JPH10513041A

JPH10513041A - 第２１染色体遺伝子マーカー、これを使用する組成物および方法

Info

Publication number: JPH10513041A
Application number: JP8516212A
Authority: JP
Inventors: アール．コレンバーグ，ジュリー; 和弘山川
Original assignee: シーダーズ−サイナイメディカルセンター
Priority date: 1994-11-09
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 1998-12-15
Also published as: US20040180335A1; US6166180A; CN1166837A; EP0796274A2; WO1996015144A2; US5773268A; CN1131240C; WO1996015144A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＥＨＯＣ−１タンパク質をコードする単離された核酸、およびこれにコードされる単離された受容体タンパク質を提供する。さらに本発明は、本発明の核酸を含有するベクター、これにハイブリダイズするプローブ、これに形質転換される宿主細胞、これに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、本発明のタンパク質を含有する組成物、並びに本発明のタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】第２１染色体遺伝子マーカー、これを使用する組成物および方法発明の背景ヒトゲノムの地図の作成について、分子遺伝学の精力的な努力がなされている。ヒトゲノムマッピングは、一般に、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、体細胞ハイブリッド解析またはランダムクローンフィンガープリント法のような、幾つかの方法を使用してこれらの染色体上のゲノムＤＮＡ断片の順序を決定することからなる。マークした多型部位に対応するＤＮＡ断片は、遺伝子結合解析によりオーダリングが行われる。多型遺伝子座の間の距離は、減数分裂組換えの頻度により予測される。しかし、分子レベルではこの解像度が低く、組換え頻度が物理的距離に直線的には相関しないため、この予測される距離に基づく高分解能地図は、このような方法では容易に作成することはできない。すなわち、例えば情報量の多いマーカーを得ることが困難なことおよび染色体に沿って均等に分布している同定されたマーカーが少ないことなどの種々の障害が、現在の遺伝子地図の大きな欠点である。マッピングされたマーカーの多くは、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより測定される制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である。これらのマーカーに基づく地図は、多くの疾患の一次的マッピングに大きく貢献してきたが、まれな単一要因性疾患のマッピング、遺伝子同定に適した距離にまで連鎖の間隔の精度を上げること、および複雑な形質に寄与する遺伝子座のマッピングなどの多くの応用にはまだ不充分である。遺伝子連鎖マッピングは、ヒトの生物学の研究、および特に疾患の分子学的基礎を規定するのに応用される重要な技術である。実際、ヒトの遺伝疾患の研究に最も一般的に使用される方策の一つは、染色体の位置に基づく関連する遺伝子をクローニングすることである。従って、遺伝子連鎖地図は、単一遺伝子性疾患に関与する遺伝子、多要因性疾患に関与する遺伝子の同定とマッピングを促進し、保因者の検出や遺伝疾患の出生前診断に有用である。詳細な連鎖地図はまた、全染色体のクローンに基づく物理マッピングやＤＮＡ配列解析の前提条件でもある。ヒトの第２１染色体は、大規模なヒト遺伝子マッピング計画の典型例である。最も小さいヒト染色体である第２１染色体は、約５０メガ塩基（Ｍｂ）のＤＮＡを有する。第２１染色体上にあると予想される２０００遺伝子のうち判明しているのは１％にも達しない。染色体の高分解能地図は、家族制アルツハイマー病（ＦＡＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、およびフィニッシュ進行性ミオクローヌスてんかん（Finnish progressive myoclonus epil epsy）（ＰＭＥ）における明らかな役割のため、特に興味深い。ＦＡＤの原因である遺伝子の欠陥は、３つの含セントロメア遺伝子座への遺伝子連鎖に基づき、第２１染色体に局在化されている。アルツハイマー病（ＡＤ）の老人斑と脳血管アミロイド沈着の主要成分であるアルツハイマー病関連アミロイドβタンパク質前駆体（ＡＰＰ）をコードする遺伝子もまた、第２１染色体にマッピングされている。このような広範囲の連続地図の作成には、クローン化された遺伝子断片中の目標の同定と局在化が必要である。クローンされた断片のサイズにとって充分量の目標があれば、隣接地図が作成され、同時に目標がオーダリングされる。現在、ＹＡＣ（すなわち、酵母人工染色体）が、ヒトゲノムのマッピングのほとんどに使用されている。ＹＡＣは約５００Ｋｂ以上の断片のクローニングを可能にする。しかし、ＹＡＣライブラリーの操作には、いくつかの困難がある。例えば、種々のＹＡＣライブラリーにおいて、クローンの一部は、同時クローニングから生じ、すなわち単一のクローン内に非連続的なＤＮＡ断片が含まれる。高率のＹＡＣクローン、特に高分子量挿入体を有するクローンは、キメラ性である。キメラクローンは、染色体の多くの部位にマッピングされ、従ってマッピングや解析の進展を妨げる。ＹＡＣクローニング特有の別の問題は、クローン化不可能であるかまたは不安定であり、再配列や欠損し易いＤＮＡセグメントにより引き起こされる。細菌人工染色体（ＢＡＣ）は、ＹＡＣ系の代替物となる。ＢＡＣを用いると、ＹＡＣの最も問題のある側面（例えば、キメラが高率であることやクローンの不安定性）が軽減される。ＢＡＣは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）単一コピープラスミドであるＦ因子をベースにしており、約３００ｋｂより大きいサイズのＤＮＡ断片を忠実に増やすことができる。ＢＡＣは、それらを物理マッピングをし易くする多くの物理的性質（操作が容易であること、およびキメラが存在しないことなど）を有する。ＢＡＣは、キメラが存在しないことや大きな外来性挿入体ＤＮＡを増やすことができるため、染色体歩行（chromosome walking）や隣接物理地図の作成の優れた候補である。第２１染色体を分子的に説明する必要性は、いくつかのヒトの遺伝疾患との関連に直接由来する。この染色体をカバーする隣接単位の（ｃｏｎｔｉｇ）の地図は、これらの疾患の原因を同定することを加速するであろう。実際、詳細な地図は、病原性の遺伝子座が遺伝子連鎖または細胞遺伝学的解析により局在化されれば直ちに、ゲノムセグメント（任意の病原性遺伝子座など）に直接アクセスすることを可能にするであろう。すなわち、高分解能染色体地図の生理学的、医学的および診断的応用を促進する第２１染色体の遺伝子座を占める膨大な遺伝子を同定、性状解析、およびマッピングすることのニーズが存在する。本発明は、このニーズを満たし、関連する利点を与える。発明の要約本発明は、ヒトＥＨＯＣ−１タンパク質をコードする単離された核酸、およびこれにコードされる単離された受容体タンパク質を提供する。さらに本発明は、本発明の核酸、これとハイブリダイズするプローブ、これに形質転換される宿主細胞、これに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび含有する組成物、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体および含有する組成物、並びに本発明のタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、提供する。図面の簡単な説明図１は、ＨＰＥ１の共通配列の物理地図を示す。図２は、ＨＰＥ１の共通配列に関連するＥＰＭ１の共通配列の物理地図を示す。ＹＡＣクローン、ＢＡＣクローンおよびＥＨＯＣ−１の位置を、太い棒で示す。図３Ａは、ＥＨＯＣ−１が経膜的(transmembrane)タンパク質に対する相同性を有する領域を示す。領域１は、ラットのナトリウムチャネルタンパク質III と重複する３４アミノ酸中で２９．４％の同一性を示す。領域２は、サルモネラ・チフィムリン(Salmonella typhimurin)のホスホグリセレート輸送系制御タンパク質と重複する１０３アミノ酸中で２０．４％の同一性を示す。領域３は、アラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）のピロリン酸−エネルギー化液胞膜プロトンポンプと重複する５５アミノ酸中で２９．１％の同一性を示す。領域４は、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）のミオシン様タンパク質と重複する５０アミノ酸中で２４．０％の同一性を示す。領域５は、ウサギの心筋リアノジン(ryanodine)受容体と重複する３９アミノ酸中で１７．９％の同一性を示す。領域６は、ラットの心筋ナトリウムチャネルタンパク質アルファサブユニットと重複する６２アミノ酸中で２１．０％の同一性を示す。領域７は、ラットの骨格筋ナトリウムチャネルタンパク質アルファサブユニットと重複する２７アミノ酸中で４０．７％の同一性を示す。領域８は、ジストロフィン（dystrophin）のシステインリッチなドメインと重複する３３アミノ酸中で３０．３％の同一性を示す。図３Ｂは、連鎖不平衡解析で計算したＥＰＭ１遺伝子座との遺伝子距離（センチモルガン）の比較を示す（レヘスジョキ(Lehesjoki)ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１２２９−１２３４（１９９３））。図４は、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの異なるイソフォームのスプライス変種とポリ（Ａ）＋結合部位の推定遺伝子座を示す。発明の詳細な説明進行性ミオクローヌスてんかん（ＰＭＥ）は、ミオクローヌス、てんかん発作および進行性神経変性（運動失調症や痴呆症を含む）を特徴とする、不均一な群の疾患である（ベルコビック（Berkovic）ら、Ｎｅｗ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５：２９６−３０５（１９８６））。ウンフェリヒト−ルンドボルグ(Unver richt-Lundborg)型のＰＭＥ（ＥＰＭ１）は、フィンランドや地中海地域で血族内で発生する常染色体性劣性遺伝疾患であり、フィンランドでの罹患率は少なくとも１：２０，０００である。遺伝子連鎖解析により、ＥＰＭ１の遺伝子座は、染色体２１ｑ２２．３上にあることが示され（マラフォッセ(Malafosse)ら、Ｌａｎｃｅｔ３３９：１０８０−１０８１（１９９２））、ラフォラ（Ｌａｆｏｒａ）病（これも、ＰＭＥの１つである）をこの領域から排除した（レヘスジョキ(Lehesjoki)ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４２：１５４５−１５５０（１９９２））。連鎖不平衡解析は、ＰＦＫＬ、Ｄ２１Ｓ２５およびＤ２１Ｓ１５４の遺伝子座にまたがる３００ｋｂの候補領域を限定することを可能にした（レヘスジョキ(Lehesjoki)ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１２２９− １２３４（１９９３）；レヘスジョキ(Lehesjoki)ら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ９３：６６８−６７４（１９９４））。自己免疫多腺性疾患タイプＩ（ＡＰＥＣＥＤ）もまた、連鎖不平衡解析により染色体２１ｑ２２．３にマッピングされた（アアルトネン，ジェイ（Aaltonen， J.）ら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．８：８３−８７（１９９４））。