JPH0977792A - Ｔｂｐと複合体を形成する蛋白質、その遺伝子及び抗体ならびにそれらを用いた癌の診断法 - Google Patents

Ｔｂｐと複合体を形成する蛋白質、その遺伝子及び抗体ならびにそれらを用いた癌の診断法

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JPH0977792A
JPH0977792A JP7236263A JP23626395A JPH0977792A JP H0977792 A JPH0977792 A JP H0977792A JP 7236263 A JP7236263 A JP 7236263A JP 23626395 A JP23626395 A JP 23626395A JP H0977792 A JPH0977792 A JP H0977792A
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protein
dna
leu
cancer
antibody
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JP7236263A
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Toshihiko Kishimoto
利彦 岸本
Takaaki Tamura
隆明 田村
Yasutaka Makino
泰孝 牧野
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Sumitomo Electric Industries Ltd
Original Assignee
Sumitomo Electric Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 TＢＰと複合体を形成する新規蛋白質、及び
癌でその発現が減少する蛋白質、これらの蛋白質に対す
る抗体及び該抗体による該蛋白質の検出法、癌でその発
現が減少する蛋白質の抗体による癌診断法の提供。これ
らの蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ及びこれによ
る該蛋白質の作製方法の提供。 【解決手段】 ＴＢＰと複合体を形成する分子量１２０
ｋＤの蛋白質（ＴＩＰ１２０）の遺伝子（ＴＩＰ１２０
遺伝子）の塩基配列及びこれがコードするアミノ酸配列
を決定。さらに、ＴＩＰ１２０遺伝子がコードする組み
換え蛋白質を作製も、該組み換え蛋白質が天然に存する
ＴＩＰ１２０と同じ性質を有することを確認。また、該
蛋白質をそれが由来する以外の動物に免疫することによ
り、該蛋白質に対する抗体を得、該蛋白質の抗原性を確
認。さらに、ＴＩＰ１２０遺伝子が癌で減少することを
確認し、ＴＩＰ１２０遺伝子又はＴＩＰ１２０の検出に
より癌診断の可能性を確認。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物の各組織
に広く存在し、ＴＢＰと複合体を形成する蛋白質及び癌
でその発現が減少する蛋白質、それらをコードするＤＮ
Ａ又はＲＮＡ及び該蛋白質に対する抗体に関するもので
ある。また、該ＤＮＡ又はＲＮＡを用いて該蛋白質を作
製することに関するものである。また、癌でその発現が
減少する蛋白質または該蛋白質をコードするＤＮＡ又は
ＲＮＡの検出方法および該検出方法を利用した癌の診断
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】癌の発症は遺伝子の何らかの異常によっ
て起こることが知られており、特に、遺伝子の転写レベ
ルでの変動異常が癌の発症の主たる原因となると考えら
れている（『Ｓｃｉｅｎｃｅ』Ｖｏｌ．２２２、１９８
３、ｐｐ７６５〜７７１）。癌の原因遺伝子の究明は、
癌の発症機構の解明や癌の診断法、治療法の開発等を実
現するために不可欠な重要課題であり、該遺伝子の探索
は１９８０年頃よりさかんに行われてきた。
【０００３】一方、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ）は、遺伝子転写における中心的な因
子であり、生物の全遺伝子の転写に関わっていることが
知られている（『Ｃｅｌｌ』Ｖｏｌ．６８、１９９２、
ｐｐ８１９〜８２１及び『Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ』Ｖｏ
ｌ．７、１９９３、ｐｐ１２９１〜１３０８）。具体的
には、ＤＮＡからｍＲＮＡへの翻訳が行われるときにＴ
ＢＰが該ＤＮＡのプロモーター領域に結合することで遺
伝子の転写制御が行われている。各遺伝子のそれぞれ異
なる転写制御に対応するだけの機能をＴＢＰは持つこと
になるが、これはＴＢＰが他の多様な蛋白質と複合体を
形成することで、その相手の蛋白質や複合体の構造によ
り、それぞれの機能を持つことになると考えられている
（『転写制御のメカニズム』ｐｐ１１０〜１１２（羊土
社、１９９５））。
【０００４】ＴＢＰと複合体を形成する蛋白質として
は、これまでにもＴＡＦｓ（ＴＢＰａｓ ｓｏｃｉａｔ
ｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）やＤｒ１、Ｄｒ２といった遺
伝子の転写に関連すると考えられるものから、Ｔａｔ、
ｐ５３、Ｒｂ等の癌関連遺伝子等まで幅広く同定されて
いる。しかし、ＴＢＰが数百万種類ともいわれる遺伝子
の転写を制御することと、その多面的な機能と考える
と、これらの同定された既知のＴＢＰと複合体を形成す
る蛋白質以外にもまだまだ重要な蛋白質が未同定のまま
であると言わざるを得ない状況である。
【０００５】ところで、従来の新規遺伝子の取得は、生
化学的な手法等を用いて同定した蛋白質の情報をもとに
行われていた。得られた蛋白質からの遺伝子の取得は、
遺伝子工学的な手法を用いて遺伝子ライブラリーと呼ば
れる遺伝子の集団から選択されていた。この選択方法
は、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏ
ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９
８９年）Ｃｈａｐｔｅｒ８，９，１２に示されるよう
に、得られた蛋白質の情報をもとに遺伝子プローブと呼
ばれるものを作製し、この遺伝子プローブに対応する遺
伝子を遺伝子ライブラリーよりコロニー／プラークハイ
ブリダイゼーションという方法により取得するものであ
る。また、同書Ｃｈａｐｔｅｒ８，９，１１，１２に示
されているが、目的とする蛋白質に対する特異的な抗体
が存在する場合、この抗体を用いて該抗体が認識する蛋
白質を識別し、該蛋白質の素となる遺伝子を遺伝子ライ
ブラリーから取得することが可能である。
【０００６】しかしながらこれらの方法では、生化学的
に蛋白質を同定する場合では同定する蛋白質の量が多い
こと、また抗体を用いる場合では抗体が認識する蛋白質
が抗原性の高いものであることが必要であり、これらの
条件を満たさない場合は、重要な蛋白質であってもそれ
を取得することが非常に困難であり、従って該蛋白質を
コードする遺伝子の取得も非常に困難であった。ところ
が、一昨年になって、本発明者のうちの田村、牧野によ
って、これらの問題を克服する方法が報告され（『バイ
オマニュアルシリーズ５ 転写因子研究法』ｐｐ１１〜
１６、ｐｐ２７〜３７、ｐｐ１８９〜１９６及びｐｐ２
１５〜２１９（羊土社、１９９３年））、それまで取得
が困難であった遺伝子についても、その取得がなされる
ことが期待されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ＴＢＰと
複合体を形成する蛋白質の取得およびその機能解析と同
時に癌の原因遺伝子の究明のため、鋭意研究を続け、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、新規な
ＴＢＰと複合体を形成する蛋白質の提供を目的とするも
のである。さらに、本発明は癌でその発現が減少する蛋
白質の提供を目的とするものである。さらに、本発明は
これらの蛋白質に対する抗体を提供することを目的とす
るものである。さらに、本発明は該抗体を用いて該蛋白
質の検出を可能ならしめることを目的とするものであ
る。さらに、本発明は癌でその発現が減少する蛋白質の
抗体を用いて癌の診断を可能ならしめることを目的とす
るものである。また、本発明は、これらの蛋白質をコー
ドする遺伝子を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は該遺伝子を用いて該蛋白質の検出およ
び癌の診断を可能ならしめることを目的とするものであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記の田
村、牧野の方法にさらに手を加えて、ＴＢＰと複合体を
形成する蛋白質でその分子量が１２０ｋＤである蛋白質
（ＴＩＰ１２０と命名した。）の遺伝子（ＴＩＰ１２０
遺伝子）の塩基配列を決定した。そして、該遺伝子がコ
ードするアミノ酸配列を決定した。さらに、ＴＩＰ１２
０遺伝子がコードする組み換え蛋白質を作製し、該組み
換え蛋白質が天然に存するＴＩＰ１２０と同じ性質を有
することを確認した。また、該蛋白質を該蛋白質が由来
する動物以外の動物に免疫することにより、該蛋白質に
対する抗体を得、該蛋白質の抗原性を確認した。さら
に、ＴＩＰ１２０遺伝子が癌で減少することを確認し
た。すなわち、このことは該遺伝子がコードするＴＩＰ
１２０の発現が癌で減少することを意味する。そして、
ＴＩＰ１２０遺伝子又はＴＩＰ１２０の検出により癌の
診断が可能であることを示すものである。もちろん、Ｔ
ＩＰ１２０の検出に該蛋白質に対する抗体を用いること
は非常に有効である。
【０００９】すなわち、本発明は、ＴＢＰと複合体を形
成し且つ配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列と
のホモロジーが３０％以上である蛋白質に関するもので
ある。また、本発明は、ＴＢＰと複合体を形成し且つ配
列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジ
ーが４０％以上である蛋白質に関するものである。ま
た、本発明は、組織の癌が進行するにつれて該組織で発
現される量が減少する前記の蛋白質に関するものであ
る。また、本発明は、肝臓において癌が進行するにつれ
てその発現が減少する前記の蛋白質に関するものであ
る。
【００１０】また、本発明は、配列表の配列番号２で表
される塩基配列のＤＮＡのコード領域の全部、又は連続
する８個以上のアミノ酸をコードする一部とハイブリダ
イズするＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされる蛋白質に
関するものである。また、本発明は、配列表の配列番号
１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に関するもの
