KR20160043984A - 에이치. 필로리 감염의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피험체로부터의 샘플에서 항-FliD 항체를 포함하는 FliD에 대한 면역 반응물을 검출하는 것을 포함하여, 피험체에서 에이치. 필로리 감염을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

에이치. 필로리 감염의 검출 방법{Method for the detection of H. pylori infection}
본 발명은 헬리코박터 감염, 특히 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 감염을 검출하는 방법, 면역 반응물의 바이오마커로서의 용도, 헬리코박터 단백질의 바이오마커로서의 용도, 헬리코박터 단백질을 암호화하는 핵산의 바이오마커로서의 용도, 및 헬리코박터 감염, 특히 에이치. 필로리 (H. pylori) 감염을 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
미호기성의 그람-음성 나선형 세균인 헬리코박터 필로리는 세계 인구의 약 절반에 집단 서식하고 있으며 인간-특이적 위 병원체로 간주된다 (Michetti, et al., 1999). 대부분의 감염된 개체는 무증상의 만성 위염을 나타낸다. 그러나, 일부 피험체에서, 감염은 만성 위염, 소화성 궤양 및 위축을 일으키며, 점막-연관된 림프 조직 (MALT) 림프종, 위 선암종 및 원발성 위 비-호지킨 림프종의 발병에 중요한 역할을 한다 (Suganuma, et al., 2001).
세계보건기구는 에이치. 필로리를 제1 부류의 발암물질로 분류하였으며 (Goto, et al., 1999), 발암의 직접적 증거가 동물 모델에서 입증되었다 (Honda, et al., 1998; T. Watanabe, et al., 1998). 에이치. 필로리의 박멸은 인간에서 위암을 예방할 수 있다 (Uemura, et al., 2001). 시험 & 치료 전략은 높은 위암 위험을 갖는 집단에서 고려되었다 (Yamaoka, et al., 1998). 그러나, 이러한 접근은 특히 낮은 사회경제적 지위의 나라에 대해서 효과적이고 입수가능한 스크리닝 시스템 결여로 저지되었다. 이들 나라에서는 단지 혈청학적 시험만이 적용가능하며, 대부분의 시험이 저조한 성과를 갖거나 만족스럽게 입증되지 않는다. 에이치. 필로리 혈청학에 대해, 공지되고 보고된 수개의 특정한 단일 마커들이 있다. 이들 인자들이 많은 진단 접근에 적용되었으나, 거의 모두가 이들을 에이치. 필로리 진단에 적합하지 못하게 하는 상당한 한계를 갖는다. 예를 들어, 세포독소-연관된 단백질 (CagA)은 매우 잘 특징지어진 에이치. 필로리 단백질이다. 이는 cag-PAI (세포독소 연관된 유전자의 병원성 유전자균) 상에서 암호화되며, 발암성 단백질로 기재된다 (Franco, et al., 2005; Murata-Kamiya, et al., 2007). 이 단백질은 또한 고도의 면역원성 항원으로서 혈청학적 시험을 위한 마커로서 빈번히 사용되게 한다. CagA 양성은, CagA 양성 스트레인으로 감염된 개체가 위십이지장 질환을 발병시키는 고위험에 있기 때문에, 에이치. 필로리 병독성의 지시자로 사용될 수 있다. 그러나, 에이치. 필로리 스트레인의 단지 아그룹만이 CagA 양성이기 때문에, CagA 양성은 단일 마커로는 적합하지 않다. 또한, CagA 양성은, 에이치. 필로리 박멸된 환자가 오랜 세월 동안 CagA에 대한 항체를 유지하기 때문에, 활성 감염에 대한 특징이 아니다 (Fusconi, et al., 1999). 따라서, CagA는 항상 양성을 확인하기 위한 혈청학적 시험에서 다른 적합한 항원과 조합되어야 한다. 또 다른 잘 특성화된 에이치. 필로리 단백질은 공포화 (vacuolating) 세포독소 (VacA)이다. 이는 에이치. 필로리 상등액 또는 정제된 단백질에 노출된 세포에서 공포화를 유도하는 것으로 보고되었다 (Cover & Blaser, 1992). vacA 유전자는 140 kDa 프로-독소를 암호화하며, 이 독소에서 아미노-말단 시그널 서열 및 카복시-말단 단편은 분비 동안 단백분해로 절단됨으로써 헥사머로 응집되고 소공 (pore)을 형성하는 분자량 88 kDa의 활성 단백질이 된다 (Montecucco & de Bernard, 2003). 이 단백질은 2개의 상이한 영역으로 이루어진다. 시그널 서열 (s1a, s1b, s2) 및 중간-영역 (m1, m2) (이둘 모두 세포독성 활성을 조절하는 것으로 보이는 높은 대립형질 변이를 갖는다) (Atherton, et al., 1995). VacA의 높은 다양성은 이러한 단백질을 혈청학적 시험에 부적합하게 한다.
또 다른 잘 특성화된 에이치. 필로리 단백질인 GroEL은 스트레스 조건 하에서 많은 단백질의 적합한 폴딩에 필요한 분자 샤페론의 패밀리에 속한다 (Dunn, et al., 1992). 다른 연구에서, 이러한 단백질은 상이한 에이치. 필로리 스트레인 사이에서 고도로 보존되며 이의 혈청 양성은 감염된 환자에서의 CagA에 대한 것보다 훨씬 높은 것으로 밝혀졌다 (Macchia, et al., 1993; Suerbaum, et al., 1994). 또한, 본 발명자들에 의해 수행된 연구에서, GroEL에 대한 양성 혈청상태 (serostatus)가 매칭된 대조군에 비해 독일 위암 환자에서 보다 자주 발견되는 것으로 관측되었다 (비공개된 자료). 또한, GroEL에 대한 항체는 에이치. 필로리 감염의 질병으로 입은 피해 후 오랫동안 지속될 수 있다고 제시된다. 따라서, GroEL은 현재 또는 과거 감염에 대한 적합한 마커일 수 있으며, 감염 제거에 기인한 에이치. 필로리-관련된 위암의 저평가를 극복하는데 도움이 될 수 있다 (Gao et al., 2009).
