＮＡからｐ53の応答配列を単離した（Tokino, J. et al., Human Mol. Genet., 3, 1537-1542, 1994）。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで処理して得られたＤＮＡ断片をＨＩＳ３レポータープラスミドｐＢＭ947 の上流に組み込んだレポーターライブラリーを作製し、ヒトｐ53を発現するプラスミドを保有する酵母にレポータープラスミドを導入し、Ｈｉｓ栄養要求性を指標にして1000クローンを単離した。このうち約1/4 のクローンがｐ53依存性に転写を促進するコンセンサス配列を有していることを報告した。
【００１１】
これらクローンより、制限酵素によりｐ53応答配列を切り取り構造解析したものの中から、配列番号３に記載のコンセンサス配列を有するp53 応答配列を標識しプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法（Gene, 10, 63, 1980）によりヒトゲノムコスミドライブラリー（Tokino, T. et al., Am. J. Hum. Genet., 48, 258-268, 1991）をスクリーニングし、該プローブとハイブリダイズするコスミドクローンを取得することができる。このようにして得たコスミドクローンを適当なプラスミドベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定することにより当ｐ53応答遺伝子のゲノム塩基配列が決定できる。
【００１２】
またこのようにして得たコスミドクローンを制限酵素、例えばBam HIおよびBgl IIで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＰＬ３などのトラッピングベクターに挿入し、エクソントラッピング法によりエクソン部分を増幅させ、エクソン配列を単離・構造解析、さらにGenBank などのパブリックデ−タベ−スに対する相同性検索によりエクソン配列を得ることができる。次いでこのエクソン配列をヒト組織、例えば精巣から調製したpoly(A) ＲＮＡを鋳型にして、５’−, ３’−ＲＡＣＥ法により該エクソンの両サイドを延長させ目的とするｃＤＮＡを取得することができる。これらｃＤＮＡとジェノミッククローンの構造決定された塩基配列を比較することによって、イントロン−エクソン結合部が解析される。
【００１３】
塩基配列の構造はマキサム・ギルバート法（Maxam, A.M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560, 1977 ）あるいはジデオキシ法（Messing, J et al., Nucl. Acids Res., 9, 309, 1981 ）によって決められる。
ＧＭＬ蛋白質組換え発現ベクターおよびその形質転換体の作製は、上記記載の方法により得られたＧＭＬｃＤＮＡを適切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入することにより形質転換体を得ることができる。これを常法により培養し培養物よりＧＭＬ蛋白質を大量に生産することができる。
【００１４】
ＧＭＬ蛋白質をコードするｃＤＮＡをＧＭＬ蛋白質の発現に適したベクターのプロモーター下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合して組換発現ベクターを作成することができる。使用できるべクターとしては、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ322 、ｐＵＣ18、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ110 、酵母由来のプラスミドｐＲＢ15、バクテリオファージλgt10、λgt11あるいはＳＶ40などが挙げられるが、宿主内で複製、増幅可能なベクターであれば特に限定されない。プロモーターおよびターミネーターに関してもＧＭＬ蛋白質をコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合わせも可能である。
【００１５】
ＧＭＬ蛋白質をコードするｃＤＮＡはＧＭＬ蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れでもよく、また化学合成によって合成されたものでもよい。
さらに発現される蛋白質がＧＭＬ蛋白質の生理活性を有するものならば、配列番号２記載の塩基配列に限定されるものではなく、アミノ酸配列の一部が付加、欠失もしくは置換された、実質的に同等な蛋白質をコ−ドするＤＮＡであってもよい。
【００１６】
このようにして得られた組換え発現ベクターはコンビテント細胞法（J. Mol. Biol., 53, 154, 1970）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 221, 551, 1983 ）、インビトロパッケージング法（Porc. Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975 ）、ウイルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞および動物細胞などが用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。培養物からのＧＭＬ蛋白質の分離・精製は公知の分離・精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィなどが挙げられる。このようにして得られたＧＭＬ蛋白質は細胞内にマイクロインジェクション法により注入することにより該細胞の増殖を抑制する活性を示すことが期待される。
【００１７】
組織または細胞でのＧＭＬ遺伝子の発現の有無は組織または細胞から得られるｍＲＮＡまたは総ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法にて解析することにより検討することができる。例えば、検体試料からグアジニンチオシアネート法（Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979 ）などに基づいてＲＮＡを抽出する。必要に応じて得られた総ＲＮＡをさらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いるクロマトグラフィーによって精製することによりｍＲＮＡを調製することができる。得られたＲＮＡを鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）またはランダムヘキサデオキシヌクレオチドをプライマーとして、逆転写酵素により単鎖ｃＤＮＡを合成する。 この単鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＧＭＬのｃＤＮＡより適切なプライマーを選択し、ＰＣＲを行いＰＣＲ産物の量を測定すればよい。
【００１８】
ｍＲＮＡ量を測定する場合は、抽出したｍＲＮＡをゲル上、電気泳動後、メンブレンに転写し標識したＧＭＬＤＮＡプロ−ブとハイブリダイズさせるノーザンブロット分析することでも測定することができる。
エクソントラッピング法はBuckler らの方法に準ずればよい（Buckler, A.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4005-4009, 1991 ）。例えば、ヒトコスミドＤＮＡをBam HIおよびBgl IIの制限酵素を用いて完全に切断し、スプライシングベクターｐＳＰＬ１のBam HI部位にクローニングした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォームしてから、プラスミドＤＮＡを回収し、Cos ７細胞へエレクトロポレーションによりトランスフェクション（形質転換）を行う。ついで約48時間後にCos ７細胞より細胞質ＲＮＡを調製し、ベクターのＤＮＡ配列を基に設計されたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、さらに内側のプライマーにより２nd−ＰＣＲを行うことにより、未知のエクソンの増幅を行うことができる。得られたエクソン部分はpBluescript IIなどのベクターにクローニングし、塩基配列を決定することにより目的とするエクソンを取得できる。 ＲＡＣＥ法はｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡの配列既知の部分の５’側を増幅する５’−ＲＡＣＥと３’側を増幅する３’−ＲＡＣＥがあるがFrohman らの方法により行うことができる（Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988 ）。
【００１９】
抗体の作成は、ＧＭＬ蛋白質を抗原として、常法に従い例えばマウス、モルモット、ウサギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十分に免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離し抗ＧＭＬポリクロ−ナル抗体を作製することができる。なお、市販のアジュバントも使用できる。