である。また、本発明は、前期の蛋白質をコードするＤ
ＮＡ又はＲＮＡの非コード領域を含む塩基配列のうちの
連続する１２塩基以上から成り且つＧＣ含有率が３０〜
７０％であるＤＮＡ又はＲＮＡに関するものである。ま
た、本発明は、前期の蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲ
ＮＡの非コード領域を含む塩基配列のうちの連続する１
６塩基以上から成り且つＧＣ含有率が３０〜７０％であ
るＤＮＡ又はＲＮＡに関するものである。
【００１１】また、本発明は、配列表の配列番号２で表
される塩基配列のうちの連続する１２塩基以上から成り
且つＧＣ含有率が３０〜７０％であるＤＮＡに関するも
のである。また、本発明は、配列表の配列番号２で表さ
れる塩基配列のうちの連続する１６塩基以上から成り且
つＧＣ含有率が３０〜７０％であるＤＮＡに関するもの
である。また、本発明は、前期の蛋白質をコードするＤ
ＮＡ又はＲＮＡの塩基配列のうちのコード領域部分のう
ちの連続して８個以上のアミノ酸をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡに関するものである。
【００１２】また、本発明は、配列表の配列番号２で表
される塩基配列のＤＮＡの３５５番目のＡから４０４４
番目のＴ迄のコード領域部分のうちの連続して８個以上
のアミノ酸をコードするＤＮＡ、又は該ＤＮＡとハイブ
リダイズするＲＮＡに関するものである。また、本発明
は、式（１）ＣＡＴ ＧＡＮ ＡＴＧ ＣＴＮ ＣＣＮ
ＧＡＮＴＴＣ ＴＡＣ、式（２）ＣＡＴ ＧＡＮ Ａ
ＴＧ ＴＴＡ ＣＣＮ ＧＡＮＴＴＣ ＴＡＣ、又は式
（３）ＣＡＴ ＧＡＮ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＣＮ ＧＡ
Ｎ ＴＴＣ ＴＡＣ（ただし、Ａはアデニン、Ｔはチミ
ン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｎはアデニン又はチ
ミン又はグアニン又はシトシン又はイノシンである塩基
を表す）からなる塩基配列群のいずれかであるＤＮＡに
関するものである。また、本発明は、前記の式（１）〜
（３）の塩基配列で表されるＤＮＡとハイブリダイズす
るＲＮＡに関するものである。また、本発明は、化学修
飾された前記のＤＮＡ又はＲＮＡに関するものである。
【００１３】また、本発明は、前記の各蛋白質に対する
抗体（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）に
関するものである。また、本発明は、前記の各蛋白質を
検出する方法に関するものである。また、本発明は、前
記の各蛋白質を検出する方法であって、該蛋白質に対す
る抗体を用いることを特徴とする検出方法、該蛋白質を
分解または修飾する酵素反応を用いることを特徴とする
検出方法、又は少なくとも該蛋白質をコードするＤＮＡ
又はＲＮＡを検出するステップを含むことを特徴とする
検出方法に関するものである。また、本発明は、哺乳動
物の各組織の癌の発症および進行程度を診断する診断方
法であって、前記の各蛋白質を該蛋白質に対する抗体を
用いて該組織から検出することを特徴とする診断方法、
該蛋白質を分解または修飾する酵素反応を用いることを
特徴とする診断方法、又は少なくとも該蛋白質をコード
するＤＮＡ又はＲＮＡを該組織から検出するステップを
含むことを特徴とする診断方法に関するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明では、後述するように、実
施例としてラットの肝臓から、ＴＢＰと複合体を形成す
るＴＩＰ１２０を単離したが、ＴＢＰが生物の全ての遺
伝子の転写の中心因子であることから、ラット以外の生
物が今回単離した蛋白質と同じ機能をもつ蛋白質を有し
ていることは当然のことと考えられる。また、実施例４
で実証したように各組織に広く存在することから、肝臓
だけではなく各組織での癌の発症に関与する蛋白質であ
ることも当然のことと考えられる。もちろん、種によっ
てそのアミノ酸配列にいくらかの相違はあるが、一般的
には異種間の同一機能の蛋白質については３０％〜４０
％以上のホモロジーがあると言われている。ここでいう
ホモロジーがあるということは、一般に言われているの
と同じく、同族アミノ酸をポジティブとカウントする算
出法によるものであり、アミノ酸鎖の長さが異なる場合
は、アミノ酸鎖が短い方の蛋白質の長さに対して、ホモ
ロジーがある部分の割合がいくらかを表す。
【００１５】したがって、本発明のＴＩＰ１２０は由来
する動物の種によらず以下の２点により特徴付けされ
る。 ＴＢＰと複合体を形成する。 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と３０％以
上、望ましくは４０％以上のホモロジーを有する。 ＴＢＰと複合体を形成するかどうかについては、例えば
実施例７に示した方法を用いて確認すればよい。また、
ＴＩＰ１２０をコードする遺伝子は、上で定義したＴＩ
Ｐ１２０をそれぞれコードする遺伝子である。本発明
は、ＴＩＰ１２０の抗原性について、実施例６に例示す
るように、該ＴＩＰ１２０が由来する動物以外の動物に
免疫することで容易に抗体が得られるものであることを
明らかにするものである。したがって、本発明のＴＩＰ
１２０に対する抗体は、同様の方法、すなわちＴＩＰ１
２０を該ＴＩＰ１２０が由来する動物以外の動物に免疫
感作することにより得られる抗血清及びポリクローナル
抗体をその範囲内に含む。
【００１６】また、免疫原として、蛋白質の一部であっ
ても該蛋白質の一部をウシ血清アルブミンなどの他のキ
ャリアー蛋白質に結合させたものを用いることは、よく
用いられる方法である。該蛋白質の一部は、例えばペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。なお、蛋白質の一
部としては、８アミノ酸残基以上であることが好まし
い。抗原性が明らかとなった物質については、免疫感作
によってポリクローナル抗体が得られるならば、該免疫
した動物のリンパ球を用いたハイブリドーマによりモノ
クローナル抗体が産生されることはよく知られている
（『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）Ｃ
ｈａｐｔｅｒ６）。したがって本発明のＴＩＰ１２０に
対する抗体はモノクローナル抗体もその範囲内に含むも
のである。
【００１７】ＴＩＰ１２０の検出については、抗体を用
いる方法、酵素反応を利用する方法、ＴＩＰ１２０遺伝
子を検出する方法が挙げられる。抗体を用いる方法とし
ては具体的には、ＴＩＰ１２０に対する抗体を用いて
ＴＩＰ１２０を検出する方法、ＴＩＰ１２０に対する
抗体および該抗体の標識二次抗体を用いてＴＩＰ１２０
を検出する方法が挙げられる。標識としては、例えば放
射性同位元素（ＲＩ）、酵素、アビジン又はビオチン、
もしくは蛍光物質（ＦＩＴＣやローダミン等）が利用さ
れる。
【００１８】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ＥＬＩＳＡが挙げられる。また、遺伝子を検出する
方法としては具体的には、ノーザンブロットハイブリダ
イゼーション法やＲＴ−ＰＣＲ法（『Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ』（Ｇｒｅｅｕｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｊｕｔｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｃｈａｐｔｅｒ１５）又はインサイ
チュハイブリダイゼーション法（同書Ｃｈａｐｔｅｒ１
４）が挙げられる。なお、ハイブリダイズの条件は、プ
ローブの長さや使用するメンブランにより最適な条件が
異なる。つまり、ハイブリダイズ条件は自ずから或る幅
をもつものである。本発明の実施例では、使用したメン
ブランの性質と得ようとしたプローブの長さにおける最
適な条件を開示するものであり、メンブランやプローブ
の長さが異なれば当然異なるハイブリダイズ条件でもハ
イブリダイズし得る。例えば、ピロリン酸ナトリウムが
なくてもハイブリダイズする場合もある。その範囲とし
ては、目安としては以下の条件程度であると言える。
【００１９】ハイブリダイズ条件： プレハイブリダイゼーション ６以上１０以下ｘＳＳＣ ５以上１０以下ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．１％以下ピロリン酸ナトリウム 約１００μｇ／ｍｌ熱変性ＤＮＡ ０．１以上１％以下ＳＤＳ 総液量 約５０ｍｌ 反応温度３５以上３７℃以下 反応時間５０以上７０分間 ハイブリダイゼーション ６以上１０以下ｘＳＳＣ ５以上１０以下ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．１％以下ピロリン酸ナトリウム 約１００μｇ／ｍｌ熱変性ＤＮＡ １ｘ１０5 以上２ｘ１０6 ｃｐｍ／ｍｌ以下ｃＤＮＡプ
ローブ 反応温度３５以上４２℃以下 反応時間１２時間２０時間以下
【００２０】これらの遺伝子の検出のために用いるプロ
ーブはＤＮＡでもＲＮＡでもどちらでも用いることがで
きる。さて、ヒトの蛋白質の種類は３ｘ１０9 個といわ
れている。１６塩基のＤＮＡは４16種類存在するので、
この長さのＤＮＡがあればヒトの蛋白質を全て識別でき
る。すなわち、プローブとして必要な長さは理論的には
１６塩基である。実用上もこの長さ以上であることが望
ましいことは言うまでもないが、実用的には１２塩基以
上で用いられることが多い。また、プローブとして用い
る箇所は、ＧＣ含有率が３０〜７０％であれば、非コー
ド領域、コード領域のいずれも使用可能である。
【００２１】ＤＮＡ又はＲＮＡをを化学合成するとき
に、側鎖をメチル化すること、あるいはビオチン化する
こと、もしくはリン酸基部分のＯをＳ置換すること等の
化学的に修飾することはよく知られている。例えば、配
列表の配列番号２又は４に記載のＤＮＡを化学合成する
ときに、該化学修飾を行い、配列表に示されたＤＮＡそ
のものと異なるものを合成することが可能である。した
がって、本発明のＤＮＡ及びＲＮＡは、該化学修飾され
たＤＮＡ及びＲＮＡをその範囲に含むものである。
【００２２】ＴＩＰ１２０の検出による癌の診断につい
ては、被験者から採取した組織又は細胞中に該蛋白質が
存するかを調べることにより行える。また、ＴＩＰ１２
０が細胞外に分泌又は放出される場合には、被験者の血
液中のＴＩＰ１２０の有無を調べることにより癌の診断
が可能である。具体的には、前記の検出方法と同様に行
えばよい。また、ＴＩＰ１２０遺伝子による癌の診断に
ついては、被験者から採取した組織又は細胞中に該遺伝
子が存するかを調べることにより行える。遺伝子の検出
方法は、前記のようにノーザンブロットハイブリダイゼ
ーション法やＲＴ−ＰＣＲ法、インサイチュハイブリダ
イゼーション法が挙げられる。
【００２３】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳述す
