JPH09500266A

JPH09500266A - ヘリコバクター・ピロリのヘマグルチニン／プロテアーゼタンパク質、それをコードする核酸およびそれに対する特異的抗体

Info

Publication number: JPH09500266A
Application number: JP7503354A
Authority: JP
Inventors: スミス，アンドリュー・ウィリアム
Original assignee: レキット・アンド・コールマン・プロダクツ・リミテッド
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-29
Publication date: 1997-01-14
Also published as: CA2166401A1; AU7005794A; WO1995001445A1; US5837502A; ZA944731B; GB9313437D0; BR9406875A; EP0708832A1

Abstract

(57)【要約】ヘリコバクター・ピロリのヘマグルチニン／プロテアーゼタンパク質、それをコードする核酸およびそれに対する特異的抗体、そして特にヘリコバクター・ピロリの同定およびヘリコバクター・ピロリ感染の診断におけるその用途。ヘリコバクター・ピロリ感染の同定および診断用キットも記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクター・ピロリのヘマグルチニン／プロテアーゼタンパク質、それをコードする核酸およびそれに対する特異的抗体本発明はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloriまたはH.pylori)のヘマグルチニン／プロテアーゼタンパク質、それをコードする核酸およびそれに対する特異的抗体、そして特にヘリコバクター・ピロリの同定およびヘリコバクター・ピロリ感染の診断におけるその用途に関する。ヘリコバクター・ピロリ[正式にはカンピロバクター・ピロリジス（Campyloba cter pyloridisまたはC.pylori]は、胃の粘膜層の下に生存すると思われる螺旋形状のグラム陰性微生物である。１９８２年のその最初の単離以来、ヘリコバクター・ピロリは、胃および十二指腸のガン性疾患および胃ガンと関連があるとみなされている。ヘリコバクター・ピロリはヒトの最も慢性の感染因子であることが開示されている。技術の現状における評論としては、C.A.M.マクナルティの「 J.Infection」,１９８６年,１３,１０７−１１３；C.S.グッドウィンらの「J.Cl in.Pathol.」,１９８６年,３９,３５３−３６５；およびユーロガスト研究グループの「Lancet」,１９９３年,３４１,１３５９−１３６２が挙げられる。ヘリコバクター・ピロリの疾患を引き起こす能力に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子の数は知られておらず、ヘリコバクター・ピロリのウイルレンス（毒力）決定素は、これまでに同定されていない。この微生物がもつ決定素の幾つかが、病原因子の可能性があるものとして提案されている。たとえば、この微生物は、腸の上皮細胞に至る経路において通常は細菌に対する障壁となる腸の粘膜層などの高粘度の液体中を、複数の鞭毛の働きによってすばやく螺旋状運動をすることができる。また、ヘリコバクター・ピロリは、そのムチナーゼ消化酵素産生能力によって胃の中で拡散することができる。顕微鏡を用いたヘリコバクター・ピロリ感染患者の胃の生検から、ヘリコバクター・ピロリが胃の上皮細胞上の特定の部位に存在する生物であることが示されている。生化学的研究においては、ヘリコバクター・ピロリをそれらの部位に付着せしめるヘマグルチニンの同定が報告されている。細胞外酵素であるメタロプロテアーゼは、哺乳動物に疾患を引き起こす、細菌がもつ普通の微生物病原因子である。亜鉛メタロプロテアーゼは急速な基質回転率および広範な基質プロファイルをもつことが知られている。技術の現状における評論としては、フラウスト・ダ・シルバ,J.J.R.およびウィリアムズ,R.J.P.の「ザ・バイオロジカル・ケミストリー・オブ・ジ・エレメンツ」,１９９３年,クレアンドン・プレス,オクスフォード,チャプター１１；およびバリー,B.L.およびオールド,D.S.の「バイオケミストリー」,２９,５６４７−５６５９が挙げられる。シュードモナス・アエルギノーサの亜鉛メタロプロテアーゼ(これはエラスターゼとして公知である)は、嚢胞性繊維症の患者において該微生物によって引き起こされる肺組織破壊プロセスにおいて重要であることが示されている（ビバー ,R.A.およびイグリュースキー,B.H.の「J.Bacteriol.」,１９８８年,１７０,４３０９−４３１４）。同様に、ビブリオ・コレラエの亜鉛メタロプロテアーゼ（ムチナーゼまたはヘマグルチニン／プロテアーゼ（ＨＡＰ）として公知である）は、コレラ感染中のこれらの微生物の付着および脱離において重要であることが示されている。技術の現状における文献としては、ハース,C.C.およびフィンケルシュタイン,R.A.の「J.Bacteriol.」,１９９１年,１７３,３３１１−３３１７；およびフィンケルシュタインらの「Infect.Immunol.」,１９９２年,６０,４７２−４７８が挙げられる。ところで、我々は驚くべきことに、ビブリオ・コレラエhap遺伝子とほとんど等しいウイルレンス遺伝子（ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子と命名した）がヘリコバクター・ピロリのゲノムに存在することを発見した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または他のハイブリダイゼーション法による該ヘリコバクター・ピロリhap核酸配列の検出、抗体検出法によるヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質のエピトープの検出、またはＥＬＩＳＡなどによる該ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質に対する抗体の検出は、ヘリコバクター・ピロリが媒介する哺乳動物の胃および十二指腸の疾患の診断において有用性をもつ。ヘリコバクター・ピロリが媒介する胃の疾患の診断に関する先行技術には、ヘリコバクター・ピロリＲＮＡとハイブリッド形成しうるカンピロバクターＤＮＡプローブが包含される（ＥＰ−Ａ−０３５０２０５）。ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ遺伝子配列に特異的なヘリコバクター・ピロリオリゴヌクレオチドが、ＷＯ９１／０９０４９に開示されている。