FR2706487A1 - Préparation purifiée de protéine kin17 et ses applications, notamment au dépistage de remaniements chromosomiques. - Google Patents

Abstract

Préparation purifiée de la protéine kin17 de souris. Ladite préparation purifiée de la protéine kin17 de souris est caractérisée en ce qu'elle présente un "doigt de zinc" capable de fixer les ions Zn+ + réactifs, en ce qu'elle est capable de reconnaître l'ADN simple- ou double-brin et notamment les régions courbées de l'ADN double-brin, en ce qu'elle présente un poids moléculaire apparent de 43 000 daltons, et en ce qu'elle est reconnue aussi bien par les anticorps anti-protéine kin17 que par les anticorps anti-protéine recA d'E. coli. Les fragments peptidiques de cette préparation sont aptes à être utilisés comme réactifs de détection de la protéine kin17, pour surveiller, évaluer et apprécier l'exposition des mammifères, notamment de l'homme, aux différents agents génotoxiques.

Description

La présente invention est relative à une pré-

paration purifiée de protéine kinl7 de souris, à son pro-

cédé d'obtention et à ses applications, notamment à la production d'anticorps et à la détection des protéines kinl7 de mammifères, des gènes ainsi que des produits de transcription KIN-17 de mammifères et au dépistage de

remaniements chromosomiques chez les mammifères et no-

tamment l'Homme.

La présente invention est également relative aux séquences d'ADNs génomiques murins et humains ainsi qu'à la séquence de l'ADNc humain, aux oligonucléotides

qui permettent la détection des gènes KIN17 ou des pro-

duits de transcription correspondants, aux vecteurs d'ex-

pression ou plasmides portant lesdites séquences ainsi

qu'aux bactéries contenant lesdits vecteurs.

De nombreux agents génotoxiques provoquent des

lésions ou altérations de l'ADN et bloquent la réplica-

tion de l'ADN; pour assurer la survie cellulaire et le maintien de l'intégrité de l'ADN, une série de systèmes de sauvegarde existent aussi bien chez les bactéries que chez les organismes supérieurs tels que les mammifères; en particulier, de nombreux gènes sont induits afin de rétablir la structure normale de l'ADN et participent

ainsi au processus de réparation de ce dernier.

Ce processus a été particulièrement bien étu-

dié chez la bactérie Escherichia coli, chez laquelle un ensemble de gènes appelé système SOS, est impliqué dans la réparation de l'ADN. Ces gènes, sous le contrôle d'un

même répresseur, sont induits par les lésions de l'ADN.

Une protéine, la protéine recA, joue un rôle central dans

ce processus de réparation: c'est en effet son activa-

tion qui va déclencher la réponse SOS, en inactivant par clivage le répresseur des gènes SOS; en plus d'un rôle de régulation, cette protéine RecA a un rôle enzymatique

direct dans la recombinaison et intervient dans le pro-

cessus de mutagénèse. De manière plus précise [A.I. ROCA et ai., (Biochemistry and Molecular Biology, 1990, 25, 415-456)], la protéine recA participe à la recombinaison de façon essentielle et favorise: (i) l'inactivation de la protéine lexA, qui a un rôle de répresseur des gènes du système SOS,

(ii) elle est également impliquée dans le pro-

cessus de mutagénèse et dans la réplication de l'ADN

stable.

A.I ROCA et al. ont, en particulier, étudié la

structure de cette protéine recA, qui comprend 352 ami-

noacides. Cette protéine se lie à l'ADN de manière assez complexe (liaison à deux molécules d'ADN) et une étude

plus fine de sa structure a montré que la région C-

terminale est impliquée dans les interactions protéine-

protéine ainsi que dans l'activité protéique et que les 17 aminoacides Cterminaux ne sont pas essentiels pour les opérations de recombinaison homologue, de résistance

aux U.V. et d'induction de la réponse SOS. La région N-

terminale interviendrait dans le processus d'auto-assem-

blage de la protéine.

Chez les mammifères, on connaît quelques gènes qui interviennent dans la réparation par excision, mais

les gènes responsables de la recombinaison et de la muta-

génèse n'ont pas encore été clairement identifiés.

Toutefois, une protéine nucléaire de souris, kinl7, a été mise en évidence par l'un des Inventeurs [Angulo J.F. et ai, (Mutation Res., 1989, 123-134)] et

est immunologiquement reliée à la protéine recA d'E.

coli, son identification ayant été possible à l'aide d'anticorps antirecA d'E. coli, chez des cellules de rat FR 3T3. La production de cette protéine kinl7 est induite

par les agents génotoxiques, comme le rayonnement ultra-

violet. Elle a une localisation préférentiellement

nucléaire. De plus, elle est minoritaire parmi les pro-

téines cellulaires et très sensible à la protéolyse enzy- matique.

Elle est vraisemblablement impliquée dans le métabolisme de l'ADN, dans la mesure o elle augmente lors de certaines phases cellulaires de la synthèse de l'ADN et dans la réparation et o elle s'accumule dans le noyau après altération de l'ADN. Poursuivant ses travaux, J.F. ANGULO et al.

(Biochimie, 1991, 73, 251-256) ont caractérisé des anti-

corps anti-recA monospécifiques, aptes à être utilisés pour détecter l'expression de ladite protéine kin par des

vecteurs d'expression. Ces Auteurs ont ainsi mis en va-

leur un fragment d'ADNc dénommé KIN17601, dérivé de 1'ARN embryonnaire de souris et exprimant un polypeptide (kin17200) qui présente des réactions croisées avec les

anticorps anti-recA.

La comparaison de la séquence du polypeptide

(kin200) codé par cet ADNc avec la séquence de la pro-

téine recA a conduit à la mise en évidence de séquences communes correspondant à des séquences situées entre les

aminoacides 309-347 de la recA.

Dans Nucleic Acids Research, (1991, 19, 5117-

5123), J.F. ANGULO et al. ont identifié et exprimé l'ADNc

de KIN17 (1414 bp) chez la souris, en utilisant le frag-

ment KIN17601 précité, comme sonde.

L'ADNc KIN17 présente un seul cadre de lecture ouvert, entre les positions 25 et 1198, qui code pour une protéine de 391 aminoacides (protéine kinl7) qui présente un domaine de liaison au zinc (motif en "doigt de zinc") entre les résidus 28 et 50 et un déterminant antigénique

du même type que celui de la protéine recA entre les po-

sitions 162 et 201.

L'existence de trois signaux de localisation

nucléaire est supposée au niveau respectivement des rési-

dus 157-160, 253-256 et 295-300 de ladite protéine kinl7.

La localisation chromosomique du gène codant pour la kinl7 a été effectuée par hybridation in situ,

sur le chromosome 2, chez la souris.

Compte-tenu de ce qui précède, il paraissait

important et intéressant de disposer de réactifs spéci-

fiques, aptes à suivre l'expression du gène KIN-17 chez les mammifères, pour surveiller, évaluer et apprécier l'exposition des mammifères et notamment de l'Homme aux

différents agents génotoxiques.

En conséquence, poursuivant ses études J.F.

ANGULO et al. se sont donné pour but de pourvoir à des réactifs aptes à permettre la détection d'une exposition

d'un mammifère et notamment de l'Homme, à un agent géno-

toxique. Ils ont pris pour point de départ, une prépa-

ration purifiée de protéine kinl7 de souris obtenue par: (a) surproduction de protéine kinl7, à partir de bactéries porteuses de plasmides contenant 1'ADNc du

gène KIN17 et un promoteur inductible, par culture des-

dites bactéries en présence d'IPTG,

(b) séparation des bactéries ayant exprimé la-

dite protéine kinl7,

(c) extraction des protéines par lyse des bac-

téries,

(d) séparation d'une fraction riche en pro-

téine kinl7, à partir de l'extrait total de protéines par chromatographie sur colonne d'héparine-AcA et élution avec un tampon d'une force ionique égale à 0,55 M NaCl, (e) purification par chromatographie de la

fraction obtenue sur une colonne d'hydroxyapatite et élu-

tion par un gradient de force ionique et (f) séparation de la fraction purifiée par

électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 11 %.

