JPH0975080A

JPH0975080A - 新規ｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JPH0975080A
Application number: JP7262246A
Authority: JP
Inventors: Yasukazu Tanuma; 靖一田沼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-09-14
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 1997-03-25

Abstract

(57)【要約】【解決手段】ＨＩＶプロモーターに選択的に結合する
新規ＤＮＡポリメラーゼ。該酵素をコードするＤＮＡ、
該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクター
で形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養すること
による該酵素の製法、及び該酵素に親和性を示す抗体。【効果】本発明のＤＮＡポリメラーゼ、該酵素をコー
ドするＤＮＡ及び該酵素の抗体は、癌やウィルス感染症
等の診断、予防及び治療に利用できる点で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト後天性免疫不
全症候群ウイルス（以下、ＨＩＶと称する）プロモータ
ーに結合する新規ＤＮＡポリメラーゼに関する。詳細に
は、ＨＩＶプロモーター中に存在する特定の塩基配列に
選択的に結合する新規ＤＮＡポリメラーゼに関する。ま
た本発明は、該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、
該組換えベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細
胞を培養することによる該ＤＮＡポリメラーゼの製造方
法、及び該ＤＮＡポリメラーゼもしくはそのペプチド断
片に対して親和性を示す抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】ＤＮＡポ
リメラーゼは、遺伝子ＤＮＡの複製反応を触媒する酵素
である。大腸菌では、ＤＮＡポリメラーゼＩ〜ＩＩＩが
知られており、特にＤＮＡポリメラーゼＩＩＩがＤＮＡ
複製時の重合反応を担い、ＤＮＡポリメラーゼＩ（以
下、ポルＩと称する）は、プライマーＲＮＡの除去、ギ
ャップの補修及びＤＮＡ損傷の修復を担当している。一
方、真核細胞のＤＮＡポリメラーゼはこれまでにα、
β、γ、δ及びε（以下、それぞれポルα、ポルβ、ポ
ルγ、ポルδ及びポルεと称する）が知られている。ポ
ルαはＤＮＡ複製フォーク上でのラギング鎖の合成を、
ポルβはＤＮＡ修復を、ポルγはミトコンドリアでのＤ
ＮＡ複製を、ポルδはＤＮＡ複製フォーク上でのリーデ
ィング鎖の合成をそれぞれ担っている。また、ポルεに
ついてはＤＮＡ修復を行っているという説と、ＤＮＡ複
製フォーク上での複製反応に関与しているという説があ
る。

【０００３】細胞に、血清や成長因子の添加、癌ウィル
スの感染等の増殖刺激を与えた場合、ポルα、ポルδ及
びポルεは、血清添加後１０時間以上経過してから発現
誘導が起こる。このことから、癌細胞やウィルスの無秩
序且つ無制限な増殖、また、受精及び発生の初期段階に
おける非常に早いＤＮＡ複製を矛盾なく説明するために
は、図１に示すような、増殖刺激に対して非常に早い応
答性を示す未知のＤＮＡポリメラーゼの存在を仮定する
必要がある。すなわち、かかるＤＮＡポリメラーゼは、
増殖刺激に応答して速やかに発現誘導され、クロモソー
ム中の複製起点（ｏｒｉ）に結合して、さらに何らかの
因子と共同して複製を開始する。本発明は、増殖刺激に
対して非常に早い応答性を示す新規ＤＮＡポリメラー
ゼ、及び該酵素をコードするＤＮＡを提供することを目
的とする。また本発明は、該ＤＮＡを含むベクター、該
ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養
することによる該酵素の製法及び該酵素に対する抗体の
提供を目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、増殖刺激に
対して非常に早い応答性を示す新規ＤＮＡポリメラーゼ
の探索を行っていたところ、ＨＩＶ遺伝子プロモーター
内の特定の塩基配列に選択的に結合するタンパク質（Ｈ
ＰＢと命名）をコードする遺伝子が、増殖刺激後３０分
から１時間で発現が最大に達し、以後低下すること、及
び該遺伝子ｃＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換し
た宿主細胞の培養物から精製したＨＰＢを含む融合タン
パク質が、ＤＮＡ重合活性をも有することを発見した。
さらなる研究遂行の結果、本発明者は、ＨＰＢを増殖刺
激に対して非常に早い応答性を示す新規ＤＮＡポリメラ
ーゼであると断定し、ＤＮＡポリメラーゼο（以下、ポ
ルοと称する）と改名した。さらに、該ポルοを含む融
合タンパク質を抗原として、ポルοに対する抗体を作製
して本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は以下に述べるものであ
る。（１）ＨＩＶプロモーター、詳細には、ＨＩＶプロモー
ターの塩基配列中、配列表配列番号１に示される塩基配
列に結合することを特徴とし、且つ以下の性状を有する
新規ＤＮＡポリメラーゼ。（ａ）分子量（単量体）：５７．６ｋＤａ（アミノ酸配
列より類推される理論値）。（ｂ）ロイシンジッパー構造を有する。（ｃ）Ｎ末端近傍にＤＮＡ結合ドメインが存在する。（ｄ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと約６０％以上の相
同性を有する約４３０残基から成る領域を含む。（ｅ）インビトロにおいて、細胞核抽出物共存下で二本
鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ重合活性を有する。（ｆ）該酵素をコードする遺伝子が、増殖刺激に対して
１時間以内に最大発現し、以後低下する。（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ法）（２）実質的に、配列表配列番号２に示されるアミノ酸
配列を有する上記（１）の新規ＤＮＡポリメラーゼ。（３）上記（１）又は（２）のＤＮＡポリメラーゼをコ
ードする塩基配列を有するＤＮＡ。好ましくは、配列表
配列番号３に示される塩基配列中、塩基番号４２７〜１
９７４で示される塩基配列を有するＤＮＡ。（４）上記（３）のＤＮＡを含有する組換えベクター。（５）上記（４）の組換えベクターで形質転換された宿
主細胞。（６）上記（５）の宿主細胞を培養し、得られる培養物
から上記（１）又は（２）の新規ＤＮＡポリメラーゼを
採取することを特徴とする上記（１）又は（２）の新規
ＤＮＡポリメラーゼ製造法。（７）実質的に、配列表配列番号２に示されるアミノ酸
配列の全部又は一部を有するペプチドに親和性を示す抗
体。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳細に説明す
る。本発明者は、これまでに茶などに含まれる天然成分
であるタンニン酸が、ＨＩＶ遺伝子の発現を抑制するこ
とを見出している。さらにＨＩＶプロモーターのディリ
ーションシリーズを用いた研究から、ＨＩＶプロモータ
ーの−１３３〜−１０４の塩基配列ＨΔκ（転写開始点
を＋１、その直前の塩基を−１とする；配列は配列表配
列番号１に示す）がタンニン酸による転写抑制に関与す
ることが確認されている。本発明ＤＮＡポリメラーゼο
（ポルο）は、ＨＩＶプロモーター内の特定の塩基配
列、詳細には上記ＨΔκに選択的に結合することを特徴
とする新規ＤＮＡポリメラーゼである。

