CA1280079C - Moyens pour le diagnostic in vitro de cellules malignes originaires du tube digestif - Google Patents
Moyens pour le diagnostic in vitro de cellules malignes originaires du tube digestifInfo
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Abstract
PRECIS DE LA DIVULGATION L'invention concerne le diagnostic in vitro de cellules malignes originaires du tube digestif par mise en contact d'un prélèvement biologique avec un réactif présentant une affinité spécifique pour la villine.
Description
~ r~85~
Moyens pour le diagnostic in vitro de cellules malignes oxiginaires du tube digestif L'invention est relative à des moyens de dia-gnostic 1n vitro de l'existence ou non chez l'homme des proliférations de cellules malignes à partir de cellu-les tumorales du tube digestif, plus particulièrement du type adénocarcinome. Ces moyens concernent tant des procédés de diagnostic ln vitro, que des éléments maté-riels susceptibles d'être rnis en oeuvre dans ces procé-dés, plus particulièrement des fragments d'~DN utili-sables comme sondes ou encore des anticorps, de préfé-rence monoclonaux, dirigés contre la villine humaine.
L'invention étend encore ses effets aux dif-férentes applications de ces anticorps monoclonaux, par exemple à la purification de la villine humaine à par-tir d'extraits cellulaires la contenant. A ce titre, l'invention concerne aussi la villine humaine purifiée elle-meme.
Il a déjà été proposé d'avoir recours à la détection de protéines de structure en tant que mar-queurs spécifiques, pour l'identification de certains types de cellules d'eucaryotes supérieurs et pour l'étude du suivi des différentes étapes de leur déve-loppement, notamment au cours de leur différenciation.
A titre d'exemples de marqueurs connus, on mentionnera des protéines de filaments, par exemple la vimentine, des kératines ou des protéines de neurofilaments, qui ont permis l'identification de certains types de cel-lules, l'étude de leur développement, à partir du stade de l'embryogénèse jusqu'au stade ultime de la diffé-renciation cellulaire, ainsi que de leur comportement vis-à-vis du milieu environnant (E. LAZARIDES, Nature, 283, 249 (1980) et R. MOLL et al., Cell 31, 11 (1982).
~. ' ~z~
Les kératines sont souvent considérées comme des marqueurs particulièrement efficaces, permettant de distinguer les cellules épithéliales et les cellules non épithellales. Ceci etant, il a ete etabli que ce type de distinction ne permettait pas toujours d'eta-blir de façon non ambiguë l'origine des cellules epitheliales en cause.
Pourtant la necessite d'etablir de façon cer-taine l'origine de certains types de cellules revet une importance particulièrement importante dans un grand nombre de cas, par exemple lorsqu'il s'agit, à l'occa-sion de l'examen d'un prelèvement biologique temoignant d'une proliferation de cellules tumorales d'identifier les cellules tumorales primaires, se trouvant à l'ori-gine de cette proliferation, ou encore de detecterl'existence de metastases dont l'origine serait un cancer de la region digestive ou encore de verifier l'efficacite d'un traitement chimiotherapeutique ou autres contre des metastases cancereuses. On sait bien que l'efficacite d'un traitement anticancereux peut etre liee à l'identification precise des cellules tumo-rales qui sont la cause première de la maladie.
Ces observations s'appliquent avec une force particulière à la detection, de preference precoce, de proliferations de cellules tumorales d'origine diges-tive (responsables d'une importante proportion des cancers observes en clinique) ou renales, ou de cellu-les derivees des cellules précédentes, plus particu-lièrement à l'identification de marqueurs carac-téris-tiques de ces cellules.
L'invention s'intéresse donc plus particuliè-rement à la détection de cellules tumorales qui ont conservé certains des phénotypes essentiels des cellu-les épithéliales normalement présentes dans les muqueu-ses de l'appareil digestif, plus particulièrement lesmuqueuses intestinales, et dont les types différenciés ~2~
majeurs sont constitués par les cellules absorbantes ou entérocytes.
Plus particulièrement encore l'invention se rapporte a des marqueurs spéclfiques susceptibles d'être détectés, qu'ils soient ou non portés par ces cellules tumorales.
En particulier l'invention vise à permettre la détection de ces marqueurs, meme lorsqu'ils sont dé-tachés desdites cellules tumorales, notamment à l'occa-sion de la nécrose de ces cellules, et libérés, par exemple dans la circulation sanguine.
Le marqueur mis en jeu dans le cadre de la présente invention est constitué par tout ou partie de la villine. Il s'agit d'une protéine ayant un poids 15 moléculaire de l'ordre de 95,000 daltons et qui est normalement présente dans les villosités des muqueuses digestives, plus particulièrement intestinales. La villine est capable de se lier à l'actine, en présence d'ions calcium.
D'une espèce à l'autre, la séquence en acides aminés peut légèrement différer, mais les caractéristi-ques fonctionnelles sont maintenues. Les techniques de purification connues à ce jour permettent d'obtenir à
l'état pratiquement pur la villine de poulet et celle de porc. En revanche, ces techniques ne conduisent pas à l'obtention de villine humaine purifiée.
L'une des villines les mieux connues est celle du poulet. Elle est formée d'une séquence de 854 acides aminés. Elle peut etre coupée par protéolyse ménagée avec la trypsine et la protéase V-8 en des points déterminés, pour produire des fragments 44 Kd, 51 Rd et 10 Kd dont les positions relatives appa-raissent dans la carte, de la villine, d'après Paul MADSUDAIRA, MRC, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, U.K. et John GLENNEY et al, J.B.C., 1981, 256, 8156-8161, qui s'établit comme suit:
~x~o~
Fragments protéolyse ménagée Site de liaison à
l'actine, indépen-dante de la présence de calcium 44 Kd 51 Kd V8 10 Kd (HP) Ti NH2 ~ COOH
1 ~--t 69 779 ~----------~ 854 site de liaison à région connue quant 10 l'actine, dépendant à la séquence en de la présence de calcium acides amines Ti : rupture trypsique V8 : rupture avec la protéase V8.
La séquence en acides amines de la partie COOH-terminale (779-854) ou "partie de tête" (head piece ou "peptide HP") pour la villine de poulet est la suivante:
Val-Phe-Thr-Ala-Thr-Thr-Thr-Leu-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Glu-Thr-Phe-Pro-Leu-Asp-Val-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Ala-Glu-Asp-Leu-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-Pro-Ser-Arg-Lys-Glu-Asn-His-Leu-Ser-Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Ala-Val-Phe-Gly-Met-Thr-Arg-Ser-61 7~ 71 Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Trp-Lys-Gln-Gln-Asn-Leu-Lys-Lys-Glu-Glu-Lys-Gly-Leu-Phe D'une manière générale, la villine est pré-sente plus particulièrement dans les bordures en bros-ses qui sont observées à la surface des entérocytes, notamment lorsque ceux-ci ont atteint leur stade ultime de différentiation, au niveau des parois de la lumière intestinale. Les microvillosités sont des organelles 3Q assemblées dans le stade final de la différentiation des entérocy-tes. La villine est plus particulièrement ~z~
localisée dans les faisceaux de microfilaments axiaux de ces microvillosités. Elle con-tribue à la constitu-tion de leur cytosquele-tte. Par examen de coupes con-gelées en immunofluorescence, il a pu être constaté que la villine était présente au pole apical des cellules allongées formant des colonnes affleurant à la paroi interne de l'intestin, et également à proximité des cellules tubulaires proximales du rein. Dans les deux cas il s'agit de régions coïncidant avec la bordure en brosse des cellules concernées. Mais la villine n'a pas éte détectée au niveau de divers autres types de villosités de divers autres épithéliums, lorsque celles-ci étaient dépourvues d'une bordure en brosse très organisée (A. BRETSCHER et al, Exp. Cell. res., 135, 213 (1981) ou encore article de H. REGGIO et al, publié dans l'ouvrage intitulé "Membranes in Growth and Development" (Membranes en cours de croissance et de développement) de A. LISS, New York ((198~) pp.
89-105).
Il a en outre été constaté que la villine était présente dans les entérocytes dans un stade pré-coce de leur développement, bien avant la mise en place de la bordure en brosse.
L'invention résulte d'une double découverteO
La villine reste détectable de façon pratiquement sys-tématique au cours de la tumorigénèse des tissus du tube digestif, et plus particulièrement dans les can-cers du colon, l'une des formes de cancers parmi les plus répandues et aussi dans certains types de cancers rénaux, alors que la villine n'a jamais été détectée dans des cellules -tumorales primaires résultant de la cancérisation initiale de tissus localisés dans d'au-tres organes (foie, ovaires, poumons, etc.).
En outre, la villine est dé-tectable ln vivo à
tous les niveaux du développement des cellules tumora-les de la région digestive, tant au stade précoce de la ~;r lZ8~
tumorigénèse qu'aux stades les plus tardifs, quel que soit l'état de différenciation des cellules en cause.
Le procédé de diagnostic selon l'invention, qui a essentiellement pour but la détection in vitro de cellules tumorales initialement formées dans la région digestive et/ou dérivées de celles-ci dans un prélève-ment biologique est caractérisé par la mise en contact de ce prélèvement biologique avec des réactifs présen-tant une affinité specifique pour la villine ou recon-lQ naissant le gène codant pour cette protéine.
Le procédé de diagnostic selon l'inventionest applicable à tout échantillon biologique suscepti-ble de contenir des cellules tumorales d'origine diges-tive ou des cellules tumorales éventuellement formées dans d'autres régions de l'organisme, sous l'influence de cellules primaires d'origine digestive ou rénale, ou encore à tout échantillon biologique susceptible de contenir des produits de dégrada-tion de ces diverses cellules tumorales, y compris le marqueur villine, a l'occasion de la nécrose desdites cellules. Cet échan-tillon biologique peut consister en toutes formes de prélèvements : fragments de tissus ou de tumeurs soli-des, par exemple obtenus par biopsie, ou encore prélè-vement de liquides biologiques, plus particulièrement de sang total ou de sérum sanguin, susceptible de véhi-culer des cellules malignes ou des fragments originai-res de celles-ci.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le réactif mis en oeuvre dans le procédé de diagnostic de l'invention est constitué par un ADN dont la sé-quence comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, plus spéciale-ment la partie COOH-termi.nale.
Selon un autre mode de réalisation de l'in-vention, les techniques mises en oeuvre dans le procédéde diagnostic font appel à des techniques immunologi-ques, le réactif présentan-t une affinité spécifique pour la villine é-tant alors constitué par des anticorps suscep-tibles de reconnaitre la villine.
Ces anticorps sont eux-mêmes marqués de toute facon en soi connue, ou sont reconnaissables à leur tour, lorsqu'ils sont à l'état fixé sur la villine ou les tissus la portant, par des immunoglobulines mar-quées ou autres protéines marquées (par exemple la protéine A de Staphylococcus aureus).
Des techniques particulièrement appropriées sont celles qui ont été mises en oeuvre dans les essais qui seront décrits plus loin, et qui ont conduit aux constatations exposées ci-dessus.
L'invention a également pour but de fournir des moyens nouveaux spécifiques, pour la détection de la villine au niveau des microvillosités des entero-cytes ou cellules analogues (etant entendu que l'utili-sation de ces moyens nouveaux n'est pas nécessairement limitée à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic 2Q conforme à l'invention).
Selon un aspect de l'invention, ces moyens sont constitués par l'ADN correspondant à l'ARNm com-plet de la villine humaine ou par un fragment d'ADN
dont la séquence nucléotidique comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique codant pour la villine.
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L'invention vise plus spécialement l'utilisa-tion dans le procédé ci-dessus d'un ADN correspondant à
l'ARNm complet de la villine humaine ou d'un fragment d'ADNc caractérisé par le fait qu'il renferme au moins une partie de la séquence nucléotidique codant pour les acides amin~s de l'extrémité COOH de la villine humaine.