Cette préparation purifiée de protéine kinl7 se caractérise en ce qu'elle présente un "doigt de zinc" capable de fixer les ions Zn++ réactifs, en ce qu'elle est capable de reconnaître l'ADN simple- ou double-brin et notamment les régions courbées de l'ADN double-brin, en ce qu'elle présente un poids moléculaire apparent de 43 000 daltons, et en ce qu'elle est reconnue aussi bien

par les anticorps anti-protéine kinl7 que par les anti-

corps anti-protéine recA d'Escherichia coli.

Les Inventeurs ont trouvé qu'une telle prépa-

ration purifiée de kinl7 permet, de manière inattendue, de fournir tout un pool de réactifs aptes à détecter la protéine kinl7 induite par des agents génotoxiques, tels que le rayonnement X ou ultraviolet, en particulier, et de caractériser ainsi l'interaction de cette protéine

avec l'ADN courbé.

La présente invention a pour objet des frag-

ments de la protéine kinl7 purifiée et notamment:

- un fragment de 15 aminoacides (peptide D-16-

Y), de séquence: Asp-Glu-Glu-LysThrAla-Lys-Phe-Ile-Glu-

Glu-Gln-Val-Arg-Arg, qui correspond à la région de la protéine kinl7, homologue à la protéine recA d'E.coli et

- un fragment de 11 aminoacides (peptide Y-13-

K), de séquence: Gln-Lys-Gln-Cys-Arg-Asp-Glu-Asn-Gly-

Phe-Lys, qui se trouve dans le domaine fonctionnel dé-

nommé doigt de zinc.

De tels peptides correspondent à des zones particulièrement immunogènes et conservées de la protéine

kinl7 et permettent d'obtenir des anticorps polyspéci-

fiques de mammifères.

La présente invention a également pour objet des anticorps anti- protéine kinl7, caractérisés en ce

qu'il sont obtenus par immunisation de mammifères et no-

tamment de lapins avec une suspension antigénique consti-

tuée par la préparation purifiée de protéine kinl7,

conforme à l'invention.

La présente invention a également pour objet des anticorps anti-protéine kinl7, caractérisés en ce qu'il sont constitués par des anticorps antifragments

peptidiques tels que décrits ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux des-

dits anticorps, ils sont constitués par des anticorps po-

lyclonaux. Ces anticorps polyclonaux sont avantageusement

obtenus par immunisation d'un mammifère approprié, notam-

ment le lapin, avec un peptide ou un mélange de peptides

conformes à l'invention, éventuellement couplé à une pro-

téine convenable, telle que l'ovalbumine, la BSA notamment. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits anticorps, ils sont constitués par des anticorps monoclonaux spécifiques de chacun des peptides définis

ci-dessus.

Ces anticorps monoclonaux anti-fragments pep-

tidiques sont avantageusement obtenus, d'une manière connue en elle-même par fusion de cellules spléniques de souris immunisées par un antigène constitué par l'un des

fragments peptidiques tels que définis ci-dessus, éven-

tuellement couplé à une protéine convenable, telle que l'ovalbumine ou la BSA notamment, avec des cellules

myélomateuses appropriées.

La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle

est constituée par la séquence d'ADN génomique KIN17 mu-

rin, en ce qu'elle possède au moins deux introns, dont l'un se situe au niveau du nucléotide 137 et l'autre entre les nucléotides 339 et 429 de l'ADNc murin codant pour la protéine kinl7, comprenant 1414 paires de bases et présentant la formule I représentée à la figure 1 annexee.

L'invention a également pour objet des oligo-

nucléotides, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par un fragment de la séquence nucléotidique de formule I

conforme à l'invention.

Parmi lesdits fragments, on peut citer en par-

ticulier: - un oligonucléotide B, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule B suivante:

AGGCGGAAAGAACCAGGGGATCCC

un oligonucléotide C, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule C suivante:

GCGAGTCCCAGCGGTACC

- un oligonucléotide D, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule D suivante:

GACCTTGAAGACTCCGCTGCGAA

- un oligonucléotide E, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule E suivante:

ACTGCCAAGTTCATTGAG

- un oligonucléotide F, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule F suivante:

TTCTTCTTCTTCAGCCGGGACCTA

- un oligonucléotide G, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule G suivante:

TCGAAGAGGAAAAGAAAAGGACCG

- un oligonucléotide I, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule I suivante:

CTGGAACTTCTGAGGCGACGCTT

- un oligonucléotide J, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule J suivante:

CCGACCATGTAAGTCATCTATCTG

- un oligonucléotide K, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule K suivante:

CATCAGCCACCGAGAGCACATC,

- un oligonucléotide L, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule L suivante:

AGCTGCTGCAGCAGCTTATCG,

- un oligonucléotide S, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule S suivante:

AGCCCCAAGGCCATCGCCAA.

La présente invention a également pour objet des paires d'amorces pour la synthèse et/ou la détection de l'ADN génomique ou d'un produit de transcription du gène KIN17, caractérisé en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique

telle que définie ci-dessus.

Selon un mode de réalisation desdites paires d'amorces, elles sont avantageusement constituées par un

oligonucléotide de formule E apparié avec un oligonucléo-

tide de formule F. Selon un mode de réalisation desdites paires d'amorces, elles sont avantageusement constituées par un

oligonucléotide de formule I apparié avec un oligonucléo-

tide de formule J. Selon un mode de réalisation desdites paires d'amorces, elles sont avantageusement constituées par un

oligonucléotide de formule K apparié avec un oligonucléo-

tide de formule J. Les différentes paires d'amorces (oligonucléotide E/oligonucléotide F, oligonucléotide I/oligonucléotide J, oligonucléotide K/oligonucléotide J) permettent de détecter (et éventuellement de doser) l'ADN

et l'ARN KIN17, avec une sensibilité accrue, due à l'am-

plification en chaîne à l'aide d'une polymérase.

La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de

séquence telle que définie ci-dessus, éventuellement mar-

quée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif,

une enzyme appropriée ou un fluorochrome.

La présente invention a également pour objet la séquence de l'ADNc humain codant pour la protéine

kinl7, comprenant 2400 paires de bases.

La présente invention a, de plus, pour objet

un plasmide contenant l'ADNc du gène KIN17 humain.

Ce plasmide, dénommé XLpHK17, a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR

sous le n 1-1316 en date du 08 juin 1993.

La présente invention a également pour objet un réactif utilisable pour la détection, le diagnostic et

le suivi de remaniements chromosomiques chez un mammi-

fère, après exposition à un agent génotoxique, caracté-

risé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par

les réactifs immunologiques sélectionnés parmi la prépa-

ration de protéine kinl7 purifiée, les fragments pepti-

diques, les anticorps anti-peptides et les anticorps anti-protéine kinl7 purifiée, conformes à l'invention et

les réactifs nucléotidiques sélectionnés parmi les sé-

quences d'ADN génomique murin codant pour la protéine kinl7 ou leurs fragments et les séquences d'ADNc humain

codant pour la protéine kinl7 ou leurs fragments.

La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage de remaniements chromosomiques chez les mammifères, caractérisé en ce qu'il consiste à

mettre en contact une cellule humaine (lymphocytes notam-

ment) appropriée avec un réactif, tel que défini ci-des-

sus, apte à détecter la présence d'une protéine, dont la

production est induite par un toxique génétique.

Un tel procédé doit être suffisamment spéci-

fique et sensible, pour détecter l'induction d'une pro-

duction significativement accrue de ladite protéine par

rapport à sa concentration basale.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit

procédé de dépistage, on détecte la protéine kinl7 pro-

duite par une cellule appropriée, en mettant en présence ladite cellule avec un réactif immunologique sélectionné parmi les réactifs du groupe qui comprend une préparation de protéine kinl7 purifiée, des fragments peptidiques de ladite préparation, les anticorps anti-peptides et les

anticorps anti-protéine kinl7 purifiée, conformes à l'in-

vention.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le réactif immunologique est fixé sur un

support solide approprié.

Ledit procédé immunologique peut être avanta-

geusement de type direct, de type indirect ou mettre en

oeuvre une méthode sandwich ou bi-site.