【０００７】本発明ポルοは、動物組織または細胞を原
料として抽出精製する方法、化学的合成による方法また
は遺伝子組換え技術等公知手法を適宜用いることによっ
て製造することができる。好ましくは、サウスウェスタ
ン法を用いて、まず該酵素をコードするＤＮＡをヒト、
ラット等の動物細胞由来のｃＤＮＡライブラリーよりＨ
Δκをプローブとしてクローニングし、次いで、該ＤＮ
Ａを含有する組換えベクターで形質転換された宿主細胞
を培養することによって該酵素を採取する方法が例示さ
れる。

【０００８】サウスウェスタン法は、タンパク抽出液を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し
た後、ニトロセルロース膜やナイロン膜にトランスブロ
ットし、標識したＤＮＡをプローブとしてハイブリダイ
ゼーションを行う方法であり、該ＤＮＡプローブ中の塩
基配列に結合するタンパク質のみが検出される。この原
理に基づき、ｃＤＮＡライブラリーのファージが産生す
る（融合）タンパク質を膜上に固定し、標識したＤＮＡ
プローブを結合させて目的のｃＤＮＡを単離することが
できる。

【０００９】使用するｃＤＮＡライブラリーは、動物細
胞又は組織、好ましくはヒト、ラット等の細胞又は組織
から抽出したｍＲＮＡより作製されるｃＤＮＡを、λｇ
ｔ１１等の宿主大腸菌中でポルο遺伝子を発現できるフ
ァージベクターに挿入したものであればよい。

【００１０】本発明ポルοは、実質的に配列表配列番号
２に示されるアミノ酸配列を有し、５１６アミノ酸残基
で構成されている。かかるアミノ酸配列は、該ポルοの
性状を変化させない限り特に限定されず、アミノ酸配列
の一部で置換、欠失、挿入又は修飾が起こっていてもよ
い。また、該アミノ酸配列から計算される単量体分子の
理論分子量は５７．６ｋＤａである。ポルοのアミノ酸
配列は、以下の〜によって得られたデータを総合し
て同定する直接的方法、該酵素を完全加水分解しアミノ酸組成を決定するエドマン法等によりＮ末端を、加ヒドラジン分解等に
よりＣ末端を決定するプロテアーゼ又は化学物質を用いて限定分解後、プロ
テインシークエンサーで各断片のアミノ酸配列を決定す
る別のプロテアーゼ又は化学物質を用いてと同様の処
理を行う又は該ポルοのｃＤＮＡもしくはゲノミックＤ
ＮＡをクローニングし、そのコード領域（ＯＲＦ）の塩
基配列より対応するアミノ酸配列を決定する間接的方法
により同定される。

【００１１】また本発明ポルοは、配列表配列番号２記
載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号６９〜４９８で示さ
れる４３０アミノ酸からなる領域で、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（ポルＩ）と６３％の相同性を有している。
一方、ポルοは真核のＤＮＡポリメラーゼ（α、δ、
ε）とは相同性を持たない。

【００１２】本発明ポルοは、ロイシンジッパー構造と
いわれる７アミノ酸残基毎にロイシンが存在し、それが
５回繰り返されるドメイン（配列表配列番号２記載のア
ミノ酸配列中、アミノ酸番号２１４〜２４２で示される
アミノ酸配列）を有する。該ドメインは疎水性の面をつ
くり、二量体を形成することが推定される。また、一般
にロイシンジッパーのＮ末端近傍には、アルギニンやリ
ジン等の正荷電を有するアミノ酸に富んだドメインがあ
る。

【００１３】また本発明ポルοは、配列表配列番号２記
載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１〜８７で示される
アミノ酸配列の或る領域が、ＨＩＶプロモーター内のシ
ス配列ＨΔκとの結合ドメインとなっている（実施例３
参照）。

【００１４】本発明ポルοは、インビトロにおいて、Ｈ
ｅＬａ細胞核抽出物共存下で未変性の二本鎖ＤＮＡを鋳
型としてＤＮＡ重合活性を有する（実施例４参照）。公
知の真核ＤＮＡポリメラーゼには、このような活性は認
められない。

【００１５】さらに、本発明ポルοをコードする遺伝子
は、血清刺激等の増殖刺激に対して３０分〜１時間で発
現がピークに達し、その後発現レベルは低下する（実施
例２参照）。このような非常に早い遺伝子発現応答は、
公知の真核ＤＮＡポリメラーゼ（α、δ、ε）では見ら
れない。該ポリメラーゼは増殖刺激後、１０時間以上経
過してから発現誘導が起こる。

【００１６】本発明のＤＮＡは、本発明ポルοのアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであれば特
に限定されないが、好ましくは配列表配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、より好ましく
は、配列表配列番号３に示される塩基配列中、塩基番号
４２７〜１９７４で示される塩基配列を有するＤＮＡで
ある。

【００１７】また、本発明のＤＮＡはいかなる方法で得
られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製さ
れる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノミックＤＮＡから調
製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増
幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組
み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものであ
る。

【００１８】例えば、ポルοを産生する細胞由来のｃＤ
ＮＡライブラリーからポルοのｃＤＮＡをクローン化す
る方法としては、以下の方法が例示される。

【００１９】まず、ポルοを産生する細胞組織、好まし
くはヒト、ラット等の細胞又は組織よりｍＲＮＡを抽出
する。ｍＲＮＡ〔poly (A) RNA〕の調製は、例えばグア
ニジンチオシアネート法〔Chirgwin, J. M. et al., Bi
ochem., 18, 5294 (1979) 〕、熱フェノール法もしくは
酸グアニジン−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）
法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ
（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるア
フィニティクロマトグラフィーにかけることによって行
うことができる。

