JP2688481B2 - 消化管起源の悪性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法 - Google Patents
消化管起源の悪性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒト消化管の腫瘍細胞における悪性細胞の
増殖の有無特に腺癌型細胞の増殖の有無をin vitro検出
する方法に係る。 いくつかの高等真核細胞型を同定するため及びこれら
の細胞の種々の発生段階、特に分化段階の追跡研究のた
めに、特異的ラベルとして構造タンパク質の検出を利用
することは既に提案されている。公知のラベルとしては
例えば、線維タンパク質例えばビメンチル、ケラチン又
は神経線維タンパク質があり、これらは幾つかの細胞型
の同定、胚形成時期から細胞分化の最終時期までの細胞
の発生の研究及び環境培地に対する細胞の挙動の研究に
使用できる（E.LAZARIDES、Nature、283、249（1980）
及びR.MOLL等、Cell、31、11（1982））。 ケラチンはしばしば上皮細胞と非上皮細胞とを識別し
得る特に有効なラベルと考えられる。しかし乍ら、この
種の識別では、該当する上皮細胞の起源を必ずしも明確
に確定することはできないことが判明した。 しかし乍ら、幾つかの細胞型の起源を確実に検出する
ことの必要性は、多くの場合、例えば腫瘍細胞の増殖を
示す生物サンプルを検査する場合に、この増殖の起源に
存在する一次腫瘍細胞を同定するため又は消化領域の癌
を起源とする転移の存在を検出するため又は転移癌に対
する化学療法及びその他の療法の効果を確認するために
特に重要視されつつある。勿論、抗癌治療の効果は疾患
の一次原因たる腫瘍細胞の正確な同定とのつながりが深
い。 これらの観察は、（臨床的に発見される癌のうちの高
い割合を占める）消火器官起源又は腎臓起源の腫瘍細胞
の増殖又はこれら細胞から誘導された細胞の増殖の検出
好ましくは早期発見、特にこれら細胞の特有ラベルの固
定のために特に重要である。 従って本発明は特に、消化器官の粘膜特に腸粘膜中に
通常は存在し主な分化型が吸収細胞又は腸細胞から構成
される上皮細胞の幾つかの主要表現型を維持した腫瘍細
胞の検出に重要である。 本発明はまた、これら腫瘍細胞に担持されるか否かに
かかわりなく検出され得る特異的ラベルに係る。 本発明の目的は特に、これらラベルが腫瘍細胞特に該
細胞の壊死の場合に該細胞から離脱し例えば血管系に遊
離されたときにもラベルを検出することである。 本発明の範囲内で使用されるラベルは、絨毛の全部又
は一部から構成される。絨毛タンパク質は、通常は消化
粘膜特に腸粘膜の絨毛組織中に存在する分子量約95,000
ドルトンのオーダのタンパク質である。絨毛タンパク質
はカルシウムイオンの存在下でアクチンと結合し得る。 絨毛の種類毎にアミノ酸配列は若干異なっているが機
能特性は維持されている。今日まで公知の精製技術では
ニワトリ及びブタの絨毛タンパク質を実質的に純粋な状
態まで精製し得る。しかし乍らこれらの技術ではヒト絨
毛タンパク質を精製することはできない。 最もよく知られた絨毛タンパク質の１つはニワトリの
絨毛タンパク質である。この絨毛タンパク質は854個の
アミノ酸配列から形成されている。トリプシン及びプロ
テアーゼＶ−８を使用したタンパク質限定分解によって
所定箇所を切断し44Kd,51Kd及び10Kdの断片を得ること
ができる。絨毛タンパク質のマップ内でのこれら断片の
相対位置は、Paul MADSUDAIRA、MRC、Laboratory of Mo
lecular Biology、Cambridge、U.K.及びJohn GLENNEY
等、J.B.C.、1981、256、8156−8161によって以下のご
とく確認されている。 Ti:トリプシン切断 V8:プロテアーゼV8による切断 ニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端のアミノ酸配列
（779−854）即ち「ヘッド部」（「ペプチドHP」）は以
下の式で示される。 一般的に絨毛タンパク質は、特に分化終期に到達した
腸細胞の表面で観察される腸内腔壁の刷毛縁中に存在す
る。微絨毛は腸細胞の分化終期の集合オルガネラであ
る。絨毛タンパク質は特に微絨毛の軸方向微線維束中に
局在している。絨毛タンパク質は、細胞骨格の構成に寄
与している。凍結切片を免疫蛍光で検査すると、絨毛タ
ンパク質が腸内壁に露出する円柱を形成する細長い細胞
の頂端に存在し、また腎臓の近位尿細管細胞の近傍にも
存在することを確認した。いずれの場合も絨毛タンパク
質の存在領域は該当細胞の刷毛縁と一致する。しかし乍
ら、その他の種々の上皮の別の種々の絨毛が極めて組織
化された刷毛縁を持たないときは絨毛タンパク質は検出
されなかった（A.BRETSCHER等、Exp.Cell.res.135、213
（1981）又はA.LISSの著書Membrane in Growth and Dev
elopment（成長及び発生中の膜）、New York（1982）、
pp.89−105に所収のH.REGGIOの論文）。 更に、絨毛タンパク質が刷毛縁の形成よりかなり早い
発生早期の腸細胞中に存在することも確認された。 本発明は、２つの知見により得られたものである。絨
毛タンパク質は消化管の組織腫瘍形成中、特に最も頻繁
な癌の形態の１つたる結腸の癌、及び幾つかのタイプの
腎臓癌においては実質的に組織的に検出可能な状態で維
持されるが、その他の器官（肝臓、卵巣、肺等）に局在
する組織の初期癌化から生じる一次腫瘍細胞中では決し
て検出されない。 更に、絨毛タンパク質は、消化部の腫瘍細胞の全ての
発生箇所で腫瘍形成の早期及びより遅い時期に、該当細
胞の分化状態にかかわりなくin vivo検出可能である。 生物サンプル中の最初から消化部で形成された腫瘍細
胞及び／又は該腫瘍細胞の誘導体をin vitro検出するこ
とを主目的とする本発明の診断方法の特徴は、この生物
サンプルを絨毛タンパク質に対する特異的アフィニティ
をもつか又はこのタンパク質をコードする遺伝子を認識
する試薬と接触させることである。 本発明の検出方法は、消化器官起源の腫瘍細胞又は消
化器官もしくは腎臓起源の一次細胞の影響によって生物
体の別の部分に後で形成された腫瘍細胞を内包する全て
の生物サンプル、又は該細胞の壊死の場合に絨毛ラベル
を含む種々の腫瘍細胞の分解産物を内包する全ての生物
サンプルに適用し得る。この生物サンプルは、いかなる
形態でもよく例えば、生検により得られた組織もしくは
固体腫瘍の断片、又は悪性細胞もしくは該細胞由来の断
片を運ぶ液体生物サンプル例えば全血もしくは血清であ
る。 本発明の実施態様によれば、本発明の検出方法で使用
される試薬は、ヒト絨毛タンパク質特にCOOH末端部のア
ミノ酸配列をコードする領域を含む配列をもつDNAから
構成される。 本発明の別の実施態様によれば、検出方法で使用され
る技術は免疫技術であり、絨毛に特異的アフィニティを
もつ試薬は絨毛タンパク質を認識し得る抗体から構成さ
れる。 これらの抗体は、公知の任意の方法で抗体自体がラベ
ルされるか、又は、絨毛タンパク質もしくは絨毛タンパ
ク質担持細胞に固定された状態のときはラベル免疫グロ
ブリン又はその他のラベルタンパク質（例えばStaphylo
coccus aureusのプロテインＡ）で認識され得る。 特に適当な技術は、後述する試験で使用され前記のご
とき結果を示す技術である。 本発明の目的はまた、腸細胞又は同類細胞の微絨毛の
箇所の絨毛タンパク質を検出するための新規な特異的手
段を提供することである（勿論新規な手段の使用は、本
発明の検出方法に必ずしも限定されない）。 本発明の１つの特徴によれば、これら手段は、ヒト絨
毛タンパク質の完全mRNAに対応するDNA又はヒト絨毛タ
ンパク質のアミノ酸配列をコードする領域を含むヌクレ
オチド配列をもつDNA断片から構成され、絨毛タンパク
質をコードするヌクレオチド配列と特異的にハイブリダ
イズし得る。 本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質の完全mRNAに対応
するDNA又はヒト絨毛タンパク質のCOOH末端のアミノ酸
をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む
cDNA断片を前記方法において使用することを目的とす
る。このヌクレオチド配列と、コードされたアミノ酸の
対応配列とを以下に示す。 使用されるヌクレオチド配列は、ヒト絨毛タンパク質
をコードするmRNA又はDNAを検出するためのプローブと
して使用される。 この種の検出に適したプローブは、放射性元素によっ
てラベルされるか又は被検mRNAもしくはDNAを含む調製
物とのハイブリダイズ状態で認識可能な別の物質によっ
てラベルされるのが有利である。 従来技術によれば、これらプローブと被検細胞を含む
生物サンプルとを、プローブのヌクレオチド配列と被検
サンプルに任意に含まれる相補的配列とが任意にハイブ
リダイズできる条件下に接触させるか又は核酸と直接接
触させる。 200塩基対のインサートを含むプローブを使用して検
出の再現性を試験した。 本発明の範囲に包含された新規な産生物を構成するこ
れらヌクレオチドプローブの別の特徴は、腸細胞及び／
又は絨毛タンパク質発現細胞の各分化状態及び腎臓又は
腸起源の細胞の種々の成熟時期における絨毛タンパク質
のmRNAの発現を研究するために使用されることである。 従って、得られたプローブはヒト遺伝子バンクから単
離された絨毛タンパク質の遺伝子の数、組織及び構造を
決定し得る。 本発明によれば、ヒト絨毛タンパク質の末端をコード
するヌクレオチド配列の単離は以下の手順で行なわれ
る： −公知技術を使用し絨毛タンパク質を発現する細胞系か
ら完全mRNA（メッセンジャーRNA）を調製する、 −cDNA（相補的DNA）バンクを構築する、 −インサートによってコードされたタンパク質を発現し
得るベクターにcDNAを挿入する、 −得られた組換体ベクターによって細菌株を形質転換
し、次に細菌中で所望タンパク質を発現させ得る条件を
認定する、 −絨毛タンパク質を認識し得る抗体を用いて絨毛タンパ
ク質の特異的クローンを含む組換体クローンを選択す
る。 cDNAバンクの構築段階は、挿入cDNAによってコードさ
れたタンパク質を発現し得るベクターを用いて行なわれ
る。 特に発現効率が高いので特に有利なクローニングベク
ターは、pEXタイプのプラスミドから構成される。かか
るプラスミドは、Stanley及びLuzioによってEMBO Journ
al、1984、３、1429−1434に記載されている。この文献
には、λバクテリオファージのプロモータPRのコントロ
ール下で発現する融合遺伝子cro−lacZを含むプラスミ
ドが記載されている。この発現は温度によって誘発され
る。 複数の非反復制限部位を含むポリヌクレオチドが読取
りフェーズの各々に挿入され、また転写及び翻訳の終了
シグナルも挿入される。非反復制限部位に挿入されたcD
NAは、対応するハイブリッドタンパク質cro−βgal−ペ
プチドの形態で極めて高い効率で発現される。このハイ
ブリッドタンパク質の利点は、難溶性であり従って細菌
中でのタンパク質分解のおそれが少なく特異的抗体によ
って容易に免疫検出されることである。 対応するポリペプチドを細菌中で発現させるべく、遺
伝子cro−lacZに対して正しい配向でcDNAを挿入するた
めに、P.N.A.S.USA、1983、80、31−35に記載のHelfman
n等の技術に従ってcDNAの両端に種々のリンカーを順次
付加するプロトコルを使用する。使用されるリンカーは
BamH I及びSal I切断部位に対応する。 これら組換体プラスミドは、従来技術を用い所望配列
によってタンパク質を発現させる細菌株を形質転換する
ために使用される。 細菌株としては大腸菌株が好ましく、リプレッサーcr
oの対立遺伝子cIts857を含む大腸菌pop2135が特に好ま
しい。 このようにして細菌株中で高レベルの絨毛タンパク質
