JPH10500001A

JPH10500001A - 折り畳みタンパク質

Info

Publication number: JPH10500001A
Application number: JP7519956A
Authority: JP
Inventors: ロバートウィルソン，キース; 広志久保田; アシュワース，アラン
Original assignee: キャンサーリサーチキャンペーンテクノロジーリミティド
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 1998-01-06
Also published as: US6255070B1; WO1995020654A1; EP0742822B1; DE69533545D1; CA2182499A1; EP0742822A1; DE69533545T2; ATE277176T1; AU1541395A

Abstract

(57)【要約】 TCP-1 を含むポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットをコードする核酸は、試験管内または生体内での該複合体の折り畳みのためのサブユニットの発現の際に有用である。該複合体は、例えば組換え発現後の、ツブリンのようなポリペプチドの折り畳みを促進する。これらの配列は高度の相同性を共有するが、それから誘導された配列を有するペプチドが種々のサブユニットに特異的な抗体を得る際に使用できるほど、即ちそれらの間を識別できるほど十分にＣ末端は異なっている。前記抗体は他のポリペプチドを折り畳むことができる複合体の分析や設計に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】折り畳みタンパク質本発明はタンパク質の折り畳みに関する。特に、本発明はタンパク質、例えば組換えＤＮＡ技術を使って製造されたもの、の折り畳みを促進するのに有用な、試験管内で複合体を形成することのできるタンパク質を提供する。前記複合体タンパク質をコードする遺伝子も提供する。本発明は更に、試験管内環境においてタンパク質を折り畳むことができるタンパク質複合体の構築方法に関する。カペロン分子は、変性状態から正しく折り畳まれた生成物への折り畳み過程に沿ったタンパク質の折り畳みを手伝うことができることが知られている（[1]中に概説されている）。良く研究されているカペロン分子の１つの種類は、真正細菌、ミトコンドリアおよび色素体中に見つかるカペロニン（GroEL，Hsp60および Rubisco サブユニット結合タンパク質）である（[2,3]中に概説されている）。それらは１サブユニット型（GroEL とHsp60 ）または２サブユニット型（Rubisc o サブユニット結合タンパク質）から構成される14マーの二重トーラス構造であり、７重対称を示す[4,5]。試験管内では、それらのカペロニンは変性タンパク質を結合し、ＡＴＰ加水分解を受けるとそれらを水溶液中に遊離し、そこで折り畳みを完成する[6]。生体内では、それらは新たに合成されたタンパク質の折り畳み、輸送および構築に関係するという証拠がある。groE中に単離された最初の変異はバクテリオファージ粒子のサブユニットの折り畳みに影響を与えた[7]が、より最近に行われた遺伝子分析は、Ｅ．コリ中でのタンパク質の生物発生におけるより一般的な役割を示唆している[8]。Hsp60 は細胞質からのミトコンドリア内腔へのタンパク質の搬入に関係している[9]。真核生物のサイトゾル中にはGroEL 様カペロニンは同定されていないけれども、二重トーラス形TCP-1 含有粒子が真核生物の折り畳み機構の一成分であるように思われ、真正細菌中のGroEL や共生細胞小器官中のGroEL 関連カペロニンと同様な役割を果たすかもしれない。TCP-1 はGroEL ファミリーと弱く関連するが[1 0]、古細菌カペロニンTF55とほぼ40％の一致を示す[11]。GroEL とTCP-1 は始源的遺伝子から派生するサブファミリーであると提唱されており[10，12，13，14] 、真核生物のTCP-1 含有カペロニンが古細菌系統から進化したかもしれないと提唱されている[3，11]。最近、精製したTCP-1 含有カペロニンは試験管内でアクチン[15]やツブリン[1 6，17]の折り畳みを促進し、そして新たに合成されたアクチン、ツブリンおよび他の未同定のポリペプチドを生体内で結合する[18]ことが示された。細菌由来のカペロニンとTCP-1 含有カペロニンとの１つの著しい相違は、TCP-1 含有粒子の異なった化学構造を持つ（heteromeric）性質である[14，15，17，19]。TCP-1を含む複合体中には少なくとも５つのポリペプチド種が存在する。現在まで、様々な関係者が種々の生物のTCP 複合体の多数のポリペプチドからペプチド配列を得たという事実にもかかわらず、複合体を構成するポリペプチドに関する配列情報はほとんど入手できない。Frydman 他[17]は、ウシTCP 複合体中に６つのサブユニットが存在することを証明し、それらを“TRiC”（TCP-1 環複合体）と命名し、該複合体のポリペプチド間と、それらのポリペプチドと他の生物のものの間の両方で類似性を示す幾つかのペプチド配列情報を得た。Rommel aere他[59]は、ウサギの網状赤血球溶解物とウシ精巣の両方からサイトゾル性カペロニンを発見した。彼らはウサギ網状赤血球カペロニン中に８つの異なるポリペプチドを発見し、８種全ての部分アミノ酸配列を得たと報告している。しかしながら、全長クローンはつかみどころがないとわかった。マウスTCP-1 の全配列は1986年以来入手可能であり[20]、Ehmann他(FEBS，336: 2，313-316， 1993 )はカラスムギ（Avena sativa）の苗からのTCP-1 関連配列の入手を報告している。この情報が入手可能であるにもかかわらず、哺乳類のTCP-1 複合体の成分をコードする全長核酸配列の入手の報告はまだない。TCP-1 含有カペロニンの個々のサブユニットから誘導された短いペプチド配列の知識があっても、個々のサブユニットの全長cDNAの特異的クローニングができなかった。１つの問題点は、あるペプチド配列が確実に該ファミリーの１つのサブユニットに由来するためには、それが入手可能な全長哺乳類配列、即ちTCP-1 だけに相同でなければならないことである[20,48]。新規ペプチド配列からの逆翻訳により誘導される任意のＤＮＡ配列もTCP-1 および関連遺伝子配列に関連するだろう。それらの配列をＰＣＲプライマーとして使うと、それらは多数のTCP-1 関連配列の合成と増殖を開始するので、該複合体の特定のサブユニットをコードする配列を同定するには更に洞察力と労力が必要とされる。本発明は、最初のTcp-1 遺伝子（20中に報告されたもの）とは異なる、TCP-1 含有カペロニンのサブユニットをコードする配列を有する７つの核酸分子を個別的に提供する。マウスでは、少なくとも３つの新規Tcp-1 関連遺伝子はマウスｔ複合体に未結合であるので、TCP-1 複合体[14]をＣＣＴ（TCP-1 含有カペロニン）と新たに命名することを提案する。今はじめて、我々は偏在的に発現されるサブユニットの８つの完全な配列を全て得ることができ、各ＰＣＲ生成物が該当する遺伝子およびサブユニットを知ることが可能である。同様に、データベース中の他の全てのTCP-1 関連遺伝子も、完全な配列が入手できなければ意味をなさない。本発明は、提供される７つの配列のいずれか１つの変異体、誘導体または対立遺伝子、特にそれぞれの野性型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的特徴、特に少なくとも別のサブユニットと会合してポリペプチドを折り畳むことのできる複合体を形成する能力、を保持しているタンパク質をコードする変異体、誘導体および対立遺伝子である分子も提供する。変異体または誘導体を提供する配列の変化は、１もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換をもたらす核酸中の１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換のうちの１つまたは複数によることができる。もちろん、コードされるアミノ酸に変化を起こさない核酸の変化も包含される。我々はハイブリダイゼーションにより酵母および植物中の８つの遺伝子配列の存在を証明し（52，未発表の結果）、そして我々と他の研究者により酵母から６つの遺伝子が単離された［53］。それらの６つの酵母遺伝子は本出願中に例示される遺伝子のうちの６つ、ＣＣＴα，β，γ，δ，ε ，ηおよびζとぴったり一致する〔すなわち、それらの相関物（orthologue）である〕。我々は、全ての真核生物がマウスに関して説明した少なくともこの８遺伝子のセットを含むと推測する。生物によっては組織特異的ＣＣＴ遺伝子や追加のＣＣＴ遺伝子が存在するかもしれないが、それらの各々が本明細書中に記載する８つの遺伝子のうちの１つに密接に関連する（70％以上のアミノ酸配列相同性を有する）と予測される。これらのマウスの８つのＣＣＴ遺伝子はコアＣＣＴ複合体を含んで成る基本的ファミリーに貢献する。本発明の好ましい態様では、該配列はヒトまたはマウス中に見つかるポリペプチドをコードするものである。それらのポリペプチドは、本明細書中に提供される特定配列のいずれかと相当な程度の相同性を共有するアミノ酸配列を有することができる。そのような相同性は例えば60％以上、70％以上、80％以上、90％以上または95％以上であることができるが、ただし、該ポリペプチドはポリペプチドを折り畳むことのできる複合体のサブユニットとして機能することができることを前提とする。本発明の７つの異なる態様の各々に従った核酸によりコードされるポリペプチドの配列は図３の(a)〜(f)と図８の(h)に提供される。好ましい核酸配列は図８の(b)〜(h)に示される。本発明はまた、提供された配列のうちのいずれか１つを有する核酸を含んで成るベクター、好ましくは核酸配列によりコードされるポリペプチドを発現させることができるベクターを提供する。本発明の別の観点によれば、ポリペプチドを折り畳むことができる複合体のポリペプチド成分（サブユニット）を製造する方法であって、コードする核酸から前記ポリペプチド成分を発現させることを含んで成り、前記成分がTCP-1 以外のものであるという方法が提供される。（TCP-1 をコードする核酸配列は図８(a) に示される。）好ましくは、前記核酸は図８に示される配列またはそのような配列の変異体、誘導体もしくは対立遺伝子を有するものである。複合体が或る環境中で機能するためには補因子または補助物質が必要なことがある。実際、補因子が存在するかどうかそして／またはポリペプチド成分（「サブユニット」）のどんな組合せを使うかによって、異なるポリペプチドを折り畳む複合体の特異性が変更され得る。本発明は、ポリペプチドを折り畳むことのできる複合体のポリペプチド成分であって、他のポリペプチドを実質的に含まないかまたは該複合体の他のポリペプチド成分を実質的に含まず、且つTCP-1 以外のものである、ポリペプチド成分も提供する。好ましくは、前記ポリペプチド成分またはそれの変異体もしくは誘導体は哺乳類に見つけることができ、最も好ましくはマウスまたはヒトに見出すことができる。本発明の好ましい態様では、該ポリペプチドは図８(b)〜(h)に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドである（図３も参照のこと）。ポリペプチドを折り畳むことのできる複合体を形成する能力を持つ変形ポリペプチド（例えば変異体または誘導体）も本発明に包含される。ポリペプチドを折り畳むことができる複合体のポリペプチドをコードする核酸分子の全長配列を正に最初に提供することにより、組換え技術を使ったそのような複合体の製造が可能になる。本発明の別の観点によれば、ポリペプチドを折り畳むことができる複合体の（適当な条件下での）製造方法であって、コードする核酸から前記複合体のポリペプチド成分を発現させ、そして前記複合体へのポリペプチド成分の構築を誘導するかまたは許容することを含んで成る方法が提供される。好ましくは、該成分のうちの少なくとも幾つかはマウスまたはヒトである。好ましくは、複合体の１つのポリペプチド成分が図８(a)〜(h)に示されるもののいずれか１つ、またはそれの変異体もしくは誘導体である。複合体のポリペプチド成分を個別に発現させ、次いで精製し、適当な組合せでＣＣＴサブユニットを混合することにより構築を行うことができる。他方で、サブユニットを一緒に発現させてもよい。ポリペプチドを折り畳むことができる複合体であって、組換えＤＮＡ技術を使って製造された複合体もまた本発明により提供される。複合体の製造に組換えＤＮＡ技術を使うことにより、提供されるもの全てが必要なわけではない場合に、含めるべきサブユニットについての適切な選択ができるようになり、且つ必要な生物学的活性を有する複合体の容易な構築と精製が可能になる。これは後述のサブユニット特異的抗体の提供により更に一層促進される。有用な複合体についての機能試験は、ポリペプチドを折り畳むことができるそれの能力である。下記に示す結果は、サブユニットの様々な組合せが生体内に存在することを指摘する。精製された複合体中のサブユニットの組合せを決定するのに免疫沈澱実験を使うことができる。更に、サブユニットの種々の組合せの組換え生産および基質ポリペプチドを結合する能力（例えば網状赤血球溶解物系の場合）またはポリペプチドを折り畳む能力（例えばＥ．コリ発現系の場合または最初のサブユニット生産後の別の組合せ段階において）の試験管内試験は、機能的であるサブユニットの組合せの容易な決定を可能にする。本発明はまた、ポリペプチドを折り畳む際の複合体の使用を包含する。一般的に該複合体は組換えＤＮＡ技術を使って製造されたものであろう。記載するように、該複合体は本明細書中に提供されるサブユニットの全部または部分から成ることができる。