ＡＰＥＣＥＤは常染色体性劣性遺伝疾患であり、副甲状腺、副腎皮質、性腺、膵臓β細胞、甲状腺および胃壁細胞の機能不全の種々の組合せが起きる。ＡＰＥＣＥＤのさらに別の作用には、脱毛症、白斑、肝炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、エナメル質や爪の形成異常、および角膜症がある。ＡＰＥＣＥＤは通常、小児期に発症するが、組織特異的症状は成人期に現れることがある。ＡＰＥＣＥＤ遺伝子座は、Ｄ２１Ｓ４９とＤ２１Ｓ１７１の５００ｋｂ以内にマッピングされている。全前脳症は、単眼症、猿頭奇形猿頭症、顎骨前無形成、間隔異常減少、および単一上顎中切り歯などの広範囲の顔面中央の異常として現れる、胚の前脳の分割不全や不完全な顔面中央の発達が特徴である。最も一般的な関連する染色体異常には、ｄｕｐ（３ｐ）、ｄｅｌ（７ｑ）、第１３染色体の欠失、トリソミー１３、トリソミー１８、および三倍体性がある（ムンケ(Munke)、ＡＭＪＭｅｄＧｅｎｅｔ３４：２３７−２４５（１９８９））がある。原因は種々あり、第２、３、７、１３、１８および２１染色体の異数性がある。ＨＰＥ１の候補領域を限定するために、２人のＨＰ患者で２１（ｑ２２．３）の欠失を、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションと定量サザンブロット用量解析により性状解析した。小さな欠失については、Ｄ２１Ｓ２５、Ｄ２１Ｓ１５４、Ｄ２１Ｓ１７１およびＤ２１Ｓ４４の領域を欠失させ、Ｄ２１Ｓ４２とＤ２１Ｓ４９については欠失させなかった。これらのデータを、全前脳症表現型のない２１ｑ２２．３の欠失（Ｄ２１Ｓ１１２−ｔｅｒ）の以前の報告と組合わせると、全前脳症を起こす領域は、ＰＦＫＬとＩＴＧＢ２を含む１〜２Ｍｂの領域（ＣＤ１８）にまたがることを示している。第２１染色体異常を有する全前脳症の４症例が公表されている。エスタブルークス（Estabrooks）らは、染色体２１（ｑ２２．３）の微小欠失を記載し（エスタブルークス（Estabrooks）ら、ＡＭＪＭｅｄＧｅｎｅｔ、３６：３０６−３０９（１９９０））、この領域を全前脳症の遺伝子座（ＨＰＥ１）として示唆している。ＥＰＭ１−ＡＰＥＣＥＤ−ＨＰＥ１候補領域の隣接単位のＢＡＣ（細菌人工染色体）（シズヤ(Shizuya)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：８７９４−８７９７（１９９２））作成、および直接ｃＤＮＡ選択法を用いるこの隣接地図単位からの新規遺伝子の単離が、本明細書に記載される。これらの疾患の原因となる遺伝子を単離するために、ウニ−ザップＸＲ（Ｕｎｉ−ＺａｐＸＲ）（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア(LaJolla)、カリホルニア州）を用いて、１４週令のトリソミー２１胎児脳からｃＤＮＡライブラリーを作成した。９５％以上のクローンは、１〜４ｋｂ（平均２ｋｂ）の範囲の挿入体を有する。さらに、直接ｃＤＮＡ選択法を、２１ｑ２２．３領域でＢＡＣ（細菌人工染色体）に応用した。Ｓａｕ３ＡＩリンカーを、トリソミー２１胎児脳から合成したｃＤＮＡに結合させた。Ｓａｕ３ＡＩで消化後、リンカーの第２の対をこのｃＤＮＡに結合させ、次にこれを、候補領域をカバーするビオチン化ＢＡＣＤＮＡにハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡ／ＢＡＣＤＮＡハイブリッド分子を、ストレプトアビジン被覆した磁気ビーズ上に捕捉し、非特異ｃＤＮＡを洗浄して除去し、特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡを溶出させ、次にＰＣＲで増幅した。２回選択したＰＣＲ産物をサブクローニングし、解析した。サザンブロット解析は、３０のうち２１（７０％）の断片が元々のＢＡＣのユニークなバンドを与えることを明らかにした。これらの断片をプローブとして用いて、ライブラリーからｃＤＮＡ（３ｋｂ、４ｋｂおよび５ｋｂ）を単離した。５ｋｂのｃＤＮＡサブクローン（ＥＨＯＣ−１）は、近くのＤ２１Ｓ２５の近傍にマッピングされ、他の経膜的遺伝子との相同性を示した。これらの遺伝子の遺伝子座はすべて、全前脳症、ＥＰＭ１およびＡＰＥＣＥＤが局在化されている共通領域内にマッピングされる。５ｋｂのｃＤＮＡのＤＮＡ配列解析は、３５７０塩基対の完全なコード配列を示し、これは、３つのナトリウムチャネルタンパク質を含む他の経膜的タンパク質とのアミノ酸配列の相同性（配列番号：１〜２；図３）を明らかにした。ＰＦＫＬ、Ｄ２１Ｓ２５、Ｄ２１Ｓ１５４およびＣＤ１８を含有する配列に標識をした部位（ＳＴＳ）を用いるＰＣＲスクリーニング法により、５つのＢＡＣクローンを全ヒトゲノムＤＮＡＢＡＣライブラリーから単離した（シズヤ(Shi zuya)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：８７９４− ８７９７（１９９２））。これらのＢＡＣクローンやＹＡＣクローンを有するＨＰＥ１−ＥＰＭ１−ＡＰＥＣＥＤ共通領域との物理地図（チュマコフ（Chumakov ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５９：３８０−３８７（１９９２））を図１と２に示す。ＢＡＣ−１（２３０ｋｂ）とＢＡＣ−２（２１０ｋｂ）は、Ｄ２１Ｓ２５について陽性である。ＢＡＣ−３（１７０ｋｂ）は、Ｄ２１Ｓ２５とＰＦＫＬについて陽性である。ＥｃｏＲＩ消化したＢＡＣＤＮＡのアガロースゲル電気泳動とサザンブロット解析は、これらの３つのＢＡＣが重複することを示した。ＢＡＣ −４はＢＡＣ−３と同じであった。ＢＡＣ−５（１００ｋｂ）は、ＣＤ１８について陽性であった。共通領域にまたがる５つのＢＡＣＤＮＡ（このうち４つは重複する）について、直接ｃＤＮＡ選択法を行なった。サブクローンＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化により、クローンの１０％がキメラであることがわかった。非キメラクローンの平均サイズは４００塩基対であった。選択されたｃＤＮＡの４０の非キメラサブクローンを、ＥｃｏＲＩ消化したＢＡＣＤＮＡサザンブロットにより解析した。２８クローン（７０％）は、ＢＡＣブロット上にユニークなシグナルを示し、６クローン（１５％）は、反復性であり、６クローン（１５％）は、これらのブロット上で何のシグナルも示さなかった。これらのサブクローンの挿入体ＤＮＡをプローブとして用いて、トリソミー２１胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ポリ（Ａ）⁺テイルを含有する３つの重複ｃＤＮＡ（３ｋｂ、４ｋｂおよび５ｋｂ）が単離され、ＥＨＯＣ−１と名付けた。３つの重複するＥＨＯＣ−１ｃＤＮＡサブクローンを、ＥｃｏＲＩ消化したＢＡＣＤＮＡブロットを用いてサザンブロット解析のために使用した。ＢＡＣ −１のみがユニークな複数バンドシグナルを示し、これはこれらのｃＤＮＡがＢＡＣ−１由来であることを示す。シグナルバンドのサイズが同じであることは、これらのクローンは互いに重複することを示す。ＥＨＯＣ−１の５ｋｂのｃＤＮＡクローンの完全な配列解析と３ｋｂと４ｋｂのクローンの部分的配列解析は、５ｋｂクローンの中に３ｋｂクローンの全配列と４ｋｂクローンの配列の一部が含有されていることを示した。しかし、４ｋｂクローンの３’末端は、５ｋｂクローンのものとは異なり、ＥＨＯＣ−１ｃＤＮＡのスプライス変種が存在することを示した。全部で９つのヒトｃＤＮＡクローン（２．７ｋｂ〜７．２ｋｂ）をさらに性状解析すると、別のスプライシングおよび／または複数のポリ（Ａ）⁺ 結合部位が明らかであった（図４を参照）。例えば、配列番号：４は、３’非翻訳ＥＨＯＣ−１ｃＤＮＡの１８０１ヌクレオチドを含有し、配列番号：１のヌクレオチド５１０７のすぐ後ろまで延びている（ＥＨＯＣ−１ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの或るイソフォーム）。配列番号：１のヌクレオチド５１０７のすぐ後ろから始まるポリ（Ａ）＋結合部位以外に、６つの別のポリ（Ａ）＋結合部位が解明されている。これらの６つの結合部位は、ヌクレオチド：１０、３１０、１１４９、１１５５、１７９８および１８０１に対応して配列番号：４のヌクレオチド位置に存在する（図４を参照、それぞれ、クローンｃＤＦ７、ｃＥＨ１８／ｃＤＦ４、ｃＥＨ３０、ｃＥＨ３３、ｃＥＨ３８、およびｃＥＨ２／ｃＥＨ２５）。５ｋｂのＥＨＯＣ−１ｃＤＮＡの挿入体を用いるノーザンブロット解析により、複数の成人組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）について３つの転写体（５．３ｋｂ、７．５ｋｂおよび８ｋｂ）が明らかになった。ＥＨＯＣ−１５ｋｂのｃＤＮＡサブクローンからの挿入体をプローブとして用いて、健常人のリンパ球について蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションも行なった。染色体２１ｑ２２．３について不連続なシグナルが観察され、遺伝子座が確認された。ヒトおよびマウスの脳組織を用いるヒトおよびマウスＥＨＯＣ−１ｃＤＮＡクローンの組織ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析により、ＥＨＯＣ −１は普遍的に発現されるが、主にニューロン細胞中に存在することが明らかになった。成体マウスの海馬歯状回と小脳のプルキンエ細胞は、かなり強いシグナルを示す組織であった。ＥＰＭ１患者ではプルキンエ細胞が顕著に欠如しているため、プルキンエ細胞中のＥＨＯＣ−１の強い発現は、進行性ミオクローヌスてんかんの原因としてのこの遺伝子の可能性を増加させている。５ｋｂｃＤＮＡの完全な配列から、３５７０塩基対の読みとり枠が明らかになった（１１９０アミノ酸；配列番号：２）。開始ＡＴＧは、コザック(Kozak) 共通配列内に位置していた（コザック，エム（Kozak，Ｍ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）；コザック，エム（Kozak，Ｍ）、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１５：８１２５−８１４８（１９８７））。この読みとり枠（ＯＲＦ）をＧｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬに登録された遺伝子で相同性の検索を行うと、この遺伝子産物は、３つのナトリウムチャネルタンパク質を含む複数の経膜的タンパク質に相同的であることが明らかになった（図３）。マウス胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）を、約５ｋｂのヒトＥＨＯＣ−１ｃＤＮＡクローン（ｃＤＦ９）をプローブとして用いてスクリーニングした。２つの相同性クローンが単離され、ｃＭＯ１（３．５ｋｂ）とｃＭＯ６（３．０ｋｂ）と呼んだ。ｃＭＯ６クローンは部分的に配列決定され、配列番号：６に示す。配列番号：６に記載の２２９塩基対の配列は、マウスＥＨＯＣ−１タンパク質の１つの断片をコードし、配列番号：１のヌクレオチド１９１３〜２１４１でヒトＥＨＯＣ−１ｃＤＮＡに７５．４％相同である。ヒトのいくつかの神経疾患は、ナトリウムチャネル（プタセク（Ptacek）ら、Ｃｅｌｌ６７：１０２１−１０２７（１９９１）；ロジャス(Rojas)ら、Ｎａｔｕｒｅ３５４：３８７−３８９（１９９１）；マクラチェイ(MacClatchey) ら、Ｃｅｌｌ６８：７６９−７７４（１９９２）；プタセク(Ptacek)ら、Ｎｅｕｒｏｎ８：８９１−８９７（１９９２））、カルシウムチャネル（プタセク（Ptacek）ら、Ｃｅｌｌ７７：８６３−８６８（１９９４）；ジュルクト−ロット（Jurkut-Rott）ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１４１５−１４１９（１９９４））、およびカリウムチャネル（ブラウネ（Broune）ら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．８：１３６−１４０（１９９４））の突然変異により起きることが知られている。ＢＬＡＳＴコンピュータープログラム（アルツチュル，エス・ジェイ（Altschul，S.J.）