JPH04506457A - ヒトｎｍ２３タンパク質及びそれに対する抗体の産生及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトｎｍ２３タンパク質及びそれ に対する抗体の産生及び使用 発明の背景 本発明はヒトｎｍ２３タンパク質、ヒトｎｍ２３タンパク質をコードするＤＮＡ 　（又はこのようなりＮＡの断片もしくはアナログ）、ヒトｎｍ２３タンパク質 を認識する抗体並びにこのような物質を産生及び使用するためのプロセス及び産 物に関する。

Ｓｔｅｅｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ 　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、８０：２００−２０４，１９１＋８はマウ ス腫瘍転移潜在能力に関与するマウスｎｍ２３遺伝子及び対応タンパク質につい て開示する。本出願人はヒトｎｍ２３タンパク質をコードするヒト遺伝子、並び に、ヒト腫瘍の侵攻を予想する上で役立つタンパク質及び抗体を提供する。本発 明の一面によれば、ヒトｎｍ２３タンパク質をコードするＤＮＡ又はこのような りＮＡの断片、アナログもしくは誘導体が提供される。

本発明のもう１つの面によれば、ヒトｎｍ２３タンパク質をコードするＤＮＡ又 はこのようなりＮＡの断片、アナログもしくは誘導体を含むクローニング又は発 現ビヒクルが提供される。

本発明の別の面によれば、宿主；特にヒトｎｍ２３タンパク質又はこのようなり ＮＡの断片、アナログもしくは誘導体をコードするＤＮＡ又はこのようなりＮＡ の断片、アナログもしくは誘導体を含むように遺伝子工学処理された細胞；即ち ヒトｎｍ２３ＤＮＡを含むように修正されたこのような細胞が提供される。

本発明の更にもう１つの面によれば、ヒトｎｍ２３タンパク質が提供される。

本発明の更に別の面によれば、ヒトｎｍ２３タンパク質を認識する抗体が提供さ れる。

本発明の更に他の面によれば、前記ＤＮＡを用いるための操作及び腫瘍の転移潜 在能力を予想するための抗体が提供される。

ここで用いられる“ヒトｎｍ２３遺伝子又はＤＮＡ″という用語は、ヒトｎｍ２ ３タンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡあるいはヒトｎｍ２３タンパク質を コードするＤＮＡに特有のＤＮＡ配列を包含する又は含むこのようなりＮＡ又は 遺伝子のアナログ、誘導体又は断片を意味する。このため、ヒトｎｍ２３遺伝子 という用語は、第２図の遺伝子又はＤＮＡ、第３図で示された遺伝子又はＤＮＡ 、そのフラクションあるいはこのような遺伝子の断片、誘導体又はアナログを包 含する。

“ヒトｎｍ２３タンパク質°とは、ヒトｎｍ２３タンパク質に独特なアミノ酸配 列を包含するか又は含みかつ好ましくはヒトｎｍ２３タンパク質で認識される抗 体を誘導する、ヒトで見出されるｎｍ２３タンパク質又はその断片、アナログも しくは誘導体を意味する。ヒトｎｍ２３タンパク質という用語は第２図又は第３ 図の遺伝子でコードされるタンパク質を包含する。

ここで用いられる“抗体”という用語はポリクローナル及びモノクローナル抗体 を包含する。

“ｎｍ２３抗体“という用語はヒトｎｍ２３タンパク質に応答して誘導されるか 又はヒトｎｍ２３タンパク質を認識する抗体を意味する。ヒトｎｍ２３タンパク 質を認識する抗体はヒトｎｍ２３タンパク質に応答して誘導されても又はされな くてもよい。

本出願人はここで２種の異なるかつ別個のｎｍ２３タンパク質をコードする２種 の異なるかつ別個のヒト遺伝子（ＤＮＡ）を発見した。第一遺伝子は第２図で示 され、ここではｎｍ２３−Ｈｌと称される。第二遺伝子はここではｎｍ２３−Ｈ ２と称され、このような遺伝子配列の一部が第３図で示されている。第３図にお いて、塩基対番号１は第２図における塩基対番号２１６に相当する。

本出願人はここに２種の異なるｎｍ２３タンパク質をコードする２種の別個のヒ ト遺伝子を確認したが、本発明の範囲はこのような特定遺伝子に限定されない。

ヒトｎｍ２３ＤＮＡ　（ＲＮＡ）はＲＮＡ又はＤＮＡを検出及び／又は測定する ための診断手段として用いることができる。例えば、このようなりＮＡ又はＲＮ Ａは、癌細胞におけるｍＲＮＡ発現を検出し、それによりヒト腫瘍の悪性潜在能 力を予測する上で役立てるために用いてよい。使用可能な方法としては以下があ る：（１）ＲＮＡ　（“ノーザン”）プロッティング、ＲＮＡはいくつかの標準 的操作のうちいずれかで腫瘍サンプルから単離することができる。例えば、Ｌｅ ｈｒａｃｈ　（１）の方法の改良法が使用可能である。ＲＮＡは変性ゲル電気泳 動に付され、ニトロセルロース又は他の支持マトリックスに移される。ｎｍ２３ ｍＲＮＡは放射線又は非放射線機織ｎｍ２３−Ｈ１又はｎｍ２３−Ｈ２のハイブ リッド形成により検出できる。腫瘍中のｍＲＮＡはハイブリッド形成の強度で反 映される。比較のため、レベルが一定のｍＲＮＡに関するコントロールプローブ （Ｎえば、β−アクチン）とのハイブリッド形成で結果を標準化させる。低レベ ルのｎｍ２３−Ｈｌ又はｎｍ２３−Ｈ２の検出は高悪性潜在能力の腫瘍を示す。