同様に、本発明はポリペプチドを折り畳む方法であって、該複合体の製造の前段階の後に、そのような複合体のポリペプチドへの折り畳みを誘導するかまたは許容することを含んで成る方法を提供する。実際には、前段階において製造するよりむしろ、例えば同一ベクターからの発現および／または同一宿主細胞中での発現により、ポリペプチドを折り畳むのと同時に複合体を製造することが可能である。本発明による折り畳み複合体のサブユニットの全長配列の提供は、個別的なサブユニットの製造、その後の精製および複合体を形成させる結合；宿主細胞培養物（例えばＥ．コリ、酵母またはバキュロウイルス系）中で行われるサブユニットの結合と一緒のサブユニットの製造およびその後の精製；または宿主細胞系（例えばＥ．コリ、酵母またはバキュロウイルス系）中でのサブユニットと基質の複合体の発現を可能にし、従って生体内で折り畳み機構を構築することを可能にする。今までに、あるサブユニットを他のものとを区別するという意味で、複合体から個々のサブユニットに特異的な抗体を得ることは問題であると判明した。この理由は明白である：サブユニットは互いに（様々な程度の）相同性を共有するからである。従って、サブユニット特異的抗体を得る試みは失敗に終わった。精製されたサブユニットによる動物の免疫は、大部分が多数のサブユニットと交差反応する抗体の生産を引き起こす。今や本出願が初めてサブユニットの全配列を提供したからには、サブユニット特異的抗体の生産を可能にする、他のサブユニット中の対応領域とは有意に異なるサブユニットの領域を同定することができるようになった。よって、本発明の別の観点によれば、TCP-1（ＣＣＴα）以外のＣＣＴサブユニット（タンパク質を折り畳むことができる複合体のサブユニット）、好ましくはヒトまたはマウスのような哺乳類のサブユニットに特異的な抗体が提供される。好ましい態様では、該抗体は１つのサブユニットのＣ末端部分に相当するペプチドのエピトープ、またはそのようなペプチドの変異体（１もしくは複数のアミノ酸の挿入、置換または欠失のいずれかにより変更されたもの）に特異的である。この目的で最も好ましいペプチドは次のものである：これらのペプチド（変異体に対して惹起された抗体のサブユニット特異的性質が保持されることを前提として、どんなやり方によって変更された変異体でも包含する）は各々本発明の観点を表す。本発明の別の観点によれば、TCP-1（ＣＣＴα）以外のＣＣＴサブユニットに特異的な抗体を獲得する方法であって、該サブユニットのペプチドにより哺乳類（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を免疫することを含んで成る方法が提供される。好ましくは、前記ペプチドは上記に挙げたものの１つであるか、または列挙したものの１つの変異体であって、ただし該ペプチド変異体を結合する抗体のサブユニット特異性が保持されることを前提とするペプチドである。抗体は当業界において既知の様々な技術を使って免疫動物から得ることができ、そして好ましくは着目の抗原（例えば、Ｃ末端ペプチドの１つ）への抗体の結合を使ってスクリーニングすることができる。例えば、ウエスタンブロット法または免疫沈澱を使うことができる〔Armitage他（1992）Nature 357: 80-82〕。ペプチドにより哺乳類を免役することの代替または補足として、発現された免疫グロブリン可変領域の組換え産生ライブラリーから、例えば表面上に機能的な免疫グロブリン結合領域を表示するλバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを使って、サブユニット特異的抗体を得ることができる；例えばWO 9 2/01047 を参照のこと。このライブラリーは「まだ使われたことがない(naive) 」、即ち、ペプチドのいずれによっても免疫されていない生物から得られた配列から作製してもよく、または１もしくは複数の着目のペプチドに暴露されたことがある生物から得られた配列から作製してもよい。本発明の抗体は様々な方法で変更することができる。実際、「抗体」という用語は、必要な特異性を持つ結合領域を有する任意の結合メンバーを包含すると解釈すべきである。よって、本発明は抗体の断片、誘導体、機能的等価物および同族体を包含する。抗原または他の結合相手を結合することができる抗体断片の例は、ＶＬ，ＶＨ，Ｃ１およびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片；ＶＨとＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；抗体の一本のアームのＶＬとＶＨドメインから成るＦｖ断片；ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片；単離されたＣＤＲ領域；およびヒンジ領域のところでジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片を含んで成る二価断片であるＦ（ａｂ’）₂断片である。一本鎖Ｆｖ断片も包含される。誘導体はポリペプチドまたは抗体から誘導される物質である。誘導体は、１もしくは複数のアミノ酸の付加、削除、置換もしくは挿入により、またはポリペプチドへの他の分子の結合もしくは融合により、それが誘導されるポリペプチドとは異なっていてもよい。付加、削除、置換または挿入といった変更はヌクレオチドまたはタンパク質レベルで行うことができる。本発明に係るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝的変異または他の変化を受けることがある。更に、モノクローナル抗体は、元の抗体の特異性を保持している別の抗体またはキメラ分子を生産するように組換えＤＮＡ技術にかけることができると当業者は解釈するであろう。そのような技術は、定常領域に抗体の免疫グロブリン可変領域もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）、または別の免疫グロブリンの定常領域とフレームワーク領域をコードするＤＮＡを導入することを含む。例えばEP 184187A，GB 2188638Aまたは EP=A-0239400 を参照のこと。キメラ抗体のクローニングと発現はEP-A-0120694とEP-A-0125023中に記載されている。抗体を獲得する時に使われるペプチドは、当業者に周知の様々な技術のいずれによっても製造することができる。例えば、固相合成〔Merrifield，JACS 85: 2 159-2154（1963）〕またはBondanszky他，Peptide Synthesis, 第２版（Wiley，1976）中に記載された技術によるものであることができる。化学的または酵素的なアミド結合形成方法を使った標準液相ペプチド合成方法論を用いてもよい。市販のペプチド合成装置が利用できる。便利には標準化学を使ってシステインを通してペプチドをＰＰＤに結合できるようにするために、選択されたペプチドにアミノ末端システインを付加することができる。多種多様な宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングと発現のための系は周知である。適当な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現に利用できる哺乳類細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞などが挙げられる。一般に好ましい細菌宿主はＥ．コリである。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適宜他の配列を含む適当な調節配列を含有する適当なベクターを選択または作製することができる。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Sambrook他，1989，Col d Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。形質転換方法は使用する宿主に依存するが、周知である。バキュロウイルス発現系は例えばMaxBac^TMのようなキット形態で商業的に入手可能である。使われる技術は SummersおよびSmith，Texas Agricultural Experi ment Station Bulletin 1555(1987)中に記載されている。Baclurovirusの総説についてはThe Molecular Biology of Baculoviruses（Doerfler編，1986）も参照のこと。バキュロウイルス発現系は、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、オートグラフ・カリフォルニカ（Autograph californica）、カイコガ（Bombyx mori）、ショウジョウバエ（Drosophyila melanogaster）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）およびトビケラ（Trichopl usia ni ）を含む多数の細胞型への感染のために開発されている。下記に説明する図面を参照しながら、本発明の態様を例示の目的で更に記載する。明細書中に言及される全ての文書は参考として本明細書中に組み込まれる。図１は、マウスＣＣＴとウシTRiCの一次元および二次元ゲル電気泳動を示す。 (a)マウス精巣ＣＣＴのSDS-PAGE分析（８％ゲル）。ショ糖勾配分画に次いでＡＴＰ−アフィニティーカラムクロマトグラフィーによってマウス精巣から精製したTCP-1 含有粒子[14]を電気泳動した。(b)〜(c)マウスＣＣＴ（図１ａと同じ試料）およびウシTRiC［17］（F.-U．Hartl 贈呈）の2D-PAGE 分析。ショ糖勾配分画に次いでＡＴＰ−アフィニティーカラムクロマトグラフィーによってマウス精巣(b)とウシ精巣(c)から精製したTCP-1 含有粒子のサブユニットを、IEF に次いでSDS-PAGEにより分離した。(d)ウシTRiCの2D-NEPHGE 分析。ウシTRiCのサブユニットをNEPHGEの後でSDS-PAGEにより分離した。(e)抗体アフィニティー精製したＣＣＴの2D-NEPHGE分析。TCP-1 に対する一特異的モノクローナル抗体を使って、³⁵Ｓ標識Ｆ９細胞抽出物からTCP-1 含有粒子を精製した。銀染色(a)〜(c)、クーマシーブルー染色(d)またはオートラジオグラフィー(e)によりタンパク質を可視化した。矢じりはＦ９細胞のＣＣＴと一緒に精製されたpI 6.5の45 kDaタンパク質を示す。矢印はHsp70 タンパク質を示す。(f)マウスＣＣＴとウシTRiCを含んで成るポリペプチドの分子量とｐＩ値。それらの値は、ｐＩマーカーと分子量マーカーの両方を使った２Ｄゲル分析から決定した。図２は、16個のTcp-1 関連遺伝子（配列番号８〜23）の５′末端ＤＮＡ配列から推定されたペプチド配列の整列を示す。この図面ではマウス、ヒトおよび酵母のTcp-1 遺伝子を除いてクローン名を使用する。括弧中の文字は起源の種を表す：Ｍ，Mus musculus（マウス）；Ｈ，Homo sapiens（ヒト）；Ｃ，Caenorhabditis elegans （線虫）；Ｓ，Saccaromyces cerecisiae （酵母）。ヌクレオチド配列の源は次の通りである：マウスTcp-1［20,48］；ヒトTcp-1[48] ；酵母Tcp-1［27］；4950［28］；pG1-pG4（部分的５′末端配列）［22および本明細書］；p383とp384（部分的５′末端配列），pTβ2，pTγ7，pTδ2，pTε5， pTζ12およびpCBL80（本明細書）。３つの追加のヒトTcp-1 関連部分ＤＮＡ配列であるpAP3（A．Malik他、印刷中）、HTR3［41］およびIB713[49]も知られているが、それらの配列は５′末端配列の欠損（pAP3とHTR3）または配列の間違い（ IB713）のため、この図には加えてない。しかしながら、DNA配列相同性により判断すると、IB713，pAP3 およびpHTR3 はそれぞれグループ２，５および６のメンバーである。図３は、マウスＣＣＴのβ，γ，δ，ε，ζおよびηサブユニットを示す。マウスＣＣＴβ(a)（配列番号25）、ＣＣＴγ(b)（配列番号26）、ＣＣＴδ(c)（配列番号27）、ＣＣＴε(d)（配列番号28）、ＣＣＴζ(e)（配列番号29）およびＣＣＴη(f)（配列番号30）のアミノ酸配列はcDNAクローンpTβ2，pTγ7，pTδ2 ，pTε5，pTζ12およびpCBL80からそれぞれ推定された。マウスＣＣＴのＢ１〜Ｂ４（図１(a)）から誘導されたトリプシンペプチドの配列が太い下線により示される。細い下線は、TRiCサブユニットのトリプシンポリペプチドから決定されたウシＰ１〜Ｐ３およびＰ５（[17]と図１）のものと同じアミノ酸を示す（[17] とF.U．Hartl他の未発表の結果）。ペプチド配列分析により決定されなかったアミノ酸位置は“Ｘ”により示される。ウシのトリプシンペプチド配列Ｐ５／Ｔ36 は、マウス配列と比較すると３つのアミノ酸相違を含み、それらは列の下に示されている。図４は、８つのマウスＣＣＴサブユニットおよびホモオリゴマーの古細菌カペロンTF55のアミノ酸配列の整列を示す。ダッシュ（−）はアミノ酸のギャップを示す。保存されたアミノ酸はボールド字体により示される。それらのタンパク質の共通アミノ酸は整列の下に示される（配列番号33）。ＣＣＴθのアミノ酸配列は配列番号31である。マウスＣＣＴα(TCP-1)のアミノ酸配列［20,40］（配列番号24）とスルホロブス・シバテ（Sulfolobus shibatae）の古細菌カペロンTF55 のアミノ酸配列［11］（配列番号32）は前の刊行物から引用したものである。図５は、ＣＣＴサブユニットの共通モチーフとｃＡＭＰ依存性キナーゼやこの部類の他のキナーゼのＡＴＰ結合モチーフとの比較を示す。ＣＣＴサブユニットの共通モチーフの周りのアミノ酸配列（図４中の102 〜115 位）とｃＡＭＰ依存性キナーゼや関連キナーゼのＡＴＰ結合モチーフ［25,26］を比較する。