を発現する細胞のmRNAに対応し約30,000のクローン組換
体を含むcDNAバンクが得られる。 ハイブリッドタンパク質の発現は温度によって誘発さ
れ得る。従って遺伝子croのリプレッサーが失活する温
度で処理する。このためには、室温より高温、特に40〜
42℃のオーダの温度で菌株を約２時間インキュベートす
るだけでよい。 従来技術による細菌の溶解及びタンパク質の再生後に
回収されたクローンを免疫スクリーニングによって選択
する。 好ましくは先ず少なくとも１種類の抗絨毛ポリクロー
ナル抗体によってcDNAバンクのスクリーニングを行う。
１種類以上のポリクローナル抗体と特異的に反応するク
ローンをCOOH末端エピトープに対する少なくとも１種類
のモノクローナル抗体を用いて再度スクリーニングす
る。 完全ブタ絨毛タンパク質に対する抗ポリクローナル抗
体の如き抗絨毛ポリクローナル抗体と、分子のCOOH末端
に位置するエピトープを認識し得る１種類以上のモノク
ローナル抗体とを順次使用すると十分なスクリーニング
が行なわれる。 ポリクローナル抗体によるスクリーニング後に、別の
ポリクローナル抗体特にニワトリの絨毛タンパク質のCO
OH末端断片に対するポリクローナル抗体を用いた二次ス
クリーニングを行なうのが有利である。 本発明の目的は特に、完全絨毛タンパク質に対するポ
リクローナル抗体とニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末
端ペプチドに対するポリクローナル抗体とCOOH末端エピ
トープに対する２種類のモノクローナル抗体とに特異的
に反応することを特徴とするヒト絨毛タンパク質に対応
するcDNAを担持するクローンを提供することである。 本発明の目的はまた、ポリＡ配列とポリアデニル化部
位とをもつインサートを含む絨毛タンパク質に対応する
cDNAを担持するクローンを提供することである。 本発明の別の特徴によれば、絨毛タンパク質の検出に
使用される手段はモノクローナル抗体から構成される。 本発明のこの特徴は、異なる種に由来する絨毛タンパ
ク質がモノクローナル抗体に接近し得る共通エピトープ
をもち、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
の産生に適したミエローマ細胞と融合した脾臓細胞をも
つ動物の免疫化に使用された特定の絨毛タンパク質を特
異的に認識するだけでなくヒトを含むその他の種に由来
する絨毛タンパク質をも特異的に認識するという事実に
基づく。 従って本発明の好ましいモノクローナル抗体の特徴
は、以下の特性をもつことである。 −精製ブタ絨毛タンパク質を認識する（Western Blotti
ng）、 −ニワトリの絨毛タンパク質を認識する（Western Blot
ting）、 −ヒト結腸の腺癌HT29に由来する系の細胞抽出物の絨毛
タンパク質を認識する（Western Blotting）、 −免疫細胞化学的ラットの絨毛タンパク質（ホルムアル
デヒドに固定されたラットの腸粘膜の凍結切片（クリオ
スタット））を認識する。 前記定義に対応するモノクローナル抗体のうちの好ま
しいモノクローナル抗体は、ニワトリの絨毛タンパク質
の「ペプチドHP」に含まれるエピトープをも認識する。
予め単離されたペプチドHPとペプチドHPをまだ含む51Kd
のペプチドとの双方に対して認識が可能である。該抗体
はニワトリ絨毛タンパク質のペプチド44Kd又はペプチド
44Kdのいずれをも認識しない。 本発明の好ましい抗体は、更に、タンパク質HPを特に
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で処理後の再生状態で
認識でき、また、絨毛タンパク質を担持する上皮細胞で
認識し得る。この結果は、ペプチドHPによって担持され
るエピトープが細胞培地中の他のタンパク質によって遮
蔽されていないことを示す。 本発明は当然、これらモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマに係る。これらハイブリドーマを産生す
るための有利な技術、特に精製ブタ絨毛タンパク質に対
する免疫マウスの脾臓細胞と適当なミエローマの細胞と
の融合によるハイブリドーマ産生技術については後述す
る。この方法で得られた好ましいハイブリドーマ（BD−
D2C3株）はパリ、パスツール研究所のCollection Natio
nale des Cultures de Microorganismes（CNCM）に1985
年４月29日に受託番号no.I−440で寄託された。 本発明の有利な特徴によれば、抗体の形成に使用され
る免疫物質は細菌中で多量に発現し得る。この免疫物質
は、ヒト絨毛タンパク質のDNA又はその断片に対応する
前記ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドに
対応する。 従来技術によって、ペプチドを動物に注射し、抗血清
を回収し、次に必要な場合、例えばアフィニティクロマ
トグラフィーによって抗血清から抗体を回収する。抗体
産生のこの変形例は、上記に定義したcDNA断片によって
コードされた領域HPが最も免疫原性で最も絨毛タンパク
質特異的な領域であるときに一層有利である。 絨毛タンパク質の相補的DNA又は該DNAの断片のヌクレ
オチド配列によってコードされるタンパク質はまた、競
合ラジオイムノアッセイ（直接ELISA法又は競合ELISA
法）を行うための抗原ソースを構成する。 しかし乍ら勿論、同じ免疫原性配列を含むその他の全
ての免疫物質を使用し得る。例えば、ペプチドHP自体を
使用してもよく、場合によっては免疫特性を強化するた
めに子牛血清アルブミンのごときキャリャー分子に予め
グラフト重合されたペプチドHPを使用してもよい。 本発明の好ましいモノクローナル抗体を入手できれば
ペプチドHPの特性的エピトープ領域を定義し得ることも
当業者に明らかであろう。より正確に同定するために
は、特に、以下の段階を含む方法を使用するとよい。 −ペプチドHP（又は所望エピトープを含むと推定できる
ペプチドHPの部分）をコードするポリヌクレオチド配列
を合成する、 −絨毛タンパク質のCOOH末端をコードするヌクレオチド
配列を含む前記に定義した前記プラスミドを前記配列の
外部の制限部位のところで直線化する、 −酵素Bal31の如きエキソヌクレアーゼによって直線
化プラスミドを調整的トリミングする、 −DNAリガーゼによってプラスミドを再環化する、 −対応プラスミドによってそれ自体形質転換できかつプ
ラスミドに内包されるインサートを発現し得る適当な微
生物を形質転換する、 −この微生物の発現産物と該当抗体とを再度接触させ
る。 再環化された最終プラスミドによって形質転換された
前記微生物の発現産物中で前記免疫原性ペプチドの検出
が消滅するまで上記処理サイクルを繰り返す。 方法の各サイクルの終期、特に中間再環化プラスミド
の認識能力を消滅させる最終トリミング処理の以前及び
以後のプラスミドの末端部分の配列決定のときに、この
最終トリミング処理中に除去されたヌクレオチド配列に
よってコードされるペプチドの箇所にエピトープを配置
することが可能である。即ち、当業者にとって前記抗体
を入手することは、該エピトープを含む化学的に定義さ
れたペプチド配列を入手したことと等価である。 本発明はまた、上記に定義した好ましいモノクローナ
ル抗体と反応でき且つポリアクリルアミドゲル電気泳動
特にSDS−PAGE試験で実質的に１つのバンドだけを生じ
る生物学的に実質的に純粋なヒト絨毛タンパク質を係
る。 即ち、ヒト絨毛タンパク質は、ヒト腸細胞溶解物、特
に適当な洗浄剤を含む水溶液で処理し前記モノクローナ
ル抗体を用いて精製したヒト腸細胞溶解物から抽出され
得る。この種の精製方法では、アフィニティクロマトグ
ラフィー処理に適応するように好ましくは固体支持体に
固定されたモノクローナル抗体を使用するのが有利であ
る。例えば、スエーデンのPHRMACIA A.G.によって商標S
EPHAROSEとして市販されている三次元網目状構造のアガ
ロースの網にモノクローナル抗体を例えばシアノゲンブ
ロマイド法で固定する。 従って本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質を分離する
ために、該絨毛タンパク質を含む溶液を前記モノクロー
ナル抗体を含むアフィニティカラムと接触させてヒト絨
毛タンパク質を選択的に固定し、次にグリシンベースの
pH2〜４の酸性バッファ又はメチルアミンベースのpH11
の塩基性バッファによる抗原抗体複合体の溶解によって
ヒト絨毛タンパク質を回収し、次に酢酸アンモニウムバ
ッファに透析する方法に係る。 勿論本発明はまた、ヒト絨毛タンパク質断片から成る
より小さい分子量のポリペプチドに係る。断片が特異的
部位のポリペプチド切断酵素によるヒト絨毛タンパク質
の切断によって得られることは当業者に明らかであろ
う。かかるタンパク質として例えば、先ず、トリプシン
即ちStaphylococcus aureusV8のプロテアーゼ、アルフ
ァキモトリプシン、BOEHRINGER社により市販のマウスの
顎下腺プロテアーゼ、前記ペプチドGly−Pro及びGly−A
la等を特異的に認識するVibrio alginolyticus chemova
r iophagusのコラゲナーゼがある。 ヒト絨毛タンパク質又はその断片から製造され得る任
意に種特異的なハイブリドーマ及びモノクローナル抗体
も本発明の一部を構成することが理解されよう。 本発明の別の特徴及び利点は、ヒト絨毛タンパク質の
検出、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の産生及
び試験で使用される特定条件の例を示す以下の記載より
明らかにされるであろう。 またヒト絨毛タンパク質のcDNA部分を担持するクロー
ンの作成方法も記載する。 実施例1:ヒト絨毛タンパク質の検出 消化部又は腎臓部と生物体のその他の部とに由来する
腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の増殖の種々の時期の絨毛タン
パク質の発現を検査した。BROWN及びFARQUHAR、Cell、3
6、295（1984）に記載の技術で該当組織を採取し凍結し
固定して切片（凍結切片）の調製した。 −25℃で５μｍ厚の切片を得、ポリリジンで被覆した
ガラスプレートに載せた。0.2％のゼラチンを含む生理
食塩水リン酸バッファ（PBS−ゼラチン）溶液に浸漬し
た後に、絨毛タンパク質を検出すべくPBS−ゼラチン中
に1/800に希釈した抗絨毛ウサギ抗血清50μを含む溶
液で切片を処理し、湿潤室で室温で25分間インキュベー
トした。 次にPBS−ゼラチン中で切片を10分間ずつ３回洗浄し
た。 次にローダミン（オランダのNordic Immunological L
aboratoriesの製品）でラベルしたウサギ抗IgGを添加
し、これら抗IgGの存在下に切片を室温で25分間インキ
ュベートした。次に切片をPBS−ゼラチン中で完全に洗
浄し、Plan Nofluarオイルに浸漬したレンズと１組の
適当なフィルターとを備えた蛍光顕微鏡（ZEISS光顕微
鏡）で検査した。 コントロール組織及び他の起源の腫瘍細胞についても
同様に処理した。 以下の結果が観察された。 組織が結腸の腺癌に由来するとき、12のサンプルのう
ちの11のサンプルが絨毛タンパク質の発現の陽性を示し
た。他の起源のヒト腫瘍、例えばリンパ腫特に腸間膜結
節リンパ腫及び膵臓、食道等の転移又はそれ以外の原因
による他の起源の種々のタイプの癌腫はタンパク質を発
現しなかった。 観察の結果一般的に、処理された腫瘍の一次腸起源と
絨毛タンパク質の発現との間に緊密な相関関係があるこ
とが判明した。明らかに別の起源の腫瘍に対して行なっ
た多数の試験では、実質的に全部の場合にタンパク質の
発現が陰性であった。 注目すべきは、腸起源の組織においては、該細胞の増
殖程度にかかわりなく絨毛タンパク質が常に観察される
ことである。 前記の試験ではポリクローナル抗体を用いた。CNCMに