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９４）を用いて、３５６＜−＞４０１ａ．ａ．に１つのフィブロネクチンドメイン（ＣｘＶ．．．．ＹｘＣ）が見つかった。解析により、モチーフ（Ｓｘｘｘ（Ｉ，Ｌ）Ｅ）が、４６２、６７０、７０８、７１６、７３０、および１０７８に存在することが証明された。このモチーフをさらに、種々のタンパク質データベースで検索し、これが３回またはそれ以上存在することはあまりなかった。このモチーフは、例えばラットの軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質、ミオシン、ショウジョウバエ・セブンレス(drosophila sevenl ess)（４コピー）、ショウジョウバエ・プロスペロ(drosophila prospero)（４コピー）、およびショウジョウバエ・セレンディピティ(drosophila serendipit y)（３コピー）中に存在していた。後者の３つは、開発中の突然変異体である。セブンレス（ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）遺伝子は、目の疾患を引き起こし、プロスペロ（prospero）遺伝子は軸策の開通（axon pathfinding）における欠陥を引き起こし、セレンディピティ(serendipity)遺伝子は、小区画化の欠陥を引き起こす。従って、軸策経路作成の欠陥は、ＥＨＯＣ−１の表現型と相関すると仮定することが妥当である。７７７で始まる領域はまた、多剤耐性遺伝子およびショウジョウバエ・ルタバーガ(drosophila rutabaga)遺伝子とある程度の相同性を有する。ルタバーガ（rutabaga）遺伝子は、ショウジョウバエの学習に関係している。従って、本発明は、新規ＥＨＯＣ−１タンパク質をコードする単離された核酸を提供し、この核酸はヒト第２１染色体から、特にＰＭＥ、ＨＰＥ１、およびＡＰＥＣＥＤを引き起こす突然変異部位である、ｑ２３．２遺伝子座で得られる。この遺伝子にコードされるタンパク質は、複数の経膜的ドメインを有する。ＥＨＯＣ−１の約５ｋｂのｃＤＮＡクローン（ｃＤＦ９）の解析は、ｃＤＦ９は２３を超えるエキソンよりなることを示した。「核酸」（ポリヌクレオチドとも呼ぶ）という用語は、ＲＮＡならびに１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。本明細書において、「単離された」という用語は、自然には存在しない形であることを意味する。ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸を単離するための１つの方法は、当業者に公知の方法を用いて、天然のまたは人工的に作成したＤＮＡプローブで哺乳動物ゲノムライブラリーをプローブ探索することである。ＥＨＯＣ−１遺伝子由来のＤＮＡプローブは、この目的のために特に有用である。ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子は、以下に詳述される方法により、ヒト、哺乳動物、または他の動物から相補的なゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを得るために、またはｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのスクリーニングにより、関連するｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するために、使用される。核酸の例としては、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離されたゲノムＤＮＡがある。このような核酸は、配列番号：１または配列番号：６に記載のコード配列と実質的に同じコード配列を含有しても良い。本発明はまた、配列番号：１または配列番号：６に示す核酸とは異なるが、同じ表現型を有する（すなわち、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列であるタンパク質のすべてまたは断片をコードする）核酸も包含する。表現型が類似の核酸はまた、「機能的に同等の核酸」とも呼ぶ。本明細書において、「機能的に同等の核酸」という用語は、本明細書に開示の核酸と実質的に同じように機能して同じタンパク質生成物を産生する、小さなおよびあまり重要でない配列の変化を特徴とする核酸を包含する。特に、機能的に同等の核酸は、本明細書に開示のポリペプチドと同じであるか、または保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする。例えば、保存的変化には、非極性残基の別の非極性残基による置換、または荷電残基の類似の荷電残基による置換などがある。これらの変化は、タンパク質の三次構造を実質的に変化させない、当業者に公知の変化を含む。遺伝コードの縮重のために、特定のハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸に必ずしもハイブリダイズしない、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸も提供される。本発明のポリペプチドをコードする好適な核酸は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドよりなる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードする好適な核酸は、高厳密性条件下で、配列番号：１または配列番号：６に記載の核酸配列の全配列または実質的な部分（すなわち、典型的には１５〜３０ヌクレオチド）と、ハイブリダイズする。本明細書において、ハイブリダイゼーションの厳密性とは、ポリヌクレオチドハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、１９８９（参考のため本明細書に引用される）を参照）。また、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドである、本発明の核酸にコードされる単離されたペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質が提供される。ＥＨＯＣ −１ポリペプチドは、約１１９０アミノ酸の長さのタンパク質よりなる。ヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする完全なアミノ酸配列は、配列番号：２に示す。さらに、配列番号：６は、マウスＥＨＯＣ−１タンパク質の断片をコードする、２２９塩基対のマウスｃＤＮＡ配列を示す。本明細書において、「単離された」という用語は、未変性のインビボの環境に通常関係ある細胞性成分および／または汚染物質のないタンパク質分子を意味する。本発明のポリペプチドおよび／またはタンパク質には、天然に存在する任意のアレレ変種、並びにその組換え型がある。ＥＨＯＣ−１ポリペプチドは、当業者に公知の種々の方法を用いて単離することができる。本発明のタンパク質の単離と精製に利用できる方法には、沈降法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーがある。他の公知の方法は、ドイチャー(Deutscher)ら、タンパク質精製のガイド(Guide to Protein Purification)：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻、（アカデミックプレス(Academic Press)、１９９０）に記載されている（これは、参考のため本明細書に引用される）。あるいは、本発明の単離されたポリペプチドは、例えばサムブルーク（Sambrook）ら（前述、１９８９）に記載されているように公知の組換え法を用いて得られる。本発明のポリペプチドを調製する方法の例では、当該分野で公知の方法を用いて、適当な宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生類の細胞（すなわち、卵母細胞）、または哺乳動物細胞）中で、ＥＨＯＣ−１をコードする核酸を発現し、再び公知の方法を用いて、発現されたポリペプチドを回収する。本発明のポリペプチドは、発現ベクター（以下で詳述される）で形質転換した細胞から直接単離することができる。本発明のポリペプチド、その生物活性を有する断片、および機能性同等物もまた、化学合成により産生することができる。本明細書において「生物活性のある断片」とは、アセチルコリンにより活性化されるＣａ²⁺に透過性の陽イオン性チャネルに集合する、配列番号：２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドの任意の部分を意味する。合成ポリペプチドは、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems，Inc）モデル４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチド合成機（フォスターシティ、カリホルニア州）を用いて、製造業者に提供される試薬を使用して産生することができる。本明細書において「ＥＨＯＣ−１」という用語は、高度に疎水性の領域を含有する、天然物から精製したかまたは組換え法で発現／産生させた（すなわち、単離されたかまたは実質的に純粋な）タンパク質を意味し、ここで高度に疎水性の領域は、複数の経膜的タンパク質（一次転写体の別のスプライスにより産生されるｍＲＮＡによりコードされるナトリウムチャネル、カルシウムチャネルおよびカリウムチャネルタンパク質、およびその変種を含み、さらに前記性質の１つまたはそれ以上を含有するその断片を含有する）と相同性を有する膜にまたがる領域を予言する。本明細書において、「機能性ポリペプチド」という用語は、例えばリガンドの結合がＥＨＯＣ−１タンパク質の転写活性化を誘発することを意味する。さらに詳しくは、「機能性の本発明のポリペプチド」のアゴニスト活性化は、タンパク質がシグナルを出すことを誘発する。以下の用語を有する本発明の核酸、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾（「組換え法で発現／産生」、「単離された」、または「実質的に純粋」）は、ヒトの手によりそのような形で産生され、従ってその未変性のインビボの細胞環境から分離された、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を包含する。このヒトによる介入の結果、本発明の組換え核酸、ポリペプチドおよびタンパク質は、対応する天然に存在する分子が有用ではない方法（例えば、選択薬剤または化合物の同定）において有用である。「実質的な配列相同性」を有する配列とは、典型的には本発明の核酸と少なくとも約７５％、好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；および本発明のポリペプチドと少なくとも約７５％、好ましくは約８５％、さらに好ましくは約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。しかし、スプライス変種としてまたは保存的アミノ酸置換、もしくは縮重コドンの置換により修飾されていることにより、前記のレベルの相同性より低いポリペプチドまたは核酸もまた、本発明の範囲に包含されると考えられる。本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合した単離されたポリヌクレオチド、並びに他の制御配列を提供する。本明細書において、「機能的に結合」という用語は、ヌクレオチドの制御配列およびエフェクター配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位および他のシグナル配列）とのポリヌクレオチドの機能的関係を意味する。例えば、プロモーターへのポリヌクレオチドの機能的に結合とは、プロモーターを特異的に認識しプロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーターからＤＮＡの転写が開始されるように、ポリヌクレオチドとプロモーターの間の物理的および機能的関係を意味し、ここでプロモーターはポリヌクレオチドからＲＮＡの転写を指令する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に充分な特異的配列を含む。さらにプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始活性を調節する配列を含有する。そのような配列は、ｃｉｓ作用性であるか、またはｔｒａｎｓ作用性因子に応答性である。制御の性質に依存して、プロモーターは構成性であるかまたは制御性である。プロモーターの例には、ＳＰ６、Ｔ４、Ｔ７、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどがある。プロモーターと、ポリヌクレオチドが機能的に結合しているクローニング部位の両方を有するベクターは、当該分野で公知である。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、ストラタジーン（Stra tagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）やプロメガ (Promega)、マジソン、ウィスコンシン州）などから市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、余分の不適当な代替翻訳開始コドン、または転写または翻訳のレベルで発現を妨害または低下させる他の配列を除去することが必要なことがある。あるいは、開始コドンの５’のすぐ横に共通リボゾーム結合部位を挿入して、発現を増強することができる（例えば、コザック (Kozak)、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７（１９９１）を参照）。同様に、転写を増強するために、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドのコード配列の代わりに、同じアミノ酸をコードする代替コドンを置換することができる（例えば、宿主細胞のコドンの好みを採用、Ｇ−Ｃリッチなドメインの存在を低下させる、など）。また本発明の核酸よりなるベクターが提供される。ベクターの例には、バキュロウイルスやレトロウイルスのようなウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミドおよび当該分野で典型的に使用される他の組換えビヒクルがある。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いてベクターゲノムに挿入される。例えば、挿入体とベクターは、適当な条件下で制限酵素と接触されて、互いに対合でき、リガーゼと結合することができる各分子の相補端を作成することができる。あるいは、合成核酸リンカーは、制限ポリペプチドの末端に結合することができる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。さらに、停止コドンと適当な制限部位を含有するオリゴヌクレオチドを、例えば以下の一部またはすべてを含有するベクターへの挿入のために結合させることができる：哺乳動物細胞中での安定なまたは一過性のトランスフェクション体の選択のためのネオマイシン遺伝子のような選択性マーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写停止およびＲＮＡプロセシングシグナル；正しいエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製開始点およびＣｏｌＥ１；センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ＲＮＡプロモーター。他の手段は当該分野で公知である。さらに、細菌細胞、酵母細胞、両生類の細胞（すなわち、卵母細胞）、哺乳動物細胞および他の動物細胞中での発現に適した、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸よりなるベクターが提供される。ベクターはさらに、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸に対して発現を可能にするように位置する、細菌、酵母、両生類、哺乳動物、または動物細胞での発現に必要な制御成分を含有してもよい。本明細書において、「発現」という用語は、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を意味する。核酸がゲノムＤＮＡ由来の場合は、発現は、（適当な真核生物宿主が選択される場合）ｍＲＮＡをスプライスを含んでよい。発現に必要な制御成分には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、およびリボゾーム結合のための転写開始配列がある。例えば、細菌発現ベクターには、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、そして転写開始のためにシャイン・ダルガルノ配列（Shine-Dalgarno seq uence）や開始コドンＡＵＧがある（サムブルーク（Sambrook）ら、前述）。同様に、真核生物発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼIIのために異種または同族プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボゾームの脱着のための停止コドンがある。そのようなベクターは、市販されているかまたは当該分野で公知の方法に記載された配列により集合される（例えば、ベクター作成のために前記で一般的に記載した方法）。発現ベクターは、本発明のポリペプチドを発現する細胞を産生するのに有用である。本発明は、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドを組換え法で発現する形質転換された宿主細胞を提供する。形質転換された宿主細胞の例は、哺乳動物細胞での発現に適するようにしたプラスミドを含む哺乳動物細胞である。このプラスミドは、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸、および本発明のタンパク質の発現に必要な制御成分を含有する。種々の哺乳動物細胞が宿主として使用され、例えば、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｌｔｋ−細胞などがある。前記したような発現プラスミドは、当該分野で公知の方法（例えば、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、微量注入法またはリポフェクチン）により哺乳動物細胞をトランスフェクションするのに使用することができる。真核細胞表面で組換え法で発現されるＥＨＯＣ−１ポリペプチドは、少なくとも１つのＥＨＯＣ−１ポリペプチドを含有するか、または宿主細胞によりコードされるペプチドおよび／または異種核酸によりコードされるサブユニットの混合物を含有してもよい。本発明は、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸内に含有される配列と特異的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、例えば配列番号：１または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列内に含有されるコード配列を含んでなる核酸プローブを提供する。本明細書において「プローブ」という用語は、配列番号：１または配列番号：６に記載の少なくとも１５の隣接塩基を含有するヌクレオチドの配列を有する、１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブを作成するに好適な領域には、５’および／または３’コード配列、ＯＲＦ内の配列、経膜的ドメインをコードすることが予測される配列、細胞質性ループをコードすることが予測される配列、シグナル配列、リガンド結合部位などがある。ｃＤＮＡクローンの全長または断片はまた、関連遺伝子の検出と単離のためのプローブとしても使用できる。断片がプローブとして使用される時、好ましくはｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡのカルボキシ末端をコードする部分由来であり、好ましくはｃＤＮＡ配列の予測される経膜的ドメインをコードする部分を含むであろう。経膜的ドメイン領域は、カイトとドリトル（Kyte and Doolittle）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５（１９８２）の方法を用いて予測されるアミノ酸配列のヒドロパシー解析に基づき予測できるであろう（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５（１９８２）．別の態様において、ＥＨＯＣ−１ゲノムＤＮＡは、診断用プローブとして使用される。例えば、ＥＨＯＣ−１遺伝子のエキソン７の約２２塩基上流のゲノムイントロン配列中でＧ（グアニン）からＡ（アデノシン）への変換が起きることがわかっている。このＧからＡへの変換は、ＰＭＥ患者ではホモ接合性であると考えられる。すなわち、配列番号：５のヌクレオチド９４に対応するゲノムヌクレオチド位置でのそのような突然変異は、ＰＭＥ疾患に関連していると考えられる。配列番号：５のヌクレオチド１１７〜２６３のエキソン配列は、配列番号：１のヌクレオチド１１７６〜１３２２に対応する。すなわち、配列番号：５のヌクレオチド９４でのそのような変換を検出することができる配列番号：５由来の任意のプローブは、本明細書で使用されると考えられる。本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ポリヌクレオチドがそれに相補的な核酸の配列を認識して、相補的な塩基対間の水素結合を介して２重らせんセグメントを形成する能力を包含する。核酸プローブ技術は、当業者に公知であり、そのようなプローブは長さの変動が大きく、プローブの検出を促進するために検出可能な物質（例えば、放射線同位元素、蛍光色素など）で標識してもよいことは容易に理解できるであろう。本発明のプローブは、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸の存在を検出するのに有用である。例えば、このプローブは、本発明の遺伝子が発現される生物組織を見つけるために、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために使用することができる。さらに、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の核酸に相補的な合成されたオリゴヌクレオチドは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの相同性スクリーニングを用いて、または当該分野で公知の増幅法を用いて、本発明の遺伝子の検出、その関連ｍＲＮＡの検出、または関連遺伝子を単離するためのプローブとして有用である。また、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの任意の部分と特異的に結合して、ｍＲＮＡの翻訳を防ぐことができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＨＯＣ− １ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの配列の任意の部分と特異的に結合できる配列を有していてもよい。本明細書において、「特異的に結合する」という用語は、核酸配列が相補的な核酸配列を認識して、相補的な塩基対間の水素結合の形成を介して２重らせんセグメントを形成する能力、核酸配列の能力を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、ヌクレオチドの化学的類似体を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。