血清イムノアッセイによるヘリコバクター・ピロリ感染の血清学的検出および診断、ならびにヘリコバクター・ピロリ抗原および抗原フラグメントの検出が、ＷＯ８９／０８８４３、ＷＯ８９／０９４９７およびＥＰ−Ａ−０３２９５７０に開示されている。胃炎、胃潰瘍または消化性潰瘍あるいは胃ガンの早期診断手段として、ヘリコバクター・ピロリのＤＮＡ、ＲＮＡまたはヘリコバクター・ピロリの特定のタンパク質に対する抗体、あるいは患者由来の臨床サンプル中（胃粘膜、唾液、排泄物、血漿または血清中など）のヘリコバクター・ピロリタンパク質自体を検出する確実な手段をもつことが強く求められている。したがって、本発明は、図１の核酸配列の全部または一部からなる、ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列を提供する。本発明のヘリコバクター・ピロリhap遺伝子の配列決定によってヘリコバクター・ピロリに対して特異的な選択されたオリゴヌクレオチドまたはタンパク質のエピトープ配列を構築する可能性が生じる。配列決定されたヘリコバクター・ピロリhap遺伝子は、コード領域においてビブリオ・コレラエhap遺伝子と９９％以上同じであることがわかっている。１ｋｂのコード配列および約５００ｂｐの３'フランキング配列を示すクローン化された１.５ｋｂのヘリコバクター・ピロリhap遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を図１に示す。該核酸配列はヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の少なくともひとつの抗原決定基をコードするのが好ましい。該核酸配列は図１の１番から９３６番の塩基配列を含むのが好ましい。また本発明は、上記ヘリコバクター・ピロリhap の核酸配列と相補的な核酸配列をも提供する。該核酸配列には、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡまたは組換えＤＮＡあるいはＲＮＡが含まれる。該核酸配列は、図１に示す核酸配列の一部に対して特異的結合親和性をもつ１５番〜５０番のヌクレオチド、好ましくは１８番〜５０番のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドあるいはそれに対する相補的核酸配列をもつ。該オリゴヌクレオチドは１５番〜３０番のヌクレオチド、好ましくは１５番〜２５番のヌクレオチドであってもよい。該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５またはそれ以上のヌクレオチド配列からなり、図１に示す１６番〜１８番、２２０番〜２２２番または４３番〜４５番のヌクレオチドを包含するのが好ましい。好ましいオリゴヌクレオチド配列は、以下の配列のいずれかである。該オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ配列も含む。本発明の範囲内のオリゴヌクレオチドは一本鎖および二本鎖の両方を包含するが、どのようなハイブリッド形成操作においても、このような二本鎖プローブは変性して一本鎖プローブとなることが必要であることが理解されよう。さらに本発明は、前記核酸配列のいずれかを含むベクターを提供する。本発明は、ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９などのクローニングベクターならびにｐＡＳＫ６０−Ｓtrepなどの発現ベクターを含む公知のいずれかのベクター系を用いることを特に企図している。さらに本発明は、ひとつまたはそれ以上のこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。また本発明は、該ＤＮＡ配列を含むひとつまたはそれ以上のベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、該培養物から該ＤＮＡ配列を単離することを特徴とする前記ＤＮＡ配列の生産方法を提供する。このような方法は当業者には公知の条件および操作にしたがって行われる。さらに本発明は、図１のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントを提供する。ＨＡＰタンパク質のフラグメントが、ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の抗原決定基であるのが好ましい。ＨＡＰタンパク質のフラグメントが、図１の１番〜９３６番の塩基の配列によってコードされるのが好ましい。本発明の範囲内のヘリコバクター・ピロリタンパク質またはそのフラグメントには、ヘリコバクター・ピロリから精製されるかまたは組換えタンパク質として、大腸菌またはバシラス・サブチリス内で産生された、ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質自体が包含されるが、胃粘膜または胃腸管の他の分泌物または産物中のヘリコバクター・ピロリタンパク質の検出などの次に続く診断操作も本発明の範囲であることが理解されよう。また本発明は、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、該培養物から該タンパク質またはそのフラグメントタンパク質を単離することを特徴とする前記ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの生産方法をも提供する。本発明では、定義された核酸配列には、同一の核酸配列のみならず、特に、類似コドンが得られるような塩基の置換などの、天然の核酸配列から幾らかの少数の塩基を変更したものも含まれることが理解されよう（異なるコドンが同一のアミノ酸を特定する）。さらに、定義されたタンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸配列には、同一のアミノ酸配列のみならず、特に、保守的アミノ酸置換などの天然のアミノ酸配列から少数のアミノ酸を変更したものも含まれる（アミノ酸による置換はその側鎖に関したものである）。天然のアミノ酸から変化したものであるが、天然の配列でコードされるポリペプチドと免疫学的に同一であるポリペプチドが得られるようなアミノ酸配列も本発明に包含される。これには、対応して変更されたコード核酸配列が包含される。本発明はまた、ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの抗原決定基を認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本発明のヘリコバクター・ピロリ特異的抗体には、ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の両方が含まれるが、胃粘膜または胃腸管の他の分泌物または産物中のヘリコバクター・ピロリの検出などの次に続く診断操作も本発明の範囲であることが理解されよう。