JPH09221499A

JPH09221499A - 神経細胞で発現する新規タンパク質

Info

Publication number: JPH09221499A
Application number: JP8278254A
Authority: JP
Inventors: Manabu Nakayama; 学中山; Toshihiko Miyake; 敏彦三宅; Tadahisa Kitamura; 忠久北村; Yoshinari Wagahara; 義成我原; Osamu Obara; 收小原
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-21
Publication date: 1997-08-26

Abstract

(57)【要約】【課題】神経細胞で発現され、神経損傷に伴って発現
が抑制されるタンパク質を得ること。【解決手段】サブトラクティブ／ディファレンシャル
スクリーニングにより、カルボキシ末端付近にＲＩＮＧ
−Ｈ２フィンガーモチーフを有する新規タンパク質をコ
ードする遺伝子を得た。さらに、この遺伝子を有する発
現ベクター、および発現ベクターを導入した形質転換体
が得られ、この形質転換体を培養することによりニュー
ロダップ１タンパク質を産生した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＩＮＧ−Ｈ２フ
ィンガーモチーフを含みかつ神経細胞のシナプス後膜肥
厚領域に局在し得るタンパク質、特に、神経損傷（例え
ば、神経細胞の逆行性変性）に伴って発現が抑制される
タンパク質；該タンパク質の構造遺伝子；該遺伝子を有
する発現ベクター；該発現ベクターを導入した形質転換
体；該形質転換体を用いる、ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガー
モチーフを含みかつ神経細胞のシナプス後膜肥厚領域に
局在し得るタンパク質の製造方法；該タンパク質を認識
する抗体；および該抗体を産生し得るハイブリドーマに
関する。

【０００２】

【従来の技術】神経の軸索損傷により影響を受けた神経
細胞の逆行性変性または軸索の再生は、中枢および末梢
神経系で通常に生じるプロセスである。ラットの顔面神
経の軸索切断により影響を受けた神経細胞では、以下の
ような一連のグリア反応が報告されている。第１に、ア
ストログリア細胞で、グリア線維性酸性タンパク質のレ
ベルが増加する（KitamuraおよびFujita、Denshi-kenbi
kyou 19:193-199 (1985)；GraeberおよびKreutzberg、J
Neurocytol 15:363-373 (1986)）。第２に、ミクログ
リア細胞が活性化され、そして増殖する（Kitamuraおよ
びFujita、(1985)前出；Graeberら、Neurosci Lett 85:
317-321 (1988)）。第３に、神経周囲のミクログリア細
胞が、シナプス結合に侵入し、神経細胞体および主要樹
状突起の表面からシナプス末端を剥離する（Blinzinger
およびKreutzberg、Z ZellforschMikrosk Anat 85:145-
157 (1968)）。このような一連の反応が起こった後に、
顔面神経の軸策が再生を起こすことが知られている。

【０００３】これらの現象論的観察にも関わらず、軸索
切断に応答する神経細胞体の周りの領域で生じる分子生
物学的事象についてはほとんど知られていない。GAP-43
（Basiら、Cell 49: 785-791 (1987)）、α-チューブリ
ン（α-tubulin）（Millerら、J Neurosci 9:1452-1463
(1989)）、α-インターネキシン（α-internexin）（F
liegnerら、EMBO J 9:749-755 (1990)）、SCG-10（Okaz
akiら、Genomics 18:360-373 (1993)）、ユビキチン（F
inchら、Nucleic Acids Res 18:1907 (1990)）、MHCク
ラスI RT1 Aa α鎖（Radaら、Proc Natl Acad Sci USA
87:2167-2171(1990)）、およびカテプシンS（Petancesk
aおよびDevi、J Biol Chem 267:26038-26043 (199
2)）、ニューロフィラメント（KitamuraおよびWatanab
e、Acta Histochem Cytochem 23:375-386 (1990)；Kita
muraら、Neuropathology Suppl 4:263-268 (1991)）、G
FAP（Kitamura、「Functional neuroteratology of sho
rt-term exposure to drugs」（Fujita TおよびBoer GJ
編）187-197頁、Tokyo、TeikyoUP (1991)；Tetzlaff
ら、J Neurosci 11:2528-2544 (1991)）、神経成長因子
レセプター（Saikaら、Mol Brain Res 9:157-160 (199
1)；Chiuら、J Comp Neurol328:351-363 (1993)）、お
よびアミロイドβタンパク質前駆体（βAPP：Solaら、E
ur J Neurosci 5795-5808 (1993)）を含む非常に少数の
遺伝子が、軸索切断後にその発現レベルが変化すること
が既に報告されている。しかし、これらの同定された遺
伝子は、軸索切断によりその発現が変動した一部の遺伝
子であり、軸索切断後に重要な役割を果たすさらに他の
未知遺伝子の存在が考えられる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＲＩ
ＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフを含みかつ神経細胞のシ
ナプス後膜肥厚領域に局在し得るタンパク質、詳細に
は、神経損傷に伴って発現が変動する上記従来技術の遺
伝子とは別の遺伝子から発現するタンパク質、特にその
発現が抑制されるタンパク質を提供することにある。さ
らに本発明の目的は、上記タンパク質の構造遺伝子；該
遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを導入し
た形質転換体；該形質転換体を用いるＲＩＮＧ−Ｈ２フ
ィンガーモチーフを含みかつ神経細胞のシナプス後膜肥
厚領域に局在し得るタンパク質の製造方法；該タンパク
質に対する抗体；および該抗体を産生し得るハイブリド
ーマを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】発明者らは、ＲＩＮＧ−
Ｈ２フィンガーモチーフを含みかつ神経細胞のシナプス
後膜肥厚領域に局在し得るタンパク質、特に、軸索切断
により転写レベルで影響を受ける遺伝子についてさらに
種々の検討を行うために、サブトラクティブ／ディファ
レンシャルスクリーニングというクローニング法を適用
した。これによって、いくつかの軸索切断によりその発
現が変動する遺伝子を単離し得、このうちの１つが、軸
索切断により発現が抑制される新規の遺伝子であった。
この遺伝子のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列、お
よび大腸菌を用いてこの遺伝子を発現して得られた産物
が、亜鉛フィンガーファミリーに分類される特徴的なＲ
ＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフを有するタンパク質で
あることを見出した。さらに、このタンパク質が、シナ
プス後膜肥厚（ＰＳＤ）に局在することを見出し、これ
をニューロダップ１（Neurodap-1）と命名し、本発明を
完成するに至った。

【０００６】本発明の神経細胞のシナプス後膜肥厚領域
に局在し得るタンパク質（ニューロダップ１）は、ＲＩ
ＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフを含む。

【０００７】好ましい実施態様によれば、上記タンパク
質は、神経損傷に伴って発現が抑制される。

【０００８】好ましい実施態様によれば、上記ＲＩＮＧ
−Ｈ２フィンガーモチーフは、配列表の配列番号１の６
３３位のCysから６７３位のCysまでのアミノ酸配列また
はその類似の配列である。

【０００９】好ましい実施態様によれば、上記タンパク
質は、配列表の配列番号１の１位のMetから７０７位のP
roまでのアミノ酸配列またはその類似の配列を含む。

【００１０】好ましい実施態様によれば、上記タンパク
質は、ヒトの中枢神経系で発現される。

【００１１】好ましい実施態様によれば、上記ＲＩＮＧ
−Ｈ２フィンガーモチーフは、配列表の配列番号８の６
３４位のCysから６７４位のCysまでのアミノ酸配列また
はその類似の配列である。

【００１２】好ましい実施態様によれば、上記タンパク
質は、配列表の配列番号８の１位のMetから７０８位のP
roまでのアミノ酸配列またはその類似の配列を含む。

【００１３】本発明のＤＮＡ分子は、上記のいずれかに
記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する。

【００１４】本発明のＤＮＡ分子は、配列表の配列番号
１の６３３位のCysから６７３位のCysまでのアミノ酸配
列またはその類似の配列をコードする塩基配列を少なく
とも含む。

【００１５】好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ分
子は、配列表の配列番号１の２０３７位のＴから２１５
９位のＣまででなる塩基配列を有する。

【００１６】好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ分
子は、配列表の配列番号１の１４１位のＡから２２６１
位のＧまででなる塩基配列を有する。

【００１７】好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ分
子は、配列表の配列番号１の１位のＴから４７５８位の
Ａまででなる塩基配列を有する。

【００１８】本発明のＤＮＡ分子は、配列表の配列番号
８の６３４位のCysから６７４位のCysまでのアミノ酸配
列またはその類似の配列をコードする塩基配列を少なく
とも含む。

【００１９】好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ分
子は、配列表の配列番号８の２０２８位のＴから２１５
０位のＣまででなる塩基配列を有する。

【００２０】好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ分
子は、配列表の配列番号８の１２９位のＡから２２５２
位のＣまででなる塩基配列を有する。

【００２１】好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ分
子は、配列表の配列番号８の１位のＧから４７７８位の
Ａまででなる塩基配列を有する。

【００２２】本発明の発現ベクターは、上記のいずれか
に記載のＤＮＡ分子を有する。

【００２３】本発明の形質転換体は、上記発現ベクター
を宿主に導入して得られる。

【００２４】好ましい実施態様によれば、上記宿主は大
腸菌である。

【００２５】本発明のＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチー
フを含みかつ神経細胞のシナプス後膜肥厚領域に局在し
得るタンパク質の製造方法は、上記形質転換体を培養す
る工程、および産生されたタンパク質を培養培地から回
収する工程を包含する。

【００２６】本発明の抗体は、上記のいずれかに記載の
タンパク質を認識する。

【００２７】好ましい実施態様によれば、上記抗体は、
モノクローナル抗体である。

【００２８】本発明のハイブリドーマは、上記のいずれ
かに記載の抗体を産生し得る。

【００２９】

【発明の実施の形態】

（Ｉ）定義以下に、本発明を説明するうえで用いられる用語を説明
する。

【００３０】「ＲＩＮＧフィンガーモチーフ」および
「ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフ」は、いずれも亜
鉛フィンガーモチーフに分類されるタンパク質中の構造
的配列であり、亜鉛原子の周りにポリペプチド鎖が折り
たたまれることによって形成される。ＲＩＮＧフィンガ
ーモチーフは、ヒトＲＩＮＧ１遺伝子（Loveringら、Pr
oc Natl Acad Sci USA 90:2112-2116 (1993)）の配列中
に見られるシステインリッチのアミノ酸配列モチーフで
ある。ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフは、ＲＩＮＧ
−フィンガーモチーフに密接に関連しており、ＲＩＮＧ
フィンガーモチーフ中のCys4がHisで置換されているモ
チーフである（Freemont、Ann NY Acad Sci684:174-192
(1993)）。

【００３１】アミノ酸配列またはＤＮＡ配列に「類似の
配列」とは、特定の配列に必ずしも限定されることはな
く、この配列に加えて当業者に公知の置換、挿入、欠失
などを含み、そしてコードされるタンパク質の機能また
は活性が実質的に同じ程度である改変を含む配列をい
う。あるいは、タンパク質の機能または活性が実質的に
同じ程度であるならば、化学的または生化学的な改変、
あるいは非天然または誘導体化されたアミノ酸または塩
基を含んでいてもよい。

【００３２】（ＩＩ）本発明のタンパク質またはＤＮＡ
配列の単離または同定に用い得る方法本発明の各工程において用い得る一般的な分子生物学的
実験手法（ＤＮＡの電気泳動、電気泳動分離したＤＮＡ
をゲル中から回収する方法、ライゲーション、宿主の形
質転換、組換え宿主の培養、プラスミドＤＮＡの調製、
ＤＮＡの制限酵素による切断、ＤＮＡの放射標識など）
は、例えばMolecular Cloning 第２版（Maniatisら、Co
ld Spring Harbor Laboratory, New York (1989)）に記
載されているような、当業者に公知の方法が採用され
る。

【００３３】以下に本発明のタンパク質またはＤＮＡ分
子の単離または同定に用い得る一般的方法を述べる。

【００３４】（１）ニューロダップ１のｃＤＮＡのクロ
ーニング本発明のタンパク質であるニューロダップ１をコードす
るＤＮＡを含むＤＮＡ断片のクローニングを配列決定方
法と共に以下に例示する。本発明のニューロダップ１に
ついては、神経細胞で発現されていること、特に顔面神
経軸索切断により発現が変動すること以外に情報がない
ので、この遺伝子を得るために、サブトラクティブ／デ
ィファレンシャルスクリーニングを用いて、例えば、以
下に記載のように行う。