るが、前述のように、本発明はこの例に限定されるもの
ではない。 ＜実施例１＞ＴＩＰ１２０遺伝子の単離及びＴＩＰ１２
０のアミノ酸配列の決定 １．ラット核抽出液中蛋白質の精製 １）『バイオマニュアルシリーズ５ 転写因子研究法』
ｐｐ２７〜３７（１９９３年、羊土社）に記載の方法の
通りにラット肝細胞核抽出液を２５ｍｌ調製した。 ２）『バイオマニュアルシリーズ５ 転写因子研究法』
ｐｐ２１５〜２１９（１９９３年、羊土社）に記載の方
法を基としてラット肝細胞核抽出液から蛋白質を単離し
た。
【００２４】実際には、ＴＦＩＩＤ画分の代わりにラッ
ト肝細胞核抽出液を用いた。該ラット肝臓核抽出液は、
５２℃で２０分間熱処理を行った後、上述の蛋白質の単
離を行った。図１に示すように４７℃、５２℃と熱処理
の温度を上げていくことにより精製後のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの像において、目的とする１２０ｋＤの蛋白質付近の
夾雑蛋白質が消失していくのがわかる。この熱処理の結
果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の目的蛋白質に相当する部分の
バンドの切り出し（次項を参照）が正確に行えるように
なった。また、このことはＴＩＰ１２０が５２℃で２０
分間での熱耐性があることを示している。また、ＨＸ−
ＴＢＰにはヒスチジンタグ（ヒスチジンが６個連続した
もの）付のものを用いた。これにより、Ｎｉ−アガロー
スを用いた精製が可能となった。プロトコルの変更点
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ時に銀染色を行わず、メンブラン
に転写後クマシーブリリアントブルー染色をし、アミノ
酸マイクロシーケンスを可能としたことであった。
【００２５】２．ラット核抽出液中蛋白質の部分アミノ
酸配列の決定 １）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、エレクトロブロッティング
装置（日本エイドー製）を用いて、常法によりゲルから
メンブラン（ミリポア製）に蛋白質を転写した。その後
クマシーブリリアントブルー染色した。 ２）メンブランに転写された蛋白質のうち１２０ｋＤの
蛋白質の部分をカッターナイフを用いて切り出し、これ
をトリプシン消化後、高速液体クロマトグラフィーで各
ペプチド断片に分画し、そのうち一つをプロテインシー
クエンサー（ベックマン製）で解析した。マイクロシー
クエンスの結果、次式（１）で表される部分アミノ酸配
列であることが分かった。 Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ ・・・（１）
【００２６】３．ラット肝細胞核抽出液中蛋白質に対応
するＤＮＡプローブの合成 １）式（１）で表されるアミノ酸配列より、該アミノ酸
配列に対応する、次式（２）〜（４）で表されるＤＮＡ
プローブをＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ製）を用いて合成し
た。 ＣＡＴ ＧＡＩ ＡＴＧ ＣＴＩ ＣＣＩ ＧＡＩ ＴＴＣ ＴＡＣ ・・・（２） ＣＡＴ ＧＡＩ ＡＴＧ ＴＴＡ ＣＣＩ ＧＡＩ ＴＴＣ ＴＡＣ ・・・（３） ＣＡＴ ＧＡＩ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＣＩ ＧＡＩ ＴＴＣ ＴＡＣ ・・・（４） なお、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃは
シトシン、Ｉはイノシンである各塩基を表す。なお、Ｉ
の代わりにＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれを用いてもよい。
【００２７】２）式（２）〜（４）で表されるＤＮＡプ
ローブをＴａｋａｒａ ＭＥＧＡ．ＬＡＢＥＬTMキット
（宝酒造製）を用いて取扱説明書の通りに標識した。 ３）次に、下記の組成のＤＮＡ反応液を調製し、この液
を３７℃で３０分間インキュベートした後、７０℃で１
０分間熱処理し、酵素を失活させた。 ＤＮＡプローブ（２ｐｍｏｌ／μｌ） ３μｌ １０倍ホスホライレイション緩衝液 ３μｌ 〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（３７０ＭＢｑ／ｍｌ）（アマシャム製） ５μｌ Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ １μｌ 合計１０μｌ ４）Ｔ５０Ｅ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．
０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５TM（ファルマシア製）を１．５ｍｌポリプレ
ップカラム（バイオラッド製）に詰め、３）で熱処理を
したＤＮＡ反応液を該カラムに載せた。 ５）その後、４００μｌＴ５０Ｅをカラムに２回流し、
２回目の４００μｌで溶出してきた画分をＤＮＡプロー
ブ画分として以後の操作に用いた。
【００２８】４．ラット肝細胞核抽出液中蛋白質に対応
するＤＮＡプローブを用いたラット肝臓ｃＤＮＡライブ
ラリーからの遺伝子の取得 １）ウィスター系ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、
タイムセイバーｃＤＮＡシンセシスキットTM（ファルマ
シア製）を用いて常法により作製した。該ｃＤＮＡライ
ブラリーを用いて１０6 程度のプラークをＮＺＹ寒天培
地上に作製した。このｃＤＮＡライブラリーを『Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ』（１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）Ｃｈ
ａｐｔｅｒ９に記載の方法に従ってニトロセルロース膜
（ミリポア製）上に固定した。その後、この膜を２ｘＳ
ＳＣで６０℃で洗浄した。
【００２９】２）３．で得られた標識化ＤＮＡプローブ
画分のうち１５０μｌを、該膜上に固定したプラークの
ｃＤＮＡプローブと以下の条件でハイブリダイズさせ
た。 プレハイブリダイゼーション ６ｘＳＳＣ ５ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．０５％ ピロリン酸ナトリウム １００μｇ／ｍｌ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｈｅｒｒｉｎ
ｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ０．５％ＳＤＳ 総液量 ５０ｍｌ 反応温度３７℃ 反応時間１時間 ハイブリダイゼーション ６ｘＳＳＣ １ｘＤｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．０５％ ピロリン酸ナトリウム １００μｇ／ｍｌ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｈｅｒｒｉｎ
ｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ １ｘ１０6 ｃｐｍ／ｍｌｃＤＮＡプローブ 総液量５０ｍｌ 反応温度４２℃ 反応時間１８時間
【００３０】３）ハイブリダイズの終了したニトロセル
ロース膜を以下の条件で１回ずつ洗浄した。 ６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ５００ｍｌ 温度４０℃ 時間２０分間 ３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ５００ｍｌ 時間４２℃ 時間２０分間 ４）洗浄したニトロセルロース膜はＫＯＤＡＫ ＸＡＲ
５フィルムに−８０℃で一晩露光し、オートラジオグラ
フとした。 ５）得られたオートラジオグラフから、陽性のプラーク
の位置を決定し、対応する寒天上のプラークをＳＭ溶液
に回収した。 ６）回収したプラークは、常法により再度ＮＺＹ寒天培
地上にプラーク形成を行わせ、ニトロセルロース膜上に
固定した。 ７）２）〜６）の過程を３回繰り返した。その結果、陽
性のプラークは単一なものとなった。該プラークを回収
し、１００μｌのＳＭ溶液に懸濁し、ファージを安定化
させた。該プラークから単離した遺伝子をＴＩＰ１２０
遺伝子と名付けた。
【００３１】５．ＴＩＰ１２０遺伝子の大量調製 １）ＳＭ溶液に懸濁したプラークのファージ５０μｌと
Ｙ１０９０ｒ−大腸菌２０μｌを混合し、３７℃、１５
分間放置した。 ２）その後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１０
ｍｌＮＺＹ培地に１）で混合した溶液を移し、３７℃で
６時間培養した。 ３）８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を回収し
た。 ４）該上清に、５Ｍ ＮａＣｌを１ｍｌ、ポリエチレン
グリコール６０００を１．１ｇを加え、溶かした。 ５）該溶液を氷上に１時間置き、その後１００００ｒｐ
ｍ、４℃で２０分間遠心分離を行った。 ６）沈殿を回収し、７００μｌのＳＭ溶液に懸濁した。 ７）クロロホルムを５００μｌ加えて撹拌し、残った大
腸菌を溶かした。 ８）５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、水層を回収
した。
【００３２】９）これに、１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ
Ａ、５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（共にシグマ製）を各
１μｌずつ加え、３７℃で１時間放置したのち、２０％
ポリエチレングリコール６０００（０．８Ｍ ＮａＣ
ｌ）を６００μｌ加え、氷上に３０分間放置した。 １０）４℃で、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し
た後、沈殿を回収した。 １１）この沈殿に５００μｌのＳＭ溶液、５０μｌの５
Ｍ ＮａＣｌ、５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加え、
更に、４００μｌのフェノールを加えて撹拌し、ファー
ジを溶かしてｃＤＮＡを遊離させた。 １２）該溶液を室温で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分
離した後、水層を回収した。これに１ｍｌのエタノール
を加え、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、液層
を捨てた。 １３）７０％エタノール１ｍｌで沈殿を洗浄し、１００
μｌのＴＥ溶液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０ １０ｍ
