JP2698337B2 - 消化管起源の悪性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出に使用し得る抗絨毛モノクローナル抗体 - Google Patents
消化管起源の悪性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出に使用し得る抗絨毛モノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ヒト消化管の腫瘍細胞における
悪性細胞の増殖の有無特に腺癌型細胞の増殖の有無をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ検出する方法で使用され得る材料要素、
特にヒト絨毛タンパク質に対する抗体好ましくはモノク
ローナル抗体に係る。 【０００２】本発明は更に、種々の用途、例えばヒト絨
毛タンパク質を含む細胞抽出物からヒト絨毛タンパク質
を精製するために使用されたときのこれらモノクローナ
ル抗体の効果に及ぶ。 【０００３】いくつかの高等真核細胞型を同定するため
及びこれらの細胞の種々の発生段階、特に分化段階の追
跡研究のために、特異的ラベルとして構造タンパク質の
検出を利用することは既に提案されている。公知のラベ
ルとして例えば、線維タンパク質例えばビメンチン、ケ
ラチン又は神経線維タンパク質があり、これらは幾つか
の細胞型の同定、胚形成時期から細胞分化の最終時期ま
での細胞の発生の研究及び環境培地に対する細胞の挙動
の研究に使用できる(E.LAZARIDES、Nature、283 、249
(1980) 及びR.MOLL等、Cell、31、11(1982))。 【０００４】ケラチンはしばしば上皮細胞と非上皮細胞
とを識別し得る特に有効なラベルと考えられる。しかし
乍ら、この種の識別では、該当する上皮細胞の起源を必
ずしも明確に確定することはできないことが判明した。 【０００５】しかし乍ら、幾つかの細胞型の起源を確実
に検出することの必要性は、多くの場合、例えば腫瘍細
胞の増殖を示す生物サンプルを検査する場合に、この増
殖の起源に存在する一次腫瘍細胞を同定するため又は消
化領域の癌を起源とする転移の存在を検出するため又は
転移癌に対する化学療法及びその他の療法の効果を確認
するために特に重要視されつつある。勿論、抗癌治療の
効果は疾患の一次原因たる腫瘍細胞の正確な同定とのつ
ながりが深い。 【０００６】これらの観察は、( 臨床的に発見される癌
のうちの高い割合を占める) 消化器官起源又は腎臓起源
の腫瘍細胞の増殖又はこれら細胞から誘導された細胞の
増殖の検出好ましくは早期発見、特にこれら細胞の特有
ラベルの同定のために特に重要である。 【０００７】従って本発明は特に、消化器官の粘膜特に
腸粘膜中に通常は存在し主な分化型が吸収細胞又は腸細
胞から構成される上皮細胞の幾つかの主要表現型を維持
した腫瘍細胞の検出に重要である。 【０００８】本発明はまた、これら腫瘍細胞に担持され
るか否かにかかわりなく検出され得る特異的ラベルに係
る。 【０００９】本発明の目的は特に、これらラベルが腫瘍
細胞特に該細胞の壊死の場合に該細胞から離脱し例えば
血管系に遊離されたときにもラベルを検出することであ
る。 【００１０】本発明の範囲内で使用されるラベルは、絨
毛タンパク質の全部又は一部から構成される。絨毛タン
パク質は、通常は消化粘膜特に腸粘膜の絨毛組織中に存
在する分子量約95,000ダルトンのオーダのタンパク質で
ある。絨毛タンパク質はカルシウムイオンの存在下でア
クチンと結合し得る。 【００１１】絨毛の種類毎にアミノ酸配列は若干異なっ
ているが機能特性は維持されている。今日まで公知の精
製技術ではニワトリ及びブタの絨毛タンパク質を実質的
に純粋な状態まで精製し得る。しかし乍らこれらの技術
ではヒト絨毛タンパク質を精製することはできない。 【００１２】最もよく知られた絨毛タンパク質の１つは
ニワトリの絨毛タンパク質である。この絨毛タンパク質
は854 個のアミノ酸配列から形成されている。トリプシ
ン及びプロテアーゼV-8 を使用したタンパク質限定分解
によって所定箇所を切断し44Kd,51Kd 及び10Kdの断片を
得ることができる。絨毛タンパク質のマップ内でのこれ
ら断片の相対位置は、Paul MADSUDAIRA、MRC、Laboratory
of Molecular Biology、Cambridge 、U.K.及びJohn GLE
NNEY等、J.B.C.、1981、256 、8156-8161 によって以下
のごとく確認されている。 【００１３】 【表１】 【００１４】ニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端のア
ミノ酸配列(779−854)即ち「ヘッド部」（「ペプチドH
P」）は以下の式で示される。 【００１５】 【化３】【００１６】一般的に絨毛タンパク質は、特に分化終期
に到達した腸細胞の表面で観察される腸内腔壁の刷毛縁
中に存在する。微絨毛は腸細胞の分化終期の集合オルガ
ネラである。絨毛タンパク質は特に微絨毛の軸方向微線
維束中に局在している。絨毛タンパク質は、細胞骨格の
構成に寄与している。凍結切片を免疫蛍光で検査する
と、絨毛タンパク質が腸内壁に露出する円柱を形成する
細長い細胞の頂端に存在し、また腎臓の近位尿細管細胞
の近傍にも存在することを確認した。いずれの場合も絨
毛タンパク質の存在領域は該当細胞の刷毛縁と一致す
る。しかし乍ら、その他の種々の上皮の別の種々の絨毛
が極めて組織化された刷毛縁を持たないときは絨毛タン
パク質は検出されなかった（A.BRETSCHER 等、Exp.Cel
l.res.135、213 （1981）又はA.LISSの著書Membrane in
Growth and Development（成長及び発生中の膜）、New
York(1982)、pp.89 −105 に所収のH.REGGIOの論
文）。 【００１７】更に、絨毛タンパク質が刷毛縁の形成より
かなり早い発生早期の腸細胞中に存在することも確認さ
れた。 【００１８】本発明は、２つの知見により得られたもの
である。絨毛タンパク質は消化管の組織腫瘍形成中、特
に最も頻繁な癌の形態の１つたる結腸の癌、及び幾つか
のタイプの腎臓癌においては実質的に組織的に検出可能
な状態で維持されるが、その他の器官（肝臓、卵巣、肺
等）に局在する組織の初期癌化から生じる一次腫瘍細胞
中では決して検出されない。 【００１９】更に、絨毛タンパク質は、消化管部の腫瘍
細胞の全ての発生箇所で腫瘍形成の早期及びより遅い時
期に、該当細胞の分化状態にかかわりなくin vivo 検出
可能である。 【００２０】生物サンプル中の最初から消化管部で形成
された腫瘍細胞及び／又は該腫瘍細胞の誘導体をin vit
ro検出することを主目的とする本発明における検出方法
の特徴は、この生物サンプルを絨毛タンパク質に対する
特異的アフィニティをもつか又はこのタンパク質をコー
ドする遺伝子を認識する試薬と接触させることである。 【００２１】本発明における検出方法は、消化器官起源
の腫瘍細胞又は消化器官もしくは腎臓起源の一次細胞の
影響によって生物体の別の部分に後で形成された腫瘍細
胞を内包する全ての生物サンプル、又は該細胞の壊死の
場合に絨毛ラベルを含む種々の腫瘍細胞の分解産物を内
包する全ての生物サンプルに適用し得る。この生物サン
プルは、いかなる形態でもよく例えば、生検により得ら
れた組織もしくは固体腫瘍の断片、又は悪性細胞もしく
は該細胞由来の断片を運ぶ液体生物サンプル例えば全血
もしくは血清である。 【００２２】本発明の実施態様によれば、本発明におけ
る検出方法で使用される試薬は、ヒト絨毛タンパク質特
にそのCOOH末端部のアミノ酸配列をコードする領域を含
む配列をもつDNA から構成される。 【００２３】本発明の別の実施態様によれば、検出方法
で使用される技術は免疫技術であり、絨毛に特異的アフ
ィニティをもつ試薬は絨毛タンパク質を認識し得る抗体
から構成される。 【００２４】これら抗体は、公知の任意の方法で抗体自
体がラベルされるか、又は、絨毛タンパク質もしくは絨
毛タンパク質含有細胞に固定された状態のときはラベル
免疫グロブリン又はその他のラベルタンパク質（例えば
Staphylococcus aureus のプロテインA ）で認識され得
る。 【００２５】特に適当な技術は、後述する試験で使用さ
れ前記のごとき結果を示す技術である。 【００２６】本発明の目的はまた、腸細胞又は同類細胞
の微絨毛の箇所の絨毛タンパク質を検出するための新規
な特異的手段を提供することである（勿論新規な手段の
使用は、本発明における検出方法に必ずしも限定されな
い）。 【００２７】本発明の１つの特徴によれば、これら手段
は、ヒト絨毛タンパク質の完全mRNAに対応するDNA 又は
ヒト絨毛タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域を
含むヌクレオチド配列をもつDNA 断片から構成され、絨
毛タンパク質をコードするヌクレオチド配列と特異的に
ハイブリダイズし得る。 【００２８】本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質の完全
mRNAに対応するDNA 又はヒト絨毛タンパク質のCOOH末端
のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の少なくとも
一部を含むcDNA断片を前記方法において使用することを
目的とする。このヌクレオチド配列と、コードされたア
ミノ酸の対応配列とを以下に示す。 【００２９】 【化４】 【００３０】使用されるヌクレオチド配列は、ヒト絨毛
タンパク質をコードするmRNA又はDNA を検出するための
プローブとして使用される。 【００３１】この種の検出に適したプローブは、放射性
元素によってラベルされるか又は被検mRNAもしくはDNA
を含む調製物とのハイブリダイズ状態で認識可能な別の
物質によってラベルされるのが有利である。 【００３２】従来技術によれば、これらプローブと被検
細胞を含む生物サンプルとを、プローブのヌクレオチド
配列と被検サンプルに任意に含まれる相補的配列とが任
意にハイブリダイズできる条件下に接触させるか又は核
酸と直接接触させる。 【００３３】200 塩基対のインサートを含むプローブを
使用して検出の再現性を試験した。 【００３４】本発明の範囲に包含された新規な産生物を
構成するこれらヌクレオチドプローブの別の特徴は、腸
細胞及び／又は絨毛タンパク質発現細胞の各分化状態及
び腎臓又は腸起源の細胞の種々の成熟時期における絨毛
タンパク質のmRNAの発現を研究するために使用されるこ
とである。 【００３５】従って、得られたプローブはヒト遺伝子バ
ンクから単離された絨毛タンパク質の遺伝子の数、組織
及び構造を決定し得る。 【００３６】本発明によれば、ヒト絨毛タンパク質の末
端をコードするヌクレオチド配列の単離は以下の手順で
行なわれる： −公知技術を使用し絨毛タンパク質を発現する細胞系か
ら完全mRNA（メッセンジャーRNA)を調製する、 −cDNA( 相補的DNA)バンクを構築する、 −インサートによってコードされたタンパク質を発現し
得るベクターにcDNAを挿入する、 −得られた組換体ベクターによって細菌株を形質転換
し、次に細菌中で所望タンパク質を発現させ得る条件を
設定する、 −絨毛タンパク質を認識し得る抗体を用いて絨毛タンパ
ク質の特異的クローンを含む組換体クローンを選択す
る。 【００３７】cDNAバンクの構築段階は、挿入cDNAによっ
てコードされたタンパク質を発現し得るベクターを用い