（２）ヌクレアーゼ保護アッセイ、腫瘍サンプルから単離されたＲＮＡは、標識 された相補的ＤＮＡ又はＲＮＡとの二本鎖形成能力により、ｎｍ２３−Ｈｌ又は ｎｍ２３−Ｈ２の含有量に関して分析できる。ｎｍ２３−Ｈｌ又はｎ　ｍ　２　 Ｂ　−Ｈ２ヌクレオチド配列の全部又は一部を用いて、プラスミドが対応ｍＲＮ Ａと相補的な核酸プローブの産生用に形成できる。このようなベクターの例とし では、ＲＮＡプローブ用のＴ７もしくはＳＰ６プロモーターに基づくベクター、 又は、オリゴヌクレオチドブライミングを用いたＤＮＡプローブ製造用のｍ１３ フアージがある。このようなベクターから製造されたプローブは、過剰プローブ の条件下で腫瘍サンプルからのＲＮＡと完全にハイブリッド形成する。ＲＮアー ゼはモル非ハイブリッド形成ＲＮＡプローブを除去するために使用でき、又はＳ １ヌクレアーゼもしくは他の一本鎖特異性ＤＮアーゼは非ハイブリッド形成りＮ Ａプローブを除去するために使用できる。次いでこれらは変性ゲル電気泳動及び オートラジオグラフィーに付される。保護プローブに相当するバンドの強度が、 サンプルからのｎｍ２３−Ｈｌ又はｎｍ２３−　Ｈｌのいずれかの量である。レ ベルが変化していないｍＲＮＡに関するヌクレアーゼ保護実験も含めれば、結果 を標準化できる。相対的に低レベルのｎｍ２３−Ｈｌ又はｎｍ２３−Ｈｌである 腫瘍の検出は高悪性潜在能力の腫瘍を示す。

（２）腫瘍切片中におけるｎｍ２３−Ｈｌ又はｎｍ２Ｂ−Ｈｌの現場ハイブリッ ド形成から、腫瘍の個々の細胞におけるｎｍ２３−Ｈｌ又はＨｌ　ｍＲＮＡの量 が分析される。ｎｍ２３−Ｈｌ又はＨ２配列に相補的なプローブは前記のように 製造でき、（パラフィンの使用によるような標準的技術で包埋されたか又はそれ 以外で保存された）腫瘍サンプルの薄い切片内でｍＲＮＡとハイブリッド形成で きる。非ハイブリッド形成プローブはヌクレアーゼで除去できる。ハイブリッド 形成はオートラジオグラフィー又は他の方法で検出できる。ハイブリッド形成の 強度は腫瘍細胞内におけるｎｍ２３−Ｍｌ又はＨｌ　ｍＲＮＡの量を反映する。

腫瘍細胞が低レベルのｎｍ２３を含有する場合、それらは高度に悪性であると思 われる。

ヒトｎｍ２３ＤＮＡ　（ＲＮＡ）はヒト癌細胞におけるこのようなりＮＡの異常 を検出して、それにより癌の侵攻を予測する上で役立てるために用いてもよい（ 異常はより侵攻性の細胞でみられる）。このような方法としては以下がある： （１）腫瘍から単離されたＤＮＡは、プロットハイブリッド形成により、ｎｍ２ ３−Ｈｌ又はＨ２遺伝子の異常に関して試験できる。正常組織及び腫瘍組織から 単離されたＤＮＡは制限酵素で断片化され、ゲル電気泳動に付され、ニトロセル ロース又は他の支持マトリックスに移され、ｎｍ２３−Ｈｌ及びＨ２遺伝子断片 は、前記ｃＤＮＡの全部もしくは一部又はｎｍ２３−ＨｌもしくはＨ２遺伝子の 他の領域を含むプローブを用いてハイブリッド形成により検出される（サザンプ ロット操作）。

正常又は腫瘍細胞からのＤＮＡ間におけるハイブリッド形成パターンの差異はｎ ｍ２３−　Ｈｌ又はＨ２遺伝子に関する異常を示す。

（２）ｎｍ２３−Ｈｌ又はＨ２遺伝子に関する対立遺伝子欠失の確認。各ｎｍ２ ３遺伝子に関する制限鎖長冬型（ＲＦＬＰ）はサザンプロット操作で確認するこ とができる。ＲＦＬＰは、ＲＦＬＰに関して異型接合性である患者において、遺 伝子に関する個々の対立遺伝子を確認するために用いてもよい。−患者の正常及 び腫瘍細胞からのＤＮＡが、ｎｍ２Ｂ−Ｈｌ又はＨｌのいずれかに関する腫瘍Ｄ ＮＡで対立遺伝子欠失があることを示す場合、このような変化は高悪性潜在能力 の腫瘍を示す。