Ｍ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に沈殿を溶かし、ＤＮＡ溶液を
得た。
【００３３】６．ＴＩＰ１２０遺伝子のベクターへの挿
入 １）ＤＮＡ切断の系を以下のようにし、制限酵素Ｎｏｔ
Ｉ（宝酒造製）によるＤＮＡ切断を行った。 ＤＮＡ溶液（５．で調製したもの） ２０μｌ ０．１％ＢＳＡ １０μｌ ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ １０μｌ ＮｏｔＩ（Ｔａｋａｒａ製） ２μｌ ＲＮａｓｅＡ（日本ジーン製） １μｌ １０ｘＨ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造製） １０μｌ 滅菌水 ４７μｌ 合計１００μｌ 反応温度３７℃ 反応時間４時間 ２）その後、０．７％ＮｕＳｉｅｖｅTMＧＴＧアガロー
ス（宝酒造製）電気泳動を行い、４．５ｋｂｐ付近のＤ
ＮＡを切り出し、このＤＮＡをＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ
ＩＩTM（フナコシ製）を用いて取扱説明書の通りにＤＮ
Ａを回収した。
【００３４】３）ＤＮＡを組み込むｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩ（ストラタジーン製）にＮｏｔＩで切断後脱リ
ン酸化を行った。 ＮｏｔＩでの切断は、以下の系で行った。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（１μｇ／μｌ） ３μｌ １０ｘＨ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ ０．１％ＢＳＡ ２μｌ ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ２μｌ ＮｏｔＩ ２μｌ 滅菌水 １０μｌ 合計 ２０μｌ 反応温度３７℃ 反応時間一晩
【００３５】その後、２μｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０を加え、１μｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａ
ｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造製）を加
え、６５ ℃で１時間放置し、脱リン酸化した。 その後、フェノール／ＣＨＣｌ3 抽出を常法に従い２
回行い酵素を失活させた後、エタノール沈殿により精製
し、ＴＥ溶液にて１００μｇ／μｌに溶かした。 ２）で得られたＤＮＡと、で得られたｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩを、以下の系で反応させ、ＤＮＡをベク
ターに挿入した。 ＤＮＡ（約４．５ｋｂｐ、２）で調製したもの） ５μｌ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＮｏｔＩ切断物（で調製したもの） １μｌ １０倍ライゲーションバッファー（日本ジーン製） ２μｌ Ｔ４リガーゼ（日本ジーン製） １μｌ 滅菌水 １１μｌ 合計２０μｌ 反応温度１６℃ 反応２時間
【００３６】７．ＴＩＰ１２０遺伝子の大腸菌への導入 常法に従い反応液を全て、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９コン
ピテントセル（宝酒造製）に混合し、氷上で３０分間、
４２℃で４５秒間、氷上で３分間反応させた後、ＳＯＣ
培地９００μｌを加え、３７℃、１時間置き、ベクター
をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に導入した。その後、Ｅ．ｃ
ｏｌｉＪＭ１０９を回収した。なお、このＴＩＰ１２０
遺伝子を導入した組み換え体大腸菌を工業技術院生命科
学研究所に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１６
３）。
【００３７】８．ＴＩＰ１２０遺伝子の塩基配列の決定 １）７．で回収したＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９をＬＢ寒天
培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭＩＰ
ＴＧ、０．００４％Ｘ−ｇａｌ含有）に撒き、３７℃で
１６時間培養した。 ２）形成されたコロニーのうち、白色のコロニーを２ｍ
ｌ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に植
え、３７℃で１６時間培養した ３）その後、１２０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して集
菌し、Ｍａｇｉｃ ＭｉｎｉｐｒｅｐTM（プロメガ製）
に従いプラスミドＤＮＡ溶液を回収した。 ４）回収したＤＮＡをＴ７シークエンシングキット（フ
ァルマシア製）に従い、シークエンスし、全塩基配列を
決定した。結果を配列表の配列番号２に示す。 ９．ＴＩＰ１２０のアミノ酸配列の決定 ８．で決定した塩基配列から、ＴＩＰ１２０のアミノ酸
配列を決定した。結果を配列表の配列番号１に示す。
【００３８】＜実施例２＞ＴＩＰ１２０蛋白質の作製 ＴＩＰ１２０遺伝子を試験管内で作製し、その機能の確
認として熱耐性試験を行った。 １．ｉｎ ｖｉｔｏｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ 実施例１の６．で得られたｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔＩＩ
上に挿入したＴＩＰ１２０遺伝子を用いて、ＴＮＴ Ｔ
３ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙ
ｓａｔｅ ＳｙｓｔｅｍTM（プロメガ製）を用いて製品
説明書に従い、Ｓ３５−メチオニンでラベル化されたＴ
ＩＰ１２０蛋白質を試験管内で作製した。
【００３９】２．熱耐性試験 得られた産物を、そのまま、５２℃で２０分熱処理
した後、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけて分
析した。なお、コントロールとしてラット核抽出液から
精製したＴＩＰ１２０蛋白質も同時にＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動にかけた。結果を図３に示す。図３において、
ｌａｎｅ１はコントロール、ｌａｎｅ２は熱処理せずそ
のまま使用したサンプル、ｌａｎｅ３は５２℃で熱処理
したサンプルである。いずれも１２０ｋＤに目的とする
バンドが検出され、作製されたＴＩＰ１２０が、分子量
が天然物と同じく１２０ｋＤであることと５２℃、２０
分間の熱耐性があることが確認された。なお、ＴＢＰと
の結合についての確認は実施例７で詳述する。
【００４０】＜実施例３＞ＴＩＰ１２０遺伝子のラット
肝臓癌発癌状態での発現の確認 １．各種ラット肝臓の調製 １）５週齢のウィスター系ラット１０匹を購入し、うち
７匹にＤＥＮ（ジエチルニトロソアミン）を０．２ｍｇ
／ｇラットの濃度で腹腔内投与し、１２，２４，４８時
間後に各１匹ずつラットを殺し、肝臓を採取し、液体窒
素中で保存した。 ２）残りのＤＥＮ投与ラットは、２週間後、ＡＡＦ（ア
ミノアセチルフルオレン）を０．０２％含むエサの継続
的経口投与（１回／日）を開始した。さらに、１週間
後、再生肝手術を行い、その後１，３，５，７カ月に癌
化した肝臓を採取し、液体窒素中で保存した。 ２．ＲＮＡの調製 『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ１９８９）
ｐｐ７．３−７．８４に記載のチオシアン酸グアニジン
法に従い、各種ラット肝臓のＲＮＡを調製した。実際に
は、各種ラット肝臓１ｇをそれぞれ液体窒素中で粉砕し
た後、５０ｍｌの５．５Ｍチオシアン酸グアニジン液に
加えホモジナイズした後、プロトコール通りに超遠心分
離を行い、さらに精製を行いＲＮＡ標品を得た。また得
られたＲＮＡ標品は、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３ ｓｕ
ｐｅｒTM（宝酒造製）を用いて製品説明書の方法に従
い、ｐｏｌｙＡ ＲＮＡに精製した。
【００４１】３．プローブＤＮＡの調整 ＴＩＰ１２０遺伝子を用いてハイブリダイゼーション用
のプローブを作製した。作製方法は、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＩＩ上にのせたＴＩＰ１２０遺伝子を制限酵素処
理にて、ＴＩＰ１２０遺伝子部分を切り出し、アガロー
スゲル電気泳動にて目的遺伝子を分離後、ＧＥＮＥ Ｃ
ＬＥＡＮ ＩＩTM（フナコシ製）を用いてＴＩＰ１２０
遺伝子を精製した。精製したＴＩＰ１２０遺伝子を１０
０ｎｇ用いて、ランダムプライムドＤＮＡラベリングキ
ット（ベーリンガーマンハイム製）を用いて製品取扱説
明書に従いα−Ｐ３２ ｄＣＴＰ（アマシャム製）を用
いてＤＮＡプローブを作製し、次のノーザンブロットハ
イブリダイゼーションに用いた。
【００４２】４．ノーザンブロットハイブリダイゼーシ
ョン １）『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏ
ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ１９８
９）ｐｐ７．３−７．８４に記載のノーザンブロット法
（ホルムアルデヒド法）に従いノーザンブロットハイブ
リダイゼーションを行った。ＤＮＡプローブとして３．
で調整したものを用いた。実際には、サンプル調整時の
ＲＮＡはｐｏｌｙＡ ＲＮＡ ３００ｎｇを用いた。ま
た、オートラジオクラフィーの感光時間は４８時間とし
た。 ２）１．〜４．１）の操作により図４に示すＴＩＰ１２
０遺伝子発現のパターンが得られた。図４に明らかなよ
うに、肝臓癌が進むにつれてドットが薄くなっている
（発現量が減少している）ことが判明した。
【００４３】＜実施例４＞ＴＩＰ１２０遺伝子の組織間
分布の確認 組織間分布の確認には、Ｒａｔ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ
TM（クローンテック製）を用いた。この製品は、上述の
ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行うために
市販されている、ラット各組織のｐｏｌｙＡ ＲＮＡを
ブロットしたメンブランである。このメンブランを『Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）ｐ
ｐ７．３−７．８４に記載の方法、及び製品取り扱い説
明書に従い前述のＤＮＡプローブを用いてノーザンブロ
ットハイブリダイゼーションを行った。オートラジオク
ラフィーの感光時間は９６時間とした。その結果を図５