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は当業界では公知の標準的方法で生産されるが、たとえば、クーラー,F.およびミルスタイン,C.の（１９７５年）「 Nature」,２５６,４９５〜４９７に開示されている技術によってモノクローナル抗体を生産する。本発明にしたがって、特異的ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質は、実験動物において該ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質に対する抗体を作るのに有用であり、これらの特異的抗ヘリコバクター・ピロリＨＡＰ抗体は、患者からの臨床サンプル中のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の検出に有用である。該ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンバク質はＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析において有用であり、ヘリコバクター・ピロリから精製するかまたは組換えＤＮＡ技術によって生産することができ、このための技術はよく知られており、十分に当業者の能力の範囲内である。さらに本発明は、ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を生産することができるハイブリドーマを提供する。さらに本発明は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または転写補助増幅システム（ＴＡＳ）などの当業界で公知の等価の技術によって前記核酸配列を増幅する方法を提供する。好ましくは、下記のオリゴヌクレオチド対を用いてＰＣＲ法を行う。さらに本発明は、図１の核酸配列またはその一部を含む核酸プローブを提供する。また本発明は、当業界で公知の適当な条件下で被検サンプルを前記核酸プローブと接触させ、ヘリコバクター・ピロリ核酸配列（単数または複数）と該プローブとのハイブリッド形成を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法を提供する。特定のプローブまたはプローブ対の選択は、当業界で公知の多数の因子に依存するが、特に緊縮要求（すなわち、標的ＤＮＡにおいて相補配列との不適当な組み合わせを寛容に扱うような能力あるいはそのためのプローブ）が選択の基準となる。明らかに、長いプローブほど標的ＤＮＡに対するプローブのハイブリッド形成に影響を及ぼすことなく局所的不適合に抵抗する能力が優れている。プローブの選択に影響を及ぼす因子はよく認識されており、十分に当業者の能力の範囲内である。さらに本発明は、被検サンプル中において、ＰＣＲまたは等価の技術により図１のヘリコバクター・ピロリ核酸配列を増幅させ、増幅された核酸配列を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法を提供する。ＰＣＲ増幅が、本発明のヘリコバクター・ピロリ特異的ヌクレオチドを用いるヘリコバクター・ピロリ検出の好ましい方法であるが、他の検出操作も使用でき、それらは当業界で公知である。このために、放射標識、蛍光標識または酵素標識などの種々の異なる標識をした本発明のヘリコバクター・ピロリ特異的オリゴヌクレオチドまたは核酸プローブが提供されるが、すべてが、研究中の未同定の核酸サンプルと結合してハイブリッド形成したヌクレオチドのいずれの検出をも可能にする。さらに本発明は、被検サンプルを本発明抗体と接触させ、抗体−抗原複合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の抗原決定基の同定方法を提供する。また同じく本発明は、被検サンプルを前記ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントに接触させ、抗原−抗体複合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ感染の同定方法も提供する。被検サンプルは通常、歯垢、唾液、胃液または排泄物を用いるが、あるいは胃粘膜サンプルを用いてもよい。本発明のヘリコバクター・ピロリ核酸配列について前に記載したように、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質および抗体についても、蛍光、放射または酵素標識などの種々の異なる標識をすることができ、それらはすべて、それぞれ研究中の抗体またはアミノ酸サンプルに対して、該アミノ酸配列または抗体を検出可能にする。ヘリコバクター・ピロリＨＡＰ抗原（ＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント）またはビブリオ・コレラエＨＡＰ抗原は、交差反応性抗体をもつ患者を検出するためのイムノアッセイに用いることができる。逆に、抗体を用いて、交差反応性のヘリコバクター・ピロリＨＡＰ抗原をもつ患者を検出するためのイムノアッセイを行うことができる。このように、ヘリコバクター・ピロリ感染に関連する胃および十二指腸疾患との相関性を作ることができる。本発明によって企図されたイムノアッセイは、公知の診断法を含む。該イムノアッセイは、直接抗原− 抗体反応、競合、シングルまたはダブルサンドイッチアッセイなどに基づいて行ってよく、ビオチンおよびアビジンを利用する方法などの増幅システムを包含することができる。該アッセイは、免疫診断プレートまたはガラスビーズなどの固相担体に付着された構成要素を含んでよく、免疫沈降を含むこともできる。イムノアッセイは通常、標識抗体／抗原の使用を含み、該標識は蛍光標識、化学発光標識、放射標識または着色分子による標識であってよい。さらに本発明は、ヘリコバクター・ピロリhap核酸もしくはＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントを用いて製造したヘリコバクター・ピロリに関連する胃疾患の診断用の材料およびキット提供する。したがって、本発明は、１種またはそれ以上の、図１の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；図１のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント；あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント；もしくはヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を特徴とするキットを提供する。