【００２０】次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例
えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法〔Okayama, H.
et al., Mol.Cell.Biol., 2, 161 (1982) 及び同誌 3,
280(1983)、Gubler, H. and Hoffman, B.J., Gene, 25,
263(1983) 等〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ＲＮａｓｅＨ
で鋳型ＲＮＡにニックを導入した後ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉで二本鎖ｃＤＮＡを作製する。さらに末端平滑化、リ
ンカー結合後、該ｃＤＮＡをファージベクターに組み込
み、インビトロパッケージングを行いｃＤＮＡライブラ
リーを作製する。また、市販のヒト、ラット細胞由来の
ｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。

【００２１】ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方
法としては、Hyunh,T. V. らの方法（Hyunh,T.V., DNA
Cloning, a practical approach,1,49(1985)）などが挙
げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例
えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このように
して得られるファージベクターは、原核細胞（例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，ＤＨ５またはＭＣ１０６１／
Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。

【００２２】ファージベクターを宿主に導入する方法と
してはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした
後、増殖させた宿主に導入（トランスフェクション）す
る方法等が例示される。インビトロパッケージングは、
市販のインビトロパッケージングキット（例えば、スト
ラタジーン社製，アマシャム社製等）を用いることによ
って簡便に行うことができる。

【００２３】上記の方法によって作製されたｃＤＮＡラ
イブラリーから、本発明ポルοをコードするｃＤＮＡを
単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を
組み合わせることによって行うことができる。例えば、
別個にポルοの部分アミノ酸配列に対応すると考えられ
るオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを³²Ｐ
でラベルしてプローブとなし、公知のプラークハイブリ
ダイゼーション法〔Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, second edition , Cold Spring Harbor Labora
tory, 2.108 (1989)〕により、目的のｃＤＮＡを含有す
るクローンをスクリーニングする方法、ＰＣＲプライマ
ーを作製しポルοの特定領域をＰＣＲ法により増幅し、
該領域をコードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択
する方法等が挙げられる。また、ｃＤＮＡを発現しうる
ベクター（例えば、λｇｔ１１ファージベクター）を用
いて作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、
ポルοに対する抗体を用いるイムノスクリーニングによ
り、目的のクローンを選択することができる。大量にク
ローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリ
ーニング法を用いることが好ましい。

【００２４】また、本発明ポルοのように、ＤＮＡ結合
タンパク質をコードするｃＤＮＡの場合は、そのＤＮＡ
結合特異性を利用して、上述のようにサウスウェスタン
法を応用した方法によりクローニングが可能である。本
法の好ましい態様については、実施例１において詳述す
る。

【００２５】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列は
マキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert,
W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)〕
あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシターミネー
ション法〔Sanger,f. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 74, 5463-5467 (1977)〕によって決定することがで
きる。ポルοｃＤＮＡは、その全部または一部を上記の
ようにして得られるクローンから制限酵素等により切り
出すことにより取得できる。

【００２６】また、ゲノミックＤＮＡライブラリーから
本発明ポルοをコードするＤＮＡを単離する方法として
は以下の方法が例示される。まず、ラット胸腺又は脾臓
等の細胞からＳＤＳーフェノール法、セチルトリメチル
アンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）法等の公知の方法
を用いてゲノミックＤＮＡを調製する。好ましくはリボ
ヌクレアーゼによりＲＮＡを分解除去する。得られるＤ
ＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮ
Ａ断片を適当なファージ又はコスミドで増幅しライブラ
リーを作製する。そして目的の配列を有するクローン
を、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方
法等により検出し、該クローンからポルο遺伝子の全部
または一部を制限酵素等により切り出し取得する。

【００２７】また、化学的合成による本発明のＤＮＡの
製造は、配列表配列番号３記載の塩基配列中、塩基番号
４２７〜１９７４で示される塩基配列を基にして、その
全部又は一部を合成することにより行うことができる。

【００２８】さらに本発明は、上述のポルοをコードす
るＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。本発明の
組換えベクターとしては、原核細胞及び／又は真核細胞
の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるもので
あれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファ
ージベクターが包含される。当該組換えベクターは、簡
便には当分野において入手可能な組換え用ベクター（プ
ラスミドＤＮＡおよびバクテリオファージＤＮＡ）に本
発明ポルοをコードするＤＮＡを常法により連結するこ
とによって調製することができる。用いられる組換え用
ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドと
して例えばpBR322, pBR325, pUC12, pUC13など、酵母由
来プラスミドとして例えばpSH19, pSH15など、枯草菌由
来プラスミドとして例えばpUB110, pTP5, pC194 などが
例示される。また、ファージとしては、λファージなど
のバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワク
シニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫の
ウイルス〔pVL1393 （インビトロゲン社製) 〕が例示さ
れる。

【００２９】ポルοを発現・生産させる目的において
は、発現ベクターが有用である。発現ベクターとして
は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞
中でポルο遺伝子を発現し、該酵素を生産する機能を有
するものであれば特に制限されない。宿主細胞として細
菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少
なくともプロモーター−オペレーター領域，開始コド
ン，本発明ポルοをコードするＤＮＡ，終止コドン，タ
ーミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場
合、発現ベクターは少なくともプロモーター，開始コド
ン，本発明ポルοをコードするＤＮＡ，終止コドンを含
んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ，エンハンサー配列，本発明ポルο遺伝子
の５’側および３’側の非翻訳領域，スプライシング接
合部，ポリアデニレーション部位，選択マーカー領域ま
たは複製可能単位などを含んでいてもよい。

【００３０】細菌中で本発明のポルοを発現させるため
のプロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、
オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列（例え
ば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエ
シェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモーター，
ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプ
ロモーター，ｌｐｐプロモーター，ｔａｃプロモーター
などを含むものが例示される。宿主がバチルス属菌の場
合は、ＳＬＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，
ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、真核細
胞の酵母中で本発明のＤＮａｓｅγを発現させるための
プロモーターとしては、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫ
プロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモータ
ーが挙げられ、さらに宿主が哺乳動物細胞等である場
合、ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルスのプ
ロモーター，ヒートショックプロモーターなどが挙げら
れる。好ましくは、ＳＶ−４０，レトロウイルスであ
る。しかし、特にこれらに限定されるものではない。ま
た、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であ
る。

【００３１】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。終止コドンとしては、
常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡ，ＴＡＡな
ど）が例示される。ターミネーター領域としては、通常
用いられる天然または合成のターミネーターを用いるこ
とができる。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全Ｄ
ＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡをい
い、天然のプラスミド，人工的に修飾されたプラスミド
（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメン
ト）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラス
ミドとしては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、
もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限
酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母
では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡ
が、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 371
98, プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145,プラスミドpdBPV-
MMTneo ATCC 37224,プラスミドpSV2neo ATCC37149等が
あげられる。