て行なわれる。 【００３８】特に発現効率が高いので特に有利なクロー
ニングベクターは、pEX タイプのプラスミドから構成さ
れる。かかるプラスミドは、Stanley及びLuzio によって
EMBOJournal、1984 、3 、1429−1434に記載されてい
る。この文献には、λバクテリオファージのプロモータ
PR のコントロール下で発現する融合遺伝子cro-lacZを
含むプラスミドが記載されている。この発現は温度によ
って誘発される。 【００３９】複数の非反復制限部位を含むポリヌクレオ
チドが読取りフェーズの各々に挿入され、また転写及び
翻訳の終結シグナルも挿入される。非反復制限部位に挿
入されたcDNAは、対応するハイブリッドタンパク質cro-
βgal-ペプチドの形態で極めて高い効率で発現される。
このハイブリッドタンパク質の利点は、難溶性であり従
って細菌中でのタンパク質分解のおそれが少なく特異的
抗体によって容易に免疫学的に検出されることである。 【００４０】対応するポリペプチドを細菌中で発現させ
るべく、遺伝子cro-lacZに対して正しい配向でcDNAを挿
入するために、P.N.A.S.USA 、1983、80、31-35 に記載
のHelfmann等の技術に従ってcDNAの両端に種々のリンカ
ーを順次付加するプロトコルを使用する。使用されるリ
ンカーは BamH Ｉ及びSal Ｉ切断部位に対応する。 【００４１】これら組換体プラスミドは、従来技術を用
い所望配列によってタンパク質を発現させる細菌株を形
質転換するために使用される。 【００４２】細菌株としては大腸菌株が好ましく、リプ
レッサーcro の対立遺伝子cIts857を含む大腸菌pop2135
が特に好ましい。 【００４３】このようにして細菌株中で高レベルの絨毛
タンパク質を発現する細胞のmRNAに対応し約30,000のク
ローン組換体を含むcDNAバンクが得られる。 【００４４】ハイブリッドタンパク質の発現は温度によ
って誘発され得る。従って遺伝子cro のリプレッサーが
失活する温度で処理する。このためには、室温より高
温、特に40〜42℃のオーダの温度で菌株を約２時間イン
キュベートするだけでよい。 【００４５】従来技術による細菌の溶解及びタンパク質
の再生後に回収されたクローンを免疫スクリーニングに
よって選択する。 【００４６】好ましくは先ず少なくとも１種類の抗絨毛
タンパクポリクローナル抗体によってcDNAバンクのスク
リーニングを行う。１種類以上のポリクローナル抗体と
特異的に反応するクローンをCOOH末端エピトープに対す
る少なくとも１種類のモノクローナル抗体を用いて再度
スクリーニングする。 【００４７】完全ブタ絨毛タンパク質に対する抗ポリク
ローナル抗体の如き抗絨毛ポリクローナル抗体と、分子
のCOOH末端に位置するエピトープを認識し得る1 種類以
上のモノクローナル抗体とを順次使用すると十分なスク
リーニングが行なわれる。 【００４８】ポリクローナル抗体によるスクリーニング
後に、別のポリクローナル抗体特にニワトリの絨毛タン
パク質のCOOH末端断片に対するポリクローナル抗体を用
いた二次スクリーニングを行なうのが有利である。 【００４９】本発明の目的は特に、完全絨毛タンパク質
に対するポリクローナル抗体とニワトリの絨毛タンパク
質のCOOH末端ペプチドに対するポリクローナル抗体とCO
OH末端エピトープに対する２種類のモノクローナル抗体
とに発現産物が特異的に反応することを特徴とするヒト
絨毛タンパク質に対応するcDNAを含有するクローンを提
供することである。 【００５０】本発明の目的はまた、ポリA 配列とポリア
デニル化部位とをもつインサートを含む絨毛タンパク質
に対応するcDNAを含有するクローンを提供することであ
る。 【００５１】本発明の別の特徴によれば、絨毛タンパク
質の検出に使用される手段はモノクローナル抗体から構
成される。 【００５２】本発明のこの特徴は、異なる種に由来する
絨毛タンパク質がモノクローナル抗体に接近し得る共通
エピトープをもち、モノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマの産生に適したミエローマ細胞と融合した脾
臓細胞をもつ動物の免疫化に使用された特定の絨毛タン
パク質を特異的に認識するだけでなくヒトを含むその他
の種に由来する絨毛タンパク質をも特異的に認識すると
いう事実に基づく。 【００５３】従って本発明の好ましいモノクローナル抗
体の特徴は、以下の特性をもつことである。 【００５４】−精製ブタ絨毛タンパク質を認識する（ウ
ェスターンブロッティング使用）、 −ニワトリの絨毛タンパク質を認識する（ウェスターン
ブロッティング使用）、 −ヒト結腸の腺癌HT29に由来する系の細胞抽出物の絨毛
タンパク質を認識する（ウェスターンブロッティング使
用）、 −免疫細胞化学的にラット絨毛タンパク質を認識する
（ホルムアルデヒド固定されたラット腸粘膜の凍結（ク
リオスタット）切片使用）。 【００５５】前記定義に対応するモノクローナル抗体の
うちの好ましいモノクローナル抗体は、ニワトリ絨毛タ
ンパク質の「ペプチドHP」に含まれるエピトープをも認
識する。予め単離されたペプチドHPとペプチドHPをまだ
含む51Kdのペプチドとの双方に対して認識が可能であ
る。該抗体はニワトリ絨毛タンパク質のペプチド44Kd又
はペプチド44Kdのいずれをも認識しない。 【００５６】本発明の好ましい抗体は、更に、タンパク
質HPを特にドデシル硫酸ナトリウム(SDS) で処理後の再
生状態で認識でき、また、絨毛タンパク質を含有する上
皮細胞で認識し得る。この結果は、ペプチドHPによって
担持されるエピトープが細胞培地中の他のタンパク質に
よって遮蔽されていないことを示す。 【００５７】本発明は当然、これらモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマに係る。これらハイブリドー
マを産生するための有利な技術、特に精製ブタ絨毛タン
パク質に対する免疫マウスの脾臓細胞と適当なミエロー
マの細胞との融合によるハイブリドーマ産生技術につい
ては後述する。この方法で得られた好ましいハイブリド
ーマ(BD-D2C3株) はパリ、パスツール研究所のCollecti
on Nationale des Cultures de Micro-organismes(CNC
M) に1985年４月29日に受託番号no.I-440で寄託され
た。 【００５８】本発明の有利な特徴によれば、抗体の形成
に使用される免疫物質は細菌中で多量に発現し得る。こ
の免疫物質は、ヒト絨毛タンパク質のDNA 又はその断片
に対応する前記ヌクレオチド配列によってコードされる
ペプチドに対応する。 【００５９】従来技術によって、ペプチドを動物に注射
し、抗血清を回収し、次に必要な場合、例えばアフィニ
ティクロマトグラフィーによって抗血清から抗体を回収
する。抗体産生のこの変形例は、上記に定義したcDNA断
片によってコードされた領域HPが最も免疫原性で最も絨
毛タンパク質に特異的な領域であるときに一層有利であ
る。 【００６０】絨毛タンパク質の相補的DNA 又は該DNA の
断片のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク
質はまた、競合ラジオイムノアッセイ（直接ELISA 法又
は競合ELISA 法）を行うための抗原ソースを構成する。 【００６１】しかし乍ら勿論、同じ免疫原性配列を含む
その他の全ての免疫物質を使用し得る。例えば、ペプチ
ドHP自体を使用してもよく、場合によっては免疫特性を
強化するために子牛血清アルブミンのごときキャリャー
分子に予めグラフト重合されたペプチドHPを使用しても
よい。 【００６２】本発明の好ましいモノクローナル抗体を入
手できればペプチドHPの特性的エピトープ領域を定義し
得ることも当業者に明らかであろう。より正確に同定す
るためには、特に、以下の段階を含む方法を使用すると
よい。 【００６３】−ペプチドHP（又は所望エピトープを含む
と推定できるペプチドHPの部分）をコードするポリヌク
レオチド配列を合成する、 −絨毛タンパク質のCOOH末端をコードするヌクレオチド
配列を含む前記に定義した前記プラスミドを前記配列の
外部の制限部位のところで直線化する、 −酵素Bal31 の如きエキソヌクレアーゼによって直線化
プラスミドを調整的トリミングする、 −DNA リガーゼによってプラスミドを再環化する、 −対応プラスミドによってそれ自体形質転換できかつプ
ラスミドに内包されるインサートを発現し得る適当な微
生物を形質転換する、 −この微生物の発現産物と該当抗体とを再度接触させ
る。 【００６４】再環化された最終プラスミドによって形質
転換された前記微生物の発現産物中で前記免疫原性ペプ
チドの検出が消滅するまで上記処理サイクルを繰り返
す。 【００６５】方法の各サイクルの終期、特に中間再環化
プラスミドの認識能力を消滅させる最終トリミング処理
の以前及び以後のプラスミドの末端部分の配列決定のと
きに、この最終トリミング処理中に除去されたヌクレオ
チド配列によってコードされるペプチドの箇所にエピト
ープを配置することが可能である。即ち、当業者にとっ
て前記抗体を入手することは、該エピトープを含む化学
的に定義されたペプチド配列を入手したことと等価であ
る。 【００６６】本発明はまた、上記に定義した好ましいモ
ノクローナル抗体と反応でき且つポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動特にSDS-PAGE試験で実質的に１つのバンドだ
けを生じる生物学的に実質的に純粋なヒト絨毛タンパク
質に係る。 【００６７】即ち、ヒト絨毛タンパク質は、ヒト腸細胞
溶解物、特に適当な洗浄剤を含む水溶液で処理し前記モ
ノクローナル抗体を用いて精製したヒト腸細胞溶解物か
ら抽出され得る。この種の精製方法では、アフィニティ
クロマトグラフィー処理に適応するように好ましくは固
体支持体に固定されたモノクローナル抗体を使用するの
が有利である。例えば、スエーデンのPHRMACIA A.G. に
よって商標SEPHAROSEとして市販されている三次元網目
状構造のアガロースの網にモノクローナル抗体を例えば
シアノゲンブロマイド法で固定する。 【００６８】従って本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質
を分離するために、該絨毛タンパク質を含む溶液を前記
モノクローナル抗体を含むアフィニティカラムと接触さ
せてヒト絨毛タンパク質を選択的に固定し、次にグリシ
ンベースのpH2 〜4 の酸性バッファ又はメチルアミンベ
ースのpH11の塩基性バッファによる抗原抗体複合体の溶
解によってヒト絨毛タンパク質を回収し、次に酢酸アン
モニウムバッファに透析する方法に係る。 【００６９】勿論本発明はまた、ヒト絨毛タンパク質断
片から成るより小さい分子量のポリペプチドに係る。断
片が特異的部位のポリペプチド切断酵素によるヒト絨毛
タンパク質の切断によって得られることは当業者に明ら
かであろう。かかるタンパク質として例えば、先ず、ト
リプシン即ちStaphylococcus aureus V8のプロテアー
ゼ、アルファキモトリプシン、BOEHRINGER社により市販
のマウスの顎下腺プロテアーゼ、前記ペプチドGly-Pro
及びGly-Ala 等を特異的に認識するVibrio alginolyti
-cus chemovar iophagusのコラゲナーゼがある。 【００７０】ヒト絨毛タンパク質又はその断片から製造
され得る任意に種特異的なハイブリドーマ及びモノクロ