寄託した好ましいモノクローナル抗体を使用するとより
明白な結果が得られた。 これらモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
の単離条件の例を以下に記載する。また、ELISAタイプ
の免疫試験によって絨毛タンパク質の有無を診断するた
めの好ましい検出条件の与え方についても以下に記載す
る。 実施例2:絨毛タンパク質に対するモノクローナル抗体の
調製 （Ａ）免疫化プログラム −Balb/Cマウス:6〜８週齢 −抗原：精製ブタ絨毛タンパク質（10mg/ml）（SDSの存
在下にポリアクリルアミドゲル（10％）電気泳動後の分
子量95Kdのタンパク質の均質バンド） 10mM イミダゾール 75mM HCl 1mM EGTA 0.1M DTT 50％ グリセロール −プログラム 初日:50/50エマルジョン（PBS−フロインド完全アジュ
バント）中の50μｇの純粋絨毛タンパク質のIP（腹腔組
織内）注射、 14日:50μｇの絨毛タンパク質（PBS−フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 21日:50μｇの絨毛タンパク質（PBS−フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 28日:PBSに溶解した20μｇの絨毛タンパク質のIM（筋肉
内）注射、 29日:PBSに溶解した10μｇの絨毛タンパク質のIV（静
脈）注射、 32日：融合。 （Ｂ）融合 （Ｉ）親細胞 （ａ）ミエローマ細胞 Sp2/O−Ag14系（8 Azaguanine耐性） DMEM10％FCS培地中の無菌培養物 （ｂ）脾臓細胞 起源：ブタ絨毛タンパク質に対する超免疫マウスo Ba
lb/Cの脾 （II）Ｋhler G.及びMilstein C.による細胞融合方法
（所定特異性をもつ抗体を分泌する融合細胞の連続培養
物、Nature、1975、256、495） −無血清DMEM培地中の50％のポリエチレングリコール溶
液（PEG1000−Merck9729）の存在下に無菌条件下の無血
清DMEM培地中で融合させる。２種類の親細胞の計数後
に、培養中のミエローマ細胞の懸濁液を脾臓細胞の懸濁
液に1:5の割合で混合する。 −２分30秒間接触させる。 −完全DMEM培地で希釈してPEGの作用を停止させる。 −選択DMEM−HAT培地に細胞懸濁液を最終的に希釈（２
×105細胞/ml）とする。 −1mlのウェルを含むCOSTAR24皿に分配（COSTAR Tissue
Culture Cluster 24、Cat.No.3524、COSTAR 205 Groad
way、Cambridge、Ma、USA）。 （III）クローンの選択 ブタ精製絨毛タンパク質に対する抗体の分泌能力によ
ってクローンを同定する。 （Ｃ）選択方法 （Ｉ）ELISA試験： この試験では融合後の培養物上清中の抗絨毛タンパク
質モノクローナル抗体を証明し得る。 −抗原の固定：支持体（ELISAプラーク）に抗原を固定
する。 濃度:50mM、pH8のリン酸カリウムバッファ中に５μg/m
l。４℃で１晩維持。 −飽和:PBS−Tween20−BSAで飽和。 −インキュベーションI:非希釈ハイブリドーマ上清と共
に４℃で３時間。 −インキュベーションII:βガラクトシダーゼでラベル
したマウス抗IgGと共に４℃で２時間。 各段階間の洗浄にはいずれも0.1％のPBS−Tween20を
用いる。 −基質:0.1M、pH7.0のリン酸バッファ、10-3M MgSO4、
２×10-3M MnSO4、２×10-3M脱水トリトリプレックス
（Tritriplex）マグネシウム（Merck8409）中のｏ−ニ
トロフェニル−β−ガラクトピラノシド（Sigma N11−2
7） 読取り:414nmでのDO（光学密度）読取り。 バックグラウンドノイズのDOの10倍のDOを与えるハイ
ブリドーマ上清をもつクローンを選択した。 （II）Western Blotting、Burnette.Anal.Biochem.198
1、112、195−203 この試験によって、ELISA試験の陽性クローンのうち
でもヒト絨毛タンパク質とニワトリ絨毛タンパク質とを
同時に認識し得るブタ抗絨毛タンパク質モノクローナル
抗体を分泌するクローンを選択し得る。 種々の試験段階 （ａ）ニワトリの腸粘膜の細胞抽出物と絨毛タンパク質
を発現するHT29系（ヒト結腸の腺癌）の細胞抽出物とを
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。 （ｂ）ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質
をニトロセルローズ紙に電気転移する。 （ｃ）細胞タンパク質が転移されたニトロセルローズ紙
を、ELISAで予め選択したハイブリドーマ上清と共に４
℃で１晩インキュベートする。 （ｄ）ペルオキシダーゼでラベルしたマウス抗IgGと共
に室温で１時間インキュベートする。 （ｅ）基質： −10mgの四塩酸ジアミノベンジジン −20mlのpH7.6の0.1M TrisHCl −0.2mlの１％H2O2 各段階間の洗浄にはいずれも新生子ウシ血清−PBS−T
ri−ton X100を用いる。 （ｆ）陽性反応：抗原−モノクローナル抗体反応が生じ
ると、栗色バンド（分子量95Kd）が速やかに出現する。 （Ｄ）選択ハイブリッドのクローニング −限界希釈法： ウェルの底部に結合したマクロファージ（４週齢のBa
lb/Cマウス起源）に（96ウェルのプラークの）ウェル当
たり１つの細胞が分布するように陽性クローンを選択培
地に希釈する。 条件調整した選択培地を添加する。 −前記方法によって陽性クローンを選択する。 −必要に応じて再クローニングする。 （Ｅ）腹水の調製 −４〜５日以前にPRISTANE（Aldrich、2,6,10,14−テト
ラメチルペンタデカン）を注射しておいたマウスに選択
クローンを注射する。 −マウス当たり１〜２×106の細胞を注射する。 −10〜15日後に増殖したクローン細胞を含む腹水をマウ
スから回収する。 腹水の抗絨毛モノクローナル抗体価は1mg/mlより高
い。 −選択クローンの凍結は10％FCS−５％DMSOのDMEM培地
中で行なう。 −176℃の液体窒素中で保存する。 絨毛タンパク質定量のための直接ELISA法 −精製IgGの吸着：一定濃度の腹水BD−D2C3からELISAプ
ラークに吸着させる。 イオン交換クロマトグラフィー（DEAE−Trisアクリ
ル）及びヒドロキシアパタイトカラムによって抗体を精
製した。 所定濃度まで濃縮する。 37℃で２時間次に４℃で１晩インキュベートする。 0.1％のPBS/Tween20で洗浄する。 −プラークの飽和 PBS/0.1％のTween20/0.4％のBSAの存在下に30分間イ
ンキュベートする。 −抗原の添加 0.4％BSAの存在下で精製絨毛タンパク質の濃度範囲は
５μg/mlから１又は0.1ng/mlに減少する。 ４℃で３時間インキュベートする。 0.1％のPBS/Tween20で洗浄する。 −精製IgGの添加：βガラクトシダーゼと結合した絨毛
タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体血清から
精製されたIgGを添加する。 ４℃で２時間インキュベートする。 0.1％のPBS/Tween20中で洗浄する。 −βガラクトシダーゼの検出 20mlのpH7の0.1Mのリン酸緩衝バッファ、10-3MのMgSO
4、２×10-4MのMnSO4、２×10-3MのEDTA（Merck8409）
中の4mg/mlの溶液を用いて20mgのｐ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを添加する。 37℃でＸ時間インキュベートする。 414nmでの光学密度を読取る。 実施例3:ヒト臨床観察 細胞抽出物中の極めて少量（全タンパク質1mg当たり
0.5ng）の絨毛タンパク質を検出し得る感度をもつ後述
のELISA試験を使用して血清中の絨毛タンパク質の定量
可能な量を検出するための測定を行なった。即ち、絨毛
タンパク質は、消化管の健常細胞及び腫瘍細胞によって
発現される細胞内タンパク質なので、ある種の病理的及
び生理的状態では絨毛タンパク質を含む細胞の壊死によ
って絨毛が血管系に遊離されることが判明した。 供血集団（ｎ＝190）に関する検査によれば、大多数
の血清（ｎ＝168）中で絨毛タンパク質が検出されない
ことが判明した。しかし乍ら、少数の固体（ｎ＝15）に
は検出可能量の絨毛タンパク質（５〜10ng/ml）が存在
した。この値を病理微候でない絨毛タンパク質のレベル
と考えてよい。最後に、幾つかの固体（ｎ＝７）では基
底値より高いレベルの絨毛タンパク質（50〜100ng/ml）
が存在した。所謂「健常」なこれら固体（3.6％）に対
しては消化管の付加的臨床検査（ファイバースコープ、
コロノスコープ）を行なわなかった。 種々の胃腸病理に関して得られた結果を以下の表にま
とめる。 患者の血清中に検出可能量の絨毛タンパク質が検出さ
れる疾患： 消化管の悪性病理： −結腸癌 −胃癌 消化管の良性病理： −絨毛腫 −Crohn病 −出血性直腸結腸炎 −十二指腸球潰瘍、胃潰瘍、食道潰瘍 注目すべきは消化器官の多腺腫（ポリープ）は逆にこ
のタンパク質を血液中に遊離しないことである。 この検査から更に幾つかの結論が得られる。 1/血液中の絨毛タンパク質の量と腫瘍の大きさ又はその
進行期には相関関係がないと考えてよい。 2/手術後の追跡のためにこのタンパク質を判定すると完
全摘除後には血清中の率が低下する。これに反して、腫
瘍細胞が残存すると（不完全摘除、再発、転移）絨毛タ
ンパク質レベルは維持されるか又は増加する。 この研究により、絨毛タンパク質が健常被検者の血清
中では通常検出されないが、悪性病理（結腸癌又は腎臓
癌）に侵された患者又は消化粘膜の炎症性又は壊死性突
起を生じる消化管の良性潰瘍（Crohn病、RCH病、潰瘍）
がみられる患者では絨毛タンパク質を定量できることが
判明した。 血液中の絨毛タンパク質の定量はまた、良性疾患（消
化管の潰瘍及び炎症性疾患）の監視にも極めて重要であ
ることが判明した。他方、血液中の絨毛タンパク質を追
跡するためには、本発明の抗体と共に癌の進行監視のた
めに現在使用されているCEA（癌胎児性抗原）の如き別
の腫瘍ラベルを使用することも可能である。これら現行
の腫瘍ラベルは、1/侵された器官に特異的でない、2/種
々の良性病理中に観察される、という欠点をもつ。 実施例4:ヒト絨毛タンパク質に対応するcDNAの調製 mRNAの調製 ヒト結腸腺癌由来の細胞系HT29からmRNAを調製する。
Ullrich等による塩化グアニジウム法、Science、1977、
196、1313−1319、によってRNAを抽出する。Aviv及びLe
derによるオリゴdT−セルロースカラムクロマトグラフ
ィー法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1972、69、1408−14
12、によってmRNAポリA+の精製を行なう。 cDNAの調製 Fiddes及びGoodmanの方法、Nature、1979、281、351
−356、によってcDNAの第１ストランドと第２ストラン
ドとを調製する。Helfmann等の方法、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA、1983、80、31−35、によって３′末端にリンカ
ーSal I及び５′末端にBamH Iを順次付加する。 約30,000の組換体クローンを含むcDNAバンクを得る。 ベクター プラスミドpEX1−３（Stanley及びLuzio、EMBO Journ
al、1984、３、1429−1430、1984参照）を使用する。こ
れらベクターは、その発現がλバクテリオファージのプ
ロモータPRのコントロール下にある融合遺伝子cro−Lac
Zを含むプラスミドから誘導される。複数の非反復制限