Dans le cas d'une méthode directe, la protéine kinl7 se fixe aux anticorps conformes à l'invention, préalablement fixés au support solide et des conjugués enzyme appropriée-anticorps anti-Ig humains appropriés sont ensuite révélés. Dans le cas d'une méthode indirecte, par

exemple des conjugués enzyme appropriée-préparation puri-

fiée de protéine kinl7 ou des complexes enzyme-peptides conformes à l'invention, entrent en compétition avec la protéine kin 17 produite par les cellules pour se lier au

support solide revêtu d'anticorps conformes à l'inven-

tion. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit procédé de dépistage, on détecte l'ADN génomique et/ou les produits de transcription du gène KIN17,

(1) en mettant en contact l'échantillon biolo-

gique à analyser, traité pour extraire l'acide nucléique

recherché avec une paire d'amorces conforme à l'inven-

tion, pour amplifier au moins un fragment dudit ADN ou ARN,

(2) après quoi, la séquence d'ADN ou d'ARN am-

plifiée est détectée par au moins une sonde nucléotidique

conforme à l'invention.

La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'une modification chromosomique, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) l'extraction de l'ADN ou de l'ARN à partir de cellules appropriées, (2) leur mise en contact avec une protéine kinl7, (3) la quantification de l'ARNm KIN17, (4) la détermination du rapport concentration

ARNm KIN17/ADN total.

La présente invention a en outre pour objet un kit de détection d'une modification chromosomique chez l'Homme, caractérisé en ce qu'il comprend, outre les l1 réactifs usuels, des anticorps anti-protéine kinl7 de souris pour l'immunodétection rapide et sensible de la protéine kinl7 dans des extraits totaux de cellules

humaines par Western blot ou par immunofluorescence.

Conformément à la présente invention, un kit de détection de la protéine kinl7 par la méthode ELISA ou RIA, comprend, outre les réactifs usuels, des anticorps anti-protéine kinl7 de souris et un couple d'anticorps,

dirigés chacun contre un peptide choisi parmi les pep-

tides D-16-Y et Y-13-K définis plus haut.

Outre les dispositions qui précèdent, l'inven-

tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti-

ront de la description qui va suivre, avec référence aux

dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 représente la séquence d'ADN génomique KIN17 murin, - la figure 2 représente le profil d'élution

de la protéine kinl7 de souris sur colonne d'hydroxyapa-

tite; - les figures 3A et B illustrent la détection de la protéine kinl7 dans des extraits cellulaires de souris; - les figures 4A et B illustrent la détection de la protéine kinl7 dans des cultures primaires de fibroblastes normaux et de patients X.p. et TTD;

- la figure 5 représente l'organisation puta-

tive intron-exon du gène KIN-17 de souris; - la figure 6 illustre la détection indirecte des introns dans le gène KIN-17; - la figure 7 illustre la localisation d'une des jonctions intron-exon dans le gène KIN-17; - la figure 8 illustre la mise en évidence du gène KIN- 17 humain avec les oligonucléotides E et F de la région conservée du gène de souris;

- la figure 9 représente les phages recombi-

nants qui contiennent la région promotrice; - la figure 10 illustre la localisation des

inserts des phages recombinants le long de l'ADN géno-

mique; - la figure 11 représente une cartographie de restriction des phages XGK9 et XGK12;

- la figure 12 représente une séquence schéma-

tique de la protéine kinl7; - la figure 13 illustre les propriétés de liaison de la protéine kinl7 à de l'ADN simple brin ou double brin; - la figure 14 montre que la liaison protéine kinl7-ADN est dépendante du zinc;

- la figure 15 illustre la liaison préféren-

tielle kinl7-structure courbée d'ADN.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins, de même que les exemples qui vont suivre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière

une limitation.

EXEMPLE 1: Détermination de la séquence génomique du

gène KIN-17 de souris.

* Isolement des phages contenant le gène KIN-

17: A. Criblage de la banque génomique de souris et purification des phages recombinants: une banque d'ADN génomique de souris, clonée dans le vecteur XDashII a été criblée avec une sonde

d'ADN radiomarquée correspondant au fragment d'ADN com-

plémentaire du gène KIN-17 de formule I ci-dessus (appelé Sonde-1192). L'ADN des phages recombinants, immobilisé sur des filtres de nitrocellulose a été hybridé avec la

*sonde-1192 radioactive.

- Matériels: banque: la banque a été obtenue à partir

d'une digestion partielle de l'ADN de foie de souris mâles de la souche 129 par l'enzyme de restriction Sau3A.

Après la digestion, les fragments d'ADN de 15 kb sélec-

tionnés ont été insérés au site BamHI du vecteur XDashII

(Stratagène). Les phages recombinants ont été sélection-

nés positivement car ils sont les seuls capables de se répliquer dans une souche lysogénique pour P2 (souche

SRB P2).

Fragment d'ADN utilisé pour le criblage: la

sonde utilisée est un ADN double brin obtenu par amplifi-

cation en chaîne à l'aide de la polymérase, contenant les nucléotides 253-1414 de la séquence de formule I [ADNc du gène KIN-17 (ANGULO et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 5117-5123)]. Cet ADN a été marqué avec du dCTPaP32

(MANIATIS et al., 1989).

- Méthode: Dénaturation et immobilisation de l'ADN du

bactériophage lambda sur des filtres de nitrocellulose.

400 000 bactériophages XDashII contenant des inserts de 15 kb d'ADN génomique de souris, sont incubés min à 37C avec 0,15 ml de bactéries réceptrices DP50 (culture de 7 h à 37'C), puis mélangés avec 8 ml de milieu LB agarose à 49'C. L'ensemble est coulé sur une

boîte de Pétri de 140 mm de diamètre contenant de l'agar.

Les boîtes ont été incubées à 37 C, 14 heures, jusqu'à ce que les plages de lyse arrivent à confluence. Un filtre de nitrocellulose (SCHLEICHER & SCHUELL, BA85) sec a ensuite été déposé sur la surface de la boîte, marquée de façon asymétrique avec de l'encre de chine. Après 1 min de contact, ce filtre est marqué, puis traité de la façon suivante: - le filtre est placé pendant 5 min, face en contact avec les phages vers le haut, sur des feuilles de papier Whatman imbibées de solution dénaturante (0,5 N NaOH-1,5 M NaCl), pour permettre la lyse des phages et la dénaturation de l'ADN; - le filtre est ensuite transféré pendant 5 min dans la solution de neutralisation (1,5 M NaCl-0,5 M TrisCl pH = 7,4), puis est lavé pendant 10 min dans du tampon 2xSSC pour éliminer les protéines phagiques et les débris cellulaires; - le filtre est ensuite séché à 80'C, sous vide, pendant 2 h. Un deuxième filtre est mis en contact 2 min avec les plages de lyse à la surface de la boîte. Il est

traité de la même façon que la première empreinte.

Les boîtes contenant les phages, sont conser-

vées à 4'C à l'obscurité. L'ADN fixé sur les filtres est alors hybridé avec la sonde-1192 radiomarquée (MANIATIS

et al., 1989).

B. Hybridation des ADNs recombinants avec la sonde-1192 radioactive: l'ADN phagique dénaturé, immobilisé sur les membranes de nitrocellulose, est hybridé avec un fragment

radioactif de l'ADNc du gène KIN-17.

- Préhybridation: filtres de 60 cm2 sont incubés pendant 2 h

à 65'C avec agitation dans 10 ml de solution d'hybri-

dation (5xSSPE-5xDenhardt's solution-0,5 % SDS) en pré-

sence de 20 gg/ml final d'ADN de sang de poulet soniqué (préalablement dénaturé à 100'C pendant 10 min, puis

placé sur la glace).

- Hybridation: Les filtres sont incubés avec la sonde-1192

radiomarquée (4x104 dpm/cm2 de filtre/ml de volume d'in-

cubation) pendant 14 h à 65'C avec agitation. Après hy-

bridation, les filtres sont lavés de la façon suivante: 4 lavages de 5 min dans du tampon 2xSSC-0,1 %

SDS à température ambiante, 1 lavage de 1 h dans du tam-

pon lxSSC-0,1 % SDS à 65'C.

Après élimination de l'excès de radioactivité, les filtres sont mis en contact avec des films X-OMAT AR (Kodak) que l'on a placé à -80'C pendant 24 h (MANIATIS

et al., 1989).