ーナル抗体も本発明の一部を構成することが理解されよ
う。 【００７１】 【実施例】本発明の別の特徴及び利点は、ヒト絨毛タン
パク質の検出、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体
の産生及び試験で使用される特定条件の例を示す以下の
記載より明らかにされるであろう。 【００７２】またヒト絨毛タンパク質のcDNA部分を含有
するクローンの作成方法も記載する。 【００７３】実施例1:ヒト絨毛タンパク質の検出 消化部又は腎臓部と生物体のその他の部とに由来する腫
瘍細胞及び非腫瘍細胞の増殖の種々の時期の絨毛タンパ
ク質の発現を検査した。BROWN 及びFARQUHAR、Cell、3
6、295(1984) に記載の技術で該当組織を採取し凍結し
固定して切片（凍結切片）を調製した。 【００７４】−25℃で５mm厚の切片を得、ポリリジンで
被覆したガラスプレートに載せた。0.2 ％のゼラチンを
含む生理食塩水リン酸バッファ（PBS-ゼラチン）溶液に
浸漬した後に、絨毛タンパク質を検出すべくPBS-ゼラチ
ン中に1/800 に希釈したウサギ抗絨毛タンパク抗血清50
mlを含む溶液で切片を処理し、湿潤室で室温で25分間イ
ンキュベートした。 【００７５】次にPBS-ゼラチン中で切片を10分間ずつ３
回洗浄した。 【００７６】次にローダミン（オランダのNordic Immun
ological Laboratories の製品）でラベルしたウサギ抗
IgG を添加し、これら抗IgG の存在下に切片を室温で25
分間インキュベートした。次に切片をPBS-ゼラチン中で
完全に洗浄し、Plan Neo-fluar オイルに浸漬したレンズ
と１組の適当なフィルターとを備えた蛍光顕微鏡（ZEIS
S 光顕微鏡）で検査した。 【００７７】コントロール組織及び他の起源の腫瘍細胞
についても同様に処理した。 【００７８】以下の結果が観察された。 【００７９】組織が結腸の腺癌に由来するとき、12のサ
ンプルのうちの11のサンプルが絨毛タンパク質の発現の
陽性を示した。他の起源のヒト腫瘍、例えばリンパ腫特
に腸間膜結節リンパ腫及び膵臓、食道等の転移又はそれ
以外の原因による他の起源の種々のタイプの癌腫はタン
パク質を発現しなかった。 【００８０】観察の結果一般的に、処理された腫瘍の一
次腸起源と絨毛タンパク質の発現との間に緊密な相関関
係があることが判明した。明らかに別の起源の腫瘍に対
して行なった多数の試験では、実質的に全部の場合にタ
ンパク質の発現が陰性であった。 【００８１】注目すべきは、腸起源の組織においては、
該細胞の増殖程度にかかわりなく絨毛タンパク質が常に
観察されることである。 【００８２】前記の試験ではポリクローナル抗体を用い
た。CNCMに寄託した好ましいモノクローナル抗体を使用
するとより明白な結果が得られた。 【００８３】これらモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマの単離条件の例を以下に記載する。また、EL
ISA タイプの免疫試験によって絨毛タンパク質の有無を
診断するための好ましい検出条件の与え方についても以
下に記載する。 【００８４】実施例2:絨毛タンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体の調製 (A) 免疫化プログラム −Balb/C o マウス：６〜８週齢 −抗原：精製ブタ絨毛タンパク質(10mg ／ml）（SDS の
存在下にポリアクリルアミドゲル（10％）電気泳動後の
分子量95Kdのタンパク質の均質バンド）、10mM イミダ
ゾール、75mM HCl 、1mM EGTA 、0.1M DTT 、50 ％グリ
セロール。 【００８５】−プログラム 初日：50/50 エマルジョン（PBS-フロインド完全アジュ
バント）中の50μｇの純粋絨毛タンパク質のIP（腹腔
内）注射、 14日：50μｇの絨毛タンパク質（PBS-フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 21日：50μｇの絨毛タンパク質（PBS-フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 28日：PBS に溶解した20μｇの絨毛タンパク質のIM（筋
肉内）注射、 29日：PBS に溶解した10μｇの絨毛のIV（静脈内）注
射、 32日：融合。 【００８６】(B) 融合 (Ｉ) 親細胞 (a)ミエローマ細胞 Sp2/O-Ag14系（8 Azaguanine耐性）、DMEM10％FCS 培地
中の無菌培養物。 【００８７】(b)脾臓細胞 起源：ブタ絨毛タンパク質に対する超免疫マウスBalb/C
の脾細胞。 【００８８】(II)Kohler G.及びMilstein C. による細
胞融合方法（所定特異性をもつ抗体を分泌する融合細胞
の連続培養物、Nature、1975、256 、４９５） −無血清ＤＭＥＭ培地中の50％のポリエチレングリコー
ル溶液(PEG1000-Merck9729)の存在下に無菌条件下の無
血清DMEM培地中で融合させる。２種類の親細胞の計数後
に、培養中のミエローマ細胞の懸濁液を脾臓細胞の懸濁
液に1:5 の割合で混合する。 【００８９】−２分30秒間接触させる。 【００９０】−完全DMEM培地で希釈してPEG の作用を停
止させる。 【００９１】−選択DMEM-HAT培地に細胞懸濁液を最終的
に希釈(2×105 細胞／ml）する。 【００９２】−１mlのウェルを含むCOSTAR24穴に分配(C
OSTAR Tissue Culture Cluster 24 、Cat.No.3524 、CO
STAR 205 Groadway 、Cambridge 、Ma、USA)。 【００９３】(III)クローンの選択 ブタ精製絨毛タンパク質に対する抗体の分泌能力によっ
てクローンを同定する。 【００９４】(C) 選択方法 (Ｉ)ELISA試験：この試験では融合後の培養物上清中の
抗絨毛タンパク質モノクローナル抗体を証明し得る。 【００９５】−抗原の固定：支持体(ELISAプラーク) に
抗原を固定する。濃度:50mM 、pH8 のリン酸カリウムバ
ッファ中に５μｇ／ml。 【００９６】４℃で１晩維持。 【００９７】−飽和:PBS-Tween20-BSAで飽和。 【００９８】−インキュベーションＩ：非希釈ハイブリ
ドーマ上清と共に４℃で３時間。 【００９９】−インキュベーションII：βガラクトシダ
ーゼでラベルしたマウス抗IgG と共に４℃で２時間。 【０１００】各段階間の洗浄にはいずれも0.1 ％のPBS-
Tween20 を用いる。 【０１０１】−基質:0.1M 、pH7.0 のリン酸バッファ、
10-3M MgSO4 、２×10-3M MnSO4 、２×10-3M 無水トリ
トリプレックス(Tritriplex)マグネシウム(Merck8409)
中のo-ニトロフェニル- β- ガラクトピラノシド(Sigma
N11-27)。 【０１０２】読取り:414nmでのOD（光学密度）読取り。 【０１０３】バックグラウンドノイズのODの10倍のODを
与えるハイブリドーマ上清をもつクローンを選択した。 【０１０４】(II)Western Blotting （Burnette.Anal.B
iochem.1981、 112、195-203 ） この試験によって、ELISA 試験の陽性クローンのうちで
ヒト絨毛タンパク質とニワトリ絨毛タンパク質とを同時
に認識し得るブタ抗絨毛モノクローナル抗体を分泌する
クローンを選択し得る。 【０１０５】種々の試験段階 (a) ニワトリの腸粘膜の細胞抽出物と絨毛タンパク質を
発現するHT29系（ヒト結腸の腺癌）の細胞抽出物とをポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。 【０１０６】(b) ポリアクリルアミドゲルで分離された
タンパク質をニトロセルロース紙に電気転移する。 【０１０７】(c) 細胞タンパク質が転移されたニトロセ
ルロース紙を、ELISA で予め選択したハイブリドーマ上
清と共に４℃で１晩インキュベートする。 【０１０８】(d) ペルオキシダーゼでラベルしたマウス
抗IgG と共に室温で１時間インキュベートする。 【０１０９】(e) 基質： −10mgの四塩酸ジアミノベンジジン、 −20ｍｌpH7.6 の0.1M TrisHCl、 −0.2ml の１％Ｈ2 Ｏ2 。 【０１１０】各段階間の洗浄にはいずれも新生子ウシ血
清-PBS-Triton X100を用いる。 【０１１１】(f) 陽性反応：抗原- モノクローナル抗体
反応が生じると、栗色バンド（分子量95Kd）が速やかに
出現する。 【０１１２】(D) 選択ハイブリッドのクローニング −限界希釈法：ウェルの底部に結合したマクロファージ
(4週齢のBalb/Cマウス起源）に（96ウェルのプラーク
の）ウェル当たり１つの細胞が分布するように陽性クロ
ーンを選択培地に希釈する。 【０１１３】条件調整した選択培地を添加する。 【０１１４】−前記方法によって陽性クローンを選択す
る。 【０１１５】−必要に応じて再クローニングする。 【０１１６】(E) 腹水の調製 −４〜５日以前にPRISTANE(Aldrich、2,6,10,14-テトラ
メチルペンタデカン) を注射しておいたマウスに選択ク
ローンを注射する。 【０１１７】−マウス当たり１〜２×106 の細胞を注射
する。 【０１１８】−10〜15日後に増殖したクローン細胞を含
む腹水をマウスから回収する。 【０１１９】腹水の抗絨毛モノクローナル抗体価は１mg
／mlより高い。−選択クローンの凍結は10％FCS-５％DM
SOのDMEM培地中で行なう。 【０１２０】−176 ℃の液体窒素中で保存する。 【０１２１】絨毛タンパク質定量のための直接ELISA 法 −精製IgG の吸着：一定濃度の腹水BD-D2C3 からELISA
プラークに吸着させる。 【０１２２】イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Tris
アクリル) 及びヒドロキシアパタイトカラムによって抗
体を精製した。 【０１２３】所定濃度まで濃縮する。 【０１２４】37℃で２時間次に４℃で１晩インキュベー
トする。 【０１２５】0.1 ％のPBS/Tween20 で洗浄する。 【０１２６】−プラークの飽和 PBS/0.1 ％のTween20/0.4 ％のBSA の存在下に30分間イ
ンキュベートする。 【０１２７】−抗原の添加 0.4 ％BSA の存在下で精製絨毛タンパク質の濃度範囲は
５μｇ／mlから１又は0.1ng／mlに減少する。 【０１２８】４℃で３時間インキュベートする。 【０１２９】0.1 ％のPBS/Tween20 で洗浄する。 【０１３０】−精製IgG の添加：βガラクトシダーゼと
結合した、絨毛タンパク質に対するウサギポリクローナ
ル抗体血清から精製されたIgG を添加する。 【０１３１】４℃で２時間インキュベートする。 【０１３２】0.1％のPBS/Tween20 中で洗浄する。 【０１３３】−ガラクトシダーゼの検出 20mlのpH7 の0.1Mのリン酸緩衝バッファ、10-3M のMgSO
4 、２×10-4M のMnSO4 、２×10-3M のEDTA(Merck840
9) 中の4m／mlの溶液を用いて20mgのp-ニトロフェニル-
β-D- ガラクトピラノシドを添加する。 【０１３４】37℃でX 時間インキュベートする。 【０１３５】414nm での光学密度を読取る。 【０１３６】実施例3:ヒト臨床観察 細胞抽出物中の極めて少量（全タンパク質１mg当たり0.