部位を含むポリヌクレオチドを遺伝子LacZの３′末端に
挿入した。また、転写及び翻訳終了シグナルを３つの読
取りフェーズに挿入した。 制限酵素BamH I及びSal Iで消化したプラスミドpEXの
各々にcDNAを挿入した。従ってこれらは全て遺伝子CroL
acZに対して同方向に配向されている。 形質転換 O.RaibaudによってNucleic Acid Researchに記載のご
とく構築された大腸菌pop2135株を細菌株として使用す
る。 以下の式によって操作し、対立遺伝子CI857とプロモ
ータPRとを含むλファージの2.3kbのBal II断片をポリ
リンカーのBamH I部位にクローニングする。 このように得られたEcoR I断片を、pOM41のEcoR I部
位にクローニングし、菌株C600の染色体に組み込む（Ge
ne、292、232−241）。 近位aroBラベルとP1′とのコトランスフェクションに
よって、この構造をMM294の染色体（F- endA thi hsd
R）に導入する。大腸菌pop2135が、配向maIT、CI857、P
R、maIPOで得られる。 大腸菌pop2135を組換体プラスミドで形質転換するた
めには、Hanahan等のルビジウムを使用する技術、J.Mo
l.Biol.、1983、166、557−580、を使用する。この菌株
はcroのリプレッサーの対立遺伝子cIts857を含む。 得られた組換体の数は103〜104ngのcDNAのオーダであ
る。 免疫検出によるクローンの選択 得られた組換体クローンをニトロセルロースフィルタ
ーに塗抹する。42℃で２時間インキュベーション後にハ
イブリッドタンパク質の合成が誘発される。SDSによる
細菌の溶解及びメタノールの非存在下でのタンパク質の
再生後に免疫スクリーニングによってクローンを分析す
る。タンパク質の再生にはBurnettの技術、Anal.Bioche
m.、1981、112、195−203、を用いる。 先ず、完全ブタ絨毛タンパク質に対するポリクローナ
ル抗体によってバンクをスクリーニングする。次に、ニ
ワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端断片に対するポリク
ローナル抗体と、分子のCOOH末端領域に位置するエピト
ープを認識する２種類のモノクローナル抗体（BDD2C3及
びIID3H9）とを使用して二次スクリーニングを行なう。 クローンpEXZ−V19は、510塩基対のインサートを含
む。コード部分は330の塩基対をもつ。この部分に続い
て200塩基対の非コード領域が存在する。 クローニングされたcDNAはヒト絨毛タンパク質のCOOH
末端の95個のアミノ酸をコードしており全タンパク質の
約1/10（分子量:95Kd）に相当する。 参考文献 （１）Ullrich,A.,Shine,J.,Chirgwin,J.,Pictet,R.,Ti
scher,E.,Rutter,W.J.＆ Goodman,H.M. Rat insulin genes:construction of plasmids contain
ing the coding sequences Science,1977,196,1313−1319 （２）Aviv,H.＆ Leder,P. Purification of biologically active globin mRNA by
chromatography on oligothymidylic acid cellulose Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1972,69,1408−1412 （３）Fiddes,J.C.＆ Goodman,H.M. Isolation,cloning and sequence analysis of the cDN
A for the alpha−subunit of human chorionic gonado
tropin Nature,1972,281,351−355 （４）Helfman,D.M.,Feramisco,J.R.,Fiddes,J.C., Thomas,G.P.＆ Hughes,S.H. Identification of clones that encode chicken tropo
myosin by direct immunologial screening of a cDNA
expression library Proc.Natl,Acad.Sci.USA,1983,80,31−35 （５）Stanley,K.K.＆ Luzio,J.P. Construction of a new family of high efficiency ba
cterial expression vectors:identification of cDNA
clones coding for human liver EMBO Journal,1984,３,1429−1434 （６）Stanley,K.K. Solubilization and immune−detection of beta−gala
ctosidase hybrid proteins carrying foreign antigen
ic determinants Nucleic Acids Res.,1983,11,4077−4092 （７）Hanahan,D. Studies on transformation of E.coli with plasmids J.Mol.Biol.,1983,166,557−580 （８）Burnett,W.N. “Western Blotting":Electrophoretic transfer of pr
oteins from sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide
gels to unmodified nitrocellulose and radiographi
c detection with antibody and radioiodinated prote
in A Anal.Biochem.,1981,112,195−203
増殖の有無特に腺癌型細胞の増殖の有無をin vitro検出
する方法に係る。 いくつかの高等真核細胞型を同定するため及びこれら
の細胞の種々の発生段階、特に分化段階の追跡研究のた
めに、特異的ラベルとして構造タンパク質の検出を利用
することは既に提案されている。公知のラベルとしては
例えば、線維タンパク質例えばビメンチル、ケラチン又
は神経線維タンパク質があり、これらは幾つかの細胞型
の同定、胚形成時期から細胞分化の最終時期までの細胞
の発生の研究及び環境培地に対する細胞の挙動の研究に
使用できる（E.LAZARIDES、Nature、283、249（1980）
及びR.MOLL等、Cell、31、11（1982））。 ケラチンはしばしば上皮細胞と非上皮細胞とを識別し
得る特に有効なラベルと考えられる。しかし乍ら、この
種の識別では、該当する上皮細胞の起源を必ずしも明確
に確定することはできないことが判明した。 しかし乍ら、幾つかの細胞型の起源を確実に検出する
ことの必要性は、多くの場合、例えば腫瘍細胞の増殖を
示す生物サンプルを検査する場合に、この増殖の起源に
存在する一次腫瘍細胞を同定するため又は消化領域の癌
を起源とする転移の存在を検出するため又は転移癌に対
する化学療法及びその他の療法の効果を確認するために
特に重要視されつつある。勿論、抗癌治療の効果は疾患
の一次原因たる腫瘍細胞の正確な同定とのつながりが深
い。 これらの観察は、（臨床的に発見される癌のうちの高
い割合を占める）消火器官起源又は腎臓起源の腫瘍細胞
の増殖又はこれら細胞から誘導された細胞の増殖の検出
好ましくは早期発見、特にこれら細胞の特有ラベルの固
定のために特に重要である。 従って本発明は特に、消化器官の粘膜特に腸粘膜中に
通常は存在し主な分化型が吸収細胞又は腸細胞から構成
される上皮細胞の幾つかの主要表現型を維持した腫瘍細
胞の検出に重要である。 本発明はまた、これら腫瘍細胞に担持されるか否かに
かかわりなく検出され得る特異的ラベルに係る。 本発明の目的は特に、これらラベルが腫瘍細胞特に該
細胞の壊死の場合に該細胞から離脱し例えば血管系に遊
離されたときにもラベルを検出することである。 本発明の範囲内で使用されるラベルは、絨毛の全部又
は一部から構成される。絨毛タンパク質は、通常は消化
粘膜特に腸粘膜の絨毛組織中に存在する分子量約95,000
ドルトンのオーダのタンパク質である。絨毛タンパク質
はカルシウムイオンの存在下でアクチンと結合し得る。 絨毛の種類毎にアミノ酸配列は若干異なっているが機
能特性は維持されている。今日まで公知の精製技術では
ニワトリ及びブタの絨毛タンパク質を実質的に純粋な状
態まで精製し得る。しかし乍らこれらの技術ではヒト絨
毛タンパク質を精製することはできない。 最もよく知られた絨毛タンパク質の１つはニワトリの
絨毛タンパク質である。この絨毛タンパク質は854個の
アミノ酸配列から形成されている。トリプシン及びプロ
テアーゼＶ−８を使用したタンパク質限定分解によって
所定箇所を切断し44Kd,51Kd及び10Kdの断片を得ること
ができる。絨毛タンパク質のマップ内でのこれら断片の
相対位置は、Paul MADSUDAIRA、MRC、Laboratory of Mo
lecular Biology、Cambridge、U.K.及びJohn GLENNEY
等、J.B.C.、1981、256、8156−8161によって以下のご
とく確認されている。 Ti:トリプシン切断 V8:プロテアーゼV8による切断 ニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端のアミノ酸配列
（779−854）即ち「ヘッド部」（「ペプチドHP」）は以
下の式で示される。 一般的に絨毛タンパク質は、特に分化終期に到達した
腸細胞の表面で観察される腸内腔壁の刷毛縁中に存在す
る。微絨毛は腸細胞の分化終期の集合オルガネラであ
る。絨毛タンパク質は特に微絨毛の軸方向微線維束中に
局在している。絨毛タンパク質は、細胞骨格の構成に寄
与している。凍結切片を免疫蛍光で検査すると、絨毛タ
ンパク質が腸内壁に露出する円柱を形成する細長い細胞
の頂端に存在し、また腎臓の近位尿細管細胞の近傍にも
存在することを確認した。いずれの場合も絨毛タンパク
質の存在領域は該当細胞の刷毛縁と一致する。しかし乍
ら、その他の種々の上皮の別の種々の絨毛が極めて組織
化された刷毛縁を持たないときは絨毛タンパク質は検出
されなかった（A.BRETSCHER等、Exp.Cell.res.135、213
（1981）又はA.LISSの著書Membrane in Growth and Dev
elopment（成長及び発生中の膜）、New York（1982）、
pp.89−105に所収のH.REGGIOの論文）。 更に、絨毛タンパク質が刷毛縁の形成よりかなり早い
発生早期の腸細胞中に存在することも確認された。 本発明は、２つの知見により得られたものである。絨
毛タンパク質は消化管の組織腫瘍形成中、特に最も頻繁
な癌の形態の１つたる結腸の癌、及び幾つかのタイプの
腎臓癌においては実質的に組織的に検出可能な状態で維
持されるが、その他の器官（肝臓、卵巣、肺等）に局在
する組織の初期癌化から生じる一次腫瘍細胞中では決し
て検出されない。 更に、絨毛タンパク質は、消化部の腫瘍細胞の全ての
発生箇所で腫瘍形成の早期及びより遅い時期に、該当細
胞の分化状態にかかわりなくin vivo検出可能である。 生物サンプル中の最初から消化部で形成された腫瘍細
胞及び／又は該腫瘍細胞の誘導体をin vitro検出するこ
とを主目的とする本発明の診断方法の特徴は、この生物
サンプルを絨毛タンパク質に対する特異的アフィニティ
をもつか又はこのタンパク質をコードする遺伝子を認識
する試薬と接触させることである。 本発明の検出方法は、消化器官起源の腫瘍細胞又は消
化器官もしくは腎臓起源の一次細胞の影響によって生物