【００３５】（Ａ）ＲＮＡの調製顔面神経軸索切断により発現が変動するＤＮＡをクロー
ニングする場合、例えばラットなどの動物を麻酔して、
その片側の顔面神経を、例えば茎乳突孔のレベルで切断
する。適当な時間の後、これらの動物を屠殺し、その脳
幹から、切断側および非切断側の顔面神経核を取り出
す。それぞれの取り出した顔面神経核を有する脳組織か
ら、グアニジンチオシアネート法（ChomczynskiおよびS
acchi、Anal Biochem 162:156-159 (1987)）に従ってＲ
ＮＡを抽出し得る。あるいは、神経細胞で発現されてい
るＤＮＡをクローニングする場合は、例えば、未処理の
ラットの脳組織から、上記の公知の方法によりＲＮＡを
抽出し得る。

【００３６】（Ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの構築ｃＤＮＡライブラリーを、上記のようにして得た切断側
または非切断側顔面神経核あるいは未処理脳組織由来の
ＲＮＡから、例えば市販のｃＤＮＡ構築キット（GIBCO
BRL社製）を用いて構築し得る。ｃＤＮＡ合成用のアダ
プタープライマーとして、および適切なベクターへのｃ
ＤＮＡ挿入物用のアダプターとしての適当な長さのオリ
ゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機などで化学的に合成し
得る。

【００３７】（Ｃ）サブトラクティブ／ディファレンシ
ャルハイブリダイゼーションサブトラクティブハイブリダイゼーションは、例えば、
Rubensteinら（Nucleic Acids Res 18:4833-4842 (199
0)）およびSwaroopら（Nucleic Acids Res 19:1954 (19
91)）に記載の方法で行い得る。まず、軸索切断により
発現が転写レベルで抑制される遺伝子を得るためには、
例えば、ヘルパーファージM13KO7とともに非切断側顔面
神経核ｃＤＮＡライブラリー由来の一本鎖（ss）環状Ｄ
ＮＡを、切断側顔面神経核ｃＤＮＡライブラリー由来の
二本鎖（ds）プラスミドＤＮＡからの転写物であるビオ
チン化ＲＮＡにアニールする。次いで、ビオチン化ＲＮ
Ａおよびこのビオチン化ＲＮＡにハイブリダイズしたＤ
ＮＡを、ストレプトアビジンの添加により取り除き、こ
れをフェノール／クロロホルムにより抽出する。このス
トレプトアビジン−フェノール処理後に残った非切断側
由来のssＤＮＡを、例えばシークエナーゼおよび適切な
プライマーを用いて、dsＤＮＡに変換し得る。次いで、
得られたdsＤＮＡを、例えば大腸菌にトランスフェクト
する。このようにして得られるサブトラクトしたライブ
ラリー由来の各クローン中の挿入ｃＤＮＡを、ＰＣＲに
より増幅する。得られるＰＣＲ産物について、サブトラ
クトしたライブラリーのディファレンシャルスクリーニ
ングを、切断または非切断顔面神経核由来のｍＲＮＡか
ら形成される標識ｃＤＮＡプローブを用いるドットハイ
ブリダイゼーションにより行い得、軸索切断後に顔面神
経核で発現が抑制されるｃＤＮＡを単離し得る。

【００３８】一方、軸索切断後に顔面神経核で転写レベ
ルで発現が誘導された遺伝子を得るためには、同様のプ
ロセスを、一本鎖（ss）環状ＤＮＡの合成のための切断
側顔面神経核のｃＤＮＡライブラリー、および二本鎖
（ds）プラスミドＤＮＡ用の非切断側顔面神経核のｃＤ
ＮＡライブラリーを用いて行うことにより、軸索切断後
に顔面神経核で発現が誘導されるｃＤＮＡを単離し得
る。

【００３９】あるいは、未処理の神経細胞で発現されて
いる遺伝子を得るためには、上記のようにして得られた
目的のｃＤＮＡの断片を用いて、例えばコロニーハイブ
リダイゼーションなどの公知の方法により、ｃＤＮＡを
単離し得る。

【００４０】（Ｄ）ＤＮＡ配列およびタンパク質のホモ
ロジー検索上記のようにして、軸索切断後に顔面神経核で発現が変
動するいくつかのｃＤＮＡを単離し得る。このような軸
索切断により影響を受ける遺伝子を有するクローンにつ
いて、例えばコロニーハイブリダイゼーションにより全
長のｃＤＮＡが得られる。この塩基配列の決定は、例え
ば、ジデオキシ法（Sanger、Science, 214, 1205-1210
(1981)）に従って行い得る。このようなクローンを解析
して得られたニューロダップ１のＤＮＡ配列およびアミ
ノ酸配列を、配列表の配列番号１および配列番号８に示
す。このＤＮＡ配列およびアミノ酸配列について、例え
ば、GenBank/EMBL/DDBJ ＤＮＡ配列データベースおよび
NBRF/Swiss pROT/PIRタンパク質データベースに対して
適切なホモロジー検索プログラムを用いて、検索を行い
得る。さらに、タンパク質モチーフについては、例え
ば、PROSITEプログラムを用いてモチーフ検索を行い得
る。このモチーフ検索の結果、本発明の神経細胞で発現
されているタンパク質、すなわちラット神経損傷に伴っ
て発現が抑制されるタンパク質（ニューロダップ１）
は、そのカルボキシ末端付近にＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガ
ーモチーフを有することが明らかになった。また、この
ラットニューロダップ１のｃＤＮＡ断片を用いたスクリ
ーニングにより得られたヒトニューロダップ１も、カル
ボキシル末端付近にＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフ
を有することがわかった。

【００４１】ＲＩＮＧフィンガーモチーフを有するタン
パク質の多くについては、亜鉛フィンガーモチーフタン
パク質の場合のように、ＤＮＡ結合活性を有することが
報告されているが、ほとんどのＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガ
ーモチーフタンパク質および少数のＲＩＮＧフィンガー
モチーフタンパク質は、ＤＮＡに結合しないと考えられ
ている（Freemont、(1993) 前出）。特に、ＲＩＮＧま
たはＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフタンパク質のサ
ブファミリーは、それぞれのカルボキシ末端部分にこの
配列モチーフを有しており、このモチーフは空胞または
膜と結合することが知られている。例えば、酵母タンパ
ク質PET3/Vps18pおよびPET5/Vps11/END1は、空胞の生合
成に関連し（DulicおよびRiezman、EMBO J 8:1349-1359
(1989)；Prestonら、Mol Cell Biol 11:5801-5812 (19
91)；Robinsonら、Mol Cell Biol 12:5813-5824 (199
1)）、そして43-kDaシナプス後膜タンパク質（43K）
は、アセチルコリンレセプターの集合（clustering）お
よび凝集（aggregation）に関連しており、原形質膜と
結合することが見出されている（Scotlandら、J Cell B
iol 123:719-728 (1993)）。これらの知見から、ＲＩＮ
Ｇ−Ｈ２フィンガーモチーフが、タンパク質−タンパク
質またはタンパク質−脂質関連ドメインを形成し得るこ
とが示唆される。そのため、このモチーフは、細胞内タ
ンパク質輸送システムに関連していると考えられる。従
って、本発明のニューロダップ１タンパク質も、細胞内
タンパク質輸送システムに関連していると考えられる。

【００４２】（２）ニューロダップ１の組織および組織
内分布の確認本発明のニューロダップ１の組織分布は、例えば、ｍＲ
ＮＡの発現またはニューロダップ１タンパク質の発現を
解析することにより、確認することができる。ｍＲＮＡ
の発現については、ｃＤＮＡを用いてノーザンブロット
分析により確認し得る。ニューロダップ１タンパク質の
発現については、このタンパク質に対する抗体を作成し
た後、ウエスタンブロット分析により確認することがで
きる。

【００４３】本発明のニューロダップ１の組織内分布
は、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションなど
によりｍＲＮＡを、抗体を使用する免疫組織化学などに
よりタンパク質を分析することによって確認することが
できる。インサイチュハイブリダイゼーションは、例え
ば、公知の文献に記載のように（Nakayamaら、Mol Brai
n Res 21:206-218 (1994)）、放射性同位体またはジゴ
キシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いて、組織の凍結切
片について行い得る。

【００４４】（３）ニューロダップ１の免疫組織化学的
検査免疫組織化学的検査は、パラホルムアルデヒドなどで固
定した脳の切片を切り出し、この切片をニューロダップ
１タンパク質に対する抗体を用いた染色法により染色
し、そしてエポキシ樹脂で扁平に包埋する。樹脂包埋組
織の切片を、光学顕微鏡および電子顕微鏡下でそれぞれ
観察し得る。

【００４５】（４）ニューロダップ１タンパク質の発現本発明のニューロダップ１をコードする遺伝子は、適当
なベクター、例えば、pGEX-3X、pGEX5Xに組み込まれ
て、ニューロダップ１タンパク質を発現させるための発
現ベクターとされる。

【００４６】この発現ベクターを、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体
が作成される。この形質転換体を培養することにより、
本発明のニューロダップ１タンパク質が産生され得る。
また、本発明のニューロダップ１タンパク質は、適当な
タンパク質との融合タンパク質としても産生され得る。

【００４７】発現させた本発明のニューロダップ１タン
パク質またはその融合タンパク質は、ニューロダップ１
タンパク質に対する抗体を産生するための抗原として用
い得る。本発明のニューロダップ１タンパク質の特定部
分のみを抗原として利用して、抗体を作成し得る。例え
ば、ニューロダップ１タンパク質のカルボキシ末端付近
の約３分の１のアミノ酸配列部分を抗原として利用し
て、抗体を調製することが可能である。

【００４８】例えば、pGEX-3XのBglII-HindIII部位に本
発明のニューロダップ１タンパク質のカルボキシ末端付
近の約３分の１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を組
み込んで、該遺伝子を含む発現ベクターを作成し、これ
を大腸菌などに導入することによって形質転換体を作成
し得る。この形質転換体は、グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現され得
る。このようにして得られたニューロダップ１遺伝子産
生培養物は、アフィニティーカラム法などで精製され得
る。

【００４９】（５）ニューロダップ１タンパク質に対す
る抗体の産生上記（４）項のようにして得られるニューロダップ１タ
ンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質を、例えば、ウサ
ギに注射して抗血清を誘起し、その血清から抗体（ポリ
クローナル抗体）をニューロダップ１タンパク質アフィ
ニティーカラムで精製し得る。このようにして得られる
抗体を、例えば、アルカリホスファターゼ結合した抗ウ
サギIgGとともに用いて、免疫ブロッティング分析を行
い得る。

【００５０】または、例えば、上記（４）項のようなニ
ューロダップ１タンパク質の一部分を認識する抗体を産
生させ得るタンパク質を免疫原とし、マウス、ラット、
モルモットなどの動物を免疫し、免疫した動物の脾臓ま
たはリンパ節から細胞を取り出し、ミエローマ細胞など
の細胞と融合させてハイブリドーマを作製した後、該ハ
イブリドーマからモノクローナル抗体を産生させ得る。

【００５１】本発明のニューロダップ１タンパク質に対
する抗体を用いて、本発明のニューロダップ１タンパク
質を免疫学的に測定することができる。例えば、免疫に
用いた免疫原と同一の抗原部位を有する標識（例えば、
放射性同位体または蛍光色素などで標識）した一定量の
タンパク質に、濃度既知の非標識抗原、および血清由来
のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を加え
て、抗原抗体競合反応を行わせる。非標識抗原の濃度を
適当に変化させた後、抗体に結合した標識抗原と抗体に
結合していない標識抗原とを適当な方法で分離して、抗
体と結合した標識抗原の放射能量、酵素活性、または蛍
光強度を測定する。非標識抗原の量が増すにつれ、抗体
と結合する標識抗原の量は減少する。この関係をグラフ
にして標準曲線を得る。

【００５２】次に、上記の反応系に濃度既知の非標識抗
原の代わりに未知量の抗原を含む試料を加え、これを反
応させた後に得られる放射能量、酵素活性、または蛍光
強度を、標準曲線にあてはめれば、試料中の抗原の量を
知ることができる。

【００５３】

【実施例】

［実施例１］ｃＤＮＡライブラリーのサブトラクティブ
／ディファレンシャルスクリーニング顔面神経軸索切断により発現が変動する遺伝子を得るた
めに、ラットの顔面神経を用いて、サブトラクティブ／
ディファレンシャルスクリーニングを以下に記載のよう
に行った。