Cette séquence nucléotidique et la séquence correspon-dante des acides aminés codés sont indiquées ci-apres:
LYS TRP SER ASN THR LYS SER TYR GLU ASP LEU LYS ALA GLU
AAG TGG AGT AAC ACC AAA TCC TAT GAG GAC CTG AAG GCG GAG
SER GLY ASN SER ARG ASP TRP SER GLN ILE THR ALA GLU VAL
TCT GGC AAC TCT AGG GAC TGG AGC CAG ATC ACT GCT GAG GTC
THR SER PRO LYS VAL ASP VAL PHE ASN ALA ASN SER ASN LEU
ACA AGC CCC AAA GTG GAC GTG TTC AAT GCT AAC AGC AAC CTC
SER SER GLY PRO LEU PRO ILE PHE PRO LEU GLU GLN LEU VAL
AGT TCT GGG CCT CTG CCC ATC TTC CCC CTG GAG CAG CTA GTG
ASN LYS PRO VAL GLU GLU LEU PRO GLU GLY VAL ASP PRO SER
AAC AAG CCT GTA GAG GAG CTC CCC GAG GGT GTG GAC CCC AGC
ARG LYS GLU GLU HIS LEU SER ILE GLU ASP PHE THR GLN ALA
AGG AAG GAG GAA CAC CTG TCC ATT GAA GAT TTC ACT CAG GCC
PHE GLY MET THR PRO ALA ALA PHE SER ALA LEU PRO ARG TRP
TTT GGG ATG ACT CCA GCT GCC TTC TCT GCT CTG CCT CGA TGG
LYS GLN GLN ASN LEU LYS LYS GLU LYS GLY LEU PHE *
AAG CAA CAA AAC CTC AAG AAA GAA AAA GGA CTA TTT TGA GAAG
AGTAGCTGTGGTTGTAAAGCAGTACCCTACCCTGATTGTAGGGTCTCATTTTCTCA
CCGATATTAGTCCTACACCAATTGAAGTGAAATTTTGCAGATGTGCCTATGAGCAC
AAACTTCTGTGGCAAATGCCAGTTTTGTTTAATAAATGTACCTATTCCTTCAGAAA
GATGATACCCCAAAA~AAaA~A
7~`
- 8a -La sequence nucleotidique mise en oeuvre est utilisee comme sonde pour la detection des ARNm ou des ADN codant pour la villine humaine.
Une sonde appropriee pour ce type de detection est avantageusement marquee par un élément radioactif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'etat hybride avec la preparation renfermant l'ARNm ou l'ADN a etudier.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un prelèvement biologique renfermant les cellules à etudier, ou directement avec leurs acides nucleiques, dans des conditions autorisant l'hybriaation eventuelle de la séquence nucleotldique de //// ' ~L28~9 la sonde avec une sequence complementaire eventuelle-ment contenue dans l'echantillon teste.
La reproductibilite de la detection a ete testee en utilisan-t une sonde contenant un inserat de 200 paires de bases.
Ces sondes nucleotidiques, qui constituent des produits nouveaux entrant dans le cadre de l'inven-tion, sont utilisees egalement, selon un autre aspect, pour l'etude de l'expression des ARNm de la villine dans chacun des etats de differenciation des entero-cytes et/ou des cellules exprimant la villine, et dans les differents s-tades de maturation des cellules d'ori-gine renale ou intestinale.
Les sondes obtenues permettent ainsi de de-terminer le nombre, l'organisation et la structure duou des gènes de la villine tels qu'isoles à partir d'une banque genomique humaine.
Conformement à l'invention, on isole la se-quence nucleotidique codant pour l'extremite de la villine humaine en procedant selon les etapes suivan-tes:
- on prepare selon les techniques connues les ARNm (ARN messagers) totaux à partir d'une lignee cel-lulaire exprimant la villine;
- on construit une banque d'ADNc (ADN comple-men-taires);
- on insère les ADNc dans un vecteur suscep-tible d'exprimer la proteine codee par l'inserat;
- on transforme à l'aide des vecteurs recom-binants obtenus une souche bacterienne, puis on etablit des conditions permettant l'expression de la proteine recherchee dans la bacterie;
- on selectionne les clones recombinants contenant le clone specifique de la villine à l'aide d'anticorps reconnaissant la villine.
L'etape de construction de la banque d'ADNc ~i ~LZ8~
est réalisée à l'aide d'un vecteur capable d'exprimer la protéine codee par l'ADNc inséré.
Des vecteurs de clonage particulièrement avantageux, en raison notamment de leur rendement d'ex-pression élevé, sont constitués par des plasmides de-type pEX. De tels plasmides sont décrits par Stanley et Luzio dans EMBO Journal, 1984, 3, 1429-1434. Ils dérivent de plasmides contenant le gène de fusion cro-lacZ dont l'expression est sous le contrôle du promo-teur PR du bactériophage lambda. Cette expression estinductible par la température.
Un polynucléotide contenant plusieurs sites uniques de restriction est inséré dans chacune des phases de lecture, ainsi que les signaux de terminaison de la transcription et de la traduction. Les ADNc insérés au niveau des sites uniques de restriction sont exprimés avec une grande efficacité sous forme de pro--téine hybride cro-~gal-peptide correspondante. Cette protéine hybride est peu soluble, ce qui réduit d'une manière avantageuse les risques de protéolyse dans la bactérie et facilite sa détection immunologique par des anticorps spécifiques.
Pour réaliser l'insertion de l'ADNc dans la bonne orientation par rapport au gène cro-lacZ, afin d'obtenir l'expression dans la bactérie du polypeptide correspondant, on utilise un protocole d'addition séquentielle de linkers différents aux deux extrémités de l'ADNc selon la technique de Helfmann et al. dans P.N.A.S. USA, 1983, 80, 31-35. Les linkers utilisés correspondent aux sites de coupure de BarnHI et SalI.
Ces plasrnides recombinants sont utilisés pour transformer, selon les techniques classiques, la souche bactérienne mise en oeuvre pour l'expression de la pro-téine par la séquence recherchée.
Les souches bactériennes de E. coli sont par-ticulièrement préférées, plus spécialement la souche ~L280~7~
E. coli pop 2135 qui contient l'allèle cIts857 du re-presseur cro.
On obtient ainsi dans la souche bactérienne une banque d'ADNc correspondant à l'ARNm des cellules exprimant un haut niveau de villine, contenant environ 30 000 clones recombinants.
L'expression de la protéine hybride est inductible par la température. On opère donc à une température où le répresseur du gène cro n'est plus actif. A cet effet, il est satisfaisant d'incuber les souches environ 2 heures à une température supérieure à
l'ambiante, en particulier de l'ordre de 40-42C.
Les clones récupérés après lyse des bactéries et rénaturation des protéines selon les techniques classiques sont sélectionnés par criblage immunologi-que.
D'une manière préférée, on effectue d'abord un criblage de la banque d'ADNc par au moins un type d'anticorps polyclonal anti-villine. Les clones réa-gissant spécifiquement avec le ou les anticorps poly-clonaux sont recriblés à l'aide d'au moins un type d'anticorps monoclonal dirigé contre des épitopes COOH-terminaux.
Un criblage satisfaisant est réalisé à l'aide d'un anticorps anti-villine polyclonal tel qu'un anti-corps polyclonal dirigé contre la villine de porc intacte puis un ou plusieurs anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes situés dans la région COOH-terminale de la molécule.
3Q Le criblage à l'aide de l'anticorps polyclo-nal est avantageusement suivi d'un criblage secondaire à l'aide d'un autre anticorps polyclonal, en particu-lier un anticorps polyclonal dirigé contre le fragment COOH-terminal de la villine de poulet.
L'invention vise plus particulièrement un clone porteur d'un ADNc correspondant à la villine 07~
humaine caractérisé en ce qu'il réagit spécifiquement avec l'anticorps polyclonal dirigé contre la villine intacte, avec l'anticorps polyclonal dirigé contre le peptide COOH-terminal de la villine de poulet et avec les deux anticorps monoclonaux dirigés contre des épi-topes COOH-terminaux.
L'invention vise également un clone porteur d'un ADNc correspondant à la villine comprenant un insérat avec une séquence polyA et un site de poly-adénylation.
Selon un autre aspect de l'invention, lesmoyens mis en oeuvre pour la détection de la villine sont constitués par des anticorps monoclonaux.
Cet aspect de l'invention s'appuie sur le fait que les villines, originaires de différentes espè-ces, possèdent des épitopes communs, accessibles à des anticorps monoclonaux reconnaissant de fason spécifique non seulement la villine particulière ayant servi à
l'immunisation de l'animal, dont les cellules spléni-ques avaient été fusionnées avec les cellules de myé-lome appropriées à la production des hybridomes sécré-teurs desdits anticorps monoclonaux, mais reconnaissant de façon aussi spécifique des villines originaires d'autres espèces, y compris l'espèce humaine.
Un anticorps monoclonal préféré selon l'in-vention est donc caractérisé par les propriétés suivan-tes:
- Il reconnaît la villine de porc purifiée (Western Blotting).
- Il reconnaît la villine de poulet (Western Blotting).
- Il reconnaît la villine d'extrait cellulaire de la lignée dérivée d'un adénocarcinome de colon humain :
HT29 (Western Blotting).
- Il reconnaît la villine de rat en immunocytochimie (coupes congelées (cryostat) de muqueuse intestinale de rat fixées au formaldéhyde).
,,~.
~2lS~
Un anticorps monoclonal préféré parmi ceux qui répondent à la définition précédente reconnaît éga-lemen-t un épitope contenu dans le "peptide HP" de la villine de poulet, la reconnaissance étant possible tant à l'égard du peptide HP préalablement isolé qu'à
l'égard du peptide 51 Kd contenant encore le peptide HP; cet an-ticorps ne reconnaît ni le peptide 44 Kd ni le pep-tide 44 Kd de la villine de poulet.
L'anticorps préféré de l'invention reconnalt d'ailleurs la protéine HP, aussi bien à l'état déna-turé, notamment après traitement par le dodécylsulfate de sodium (SDS) que sur les cellules épithéliales por-teuses de la villine. Ce résultat démontre que l'épi-tope porté par le peptide HP n'est pas masqué par d'au-tres protéines dans le milieu cellulaire.
L'invention concerne naturellement égalementles hybridomes sécréteurs de ces anticorps monoclonaux.
Une technique avantageuse pour produire ces hybridomes, notamment par fusion d~ cellules spléniques de souris immunisées contre la villine purifiée de porc, d'une part, et de cellules d'un myélome approprié, sera décrit plus loin. L'hybridome préféré ainsi obtenu (souche BD-D 2C3) a été déposé à la Collection Natio-nale des Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Ins-titut Pasteur de Paris, le 29 avril 19~5, sous le n I-440.
Selon un aspect avantageux de l'invention, l'agent immunogène utilisé pour former des anticorps peut être exprimé en grandes quantités dans la bacté-rie. Cet agent immunogène correspond au peptide codé
par la séquence nucléotidique définie ci-dessus corres-pondant à l'ADN de la villine humaine ou à un fragment.
Selon les techniques classiques, on injecte le peptide à des animaux, on récupère les antisérums, puis, le cas échéant, les anticorps à partir des anti-sérums, par exemple par chromatographie d'affinité. La ~ .
~2~30()79 production d'anticorps selon cette variante revêt un intérêt d'autant plus grand que la région HP codée par le fragment d'ADNc définie plus haut est à la fois la région la plus immunogène et la plus spécifique de la villine.
On remarquera que la protéine codée par la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire de la villine ou d'un fragment de cet ADN constitue également une source d'antigènes permettant de réaliser des ra-dioimmunoassays compétitifs (soit par la méthode ELISAdirecte, soit par la méthode ELISA par compétition).
Il va cependant de soi que tout autre agent immunogène contenant la même séquence immunogène peut être utilisée; par exemple, le peptide HP lui-même, le cas échéant greffé au préalable sur une molécule por-teuse, telle que la sérum albumine bovine, en vue d'ac-croItre ses propriétés immunogènes.