5ng ）の絨毛タンパク質を検出し得る感度をもつ後述の
ELISA 試験を使用して血清中の絨毛タンパク質の定量可
能な量を検出するための測定を行なった。即ち、絨毛タ
ンパク質は、消化管の健常細胞及び腫瘍細胞によって発
現される細胞内タンパク質なので、ある種の病理的及び
生理的状態では絨毛を含む細胞の壊死によって絨毛タン
パク質が血管系に遊離されることが判明した。 【０１３７】供血集団(n＝190)に関する検査によれば、
大多数の血清(n＝168)中で絨毛タンパク質が検出されな
いことが判明した。しかし乍ら、少数の個体(n＝15) に
は検出可能量の絨毛タンパク質（５〜10ng／ml）が存在
した。この値を病理徴候でない絨毛タンパク質のレベル
と考えてよい。最後に、幾つかの個体(n＝7)では基底値
より高いレベルの絨毛タンパク質（50〜 100ng／ml）が
存在した。所謂「健常」なこれら個体（ 3.6％）に対し
ては消化管の付加的臨床検査（ファイバースコープ、コ
ロノスコープ）を行なわなかった。 【０１３８】種々の胃腸病理に関して得られた結果を以
下の表にまとめる。 【０１３９】患者の血清中に検出可能量の絨毛タンパク
質が検出される疾患：消化管の悪性病理 ： −結腸癌、 −胃癌。 【０１４０】消化管の良性病理： −絨毛腫、 −Crohn 病、 −出血性直腸結腸炎、 −十二指腸球潰瘍、胃潰瘍、食道潰瘍。 【０１４１】注目すべきは消化器官の多腺腫（ポリー
プ）は逆にこのタンパク質を血液中に遊離しないことで
ある。 【０１４２】この検査から更に幾つかの結論が得られ
る。 【０１４３】1/血液中の絨毛タンパク質の量と腫瘍の大
きさ又はその進行期には相関関係がないと考えてよい。 【０１４４】2/手術後の追跡のためにこのタンパク質を
測定すると完全摘除後には血清中の率が低下する。これ
に反して、腫瘍細胞が残存すると（不完全摘除、再発、
転移）絨毛タンパク質レベルは維持されるか又は増加す
る。 【０１４５】この研究により、絨毛タンパク質が健常被
検者の血清中では通常検出されないが、悪性病理（結腸
癌又は腎臓癌）に侵された患者又は消化粘膜の炎症性又
は壊死性突起を生じる消化管の良性潰瘍（Crohn 病、RC
H 病、潰瘍）がみられる患者では絨毛タンパク質を定量
できることが判明した。 【０１４６】血液中の絨毛タンパク質の定量はまた、良
性疾患（消化管の潰瘍及び炎症性疾患）の監視にも極め
て重要であることが判明した。他方、血液中の絨毛タン
パク質を追跡するためには、本発明の抗体と共に癌の進
行監視のために現在使用されているCEA （癌胎児性抗
原）の如き別の腫瘍ラベルを使用することも可能であ
る。これら現行の腫瘍ラベルは、1/侵された器官に特異
的でない、2/種々の良性病理中に観察される、という欠
点をもつ。 【０１４７】実施例4:ヒト絨毛タンパク質に対応するcD
NAの調製 mRNAの調製 ヒト結腸腺癌由来の細胞系HT29からmRNAを調製する。Ul
lrich 等による塩化グアニジウム法、Science 、1977、1
96、1313-1319 、によってRNA を抽出する。Aviv及びLe
der によるオリゴdT- セルロースカラムクロマトグラフ
ィー法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 、1972、69、1408-141
2 、によってmRNAポリＡ+ の精製を行なう。 【０１４８】cDNAの調製 Fiddes及びGoodman の方法、Nature、1979、281 、351-3
56、によってcDNAの第１ストランドと第２ストランドと
を調製する。Helfmann等の方法、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、1983、80、31-35 、によって３′末端にリンカーSa
l Ｉ及び５′末端にBamHＩを順次付加する。 【０１４９】約30,000の組換体クローンを含むcDNAバン
クを得る。 【０１５０】ベクター プラスミドpEX1-3(Stanley及びLuzio 、EMBO Journal、
1984、3 、1429-1430、1984参照) を使用する。これら
ベクターは、その発現がλバクテリオファージのプロモ
ータ PR のコントロール下にある融合遺伝子cro-LacZを
含むプラスミドから誘導される。複数の非反復制限部位
を含むポリヌクレオチドを遺伝子LacZの３′末端に挿入
した。また、転写及び翻訳終了シグナルを３つの読取り
フェーズに挿入した。 【０１５１】制限酵素BamHＩ及びSal Ｉで消化したプラ
スミドpEX の各々にcDNAを挿入した。従ってこれらは全
て遺伝子CroLacZ に対して同方向に配向されている。 【０１５２】形質転換 O.Raibaud によってNucleic Acid Research に記載のご
とく構築された大腸菌pop2135 株を細菌株として使用す
る。 【０１５３】以下の式によって操作し、対立遺伝子CI85
7 とプロモータ PR とを含むλファージの2.3kb のBgl
II断片をポリリンカーのBamHＩ部位にクローニングす
る。 【０１５４】 【化５】 【０１５５】このように得られたEco R Ｉ断片を、pOM4
1 のEco R Ｉ部位にクローニングし、菌株C600の染色体
に組み込む(Gene 、292 、231-241)。 【０１５６】近位aroBラベルとP1′とのコトランスフェ
クションによって、この構造をMM294 の染色体(F′endA
thi hsdR）に導入する。大腸菌pop2135 が、配向ma
IT、CI857 、 PR 、maIPO で得られる。 【０１５７】大腸菌pop2135 を組換体プラスミドで形質
転換するためには、Hanahan等のルビジウムを使用する技
術、J.Mol.Biol.、1983、166 、557-580 、を使用する。
この菌株はcro のリプレッサーの対立遺伝子cIts857 を
含む。 【０１５８】得られた組換体の数は103 〜104 ngのcDNA
のオーダである。 【０１５９】免疫検出によるクローンの選択 得られた組換体クローンをニトロセルロースフィルター
に塗抹する。42℃で２時間インキュベーション後にハイ
ブリッドタンパク質の合成が誘発される。SDSによる細
菌の溶解及びメタノールの非存在下でのタンパク質の再
生後に免疫スクリーニングによってクローンを分析す
る。タンパク質の再生にはBurnett の技術、Anal.Bioch
em. 、1981、112 、195-203 、を用いる。 【０１６０】先ず、完全ブタ絨毛タンパク質に対するポ
リクローナル抗体によってバンクをスクリーニングす
る。次に、ニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端断片に
対するポリクローナル抗体と、分子のCOOH末端領域に位
置するエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗
体(BDD2 Ｃ3 及び IID3 Ｈ9 ）とを使用して二次スクリ
ーニングを行なう。 【０１６１】クローンpEXZ-V19は、510 塩基対のインサ
ートを含む。コード部分は330 の塩基対をもつ。この部
分に続いて200 塩基対の非コード領域が存在する。 【０１６２】クローニングされたcDNAはヒト絨毛タンパ
ク質のCOOH末端の95個のアミノ酸をコードしており全タ
ンパク質の約1/10（分子量：95Kd) に相当する。
悪性細胞の増殖の有無特に腺癌型細胞の増殖の有無をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ検出する方法で使用され得る材料要素、
特にヒト絨毛タンパク質に対する抗体好ましくはモノク
ローナル抗体に係る。 【０００２】本発明は更に、種々の用途、例えばヒト絨
毛タンパク質を含む細胞抽出物からヒト絨毛タンパク質
を精製するために使用されたときのこれらモノクローナ
ル抗体の効果に及ぶ。 【０００３】いくつかの高等真核細胞型を同定するため
及びこれらの細胞の種々の発生段階、特に分化段階の追
跡研究のために、特異的ラベルとして構造タンパク質の
検出を利用することは既に提案されている。公知のラベ
ルとして例えば、線維タンパク質例えばビメンチン、ケ
ラチン又は神経線維タンパク質があり、これらは幾つか
の細胞型の同定、胚形成時期から細胞分化の最終時期ま
での細胞の発生の研究及び環境培地に対する細胞の挙動
の研究に使用できる(E.LAZARIDES、Nature、283 、249
(1980) 及びR.MOLL等、Cell、31、11(1982))。 【０００４】ケラチンはしばしば上皮細胞と非上皮細胞
とを識別し得る特に有効なラベルと考えられる。しかし
乍ら、この種の識別では、該当する上皮細胞の起源を必
ずしも明確に確定することはできないことが判明した。 【０００５】しかし乍ら、幾つかの細胞型の起源を確実
に検出することの必要性は、多くの場合、例えば腫瘍細
胞の増殖を示す生物サンプルを検査する場合に、この増
殖の起源に存在する一次腫瘍細胞を同定するため又は消
化領域の癌を起源とする転移の存在を検出するため又は
転移癌に対する化学療法及びその他の療法の効果を確認
するために特に重要視されつつある。勿論、抗癌治療の
効果は疾患の一次原因たる腫瘍細胞の正確な同定とのつ
ながりが深い。 【０００６】これらの観察は、( 臨床的に発見される癌
のうちの高い割合を占める) 消化器官起源又は腎臓起源
の腫瘍細胞の増殖又はこれら細胞から誘導された細胞の
増殖の検出好ましくは早期発見、特にこれら細胞の特有
ラベルの同定のために特に重要である。 【０００７】従って本発明は特に、消化器官の粘膜特に
腸粘膜中に通常は存在し主な分化型が吸収細胞又は腸細
胞から構成される上皮細胞の幾つかの主要表現型を維持
した腫瘍細胞の検出に重要である。 【０００８】本発明はまた、これら腫瘍細胞に担持され
るか否かにかかわりなく検出され得る特異的ラベルに係
る。 【０００９】本発明の目的は特に、これらラベルが腫瘍
細胞特に該細胞の壊死の場合に該細胞から離脱し例えば
血管系に遊離されたときにもラベルを検出することであ
る。 【００１０】本発明の範囲内で使用されるラベルは、絨
毛タンパク質の全部又は一部から構成される。絨毛タン
パク質は、通常は消化粘膜特に腸粘膜の絨毛組織中に存
在する分子量約95,000ダルトンのオーダのタンパク質で