（３）ｎｍ２３−Ｈｌ又はＨｌに関する遺伝子配列内における遺伝子異常の確認 。ヌクレオチド配列分析は腫瘍サンプル中におけるｎｍ２３−Ｈｌ又はＨｌの遺 伝子構造を調べるために用いることができる。ｎｍ２３−Ｈｌ及びＨｌのヌクレ オチド配列は正常配列を規定する。

患者のＤＮＡにおけるこれら配列の変化は高転移潜在能力の腫瘍を示す。

ヒトｎ　ｍ　２３　Ｄ　Ｎ　Ａはヒトｎｍ２Ｂタンパク質を産生ずる上で適切な 発現ビヒクル中に組み込んでもよい。

適切なりＮＡ配列は広範囲のベクター又はプラスミドのうちいずれに含有させて もよい。このようなベクターとしては染色体、非染色体及び合成りＮＡ配列；例 えばＳＶ４０の誘導体：細菌プラスミド、ファージＤＮＡ　。

酵母プラスミド；プラスミド及びファージＤＮＡ、ワクシニア、アデノウィルス 、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病等のようなウィルスＤＮＡの組合せから誘導される ベクターがある。

適切なりＮＡ配列は様々な操作でベクター中に挿入させてよい。一般に、ＤＮＡ 配列は当業界で公知の操作により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され る。

このような操作及びその他はいわゆる当業者が知る範囲内に属すると思われる。

ベクター中におけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指示するため適切な発現コン トロール配列（プロモーター）に作動的に結合される。このようなプロモーター の代表例としては、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐ 、ファージラムダＰＬプロモーター及びその他の原核及び真核細胞又はそれらの ウィルスにおいて遺伝子の発現をコントロールすることが知られたプロモーター が挙げられる。発現ベクターは翻訳開始及び転写終結に関するリポソーム結合部 位も含む。ベクターは発現を増幅させるために適した配列も含んでよい。

加えて、発現ベクターは真核細胞培養のためジヒドロ葉酸レダクターゼもしくは ネオマイシン耐性又は大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐 性のような形質転換宿主細胞の選択用に表現型の形質を提供する遺伝子を含むこ とが好ましい。

前記のように適切なりＮＡ配列及び適切なプロモーター又はコントロール配列を 含むベクターは、適切な宿主を形質転換させて宿主にタンパク質を発現させるた めに用いてよい。適切な宿主の代表例としては、大腸菌、サルモネラ・チフィム リウム（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉａ＋ｕｒｉｕｓ）のような細菌細胞 、酵母のような真菌細胞、ＣＨＯ又はボーウェス（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマのよ うな動物細胞；植物細胞等が挙げられる。適切な宿主の選択は本開示から当業者 の範囲内に属すると思われる。

慣用的ペプチド化学により、例えばペプチドシンセサイザー及び固相技術の使用 によりヒトｎｍ２３タンパク質を産生ずることも可能である。

ヒトｎｍ２３タンパク質はｎｍ２３抗体を産生ずるために用いることができる。

ヒトｎｍ２３タンパク質に対する抗体は当業界で通常知られる操作により産生じ てよい。例えば、ポリクローナル抗体は、単独の又は適切なタンパク質にカップ リングされたタンパク質を非ヒト動物に注入することで産生じてもよい。適切な 期間の後、動物から採血され、血清が回収され、当業界で公知の技術により精製 される。モノクローナル抗体は、例えば免疫Ｂ−リンパ球とミエローマ細胞との 融合からなるＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ　（２）の技術で製造される。

例えば、前記のような抗原は、ポリクローナル抗体応答がマウス血清で検出され るまで前記のようにマウスに注入することができる。マウスは再度追加免疫して もよく、その牌臓が摘出され、ミエローマとの融合が様々な方法に従い行われる 。個々の生存ハイブリドーマ細胞は、まず免疫抗原と結合しうるそれらの能力に より、次に細胞からのｎｍ２３−Ｈｌ及びＨｌを免疫沈降させつるそれらの能力 により、抗ｎ　ｍ　２３抗体の分泌に関して試験される。このため、ヒトｎｍ２ ３タンパク質に応答して誘導される抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗 体のいずれであってもよい。

ｎｍ２３抗体は低レベルのｎｍ２３タンパク質、ひいては転移性又は悪性である 高い能力を有した腫瘍を検出するために用いることができる。このような抗体は 精製されても又はされなくてもよい。このようなアッセイに関するフォーマット としては以下がある：（１）免疫組織化学分析、腫瘍の切片は抗ｎｍ２３−Ｈｌ 又はＨ２抗体と反応させることができ、免疫複合体はペルオキシダーゼ標識第二 抗体のような標準的かつ市販品によって検出される。このような免疫染色の密度 から、細胞で産生されるｎｍ２３−Ｈｌ又はＨｌの量を評価できる。