細胞膜を通過して、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡと特異的に結合することにより、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの発現を低下させて、翻訳を防止するのに有効な量の前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過することができる許容される疎水性担体を含んでなる組成物も、本明細書において提供される。細胞膜を通過することができる許容される疎水性担体は、選択された細胞型に特異的な受容体に結合し、こうして選択された細胞型の細胞により摂取される構造を含有してもよい。この構造は、細胞型特異的受容体に結合することが知られているタンパク質の一部であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有用である。合成オリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス化学的構造は、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計され、組織試料または被験体中のＥＨＯＣ−１関連遺伝子の発現を阻害するための組成物として有用である。本発明は、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物（以後、ＳＡＯＣと呼ぶ）を用いて、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの発現レベルを調節する手段を提供する。ｍＲＮＡを認識しこれに選択的に結合するように設計される合成オリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス化学的構造は、配列番号：１または配列番号：６に示すヌクレオチド配列の部分に相補的であるように作製される。ＳＡＯＣは、注射で被験体に投与するために血流中で、または実験室の細胞培養条件で安定であるように設計される。ＳＡＯＣは、例えば、小さい疎水性ＳＡＯＣ化学構造を設計するか、またはＳＡＯＣを認識してこれを細胞内に輸送する細胞中の特異的な輸送系により、細胞膜を通過できるようにするＳＡＯＣの物理的および化学的性質により細胞の細胞質に入るために、細胞膜を通過できるように設計される。さらに、選択された細胞集団内でのみＳＡＯＣに結合しこれを摂取する特異的細胞摂取機構により認識されるように、ＳＡＯＣをターゲティングして、選択された細胞集団にのみ投与するように設計することができる。例えば、ＳＡＯＣは、ある型の細胞（前述）にのみ存在する受容体に結合するように設計してもよい。ＳＡＯＣはまた、配列番号：１または配列番号：６に示す配列内に含有される配列に対応する、標的ｍＲＮＡ配列を認識しこれに選択的に結合してターゲティングするように設計される。ＳＡＯＣは、標的ｍＲＮＡ配列に結合して、例えばＲＮａｓｅＩ消化によるｍＲＮＡの分解を誘発するか、または翻訳制御因子もしくはリボゾームの結合を妨害してｍＲＮＡ標的配列の翻訳を阻害するか、または他の化学的構造（例えば、リボザイム配列または標的ｍＲＮＡを分解するかまたは化学的に修飾する反応性化学基）を取り込むことにより、標的ｍＲＮＡ配列を不活性化するように設計される。ＳＡＯＣは、ｍＲＮＡ標的に向けられた時、このような性質を示すことができることが証明されている（コーエン（Cohen）ら、ＴＩＰＳ，１０：４３５（１９８９）、およびウェイントラウプ（Weintraub）、Ｓｃｉ．Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｊａｎｕａｒｙ（１９９０）、ｐｐ．４０（いずれも参考のため本明細書に引用される）を参照）。本発明はまた、許容される担体、および任意の単離され精製されたＥＨＯＣ− １ポリペプチド、その活性断片、または精製された成熟タンパク質およびその活性断片を、単独または互いに組合せて含有する組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換え法により得られるか、化学合成されるか、または天然の供給源から精製することができる。本明細書において「許容される担体」という用語は、任意の薬剤学的担体（例えばリン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、および油／水または水／油のようなエマルジョン、および種々の型の湿潤剤）を包含する。さらに、本発明のＥＨＯＣ−１ポリペプチドとの特異的反応性を有する抗体が提供される。抗体の活性断片は、「抗体」の定義の中に包含される。本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、タンパク質またはこれらの部分を抗原として用いて、公知の方法により産生することができる。例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当該分野で公知の方法、例えばハーローとレーン(Harlow and Lane)、「抗体：実験室マニュアル」(Antibodies: A Labo ratory Manual)（コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbo r Laboratory)１９８８）（参考のため本明細書に引用される）に記載の方法により産生することができる。本発明のポリペプチドは、このような抗体を作成するための免疫原として使用することができる。あるいは、（市販の合成機を用いて）合成ペプチドを調製し、免疫原として使用することができる。アミノ酸配列は、当該分野で公知の方法により解析して、これらが対応するポリペプチドの疎水性または親水性ドメインをコードするか否かを決定することができる。キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ−移植抗体または二官能性抗体のような改変抗体は、当該分野で公知の方法により産生することもできる。このような抗体はまた、ハーローとレーン(Harlow and Lane)（前述）に記載のハイブリドーマ、化学合成または組換え法により産生することもできる。抗−ペプチドや抗−融合蛋白抗体の両方が使用できる（例えば、バホウス(Bahouth)ら、ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：３３８（１９９１）；アウスベル(Ausubel)ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley and Sons)、ニューヨーク、１９８９）（参考のため本明細書に引用される）を参照）。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドを単離するのに使用することもできる。さらにこの抗体は、本発明のポリペプチドの存在の検出、並びに染色体の局在および構造ドメインや機能性ドメインの解析に、有用である。細胞の表面のＥＨＯＣ−１ポリペプチドの存在の検出方法は、抗体がポリペプチドに結合することを可能にする条件下で、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体に細胞を接触させ、細胞に結合した抗体の存在を検出し、そしてこうして細胞表面上の本発明のポリペプチドの存在を検出する、ことよりなる。このようなポリペプチドの検出において、抗体は、インビトロの診断またはインビボのイメージング法のために使用できる。試料中の標的ＥＨＯＣ−１ポリペプチドのインビトロ検出に有用な免疫学的方法には、検出可能な抗体を用いる免疫測定法がある。このような免疫測定法には、例えば当該分野で公知の、ＥＬＩＳＡ、パンデックス（Pandex）微量蛍光法、凝集測定法、フローサイトメトリー、血清診断法および免疫組織染色法がある。抗体は、当該分野で公知の種々の方法により、検出可能にすることができる。例えば、検出可能なマーカーは、直接または間接に抗体に結合させることができる。有用なマーカーには、例えば放射性核種、酵素、蛍光物質、発色原および化学発光標識物がある。さらに、本発明の抗体は、生きている動物、ヒト、またはこれらから単離される生物学的組織または体液中の、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの活性を調節するのに使用することができる。従って、担体と、本発明のポリペプチドへの天然に存在するリガンドの結合を阻止するのに有効な量の、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドに対する特異性を有する抗体を含んでなる組成物。細胞表面上のＥＨＯＣ−１ポリペプチド分子のエピトープに対するものであり、配列番号：２に示すＥＨＯＣ− １ポリペプチドの細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体は、この目的のために有用である。本発明はさらに、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドコードする核酸を発現することができる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。また本発明は、正常な活性を示すことができない（すなわち、未変性のＥＨＯＣ−１を発現しない）ように突然変異させた、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸を発現することができるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本発明はまた、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡ（これは、ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる）に転写されるように位置しており、従ってその翻訳を低下させる、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。この核酸はさらに、誘導性プロモーターおよび／または組織特異的制御成分よりなり、その結果発現が誘導され特定の型の細胞に限定される。核酸の例には、配列番号：１または配列番号：６に示すコード配列と実質的に同じコード配列を有するＤＮＡまたはｃＤＮＡがある。トランスジェニック非ヒト哺乳動物の例には、トランスジェニックマウスがある。組織特異性決定成分の例は、メタロチオネインプロモーターおよびＬ７プロモーターである。種々の方法を用いてＥＨＯＣ−１ポリペプチドの発現が改変されているトランスジェニック動物を作成することにより、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの生理学的および行動的役割を明らかにする動物モデルの系が、作成される。そのような方法の例には、微量注入法、レトロウイルス感染、または当業者に公知の他の方法による、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする正常なまたは突然変異した核酸を、適当な受精した胚に挿入してトランスジェニック動物を作成する方法がある。（例えば、ホーガン(Hogan)ら、「マウス胚の操作：実験室マニュアル」（Manipulating the Mouse Embryo: A Labtoraory Manual）（コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、１９８６）を参照）。もう１つの方法には、これらの遺伝子の突然変異型または正常な型を、トランスジェニック動物の未変性の遺伝子座と相同的組換えを行う方法があり、これは、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの発現または構造の制御を改変するために使用される（例えば、カペッチ（Capecchi）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８（１９８９）；チマー（Zimmer）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３８：１５０（１９８９）を参照；これらは参考のため本明細書に引用される）。