* Isolement des phages qui portent l'ADN géno-

mique KIN-17:

Les plages de lyse qui donnent un signal po-

sitif par autoradiographie sont repérées sur les boîtes.

Les plages donnant un signal positif sont prélevées et remises en suspension dans 100 R1 de TMG contenant 5 gl

de chloroforme. Le même protocole utilisé pour le cri-

blage permet par la suite de purifier les phages intéres-

sants ainsi que leur ADN pour déterminer la taille des

inserts et la structure du gène.

A. Purification de l'ADN du chaae lambda: 2 ml d'une suspension de bactéries réceptrices DP 50 (DO600 = 3) sont incubés, pendant 15 min avec 3 il de suspension de phages concentrés à 1010 pfu/ml. Cette

suspension est ensuite mise dans 200 ml de LBM. L'en-

semble est agité vigoureusement dans un bain-marie à 37C jusqu'à la lyse des bactéries (environ 8 h). 0,5 ml de

chloroforme sont ensuite ajoutés et l'agitation est pour-

suivie pendant 10 min à 37'C. Après une centrifugation de 20 min à 10 000 g et à 4'C, le surnageant récupéré a un

titre de 1010 phages/ml. Une quantité de sulfate d'ammo-

nium solide est ensuite ajoutée afin d'obtenir une satu-

ration finale de 50 % (pour 50 % de saturation, il faut

dissoudre 313 g de sulfate d'ammonium dans un volume fi-

nal de 1 litre selon HARLOW and LANE, 1988). Le mélange est incubé pendant 30 min sur la glace, puis centrifugé

pendant 20 min à 10 000 g et à 4'C.

Le culot est repris dans 1 ml de TE-SDS conte-

nant 20 gg/ml final de RNase. Ce mélange est incubé 15 min à température ambiante. On ajoute de la protéinase K à 200 gg/ml final. Le mélange est incubé 20 min à 60'C,

puis est placé 15 min sur la glace, avant d'être centri-

fugé 10 min à 4'C et à 15 000 g. 2 extractions succes-

sives des protéines du surnageant sont réalisées avec du phénol saturé avec du TE. Ces deux étapes ont été suivies

d'une extraction au chloroforme puis d'une dernière ex-

traction avec de l'éther saturé avec de l'eau. L'ADN ainsi purifié est précipité en présence du même volume d'isopropanol

pendant au moins 30 min à 4'C, puis est centrifugé 30 min à 15 000 g et à 4'C. Le culot a été rincé 2 fois avec de l'éthanol à 70 % puis

repris dans 50 g1 de TE (ZIAI et al., 1989). L'ADN pha-

gique ainsi obtenu est hydrolysé avec différentes endo-

nucléases de restriction et les sites de coupures ont été

localisés par rapport aux sites du vecteur de clonage.

Une première carte de restriction est ainsi établie par hybridation des ADNs phagiques avec des oligonucléotides

qui correspondent à l'ADNc KIN-17.

B. Hybridation des ADNs Dhaaiaues avec des oliaonucléotides radioactifs:

1) Fixation de l'ADN sur des filtres de ny-

lon: On dépose à la surface d'une membrane de nylon chargée positivement (Membrane Hybond N+, Amersham) des échantillons de 5 gl, contenant respectivement 0,5x107, 2x107 et 5x107 phages recombinants, soit une quantité d'ADN équivalent à 250 pg, 1 000 pg et 2 500 pg d'ADN de

phage lambda (2x1010 pfu de phage lambda = 1 gg d'ADN).

De même 250, 1 000 et 2 500 pg d'ADN double brin (sondes ' et 3' de la 1'ADNc de KIN-17 réalisées par PCR) sont

déposés sur la même membrane pour servir de contrôle.

Traitement de la membrane: la membrane est placée sur une feuille de papier Whatman 3MM imbibée avec ml de solution de dénaturation pendant 5 min, puis min sur une feuille de papier Whatman imbibée de solu- tion de neutralisation. L'ADN a été fixé à la membrane en laissant celle- ci 30 min sur un papier Whatman imbibé

d'une solution 0,4 M NaOH. La membrane est rincée rapide-

ment dans du tampon 5xSSC avant de procéder à l'hybrida-

tion avec un oligonucléotide marqué radioactivement.

2) Marquage radioactif de l'oligonucléotide: 4 pmol d'oligonucléotides sont mélangés à 3 gl de tampon de réaction 5 fois concentré, 3 g1 d'ATP 32p (10 gCi/ml à 5 000 Ci/mmol, Amersham), et 7 unités de polynucléotide kinase dans un volume final de 5 j1. Après incubation à 37 C pendant 30 min, l'enzyme est inactivée par chauffage pendant 5 min à 55 C (MANIATIS et al.,

1989).

3) Hybridation des membranes avec une sonde oligonucléotidique: a) Préhybridation: le mélange réactionnel contient 4 ml de solution d'hybridation pour une membrane de nylon de 100 cm2 et 20 gg/ml final d'ADN non homologue (ADN soniqué de sang de poulet). L'ensemble est incubé

pendant 2 h à une température déterminée.

Détermination de la température d'hybrida-

tion: la température d'hybridation (Th) dépendant de la composition en bases: Th = 2 x (A + T) + 3 x (G + C)

les lettres A, T, G et C correspondent aux 4 bases Adé-

nine, Thymine, Guanine et Cytosine.

b) Hybridation: l'hybridation se fait pendant

3 h à Th avec agitation en ajoutant la totalité de la so-

lution d'oligonucléotide radioactif, soit 2,6x107 dpm, à la solution de préhybridation. Après hybridation, les membranes sont lavées 2 fois pendant 5 min dans du tampon

2xSSPE-0,1 % SDS, à température ambiante et exposées pen-

dant 14 heures avec un film X-OMAT AR (Kodak) à -80'C.

L'hydrolyse de l'ADN du gène KIN-17 et l'hy-

bridation des ADNs phagiques avec les oligonucléotides radioactifs ont permis de proposer une première carte de

restriction du gène.

- Résultats: Le criblage de la banque d'ADN génomique de souris clonée dans le vecteur XDASH II avec un fragment d'ADNc du gène KIN-17, comme spécifié ci-dessus, a permis

d'isoler 11 phages recombinants qui contiennent des frag- ments du gène KIN-17.

L'ADN des 11 phages a été hybridé avec les oligonucléotides de synthèse C, D, E, F, G et H (voir

formule I).

La figure 9 est une autoradiographie d'une membrane contenant des spots d'ADN des phages recombi- nants isolés et montre que l'oligonucléotide radiomarqué C, qui contient l'ATG d'initiation de la phase ouverte de lecture, est reconnu spécifiquement par les phages qui

portent la région 5'.

Dans cette figure, XGX Ctrl est un phage contrôle qui provient de la banque mais qui n'hybride pas avec la sonde 1192; XcKinl7 est un phage dérivé du phage XGTll, qui porte un fragment de 601 nucléotides de l'ADNc KIN17 entre les nucléotides 241 et 842; XDashII est le phage dans lequel a été clonée la banque, mais sans insertion d'ADN génomique de souris; les sondes 3' et 5' sont des fragments d'ADNc KIN-17 représentés à la formule I.

Seuls les ADN des phages XGK9 et XG12 contien-

nent l'extrémité 5' de l'ADNc autour de 1'ATG qui code

pour l'initiation de la synthèse protéique.

Le Tableau I ci-après montre les résultats

d'hybridation obtenus avec ces différents oligonucléo-

tides.

TABLEAU I

ADN DES PHIAGES OLIGONUCLEOTIDES SONDE

OU ADN CONTROLE C O F G H 1192

XGK2 - - - + - +

XGK3. + +

XGK4 - - - ± ±

XGK5

XGK, - - - - + -

XGK, - ++ - -

XGK9 - - + - + _ -

ÀG +XGK10

+ - 4- "- + +=

ÀGK 12 - + - + +

XGKI4 - - - + + - -

X cKin l7 - - + 4- - - + 2O

XGX Clrt.. -

X DashII - - - - -

SONDE3' - - - - - - -

SONDE -5' - - - -

Il ressort de ce Tableau que seulement 2

phages XGK9 et XGK12 s'hybrident avec la totalité des oli-

gonucléotides testés, ils contiennent donc la partie 5' et centrale du gène KIN-17. 7 autres phages, XGK2, 4, 5, 6, 8, 10 et 14 s'hybrident avec les oligonucléotides F et G et contiennent donc tous vraisemblablement la partie centrale du gène. Les 2 phages restants, XGK3 et 7 s'hybrident avec la sonde 1192 mais avec aucun des oligonucléotides testés. Ils semblent donc contenir la partie terminale la plus proche de l'extrémité 3' de

l'ADN génomique (figure 10).