（２）固相免疫アッセイ、このようなアッセイは、腫瘍組織の可溶性抽出物中に おけるｎｍ２３−Ｈｌ及びＨｌの量を定量測定するために用いることができる。

このようなアッセイにおいて、抗体又は抗原いずれかの１成分が固体支持腫瘍に 固定される。

このため、本発明のもう１つの面によれば、アッセイにおいて特異的結合剤とし て前記タイプのｎｍ２３抗体を用いるヒトｎｍ２３タンパク質の検出又は測定用 のアッセイが提供される。

用いられるアッセイ技術は、ｎｍ２３抗体がサンプル中に存在するヒトｎｍ２３ タンパク質と結合する結合剤として固体支持体に支持され、結合タンパク質が適 切なトレーサーの使用により測定されるアッセイであることが好ましい。

トレーサーは、検出可能標識で標識されたリガンドから構成される。そのリガン ドはヒトｎｍ２３タンパク質で免疫学的に結合されたものであり、このようなリ ガンドは当業界で公知の技術により標識してもよい。

このため、例えば、固体支持体上のｎｍ２３抗体に結合されたヒトｎｍ２３タン パク質は適切な検出可能標識で標識されたｎｍ２３抗体の使用により測定される 。

このようなサンドイッチアッセイ技術において、標識されたｎｍ２３抗体はモノ クローナル抗体でも又はポリクローナル抗体であってもよく；例えばポリクロー ナル抗体はヒトｎｍ２３タンパク質に特異的な抗体であってもよく、その抗体は 当業界で公知の操作、例えば適切な動物をヒトｎｍ２３タンパク質で接種する操 作により産生じてよい。

検出可能標識は酵素、放射線標識、全色原（ケイ光及び／又は吸着色素の双方を 含む）等を含めた様々な検出可能６１歳のうちいずれであってもよい。検出可能 標識の選択は、本開示から当業者の範囲内に属すると思われる。

ｎｍ２３抗体に関する固体支持体は様々な固体支持体。

のうちいずれであってもよく、適切な支持体の選択は本開示から当業者の範囲内 に属すると思われる。例えば、固体支持体は微量滴定プレート、チューブ、粒子 等であるが、しかしながら本発明の範囲はいかなる代表的支持体にも制限されな い。ｎｍ２３抗体は当業界で公知の技術、例えばコーティング、共有結合カップ リング等により支持体に支持される。適切な技術の選択は本開示から当業者の範 囲内に属すると思われる。

サンドイッチアッセイは様々な技術、例えば“フォワード＝　（ｆｏｒｗａｒｄ ）、“リバーズ”　（ｒｅｖｅｒｓｅ）又は“同時。

で実施できるが、しかしながらフォワード技術が好ましい。

典型的操作において、固体支持体に支持されたｎｍ２３抗体は、サンプル中に存 在するこのようなタンパク質のいずれかを支持体上のこのような抗体と特異的に 結合させるため、まずヒトｎｍ２３タンパク質を含有するか又はその含有が疑わ れるサンプルと接触される。

固体支持体の洗浄後、支持体はヒトｎ　ｍ　２３タンパク質と結合するトレーサ ーと接触される。このようなタンパク質がサンプル中に存在すると、トレーサー は固体支持体上の抗体と結合したこのようなタンパク質と結合するようになり、 固体支持体上にｉけるトレーサーの存在ｉヨサンプル中におけるヒトｎｍ２３タ ンパク質の存在を示す。トレーサーの存在ホ二゛当業界で公知の操作により好ま しζ′λ操作は与ンドイッチアッセイであるが、ｎｍら３抗体は他のアッセイ技 術、例えばｎｍ２３抗体がラテックス粒子のよう一固体粒子上で用いられる凝集 アッセイで用いでもよε）ことが理耐基れる。

本発明のｉう１つの面１許よれば、ｎｍ２３抗体、好ましくはｎｍ２３タンパク 質に応答して誘導されるｎｍ２３抗体、を含有したヒトｎｍ２３タンパク質測定 用のアッセイキット文はパッケージが提供される。ｎｍ２３抗体は検出゛可能マ ーカー又は標識で標識しても又はしなくてとよい。キットが免疫組織化学アッセ イに用いられる場合、そのキットは未標識ｎｍ２３抗体及びそのｎｍ２３抗体と 免疫結合する標識抗体を含有していてもよい。

キットが免疫アッセイに用いられる場合、そのキットは支持ｎ　ｍ　２３抗体及 び非支持ｎｍ２３抗体の双方を含有していてもよいが、これは検出可能標識又は マーカーで標識されていることが好ましい。そのキットは緩衝液等のような他の 成分も含有してよい。

本発明は下記の実施例で更に説明されるが、しかしながら本発明の範囲はそれに より制限されない。実施例中において、他に指摘がなければ、精製、切断及び結 合は＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　１ａｂｏ’ｒａｔｏｒｙ　ｍ ａｎｕａ＋−（分子クローニング、実験マニュアル）ｂｙ　Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ｅｔ　ａｌ、、ｃｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ １９８２’）に記載されたように実施される。