Il apparaItra clairement à l'homme du métier qu'ayant en mains l'anticorps monoclonal préféré selon l'invention, il est à même de définir la région épito-pique caractéristique au peptide HP. Pour l'identifier de façon plus précise, il pourrait notamment avoir recours à un procédé comprenant les étapes suivantes:
- synthèse d'une séquence polynucléotidique codant pour le peptide HP (ou pour la partie de peptide HP dont il est raisonnable de présumer qu'elle contient l'épitope recherché), - linéarisation dudit plasmide défini ci-dessus conte-nant la séquence nucléotidique codant pour l'extrémité
COOH-terminale de la villine, et ce au niveau d'un site de restriction extérieur à ladite séquence, - émondage de façon contrôlée du plasmide linéarisé
avec une enzyme exonucléolytique, telle que l'enzyme Bal 31, - recircularisation du plasmide au moyen d'une ADN-ligase, ;
- transformation d'un microorganisme approprié, lui-meme transformable par le plasmide correspondant et capable d'exprimer l'insérat contenu dans celui-ci, - remise en contact des produits d'expression de ce microorganisme avec l'anticorps considéré, le cycle d'opérations qui vient d'etre défini étant répété jusqu'à la dispari-tion de la détection dudit peptide immunogène parmi les produits d'expression dudit microorganisme transformé par le dernier plasmide recircularisé.
Il est possible, au terme de chacun des cy-cles du procédé sus-défini, notamment séquençage des parties d'extrémité du plasmide avant et après la der-nière opération d'émondage, ayant conduit à la perte de capacité de reconnaissance du plasmide recircularisé
intermédiaire, de situer l'épitope au niveau du peptide codé par la séquence nucléotidique éliminée au cours de cette dernière opération d'émondage. C'est dire que le fait pour l'homme du métier de disposer de l'anticorps monoclonal sus-indiqué est équivalent à la mise à sa disposition de la séquence peptidique définie chimique-ment et contenant cet épitope.
L'invention concerne également la villine humaine pratiquement pure biologiquement, réagissant avec l'anticorps monoclonal préféré défini ci-dessus et ne donnant essentiellement qu'une seule bande dans des essais de migration en électrophorèse sur gel de poly-acrylamide, notamment SDS-PAGE.
En effet, la villine humaine peut etre ex-traite d'un lysat d'entérocytes humains, notamment ob-tenu par traitement de ces derniers avec une solution aqueuse contenant un détergent approprié, et purifiée à
l'aide du susdit anticorps monoclonal. Un procédé de purification de ce type met en jeu l'anticorps monoclo-nal avantageusement immobilisé sur un support solide,de préférence adapté à des opérations de chromatogra-~,~
~ ~rc ~
phie d'afEinité. Par exemple, l'anticorps monoclonalest fixé sur un réseau d'agarose à réticulation tri-dimensionnelle, commercialisé sous la marque SEPHAROSE
par la société suédoise PHARMACIA A.G., par exemple par la méthode au bromure de cyanogène.
L'invention concerne donc plus particulière-ment un procéde de sépara-tion de la villine humaine caractérisé par les opérations consistant à faire pas-ser une solution la contenant au contact d'une colonne d'affinité portant le susdit anticorps monoclonal, pour fixer sélectivement la villine humaine, puis à récu-pérer celle-ci par dissociation du complexe antigène-anticorps soit par tampon acide à pH 2-4 à base de glycine, soit par un tampon basique à base de méthyl-amine, pH 11, puis à dialyser contre un tampon d'acé-tate d'ammonium.
Il va de soi que l'invention concerne égale-ment des polypeptides de poids moléculaires plus fai-bles consistant en des fragments de villine humaine.
Il apparaîtra clairement au spécialiste que les frag-ments pourront etre obtenus par découpage de la villine humaine par des enzymes de coupure de polypeptides en des sites spécifiques. A titre d'exemple de telles protéines, on mentionnera en premier lieu la trypsine ou la protéase de Staphylococcus aureus V8, l'alpha-chymotrypsine, la "protéase de glande sous-maxillaires de souris" (mouse submaxillary gland protease) commer-cialisée par la Société BOEHRINGER, la collagénase de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus, qui reconnaît spécifiquement lesdits peptides Gly-Pro et Gly-Ala, etc.
Il va sans dire que font alors également partie de l'invention les hybridomes et anticorps mono-clonaux spécifiques d'espèce ou non qui peuvent etre fabriqués à partir de la villine humaine ou de ses fragments.
l 7 D'autres caracteris-tlques et avantages de l'invention appara;tront encore dans la description qui suit des conditions particulières, indiquées à titre d'exemple, de dé-tection de viline humaine, de produc-tion et de mise en oeuvre dans des essais d'hybridomese-t d'anticorps monoclonaux.
On rapporte également un procédé d'obtention d'un clone porteur d'une portion d'ADNc de la villine humaine.
EXEMPLE l : DETECTION DE VILLINE HUMAINE.
L'expression de la villine peut être étudiée à différents stades de la prolifération de cellules tumorales ou non originaires des régions digestives ou rénales d'une part, et d'autres régions de l'organisme d'autre part. Partant des tissus concernés, ceux-ci ont été congelés, fixés et préparés dans des conditions à permettre la réalisation de coupes (cryocoupes) selon la technique décrite par BROWN et FARQUHAR, Cell, 36, 295 (1984).
2Q Des coupes ayant des épaisseurs de 5 ~m ont été obtenues à -25C et déposées sur des lames de verre recouvertes de polylysine. Après trempage dans une solution d'un tampon constitué d'une solution saline de phosphate et contenant 0,2% de gélatine (PBS-gélatine), les coupes ont été traitées pour détecter la villine à
l'aide d'une solution contenant 50 ~l d'antiserum de lapin anti-villine dilue au l/800 dans la PBS~-gela-tine, puis incubees pendant 25 minutes a la temperature ambiante dans une chambre humide.
: 30 Les coupes ont ensuite été lavées trois fois pendant 10 minutes dans la PBS~-gélatine.
Des anti-IgG de lapin marqués par la rhoda-mine (produit par la Société neerlandaise Nordic Immu-nological Laboratories) ont ensuite eté ajoutés et les coupes incubées en présence de ces anti-IgG à la tempé-rature ambiante pendant 25 minutes. Les coupes ont .
~Z~00'-~9 ensuite été lavees de façon complète dans la PBS-gela-tine, puis montees pour examen sous microscope à fluo-rescence (Photomicroscope ZEISS) equipe de lentille à
immersion dans une huile Plan Néofluar et d'un jeu de filtres appropries.
Les tissus temoins ou les tissus tumoraux d'autres origines ont ete traites de la meme manière.
Les observations suivantes ont pu etre fai-tes:
Lorsque les tissus provenaient d'adénocarci-nomes du colon, ll observations sur 12 se sont révelees positives pour ce qui est de l'expression de la villi-ne. Des tumeurs humaines d'autres origines telles que des lymphomes, notamment lymphomes de nodules mesente-riques et des types varies de carcinomes d'autres ori-gines resultant des metastases ou non au niveau du pan-creas, de l'oesophage, n'ont pas exprime la proteine.
D'une façon generale, les observations ont montre une correlation etroite entre l'origine intesti-nale primaire de tumeurs traitees et l'expression de la villine. Les nombreux essais realises sur des tumeurs manifestement d'origine distincte se sont pratiquement dans tous les cas reveles negatifs au niveau de l'ex-pression de la proteine.
Il est à remarquer que dans les tissus d'ori-gine intestinale, la villine a toujours ete observee, quel que soit le degre de proliferation desdites cellu-les.
Les essais qui precèdent ont eté réalisés avec des anticorps polyclonaux. Des resultats beaucoup plus nets peuvent etre obtenus avec l'anticorps mono-clonal prefere qui a fait l'objet d'un depot à la CNCM.
Les conditions dans lesquelles les hybridomes secreteurs de ces anticorps monoclonaux ont ete isoles seront decrites ci-après à titre d'exemples. Il sera egalement indique un mode de mise en oeuvre prefere des ~8~
conditions dans lesquelles le diagnos-tic de la présence ou non de villine peut être détecté dans des essais immunologiques du type ELISA.
EXEMPLE 2 : PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES
CONTRE LA VILLINE.
A) PROGRAMME D'IMMUNISATION
- Souris Balb/C o 6 à 8 semaines.
- Antigene : villine de porc purifiée (10 mg/ml) (bande homogène après électrophorèse de la protéine sur gel de polyacrylamide (10%) en présence de SDS~ de poids molé-culaire 95 Kd):
. 10 mM Imidazole . 75 mM HCl . 1 mM EGTA
. 0,1 M DTT
. 50% Glycérol.
- Programme:
. Jour 0 : Injection en IP de 50 ~g de vil-line pure dans une émulsion 50/50 (PBS-Adjuvant de Freund Complet).
. Jour 14 : Rappel en IP 50 ~g de villine (émulsion PBS-Adjuvant de Freund Incomplet).
- . Jour 21 : Rappel en IP 50 ~g de villine (émulsion PBS-Adjuvant de Freund Incomplet).
. Jour 28 : Injec-tion en IM de 20 ~g de vil-line pure en solution dans du PBS.
. Jour 29 : Injection IV de 10 ~g de villine pure en solution dans du PBS.
. Jour 32 : Fusion.
B) FUSION
I) Cellules parentales ; a) Cellules de myélome:
. .
. Lignée Sp2/0-Agl4 (8 Azaguanine résistant).
. Culture stérile en milieu DMEM 10% FCS.
Moyens pour le diagnostic in vitro de cellules malignes oxiginaires du tube digestif L'invention est relative à des moyens de dia-gnostic 1n vitro de l'existence ou non chez l'homme des proliférations de cellules malignes à partir de cellu-les tumorales du tube digestif, plus particulièrement du type adénocarcinome. Ces moyens concernent tant des procédés de diagnostic ln vitro, que des éléments maté-riels susceptibles d'être rnis en oeuvre dans ces procé-dés, plus particulièrement des fragments d'~DN utili-sables comme sondes ou encore des anticorps, de préfé-rence monoclonaux, dirigés contre la villine humaine.
L'invention étend encore ses effets aux dif-férentes applications de ces anticorps monoclonaux, par exemple à la purification de la villine humaine à par-tir d'extraits cellulaires la contenant. A ce titre, l'invention concerne aussi la villine humaine purifiée elle-meme.
Il a déjà été proposé d'avoir recours à la détection de protéines de structure en tant que mar-queurs spécifiques, pour l'identification de certains types de cellules d'eucaryotes supérieurs et pour l'étude du suivi des différentes étapes de leur déve-loppement, notamment au cours de leur différenciation.
A titre d'exemples de marqueurs connus, on mentionnera des protéines de filaments, par exemple la vimentine, des kératines ou des protéines de neurofilaments, qui ont permis l'identification de certains types de cel-lules, l'étude de leur développement, à partir du stade de l'embryogénèse jusqu'au stade ultime de la diffé-renciation cellulaire, ainsi que de leur comportement vis-à-vis du milieu environnant (E. LAZARIDES, Nature, 283, 249 (1980) et R. MOLL et al., Cell 31, 11 (1982).
~. ' ~z~
Les kératines sont souvent considérées comme des marqueurs particulièrement efficaces, permettant de distinguer les cellules épithéliales et les cellules non épithellales. Ceci etant, il a ete etabli que ce type de distinction ne permettait pas toujours d'eta-blir de façon non ambiguë l'origine des cellules epitheliales en cause.
Pourtant la necessite d'etablir de façon cer-taine l'origine de certains types de cellules revet une importance particulièrement importante dans un grand nombre de cas, par exemple lorsqu'il s'agit, à l'occa-sion de l'examen d'un prelèvement biologique temoignant d'une proliferation de cellules tumorales d'identifier les cellules tumorales primaires, se trouvant à l'ori-gine de cette proliferation, ou encore de detecterl'existence de metastases dont l'origine serait un cancer de la region digestive ou encore de verifier l'efficacite d'un traitement chimiotherapeutique ou autres contre des metastases cancereuses. On sait bien que l'efficacite d'un traitement anticancereux peut etre liee à l'identification precise des cellules tumo-rales qui sont la cause première de la maladie.
Ces observations s'appliquent avec une force particulière à la detection, de preference precoce, de proliferations de cellules tumorales d'origine diges-tive (responsables d'une importante proportion des cancers observes en clinique) ou renales, ou de cellu-les derivees des cellules précédentes, plus particu-lièrement à l'identification de marqueurs carac-téris-tiques de ces cellules.
L'invention s'intéresse donc plus particuliè-rement à la détection de cellules tumorales qui ont conservé certains des phénotypes essentiels des cellu-les épithéliales normalement présentes dans les muqueu-ses de l'appareil digestif, plus particulièrement lesmuqueuses intestinales, et dont les types différenciés ~2~
majeurs sont constitués par les cellules absorbantes ou entérocytes.