【００５４】（１）ＲＮＡの調製 40匹の成熟雄Sprague-Dawley系ラット（６〜８週齢）
を、ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、左側顔面
神経を茎乳突孔のレベルで切断した。その24時間後にこ
れらのラットをエーテル麻酔下で断頭により屠殺した。
ラットの脳幹を、両側の顔面神経核が1.5mm厚の薄片に
含まれるようにかみそりの刃で切断し、そして各顔面神
経核を15ゲージのステンレス管で穴をあけて取り出した
（Yu、「Adissection and tissue culture manual of t
he nervous system 」（Shaharら編）30-39頁、New Yor
k:Alan R. Liss Inc. (1989)）。それぞれの取り出した
顔面神経核を有する脳組織から、公知の方法（Chomczyn
skiおよびSacchi、(1987)前出）に従ってＲＮＡを抽出
した。

【００５５】（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築方向性のあるｃＤＮＡライブラリーを、上記のようにし
て得た左側（切断）または右側（非切断）顔面神経核由
来の30〜60μgの総ＲＮＡから、ｃＤＮＡ構築キット（G
IBCO BRL社製）を用いて構築した：第１鎖のｃＤＮＡ合
成用のアダプタープライマーとして、オリゴマーＡ（配
列表の配列番号２）を用い、そしてpBluescript SKベク
ター（Stratagene社製）へのｃＤＮＡ挿入物用のアダプ
ターとして、オリゴマーＢおよびＣ（それぞれ、配列表
の配列番号３および配列番号４）を用いた。これらのオ
リゴマーは、Pharmacia Gene Assembler Plus ＤＮＡ合
成機で合成した。

【００５６】（３）サブトラクティブ／ディファレンシ
ャルハイブリダイゼーションサブトラクティブハイブリダイゼーションを、以下に記
載のように行った。軸索切断により発現が抑制される遺
伝子を得るために、まず、右側（非切断）顔面神経核の
ｃＤＮＡライブラリーを用いて、ヘルパーファージM13K
O7とともに一本鎖（ss）環状ＤＮＡを生成した。左側
（切断）顔面神経核のｃＤＮＡライブラリーから調製し
た二本鎖（ds）プラスミドＤＮＡを、ビオチン化UTP（E
nzo Biochem社製）でビオチン化し、ビオチン化ＲＮＡ
を合成した。次に、非切断側ライブラリー由来の0.4μg
のssＤＮＡを、10μlのハイブリダイゼーション緩衝液
［0.5M リン酸ナトリウム（pH 7.2）、1O mM EDTA、お
よび0.1％ SDS］で、65℃にて16時間、切断側ｃＤＮＡ
ライブラリー由来の40μgのビオチン化ＲＮＡにアニー
ルした。次いで、ビオチン化ＲＮＡおよびこのビオチン
化ＲＮＡにハイブリダイズしたＤＮＡを、ストレプトア
ビジン（GIBCO BRL社製）の添加により取り除き、そし
てこれをフェノール／クロロホルムにより抽出した（Ru
bensteinら、(1990) 前出）。このストレプトアビジン
−フェノール処理後に残った非切断側由来のssＤＮＡ
を、Sequenase（United States Biochemical社製）およ
びオリゴマーＤ（配列表の配列番号５）を用いて、dsＤ
ＮＡに変換した。次いで、得られたdsＤＮＡを、電気形
質転換法により大腸菌DH10B細胞（GIBCO BRL社製）にト
ランスフェクトした。サブトラクトしたライブラリーか
らの各クローン中の挿入ｃＤＮＡを、プライマーとして
上記オリゴマーＢおよびＤを用いるＰＣＲにより増幅し
た。ＰＣＲは、以下の熱サイクル条件を用いて、AmpliT
aq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer-Cetus社製）お
よびＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer-Cetus社
製）で通常に行った：94℃にて30秒変性、55℃にて1分
アニール、72℃にて30秒伸長、72℃にて5分最後の伸
長；30〜50サイクル。各ＰＣＲ産物（約0.2 mg）を、96
ウェルドットブロット装置を用いてナイロンフィルター
上に２つずつスポットした。サブトラクトしたライブラ
リーのディファレンシャルスクリーニングを、切断また
は非切断顔面神経核由来のｍＲＮＡから生成されるラン
ダムプライム³²P-標識ｃＤＮＡプローブを用いるドット
ハイブリダイゼーションにより行い、軸索切断後に顔面
神経核で発現が抑制されるｃＤＮＡを単離した。

【００５７】また、軸索切断後に顔面神経核で発現が誘
導された遺伝子を得るために、同様のプロセスを、一本
鎖（ss）環状ＤＮＡの合成のための左側（切断）顔面神
経核のｃＤＮＡライブラリーおよび二本鎖（ds）プラス
ミドＤＮＡ用の右側（非切断）顔面神経核のｃＤＮＡラ
イブラリーを用いて行い、軸索切断後に顔面神経核で発
現が誘導されるｃＤＮＡを単離した。

【００５８】（４）ＤＮＡ配列の核酸ホモロジー検索上記のようにして、軸索切断後に顔面神経核で発現が誘
導または抑制されるいくつかのｃＤＮＡを単離した。こ
のような軸索切断により影響を受ける遺伝子を有するク
ローンについて、部分的に配列決定し、そしてこの配列
をGenBank/EMBL/DDBJ ＤＮＡ配列データベースに対して
核酸ホモロジー検索を行った。

【００５９】まず、3000クローンを含む発現が誘導され
たｃＤＮＡライブラリーから、軸索切断により発現が誘
導されるいくつかのｃＤＮＡクローンを単離した。核酸
ホモロジー検索により、GAP43、α-チューブリンなどの
軸索切断後に顔面神経核で発現が誘導されているｃＤＮ
Ａクローンを単離した。従って、このスクリーニング方
法により単離された公知のｃＤＮＡが実際に見出され、
この結果は、このスクリーニングシステムが予測通りに
作用することを示した。

【００６０】このスクリーニング方法により、発現が抑
制されるｃＤＮＡライブラリー（約2000クローン）か
ら、軸索切断で発現が抑制されるｃＤＮＡを有する2.2
kbpの１つのクローンを単離した。これについても核酸
ホモロジー検索を行い、新規遺伝子であることが明らか
となった。このｃＤＮＡを、ニューロダップ１と命名し
た。

【００６１】［実施例２］ニューロダップ１タンパク質
の配列分析プローブとして上記実施例１で得たニューロダップ１の
ｃＤＮＡクローン（2.2 kbp）を用いて、ノーザンブロ
ット分析を行い、ラットの全脳ｍＲＮＡにおいて、4.8
kbpの単一バンドを検出した。従って、上記実施例１で
得たニューロダップ１のｃＤＮＡクローンは、ニューロ
ダップ１のｃＤＮＡの一部であると考えられる。従っ
て、ニューロダップ１の全長ｃＤＮＡ（プラスミドpful
l223中に含まれる）を、コロニーハイブリダイゼーショ
ンにより右側（非切断）顔面神経核のｃＤＮＡライブラ
リーから単離した。

【００６２】ジデオキシ法によるＤＮＡ配列決定を、プ
ライマーウォーキングおよびnested欠失法下で、Sequen
aseキット（United States Biochemical）を用い、完全
な4.8 kbpのニューロダップ１のｃＤＮＡを両鎖につい
て行った。得られたニューロダップ１のｃＤＮＡの核酸
配列から、707アミノ酸残基からなるオープンリーディ
ングフレームの存在を予測した（配列表の配列番号
１）。この配列番号１に報告したＤＮＡ配列およびアミ
ノ酸配列のデータは、DDBJに提出され、受託番号D32249
が与えられている。

【００６３】ホモロジーの検索を、GenBank（リリース
番号79）／EMBL（リリース番号35）／DDBJ（リリース番
号15）核酸データベースおよびNBRF/Swiss pROT/PIRタ
ンパク質データベースについて、それぞれ、ホモロジー
比較プログラムのFASTAおよびTFASTA（PearsonおよびLi
pman、Proc Natl Acad Sci USA 85:2444-2448 (1988)）
を用いて行った。このｃＤＮＡ配列は、入手可能なデー
タベース中のヒトEST00844（Hoog、Nucleic Acids Res
19:6123-6127 (1991)）と4.7％の相同性、およびマウス
Tsg163X（Adamsら、Nature 355:632-634 (1992)）と3.7
％の相同性を有するのみであり、顕著な配列の相同性を
示さなかった。明らかな膜貫通ドメインもＮ-末端シグ
ナル配列も同定されなかったので、この推定タンパク質
は細胞質タンパク質であると考えられる。

【００６４】次に、タンパク質モチーフについての検索
を、PROSITEプログラム（Bairoch、Nucleic Acids Res
19:2241-2245（1991））を用いて行った。ニューロダッ
プ１タンパク質のカルボキシ末端付近の領域が、ゴリア
ス（goliath）と呼ばれるショウジョウバエタンパク質
（BouchardおよびCote、Gene 125:205-209 (1993)）お
よびいくつかのＲＩＮＧフィンガータンパク質に見られ
る、ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフ（Freemont、(1
993) 前出）という定義された配列モチーフを有するこ
とが見出された。ニューロダップ１タンパク質中のＲＩ
ＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフは、配列表の配列番号１
の６３３位のCysから６７３位のCysまでのアミノ酸配列
である。このＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフは、Cy
s₁-X-X(疎水性)-Cys₂-X(12-35)-Cys₃-X-His₁-X-X(疎水
性)-His₂-X(疎水性)-X-Cys₄-X(8-39)-Cys₅-X-X-Cys₆で
あり、ここで、Xは任意のアミノ酸残基である。ニュー
ロダップ１のカルボキシ末端領域の一部を、図１に示す
ように、ゴリアス、43K（Scotlandら、(1993) 前出）、
PET3/Vps18（Prestonら、(1991) 前出；Robinsonら、(1
991) 前出）、PET5/Vps11/End1（DulicおよびRiezman、
(1989) 前出）、CELG（Freemont、(1993) 前出）、およ
びFAR1（ChangおよびHerskowitz、Cell 63:999-1011 (1
990)）中のＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフと比較し
た。図１において、ファミリーのメンバー間で完全に保
存される金属結合リガンドを、アステリスク（*）で示
し、保存された疎水性残基の位置をシンボル（#）で示
す。各保存されたCysおよびHisの下の数字（1〜6および
1〜2）は、それぞれ金属結合リガンド部位C1〜C6および
H1〜H2を示す。また、括弧内の数字は、挿入されている
アミノ酸の数を示す。この比較により、ニューロダップ
１タンパク質のカルボキシ末端部分が、ＲＩＮＧ−Ｈ２
フィンガーモチーフとして定義されるのと同様の構造を
有することが明らかになった。また、アミノ酸配列に基
づく推定分子量は、８０ｋＤａであった。

【００６５】［実施例３］ラット脳におけるニューロダ
ップ１の発現（１）ノーザンブロット分析ニューロダップ１の組織別発現分布を調べるために、組
織のＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った。

【００６６】ラット組織由来ｍＲＮＡをブロッティング
した市販のナイロン膜（Clontech Laboratories）につ
いて、ニューロダップ１のｃＤＮＡを、[α³²P]dCTP（A
mersham社製）によりPrime-It II（Stratagene社製）を
用いて標識したものをプローブとして用いて、ハイブリ
ダイゼーション緩衝液（0.5 M リン酸ナトリウム（pH7.
2)、１mM EDTA、１％BSA、７％SDS）中で、65℃、16時
間、ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は、0.
1×SSC、65℃で行った。シグナルの検出には、Ｘ線フィ
ルム（Eastman Kodak社製；XAR5）を用い、増感紙の存
在下で-70℃16時間感光した後現像した。

【００６７】検討した組織（脳、心臓、骨格筋、脾臓、
肺、肝臓、腎臓、および精巣）の中で、脳が最もニュー
ロダップ１のｍＲＮＡを豊富に含むことが示された。し
かし、心臓および骨格筋もまた少量であるが検出し得る
量のｍＲＮＡを含んでいた。従って、次に、脳内におけ
るニューロダップ１のｍＲＮＡの詳細な分布について検
討した。

【００６８】（２）インサイチュハイブリダイゼーショ
ン軸索切断の３、７、および14日後にラットを屠殺し、そ
の脳幹から顔面神経核を含む切片を切り出した。両側の
顔面神経核を含む凍結した切片を、低温槽上で５μmに
切断し、そしてそれらをＰＢＳ中の４％パラホルムアル
デヒドで固定した。これらの切片について、インサイチ
ュハイブリダイゼーションを、公知の文献に記載のよう
に（Nakayamaら、(1994) 前出）、放射性同位体または
ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いて行った。