따라서, 본 발명의 기초가 되는 문제는 에이치. 필로리 감염을 고민감성 및/또는 고특이성으로 검출하는 방법의 제공이었다. 본 발명의 기초가 되는 또 다른 문제는 종래 기술의 검정과 비교하여 특히 모집단-기반 (population-based) 접근에서 거짓 양성 결과 및 거짓 음성 결과가 덜한 검정의 제공이었다. 본 발명이 기초가 되는 추가의 문제는 각각 이러한 방법 및 이러한 검정을 수행하기 위한 수단의 제공이었다. 본 발명이 기초가 되는 추가의 문제는, 바람직하게는 다른 세균 및 임의의 단백질, 펩타이드 또는 특히 이러한 단백질 및 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자와 어떠한 교차-반응성도 나타내지 않는, 에이치. 필로리 감염된 환자에 대한 바이오마커의 제공이었다.
본 발명의 기초가 되는 이들 및 다른 문제들은 첨부된 독립 청구항의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 실시형태는 첨부된 종속 청구항으로부터 취해질 수 있다.
본 발명의 기초가 되는 이들 및 다른 문제들은 또한 하기의 실시형태에 의해 해결된다.
실시형태 1: 피험체로부터의 샘플에서 FliD에 대한 면역 반응을 검출하는 것을 포함하는, 헬리코박터 감염, 더욱 바람직하게는 에이치. 필로리 감염의 검출 방법.
실시형태 2: 실시형태 1에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 피험체로부터의 샘플에서 검출되는 경우, 피험체가 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓거나, 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 과거에 에이치. 필로리 감염을 앓았던 피험체인, 방법.
실시형태 3: 실시형태 1 또는 2에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 피험체로부터의 샘플에서 검출되지 않는 경우, 피험체가 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓지 않는 피험체인, 방법.
실시형태 4: 실시형태 1 또는 2에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 피험체로부터의 샘플에서 검출되지 않는 경우, 피험체가 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓았던 피험체인, 방법.
실시형태 5: 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 FliD에 대한 항체 반응물, 바람직하게는 항-FliD 항체 반응물인, 방법.
실시형태 6: 실시형태 5에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 FliD에 대한 항체 반응물이고, FliD에 대한 항체 반응물이 IgG 항체 및 IgA 항체를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 항-FliD 항체를 포함하는, 방법.
실시형태 7: 실시형태 5에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 항-FliD 항체 반응물이고, 항-FliD 항체 반응물이 IgG 항체 및 IgA 항체를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 항-FliD 항체를 포함하는, 방법.
실시형태 8: 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 FliD를 발현하는 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리로 감염된 피험체인, 방법.
실시형태 9: 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 면역억제된 피험체와는 상이한, 바람직하게는 면역억제 치료 하의 피험체와는 상이한 피험체인, 방법.
실시형태 10: 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원을 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 11: 실시형태 10에 있어서, 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원이 CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 및 HtrA를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
?실시형태 12: 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 샘플을 FliD 또는 이의 단편과 반응시키는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 13: 실시형태 13에 있어서, 샘플을 전장 FliD와 반응시키는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 14: 실시형태 12 또는 13에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 FliD와 상호작용할 수 있는 체액성 화합물 및 FliD와 상호작용할 수 있는 세포성 화합물 중 적어도 하나를 포함하고, 적어도 하나의 체액성 화합물 및/또는 세포성 화합물이 FliD와 상호작용하고, 바람직하게는 FliD와 상호작용하는 적어도 하나의 체액성 화합물 및/또는 세포성 화합물이 FliD와 상호작용 생성물을 형성하는 것인, 방법.
실시형태 15: 실시형태 14에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 FliD에 대한 항체 반응물이고, FliD에 대한 항체 반응물이 FliD와 상호작용 생성물을 형성하는 것인, 방법.
실시형태 16: 실시형태 14에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 항-Flid 항체 반응물이고, 항-Flid 반응물이 FliD와 상호작용 생성물을 형성하는 것인, 방법.
실시형태 17: 실시형태 14에 있어서, FliD에 대한 면역 반응물이 적어도 하나의 항-FliD 항체를 포함하고, 항-FliD 항체가 FliD와 상호작용 생성물을 형성하는 것인, 방법.
실시형태 18: 실시형태 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상호작용 생성물이 검출되는 것인, 방법.
실시형태 19: 실시형태 18에 있어서, 상호작용 생성물이 직접적으로 검출되는 것인, 방법.
실시형태 20: 실시형태 18에 있어서, 상호작용 생성물이 간접적으로 검출되는 것인, 방법.
실시형태 21: 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 검출이 ELISA 또는 라인 면역검정에 의해 일어나는 것인, 방법.
실시형태 22: 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 검출이 측방 유동 검정에 의해 일어나는 것인, 방법.
실시형태 23: 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 혈청, 혈장 및 전혈을 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 24: 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 인간이고, 헬리코박터 감염이 에이치. 필로리 감염인, 방법.
실시형태 25: 실시형태 24에 있어서, 샘플과 반응되는 FliD가 에이치. 필로리로부터의 FliD인, 방법.
실시형태 26: 실시형태 25에 있어서, FliD가 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 27: 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 돼지이고, 헬리코박터 감염이 헬리코박터 수이스 감염인, 방법.
실시형태 28: 실시형태 27에 있어서, 샘플과 반응되는 FliD가 에이치. 수이스로부터의 FliD인, 방법.