Plus particulièrement encore l'invention se rapporte a des marqueurs spéclfiques susceptibles d'être détectés, qu'ils soient ou non portés par ces cellules tumorales.
En particulier l'invention vise à permettre la détection de ces marqueurs, meme lorsqu'ils sont dé-tachés desdites cellules tumorales, notamment à l'occa-sion de la nécrose de ces cellules, et libérés, par exemple dans la circulation sanguine.
Le marqueur mis en jeu dans le cadre de la présente invention est constitué par tout ou partie de la villine. Il s'agit d'une protéine ayant un poids 15 moléculaire de l'ordre de 95,000 daltons et qui est normalement présente dans les villosités des muqueuses digestives, plus particulièrement intestinales. La villine est capable de se lier à l'actine, en présence d'ions calcium.
D'une espèce à l'autre, la séquence en acides aminés peut légèrement différer, mais les caractéristi-ques fonctionnelles sont maintenues. Les techniques de purification connues à ce jour permettent d'obtenir à
l'état pratiquement pur la villine de poulet et celle de porc. En revanche, ces techniques ne conduisent pas à l'obtention de villine humaine purifiée.
L'une des villines les mieux connues est celle du poulet. Elle est formée d'une séquence de 854 acides aminés. Elle peut etre coupée par protéolyse ménagée avec la trypsine et la protéase V-8 en des points déterminés, pour produire des fragments 44 Kd, 51 Rd et 10 Kd dont les positions relatives appa-raissent dans la carte, de la villine, d'après Paul MADSUDAIRA, MRC, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, U.K. et John GLENNEY et al, J.B.C., 1981, 256, 8156-8161, qui s'établit comme suit:
~x~o~
Fragments protéolyse ménagée Site de liaison à
l'actine, indépen-dante de la présence de calcium 44 Kd 51 Kd V8 10 Kd (HP) Ti NH2 ~ COOH
1 ~--t 69 779 ~----------~ 854 site de liaison à région connue quant 10 l'actine, dépendant à la séquence en de la présence de calcium acides amines Ti : rupture trypsique V8 : rupture avec la protéase V8.
La séquence en acides amines de la partie COOH-terminale (779-854) ou "partie de tête" (head piece ou "peptide HP") pour la villine de poulet est la suivante:
Val-Phe-Thr-Ala-Thr-Thr-Thr-Leu-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Glu-Thr-Phe-Pro-Leu-Asp-Val-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Ala-Glu-Asp-Leu-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-Pro-Ser-Arg-Lys-Glu-Asn-His-Leu-Ser-Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Ala-Val-Phe-Gly-Met-Thr-Arg-Ser-61 7~ 71 Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Trp-Lys-Gln-Gln-Asn-Leu-Lys-Lys-Glu-Glu-Lys-Gly-Leu-Phe D'une manière générale, la villine est pré-sente plus particulièrement dans les bordures en bros-ses qui sont observées à la surface des entérocytes, notamment lorsque ceux-ci ont atteint leur stade ultime de différentiation, au niveau des parois de la lumière intestinale. Les microvillosités sont des organelles 3Q assemblées dans le stade final de la différentiation des entérocy-tes. La villine est plus particulièrement ~z~
localisée dans les faisceaux de microfilaments axiaux de ces microvillosités. Elle con-tribue à la constitu-tion de leur cytosquele-tte. Par examen de coupes con-gelées en immunofluorescence, il a pu être constaté que la villine était présente au pole apical des cellules allongées formant des colonnes affleurant à la paroi interne de l'intestin, et également à proximité des cellules tubulaires proximales du rein. Dans les deux cas il s'agit de régions coïncidant avec la bordure en brosse des cellules concernées. Mais la villine n'a pas éte détectée au niveau de divers autres types de villosités de divers autres épithéliums, lorsque celles-ci étaient dépourvues d'une bordure en brosse très organisée (A. BRETSCHER et al, Exp. Cell. res., 135, 213 (1981) ou encore article de H. REGGIO et al, publié dans l'ouvrage intitulé "Membranes in Growth and Development" (Membranes en cours de croissance et de développement) de A. LISS, New York ((198~) pp.
89-105).
Il a en outre été constaté que la villine était présente dans les entérocytes dans un stade pré-coce de leur développement, bien avant la mise en place de la bordure en brosse.
L'invention résulte d'une double découverteO
La villine reste détectable de façon pratiquement sys-tématique au cours de la tumorigénèse des tissus du tube digestif, et plus particulièrement dans les can-cers du colon, l'une des formes de cancers parmi les plus répandues et aussi dans certains types de cancers rénaux, alors que la villine n'a jamais été détectée dans des cellules -tumorales primaires résultant de la cancérisation initiale de tissus localisés dans d'au-tres organes (foie, ovaires, poumons, etc.).
En outre, la villine est dé-tectable ln vivo à
tous les niveaux du développement des cellules tumora-les de la région digestive, tant au stade précoce de la ~;r lZ8~
tumorigénèse qu'aux stades les plus tardifs, quel que soit l'état de différenciation des cellules en cause.
Le procédé de diagnostic selon l'invention, qui a essentiellement pour but la détection in vitro de cellules tumorales initialement formées dans la région digestive et/ou dérivées de celles-ci dans un prélève-ment biologique est caractérisé par la mise en contact de ce prélèvement biologique avec des réactifs présen-tant une affinité specifique pour la villine ou recon-lQ naissant le gène codant pour cette protéine.
Le procédé de diagnostic selon l'inventionest applicable à tout échantillon biologique suscepti-ble de contenir des cellules tumorales d'origine diges-tive ou des cellules tumorales éventuellement formées dans d'autres régions de l'organisme, sous l'influence de cellules primaires d'origine digestive ou rénale, ou encore à tout échantillon biologique susceptible de contenir des produits de dégrada-tion de ces diverses cellules tumorales, y compris le marqueur villine, a l'occasion de la nécrose desdites cellules. Cet échan-tillon biologique peut consister en toutes formes de prélèvements : fragments de tissus ou de tumeurs soli-des, par exemple obtenus par biopsie, ou encore prélè-vement de liquides biologiques, plus particulièrement de sang total ou de sérum sanguin, susceptible de véhi-culer des cellules malignes ou des fragments originai-res de celles-ci.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le réactif mis en oeuvre dans le procédé de diagnostic de l'invention est constitué par un ADN dont la sé-quence comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, plus spéciale-ment la partie COOH-termi.nale.
Selon un autre mode de réalisation de l'in-vention, les techniques mises en oeuvre dans le procédéde diagnostic font appel à des techniques immunologi-ques, le réactif présentan-t une affinité spécifique pour la villine é-tant alors constitué par des anticorps suscep-tibles de reconnaitre la villine.
Ces anticorps sont eux-mêmes marqués de toute facon en soi connue, ou sont reconnaissables à leur tour, lorsqu'ils sont à l'état fixé sur la villine ou les tissus la portant, par des immunoglobulines mar-quées ou autres protéines marquées (par exemple la protéine A de Staphylococcus aureus).
Des techniques particulièrement appropriées sont celles qui ont été mises en oeuvre dans les essais qui seront décrits plus loin, et qui ont conduit aux constatations exposées ci-dessus.
L'invention a également pour but de fournir des moyens nouveaux spécifiques, pour la détection de la villine au niveau des microvillosités des entero-cytes ou cellules analogues (etant entendu que l'utili-sation de ces moyens nouveaux n'est pas nécessairement limitée à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic 2Q conforme à l'invention).
Selon un aspect de l'invention, ces moyens sont constitués par l'ADN correspondant à l'ARNm com-plet de la villine humaine ou par un fragment d'ADN
dont la séquence nucléotidique comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique codant pour la villine.
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/-c~7 ,~!, ~.J
L'invention vise plus spécialement l'utilisa-tion dans le procédé ci-dessus d'un ADN correspondant à
l'ARNm complet de la villine humaine ou d'un fragment d'ADNc caractérisé par le fait qu'il renferme au moins une partie de la séquence nucléotidique codant pour les acides amin~s de l'extrémité COOH de la villine humaine.
Cette séquence nucléotidique et la séquence correspon-dante des acides aminés codés sont indiquées ci-apres:
LYS TRP SER ASN THR LYS SER TYR GLU ASP LEU LYS ALA GLU
AAG TGG AGT AAC ACC AAA TCC TAT GAG GAC CTG AAG GCG GAG
SER GLY ASN SER ARG ASP TRP SER GLN ILE THR ALA GLU VAL
TCT GGC AAC TCT AGG GAC TGG AGC CAG ATC ACT GCT GAG GTC
THR SER PRO LYS VAL ASP VAL PHE ASN ALA ASN SER ASN LEU
ACA AGC CCC AAA GTG GAC GTG TTC AAT GCT AAC AGC AAC CTC
SER SER GLY PRO LEU PRO ILE PHE PRO LEU GLU GLN LEU VAL
AGT TCT GGG CCT CTG CCC ATC TTC CCC CTG GAG CAG CTA GTG
ASN LYS PRO VAL GLU GLU LEU PRO GLU GLY VAL ASP PRO SER
AAC AAG CCT GTA GAG GAG CTC CCC GAG GGT GTG GAC CCC AGC
ARG LYS GLU GLU HIS LEU SER ILE GLU ASP PHE THR GLN ALA
AGG AAG GAG GAA CAC CTG TCC ATT GAA GAT TTC ACT CAG GCC
PHE GLY MET THR PRO ALA ALA PHE SER ALA LEU PRO ARG TRP
TTT GGG ATG ACT CCA GCT GCC TTC TCT GCT CTG CCT CGA TGG
LYS GLN GLN ASN LEU LYS LYS GLU LYS GLY LEU PHE *
AAG CAA CAA AAC CTC AAG AAA GAA AAA GGA CTA TTT TGA GAAG
AGTAGCTGTGGTTGTAAAGCAGTACCCTACCCTGATTGTAGGGTCTCATTTTCTCA
CCGATATTAGTCCTACACCAATTGAAGTGAAATTTTGCAGATGTGCCTATGAGCAC
AAACTTCTGTGGCAAATGCCAGTTTTGTTTAATAAATGTACCTATTCCTTCAGAAA
GATGATACCCCAAAA~AAaA~A
7~`
- 8a -La sequence nucleotidique mise en oeuvre est utilisee comme sonde pour la detection des ARNm ou des ADN codant pour la villine humaine.
Une sonde appropriee pour ce type de detection est avantageusement marquee par un élément radioactif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'etat hybride avec la preparation renfermant l'ARNm ou l'ADN a etudier.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un prelèvement biologique renfermant les cellules à etudier, ou directement avec leurs acides nucleiques, dans des conditions autorisant l'hybriaation eventuelle de la séquence nucleotldique de //// ' ~L28~9 la sonde avec une sequence complementaire eventuelle-ment contenue dans l'echantillon teste.
La reproductibilite de la detection a ete testee en utilisan-t une sonde contenant un inserat de 200 paires de bases.
Ces sondes nucleotidiques, qui constituent des produits nouveaux entrant dans le cadre de l'inven-tion, sont utilisees egalement, selon un autre aspect, pour l'etude de l'expression des ARNm de la villine dans chacun des etats de differenciation des entero-cytes et/ou des cellules exprimant la villine, et dans les differents s-tades de maturation des cellules d'ori-gine renale ou intestinale.
Les sondes obtenues permettent ainsi de de-terminer le nombre, l'organisation et la structure duou des gènes de la villine tels qu'isoles à partir d'une banque genomique humaine.
Conformement à l'invention, on isole la se-quence nucleotidique codant pour l'extremite de la villine humaine en procedant selon les etapes suivan-tes:
- on prepare selon les techniques connues les ARNm (ARN messagers) totaux à partir d'une lignee cel-lulaire exprimant la villine;
- on construit une banque d'ADNc (ADN comple-men-taires);
- on insère les ADNc dans un vecteur suscep-tible d'exprimer la proteine codee par l'inserat;
- on transforme à l'aide des vecteurs recom-binants obtenus une souche bacterienne, puis on etablit des conditions permettant l'expression de la proteine recherchee dans la bacterie;
- on selectionne les clones recombinants contenant le clone specifique de la villine à l'aide d'anticorps reconnaissant la villine.