に示す。結果から明らかなように、ＴＩＰ１２０遺伝子
は精巣で強く発現しているが、全組織で発現がみられる
普遍的な遺伝子であることが判明した。
【００４４】＜実施例５＞ＴＩＰ１２０の大量調整 １．ＴＩＰ１２０遺伝子の大量調整 １）組み換えベクターの作製 ＴＩＰ１２０遺伝子を図２に示されるヒスチジンタグを
導入したｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩベクター（インビトロ
ゲン製）に組み込んだ。以下、その詳細を記す。 まず、実施例１の６．で作製したＴＩＰ１２０遺伝子
を挿入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを、Ｐ
ＣＲ法（『Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａ
ｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８
７）ｃｈａｐｔｅｒ１５に記載）により、次の式（５）
及び式（６）の塩基配列のプライマーを用いて、ＴＩＰ
１２０遺伝子の第一メチオニン部分をコードする塩基配
列をＮｃｏＩ認識部位とし、該ＴＩＰ１２０遺伝子部分
を増幅した。 ５’ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＡＧＣ ＧＣＴ ＴＣＧ ＴＡＣ Ｃ ３’ ・・・式（５） ５’ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＧＴＴ ＣＴＧ ３’・・・式（６） 増幅された遺伝子をＮｃｏＩ，ＰｓｔＩで切断した。 別に、実施例１の６．で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩ上のＴＩＰ１２０遺伝子のＣ末端側に存在する
部分をＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩで切断し、遺伝子を切り出
した。 で切り出した遺伝子とで切り出した遺伝子とを、
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｐａｃｋ（日本ジーン製）を用いて
その取扱説明書に従い連結し、ＴＩＰ１２０遺伝子を作
製した。 ヒスチジンタグを導入したｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩベ
クターのＮｃｏＩ，ＢａｍＨＩ部位に、で作製したＴ
ＩＰ１２０遺伝子を組み込んだ（図２）。
【００４５】２）ＴＩＰ１２０遺伝子の大量調整 ＴＩＰ１２０遺伝子を組み込んだプラスミドを『Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）ｃｈａ
ｐｔｅｒ１に記載の方法で大量調製した。なお、プラス
ミドの精製には同書記載の超遠心分離を用いたが、その
回数は３回行った。
【００４６】２．ＴＩＰ１２０の発現 大量調製したプラスミドをリポフェクション法（ＤＯ
ＴＡＰTM（ベーリンガーマンハイム製））によってＳｆ
９細胞に導入した。得られた組み換え体ウィルスを再び
Ｓｆ９細胞に感染させ、大量発現させた。リポフェクシ
ョン後のＳｆ９細胞の扱いや、組み換え体ウィルスの作
製、蛋白質の大量発現等の方法は、すべてＭＡＸＢＡＣ
TM（インビトロゲン製）の製品説明書に従い行った。 ３．ＴＩＰ１２０の精製 Ｎｉ−ＮＴＡアガロースTM（キアゲン製）を用い、製品
説明書記載の方法に準じてＴＩＰ１２０の精製を行っ
た。組み換え体Ｓｆ９細胞はＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ
で懸濁後超音波処理したものを遠心し、その上清をＮｉ
−ＮＴＡアガロースカラムにアプライした。カラムの洗
浄には５０ｍＭの、溶出には２００ｍＭのイミダゾール
を含むＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを使った。
【００４７】＜実施例６＞抗ＴＩＰ１２０抗体の作製 （１）抗体の作製は、実施例５で精製を行ったＴＩＰ１
２０を用いて、『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｏｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）
ｃｈａｐｔｅｒ５に記載の方法に従い、ウサギに免疫
し、抗血清を回収した。 （２）ラット核抽出液から精製したＴＩＰ１２０と、実
施例５で精製したＴＩＰ１２０に、それぞれ抗ＴＩＰ１
２０抗体を用いてウェスタンブロット法による解析を行
った。結果を図６に示す。これにより、抗原抗体反応の
確認及び核抽出液から精製したＴＩＰ１２０と遺伝子工
学的に発現させたＴＩＰ１２０が同じものであることの
確認がなされた。
【００４８】＜実施例７＞ＴＢＰとＴＩＰ１２０との相
互作用の検出 １．抗ＴＢＰ抗体の作製 ＴＢＰを『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』ｃｈａｐｔｅｒ５に記載の方法
にしたがってウサギに免疫し、抗ＴＢＰ抗体を作製し
た。 ２．抗ＴＩＰ１２０抗体による免疫沈降 ＴＢＰとＴＩＰ１２０との相互作用の検出は、『Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ』ｃｈａｐｔｅｒ１１に記載の免疫沈降実験により行
った。ＴＢＰ及びＴＩＰ１２０としては、実施例１の
１．１）で調製したラット核抽出液を使用し、実施例６
で作製した抗ＴＩＰ１２０抗体により免疫沈降させた。
【００４９】３．抗ＴＢＰ抗体によるウェスタンブロッ
ト １．で作製した抗ＴＢＰ抗体を用いて、抗ＴＩＰ１２０
抗体で免疫沈降したラット肝臓核抽出液を、『Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）ｃｈａｐｔｅｒ
１に記載の方法に準じてウェスタンブロット法による解
析を行った。これを抗ＴＢＰ抗体と反応させ、さらに抗
ＴＢＰ抗体をアルカリフォスファターゼで標識した二次
抗体と反応させた。アルカリフォスファターゼを基質
（ＮＢＴ、ＢＣＩＤ（共にプロメガ製））と反応させ、
ゲル上のＴＢＰのバンドを呈色させた。結果を図７に示
すが、抗ＴＩＰ１２０抗体で免疫沈降されたものの中に
ＴＢＰが含まれることが分かる。これよりＴＢＰとＴＩ
Ｐ１２０とが複合体を形成していることが確認された。
【００５０】
【発明の効果】本発明のＴＩＰ１２０またはＴＩＰ１２
０遺伝子により、生物の全遺伝子の転写に関わっている
ＴＢＰの転写制御機能の究明の一手段が供せられる。ま
た、ＴＩＰ１２０に対する抗体又はＴＩＰ１２０遺伝子
を用いることで癌の発症及び進行程度を、免疫組織学的
に又は遺伝子の発現レベルで診断することが可能とな
る。また、将来的には遺伝子を用いた肝臓癌治療への応
用が期待される。
【００５１】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１２３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ala Ser Ala Ser Tyr His Ile Ser Asn Leu Leu Glu Lys Met Thr 1 5 10 15 Ser Ser Asp Lys Asp Phe Arg Phe Met Ala Thr Asn Asp Leu Met Thr 20 25 30 Glu Leu Gln Lys Asp Ser Ile Lys Leu Asp Asp Asp Ser Glu Arg Lys 35 40 45 Val Val Lys Met Ile Leu Lys Leu Leu Glu Asp Lys Asn Gly Glu Val 50 55 60 Gln Asn Leu Ala Val Lys Cys Leu Gly Pro Leu Val Ser Lys Val Lys 65 70 75 80 Glu Tyr Gln Val Glu Thr Ile Val Asp Thr Leu Cys Thr Asn Met Leu 85 90 95 Ser Asp Lys Glu Gln Leu Arg Asp Ile Ser Ser Ile Gly Leu Lys Thr 100 105 110 Val Ile Gly Glu Leu Pro Pro Ala Ser Ser Gly Ser Ala Leu Ala Ala 115 120 125 Asn Val Cys Lys Lys Ile Thr Gly Arg Leu Thr Ser Ala Ile Ala Lys 130 135 140 Gln Glu Asp Val Ser Val Gln Leu Glu Ala Leu Asp Ile Met Ala Asp 145 150 155 160 Met Leu Ser Arg Gln Gly Gly Leu Leu Val Asn Phe His Pro Ser Ile 165 170 175 Leu Thr Cys Leu Leu Pro Gln Leu Thr Ser Pro Arg Leu Ala Val Arg 180 185 190 Lys Arg Thr Ile Ile Ala Leu Gly His Leu Val Met Ser Cys Gly Asn 195 200 205 Ile Val Phe Val Asp Leu Ile Glu His Leu Leu Ser Glu Leu Ser Lys 210 215 220 Asn Asp Ser Met Ser Thr Thr Arg Thr Tyr Ile Gln Cys Ile Ala Ala 225 230 235 240 Ile Ser Arg Gln Ala Gly His Arg Ile Gly Glu Tyr Leu Glu Lys Ile 245 250 255 Ile Pro Leu Val Val Lys Phe Cys Asn Val Asp Asp Asp Glu Leu Arg 260 265 270 Glu Tyr Cys Ile Gln Ala Phe Glu Ser Phe Val Arg Arg Cys Pro Lys 275 280 285 Glu Val Tyr Pro His Val Ser Thr Ile Ile Asn Ile Cys Leu Lys Tyr 290 295 300 Leu Thr Tyr Asp Pro Asn Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu 305 310 315 320 Asn Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Asp Asp Asp Asp Gln Gly Ser Asp 325 330 335 Asp Glu Tyr Ser Asp Asp Asp Asp Met Ser Trp Lys Val Arg Arg Ala 340 345 350 Ala Ala Lys Cys Leu Asp Ala Val Val