ある。絨毛タンパク質はカルシウムイオンの存在下でア
クチンと結合し得る。 【００１１】絨毛の種類毎にアミノ酸配列は若干異なっ
ているが機能特性は維持されている。今日まで公知の精
製技術ではニワトリ及びブタの絨毛タンパク質を実質的
に純粋な状態まで精製し得る。しかし乍らこれらの技術
ではヒト絨毛タンパク質を精製することはできない。 【００１２】最もよく知られた絨毛タンパク質の１つは
ニワトリの絨毛タンパク質である。この絨毛タンパク質
は854 個のアミノ酸配列から形成されている。トリプシ
ン及びプロテアーゼV-8 を使用したタンパク質限定分解
によって所定箇所を切断し44Kd,51Kd 及び10Kdの断片を
得ることができる。絨毛タンパク質のマップ内でのこれ
ら断片の相対位置は、Paul MADSUDAIRA、MRC、Laboratory
of Molecular Biology、Cambridge 、U.K.及びJohn GLE
NNEY等、J.B.C.、1981、256 、8156-8161 によって以下
のごとく確認されている。 【００１３】 【表１】 【００１４】ニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端のア
ミノ酸配列(779−854)即ち「ヘッド部」（「ペプチドH
P」）は以下の式で示される。 【００１５】 【化３】【００１６】一般的に絨毛タンパク質は、特に分化終期
に到達した腸細胞の表面で観察される腸内腔壁の刷毛縁
中に存在する。微絨毛は腸細胞の分化終期の集合オルガ
ネラである。絨毛タンパク質は特に微絨毛の軸方向微線
維束中に局在している。絨毛タンパク質は、細胞骨格の
構成に寄与している。凍結切片を免疫蛍光で検査する
と、絨毛タンパク質が腸内壁に露出する円柱を形成する
細長い細胞の頂端に存在し、また腎臓の近位尿細管細胞
の近傍にも存在することを確認した。いずれの場合も絨
毛タンパク質の存在領域は該当細胞の刷毛縁と一致す
る。しかし乍ら、その他の種々の上皮の別の種々の絨毛
が極めて組織化された刷毛縁を持たないときは絨毛タン
パク質は検出されなかった（A.BRETSCHER 等、Exp.Cel
l.res.135、213 （1981）又はA.LISSの著書Membrane in
Growth and Development（成長及び発生中の膜）、New
York(1982)、pp.89 −105 に所収のH.REGGIOの論
文）。 【００１７】更に、絨毛タンパク質が刷毛縁の形成より
かなり早い発生早期の腸細胞中に存在することも確認さ
れた。 【００１８】本発明は、２つの知見により得られたもの
である。絨毛タンパク質は消化管の組織腫瘍形成中、特
に最も頻繁な癌の形態の１つたる結腸の癌、及び幾つか
のタイプの腎臓癌においては実質的に組織的に検出可能
な状態で維持されるが、その他の器官（肝臓、卵巣、肺
等）に局在する組織の初期癌化から生じる一次腫瘍細胞
中では決して検出されない。 【００１９】更に、絨毛タンパク質は、消化管部の腫瘍
細胞の全ての発生箇所で腫瘍形成の早期及びより遅い時
期に、該当細胞の分化状態にかかわりなくin vivo 検出
可能である。 【００２０】生物サンプル中の最初から消化管部で形成
された腫瘍細胞及び／又は該腫瘍細胞の誘導体をin vit
ro検出することを主目的とする本発明における検出方法
の特徴は、この生物サンプルを絨毛タンパク質に対する
特異的アフィニティをもつか又はこのタンパク質をコー
ドする遺伝子を認識する試薬と接触させることである。 【００２１】本発明における検出方法は、消化器官起源
の腫瘍細胞又は消化器官もしくは腎臓起源の一次細胞の
影響によって生物体の別の部分に後で形成された腫瘍細
胞を内包する全ての生物サンプル、又は該細胞の壊死の
場合に絨毛ラベルを含む種々の腫瘍細胞の分解産物を内
包する全ての生物サンプルに適用し得る。この生物サン
プルは、いかなる形態でもよく例えば、生検により得ら
れた組織もしくは固体腫瘍の断片、又は悪性細胞もしく
は該細胞由来の断片を運ぶ液体生物サンプル例えば全血
もしくは血清である。 【００２２】本発明の実施態様によれば、本発明におけ
る検出方法で使用される試薬は、ヒト絨毛タンパク質特
にそのCOOH末端部のアミノ酸配列をコードする領域を含
む配列をもつDNA から構成される。 【００２３】本発明の別の実施態様によれば、検出方法
で使用される技術は免疫技術であり、絨毛に特異的アフ
ィニティをもつ試薬は絨毛タンパク質を認識し得る抗体
から構成される。 【００２４】これら抗体は、公知の任意の方法で抗体自
体がラベルされるか、又は、絨毛タンパク質もしくは絨
毛タンパク質含有細胞に固定された状態のときはラベル
免疫グロブリン又はその他のラベルタンパク質（例えば
Staphylococcus aureus のプロテインA ）で認識され得
る。 【００２５】特に適当な技術は、後述する試験で使用さ
れ前記のごとき結果を示す技術である。 【００２６】本発明の目的はまた、腸細胞又は同類細胞
の微絨毛の箇所の絨毛タンパク質を検出するための新規
な特異的手段を提供することである（勿論新規な手段の
使用は、本発明における検出方法に必ずしも限定されな
い）。 【００２７】本発明の１つの特徴によれば、これら手段
は、ヒト絨毛タンパク質の完全mRNAに対応するDNA 又は
ヒト絨毛タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域を
含むヌクレオチド配列をもつDNA 断片から構成され、絨
毛タンパク質をコードするヌクレオチド配列と特異的に
ハイブリダイズし得る。 【００２８】本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質の完全
mRNAに対応するDNA 又はヒト絨毛タンパク質のCOOH末端
のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の少なくとも
一部を含むcDNA断片を前記方法において使用することを
目的とする。このヌクレオチド配列と、コードされたア
ミノ酸の対応配列とを以下に示す。 【００２９】 【化４】 【００３０】使用されるヌクレオチド配列は、ヒト絨毛
タンパク質をコードするmRNA又はDNA を検出するための
プローブとして使用される。 【００３１】この種の検出に適したプローブは、放射性
元素によってラベルされるか又は被検mRNAもしくはDNA
を含む調製物とのハイブリダイズ状態で認識可能な別の
物質によってラベルされるのが有利である。 【００３２】従来技術によれば、これらプローブと被検
細胞を含む生物サンプルとを、プローブのヌクレオチド
配列と被検サンプルに任意に含まれる相補的配列とが任
意にハイブリダイズできる条件下に接触させるか又は核
酸と直接接触させる。 【００３３】200 塩基対のインサートを含むプローブを
使用して検出の再現性を試験した。 【００３４】本発明の範囲に包含された新規な産生物を
構成するこれらヌクレオチドプローブの別の特徴は、腸
細胞及び／又は絨毛タンパク質発現細胞の各分化状態及
び腎臓又は腸起源の細胞の種々の成熟時期における絨毛
タンパク質のmRNAの発現を研究するために使用されるこ
とである。 【００３５】従って、得られたプローブはヒト遺伝子バ
ンクから単離された絨毛タンパク質の遺伝子の数、組織
及び構造を決定し得る。 【００３６】本発明によれば、ヒト絨毛タンパク質の末
端をコードするヌクレオチド配列の単離は以下の手順で
行なわれる： −公知技術を使用し絨毛タンパク質を発現する細胞系か
ら完全mRNA（メッセンジャーRNA)を調製する、 −cDNA( 相補的DNA)バンクを構築する、 −インサートによってコードされたタンパク質を発現し
得るベクターにcDNAを挿入する、 −得られた組換体ベクターによって細菌株を形質転換
し、次に細菌中で所望タンパク質を発現させ得る条件を
設定する、 −絨毛タンパク質を認識し得る抗体を用いて絨毛タンパ
ク質の特異的クローンを含む組換体クローンを選択す
る。 【００３７】cDNAバンクの構築段階は、挿入cDNAによっ
てコードされたタンパク質を発現し得るベクターを用い
て行なわれる。 【００３８】特に発現効率が高いので特に有利なクロー
ニングベクターは、pEX タイプのプラスミドから構成さ
れる。かかるプラスミドは、Stanley及びLuzio によって
EMBOJournal、1984 、3 、1429−1434に記載されてい
る。この文献には、λバクテリオファージのプロモータ
PR のコントロール下で発現する融合遺伝子cro-lacZを
含むプラスミドが記載されている。この発現は温度によ
って誘発される。 【００３９】複数の非反復制限部位を含むポリヌクレオ
チドが読取りフェーズの各々に挿入され、また転写及び
翻訳の終結シグナルも挿入される。非反復制限部位に挿
入されたcDNAは、対応するハイブリッドタンパク質cro-
βgal-ペプチドの形態で極めて高い効率で発現される。
このハイブリッドタンパク質の利点は、難溶性であり従
って細菌中でのタンパク質分解のおそれが少なく特異的
抗体によって容易に免疫学的に検出されることである。 【００４０】対応するポリペプチドを細菌中で発現させ
るべく、遺伝子cro-lacZに対して正しい配向でcDNAを挿
入するために、P.N.A.S.USA 、1983、80、31-35 に記載
のHelfmann等の技術に従ってcDNAの両端に種々のリンカ
ーを順次付加するプロトコルを使用する。使用されるリ
ンカーは BamH Ｉ及びSal Ｉ切断部位に対応する。 【００４１】これら組換体プラスミドは、従来技術を用
い所望配列によってタンパク質を発現させる細菌株を形
質転換するために使用される。 【００４２】細菌株としては大腸菌株が好ましく、リプ
レッサーcro の対立遺伝子cIts857を含む大腸菌pop2135
が特に好ましい。 【００４３】このようにして細菌株中で高レベルの絨毛
タンパク質を発現する細胞のmRNAに対応し約30,000のク
ローン組換体を含むcDNAバンクが得られる。 【００４４】ハイブリッドタンパク質の発現は温度によ
って誘発され得る。従って遺伝子cro のリプレッサーが
失活する温度で処理する。このためには、室温より高
温、特に40〜42℃のオーダの温度で菌株を約２時間イン
キュベートするだけでよい。 【００４５】従来技術による細菌の溶解及びタンパク質