実施例１ ２種の別個のｃＤＮＡを、正常ヒト繊維芽細胞ｍＲＮＡから作られたｃ　ＤＮＡ ライブラリーから単離した。標準的技術を全体にわたり用いた。プローブとして 、我々はｐ　ｎ　ｍ　２３−　Ｍ　１の５０２−基Ｈｐａｌｌ制限断片を用いた 。Ｓｔｅ’ｅｇら（３）。このＤＮＡはＤＥ４５膜を用いて、アガロースゲル電 気泳動から単離した（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｅｕｅｌｌ）　ｏその ＤＮＡはニックトランスレーション反応（Ａｓｅｒｓｈａｍ　ｋｉｔ）及びｐ３ ２ＰｄＣＴＰ（Ａｖｔｅｒｓｈａｍ）を用いて放射化した。旧ｒｏｔｏ　Ｏｋａ ｙａｌａ（Ｏｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｔ、　（４）　）から得たｃＤＮＡライブ ラリーの個々の細菌をアガロ−スルリアブロスプレート上に分散させた。増殖後 にそれらをニトロセルロースに移しく５ｃｈｌｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｅｕ ｅｌｌ）　、０．　５Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨ及び１．５Ｍ　ＮａＣ１を用いて溶離さ せ、ＩＭＮＨＡｃで中和した。ＤＮＡをベーキングでニトロセルロースに固定し た。放射線プローブとのハイブリッド形成を４０％ホルムアミド、０．７５Ｍ　 ＮａＣ１，０，０７５Ｍクエン酸Ｎａ、０．２％牛血清アルブミン、０，２％フ ィコール（Ｆｉｃｏｌ）　ｓ　Ｏ，２％ポリビニルピロリドン及び２　ｓｇ／ｍ ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ中で行った。ハイブリッド形成は４２℃で１５時間行った。ハイ ブリッド形成の後、フィルターを室温で２０分間にわたり０．３Ｍ　ＮａＣ１゜ ０．０３Ｍクエン酸Ｎａで２回洗浄し、しかる後４２℃で各２０分間にわたり０ ．０１５Ｍ　ＮａＣ１及びｏ、ｏｏｘ５Ｍクエン酸Ｎａで２回洗浄した。陽性ハ イブリッド形成をオートラジオグラフィーで５つの細菌について検出した。これ らを単一細胞クローニングで精製した。

ＤＮＡを５クローンの各々から抽出し、制限酵素分析で分析した。別個のパター ンを２クローンのｐｎｍ２３−Ｈｌ及びｐｎｍ２３−Ｈ２に関して確認した。こ れらを次の分析に付した。

ｐｎｍ２３−Ｈｌ及びｐｎｍ２３−Ｈ２のＤＮＡ配列はジデオキシチェインター ミネイション法（５）　（Ｕ、Ｓ。

ＢＩＯｅｈｅ層１ｃａｌ　ｋｉｔ　）を用いて決定した。この目的のため、ｐｎ ｍ２３−Ｈｌ及びｐｎｍ２３−Ｈ２のＸｈｏｌ断片をプラスミドから除去し、標 準的技術を用いてＭ　１３　ｍｐ１８　（ＢＲＬ）の５ａｌＩ部位に挿入した。

ＤＮＡ配列分析は、反応プライマーとして合成１７塩基オリゴヌクレオチドを用 いて行った。ｐｎｍ２３−Ｈｌ及びｐｎｍ２３−　Ｈ２のＤＮＡ配列は第２図及 び第３図に示されている。第２図は、ｐｎｍ２３−Ｈｌが推定翻訳開始コドン（ ヌクレオチド８７）の上流にヌクレオチド配列を含むことを示している。第３図 は、ｐｎｍ２３−Ｈ２がオーブン読取り枠内で始まるｍＲＮＡの部分的コピーを 含むことを示す。ヌクレオチド配列の非同−性（類似率９４％）は、ｐｎｍ２３ −Ｈｌ及びｐｎｍ２３−Ｈ２が別の遺伝子の産物であることを示す。

実施例２−ｎｍ２３−Ｈｌ及びｎ　ｍ　２３−　Ｈ２タンパク質の産生 ｐ　ｎ　ｍ　２３−　Ｈ１及びＨ２のヌクレオチド配列は、対応タンパク質に関 する予想タンパク質配列に翻訳することができる。いくつかの方法がこのような タンパク質を形成するために使用できる。

（１）標準的化学操作はｎｍ２３−　Ｈｌ又は■２アミノ酸配列の全部又は一部 に相当するペプチドを合成するために用いることができる。これらのペプチドは 抗体産生のためＫＬＨのようなキャリアタンパク質にカップリングさせることが できる。