さらに本発明は、少なくともひとつの前記オリゴヌクレオチド対を特徴とするポリメラーゼ鎖反応または同様な技術を用いるヘリコバクター・ピロリの同定用キットを提供する。本発明キットは適当に標識された試薬、緩衝液などの付加的試薬および材料、アッセイの結果の検出手段およびアッセイ器具を包含する。該キットの構成要素は適当なキット容器にパッケージングしてもよい。また本発明は、図１の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；図１のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント；あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント；もしくはヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いたヘリコバクター・ピロリ感染の診断法も提供する。したがって、本発明は、本発明のヘリコバクター・ピロリhap核酸配列またはそのフラグメントあるいはタンパク質配列またはそのフラグメントもしくはヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質に対する抗体を用いた、ヘリコバクター・ピロリに関連する胃の疾患の診断用キットまたは他の材料の製造を包含する。ヘリコバクター・ピロリhap核酸配列またはそのフラグメントあるいはタンパク質配列またはそのフラグメントもしくは抗ヘリコバクター・ピロリＨＡＰ抗体は、ヘリコバクター・ピロリに関連する胃の疾患の診断に用いた１種またはそれ以上の他の核酸配列またはそのフラグメントあるいはタンパク質配列またはそのフラグメントもしくは抗体と組み合わせてもよい。図面を参照しながら本発明をさらに説明する。図１は、約１ｋｂのコード領域および約５０００ｂｐの３'フランキング配列を示すヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３８由来のクローン化された１. ５ｋｂのヘリコバクター・ピロリhap遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列である。ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子のこの領域の配列は、ＥＭＢＬヌクレオチド・シーケンス・データ・ライブラリに受託番号Ｚ２７２３９で寄託されている。図２は、プラスミドｐＵＣ１９中のヘリコバクター・ピロリhap遺伝子の１.５ｋｂフラグメントの遺伝子マップである。該ヘリコバクター・ピロリ遺伝子フラグメントは、２カ所のBamＨ１部位の間に位置する。図１では、番号付けはＥcoＲ１部位の最初のアデノシン塩基（Ａ）から始めている。ＰＣＲプライマーは、２０６番〜２２５番（ＨｐＨＡＰ３）および７６２番〜７８０番（ＨｐＨＡＰ４）の位置にある点線の上線で示される。ビブリオ・コレラエhap遺伝子からの３塩基インフレーム欠失（記号△Ｈ）は２２２番の位置であり、７９８番の位置にひとつ付加され、８４３番の位置にひとつ欠失（Ｔの）がある以外は、ビブリオ・コレラエhap遺伝子と同一の領域が１番の位置からコード領域（二重線の下線）を越えて伸びている。停止コドンは***で示される。同定されたヘリコバクター・ピロリhap核酸配列内で、２つの領域がタンパク質の活性部位成分のコード領域を含むことが確認されている。該２つの領域はチロシンをコードする１６番〜１８番の核酸およびヒスチジンをコードする２２０番〜２２２番の核酸の周囲である。グルタミン酸をコードする４３番〜４５番の核酸の周囲の領域は、推定の亜鉛結合コード領域として同定されている。図１の配列内で、遺伝子含有配列のうち、ある領域が、カンピロバクターＤＮＡと交差ハイブリッド形成しないことが確認されている。これらは、１番〜１７４番のヌクレオチドを含む。次の実施例により本発明をさらに詳しく説明する。実施例１ヘリコバクター・ピロリ菌株の成長およびＤＮＡとタンパク質の抽出ＤＮＡ抽出用のローンとして、ヘリコバクター・ピロリ菌株のＮＣＴＣ（ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー,ロンドン）１１６３７、１１６３８、１１９１６およびＨＰ３４（ノッチンガムのザ・ユニバーシティ・ホスピタルのクイーンズ・メディカル・センターの患者の内視鏡生検から臨床単離）を、５％のウマ血液（オキソイド）を含むコロンビア血液寒天上で、微好気性（ microaerphilic）条件下（カンピーパク、ＢＢＬ）で２日間３７℃にて成長させた。４つのプレートから、得られる成長物を採収し、まずグラム染色して特徴的な形体を同定した。１mlの溶解緩衝液(５０mＭＥＤＴＡ、１００mＭＮａＣｌ) で細胞を洗浄し、４００μlの溶解緩衝液に再懸濁し、２０％Ｎ−ラウロイルサルコシン（シグマ）を含有する３０μlの溶解緩衝液を加えた。室温で５分間インキュベーション後、ＴＥ（１０mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１mＭＥＤＴＡ）で飽和したフェノールで懸濁物を繰り返し抽出した。次いで核酸を一夜エタノール沈澱させ、遠心分離して集め、７０％エタノールで洗浄し、ペレットを１０分間風乾した。次いでＤＮＡをプロテイナーゼＫで処理し、使用説明書にしたがってキアゲンミニカラムで精製した。ひとつの採収プレートの培養物を、５００ mlの三角フラスコ中の２％β−シクロデキストリン（シグマ）および０.２mlの再構築されたヘリコバクター・ピロリ選択性サプリメント（オキソイド）を含む１００mlのブルセラ・ブロス（ディフコ）に加え、ヘリコバクター・ピロリ菌株ＮＣＴＣ１１６３８を液体培地中で成長させた。該フラスコを嫌気性ジャーに入れ、３７℃、微好気性条件下（カンピーパク、ＢＢＬ）で緩やかに振とうしながら（１００r.p.m）３日間インキュベートした。遠心分離によってヘリコバクター・ピロリ細胞を集め、ミルトン,D.L.、ノルヴィスト,A.およびウオルフ・ワッツ,H.の「J.Bacteriol.」,１９９２年,１７４,７２３５〜７２４４に記載の方法で、上清中のタンパク質を沈澱させた。２つのプレートの成長物を１.５mlのタンパク質−抽出緩衝液（１０mＭトリス、ｐＨ７.５、１mＭＭｇＣｌ₂、０.１５mＭＥＤＴＡ、１mＭＤＴＴ、１mＭＰＭＳＦ、２μgml^-1ペプスタチンＡ（シグマ）、０.