실시형태 29: 실시형태 28에 있어서, FliD가 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 30: 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 고양이이고 헬리코박터 감염이 헬리코박터 펠리스 감염이고, 바람직하게는 고양이가 집고양이, 야생형 고양이, 작은 고양이 및 큰 고양이를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 31: 실시형태 30에 있어서, 샘플과 반응되는 FliD가 에이치. 펠리스로부터의 FliD인, 방법.
실시형태 32: 실시형태 31에 있어서, FliD가 서열번호 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 33: 실시형태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 인간에서 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 검출하기 위한 방법의 민감도가 90% 초과 및/또는 97% 이하인, 방법.
실시형태 34: 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 인간에서 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 검출하는 방법의 특이도가 90% 초과 및/또는 99% 이하인, 방법.
실시형태 35: 피험체에서 FliD에 대한 면역 반응물의 바이오마커로서의 용도.
실시형태 36: 실시형태 35에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커인, 용도.
실시형태 37: 실시형태 35 또는 36에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 인간이고 헬리코박터가 에이치. 필로리인, 용도.
실시형태 38: 실시형태 35 또는 36에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 돼지이고 헬리코박터가 에이치. 수이스인, 용도.
실시형태 39: 실시형태 35 또는 36에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 고양이이고 헬리코박터가 에이치. 펠리스인, 용도.
실시형태 40: 실시형태 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 바이오마커가 예측 바이오마커인, 용도.
실시형태 41: 실시형태 35 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 면역반응물이 FliD에 대한 항체 반응물인, 용도.
실시형태 42: 실시형태 35 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 면역 반응물이 FliD에 대한 항-FliD 항체 반응물인, 용도.
실시형태 43: FliD 또는 이의 단편 및 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는 키트.
실시형태 44: 실시형태 43에 있어서, 적어도 하나의 추가 성분이 버퍼, 고체상 및 설명서를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 키트.
실시형태 45: 실시형태 43 또는 44에 있어서, FliD가 전장 FliD인, 키트.
실시형태 46: 실시형태 43 또는 44에 있어서, FliD가 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열이 서열번호 1에 따른 아미노산 서열, 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 및 서열번호 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 키트.
실시형태 47: 실시형태 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 키트가 피험체에서 헬리코 박터를 검출하는 방법에서 사용하기에 적합하거나 상기 방법에 사용하기 위한 것인, 키트.
실시형태 48: 실시형태 46에 있어서, 키트가 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 방법에 사용하기에 적합하거나 상기 방법에 사용하기 위한 것인, 키트.
실시형태 49: 피험체로부터의 샘플에서 FliD를 검출하는 것을 포함하는, 피험체에서 헬리코박터 감염, 더욱 바람직하게는 에이치. 필로로 감염의 검출 방법.
실시형태 50: 실시형태 49에 있어서, FliD가 피험체로부터의 샘플에서 검출되는 경우, 피험체는 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓거나 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓았던 피험체인, 방법.
실시형태 51: 실시형태 49 또는 50에 있어서, 어떠한 FliD도 피험체로부터의 샘플에서 검출되지 않는 경우, 피험체가 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓지 않는 피험체인, 방법.
실시형태 52: 실시형태 49 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 어떠한 FliD도 피험체로부터의 샘플에서 검출되지 않는 경우, 피험체가 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓았던 피험체인, 방법.
실시형태 53: 실시형태 49 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 FliD를 발현하는 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리로 감염된 피험체인, 방법.
실시형태 54: 실시형태 49 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원을 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 55: 실시형태 54에 있어서, 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원이 CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 및 HtrA를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 56: 실시형태 49 내지 55 중 어느 하나에 있어서, FliD가 전장 FliD 또는 이의 단편인, 방법.
실시형태 57: 실시형태 49 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 샘플을 상호작용제와 반응시키는 것을 포함하고, 상호작용제가 FliD 또는 이의 단편과 상호작용하고, 바람직하게는 상호작용제가 FliD 또는 이의 단편과 특이적으로 상호작용하는 것인, 방법.
실시형태 58: 실시형태 57에 있어서, 상호작용제가 전장 FliD 또는 FliD의 단편과 상호작용하는 것인, 방법.
실시형태 59: 실시형태 57 또는 58에 있어서, 상호작용제가 항체, 압타머 및 스피겔머 (spiegelmer)를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 60: 실시형태 59에 있어서, 상호작용제가 항체이고, 항체가 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인, 방법.
실시형태 61: 실시형태 56 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상호작용제 및 샘플에 존재하는 FliD가 상호작용 생성물을 형성하는 것인, 방법.
실시형태 62: 실시형태 61에 있어서, 상호작용 생성물이 검출되는 것인, 방법.
실시형태 63: 실시형태 62에 있어서, 상호작용 생성물이 직접적으로 검출되는 것인, 방법.
실시형태 64: 실시형태 62에 있어서, 상호작용 생성물이 간접적으로 검출되는 것인, 방법.
실시형태 65: 실시형태 49 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 검출이 ELISA 또는 라인 면역검정에 의해 일어나는 것인, 방법.
실시형태 66: 실시형태 49 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 검출이 측방 유동 검정에 의해 발생하는 것인, 방법.
실시형태 67: 실시형태 49 내지 56 중 어느 하나에 있어서, FliD가 질량 분광 분석에 의해 검출되는 것인, 방법.
실시형태 68: 실시형태 67에 있어서, 질량 분광 분석이 LC-ESI-MS/MS, MALDI-MS, 텐덤 (tandem) MS, TOF/TOF, TOF-MS, TOF-MS/MS, 삼중 4극 MS, 및 삼중 4극 MS/MS를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 69: 실시형태 49 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 인간이고, 헬리코박터 감염이 에이치. 필로리 감염인, 방법.
실시형태 70: 실시형태 69에 있어서, FliD가 에이치. 필로리로부터 것인, 방법.