L'etape de construction de la banque d'ADNc ~i ~LZ8~
est réalisée à l'aide d'un vecteur capable d'exprimer la protéine codee par l'ADNc inséré.
Des vecteurs de clonage particulièrement avantageux, en raison notamment de leur rendement d'ex-pression élevé, sont constitués par des plasmides de-type pEX. De tels plasmides sont décrits par Stanley et Luzio dans EMBO Journal, 1984, 3, 1429-1434. Ils dérivent de plasmides contenant le gène de fusion cro-lacZ dont l'expression est sous le contrôle du promo-teur PR du bactériophage lambda. Cette expression estinductible par la température.
Un polynucléotide contenant plusieurs sites uniques de restriction est inséré dans chacune des phases de lecture, ainsi que les signaux de terminaison de la transcription et de la traduction. Les ADNc insérés au niveau des sites uniques de restriction sont exprimés avec une grande efficacité sous forme de pro--téine hybride cro-~gal-peptide correspondante. Cette protéine hybride est peu soluble, ce qui réduit d'une manière avantageuse les risques de protéolyse dans la bactérie et facilite sa détection immunologique par des anticorps spécifiques.
Pour réaliser l'insertion de l'ADNc dans la bonne orientation par rapport au gène cro-lacZ, afin d'obtenir l'expression dans la bactérie du polypeptide correspondant, on utilise un protocole d'addition séquentielle de linkers différents aux deux extrémités de l'ADNc selon la technique de Helfmann et al. dans P.N.A.S. USA, 1983, 80, 31-35. Les linkers utilisés correspondent aux sites de coupure de BarnHI et SalI.
Ces plasrnides recombinants sont utilisés pour transformer, selon les techniques classiques, la souche bactérienne mise en oeuvre pour l'expression de la pro-téine par la séquence recherchée.
Les souches bactériennes de E. coli sont par-ticulièrement préférées, plus spécialement la souche ~L280~7~
E. coli pop 2135 qui contient l'allèle cIts857 du re-presseur cro.
On obtient ainsi dans la souche bactérienne une banque d'ADNc correspondant à l'ARNm des cellules exprimant un haut niveau de villine, contenant environ 30 000 clones recombinants.
L'expression de la protéine hybride est inductible par la température. On opère donc à une température où le répresseur du gène cro n'est plus actif. A cet effet, il est satisfaisant d'incuber les souches environ 2 heures à une température supérieure à
l'ambiante, en particulier de l'ordre de 40-42C.
Les clones récupérés après lyse des bactéries et rénaturation des protéines selon les techniques classiques sont sélectionnés par criblage immunologi-que.
D'une manière préférée, on effectue d'abord un criblage de la banque d'ADNc par au moins un type d'anticorps polyclonal anti-villine. Les clones réa-gissant spécifiquement avec le ou les anticorps poly-clonaux sont recriblés à l'aide d'au moins un type d'anticorps monoclonal dirigé contre des épitopes COOH-terminaux.
Un criblage satisfaisant est réalisé à l'aide d'un anticorps anti-villine polyclonal tel qu'un anti-corps polyclonal dirigé contre la villine de porc intacte puis un ou plusieurs anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes situés dans la région COOH-terminale de la molécule.
3Q Le criblage à l'aide de l'anticorps polyclo-nal est avantageusement suivi d'un criblage secondaire à l'aide d'un autre anticorps polyclonal, en particu-lier un anticorps polyclonal dirigé contre le fragment COOH-terminal de la villine de poulet.
L'invention vise plus particulièrement un clone porteur d'un ADNc correspondant à la villine 07~
humaine caractérisé en ce qu'il réagit spécifiquement avec l'anticorps polyclonal dirigé contre la villine intacte, avec l'anticorps polyclonal dirigé contre le peptide COOH-terminal de la villine de poulet et avec les deux anticorps monoclonaux dirigés contre des épi-topes COOH-terminaux.
L'invention vise également un clone porteur d'un ADNc correspondant à la villine comprenant un insérat avec une séquence polyA et un site de poly-adénylation.
Selon un autre aspect de l'invention, lesmoyens mis en oeuvre pour la détection de la villine sont constitués par des anticorps monoclonaux.
Cet aspect de l'invention s'appuie sur le fait que les villines, originaires de différentes espè-ces, possèdent des épitopes communs, accessibles à des anticorps monoclonaux reconnaissant de fason spécifique non seulement la villine particulière ayant servi à
l'immunisation de l'animal, dont les cellules spléni-ques avaient été fusionnées avec les cellules de myé-lome appropriées à la production des hybridomes sécré-teurs desdits anticorps monoclonaux, mais reconnaissant de façon aussi spécifique des villines originaires d'autres espèces, y compris l'espèce humaine.
Un anticorps monoclonal préféré selon l'in-vention est donc caractérisé par les propriétés suivan-tes:
- Il reconnaît la villine de porc purifiée (Western Blotting).
- Il reconnaît la villine de poulet (Western Blotting).
- Il reconnaît la villine d'extrait cellulaire de la lignée dérivée d'un adénocarcinome de colon humain :
HT29 (Western Blotting).
- Il reconnaît la villine de rat en immunocytochimie (coupes congelées (cryostat) de muqueuse intestinale de rat fixées au formaldéhyde).
,,~.
~2lS~
Un anticorps monoclonal préféré parmi ceux qui répondent à la définition précédente reconnaît éga-lemen-t un épitope contenu dans le "peptide HP" de la villine de poulet, la reconnaissance étant possible tant à l'égard du peptide HP préalablement isolé qu'à
l'égard du peptide 51 Kd contenant encore le peptide HP; cet an-ticorps ne reconnaît ni le peptide 44 Kd ni le pep-tide 44 Kd de la villine de poulet.
L'anticorps préféré de l'invention reconnalt d'ailleurs la protéine HP, aussi bien à l'état déna-turé, notamment après traitement par le dodécylsulfate de sodium (SDS) que sur les cellules épithéliales por-teuses de la villine. Ce résultat démontre que l'épi-tope porté par le peptide HP n'est pas masqué par d'au-tres protéines dans le milieu cellulaire.
L'invention concerne naturellement égalementles hybridomes sécréteurs de ces anticorps monoclonaux.
Une technique avantageuse pour produire ces hybridomes, notamment par fusion d~ cellules spléniques de souris immunisées contre la villine purifiée de porc, d'une part, et de cellules d'un myélome approprié, sera décrit plus loin. L'hybridome préféré ainsi obtenu (souche BD-D 2C3) a été déposé à la Collection Natio-nale des Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Ins-titut Pasteur de Paris, le 29 avril 19~5, sous le n I-440.
Selon un aspect avantageux de l'invention, l'agent immunogène utilisé pour former des anticorps peut être exprimé en grandes quantités dans la bacté-rie. Cet agent immunogène correspond au peptide codé
par la séquence nucléotidique définie ci-dessus corres-pondant à l'ADN de la villine humaine ou à un fragment.
Selon les techniques classiques, on injecte le peptide à des animaux, on récupère les antisérums, puis, le cas échéant, les anticorps à partir des anti-sérums, par exemple par chromatographie d'affinité. La ~ .
~2~30()79 production d'anticorps selon cette variante revêt un intérêt d'autant plus grand que la région HP codée par le fragment d'ADNc définie plus haut est à la fois la région la plus immunogène et la plus spécifique de la villine.
On remarquera que la protéine codée par la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire de la villine ou d'un fragment de cet ADN constitue également une source d'antigènes permettant de réaliser des ra-dioimmunoassays compétitifs (soit par la méthode ELISAdirecte, soit par la méthode ELISA par compétition).
Il va cependant de soi que tout autre agent immunogène contenant la même séquence immunogène peut être utilisée; par exemple, le peptide HP lui-même, le cas échéant greffé au préalable sur une molécule por-teuse, telle que la sérum albumine bovine, en vue d'ac-croItre ses propriétés immunogènes.
Il apparaItra clairement à l'homme du métier qu'ayant en mains l'anticorps monoclonal préféré selon l'invention, il est à même de définir la région épito-pique caractéristique au peptide HP. Pour l'identifier de façon plus précise, il pourrait notamment avoir recours à un procédé comprenant les étapes suivantes:
- synthèse d'une séquence polynucléotidique codant pour le peptide HP (ou pour la partie de peptide HP dont il est raisonnable de présumer qu'elle contient l'épitope recherché), - linéarisation dudit plasmide défini ci-dessus conte-nant la séquence nucléotidique codant pour l'extrémité
COOH-terminale de la villine, et ce au niveau d'un site de restriction extérieur à ladite séquence, - émondage de façon contrôlée du plasmide linéarisé
avec une enzyme exonucléolytique, telle que l'enzyme Bal 31, - recircularisation du plasmide au moyen d'une ADN-ligase, ;
- transformation d'un microorganisme approprié, lui-meme transformable par le plasmide correspondant et capable d'exprimer l'insérat contenu dans celui-ci, - remise en contact des produits d'expression de ce microorganisme avec l'anticorps considéré, le cycle d'opérations qui vient d'etre défini étant répété jusqu'à la dispari-tion de la détection dudit peptide immunogène parmi les produits d'expression dudit microorganisme transformé par le dernier plasmide recircularisé.
Il est possible, au terme de chacun des cy-cles du procédé sus-défini, notamment séquençage des parties d'extrémité du plasmide avant et après la der-nière opération d'émondage, ayant conduit à la perte de capacité de reconnaissance du plasmide recircularisé
intermédiaire, de situer l'épitope au niveau du peptide codé par la séquence nucléotidique éliminée au cours de cette dernière opération d'émondage. C'est dire que le fait pour l'homme du métier de disposer de l'anticorps monoclonal sus-indiqué est équivalent à la mise à sa disposition de la séquence peptidique définie chimique-ment et contenant cet épitope.
L'invention concerne également la villine humaine pratiquement pure biologiquement, réagissant avec l'anticorps monoclonal préféré défini ci-dessus et ne donnant essentiellement qu'une seule bande dans des essais de migration en électrophorèse sur gel de poly-acrylamide, notamment SDS-PAGE.
En effet, la villine humaine peut etre ex-traite d'un lysat d'entérocytes humains, notamment ob-tenu par traitement de ces derniers avec une solution aqueuse contenant un détergent approprié, et purifiée à
l'aide du susdit anticorps monoclonal. Un procédé de purification de ce type met en jeu l'anticorps monoclo-nal avantageusement immobilisé sur un support solide,de préférence adapté à des opérations de chromatogra-~,~
~ ~rc ~
phie d'afEinité. Par exemple, l'anticorps monoclonalest fixé sur un réseau d'agarose à réticulation tri-dimensionnelle, commercialisé sous la marque SEPHAROSE
par la société suédoise PHARMACIA A.G., par exemple par la méthode au bromure de cyanogène.
L'invention concerne donc plus particulière-ment un procéde de sépara-tion de la villine humaine caractérisé par les opérations consistant à faire pas-ser une solution la contenant au contact d'une colonne d'affinité portant le susdit anticorps monoclonal, pour fixer sélectivement la villine humaine, puis à récu-pérer celle-ci par dissociation du complexe antigène-anticorps soit par tampon acide à pH 2-4 à base de glycine, soit par un tampon basique à base de méthyl-amine, pH 11, puis à dialyser contre un tampon d'acé-tate d'ammonium.
Il va de soi que l'invention concerne égale-ment des polypeptides de poids moléculaires plus fai-bles consistant en des fragments de villine humaine.
Il apparaîtra clairement au spécialiste que les frag-ments pourront etre obtenus par découpage de la villine humaine par des enzymes de coupure de polypeptides en des sites spécifiques. A titre d'exemple de telles protéines, on mentionnera en premier lieu la trypsine ou la protéase de Staphylococcus aureus V8, l'alpha-chymotrypsine, la "protéase de glande sous-maxillaires de souris" (mouse submaxillary gland protease) commer-cialisée par la Société BOEHRINGER, la collagénase de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus, qui reconnaît spécifiquement lesdits peptides Gly-Pro et Gly-Ala, etc.
Il va sans dire que font alors également partie de l'invention les hybridomes et anticorps mono-clonaux spécifiques d'espèce ou non qui peuvent etre fabriqués à partir de la villine humaine ou de ses fragments.
l 7 D'autres caracteris-tlques et avantages de l'invention appara;tront encore dans la description qui suit des conditions particulières, indiquées à titre d'exemple, de dé-tection de viline humaine, de produc-tion et de mise en oeuvre dans des essais d'hybridomese-t d'anticorps monoclonaux.