【００３２】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例えば
それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。

【００３３】選択マーカーとしては、通常使用されるも
のを常法により用いることができる。例えばテトラサイ
クリン，アンピシリン，またはカナマイシン等の抗生物
質耐性遺伝子等が例示される。

【００３４】本発明の発現ベクターは、少なくとも、上
述のプロモーター，開始コドン，本発明ポルοをコード
するＤＮＡ，終止コドンおよびターミネーター領域を連
続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによ
って調製することができる。またこの際、所望により制
限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲー
ション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例え
ば、リンカー、他の制限部位など）を用いることができ
る。

【００３５】本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベク
ターを宿主細胞に導入することにより調製することがで
きる。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発
現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特
に限定されず、本発明の技術分野において通常使用され
る天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細胞など
種々の細胞〔例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチル
ス属菌），酵母（サッカロマイセス属、ピキア属な
ど），動物細胞または昆虫細胞など〕が例示される。好
ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には大
腸菌（ＤＨ５，ＨＢ１０１等）、マウス由来細胞（ＣＯ
Ｐ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１またはＮＩＨ
3 Ｔ3 等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（Ｂ
ＨＫおよびＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯ
Ｓ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１およびＶｅｌｏ等）およびヒト
由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する細
胞、ミエローマ細胞およびＮａｍａｌｗａ等）などが例
示される。

【００３６】発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転
換又は形質移入）は従来公知の方法を用いて行うことが
できる。例えば、細菌（E.coli, Bacillus subtilis
等）の場合は、例えばCohen らの方法〔Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法
〔Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979) 〕やコンピテン
ト法〔J. Mol. Biol., 56, 209 (1971) 〕によって、Sa
ccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1927(1978)〕
やリチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕によ
って、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法〔Virolo
gy, 52, 456 (1973)〕、昆虫細胞の場合は、例えばSumm
ers らの方法〔Mol. Cell. Biol.3, 2156-2165 (1983)
〕によってそれぞれ形質転換することができる。

【００３７】本発明ポルοは、上記の如く調製される発
現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体を包
含する意味で使用する。）を栄養培地で培養することに
よって製造することができる。栄養培地は、宿主細胞
（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もし
くは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源とし
ては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプ
ン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源とし
ては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，
コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキ
ス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また
所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カ
ルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウ
ム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリ
ン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）な
ど〕を含んでいてもよい。

【００３８】培養は当分野において知られている方法に
より行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよ
び培養時間は、ポルοが大量に生産されるように適宜選
択される。なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具
体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに
限定されるものではない。

【００３９】宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌である
場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当であ
る。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主
がE. coli の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９
培地〔Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, New York (1972)〕等が例示さ
れる。かかる場合、培養は、必要により通気，攪拌をし
ながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことが
できる。

【００４０】宿主がBacillus属菌の場合、必要により通
気，攪拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６
時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地と
して、例えばBurkholder最小培地〔Bostian. K. L. et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) 〕
が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養
は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、
必要により通気や攪拌を行うこともできる。

【００４１】宿主が動物細胞の場合、培地として例えば
約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science,
122, 501 (1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396
(1959) 〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔J. Am. Med. Asso
c., 199, 519 (1967) 〕，１９９培地〔proc. Soc. Ex
p. Biol. Med., 73, 1 (1950)〕等を用いることができ
る。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は
通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要
により通気や攪拌を行うこともできる。

【００４２】宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清
を含むGrace's 培地〔Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82,
8404 (1985)〕等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であ
るのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１
００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うことも
できる。

【００４３】本発明のポルοは、上記培養により得られ
る培養物より以下のようにして取得できる。すなわち、
本発明ポルοが、培養物のうち培養液中に存在する場合
は、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培
養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋
白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法
に従って該ポルοを精製、単離する。単離，精製方法と
しては、例えば塩析，溶媒沈澱法等の溶解度を利用する
方法、透析，限外濾過，ゲル濾過，ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。

【００４４】一方、本発明ポルοが培養された形質転換
体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培
養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体ある
いは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音
波、リゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞
壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過
などの方法でポルοを含有する膜画分を得る。該膜画分
をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤を用いて可溶化
して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示した
ような常法を用いることにより、単離，精製することが
できる。また、当該ポルοが培養された形質転換細胞の
核内に存在する場合は、常法により細胞壁及び細胞膜を
破壊して核を単離した後、超音波処理等により核膜を破
壊し、遠心処理して上清を得、該上清を先に例示したよ
うな常法を用いることにより、単離・精製することがで
きる

【００４５】また、本発明は、上述のポルοもしくはそ
の前駆体ポリペプチド又はそれらのアミノ酸配列の一部
を有するペプチドに親和性を有する抗体に関する。本発
明の抗体は、上記性質を有するポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体を共に包含する。また、当該モノ
クローナル抗体には、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ
およびＩｇＥなるいずれのイムノグロブリンクラスに属
するモノクローナル抗体をも包含し、好適には、ＩｇＧ
またはＩｇＭイムノグロブリンクラスモノクローナル抗
体が挙げられる。

【００４６】本発明の抗体は常法に従って取得すること
ができる（続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日
本生化学会編：東京化学同人発行、等）。例えば、本
発明のポリクローナル抗体は、以下の方法により作製す
ることができる。本発明ポルοのアミノ酸配列の全部又
は一部を有する（ポリ）ペプチドをウシ血清アルブミ
ン、Keyhole Limpets Hemocyanin（ＫＬＨ）等のキャリ
アタンパク質に架橋した複合体もしくは（ポリ）ペプチ
ドのみと、完全（不完全）フロイントアジュバント〔Ｆ
ＣＡ（ＦＩＡ）〕との混和物を抗原として、ウサギ、マ
ウス、ラット、モルモット又はハムスター等の哺乳動物
に免疫（初回免疫から約１〜４週間毎に１〜数回追加免
役し、各追加免疫の約３〜１０日後に部分採血した血清
の抗体価を従来公知の抗原抗体反応を利用して測定、そ
の上昇を確認しておく。さらに最終免疫から約３〜１０
日後全血を採取して抗血清を精製する。

【００４７】また、本発明ポルοに対するモノクローナ
ル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブ
リドーマ（融合細胞）から製造することができる。すな
わち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリド
ーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、本
発明ポルοのアミノ酸配列の全部または一部を有する
（ポリ）ペプチドを抗原として、それに対して特異的親
和性を示す抗体を生産するクローンを選択することによ
って製造される。その操作は免疫抗原として本発明のポ
ルοのアミノ酸配列の全部または一部を有する（ポリ）
ペプチドを使用する以外は、従来既知の手段を用いるこ
とができる。