それらの２つのグループ間で保存されたアミノ酸はボールド字体により示されている。ＣＣＴα−配列番号34、ＣＣＴβ−配列番号35、ＣＣＴγ−配列番号36、ＣＣＴ δ−配列番号37、ＣＣＴε−配列番号38、ＣＣＴζ−配列番号39、ＣＣＴη−配列番号40、ＣＣＴθ−配列番号41；ｃＡＰＫ−α、サイクリックＡＭＰ依存性キナーゼ−α（配列番号42）；ＰＫＣ−α、プロテインキナーゼｃ−α（配列番号 43）；ＣａＭII−α、ウシカルシウム−カルモジュリン依存性キナーゼIIα型（配列番号44）；ＳＮＦ１、ショ糖非醗酵性変異体の出芽酵母野性型遺伝子産物（配列番号45）；cdc2⁺、分裂酵母細胞分裂周期遺伝子産物（配列番号46）；ＣＤＣ７、出芽酵母細胞分裂周期遺伝子産物（配列番号47）；Ｒａｆ、マウス肉腫ウイルス産物のヒト細胞同族体（配列番号48）；Ｓｒｃ、ラウストリ肉腫ウイルス産物のヒト細胞同族体（配列番号49）；Ａｂ１、マウス白血病ウイルス産物のヒト細胞同族体（配列番号50）；ＥＧＲＦ、ヒト表皮増殖因子受容体（配列番号51）；ＩＮＳＲ、ヒトインスリン受容体（配列番号52）；PDGFR 、マウス血小板由来増殖因子受容体（配列番号53）。図６は、マウスおよび酵母のCct 遺伝子のハイブリダイゼーション分析を示す。(a)マウスCct 遺伝子のサザン分析。マウス129/Svの肝臓ＤＮＡ（10μｇ／レーン）をHindIIIで消化し、0.7 ％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロン膜上にブロットした。その膜を７枚に切り、それらの各々を³²Ｐ−標識マウスCcta／Tcp-1 （クローンpT1b11）、Cctb(pTβ2)、Cctg(pTγ7)、Cctd(pTδ2) 、Ccte(pTε5)、Cctz(pTζ12)およびCcth(pCBL80)の1.5 kb cDNAプローブとハイブリダイズさせた。それらの膜を0.1％ＳＤＳが補足された0.1×ＳＳＣ中で65℃ で洗浄した。(b)マウスcDNAプローブを使ったCct 遺伝子の酵母同族体についてのサザン分析。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＤＮＡ（1.5μg/レーン）をPstIで消化した。パネル(a)中に記載したのと同様にして該ＤＮＡを電気泳動し、ブロッティングし、そしてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、それらの膜を0.1％ＳＤＳが補足された２×ＳＳＣ中で5 8.5℃で洗浄した。分子量マーカーの位置は各パネルの左側に示されている。図７は、真核生物のＣＣＴサブユニットおよび古細菌スルホロブス・シバテ（Sulfolobus shibatae ）のホモオリゴマーカペロニンＴＦ55の進化の系統樹を示す。アミノ酸置換に基づく進化の系統樹は、図４中のマウスＣＣＴサブユニットと古細菌カペロンＴＦ55の整列されたアミノ酸配列 18-67，70-157，169-200，2 13-241，251-272，274-310，326-372，376-388，398-505および521-566（各サブユニットにつき472 アミノ酸）並びに他の同族体の対応するアミノ酸配列を使って隣り合うものを線で結ぶ方法[50]により作製される。ＣＣＴα／TCP-1 のヒト[48]、ショウジョウバエ[51]、植物[29]および酵母[27]同族体のアミノ酸配列は先行文献から引用した。ＣＣＴβの酵母同族体のアミノ酸配列はMiklos他[28] から得た。括弧内の文字は起源となる種を示す：ＭＭ，Mus musculus（マウス）；ＨＳ，Homo sapiens（ヒト）；ＤＭ，Drosophila melanogaster （ショウジョウバエ）；ＣＥ，Caenorhabditis elegans（線虫）；ＡＴ，Arabidopsis thalia na （植物）；ＳＣ，Saccaromycescerecisiae（酵母）；ＳＳ，Sulfolobus shib atae （古細菌）。図８は、複合体のサブユニットをコードする全長ヌクレオチド配列（この場合マウスＣＣＴのcDNA）を示す。予想される転写解読枠のポリペプチド配列が各ＤＮＡ配列の下に与えられている。図８(a)はTcp-1a／Ccta（配列番号54）の配列である。図８(b)（配列番号55）、(c)（配列番号56）、(d)（配列番号57）、(e) （配列番号58）、(f)（配列番号59）、(g)（配列番号60）および(h)（配列番号6 1）は、それぞれCctb，Cctg，Cctd，Ccte，Cctz，CcthおよびCctq遺伝子の配列である。図９は、ＣＣＴβ，ＣＣＴγ，ＣＣＴεおよびＣＣＴηに特異的な抗ペプチド抗体を使って未変性条件下[14]で沈澱させたマウスＦ９細胞からのＣＣＴ複合体の免疫沈澱を示す。負の対照は、どの哺乳類サブユニットも認識しないシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＣＣＴαに対する抗ペプチド抗体を使った時にシグナルの欠損を示す。図10はＣＣＴの2D-PAGE 分析を示す。マウス精巣からＡＴＰ−アフィニティー精製したＣＣＴのサブユニットを2D-PAGE により分離し、そして銀染色によりタンパク質を可視化した（Ａ）。ギリシャ文字は遺伝子がクローニングされた８つのサブユニット種を表し、Ｓ６は精巣で発現されるサブユニットを示す。pI 6.93 の同時精製される新規63 kDaタンパク質は矢印により示され、hsp 70タンパク質は矢じりにより示される。ＣＣＴθ（Ｂ），ＣＣＴε（Ｃ），ＣＣＴβ（Ｅ），ＣＣＴγ（Ｆ），ＣＣＴζ（Ｇ），ＣＣＴη（Ｈ），ＣＣＴδ（Ｉ）のカルボキシ末端アミノ酸配列に対するウサギ抗体、およびＣＣＴαに対するモノクローナル抗体91ａ（Ｄ）を使ってＣＣＴサブユニットを免疫ブロッティングした。パネルＪは、ＡＴＰ結合に関係すると思われるカペロニン共通配列に対するウサギ抗体を使って免疫ブロッティングしたＣＣＴサブユニットを示す。ペプチド免疫原の配列は表２に与えられる。どのパネルも酸性側が左側である。図11はＣＣＴの生来の集団の分析を示す。マウス精巣から部分精製されたＣＣＴを未変性等電点電気泳動に次いでSDS-PAGEにかけた。タンパク質を銀染色により可視化した（Ａ）。未変性ＩＥＦにより分離されたＣＣＴの生来の集団はＩと IIにより示され、そしてhsp 70は矢じりにより示される。ＣＣＴεに対するウサギ抗体（Ｂ）（ＣＣＴεの30 kDaタンパク質分解断片は矢印により示される）、またはβ−ツブリンに対するモノクローナル抗体（Ｃ）を使って、ＣＣＴの生来の集団を免疫ブロッティングした。どのパネルも酸性側が左側である。図12は、個々のＣＣＴのcDNAクローンから生産される試験管内翻訳産物を示す。個々のＣＣＴのcDNAクローンからウサギ網状赤血球溶解物中で合成された³⁵Ｓ標識ＣＣＴサブユニットの分析。試験管内翻訳反応物のアリコートを10％SDS-PA GE上で電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。レーン： (1)ＣＣＴα，(2)ＣＣＴβ，(3)ＣＣＴγ，(4)ＣＣＴδ，(5)ＣＣＴε，(6)ＣＣＴζ， (7)ＣＣＴη，(8)ＣＣＴθ。Ｍ＝分子量マーカー。図13は、標識したＣＣＴ複合体の検出を示す。図13Ａは、ウサギ網状赤血球溶解物中で試験管内で構築されたＣＣＴのショ糖密度勾配分析からの画分中に検出される³⁵Ｓ標識ＣＣＴタンパク質の10％ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。８つのＣＣＴサブユニットmRNAであるＣＣＴα〜ＣＣＴθを一緒に翻訳し、以前に記載された通りに[1 4]、反応混合物を10％〜40％ショ糖勾配に適用した。レーンＭ＝マーカータンパク質、レーン１〜14は１mlショ糖画分（画分17〜４）の30μｌアリコートを含有する。画分17は勾配の一番上の最も軽い画分である。画分16と15（レーン２と３）には遊離のＣＣＴサブユニットが観察され、画分12と11（レーン６と７）には構築された複合体が検出される。図13Ｂは、抗ＣＣＴβ抗体によりショ糖勾配画分から免疫沈澱させた³⁵Ｓ標識ＣＣＴタンパク質の10％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。この分析は、構築されたＣＣＴがショ糖画分12と11中に存在し、画分16 と15中には存在しないことを証明する。図13Ａと同じショ糖勾配からの画分のアリコートの免疫沈澱を示す。勾配画分17〜９の各々の300μｌアリコートを、５ μｌの抗ＣＣＴβ抗体を含む１mlの反応液中で免疫沈澱させた。プロテインＡ− セファロースビーズに結合させることにより免疫複合体を回収した。抗ＣＣＴβ 抗体による画分16と15の沈澱は、この軽い画分中の８つの未構築形態の遊離のＣＣＴサブユニットの混合物からＣＣＴβだけを回収する。しかしながら、画分12 と11の沈澱は、それらのショ糖画分が期待のサイズと沈降特性を有する構築されたＣＣＴを含むという考えと一致して、全てのサブユニットを回収する。遺伝子配列を得るのに使った材料および方法の要約。ＣＣＴの精製以前に記載されたように[14]ショ糖勾配分画に続くＡＴＰ−アガロースアフィニティークロマトグラフィーによりマウス精巣ＣＣＴを精製した。ウシ精巣TCP- 1 環複合体（TRiC）[17]はF.U．Hartlからの提供された。マウスＦ９細胞を³⁵Ｓ −メチオニンと³⁵Ｓ−システインで５時間標識し、そして抗TCP-1 モノクローナル抗体84Ａと91Ａ[14,21]を使った免疫アフィニティークロマトグラフィーによりＣＣＴを精製した。等電点電気泳動（ＩＥＦ）[43]と非平衡ｐＨ勾配電気泳動（NEPHGE）[44]は、Corbett およびDunn［45］に従って実施した。ＣＣＴサブユニットのペプチド配列決定ＣＣＴを８％SDS-PAGEゲル上での電気泳動にかけ、タンパク質バンドを0.5 ％酢酸／10％水性メタノール中の0.1 ％クーマシーブリリアントブルーで染色し、そして10％水性メタノール中で脱色した。図１ａに示されるバンドを切り取り、ゲル切片からタンパク質を電気溶出せしめた。ProSpin カートリッジ(ABI)を使ってポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜上にタンパク質を濃縮し、Fernande z他［46］により記載された方法を使って、各試料を37℃にて18時間トリプシン消化した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使って消化を終結させ、ABI 130A微視孔分離システムを使ってPVDF上清からトリプシンペプチドを単離した。2.1×100 mmのBrownlee Aquapore RP-300 カラム上でＴＦＡ緩衝液（Ａ：0.1 ％ＴＦＡ；Ｂ：0.085 ％ＴＦＡ，70％アセトニトリル）と単純な直線勾配（50分で５→100 ％Ｂ；200 μｌ／分）を使用した。オンラインＰＴＨ検出とデータ処理を有する ABI 477Aタンパク質配列決定装置を使って、単離された断片の配列分析を実施した。８つのTRiCペプチド配列はFrydman 他［17］により発表され、追加のTRiCペプチド配列（Ｐ２）はF-U．Hartlにより与えられた。Ｃ．エレガンス Tcp-1関連cDNAクローン無作為に選択したＣ．エレガンス（C．elegans）cDNAクローンの５′末端からの一方向配列分析から９つのTcp-1 関連cDNAクローンが報告された［22］。我々はそれらの９つの部分配列を比較し、それらが４つの独立した遺伝子から誘導されることを発見した。それらのcDNAは全て指向的にクローニングされたため、我々は４つの遺伝子の各々について最長の５′領域を有するcDNAをサブクローニングした（cm08g10，cm12b10，cm11d3およびcm13e8）。それらのpBluescript KS⁺ クローンをpG1，pG2，pG3 およびpG4 とし、それらは４つのＣ．エレガンス遺伝子の各々の1.8 kb挿入断片を表す。我々はそれらのプラスミドサブクローンの５ ′末端を正確に配列決定し、各遺伝子のNH₂末端配列の90アミノ酸を推定した（図２）。pG1，pG2，pG3 およびpG4 の推定ペプチド配列は、それらのNH₂末端部分がマウスTCP-1[20]と74％、31％、52％および48％一致する。ヒトTcp-1 関連cDNA ヒト細胞系HT1080（P．Mitchell により提供）のcDNAライブラリーは、バクテリオファージλZAPII のEcoRI 部位のところにcDNAが挿入されている。それらのファージ（1200 pfu）を24枚のプレートの各々に塗布し、各芝生を５mlのＳＭ緩衝液中で一晩インキュベートすることにより、それら各々のファージプールを作製した。各プレートから約1.5 mlのプールしたファージ原液を得た。ペプチド配列TNDGATI（TCP-1 とTF55の間で保存されたモチーフ）の混合プライマーをデザインした（配列番号62）：この特異的プライマーと挿入断片の５′側のλ ZAPIIポリリンカーのプライマーを使って内外（in and out）ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応液（ 60 mM KCl，15 mM Tris-HCl pH 8.8，2.25 mM MgCl₂，各 250μM のdATP，dGTP ，dCTPおよびdTTP，0.4 pmol／μｌの各プライマー，25μｌ／反応チューブ）を調製し、次いでファージ原液１μｌと1.5単位のTaq ポリメラーゼを各チューブに添加した。それらを95℃で15秒、45℃で15秒および72℃で30秒の30サイクルにかけた。20のプールからのＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲル電気泳動により１つまたは少数の150〜300 bpバンドを与えた。それらのバンドをゲルから切り取り、再増幅し、配列決定した。