실시형태 71: 실시형태 70에 있어서, FliD가 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 72: 실시형태 49 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 돼지이고, 헬리코박터 감염이 헬리코박터 수이스 감염인, 방법.
실시형태 73: 실시형태 72에 있어서, FliD가 에이치. 수이스로부터 것인, 방법.
실시형태 74: 실시형태 73에 있어서, FliD가 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 75: 실시형태 49 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 고양이고, 헬리코박터 감염이 헬리코박터 펠리스 감염인, 방법.
실시형태 76: 실시형태 75에 있어서, FliD가 에이치. 펠리스로부터의 것인, 방법.
실시형태 78: 실시형태 49 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 분변, 혈청, 혈장 및 전혈을 포함하는 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 샘플이 분변인, 방법.
실시형태 79: FliD의 바이오마커로서의 용도.
실시형태 80: 실시형태 79에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커인, 용도.
실시형태 81: 실시형태 79 또는 80에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 인간이고 헬리코박터가 에이치. 필로리인, 용도.
실시형태 82: 실시형태 81에 있어서, FliD가 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
실시형태 83: 실시형태 80 또는 81에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 돼지이고 헬리코박터가 에이치. 수이스인, 용도.
실시형태 84: 실시형태 83에 있어서, FliD가 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
실시형태 85: 실시형태 80 또는 81에 있어서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 고양이이고 헬리코박터가 에이치. 펠리스인, 용도.
실시형태 86: 실시형태 85에 있어서, FliD가 서열번호 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
실시형태 87: 실시형태 79 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 바이오마커가 예측 바이오마커인, 용도.
실시형태 88: FilD 또는 이의 단편과 상호작용할 수 있는 상호작용제 및 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는 키트.
실시형태 89: 실시형태 88에 있어서, 적어도 하나의 추가 성분이 버퍼, 고체상 및 설명서를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 키트.
실시형태 90: 실시형태 89에 있어서, 상호작용제가 FliD 또는 이의 단편과 특이적으로 상호작용할 수 있는 것인, 키트.
실시형태 91: 실시형태 88 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상호작용제가 항체, 압타머 및 스피겔머를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 키트.
실시형태 92: 실시형태 88 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 키트가 피험체에서 헬리코박터의 검출 방법에 사용하기에 적합하거나 상기 방법에서 사용하기 위한 것인, 키트..
실시형태 93: 실시형태 92에 있어서, 키트가 실사형태 49 내지 78 중 어느 하나의 방법에 사용하기에 적합하거나 상기 방법에 사용하기 위한 것인, 키트.
실시형태 94: 피험체로부터의 샘플에서 FliD를 암호화하는 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 피험체에서 헬리코박터 감염, 더욱 바람직하게는 에이치. 필로리 감염의 검출 방법.
실시형태 95: 실시형태 94에 있어서, 핵산이 FliD를 암호화하는 게놈 핵산, 바람직하게는 DNA인, 방법.
실시형태 96: 실시형태 94에 있어서, 핵산이 FliD를 암호화하는 mRNA인, 방법.
실시형태 97: 실시형태 94 내지 96 중 어느 하나에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산이 피험체로부터의 샘플에서 검출되는 경우, 피험체가 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓거나, 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓았던 피험체인, 방법.
실시형태 98: 실시형태 94 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 어떠한 FliD를 암호화하는 핵산도 피험체로부터의 샘플에서 검출되지 않는 경우, 피험체가 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓지 않는 피험체인, 방법.
실시형태 99: 실시형태 94 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 어떠한 FliD를 암호화하는 핵산도 피험체로부터의 샘플에서 검출되지 않는 경우, 피험체가 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓았던 피험체인, 방법.
실시형태 100: 실시형태 94 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 FliD를 발현하는 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리로 감염된 피험체인, 방법.
실시형태 101: 실시형태 94 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원, 및/또는 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원을 암호화하는 핵산을 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 102: 실시형태 101에 있어서, 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원이 CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 및 HtrA를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 103: 실시형태 94 내지 102 중 어느 하나에 있어서, FliD가 전장 FliD 또는 이의 단편인, 방법.
실시형태 104: 실시형태 94 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 샘플을 상호작용제와 반응시키는 것을 포함하고, 상호작용제가 FliD를 암호화하는 핵산과 상호작용하고, 바람직하게는 상호작용제가 FliD를 암호화하는 핵산과 특이적으로 상호작용하는 것인, 방법.
실시형태 105: 실시형태 104에 있어서, 상호작용제가 전장 FliD 또는 FliD의 단편을 암호화하는 핵산과 상호작용하는 것인, 방법.
실시형태 106: 실시형태 104 또는 105에 있어서, 상호작용제가 프라이머 및 프로브를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 107: 실시형태 104 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상호작용제 및 샘플 중에 존재하는 FliD를 암호화하는 핵산이 상호작용 생성물을 형성하는 것인, 방법.
실시형태 108: 실시형태 107에 있어서, 상호작용 생성물이 검출되는 것인, 방법.
실시형태 109: 실시형태 108에 있어서, 상호작용 생성물이 직접적으로 검출되는 것인, 방법.
실시형태 110: 실시형태 108에 있어서, 상호작용 생성물이 간접적으로 검출되는 것인, 방법.
실시형태 111: 실시형태 94 내지 103 중 어느 하나에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산 분자가 질량 분광 분석, PCR 또는 하이브리드화 검정에 의해 검출되는, 방법.
실시형태 112: 실시형태 111에 있어서, 질량 분광 분석이 LC-ESI-MS/MS, MALDI-MS, 탠덤 MS, TOF/TOF, TOF-MS, TOF-MS/MS, 삼중 4극 MS, 및 삼중 4극 MS/MS로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
실시형태 113: 실시형태 94 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 인간이고, 헬리코박터 감염이 에이치. 펠리스 감염인, 방법.