モノクローナル抗体は公知の方法により作製しえる。たとえば、ＧＭＬ蛋白質で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水から抗ＧＭＬモノクローナル抗体を調製することができる。抗原とするＧＭＬ蛋白質は全アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構造を有するペプチドや他のペプチドとの融合蛋白質であってもよく、調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。これら抗体はヒト生体試料中のＧＭＬ蛋白質の同定や定量を可能とし癌診断試薬などへの使用が期待される。ＧＭＬ蛋白質の免疫学的測定法は、公知の方法に準ずればよく、たとえば蛍光抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施できる。
【００２０】
以上の方法はすでに公知の方法により実施することが可能である。
【００２１】
【実施例】
以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．ゲノムＤＮＡからのエクソン配列のクローニングおよび塩基配列の解析。
ｐ53応答配列（Tokino, T. et al., Hum. Mol. Genet., 3, 1537-1542, 1994 ）を含むＤＮＡ断片（配列番号３）を放射ラベルし、ヒトゲノムＤＮＡコスミドライブラリーを常法によりコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングしてコスミドクローンｃ169 を得た。このクローンのＤＮＡをBam HIとBgl IIで切断し、エクソントラップベクターｐＳＰＬ３（Gibco-BRL 社）に挿入してエクソントラッピングを行い、一つのエクソン配列を単離した。
【００２２】
得られたエクソン配列をＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いるホモロジー検索によって公開データベースの配列と比較したところ、GPI-anchored proteinの一つ、Ｅ48（Brakenhoff, R.H. et al., J. Cell Biol., 129, 1677-1689, 1995）とそのアミノ酸配列が顕著なホモロジーを示した。そこでこの新しい遺伝子をＧＭＬ（GPI-anchored molecule-like protein）と命名した。本発明のＧＭＬ蛋白質は、ＢＬＡＳＴＡプログラムによる解析から、ＧＰＩアンカーを有する膜蛋白質であるＥ48抗原とホモロジーを有することが確認された。
【００２３】
ＤＮＡシークエンシングは二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、AmpliTaqＦＳ ＤＮＡポリメラーゼを用いたサイクルシークエンシングキット（dye-terminator使用、Perkin Elmer社）を用いＡＢＩ377 型ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社）によっておこなった。ＤＮＡ配列の確認はSequenase Version 2.0 （United States Biochemical 社）を用いた35Ｓ−ラベルによるマニュアルシークエンシングにより行った。
【００２４】
実施例２．ＧＭＬ遺伝子の構造
実施例１によって得られたエクソン部をFromanらのＲＡＣＥ法により両側へ延長させた。５’−および３’−ＲＡＣＥは精巣のpoly(A) ＲＮＡ（Clontech社）を用い、Clontech社のキットによって行った。
さらにコスミドクローンｃ169 に含まれている全ゲノムＤＮＡ配列を決定し、コンピュータープログラムを用いてエクソンの可能性のある配列を検索した。ＧＲＡＩＬによる検索と５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥによる検討を組み合わせることにより、722bp よりなるほぼ全長の転写産物（Northern blot 解析では転写産物のサイズはポリシグナルを含めて0.9 kbと見積られている）を決定した。最初のＡＴＧコドンは塩基番号90位に存在し、終止コドンは塩基番号564 位に存在した（配列番号２）。474bp のＯＲＦ（翻訳領域）より17kdの翻訳産物がコードされる。ゲノムＤＮＡ配列決定により、機能をもつｐ53結合部位はコーディング配列より19kb上流に位置することが明らかになった。ＧＭＬ蛋白質の保有するシステイン残基の11個中10個までがこれらＧＰＩアンカーを有する蛋白質のファミリーに保存されていた。ＧＭＬ遺伝子は染色体上8q24.3-q terにマップされ、Ｅ48およびＧＭＬを含むＧＰＩアンカーを有するタンパクファミリーの遺伝子がこの領域に集まっている可能性が示された。
【００２５】
実施例３．ＧＭＬ遺伝子（ｍＲＮＡ）の野生型ｐ53による発現誘導の確認
ＧＭＬが野生型ｐ53によって誘導されるか否かを確認するため、野生型もしくは変異型ｐ53遺伝子を発現する細胞株を作製し、その細胞より総ＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲによる解析を行った。大腸癌細胞株ＳＷ480 は片方のｐ53のアレルが変異型（273 Arg to His）であり、もう一方のアレルが欠失しており、この株の増殖は野生型ｐ53を発現するベクターを導入することにより抑制されることが知られている。
【００２６】
そこで、まず、このＳＷ480 に野生型もしくは変異型（Kern, S. et al., Science, 256, 827-830, 1992）ｐ53の発現ベクターをトランスフェクトした。１×106 個の細胞を25cm2 のフラスコにまき24時間培養した後、25μg のリポフェクチンと５μg のプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクションを行った。これら細胞からTRizol試薬（Gibco-BRL 社）を用いて総ＲＮＡを抽出し、DNase Ｉ（Boeringer Mannheim社）で消化してから、Superscript II（Gibco-BRL 社）を用いてｃＤＮＡを合成しＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は200ng の総ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを12.5μl の反応液中に加えて、94℃、２分の変性の後、94℃、30秒、55〜60℃、30秒、72℃、１分を25ないし35サイクルくり返して行った。ＰＣＲ増幅産物は３％のNuSieve GTG ２：１アガロースゲルによる電気泳動によって分析した。使用したプライマーの配列は配列番号４および５に記載した。これらはセンスコ−ド73-93 位、アンチセンスコ−ド247-268 位に相当する。この際、p53 標的遺伝子p21/WAF1の発現量も測定し、プライマ−は配列番号６および７を使用した。対照遺伝子として、GAPDH の発現量を測定し、配列番号８および９をプライマ−として使用した。
【００２７】
その結果、図１に示す如く、ＧＭＬのｍＲＮＡは、p21/WAF1と同様に野生型ｐ53発現ベクターでトランスフェクトした細胞でより強く発現していた。
実施例４．正常組織および食道癌細胞株におけるＧＭＬｍＲＮＡの発現。
種々のヒト組織のpoly(A) ＲＮＡのノーザンブロット膜（Clontech社）を使用し、32Ｐで標識したヒトＧＭＬｃＤＮＡ（配列番号２記載の73-673位ＤＮＡ、601bp ）をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはClontech社の指示通りに行い、洗浄は 0.1×ＳＳＣ、 0.1％ＳＤＳで50℃、20分行った。食道癌細胞株の総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析は実施例３に記載の方法で行った。ＰＣＲ反応は少なくとも２回行い結果を確認した。ＲＮＡの完全性はすべての検体に同様なシグナルを示す陽性対照のＧＡＰＤＨ遺伝子の転写産物の増幅により確認した。このためのＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲプライマーは配列番号８および９に示した。
【００２８】
測定の結果、16種の正常組織からのｍＲＮＡのNorthern blot 解析からおよそ0.9 kbのＧＭＬｍＲＮＡが精巣に発現していることが明らかになった。ついで食道癌細胞株のパネル（Nishihira, T. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 119, 441-449, 1993 ）を用いてＲＴ−ＰＣＲ解析法により11種の細胞株におけるＧＭＬの発現を検討した。その結果、図２に示されるごとく11株のうち４株にＧＭＬｍＲＮＡが発現しており、さらに１株に弱く発現していた。
【００２９】
実施例５．抗癌剤感受性とＧＭＬ発現の相関。
ＧＭＬを発現しているか否かによって抗癌剤に対する耐性がどう変化するか検討した。使用する食道癌細胞株は薬剤添加24時間前に 100mmディシュ当り１×106 個の細胞をプレーティングしておく。ブレオマイシンを24時間添加したのち４日後の細胞の生存率を測定した。各々のポイントは少なくとも３回の独立した実験から得た平均値を示し、すべての値は同時に行った対応する非処理・コントロールに対しての相対的生存率として表示した。なお、使用した食道癌細胞株の性質を表１に示した。その結果、図３に示す如く、ＧＭＬを発現している５種の食道癌細胞株はブレオマイシンに対し感受性を示した。一方ＲＴ−ＰＣＲでＧＭＬ遺伝子の発現が認められなかった６種の細胞株は同様のブレオマイシン処理に対し比較的耐性であった。なお、CDDPに対しても同様の結果を示した（図３）。