３つのTcp-1 関連配列が同定され、それをpBlu escript KS⁺中にサブクローニングし、そしてp383，p384およびph13と命名した。p383からの推定ポリペプチド配列は、それのNH₂末端の54アミノ酸〔プライム配列TNDGATI（配列番号63）を除く〕に渡りマウスTCP-1 と28％の一致を有し、p 384からのペプチド配列はそれのNH₂末端の51アミノ酸（TNDGATI を除く）に渡りマウスTCP-1 と41％の一致を有し、そしてph13からのペプチド配列はそれのNH₂ 末端の65アミノ酸（TNDGATI を除く）に渡りマウスTCP-1 と24％の一致を有する。成人腎臓cDNAライブラリーから、Na／Ｋ輸送体ＡＴＰアーゼ配列に相当する重複プライマーを使って作製したＰＣＲ断片とのハイブリダイゼーションにより、部分的cDNAクローンpAP3を単離した（Malik,印刷中）。配列決定により、pAP3はTcp-1 関連遺伝子をコードする1050塩基対の挿入断片を含むことがわかった。マウス脳全cDNAをヒトpAp3配列からの次の２つのプライマーを使ったＰＣＲにかけた： pAP3遺伝子のマウスオルト体の800 bp断片が作製された。マウスTcp-1 関連cDNAクローンの単離６つの新規TCP-1 関連タンパク質をコードするマウス全長cDNAクローンを次のようにしてクローニングした。Nagata他［47］の方法によりλZAP 中にＦ９胎児性癌細胞cDNAライブラリーを作製し、１μｇのポリ (A)⁺RNAから7.5 ×10⁴のサイズ選択した組換え体を得た。このライブラリーをGeneScreen Plus（NEN）膜上に移行し、そして二重複製フィルターを次の５つのTcp-1 関連cDNAプローブにより探査した。２つのＣ．エレガンスcDNAのpG2 とpG3 、３つのヒトcDNAのp383， p384およびph13、並びにpAP3からの800 bpマウスRT-PCR生成物を³²Ｐ標識し、サザンハイブリダイゼーション（ＳＨ）緩衝液（６×SSPE，５×デンハーツ試薬， 0.5 ％ＳＤＳ，10mg／mlのサケ精子ＤＮＡ）中で２つのＣ．エレガンスプローブの場合は55℃、３つのヒトプローブの場合は60℃、そしてマウスプローブの場合は65℃で一晩、前記膜にハイブリダイズせしめた。各プローブについて６〜12個のハイブリダイズする陽性クローンを精製した。各スクリーニングから誘導された最長のクローン（1.8 〜2.2 kbの挿入断片）をpTβ２（p383同族体）、pTε５（p384同族体）、pTθ１（ph13同族体）、pTζ12（pG2 同族体）、pTδ２（pG3 同族体）およびpTγ７（pAP3同族体）と命名した。それらのプローブとクローンの関係は図２に記載される。マウス精巣cDNA配列決定計画のためのパイロット実験の最中に６つのマウスTcp-1 関連cDNAが回収された。λZAPII 中に指向的にクローニングされた95個のランダムマウス精巣cDNAを、それらの５′末端から一方向に配列決定した。80番目のcDNAの配列は上記に記載した他のいずれとも異なる新規Tcp-1 関連遺伝子を示し、このプラスミドpCBL80を完全に配列決定した。ＤＮＡ配列決定およびコンピューター分析 pCBL80以外の全てのTcp-1 関連遺伝子のヌクレオチド配列は、 PRISM キットと373A自動配列決定装置(ABI)を使って、蛍光標識したプライマーを用いるジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法により決定した。クローンpCBL80は、欠失クローンと特異的プライマーの組合せを使ってジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーションと³⁵Ｓ−dATPにより手動で配列決定した。それらの配列および推定アミノ酸配列を全てSERC，Daresbury，UK において Silicon Graphics Crimson networkのUWGCG プログラムにより分析した。Daresb ury においてPHYLIP集積プログラムを使って系統発生的分析も実施した。サザンブロッティングマウス株129/SvのＤＮＡ（10μg/レーン）とＳ．セレビシエ株３ａのＤＮＡ（ 1.5 μg/レーン）をHindIIIで消化し、0.7 ％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてGeneScreen Plus 膜上にブロッティングした。マウスTcp-1 cDNA（pT1b11 ）[33]とマウスTcp-1 関連cDNA（pTβ2，pTγ7，pTδ2，pTε5，pTζ12およびpC BL80）を使ったＰＣＲにより、長さ1500±3 bpのプローブを調製した。これらの７つのプローブを³²Ｐで標識し、次いでＳＨ緩衝液中で65℃（マウス）または55 ℃（酵母）で一晩ブロット膜にハイブリダイズせしめた。65℃にて0.1 ％ＳＤＳを含有する0.1 ×ＳＳＣ中で（マウス）または58.5℃にて0.1 ％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で（酵母）膜を洗浄した。結果TCP-1 を含むカペロニン（ＣＣＴ）のサブユニット組成ＣＣＴのサブユニットの二次元ゲル分析は、52〜65 kDaを有する７〜９個のスポットを明らかにした。図１は、マウス精巣およびＦ９胎児性癌細胞から単離されたＣＣＴ並びにウシ精巣TCP-1 環複合体（TRiC）[17]の、SDS-PAGE，2D-PAGE および2D-NEPHGE 比較を示す。ＣＣＴと共に特異的に同時精製されるHsp70 種［14］を除いて、精巣調製物は９つの主要種を含み（図１ｂ〜ｄ）、そしてＦ９細胞調製物は45 kDaタンパク質を除く７つの53〜65 kDa種を含む（図１ｅ）。これは、塩基性ｐＩを有する２つの種（Ｓ８とＳ９）が平衡まで泳動された2D-PAGE のＩＥＦ次元では完全には分離しないため、Lewis 他［14］により報告された種の数の増加を表す。ウシTRiC のSD-NEPHGE 分析は明らかに９つのサブユニット種を示す（図Ｉｄ）。我々は、ＣＣＴの単一サブユニット（Ｓ３，TCP-1 ）だけを認識するモノクローナル抗体（91Ａ）[21]を使って、抗体アフィニティー精製したＣＣＴが、SDS- PAGEゲル上で、ＡＴＰ−アガロースアフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより精製したＣＣＴと同様な電気泳動分布を有することを以前に示した［14］。図１ｅはＦ９細胞から抗体アフィニティー精製したＣＴＴの2D-NEPHG E分析を示す。そのポリペプチドスポット分布は、精巣から生化学的に精製したＣＣＴ（図１ａ，ｂ）と非常によく似ており、２Ｄ分析により７つの52〜65 kDa 種が識別可能である。pI 6.5の45 kDaタンパク質が抗体アフィニティー法によりＣＣＴと同時に精製され、ＣＣＴの新規補因子または基質を暗示する（図１ｅ中の矢じり）。これらの結果は、TCP-1 が別のポリペプチドとのヘテロオリゴマー複合体を含んで成ることを確証する。図１ｆは、ＣＣＴサブユニットの見かけの等電点と分子量の表を示す。Frydma n 他［17］は、ウシ精巣TRiCが12.5％SDS-PAGE上で５つのバンドとして移動することを報告した。我々は、バンドＰ４が２Ｄゲル上で互いに識別可能である５種類のポリペプチドを含むことを発見し、上昇するｐＩに従ってそれらをＰ4.1，4 .2，4.3，4.4および4.5と命名した。マウスＣＣＴのサブユニット（Ｓ１〜Ｓ９）は、標準としてマウス精巣パターンを使って上昇するｐＩに従って番号付けした。それらのウシおよびマウスのスポットは、最も塩基性のスポットを除いてpH 6 .1〜pH 7.1およびMW 65 kDa〜MW 52 kDaに分布する（NEPHGE分析は最も塩基性のスポットのpIが約pH 7.4の値であることを示唆する）。７つの新規TCP-1 関連タンパク質をコードするマウスcDNAの単離我々は、ＣＣＴサブユニットをコードする最初に同定された遺伝子[14,17]である最初のマウスTcp-1 遺伝子に関連する多数の遺伝子および部分的cDNA配列［ 20］が様々な真核生物中に存在することを以前に報告した［14］。マウスTcp-1 関連遺伝子を単離しそして本明細書中に記載の７つの新規TCP-1 関連タンパク質をコードする全長cDNAをクローニングするには方法の組合せを使うことが必要であるとわかった。第一および第二（クローンpTδ2 およびpTζ12）は、Watersto n 他［22］の５′発現配列標識収集物から回収されたセノルハディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）cDNAプローブとの交差ハイブリダイゼーションにより単離された。第三、第四および第七（クローンpTβ2，pTε5 およびpTθ1）は、TCP-1 とTF 55の保存領域からの縮重プライマーを使ったヒトHT1080細胞系cDNAのＰＣＲにより回収されたヒトプローブとの交差ハイブリダイゼーションにより単離された。第五遺伝子（クローンpCBL80）は、Chester Beatty Laboratories，Londonでのマウス精巣cDNA配列決定プロジェクトの最中に単離された。Tcp-1 関連遺伝子のcDNA断片（クローンpAP3）はイオン輸送チャンネル遺伝子のスクリーニングの間にヒト腎臓cDNAライブラリーから偶然回収され（Malik 他，印刷中）、そして第六マウス遺伝子（クローンｐＴγ７）はこのヒトcDNAの配列から誘導されたプライマーを使って作製されたマウスcDNAのＰＣＲ生成物とのハイブリダイゼーションにより単離された。図２は、マウス、ヒト、Ｃ．エレガンスおよびサッカロミセス・セレビシエの様々なTcp-1 遺伝子およびTcp-1 関連遺伝子から推定された高度保存NH₂末端領域を示す。該領域のアミノ酸配列に基づいた発生系統的分析(UPGMA)[23]は７グループの遺伝子を示した（データは示してない）。このことは、真核生物ではTc p-1 およびTcp-1 関連遺伝子は両遺伝子が分岐して以来ずっと各々独立的に進化してきたことを示唆する。Cct 遺伝子ファミリーの８つの構成員の分析は、ヘテロメリックＣＣＴ粒子が５億年以上も前に動物、植物および酵母の共通の祖先生物中で既に進化していること、そしてタンパク質折り畳みの際に異なるサブユニットが異なる機能を持つことができることを暗示する。図３と図８は、それらの全長cDNAクローンから推定された７つのマウスTCP-1 関連タンパク質のアミノ酸配列を示す。図８(b)〜(h)は、７つの遺伝子のＤＮＡ配列とその下に（推定転写解読枠の）アミノ酸配列を示す。７つのTcp-1 関連cDNAはＣＣＴサブユニットをコードするマウス精巣ＣＣＴのSDS-PAGEゲル分離から得られた内部トリプシンペプチド（Ｂ１〜Ｂ４、図１ａ）を配列決定した。というのは、どのサブユニットのNH₂末端も配列データが全くないことからブロックされていると思われるからである。 Frydman 他［17］はウシ精巣TRiCサブユニットのうちの４つから幾つかの内部ペプチド配列（Ｐ１，Ｐ３，Ｐ４ａ／TCP-1 およびＰ５）を得た。彼らはまた、TR iCサブユニットＰ２に相当すると我々がここで証明する未発表のペプチド配列を我々に入手可能にした。それらのマウスおよびウシペプチド配列と７つのTcp-1 関連cDNAの推定ペプチド配列との比較は、それらが各々特定のＣＣＴサブユニットタンパク質をコードすることを明らかにした（図３、図８(h)、表１）。我々はそれらの７つの新規遺伝子をそれぞれCctb(pTβ2)，Cctg(PTγ7)，Cctd(pT δ2)，Ccte(pTε5)，Cctz( pTζ12)，Ccth(pCBL80)およびCctq(pTθ1)と命名し、コードされるタンパク質をそれぞれＣＣＴβ，γ，δ，ζ，ηおよびθサブユニットと命名した。我々は、Tcp-1 遺伝子［20］をCctαそしてTCP-1 タンパク質をCCTαと新たに命名することを提案する。表１は、Cct 遺伝子によりコードされるタンパク質と２Ｄゲル電気泳動により分離されたＣＣＴサブユニットのスポット（図１）との間の対応関係を要約する。ＣＣＴサブユニットポリペプチド間の類似表１は、ＣＣＴサブユニットのアミノ酸数としての長さと分子量も示す。それらのアミノ酸配列が互いに対して約30％しか一致しない（表２）という事実にもかかわらず、それらは類似した特徴を有する。それらは長さが531〜556 残基で、そして推定分子量が57456〜60636 Daでわずかに異なる。それらの推定分子量はSDS-PAGE（図１）により決定されたものとほぼ一致する。等電点電気泳動により実験的に決定されたサブユニットのｐＩは、各々のｐＩにおいて幾つかのヒスチジン残基がカチオンとして帯電していると仮定すると各々の推定ＣＣＴサブユニットポリペプチドの総電荷値と良く一致する（データは示してない）。各ＣＣＴサブユニット中の疎水性アミノ酸と荷電アミノ酸の割合は高度に保存されており、それぞれ31.6〜33.5％と23.9〜27.3％の範囲である。このような保存された化学的性質は恐らく各哺乳類サブユニットの共通機能を反映し、古細菌カペロニンTF55と共有するだろう。Agard[24]は、Ｅ．コリのカペロニンGroEL とそれの基質との疎水的相互作用が折り畳み過程に重要かもしれないと提唱した。従ってＣＣＴサブユニット中の疎水性アミノ酸の保存率が基質との相互作用に重要かもしれない。ＣＣＴサブユニットの疎水性分布はＣＣＴサブユニット間での疎水性および親水性アミノ酸分布の保存、特にNH₂末端での保存を示す（データは示してない）。図４は、８つのＣＣＴ配列およびTF55の全ての整列を示す。それらのペプチド配列の整列は６つの主なギャップ（図４中の164，201，246，315，392 および50 8 位）を示し、従って該ギャップにより分割された７つの相同性ブロックを示す。