【００４８】本発明の「モノクローナル抗体」は、上述
の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得ら
れたものであってもよい。また、通常「モノクローナル
抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞ
れ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明における「モノ
クローナル抗体」は該糖鎖の構造差異により限定される
ものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル
抗体をも包含するものである。さらに、例えばヒトイム
ノグロブリン遺伝子を組み込むことにより、ヒト型抗体
を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランスジ
ェニックマウスを用いて得られるヒト型モノクローナル
抗体、あるいは、遺伝子組換え技術により、ある哺乳動
物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Ｆｃ領域）を
ヒトモノクローナル抗体のＦｃ領域と組み換えたキメラ
モノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合
し得る相補性決定部位（ＣＤＲ：complementarity dete
rmining region）以外、全領域をヒトモノクローナル抗
体抗体の対応領域と組換えたキメラモノクローナル抗体
も本発明の「モノクローナル抗体」に包含される。

【００４９】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるもの
ではない。

【００５０】実施例１ポルοｃＤＮＡのクローニング（１）ｃＤＮＡライブラリーヒトＴ細胞リンパ腫培養細胞（Ｊｕｒｋａｔ）ｃＤＮＡ
ライブラリーは、市販のhuman Jurkat λgt11 cDNA L
ibrary（クロンテック社製）を用いた。このライブラリ
ーは、ヒトＴ細胞リンパ腫培養細胞（Ｊｕｒｋａｔ）よ
り抽出・精製したｍＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）ランダ
ムプライマーを用いて調製したｃＤＮＡ（平均サイズ：
１．２ｋｂ）クローン（１×１０⁶インディペンデント
クローンを含む）をアダプターを介してλｇｔ１１ベク
ターのＥｃｏＲＩ部位に挿入したものである。該クロー
ニング部位は、大腸菌由来ｌａｃＺ遺伝子の３’末端近
傍にあるため、挿入され且つコドンフレームが一致した
ｃＤＮＡはβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質と
して発現する。また、ｌａｃＺ遺伝子は、宿主プラスミ
ド中のｌａｃリプレッサーにより抑制制御されており、
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
の添加により発現が誘導される。

【００５１】（２）ＤＮＡプローブの作製ＨＩＶプロモーター内の−１３３〜−１０４に位置する
シス配列ＨΔκの塩基配列に基づき、３０ｂｐのＤＮＡ
プローブを合成した（配列表配列番号１記載の塩基配
列）。

【００５２】（３）スクリーニングスクリーニング用フィルターの作製大腸菌Ｙ１０９０^r-を０．２％マルトースと１０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄を含む４０ｍｌのＬＢ培地で一晩培養後、菌
体を遠心して回収し、該菌体を３０〜４０ｍｌの１０ｍ
ＭＭｇＳＯ₄に懸濁した。懸濁液２００μｌと上記
（１）のＪｕｒｋａｔｃＤＮＡを有するλｇｔ１１ファ
ージ液とを混合し、ＳＭ１０緩衝液〔10mMTris-HCl(ph
7.6), 10mM MgCl ₂, 68mM NaCl,0.1mg/mlゼラチン〕を
加えて全量を４００μｌとして３７℃で２０〜３０分間
インキュベーションした。大腸菌・ファージ混合液を１
０ｍＭＭｇＳＯ₄を含む１．５％ＬＢ寒天培地上にま
き、次いで６０〜６５℃のＬＢトップアガロース６ｍｌ
をまいてよく混合した。トップアガロースが固まったら
４２℃で３時間インキュベーションしてプラークを一面
に生じさせた。次いで、ＩＰＴＧで処理したナイロンフ
ィルター（ポール社製）をトップアガロース上に置き、
一晩インキュベーションしてトランスファーを行った。
インキュベーション後、該ナイロンフィルターを静かに
剥がし、ファージ吸着面を上にして濾紙上に並べ１５分
間風乾した後、さらにＵＶ照射により固定した。

【００５３】プローブの標識上記（２）で作製したＤＮＡプローブを〔γ−³²Ｐ〕Ａ
ＴＰとＴ４キナーゼを用いて、５’末端を³²Ｐ標識し
た。以下の組成の反応液を３７℃で３０分間インキュベ
ーションした。１０ｎｇ／μｌオリゴＤＮＡ１μｌ１０× キナーゼバッファー４μｌ〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ１０μｌＵＰＷ２３μｌＴ４キナーゼ２μｌ

【００５４】サウスウェスタン法以下のように、プレバインディング液を調製した。２．５％スキムミルク１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）１００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１ｍＭＤＴＴ０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（バイオラッド社製）２００ｍＭＫＣｌ上記で作製したフィルターを該プレバインディング液
中に入れ、４℃で６時間放置した。次いで、上記で調
製した標識化プローブを適量のバインディング液と混合
し、フィルター１枚あたり５μｌのプローブ溶液を用い
て４℃、１８時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイ
ゼーション終了後、該フィルターをプレハイブリダイゼ
ーション液で３０分間振盪しながら洗った。この操作を
３〜４回繰り返した後、フィルターを濾紙上に広げて乾
燥させ、オートラジオグラフィーを行った（３日間）。

【００５５】オートラジオグラフィーの結果、ポジティ
ブクローンを示すシグナルの位置に対応するトップアガ
ロースを取り出し、５００μｌの１×λバッファー中に
入れ、室温で３０〜６０分間放置した後、その１０³倍
希釈液１〜１０μｌを大腸菌Ｙ１０９０^r-懸濁液２００
μｌと混合した。該混合液を用いて上記〜の操作を
繰り返して二次スクリーニングを行い、単一プラークを
分離した。その結果、１個のポジティブクローンが得ら
れた。該ポジティブクローンを再び大腸菌Ｙ１０９０^r-
に感染させ、ＬＢ寒天培地プレート１枚に一面にプラー
クができるようにまき、そのλｇｔ１１ファージＤＮＡ
を回収した。ファージＤＮＡの回収法の詳細について
は、Maniatisらの方法〔Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, second edition 2.64 (1989)〕を参照し
た。