On rapporte également un procédé d'obtention d'un clone porteur d'une portion d'ADNc de la villine humaine.
EXEMPLE l : DETECTION DE VILLINE HUMAINE.
L'expression de la villine peut être étudiée à différents stades de la prolifération de cellules tumorales ou non originaires des régions digestives ou rénales d'une part, et d'autres régions de l'organisme d'autre part. Partant des tissus concernés, ceux-ci ont été congelés, fixés et préparés dans des conditions à permettre la réalisation de coupes (cryocoupes) selon la technique décrite par BROWN et FARQUHAR, Cell, 36, 295 (1984).
2Q Des coupes ayant des épaisseurs de 5 ~m ont été obtenues à -25C et déposées sur des lames de verre recouvertes de polylysine. Après trempage dans une solution d'un tampon constitué d'une solution saline de phosphate et contenant 0,2% de gélatine (PBS-gélatine), les coupes ont été traitées pour détecter la villine à
l'aide d'une solution contenant 50 ~l d'antiserum de lapin anti-villine dilue au l/800 dans la PBS~-gela-tine, puis incubees pendant 25 minutes a la temperature ambiante dans une chambre humide.
: 30 Les coupes ont ensuite été lavées trois fois pendant 10 minutes dans la PBS~-gélatine.
Des anti-IgG de lapin marqués par la rhoda-mine (produit par la Société neerlandaise Nordic Immu-nological Laboratories) ont ensuite eté ajoutés et les coupes incubées en présence de ces anti-IgG à la tempé-rature ambiante pendant 25 minutes. Les coupes ont .
~Z~00'-~9 ensuite été lavees de façon complète dans la PBS-gela-tine, puis montees pour examen sous microscope à fluo-rescence (Photomicroscope ZEISS) equipe de lentille à
immersion dans une huile Plan Néofluar et d'un jeu de filtres appropries.
Les tissus temoins ou les tissus tumoraux d'autres origines ont ete traites de la meme manière.
Les observations suivantes ont pu etre fai-tes:
Lorsque les tissus provenaient d'adénocarci-nomes du colon, ll observations sur 12 se sont révelees positives pour ce qui est de l'expression de la villi-ne. Des tumeurs humaines d'autres origines telles que des lymphomes, notamment lymphomes de nodules mesente-riques et des types varies de carcinomes d'autres ori-gines resultant des metastases ou non au niveau du pan-creas, de l'oesophage, n'ont pas exprime la proteine.
D'une façon generale, les observations ont montre une correlation etroite entre l'origine intesti-nale primaire de tumeurs traitees et l'expression de la villine. Les nombreux essais realises sur des tumeurs manifestement d'origine distincte se sont pratiquement dans tous les cas reveles negatifs au niveau de l'ex-pression de la proteine.
Il est à remarquer que dans les tissus d'ori-gine intestinale, la villine a toujours ete observee, quel que soit le degre de proliferation desdites cellu-les.
Les essais qui precèdent ont eté réalisés avec des anticorps polyclonaux. Des resultats beaucoup plus nets peuvent etre obtenus avec l'anticorps mono-clonal prefere qui a fait l'objet d'un depot à la CNCM.
Les conditions dans lesquelles les hybridomes secreteurs de ces anticorps monoclonaux ont ete isoles seront decrites ci-après à titre d'exemples. Il sera egalement indique un mode de mise en oeuvre prefere des ~8~
conditions dans lesquelles le diagnos-tic de la présence ou non de villine peut être détecté dans des essais immunologiques du type ELISA.
EXEMPLE 2 : PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES
CONTRE LA VILLINE.
A) PROGRAMME D'IMMUNISATION
- Souris Balb/C o 6 à 8 semaines.
- Antigene : villine de porc purifiée (10 mg/ml) (bande homogène après électrophorèse de la protéine sur gel de polyacrylamide (10%) en présence de SDS~ de poids molé-culaire 95 Kd):
. 10 mM Imidazole . 75 mM HCl . 1 mM EGTA
. 0,1 M DTT
. 50% Glycérol.
- Programme:
. Jour 0 : Injection en IP de 50 ~g de vil-line pure dans une émulsion 50/50 (PBS-Adjuvant de Freund Complet).
. Jour 14 : Rappel en IP 50 ~g de villine (émulsion PBS-Adjuvant de Freund Incomplet).
- . Jour 21 : Rappel en IP 50 ~g de villine (émulsion PBS-Adjuvant de Freund Incomplet).
. Jour 28 : Injec-tion en IM de 20 ~g de vil-line pure en solution dans du PBS.
. Jour 29 : Injection IV de 10 ~g de villine pure en solution dans du PBS.
. Jour 32 : Fusion.
B) FUSION
I) Cellules parentales ; a) Cellules de myélome:
. .
. Lignée Sp2/0-Agl4 (8 Azaguanine résistant).
. Culture stérile en milieu DMEM 10% FCS.
2~
b) Cellules spléniques:
Origine : rate de souris o Balb/C hyperimmu-nisée contre la villine de porc.
II) Procédé de fusion cellulaire selon Kuhler G. et Milstein C. (Continuous culture of fused-cells secret-ing antibody of predefined specificity, Nature 1975, 256, 495).
- Fusion en milieu DMEM sans sérum dans des conditions stériles, en présence d'une solution de polyéthylène-glycol (PEG 1000-Merck 9729 ) à 50% dans un milieu DMEM
sans sérum. Après dénombrement des deux types de cel-lules parentales, la suspension de cellules de myélome en culture est mélangée à la suspension de cellules spléniques dans la proportion de 1 pour 5.
- Contact 2'30".
- Arrêt de l'action du PEG par dilution en milieu DMEM
complet.
- Dilution finale de la suspension cellulaire (2x105 cellules/ml) dans du milieu sélectif DMEM-HAT.
- Distribution dans puits boîte COSTAR-24 trous 1 ml/-puits (COSTAR Tissue Culture Cluster 24, Cat. N 3524, COSTAR 205 Groadway, Cambridge, Ma. USA).
III) Sélection des clones ; Les clones sont iden-tifiees pour leur capa--25 cité à sécréter des anticorps dirigés contre la villine purifiée de porc.
C) METHODE DE SELECTION
I) Test ELISA : Ce test permet la mise en évidence d'anticorps monoclonaux anti-villine dans les surna-geants de culture après fusion.
- Fixation de l'antigène sur support (plaque ELISA) Concentration : 5 ~g/ml dans un tampon phosphate de potassium 50 mM pH 8, 1 nuit à 4C.
- Saturation avec PBS-Tween 20-BSA.
- Incubation I avec surnageant d'hybridome non dilué, 3 heures à 4C.
' ' ~28~
- Incubation II avec des anti-IgG de souris marquées à
la bêta-galactosidase, 2 heures à 4C.
Tous les lavages entre chaque étape sont effectués avec du PBS-Tween~ 20 0,1%.
- Substrat O-nitrophényl-bêta-D-galactopyranoside (Sigma N11-27) dans du -tampon phosphate 0,1 M pH 7,0.
10 3 M MgSO4. 2xlO 3 M MnSO4. 2xlO 3 M magnésium Tritriplex~ déshydraté (Merck 8409).
Lecture : DO 414 nm.
10Les clones sélectionnés sont ceux pour les-quels les surnageants d'hybridome donnent une DO supé-rieure à 10 fois la DO du bruit de fond.
II) Western Blotting selon Burnett. Anal. Biochem.
1981, 112, 195-203.
15Ce test permet de sélectionner les clones `~ sécrétant des anticorps monoclonaux anti-villine de porc, reconnaissant également la villine humaine et la villine de poulet, parmi les clones positifs pour le test ELISA.
Différentes étapes du test:
~` a) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide d'un extrait cellulaire de la muqueuse intestinale de -~ poulet et d'un extrait cellulaire de la lignée HT29 ; (adénocarcinome de colon humain) exprimant la villine.
25b) Electrotransfert des protéines séparées sur gel de polyacrylamide sur papier de nitrocellulose.
c) Incubation du papier de nitrocellulose sur .,r lequel les protéines cellulaires ont été -transférées avec les surnageants d'hybridomes préalablement sélec-tionnés en ELISA 1 nuit à 4 C.
d) Incubation 1 heure à température ambiante avec des anti-IgG de souris marquées à la peroxydase.
-~ e) substrat:
- 10 mg tétrahydrochlorure de diamino-ben~idine.
'~
~X8~9 - 20 ml 0,1 M Tris HCl pH 7,6.
- 0,2 ml H2O2 à 1%.
Tous les lavages entre chaque étape sont effectués avec du sérum de veau nouveau-né-PBS-Triton X100.
f) réaction positive : apparition rapide d'une bande marron (poids moléculaire 95 Kd) si la ; réaction an-tigène-anticorps monoclonal a eu lieu.
'~ D) CLONAGE DES HYBRIDES SELECTIONNES
- Méthode des dilutions limitées:
Dilution en milieu sélectif des clones posi-tifs de façon à ne distribuer qu1une cellule par puits ~- (plaques 96 trous) sur des macrophages (origine souris Balb/C, 4 semaines) attachées au fond des puits.
Addition de milieu sélectif conditionné.
- Sélection des clones positifs selon les méthodes ` précédemment énoncées.
- Reclonage si nécessaire.
E) PREPARATION D'ASCITES
- Les clones sélectionnés sont injectés à des souris (qui ont subi une injection de "PRISTANE~" (Aldrich, 2,6,10,14-tétraméthylpentadécane) 4 à 5 jours avant).
- 1 à 2X106 cellules injectées/souris.
- Récuperation au bout de 10 à 15 jours du liquide d'ascite contenant les ceilules du clone qui ont proli-. .
~ féré. Le liquide d'ascite a un taux d'anticorps mono-, ;.
!` clonal anti-villine supérieur à 1 mg/ml.
; = Congélation des clones sélectionnés en milieu DMEM
~- 10% FCS-5% DMSO.
-~ 30 Conservation dans azote liquide à -176C.
PROCEDE ELISA DIRECT POUR DOSER LA VILLINE.
= Adsorption des IgG purifiées à partir de l'ascite BD-D2C3 en concentration constante sur des plaques ELISA.
L'anticorps a été purifié par chromatographie ' ~
' ' ' ' . ' ' ' d'échange d'ions (DEAE-Tris acryl) et sur colonne d'hydroxyapatite.
. Concentration à etablir.
. Incubation 2 heures à 37'C, puis 1 nuit à 4-C.
. Lavage dans PBS/Tween 20 0,1 '~..
= Saturation des Plaques ~ Incubation 30 minutes en présence de P~S/Tween 20 - 0,1~./BSA 0,4~0.
= Addition de l'anti ène . Gamme de concentration décroissante de la villine purifiée de 5 ~g/ml à 1 ou 0,1 ng/ml en présence de asA
0,4 ~.
. Incubation 3 heures à 4 C.
. Lavages dans PBS/Tween 20 0,1 ~0.
; 15 = Addltion des IqG Purifiées à partir d'un sérum poly-clonal de lapin dirigé contre la villine et couplées à
la bêta-galactosidase.
~ . Incubation 2 heures à 4 C.
- . Lavages dans PBS/Tween 20 0,1 %.
= Détection de la beta-aalactosidase . Addition de 20 mg de p-nitrophényl-bêta-D-g_lacto-pyrannoside a partir d'une solution à 4 mglml, dans 20 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7, MgS04 10 3 M, MnS04 2x10 M, EDTA ~Merck 8409) 2x10 3 M.
; 25 . Incubation x heures a 37 C.
. Lecture densité optique a 414 nm.
EXEMPLE 3 __PRrPAP~AT.~N 3'ADNc CORRESPON~ANT A LA
VILLINE HUMAINE.
Pré~2ration des A~Nm.
On prépare les ARNm à partir de la lisnée cellulaire HT29 dérivée d'un adénocarcinome collque humain. Les ARN sont extraits par la méthode au chloru-e de guanidium décrite par Ullrich et al. dans Science, 1977, 196, 1313-1319. La purifica~ion des ARNm polyA
est effectuée par chromatographie sur colonne d'oligo dT-cellulose selon la méthode décrite par Aviv et Leder dans Proc. Na-tl. Acad. Sci. USA, 1972, 69, 1408-1412.