【００３０】
この如く、ＧＭＬの発現と薬剤感受性、耐性が食道癌細胞株において明らかな相関性を示したことは、ＧＭＬがｐ53によって誘発されるアポトーシスの経路に重要な役割を果していることが示唆された。
【００３１】
【表１】
【００３２】
実施例６ 形質転換体の作製
ＧＭＬ蛋白質（配列番号１）をコードするＤＮＡ（配列番号２）を基質として、プライマーＧＭＬ−ＡとＧＭＬ−Ｂを用いて、ＭＤＣ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＭＬ−Ａ ５’-CACAGATCTGTGAAGTGATGCTCCTCT- ３’
( コーディング鎖、配列番号２の塩基番号 82-99に相当)
ＧＭＬ−Ｂ ５’-AACAAGCTTCATGGCAATATATTGCT-３’
( アンチセンス鎖、配列番号２の塩基番号 548-566に相当、下線
は終止コドンを示す)
ベクター構築用に、プライマーの５’端にはそれぞれ Bgl II 、Hind III の切断部位配列を付加してある。
【００３３】
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分取し、 Bgl II と Hind III で切断した。こうして得られたＧＭＬ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片を、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pMAL-c2 (New England Biolabs 社製) ベクターに結合してプラスミド pMAL-GML を構築する。
同様に、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pQE-13 (Diagen 社製) ベクターに結合してプラスミド pH6-GMLを構築する。
【００３４】
pMAL-c2 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側にマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質はアミロースカラムによってアフィニティー精製する。また、 pQE-13 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側に６個のヒスチジン残基よりなるペプチド（His ６）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質は金属キレートカラムによってアフィニティー精製する。
【００３５】
各プラスミド pMAL-GML および pH6-GMLを用いて E.coli JM109 をトランスフォームし、アンピシリン耐性で選択してそれぞれの形質転換体を得る。
実施例７ 組換えＭＤＣ蛋白質の発現と精製
実施例６で得られたそれぞれの形質転換体を培養し、培養物より組換えＭＤＣ融合蛋白質を抽出、精製する。
【００３６】
すなわち、各形質転換体を 100ml のＬＢ培地 (1%ポリペプトン、 0.5% 酵母抽出物, 1%NaCl) で 37 ℃ 一夜振とう培養する。培養液を予め 37 ℃ に加温したＬＢ培地で１０倍に希釈し、さらに３０分〜９０分培養して、対数増殖期の培養物を得る。培養物１リッタ−にＩＰＴＧ（ Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside ）を終濃度１ｍＭとなるように添加して３〜４時間培養した。培養物から遠心分離により菌体を集める。
【００３７】
プラスミド pMAL-GML による形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのカラムバッファー（20mM Tris-HCl pH7.4, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕する。組換えＧＭＬ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在するので、これを遠心分離して変性バッファー（8M 尿素、 20mM Tris-HCl pH8.5, 10mM ジチオスライト−ル）に溶解する。次いで、これをカラムバッファーに透析後、遠心分離して上清可溶画分を集める。透析不溶性画分は、さらに変性、透析、遠心分離を繰返して上清可溶画分を回収する。集めた可溶性画分をアミロースカラム (New England Biolabs 社製) にかけ、カラムバッファーで洗浄後、１０ｍＭマルトースを含むカラムバッファーで溶出する。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画する。この結果、プラスミド pMAL-GML による形質転換体のそれぞれで、期待される分子量のＧＭＬ融合蛋白質が主要バンドとして検出される画分が得られる。これらの融合蛋白質を以下、それぞれ MBP-GMLと称する。
【００３８】
同様に、プラスミド pH6-GMLによる形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのソニケーションバッファー（10mM リン 酸ナトリウム pH8.0, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕する。組換えＧＭＬ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在するので、これを遠心分離してバッファーＡ（6M塩酸グアニジン, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH8.0 ) に溶解し、遠心分離して上清可溶画分を集め、Ｎｉ−ＮＴＡカラム (Diagen社製) にかけ、バッファーＡ、次いでバッファーＢ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH8.0 )で洗浄後、バッファーＣ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH6.3 )、バッファーＤ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH5.9 )、バッファーＥ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH4.5 )およびバッファーＦ（6M塩酸グアニジン, 200ｍＭ酢酸) で段階的に溶出する。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画する。この結果、バッファーＦによる溶出液に、期待される約３４Ｋｄの His６融合蛋白質が単一バンドとして検出される画分が得らる。この融合蛋白質を以下、His ６-GMLと称する。
【００３９】
実施例８ モノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体の作製
実施例７で得られる２種の組換え融合蛋白質、His ６-GML、 MBP-GMLを、それぞれ、免疫抗原、抗体精製・スクリーニング用抗原、測定用標準抗原として用いる。抗ＧＭＬ蛋白特異的モノクローナル抗体は、His ６-GMLをマウスに免疫して作製する。すなわち、His ６-GMLの３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００ｕｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合しマウスの腹腔内に１００ｕｇ／匹にて２週間隔で４〜６回免疫を行なう。免疫終了後、Ｐ３Ｕ１細胞とＢ細胞とのハイブリドーマをＰＥＧ１５００を用いて作製し、培養上清中の抗体価をモニターし、抗ＧＭＬ蛋白特異的抗体を産生するハイブリドーマの選択を行う。抗体価の測定は、実施例７で得た MBP-GML融合蛋白質を固相化（５ｕｇ／ｍｌ）したポリスチレン製カップに培養上清１００ｕｌを加え第一反応を行い、洗浄後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Horse-raddish peroxidase）を加え第二反応を行なう。洗浄後、酵素基質溶液（過酸化水素水およびＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）混合液）を添加し、発色反応（第三反応）を行いモニターする。
【００４０】
ハイブリドーマを９６ウエルマルチプレートにて培養し、ＨＡＴ選択を行い、約２週間後に培養上清中の抗体価を測定し抗原と特異的に反応するクローンを選択する。更に、クローニング操作を行い、各ハイブリドーマ細胞３００万個を、予め約１週間前に０.5ml のプリスタンを腹腔内に投与しておいた BALB/c マウスの腹腔内に接種し、８〜１０日後に腹水を採取する。各腹水よりプロテインＧカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製する。
【００４１】