【００６９】放射性同位体標識ＲＮＡプローブを用いる
場合、このプローブを、[α-³⁵S]UTP（800 Ci/mmol、Am
ersham社製）とともに、T3またはT7 ＲＮＡポリメラー
ゼを用いて調製した。ハイブリダイゼーションを、5×1
0⁷cpm/mlのＲＮＡプローブの条件下で55℃にて16時間行
った。O.1×SSCで30分間60℃にて洗浄した後、切片を、
リボヌクレアーゼＡ（Sigma社製）（30分、37℃）で処
理した。次いで、切片を、原子核乳剤（Kodak NTB2、Ea
stman Kodak社製）でコートし、そして暗箱中４℃で７
日間曝露した。現像後、切片をヘマトキシリン-エオシ
ンで染色し、次いで、暗または明視野光学顕微鏡（Zeis
s Axiophoto、Karl Zeiss社製）下で観察した。この結
果を、図２の明視野顕微鏡写真、および図３の暗視野顕
微鏡写真に示す。図２は軸索切断７日後の非切断側およ
び切断側の顔面神経核についての結果であり、図中のＡ
は非切断側、Ｂは切断側であり、スケールバーは、50μ
mを示す。図３は、顔面神経軸索切断後３日（Ａ）、７
日（Ｂ）、および14日（Ｃ）のニューロダップ１ｍＲＮ
Ａの発現の暗視野顕微鏡写真であり、図中の矢印は、左
側顔面神経核（軸索切断側）を示し、スケールバーは10
00μmを示す。

【００７０】ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを用い
る場合、このプローブを、DIG ＲＮＡ標識キット（Boeh
ringer Mannheim社製）を用いて調製した。ハイブリダ
イゼーションの後、ジゴキシゲニン標識ニューロダップ
１ｍＲＮＡを、ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体のアルカリ
ホスファターゼ結合Fabフラグメント（Boehringer Mann
heim社製）［100 mM Tris-HCl（pH 7.5）＋150 mM NaCl
により1：500希釈］およびBCIP/NBTホスファターゼ基質
システム（GIBCO BRL社製）を用いて、Springerら（J H
istochem Cytochem 39:231-234 (1991)）の手順に従っ
て検出した。ニューロダップ１遺伝子のジゴキシゲニン
標識アンチセンスＲＮＡプローブを用いて、小脳
（Ａ）、海馬（Ｂ）、および大脳皮質（Ｃ）の切片につ
いて行い、これを、ヘマトキシリン-エオシンで染色し
たインサイチュハイブリダイゼーションの結果を、図４
に示す。図中のスケールバーは100μmを示す。

【００７１】インサイチュハイブリダイゼーションの結
果、ニューロダップ１のｍＲＮＡの強いハイブリダイゼ
ーションシグナルが、非切断（右）側の顔面神経核の大
型の神経細胞で観察され、一方このシグナルは切断
（左）側で著しく減少しており、そして軸索切断の７日
後には非切断（右）側の約半分のレベルであった（図
２、３Ｂ）。この低レベルの発現は、軸索切断の14日後
もなお続いていた（図３Ｃ）。切断した顔面神経核以外
の神経細胞におけるｍＲＮＡのハイブリダイゼーション
シグナルのレベルは、顔面神経軸索切断により影響を受
けなかった。

【００７２】また、ニューロダップ１のｍＲＮＡのシグ
ナルが、大脳皮質の神経細胞、海馬の錘体神経細胞、小
脳のプルキンエ細胞、および脳幹における神経細胞など
の核周囲部の細胞質で観察された（図２、３、４Ａ〜４
Ｃ）。標識センスプローブが同様のハイブリダイゼーシ
ョン／洗浄条件下でシグナルを示さないので、これらの
シグナルは特異的であると考えられる（データは示して
いない）。また、より弱いシグナルを、海馬歯状回の顆
粒細胞で検出したが、ニューロダップ１のｍＲＮＡにつ
いてのシグナルは、ラット脳のいかなる領域のグリア細
胞においても検出しなかった。

【００７３】（３）免疫組織化学的検査ラットを、ペントバルビタール麻酔下、ＰＢＳ（pH 7.
4）に溶かした４％パラホルムアルデヒドを心臓から全
身に潅流し、そして脳を取り出し、これを同じ固定液に
さらに４時間浸した。固定した脳の４μm厚の切片を、
公知の文献（MiyakeおよびKitamura、Brain Res 586:53
-60 (1992)）のようなABC法（Hsuら、J Histochem Cyto
chem 29:577-580 (1981)）により、以下の実施例５に記
載のようにして得た精製抗体（1:3500希釈）で染色し
た。電子顕微鏡の免疫組織化学的検査用に、固定した脳
の60μm厚の切片を、Microslicer（Dosaka EM社製）で
切り出し、そしてこの切片を、抗体（1:3500希釈）で染
色し、既述のように（MiyakeおよびKitamura、(1992)
前出）、エポキシ樹脂で扁平に包埋した。樹脂包埋組織
の１μm厚の切片を、光学顕微鏡（Nikon Optiphoto、Ni
kon社製）および電子顕微鏡（JEOL 1OO CX Il、JEOL社
製）下でそれぞれ観察した。

【００７４】免疫組織化学的検査の結果を、図４のＤ、
Ｅ、およびＦ、ならびに図５に示す。図４は、精製抗ニ
ューロダップ１タンパク質抗体を用いて、小脳（Ｄ）、
海馬（Ｅ）、および大脳皮質（Ｆ）の切片について免疫
組織化学的検査を行った結果であり、ニューロダップ１
に対する精製抗体を用いる免疫組織化学的検査により、
ニューロダップ１陽性細胞の分布がインサイチュハイブ
リダイゼーションにより示されたｍＲＮＡの分布と本質
的に同じであることが示された。図５のＡは非切断側、
Ｂは切断側の顔面神経核の１μm厚切片の免疫組織化学
的検査の結果であり、この図より、ニューロダップ１が
細胞質中に分布することが示された。図５Ｂに示すよう
に、ニューロダップ１に対する免疫反応性は、軸索切断
後著しく低減した。

【００７５】［実施例４］ニューロダップ１タンパク質
の大腸菌内での発現インビトロ転写-翻訳連結アッセイを、テンプレートと
してニューロダップ１の全長ｃＤＮＡを挿入したプラス
ミド２μgを、TNT T7-網赤血球ライセート（Promega社
製）に加えて１〜２時間インキュベートして行った。翻
訳産物を、4〜20％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動した結果を、図６のＢに示す。各レーンは、左か
ら順にそれぞれ、テンプレートとして、pBluescript SK
(-)（ベクター）、pfull223（全長）、EcoRIで消化した
pfull223（EcoRI）、およびHindIIIで消化したpfull223
（HindIII）を用いて行った結果である。図中の白三角
はニューロダップ１タンパク質の位置を示し、黒三角は
短縮型ニューロダップ１タンパク質の位置を示す。全長
のレーンに示すように、複数のバンドが現れるが、この
うち最大のポリペプチドを、このｃＤＮＡの産物である
と仮定し、小さいポリペプチド（約46〜60kDa）を疑似
産物と仮定した。従って、このインビトロシステムで生
成したニューロダップ１の分子量を、SDS-ポリアクリル
アミド電気泳動により約140kDaであると推定した。翻訳
後修飾はこのインビトロシステムでは生じないが、この
値は一次構造から推定した予測分子量（約80kDa）より
も大きかった。このような予測分子量と実測分子量との
間の不一致は、SDS-ポリアクリルアミドゲル上のタンパ
ク質移動速度の変動により説明され得る（OharaおよびT
eraoka、FEBS letters 211:78-82 (1987)）。なぜな
ら、図６のＡの図に示すように、オープンリーディング
フレーム（白抜きのバー）の同定の誤りの可能性につい
ては、EcoRIおよびHindIII部位がそれぞれ同定された停
止コドンの前後に位置することに基づく以下の結果によ
り排除されるからである。図６のＢのEcoRIのレーンに
示すように、EcoRI消化により3'-非コーディング領域を
除去した場合は、インビトロ産物の見かけの分子量は変
わらなかったが、HindIIIのレーンに示すように、HindI
II消化により停止コドンを消失させた場合は、短縮型産
物のみが生成した。

【００７６】次に、ニューロダップ１のカルボキシ末端
部分の約３分の１のアミノ酸配列（配列表の配列番号１
の４５６位〜７０７位のアミノ酸配列）をコードする1.
2 kbpのｃＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてp
full223を用いて、プライマーとしてオリゴマーＥおよ
びＦ（それぞれ、配列番号６および７）を用いたＰＣＲ
により増幅した。このＰＣＲ産物を、BglII（TAKARA Sh
uzo社製）およびEcoRI（TAKARA Shuzo社製）の両方で切
断し、そしてpGEX-3Xベクター（Pharmacia社製）のBamH
I-EcoRI部位に連結した。これを大腸菌SURE株にエレク
トロポレーションし、陽性クローンを分離し、LB培地で
培養し、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシ
ド（Sigma社製）を添加した培地でタンパク質の発現誘
導を行い、そして大腸菌を採集した。これを１％Triton
X100を含むＰＢＳ中で音波処理した後、遠心分離し、
得られた上清を、グルタチオン-セファロース4Bビーズ
に吸着させた。このビーズをＰＢＳで洗浄した後、グル
タチオンを含む溶出緩衝液で溶出してアフィニティー精
製し、GST-ニューロダップ１融合タンパク質を得た。得
られた融合タンパク質を、SDS-ポリアクリルアミドゲル
電気泳動し、クーマシーブリリアントブルーで染色し
た。この結果を、図６のＣのレーン２に示す。レーン１
は分子量マーカーであり、その左側に分子量を示す。精
製したGST-ニューロダップ１融合タンパク質は、単一バ
ンドとして現れた。

【００７７】［実施例５］抗ニューロダップ１タンパク
質抗体の産生上記実施例４で得た精製GST-ニューロダップ１融合タン
パク質100μgを、Freundの完全アジュバント（DIFCO社
製）とコンジュゲートした後、これをニュージーランド
ホワイトウサギに注射して抗血清を誘起した。数回のブ
ーストの後、全血を採取し、GST-ニューロダップ１融合
タンパク質アフィニティーカラムで精製した。このよう
にして得たGST-ニューロダップ１融合タンパク質に対す
る抗体は、既述（Towbinら、Proc Natl Acad Sci USA 7
6:4350-4354 (1979)）のように、アルカリホスファター
ゼ（Promega社製）と結合した抗ウサギIgGを用いて、免
疫ブロット分析を行った。図６のＤのレーン１に示すよ
うに、細菌の組換えGST-ニューロダップ１タンパク質と
特異的に反応した。次に、ラットの脳細胞抽出物をガラ
スホモジナイザーを用いて調製し、同様に分析した（図
６のＤのレーン２）。

【００７８】ニューロダップ１タンパク質に対する抗体
の特異性を、以下の観察結果により確認した。第１に、
この抗体により免疫染色した脳細胞の分布は、以下に記
載のように、インサイチュハイブリダイゼーションで観
察されたｍＲＮＡ陽性細胞の分布と同一であった。ニュ
ーロダップ１のｍＲＮＡに対するシグナルおよびニュー
ロダップ１タンパク質が、神経細胞で観察されたが、グ
リア細胞では見られなかった。第２に、この抗体は、主
として免疫ブロットにおいて脳抽出物の単一タンパク質
バンドを染色し（図６Ｄ）、そしてこのバンドは、イン
ビトロで合成したニューロダップ１と共に移動した（図
６Ｂ）。第３に、この抗体は、細菌で発現させたGST-ニ
ューロダップ１融合タンパク質だけでなく、ラット脳抽
出物から得られたニューロダップ１自体をも免疫沈降さ
せた（データは示していない）。