Préparation des ADNc.
Le premier e-t second brin des ADNc sont pré-parés selon la méthode de Fiddes et Goodman décritedans Nature, 1979, 281, 351-356. L'addition séquen-tielle des linkers SalI à l'extrémité 3' e-t Bam HI à
l'extrémite 5' est effectuée par la méthode d'Helfmann et al. rapportée dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 31-35.
On obtient une banque d'ADNc contenant envi-ron 30 000 clones recombinants.
Vecteur.
On utilise des plasmides pEXl-3 (voir Stanley :
et Luzio, EMBO Journal, 1984, 3, 1429-1430, 1984). Ces vecteurs dérivent de plasmides contenant le gène de fusion cro-LacZ, dont l'expression est sous contrôle du promoteur PR du bactériophage lambda. Un polyunucléo-tide contenant plusieurs sites uniques de restriction a été inséré à l'extrémité 3' du gène LacZ. Les signaux de terminaison de transcription et de traduction sont également insérés dans les trois phases de lecture.
Les ADNc ont été insérés dans chacun des plasmides pEX digérés par les enzymes de restriction Bam HI SalI. Ils se trouvent donc tous dans la meme orientation par rapport au gène Cro-LacZ.
Transformation.
On utilise comme souche bactérienne la souche E. coli pop 2135, construite par O. Raibaud comme dé-
b) Cellules spléniques:
Origine : rate de souris o Balb/C hyperimmu-nisée contre la villine de porc.
II) Procédé de fusion cellulaire selon Kuhler G. et Milstein C. (Continuous culture of fused-cells secret-ing antibody of predefined specificity, Nature 1975, 256, 495).
- Fusion en milieu DMEM sans sérum dans des conditions stériles, en présence d'une solution de polyéthylène-glycol (PEG 1000-Merck 9729 ) à 50% dans un milieu DMEM
sans sérum. Après dénombrement des deux types de cel-lules parentales, la suspension de cellules de myélome en culture est mélangée à la suspension de cellules spléniques dans la proportion de 1 pour 5.
- Contact 2'30".
- Arrêt de l'action du PEG par dilution en milieu DMEM
complet.
- Dilution finale de la suspension cellulaire (2x105 cellules/ml) dans du milieu sélectif DMEM-HAT.
- Distribution dans puits boîte COSTAR-24 trous 1 ml/-puits (COSTAR Tissue Culture Cluster 24, Cat. N 3524, COSTAR 205 Groadway, Cambridge, Ma. USA).
III) Sélection des clones ; Les clones sont iden-tifiees pour leur capa--25 cité à sécréter des anticorps dirigés contre la villine purifiée de porc.
C) METHODE DE SELECTION
I) Test ELISA : Ce test permet la mise en évidence d'anticorps monoclonaux anti-villine dans les surna-geants de culture après fusion.
- Fixation de l'antigène sur support (plaque ELISA) Concentration : 5 ~g/ml dans un tampon phosphate de potassium 50 mM pH 8, 1 nuit à 4C.
- Saturation avec PBS-Tween 20-BSA.
- Incubation I avec surnageant d'hybridome non dilué, 3 heures à 4C.
' ' ~28~
- Incubation II avec des anti-IgG de souris marquées à
la bêta-galactosidase, 2 heures à 4C.
Tous les lavages entre chaque étape sont effectués avec du PBS-Tween~ 20 0,1%.
- Substrat O-nitrophényl-bêta-D-galactopyranoside (Sigma N11-27) dans du -tampon phosphate 0,1 M pH 7,0.
10 3 M MgSO4. 2xlO 3 M MnSO4. 2xlO 3 M magnésium Tritriplex~ déshydraté (Merck 8409).
Lecture : DO 414 nm.
10Les clones sélectionnés sont ceux pour les-quels les surnageants d'hybridome donnent une DO supé-rieure à 10 fois la DO du bruit de fond.
II) Western Blotting selon Burnett. Anal. Biochem.
1981, 112, 195-203.
15Ce test permet de sélectionner les clones `~ sécrétant des anticorps monoclonaux anti-villine de porc, reconnaissant également la villine humaine et la villine de poulet, parmi les clones positifs pour le test ELISA.
Différentes étapes du test:
~` a) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide d'un extrait cellulaire de la muqueuse intestinale de -~ poulet et d'un extrait cellulaire de la lignée HT29 ; (adénocarcinome de colon humain) exprimant la villine.
25b) Electrotransfert des protéines séparées sur gel de polyacrylamide sur papier de nitrocellulose.
c) Incubation du papier de nitrocellulose sur .,r lequel les protéines cellulaires ont été -transférées avec les surnageants d'hybridomes préalablement sélec-tionnés en ELISA 1 nuit à 4 C.
d) Incubation 1 heure à température ambiante avec des anti-IgG de souris marquées à la peroxydase.
-~ e) substrat:
- 10 mg tétrahydrochlorure de diamino-ben~idine.
'~
~X8~9 - 20 ml 0,1 M Tris HCl pH 7,6.
- 0,2 ml H2O2 à 1%.
Tous les lavages entre chaque étape sont effectués avec du sérum de veau nouveau-né-PBS-Triton X100.
f) réaction positive : apparition rapide d'une bande marron (poids moléculaire 95 Kd) si la ; réaction an-tigène-anticorps monoclonal a eu lieu.
'~ D) CLONAGE DES HYBRIDES SELECTIONNES
- Méthode des dilutions limitées:
Dilution en milieu sélectif des clones posi-tifs de façon à ne distribuer qu1une cellule par puits ~- (plaques 96 trous) sur des macrophages (origine souris Balb/C, 4 semaines) attachées au fond des puits.
Addition de milieu sélectif conditionné.
- Sélection des clones positifs selon les méthodes ` précédemment énoncées.
- Reclonage si nécessaire.
E) PREPARATION D'ASCITES
- Les clones sélectionnés sont injectés à des souris (qui ont subi une injection de "PRISTANE~" (Aldrich, 2,6,10,14-tétraméthylpentadécane) 4 à 5 jours avant).
- 1 à 2X106 cellules injectées/souris.
- Récuperation au bout de 10 à 15 jours du liquide d'ascite contenant les ceilules du clone qui ont proli-. .
~ féré. Le liquide d'ascite a un taux d'anticorps mono-, ;.
!` clonal anti-villine supérieur à 1 mg/ml.
; = Congélation des clones sélectionnés en milieu DMEM
~- 10% FCS-5% DMSO.
-~ 30 Conservation dans azote liquide à -176C.
PROCEDE ELISA DIRECT POUR DOSER LA VILLINE.
= Adsorption des IgG purifiées à partir de l'ascite BD-D2C3 en concentration constante sur des plaques ELISA.
L'anticorps a été purifié par chromatographie ' ~
' ' ' ' . ' ' ' d'échange d'ions (DEAE-Tris acryl) et sur colonne d'hydroxyapatite.
. Concentration à etablir.
. Incubation 2 heures à 37'C, puis 1 nuit à 4-C.
. Lavage dans PBS/Tween 20 0,1 '~..
= Saturation des Plaques ~ Incubation 30 minutes en présence de P~S/Tween 20 - 0,1~./BSA 0,4~0.
= Addition de l'anti ène . Gamme de concentration décroissante de la villine purifiée de 5 ~g/ml à 1 ou 0,1 ng/ml en présence de asA
0,4 ~.
. Incubation 3 heures à 4 C.
. Lavages dans PBS/Tween 20 0,1 ~0.
; 15 = Addltion des IqG Purifiées à partir d'un sérum poly-clonal de lapin dirigé contre la villine et couplées à
la bêta-galactosidase.
~ . Incubation 2 heures à 4 C.
- . Lavages dans PBS/Tween 20 0,1 %.
= Détection de la beta-aalactosidase . Addition de 20 mg de p-nitrophényl-bêta-D-g_lacto-pyrannoside a partir d'une solution à 4 mglml, dans 20 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7, MgS04 10 3 M, MnS04 2x10 M, EDTA ~Merck 8409) 2x10 3 M.
; 25 . Incubation x heures a 37 C.
. Lecture densité optique a 414 nm.
EXEMPLE 3 __PRrPAP~AT.~N 3'ADNc CORRESPON~ANT A LA
VILLINE HUMAINE.
Pré~2ration des A~Nm.
On prépare les ARNm à partir de la lisnée cellulaire HT29 dérivée d'un adénocarcinome collque humain. Les ARN sont extraits par la méthode au chloru-e de guanidium décrite par Ullrich et al. dans Science, 1977, 196, 1313-1319. La purifica~ion des ARNm polyA
est effectuée par chromatographie sur colonne d'oligo dT-cellulose selon la méthode décrite par Aviv et Leder dans Proc. Na-tl. Acad. Sci. USA, 1972, 69, 1408-1412.
Préparation des ADNc.
Le premier e-t second brin des ADNc sont pré-parés selon la méthode de Fiddes et Goodman décritedans Nature, 1979, 281, 351-356. L'addition séquen-tielle des linkers SalI à l'extrémité 3' e-t Bam HI à
l'extrémite 5' est effectuée par la méthode d'Helfmann et al. rapportée dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 31-35.
On obtient une banque d'ADNc contenant envi-ron 30 000 clones recombinants.
Vecteur.
On utilise des plasmides pEXl-3 (voir Stanley :
et Luzio, EMBO Journal, 1984, 3, 1429-1430, 1984). Ces vecteurs dérivent de plasmides contenant le gène de fusion cro-LacZ, dont l'expression est sous contrôle du promoteur PR du bactériophage lambda. Un polyunucléo-tide contenant plusieurs sites uniques de restriction a été inséré à l'extrémité 3' du gène LacZ. Les signaux de terminaison de transcription et de traduction sont également insérés dans les trois phases de lecture.
Les ADNc ont été insérés dans chacun des plasmides pEX digérés par les enzymes de restriction Bam HI SalI. Ils se trouvent donc tous dans la meme orientation par rapport au gène Cro-LacZ.
Transformation.
On utilise comme souche bactérienne la souche E. coli pop 2135, construite par O. Raibaud comme dé-
3~ crit dans Nucleic Acid Research de la manière suivante:
On clone dans le site Bam HI d'un polylinker,le fragment BglII de 2,3 kb du phage lambda, portant l'allèle C1857 et le promoteur PR en opérant selon le schéma ci-dessous:
. ~
~Z8~
II CI857 , PR ~
\
GA~G~ e~COO~u~c~ r~AGO~ CDO~ LK~IA~TCGA~TTC
EcoRI Ba~HI EcoRI
Le fragment EcoRI ainsi obtenu est alors cloné dans le site EcoRI de pOM41 et transféré dans le ; chromosome de la souche C600 (voir Gene, 29, 231-241).
- Par cotransduction Pl' avec un marqueur prox-imal aroB, on introduit cette structure dans le chromo-some de MM294 (F endA thi hsdR). On obtient E. coli .:
10 pop 2135 : orientation maIT, CI857, PR, maIPO.
La transformation de la souche bactérienne E. coli pop 2135 par les plasmides recombinants est réalisée selon la technique utilisant le rubidium décrite par Hanahan et al., J. Mol. Biol., 1983, 166, 15 557-580. Cette souche contient l'allèle cIts857 du répresseur de cro.
Le nombre de recombinants obtenus est de l'ordre de 103 à 104 ng d'ADNc.
Sélection des clones par détection immunologique.
_ Les clones recombinants obtenus sont étalés sur filtres de nitrocellulose. La synthèse de la pro-téine hybride est induite après 2 heures d'incubation à
42C. Après lyse des bactéries par le SDS et renatura-tion des protéines en l'absence de méthanol, les clones sont analysés par cri~lage immunologique. La renatu-ration des protéines est effectuée selon la technique de Burnett rapportée dans Anal. Biochem. 1981, 112, 195-203.
Dans un premier temps, la banque est criblée par un anticorps polyclonal dirigé contre la villine de porc intacte. On effectue ensuite un criblage secondai-re en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contreun ~' ~8~B~
fragment COOH-terminal de la villine de poulet et deux anticorps monoclonaux (BDD2C3 et IID3H9) reconnaissant les épitopes situés dans la région COOH-terminale de la molécule.