それらの７つのブロックのうち、第１（１〜164 位）と第５（392 〜508 位）ブロックが最長であり、幾つかの高度に保存されたモチーフを含む：LGPKGMDKM （52〜60位）（配列番号66），TITNDGATIL（71〜80位）（配列番号67），QDDEVG DGTTSVV（100 〜112 位）（配列番号68），ERSLHDAL（423 〜430 位）（配列番号69）およびVV(A/P)GGGA（442 〜448位）（配列番号70）。三番目のモチーフは、サイクリックＡＭＰ依存性キナーゼおよびこのキナーゼ族の他のメンバーのヌクレオチドリン酸結合領域[25,26]と相同であるとLewis 他［14］により以前に認められたＣＣＴサブユニット中の完全に保存されたモチーフGDGTT（配列番号7 1）を含有する。図５はそれらのモチーフ間の比較を示す。これは、全ＣＣＴサブユニットが共通のＡＴＰアーゼ機能を共有することを暗示する。ＣＣＴサブユニットをコードする構造遺伝子および酵母中の相同遺伝子マウスゲノムＤＮＡのサザン分析（図６ａ）は、７つのマウスＣＣＴサブユニットをコードする独立した構造遺伝子を示す。サッカロミセス・セレビシエＤＮＡと７つのマウスCct cDNAプローブとのハイブリダイゼーション（図６ｂ）は、各プローブに対して１本または２本のPstＩ消化ＤＮＡバンドを示す。２つのTcp -1 関連遺伝子が酵母において既に同定されている；Ccta／Tcp-1 [27]の相関物とCctbの相関物［28］。それらの遺伝子は両方とも不可欠であり［27,28］、両遺伝子中の温度感受性変異は微小管媒介過程に影響を及ぼす[28]。Ｓ．セレビシエのＣＣＴは多数のサブユニットから構成され、ＣＣＴα／TCP-1 およびＣＣＴβの酵母同族体は一緒に精製されるので同一複合体の成分である［28］。マウスCct プローブを使って検出された新規配列に相当する酵母ＤＮＡクローンから誘導された予備配列データは、それらが実際にマウスCct 遺伝子の相関物（orth ologue）体であることを示す。７つのCct cDNAプローブを使ったアラビドプティス（Arabidopsis ）ＤＮＡのサザン分析も、各サブユニットの植物同族体の存在を示す（データは示してない）；Ccta／Tcp-1 のアラビドプティス同族体は既に報告されている［29］。それらのＣＣＴサブユニットの７種は全ての真核生物に偏在するらしい。サブユニット組成の決定とＣＣＴ中の配置８つのＣＣＴサブユニットの配列はそれらがＣ末端でより多様であることを明らかにした。ＣＣＴαのＣ末端と反応し（Harrison-Lavoie他，1993，EMBO J．7 : 2847-2853）そしてＣＣＴ複合体を沈澱させるのに使うことができるモノクローナル抗体23Ｃが以前に作製されている［21］。本発明により与えられる配列情報を使って、今初めてサブユニット特異的抗体を作製した。該抗体は次の配列を有するＣ末端ペプチドに対して惹起せしめた：これらのペプチドは市販のペプチド合成装置上で常用の固相法により合成した。該ペプチドにアミノ末端システインを付加し、該ペプチドを精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）固体支持体にカップリングさせるのに使った。精製ペプチド10mgをＰＰＤ 9mgとカップリングさせ、生じた接合体をカラムクロマトグラフィーにより２回精製して未接合の不純物を除去した。ウサギを96日間に渡り免疫した。常法（Harlow，E およびLane，D（1988），Antibodies: alaboratory manual，CSH Press，NY 中に概説されている）を使って、抗体をスクリーニングしそして該ペプチドへの結合を利用して抗体を単離した。個々のサブユニットに特異的な抗体が得られた。それらの抗体はマウスとヒトの両方のサブユニットに特異的であることがわかった。それらのサブユニット特異的抗体を使って未変性条件下で（50mM Hepes pH 8 ，90mM KCl，0.5% TX-100）行った免疫沈澱は、ＣＣＴサブユニットが粒子の複雑な混合物から成ることを示した。異なる抗体は異なるサブユニットの組合せを免疫沈澱させる（例えば、図９を参照のこと）。異なる免疫沈澱の検査は、どんな細胞型でもＣＣＴの組成の決定を可能にする。この情報は、例えばサブユニットの組換え発現およびそれらの構築によるＣＣＴの試験管内作製に使用すべきサブユニット組合せの賢明な選択を可能にする。抗体の特徴づけ 2D-PAGE マウス精巣ＣＣＴを、以前に記載された通りに［14］ショ糖密度勾配分画に続いてＡＴＰ−アフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。[45]に従って等電点電気泳動（ＩＥＦ）を実施し；続いて[14]に記載されたような８％ゲル上でのSDS-PAGE、次いで銀染色またはニトロセルロースへのタンパク質の電気移行のいずれか、免疫ブロッティングおよびＥＣＬシステム（Amersham）による検出を実施した。未変性等電点電気泳動マウス精巣ＣＣＴを[14]に従ってショ糖密度勾配分画により部分精製した。20 ％ショ糖に相当する画分を同容量の試料緩衝液（40％ショ糖 w/v、２％Ampholyt es[Resolte 4-8，BDH]）と混合し、500Ｖで４時間の未変性等電点電気泳動にかけた。未変性ＩＥＦは、アクリルアミドゲル混合物中の50％尿素を40％ショ糖に置換しそして３−〔（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸（CHAPS）を削除すること以外は、[45]により記載された変性ＩＥＦと同様に行った。未変性ＩＥＦに続いて８％ゲル上でのSDS-PAGE、銀染色またはニトロセルロースへのタンパク質の電気移行のいずれか、免疫ブロッティングおよびＥＣＬシステム（Amersham）による検出を実施した。図10に示されるように、マウス精巣ＣＣＴは2D-PAGE 分析によると９つのサブユニット種（Ｓ１〜Ｓ９）を含む（図10Ａおよび表３）。マウスＣＣＴのα，β ，γ，δ，ε，ζ，ηおよびθサブユニットをコードするTcp-1 と７つのTcp-1 関連遺伝子がクローニングされている［52］。精巣で発現されるサブユニットＳ６、およびマウスＣＣＴの追加のサブユニットであるかもしれない同時精製される63kDa タンパク質（図10Ａ中の矢印）は、なおクローニングが残っている。我々は、Ｓ６とＳ７のＤＮＡ配列を得、それらが２つの密接に関連したＣＣＴζ遺伝子によりコードされることを確立した。本発明者らは、Ｓ６とＳ７がＣＣＴ中で互いの代わりをすることができ、ＣＣＴの機能に或る種の組織特異性を付与するかもしれないと予想する。ＣＣＴαを検出するには以前に特徴づけられたモノクローナル抗体91ａ［41,52］を使った（図10Ｄ）。単一のサブユニット種を認識する６つの抗体BC-1，GC-1，DC-1，EC-1，TC-1 およびTHC-2 を製造した。これらはそれぞれＣＣＴのβ，γ，δ，ε，ηおよびθサブユニットと特異的に反応した（図10 Ｂ，10Ｃ，10Ｅ，10Ｆ，10Ｈおよび10Ｉ）。ＣＣＴζに加えて、抗体ZC-1は精巣で発現されるサブユニットＳ６とも反応し（図10Ｇ）、このことはそれら２つのサブユニットＳ６とＳ７が関連したカルボキシ末端配列を有することを示し、それらが密接に関連した遺伝子によりコードされるというＤＮＡ配列データを支持する。全てのカペロニン配列間で高度に保存されており、ＡＴＰ結合や加水分解に関与すると提唱されているアミノ末端共通モチーフに対してポリクローナルウサギ抗体UM-1を作製した（表３）［52,53］。UM-1は、精巣発現サブユニットＳ６を含む、マウス精巣ＣＴＴの９つのサブユニット全部と反応した。ＣＣＴβ，ＣＣＴε，ＣＣＴγ，ＣＣＴζおよびＳ６が強く認識され（図10Ｊ）、ＣＣＴα ，ＣＣＴδ，ＣＴＴηおよびＣＣＴθは弱く認識された（図10Ｊ中には示されないが、より長時間暴露すると観察される）。上記の９つのサブユニットに加えて、UM-1は同時精製する63 kDaタンパク質とも強く反応した。このことは、このタンパク質がマウス精巣ＣＣＴの追加のサブユニット種であるかあるいはまた以前に同定されたＣＣＴサブユニットの変形イソ型タンパク質であり得ることを示唆する。ＣＣＴの生来の集団の解析マウス精巣生殖細胞から部分精製されたＣＣＴは、未変性等電点電気泳動にかけると２つの異なる集団ＩとIIに分かれる（図11）。それらの集団をSDS-PAGEにより二次元において更に分析し、銀染色（図11Ａ）または特異抗体による免疫ブロッティング（図11Ｂと11Ｃ）により視覚化した。２つの集団間の顕著な相違は、IIがＣＣＴ複合体のサブユニットの他に多数のポリペプチドを有し、一方Ｉでは同時移動する種が少ししか観察されないことである（図11Ａ）。それらの付随ポリペプチドの多くはＣＣＴによる折り畳みのための基質であり、IIはポリペプチド鎖基質を結合する親和力が高く、Ｉは低い親和力を有すると思われる。現在まで、ツブリンとアクチンだけが生体内でのＣＣＴによる折り畳みのための基質として確立されており[15,18,16]、β−ツブリン（図11ｃ）とアクチン（データは示してない）の両方がIIと付随して検出され、Ｉと付随して検出されない。矢じりは、おそらく試料負荷中の高ｐＨ条件のためにＣＣＴから分離されるhs p 70タンパク質を示す（図11Ａ）。少量のhsp 70タンパク質が未変性条件下でＣＣＴと一緒に免疫沈澱するが、これはhsp 70がＣＣＴ上で折り畳み畳みを受けるポリペプチド鎖との相互作用のために付随して見つかることを示唆する。従って、この技術はタンパク質相互作用の厳重な解析と基質に対するＣＣＴII形の高親和力の反映である。図11Ｂは、ＣＣＴεに対するポリクローナルウサギ抗体を使って免疫ブロッティングしたＣＣＴ集団ＩとIIを示す。しかしながら、両集団は上述の抗体を使った免疫ブロッティングにより証明されるようにマウス精巣ＣＴＴの９つのサブユニットを全て含有する（データは示してない）。この系での未変性ＩＥＦマーカーの分離は、分離が電荷に基づくのであってサイズではないことを証明するので、ＩとIIは各コンホメーションにおいて暴露される表面電荷の全量が異なるためにそれらの条件下で分離されるヘテロオリゴマーＣＣＴの２つの異なるコンホメーションを表すと我々は提唱する。マウス精巣または他の源からのＣＣＴの生化学的抽出の間に、完全な900 kDa ＣＣＴ複合体の調製物中に全てのサブユニットの限定されたタンパク質分解がしばしば観察される。ＣＣＴεの30 kDa断片（図11Ｂ中に矢印で示されるもの）はII型だけに検出される。タンパク質分解に対するこの異なる感受性は、IIの方の開裂部位がより近づきやすいことを指摘し、これはＩとIIが異なるコンホメーションをとるという証拠を裏付けている。それらのタンパク質分解断片のサイズは28〜30 kDaであり、このことはプロテアーゼ感受性部位が各ＣＣＴサブユニットの推定上の頂上のポリペプチド鎖結合領域にあることを示唆する［53］。抗体の考察各サブユニット種に特異的な抗体はＣＣＴ複合体中のサブユニットの組合せと配置を研究するのに有用であろうし、全てのサブユニットを認識する抗体UM-1は他の真核生物からＣＣＴを同定するための万能試薬として用いることができる。マウス精巣ＣＣＴの特徴づけは、精巣発現サブユニットＳ６［52］がＳ７に関連すること、そして同時精製する63 kDaタンパク質がマウス精巣ＣＣＴの新規サブユニットであるかもしれないことを明らかにする。63 kDaタンパク質はおそらく新規Tcp-1 関連遺伝子によりコードされるだろう。ＣＣＴのような高分子量複合体の生化学的分析に伴う問題は、それらの状態が補助ポリペプチド、例えば基質または補因子の付加によって異なる時であっても、異なる状態を分離することにある。ＣＣＴの２つの形態の分離を促進する未変性等電点電気泳動技術が本明細書中に記載される。１形態は多数の他のポリペプチドと結合しており且つタンパク質分解を受けやすいく、もう１つの形態は少数の他のポリペプチドと結合しており且つタンパク質分解に耐性である。これらの結果は、細胞中のＣＣＴがポリペプチド鎖基質に対して異なる親和力を有する２つの異なるコンホメーションをとり得ることを示唆する。基質に対して高結合親和力を有するコンホメーションは各ＣＣＴサブユニット中のタンパク質分解に感受性である領域を露出しており、この部位がGroEL の基質結合領域[54,55]と同様な位置にあることから、この部位は基質結合領域中に位置するのかもしれない。GroEL では、構造的変化はＡＴＰ結合と関連づけられている［5,56］。本発明者らのデータの１つの解釈は、ＡＴＰの結合または加水分解がポリペプチド鎖基質と強くまたは弱く相互作用するＣＣＴのコンホメーション形態の間のスイッチとして働くというものである。ＣＣＴと付随して見つかる広範囲のポリペプチドは、ＣＣＴの生理学的基質がアクチンとツブリンに限定されないだろうことを示唆し、そしてＣＣＴが真核生物のサイトゾル中でのタンパク質折り畳みにおいて一般的な役割を有することを暗示する。折り畳み複合体のポリペプチド成分の製造と構築 (1) ポリペプチドを折り畳むことができる複合体を製造するために、伝令ＲＮＡ依存性ウサギ網状赤血球溶解物を使用する。ＣＣＴサブユニットの各々をコードするキャップ付合成mRNAを、適当な調節配列下に全長コードＣＣＴ配列を含む各々の線状Bluescript^TMプラスミドのＲＮＡ転写により、試験管内で個別に合成する（Sambrook他，1989，Molecular Cloning: a Laboratory Manual，CSH Pres s，New York）。これらのＲＮＡを、未変性電気泳動ゲルまたはショ等密度勾配での検出を容易にする³⁵Ｓ−標識ＣＣＴサブユニットの合成のために³⁵Ｓ−メチオニンを含有するウサギ網状赤血球溶解物に添加する。更に、サブユニット特異的抗体を使った免疫沈澱によって特定のサブユニットの存在を確認する。サブユニットの同時合成は、ポリペプチドを結合しそして／または折り畳む能力を試験することができる複合体の構築をもたらす。アクチンやツブリンのようなサブユニットと共に折り畳まれる基質ポリペプチドをコードするmRNAを翻訳することは、標識ＣＣＴと基質の複合体の検出を可能にする。