【００７９】［実施例６］ニューロダップ１タンパク質
の細胞内局在ニューロダップ１タンパク質の細胞内局在を検討するた
めに、上記実施例３の（３）項に記載と同様の方法で、
大脳皮質および顔面神経核について免疫組織化学的検査
を行った。結果を図７に示す。図中のＡは大脳皮質、Ｂ
およびＣは非切断側の顔面神経核、そしてＤは切断側の
顔面神経核（軸索切断９日後）の結果である。Ａ中の矢
印で示した軸索細胞体間シナプスの部分を拡大したもの
を、Ａの右肩に示し、図中のスケールバーは１μmを示
す。図７のＡから明らかなように、ニューロダップ１タ
ンパク質が小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置の周りで濃
縮されることが見出された。免疫反応産物は、核膜の周
りでは観察されなかったが、ＥＲ、ゴルジ装置、いくつ
かの小胞、および細胞膜の細胞質側表面上で検出した。
特に、ニューロダップ１タンパク質の免疫反応性が軸索
細胞体間シナプスのシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）領域に
観察された。顔面神経核の神経細胞では、軸索細胞体間
シナプスのＰＳＤの約７％がニューロダップ１で染色さ
れるが、大脳皮質の神経細胞の軸索細胞体間シナプスの
ＰＳＤの約60％は、ニューロダップ１タンパク質と関連
していた。この結果は、ニューロダップ１のＰＳＤへの
関連がＰＳＤのタイプに非常に依存することを示す。

【００８０】軸索切断後のニューロダップ１タンパク質
の細胞内分布の顕著な変化は、電子顕微鏡による免疫組
織化学的検査では見られなかった。ニューロダップ１の
免疫反応性は、一般に軸索切断後低下するが、この免疫
反応性はゴルジ装置の周りでわずかに増大するようであ
った（図７Ｄ）。

【００８１】［実施例７］ヒトニューロダップ１ｃＤＮ
Ａのクローニングヒトの中枢神経系で発現されているニューロダップ１タ
ンパク質の相同体を得るために、ヒト脳ｃＤＮＡライブ
ラリーを用いて以下のようにスクリーニングを行った。

【００８２】まず、ヒト脳ＲＮＡ（whole brain poly A
+RNA；Clontech社製）からSUPERSCRIPT Plasmid System
（GIBCO BRL社製）を用いてヒト脳ｃＤＮＡプラスミド
ライブラリーを作成した。このｃＤＮＡプラスミドライ
ブラリーを、Gene Pulser（BIO-RAD）を用いて大腸菌
（Electro MAX DH10B細胞、GIBCO BRL社製）内へ導入し
た。ＬＢプレート１枚当たり約２万クローンまで増殖
し、これを15枚作製して約30万クローンを得た。このＬ
Ｂプレート上のコロニーをBIODYNE A TRANSFER MEMBRAN
E（Pall Biosupport Division社製）に移し取り、変性
液（0.5N NaOH、1.5MNaCl）で２分間、次いで中和液
（0.5M Tris-HCl、pH7.2、1.5M NaCl）で５分間処理し
た後、UV Stratalinker（STRATAGENE社製）でＤＮＡを
固定した。次いで、ハイブリダイゼーションを、プロー
ブとして、Prime-It II（STRATAGENE社製）で³²Ｐ標識
した上記実施例２で得られたラットニューロダップ１の
ｃＤＮＡの5'末端側の1.7kbp断片を用いて、ハイブリダ
イゼーション溶液（0.5M NaHPO₄ pH7.2、１％BSA、１mM
EDTA、７％SDS）中で、60℃にて16時間反応させた。次
いで、0.1×SSC（１×SSC＝150mM NaCl、15mM クエン酸
ナトリウム）、0.1％SDS溶液で、室温にて10分間の洗浄
を３回、さらに59℃にて30分間の洗浄を１回行った後、
オートラジオグラフを行った。その結果、約4.8kbpの完
全長のヒトニューロダップ１ｃＤＮＡを挿入断片として
有するクローンを得た。

【００８３】［実施例８］ヒトニューロダップ１の配列
分析上記実施例７で得たヒトニューロダップ１のｃＤＮＡに
ついて、ジデオキシ法によるＤＮＡ配列決定を、プライ
マーウォーキング法下でSequencing PRO（TOYOBO社製）
を使用して行った。得られたヒトニューロダップ１のｃ
ＤＮＡの核酸配列は、そのコード領域が4778bpの長さで
あり、708アミノ酸残基をコードしていた（配列表の配
列番号８）。また、配列表の配列番号８の６３４位のCy
sから６７４位のCysまでのアミノ酸配列が、ＲＩＮＧ−
Ｈ２フィンガーモチーフに一致していた。さらに、この
ヒトニューロダップ１のアミノ酸配列と上記実施例２で
得たラットニューロダップ１のアミノ酸配列とは、81％
の相同性を示した。

【００８４】

【発明の効果】本発明によれば、シナプス後膜肥厚領域
に局在し得る、詳細には神経損傷に伴って発現が抑制さ
れる、上記従来技術とは別のタンパク質、特にＲＩＮＧ
−Ｈ２フィンガーモチーフを含むタンパク質が提供され
る。さらに本発明によれば、上記タンパク質の構造遺伝
子；該遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを
導入した形質転換体；該形質転換体を用いるシナプス後
膜肥厚領域に局在し得るタンパク質の製造方法；該タン
パク質を認識する抗体；および該抗体を産生し得るハイ
ブリドーマが提供される。

【００８５】ニューロダップ１タンパク質は、ＲＩＮＧ
−Ｈ２フィンガーモチーフを有し、神経細胞の小胞体お
よびゴルジ装置の膜の細胞質側表面に局在している。従
って、ニューロダップ１タンパク質は、細胞内タンパク
質輸送機構に関連し、神経細胞活性維持に重要な働きを
すると考えられ、この機構解明に応用し得る。

【００８６】さらに、ニューロダップ１タンパク質は、
一部の小型神経細胞を除いてほとんど全ての神経細胞の
軸索細胞体間シナプスのＰＳＤ領域に存在し、そしてそ
の遺伝子発現は、例えば、軸索体細胞間シナプスの数が
減少するような、顔面神経の軸索切断などの条件で抑制
されている。このことは、ニューロダップ１タンパク質
が、主として、細胞体および軸索細胞体間シナプスが十
分に発達している神経細胞で発現していることを示唆し
ている。これは、ニューロダップ１が、細胞内タンパク
質輸送機構で一般的な役割を果たすというよりも、ＰＳ
Ｄ領域でのシナプス情報伝達またはシナプス結合に関係
した役割を果たすことを示唆していると思われる。ＰＳ
Ｄは、神経細胞のシナプス伝達および可塑性に関連する
観点から非常に注目されている（Siekevitzら、Proc Na
tl Acad Sci USA 82:3494-3498 (1985)；WalshおよびKu
ruc、J Neurochem 59:667-678 (1992)）。従って、ニュ
ーロダップ１タンパク質またはその遺伝子を用いて、シ
ナプスに関連する記憶、学習、および発達段階、ならび
に虚血、てんかん、およびアルツハイマー病などの神経
変性状態において、その発現の変動を検討することは、
これらの機構を研究する上で有用であり得る。