（２）ｎｍ２３−Ｈｌの全部もしくは一部又はｎｍ２３−Ｈ２の一部に相当する タンパク質は、細菌転写促進シグナルの指示下において細菌内で合成できる。ｎ ｍ２３−Ｈｌタンパク質は、（６）に記載されたものに類似したベクターにおい て、バクテリオファージラムダＰＬプロモーターの指示下で発現されている。こ のベクターは第１図に示されたように構築された。プラスミドｐＢＲ３２２をＥ ｃｏＲＩ及びＡｕａｌで切断し、塩基断片をアガロースゲル電気泳動で単離した 。これはいくつかの酵素部位、細菌リポソーム結合部位及びＮｃｏｌ制限酵素部 位含有翻訳開始コドンを含んだ合成制限断片（第１図）と組合せた。これらをＴ ４ＤＮＡリガーゼと反応させ、大腸菌に組込んで形質転換させ、正しい構造のプ ラスミドを確認した。これらプラスミドからのＤＮＡをＢｓ　ｔＸＩ及びＢａｍ ＨＩで切断し、バクテリオファージＤＮＡの４．　５ｋｂＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ 断片のＢｓ　ｔＸＩ−Ｂｇｌｌ＋切断と組合せた。このＢｓｔＸＩ−Ｂｇｌｌｌ 断片はＰＬプロモーターを含む。結合及び大腸菌（ｃＩ８５７ブロフアージを含 む）での形質転換後、第１図に示された構造を含むプラスミドを確認した。これ らプラスミドからのＤＮＡをＢｓ　ｔＸＩ及びＨｐａｌで切断し、各ＤＮＡの付 着末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ工大断片で補充した。これを標準条件下で結 合させ、大腸菌に組込んで形質転換させた（７）。ｎｍ２−　Ｈｌは、超コイル 化分子から直鎖形への変換で確認されるような部分的切断分子を産生するため、 ＤＮＡ１μｇ当たり酵素１単位の比率で２分間かけてＮｃａｌで切断することに よりＭ　１３　ｍ　ｐ　１８から除去された。これをフェノール／ＣＨＣ１２抽 出し、エタノール沈降させてＮｃｏＩ酵素を除去し、更にＥｃｏＲＩで切断した 。０．７ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動から単離した。この断片をＥｃｏＲ Ｉ及びＮｃｏＩで切断されたプラスミドｐＰＬと混合し、結合させ、大腸菌に組 込んで形質転換させた。

ヒトｎｍ２３−Ｈｌタンパク質の合成を指示できる細菌クローンが確認された。

細菌を３２℃で０Ｄ６６０−１となるまで増殖させ、温、度をシフトさせて４２ ℃で１６時間増殖させた。全細菌タンパク質を、ＳＤＳ含有１５％ポリアクリル アミドゲルを含有した中で電気泳動により試験した。ヒトｎｍ２３−　Ｈｌタン パク質は、そのタンパク質のアミノ酸８６−１０２に対する１抗ペプチド抗血清 と反応できる１　９　ｋＤａタンパク質として確認された。

ヒトｎｍ２３−　Ｈｌタンパク質は様々な方法により細菌から精製できる。例え ば、増殖及び温度シフト誘導後、細菌をｐＨ７，５の２０ｍＭ）リス、１５０ｎ ＭＮａＣ１（ＴＢＳ）中における音波処理で溶離させた。不溶性物質を１００． ０００Ｘｇで３０分間の遠心により除去した。次いで硫酸アンモニウムを６０％ 飽和溶液まで加え、タンパク質を４℃で１０分間かけて沈降させた。これらのタ ンパク質を１００，０００ｘｇで１０分間の遠心により集め、沈降物をＴＢＳに 溶解させた。７１６時間の透析後、細かな沈降物を１０，０００Ｘｇで１０分間 の遠心により集める。これはＴＢＳ及び１　ｍＭＤ　Ｔ　Ｔに可溶化する。こう して得られたタンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判断したと ころ純度８０％以上である。こうして得られたタンパク質は抗体産生及び生物学 的修飾実験における免疫抗原として使用上適している。

ｎｍ２３−Ｈｌ及びＨ２のヌクレオチド配列は、真核細胞でいずれかのタンパク 質を発現する。酵母〜ヒト組織培養細胞の範囲にわたる細胞においてタンパク質 の発現用に入手可能な様々な系が存在する。ｎｍ２３−Ｈｌ又はＨ２タンパク質 の発現用に必要な必須要素は、ｎｍ２３の合成を指示できるヌクレオチド配列で あった。

実施例３−　ｎｍ２３抗体の産生 実施例３セクシヨンで記載された産物は抗原として使用できる。これらはそのま まで又はキーホール・リンピド（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｉｄ）ヘモシアニン のようなキャリアタンパク質にカップリングして用いることができる。カップリ ングは確立された技術を用いて及びＥＤＣのような架橋剤を用いて行える。次い で抗原をアジュバント（例えば、フロイント）と混合し、（ウサギ、ラット又は ヤギのような）動物に注射する。アジュバント（例えば、フロイント不完全）と 混合された抗原による追加免疫注射後、動物から採血し、血清を調製する。抗体 の存在は免疫沈降、ウェスターンプロット又は固相結合アッセイ（例えば、ＥＬ ＩＳＡ）でモニターすることができる。