Chaque phage contenant un insert d'environ kb, l'ensemble de ces 11 phages a permis d'isoler

l'ensemble du gène KIN-17.

Les cartes de restriction de ces différents phages et en particulier des phages XGK9 et XGK12 ont été établies après digestion par les enzymes EcoR I, BamH I, et Hind III.

La figure 11 illustre les résultats obtenus.

Organisation intron-exon du gène KIN-17 de souris:

L'amplification en chaîne à l'aide de la poly-

mérase (ACP) sur l'ADN génomique KIN-17 (avec des oligo-

nucléotides qui correspondent à la séquence de l'ADN com-

plémentaire) a donné des informations sur la localisation des exons et des introns. En effet, l'utilisation d'un couple d'oligonucléotides sur l'ADN complémentaire donne

une bande majeure clairement détectable par électro-

phorèse sur gel. La même amplification produirait le même amplimère seulement s'il s'agissait d'une séquence sans

interruption (sans introns). Avec ce type d'analyse ra-

pide (avec le couple d'oligonucléotides E = ACTGCCAAGTT-

CATTGAG et F = TTCTTCTTCTTCAGCCGGGACCTA), on a démontré que le gène KIN-17 ne possède pas d'intron entre les nucléotides 529 et 804 de l'ADN complémentaire (bande de

255 paires de bases, figure 6). Le couple E/F d'oligo-

nucléotides permet donc de détecter (et éventuellement de doser) l'ADN et i'ARN KIN-17 avec une sensibilité accrue

due à i'ACP.

Pour le couple d'oligonucléotides I/J, l'am-

plification de 1'ADNc met en évidence une bande de 200 pb alors que l'amplification de l'ADN génomique avec ces 2 oligonucléotides ne fournit aucune amplification, de même entre les oligonucléotides K/F, on obtient une bande de 486 pb pour l'ADNc alors que l'on amplifie plus pour l'ADN génomique. La figure 5 illustre la structure de

l'ADN génomique obtenu.

C. Détermination de la séauence nucléotidique de l'ADN aénomiaue KIN-17:

Méthode: l'ADN des phages recombinants obte-

nus précédemment est traité avec Prep-A-Gene (BIO-RAD) afin d'éliminer les nucléases et les ARNs. On mélange 1 pmol d'oligonucléotide radiomarqué (selon le protocole indiqué par AMERSHAM) dans un volume de 5 g1 avec 4,5 g1 de tampon de séquence (300 mM Tris-HCl pH = 9 - 50 mM MgC12 - 300 mM KC1) et 1,5 gl d'ADN double brin de lambda, soit l'équivalent de 50 fmol dans un volume de 26 jl et 0,5 Ri de Taq DNA polymérase (5 U/gi) (dsDNA

Cycle Sequencing System - BRL).

Réaction de séquençage 5 min à 95'C, puis 30 cycles suivants: 1 min à 95'C, 2 min à 55'C, 2 min à 70'C [KRISHNAN et al., Nucleic Acids Res., vol. 19,

p. 1153 (1990)].

La réaction est arrêtée avec 5 Rl de solution contenant 95 % de formamide, 10 mM EDTA pH = 8,0 dans

chaque tube. Cette solution contient également des té-

moins de migration comme le Bleu de Bromophénol (0,1 %)

et le Xylène Cyanol (0,1 %).

Migration sur gel de polyacrylamide: on

chauffe les échantillons 5 min à 95'C avant de les dépo-

ser à la surface d'un gel 6 % de polyacrylamide. Les échantillons vont migrer pendant environ 2 h à 60 W dans du tampon TBE. Le gel est séché puis mis en contact avec

des films X-OMAT AR (Kodak) à température ambiante pen-

dant toute une nuit.

La figure 7 illustre la détermination d'une des jonctions intron-exon du gène KIN-17 et montre qu'elle coincide avec la séquence AG/GTAAGT, qui a été

décrite dans la littérature comme une séquence consensus de site d'épissage en 5'.

EXEMPLE 2: Procédé de détection du gène KIN-17 murin et

humain par amplification en chaîne à l'aide de la polymé-

rase. Les oligonucléotides E et F définissent une séquence de 270 nucléotides de l'ADN complémentaire KIN- 17 de souris. Ce fragment permet de mettre en évidence facilement les gènes KIN-17 d'autres espèces. En effet, on utilise les oligonucléotides E et F pour détecter l'ADNc du gène KIN-17 humain par ACP. L'utilisation de ces oligonucléotides dans i'ACP sur des ADNc obtenus après transcription reverse des ARN messagers permet de

déterminer le taux de transcrits de gènes KIN-17.

La figure 8 représente un exemple d'utilisa-

tion des oligonucléotides E et F qui sont les oligo-

nucléotides de la région conservée du gène de souris,

pour détecter le gène KIN-17 humain.

Les oligonucléotides E et F sont localisés dans un exon du gène KIN-17 de souris. Leur utilisation dans un système d'amplification en chaîne à l'aide de la polymérase (ACP), permet donc d'amplifier un fragment d'ADN long de 270 nucléotides à partir d'une matrice d'ADN de souris. En effet, un plasmide qui contient l'ADNc du gène KIN-17 de souris a été utilisé comme matrice pour i'ACP avec le couple d'oligonucléotides

d'amorce E/F.

Après ACP, les produits d'amplification ont été séparés dans un gel d'agarose à 2 %. La présence

d'ADN a été révélée avec le bromure d'éthydium.

L'émission de lumière due au complexe ADN-bro-

mure d'éthydium a été enregistrée comme une photographie du gel de séparation. On détecte une seule bande de 270 nucléotides après ACP sur l'ADN plasmidique (voir figure 8, ligne 6: couple d'oligonucléotides E-F sur une matrice d'ADNc murin). La conservation de la séquence du

gène KIN-17 chez l'Homme a permis aux Inventeurs d'utili-

ser les oligonucléotides E/F pour amplifier un fragment d'ADN de la même longueur, à partir de l'ADNc du gène

KIN-17 humain (voir figure 8, ligne 5: couple d'oligo-

nucléotides E-F sur une matrice d'ADNc humaine).

La même figure montre que l'utilisation d'autres couples d'oligonucléotides dérivés de la séquence de l'ADNc de souris conduit à l'amplification des fragments d'ADN de longueurs différentes après ACP sur de l'ADNc humain ou murin. Cela est probablement dû à une diminution de la spécificité et de la capacité de ces couples d'oligonucléotides pour amorcer la réaction d'ACP

(voir couples I-J et K-F, lignes 1 à 4 de la figure 8).

Les deux dernières lignes de cette figure (7 et 8), mar-

quées par MT (Marqueur de Taille), correspondent aux standards de longueur de fragments d'ADN qui ont permis

de déterminer la longueur de fragments amplifiés par ACP.

Dans la ligne 7: les produits de l'hydrolyse de l'ADN du

phage X par l'enzyme Hind3. Dans la ligne 8: les pro-

duits de l'hydrolyse de l'ADN du plasmide pBR322 par

l'enzyme Hae2.

EXEMPLE 3: Isolement de l'ADNc du gène KIN-17 humain.

Comme l'expression du gène KIN-17 semble affectée dans certaines maladies liées à la réparation de l'ADN, on décide d'isoler l'ADNc et la séquence génomique du gène KIN-17 humain. On crible donc des banques d'ADNc humain faites dans des vecteurs d'expression à l'aide des anticorps dirigés contre des parties conservées de la

protéine kinl7.