【００８７】

【配列表】

【００８８】

【配列番号１】配列の長さ：４７５８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：ラット配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：141..2264 特徴を決定した方法：E 配列 TGGCGGGTGG AGGATCGAGC GCTGTTCTCG CTCTGGAGCC GCTGCACATC TCGGAATCAT 60 TTGCAGCTTA TTCACTGTGT AAGGAAAAAC CAAATTACAT CCATAATTCT ATTGAACTGG 120 AAGCATAGAC GCTGCCATAT ATG TCA CAG TAT ACA GAA AAA GAA CCA TCA GTA 173 Met Ser Gln Tyr Thr Glu Lys Glu Pro Ser Val 1 5 10 ATG GAT CAA GAC TCC AGC AAG GCT GCG TGG CCT AGA GCA GCA GGA GGA 221 Met Asp Gln Asp Ser Ser Lys Ala Ala Trp Pro Arg Ala Ala Gly Gly 15 20 25 TAC CAG ACG ATT ACA GGC AGG AGG TAC GGA AGG AGA CAT GCG TAT GTC 269 Tyr Gln Thr Ile Thr Gly Arg Arg Tyr Gly Arg Arg His Ala Tyr Val 30 35 40 AGT TTT AAG CCA TGT ATG ACC AGG CAT GAA CGG AGC TTG GGT CGG GCT 317 Ser Phe Lys Pro Cys Met Thr Arg His Glu Arg Ser Leu Gly Arg Ala 45 50 55 GGC GAT GAC TAT GAA GTT CTG GAA CTG GAT GAC GTT GCC AAG GAA AAC 365 Gly Asp Asp Tyr Glu Val Leu Glu Leu Asp Asp Val Ala Lys Glu Asn 60 65 70 75 ACC GCA GGT TCC AGT TCA TTG GAT CAA GTC CAT CCT TCT TTA CCC AGT 413 Thr Ala Gly Ser Ser Ser Leu Asp Gln Val His Pro Ser Leu Pro Ser 80 85 90 GAA ACT ACA GTT GAA AAA AGT GAA ACA GAA ATT CCT ACT TGT GGT CCA 461 Glu Thr Thr Val Glu Lys Ser Glu Thr Glu Ile Pro Thr Cys Gly Pro 95 100 105 GCA CTG AAT CAA AGC ACG GAG AGC AAC CCA TCC GTT GCC ACA GTG TGT 509 Ala Leu Asn Gln Ser Thr Glu Ser Asn Pro Ser Val Ala Thr Val Cys 110 115 120 CAT AGT GAG GAA GTC AGG GAG ACC TTA GAC AGC AGT ACG AAT CTT CAG 557 His Ser Glu Glu Val Arg Glu Thr Leu Asp Ser Ser Thr Asn Leu Gln 125 130 135 AAT CAC GCT GAG AGA GAG TGT ACG CCA GCA GTT TGT AAT GCC TCA AGT 605 Asn His Ala Glu Arg Glu Cys Thr Pro Ala Val Cys Asn Ala Ser Ser 140 145 150 155 GTC CAG AAT GGA ATT GTG TTG GTT CAT ACT GAC TCT TAT GAT CCA GAC 653 Val Gln Asn Gly Ile Val Leu Val His Thr Asp Ser Tyr Asp Pro Asp 160 165 170 AGC AAG CAT GAT GAG AAT GAC TCT CTT CAA CTT TGT GCC CAA GCT GTG 701 Ser Lys His Asp Glu Asn Asp Ser Leu Gln Leu Cys Ala Gln Ala Val 175 180 185 GAA GGT GGT AGA CGT CAG AAG GTA TTA GGC AAT GCA GTC TTT GAG CTG 749 Glu Gly Gly Arg Arg Gln Lys Val Leu Gly Asn Ala Val Phe Glu Leu 190 195 200 GAA AAT GGA GAG GTA GAG AGA TAT GCT GAT CTG TGT CCC TCA GTT CCC 797 Glu Asn Gly Glu Val Glu Arg Tyr Ala Asp Leu Cys Pro Ser Val Pro 205 210 215 TCT CTC AGT GGT GAA ATA AGG GAG GAG TCT GAA GAG CTA GGT TCA GCA 845 Ser Leu Ser Gly Glu Ile Arg Glu Glu Ser Glu Glu Leu Gly Ser Ala 220 225 230 235 CTC TTA GAG AAA AAT TCT GCT GGC GAT GCG GAG GCT GTC CAT CAG GAT 893 Leu Leu Glu Lys Asn Ser Ala Gly Asp Ala Glu Ala Val His Gln Asp 240 245 250 GGG CAG GAA TTT CAG AGG TCT TCT GAA GAC GGC ATT GTT AGA AAG AGG 941 Gly Gln Glu Phe Gln Arg Ser Ser Glu Asp Gly Ile Val Arg Lys Arg 255 260 265 CGA CAA GAT GAT ACC GAT CAG GGA AGA CAG ACA GAA AAT TCA ACT GAA 989 Arg Gln Asp Asp Thr Asp Gln Gly Arg Gln Thr Glu Asn Ser Thr Glu 270 275 280 GAT GCA GAC TGT GTT CCA GGC CAT GTT GAA CAA AAT ACT AGT GAG AGA 1037 Asp Ala Asp Cys Val Pro Gly His Val Glu Gln Asn Thr Ser Glu Arg 285 290 295 GCC AAT CAC CAT GGA AGT TCT CCT GAA CAG GTA GTG AGG CCC AAA GTT 1085 Ala Asn His His Gly Ser Ser Pro Glu Gln Val Val Arg Pro Lys Val 300 305 310 315 AGA AAA GTG ATC AGT TCA AGC CAG GTG GAC CAA GAG AGC GGT TTT AAT 1133 Arg Lys Val Ile Ser Ser Ser Gln Val Asp Gln Glu Ser Gly Phe Asn 320 325 330 AGG CAC GAG GCT AAG CAA AGA AGT GTT CAG AGG TGG AGA GAG GCT CTG 1181 Arg His Glu Ala Lys Gln Arg Ser Val Gln Arg Trp Arg Glu Ala Leu 335 340 345 GAA GTT GAG GAA TGC AGT TCA GAT GAC CCT ATA ATC AAG TGT GAC GAT 1229 Glu Val Glu Glu Cys Ser Ser Asp Asp Pro Ile Ile Lys Cys Asp Asp 350 355 360 TAT GAT GGA GAC CAT GAC TGC ATG TTC CTA ACC CCA TCC TAC TCA AGA 1277 Tyr Asp Gly Asp His Asp Cys Met Phe Leu Thr Pro Ser Tyr Ser Arg 365 370 375 GTT ACG CCA AGG GAA GCA GAA CGT CAC CGT GCG ACA GCA GAA AAT GGA 1325 Val Thr Pro Arg Glu Ala Glu Arg His Arg Ala Thr Ala Glu Asn Gly 380 385 390 395 GCC ACA GCT TCA GGA AGG CAA GAG GCT CGG GAA AAT GCC TTT TGG AAT 1373 Ala Thr Ala Ser Gly Arg Gln Glu Ala Arg Glu Asn Ala Phe Trp Asn 400 405 410 GCC TGT GGA GAG TAT TAC CAG CTC TTT GAC AAA GAC GAA GAC AGT TCA 1421 Ala Cys Gly Glu Tyr Tyr Gln Leu Phe Asp Lys Asp Glu Asp Ser Ser 415 420 425 GAG TGC AGT GAT GGG GAA TGG TCT GCT TCT CTG CCT CAC CGA TTT TCT 1469 Glu Cys Ser Asp Gly Glu Trp Ser Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ser 430 435 440 GGC ACA GAA AAA GAC CAG TCC TCA AGC GAT GAA AGC TGG GAA ACT CTG 1517 Gly Thr Glu Lys Asp Gln Ser Ser Ser Asp Glu Ser Trp Glu Thr Leu 445 450 455 CCA GGA AAA GAT GAG AAT GAA CCT GAG CTA CAG AGT GAT AGT AGT GGC 1565 Pro Gly Lys Asp Glu Asn Glu Pro Glu Leu Gln Ser Asp Ser Ser Gly 460 465 470 475 CCT GAG GAA GAA AAC CAA GAA TTG TCT CTT CAG GAG GGA GAA CAG ACG 1613 Pro Glu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Ser Leu Gln Glu Gly Glu Gln Thr 480 485 490 TCC TTG GAG GAG GGG GAG ATT CCC TGG TTA CAG TAC AAT GAG GTC AAT 1661 Ser Leu Glu Glu Gly Glu Ile Pro Trp Leu Gln Tyr Asn Glu Val Asn 495 500 505 GAG AGC AGC AGC GAT GAA GGG AAC GAG CCT GCC AAT GAG TTT GCA CAA 1709 Glu Ser Ser Ser Asp Glu Gly Asn Glu Pro Ala Asn Glu Phe Ala Gln 510 515 520 CCA GAA GCT TTC ATG TTG GAT GGG AAC AAC AAC CTG GAG GAC GAC TCG 1757 Pro Glu Ala Phe Met Leu Asp Gly Asn Asn Asn Leu Glu Asp Asp Ser 525 530 535 AGC GTG AGT GAA GAC CTG GAT GTG GAC TGG AGC CTA TTT GAT GGT TTT 1805 Ser Val Ser Glu Asp Leu Asp Val Asp Trp Ser Leu Phe Asp Gly Phe 540 545 550 555 GCG GAT GGA CTT GGT GTT GCT GAA GCT ATT TCC TAC GTG GAT CCT CAG 1853 Ala Asp Gly Leu Gly Val Ala Glu Ala Ile Ser Tyr Val Asp Pro Gln 560 565 570 TTC CTC ACC TAC ATG GCA CTA GAA GAA CGC TTA GCC CAG GCT ATG GAG 1901 Phe Leu Thr Tyr Met Ala Leu Glu Glu Arg Leu Ala Gln Ala Met Glu 575 580 585 ACT GCA CTG GCA CAC TTA GAG TCT CTT GCT GTA GAC GTT GAG GTG GCT 1949 Thr Ala Leu Ala His Leu Glu Ser Leu Ala Val Asp Val Glu Val Ala 590 595 600 AAC CCA CCT GCC AGT AAG GAA AGC ATC GAC GGA CTT CCA GAA ACC CTT 1997 Asn Pro Pro Ala Ser Lys Glu Ser Ile Asp Gly Leu Pro Glu Thr Leu 605 610 615 GTC CTA GAA GAT CAC ACC GCT ATT GGT CAG GAG CAG TGC TGT CCC ATC 2045 Val Leu Glu Asp His Thr Ala Ile Gly Gln Glu Gln Cys Cys Pro Ile 620 625 630 635 TGC TGC AGT GAG TAC ATT AAG GAT GAC ATC GCA ACA GAG CTG CCC TGC 2093 Cys Cys Ser Glu Tyr Ile Lys Asp Asp Ile Ala Thr Glu Leu Pro Cys 640 645 650 CAT CAC TTC TTT CAT AAG CCT TGT GTC TCC ATT TGG CTA CAG AAG TCC 2141 His His Phe Phe His Lys Pro Cys Val Ser Ile Trp Leu Gln Lys Ser 655 660 665 GGA ACG TGC CCT GTG TGC CGC CGC CAC TTC CCA CCT GCA GTG ATT GAC 2189 Gly Thr Cys Pro Val Cys Arg Arg His Phe Pro Pro Ala Val Ile Asp 670 675 680 GCA TCT GCA GCT GCT TCC TCT GAA CCA GAC CTT GAT GCC TCG CCT GCA 2237 Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ser Glu Pro Asp Leu Asp Ala Ser Pro Ala 685 690 695 AAC GAC AAT GCT GAG GAA GCC CCG TAA GCCGTCACGG GGAAATGAGA 2284 Asn Asp Asn Ala Glu Glu Ala Pro 700 705 TCGAAATTCT ATCACAGTAA ATCTGCAAAT TCCTTCTAAA TCTGATGTGC AAATAATTAT 2344 ATATAAATAT ATTTAAAATG CTCTATATAG TATATGCCGT AGTTTAGAAA GAGAATATTA 2404 ACCTTTCTAA ACTGAATTTA GGTTTGCAGA AGATACTAAA CATTTTCAAG CTGAATGTTG 2464 AAGCAGTGCA TCCATTTTCT TTAGTTGAAC ATGGTGTCCA TTGTAACGTC AGTAGTCATC 2524 TCTGTGGCAT ACGTTTCTGT TTTGTCTGAA GTGCTGCCAC TAAGAGATCA GAATTAAGCT 2584 CTCCTTTCCA CATCAGATGT GAAAGGAGAG CTTAATTCTG ATCTCTGTGG CATACGTTTC 2644 TGTTTTGTCT GAAGTGCTGC CACTAAGAGA TCAGAATTAA GCTCTCCTTT CCACATCAGA 2704 TGTGAAAACT GTGATCACAA CAGTAGTACA GTTTGGTTTC ATTGAAAATA AACTGAATTC 2764 TAAAGCATGC TTTTTCACTG GTCCCTTTGC TTTTGCTACT TCGAGACCTC TTGGTTTATA 2824 TAACACTGAG GTTAAGATTA AAGCTTTTCA GAATGCCAGG CAAAGACTAG AGTTTTGACC 2884 CGAACACACA CACAAAATAA AAAAATAAAA AATAAATTAC ATCTTAGATG TAAACTTCCT 2944 GAAACTGTCA TGTAATAAAC TATTCAGTGA ACGTTGGATG TTTAAAGGCT AGTAAAGCAT 3004 GTGAATTATC TGATGTGCTT CATGCTCGGC ACAGTCTCAT GAGCTTGGCC TATGAAACAC 3064 TGTCTAAGCC CTCATGCAGT CTGCTTCTAC TTGTTAAACA CTGAAGGTCC AGACCAGTCT 3124 TGGCATCTGA TTAAGAAATT GGATGTAGTT AGCTAAGGTA GTTTGGGTTC TACTTTAGGA 3184 GATCTGAAGA TTTGCACATG GCCATGTCTG TTACAGCATC ACCCCAGATT AGAAAGGCAC 3244 AGCTTTTAGG TGGTCACACG AGTAGGCAAG TCTGTGCAGA CGCTGGTGTG ATAGGTAGCT 3304 TACAGGTGAG CCCTGACATC AGCACAGGGA CAACGGCTCA GCAGGCCCAG CACTGGAGCC 3364 CATCCGCGTG CACATCTACC TGCCCTGCTC ATCCAGTTCG GGAATATTTC TATAGCTTCC 3424 CAAATCAGCT TCATCTGATT TGTGTAATAT ATCTGAGTAT TTATAGTCTT TCTTTTTTCT 3484 CCAGTCTTAA AAATAAATGA ATTTTCACTG TTGGCACATT TGAGGCTTAA ATATAAGAAA 3544 CCTAACACTT GCATTCTGAT TTTTGCATAT ATTGTAAATG TGGCTGGTAT TTACAGCGAA 3604 TCCTGTGTGT CCTTTTATGG GTAAAACAAA AGTGAACATT GCATGCAAGT AATGTGGTGA 3664 ATTTGTAATT TAGGGGTTTT CTGGGGCTTC TGTGACTGTG GATGCTTAAA TTCAGGCCTT 3724 AATGTTGCTC TAGCTAGCAT GTTTCCTTCT AATGTACATA GTCAGCCTGT ATCCACTAAT 3784 CTCTGCTTGT CTTCTCCTCC GTGGTCTTCA CACCGTATCC ACTGATGGTC AGTTAGTGTC 3844 AGAGGTCACC CAGGTTAGCA TCAGTTCCCA TGTGTGCCGT GCGGATTGTG AGCCGTGTGG 3904 TTGCTTGGTT GGTTTTCTTT TATGTACTTT GATTAGCTGT GGCACTTACT GAGTAAACTT 3964 ACGTTGCTGC AGACTGCTGT GTAACAAGCC ACGTTTTGTG TTTAGTCAGT ATTACACACG 4024 GGACCTTGTT TTATTCTTCT AGATAGCAGC TGTCCCAAAG AAAATATTTC TTCTTTGCCT 4084 ATTAAGATTT AGCTATTATC TGCCAGTTGT TAAGGGGTTT GATTCCAAAC TCAACCAGAG 4144 TTGAACGTAA GAAAGCTGCT GTACTCTTGC TGTCCATCTG TTACGTCCTC CGTTGTTGGC 4204 TCCTGACTAC GTACCCACGG CTGCTGAAGG AGACTTGTTT TAATTTGTTT TAAAAAGGAA 4264 AATGAAGTTT TAGGACTTTG ATGGTGGGGA AGCTGACAAG TTCAGACCCC AGTCTGTCAT 4324 TTGCTCTTAG CTTGGATCCT TTTGAAAAGT TAAGAATATA TGAAGGTAAA TTAGAAAAAG 4384 TAAAAATATT GATAAAATGT CATTTATCTT ATGTCTATTT TATGTTGTTA TTTGGCCTAT 4444 TAATTTTAAT TTTTTGAACA TTTTCTTATT TCTTGTAATA TGAATGCCGA TATTTAAAGT 4504 TTGACTCACT TGGGTTTCTT TTGTGTTTCT TAGTTGTTAT CTCTAAGCCT AACTAACTTT 4564 TAAGATTATT TGTGATATGG ATTTATATAA GCTGTTAAAT ATATATGAGC TGTTAAAATG 4624 GAATGCAAGG TTTTCCAAAG ACCAGGTCTA ACTGTAATGA TTGGTTTATT GTTCTACAAT 4684 CCCAGCCCGG CATTTTCCGT GTAAATCATA AACAATAAAC AGGATATACT CAGTGTTCAT 4744 TTCTAAAAAA AAAA 4758

【００８９】

【配列番号２】配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列 GACTAGTCAA AGCGGCCGCG AGCTCTTTTT TTTTTTTTTT TTTTT 45

【００９０】

【配列番号３】配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列ＣＧＣＧＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣ
１６

【００９１】

【配列番号４】配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GCCGAGCTCG GA 12

【００９２】

【配列番号５】配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列 GCCGCGAGCT CTTTTTTTTT T 21

【００９３】

【配列番号６】配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列ＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡ
２７

【００９４】

【配列番号７】配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGGAATTCTG ATCTCTTAGT GCAGC 25