ｎｍ２３−Ｈｌ又はＨ２に対するポリクローナル抗血清は、アフィニティクロマ トグラフイーにより精製された形で得ることができる。免疫グロブリン分子はブ ドウ球菌タンパク質Ａ結合により血清から得ることができ、抗ｎｍ２３−Ｈ１又 はＨ２は適切なｎｍ２３抗原が化学的に固定された固体マトリックスとの結合に より得た。

実施例４−モノクローナル抗体の製造 Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウスを、免疫用にフロイント完全アジュバントと及び 追加免疫用にフロイント不完全アジュバントと混合された精製ｎｍ２３−Ｈｌタ ンパク質１００μｇの１週間間隔で３回のＩＰ注射により免疫した。ハイブリド ーマはＬａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ、、１２１．ｐ 。

［１３（１９８Ｂ）の方法により得た。融合の相手はミエローマＰ３ｘ６３−Ａ ＴＣＣから得られるＡｇ８．６５３であった。融合細胞にＬａｎｅ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｈｙｂｒｉｄｏｓａ、Ｖｏｌ、７．ｐ、２８９（１９８ｇ）　の方法で得ら れた腹腔内細胞をいれた。ｌ−イブリドーマをＮＣＴＣ−１０９（Ｇｉｂｃｏ　 ）　、７．　５％牛脂児血清（Ｓｉｇｍａ　）　、７．５％ＣＳ　Ｐ　Ｒ−３（ Ｓｉｇｍａ　）、１ｍＭピルビン酸Ｎａ、１００単位ペニシリン、１００μｇス トレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌインシュリン及び２５μＮβ−メルカプトエ タノールで補充され０．１履阿ヒボキサンチン、０，４μＭアンホブテリン及び ０．０１６ｍＭチミジンを含有したＤＭＥＭ中で増殖させた。ハイブリドーマク ローンを９６穴皿で２週間にわたり増殖させた。抗ｎｍ２３産生ハイブリドーマ はＥＬＩＳＡで確認した。精製され乍ｎｍ２３ＩＨトタンバク質をイムロン（１ ＋１ｌｌｕｌｏｎ）　１皿に結合させ、ノーイブリド−マ培地を室温で２時間反 応させた。

抗体反応はＢＲＬ　ＨＹＢＲＬキットでその条件下ビオチニル化ヤギ抗マウス抗 体及びステブタビクジン（ｓｔｅｐｔａｖｆｃｄｆｎ）西洋ワサビペルオキシダ ーゼを用いて検出した。陽性・１イブリドーマは５％ハイブリドーマ増殖助剤（ Ｆｉｓｈｅｒ）含有の前記培地において限界希釈によりクローニングした。これ らをＥＬＩＳＡで反応性に関して試験した。ヒトｎｍ２３タンパク質との反応は ウェスターンブロッティングアッセイで確認した。

実施例５−転移腫瘍の検出 ヒトｎｍ２３−Ｈｌ及びＨ２タンパク質に特異的な抗体は前記のようにして得る ことができる。ｎｍ２３−　Ｈ１配列のアミノ酸４５−６１に対する１つのこの ようなに用いられた。標準的技術が免疫組織化学用の切片の製造に用いることが できる。これらの方法としてはサンプルの凍結切片化又はホルマリン固定しかる 後パラフィン包埋がある。この例において、腫瘍切片を１０％中和緩衝化ホルマ リン中で一夜かけて固定し、自動組織プロセッサー（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてパ ラフィン中に包埋させた。

５ミクロン切片を切出し、キシレン及びアルコールを要する標準的操作を用いて 脱パラフイン化した。次いで切片をアフィニティ精製抗ペプチド抗体により１／ ２００希釈で免疫染色した：免疫染色はビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体しかる後 アビジンビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて製造業者（Ｖｅｃｔ ｏｒ）から示されたような標準的技術により行った。室温で５分間にわたる０　 、　５　ｇｇ／ｌでの発色反応（ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）後 、反応を停止させるため水洗した。

次いで切片をマイヤーズ（Ｍａｙｅｒｓ）ヘマトキシリンを用いて対比染色し、 脱水し、カバーガラスを標準的方法で適用した。次いで切片を明確な細胞質染色 のため光学顕微鏡で調べた。腫瘍が腋窩リンパ節に広がった乳癌患者からの２サ ンプルはほとんど染色を示さない；癌が胸部に限定された患者からの２サンプル は異なる染色を示す。

これは低ｎｍ２３タンパク質発現の検出が初期部位以外に広がる傾向がある悪性 腫瘍を確認していることを示す。

本発明の様々な修正及び変更が上記開示からみて可能であり；したがって添付さ れた請求の範囲内において本発明は具体的に記載された以外で実施してもよい。

参考文献 １、　Ｌｅｈｒａｅｈ、Ｈ，、Ｂｌｏｃｈｅｓｌｓｔｒｙ、１Ｂ、ｐ、４７４３ （１９７５）。

２、　Ｋｏｈｌｅｒ−旧１１ｓｔｅｉｎ、Ｇａ１ｆ’ｒｅ、Ｇ、ａｎｄ旧１ｓｔ ｅｌｎ、ｃ、　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ、、７３．ｐ、１（１９８１）。