相同的組換え法は、当該分野で公知である。相同的組換え法では、未変性の（内因性）遺伝子を組換えまたは突然変異遺伝子で置換して、未変性の（内因性）タンパク質を発現することができないが、例えばＥＨＯＣ−１ポリペプチドの改変発現を引き起こす突然変異タンパク質を発現する動物を産生する。相同的組換え法に対して、微量注入法は宿主遺伝子を除去することなく宿主ゲノムに遺伝子を付加する。微量注入法は、内因性および外因性ＥＨＯＣ−１タンパク質の両方を発現することができるトランスジェニック動物を産生する。誘導性プロモーターを核酸のコード配列に結合させて、トランス遺伝子(transgene)の発現を制御する手段を提供することができる。組織特異的制御成分は、コード領域に結合させて、トランス遺伝子(tra nsgene)の組織特異的発現を可能にする。トランスジェニック動物モデル系は、特異的リガンド（すなわち、タンパク質応答を活性化または阻害するアゴニストやアンタゴニスト）の同定のための化合物のインビボスクリーニングに有用である。本発明の核酸、オリゴヌクレオチド（アンチセンスを含む）、これらを含有するベクター、形質転換された宿主細胞、ポリペプチドおよびこれらの組合せ、並びに本発明の抗体は、インビトロで化合物をスクリーニングするのに使用して、化合物が本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかどうかを決定することができる。これらのインビトロのスクリーニング測定法は、本発明のポリペプチドの機能と活性に関する情報を提供し、１つまたはそれ以上の型のポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質と特異的に相互作用することができる化合物の同定や設計を可能にする。本発明のさらに別の態様において、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドに結合する化合物の同定方法が提供される。本発明のタンパク質は、競合的結合測定法に使用することができる。このような測定法は、多量の化合物を迅速にスクリーニングして、どの化合物（もしあれば）がＥＨＯＣ−１タンパク質に結合できるかを決定することを可能にする。次に、結合することがわかった化合物について、より詳細な測定法を行い、そのような化合物が、本発明の調節物質、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか否かを決定することができる。本発明の別の態様において、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための生物測定法が提供される。この方法では、本発明のポリペプチドを、「未知」すなわち試験物質（アンタゴニスト活性を試験する場合は、レポーター遺伝子作製体の存在下で）と接触させて、「未知」すなわち試験物質との接触後、ポリペプチドの活性を追跡し、レポーター遺伝子作製体を発現させる物質が、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの機能性リガンドとして同定される。本発明の別の態様において、組換え法で本発明のポリペプチドを発現する形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させて、次にその調節活性を、試験化合物の存在下および非存在下で（レポーター遺伝子発現を介して）ＥＨＯＣ−１−介在応答を比較するか、または化合物の存在に対する試験細胞または対照細胞（すなわち、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドを発現しない細胞）の応答を比較することにより、評価することができる。本明細書において、本発明のポリペプチドの「活性を調節する」化合物またはシグナルとは、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの活性を変化させて、その結果本発明のポリペプチドの活性は、その化合物またはシグナルの存在下では、その化合物またはシグナルの非存在下の活性とは異なるような、化合物またはシグナルを意味する。特に、そのような化合物またはシグナルには、アゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。アゴニストは、ＥＨＯＣ−１タンパク質発現を活性化する化合物またはシグナルを包含する。また、アンタゴニストは、ＥＨＯＣ−１タンパク質発現を妨害する化合物またはシグナルを包含する。典型的には、アンタゴニストの作用は、アゴニスト誘導性のタンパク質活性化の阻止として観察される。アンタゴニストには、競合的アンタゴニストおよび非競合的アンタゴニストがある。競合的アンタゴニスト（すなわち、競合的ブロッカー）は、アゴニスト結合に特異的な部位またはその近傍と相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用することにより、ポリペプチドの機能を不活性化する。当業者により理解されるように、ＥＨＯＣ−１活性を調節する化合物を同定する測定法は、対照との比較を必要とする。１つの型の「対照」は、化合物に接触させた試験細胞または試験培養物と実質的に同様に処理されるが、「対照」細胞または培養物は化合物に接触させていない点が異なる。例えば、電圧固定(volta ge clamp)電気生理学的方法では、同じ細胞を単に細胞を浸す外部溶液を変えることにより、化合物の存在下または非存在下で試験することができる。別の型の「対照」は、トランスフェクションされた細胞と同一の細胞または培養物であり、「対照」細胞または培養物は未変性のタンパク質を発現しない点が異なる。従って、化合物に対するトランスフェクションされた細胞の応答を、同じ反応条件下で、同じ化合物に対する「対照」細胞または培養物の応答（または、応答の欠如）と比較する。本発明のさらに別の態様において、ＥＨＯＣ−１ポリペプチドの活性化は、上記の生物測定法により同定される少なくとも１つの化合物の有効量に、ポリペプチドを接触させることにより調節することができる。本発明を以下の非限定例に関してさらに詳細に説明する。例１ＢＡＣＣｏｎｔｉｇの作製全ヒトゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーの作製は、シズヤ(Shizuya)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：８７９４−８７９７（１９９２）に記載のように行なった。ＢＡＣクローンは、ＳＴＳを用いるＰＣＲによりスクリーニングした（ＰＦＫＬ、Ｄ２１Ｓ２５、Ｄ２１Ｓ１５４、ＣＤ１８）。これらのＢＡＣクローンの遺伝子座は、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより確認した。ＢＡＣクローンの挿入体のサイズは、ＤＮＡをＮｏｔＩで消化後パルスフィールドゲル電気泳動により測定した。例２直接ｃＤＮＡ選択直接選択方法は、モルガン（Morgan）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２０：５１７３−５１７９（１９９２）に記載の方法を若干修飾した。ＴＲＩｒｅｇｉｏｎ（登録商標）（モレキュラーリサーチセンター社(Molecular Research Center，Inc.)）を用いて、１４週令のトリソミー２１の胎児脳から単離した。ポリ（Ａ）クイック（Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｃｋ）（登録商標）ｍＲＮＡ単離キット（ストラタジーン（STRATAGENE））を用いて、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを単離した。１μｇのオリゴ（ｄＴ）₁₅または０．１μｇのランダムヘキサマーを用いて、５μｇのトリソミー２１の胎児脳ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから、スーパースクリプト（登録商標）チョイスシステム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM ＣｈｏｉｃｅＳｙｓｔｅｍ）（ギブコ・ビーアールエル(GIBCO BRL)）を用いて、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。全合成反応物は、ジーンクリーン（登録商標）II（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ^TMII）キット（バイオ１０１社(BIO101,Inc.)）により精製し、次にキナーゼで処理した。Ｓａｕ３ＡＩリンカーをｃＤＮＡに結合させ、これを次にＳａｕ３ＡＩで消化した。ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）を用いて反応物を精製した。ＭｂｏＩリンカーをｃＤＮＡに結合させ、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）を用いて反応物を精製した（モルガン（Morgan ）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２０：５１７３−５１７９（１９９２））。合成した生成物を、１本鎖のＭｂｏＩリンカー（５’ＣＣＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣ３’）（配列番号：３）をプライマーとして用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲサイクル条件は、４０サイクルの９４℃／１５秒、６０℃／２３秒、７２℃／２分を、１００μｌの１×ＰＣＲ緩衝液（プロメガ (Promega)）、３ｍＭＭｇＣｌ₂、５．０単位のＴａｑポリメラーゼ（プロメガ (Promega)）、２μＭのプライマーおよび０．２ｍＭのｄＮＴＰ中で行なった。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プラスミドキットを用いて５つのＢＡＣＤＮＡ（総量２．５μｇ）を調製し、ニックトランスレーション（ＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）キットとビオチン−１６−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム(B oehringer-Mannheim)）を用いてビオチン化した。熱変性したＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの３μｇを、１００μｇのハイブリダイゼーション緩衝液（７５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、５ｍＭＥＤＴＡ、５ ×デンハルツ（Denhardt's）、０．０５％ＳＤＳ、および５０％ホルムアミド）中の熱変性ＣＯＴ１ＤＮＡ（ＢＲＬ）３μｇと、４２℃で２時間アニーリングさせた。プレハイブリダイゼーション後、１．２μｇの熱変性ビオチン化ＢＡＣＤＮＡを加え、４２℃で１６時間インキュベートした。ｃＤＮＡ−ＢＡＣＤＮＡハイブリッドを、ＥｔＯＨで沈殿させ、６０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡに溶解した。４０μｌの５ＭＮａＣｌを添加後、ＤＮＡを磁性ビーズ（ダイナビーズ(Dynabeads)Ｍ−２８０，ダイナル（Ｄｙｎａｌ））と、２５℃で１時間静かに回転させてインキュベートして、ＤＮＡを磁性ビーズに結合させた。次にビーズを、４００μｌの２×ＳＳＣにピペットでとり、磁石ホルダー（ＭＰＣ−Ｅ_TM、ダイナル（Ｄｙｎａｌ））に３０秒間セットし、上清を除去することにより２回洗浄した。０．２×ＳＳＣ中で６８℃で１０秒間の洗浄をさらに４回行い、各洗浄でビーズを新しい試験管に移した。１００μｌの蒸留水中で８０℃で１０分間時々混合して、ｃＤＮＡを溶出した。溶出したｃＤＮＡを前述のＰＣＲで増幅した。磁性ビーズを用いる選択を２回繰り返した後、増幅したｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII にサブクローニングした。