５μgml^-1ロイペプチン（シグマ））中に再懸濁させ、２００μl の１０％ＳＤＳを加え、５分間沸騰させることによって細胞タンパク質を抽出した。次いで懸濁液を５分間氷冷し、１２５００r.p.m.で５分間遠心分離を行って上清を集めた。ブラッドフォード,M.(１９７６年)「Anal.Biochem.」,７２,２４７〜２５２の記載に従い、タンパク質濃度を測定した（バイオ−ラドのキット）。実施例２酵素ヘリコバクター・ピロリプロテアーゼの同定レムリ,UK.（１９７０年）の「Nature」,２２７,６８０〜６８５に記載の操作にしたがって、４０μgの全細胞およびヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３８由来の上清タンパク質およびシュードモナス・アエルギノーサの臨床単離物を、５％アクリルアミド積み重ねゲルおよび１３％分解ゲルからなる垂直ミニゲル（ホッファー・サイエンティフィック）上で分離した。２０mＡで電気泳動を行った。ゲルの半分を直接染色し、他の半分をインキュベートしてから染色して、プロテアーゼ活性を示した。直接染色したゲルを、脱染色溶液（４０％メタノール、１０％酢酸、５０％水）中の０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０の溶液中に１時間置き、次いで脱染色溶液中に数回液を交換して置いた。未染色ゲルをインキュベートし、アミドブラックの代わりにゲルを最終的にクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色する以外は、ミルトンらの「J.Bacteri ol.」,１９９２年,１７４,７２３５〜７２４４に記載の方法によって、このゲルのプロテアーゼ活性を検出した。透明になったバンド（ゼラチンおよび他のタンパク質の消化）によってゲル中のプロテアーゼ活性を同定した。プロテアーゼ活性は、ヘリコバクター・ピロリ細胞、上清およびシュードモナス・アエルギノーサの行跡中に明らかに存在した。該ヘリコバクター・ピロリの行跡には、多数のタンパク分解性バンドが存在した。上述の操作にしたがって運転された負荷ゲル（１００μgの全ヘリコバクター・ピロリタンパク質）は、約３５ｋＤａに透明なプロテアーゼバンドを示した。移動緩衝液（４０mＭトリス、ｐＨ８、３０mＭグリシン、２０％メタノール、１.３mＭＳＤＳ）および使用説明書にしたがってＡＴＴＯＡＥ−６６７５ホリズブロット・トランスファー・ユニット（ジェネチィック・リサーチ・インターナショナル）を用いてセミドライブロッティング法を行い、電気泳動分離物をニトロセルロース膜上に移した。次いでニトロセルロース膜を乾燥し、ブロッキング溶液（１％ウシ血清アルブミン／洗浄緩衝液（１０mＭトリス、ｐＨ７.５、１００mＭＮａＣｌ、０.１％Ｔween２０））中に、一定の揺れを加えながら室温で１時間置いた。ウサギ抗シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼ（ベバーおよびイグリュースキー,１９８８年「J.Bacteriol.」,１７０：４３０９〜４３１４）または公知の技術を用いて大腸菌で吸収された合同ヒト血清のいずれかで膜をプローブした。該ブロッキング緩衝液に１：１０００の比率で第１抗体を加え、１〜４時間インキュベーションを行った。次いで洗浄緩衝液で２回膜を簡単に洗浄した（揺らせながら１５分間が一回、そして５分間が一回）。洗浄緩衝液中、１：１０００の比率で膜にＨＲＰ−標識抗体（抗ウサギまたは抗−ヒト）を加え、上述のようにして１時間インキュベートした。次いで上述のようにして膜を１５分間が一回、そして５分間が４回洗浄緩衝液で洗浄する。次いでＥＣＬ基質試薬（アメシャム）を用いて膜を展開し、フジＲＸＸ線フィルムを露光させ、使用説明書にしたがって現像した。２０mＭグリシン、ｐＨ２.５、０．０５５％Ｔween２０中で、振とうしながら、室温にて一夜インキュベーションを行うことによってストリップした後に、ブロットの再プローブ処理を行った。ＨＲＰ標識抗−ウサギ抗体でプローブした後、シュードモナス・アエルギノーサの行跡中に強いバンドが見られ、シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼと同じ分子量のバンドがヘリコバクター・ピロリの細胞タンパク質抽出物に見られた。ヘリコバクター・ピロリに対する高い力価の抗体をもつ５人の患者からの合同血清でプローブした後、抗シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼ抗体によって先に同定された該バンド（３５ｋＤａ）に対する強い応答を含む多数のバンドが観察された。ヘリコバクター・ピロリに感染していない５人の患者からの合同血清をプローブしても、バンドは見られなかった。したがって、シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼとサイズおよび免疫学的反応性が同じタンパク質が、ヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３８の細胞内および上清タンパク質抽出物に存在することが示された。実施例３ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子のクローニング５μgのＨindＩＩＩおよびＭamＨＩで切断されたヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３８ゲノムＤＮＡを、スミスらの（１９９２年）「Gene」,１１４：２１１〜２１６に記載の方法で分離し、ハイボンドＮ（アメシャム）上にブロットした。ＨＲＰで直接標識した、２００ngのビブリオ・コレラエhap遺伝子ＤＮＡの３.２ｋｂＨindＩＩＩフラグメントおよび５ngのＨindＩＩＩ切断ファージラムダＤＮＡで、該ゲノムブロットを一夜プローブ処理し（アメシャムＥＣＬキット）、洗浄し、展開し、使用説明書にしたがってフジＲＸＸ線フィルムを露光させた。ヘリコバクター・ピロリＤＮＡの４ｋｂのＨindＩＩＩおよび１.５ｋｂのＢamＨＩフラグメントは、ビブリオ・コレラエhap遺伝子プローブと強くハイブリッド形成した。４ｋｂ（ＨindＩＩＩ）および１.５ｋｂ（ＢamＨＩ）の両方のフラグメントを、ヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３８ゲノムＤＮＡから次の方法でクローン化した。１０μgの２部のゲノムＤＮＡをＢamＨＩまたはＨindＩＩＩのいずれかで切断し、０.５ｘＴＢＥミニゲル上でサイズ分離した。スミス,A.W.,（１９９０年）博士論文（イギリス、ノッチンガム、ノッチンガム大学）に記載の方法で、４ｋｂのＨindＩＩＩフラグメントおよび１.