同様に、実施例７で得られた His６-GMLを免疫抗原として、ウサギに免疫し、抗ＧＭＬ蛋白ポリクローナル抗体を作製する。すなわち、マウスと同様、 His６-GMLの３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００ｕｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合し免疫を行なう。免疫終了後、抗血清を得、実施例７で得た MBP-GML融合蛋白質を固相化したポリスチレン製カップを用いて、抗体価を測定する。抗血清を適宜希釈し、その１００ｕｌをウエルに添加し、抗体価をヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを用いて検討する。さらに、この抗血清を、プロテインＧカラムおよび MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化したセファロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【００４２】
このようにして得られる精製モノクローナル抗体および精製ウサギポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＧＭＬ蛋白質の定量法を確立する。すなわち、ハイブリドーマ由来の精製モノクローナル抗体を９６ウエルプレートに固相化し、ＢＳＡ（Bovine serum albumin）でブロッキング後、精製 MBP-GML溶液を被検液として、0.156 〜5.00 ug/ml の範囲で 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。ウエルを洗浄後、精製ウサギポリクローナル抗体溶液（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。ウエルを洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。反応終了後２ｍＭアジ化ナトリウムを 100 ul ／ウエルずつ添加し、405nm と 490nm の吸光値を測定する。
【００４３】
【発明の効果】
P53 遺伝子の変異は癌のおよそ50％に認められ、その変移の検出は癌の発生、診断、治療などに極めて重要な意義を有する。しかしながら癌組織でのP53 遺伝子の変異部位は一定しておらず、幾種類もの変異が見いだされているため、p53 遺伝子の変移を検出・同定するには多大の労力と時間を要した。それ故にP53 の変異を測定する代わりに本発明の新しい標的たんぱく質ＧＭＬ遺伝子の発現または蛋白質自体を測定することによって、P53 の変異、機能失活を判定することが可能となり、癌の診断手段として期待される。また、ＧＭＬ遺伝子を癌病巣部に発現させる遺伝子治療への応用、P53 機能に依存せずにＧＭＬを発現させる薬剤のスクリ−ニング法への応用、逆にＧＭＬの発現を抑制する医薬、アンチセンス医薬への応用など期待される。
【００４４】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１５８
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジ−：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリ−名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリ−
配列
【００４５】
配列番号：２
配列の長さ：７２２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリ−名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリ−
配列
【００４６】
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【００４７】
配列番号：４
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【００４８】
配列番号：５
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【００４９】
配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【００５０】
配列番号：７
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【００５１】
配列番号：８
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【００５２】
配列番号：９
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【００５３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＷ480 細胞株におけるp53 によるＧＭＬ遺伝子の発現。Ｗ：野生型p53 、Ｍ：変異型p53
【図２】食道癌細胞株におけるＧＭＬ遺伝子の発現。Ｗ：野生型p53 、Ｍ：変異型p53
【図３】食道癌細胞株における、抗癌剤（Bleomycinn,CDDP)感受性とＧＭＬ発現の相関。
【発明の属する技術分野】
癌抑制遺伝子ｐ53によって発現が誘導される新しい遺伝子に関し、医学の分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
ｐ53は腫瘍ウイルスの蛋白質と結合する細胞内蛋白質として1979年に発見された。1989年に大腸癌や肺癌で、ｐ53遺伝子の突然変異がみつかり、その後その変異が乳癌、膀胱癌、脳腫瘍をはじめ多種類の癌で見つかったことから、癌の発生、進展に関与していると考えられている。ｐ53の作用機構については長い間不明であったが、正常型ｐ53を強制発現させると癌細胞の増殖を抑制する能力があることから、癌抑制遺伝子として機能すると推測された。
【０００３】
このｐ53の生理機能として、細胞周期をＧ１期での停止作用およびＤＮＡ損傷によるアポトーシス作用などが知られているがその作用機構については長い間不明であった。しかし最近、ｐ53が転写因子としての活性を有することが判明し、ｐ53によって発現が誘導される遺伝子群が細胞増殖抑制というｐ53の生理機能に直接かかわっていることが推測された。その後の研究により、ｐ53によって発現が誘導される遺伝子としてｐ21／ＷＡＦ１、ＭＤＭ２、ＧＡＤＤ45、ＢＡＸ、サイクリンＧおよびＩＧＦ−ＢＰ３などが報告された（El-Deiry, W.S. et al., Cell, 75, 817-825,1993 . Wu, X. et al., Genes Dev., 7, 1126-1132,1993 . Kastan, M.B. et al., Cell, 71, 587-597,1992. Miyashita, T. & Reed, C.R. Cell, 80, 293-299,1995. Okamoto, K. & Beach, D. EMBO J., 13, 4816-4822,1994. Buckbinder, L. et al., Nature, 377, 646-649,1995. ）。これら遺伝子はプロモーター領域または隣接領域にｐ53結合性配列を有することが見い出され、それらの発現はｐ53蛋白質の発現と相関関係を有することが証明された。
【０００４】
これまでｐ53標的遺伝子を同定するために、正常型ｐ53が欠損した癌細胞に正常型ｐ53を導入し強制発現させて、発現量が増加しているｃＤＮＡをサブトラクション（消去）法でのスクリーニングやディフェレンシャルディスプレイ（differential display、分別増幅）法によるスクリーニング法が用いられてきた。これらの方法は比較的大量に発現される遺伝子については同定は可能であるが、微量に発現する遺伝子や臓器特異性を有する遺伝子の同定は困難である。
【０００５】
分子生物学の進展に伴い、癌の原因は細胞増殖制御などに関与する複数の遺伝子の変異が単一の体細胞に段階的に蓄積することであると考えられるに至っている。癌抑制遺伝子ｐ53の新規な標的遺伝子を解明し、癌化機構の解明および医学への応用が待望されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ｐ53の新しい標的遺伝子を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決しようとするための手段】
これまでに酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いるスクリーニング法により、ｐ53によって転写が促進されるヒトゲノム配列（ｐ53応答配列）が多数同定された（Tokino, T. et al., Hum. Mol. Genet., 3, 1537-1542, 1994 ）。これらの配列のほとんどはｐ53結合部位のコンセンサス配列である２コピーの5'-PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy-3'が存在していた（El-Deiry, W.S. et al., Nature Genet., 1, 45-49, 1992）。
【０００８】