실시형태 114: 실시형태 113에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산이 에이치. 필로리로부터의 것인, 방법.
실시형태 115: 실시형태 114에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산이 서열번호 2에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 116: 실시형태 94 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 돼지이고, 헬리코박터 감염이 헬리코박터 펠리스 감염인, 방법.
실시형태 117: 실시형태 116에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산이 에이치. 수이스로부터의 것인, 방법.
실시형태 118: 실시형태 117에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산이 서열번호 4에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 119: 실시형태 94 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 피험체가 고양이이고, 헬리코박터 감염이 헬리코박터 펠리스 감염인, 방법.
실시형태 120: 실시형태 119에 있어서, FliD를 암호호하는 핵산이 에이치. 펠리스인, 방법.
실시형태 121: 실시형태 120에 있어서, FliD가 서열번호 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 122: 실시형태 94 내지 121 중 어느 하나에서, 샘플이 분변, 혈청, 혈장 및 전혈으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 샘플이 분변인, 방법.
실시형태 123: FliD를 암호화하는 핵산의 바이오마커로서의 용도.
실시형태 124: 실시형태 123에서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커인, 용도.
실시형태 125: 실시형태 123 또는 124에서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 인간이고, 헬리코박터가 에이치. 필로리인, 용도.
실시형태 126: 실시형태 125에서, FliD를 암호화하는 핵산이 서열번호 2에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 용도.
실시형태 127: 실시형태 124 또는 125에서, 바이오마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 돼지이고, 헬리코박터가 에이치. 수이스인, 용도.
실시형태 128: 실시형태 127에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산이 서열번호 4에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 용도.
실시형태 129: 실시형태 124 또는 125에 있어서, 바이어마커가 헬리코박터로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커이고, 피험체가 고양이이고 헬리코박터가 에이치. 펠리스인, 용도.
실시형태 130: 실시형태 129에 있어서, FliD를 암호화하는 핵산이 서열번호 6에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 용도.
실시형태 131: 실시형태 123 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 바이오마커가 에측 바이오마커인, 용도.
실시형태 132: FliD를 암호화하는 핵산 또는 이의 단편과 상호작용할 수 있는 상호작용제 및 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는, 키트.
실시형태 133: 실시형태 132에 있어서, 적어도 하나의 추가 성분이 버퍼, 고체상 및 설명서를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 키트.
실시형태 134: 실시형태 133에 있어서, 상호작용제가 FliD 또는 이의 단편과 특이적으로 상호작용할 수 있는 것인, 키트.
실시형태 135: 실시형태 132 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 상호작용제가 프라이머 및 프로브를 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 키트.
실시형태 136: 실시형태 132 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 키트가 피험체에서 헬리코박터 감염을 검출하는 방법에 사용하기에 적합하거나 상기 방법에 사용하기 위한 것인, 키트.
실시형태 137: 실시형태 136에 있어서, 키트가 실시형태 94 내지 122 중 어느 하나의 방법에 사용하기에 적합하거나 상기 방법에 사용하기 위한 것인, 키트.
본 발명자들은 놀랍게도 "훅 (hook)-연관된 단백질 2 상동체"로도 불리는 단백질인 FliD가 헬리코박터로의 감염, 특히 에이치. 필로로로의 감염에 대한 마커라는 것을 밝혀내었다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 FliD 및/또는 FliD에 대한 면역 반응물이, 헬리코박터 및 특히 에이치. 필로리 감염에 대해 시험되는 피험체로부터의 샘플에 기초하거나 샘플을 이용하고 상기 샘플이 바람직하게는 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플 및 분변 샘플을 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 혈청학적 분석에서 및, 따라서, 임의의 방법 및 검정에서 마커로서 유리하게 사용될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 마지막으로, 본 발명자들은 놀랍게도 헬리코박터 및 특히 에이치. 필로리로의 피험체의 감염이, FliD 및/또는 FliD를 암호화하는 핵산이 단독 마커로서 사용되는, FliD 및/또는 FliD를 암호화하는 핵산에 기초하여 검출될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 다시 말해서, 본 발명에 따라, 헬리코박터 및 특히 에이치. 필로리로의 피험체의 감염은 단독으로 및 각각 FliD 및/또는 이를 암호화하는 핵산에 의존적으로 진단될 수 있다. 이는 또한 헬리코박터 및 특히 에이치. 필로리로 감염된 피험체에 의해 전개된 FliD에 대한 면역 반응물에 대해 사실이다: 본 발명에 따라, 헬리코박터 및 특히 에이치. 필로리로의 피험체의 감염은 단독으로 및, 각각, FliD에 대한 면역 반응 (FliD에 대한 면역 반응은 피험체에 의해 생성된다)에 의존적으로 진단될 수 있다. 본 발명의 추가의 이점은 FliD에 대한 면역 반응 및 FliD 그 자체가, 샘플이 생검과 같은 침습적 방법에 의해 취해져야 하는 종래 기술의 많은 검출 방법과 달리 통상적으로 비-침습적 방법에 의해 수득되는 샘플에서 측정될 수 있다는 것이다.