【００５６】（４）ポジティブクローンのサブクローニ
ングＥｃｏＲＩ処理したファージＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動し、GENECLEANII Kitを用いてインサートＤＮＡ
を回収した。そして、ｐＢＳIIＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩ
サイトに組み込んだ（このプラスミドをｐＫＳＨ１と称
する）。そのライゲーション溶液を用いてコンピテント
大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。すなわち、全量７μｌ
のライゲーション溶液にコンピテント大腸菌０．３ｍｌ
を加えて氷上で数時間放置後、４２℃で４０秒間熱刺激
を加え氷上に戻し、２００μｌのＬＢ培地を加え、３７
℃で３０分間インキュベーションした後、アンピシリン
含有ＬＢ寒天培地プレートに注ぎ３７℃で一晩インキュ
ベーションした。シングルコロニーを採取し、１．５ｍ
ｌＬＢ培地に入れ、５時間振盪培養した。遠心した沈
殿からアルカリ法〔Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, second edition 1.25 (1989)〕によってｐＫＳ
Ｈ１ＤＮＡを回収した。

【００５７】（５）塩基配列の決定（４）で得られたｐＫＳＨ１ＤＮＡからΔTaq フルオ
レッセントダイ−プライマーシーケンシングキット（Am
ersham社製）を用いて、ＤＮＡシークエンサー（ＳＱ−
５５００、日立製作所製）でポルοｃＤＮＡインサート
の塩基配列を決定した。その結果、得られたポジティブ
クローンはポルοの全長をコードしていた（配列表配列
番号３）。該ｃＤＮＡクローンの全長は２６６５ｂｐで
あり、その内部に１５５１ｂｐから成るオープンリーデ
ィングフレーム（配列表配列番号３の塩基番号４２７〜
１９７７）が存在し、５１６アミノ酸残基（配列表配列
番号２）をコードしていた。かかるアミノ酸配列から推
定される該タンパク質の分子量は５６．７ｋＤａであっ
た。

【００５８】（６）ポルοアミノ酸配列の特徴決定されたポルοのアミノ酸配列を、公知のＤＮＡポリ
メラーゼのアミノ酸配列と比較すると、配列表配列番号
２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号６９〜４９８で
示される４３０アミノ酸からなる領域で、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（ポルＩ）と６３％の相同性を有してい
た。しかしながら、ポルοは公知の真核ＤＮＡポリメラ
ーゼ（α、δ、ε）とは相同性を持たないことがわかっ
た。

【００５９】また、ポルοのアミノ酸配列中には、７ア
ミノ酸残基毎にロイシンが存在し、それが５回繰り返さ
れるロイシンジッパー構造といわれるドメイン（配列表
配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号２１４
〜２４２で示されるアミノ酸配列）を有していた。該ド
メインは疎水性の面をつくり、二量体を形成することが
推定された。また、一般にロイシンジッパーのＮ末端近
傍には、アルギニンやリジン等の正荷電を有するアミノ
酸に富んだドメインがあり、該ドメインがＤＮＡに結合
すると考えられている。

【００６０】実施例２ポルο遺伝子の増殖刺激に対す
る発現応答（１）細胞の培養１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭＬ
−グルタミン及びペニシリン(100U/ml), ストレプトマ
イシン(100μg/ml) を含むダルベッコ修正イーグル培地
にヒトパピローマウィルスでトランスフォームされたＨ
ｅＬａ細胞株を懸濁し、ＣＯ₂インキュベーター（3326
S/N Forma SCIENTIFIC Inc.)中で３７℃、５％ＣＯ₂の
条件下で細胞密度１．０×１０⁵〜１．０×１０⁶細胞
／ｍｌとなるように継代培養を行った。

【００６１】（２）血清刺激培地中のＦＣＳ濃度を０．５％に減じて４８時間培養
後、終濃度１０％となるようにＦＣＳを添加した。

【００６２】（３）ＲＴ−ＰＣＲ法上記（２）の方法により血清刺激を与えたＨｅＬａ細胞
から、グアニジンイソチオシアネート−塩化セシウム法
（Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed., 198
9)2）により、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ
（２．５μｇ）からランダムヘキサマーとマウス白血病
ウィルス由来逆転写酵素（Bethesda Research Laborato
ries）２００ＵによりｃＤＮＡを合成した。得られたｃ
ＤＮＡの１／１０量をＰＣＲ反応に供した。用いた合成
プライマーは、５’−ＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣ
ＴＣＧＡＣ−３’（配列表配列番号３の塩基番号１２７
３〜１２９９）５’−ＧＣＴＧＧＴＣＣＧＧＣＧＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧ
ＣＧＧＣ−３’（配列表配列番号３の塩基番号１６４６
〜１６７２の逆鎖）であった。以下の組成の反応液を０．５ｍｌマイクロチ
ューブに入れ、鉱物油を重層してサーマルサイクラー
（RICOH Model TPI-242 ）を用い下記の条件で反応を行
った（４００ｂｐの断片が増幅される）。ＰＣＲ反応液鋳型ｃＤＮＡ１０⁵〜１０⁶分子各プライマー２０ｐｍｏｌ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３，２０℃）１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ ２５ｍＭＫＣｌ１００μｇ／ｍｌゼラチン５０μＭｄＮＴＰ２ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ反応条件変性９６℃、１５秒アニーリング５５℃、３０秒伸長７２℃、９０秒２５サイクル、最後に７２℃、５分間伸長反応を行った
後、反応液１０μｌを５％アクリルアミドゲル電気泳動
して、エチジウムブロマイド染色によりバンドを検出し
た。

【００６３】血清刺激後０〜２４時間の細胞から抽出し
たＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果、ポルο遺伝子は血清刺
激後３０分〜１時間のうちに発現がピークに達し、以後
減少した（図２）。公知のＤＮＡポリメラーゼ（α、
δ、ε）は血清刺激後１０時間以上経過してから発現が
誘導されるが、本発明ポルοは、血清刺激に対して非常
に早い発現応答を示すことが明らかとなった。