そこで本発明者らは、ｐ53応答配列を含有し、ｐ53依存性に発現される遺伝子を同定することを目的として、ｐ53応答配列をプローブとしてヒトコスミドライブラリーを鋭意スクリーニングし、陽性クロ−ンを単離し、エクソン部を増幅、構造解析の結果、ｐ53の新しい標的遺伝子を同定することに成功し本発明を完成するに至った。本発明のＤＮＡから演繹されるアミノ酸配列はデータベースでの相同性検索の結果、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー分子（Brakenhoff, R.H. et al., J. Cell Biol., 129, 1677-1689, 1995）と顕著な類似性を有していたことからＧＭＬ（GPI anchor molecular like protein ）蛋白質と命名した。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含む蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ。該ＤＮＡ含有ベクター、形質転換体、該蛋白質の製造方法、該ＤＮＡに由来するＤＮＡプローブ、プライマー、該遺伝子の解析方法、該蛋白質に結合する抗体に関する。ＧＭＬ蛋白質のアミノ酸配列のうち、１もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含むもの、およびそれをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは酵母でのｐ53の転写活性化能を指標にして、ヒトゲノムＤＮＡからｐ53の応答配列を単離した（Tokino, J. et al., Human Mol. Genet., 3, 1537-1542, 1994）。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで処理して得られたＤＮＡ断片をＨＩＳ３レポータープラスミドｐＢＭ947 の上流に組み込んだレポーターライブラリーを作製し、ヒトｐ53を発現するプラスミドを保有する酵母にレポータープラスミドを導入し、Ｈｉｓ栄養要求性を指標にして1000クローンを単離した。このうち約1/4 のクローンがｐ53依存性に転写を促進するコンセンサス配列を有していることを報告した。
【００１１】
これらクローンより、制限酵素によりｐ53応答配列を切り取り構造解析したものの中から、配列番号３に記載のコンセンサス配列を有するp53 応答配列を標識しプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法（Gene, 10, 63, 1980）によりヒトゲノムコスミドライブラリー（Tokino, T. et al., Am. J. Hum. Genet., 48, 258-268, 1991）をスクリーニングし、該プローブとハイブリダイズするコスミドクローンを取得することができる。このようにして得たコスミドクローンを適当なプラスミドベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定することにより当ｐ53応答遺伝子のゲノム塩基配列が決定できる。
【００１２】
またこのようにして得たコスミドクローンを制限酵素、例えばBam HIおよびBgl IIで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＰＬ３などのトラッピングベクターに挿入し、エクソントラッピング法によりエクソン部分を増幅させ、エクソン配列を単離・構造解析、さらにGenBank などのパブリックデ−タベ−スに対する相同性検索によりエクソン配列を得ることができる。次いでこのエクソン配列をヒト組織、例えば精巣から調製したpoly(A) ＲＮＡを鋳型にして、５’−, ３’−ＲＡＣＥ法により該エクソンの両サイドを延長させ目的とするｃＤＮＡを取得することができる。これらｃＤＮＡとジェノミッククローンの構造決定された塩基配列を比較することによって、イントロン−エクソン結合部が解析される。
【００１３】
塩基配列の構造はマキサム・ギルバート法（Maxam, A.M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560, 1977 ）あるいはジデオキシ法（Messing, J et al., Nucl. Acids Res., 9, 309, 1981 ）によって決められる。
ＧＭＬ蛋白質組換え発現ベクターおよびその形質転換体の作製は、上記記載の方法により得られたＧＭＬｃＤＮＡを適切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入することにより形質転換体を得ることができる。これを常法により培養し培養物よりＧＭＬ蛋白質を大量に生産することができる。
【００１４】
ＧＭＬ蛋白質をコードするｃＤＮＡをＧＭＬ蛋白質の発現に適したベクターのプロモーター下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合して組換発現ベクターを作成することができる。使用できるべクターとしては、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ322 、ｐＵＣ18、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ110 、酵母由来のプラスミドｐＲＢ15、バクテリオファージλgt10、λgt11あるいはＳＶ40などが挙げられるが、宿主内で複製、増幅可能なベクターであれば特に限定されない。プロモーターおよびターミネーターに関してもＧＭＬ蛋白質をコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合わせも可能である。
【００１５】
ＧＭＬ蛋白質をコードするｃＤＮＡはＧＭＬ蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れでもよく、また化学合成によって合成されたものでもよい。
さらに発現される蛋白質がＧＭＬ蛋白質の生理活性を有するものならば、配列番号２記載の塩基配列に限定されるものではなく、アミノ酸配列の一部が付加、欠失もしくは置換された、実質的に同等な蛋白質をコ−ドするＤＮＡであってもよい。
【００１６】
このようにして得られた組換え発現ベクターはコンビテント細胞法（J. Mol. Biol., 53, 154, 1970）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 221, 551, 1983 ）、インビトロパッケージング法（Porc. Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975 ）、ウイルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞および動物細胞などが用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。培養物からのＧＭＬ蛋白質の分離・精製は公知の分離・精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィなどが挙げられる。このようにして得られたＧＭＬ蛋白質は細胞内にマイクロインジェクション法により注入することにより該細胞の増殖を抑制する活性を示すことが期待される。
【００１７】
組織または細胞でのＧＭＬ遺伝子の発現の有無は組織または細胞から得られるｍＲＮＡまたは総ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法にて解析することにより検討することができる。例えば、検体試料からグアジニンチオシアネート法（Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979 ）などに基づいてＲＮＡを抽出する。必要に応じて得られた総ＲＮＡをさらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いるクロマトグラフィーによって精製することによりｍＲＮＡを調製することができる。得られたＲＮＡを鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）またはランダムヘキサデオキシヌクレオチドをプライマーとして、逆転写酵素により単鎖ｃＤＮＡを合成する。 この単鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＧＭＬのｃＤＮＡより適切なプライマーを選択し、ＰＣＲを行いＰＣＲ産物の量を測定すればよい。
【００１８】
ｍＲＮＡ量を測定する場合は、抽出したｍＲＮＡをゲル上、電気泳動後、メンブレンに転写し標識したＧＭＬＤＮＡプロ−ブとハイブリダイズさせるノーザンブロット分析することでも測定することができる。
エクソントラッピング法はBuckler らの方法に準ずればよい（Buckler, A.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4005-4009, 1991 ）。例えば、ヒトコスミドＤＮＡをBam HIおよびBgl IIの制限酵素を用いて完全に切断し、スプライシングベクターｐＳＰＬ１のBam HI部位にクローニングした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォームしてから、プラスミドＤＮＡを回収し、Cos ７細胞へエレクトロポレーションによりトランスフェクション（形質転換）を行う。ついで約48時間後にCos ７細胞より細胞質ＲＮＡを調製し、ベクターのＤＮＡ配列を基に設計されたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、さらに内側のプライマーにより２nd−ＰＣＲを行うことにより、未知のエクソンの増幅を行うことができる。得られたエクソン部分はpBluescript IIなどのベクターにクローニングし、塩基配列を決定することにより目的とするエクソンを取得できる。 ＲＡＣＥ法はｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡの配列既知の部分の５’側を増幅する５’−ＲＡＣＥと３’側を増幅する３’−ＲＡＣＥがあるがFrohman らの方法により行うことができる（Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988 ）。