Ser Thr Arg His Glu Met Leu 355 360 365 Pro Glu Phe Tyr Lys Thr Val Ser Pro Ala Leu Ile Ser Arg Phe Lys 370 375 380 Glu Arg Glu Glu Asn Val Lys Ala Asp Val Phe His Ala Tyr Leu Ser 385 390 395 400 Leu Leu Lys Gln Thr Arg Pro Val Gln Ser Trp Leu Cys Asp Pro Asp 405 410 415 Ala Met Glu Gln Gly Glu Thr Pro Leu Thr Met Leu Gln Ser Gln Val 420 425 430 Pro Asn Ile Val Lys Ala Leu His Lys Gln Met Lys Glu Lys Ser Val 435 440 445 Lys Thr Arg Gln Cys Cys Phe Asn Met Leu Thr Glu Leu Val Asn Val 450 455 460 Leu Pro Gly Ala Leu Thr Gln His Ile Pro Val Leu Val Pro Gly Ile 465 470 475 480 Ile Phe Ser Leu Asn Asp Lys Ser Ser Ser Ser Asn Leu Lys Ile Asp 485 490 495 Ala Leu Ser Cys Leu Tyr Val Ile Leu Cys Asn His Ser Pro Gln Val 500 505 510 Phe His Pro His Val Gln Ala Leu Val Pro Pro Val Val Ala Cys Val 515 520 525 Gly Asp Pro Phe Tyr Lys Ile Thr Ser Glu Ala Leu Leu Val Thr Gln 530 535 540 Gln Leu Val Lys Val Ile Arg Pro Leu Asp Gln Pro Ser Ser Phe Asp 545 550 555 560 Ala Thr Pro Tyr Ile Lys Asp Leu Phe Thr Cys Thr Ile Lys Arg Leu 565 570 575 Lys Ala Ala Asp Ile Asp Gln Glu Val Lys Glu Arg Ala Ile Ser Cys 580 585 590 Met Gly Gln Ile Ile Cys Asn Leu Gly Asp Asn Leu Gly Pro Asp Leu 595 600 605 Ser Asn Thr Leu Gln Ile Phe Leu Glu Arg Leu Lys Asn Glu Ile Thr 610 615 620 Arg Leu Thr Thr Val Lys Ala Leu Thr Leu Ile Ala Gly Ser Pro Leu 625 630 635 640 Lys Ile Asp Leu Arg Pro Val Leu Gly Glu Gly Val Pro Ile Leu Ala 645 650 655 Ser Phe Leu Arg Lys Asn Gln Arg Ala Leu Lys Leu Gly Thr Leu Ser 660 665 670 Ala Leu Asp Ile Leu Ile Lys Asn Tyr Ser Asp Ser Leu Thr Ala Ala 675 680 685 Met Ile Asp Ala Val Leu Asp Glu Leu Pro Pro Leu Ile Ser Glu Ser 690 695 700 Asp Met His Val Ser Gln Met Ala Ile Ser Phe Leu Thr Thr Leu Ala 705 710 715 720 Lys Val Tyr Pro Ser Ser Leu Ser Lys Ile Ser Gly Ser Ile Leu Asn 725 730 735 Glu Leu Ile Gly Leu Val Arg Ser Pro Leu Leu Gln Gly Gly Ala Leu 740 745 750 Ser Ala Met Leu Asp Phe Phe Gln Ala Leu Val Val Thr Gly Thr Asn 755 760 765 Asn Leu Gly Tyr Met Asp Leu Leu Arg Met Leu Thr Gly Pro Val Tyr 770 775 780 Ser Gln Ser Thr Ala Leu Thr His Lys Gln Ser Tyr Tyr Ser Ile Ala785
790 795 800 Lys Cys Val Ala Ala Leu Thr Arg Ala Cys Pro Lys Glu Gly Pro Ala 805 810 815 Val Val Gly Gln Phe Ile Gln Asp Val Lys Asn Ser Arg Ser Thr Asp 820 825 830 Ser Ile Arg Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu Gly Glu Val Gly His His 835 840 845 Ile Asp Leu Ser Gly Gln Leu Glu Leu Lys Ser Val Ile Leu Glu Ala 850 855 860 Phe Ser Ser Pro Ser Glu Glu Val Lys Ser Ala Ala Ser Tyr Ala Leu 865 870 875 880 Gly Ser Ile Ser Val Gly Asn Leu Pro Glu Tyr Leu Pro Phe Val Leu 885 890 895 Gln Glu Ile Thr Ser Gln Pro Lys Arg Gln Tyr Leu Leu Leu His Ser 900 905 910 Leu Lys Glu Ile Ile Ser Ser Ala Ser Val Val Gly Leu Lys Pro Tyr 915 920 925 Val Glu Asn Ile Trp Ala Leu Leu Leu Lys His Cys Glu Cys Ala Glu 930 935 940 Glu Gly Thr Arg Asn Val Val Ala Glu Cys Leu Gly Lys Leu Thr Leu 945 950 955 960 Ile Asp Pro Glu Thr Leu Leu Pro Arg Leu Lys Gly Tyr Leu Ile Ser 965 970 975 Gly Ser Ser Tyr Ala Arg Ser Ser Val Val Thr Ala Val Lys Phe Thr 980 985 990 Ile Ser Asp His Pro Gln Pro Ile Asp Pro Leu Leu Lys Asn Cys Ile 995 1000 1005 Gly Asp Phe Leu Lys Thr Leu Glu Asp Pro Asp Leu Asn Val Arg Arg 1010 1015 1020 Val Ala Leu Val Thr Phe Asn Ser Ala Ala His Asn Lys Pro Ser Leu 1025 1030 1035 1040 Ile Arg Asp Leu Leu Asp Ser Val Leu Pro His Leu Tyr Asn Glu Thr 1045 1050 1055 Lys Val Arg Lys Glu Leu Ile Arg Glu Val Glu Met Gly Pro Phe Lys 1060 1065 1070 His Thr Val Asp Asp Gly Leu Asp Ile Arg Lys Ala Ala Phe Glu Cys 1075 1080 1085 Met Tyr Thr Leu Leu Asp Ser Cys Leu Asp Arg Leu Asp Ile Phe Glu 1090 1095 1100 Phe Leu Asn His Val Glu Asp Gly Leu Lys Asp His Tyr Asp Ile Lys 1105 1110 1115 1120 Met Leu Thr Phe Leu Met Leu Val Arg Leu Ser Thr Leu Cys Pro Ser 1125 1130 1135 Ala Val Leu Gln Arg Leu Asp Arg Leu Val Glu Pro Leu Arg Ala Thr 1140 1145 1150 Cys Thr Thr Lys Val Lys Ala Asn Ser Val Lys Gln Glu Phe Glu Lys 1155 1160 1165 Gln Asp Glu Leu Lys Arg Ser Ala Met Arg Ala Val Ala Ala Leu Leu 1170 1175 1180 Thr Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ser Pro Leu Met Ser Glu Phe Gln Ser 1185 1190 1195 1200 Gln Ile Ser Ser Asn Pro Glu Leu Ala Ala Ile Phe Glu Ser Ile Gln 1205 1210 1215 Lys Asp Ser Ser Ser Thr Asn Leu Glu Ser Met Asp Thr Ser 1220 1225 1230