体の別の部分に後で形成された腫瘍細胞を内包する全て
の生物サンプル、又は該細胞の壊死の場合に絨毛ラベル
を含む種々の腫瘍細胞の分解産物を内包する全ての生物
サンプルに適用し得る。この生物サンプルは、いかなる
形態でもよく例えば、生検により得られた組織もしくは
固体腫瘍の断片、又は悪性細胞もしくは該細胞由来の断
片を運ぶ液体生物サンプル例えば全血もしくは血清であ
る。 本発明の実施態様によれば、本発明の検出方法で使用
される試薬は、ヒト絨毛タンパク質特にCOOH末端部のア
ミノ酸配列をコードする領域を含む配列をもつDNAから
構成される。 本発明の別の実施態様によれば、検出方法で使用され
る技術は免疫技術であり、絨毛に特異的アフィニティを
もつ試薬は絨毛タンパク質を認識し得る抗体から構成さ
れる。 これらの抗体は、公知の任意の方法で抗体自体がラベ
ルされるか、又は、絨毛タンパク質もしくは絨毛タンパ
ク質担持細胞に固定された状態のときはラベル免疫グロ
ブリン又はその他のラベルタンパク質（例えばStaphylo
coccus aureusのプロテインＡ）で認識され得る。 特に適当な技術は、後述する試験で使用され前記のご
とき結果を示す技術である。 本発明の目的はまた、腸細胞又は同類細胞の微絨毛の
箇所の絨毛タンパク質を検出するための新規な特異的手
段を提供することである（勿論新規な手段の使用は、本
発明の検出方法に必ずしも限定されない）。 本発明の１つの特徴によれば、これら手段は、ヒト絨
毛タンパク質の完全mRNAに対応するDNA又はヒト絨毛タ
ンパク質のアミノ酸配列をコードする領域を含むヌクレ
オチド配列をもつDNA断片から構成され、絨毛タンパク
質をコードするヌクレオチド配列と特異的にハイブリダ
イズし得る。 本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質の完全mRNAに対応
するDNA又はヒト絨毛タンパク質のCOOH末端のアミノ酸
をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む
cDNA断片を前記方法において使用することを目的とす
る。このヌクレオチド配列と、コードされたアミノ酸の
対応配列とを以下に示す。 使用されるヌクレオチド配列は、ヒト絨毛タンパク質
をコードするmRNA又はDNAを検出するためのプローブと
して使用される。 この種の検出に適したプローブは、放射性元素によっ
てラベルされるか又は被検mRNAもしくはDNAを含む調製
物とのハイブリダイズ状態で認識可能な別の物質によっ
てラベルされるのが有利である。 従来技術によれば、これらプローブと被検細胞を含む
生物サンプルとを、プローブのヌクレオチド配列と被検
サンプルに任意に含まれる相補的配列とが任意にハイブ
リダイズできる条件下に接触させるか又は核酸と直接接
触させる。 200塩基対のインサートを含むプローブを使用して検
出の再現性を試験した。 本発明の範囲に包含された新規な産生物を構成するこ
れらヌクレオチドプローブの別の特徴は、腸細胞及び／
又は絨毛タンパク質発現細胞の各分化状態及び腎臓又は
腸起源の細胞の種々の成熟時期における絨毛タンパク質
のmRNAの発現を研究するために使用されることである。 従って、得られたプローブはヒト遺伝子バンクから単
離された絨毛タンパク質の遺伝子の数、組織及び構造を
決定し得る。 本発明によれば、ヒト絨毛タンパク質の末端をコード
するヌクレオチド配列の単離は以下の手順で行なわれ
る： −公知技術を使用し絨毛タンパク質を発現する細胞系か
ら完全mRNA（メッセンジャーRNA）を調製する、 −cDNA（相補的DNA）バンクを構築する、 −インサートによってコードされたタンパク質を発現し
得るベクターにcDNAを挿入する、 −得られた組換体ベクターによって細菌株を形質転換
し、次に細菌中で所望タンパク質を発現させ得る条件を
認定する、 −絨毛タンパク質を認識し得る抗体を用いて絨毛タンパ
ク質の特異的クローンを含む組換体クローンを選択す
る。 cDNAバンクの構築段階は、挿入cDNAによってコードさ
れたタンパク質を発現し得るベクターを用いて行なわれ
る。 特に発現効率が高いので特に有利なクローニングベク
ターは、pEXタイプのプラスミドから構成される。かか
るプラスミドは、Stanley及びLuzioによってEMBO Journ
al、1984、３、1429−1434に記載されている。この文献
には、λバクテリオファージのプロモータPRのコントロ
ール下で発現する融合遺伝子cro−lacZを含むプラスミ
ドが記載されている。この発現は温度によって誘発され
る。 複数の非反復制限部位を含むポリヌクレオチドが読取
りフェーズの各々に挿入され、また転写及び翻訳の終了
シグナルも挿入される。非反復制限部位に挿入されたcD
NAは、対応するハイブリッドタンパク質cro−βgal−ペ
プチドの形態で極めて高い効率で発現される。このハイ
ブリッドタンパク質の利点は、難溶性であり従って細菌
中でのタンパク質分解のおそれが少なく特異的抗体によ
って容易に免疫検出されることである。 対応するポリペプチドを細菌中で発現させるべく、遺
伝子cro−lacZに対して正しい配向でcDNAを挿入するた
めに、P.N.A.S.USA、1983、80、31−35に記載のHelfman
n等の技術に従ってcDNAの両端に種々のリンカーを順次
付加するプロトコルを使用する。使用されるリンカーは
BamH I及びSal I切断部位に対応する。 これら組換体プラスミドは、従来技術を用い所望配列
によってタンパク質を発現させる細菌株を形質転換する
ために使用される。 細菌株としては大腸菌株が好ましく、リプレッサーcr
oの対立遺伝子cIts857を含む大腸菌pop2135が特に好ま
しい。 このようにして細菌株中で高レベルの絨毛タンパク質
を発現する細胞のmRNAに対応し約30,000のクローン組換
体を含むcDNAバンクが得られる。 ハイブリッドタンパク質の発現は温度によって誘発さ
れ得る。従って遺伝子croのリプレッサーが失活する温
度で処理する。このためには、室温より高温、特に40〜
42℃のオーダの温度で菌株を約２時間インキュベートす
るだけでよい。 従来技術による細菌の溶解及びタンパク質の再生後に
回収されたクローンを免疫スクリーニングによって選択
する。 好ましくは先ず少なくとも１種類の抗絨毛ポリクロー
ナル抗体によってcDNAバンクのスクリーニングを行う。
１種類以上のポリクローナル抗体と特異的に反応するク
ローンをCOOH末端エピトープに対する少なくとも１種類
のモノクローナル抗体を用いて再度スクリーニングす
る。 完全ブタ絨毛タンパク質に対する抗ポリクローナル抗
体の如き抗絨毛ポリクローナル抗体と、分子のCOOH末端
に位置するエピトープを認識し得る１種類以上のモノク
ローナル抗体とを順次使用すると十分なスクリーニング
が行なわれる。 ポリクローナル抗体によるスクリーニング後に、別の
ポリクローナル抗体特にニワトリの絨毛タンパク質のCO
OH末端断片に対するポリクローナル抗体を用いた二次ス
クリーニングを行なうのが有利である。 本発明の目的は特に、完全絨毛タンパク質に対するポ
リクローナル抗体とニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末
端ペプチドに対するポリクローナル抗体とCOOH末端エピ
トープに対する２種類のモノクローナル抗体とに特異的
に反応することを特徴とするヒト絨毛タンパク質に対応
するcDNAを担持するクローンを提供することである。 本発明の目的はまた、ポリＡ配列とポリアデニル化部
位とをもつインサートを含む絨毛タンパク質に対応する
cDNAを担持するクローンを提供することである。 本発明の別の特徴によれば、絨毛タンパク質の検出に
使用される手段はモノクローナル抗体から構成される。 本発明のこの特徴は、異なる種に由来する絨毛タンパ
ク質がモノクローナル抗体に接近し得る共通エピトープ
をもち、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
の産生に適したミエローマ細胞と融合した脾臓細胞をも
つ動物の免疫化に使用された特定の絨毛タンパク質を特
異的に認識するだけでなくヒトを含むその他の種に由来
する絨毛タンパク質をも特異的に認識するという事実に
基づく。 従って本発明の好ましいモノクローナル抗体の特徴
は、以下の特性をもつことである。 −精製ブタ絨毛タンパク質を認識する（Western Blotti
ng）、 −ニワトリの絨毛タンパク質を認識する（Western Blot
ting）、 −ヒト結腸の腺癌HT29に由来する系の細胞抽出物の絨毛
タンパク質を認識する（Western Blotting）、 −免疫細胞化学的ラットの絨毛タンパク質（ホルムアル
デヒドに固定されたラットの腸粘膜の凍結切片（クリオ
スタット））を認識する。 前記定義に対応するモノクローナル抗体のうちの好ま
しいモノクローナル抗体は、ニワトリの絨毛タンパク質
の「ペプチドHP」に含まれるエピトープをも認識する。
予め単離されたペプチドHPとペプチドHPをまだ含む51Kd
のペプチドとの双方に対して認識が可能である。該抗体
はニワトリ絨毛タンパク質のペプチド44Kd又はペプチド
44Kdのいずれをも認識しない。 本発明の好ましい抗体は、更に、タンパク質HPを特に
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で処理後の再生状態で
認識でき、また、絨毛タンパク質を担持する上皮細胞で
認識し得る。この結果は、ペプチドHPによって担持され
るエピトープが細胞培地中の他のタンパク質によって遮
蔽されていないことを示す。 本発明は当然、これらモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマに係る。これらハイブリドーマを産生す
るための有利な技術、特に精製ブタ絨毛タンパク質に対
する免疫マウスの脾臓細胞と適当なミエローマの細胞と
の融合によるハイブリドーマ産生技術については後述す
る。この方法で得られた好ましいハイブリドーマ（BD−
D2C3株）はパリ、パスツール研究所のCollection Natio
nale des Cultures de Microorganismes（CNCM）に1985
年４月29日に受託番号no.I−440で寄託された。 本発明の有利な特徴によれば、抗体の形成に使用され
る免疫物質は細菌中で多量に発現し得る。この免疫物質
は、ヒト絨毛タンパク質のDNA又はその断片に対応する
前記ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドに
対応する。 従来技術によって、ペプチドを動物に注射し、抗血清
を回収し、次に必要な場合、例えばアフィニティクロマ
トグラフィーによって抗血清から抗体を回収する。抗体
産生のこの変形例は、上記に定義したcDNA断片によって
コードされた領域HPが最も免疫原性で最も絨毛タンパク
質特異的な領域であるときに一層有利である。 絨毛タンパク質の相補的DNA又は該DNAの断片のヌクレ
オチド配列によってコードされるタンパク質はまた、競
合ラジオイムノアッセイ（直接ELISA法又は競合ELISA
法）を行うための抗原ソースを構成する。 しかし乍ら勿論、同じ免疫原性配列を含むその他の全
ての免疫物質を使用し得る。例えば、ペプチドHP自体を
使用してもよく、場合によっては免疫特性を強化するた
めに子牛血清アルブミンのごときキャリャー分子に予め
グラフト重合されたペプチドHPを使用してもよい。 本発明の好ましいモノクローナル抗体を入手できれば
ペプチドHPの特性的エピトープ領域を定義し得ることも
当業者に明らかであろう。より正確に同定するために
は、特に、以下の段階を含む方法を使用するとよい。 −ペプチドHP（又は所望エピトープを含むと推定できる
ペプチドHPの部分）をコードするポリヌクレオチド配列
を合成する、 −絨毛タンパク質のCOOH末端をコードするヌクレオチド
配列を含む前記に定義した前記プラスミドを前記配列の