３、　Ｓｔｅｅｇ　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＮＣｌ、８０．ｐ、２００（１９８８） 。

４、Ｏｋａｙａｗａ、Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｌ、、３．ｐ、２８０（１９８３）。

５、　Ｓａｎｇｅｒ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　ＡｃａｄＪｃ ｉ、、ＵＳＡ、７４゜９．５４６３（１９７７）。

６、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、ａｎｄ　５ｈａｔＺｌａｎ　Ａ、、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　Ｅｎｚ、、１０１．１）、１２３（１９８３）。

７、　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　１ｎｔｏ　Ｅ、ｃｏｌｉ　（大腸菌での 形質転換）、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１ ９８２）。

第１図の説明 Ａ−Ａｖａｌ　；Ｒ−ＥｃｏＲＩ　；Ｂ−ＢａｍＨＩ　；Ｂｘ＝Ｂｓ　ｔＸＩ　 ；Ｈ−Ｈｐａ　Ｉ　；Ｎ−Ｎｃｏ　Ｉ、バクテリオファージラムダＰＬプロモー ター位置は矢印及び“ＰＬ”で示される。ラムダバクテリオファージラムダＮ遺 伝子はボックス及び“Ｎ遺伝子”で示される。リポソーム結合配列の位置はＳ１ ０で示される。タンパク質イニシエーターａｔｇの位置は’ａ　ｔ　ｇ”で示さ れる。２つの矢印が集まる箇所では結合反応が行われる。

ｐＰＬ−ｎｍ２３−ＨＩ ＦＩＧ、１ ＴＧＣＴＧＣＧＡＡ　ＣＣＡ　ＣＧＴ　ＧＧＧ　ＴＣＣＣＧＧ　ＧＣＧ　ＣＧＴ 　ＴＴＣＧＧＧ　ＴＧＣＴＧＧ　ＣＧＧ　ＣＴＧＧＡＧ　ＴＴＣＴＣＣＣＴＧ　 ＴＡＣＡＧＴ　（ｉＴＴ　ＡＣＣＡ丁ＣＣＣＣＧＡＣＣＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　 ＡＡＡ　ＡＴＧＣＴＴ　ＣＣＴ　ＣＣＣ葺ｐＯ１ｙＡ　ＦＩＧ、　２ＡＧＡ　Ｇ ＧＣＡＡＣＡＧＧ　Ａｎ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＧＡＧ　 ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＧＣＣＡＡＴＡＡ　ＡＧＣＴＴＴ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＣＣＧ 　（ｐｏｌｙ　Ａ）ＦＩＧ、　３ 国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトｎｍ２３ＤＮＡ。
2. ２．第２図の配列を含む、請求項１に記載のヒトｎｍ２３ＤＮＡ。
3. ３．第３図の配列を含む、請求項１に記載のヒトｎｍ２３ＤＮＡ。
4. ４．ｎｍ２３抗体。
5. ５．ヒトｎｍ２３タンパク質。
6. ６．第２図の配列を有する、請求項５に記載のヒトｎｍ２３タンパク質。
7. ７．第３図の配列を有する、請求項５に記載のヒトｎｍ２３タンパク質。
8. ８．ヒトから得られたサンプルをｎｍ２３抗体と接触させ、そのｎｍ２３抗体と 結合したサンプル中のヒトｎｍ２３の存在を決定することからなる、ヒトｎｍ２ ３タンパク質の分析法。
9. ９．請求項１に記載のＤＮＡを含んでなる、発現ビヒクル。
10. １０．請求項１に記載のＤＮＡで遺伝子工学処理された、宿主。
11. １１．ヒトｎｍ２３タンパク質に応答して誘導される、請求項４に記載の抗体。
12. １２．請求項２に記載のＤＮＡで遺伝子工学処理された、宿主。
13. １３．請求項３に記載のＤＮＡで遺伝子工学処理された、宿主。
14. １４．請求項６に記載のタンパク質を認識する、抗体。
15. １５．請求項７に記載のタンパク質を認識する、抗体。
16. １６．抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載の抗体。
17. １７．ヒト腫瘍の悪性潜在能力を予想するための方法であって、 ヒト腫瘍の悪性潜在能力を予想するためｎｍ２３抗体との免疫反応により腫瘍の ヒトｎｍ２３タンパク質を検出ことからなる方法。
18. １８．ｎｍ２３抗体がヒトｎｍ２３タンパク質に応答して誘導されたものである 、請求項１７に記載の方法。
19. １９．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．ＤＮＡが全鎖長ヒトｎｍ２３タンパク質をコードする、請求項１に記載の ＤＮＡ。
21. ２１．タンパク質が全鎖長ヒトｎｍ２３タンパク質である、請求項５に記載のタ ンパク質。