1) Fabrication d'anticorps anti-peptides de synthèse:

l'analyse de la structure primaire de la pro-

téine kinl7 de souris a permis de mettre en évidence deux régions particulièrement immunogènes selon la prédiction globale d'antigénicité (Fraga). On a donc commandé la synthèse chimique de deux polypeptides qui sont dans ces régions:

a) le polypeptide D-16-Y (séquence: DEEKTAK-

FIEEQVRR), qui correspond à la région de la protéine kinl7 qui est homologue à la protéine recA d'E. coli et

b) le polypeptide Y-13-K (séquence: QKQCR-

DENGFK), qui se trouve dans un domaine fonctionnel nommé doigt de zinc.

Dans les deux cas, les polypeptides sont cou-

plés à l'ovalbumine d'une façon covalente. L'ovalbumine est une protéine porteuse d'un poids moléculaire de

43 000 daltons (travail effectué à façon dans le labora-

toire privé NEOSYSTEM, Strasbourg). Les complexes pep-

tide-ovalbumine sont injectés à des lapins comme décrit précédemment dans l'exemple 2. Les sera des différents

lapins ont été collectés et testés par ELISA pour véri-

fier la spécificité des immunoglobulines produites par rapport aux polypeptides synthétiques. On vérifie que les sera obtenus reconnaissent la protéine kinl7 native et dénaturée. 2) Criblage d'une banque d'expression d'ADNc humain: a) Etalement de la banque:

des ADNc humains obtenus à partir d'ARNm ex-

primés dans des cellules testiculaires ont été insérés dans le vecteur d'expression Xgtll (titre de la banque: 6.108 pfu/ml). 100 ml de suspension bactérienne et 5 j1

de la suspension de phages recombinants sont incubés pen-

dant 30 min à 37'C. Le mélange est ensuite versé (phages + bactéries) dans 8 ml de LB-AGAROSE à 48'C et déposé dans 5 grandes boîtes de Pétri (diamètre 150 mm). Les boîtes sont incubées à 42'C jusqu'à l'apparition de plages de lyse (environ 4 heures). Les boîtes contiennent respectivement 15 000, 18 000, 22 000, 27 000 et 35 000

plages de lyse. Une membrane de nitrocellulose préalable-

ment imbibée dans une solution d'IPTG 1 mM est déposée sur les boîtes qui sont ensuite incubées à 37C toute la

nuit.

b) Détection immunologique des protéines pha-

giques sur des membranes de nitrocellulose: Les membranes sont rincées 10 min dans 50 ml de TBS avec agitation puis incubées dans une solution à 3 % d'albumine bovine dans du TBS pendant 1 heure. Les membranes sont incubées avec l'anticorps anti-KIN17

(dilué 1/1000 dans du TBS), pendant 1 heure avec agita-

tion. Elles sont ensuite rincées 3 fois pendant 10 min en

TBS-Tween à 0,1 % puis incubées avec un anticorps anti-

IgG de lapin (1/7500) pendant 30 min avec agitation. 3 rinçages de 10 min sont effectués avec du TBS contenant 0,1 % de Tween. Finalement, la détection des complexes

formés entre l'antigène et les deux anticorps est réali-

sée avec le substrat BCIP/NBT comme décrit dans l'exemple 3. c) Isolement de trois phages recombinants et

détermination de leur séquence nucléotidique.

EXEMPLE 4: Préparation purifiée de protéine kinl7 de souris. Surproduction de protéines: La préparation du plasmide qui contient l'ADNc du gène kinl7 et l'obtention de la souche d'E. coli qui surproduit la protéine kinl7 de souris sont décrites dans l'article de J. F. ANGULO et al. (Nucleic Acids Research,

1991, vol. 19, pages 5117-5123) et sont rappelées ci-

dessous.

Les bactéries qui portent le plasmide sont

cultivées en milieu liquide LB (MANIATIS et al., 1982).

Lorsque les cellules sont en phase de crois-

sance exponentielle à une DO de 0,6 unité à 600 nm, on ajoute de 1'IPTG à une concentration finale de 1 mM (système de clonage décrit par STUDIER et al., Methods

Enzymol., 1990, 185, 60-69). Après trois heures, les bac-

téries sont récupérées par centrifugation et lysées en présence d'urée et de Triton X-100. L'extrait total des

protéines bactériennes est déposé sur une colonne d'hépa-

rine-AcA (IBF, France) suivant un protocole inspiré de l'article de DESCOMBES et ai. (Genes and Development, 1990, 4, 1545-1551). Une fraction riche en protéine kinI7 est éluée de la colonne avec un tampon d'une force

ionique égale à 0.55 M NaCl.

- Chromatographie de la protéine kinl7 sur une colonne d'hydroxylapatite: Les réglages de l'appareil ont été effectués en suivant les indications du constructeur (système econo

column de BIORAD). On utilise une cartouche d'hydroxyla-

patite (BIORAD) avec un volume mort de 2,2 ml et un vo-

lume total de 5,2 ml. Les protéines sont détectées par

* leur absorption en UV à 280 nm. La séparation par chroma-

tographie d'affinité a été réalisée avec une augmentation de la concentration du tampon phosphate 10 mM pH 6,8; 10 % glycérol, 1 mM beta-Mercapto-éthanol; 0,001 % thymérosal comme tampon de départ contenu dans la cellule A, à un tampon phosphate 1500 mM pH 6,8: 10 % glycérol, 1 mM beta-Mercapto-éthanol; 0,001 % thymérosal comme tampon concentré, contenu dans la cellule B. On obtient 5 pics (numérotés de 1 à 5 sur la figure 2), qui ont été analysés par électrophorèse en gel dénaturant (LAEMMLI E.K., 1970, Nature, 227, 680- 685) et par immunodétection sur membrane de nitrocellulose

(TOWBIN H. and GORDON J., 1984, PNAS, 76, 4350-4354).

Seules les protéines de la fraction 5 ont révélé une bande majeure avec un poids moléculaire apparent de

43 000 daltons qui est reconnue par les anticorps anti-

protéine kinl7.

EXEMPLE 5: Obtention d'anticorps anti-protéine kinl7 de

souris.

Les protéines de la fraction riche en protéine

kinl7 obtenues par chromatographie sur une colonne d'hy-

droxylapatite (exemple 4) sont ensuite soumises à une

séparation électrophorétique sur un gel 11 % de poly-

acrylamide selon les protocoles décrits par LAEMMLI

(LAEMMLI U.K., 1970, Nature, 227, 680-685).

Protocole de séparation de la protéine kinl7 par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 11 %: Mélanger 200 1 d'une solution qui contient

400 gg de protéines avec le même volume du tampon d'é-

chantillon deux fois concentré. Laisser 10 minutes à 0lOC pour dénaturer les protéines. Déposer 400 g1 de la solution de protéines ainsi traitées (contenant 400 gg)

sur le gel. Brancher les électrodes au générateur et ap-

pliquer un voltage constant de 200 V. Arrêter la migra-

tion quand le bleu de bromophénol a atteint l'extrémité du gel. Les protéines du gel sont ensuite visualisées par une coloration in situ avec le chlorure de cuivre (LANE D., 1988). La bande majeure qui correspond à la protéine

kinl7 est excisée du gel de polyacrylamide et complète-

ment désagrégée. Les particules fines qui résultent de la désagrégation mécanique du gel sont émulsionnées avec

l'adjuvant de Freund (proportion volume/volume). L'émul-

sion d'antigène ainsi obtenue est utilisée pour immuniser les lapins. 50 Fg de la protéine kinl7 émulsionnée ont été injectés, dans les coussinets plantaires, à deux lapins mâles blancs de Nouvelle-Zélande, âgés de six mois. Pour la première injection, l'émulsion est réalisée

avec de l'adjuvant de Freund complet. Les injections pos-

térieures ont été réalisées tous les 15 jours avec 50 Fg de la protéine kinl7 émulsionnée avec l'adjuvant de

Freund incomplet. Après la troisième injection, des pré-

lèvements de sang sont utilisés pour obtenir le sérum. Ce sérum est capable de détecter la protéine kinl7 dans un mélange complexe de protéines déposées sur un filtre de

nitrocellulose.

EXEMPLE 6: Procédé de détection immunologique des pro-

téines kinl7 de souris et humaine.