例３サザンブロット解析１×ＴＢＥ中０．８％アガロースゲルで、ＤＮＡのゲル電気泳動を行なった。ナイボンド（Ｎｙｂｏｎｄ）Ｎ＋膜（アマシャム（Amersham））への核酸の移動は、製造業者の説明書に従って行なった。プローブを、ラッドプライム・ラベリング・システム（RadPrime Labeling System）（ＢＲＬ）を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で、４２℃で１６時間行なった。フィルターを、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温で２０分間洗浄し、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で２０分間洗浄した。ブロットをＸ線フィルムに露光させた（コダック(Kodak)、Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲ）。例４ｃＤＮＡライブラリースクリーニング単方向ｃＤＮＡライブラリーを産生するＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット（ストラタジーン（STRATAGENE））を用いて、トリソミー２１胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを作製した。簡単に説明すると、５−メチルｄＣＴＰとのハイブリッドオリゴ（ｄＴ）−ＸｈｏＩリンカープライマーを用いて、５μｇのトリソミー２１の胎児脳ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡから、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＥｃｏＲＩリンカーをｃＤＮＡに結合させ、これを次にＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、次にＵＮＩ−ＺＡＰＸＲベクターにクローン化した。ライブラリーをギガパック（登録商標）IIゴールド（Gigapack II Gold）パッケージング抽出物を用いて、ライブラリーをパッケージングした。元々のライブラリーの力価は、１．１ ×１０⁶ p.f.u．／パッケージであった。ライブラリーを１回増幅した。ブルー −ホワイト（blue-white）発色測定法は、クローンの９９％が挿入体を有することを示した。１４クローンから計算した挿入体の平均サイズは１．９ｋｂであった。選択されたｃＤＮＡ断片を用いて、トリソミー２１胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行なった。ファージを、平均密度１×１０⁵／１７５ｃｍ² プレートで塗布した。２重測定のナイロン膜（ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ＋膜（アマシャム（Amersham））を用いて、２０プレート（２×１０⁶ファージ）のファージを取り上げた。ハイブリダイズした膜を、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＤＳの最終厳密度で洗浄した。フィルターを一晩Ｘ線フィルムに露光させた。さらに解析するために、Ｍ１３介在切り出しにより、ファージをプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）にサブクローニングした。例５ノーザンブロット解析ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、ベクターからｃＤＮＡ挿入体を切り出した。ランダムプライム法により標識後、断片をマルチプル組織ノーザンブロット(M ultiple Tissue Northern Blot)（クロンテック（Clontech））を用いて、ノーザンハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。例６中期の調製ＢｒｄＵブロック（ザベル（Zabel）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：６９３２−６９３６（１９８３））を若干修飾して、染色体を調製した。簡単に説明すると、ヒト末梢リンパ球を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、１５％胎児牛血清、ペニシリン（１００単位/ ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）および０．０２％植物性血球凝集素を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ・ビーアールエル(GIBCO BRL)、ゲイサーズバーグ（Gai thersburg）、メリーランド州）中で３７℃で７２時間増殖させた。５−ブロモ −デオキシウリジン（０．８ｍｇ／ｍｌ）を１６時間加えて、細胞をＳ期でブロックした。細胞をＨＢＳＳ（ハンクス塩溶液）（ギブコ・ビーアールエル(GIBCO BRL)、ゲイサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）で洗浄して、同期物質を除去し、２．５μｇ／ｍｌチミジンを補足した培地でさらに５〜６時間インキュベートして遊離させた。０．１μｇ／ｍｌのコルセミド（colcemid）を１０分間加え、次に０．０７５ＭのＫＣｌ低張溶液を３７℃で１５分間加えて培養物を採取し、次にメタノールと酢酸の３：１混合物で１〜５分間固定した。例７高品質染色体調製物高品質染色体調製物を得るために、アルコールで洗浄したスライドに懸濁液１滴を落とし、均等で平らに、細胞質が全く入らないように広げて、中期スプレッドを調製した。次にスライドを、お湯を満たした容器の上に、周囲湿度で２０〜６０秒間置いた。まず位相差顕微鏡下で数枚のスライドをチェックして、最適条件を決定した。最適の結果を得るために、スライドを室温で少なくとも２〜３週間エージングした後、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行なった。スライドはエージング後−７０℃で保存するのが最も良い。変性の前日に、スライドを−７０℃から取り出し、一晩４℃に保存した。次にスライドを室温で１〜２時間放置した後、５５〜６０℃で一晩焼き、次に７０％ホルムアミドで変性させた（６６〜７０℃）。最適の結果を得るために、新鮮なスライドを６６℃で変性させた。例８小ＤＮＡプローブをマッピングするためのプローブ断片のサイズニックトランスレーションで標識されるプローブの断片サイズは、好ましくは約１００〜２００塩基対であり、ハイブリダイゼーション混合物中のプローブＤＮＡの濃度は、好ましくは２０〜４０ｎｇ／μｌ（すなわち、２００〜４００ｎｇ／スライド）である。この濃度は、非特異結合を増加させるが、一般的に良好なシグナル／ノイズ比を与える。繰り返し配列の非特異的バックグランドハイブリダイゼーションを減少させるために、少量のＣｏｔＩＤＮＡをｃＤＮＡプローブとともに使用することができる（すなわち、２００〜４００ｎｇのプローブＤＮＡとともに１〜３μｇのＣｏｔＩ）。例９プローブのビオチン化ニックトランスレーション（ギブコ・ビーアールエル(GIBCO BRL)）により、ＤＮＡプローブを、ビオチン−１４−ｄＡＴＰで標識した。取り込まれなかったヌクレオチドを、クロマトグラフィー（セファデックスＧ−５０）により分離した。すべてＤＮＡプローブの平均断片サイズを、約２００塩基対（１００〜６００塩基対の範囲）（非変性アガロースゲルで測定した）とした。例１０ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション小ＤＮＡプローブを有する単一コピー配列を特異的にハイブリダイゼーションするために、リヒター（Lichter）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：６４−６９（１９９０）のＦＩＳＨ方法を修飾した。使用の１年以上前に作成したスライドは、ＲＮａｓｅ処理は不要である。必要な場合は、ＲＮａｓｅ処理は、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを３７℃で２０分間スライド上に置き、次に７０％、９０％および１００％の冷エタノールのシリーズで脱水して行なった。スライドの変性は、６７〜７０℃で７０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で１〜２分間（新鮮な染色体調製物は短い時間が必要である）行なった。３μｇのＣｏｔ１ＤＮＡと７μｇの超音波処理サケ精子ＤＮＡとともにビオチン化プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（１０μｌ）を、各スライドの上に置いた（プローブ：Ｃｏｔ１ＤＮＡの比は１：１５−３０；全ＤＮＡ濃度１μｇ／μｌ）。次にカバーグラスを乗せ、ゴムセメントで密封し、次に加湿チャンバー中で３７℃で一晩インキュベートした。例１１免疫蛍光法によるプローブシグナルの検出スライドを一晩ハイブリダイゼーションした後、５０％ホルムアミド（ｖ／ｖ）／２×ＳＳＣ（４×５分間）中で４４℃で、次に２×ＳＳＣで５０〜６０℃（３×５分間）で洗浄した。小さいプローブ（挿入体サイズ＜１．５ｋｂ）については、洗浄時間は短かった（３×２分間）。小プローブにより産生される蛍光シグナルの強度を上げるために、ハイブリダイゼーション後の洗浄の厳密性を下げることが必要である（２×ＳＳＣ、４５〜５０℃）。次にスライドを、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．１％ツイーン２０含有４×ＳＳＣ１００μｌで３７℃で１０〜２０分間インキュベートしてブロックした。次に緩衝液を、ＦＩＴＣ−アビジン（４×ＳＳＣ／１％ＢＳＡ／０．１％ツイーン２０中０．５μ ｇ／ｍｌ）で、３７℃で３０分間置換した。２×ＳＳＣ／０．１％ツイーン２０中で４５℃で５分間の洗浄を３回行なった後、ビオチン化ヤギ抗−アビジン抗体層（５μｇ／ｍｌ）を添加して、ハイブリダイゼーションシグナルを３７℃で３０分間増幅させた。スライドを、５％ヤギ血清／２×ＳＳＣ／３％ＢＳＡ／０．１％ツイーン２０中で１０〜２０分間プレインキュベート後、増幅工程で免疫学的非特異結合を減少させた。洗浄後、ＦＩＴＣ−アビジンの第２の層を、前記のようにスライドに加えた。ハイブリダイゼーションシグナルの強度を上げるために、必要に応じて２回目の増幅を行ってもよい。次にスライドを、２×ＳＳＣ／０．１％ツイーン２０で４５℃で洗浄して、簡単に水を切る。例１２染色体Ｒ分染法染色体バンドと蛍光シグナルを同時に見るために、色素クロモマイシン(chrom omycin)Ａ３とジスタマイシン（dystamycin）Ａを逆染色として用いた（シュバイツアー(Schweizer)、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ５８：３０７−３２４（１９７６）；シュバイツアー(Schweizer)ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ５７：１ −１４（１９８１）；マゲニス(Magenis)ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ６９：３００−３０３（１９８５））。最後の検出の直後に、スライドをマキラバン(McIla vane's)緩衝液（ｐＨ８．５〜９．０）（シュバイツアー(Schweizer)ら、前述）（蒸留水で１：１に希釈）で洗浄後、染色した。次に、１００μｌのクロモマイシン(chromomycin)Ａ３（１／２マキラバン(McIlavane's)緩衝液（ｐＨ８．５〜９．０）中０．５ｍｇ／ｍｌ）を、スライドの上に乗せ１０分間〜１時間、室温で暗所に入れた。必要な染色時間は、スライドの新鮮さに依存し、新鮮なスライドは長い染色時間が必要であり、古いスライドはわずか１０分間の染色でよい。第１回の染色後、スライドを１／２マキラバン(McIlavane's)緩衝液で１分間洗浄し、過剰の液体を振って除去した。