【００９５】

【配列番号８】配列の長さ：４７７８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：ヒト配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：129..2255 特徴を決定した方法：E 配列ＧＴＴＣＧＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣ
ＡＣＡＴＴＴＣＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＣ６０ＣＡＴＡＧＴＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＣＴＡＴＡ
ＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＧＣ１２０ＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＧＴＣＡＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＧ
ＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＡＣＣＡＡ１７０ＭｅｔＳｅｒＧｌｎＴｙｒＴｈｒＧｌｕＬｙｓ
ＧｌｕＰｒｏＡｌａＡｌａＭｅｔＡｓｐＧｌｎ１５
１０ＧＡＡＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＡ
ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＴＡＴＣＡＧＡＣＡ２１８ＧｌｕＳｅｒＧｌｙＬｙｓＡｌａＶａｌＴｒｐＰｒｏＬｙｓ
ＰｒｏＡｌａＧｌｙＧｌｙＴｙｒＧｌｎＴｈｒ１５２０
２５３０ＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡ
ＣＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡ２６６ＩｌｅＴｈｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＴｙｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇ
ＨｉｓＡｌａＴｙｒＶａｌＳｅｒＰｈｅＬｙｓ３５
４０４５ＣＣＡＴＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣ
ＴＴＡＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣ３１４ＰｒｏＣｙｓＭｅｔＴｈｒＡｒｇＨｉｓＧｌｕＡｒｇＳｅｒ
ＬｅｕＧｌｙＡｒｇＡｌａＧｌｙＡｓｐＡｓｐ５０５５
６０ＴＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴ
ＣＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＴＣＣＴＣＡＧＧＴ３６２ＴｙｒＧｌｕＶａｌＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｓｐＡｓｐＶａｌ
ＰｒｏＬｙｓＧｌｕＡｓｎＳｅｒＳｅｒＧｌｙ６５７０
７５ＴＣＣＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＴ
ＴＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＣＣＴＡＴＡ４１０ＳｅｒＳｅｒＰｒｏＬｅｕＡｓｐＧｌｎＶａｌＡｓｐＳｅｒ
ＳｅｒＬｅｕＰｒｏＳｅｒＧｌｕＰｒｏＩｌｅ８０８５
９０ＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＣ
ＡＣＴＴＧＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＴ４５８ＰｈｅＧｌｕＬｙｓＳｅｒＧｌｕＴｈｒＧｌｕＩｌｅＰｒｏ
ＴｈｒＣｙｓＧｌｙＳｅｒＡｌａＬｅｕＡｓｎ９５１００
１０５１１０ＣＡＡＡＣＣＡＣＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴ
ＧＴＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＧＡＧ５０６ＧｌｎＴｈｒＴｈｒＧｌｕＳｅｒＳｅｒＧｌｎＳｅｒＰｈｅ
ＶａｌＡｌａＶａｌＨｉｓＨｉｓＳｅｒＧｌｕ１１５
１２０１２５ＧＡＡＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴ
ＡＣＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＣＡＣＴＣＴ５５４ＧｌｕＧｌｙＡｒｇＡｓｐＴｈｒＬｅｕＧｌｙＳｅｒＳｅｒ
ＴｈｒＡｓｎＬｅｕＨｉｓＡｓｎＨｉｓＳｅｒ１３０１３５
１４０ＧＡＧＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＧＴ
ＡＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴ６０２ＧｌｕＧｌｙＧｌｕＴｙｒＩｌｅＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓ
ＳｅｒＡｌａＳｅｒＳｅｒＶａｌＧｌｎＡｓｎ１４５１５０
１５５ＧＧＡＡＴＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＣＴＣＴ
ＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴ６５０ＧｌｙＩｌｅＡｌａＬｅｕＶａｌＨｉｓＴｈｒＡｓｐＳｅｒ
ＴｙｒＡｓｐＰｒｏＡｓｐＧｌｙＬｙｓＨｉｓ１６０１６５
１７０ＧＧＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴＴ
ＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＧＧＴ６９８ＧｌｙＧｌｕＡｓｐＡｓｎＡｓｐＨｉｓＬｅｕＧｌｎＬｅｕ
ＳｅｒＡｌａＧｌｕＶａｌＶａｌＧｌｕＧｌｙ１７５１８０
１８５１９０ＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＡＴ
ＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＴＴＧＧＡＡＡＡＣ７４６ＳｅｒＡｒｇＴｙｒＧｌｎＧｌｕＳｅｒＬｅｕＧｌｙＡｓｎ
ＴｈｒＶａｌＰｈｅＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｓｎ１９５
２００２０５ＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＣＴＴ
ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＡＴＴＴ７９４ＡｒｇＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＴｙｒＴｈｒＧｌｙＬｅｕ
ＳｅｒＰｒｏＰｒｏＶａｌＰｒｏＳｅｒＰｈｅ２１０２１５
２２０ＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡ
ＧＡＧＴＴＡＧＡＴＴＣＴＧＴＡＣＣＡＴＴＡ８４２ＡｓｎＣｙｓＧｌｕＶａｌＡｒｇＡｓｐＧｌｕＰｈｅＧｌｕ
ＧｌｕＬｅｕＡｓｐＳｅｒＶａｌＰｒｏＬｅｕ２２５２３０
２３５ＧＴＧＡＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＡＧ
ＴＴＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧ８９０ＶａｌＬｙｓＳｅｒＳｅｒＡｌａＧｌｙＡｓｐＴｈｒＧｌｕ
ＰｈｅＶａｌＨｉｓＧｌｎＡｓｎＳｅｒＧｌｎ２４０２４５
２５０ＧＡＡＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡ
ＡＴＧＧＴＴＡＧＴＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡ９３８ＧｌｕＩｌｅＧｌｎＡｒｇＳｅｒＳｅｒＧｌｎＡｓｐＧｌｕ
ＭｅｔＶａｌＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｎＧｌｎ２５５２６０
２６５２７０ＡＡＴＡＡＴＡＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＡＣＡ
ＧＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡ９８６ＡｓｎＡｓｎＴｈｒＳｅｒＧｌｎＧｌｕＡｒｇＧｌｎＴｈｒ
ＧｌｕＨｉｓＳｅｒＰｒｏＧｌｕＡｓｐＡｌａ２７５
２８０２８５ＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＴ
ＧＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＧ１０３４ＡｌａＣｙｓＧｌｙＰｒｏＧｌｙＨｉｓＩｌｅＣｙｓＳｅｒ
ＧｌｕＧｌｎＡｓｎＴｈｒＡｓｎＡｓｐＡｒｇ２９０２９５
３００ＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＴＧＡＡ
ＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＴ１０８２ＧｌｕＬｙｓＡｓｎＨｉｓＧｌｙＳｅｒＳｅｒＰｒｏＧｌｕ
ＧｌｎＶａｌＶａｌＡｒｇＰｒｏＬｙｓＶａｌ３０５３１０
３１５ＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧ
ＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＴＴＴＡＡＴ１１３０ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＩｌｅＳｅｒＳｅｒＳｅｒＧｌｎＶａｌ
ＡｓｐＧｌｎＧｌｕＴｈｒＧｌｙＰｈｅＡｓｎ３２０３２５
３３０ＡＧＧＣＡＴＧＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴ
ＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＴＴＧ１１７８ＡｒｇＨｉｓＧｌｕＡｌａＬｙｓＧｌｎＡｒｇＳｅｒＶａｌ
ＧｌｎＡｒｇＴｒｐＡｒｇＧｌｕＡｌａＬｅｕ３３５３４０
３４５３５０ＧＡＡＧＴＴＧＡＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＣ
ＣＴＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡ１２２６ＧｌｕＶａｌＧｌｕＧｌｕＳｅｒＧｌｙＳｅｒＡｓｐＡｓｐ
ＬｅｕＬｅｕＩｌｅＬｙｓＣｙｓＧｌｕＧｌｕ３５５
３６０３６５ＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＣ
ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＣＴＣＡＡＧＡ１２７４ＴｙｒＡｓｐＧｌｙＧｌｕＨｉｓＡｓｐＣｙｓＭｅｔＰｈｅ
ＬｅｕＡｓｐＰｒｏＰｒｏＴｙｒＳｅｒＡｒｇ３７０３７５
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ＡＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＴ１３２２ＶａｌＩｌｅＴｈｒＧｌｎＡｒｇＧｌｕＴｈｒＧｌｕＡｓｎ
ＡｓｎＧｌｎＭｅｔＴｈｒＳｅｒＧｌｕＳｅｒ３８５３９０
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ＧＡＴＡＡＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＣ１３７０ＧｌｙＡｌａＴｈｒＡｌａＧｌｙＡｒｇＧｌｎＧｌｕＶａｌ
ＡｓｐＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｒｐＡｓｎＧｌｙ４００４０５
４１０ＴＧＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＡＴＧＡＣ
ＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＴＧＡＡ１４１８ＣｙｓＧｌｙＡｓｐＴｙｒＴｙｒＧｌｎＬｅｕＴｙｒＡｓｐ
ＬｙｓＡｓｐＧｌｕＡｓｐＳｅｒＳｅｒＧｌｕ４１５４２０
４２５４３０ＴＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣＴ
ＴＴＧＣＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴ１４６６ＣｙｓＳｅｒＡｓｐＧｌｙＧｌｕＴｒｐＳｅｒＡｌａＳｅｒ
ＬｅｕＰｒｏＨｉｓＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙ４３５
４４０４４５ＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＴＣＡＡＧＴＧＡＴ
ＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＣＡ１５１４ＴｈｒＧｌｕＬｙｓＡｓｐＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｓｐ
ＧｌｕＳｅｒＴｒｐＧｌｕＴｈｒＬｅｕＰｒｏ４５０４５５
４６０ＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＴＡ
ＣＡＡＡＧＴＧＡＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＣＣＴ１５６２ＧｌｙＬｙｓＡｓｐＧｌｕＡｓｎＧｌｕＰｒｏＧｌｕＬｅｕ
ＧｌｎＳｅｒＡｓｐＳｅｒＳｅｒＧｌｙＰｒｏ４６５４７０
４７５ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴ
ＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＣＡＴＣＣ１６１０ＧｌｕＧｌｕＧｌｕＡｓｎＧｌｎＧｌｕＬｅｕＳｅｒＬｅｕ
ＧｌｎＧｌｕＧｌｙＧｌｕＧｌｎＴｈｒＳｅｒ４８０４８５
４９０ＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＡ
ＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＴＧＡＡ１６５８ＬｅｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＩｌｅＰｒｏＴｒｐＬｅｕ
ＧｌｎＴｙｒＡｓｎＧｌｕＶａｌＡｓｎＧｌｕ４９５５００
５０５５１０ＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＣＣＴ
ＧＣＣＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡ１７０６ＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｓｐＧｌｕＧｌｙＡｓｎＧｌｕＰｒｏ
ＡｌａＡｓｎＧｌｕＰｈｅＡｌａＧｌｎＰｒｏ５１５
５２０５２５ＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＡＡＣ
ＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＴＧ１７５４ＡｌａＰｈｅＭｅｔＬｅｕＡｓｐＧｌｙＡｓｎＡｓｎＡｓｎ
ＬｅｕＧｌｕＡｓｐＡｓｐＳｅｒＳｅｒＶａｌ５３０５３５
５４０ＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＣ
ＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＴ１８０２ＳｅｒＧｌｕＡｓｐＬｅｕＡｓｐＶａｌＡｓｐＴｒｐＳｅｒ
ＬｅｕＰｈｅＡｓｐＧｌｙＰｈｅＡｌａＡｓｐ５４５５５０
５５５ＧＧＡＣＴＡＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＡＴＴＴＣＡ
ＴＡＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴ１８５０ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＶａｌＡｌａＧｌｕＡｌａＩｌｅＳｅｒ
ＴｙｒＶａｌＡｓｐＰｒｏＧｌｎＰｈｅＬｅｕ５６０５６５
５７０ＡＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＴＴＡ
ＧＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴ１８９８ＴｈｒＴｙｒＭｅｔＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｒｇＬｅｕ
ＡｌａＧｌｎＡｌａＭｅｔＧｌｕＴｈｒＡｌａ５７５５８０
５８５５９０ＣＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧ
ＧＡＴＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＴＣＣＡ１９４６ＬｅｕＡｌａＨｉｓＬｅｕＧｌｕＳｅｒＬｅｕＡｌａＶａｌ
ＡｓｐＶａｌＧｌｕＶａｌＡｌａＡｓｎＰｒｏ５９５
６００６０５ＣＣＡＧＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴ
ＣＴＴＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴ１９９４ＰｒｏＡｌａＳｅｒＬｙｓＧｌｕＳｅｒＩｌｅＡｓｐＧｌｙ
ＬｅｕＰｒｏＧｌｕＴｈｒＬｅｕＶａｌＬｅｕ６１０６１５
６２０ＧＡＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡ
ＣＡＡＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＧＣ２０４２ＧｌｕＡｓｐＨｉｓＴｈｒＡｌａＩｌｅＧｌｙＧｌｎＧｌｕ
ＧｌｎＣｙｓＣｙｓＰｒｏＩｌｅＣｙｓＣｙｓ６２５６３０
６３５ＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＡＧＣＡ
ＡＣＡＧＡＧＴＴＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴ２０９０ＳｅｒＧｌｕＴｙｒＩｌｅＬｙｓＡｓｐＡｓｐＩｌｅＡｌａ
ＴｈｒＧｌｕＬｅｕＰｒｏＣｙｓＨｉｓＨｉｓ６４０６４５
６５０ＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴ
ＴＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＧＧＧＡＡＣＡ２１３８ＰｈｅＰｈｅＨｉｓＬｙｓＰｒｏＣｙｓＶａｌＳｅｒＩｌｅ
ＴｒｐＬｅｕＧｌｎＬｙｓＳｅｒＧｌｙＴｈｒ６５５６６０
６６５６７０ＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＡ
ＣＣＴＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＣＴ２１８６ＣｙｓＰｒｏＶａｌＣｙｓＡｒｇＡｒｇＨｉｓＰｈｅＰｒｏ
ＰｒｏＡｌａＶａｌＩｌｅＧｌｕＡｌａＳｅｒ６７５
６８０６８５ＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＣＴ
ＧＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＣ２２３４ＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒＳｅｒＧｌｕＰｒｏＡｓｐＰｒｏ
ＡｓｐＡｌａＰｒｏＰｒｏＳｅｒＡｓｎＡｓｐ６９０６９５
７００ＡＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＡＣ
ＡＧＴＴＧＡＡＡＴＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧＴＡＴ２２８５ＳｅｒＩｌｅＴｈｒＧｌｕＡｌａＰｒｏ７０５ＣＡＡＡＧＴＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴＡＡＡＴＴＴＣＡ
ＴＧＴＧＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴ２３４５ＴＴＡＧＡＡＡＴＧＣＴＡＴＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＴＧＣＣＡＴＡＧＴＴ
ＴＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴ２４０５ＡＡＡＴＴＴＡＧＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＴＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴ
ＴＡＡＧＣＴＧＡＡＴＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＴＣＣ２４６５ＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＡＡＴＴＧ
ＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＴＧＡＣＴＣＴＣ２５２５ＴＣＣＡＧＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＴＡＣＧＴ
ＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＣ２５８５ＴＡＡＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＡＴ
ＣＡＡＡＴＧＴＡＡＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＡＡＣＣＧ２６４５ＴＡＧＴＡＡＡＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡ
ＡＴＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＣＡＣＴＡＧＴＣ２７０５ＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＴＡＴＣＡＴＡＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴ
ＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＧＴ２７６５ＣＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＧＡＡＴ
ＧＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡ２８２５ＧＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡ
ＣＴＣＣＣＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＴＴＡＧＧＴＡＧＴＡ２８８５ＡＡＡＴＣＣＴＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＡＡＣ
ＧＴＡＡＧＧＴＴＡＧＴＡＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＴ２９４５ＣＴＡＧＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡ
ＡＴＴＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＣＴ３００５ＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＡＡ
ＡＡＴＴＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＴＣ３０６５ＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＧＴＴＡＧ
ＴＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＴＡＴ３１２５ＴＴＴＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＡＴＣ
ＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＡＣＣＣＣＡＡＡＣＴＡＡＧ３１８５ＡＴＧＣＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＣＡ
ＧＴＧＧＡＣＧＡＧＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＣＡ３２４５ＴＡＡＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡ
ＡＣＡＣＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＡＣＡ３３０５ＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＧＣＡＣＡＴＡＧＴＧＡ
ＧＴＧＴＡＴＧＴＣＣＡＴＣＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＴＧ３３６５ＡＴＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＣＡＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＴ
ＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡ３４２５ＴＣＴＴＡＴＴＣＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣ
ＣＣＧＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴ３４８５ＡＡＡＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＧＡＧＧＣＴ
ＴＡＡＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣＡＴ３５４５ＴＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧ
ＴＡＴＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴ３６０５ＴＴＴＡＴＧＧＧＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＣ
ＡＴＧＴＡＡＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＡＧ３６６５ＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＧ
ＣＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＧＴＴＧＣＡＴＴ３７２５ＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＧＴＣ
ＡＣＴＧＴＴＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＣＴＴＴＧＣＴＴＧ３７８５ＴＴＴＴＣＴＡＣＴＣＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴ
ＣＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＴＡＧＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧ３８４５ＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＧＴＧＴＡＴＡ
ＴＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＧＣＴＡＧＴＧＴＧＡＴＴ３９０５ＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＣＡＧ
ＴＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＡＣＧ３９６５ＴＴＧＣＴＡＡＡＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＡＡＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＴ
ＴＡＴＡＴＴＴＡＧＡＣＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＧＡＣＣＴＴ４０２５ＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＡＡＧＡＡ
ＡＡＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＧＴＴＡＡＧＡＴＴ４０８５ＴＡＧＣＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧ
ＧＴＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣＣＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＡＧ４１４５ＡＧＣＴＧＡＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＴＴＴＧＣ
ＴＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＴ４２０５ＴＧＧＣＴＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＴＡＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡ
ＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＴＡＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴ４２６５ＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＧＴＴ
ＴＴＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＧ４３２５ＧＴＡＴＡＡＧＣＴＡＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡ
ＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣ４３８５ＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＡＴＡＴＧＡＡＧＧＴＡＡＡＴ
ＴＡＧＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡ４４４５ＴＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＧＴ
ＧＡＣＴＴＡＡＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣ４５０５ＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＡＴＧＡＡＴＧＣＴＧＡＴＡ
ＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＴＡＴＴＣＴ４５６５ＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＴ
ＡＴＴＴＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴ４６２５ＴＡＧＡＴＡＣＡＴＡＣＧＡＡＴＴＧＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＡ
ＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＡＡＴＧＴ４６８５ＡＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＡＴＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣ
ＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＣＡＡ４７４５ＴＡＡＡＣＡＧＡＡＴＡＴＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
４７７８