Le protocole de séparation de la protéine

kinl7 par électrophorèse décrit dans l'exemple 5 est ap-

pliqué à des extraits protéiques de cellules de mammi-

fères (de souris ou humaines). Les protéines, séparées en

fonction de leur poids moléculaire, sont ensuite transfé-

rées sur une membrane de nitrocellulose grâce à l'action d'un champ électrique. La membrane de nitrocellulose

ainsi obtenue est incubée avec une solution 3 % d'albu-

mine bovine dans du tampon TBS (150 mM NaCl, 50 mM TrisCl pH 7,5), pendant 1 heure à 21'C puis avec le sérum total anti-protéine kinl7 (dilué 1 000 fois dans du tampon TBS). Après une incubation de 1 heure, la membrane est lavée trois fois pendant 5 minutes avec le tampon TBS. La membrane est finalement incubée 60 minutes avec un anticorps anti-IgG de lapin conjugué à la phosphatase

alcaline (Promega, COGER) dilué 7 500 fois avec du TBS.

La membrane est lavée trois fois avec le tampon TBS puis l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline est mise en évidence grâce aux substrats: bromochloroindolyl

phosphate et nitro blue tétrazolium (BCIP/NBT). En ré-

sumé, l'apparition d'une bande bleue indique la présence

de la protéine recherchée. L'identité de la bande détec-

tée est établie par des expériences de compétition avec

la protéine kinl7 pure.

La figure 3 illustre la détection de la pro-

téine kinl7 dans des extraits cellulaires de souris et la compétition avec la préparation purifiée de la protéine

kinl7.

La figure 3A: des extraits protéiques totaux des cellules de E. coli qui produisent la protéine kinl7 et des extraits totaux de la lignée cellulaire de souris

AtT-20 ont été analysés avec le procédé de détection dé-

crit précédemment. Des quantités croissantes de chaque extrait ont été déposées sur les gels. En parallèle, des protéines colorées (PC) de poids moléculaires connus ont été déposées et ont permis de faire une estimation du poids moléculaire apparent des bandes détectées avec

l'anticorps anti-kinl7.

La figure 3B: compétition avec la protéine kinl7. EXEMPLE 7: Liaison préférentielle de la protéine kinl7

aux structures courbées de l'ADN.

1) La protéine kinl7 interagit avec l'ADN d'une façon spéciale. Elle reconnaît spécifiquement la structure de l'ADN courbé. Une courbure particulière de l'ADN peut être produite par des lésions importantes de l'ADN qui induisent la recombinaison génétique et la

réparation du matériel génétique. L'expression de la pro-

téine kinl7 doit donc être modifiée dans des cellules déficientes pour une des voies de réparation de l'ADN. On a testé la concentration relative de la protéine kinl7 dans les extraits protéiques de cultures primaires de fibroblastes de patients atteints de Trichothiodystrophie

(TTD) ou de Xeroderma pigmentosum (X.p.). Ces deux mala-

dies génétiques sont dues à des défauts dans la répara-

tion de l'ADN. On a observé que le taux de protéine kinl7 dans les fibroblastes de plusieurs malades est au moins 5 fois inférieur au taux de protéine kinl7 détecté dans les

fibroblastes normaux.

La figure 4 illustre la détection de la pro-

téine kinl7 dans des cultures primaires de fibroblastes

normaux et de patients X.p. et TTD: DI = détection immu-

nologique de la protéine kinl7; PT = coloration de pro-

téines présentes sur la membrane avec le rouge ponceau;

MPC = marqueurs de poids moléculaires précolorés.

2) Pour caractériser les propriétés de liaison

à l'ADN de la protéine kinl7, dont la structure est rap-

pelée à la figure 12, l'affinité de cette protéine vis-à-

vis d'ADN simple-brin et double-brin a été testée.

Comme le montre la figure 13, la protéine

kinl7 se lie à la fois aux simple-brins et aux double-

brins avec la même efficacité.

La figure 15 montre l'affinité particulière de la protéine kinl7 pour l'ADN courbé présent dans le plas- mide pBR322, plus particulièrement en présence de zinc

(figure 14).

La protéine kinl7 se lie préférentiellement à une région située dans le fragment Pst I-Hind III de 777 pb (figure 15A). Ce fragment inclut la région C8 de haute courbure (figure 15B).

La protéine kinl7 constitue un excellent mar-

queur d'une déficience de la capacité d'une cellule à

réparer sur ADN.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède,

l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien-

nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar-15 ter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims (2)

REVENDICATIONS 1') Préparation purifiée de la protéine kinl7 de souris, caractérisée en ce qu'elle présente un "doigt de zinc" capable de fixer les ions Zn++ réactifs, en ce qu'elle est capable de reconnaître l'ADN simple- ou double-brin et notamment les régions courbées de l'ADN double-brin, en ce qu'elle présente un poids moléculaire apparent de 43 000 daltons, et en ce qu'elle est reconnue aussi bien par les anticorps anti-protéine kinl7 que par les anticorps anti-protéine recA d'Escherichia coli. 2') Préparation purifiée de la protéine kinl7 selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle com- prend un certain nombre de fragments peptidiques aptes à être utilisés comme réactifs de détection de la protéine kinl7. 3") Fragment peptidique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de 15 aminoacides (peptide D-16-Y), de séquence: Asp- Glu-Glu-Lys-Thr-Ala-Lys-Phe-Ile-Glu-Glu-Gln-Val-Arg-Arg, qui correspond à la région de la protéine kinl7, homo- logue à la protéine recA d'E. coli. 4") Fragment peptidique de la protéine puri- fiée kinl7 selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de 11 aminoacides (peptide Y-13-K), de séquence: Gln-Lys-Gln-Cys-Arg-Asp- Glu-Asn-Gly-Phe-Lys, qui se trouve dans le domaine fonc- tionnel dénommé doigt de zinc. ') Anticorps anti-protéine kinl7, caractéri- sés en ce qu'il sont obtenus par immunisation de mammi- fères et notamment de lapins avec une suspension antigé- nique constituée par la préparation purifiée de protéine kinl7 selon la revendication 1.
1. 6 ) Anticorps anti-protéine kin17, caractéri-

   sés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps anti-

   fragments peptidiques selon l'une quelconque des revendi-

   cations 2, 3 ou 4.

   7') Anticorps selon la revendication 6, carac-

   térisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps polyclonaux.

   8') Anticorps selon la revendication 6, carac-

   térisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps monoclonaux spécifiques de chacun des peptides selon la

   revendication 2 ou la revendication 3.