당업자는, 헬리코박터가 FliD를 암호화하고/하거나 이를 발현하는 한, 본 발명이 원칙적으로 헬리코박터로의 피험체의 임의의 감염을 검출하는데 적용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 당업자는, 통상적으로, 예를 들어, 인간과 같은 피험체의 상이한 종이 상이한 종의 헬리코박터에 의해 감염될 것이라는 것을 인식할 것이다. 피험체가 인간인 경우, 헬리코박터의 종은 에이치. 필로리이다. 피험체가 돼지인 경우, 헬리코박터의 종은 에이치. 수이스 (H. suis)이다. 피험체가 큰 고양이를 포함하는 고양이인 경우, 헬리코박터의 종은 에이치. 펠리스 (H. felis)이다. 본원은 특히 인간에서 에이치. 필로리의 검출을 언급한다. 그러나, 에이치. 필로리 및 인간에 대한 이러한 언급은 단지 명료히 하기 위한 것이며, 상기된 바를 고려할 때 에이치. 필로리 및 인간에 대해 언급되는 임의의 실시형태는 FliD 또는 이의 상동체를 발현하는 임의의 다른 헬리코박터 및 피험체의 임의의 다른 종에도 동일하게 적용된다. 바람직하게는, 피험체의 다른 종은 헬리코박터 및 에이치. 필로리와 상동인 종 (이러한 헬리코박터 및 에이치. 필로리에 상동인 종은 FliD 또는 이의 상동체를 발현한다)으로의 감염을 앓거나 앓을 수 있는 임의의 포유동물이다.
또한, 당업자는 헬리코박터의 종 각각에 대해 통상적으로 다양한 스트레인이 존재한다는 것을 인식할 것이다. 헬리코박터 종의 이러한 스트레인의 FliD의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 통상적으로 아미노산 서열에서 매우 높은 동일성을 보인다. 보다 구체적으로, 생물정보학 분석은 FliD 아미노산 서열이 모든 (>200) 에이치. 필로리 스트레인에서 존재하고 고도로 보존된다는 것을 보였다. FliD는 본 발명자들에 의해 분석된 약 200개의 에이치. 필로리 스트레인에서 97%의 상동성을 가졌다. 흥미롭게도, 부분적 상동성을 갖는 일부 다른 비-필로리 헬리코박터를 제외하고는, 에이치. 필로리에 대해 유의한 게놈성 또는 단백질체학적 상동성을 갖는 다른 공지된 유기체가 없다. 에이치. 필로리 FliD 단백질의 비교는 헬리코박터 종에서 FliD에 대해 높은 보존성을 보이며, 이는 대부분의 다른 세균 및 진핵생물 유기체와는 상이하다. 이러한 분석은 이러한 단백질의 높은 항원성 예측과 함께 사실상 교차-반응성이 없다는 것에 대한 합리성을 제공한다.
또한, FliD는 사실상 피험체를 감염시키거나 감염시킬 수 있는 모든 스트레인에 의해 발현된다. 이는, 본 발명에 따라 FliD가 사실상 에이치. 필로리의 스트레인 각각 및, 각각, 각각의 피험체 종을 감염시키는 헬리코박터 종의 스트레인 각각에 대한 마커인 이유를 설명한다. 달리, 거의 모든 에이치. 필로리 양성 환자가 FliD에 대한 면역 반응을 보인다.
에이치. 필로리 FliD 단백질은 기능성 편모의 어셈블리에서 필수 요소이며, FliD 돌연변이체 스트레인은 완전히 비-운동성이다. 플라젤린은 세균 운동성에서 중추 역할을 하며, 에이치. 필로리 감염의 콜로니화 및 지속에 필요하다 (Eaton, et al., 1996). 에이치. 필로리의 운동성은 위 점막 손상의 발병기전에서 병독성 요소이다 (S. Watanabe, et al., 1997). 에이치. 필로리 FliD 유전자는 76-kDa 단백질을 암호화한다 (Kim, et al., 1999). 에이치. 필로리의 FliD 오페론은 시그마 (28)-의존적 프로모터 하의 FlaG, FliD, 및 FliS 유전자 (순서대로)로 이루어진다. 에이치. 필로리로부터의 FliD에 대한 기재는, 특히 이의 아미노산 서열 및 에이치. 필로리의 다양한 스트레인에서 발견되는 돌연변이를 제공하는, 데이터뱅크 UniProtKB/Swiss-Prot에서 P96786.4로서 찾을 수 있다.
피험체에서 헬리코박터 감염, 바람직하게는 피험체에서 에이치. 필로리 감염을 검출하는 방법은 또한 피험체로부터의 샘플이 FliD에 대한 면역반응물, FliD 또는 FliD를 암호화하는 핵산을 포함하는지를 측정하는 단계를 포함하는 것으로 특징지어질 수 있다. 피험체로부터의 샘플이 FliD에 대한 항체 반응물, FliD 또는 FliD를 암호화하는 핵산을 포함하는 경우, 피험체는 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓거나 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 과거에 에이치. 필로리 감염을 앓았던 피험체이다.
피험체에서 헬리코박터 감염, 바람직하게는 피험체에서 에이치. 필로리 감염을 검출하기 위한 본 발명의 방법은 또한 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓고 있는지 모르는 피험체 또는 이러한 피험체가 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓았는지를 모르는 피험체에게 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가의 양태에서 피험자가 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓는지 또는 과거에 헬리코박터 감염, 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 앓았는지를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 용어 "과거에"는 샘플을 피험자로부터 취했거나 취하는 시점 이전의 시점을 말하며, 여기서 이러한 샘플은 본 발명의 다양한 양태 및/또는 다양한 실시양태와 관련하여, 특히 피험체에서 에이치. 필로리 및/또는 에이치. 필로리 감염을 검출하고 피험체에서 에이치. 필로리 및 에이치. 필로리 감염을 진단하는데 사용되는 샘플이다.
본 발명의 다양한 양태 및 특히 본 발명의 다양한 방법과 관련하여, 당업자는 헬리코박터 및 특히 에이치. 필로리에 의해 감염된 피험자에 의해 생성되는 면역 반응 및 항-FliD 항체 반응이 수년에 걸쳐 지속된다는 것을 인식할 것이다. 이러한 항-FliD 항체 반응의 유병률은 통상적으로 에이치. 필로리 박멸 후 약 1 내지 5년 후 약 50%, 필로리 박멸 후 약 6 내지 10년 후 약 50%, 필로리 박멸 후 약 11 내지 15년 후 약 25%, 및 필로리 박멸 후 약 16 내지 20년 후 약 25%이다. 이에 비추어 볼 때, 에이치. 필로리 양성으로 진단된 피험자는 샘플을 취했을 때 실제로 에이치. 필로리 감염에 걸려있는 피험체 또는 과거에 에이치. 필로리 감염을 앓았고 여전히 항-FliD 면역 반응이 팽배한 피험체일 수 있다.