の再生後に回収されたクローンを免疫スクリーニングに
よって選択する。 【００４６】好ましくは先ず少なくとも１種類の抗絨毛
タンパクポリクローナル抗体によってcDNAバンクのスク
リーニングを行う。１種類以上のポリクローナル抗体と
特異的に反応するクローンをCOOH末端エピトープに対す
る少なくとも１種類のモノクローナル抗体を用いて再度
スクリーニングする。 【００４７】完全ブタ絨毛タンパク質に対する抗ポリク
ローナル抗体の如き抗絨毛ポリクローナル抗体と、分子
のCOOH末端に位置するエピトープを認識し得る1 種類以
上のモノクローナル抗体とを順次使用すると十分なスク
リーニングが行なわれる。 【００４８】ポリクローナル抗体によるスクリーニング
後に、別のポリクローナル抗体特にニワトリの絨毛タン
パク質のCOOH末端断片に対するポリクローナル抗体を用
いた二次スクリーニングを行なうのが有利である。 【００４９】本発明の目的は特に、完全絨毛タンパク質
に対するポリクローナル抗体とニワトリの絨毛タンパク
質のCOOH末端ペプチドに対するポリクローナル抗体とCO
OH末端エピトープに対する２種類のモノクローナル抗体
とに発現産物が特異的に反応することを特徴とするヒト
絨毛タンパク質に対応するcDNAを含有するクローンを提
供することである。 【００５０】本発明の目的はまた、ポリA 配列とポリア
デニル化部位とをもつインサートを含む絨毛タンパク質
に対応するcDNAを含有するクローンを提供することであ
る。 【００５１】本発明の別の特徴によれば、絨毛タンパク
質の検出に使用される手段はモノクローナル抗体から構
成される。 【００５２】本発明のこの特徴は、異なる種に由来する
絨毛タンパク質がモノクローナル抗体に接近し得る共通
エピトープをもち、モノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマの産生に適したミエローマ細胞と融合した脾
臓細胞をもつ動物の免疫化に使用された特定の絨毛タン
パク質を特異的に認識するだけでなくヒトを含むその他
の種に由来する絨毛タンパク質をも特異的に認識すると
いう事実に基づく。 【００５３】従って本発明の好ましいモノクローナル抗
体の特徴は、以下の特性をもつことである。 【００５４】−精製ブタ絨毛タンパク質を認識する（ウ
ェスターンブロッティング使用）、 −ニワトリの絨毛タンパク質を認識する（ウェスターン
ブロッティング使用）、 −ヒト結腸の腺癌HT29に由来する系の細胞抽出物の絨毛
タンパク質を認識する（ウェスターンブロッティング使
用）、 −免疫細胞化学的にラット絨毛タンパク質を認識する
（ホルムアルデヒド固定されたラット腸粘膜の凍結（ク
リオスタット）切片使用）。 【００５５】前記定義に対応するモノクローナル抗体の
うちの好ましいモノクローナル抗体は、ニワトリ絨毛タ
ンパク質の「ペプチドHP」に含まれるエピトープをも認
識する。予め単離されたペプチドHPとペプチドHPをまだ
含む51Kdのペプチドとの双方に対して認識が可能であ
る。該抗体はニワトリ絨毛タンパク質のペプチド44Kd又
はペプチド44Kdのいずれをも認識しない。 【００５６】本発明の好ましい抗体は、更に、タンパク
質HPを特にドデシル硫酸ナトリウム(SDS) で処理後の再
生状態で認識でき、また、絨毛タンパク質を含有する上
皮細胞で認識し得る。この結果は、ペプチドHPによって
担持されるエピトープが細胞培地中の他のタンパク質に
よって遮蔽されていないことを示す。 【００５７】本発明は当然、これらモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマに係る。これらハイブリドー
マを産生するための有利な技術、特に精製ブタ絨毛タン
パク質に対する免疫マウスの脾臓細胞と適当なミエロー
マの細胞との融合によるハイブリドーマ産生技術につい
ては後述する。この方法で得られた好ましいハイブリド
ーマ(BD-D2C3株) はパリ、パスツール研究所のCollecti
on Nationale des Cultures de Micro-organismes(CNC
M) に1985年４月29日に受託番号no.I-440で寄託され
た。 【００５８】本発明の有利な特徴によれば、抗体の形成
に使用される免疫物質は細菌中で多量に発現し得る。こ
の免疫物質は、ヒト絨毛タンパク質のDNA 又はその断片
に対応する前記ヌクレオチド配列によってコードされる
ペプチドに対応する。 【００５９】従来技術によって、ペプチドを動物に注射
し、抗血清を回収し、次に必要な場合、例えばアフィニ
ティクロマトグラフィーによって抗血清から抗体を回収
する。抗体産生のこの変形例は、上記に定義したcDNA断
片によってコードされた領域HPが最も免疫原性で最も絨
毛タンパク質に特異的な領域であるときに一層有利であ
る。 【００６０】絨毛タンパク質の相補的DNA 又は該DNA の
断片のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク
質はまた、競合ラジオイムノアッセイ（直接ELISA 法又
は競合ELISA 法）を行うための抗原ソースを構成する。 【００６１】しかし乍ら勿論、同じ免疫原性配列を含む
その他の全ての免疫物質を使用し得る。例えば、ペプチ
ドHP自体を使用してもよく、場合によっては免疫特性を
強化するために子牛血清アルブミンのごときキャリャー
分子に予めグラフト重合されたペプチドHPを使用しても
よい。 【００６２】本発明の好ましいモノクローナル抗体を入
手できればペプチドHPの特性的エピトープ領域を定義し
得ることも当業者に明らかであろう。より正確に同定す
るためには、特に、以下の段階を含む方法を使用すると
よい。 【００６３】−ペプチドHP（又は所望エピトープを含む
と推定できるペプチドHPの部分）をコードするポリヌク
レオチド配列を合成する、 −絨毛タンパク質のCOOH末端をコードするヌクレオチド
配列を含む前記に定義した前記プラスミドを前記配列の
外部の制限部位のところで直線化する、 −酵素Bal31 の如きエキソヌクレアーゼによって直線化
プラスミドを調整的トリミングする、 −DNA リガーゼによってプラスミドを再環化する、 −対応プラスミドによってそれ自体形質転換できかつプ
ラスミドに内包されるインサートを発現し得る適当な微
生物を形質転換する、 −この微生物の発現産物と該当抗体とを再度接触させ
る。 【００６４】再環化された最終プラスミドによって形質
転換された前記微生物の発現産物中で前記免疫原性ペプ
チドの検出が消滅するまで上記処理サイクルを繰り返
す。 【００６５】方法の各サイクルの終期、特に中間再環化
プラスミドの認識能力を消滅させる最終トリミング処理
の以前及び以後のプラスミドの末端部分の配列決定のと
きに、この最終トリミング処理中に除去されたヌクレオ
チド配列によってコードされるペプチドの箇所にエピト
ープを配置することが可能である。即ち、当業者にとっ
て前記抗体を入手することは、該エピトープを含む化学
的に定義されたペプチド配列を入手したことと等価であ
る。 【００６６】本発明はまた、上記に定義した好ましいモ
ノクローナル抗体と反応でき且つポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動特にSDS-PAGE試験で実質的に１つのバンドだ
けを生じる生物学的に実質的に純粋なヒト絨毛タンパク
質に係る。 【００６７】即ち、ヒト絨毛タンパク質は、ヒト腸細胞
溶解物、特に適当な洗浄剤を含む水溶液で処理し前記モ
ノクローナル抗体を用いて精製したヒト腸細胞溶解物か
ら抽出され得る。この種の精製方法では、アフィニティ
クロマトグラフィー処理に適応するように好ましくは固
体支持体に固定されたモノクローナル抗体を使用するの
が有利である。例えば、スエーデンのPHRMACIA A.G. に
よって商標SEPHAROSEとして市販されている三次元網目
状構造のアガロースの網にモノクローナル抗体を例えば
シアノゲンブロマイド法で固定する。 【００６８】従って本発明は特に、ヒト絨毛タンパク質
を分離するために、該絨毛タンパク質を含む溶液を前記
モノクローナル抗体を含むアフィニティカラムと接触さ
せてヒト絨毛タンパク質を選択的に固定し、次にグリシ
ンベースのpH2 〜4 の酸性バッファ又はメチルアミンベ
ースのpH11の塩基性バッファによる抗原抗体複合体の溶
解によってヒト絨毛タンパク質を回収し、次に酢酸アン
モニウムバッファに透析する方法に係る。 【００６９】勿論本発明はまた、ヒト絨毛タンパク質断
片から成るより小さい分子量のポリペプチドに係る。断
片が特異的部位のポリペプチド切断酵素によるヒト絨毛
タンパク質の切断によって得られることは当業者に明ら
かであろう。かかるタンパク質として例えば、先ず、ト
リプシン即ちStaphylococcus aureus V8のプロテアー
ゼ、アルファキモトリプシン、BOEHRINGER社により市販
のマウスの顎下腺プロテアーゼ、前記ペプチドGly-Pro
及びGly-Ala 等を特異的に認識するVibrio alginolyti
-cus chemovar iophagusのコラゲナーゼがある。 【００７０】ヒト絨毛タンパク質又はその断片から製造
され得る任意に種特異的なハイブリドーマ及びモノクロ
ーナル抗体も本発明の一部を構成することが理解されよ
う。 【００７１】 【実施例】本発明の別の特徴及び利点は、ヒト絨毛タン
パク質の検出、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体
の産生及び試験で使用される特定条件の例を示す以下の
記載より明らかにされるであろう。 【００７２】またヒト絨毛タンパク質のcDNA部分を含有
するクローンの作成方法も記載する。 【００７３】実施例1:ヒト絨毛タンパク質の検出 消化部又は腎臓部と生物体のその他の部とに由来する腫
瘍細胞及び非腫瘍細胞の増殖の種々の時期の絨毛タンパ
ク質の発現を検査した。BROWN 及びFARQUHAR、Cell、3
6、295(1984) に記載の技術で該当組織を採取し凍結し
固定して切片（凍結切片）を調製した。 【００７４】−25℃で５mm厚の切片を得、ポリリジンで
被覆したガラスプレートに載せた。0.2 ％のゼラチンを
含む生理食塩水リン酸バッファ（PBS-ゼラチン）溶液に
浸漬した後に、絨毛タンパク質を検出すべくPBS-ゼラチ
ン中に1/800 に希釈したウサギ抗絨毛タンパク抗血清50