５ｋｂのＢamＨＩフラグメントをゲルから抽出し、ＨindＩＩＩまたはＢamＨＩのいずれかで切断（それぞれ）され、ウシアルカリフォスファターゼ処理されたｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（図２）およびｐＡＴ１５３に別々にライゲートした。得られるプラスミドを大腸菌株ＤＨ５α に入れて形質転換を行い、１００mg/lのアンピシリンを含有する１ブロス寒天平板上に植え、３７℃で一夜インキュベートした。ハイボンドＮ上へコロニーを乗せ、使用説明書にしたがって前記のように製造した３.２ｋｂのＨindＩＩＩビブリオ・コレラエ（ＥＣＬ）プローブを用いるコロニーハイブリッド形成法によってスクリーニングして所望の組換え体を同定した。使用説明書にしたがって、市販のユニバーサルおよびリバースのシーケンシングプライマーおよびシーケナーゼ・バージョン２（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイション）を用い、両方向に１.５ｋｂのＢamＨＩフラグメントの配列を構築した。１.５ｋｂのフラグメントの配列を構築してみると、開始コドンは示さなかったが、コード領域においてヒスチジン残基の３塩基インフレーム欠失（図１の△ Ｈ）があるだけでビブリオ・コレラエhap遺伝子の配列と９９％以上同一である約１ｋｂの領域を示した。配列は停止コドンの約５０ｂｐ下流で完全に分岐し、完全分岐前に異なる他の塩基がある。さらに、クローン化した配列は、ビブリオ・コレラエhapの遺伝子座の３'フランキング領域とはまったく異なっている。このようなコード配列保存は非常に珍しいことであり、共通先駆遺伝子または遺伝子内遺伝子転移のどちらによっても説明するのが難しい。ヘリコバクター・ピロリのＧ＋Ｃ％は３４〜３７％であり、一方ビブリオ・コレラエでは４６〜４８％であり、たとえアミノ酸配列がなお保存されるとしても、このことによる２つの属の間のコドン利用の差異はＤＮＡ配列を分岐させることになる。実施例４ヘリコバクター・ピロリのゲノムＤＮＡのＰＣＲ使用説明書にしたがってダイナザイム（フローゲン）熱安定性ポリメラーゼを用い、４種の菌株、ＮＣＴＣ１１６３８、ＮＣＴＣ１１６３７、ＮＣＴＣ１１９１６およびＨＰ３４由来の５０ngのヘリコバクター・ピロリゲノムＤＮＡを増幅した。用いたプライマーは、ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子に特異性のある５'−ＧＣＡＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＡＣＣ−３'および５'−ＡＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣ−３'またはヘリコバクター・ピロリureＡ中の４１１bpフラグメントの増幅で用いた文献開示のプライマー[クレイトンらの「J.Clin .Microbiol」, １９９２年，３０，１９２−２００；およびロペツらの「Mol.Cel l.Probes」,１９９３年，７，４３９−４４６］のいずれかであった。反応サイクルのプロファイルは、次のとおりであった：１サイクルが９５℃で５分、３０サイクルが９４℃で３０秒；５２℃（hap）または４８℃（ureＡ）のいずれかで１分；７２℃で１分３０秒、および１サイクルが７２℃で５分。実施例２で記載したように、１.５％トリス酢酸寒天ゲル上でＰＣＲ生産物を分離し、臭化エチジウムで染色し、ブロットし、ハイブリッド形成した。ＨＰ３４のサザンブロット分析において見られたものと同様な多形性が顕著であったが、４種の菌株すべてにおいて、クローン化したhap遺伝子配列から予測された５７５ｂｐの産物が得られた。同様に、４種の菌株すべてにおいて、ure Ａ遺伝子由来の４１１ｂｐ産物が得られ、これによって該ゲノムＤＮＡの起点が確認された。９種のヘリコバクター類、ヘリコバクター・アシノニクス、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・フェネリアエ、ヘリコバクター・カニス、ヘリコバクター・ムリダラム、ヘリコバクター・ネメストリナエ、ヘリコバクター・ムステラエ、ヘリコバクター・シナエジおよびヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３８のゲノムＤＮＡを、ＨＡＰ遺伝子プライマーを用いて増幅し、９種すべてにおいて、５７５ｂｐのフラグメントを得た。ヘリコバクター・アシノニクス、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・カニス、ヘリコバクター・ネメストリナエにおいて幾つかの多形性が目立って観測され、このことはこれら９種のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析からも明らかであった。この分離物をブロットし、ビブリオ・コレラエhap遺伝子でプローブ処理し、ヘリコバクター・ピロリのゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物については、５７５ｂｐのhapフラグメントのみハイブリッド形成を行った（４１１ｂｐ（ureＡ）フラグメントはしなかった）。９種すべてのヘリコバクター類からの該５７５ｂｐのＰＣＲ産物が、ビブリオ・コレラエhap遺伝子プローブとのハイブリッド形成を示した。ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子とビブリオ・コレラエhap遺伝子の間に遺伝子欠失があるため、非プルーフリーディング酵素を用いるＰＣＲでは、どのような相同なビブリオ・コレラエhap遺伝子配列が存在しようとも、増幅はおこなわれない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月２６日【補正内容】請求の範囲１．図１の核酸配列の全部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質をコードする核酸配列。２．図１の２０６番〜２２５番、７６２番〜７８０番、１番〜９３６番または１番〜１７４番の塩基配列を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質をコードする核酸配列。３．図１の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする、ヘリコバクター・ビロリから誘導された核酸配列。４．ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の抗原決定基をコードする請求項１〜３のいずれかひとつに記載の核酸配列。５．請求項１、２または４のいずれかひとつの核酸配列に相補的である核酸配列。