外部の制限部位のところで直線化する、 −酵素Bal31の如きエキソヌクレアーゼによって直線
化プラスミドを調整的トリミングする、 −DNAリガーゼによってプラスミドを再環化する、 −対応プラスミドによってそれ自体形質転換できかつプ
ラスミドに内包されるインサートを発現し得る適当な微
生物を形質転換する、 −この微生物の発現産物と該当抗体とを再度接触させ
る。 再環化された最終プラスミドによって形質転換された
前記微生物の発現産物中で前記免疫原性ペプチドの検出
が消滅するまで上記処理サイクルを繰り返す。 方法の各サイクルの終期、特に中間再環化プラスミド
の認識能力を消滅させる最終トリミング処理の以前及び
以後のプラスミドの末端部分の配列決定のときに、この
最終トリミング処理中に除去されたヌクレオチド配列に
よってコードされるペプチドの箇所にエピトープを配置
することが可能である。即ち、当業者にとって前記抗体
を入手することは、該エピトープを含む化学的に定義さ
れたペプチド配列を入手したことと等価である。 本発明はまた、上記に定義した好ましいモノクローナ
ル抗体と反応でき且つポリアクリルアミドゲル電気泳動
特にSDS−PAGE試験で実質的に１つのバンドだけを生じ
る生物学的に実質的に純粋なヒト絨毛タンパク質を係
る。 即ち、ヒト絨毛タンパク質は、ヒト腸細胞溶解物、特
に適当な洗浄剤を含む水溶液で処理し前記モノクローナ
ル抗体を用いて精製したヒト腸細胞溶解物から抽出され
得る。この種の精製方法では、アフィニティクロマトグ
ラフィー処理に適応するように好ましくは固体支持体に
固定されたモノクローナル抗体を使用するのが有利であ
る。例えば、スエーデンのPHRMACIA A.G.によって商標S
EPHAROSEとして市販されている三次元網目状構造のアガ
ロースの網にモノクローナル抗体を例えばシアノゲンブ
ロマイド法で固定する。 従って本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質を分離する
ために、該絨毛タンパク質を含む溶液を前記モノクロー
ナル抗体を含むアフィニティカラムと接触させてヒト絨
毛タンパク質を選択的に固定し、次にグリシンベースの
pH2〜４の酸性バッファ又はメチルアミンベースのpH11
の塩基性バッファによる抗原抗体複合体の溶解によって
ヒト絨毛タンパク質を回収し、次に酢酸アンモニウムバ
ッファに透析する方法に係る。 勿論本発明はまた、ヒト絨毛タンパク質断片から成る
より小さい分子量のポリペプチドに係る。断片が特異的
部位のポリペプチド切断酵素によるヒト絨毛タンパク質
の切断によって得られることは当業者に明らかであろ
う。かかるタンパク質として例えば、先ず、トリプシン
即ちStaphylococcus aureusV8のプロテアーゼ、アルフ
ァキモトリプシン、BOEHRINGER社により市販のマウスの
顎下腺プロテアーゼ、前記ペプチドGly−Pro及びGly−A
la等を特異的に認識するVibrio alginolyticus chemova
r iophagusのコラゲナーゼがある。 ヒト絨毛タンパク質又はその断片から製造され得る任
意に種特異的なハイブリドーマ及びモノクローナル抗体
も本発明の一部を構成することが理解されよう。 本発明の別の特徴及び利点は、ヒト絨毛タンパク質の
検出、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の産生及
び試験で使用される特定条件の例を示す以下の記載より
明らかにされるであろう。 またヒト絨毛タンパク質のcDNA部分を担持するクロー
ンの作成方法も記載する。 実施例1:ヒト絨毛タンパク質の検出 消化部又は腎臓部と生物体のその他の部とに由来する
腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の増殖の種々の時期の絨毛タン
パク質の発現を検査した。BROWN及びFARQUHAR、Cell、3
6、295（1984）に記載の技術で該当組織を採取し凍結し
固定して切片（凍結切片）の調製した。 −25℃で５μｍ厚の切片を得、ポリリジンで被覆した
ガラスプレートに載せた。0.2％のゼラチンを含む生理
食塩水リン酸バッファ（PBS−ゼラチン）溶液に浸漬し
た後に、絨毛タンパク質を検出すべくPBS−ゼラチン中
に1/800に希釈した抗絨毛ウサギ抗血清50μを含む溶
液で切片を処理し、湿潤室で室温で25分間インキュベー
トした。 次にPBS−ゼラチン中で切片を10分間ずつ３回洗浄し
た。 次にローダミン（オランダのNordic Immunological L
aboratoriesの製品）でラベルしたウサギ抗IgGを添加
し、これら抗IgGの存在下に切片を室温で25分間インキ
ュベートした。次に切片をPBS−ゼラチン中で完全に洗
浄し、Plan Nofluarオイルに浸漬したレンズと１組の
適当なフィルターとを備えた蛍光顕微鏡（ZEISS光顕微
鏡）で検査した。 コントロール組織及び他の起源の腫瘍細胞についても
同様に処理した。 以下の結果が観察された。 組織が結腸の腺癌に由来するとき、12のサンプルのう
ちの11のサンプルが絨毛タンパク質の発現の陽性を示し
た。他の起源のヒト腫瘍、例えばリンパ腫特に腸間膜結
節リンパ腫及び膵臓、食道等の転移又はそれ以外の原因
による他の起源の種々のタイプの癌腫はタンパク質を発
現しなかった。 観察の結果一般的に、処理された腫瘍の一次腸起源と
絨毛タンパク質の発現との間に緊密な相関関係があるこ
とが判明した。明らかに別の起源の腫瘍に対して行なっ
た多数の試験では、実質的に全部の場合にタンパク質の
発現が陰性であった。 注目すべきは、腸起源の組織においては、該細胞の増
殖程度にかかわりなく絨毛タンパク質が常に観察される
ことである。 前記の試験ではポリクローナル抗体を用いた。CNCMに
寄託した好ましいモノクローナル抗体を使用するとより
明白な結果が得られた。 これらモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
の単離条件の例を以下に記載する。また、ELISAタイプ
の免疫試験によって絨毛タンパク質の有無を診断するた
めの好ましい検出条件の与え方についても以下に記載す
る。 実施例2:絨毛タンパク質に対するモノクローナル抗体の
調製 （Ａ）免疫化プログラム −Balb/Cマウス:6〜８週齢 −抗原：精製ブタ絨毛タンパク質（10mg/ml）（SDSの存
在下にポリアクリルアミドゲル（10％）電気泳動後の分
子量95Kdのタンパク質の均質バンド） 10mM イミダゾール 75mM HCl 1mM EGTA 0.1M DTT 50％ グリセロール −プログラム 初日:50/50エマルジョン（PBS−フロインド完全アジュ
バント）中の50μｇの純粋絨毛タンパク質のIP（腹腔組
織内）注射、 14日:50μｇの絨毛タンパク質（PBS−フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 21日:50μｇの絨毛タンパク質（PBS−フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 28日:PBSに溶解した20μｇの絨毛タンパク質のIM（筋肉
内）注射、 29日:PBSに溶解した10μｇの絨毛タンパク質のIV（静
脈）注射、 32日：融合。 （Ｂ）融合 （Ｉ）親細胞 （ａ）ミエローマ細胞 Sp2/O−Ag14系（8 Azaguanine耐性） DMEM10％FCS培地中の無菌培養物 （ｂ）脾臓細胞 起源：ブタ絨毛タンパク質に対する超免疫マウスo Ba
lb/Cの脾 （II）Ｋhler G.及びMilstein C.による細胞融合方法
（所定特異性をもつ抗体を分泌する融合細胞の連続培養
物、Nature、1975、256、495） −無血清DMEM培地中の50％のポリエチレングリコール溶
液（PEG1000−Merck9729）の存在下に無菌条件下の無血
清DMEM培地中で融合させる。２種類の親細胞の計数後
に、培養中のミエローマ細胞の懸濁液を脾臓細胞の懸濁
液に1:5の割合で混合する。 −２分30秒間接触させる。 −完全DMEM培地で希釈してPEGの作用を停止させる。 −選択DMEM−HAT培地に細胞懸濁液を最終的に希釈（２
×105細胞/ml）とする。 −1mlのウェルを含むCOSTAR24皿に分配（COSTAR Tissue
Culture Cluster 24、Cat.No.3524、COSTAR 205 Groad
way、Cambridge、Ma、USA）。 （III）クローンの選択 ブタ精製絨毛タンパク質に対する抗体の分泌能力によ
ってクローンを同定する。 （Ｃ）選択方法 （Ｉ）ELISA試験： この試験では融合後の培養物上清中の抗絨毛タンパク
質モノクローナル抗体を証明し得る。 −抗原の固定：支持体（ELISAプラーク）に抗原を固定
する。 濃度:50mM、pH8のリン酸カリウムバッファ中に５μg/m
l。４℃で１晩維持。 −飽和:PBS−Tween20−BSAで飽和。 −インキュベーションI:非希釈ハイブリドーマ上清と共
に４℃で３時間。 −インキュベーションII:βガラクトシダーゼでラベル
したマウス抗IgGと共に４℃で２時間。 各段階間の洗浄にはいずれも0.1％のPBS−Tween20を
用いる。 −基質:0.1M、pH7.0のリン酸バッファ、10-3M MgSO4、
２×10-3M MnSO4、２×10-3M脱水トリトリプレックス
（Tritriplex）マグネシウム（Merck8409）中のｏ−ニ
トロフェニル−β−ガラクトピラノシド（Sigma N11−2
7） 読取り:414nmでのDO（光学密度）読取り。 バックグラウンドノイズのDOの10倍のDOを与えるハイ
ブリドーマ上清をもつクローンを選択した。 （II）Western Blotting、Burnette.Anal.Biochem.198
1、112、195−203 この試験によって、ELISA試験の陽性クローンのうち
でもヒト絨毛タンパク質とニワトリ絨毛タンパク質とを
同時に認識し得るブタ抗絨毛タンパク質モノクローナル
抗体を分泌するクローンを選択し得る。 種々の試験段階 （ａ）ニワトリの腸粘膜の細胞抽出物と絨毛タンパク質
を発現するHT29系（ヒト結腸の腺癌）の細胞抽出物とを
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。 （ｂ）ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質
をニトロセルローズ紙に電気転移する。 （ｃ）細胞タンパク質が転移されたニトロセルローズ紙
を、ELISAで予め選択したハイブリドーマ上清と共に４
℃で１晩インキュベートする。 （ｄ）ペルオキシダーゼでラベルしたマウス抗IgGと共
に室温で１時間インキュベートする。 （ｅ）基質： −10mgの四塩酸ジアミノベンジジン −20mlのpH7.6の0.1M TrisHCl −0.2mlの１％H2O2 各段階間の洗浄にはいずれも新生子ウシ血清−PBS−T
ri−ton X100を用いる。 （ｆ）陽性反応：抗原−モノクローナル抗体反応が生じ
ると、栗色バンド（分子量95Kd）が速やかに出現する。 （Ｄ）選択ハイブリッドのクローニング −限界希釈法： ウェルの底部に結合したマクロファージ（４週齢のBa
lb/Cマウス起源）に（96ウェルのプラークの）ウェル当
たり１つの細胞が分布するように陽性クローンを選択培
地に希釈する。 条件調整した選択培地を添加する。 −前記方法によって陽性クローンを選択する。 −必要に応じて再クローニングする。 （Ｅ）腹水の調製 −４〜５日以前にPRISTANE（Aldrich、2,6,10,14−テト
ラメチルペンタデカン）を注射しておいたマウスに選択
クローンを注射する。 −マウス当たり１〜２×106の細胞を注射する。 −10〜15日後に増殖したクローン細胞を含む腹水をマウ
スから回収する。 腹水の抗絨毛モノクローナル抗体価は1mg/mlより高
い。 −選択クローンの凍結は10％FCS−５％DMSOのDMEM培地