次に、スライドの上に５０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌジスタマイシンＡを乗せて、室温で１〜２分間インキュベートして染色して、次に前記のように洗浄した。この段階で、小さい挿入体を有するＤＮＡプローブ（例えば、弱いシグナルを生じると予測される）を用いるなら、リン酸緩衝液中にｐ−フェニレンジアミンを含有する抗−褪色緩衝液の薄い層を乗せることができる（ジョンソン(Johnson )ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４３：３４９−３５０（１９８１））。２回のクロモマイシンＡ３とジスタマイシンＡ染色により、最大の分染の分解能と最小の褪色が得られる。さらに、検出工程の直後（２〜３日以内）にスライドを染色すると最適の分染結果が得られる。染色直後、すなわち小さいプローブ（１．０ｋｂ〜２．５ｋｂ）については３日以内、大きなプローブ（＞２．５〜３ｋｂ）については１〜２週間以内に、スライドを顕微鏡観察するのが良い。蛍光顕微鏡でスライドを観察する前に、軽い逆染色を行えば良い。実際、この分染法の利点は、必要であれば染色体を明るくするために、ハイブリダイゼーション後のどの時点でも逆染色工程を繰り返すことができることである。さらに、像をとらえた後、コンピューターシステムを用いて、バンドパターンを選択的に漂白して、より明瞭にＦＩＴＣハイブリダイゼーションシグナルを見ることができる。例１３顕微鏡と写真ツアイスアクシオフォト（Zeiss Axiophot）１００またはアクシオベルト（Ax iovert）１３５蛍光顕微鏡（ツアイス社(Zeiss，Inc.)、ソーンウッド(Thornwoo d)、ニューヨーク）を用いて、スライドを観察した。ＦＩＴＣとクロモマイシンＡ３は両方とも、４００〜４９０ｎｍバンドパスエキサイター(band pass excit er)、４６０ｎｍダイクロイック（dichloic）、および４７０ｎｍバリアー（ツアイスフィルターセット＃５）を用いて励起する。ハイブリダイズしたセグメントは、明るい青緑色または明るい黄緑色の点として現れ、染色体バンドの残りの部分は、薄暗い緑色として現れる。コダックテクニカルパン(Kodak Technical p an)（ＡＳＡ１００）フィルムを用いて、白黒写真を撮った。カラー画像は、冷却したＣＣＤカメラ（フォトメトリクス（Photometrics）ＣＨ２５０、フォトメトリクス社(Photometrics Ltd.)、ツーソン、アリゾナ州）により、ＢＤＳ（バイオロジカル・デテクション・システムズ(Biological Detection Systems)、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）イメージングソフトウェアを用いてとらえた。本発明を好適な態様に関して詳述したが、本明細書に記載の請求の範囲の精神や範囲を逸脱することなく、修飾や変更が可能であることは理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードする、単離された核酸。２．核酸はＤＮＡを含んでなる、請求項１記載の単離された核酸。３．ＤＮＡはｃＤＮＡである、請求項２記載のＤＮＡ。４．ＤＮＡは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項２記載のＤＮＡ。５．ＤＮＡは、高厳密性条件下で配列番号：１または配列番号：６に記載の実質的に全てのコード配列（ヌクレオチド１３８〜３７１０）にハイブリダイズする、請求項２記載のＤＮＡ。６．ＤＮＡは、配列番号：１または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する、請求項２記載のＤＮＡ。７．請求項２記載のＤＮＡを含んでなるベクター。８．細胞は原核細胞または真核細胞である、請求項７記載のベクターを含有する宿主細胞。９．細胞は機能性ＥＨＯＣ−１タンパク質を発現する、請求項８記載の宿主細胞。 10．配列番号：１または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列の核酸の配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５ヌクレオチドを含んでなる核酸プローブ。 11．プローブは検出可能なマーカーで標識される、請求項１０記載の核酸プローブ。 12．複数のプローブを含んでなる、遺伝子座ｑ２２．３で第２１染色体の突然変異および異数性を検出するためのキットであって、各プローブは、配列番号：１または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列の核酸の配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５塩基対の隣接ヌクレオチドを有する核酸配列を含んでなり、各プローブは、染色体２１ｑ２２．３上の特異的遺伝子座に対応する、上記キット。 13．請求項２記載のＤＮＡに相補的な単離されたｍＲＮＡ。 14．ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合している、請求項２記載の核酸の化学的類似体を含んでなるオリゴヌクレオチド組成物。 15．請求項１３記載のｍＲＮＡに特異的に結合することができ、その翻訳を調節することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。 16．単離されたＥＨＯＣ−１ポリペプチドおよびその機能性同等物。 17．ポリペプチドは、配列番号：２に記載のものと実質的に同じアミノ酸配列を有する、請求項１６記載の単離されたＥＨＯＣ−１ポリペプチド。 18．ポリペプチドは、配列番号：２に記載のものと同じアミノ酸配列を有する、請求項１６記載の単離されたＥＨＯＣ−１ポリペプチド。 19．ポリペプチドは、配列番号：１または配列番号：６に記載のものと実質的に同じヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１６記載の単離されたＥＨＯＣ−１ポリペプチド。 20．ポリペプチドは、配列番号：１または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１６記載の単離されたＥＨＯＣ−１ポリペプチド。 21．組換え法で宿主細胞中で発現されるＥＨＯＣ−１ポリペプチド。 22．ポリペプチドは、配列番号：１または配列番号：６に記載のものと実質的に同じヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２１記載のＥＨＯＣ−１ポリペプチド。 23．ポリペプチドは、配列番号：１または配列番号：６に記載のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２１記載のＥＨＯＣ−１ポリペプチド。 24．ヒトＥＨＯＣ−１タンパク質上の抗原決定基に特異的に結合する抗体またはその活性断片。 25．抗体はモノクローナル抗体である、請求項２４記載の抗体。 26．抗体はポリクローナル抗体である、請求項２４記載の抗体。 27．ヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドの発現を調節するのに有効な量の請求項１３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過することができる許容される疎水性担体を含んでなる組成物。 28．オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活性化する物質に結合している、請求項２７記載の組成物。 29．物質はリボザイムである、請求項２８記載の組成物。 30．ヒトＥＨＯＣ−１受容体に対する天然に存在するリガンドへの結合を阻止するのに有効な量の請求項２４記載の抗体と、許容される担体を含んでなる組成物。 31．ヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 32．ポリペプチドをコードするＤＮＡは、正常ポリペプチド活性を示すことができないように突然変異され、発現されたポリペプチドは未変性のＥＨＯＣ−１ポリペプチドではない、請求項３１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 33．アンチセンスＤＮＡは、ヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写される、そのゲノムが、ヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡを含んでなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 34．ＤＮＡは誘導性プロモーターに機能的に結合している、請求項３１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 35．ＤＮＡは組織特異的制御成分に機能的に結合している、請求項３１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 36．トランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである、請求項３１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 37．ヒトＥＨＯＣ−１タンパク質をコードする核酸の同定方法であって、核酸を含有する試料に請求項１１記載のプローブを接触させ、ここで、接触は高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で行われる、これにハイブリダイズする化合物を同定することからなる、上記方法。 38．請求項９記載の細胞に化合物を接触させ、これに結合する化合物を同定することからなる、ヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドに結合する化合物の同定方法。 39．細胞表面上のヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドの存在の検出方法であって、試験細胞に請求項２４記載の抗体を接触させ、抗体−受容体複合体の存在を検出し、そして細胞表面上のヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドの存在を検出することからなる、上記方法。 40．特異的なヒトＥＨＯＣ−１ポリペプチドアレルの発現に関連する疾患への罹り易さを診断する方法であって、該方法は、核酸を含有する試料に複数のプローブを接触させることからなり、各プローブは、配列番号：１または配列番号：６記載のヌクレオチド配列の核酸の配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５塩基対の隣接ヌクレオチドを有する核酸配列を含んでなり、各プローブは染色体２１ｑ２２．３上の特異的遺伝子座に対応する、上記方法。 41．疾患は、進行性ミオクローヌスてんかん、全前脳症、または自己免疫多腺性疾患から選択される、請求項４０記載の方法。 42．遺伝子の発現を調節する組成物を投与することからなる、特定の疾患に関連した症状の発生を検出する方法。 43．ヒト染色体座２１ｑ２２．３に変化を導入する方法であって、進行性ミオクローヌスてんかんを有する被験体から得られた細胞の試料を、選択性マーカー遺伝子とともに請求項１記載の核酸で形質転換し；選択培地で細胞を維持し；そして、修飾された標的配列を含有する生存細胞を単離する、ことからなる上記方法。 44．野生型ＥＨＯＣ−１遺伝子またはその機能性断片を、発現されるように細胞内に導入することからなる、ＥＨＯＣ−１遺伝子内で突然変異／異数性を有する該細胞に野生型ＥＨＯＣ−１遺伝子機能を付与する方法。 45．プライマーは、配列番号：１、配列番号：５または配列番号：６に記載の核酸配列から得られた核酸配列を含んでなる、進行性ミオクローヌスてんかんの増幅診断のための１本鎖ＤＮＡプライマー。 46．任意のＢＡＣクローン中に含有される遺伝子内の変種ヌクレオチド配列の有無を測定することからなる、核酸試料中の１つまたはそれ以上のＥＨＯＣ−１アレルの検出方法。