Le clone pEXZ-V19 contient un insérat de 510 paires de bases. La partie codante représente 330 paires de bases. Elle est suivie d'une région non codante de 200 paires de bases.
L'ADNc cloné code pour les 95 acides aminés COO~-terminaux de la villine humaine et représente environ le 1/10' de la protéine entière (poids molécu-laire : 95 Kd).
': ~
' 15 `~ 20 ';' :
, REFERENCES
(1) Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Rutter, W.J. & Goodman, H.M.
Rat insulin genes : construc-tion of plasmids containing - 5 the coding sequences.
Science, 1977, 196, 1313-1319.
(2) Aviv, H. & Leder, P.
Purification of biologically active globin mRNA by chromatography on oligothymidylic acid cellulose.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, 69, 1408-1412.
(3) Fiddes, J.C~ & Goodman, H.M.
Isola-tion, cloning and sequence analysis of the cDNA
for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin.
Nature, 1979, 281, 351-355.
On clone dans le site Bam HI d'un polylinker,le fragment BglII de 2,3 kb du phage lambda, portant l'allèle C1857 et le promoteur PR en opérant selon le schéma ci-dessous:
. ~
~Z8~
II CI857 , PR ~
\
GA~G~ e~COO~u~c~ r~AGO~ CDO~ LK~IA~TCGA~TTC
EcoRI Ba~HI EcoRI
Le fragment EcoRI ainsi obtenu est alors cloné dans le site EcoRI de pOM41 et transféré dans le ; chromosome de la souche C600 (voir Gene, 29, 231-241).
- Par cotransduction Pl' avec un marqueur prox-imal aroB, on introduit cette structure dans le chromo-some de MM294 (F endA thi hsdR). On obtient E. coli .:
10 pop 2135 : orientation maIT, CI857, PR, maIPO.
La transformation de la souche bactérienne E. coli pop 2135 par les plasmides recombinants est réalisée selon la technique utilisant le rubidium décrite par Hanahan et al., J. Mol. Biol., 1983, 166, 15 557-580. Cette souche contient l'allèle cIts857 du répresseur de cro.
Le nombre de recombinants obtenus est de l'ordre de 103 à 104 ng d'ADNc.
Sélection des clones par détection immunologique.
_ Les clones recombinants obtenus sont étalés sur filtres de nitrocellulose. La synthèse de la pro-téine hybride est induite après 2 heures d'incubation à
42C. Après lyse des bactéries par le SDS et renatura-tion des protéines en l'absence de méthanol, les clones sont analysés par cri~lage immunologique. La renatu-ration des protéines est effectuée selon la technique de Burnett rapportée dans Anal. Biochem. 1981, 112, 195-203.
Dans un premier temps, la banque est criblée par un anticorps polyclonal dirigé contre la villine de porc intacte. On effectue ensuite un criblage secondai-re en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contreun ~' ~8~B~
fragment COOH-terminal de la villine de poulet et deux anticorps monoclonaux (BDD2C3 et IID3H9) reconnaissant les épitopes situés dans la région COOH-terminale de la molécule.
Le clone pEXZ-V19 contient un insérat de 510 paires de bases. La partie codante représente 330 paires de bases. Elle est suivie d'une région non codante de 200 paires de bases.
L'ADNc cloné code pour les 95 acides aminés COO~-terminaux de la villine humaine et représente environ le 1/10' de la protéine entière (poids molécu-laire : 95 Kd).
': ~
' 15 `~ 20 ';' :
, REFERENCES
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clones coding ~or human liver.
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clones coding ~or human liver.
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Solubilization and immune-detection of beta-galactosid-ase hybrid proteins carrying foreign antigenic deter-minants.
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(7) Hanahan, D.
Studies on transformation of E. coli with plasmids.
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(8) Burnett, W.N.
"Western Blotting" : Electrophoretic transfer of r~
1 ~-proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection . with antibody and radioiodinated protein A.
Anal. Biochem., 1981, 112, 195-203.
' 1 0 .
~ 15 ~ ~0 ' : -: 25 :~. 30
"Western Blotting" : Electrophoretic transfer of r~
1 ~-proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection . with antibody and radioiodinated protein A.
Anal. Biochem., 1981, 112, 195-203.
' 1 0 .
~ 15 ~ ~0 ' : -: 25 :~. 30
Claims (16)
1. Procédé de diagnostic pour la détection in vitro de cellules tumorales initialement formées dans la région digestive et/ou dérivées de celles-ci dans un prélèvement biologique suspecté d'avoir un caractère tumoral, caractérisé par la mise en contact de ce prélèvement biologique avec un réactif présentant une affinité spécifique pour la villine.
2. Procédé selon la revendication 1, carac-térisé en ce que le réactif présentant une affinité
spécifique pour la villine est constitué par des anti-corps antivilline, ces anticorps reconnaissant la villine humaine.
spécifique pour la villine est constitué par des anti-corps antivilline, ces anticorps reconnaissant la villine humaine.
3. Anticorps monoclonaux dirigés contre la villine utilisables dans le procédé selon la revendi-cation 2, caractérisés par les propriétés suivantes:
- il reconnaît la villine de porc purifiée (Western Blotting);
- il reconnaît la villine de poulet (Western Blotting);
- il reconnaît la villine d'extrait cellu-laire de la lignée dérivé d'un adénocarcinome de colon humain (Western Blotting);
- il reconnaît la villine de rat en immuno-cytochimie (coupes congelées (cryostat) de muqueuse intestinale de rat fixées à la formaldéhyde).
- il reconnaît la villine de porc purifiée (Western Blotting);
- il reconnaît la villine de poulet (Western Blotting);
- il reconnaît la villine d'extrait cellu-laire de la lignée dérivé d'un adénocarcinome de colon humain (Western Blotting);
- il reconnaît la villine de rat en immuno-cytochimie (coupes congelées (cryostat) de muqueuse intestinale de rat fixées à la formaldéhyde).
4. Anticorps monoclonaux selon la revendi-cation 3, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un site antigénique contenu dans la séquence C-terminale (779-854) ou "partie de tête" de la villine de poulet de formule:
lesdits anticorps monoclonaux étant capables de recon-naître ladite "partie de tête", que celle-ci soit isolée ou à l'intérieur du peptide 51Kd contenu dans la villine du poulet.
lesdits anticorps monoclonaux étant capables de recon-naître ladite "partie de tête", que celle-ci soit isolée ou à l'intérieur du peptide 51Kd contenu dans la villine du poulet.
5. Hybridome producteur des anticorps mono-clonaux selon la revendication 3 déposé à la CNCM sous le No I-440 le 29 Avril, 1985.
6. Procédé selon la revendication 1, carac-térisé en ce que le réactif mis en oeuvre est un réactif reconnaissant le gène codant pour la villine humaine.
7. Procédé selon la revendication 6, carac-térisé en ce que le réactif reconnaissant le gène codant pour la villine humaine est constitué par un ADN
dont la séquence comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, plus spécialement la partie COOH-terminale.
dont la séquence comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, plus spécialement la partie COOH-terminale.
8. ADN utilisable dans le procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il correspond à
l'ARNm complet de la villine humaine ou à un fragment d'ADN dont la séquence nucléotidique comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique codant pour la villine.
l'ARNm complet de la villine humaine ou à un fragment d'ADN dont la séquence nucléotidique comporte une région codant pour une séquence d'acides aminés de la villine humaine, capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique codant pour la villine.
9. Fragment d'ADNc utilisable dans le pro-cédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait qu'il renferme au moins une partie de la séquence nucléotidique codant pour les acides aminés de l'extré-mité COOH de la villine humaine, l'enchaînement nucléo-tidique et celui des acides aminés correspondants présentant respectivement les séquences suivantes:
10. Application des réactifs mis en oeuvre dans le procédé selon la revendication 1 à l'isolement de villine humaine biologiquement pure ne donnant essentiellement qu'une seule bande de poids moléculaire dans les essais de migration en électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
11.. Application en tant que sonde pour la détection des ARNm ou des ADN codant pour la villine humaine d'au moins une partie de la séquence nucléo-tidique selon la revendication 4, cette séquence étant le cas échéant marquée par un élément radioactif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'état hybridé avec la préparation renfermant l'ARNm ou l'ADN
à étudier.
à étudier.
12. Procédé d'obtention de la séquence nucléotidique codant pour l'extrémité de la villine humaine selon la revendication 9, caractérisé en ce que:
- on prépare selon les techniques connues les ARNm (ARN messagers) totaux à partir d'une lignée cellulaire exprimant la villine;
- on construit une banque d'ADNc (ADN complé-mentaires);
- on insère les ADNc dans un vecteur suscep-tible d'exprimer la protéine codée par l'insérat;
- on transforme à l'aide des vecteurs recom-binants obtenus une souche bactérienne, puis on établit des conditions permettant l'expression de la protéine recherchée dans la bactérie;
- on sélectionne les clones recombinants contenant le clone spécifique de la villine à l'aide d'anticorps reconnaissant la villine.
- on prépare selon les techniques connues les ARNm (ARN messagers) totaux à partir d'une lignée cellulaire exprimant la villine;
- on construit une banque d'ADNc (ADN complé-mentaires);
- on insère les ADNc dans un vecteur suscep-tible d'exprimer la protéine codée par l'insérat;
- on transforme à l'aide des vecteurs recom-binants obtenus une souche bactérienne, puis on établit des conditions permettant l'expression de la protéine recherchée dans la bactérie;
- on sélectionne les clones recombinants contenant le clone spécifique de la villine à l'aide d'anticorps reconnaissant la villine.
13. Procédé selon la revendication 12, carac-térisé en ce que la construction de la banque d'ADNc est réalisée à l'aide d'un vecteur de clonage capable d'exprimer la protéine codée par l'ADNc inséré, plus spécialement par des plasmides de type pEX.
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'on transforme une souche bacté-rienne du type E. coli, plus spécialement E. coli pop 2135, à l'aide des vecteurs recombinants renfermant une séquence nucléotidique codant pour l'extrémité de la villine humaine.
15. Procédé selon la revendication 12, carac-térisé en ce qu'on effectue un criblage de la banque d'ADNc à l'aide d'un anticorps antivilline polyclonal tel qu'un anticorps polyclonal dirigé contre la villine de porc intacte puis un ou plusieurs anticorps mono-clonaux reconnaissant des épitopes situés dans la région COOH-terminale de la molécule, le criblage à
l'aide de l'anticorps polyclonal étant avantageusement suivi d'un criblage secondaire à l'aide d'un autre anticorps polyclonal, en particulier un anticorps poly-clonal dirigé contre le fragment COOH-terminal de la villine de poulet.
l'aide de l'anticorps polyclonal étant avantageusement suivi d'un criblage secondaire à l'aide d'un autre anticorps polyclonal, en particulier un anticorps poly-clonal dirigé contre le fragment COOH-terminal de la villine de poulet.
16. Clone porteur d'un ADNc correspondant à
la villine humaine selon la revendication 9, caracté-risé en ce qu'il réagit spécifiquement avec l'anticorps polyclonal dirigé contre la villine intacte, avec l'anticorps polyclonal dirigé contre le peptide COOH-terminal de la villine de poulet et avec les deux anti-corps monoclonaux dirigés contre des épitopes COOH-terminaux.
la villine humaine selon la revendication 9, caracté-risé en ce qu'il réagit spécifiquement avec l'anticorps polyclonal dirigé contre la villine intacte, avec l'anticorps polyclonal dirigé contre le peptide COOH-terminal de la villine de poulet et avec les deux anti-corps monoclonaux dirigés contre des épitopes COOH-terminaux.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA000508231A CA1280079C (fr) | 1985-05-02 | 1986-05-02 | Moyens pour le diagnostic in vitro de cellules malignes originaires du tube digestif |
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|---|---|---|---|
| FR85.06707 | 1985-05-02 | ||
| FR85.16820 | 1985-11-13 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
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| CA1280079C true CA1280079C (fr) | 1991-02-12 |
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|---|---|---|---|
| CA000508231A Expired - Lifetime CA1280079C (fr) | 1985-05-02 | 1986-05-02 | Moyens pour le diagnostic in vitro de cellules malignes originaires du tube digestif |
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1986
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