【００１９】
抗体の作成は、ＧＭＬ蛋白質を抗原として、常法に従い例えばマウス、モルモット、ウサギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十分に免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離し抗ＧＭＬポリクロ−ナル抗体を作製することができる。なお、市販のアジュバントも使用できる。
モノクローナル抗体は公知の方法により作製しえる。たとえば、ＧＭＬ蛋白質で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水から抗ＧＭＬモノクローナル抗体を調製することができる。抗原とするＧＭＬ蛋白質は全アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構造を有するペプチドや他のペプチドとの融合蛋白質であってもよく、調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。これら抗体はヒト生体試料中のＧＭＬ蛋白質の同定や定量を可能とし癌診断試薬などへの使用が期待される。ＧＭＬ蛋白質の免疫学的測定法は、公知の方法に準ずればよく、たとえば蛍光抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施できる。
【００２０】
以上の方法はすでに公知の方法により実施することが可能である。
【００２１】
【実施例】
以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．ゲノムＤＮＡからのエクソン配列のクローニングおよび塩基配列の解析。
ｐ53応答配列（Tokino, T. et al., Hum. Mol. Genet., 3, 1537-1542, 1994 ）を含むＤＮＡ断片（配列番号３）を放射ラベルし、ヒトゲノムＤＮＡコスミドライブラリーを常法によりコロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングしてコスミドクローンｃ169 を得た。このクローンのＤＮＡをBam HIとBgl IIで切断し、エクソントラップベクターｐＳＰＬ３（Gibco-BRL 社）に挿入してエクソントラッピングを行い、一つのエクソン配列を単離した。
【００２２】
得られたエクソン配列をＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いるホモロジー検索によって公開データベースの配列と比較したところ、GPI-anchored proteinの一つ、Ｅ48（Brakenhoff, R.H. et al., J. Cell Biol., 129, 1677-1689, 1995）とそのアミノ酸配列が顕著なホモロジーを示した。そこでこの新しい遺伝子をＧＭＬ（GPI-anchored molecule-like protein）と命名した。本発明のＧＭＬ蛋白質は、ＢＬＡＳＴＡプログラムによる解析から、ＧＰＩアンカーを有する膜蛋白質であるＥ48抗原とホモロジーを有することが確認された。
【００２３】
ＤＮＡシークエンシングは二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、AmpliTaqＦＳ ＤＮＡポリメラーゼを用いたサイクルシークエンシングキット（dye-terminator使用、Perkin Elmer社）を用いＡＢＩ377 型ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社）によっておこなった。ＤＮＡ配列の確認はSequenase Version 2.0 （United States Biochemical 社）を用いた35Ｓ−ラベルによるマニュアルシークエンシングにより行った。
【００２４】
実施例２．ＧＭＬ遺伝子の構造
実施例１によって得られたエクソン部をFromanらのＲＡＣＥ法により両側へ延長させた。５’−および３’−ＲＡＣＥは精巣のpoly(A) ＲＮＡ（Clontech社）を用い、Clontech社のキットによって行った。
さらにコスミドクローンｃ169 に含まれている全ゲノムＤＮＡ配列を決定し、コンピュータープログラムを用いてエクソンの可能性のある配列を検索した。ＧＲＡＩＬによる検索と５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥによる検討を組み合わせることにより、722bp よりなるほぼ全長の転写産物（Northern blot 解析では転写産物のサイズはポリシグナルを含めて0.9 kbと見積られている）を決定した。最初のＡＴＧコドンは塩基番号90位に存在し、終止コドンは塩基番号564 位に存在した（配列番号２）。474bp のＯＲＦ（翻訳領域）より17kdの翻訳産物がコードされる。ゲノムＤＮＡ配列決定により、機能をもつｐ53結合部位はコーディング配列より19kb上流に位置することが明らかになった。ＧＭＬ蛋白質の保有するシステイン残基の11個中10個までがこれらＧＰＩアンカーを有する蛋白質のファミリーに保存されていた。ＧＭＬ遺伝子は染色体上8q24.3-q terにマップされ、Ｅ48およびＧＭＬを含むＧＰＩアンカーを有するタンパクファミリーの遺伝子がこの領域に集まっている可能性が示された。
【００２５】
実施例３．ＧＭＬ遺伝子（ｍＲＮＡ）の野生型ｐ53による発現誘導の確認
ＧＭＬが野生型ｐ53によって誘導されるか否かを確認するため、野生型もしくは変異型ｐ53遺伝子を発現する細胞株を作製し、その細胞より総ＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲによる解析を行った。大腸癌細胞株ＳＷ480 は片方のｐ53のアレルが変異型（273 Arg to His）であり、もう一方のアレルが欠失しており、この株の増殖は野生型ｐ53を発現するベクターを導入することにより抑制されることが知られている。
【００２６】
そこで、まず、このＳＷ480 に野生型もしくは変異型（Kern, S. et al., Science, 256, 827-830, 1992）ｐ53の発現ベクターをトランスフェクトした。１×106 個の細胞を25cm2 のフラスコにまき24時間培養した後、25μg のリポフェクチンと５μg のプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクションを行った。これら細胞からTRizol試薬（Gibco-BRL 社）を用いて総ＲＮＡを抽出し、DNase Ｉ（Boeringer Mannheim社）で消化してから、Superscript II（Gibco-BRL 社）を用いてｃＤＮＡを合成しＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は200ng の総ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを12.5μl の反応液中に加えて、94℃、２分の変性の後、94℃、30秒、55〜60℃、30秒、72℃、１分を25ないし35サイクルくり返して行った。ＰＣＲ増幅産物は３％のNuSieve GTG ２：１アガロースゲルによる電気泳動によって分析した。使用したプライマーの配列は配列番号４および５に記載した。これらはセンスコ−ド73-93 位、アンチセンスコ−ド247-268 位に相当する。この際、p53 標的遺伝子p21/WAF1の発現量も測定し、プライマ−は配列番号６および７を使用した。対照遺伝子として、GAPDH の発現量を測定し、配列番号８および９をプライマ−として使用した。
【００２７】
その結果、図１に示す如く、ＧＭＬのｍＲＮＡは、p21/WAF1と同様に野生型ｐ53発現ベクターでトランスフェクトした細胞でより強く発現していた。
実施例４．正常組織および食道癌細胞株におけるＧＭＬｍＲＮＡの発現。
種々のヒト組織のpoly(A) ＲＮＡのノーザンブロット膜（Clontech社）を使用し、32Ｐで標識したヒトＧＭＬｃＤＮＡ（配列番号２記載の73-673位ＤＮＡ、601bp ）をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはClontech社の指示通りに行い、洗浄は 0.1×ＳＳＣ、 0.1％ＳＤＳで50℃、20分行った。食道癌細胞株の総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析は実施例３に記載の方法で行った。ＰＣＲ反応は少なくとも２回行い結果を確認した。ＲＮＡの完全性はすべての検体に同様なシグナルを示す陽性対照のＧＡＰＤＨ遺伝子の転写産物の増幅により確認した。このためのＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲプライマーは配列番号８および９に示した。
【００２８】