mlを含む溶液で切片を処理し、湿潤室で室温で25分間イ
ンキュベートした。 【００７５】次にPBS-ゼラチン中で切片を10分間ずつ３
回洗浄した。 【００７６】次にローダミン（オランダのNordic Immun
ological Laboratories の製品）でラベルしたウサギ抗
IgG を添加し、これら抗IgG の存在下に切片を室温で25
分間インキュベートした。次に切片をPBS-ゼラチン中で
完全に洗浄し、Plan Neo-fluar オイルに浸漬したレンズ
と１組の適当なフィルターとを備えた蛍光顕微鏡（ZEIS
S 光顕微鏡）で検査した。 【００７７】コントロール組織及び他の起源の腫瘍細胞
についても同様に処理した。 【００７８】以下の結果が観察された。 【００７９】組織が結腸の腺癌に由来するとき、12のサ
ンプルのうちの11のサンプルが絨毛タンパク質の発現の
陽性を示した。他の起源のヒト腫瘍、例えばリンパ腫特
に腸間膜結節リンパ腫及び膵臓、食道等の転移又はそれ
以外の原因による他の起源の種々のタイプの癌腫はタン
パク質を発現しなかった。 【００８０】観察の結果一般的に、処理された腫瘍の一
次腸起源と絨毛タンパク質の発現との間に緊密な相関関
係があることが判明した。明らかに別の起源の腫瘍に対
して行なった多数の試験では、実質的に全部の場合にタ
ンパク質の発現が陰性であった。 【００８１】注目すべきは、腸起源の組織においては、
該細胞の増殖程度にかかわりなく絨毛タンパク質が常に
観察されることである。 【００８２】前記の試験ではポリクローナル抗体を用い
た。CNCMに寄託した好ましいモノクローナル抗体を使用
するとより明白な結果が得られた。 【００８３】これらモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマの単離条件の例を以下に記載する。また、EL
ISA タイプの免疫試験によって絨毛タンパク質の有無を
診断するための好ましい検出条件の与え方についても以
下に記載する。 【００８４】実施例2:絨毛タンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体の調製 (A) 免疫化プログラム −Balb/C o マウス：６〜８週齢 −抗原：精製ブタ絨毛タンパク質(10mg ／ml）（SDS の
存在下にポリアクリルアミドゲル（10％）電気泳動後の
分子量95Kdのタンパク質の均質バンド）、10mM イミダ
ゾール、75mM HCl 、1mM EGTA 、0.1M DTT 、50 ％グリ
セロール。 【００８５】−プログラム 初日：50/50 エマルジョン（PBS-フロインド完全アジュ
バント）中の50μｇの純粋絨毛タンパク質のIP（腹腔
内）注射、 14日：50μｇの絨毛タンパク質（PBS-フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 21日：50μｇの絨毛タンパク質（PBS-フロインド不完全
アジュバントエマルジョン中）のブースターIP注射、 28日：PBS に溶解した20μｇの絨毛タンパク質のIM（筋
肉内）注射、 29日：PBS に溶解した10μｇの絨毛のIV（静脈内）注
射、 32日：融合。 【００８６】(B) 融合 (Ｉ) 親細胞 (a)ミエローマ細胞 Sp2/O-Ag14系（8 Azaguanine耐性）、DMEM10％FCS 培地
中の無菌培養物。 【００８７】(b)脾臓細胞 起源：ブタ絨毛タンパク質に対する超免疫マウスBalb/C
の脾細胞。 【００８８】(II)Kohler G.及びMilstein C. による細
胞融合方法（所定特異性をもつ抗体を分泌する融合細胞
の連続培養物、Nature、1975、256 、４９５） −無血清ＤＭＥＭ培地中の50％のポリエチレングリコー
ル溶液(PEG1000-Merck9729)の存在下に無菌条件下の無
血清DMEM培地中で融合させる。２種類の親細胞の計数後
に、培養中のミエローマ細胞の懸濁液を脾臓細胞の懸濁
液に1:5 の割合で混合する。 【００８９】−２分30秒間接触させる。 【００９０】−完全DMEM培地で希釈してPEG の作用を停
止させる。 【００９１】−選択DMEM-HAT培地に細胞懸濁液を最終的
に希釈(2×105 細胞／ml）する。 【００９２】−１mlのウェルを含むCOSTAR24穴に分配(C
OSTAR Tissue Culture Cluster 24 、Cat.No.3524 、CO
STAR 205 Groadway 、Cambridge 、Ma、USA)。 【００９３】(III)クローンの選択 ブタ精製絨毛タンパク質に対する抗体の分泌能力によっ
てクローンを同定する。 【００９４】(C) 選択方法 (Ｉ)ELISA試験：この試験では融合後の培養物上清中の
抗絨毛タンパク質モノクローナル抗体を証明し得る。 【００９５】−抗原の固定：支持体(ELISAプラーク) に
抗原を固定する。濃度:50mM 、pH8 のリン酸カリウムバ
ッファ中に５μｇ／ml。 【００９６】４℃で１晩維持。 【００９７】−飽和:PBS-Tween20-BSAで飽和。 【００９８】−インキュベーションＩ：非希釈ハイブリ
ドーマ上清と共に４℃で３時間。 【００９９】−インキュベーションII：βガラクトシダ
ーゼでラベルしたマウス抗IgG と共に４℃で２時間。 【０１００】各段階間の洗浄にはいずれも0.1 ％のPBS-
Tween20 を用いる。 【０１０１】−基質:0.1M 、pH7.0 のリン酸バッファ、
10-3M MgSO4 、２×10-3M MnSO4 、２×10-3M 無水トリ
トリプレックス(Tritriplex)マグネシウム(Merck8409)
中のo-ニトロフェニル- β- ガラクトピラノシド(Sigma
N11-27)。 【０１０２】読取り:414nmでのOD（光学密度）読取り。 【０１０３】バックグラウンドノイズのODの10倍のODを
与えるハイブリドーマ上清をもつクローンを選択した。 【０１０４】(II)Western Blotting （Burnette.Anal.B
iochem.1981、 112、195-203 ） この試験によって、ELISA 試験の陽性クローンのうちで
ヒト絨毛タンパク質とニワトリ絨毛タンパク質とを同時
に認識し得るブタ抗絨毛モノクローナル抗体を分泌する
クローンを選択し得る。 【０１０５】種々の試験段階 (a) ニワトリの腸粘膜の細胞抽出物と絨毛タンパク質を
発現するHT29系（ヒト結腸の腺癌）の細胞抽出物とをポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。 【０１０６】(b) ポリアクリルアミドゲルで分離された
タンパク質をニトロセルロース紙に電気転移する。 【０１０７】(c) 細胞タンパク質が転移されたニトロセ
ルロース紙を、ELISA で予め選択したハイブリドーマ上
清と共に４℃で１晩インキュベートする。 【０１０８】(d) ペルオキシダーゼでラベルしたマウス
抗IgG と共に室温で１時間インキュベートする。 【０１０９】(e) 基質： −10mgの四塩酸ジアミノベンジジン、 −20ｍｌpH7.6 の0.1M TrisHCl、 −0.2ml の１％Ｈ2 Ｏ2 。 【０１１０】各段階間の洗浄にはいずれも新生子ウシ血
清-PBS-Triton X100を用いる。 【０１１１】(f) 陽性反応：抗原- モノクローナル抗体
反応が生じると、栗色バンド（分子量95Kd）が速やかに
出現する。 【０１１２】(D) 選択ハイブリッドのクローニング −限界希釈法：ウェルの底部に結合したマクロファージ
(4週齢のBalb/Cマウス起源）に（96ウェルのプラーク
の）ウェル当たり１つの細胞が分布するように陽性クロ
ーンを選択培地に希釈する。 【０１１３】条件調整した選択培地を添加する。 【０１１４】−前記方法によって陽性クローンを選択す
る。 【０１１５】−必要に応じて再クローニングする。 【０１１６】(E) 腹水の調製 −４〜５日以前にPRISTANE(Aldrich、2,6,10,14-テトラ
メチルペンタデカン) を注射しておいたマウスに選択ク
ローンを注射する。 【０１１７】−マウス当たり１〜２×106 の細胞を注射
する。 【０１１８】−10〜15日後に増殖したクローン細胞を含
む腹水をマウスから回収する。 【０１１９】腹水の抗絨毛モノクローナル抗体価は１mg
／mlより高い。−選択クローンの凍結は10％FCS-５％DM
SOのDMEM培地中で行なう。 【０１２０】−176 ℃の液体窒素中で保存する。 【０１２１】絨毛タンパク質定量のための直接ELISA 法 −精製IgG の吸着：一定濃度の腹水BD-D2C3 からELISA
プラークに吸着させる。 【０１２２】イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Tris
アクリル) 及びヒドロキシアパタイトカラムによって抗
体を精製した。 【０１２３】所定濃度まで濃縮する。 【０１２４】37℃で２時間次に４℃で１晩インキュベー
トする。 【０１２５】0.1 ％のPBS/Tween20 で洗浄する。 【０１２６】−プラークの飽和 PBS/0.1 ％のTween20/0.4 ％のBSA の存在下に30分間イ
ンキュベートする。 【０１２７】−抗原の添加 0.4 ％BSA の存在下で精製絨毛タンパク質の濃度範囲は
５μｇ／mlから１又は0.1ng／mlに減少する。 【０１２８】４℃で３時間インキュベートする。 【０１２９】0.1 ％のPBS/Tween20 で洗浄する。 【０１３０】−精製IgG の添加：βガラクトシダーゼと
結合した、絨毛タンパク質に対するウサギポリクローナ
ル抗体血清から精製されたIgG を添加する。 【０１３１】４℃で２時間インキュベートする。 【０１３２】0.1％のPBS/Tween20 中で洗浄する。 【０１３３】−ガラクトシダーゼの検出 20mlのpH7 の0.1Mのリン酸緩衝バッファ、10-3M のMgSO
4 、２×10-4M のMnSO4 、２×10-3M のEDTA(Merck840
9) 中の4m／mlの溶液を用いて20mgのp-ニトロフェニル-
β-D- ガラクトピラノシドを添加する。 【０１３４】37℃でX 時間インキュベートする。 【０１３５】414nm での光学密度を読取る。 【０１３６】実施例3:ヒト臨床観察 細胞抽出物中の極めて少量（全タンパク質１mg当たり0.