FliD에 대한 면역 반응이 FliD에 대한 항체 반응 및 보다 구체적으로 항-FliD 항체 반응인 한, 항-FliD 항체는 통상적으로 IgG 또는 IgA이다. 이러한 부류의 특이성은 검출 항체 또는 포획 항체로서 항-IgG 및/또는 항-IgA 항체를 사용함으로써 항-FliD 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 피험체가 인간인 실시형태에서, 검출 항체 및 포획 항체는 바람직하게는 항-인간 IgG 및/또는 항-인간 IgA이다.
본 발명의 다양한 양태 및 특히 본 발명의 다양한 방법과 관련하여, 상기 방법은 하나의 실시형태에서 하나 이상의 헬리코박터 항원 또는 이러한 헬리코박터 항원을 암호화하는 핵산을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 헬리코박터 항원은 에이치. 필로리 항원이다. 추가의 실시형태에서, 항원은 모두가 당해 분야에 알려지고, 예를 들어, 하기 문헌에 기재된, CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 및 HtrA를 포함하는 그룹 중에서 선택된다: Yakoob J et al. (Yakoob J et al., Gut and Liver, Vol. 4, No. 3, September2010, pp. 345-350), Sabarth N et al. (Sabarth N et al., Infection and Immunity, Nov. 2002, p. 6499-6503), Gao L. et al. (Gao L. et al., Cancer Res 2009; 69: (15). August 1, 2009, p. 6164 - 6170), Yamaoka Y (Yamaoka Y, J Med Microbiol. 2008 May; 57 (Pt5): 545-553), Miehlke S et al. (Miehlke S et al., Int. J. Cancer: 87, 322-327 (2000)), and Atherton JC et al. (Atherton JC et al., Current Microbiology, Vol. 39(1999), pp 211-218). CagA의 아미노산 서열은 서열번호 7로 본원에 기재되고, CagA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8로 본원에 기재되며, VacA의 아미노산 서열은 서열번호 9로 본원에 기재되고, VacA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10으로 본원에 기재되며, GroEL의 아미노산 서열은 서열번호 11로 본원에 기재되고, GroEL의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12로 본원에 기재되며, Hp0231의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 본원에 기재되고, Hp0231의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14로 본원에 기재되며, JHp0940의 아미노산 서열은 서열번호 15로 본원에 기재되고, JHp0940의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16으로 본원에 기재되며, HtrA의 아미노산 서열은 서열번호 17로 본원에 기재되고, HtrA의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 18로 본원에 기재된다.
헬리코박터 감염 및 더욱 바람직하게는 에이치. 필로리 감염이 피험체로부터의 샘플에서 FliD에 대한 면역 반응 및 특히 항-FliD 항체를 검출함으로써 검출되는 본 발명의 방법의 일 실시형태에서, 샘플 및 FliD가 반응된다. 하나의 실시형태에서, 샘플은 FliD에 부가된다. 바람직하게는, FliD는 이러한 방법에서 고체상에 부착된다. 또한, 본 발명에서 FliD는 샘플에 부가된다. 바람직하게는, FliDs는 용액으로, 더욱 바람직하게는 수성 용액, 예를 들어, 완충된 용액으로 부가된다. 바람직한 실시형태에서, 고체상에 부착된 FliD가 샘플과 반응된다. 당업자는 샘플이 FliD에 대한 면역 반응물 및 특히 항-FliD 항체를 포함하는 경우 상호작용 생성물이 형성되는 조건 하에서 FliD 및 샘플이 반응한다는 것을 인식할 것이다. 바람직하게는, 이러한 상호작용 생성물은 FliD 및 샘플 중에 포함된 항-FliD 항체의 복합물이다.
이렇게 형성된 상호작용 생성물은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 상호작용 생성물이 직접적으로 검출되는 실시형태에서, 샘플과 반응된 FliD는, 특히 항-FliD 항체와 상호작용하는 경우 FliD의 검출을 허용하는 표지물을 포함한다. 이러한 유형의 표지물은 당업자에게 알려져 있으며, 방사선표지물, 형광 표지물, 염료, 나노입자, 예를 들어, 금 및 효소, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제를 포함한다. 추가의 표지물은 항체의 표지화와 관련하여 본원에 기재된 것들이다. 상호작용 생성물이 간접적으로 검출되는 실시형태에서, 상호작용 생성물은 연속해서 상호작용 생성물에 특이적으로 결합하는 검출제와 반응된다. 이러한 검출제는 항체, 바람직하게는 항-IgG 또는 항-IgA 항체일 수 있다. 통상적으로 검출제 자체가, 바람직하게는 검출제가 상호작용 생성물에 특이적으로 결합되는 경우, 검출제의 검출을 가능하게 하는 표지물을 포함한다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에서, 상호작용 생성물은 당업자에게 알려진 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사면역검정에 의해 검출된다 [Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998]. ELISA는 간접적 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA 또는 비-경쟁적 ELISA일 수 있다.
본 발명의 방법의 택일적인 바람직한 실시형태에서, 상호작용 생성물은 예를 들어 US 6,485,982에 기재되는 측방 유동 면역크로마토그래피 검정으로도 알려진 측방 유동에 의해 검출된다. 이러한 측방 유동 시험은 일 실시형태에서 항-FliD 항체 및, 각각, 항-FliD 항체가 피험체로부터의 샘플에서 검출되는 본 발명의 임의의 방법에 사용된다. 측방 유동 시험은 인간인 피험체로부터의 샘플에서 항-FliD 항체가 검출되는 본 발명의 방법의 실시형태에 대해 설명적 목적으로 기재될 것이다.