【００６４】実施例３ポルοのＤＮＡ結合活性（１）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ポルο
（ＧＳＴ−ｐｏｌο）発現ベクターの作製ポルοｃＤＮＡの全長を含む前述のｐＫＳＨ１のＥｃｏ
ＲＩ断片（２．６６ｋｂ）をグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）発現ベクターであるｐＧＥＸ−１
（ファルマシア社製）のＥｃｏＲＩ部位に正しい方向に
挿入したプラスミド（ｐＧＥＸ−ｐｏｌο）を作製し
た。該プラスミドは、ＧＳＴと配列表配列番号２のアミ
ノ酸番号１〜５１６で示されるペプチドとの融合タンパ
ク質を発現する。同様に、ｐＫＳＨ１のＡｌｗＮ１−Ｂ
ａｍＨＩ１．５ｋｂ断片を末端平滑化後、リンカーを介
してｐＧＥＸ−１のＥｃｏＲＩ部位に挿入したプラスミ
ド（ｐＧＥＸ−ｐｏｌοΔ１）を作製した。該プラスミ
ドは、ＧＳＴと配列表配列番号２のアミノ酸番号８８〜
５１６で示されるペプチドとの融合タンパク質を発現す
る。さらに、ｐＫＳＨ１のＰｖｕＩ１．３ｋｂ断片を末
端平滑化後、リンカーを介してｐＧＥＸ−１のＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入したプラスミド（ｐＧＥＸ−ｐｏｌοΔ
２）を作製した。該プラスミドは、ＧＳＴと配列表配列
番号２のアミノ酸番号１５４〜５１６で示されるペプチ
ドとの融合タンパク質を発現する。

【００６５】（２）ＧＳＴ−ｐｏｌο融合タンパク質の
製造上記（１）の３つのプラスミドで、それぞれ公知のアル
カリ法により大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、該形質転換
体を１００μｇ／ｍｌアンピシリン及びＩＰＴＧを含む
ＬＢ培地５００ｍｌで３７℃、１６時間ラージスケール
培養した後集菌し、１×ＰＢＳ／１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００で抽出した。次いで、抽出液をグルタチオンセフ
ァロース４Ｂアフィニティーカラム（ファルマシア社
製）に付し、目的のＧＳＴ−ｐｏｌο融合タンパク質を
精製した。それぞれの融合タンパク質の精製度は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより調べられた。

【００６６】（３）ゲルシフトアッセイ上記（１）及び（２）の方法で得られた３つのＧＳＴ−
ｐｏｌο融合タンパク質のＨΔκに対する結合活性を調
べた。まず、下記のように反応液を調製した。ＧＳＴ−ｐｏｌο（100 〜200ng/μl ）２μｌＢ．Ｂ．溶液１５μｌ１×１０⁴cpm ³²P-プローブ１μｌ競合体プローブ１μｌ０．１％ＢＳＡ１μｌ B.B. stok soln. 1.5 ml 25 mM HEPES-KOH (pH7.9) 0.5 mM EDTA-NaOH (pH8) 50 mM KCl 10% グリセロール 1 M DTT 0.75 μl 0.3 M PMSF 2.5μl 上記反応液（総量２０μｌ）を静かに混和し、３０分間
室温で静置した後ＧＳ色素１μｌを加えて４℃で、１５
０Ｖ、２時間電気泳動した。泳動後３ＭＭ濾紙（Whatma
n 社製）にトランスファーしてオートラジオグラフィー
を行った（２日間）。その結果、ポルοの全長を含むＧ
ＳＴ−ｐｏｌοは、ＨΔκと結合するが、ポルοのＮ末
端側が欠失したＧＳＴ−ｐｏｌοΔ１及びＧＳＴ−ｐｏ
ｌοΔ２ではＨΔκへの結合活性が消失していた（図
３）。このことから、ポルοのＮ末端から８７残基まで
の領域内にＨΔκとの結合ドメインが存在することが示
唆された。

【００６７】実施例４ポルοのインビトロにおけるＤ
ＮＡ重合活性ＨＩＶプロモーター（−４５２〜＋８０に位置する領
域）の下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を繋いだレポータープラスミ
ドであるｐＨＩＶＣＡＴ（Rosen et al., Cell 41, 813
-823, 1985）の二本鎖ＤＮＡを変性液処理して一本鎖に
したものと、未変性のものをそれぞれ鋳型として、ポル
οのＤＮＡ重合活性を調べた。

【００６８】（１）アルカリ変性したＤＮＡ鋳型の場合ｐＨＩＶＣＡＴ２．５μｇを０．２５ＮＮａＯＨ，
０．２５ｍＭＥＤＴＡからなる変性液で３７℃，５分
間処理した後、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μｌとエタ
ノール２００μｌをくわえて該プラスミドを沈殿させ、
上清を除いて真空乾燥させた。これを反応直前に２．５
μｌの水に溶解して用いた。次いで、下記の重合反応液
を調製した。アルカリ変性プラスミド（２μｇ）２μｌＨΔκ＋（センス鎖）０．５ｐｍｏｌ／μｌ１μｌ１０×シーケンスバッファー１．２μｌ 70 mM Tris-HCl (pH7.5) 200 mM NaCl 70 mM MgCl₂ 1 mM EDTA Ｈ₂Ｏ５．８μｌ上記反応液を６５℃で２０分間インキュベーションし、
室温でさらに２０分間インキュベーションした。次に、
１ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ（但し、ｄＣＴＰのみ０．１
ｍＭ）１μｌ，α−³²ＰｄＣＴＰ（５μＣｉ）０．５
μｌ，ＧＳＴ−ｐｏｌο（２００〜６００ｎｇ／μｌ）
０．５μｌを加えて３７℃，３０分又は６０分重合反応
させ、氷冷後エタノール沈殿させ、シ─クエンスゲル
（６％アクリルアミド／ビスアクリルアミド，１×ＴＢ
Ｅ，７Ｍ尿素）にアプライし、電気泳動を行った（１５
００Ｖ，２時間）。泳動終了後、オートラジオグラフィ
ーを行った。ＧＳＴ−ｐｏｌοをＧＳＴ−ｐｏｌοΔ
１，ＧＳＴ−ｐｏｌοΔ２に変えて同様の重合反応を行
わせた。その結果、ポルοの全長を含むＧＳＴ−ｐｏｌ
οは、ＤＮＡ重合活性を示したが、ポルοのＮ末端側の
アミノ酸配列を欠失したＧＳＴ−ｐｏｌοΔ１やＧＳＴ
−ｐｏｌοΔ２は、ＤＮＡ重合活性を持っていなかった
（図４）。