標識された基質はこの検出を促進する。ウサギ網状赤血球抽出物は内因性ＣＣＴを含有するけれども、これは新たに合成されたＣＣＴサブユニットと一緒には循環しない。 (2) (1)のウサギ網状赤血球系は、サブユニットの様々な組合せを調べることにより、会合して着目のポリペプチドを結合しそして／または折り畳むことのできる複合体を形成する能力を評価するのに使われる。例えば、８つのサブユニット（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５，Ｓ６またはＳ７，Ｓ８およびＳ９）をコードするmRNAの翻訳産物の構築複合体を、該サブユニットのいずれか１つに特異的である抗体を使って沈澱せしめ（図13と14）、そして同じく試験管内で翻訳された基質、例えばツブリンへのそれの結合を試験することができる（16）。 (3) 適当なベクターを使ってＥ．コリ中でサブユニットを発現させる。特定の目的、即ち特定のポリペプチドの折り畳み、のために選択されたサブユニットの組合せが多量に生産される。サブユニットは会合して期待の沈降特性と分子量を有するヘテロメリック構造を形成する。サブユニットを個別に発現させ、次いで精製し、適当な組合せでＣＣＴサブユニットを混合することにより試験管内で構築を実施することができる。 (4) 大量生産のためには、サブユニットをバキュロウイルス中で発現させる。サブユニットをコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター中に挿入し、そして該ベクター中の調節要素と作用可能に連結せしめる。該ベクターと野性型ウイルスゲノムを昆虫宿主細胞中にトランスフェクションし、そこでベクターとウイルスゲノムが組み換わって組換えバキュロウイルス発現ベクターを形成する。バキュロウイルス発現ベクターを感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージングする。会合してポリペプチド基質を折り畳むことのできる複合体を形成することができる多量のサブユニットが生産される。 (5) ポリペプチド基質、例えばツブリン、アクチンまたはルシフェラーゼの折り畳みを、Frydman 他［17］により記載されたような標準技術により試験する。参考文献[4]，[15]および[16]も参照のこと。８つの組換えcDNAクローンからのマウスＣＣＴの構築この実験の目的は、ＣＣＴα，β，γ，δ，ε，ζ，ηおよびθサブユニットをコードする８つのcDNAクローンが、本発明者らの生化学的および遺伝的分析からそれらの８つのサブユニットから構成されると予想されるヘテロオリゴマーのコアＣＣＴ複合体に共に会合できる組換えＣＣＴタンパク質を生産するのに必要且つ十分であることを示すことである。本発明者らは次の方法でこれを証明した。ＣＣＴ cDNAの転写解読枠の上流にＴ３またはＴ７プロモーターを含むプラスミドを適当な制限エンドヌクレアーゼにより線状化し、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより各ＣＣＴのmRNA合成のための鋳型を作製した。使用するプラスミドはＣＣＴα／pT1611，ＣＣＴβ／pTβ２，ＣＣＴγ／pTγ７，ＣＣＴδ／ pTδ２，ＣＣＴε／pTε５，ＣＣＴζ／pTζ12，ＣＣＴη／pTη29およびＣＣＴ θ／pTθ１である。各ＣＣＴサブユニットをコードするcDNAを単独使用してウサギ網状赤血球溶解物をプログラミングすると、期待の分子量の³⁵Ｓ標識ポリペプチドが合成された（図12）。構築を示すために、８つのサブユニットをコードするプラスミドを一緒に使って溶解物をプログラミングした。合成後、以前に我々が示したように（参考文献14）、構築されたＣＣＴ複合体を遊離のサブユニットから分離するために反応混合物を10〜40％ショ糖勾配に適用した。標識されたＣＣＴ複合体が20％ショ糖密度のところに検出することができ（図13Ａ）、単一のサブユニットに特異的な抗体を使って全てのサブユニットが免疫沈澱される（図 13Ｂ）。これは、８つのサブユニット遺伝子からの共同構築の理論を証明する。この方法は哺乳類組織培養細胞、細菌および酵母中で発現させたサブユニットタンパク質を使って繰り返すことができる。酵母発現ピスチア・パストリス（Pischia pastoris）非相同遺伝子発現系を使って酵母中で個々のＣＣＴサブユニットを発現させた。詳しくは、ＣＣＴε転写解読枠を pHIL-D2 中に挿入した。該構成物を用いてピスチアを形質転換せしめ、AOX1プロモーターの調節下でＣＣＴεを発現する株を製造した。それらの株、例えばWIL5 は、小規模培養（誘導の経時変化を測定するため）およびその後の大規模醗酵の両方により、メタノールによる誘導に応答してＣＣＴεを産生することが示された。それらの実験でピスチア・パストリス（Pischia pastoris）中でのマウスＣＣＴεの発現を追跡するために、本明細書に開示される抗ＣＣＴε抗体を使った。この抗体なくては実験ができなかったであろう。全ての作業はIn Vitrogen マニュアルに従い、そしてCregg，J.M.他，1993，Bio/Technology，11巻，905-910 中に記載された通りであった。ヒト細胞中での発現ＣＣＴサブユニットをヒト細胞中で遊離サブユニットとして発現せしめ、そして標準の真核発現ベクター（例えばpcDNA1）を使って内因性ＣＣＴ複合体中に組み込んだ。詳しくは、ＣＣＴαとＣＣＴβ転写解読枠をpcDNA1中にサブクローニングしてプラスミド pEXα と pEXβを得た。これらのプラスミドをヒト293T細胞中にトランスフェクトし、そして本明細書中に開示される抗体を使ったウエスタンブロット法と免疫沈澱法により、ＣＣＴタンパク質発現を測定した。ＣＣＴαとＣＣＴβの実質的発現が得られた。追加の考察ＥＭ陰性染色分析はＣＣＴが８または９個のサブユニットを含むらしいと示すけれども［14］、ＣＣＴの二重トーラス形粒子の各環の対称性はまだ更に決定すべきである。個々のポリペプチド種についてのＣＣＴの化学量論的組成は生化学的にはまだ決定されていないけれども、我々はマウスＦ９細胞から精製した抗体アフィニティー精製ＣＣＴの2D-NEPHGE により７種のＣＣＴサブユニットが存在すると確証した。その８つのＣＣＴサブユニットタンパク質をTcp-1 ／Cct αを含む８つのCct 遺伝子に割り当てることができた。陰性染色電子顕微鏡検査によるＣＣＴ［14］およびアクチンカペロニン［15］の分析は、該粒子が異なるサイズ／形状のサブユニットを有する準対称体に見えるので、ＣＣＴのヘテロメリック性質と一致する。Lewis 他［14］はマウス精巣ＣＣＴがヒトHep2細胞ＣＣＴよりも多数のサブユニットを含むことを以前に示し、RoobolとCarden[19]はラットとモルモットから誘導した脳ＣＣＴと精巣ＣＣＴとの相違を発見した。これらのデータは、幾つかのサブユニットは組織型に依存して置換可能かもしれないが、特定のＣＣＴ粒子が数種類のサブユニットから成るという考えと一致する。本明細書に記載される８つの遺伝子（７つの新規種と初期種Tcp-1 （α））がＣＣＴを再構成するのに十分である。マウスＦ９やヒトHep-2 のような或る種の細胞型は多量の７つのＣＣＴサブユニットを含み、タンパク質分析に基づくとCc te 遺伝子によりコードされるＳ２サブユニットが欠けているらしい。しかし、それは迅速に回転しているかまたは翻訳後修飾されてＳ２のレベルを測定困難にするのかもしれない。マウス精巣で発現されるサブユニットＳ６の役割は不明であるが、Ｓ７に対して惹起させた抗体がＳ６と反応することそして我々が２つの密接に関連したＣＣＴζ遺伝子のＤＮＡクローンを有することを仮定すれば、おそらくCctz遺伝子の産物であるＳ７と交換できる機能を有するのであろう。ノーザンブロッティングとタンパク質分析は、Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５，Ｓ７，Ｓ８およびＳ９が偏在的に発現され、従ってそれらが一般的なＣＣＴ活性の８つの必須成分を構成するという結論をもたらす。それらの７つの成分の組合せを使ってＣＣＴ折り畳み機構（複合体）を構築／再構成することができる。特殊なタンパク質は、正確に折り畳むのに追加のサブユニット、例えば組織特異的なサブユニットまたは他の補因子の存在を必要とすることがある。しかしながら、それらは本明細書中に提供されるサブユニットと組み合わせてＣＣＴ機構中に組み込むことができるだろう。ＣＣＴサブユニット遺伝子の進化の起源全ての生物は、リボソームＲＮＡ配列に基づいて主に３つの界、真正細菌、古細菌および真核生物に分類することができる［30］。古細菌および真核生物のサイトゾル中に見つかる幾つかのタンパク質は互いに類似しており、ミトコンドリア、クロロプラストおよび真正細菌のものも互いに類似している［31］。我々の配列分析は、各ＣＣＴサブユニットが古細菌スルホロブス・シバテ（Su ifolobus shibate ）のTF55と非常に類似しており（図４，表２）、共通の真正細菌起源から進化したと思われるGroEL や他のカペロニンタンパク質［10］とはあまり関連していない。別の古細菌ピロジクチウム・オクルタム（Pyrodictium oc cultum ）も、トリプシンペプチドがTF55と70％一致を有するＡＴＰアーゼ複合体を含む［32］。これらの結果は、全てのＣＣＴ遺伝子が真核生物と古細菌の共通の祖先から進化したことを示す。各真核生物のCct 遺伝子は、それがTF55から分岐したのと同じ位に別のCct 遺伝子から分岐しており、このことは真核生物遺伝子が真核生物系統のごく初期に互いから分かれたことを示唆する。アミノ酸置換に基づくＣＣＴサブユニットとTF55の進化の系統樹は、そのような考えを支持する（図７）。各ＣＣＴサブユニットのアミノ酸置換率が進化の間に一定であり［33］且つ酵母と動物が10億〜12億年前に分岐したと仮定すれば、ＣＣＴサブユニットの分岐時期を18億〜24億年前と計算される。しかしながら、動物、植物および酵母の各ＣＣＴ種の相関物は互いにかなり類似しており、各サブユニットがずっと前に独立した機能を進化させ、それが大部分の真核生物中に維持されていることを示唆する。ＣＣＴは７〜９つのサブユニット種から構成され、別のカペロニンは１または２つのサブユニット種しか持たないことから、おそらくＣＣＴは真核生物のサイトゾル中でより複雑な機能を進化させたと思われる。ＣＣＴの複雑さの増大は、ＣＣＴと基質との同時進化によって高度に組織化された真核生物サイトゾルの進化を促進したのかもしれない。ＣＣＴの機能ＣＣＴ、TF55および典型的なカペロニン（GroEL，Hsp60およびRubisco 結合タンパク質）は全てＡＴＰアーゼ活性を有する。おそらくこの族における配列の保存は、多数の無関連のタンパク質、例えばグルタミンシンセターゼ［34］が採用する二重トーラス構造を形成する能力よりもむしろ、ＡＴＰアーゼ活性の維持を反映すると思われる。TCP-1，TF55 およびGroEL 族カペロニン間には３つの高度に保存されたモチーフが存在する（[14]中の図４を参照のこと）。２つのモチーフ(I/V)T(N/K)DG(A/V)(T/S)（配列番号72）とGDGTT(S/T)（配列番号73）はNH₂末端に位置し、そしてもう１つのV(A/P)GGG（配列番号74）はCOOH末端の方に位置する。それらの３つのモチーフは他のＣＣＴサブユニット中にも保存されており、そして興味深いことにGDGTT(T/S)の近くのアミノ酸配列（図５）は、cAMP依存性キナーゼ族タンパク質が共有しているＡＴＰ加水分解のためのリン酸結合領域[25,25]に対して相同性を有する。これらの広く分散したモチーフが実際にＡＴＰ結合と加水分解に関与しているなら、それらはカペロニンがＡＴＰ結合時に生じる大きなコンホメーション変化の原因であるかもしれない。この考えはcAMP依存性タンパク質キナーゼα［26］、Hsp70［35,36］およびアクチン／ミオシン[37]の構造の知識により裏付けられ；ＡＴＰアーゼ活性に必要とされる幾つかの領域はこれらのタンパク質のアミノ酸鎖の中に広く分散している。ＣＣＴサブユニット種の多様性の考えられる１つの理由は、タンパク質折り畳み過程に関与する他の補因子との相互作用への各サブユニットの寄与であろう。我々は以前にＣＣＴがHsp70 種を結合することを示した［14］。Ｅ．コリ中では、DnaK（Hsp70 族）とGroE（Hsp60 族）が新たに合成されたタンパク質の折り畳みの際にDnaJと協力し合うと考えられる[38,39]。Hsp70 、DnaJ同族体［40］およびＣＣＴが関与する同様なメカニズムが真核生物サイトゾル中でも起こる可能性がある。ＣＣＴδとHsp70 族タンパク質のCOOH末端間には弱い相同性が見られ（データは示してない）、これはカペロンと補因子との相互作用におけるＣＣＴ δの役割を暗示するのかもしれない。或るカペロニン（GroE，Hsp60）はＣＣＴが折り畳むことのできる基質を折り畳むことができないことは知られている；ミトコンドリアのHsp60 は変性α−アクチンを折り畳まずまたはそれと二価複合体を形成せず［15］、GroEL/ESはルシフェラーゼを結合することができるけれども折り畳まない［17］。これは、典型的なカペロニンとＣＣＴの基質特異性が異なること、およびＣＣＴが単一種カペロニンよりもずっと多数のサブユニット種を進化させることにより基質構造のスペクトルを変化させたかもしれないことを示唆する。 Sternlicht他［18］は、アクチンとツブリンに加えてＣＣＴと同時に精製される 40 kDaの新たに合成されたタンパク質を報告した。これはＣＣＴの新規基質であると思われる。アクチンやツブリンの折り畳みに加えて、ＣＣＴの一般的機能はＳ．セレビシエ中での遺伝子実験により証明される。部分的TCP-1 関連ポリペプチドをコードするヒトHTR3 cDNAの発現はアミノ酸輸送の変異を救済した［41］。HTR3ポリペプチドはマウスＣＣＴζに対して96％相同性を有し、従ってＣＣＴ ζのヒト相関物（orthologue）である。