【図面の簡単な説明】

【図１】ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーファミリーに属する
タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す図である。

【図２】Ａは、ラットの顔面神経軸索切断７日後の非切
断側の顔面神経核の本発明のニューロダップ１のｍＲＮ
Ａの局在を示す明視野顕微鏡写真であり、そしてＢは、
ラットの顔面神経軸索切断７日後の切断側の顔面神経核
の本発明のニューロダップ１のｍＲＮＡの局在を示す明
視野顕微鏡写真である。

【図３】Ａは、ラットの顔面神経軸索切断３日後の本発
明のニューロダップ１のｍＲＮＡの発現を示す暗視野顕
微鏡写真であり、Ｂは、ラットの顔面神経軸索切断７日
後の本発明のニューロダップ１のｍＲＮＡの発現を示す
暗視野顕微鏡写真であり、そしてＣは、ラットの顔面神
経軸索切断１４日後の本発明のニューロダップ１のｍＲ
ＮＡの発現を示す暗視野顕微鏡写真である。

【図４】Ａ、Ｂ、およびＣはそれぞれ小脳、海馬、およ
び大脳皮質におけるインサイチュハイブリダイゼーショ
ンによる本発明のニューロダップ１ｍＲＮＡに分布を示
す電子顕微鏡写真であり、そしてＤ、Ｅ、およびＦはそ
れぞれ小脳、海馬、および大脳皮質における免疫組織化
学検査によるタンパク質の分布を示す電子顕微鏡写真で
ある。

【図５】Ａは、ラットの顔面神経軸索の非切断側の顔面
神経核の免疫組織化学検査の結果を示す顕微鏡写真であ
り、そしてＢは、ラットの顔面神経軸索の切断側の顔面
神経核の免疫組織化学検査の結果を示す顕微鏡写真であ
る。

【図６】Ａは、インビトロ転写−翻訳アッセイのテンプ
レートの種々のサイズを示す図であり、Ｂは、インビト
ロ転写-翻訳アッセイの結果を示す電気泳動像の写真で
あり、Ｃは、精製GST-ニューロダップ１融合タンパク質
の電気泳動像の写真であり、そしてＤは、アフィニティ
ー精製抗ニューロダップ１抗体を用いる免疫ブロッティ
ング分析の結果を示す、電気泳動像の写真である。

【図７】Ａは、ラットの大脳皮質における本発明のニュ
ーロダップ１タンパク質の細胞内局在を示す免疫電子顕
微鏡写真であり、ＢおよびＣは、ラットの顔面神経軸索
の非切断側の顔面神経核における本発明のニューロダッ
プ１タンパク質の細胞内局在を示す免疫電子顕微鏡写真
であり、そしてＤは、ラットの顔面神経軸索の切断側の
顔面神経核（軸索切断９日後）における本発明のニュー
ロダップ１タンパク質の細胞内局在を示す免疫電子顕微
鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者我原義成兵庫県神戸市北区甲栄台３丁目１番27−13 (72)発明者小原收千葉県木更津市請西２丁目20−25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】神経細胞のシナプス後膜肥厚領域に局在
し得るタンパク質であって、ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガー
モチーフを含む、タンパク質。
【請求項２】神経損傷に伴って発現が抑制される、請
求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】前記ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフ
が配列表の配列番号１の６３３位のCysから６７３位のC
ysまでのアミノ酸配列またはその類似の配列である、請
求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】配列表の配列番号１の１位のMetから７
０７位のProまでのアミノ酸配列またはその類似の配列
を含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項５】ヒトの中枢神経系で発現される、請求項
１または２に記載のタンパク質。
【請求項６】前記ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーモチーフ
が配列表の配列番号８の６３４位のCysから６７４位のC
ysまでのアミノ酸配列またはその類似の配列である、請
求項１、２、または５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項７】配列表の配列番号８の１位のMetから７
０８位のProまでのアミノ酸配列またはその類似の配列
を含む、請求項１、２、または５のいずれかに記載のタ
ンパク質。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載のタンパ
ク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ分子。
【請求項９】請求項３に記載のタンパク質をコードす
る塩基配列を少なくとも有する、ＤＮＡ分子。
【請求項１０】配列表の配列番号１の２０３７位のＴ
から２１５９位のＣまででなる塩基配列を有する、請求
項９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】配列表の配列番号１の１４１位のＡか
ら２２６１位のＧまででなる塩基配列を有する、請求項
９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１２】配列表の配列番号１の１位のＴから４
７５８位のＡまででなる塩基配列を有する、請求項９に
記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】請求項６に記載のタンパク質をコード
する塩基配列を少なくとも有する、ＤＮＡ分子。
【請求項１４】配列表の配列番号８の２０２８位のＴ
から２１５０位のＣまででなる塩基配列を有する、請求
項１３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１５】配列表の配列番号８の１２９位のＡか
ら２２５２位のＣまででなる塩基配列を有する、請求項
１３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１６】配列表の配列番号８の１位のＧから４
７７８位のＡまででなる塩基配列を有する、請求項１３
に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１７】請求項８〜１６のいずれかに記載のＤ
ＮＡ分子を有する発現ベクター。
【請求項１８】請求項１７に記載の発現ベクターを宿
主に導入して得られる形質転換体。
【請求項１９】前記宿主が大腸菌である、請求項１８
に記載の形質転換体。
【請求項２０】請求項１８に記載の形質転換体を培養
する工程、および産生されたタンパク質を培養培地から
回収する工程を包含する、請求項１〜７のいずれかに記
載のタンパク質の製造方法。
【請求項２１】請求項１〜７のいずれかに記載のタン
パク質を認識する抗体。
【請求項２２】モノクローナル抗体である、請求項２
１に記載の抗体。
【請求項２３】請求項２１または２２に記載の抗体を
産生し得る、ハイブリドーマ。