【００５２】配列番号：２ 配列の長さ：４３９６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 TCTGGCCTCT TGCCCTAAGA AGCGAGTGCG GAGGGAGTGG GAGCGAGACT GCCCGAACGC 60 AAGTGTCTGG CTTCCCGGCG AGGCCCAGGC GTCCGTCCCG CCGCCCATGA ACTCGTTGCC 120 CCGCGAGCAG CGCCGTCGTT AGGCCGTCCC CGTCACTCTC GCTCGCCCCC ATCCCCGGGC 180 AGCCATTCCC CCCTACCCAC GTCTGGCCGG GGACTGGACG TCGTGTCGAA GCGCCTTCCC 240 CAGTCCGCGT CGCGCTGCGA CCCTGGAAGC GGGCGCCGCC GCCAACGAGA GGAGGAGCCC 300 CGGCCGCGGG GCCCAGCAGC CACTGAGCCA GCAGGCGGGA TCGAGGCCGG CAAC 354 ATG GCG AGC GCT TCG TAC CAC ATC TCC AAC TTG CTG GAA AAA ATG ACA 402 TCC AGC GAC AAG GAC TTC AGG TTT ATG GCT ACA AAT GAT CTG ATG ACA 450 GAA CTG CAG AAA GAC TCC ATC AAG CTG GAT GAT GAC AGC GAA AGG AAA 498 GTC GTA AAG ATG ATT CTG AAG TTG CTG GAG GAT AAA AAT GGC GAA GTG 546 CAG AAC TTA GCT GTG AAA TGT CTT GGT CCT TTA GTG AGT AAA GTG AAA 594 GAG TAC CAA GTT GAG ACG ATT GTA GAC ACC CTC TGT ACA AAC ATG CTT 642 TCT GAC AAG GAG CAG CTT CGA GAT ATT TCC AGT ATT GGC CTT AAA ACA 690 GTA ATT GGA GAA CTC CCT CCA GCT TCC AGT GGC TCT GCA TTA GCT GCT 738 AAT GTA TGT AAA AAG ATT ACT GGA CGC CTT ACC AGT GCA ATA GCA AAG 786 CAG GAA GAT GTT TCT GTT CAG CTA GAA GCT TTA GAT ATT ATG GCT GAT 834 ATG TTG AGC AGG CAA GGA GGA CTG CTT GTT AAT TTC CAT CCT TCA ATT 882 CTG ACC TGT CTA CTT CCC CAG CTG ACT AGC CCT AGA CTT GCA GTC AGG 930 AAA AGA ACA ATT ATT GCT CTT GGC CAC CTA GTT ATG AGC TGC GGA AAC 978 ATA GTT TTT GTA GAC CTT ATT GAA CAT CTG TTG TCA GAG TTG TCC AAA 1026 AAT GAC TCC ATG TCA ACA ACA AGG ACC TAC ATA CAG TGT ATT GCT GCT 1074 ATT AGT AGG CAA GCT GGC CAT AGA ATA GGT GAA TAC CTT GAA AAG ATA 1122 ATT CCT TTG GTG GTA AAA TTT TGT AAT GTA GAT GAT GAT GAA TTA AGA 1170 GAA TAC TGC ATT CAA GCT TTT GAA TCA TTT GTG AGA AGA TGC CCT AAG 1218 GAA GTT TAT CCT CAT GTT TCT ACC ATT ATA AAC ATT TGT CTA AAA TAC 1266 CTT ACC TAT GAT CCA AAT TAC AAC TAT GAT GAT GAA GAT GAA GAT GAG 1314 AAT GCT ATG GAT GCT GAT GGC GGA GAT GAC GAT GAC CAA GGG AGT GAC 1362 GAT GAA TAC AGT GAT GAC GAT GAC ATG AGT TGG AAA GTG AGG CGT GCG 1410 GCT GCC AAG TGC CTG GAT GCC GTA GTT AGC ACA CGG CAT GAG ATG CTC 1458 CCG GAA TTC TAC AAG ACC GTC TCT CCT GCA CTG ATA TCC AGA TTT AAA 1506 GAG CGC GAA GAG AAT GTA AAG GCA GAT GTT TTT CAT GCA TAC CTT TCT 1554 CTT TTG AAG CAA ACT CGT CCA GTA CAA AGT TGG CTG TGC GAC CCT GAT 1602 GCA ATG GAG CAA GGA GAA ACA CCC TTA ACA ATG CTT CAG AGT CAG GTT 1650 CCC AAC ATT GTT AAA GCC CTA CAT AAA CAG ATG AAA GAA AAA AGT GTA 1698 AAG ACC CGA CAG TGT TGT TTT AAC ATG TTA ACT GAA CTG GTA AAT GTG 1746 TTG CCT GGG GCA CTA ACC CAA CAC ATT CCT GTA CTT GTA CCA GGA ATC 1794 ATT TTC TCA CTC AAT GAT AAG TCC AGC TCA TCG AAT CTG AAG ATT GAT 1842 GCA TTG TCC TGT CTG TAT GTG ATC CTC TGT AAC CAC TCT CCG CAA GTT 1890 TTC CAC CCG CAT GTT CAG GCT TTG GTC CCT CCA GTG GTG GCT TGT GTT 1938 GGT GAC CCA TTT TAC AAG ATC ACA TCA GAA GCC CTT CTT GTC ACT CAG 1986 CAG CTT GTC AAA GTA ATC CGT CCT CTG GAC CAA CCC TCC TCC TTC GAT 2034 GCA ACG CCT TAC ATC AAA GAT CTC TTC ACT TGT ACA ATT AAG CGC TTA 2082 AAA GCA GCT GAC ATT GAT CAG GAA GTC AAG GAG AGG GCT ATT TCC TGT 2130 ATG GGA CAG ATT ATT TGC AAT CTT GGA GAC AAT TTG GGC CCT GAC TTA 2178 TCA AAT ACA CTT CAG ATT TTC TTG GAG AGA CTC AAG AAT GAA ATC ACC 2226 CGG CTA ACG ACA GTG AAA GCA CTG ACC CTG ATT GCT GGG TCA CCT TTG 2274 AAG ATA GAT CTG AGG CCT GTG CTG GGA GAG GGA GTC CCT ATC CTT GCT 2322 TCA TTT CTC AGG AAA AAT CAG AGA GCT TTG AAA CTG GGG ACC CTC TCT 2370 GCC CTA GAT ATT CTC ATT AAA AAC TAT AGT GAC AGT TTG ACG GCC GCC 2418 ATG ATT GAT GCA GTT CTG GAT GAG CTC CCT CCT CTT ATC AGC GAA AGT 2466 GAT ATG CAC GTG TCC CAG ATG GCT ATC AGC TTC CTT ACT ACC CTG GCA 2514 AAA GTA TAT CCC TCC TCC CTT TCA AAG ATA AGC GGA TCT ATT CTC AAT 2562 GAA CTG ATT GGA CTT GTA AGG TCA CCT CTG CTG CAG GGA GGA GCT CTT 2610 AGT GCC ATG CTA GAC TTC TTC CAA GCT TTG GTT GTC ACT GGA ACA AAC 2658 AAT CTA GGA TAC ATG GAT TTG CTG CGC ATG CTA ACG GGT CCA GTT TAC 2706 TCT CAG AGC ACA GCT CTT ACT CAT AAG CAG TCT TAC TAT TCC ATT GCC 2754 AAA TGT GTA GCT GCC CTT ACT CGA GCA TGC CCT AAA GAG GGA CCG GCT 2802 GTA GTA GGT CAG TTT ATT CAA GAT GTC AAG AAC TCC AGG TCT ACA GAT 2850 TCC ATT CGT CTC TTA GCG CTC CTT TCT CTA GGA GAA GTT GGA CAC CAT 2898 ATT GAC TTA AGT GGG CAG TTG GAG CTA AAA TCT GTA ATA TTA GAG GCT 2946 TTC TCC TCT CCT AGT GAA GAA GTT AAA TCA GCT GCA TCC TAT GCG TTA 2994 GGC AGC ATC AGT GTA GGC AAC CTC CCT GAG TAT CTG CCA TTT GTA CTA 3042 CAA GAA ATA ACC AGT CAG CCC AAA AGG CAG TAC CTG CTG CTG CAT TCC 3090 CTG AAG GAA ATC ATT AGC TCT GCG TCA GTG GTC GGC CTT AAG CCG TAT 3138 GTC GAG AAC ATC TGG GCC TTG CTG CTA AAG CAC TGT GAG TGC GCG GAG 3186 GAG GGC ACC AGA AAC GTC GTC GCC GAG TGT CTA GGG AAG CTC ACT CTT 3234 ATT GAT CCT GAA ACT CTC CTC CCG AGG CTT AAA GGG TAT TTG ATA TCA 3282 GGG TCA TCC TAT GCC AGA AGC TCA GTG GTT ACA GCT GTG AAG TTC ACT 3330 ATT TCT GAC CAC CCT CAG CCC ATT GAT CCA CTG CTC AAG AAC TGC ATA 3378 GGT GAT TTT CTA AAA ACG TTG GAA GAC CCA GAT TTG AAT GTA AGA AGA 3426 GTG GCC TTG GTC ACA TTC AAT TCT GCA GCC CAT AAC AAG CCG TCA CTG 3474 ATA CGG GAC CTT CTG GAT TCT GTT CTT CCA CAT CTT TAC AAT GAG ACA 3522 AAA GTT AGG AAG GAA CTT ATA AGA GAG GTA GAG ATG GGC CCG TTT AAG 3570 CAC ACG GTT GAT GAC GGC CTG GAC ATT AGA AAG GCA GCT TTT GAG TGT 3618 ATG TAC ACA CTT CTA GAC AGC TGT CTT GAC AGA CTG GAT ATC TTT GAA 3666 TTT CTA AAT CAT GTG GAA GAT GGT TTG AAG GAC CAT TAT GAT ATT AAG 3714 ATG CTA ACA TTT TTA ATG TTG GTG AGA CTA TCT ACC CTT TGT CCA AGT 3762 GCA GTA CTA CAG AGG TTG GAC CGG CTT GTT GAG CCA CTA CGA GCT ACG 3810 TGT ACA ACT AAG GTG AAG GCG AAC TCT GTA AAG CAG GAG TTT GAA AAG 3858 CAG GAC GAG TTA AAG CGC TCG GCC ATG AGG GCA GTA GCT GCA CTG CTC 3906 ACC ATT CCA GAG GCA GAG AAG AGC CCT CTC ATG AGT GAG TTC CAG TCA 3954 CAG ATC AGC TCC AAC CCG GAG CTG GCA GCC ATC TTT GAA AGT ATC CAG 4002 AAA GAT TCT TCG TCC ACT AAC TTG GAA TCA ATG GAC ACT AGT TAG 4047 ACGTGTGTTC CACATGAGGA CCATTACATT TGACCGCACA GTGCACTGAA CCGACAAGTT 4107 GACCATAGAC ACGGGAGAGA AGTGTCTAGA GCTTCAGGAT GTTCCACTTT TATTTTCATT 4167 CATGGGAAGT TTGTTCAGCT TTCTTCCATT GTTGTTTTTG TAGCTTTTAC TTCAGAAATC 4227 TGTATTTCCA TAATCCAGAG GTTGTAAGAC CACTGATGGT TTTAGTGGTT AGGGCAACGT 4287 TTGAAATGGG AACTAAAGTT TGGATTTATG GAATGTGGAA ATAGGGTCCA GTATCTGTTT 4347 GCCCTGTAAT GTGTAGGATT AAAATGTTAA AACTTTAAAA AAAAAAAAA 4396