測定の結果、16種の正常組織からのｍＲＮＡのNorthern blot 解析からおよそ0.9 kbのＧＭＬｍＲＮＡが精巣に発現していることが明らかになった。ついで食道癌細胞株のパネル（Nishihira, T. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 119, 441-449, 1993 ）を用いてＲＴ−ＰＣＲ解析法により11種の細胞株におけるＧＭＬの発現を検討した。その結果、図２に示されるごとく11株のうち４株にＧＭＬｍＲＮＡが発現しており、さらに１株に弱く発現していた。
【００２９】
実施例５．抗癌剤感受性とＧＭＬ発現の相関。
ＧＭＬを発現しているか否かによって抗癌剤に対する耐性がどう変化するか検討した。使用する食道癌細胞株は薬剤添加24時間前に 100mmディシュ当り１×106 個の細胞をプレーティングしておく。ブレオマイシンを24時間添加したのち４日後の細胞の生存率を測定した。各々のポイントは少なくとも３回の独立した実験から得た平均値を示し、すべての値は同時に行った対応する非処理・コントロールに対しての相対的生存率として表示した。なお、使用した食道癌細胞株の性質を表１に示した。その結果、図３に示す如く、ＧＭＬを発現している５種の食道癌細胞株はブレオマイシンに対し感受性を示した。一方ＲＴ−ＰＣＲでＧＭＬ遺伝子の発現が認められなかった６種の細胞株は同様のブレオマイシン処理に対し比較的耐性であった。なお、CDDPに対しても同様の結果を示した（図３）。
【００３０】
この如く、ＧＭＬの発現と薬剤感受性、耐性が食道癌細胞株において明らかな相関性を示したことは、ＧＭＬがｐ53によって誘発されるアポトーシスの経路に重要な役割を果していることが示唆された。
【００３１】
【表１】
実施例６ 形質転換体の作製
ＧＭＬ蛋白質（配列番号１）をコードするＤＮＡ（配列番号２）を基質として、プライマーＧＭＬ−ＡとＧＭＬ−Ｂを用いて、ＭＤＣ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＭＬ−Ａ ５’-CACAGATCTGTGAAGTGATGCTCCTCT- ３’
( コーディング鎖、配列番号２の塩基番号 82-99に相当)
ＧＭＬ−Ｂ ５’-AACAAGCTTCATGGCAATATATTGCT-３’
( アンチセンス鎖、配列番号２の塩基番号 548-566に相当、下線
は終止コドンを示す)
ベクター構築用に、プライマーの５’端にはそれぞれ Bgl II 、Hind III の切断部位配列を付加してある。
【００３３】
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分取し、 Bgl II と Hind III で切断した。こうして得られたＧＭＬ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ断片を、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pMAL-c2 (New England Biolabs 社製) ベクターに結合してプラスミド pMAL-GML を構築する。
同様に、予め BamH I と Hind III で切断しておいた pQE-13 (Diagen 社製) ベクターに結合してプラスミド pH6-GMLを構築する。
【００３４】
pMAL-c2 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側にマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質はアミロースカラムによってアフィニティー精製する。また、 pQE-13 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側に６個のヒスチジン残基よりなるペプチド（His ６）を有する融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質は金属キレートカラムによってアフィニティー精製する。
【００３５】
各プラスミド pMAL-GML および pH6-GMLを用いて E.coli JM109 をトランスフォームし、アンピシリン耐性で選択してそれぞれの形質転換体を得る。
実施例７ 組換えＭＤＣ蛋白質の発現と精製
実施例６で得られたそれぞれの形質転換体を培養し、培養物より組換えＭＤＣ融合蛋白質を抽出、精製する。
【００３６】
すなわち、各形質転換体を 100ml のＬＢ培地 (1%ポリペプトン、 0.5% 酵母抽出物, 1%NaCl) で 37 ℃ 一夜振とう培養する。培養液を予め 37 ℃ に加温したＬＢ培地で１０倍に希釈し、さらに３０分〜９０分培養して、対数増殖期の培養物を得る。培養物１リッタ−にＩＰＴＧ（ Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside ）を終濃度１ｍＭとなるように添加して３〜４時間培養した。培養物から遠心分離により菌体を集める。
【００３７】
プラスミド pMAL-GML による形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのカラムバッファー（20mM Tris-HCl pH7.4, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕する。組換えＧＭＬ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在するので、これを遠心分離して変性バッファー（8M 尿素、 20mM Tris-HCl pH8.5, 10mM ジチオスライト−ル）に溶解する。次いで、これをカラムバッファーに透析後、遠心分離して上清可溶画分を集める。透析不溶性画分は、さらに変性、透析、遠心分離を繰返して上清可溶画分を回収する。集めた可溶性画分をアミロースカラム (New England Biolabs 社製) にかけ、カラムバッファーで洗浄後、１０ｍＭマルトースを含むカラムバッファーで溶出する。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画する。この結果、プラスミド pMAL-GML による形質転換体のそれぞれで、期待される分子量のＧＭＬ融合蛋白質が主要バンドとして検出される画分が得られる。これらの融合蛋白質を以下、それぞれ MBP-GMLと称する。
【００３８】
同様に、プラスミド pH6-GMLによる形質転換体の場合は、菌体に１０ｍｌのソニケーションバッファー（10mM リン 酸ナトリウム pH8.0, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕する。組換えＧＭＬ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分に存在するので、これを遠心分離してバッファーＡ（6M塩酸グアニジン, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH8.0 ) に溶解し、遠心分離して上清可溶画分を集め、Ｎｉ−ＮＴＡカラム (Diagen社製) にかけ、バッファーＡ、次いでバッファーＢ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH8.0 )で洗浄後、バッファーＣ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH6.3 )、バッファーＤ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH5.9 )、バッファーＥ（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mMTris-HCl, pH4.5 )およびバッファーＦ（6M塩酸グアニジン, 200ｍＭ酢酸) で段階的に溶出する。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシーブルー染色）で解析して分画する。この結果、バッファーＦによる溶出液に、期待される約３４Ｋｄの His６融合蛋白質が単一バンドとして検出される画分が得らる。この融合蛋白質を以下、His ６-GMLと称する。
【００３９】
実施例８ モノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体の作製
実施例７で得られる２種の組換え融合蛋白質、His ６-GML、 MBP-GMLを、それぞれ、免疫抗原、抗体精製・スクリーニング用抗原、測定用標準抗原として用いる。抗ＧＭＬ蛋白特異的モノクローナル抗体は、His ６-GMLをマウスに免疫して作製する。すなわち、His ６-GMLの３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００ｕｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合しマウスの腹腔内に１００ｕｇ／匹にて２週間隔で４〜６回免疫を行なう。免疫終了後、Ｐ３Ｕ１細胞とＢ細胞とのハイブリドーマをＰＥＧ１５００を用いて作製し、培養上清中の抗体価をモニターし、抗ＧＭＬ蛋白特異的抗体を産生するハイブリドーマの選択を行う。抗体価の測定は、実施例７で得た MBP-GML融合蛋白質を固相化（５ｕｇ／ｍｌ）したポリスチレン製カップに培養上清１００ｕｌを加え第一反応を行い、洗浄後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Horse-raddish peroxidase）を加え第二反応を行なう。洗浄後、酵素基質溶液（過酸化水素水およびＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）混合液）を添加し、発色反応（第三反応）を行いモニターする。