【００６９】（２）未変性の二本鎖ＤＮＡ鋳型の場合鋳型のプラスミドｐＨＩＶＣＡＴを水で希釈して１ｍｇ
／ｍｌの濃度に調整した。次いで、下記の重合反応液を
調製し、３７℃で３０分又は６０分反応させた。未変性プラスミド（２μｇ）２μｌＨΔκ＋（センス鎖）０．５ｐｍｏｌ／μｌ１μｌ１０×シーケンスバッファー１．６μｌ 70 mM Tris-HCl (pH7.5) 200 mM NaCl 70 mM MgCl₂ 1 mM EDTA Ｈ₂Ｏ６．４μｌ１ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ１μｌ（但し、ｄＣＴＰのみ０．１ｍＭ） α−³²ＰｄＣＴＰ（５μＣｉ）０．５μｌＧＳＴ−ｐｏｌο（２００〜６００ｎｇ／μｌ）０．５μｌＨｅＬａ核抽出液（１ｍｇ／ｍｌ）又は４μｌＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）反応終了後氷冷し、エタノール沈殿し、上記（１）同様
にシークエンスゲルにアプライして電気泳動に付した。
泳動終了後、オートラジオグラフィーを行った。その結
果、鋳型ＤＮＡとＨΔκ＋プライマーだけの場合には、
ＧＳＴ−ｐｏｌοは重合活性を示さなかったが、ＨｅＬ
ａ核抽出液の共存下では活性が認められた（図５）。お
そらく、ＨｅＬａ核抽出液に含まれるヘリカーゼやトポ
イソメラーゼＩＩ等によってポルοのＤＮＡ重合活性が
増強されたものと考えられる。公知の真核ＤＮＡポリメ
ラーゼα、δにはこの様な未変性ＤＮＡを鋳型とした重
合活性はない。この点に関しても，本発明ポルοは従来
公知の真核ＤＮＡポリメラーゼとは極めて異なってい
る。

【００７０】実施例５ポルο抗体の作製前述のＧＳＴ−ｐｏｌο融合タンパク質を使用抗原とし
て、該タンパク質のアミノ酸配列に親和性を示す抗体を
作製した。該タンパク質と完全フロイントアジュバント
（ＦＣＡ）との混和物を抗原として、ウサギ〔Ｋｂｌ：
ＪＷ、１５齢、オス、体重３〜３．５ｋｇ（初回免疫
時）〕に背部皮下注射により約０．５ｍｇ免疫した。初
回免疫から約３週間毎に計３回約０．５ｍｇずつ追加免
疫し、各追加免疫の約１０日後に部分採血し、抗体価を
測定、さらに最終免疫（３回目の追加免疫）から約１０
日後に全血を採取して抗血清を得た。

【００７１】抗体価の測定は以下の方法で行った。抗原
を１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイタープレートに
固相化し、ブロッキング後、感作ウサギの部分血を１０
¹〜１０⁸まで希釈して抗原と反応させた。洗浄後、抗
ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ標識二次抗体を反応さ
せ、洗浄後、基質液ＡＢＴＳの発色により抗体価を測定
した。その結果、いずれの場合も経時的に抗体価の上昇
が確認された（表５）。

【００７２】

【発明の効果】本発明のＤＮＡポリメラーゼο（ポル
ο）は、血清、増殖因子、癌ウィルス等の増殖刺激に対
して非常に早い発現応答を示すことを特徴とすることか
ら、癌やウィルスの無秩序且つ無制限な増殖、また受精
及び発生の初期段階での非常に早いＤＮＡの複製に関与
していることが予測される。従って、ポルο、ポルοの
アンチセンス鎖及びポルο抗体は、癌やウィルス感染症
の初期段階での診断、予防又は治療薬に利用できる点で
有用である。

【００７３】配列表配列番号１ -452 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAACGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA -392 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGAGTC AGATATCCAC -332 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA -272 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCTG -212 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG -152 AGCTGCATCG GGAGTACTTC AAGAACTGTT GACATCGAGC TTGTTACAAG GGACTTTCCG -92 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT -32 +1 GCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 29 88 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA GCTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTGCCTT

【００７４】配列番号２

【００７５】

【化１】

【００７６】配列番号３

【００７７】

【化２】

【００７８】

【化３】

【００７９】

【化４】

【００８０】

【化５】

【００８１】

【化６】

【図面の簡単な説明】

【図１】増殖刺激に早期に応答する新規ＤＮＡポリメラ
ーゼの発現とその制御機構の仮想図である。

【図２】血清刺激に応答して発現するＤＮＡポリメラー
ゼοｍＲＮＡの経時変化を示す電気泳動像である。矢印
の長さのバンドがポルοの断片である。Ｍ：分子量マーカーＰ：ポジティブコントロールＮ：ネガティブコントロール

【図３】３種のＧＳＴ−ｐｏｌο融合タンパクとＨΔκ
とのゲルシフトアッセイにおける電気泳動像である。ＧＳＴ−ｐｏｌο左より２５，５０，１００ｎｇＧＳＴ−ｐｏｌοΔ２左より２５，５０，１００ｎｇＧＳＴ−ｐｏｌοΔ１左より５０，１００ｎｇ

【図４】３種のＧＳＴ−ｐｏｌο融合タンパクの一本鎖
ＤＮＡ重合活性を示す電気泳動像である。

【図５】ＧＳＴ−ｐｏｌοの未変性ＤＮＡ重合活性を示
す電気泳動像である。ＨｅＬａＮ．Ｅｘ．：ＨｅＬａ核抽出液

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト後天性免疫不全症候群ウィルスプロ
モーターに結合することを特徴とし、且つ以下の性状を
有するＤＮＡポリメラーゼ。（１）分子量（単量体）：５７．６ｋＤａ。（２）ロイシンジッパー構造を有する。（３）Ｎ末端近傍にＤＮＡ結合ドメインが存在する。（４）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩと約６０％以上の相
同性を有する約４３０残基から成る領域を含む。（５）インビトロにおいて、細胞核抽出物共存下で二本
鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ重合活性を有する。（６）該酵素をコードする遺伝子が、増殖刺激に対して
１時間以内に最大発現し、以後低下する。（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ法）
【請求項２】ＨＩＶプロモーターの塩基配列中、配列
表配列番号１に示される塩基配列に選択的に結合するこ
とを特徴とする請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】実質的に、配列表配列番号２に示される
アミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のＤＮＡポ
リメラーゼ。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ
ポリメラーゼをコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項５】配列表配列番号３に示される塩基配列
中、塩基番号４２７乃至１９７４で示される塩基配列を
有する請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】請求項４又は５に記載のＤＮＡを含有す
る組換えベクター。
【請求項７】請求項６記載の組換えベクターで形質転
換された宿主細胞。
【請求項８】請求項７記載の宿主細胞を培養し、得ら
れる培養物から請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ
ポリメラーゼを採取することを特徴とする請求項１〜３
のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ製造法。
【請求項９】実質的に、配列表配列番号２に示される
アミノ酸配列の全部又は一部を有するペプチドに親和性
を示す抗体。