６．ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは組換えＤＮＡである請求項１、２、４または５のいずれかひとつに記載の核酸配列。７．下記配列：をもつ図１の核酸配列のフラグメントに対する特異的結合親和性をもつ１８番から５０番のヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチド。８．請求項６に記載の組換え核酸配列を特徴とするベクター。９．ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９である請求項８に記載のベクター。１０．発現ベクターである請求項８に記載のベクター。１１．発現ベクターｐＡＳＫ６０−Ｓtrep.である請求項１０に記載のベクター。１２．請求項８〜１１のいずれかひとつに記載のベクターで形質転換された宿主細胞。１３．請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から核酸配列を単離することを特徴とする請求項６に記載の組換え核酸配列の生産方法。１４．図１のアミノ酸配列または図１の１番から９３６番の塩基配列でコードされるフラグメントを含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質。１５．ヘリコバクター・ピロリから誘導された、図１のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント。１６．請求項１０または１１に記載のベクターから発現された請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質。１７．請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から生産されたタンパク質またはそのフラグメントを単離することを特徴とする請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。１８．ヘリコバクター・ピロリから誘導されたＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントである抗原の抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産方法１９．オリゴヌクレオチド対：を用いることによってポリメラーゼ鎖反応が遂行される、ポリメラーゼ鎖反応または等価の技術によるヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列、あるいはその相補配列の増幅方法。２０．図１の核酸配列の全部または一部を含む核酸配列またはそのフラグメント、あるいはその相補配列、もしくは請求項７に記載のオリゴヌクレオチドを特徴とする核酸プローブ。２１．適当な条件下で被検サンプルを請求項２０に記載の核酸プローブと接触させ、ヘリコバクター・ピロリ核酸配列（単数または複数）と該プローブとのハイブリッド形成を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法。２２．被検サンプル中において、ポリメラーゼ鎖反応または等価の技術により図１の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリ核酸配列（単数または複数）を増幅させ、増幅された核酸配列（単数または複数）を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法。２３．被検サンプルをヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させ、抗体−抗原複合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の抗原決定基の同定方法。２４．被検サンプルを図１のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントに接触させ、抗原−抗体複合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ感染の同定方法。２５．図１の核酸配列の全部または一部を含む、ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列を特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸配列の同定用キット。２６．請求項１〜７のいずれかひとつに記載の核酸配列を特徴とする請求項２５に記載のキット。２７．オリゴヌクレオチド対プライマーを特徴とする、ポリメラーゼ鎖反応または等価の技術を用いるヘリコバクター・ピロリhap遺伝子核酸配列の同定用キット。２８．図１のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントを特徴とする、抗ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質抗体の存在によるヘリコバクター・ピロリ感染の診断用キット。２９．ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を特徴とするヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質抗原決定基の同定用キット。３０．ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における、図１の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列の使用。３１．核酸配列が、相補配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは組換えＤＮＡである請求項３０に記載の使用。３２．ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における、図１のアミノ酸配列の全部または一部でコードされるヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの使用。３３．ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における、ヘリコバクター・ピロリの抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/52 9152−4ＢＣ１２Ｎ 9/52 15/02 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/569 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 33/577 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4ＣＲ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．