【００５３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ラット肝細胞抽出液を４７℃、５２℃でそれぞ
れ２０分間熱処理をした後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
の結果を表す図である。
【図２】実施例５でＴＩＰ１２０遺伝子を導入するのに
使用したヒスチジンタグを導入したベクターを表す図で
ある。
【図３】組み換えＴＩＰ１２０を５２℃で２０分間熱処
理をした後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を表す図
である。
【図４】ラット肝臓由来のＴＩＰ１２０遺伝子をノーザ
ンブロットハイブリダイゼーションした結果を表す図で
ある。
【図５】ラット各組織由来のＴＩＰ１２０遺伝子をノー
ザンブロットハイブリダイゼーションした結果を表す図
である。
【図６】ラット肝臓由来のＴＩＰ１２０を兎に免疫感作
して得られた抗体とＴＩＰ１２０とを反応させた結果を
表す図である。
【図７】ＴＢＰとＴＩＰとの混合液に抗ＴＩＰ１２０抗
体を加えて免疫沈降させ、該沈降物を抗ＴＢＰ抗体を用
いてウェスタンブロットを行った結果を表す図である。
【符号の説明】
１：ＴＩＰ１２０のバンドの位置 ２：正常肝臓のｍＲＮＡのレーン ３：ＤＥＮ投与１２時間後の肝癌のｍＲＮＡのレーン ４：ＤＥＮ投与２４時間後の肝癌のｍＲＮＡのレーン ５：ＤＥＮ投与４８時間後の肝癌のｍＲＮＡのレーン ６：ＤＥＮ投与１カ月後の肝癌のｍＲＮＡのレーン ７：ＤＥＮ投与３カ月後の肝癌のｍＲＮＡのレーン ８：ＤＥＮ投与５カ月後の肝癌のｍＲＮＡのレーン ９：ＤＥＮ投与７カ月後の肝癌のｍＲＮＡのレーン １０：再生肝手術後１２時間の肝臓のｍＲＮＡのレーン １１：再生肝手術後２４時間の肝臓のｍＲＮＡのレーン １２：再生肝手術後４８時間の肝臓のｍＲＮＡのレーン １３：ＴＩＰ１２０ｍＲＮＡのバンドの位置 １４：心臓のｍＲＮＡのレーン １５：脳のｍＲＮＡのレーン １６：脾臓のｍＲＮＡのレーン １７：肺のｍＲＮＡのレーン １８：肝臓のｍＲＮＡのレーン １９：骨格筋のｍＲＮＡのレーン ２０：腎臓のｍＲＮＡのレーン ２１：精巣のｍＲＮＡのレーン ２２：組み換え体ＴＩＰ１２０を用いた場合のレーン ２３：抗ＴＩＰ１２０抗体によるラット肝臓核抽出液の
免疫沈降物のレーン ２４：ウサギの血清によるラット肝臓核抽出液の免疫沈
降物のレーン ２５：ラット肝臓核抽出液の免疫沈降物のレーン ２６：核抽出液から精製したＴＩＰ１２０を用いた場合
のレーン ２７：抗ＴＢＰ抗体により検出されたＴＢＰのバンドの
位置
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ 21/08 9453−4Ｂ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ 1/68 Ｔ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 9162−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の特徴を有する蛋白質。 （１）ＴＢＰと複合体を形成すること。 （２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列との
    ホモロジーが３０％以上であること。
  2. 【請求項２】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
    配列とのホモロジーが４０％以上である請求項１に記載
    の蛋白質。
  3. 【請求項３】 組織の癌が進行するにつれて該組織で発
    現される量が減少する請求項１又は２に記載の蛋白質。
  4. 【請求項４】 肝臓において癌が進行するにつれてその
    発現が減少する請求項３に記載の蛋白質。
  5. 【請求項５】 配列表の配列番号２で表される塩基配列
    のＤＮＡのコード領域の全部、又は連続する８個以上の
    アミノ酸をコードする一部とハイブリダイズするＤＮＡ
    又はＲＮＡによりコードされる蛋白質。
  6. 【請求項６】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
    列を有する蛋白質。
  7. 【請求項７】 請求項１ないし６に記載の蛋白質をコー
    ドするＤＮＡ又はＲＮＡの非コード領域を含む塩基配列
    のうちの連続する１２塩基以上から成り且つＧＣ含有率
    が３０〜７０％であるＤＮＡ又はＲＮＡ。
  8. 【請求項８】 請求項１ないし６に記載の蛋白質をコー
    ドするＤＮＡ又はＲＮＡの非コード領域を含む塩基配列
    のうちの連続する１６塩基以上から成り且つＧＣ含有率
    が３０〜７０％であるＤＮＡ又はＲＮＡ。
  9. 【請求項９】 配列表の配列番号２で表される塩基配列
    のうちの連続する１２塩基以上から成り且つＧＣ含有率
    が３０〜７０％であるＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 配列表の配列番号２で表される塩基配
    列のうちの連続する１６塩基以上から成り且つＧＣ含有
    率が３０〜７０％であるＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】 請求項１ないし６に記載の蛋白質をコ
    ードする塩基配列のうちのコード領域部分のうちの連続
    して８個以上のアミノ酸をコードする塩基配列から成る
    ＤＮＡ又はＲＮＡ。
  12. 【請求項１２】 配列表の配列番号２で表される塩基配
    列のＤＮＡの３５５番目のＡから４０４４番目のＴ迄の
    コード領域部分、又はそのうちの連続して８個以上のア
    ミノ酸をコードする塩基配列から成るＤＮＡ。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のＤＮＡとハイブリ
    ダイズするＲＮＡ。
  14. 【請求項１４】 下記の式（１）ないし（３）からなる
    塩基配列群のいずれかであるＤＮＡ。 式（１）ＣＡＴ ＧＡＮ ＡＴＧ ＣＴＮ ＣＣＮ ＧＡＮ ＴＴＣ ＴＡＣ 式（２）ＣＡＴ ＧＡＮ ＡＴＧ ＴＴＡ ＣＣＮ ＧＡＮ ＴＴＣ ＴＡＣ 式（３）ＣＡＴ ＧＡＮ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＣＮ ＧＡＮ ＴＴＣ ＴＡＣ ただし、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃ
    はシトシン、Ｎはアデニン又はチミン又はグアニン又は
    シトシン又はイノシンである塩基を表す。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のＤＮＡとハイブリ
    ダイズするＲＮＡ。
  16. 【請求項１６】 化学的に修飾された請求項７ないし１
    ５に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ。
  17. 【請求項１７】 請求項１ないし６に記載の蛋白質に対
    する抗体。
  18. 【請求項１８】 ポリクローナル抗体である請求項１７
    に記載の抗体。
  19. 【請求項１９】 モノクローナル抗体である請求項１７
    に記載の抗体。
  20. 【請求項２０】 請求項１ないし６に記載の蛋白質を検
    出する方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１ないし６に記載の蛋白質を検
    出する方法であって、該蛋白質に対する抗体を用いるこ
    とを特徴とする検出方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１ないし６に記載の蛋白質を検
    出する方法であって、該蛋白質を分解または修飾する酵
    素反応を用いることを特徴とする検出方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１ないし６に記載の蛋白質を検
    出する方法であって、少なくとも該蛋白質をコードする
    ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するステップを含むことを特徴
    とする検出方法。
  24. 【請求項２４】 哺乳動物の各組織の癌の発症および進
    行程度を診断する診断方法であって、請求項１ないし６
    に記載の蛋白質を該蛋白質に対する抗体を用いて該組織
    から検出することを特徴とする診断方法。
  25. 【請求項２５】 哺乳動物の各組織の癌の発症および進
    行程度を診断する診断方法であって、請求項１ないし６
    に記載の蛋白質を該蛋白質を分解または修飾する酵素反
    応を用いて該組織から検出することを特徴とする診断方
    法。
  26. 【請求項２６】 哺乳動物の各組織の癌の発症および進
    行程度を診断する診断方法であって、少なくとも請求項
    １ないし６に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮ
    Ａを該組織から検出するステップを含むことを特徴とす
    る診断方法。
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