【００４０】
ハイブリドーマを９６ウエルマルチプレートにて培養し、ＨＡＴ選択を行い、約２週間後に培養上清中の抗体価を測定し抗原と特異的に反応するクローンを選択する。更に、クローニング操作を行い、各ハイブリドーマ細胞３００万個を、予め約１週間前に０.5ml のプリスタンを腹腔内に投与しておいた BALB/c マウスの腹腔内に接種し、８〜１０日後に腹水を採取する。各腹水よりプロテインＧカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製する。
【００４１】
同様に、実施例７で得られた His６-GMLを免疫抗原として、ウサギに免疫し、抗ＧＭＬ蛋白ポリクローナル抗体を作製する。すなわち、マウスと同様、 His６-GMLの３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００ｕｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合し免疫を行なう。免疫終了後、抗血清を得、実施例７で得た MBP-GML融合蛋白質を固相化したポリスチレン製カップを用いて、抗体価を測定する。抗血清を適宜希釈し、その１００ｕｌをウエルに添加し、抗体価をヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを用いて検討する。さらに、この抗血清を、プロテインＧカラムおよび MBP-MDC(dC1) 融合蛋白質を固相化したセファロースカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【００４２】
このようにして得られる精製モノクローナル抗体および精製ウサギポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＧＭＬ蛋白質の定量法を確立する。すなわち、ハイブリドーマ由来の精製モノクローナル抗体を９６ウエルプレートに固相化し、ＢＳＡ（Bovine serum albumin）でブロッキング後、精製 MBP-GML溶液を被検液として、0.156 〜5.00 ug/ml の範囲で 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。ウエルを洗浄後、精製ウサギポリクローナル抗体溶液（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。ウエルを洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（5ug/ml）を 100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。反応終了後２ｍＭアジ化ナトリウムを 100 ul ／ウエルずつ添加し、405nm と 490nm の吸光値を測定する。
【００４３】
【発明の効果】
P53 遺伝子の変異は癌のおよそ50％に認められ、その変移の検出は癌の発生、診断、治療などに極めて重要な意義を有する。しかしながら癌組織でのP53 遺伝子の変異部位は一定しておらず、幾種類もの変異が見いだされているため、p53 遺伝子の変移を検出・同定するには多大の労力と時間を要した。それ故にP53 の変異を測定する代わりに本発明の新しい標的たんぱく質ＧＭＬ遺伝子の発現または蛋白質自体を測定することによって、P53 の変異、機能失活を判定することが可能となり、癌の診断手段として期待される。また、ＧＭＬ遺伝子を癌病巣部に発現させる遺伝子治療への応用、P53 機能に依存せずにＧＭＬを発現させる薬剤のスクリ−ニング法への応用、逆にＧＭＬの発現を抑制する医薬、アンチセンス医薬への応用など期待される。
【００４４】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１５８
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
トポロジ−：直鎖状
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリ−名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリ−
配列
配列番号：２
配列の長さ：７２２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ホモサピエンス
直接の起源
ライブラリ−名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリ−
配列
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
配列番号：４
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
配列番号：５
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
配列番号：７
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
配列番号：８
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
配列番号：９
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ−：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＷ480 細胞株におけるp53 によるＧＭＬ遺伝子の発現。Ｗ：野生型p53 、Ｍ：変異型p53
【図２】食道癌細胞株におけるＧＭＬ遺伝子の発現。Ｗ：野生型p53 、Ｍ：変異型p53
【図３】食道癌細胞株における、抗癌剤（Bleomycinn,CDDP)感受性とＧＭＬ発現の相関。
Claims (10)
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２に記載のＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ。
- 請求項１または２に記載のＤＮＡを含有するベクター。
- 請求項３に記載のベクターを保持する形質転換体。
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質。
- 請求項４に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収することを含む、請求項５に記載の蛋白質の製造方法。
- 配列番号２に記載の塩基配列の全部または少なくとも２６塩基を含む１本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡプローブ。
- 配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも２６塩基を含む１本鎖ＤＮＡからなる、配列番号２に記載のＤＮＡを増幅させるためのＤＮＡプライマー。
- 請求項５に記載の蛋白質と結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体。
- 請求項７または８に記載のプローブまたはプライマーを用いることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡの解析方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP09255996A JP3729924B2 (ja) | 1996-04-15 | 1996-04-15 | ｐ５３ 標的蛋白質ＧＭＬ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09255996A JP3729924B2 (ja) | 1996-04-15 | 1996-04-15 | ｐ５３ 標的蛋白質ＧＭＬ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09275983A JPH09275983A (ja) | 1997-10-28 |
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Family
ID=14057788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09255996A Expired - Lifetime JP3729924B2 (ja) | 1996-04-15 | 1996-04-15 | ｐ５３ 標的蛋白質ＧＭＬ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3729924B2 (ja) |
-
1996
- 1996-04-15 JP JP09255996A patent/JP3729924B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09275983A (ja) | 1997-10-28 |
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