図１の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列。２．ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の抗原決定基をコードする請求項１に記載の核酸配列。３．図１の１番〜９３６番の塩基配列を含む請求項１に記載の核酸配列。４．請求項１〜３のいずれかひとつの核酸配列に相補的である核酸配列。５．ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは組換えＤＮＡである請求項１〜４のいずれかひとつに記載の核酸配列。６．請求項１〜５のいずれかひとつに記載の核酸配列に対する特異的結合親和性をもつ１８番から５０番のヌクレオチド由来であるオリゴヌクレオチド。７．下記配列：をもつ請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。８．請求項５に記載の組換え核酸配列を特徴とするベクター。９．ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９である請求項８に記載のベクター。１０．発現ベクターである請求項８に記載のベクター。１１．発現ベクターｐＡＳＫ６０−Strep.である請求項１０に記載のベクター。１２．請求項８〜１１のいずれかひとつに記載のベクターで形質転換された宿主細胞。１３．請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から核酸配列を単離することを特徴とする請求項５に記載の組換え核酸配列の生産方法。１４．図１のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント。１５．請求項１０または１１に記載のベクターから発現された請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント。１６．図１の１番〜９３６番の塩基配列によってコードされたアミノ酸配列を含む請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント。１７．請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から生産されたタンパク質またはそのフラグメントを単離することを特徴とする請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。１８．ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの抗原決定基を認識するポリクローナル抗体。１９．ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの抗原決定基を認識するモノクローナル抗体。２０．請求項１９に記載のモノクローナル抗体を生産することができるハイブリドーマ。２１．オリゴヌクレオチド対：を用いることによってポリメラーゼ鎖反応が遂行される、ポリメラーゼ鎖反応または等価の技術による請求項１〜４のいずれかひとつに記載の核酸配列の増幅方法。２２．請求項１〜５のいずれかひとつに記載の核酸配列またはそのフラグメント、もしくは請求項６または７に記載のオリゴヌクレオチドを含む核酸プローブ。２３．適当な条件下で被検サンプルを請求項２２に記載の核酸プローブと接触させ、ヘリコバクター・ピロリ核酸配列（単数または複数）と該プローブとのハイブリッド形成を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法。２４．被検サンプル中において、ポリメラーゼ鎖反応または等価の技術により請求項１〜５のいずれかひとつに記載のヘリコバクター・ピロリ核酸配列を増幅させ、増幅された核酸配列（単数または複数）を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法。２５．被検サンプルを請求項１８または１９に記載の抗体と接触させ、抗体− 抗原複合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質の抗原決定基の同定方法。２６．被検サンプルを請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントに接触させ、抗原−抗体複合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ感染の同定方法。２７．請求項１〜５のいずれかひとつに記載の核酸配列を含むヘリコバクター・ピロリ核酸配列の同定用キット。２８．オリゴヌクレオチド対プライマーを特徴とする、ポリメラーゼ鎖反応または等価の技術を用いるヘリコバクター・ピロリhap遺伝子核酸配列の同定用キット。２９．請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントを特徴とする、抗ヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質抗体の存在によるヘリコバクター・ピロリ感染の診断用キット。３０．請求項１８または１９に記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を特徴とするヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質抗原決定基の同定用キット。３１．ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における請求項１〜７のいずれかひとつに記載の核酸配列の使用。３２．ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における請求項１４に記載のヘリコバクター・ピロリＨＡＰタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエＨＡＰタンパク質またはそのフラグメントの使用。３３．ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における請求項１８または１９に記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体の使用。