   9') Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence d'ADN génomique KIN17 murin, en ce qu'elle possède au moins deux introns, dont l'un se situe au niveau du nucléotide 137 et l'autre entre les nucléotides 339 et 429 de l'ADNc murin codant pour la protéine kinl7, comprenant 1414 paires de bases et de formule I suivante: / / / / <- (CtD UT H H Uln o 1n o r o O ('D', 01,l,,1, H*ca (Il I0 oCu(i'i.A\thi'('ATiW(i{HACCn Il<o S m; AI 1 ili /.AI(l 610 IALd GA( ('DCri A;-ATAAGCcGcuACliGA(tAA TtGCT I iAAGTii(( A;I.l A It,ip.,AIC ICA, ILAAA(OA;AA.: I ii IGC ICiiL ICAAAAACCL ICAG,.A i i TA I h TAiITCAA iuAAI 1 ('D Ciuo I -Itl %0rJe Jllo} 210 2'JU "10 330.0 t-hCo'"' 0 ('1 O -rt C',AAA I iAC r T1Tú IT'IAACI TCTlA CúCGAT',:I I iAG(.AC T IAAAA.GitlLCA{AACAACAT T i IC IACAA 6AA[A['A ICA{X:CACCGAGAGt)'ATATC(cACAI LUAACGIc i ALLCACiT G" FI--. 01ni D GAC I TGAAGAC1 CC( I GCiAA oIUti K crr H {-,..i/, 3i0 4I. 130 450 410/O CD LQ CAGACAC T1ACCGAC T I TACCAAGI GGCT GCAGAGAGG3C1 IG TGIAAAI LGGAIGAtACACCGAAAGC 1GGITACAT CAGTACA AOACAOAGACCCAGAAA(CCATCCd. i uiAA H 0 Oligo J%(:A('C(ATIGIAA{TCATúIATCITG fi) I--,b/ ('D' CaH- jn T lu t *10 i (St ' 1/5*) CD H. CI A TlAA A AA II M ATC.AîO1AT,,A I: IiAAAAAAA I CCCAM AA1. IVA1 TATAG CA iTA A AtATiC.1 IAAAiCIA. tG:AhA A, A, ' AAA ACACCl I[ I IAiA A H P oliqo E (D 0 ç-Htp t b lict.; uF ITCTFCT(C:iÀA T Lig bG /|i O1 : (..o CD pit stt tA;(: I l A.i.C T...A.C AGAAAAI tAG5AAIAAARAt T TAi'tiT 1 ACAA I CA TAATAAA CAtT 0C 1TCG lAt.TCACGGAuTACCI Ar AAAA ICCAAtClCAAtC T.TT TGiOAAT CAAtT, CAl T.AA., Gl (DD, ót2; II--'-Zi 7j dOtt jyt!t Iû 1i Oliî1 FITcTTICTTATIcC(rI A1ACCTAOligo G rt G tC.:A C1CTC GGACAGACGCCATG r ACA G AG AG G C Ai C AG I rG TlACGATAAr T CA I AAGaGAAGcT TGGGGAC 1G A A ATGGAC TCAC A GA GAAiAAGG 1 A T CAAti G AA G I iAT 1 GA CAGli A AC AC 1 AGI i-j 'j/O 'i50 1010 IOJû) 1050 TO/OL O Ca* G IGGIAAA1A TG1AC IGACTICTGGAG)ACAGGCTGAAAC)TGGACChL AC ICAI T TAGAGIAcAGTcATTccGaCcCcGGaGAAAAGiiGTTCTAG)TTI TiAAATuGIAủCIACAGAGGOAA. AIGAA (D\ CD C 100 ((T ((9 10i50 11u0 uo0L D -b 1210 1230 150 121/0 1290 1310 hN Gr rA- [AAAA, T GAAAACAACACAT GAAAC A CG AAûCATCAAAAT GGTGT TAGCCAAGGCAC L TGTAACTCTAC IG A TAGGGGA T ICi TGT T T ITGAT TAAAAAAAAAAAAA I CA TC

   1330 1350 110 (390 1410

   (D FIAT,TTAAATAI T CCGiGAA CAAGT i GGG A IA CAAG A TAAAAA AAA CG AtI biI T A AI A AAA A AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA '/ArA;AI'.1AAAAAC:CAlI tAIT' (7 Oligo B 11') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide B, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule B suivante:

   AGGCGGAAAGAACCAGGGGATCCC

   12') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide C, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule C suivante:

   GCGAGTCCCAGCGGTACC

   13') Oligonucléotide selon la revendication 10, dénommé oligonucléotide D, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule D suivante:

   GACCTTGAAGACTCCGCTGCGAA

   14') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide E, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule E suivante:

   ACTGCCAAGTTCATTGAG

   ') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide F, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule F suivante:

   TTCTTCTTCTTCAGCCGGGACCTA

   16') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide G, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule G suivante:

   TCGAAGAGGAAAAGAAAAGGACCG

   17') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide I, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule I suivante:

   CTGGAACTTCTGAGGCGACGCTT

   18') Oligonucléotide selon la revendication 10, dénommé oligonucléotide J, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule J suivante:

   CCGACCATGTAAGTCATCTATCTG

   19') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide K, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule K suivante:

   CATCAGCCACCGAGAGCACATC.

   ') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide L, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule L suivante:

   AGCTGCTGCAGCAGCTTATCG.

   21') Oligonucléotide selon la revendication , dénommé oligonucléotide S, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule S suivante:

   AGCCCCAAGGCCATCGCCAA.

   22') Paire d'amorces pour la synthèse et/ou la

   détection de l'ADN génomique ou d'un produit de trans-

   cription du gène KIN17, caractérisée en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence

   nucléotidique selon l'une quelconque des revendications

   à 21.

   23') Paire d'amorces selon la revendication

   22, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un oli-

   gonucléotide de formule E apparié avec un oligonucléotide de formule F. 24') Paire d'amorces selon la revendication

   22, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un oli-

   gonucléotide de formule I apparié avec un oligonucléotide de formule J. ') Paire d'amorces selon la revendication

   22, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un oli-

   gonucléotide de formule K apparié avec un oligonucléotide de formule J. 26') Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un

   fragment de séquence selon l'une quelconque des re-

   vendications 10 à 21, éventuellement marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme

   appropriée ou un fluorochrome.

   27') Séquence de l'ADNc humain caractérisée en ce qu'elle code pour la protéine kinl7 et comprend 2400

   paires de bases.

   28') Plasmide contenant l'ADNc du gène KIN17 humain, caractérisé en ce qu'il est dénommé XLpHK17 et a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM sous le

   n' 1-1316 en date du 08 juin 1993.
2. 29 ) Réactif utilisable pour la détection, le diagnostic et le suivi de remaniements chromosomiques

   chez un mammifère, après exposition à un agent géno-

   toxique, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le

   groupe constitué par les réactifs immunologiques sélec-

   tionnés parmi la préparation de protéine kinl7 purifiée selon la revendication 1, les fragments peptidiques selon

   l'une quelconque des revendications 2 à 4, les anticorps

   anti-peptides et les anticorps anti-protéine kinl7 puri-

   fiée, selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 et

   les réactifs nucléotidiques sélectionnés parmi les sé-

   quences d'ADN génomique murin codant pour la protéine kinl7 ou leurs fragments et les séquences d'ADNc humain codant pour la protéine kinl7 ou leurs fragments selon

   l'une quelconque des revendications 9 à 27.

   ') Procédé de dépistage de remaniements chromosomiques chez les mammifères, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une cellule humaine (lymphocytes notamment) appropriée avec un réactif selon la revendication 29, apte à détecter la présence d'une protéine, dont la production est induite par un toxique

   génétique.

   31') Procédé de dépistage selon la revendica-

   tion 30, caractérisé en ce que l'on détecte la protéine kinl7 produite par une cellule appropriée, en mettant en

   présence ladite cellule avec un réactif immunologique sé-

   lectionné parmi les réactifs du groupe qui comprend la préparation de protéine kinl7 purifiée, les fragments

   peptidiques de ladite préparation, les anticorps anti- peptides et les anticorps anti-protéine kinl7 purifiée, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.35 32') Procédé selon la revendication 31, carac-

   térisé en ce que le réactif immunologique est fixé sur un

   support solide approprié.

   33') Procédé selon la revendication 31, carac-

   térisé en ce que l'on détecte l'ADN génomique, les ARN messagers et/ou les produits de transcription du gène

   KIN17,

   (1) en mettant en contact l'échantillon biolo-

   gique à analyser, traité pour extraire l'acide nucléique recherché avec une paire d'amorces selon l'une quelconque

   des revendications 18 ou 19, pour amplifier au moins un

   fragment dudit ADN ou ARN,

   (2) après quoi, la séquence d'ADN ou d'ARN am-

   plifiée est détectée par au moins une sonde nucléotidique

   selon la revendication 26.

   34') Procédé de détection d'une modification chromosomique, caractérisé en ce qu'il comprend: (1) l'extraction de l'ADN ou de l'ARN à partir de cellules appropriées, (2) leur mise en contact avec une protéine kinl7, (3) la quantification de l'ARNm KIN17, (4) la détermination du rapport concentration

   ARNm KIN17/ADN total.

   ') Kit de détection d'une modification chro-

   mosomique chez l'Homme, caractérisé en ce qu'il comprend, outre les réactifs usuels, des anticorps anti-protéine

   kinl7 de souris selon l'une quelconque des revendications

   à 8, pour l'immunodétection rapide et sensible de la protéine kinl7 dans des extraits totaux de cellules

   humaines par Western blot ou par immunofluorescence.

   36') Kit de détection de la protéine kinl7 par la méthode ELISA ou RIA, caractérisé en ce qu'il

   comprend, outre les réactifs usuels, des anticorps anti-

   protéine kin17 de souris selon la revendication 5 et un

   couple d'anticorps selon la revendication 6, dirigés cha-

   cun contre un peptide choisi parmi les peptides selon

   l'une quelconque des revendications 2 à 4.