中で行なう。 −176℃の液体窒素中で保存する。 絨毛タンパク質定量のための直接ELISA法 −精製IgGの吸着：一定濃度の腹水BD−D2C3からELISAプ
ラークに吸着させる。 イオン交換クロマトグラフィー（DEAE−Trisアクリ
ル）及びヒドロキシアパタイトカラムによって抗体を精
製した。 所定濃度まで濃縮する。 37℃で２時間次に４℃で１晩インキュベートする。 0.1％のPBS/Tween20で洗浄する。 −プラークの飽和 PBS/0.1％のTween20/0.4％のBSAの存在下に30分間イ
ンキュベートする。 −抗原の添加 0.4％BSAの存在下で精製絨毛タンパク質の濃度範囲は
５μg/mlから１又は0.1ng/mlに減少する。 ４℃で３時間インキュベートする。 0.1％のPBS/Tween20で洗浄する。 −精製IgGの添加：βガラクトシダーゼと結合した絨毛
タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体血清から
精製されたIgGを添加する。 ４℃で２時間インキュベートする。 0.1％のPBS/Tween20中で洗浄する。 −βガラクトシダーゼの検出 20mlのpH7の0.1Mのリン酸緩衝バッファ、10-3MのMgSO
4、２×10-4MのMnSO4、２×10-3MのEDTA（Merck8409）
中の4mg/mlの溶液を用いて20mgのｐ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを添加する。 37℃でＸ時間インキュベートする。 414nmでの光学密度を読取る。 実施例3:ヒト臨床観察 細胞抽出物中の極めて少量（全タンパク質1mg当たり
0.5ng）の絨毛タンパク質を検出し得る感度をもつ後述
のELISA試験を使用して血清中の絨毛タンパク質の定量
可能な量を検出するための測定を行なった。即ち、絨毛
タンパク質は、消化管の健常細胞及び腫瘍細胞によって
発現される細胞内タンパク質なので、ある種の病理的及
び生理的状態では絨毛タンパク質を含む細胞の壊死によ
って絨毛が血管系に遊離されることが判明した。 供血集団（ｎ＝190）に関する検査によれば、大多数
の血清（ｎ＝168）中で絨毛タンパク質が検出されない
ことが判明した。しかし乍ら、少数の固体（ｎ＝15）に
は検出可能量の絨毛タンパク質（５〜10ng/ml）が存在
した。この値を病理微候でない絨毛タンパク質のレベル
と考えてよい。最後に、幾つかの固体（ｎ＝７）では基
底値より高いレベルの絨毛タンパク質（50〜100ng/ml）
が存在した。所謂「健常」なこれら固体（3.6％）に対
しては消化管の付加的臨床検査（ファイバースコープ、
コロノスコープ）を行なわなかった。 種々の胃腸病理に関して得られた結果を以下の表にま
とめる。 患者の血清中に検出可能量の絨毛タンパク質が検出さ
れる疾患： 消化管の悪性病理： −結腸癌 −胃癌 消化管の良性病理： −絨毛腫 −Crohn病 −出血性直腸結腸炎 −十二指腸球潰瘍、胃潰瘍、食道潰瘍 注目すべきは消化器官の多腺腫（ポリープ）は逆にこ
のタンパク質を血液中に遊離しないことである。 この検査から更に幾つかの結論が得られる。 1/血液中の絨毛タンパク質の量と腫瘍の大きさ又はその
進行期には相関関係がないと考えてよい。 2/手術後の追跡のためにこのタンパク質を判定すると完
全摘除後には血清中の率が低下する。これに反して、腫
瘍細胞が残存すると（不完全摘除、再発、転移）絨毛タ
ンパク質レベルは維持されるか又は増加する。 この研究により、絨毛タンパク質が健常被検者の血清
中では通常検出されないが、悪性病理（結腸癌又は腎臓
癌）に侵された患者又は消化粘膜の炎症性又は壊死性突
起を生じる消化管の良性潰瘍（Crohn病、RCH病、潰瘍）
がみられる患者では絨毛タンパク質を定量できることが
判明した。 血液中の絨毛タンパク質の定量はまた、良性疾患（消
化管の潰瘍及び炎症性疾患）の監視にも極めて重要であ
ることが判明した。他方、血液中の絨毛タンパク質を追
跡するためには、本発明の抗体と共に癌の進行監視のた
めに現在使用されているCEA（癌胎児性抗原）の如き別
の腫瘍ラベルを使用することも可能である。これら現行
の腫瘍ラベルは、1/侵された器官に特異的でない、2/種
々の良性病理中に観察される、という欠点をもつ。 実施例4:ヒト絨毛タンパク質に対応するcDNAの調製 mRNAの調製 ヒト結腸腺癌由来の細胞系HT29からmRNAを調製する。
Ullrich等による塩化グアニジウム法、Science、1977、
196、1313−1319、によってRNAを抽出する。Aviv及びLe
derによるオリゴdT−セルロースカラムクロマトグラフ
ィー法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1972、69、1408−14
12、によってmRNAポリA+の精製を行なう。 cDNAの調製 Fiddes及びGoodmanの方法、Nature、1979、281、351
−356、によってcDNAの第１ストランドと第２ストラン
ドとを調製する。Helfmann等の方法、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA、1983、80、31−35、によって３′末端にリンカ
ーSal I及び５′末端にBamH Iを順次付加する。 約30,000の組換体クローンを含むcDNAバンクを得る。 ベクター プラスミドpEX1−３（Stanley及びLuzio、EMBO Journ
al、1984、３、1429−1430、1984参照）を使用する。こ
れらベクターは、その発現がλバクテリオファージのプ
ロモータPRのコントロール下にある融合遺伝子cro−Lac
Zを含むプラスミドから誘導される。複数の非反復制限
部位を含むポリヌクレオチドを遺伝子LacZの３′末端に
挿入した。また、転写及び翻訳終了シグナルを３つの読
取りフェーズに挿入した。 制限酵素BamH I及びSal Iで消化したプラスミドpEXの
各々にcDNAを挿入した。従ってこれらは全て遺伝子CroL
acZに対して同方向に配向されている。 形質転換 O.RaibaudによってNucleic Acid Researchに記載のご
とく構築された大腸菌pop2135株を細菌株として使用す
る。 以下の式によって操作し、対立遺伝子CI857とプロモ
ータPRとを含むλファージの2.3kbのBal II断片をポリ
リンカーのBamH I部位にクローニングする。 このように得られたEcoR I断片を、pOM41のEcoR I部
位にクローニングし、菌株C600の染色体に組み込む（Ge
ne、292、232−241）。 近位aroBラベルとP1′とのコトランスフェクションに
よって、この構造をMM294の染色体（F- endA thi hsd
R）に導入する。大腸菌pop2135が、配向maIT、CI857、P
R、maIPOで得られる。 大腸菌pop2135を組換体プラスミドで形質転換するた
めには、Hanahan等のルビジウムを使用する技術、J.Mo
l.Biol.、1983、166、557−580、を使用する。この菌株
はcroのリプレッサーの対立遺伝子cIts857を含む。 得られた組換体の数は103〜104ngのcDNAのオーダであ
る。 免疫検出によるクローンの選択 得られた組換体クローンをニトロセルロースフィルタ
ーに塗抹する。42℃で２時間インキュベーション後にハ
イブリッドタンパク質の合成が誘発される。SDSによる
細菌の溶解及びメタノールの非存在下でのタンパク質の
再生後に免疫スクリーニングによってクローンを分析す
る。タンパク質の再生にはBurnettの技術、Anal.Bioche
m.、1981、112、195−203、を用いる。 先ず、完全ブタ絨毛タンパク質に対するポリクローナ
ル抗体によってバンクをスクリーニングする。次に、ニ
ワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端断片に対するポリク
ローナル抗体と、分子のCOOH末端領域に位置するエピト
ープを認識する２種類のモノクローナル抗体（BDD2C3及
びIID3H9）とを使用して二次スクリーニングを行なう。 クローンpEXZ−V19は、510塩基対のインサートを含
む。コード部分は330の塩基対をもつ。この部分に続い
て200塩基対の非コード領域が存在する。 クローニングされたcDNAはヒト絨毛タンパク質のCOOH
末端の95個のアミノ酸をコードしており全タンパク質の
約1/10（分子量:95Kd）に相当する。 参考文献 （１）Ullrich,A.,Shine,J.,Chirgwin,J.,Pictet,R.,Ti
scher,E.,Rutter,W.J.＆ Goodman,H.M. Rat insulin genes:construction of plasmids contain
ing the coding sequences Science,1977,196,1313−1319 （２）Aviv,H.＆ Leder,P. Purification of biologically active globin mRNA by
chromatography on oligothymidylic acid cellulose Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1972,69,1408−1412 （３）Fiddes,J.C.＆ Goodman,H.M. Isolation,cloning and sequence analysis of the cDN
A for the alpha−subunit of human chorionic gonado
tropin Nature,1972,281,351−355 （４）Helfman,D.M.,Feramisco,J.R.,Fiddes,J.C., Thomas,G.P.＆ Hughes,S.H. Identification of clones that encode chicken tropo
myosin by direct immunologial screening of a cDNA
expression library Proc.Natl,Acad.Sci.USA,1983,80,31−35 （５）Stanley,K.K.＆ Luzio,J.P. Construction of a new family of high efficiency ba
cterial expression vectors:identification of cDNA
clones coding for human liver EMBO Journal,1984,３,1429−1434 （６）Stanley,K.K. Solubilization and immune−detection of beta−gala
ctosidase hybrid proteins carrying foreign antigen
ic determinants Nucleic Acids Res.,1983,11,4077−4092 （７）Hanahan,D. Studies on transformation of E.coli with plasmids J.Mol.Biol.,1983,166,557−580 （８）Burnett,W.N. “Western Blotting":Electrophoretic transfer of pr
oteins from sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide
gels to unmodified nitrocellulose and radiographi
c detection with antibody and radioiodinated prote
in A Anal.Biochem.,1981,112,195−203