これは、ＣＣＴがアミノ酸輸送に影響を及ぼすタンパク質の折り畳みを助けるかもしれないことを示す。ＣＣＴはアフィニティー母材に結合させたクロム親和性顆粒膜に試験管内で結合する［42］。これは、ＣＣＴの役割が分泌小胞および膜透過現象の調節であることを暗示する。フィトクロムを折り畳むという特殊機能を発達させたと思われるオート麦のTCP- 1 関連カペロニンの短鎖ペプチド配列は、他のＣＣＴサブユニットよりもＣＣＴ δに関連する（図４中の残基369 〜384 ）。この特殊機能は異なる祖先の生物中の異なる本源のCct 遺伝子から誘導されたのかもしれない。ＣＣＴは、それらのタンパク質が有意なアミノ酸配列相同性を示さないという事実にもかかわらず、多くの研究者により主としてツブリンとアクチンのための折り畳み機として働くと考えられている。アクチンとツブリンは細胞中に非常に豊富であり、従ってそれらはおそらく基質として検出が最も容易なタンパク質であったのだろう[18]。表４はＣＣＴにより折り畳まれることが知られているタンパク質を要約する。ホタルのルシフェラーゼは試験管内でＣＣＴにより折り畳まれると報告されており［17,61］、脳ＣＣＴは神経フィラメント断片結合タンパク質として精製された［19］。Lingappa他［62］は、TCP-1 および／またはTCP-1 様カペロニンが試験管内でＢ型肝炎ウイルスによるカプシド形成に関与することを報告している。よって、ＣＣＴは生体内でアクチンやツブリンだけでなくもっと広い範囲のタンパク質の折り畳みを助けることができる。各サブユニット種の機能分析は、真核細胞中での一般的なタンパク質折り畳み現象における生体内でのＣＣＴの役割に関する更なる情報を提供するだろう。本発明者らは、哺乳類精巣で９つのＣＣＴサブユニット種、そしてマウスＦ９細胞で７つの主要種を同定した。本発明者らは精巣ＣＣＴとＦ９細胞ＣＣＴに共通して見つかるＣＣＴサブユニットをコードする７つのTcp-1 関連遺伝子をクローニングした。Tcp-1 ／Cct αおよびこれらの遺伝子は哺乳類から酵母まで非常に高度に保存されているので、それらは種間サザンブロット分析により検出することができる。２つのサブユニット種（ＣＣＴαとＣＣＴβ）のマウスと酵母の相関物のアミノ酸配列は、それぞれ61％と66％の配列一致を示す。ＣＣＴサブユニットは全てcAMP依存性プロテインキナーゼおよびこの族の他のキナーゼのＡＴＰ結合部位と同様なモチーフを含有し、これは全てのＣＣＴサブユニットがＡＴＰアーゼ活性を有することを示唆する。マウスＣＣＴサブユニットは、或るサブユニットタンパク質種と別のものとの間に26〜35％しか相同性を示さず、系統発生分析はＣＣＴサブユニット遺伝子の分岐時期が動物と酵母の分岐時期の約２倍前であることを示す。以上の所見は、各サブユニットがずっと昔に共通のＡＴＰアーゼ機能に加えて独立した特殊機能を進化させたこと、およびそれらの機能が全ての真核生物中に維持されていることを暗示する。他のカペロニンと比較したサブユニット種の数の増大は、高度に進化した真核生物タンパク質の折り畳みと構築に必要とされる一層複雑な機能を可能にしたかもしれない。２Ｄゲル上のＣＣＴサブユニットのスポット番号（Ｓ１〜Ｓ９）は図１に記載されている。ＣＣＴサブユニットαがスポットＳ３、εがＳ２、ζがＳ７、そして θがＳ１に対応することは（図10）、各サブユニットと特異的に反応する抗体を使った２Ｄゲルのウエスタンブロッティングにより決定した。他の対応関係は図３に記載のペプチド配列決定データと図10に記載のウエスタンブロッティングデータから誘導した。ＣＣＴサブユニットのアミノ酸の数と分子量は図３および図８のアミノ酸配列から算出した。同一アミノ酸の割合が対角線の下にそしてギャップ／挿入の数が対角線の上に示される。括弧内の数字はアミノ酸数として与えられるギャップ／挿入の全長である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月５日【補正内容】請求の範囲１．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ単離物であって、前記サブユニットが配列番号25，27，28 ，29，30および31のいずれかに示されるアミノ酸配列または前記配列の１つに対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、前記ＤＮＡ単離物。２．前記ヌクレオチド配列が配列番号55，57，58，59，60および61のいずれかである、請求項１に記載のＤＮＡ単離物。３．前記ヌクレオチド配列が、配列番号55，57，58，59，60および61に示されるヌクレオチド配列のいずれかの対立遺伝子、ヌクレオチド欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体である、請求項１に記載のＤＮＡ単離物。４．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ単離物であって、前記サブユニットが配列番号25，27，28 ，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であり且つTCP-1 サブユニットアミノ酸配列（配列番号24）から免疫学的に識別可能であるアミノ酸配列を含んで成る、前記ＤＮＡ単離物。５．請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含んで成るベクター。６．配列番号24，25，26，27，28，29，30，31に示されるアミノ酸配列の各々をコードするヌクレオチド配列または該配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有する配列、およびコードされるサブユニットの発現のための核酸を含んで成るＤＮＡを含む、ベクターまたはベクターの組合せ。７．請求項５または請求項６に記載のベクターを含んで成る宿主細胞。８．原核である、請求項７に記載の宿主細胞。９．真核である、請求項７に記載の宿主細胞。 10．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットの調製方法であって、請求項５または請求項６に記載のベクターからの発現を含んで成る方法。 11．前記発現が前記ベクターを含んで成る宿主細胞を培養することから生じる、請求項10に記載の方法。 12．前記宿主細胞が原核である、請求項11に記載の方法。 13．前記宿主細胞が真核である、請求項11に記載の方法。 14．ポリペプチド折り畳み複合体の生産方法であって、コードする核酸から該複合体のサブユニットを発現させ、そして該複合体へのサブユニットの構築を誘導するかまたは許容することを含んで成る方法。 15．前記サブユニットが、配列番号25，26，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかまたは前記配列のうちの１つに対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項14に記載の方法。 16．前記複合体が、配列番号24，25，26，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列の全部または前記配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項15に記載の方法。 17．前記サブユニットのいずれかをコードする核酸が、配列番号55，56，57， 58，59，60および61に示されるヌクレオチド配列のいずれかの対立遺伝子、ヌクレオチド欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であるヌクレオチド配列を有する、請求項15または16に記載の方法。 18．前記サブユニットのいずれかのアミノ酸配列が、配列番号25，26，27，28 ，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であり、且つTCP-1 サブユニットアミノ酸配列（配列番号24）から免疫学的に識別可能である、請求項14に記載の方法。 19．前記複合体への前記サブユニットの構築が発現後の試験管内混合による、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。 20．前記サブユニットが一緒に発現される、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。 21．ポリペプチド折り畳み複合体の精製ポリペプチドサブユニットであって、配列番号25，27，28，29，30および31のいずれかに示されるアミノ酸配列または前記配列の１つに対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、前記精製ポリペプチドサブユニット。 22．ポリペプチド折り畳み複合体のポリペプチドサブユニットであって、配列番号25，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であり且つTCP-1 のアミノ酸配列（配列番号24）から免疫学的に識別可能であるアミノ酸配列を含んで成る、前記ポリペプチドサブユニット。 23．ポリペプチド折り畳み複合体であって、請求項21または請求項22に記載のサブユニット；所望により、配列番号26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはアミノ酸欠失、置換もしくは挿入によるそれの変異体または誘導体であるアミノ酸配列を含んで成るサブユニット；および所望により、配列番号24に示される配列に対して少なくとも60％の配列相同を有するアミノ酸配列、またはアミノ酸欠失、置換もしくは挿入によるそれの変異体または誘導体であるアミノ酸配列を含んで成るサブユニット、から選択されたポリペプチドサブユニットを含んで成るポリペプチド折り畳み複合体。 24．配列番号24，25，26，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドサブユニットを含んで成る、請求項23に記載のポリペプチド折り畳み複合体。 25．ポリペプチドの折り畳みにおける請求項23または24に記載のポリペプチド折り畳み複合体の利用。 26．請求項23または請求項24に記載のポリペプチド折り畳み複合体を使ってポリペプチドを折り畳む方法。 27．前記ポリペプチドの折り畳みが、組換え発現によるサブユニットの生産に続き該サブユニットからのポリペプチド折り畳み複合体の構築の結果として起こる、請求項26に記載の方法。 28．TCP-1（ＣＣＴα−配列番号24）以外のポリペプチド折り畳み複合体の単一のサブユニットに特異的に結合することができる抗体またはその断片。 29．前記抗体またはその断片が結合することができるサブユニットが、ＣＣＴ β（配列番号25）、ＣＣＴγ（配列番号26）、ＣＣＴδ（配列番号27）、ＣＣＴ ε（配列番号28）、ＣＣＴζ（配列番号29）、ＣＣＴη（配列番号30）およびＣＣＴθ（配列番号31）のいずれか１つである、請求項28に記載の抗体またはその断片。 30．配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１，２，３，４，５，６および７に示されるもののいずれかの変異体であるアミノ酸配列を有するペプチドに対して結合特異性を有する、請求項29 に記載の抗体またはその断片。 31．請求項28に記載の抗体またはその断片を獲得する方法であって、配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１，２，３，４，５，６および７に示されるもののいずれかの変異体であるアミノ酸配列を有するペプチドを哺乳類に投与し、そして前記哺乳類から単一サブユニット種に特異的な抗体を回収することを含んで成る方法。 32．配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体もしくは誘導体であるそれの変異体であって、サブユニット特異的エピトープを含んで成るペプチド。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月１６日【補正内容】請求の範囲１．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ単離物であって、前記サブユニットが配列番号25，27，28 ，29，30および31のいずれかに示されるアミノ酸配列または前記配列の１つに対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、前記ＤＮＡ単離物。２．前記ヌクレオチド配列が配列番号55，57，58，59，60および61のいずれかである、請求項１に記載のＤＮＡ単離物。３．前記ヌクレオチド配列が、配列番号55，57，58，59，60および61に示されるヌクレオチド配列のいずれかの対立遺伝子、ヌクレオチド欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体である、請求項１に記載のＤＮＡ単離物。４．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ単離物であって、前記サブユニットが配列番号25，27，28 ，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であり且つTCP-1 サブユニットアミノ酸配列（配列番号24）から免疫学的に識別可能であるアミノ酸配列を含んで成る、前記ＤＮＡ単離物。５．請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含んで成るベクター。６．