5ng ）の絨毛タンパク質を検出し得る感度をもつ後述の
ELISA 試験を使用して血清中の絨毛タンパク質の定量可
能な量を検出するための測定を行なった。即ち、絨毛タ
ンパク質は、消化管の健常細胞及び腫瘍細胞によって発
現される細胞内タンパク質なので、ある種の病理的及び
生理的状態では絨毛を含む細胞の壊死によって絨毛タン
パク質が血管系に遊離されることが判明した。 【０１３７】供血集団(n＝190)に関する検査によれば、
大多数の血清(n＝168)中で絨毛タンパク質が検出されな
いことが判明した。しかし乍ら、少数の個体(n＝15) に
は検出可能量の絨毛タンパク質（５〜10ng／ml）が存在
した。この値を病理徴候でない絨毛タンパク質のレベル
と考えてよい。最後に、幾つかの個体(n＝7)では基底値
より高いレベルの絨毛タンパク質（50〜 100ng／ml）が
存在した。所謂「健常」なこれら個体（ 3.6％）に対し
ては消化管の付加的臨床検査（ファイバースコープ、コ
ロノスコープ）を行なわなかった。 【０１３８】種々の胃腸病理に関して得られた結果を以
下の表にまとめる。 【０１３９】患者の血清中に検出可能量の絨毛タンパク
質が検出される疾患：消化管の悪性病理 ： −結腸癌、 −胃癌。 【０１４０】消化管の良性病理： −絨毛腫、 −Crohn 病、 −出血性直腸結腸炎、 −十二指腸球潰瘍、胃潰瘍、食道潰瘍。 【０１４１】注目すべきは消化器官の多腺腫（ポリー
プ）は逆にこのタンパク質を血液中に遊離しないことで
ある。 【０１４２】この検査から更に幾つかの結論が得られ
る。 【０１４３】1/血液中の絨毛タンパク質の量と腫瘍の大
きさ又はその進行期には相関関係がないと考えてよい。 【０１４４】2/手術後の追跡のためにこのタンパク質を
測定すると完全摘除後には血清中の率が低下する。これ
に反して、腫瘍細胞が残存すると（不完全摘除、再発、
転移）絨毛タンパク質レベルは維持されるか又は増加す
る。 【０１４５】この研究により、絨毛タンパク質が健常被
検者の血清中では通常検出されないが、悪性病理（結腸
癌又は腎臓癌）に侵された患者又は消化粘膜の炎症性又
は壊死性突起を生じる消化管の良性潰瘍（Crohn 病、RC
H 病、潰瘍）がみられる患者では絨毛タンパク質を定量
できることが判明した。 【０１４６】血液中の絨毛タンパク質の定量はまた、良
性疾患（消化管の潰瘍及び炎症性疾患）の監視にも極め
て重要であることが判明した。他方、血液中の絨毛タン
パク質を追跡するためには、本発明の抗体と共に癌の進
行監視のために現在使用されているCEA （癌胎児性抗
原）の如き別の腫瘍ラベルを使用することも可能であ
る。これら現行の腫瘍ラベルは、1/侵された器官に特異
的でない、2/種々の良性病理中に観察される、という欠
点をもつ。 【０１４７】実施例4:ヒト絨毛タンパク質に対応するcD
NAの調製 mRNAの調製 ヒト結腸腺癌由来の細胞系HT29からmRNAを調製する。Ul
lrich 等による塩化グアニジウム法、Science 、1977、1
96、1313-1319 、によってRNA を抽出する。Aviv及びLe
der によるオリゴdT- セルロースカラムクロマトグラフ
ィー法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 、1972、69、1408-141
2 、によってmRNAポリＡ+ の精製を行なう。 【０１４８】cDNAの調製 Fiddes及びGoodman の方法、Nature、1979、281 、351-3
56、によってcDNAの第１ストランドと第２ストランドと
を調製する。Helfmann等の方法、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、1983、80、31-35 、によって３′末端にリンカーSa
l Ｉ及び５′末端にBamHＩを順次付加する。 【０１４９】約30,000の組換体クローンを含むcDNAバン
クを得る。 【０１５０】ベクター プラスミドpEX1-3(Stanley及びLuzio 、EMBO Journal、
1984、3 、1429-1430、1984参照) を使用する。これら
ベクターは、その発現がλバクテリオファージのプロモ
ータ PR のコントロール下にある融合遺伝子cro-LacZを
含むプラスミドから誘導される。複数の非反復制限部位
を含むポリヌクレオチドを遺伝子LacZの３′末端に挿入
した。また、転写及び翻訳終了シグナルを３つの読取り
フェーズに挿入した。 【０１５１】制限酵素BamHＩ及びSal Ｉで消化したプラ
スミドpEX の各々にcDNAを挿入した。従ってこれらは全
て遺伝子CroLacZ に対して同方向に配向されている。 【０１５２】形質転換 O.Raibaud によってNucleic Acid Research に記載のご
とく構築された大腸菌pop2135 株を細菌株として使用す
る。 【０１５３】以下の式によって操作し、対立遺伝子CI85
7 とプロモータ PR とを含むλファージの2.3kb のBgl
II断片をポリリンカーのBamHＩ部位にクローニングす
る。 【０１５４】 【化５】 【０１５５】このように得られたEco R Ｉ断片を、pOM4
1 のEco R Ｉ部位にクローニングし、菌株C600の染色体
に組み込む(Gene 、292 、231-241)。 【０１５６】近位aroBラベルとP1′とのコトランスフェ
クションによって、この構造をMM294 の染色体(F′endA
thi hsdR）に導入する。大腸菌pop2135 が、配向ma
IT、CI857 、 PR 、maIPO で得られる。 【０１５７】大腸菌pop2135 を組換体プラスミドで形質
転換するためには、Hanahan等のルビジウムを使用する技
術、J.Mol.Biol.、1983、166 、557-580 、を使用する。
この菌株はcro のリプレッサーの対立遺伝子cIts857 を
含む。 【０１５８】得られた組換体の数は103 〜104 ngのcDNA
のオーダである。 【０１５９】免疫検出によるクローンの選択 得られた組換体クローンをニトロセルロースフィルター
に塗抹する。42℃で２時間インキュベーション後にハイ
ブリッドタンパク質の合成が誘発される。SDSによる細
菌の溶解及びメタノールの非存在下でのタンパク質の再
生後に免疫スクリーニングによってクローンを分析す
る。タンパク質の再生にはBurnett の技術、Anal.Bioch
em. 、1981、112 、195-203 、を用いる。 【０１６０】先ず、完全ブタ絨毛タンパク質に対するポ
リクローナル抗体によってバンクをスクリーニングす
る。次に、ニワトリの絨毛タンパク質のCOOH末端断片に
対するポリクローナル抗体と、分子のCOOH末端領域に位
置するエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗
体(BDD2 Ｃ3 及び IID3 Ｈ9 ）とを使用して二次スクリ
ーニングを行なう。 【０１６１】クローンpEXZ-V19は、510 塩基対のインサ
ートを含む。コード部分は330 の塩基対をもつ。この部
分に続いて200 塩基対の非コード領域が存在する。 【０１６２】クローニングされたcDNAはヒト絨毛タンパ
ク質のCOOH末端の95個のアミノ酸をコードしており全タ
ンパク質の約1/10（分子量：95Kd) に相当する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(73)特許権者 594198569
アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・
ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシ
ユ・メデイカル
フランス国、75013・パリ、リユ・ド
ウ・トルビアツク、101
(72)発明者 ダニエル・ルバル
フランス国、92330・ソー、アレ・ド
ウ・トレビス、23
(72)発明者 ブリジツト・デユドウエ
フランス国、75005・パリ、リユ・ブラ
ンビル、９
(72)発明者 シルビ・ロビーヌ
フランス国、92170・バンブ、リユ・デ
イシ、54
(72)発明者 モニク・アルパン
フランス国、75014・パリ、リユ・ロリ、
９
(72)発明者 エリク・プランゴー
フランス国、75003・パリ、リユ・オ・
メール、26
(72)発明者 アルフオンス・ガルシア
フランス国、75015・パリ、リユ・ド
ウ・ビロフレ、３
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．以下の特性をもつこと、即ち −精製ブタ絨毛タンパク質を認識する、 −ニワトリの絨毛タンパク質を認識する、 −ヒト結腸の腺癌ＨＴ２９に由来する系の細胞抽出物の
絨毛タンパク質を認識する、 −免疫細胞化学的にラット絨毛タンパク質を認識する ことを特徴とする、絨毛タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体。 ２．Ｃ−末端配列（７７９−８５４）に含まれる抗原部
位、即ち式： 【化１】 で示されるニワトリの絨毛タンパク質の「ヘッド部」を
認識することができ、前記ヘッド部が単離されているか
又はニワトリ絨毛タンパク質に含まれた５１Ｋｄのペプ
チドの内部に存在するかにかかわりなく該ヘッド部を認
識し得ることを特徴とする請求項１に記載のモノクロー
ナル抗体。 ３．受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４４０のハイブリドーマに
よって産生されることを特徴とする請求項１に記載のモ
ノクローナル抗体。
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