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 15/09 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ａ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
前置審査
(73)特許権者 999999999
アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・
ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシ
ユ・メデイカル
フランス国、75013・パリ、リユ・ド
ユ・トルビアツク、101
(72)発明者 ルバル，ダニエル
フランス国、92330・ソー、アレ・ド
ウ・トレビス、23
(72)発明者 デユドウエ，ブリジツト
フランス国、75005・パリ、リユ・ブラ
ンビル、９
(72)発明者 ロビーヌ，シルビ
フランス国、92170・バンブ、リユ・デ
イシ、54
(72)発明者 アルパン，モニク
フランス国、75014・パリ、リユ・ロリ、
９
(72)発明者 プランゴー，エリク
フランス国、75003・パリ、リユ・オ・
メール、26
(72)発明者 ガルシア，アルフオンス
フランス国、75015・パリ、リユ・ド
ウ・ビロフレ、３
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．腫瘍形質の疑いのある生物サンプル中で、最初に消
化管部で形成された腫瘍細胞及び／又は該細胞の誘導体
をin vitroで検出するための方法であって、該生物サン
プルを、約95,000ダルトンの分子量を有しかつカルシウ
ムイオンの存在下でアクチンと結合可能である絨毛タン
パク質に対する抗体、又は下記のアミノ酸配列からなる
ヒト絨毛タンパク質のカルボキシ末端をコードするDN
A、と接触させることを特徴とする、前記方法。 Lys Trp Ser Asn Thr Lys Ser Tyr Glu Asp Leu Lys Al
a Glu Ser Gly Asn Ser Arg Asp Trp Ser Gln Ile Thr Ala Gl
u Val Thr Ser Pro Lys Val Asp Val Phe Asn Ala Asn Ser As
n Leu Ser Ser Gly Pro Leu Pro Ile Phe Pro Leu Glu Glu Le
u Val Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Pro Glu Gly Val Asp Pr
o Ser Arg Lys Glu Glu His Leu Ser Ile Glu Asp Phe Thr Gl
n Ala Phe Gly Met Thr Pro Ala Ala Phe Ser Ala Leu Pro Ar
g Trp Lys Gln Gln Asn Leu Lys Lys Glu Lys Gly Leu Phe ２．腫瘍が、結腸癌、胃癌及び腎臓癌から成る群から選
択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方
法。 ３．絨毛タンパク質に対する抗体が、ヒト絨毛タンパク
質を認識する抗絨毛抗体から構成されることを特徴とす
る請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４．絋毛タンパク質に対する抗体が、以下の特性： − 精製ブタ絨毛タンパク質を認識する（ウェスターン
ブロッティング使用）、 − ニワトリの絨毛タンパク質を認識する（ウェスター
ンブロッティング使用）、 又は − 免疫細胞化学的にラット絨毛タンパク質を認識する
［ホルムアルデヒド固定のラット腸粘膜の凍結（クリオ
スタット）切片使用］、 をもつ絨毛タンパク質に対するモノクローナル抗体によ
って構成されることを特徴とする請求の範囲第１項又は
第２項に記載の方法。 ５．モノクローナル抗体が、配列： Val Phe Thr Ala Thr Thr Thr Leu Val Pro Thr Lys Le
u Glu Thr Phe Pro Leu Asp Val Leu Val Asn Thr Ala Ala Gl
u Asp Leu Pro Arg Gly Val Asp Pro Ser Arg Lys Glu Asn Hi
s Leu Ser Asp Glu Asp Phe Lys Ala Val Phe Gly Met Thr Ar
g Ser Ala Asn Leu Pro Leu Trp Lys Gln Gln Asn Leu Lys Ly
s Glu Glu Lys Gly Leu Phe を有するニワトリ絨毛タンパク質のＣ末端配列（779〜8
54）に含まれる抗原部位すなわち「ヘッド部」を認識
し、かつ、該ヘッド部が単離されているか又はニワトリ
絨毛タンパク質に含まれる51Kdのペプチドの内部に存在
するかにかかわりなく該ヘッド部を認識し得ることを特
徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．モノクローナル抗体が、1985年４月29日に受託番号
Ｉ−440でCNCMに寄託されたハイブリドーマ細胞系から
産生されることを特徴とする請求の範囲第３項又は第４
項に記載の方法。 ７．前記DNAが、以下のヌクレオチド配列をもつことを
特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 AAG TGG AGT AAC ACC AAA TCC TAT GAG GAC CTG AAG GC
G GAG TCT GGC AAC TCT AGG GAC TGG AGC CAG ATC ACT GCT GA
G GTC ACA AGC CCC AAA GTG GAC GTG TTC AAT GCT AAC AGC AA
C CTC AGT TCT GGG CCT CTG CCC ATC TTC CCC CTG GAG CAG CT
A GTG AAC AAG CCT GTA GAG GAG CTC CCC GAG GGT GTG GAC CC
C AGC AGG AAG GAG GAA CAC CTG TCC ATT GAA GAT TTC ACT CA
G GCC TTT GGG ATG ACT CCA GCT GCC TTC TCT GCT CTG CCT CG
A TGG AAG CAA CAA AAC CTC AAG AAA GAA AAA GGA CTA TTT
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8506707A FR2581456B1 (fr) | 1985-05-02 | 1985-05-02 | Villine humaine, en tant que marqueur de cellules malignes primaires originaires du tube digestif, et moyens, en particulier anticorps diriges contre la villine humaine, pour la detection desdites cellules malignes |
| FR85/06707 | 1985-11-13 | ||
| FR85/16820 | 1985-11-13 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6290159A Division JP2698326B2 (ja) | 1985-05-02 | 1994-11-24 | 消化管起源の悪性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出に使用し得る絨毛タンパク質をコードするＤＮＡの合成法 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPS62502687A JPS62502687A (ja) | 1987-10-15 |
| JP2688481B2 true JP2688481B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=9318907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| FR (1) | FR2581456B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| FR2919065B1 (fr) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | Procede de dosage de l'apolipoproteine ai pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal |
| FR2919064B1 (fr) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | Procede de dosage de l'apolipoproteine all pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal |
| CA2693098C (fr) | 2007-07-19 | 2019-06-18 | Yasemin Ataman-Onal | Procede de dosage de la proteine de liaison hepatique aux acides gras, de l'antigene carcino-embryonnaire, et de l'antigene carbohydrate 19-9 pour le diagnostic in vitro du cancercolorectal |
| FR2919063B1 (fr) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | Procede de dosage du leucocyte elastase inhibitor pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal. |
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| FR2919062B1 (fr) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | Procede de dosage de l'aminoacylase 1 pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal. |
| FR2933773B1 (fr) | 2008-07-10 | 2013-02-15 | Biomerieux Sa | Procede de dosage de la proteine disulfide isomerase pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal |
-
1985
- 1985-05-02 FR FR8506707A patent/FR2581456B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-04-30 JP JP61502415A patent/JP2688481B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2581456A1 (fr) | 1986-11-07 |
| FR2581456B1 (fr) | 1987-07-17 |
| JPS62502687A (ja) | 1987-10-15 |
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