配列番号24，25，26，27，28，29，30，31に示されるアミノ酸配列の各々をコードするヌクレオチド配列または該配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有する配列、およびコードされるサブユニットの発現のための核酸を含んで成るＤＮＡを含む、ベクターまたはベクターの組合せ。７．請求項５または請求項６に記載のベクターを含んで成る宿主細胞。８．原核である、請求項７に記載の宿主細胞。９．真核である、請求項７に記載の宿主細胞。 10．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットの調製方法であって、請求項５または請求項６に記載のベクターからの発現を含んで成る方法。 11．前記発現が前記ベクターを含んで成る宿主細胞を培養することから生じる、請求項10に記載の方法。 12．前記宿主細胞が原核である、請求項11に記載の方法。 13．前記宿主細胞が真核である、請求項11に記載の方法。 14．ポリペプチド折り畳み複合体の生産方法であって、コードする核酸から該複合体のサブユニットを発現させ、そして該複合体へのサブユニットの構築を誘導するかまたは許容することを含んで成る方法。 15．前記サブユニットが、配列番号25，26，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかまたは前記配列のうちの１つに対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項14に記載の方法。 16．前記複合体が、配列番号24，25，26，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列の全部または前記配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項15に記載の方法。 17．前記サブユニットのいずれかをコードする核酸が、配列番号55，56，57， 58，59，60および61に示されるヌクレオチド配列のいずれかの対立遺伝子、ヌクレオチド欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であるヌクレオチド配列を有する、請求項15または16に記載の方法。 18．前記サブユニットのいずれかのアミノ酸配列が、配列番号25，26，27，28 ，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であり、且つTCP-1 サブユニットアミノ酸配列（配列番号24）から免疫学的に識別可能である、請求項14に記載の方法。 19．前記複合体への前記サブユニットの構築が発現後の試験管内混合による、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。 20．前記サブユニットが一緒に発現される、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。 21．ポリペプチド折り畳み複合体の精製ポリペプチドサブユニットであって、配列番号25，27，28，29，30および31のいずれかに示されるアミノ酸配列または前記配列の１つに対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、前記精製ポリペプチドサブユニット。 22．ポリペプチド折り畳み複合体のポリペプチドサブユニットであって、配列番号25，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であり且つTCP-1 のアミノ酸配列（配列番号24）から免疫学的に識別可能であるアミノ酸配列を含んで成る、前記ポリペプチドサブユニット。 23．ポリペプチド折り畳み複合体であって、請求項21または請求項22に記載のサブユニット；所望により、配列番号26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはアミノ酸欠失、置換もしくは挿入によるそれの変異体または誘導体であるアミノ酸配列を含んで成るサブユニット；および所望により、配列番号24に示される配列に対して少なくとも60％の配列相同を有するアミノ酸配列、またはアミノ酸欠失、置換もしくは挿入によるそれの変異体または誘導体であるアミノ酸配列を含んで成るサブユニット、から選択されたポリペプチドサブユニットを含んで成るポリペプチド折り畳み複合体。 24．配列番号24，25，26，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも60％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドサブユニットを含んで成る、請求項23に記載のポリペプチド折り畳み複合体。 25．ポリペプチドの折り畳みにおける請求項23または24に記載のポリペプチド折り畳み複合体の利用。 26．請求項23または請求項24に記載のポリペプチド折り畳み複合体を使ってポリペプチドを折り畳む方法。 27．前記ポリペプチドの折り畳みが、組換え発現によるサブユニットの生産に続き該サブユニットからのポリペプチド折り畳み複合体の構築の結果として起こる、請求項26に記載の方法。 28．TCP-1（ＣＣＴα−配列番号24）以外のポリペプチド折り畳み複合体の単一のサブユニットに特異的に結合することができる抗体またはその断片。 29．前記抗体またはその断片が結合することができるサブユニットが、ＣＣＴ β（配列番号25）、ＣＣＴγ（配列番号26）、ＣＣＴδ（配列番号27）、ＣＣＴ ε（配列番号28）、ＣＣＴζ（配列番号29）、ＣＣＴη（配列番号30）およびＣＣＴθ（配列番号31）のいずれか１つである、請求項28に記載の抗体またはその断片。 30．配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１，２，３，４，５，６および７に示されるもののいずれかの変異体であるアミノ酸配列を有するペプチドに対して結合特異性を有する、請求項29 に記載の抗体またはその断片。 31．請求項28に記載の抗体またはその断片を獲得する方法であって、配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１，２，３，４，５，６および７に示されるもののいずれかの変異体であるアミノ酸配列を有するペプチドを咄乳類に投与し、そして前記哺乳類から単一サブユニット種に特異的な抗体を回収することを含んで成る方法。 32．配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体もしくは誘導体であるそれの変異体であって、サブユニット特異的エピトープを含んで成るペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者久保田広志イギリス国，ロンドンエヌ６５キューディー，ハイゲート，ミルトンロード２ (72)発明者アシュワース，アランイギリス国，ロンドンエスダブリュ10 ９アールエフ，サウスケンジントン，ドレイトンガーデンズ 88ビー

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ単離物であって、前記サブユニットが配列番号25，27，28 ，29，30および31のいずれかに示されるアミノ酸配列または該配列に対して有意な程度の相同性を有するアミノ酸配列を有する、前記ＤＮＡ単離物。２．前記ヌクレオチド配列が配列番号55，57，58，59，60および61のいずれかである、請求項１に記載のＤＮＡ単離物。３．前記ヌクレオチド配列が、配列番号55，57，58，59，60および61に示されるヌクレオチド配列のいずれかの対立遺伝子、ヌクレオチド欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体である、請求項１に記載のＤＮＡ単離物。４．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ単離物であって、前記サブユニットが配列番号25，27，28 ，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であるアミノ酸配列を含んで成る、前記ＤＮＡ単離物。５．請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡとコードされるサブユニットの発現のための核酸とを含んで成るベクター。６．請求項５に記載のベクターを含んで成る宿主細胞。７．原核である、請求項６に記載の宿主細胞。８．真核である、請求項６に記載の宿主細胞。９．ポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットの調製方法であって、請求項５に記載のベクターからの発現を含んで成る方法。 10．前記発現が前記ベクターを含んで成る宿主細胞を培養することから生じる、請求項９に記載の方法。 11．前記宿主細胞が原核である、請求項10に記載の方法。 12．前記宿主細胞が真核である、請求項10に記載の方法。 13．ポリペプチド折り畳み複合体の生産方法であって、コードする核酸から該複合体のサブユニットを発現させ、そして該複合体への該サブユニットのの構築を誘導するかまたは許容することを含んで成る方法。 14．前記サブユニットが、配列番号25，26，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかまたは該配列に対して有意な程度の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、請求項13に記載の方法。 15．前記サブユニットのいずれかをコードする核酸が、配列番号55，56，57， 58，59，60および61に示されるヌクレオチド配列のいずれかの対立遺伝子、ヌクレオチド欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であるヌクレオチド配列を有する、請求項14に記載の方法。 16．前記サブユニットのいずれかのアミノ酸配列が、配列番号25，26，27，28 ，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体である、請求項13に記載の方法。 17．前記複合体への前記サブユニットの構築が発現後の試験管内混合による、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。 18．前記サブユニットが一緒に発現される、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。 19．ポリペプチド折り畳み複合体の精製ポリペプチドサブユニットであって、配列番号25，27，28，29，30および31のいずれかに示されるアミノ酸配列または該配列に対して有意な程度の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る、前記精製ポリペプチドサブユニット。 20．ポリペプチド折り畳み複合体のポリペプチドサブユニットであって、配列番号25，27，28，29，30および31に示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であるアミノ酸配列を含んで成る、前記ポリペプチドサブユニット。 21．ポリペプチド折り畳み複合体であって、請求項19または請求項20に記載のサブユニット；所望により、配列番号26に示されるアミノ酸配列、配列番号26に示されるアミノ酸配列のアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であるアミノ酸配列、または配列番号26に示される配列に対して有意な程度の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るサブユニット；および所望により、配列番号24に示されるアミノ酸配列、配列番号24に示されるアミノ酸配列のアミノ酸欠失、置換もしくは挿入による変異体または誘導体であるアミノ酸配列、または配列番号24に示される配列に対して有意な程度の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成るサブユニット、から選択されたポリペプチドサブユニットを含んで成るポリペプチド折り畳み複合体。 22．ポリペプチドの折り畳みにおける請求項21に記載のポリペプチド折り畳み複合体の利用。 23．請求項21に記載のポリペプチド折り畳み複合体を使ってポリペプチドを折り畳む方法。 24．前記ポリペプチドの折り畳みが、組換え発現によるサブユニットの生産に続き該サブユニットからのポリペプチド折り畳み複合体の構築の結果として起こる、請求項23に記載の方法。 25．TCP-1（ＣＣＴα−配列番号24）以外のポリペプチド折り畳み複合体のサブユニットに特異的に結合することができる抗体またはその断片。 26．前記抗体またはその断片が結合することができるサブユニットが、ＣＣＴ β（配列番号25）、ＣＣＴγ（配列番号26）、ＣＣＴδ（配列番号27）、ＣＣＴ ε（配列番号28）、ＣＣＴζ（配列番号29）、ＣＣＴη（配列番号30）およびＣＣＴθ（配列番号31）のいずれかである、請求項25に記載の抗体またはその断片。 27．配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１，２，３，４，５，６および７に示されるもののいずれかの変異体であるアミノ酸配列を有するペプチドに対して結合特異性を有する、請求項26に記載の抗体またはその断片。 28．請求項25に記載の抗体またはその断片を獲得する方法であって、配列番号１，２，３，４，５，６および７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１，２，３，４，５，６および７に示されるもののいずれかの変異体であるアミノ酸配列を有するペプチドを哺乳類に投与し、そして前記哺乳類から抗体を回収することを含んで成る方法。