이 기술은 일련의 모세관 베드 (capillary bed), 예를 들어, 다공성 페이퍼 또는 중합체의 부재 (piece)를 기반으로 한다. 이들 성분들 각각은 유체, 예를 들어, 혈청, 혈장 또는 혈액을 신속히 수송하는 능력을 갖는다. 샘플 패드는 스폰지와 같이 작용하고 과량의 샘플 유체를 보유한다. 샘플 패드가 포화되는 경우, 유체는 항-인간 항체와 컨쥬게이트된 나노입자, 바람직하게는 금 나노입자가 위치된 컨쥬게이트 패드로 이동한다. 샘플 유체가 이러한 요소로 이동하는 경우, 이는 입자를 용해시키고, 하나의 조합된 반응에서 샘플 및 컨쥬게이트 믹스는 다공성 구조물을 통해 유동한다. 이러한 방식으로, 나노입자 표면 상에 고정된 항체는 샘플에 존재하는 인간 IgG에 결합하고, 다음 모세관 매트릭스를 통해 더욱 이동한다. 전형적으로 니트로셀룰로스와 같은 소수성 막인 이러한 요소 상에서, 항원 및 대조군 (예: 인간 IgG)은 시험 또는 대조군 라인으로 고정된다. 컨쥬게이트 입자에 결합된 인간 IgG가 이들 라인에 도달하면, 막에 고정된 항원은 항체 복합체를 특이적으로 포획할 것이다. 얼마 후, 보다 많은 입자가 항원 부위에 모이고 간단히 검출가능한 착색된 밴드가 보인다. 일 실시형태에서, 단지 하나의 항원, 즉 FliD가 존재한다. 또 다른 실시형태에서, FliD 이외에, 하나 이상의 항원이 존재하며, 바람직하게는 하나 이상의 항원은 CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 및 HtrA를 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 방법의 추가의 대체적인 바람직한 실시형태에서, 상호작용 생성물은 라인 검정에 의해 검출된다. 이러한 라인 검정은 통상적으로 다수의 스트립을 포함한다. 상기 스트립 상에서, 고도로 정제된 재조합 FliD 또는 FliD와 상호작용할 수 있는 상호작용제가 스트립에 고정된다. 이러한 스트립은 바람직하게는 니트로셀룰로스 막으로 제조된다. 스트립은 샘플, 바람직하게는 희석된 혈청 또는 혈장 샘플과 항온처리되며, FliD가 샘플 중의 항-FliD 항체를 검출하기 위해 고정되는 경우 항-FliD 항체가 시험 스트립 상의 FliD에 결합하고, 또는 항-FliD 항체가 샘플 중의 FliD를 검출하기 위해 고정되는 경우 FliD가 시험 스트립 상의 항-FliD 항체에 결합한다. 제2 단계에서, 스트립은 서양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링된 항-인간 면역글로불린 (IgG 및 IgA)와 함께 항온처리된다. 구체적으로, 결합된 항체는 퍼옥시다제에 의해 촉매된 염색 반응으로 검출된다. 상호작용 생성물을 형성하는 항원-항체 반응이 일어나는 경우, 검은 (dark) 밴드가 스트립 상에서 상응하는 지점에 나타날 것이다. 일 실시형태에서, 시험 스트립의 상부 말단의 대조군 밴드는 다음과 같다:
a) 모든 샘플에 대해 반응을 보여야 하는, 스트림 번호 아래의 반응 대조군 밴드.
b) 컨쥬게이트 대조군 밴드 (IgG, IgA)가 검출된 항체 부류를 체크하는데 사용된다. 예를 들어, IgG 항체의 검출을 위한 시험 스트립이 사용되는 경우, IgG 컨주게이트는 선명한 (clear) 밴드를 나타낼 것이다.
c) "컷-오프 대조군": 이 밴드의 세기는 각각의 항원 밴드의 반응성 평가를 가능하게 한다.
FliD와 상이한 항원과 함께 이러한 종류의 디자인을 갖는 검정은 기본적으로 Mikrogen GmbH (Neuried, Germany)로부터 "recomLine Helicobacter IgG" 또는 "recomLine Helicobacter IgA"로서 이용가능하다 (Ref: http://www.mikrogen.de/uploads/tx_oemikrogentables/dokumente/GARLHP001EN.pdf).
피험체로부터의 샘플에서 FliD를 검출하는 것을 포함하는, 피험체에서 헬리코박터, 더욱 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 검출하는 본 발명의 방법의 일 실시형태에서, FliD는, 예를 들어, 문헌 [Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998]에 기재된 질량 분광 분석에 의해 검출된다.
FliD가 피험체로부터의 샘플에서 검출되는 본 발명의 방법의 실시형태에서, FliD와 함께 상호작용 생성물을 형성하는 상호작용제는 바람직하게는 항체, 압타머 및 스피겔머를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것이다. 이러한 상호작용제의 생성은 당업자의 기술 범위에 속한다.
FliD에 결합하는, 보다 특히 FliD에 특이적으로 결합하는 항체의 생성은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Harlow, E., and Lane, D., "Antbodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)]에 기재되어 있다. 바람직하게는, Cesar 및 Milstein의 프로토콜 및 이에 기초하여 더욱 발전된 프로토콜에 따라 제조될 수 있는 모노클로날 항체가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 본원에 기재되는 바와 같은 항체는 적합하고 FliD에 결합할 수 있는 한, 이로 제한됨이 없이, 완전한 항체, 항체 단편 또는 유도체, 예를 들어, Fab 단편, Fc 단편 및 단일-가닥 항체를 포함한다. 모노클로날 항체와는 별도로, 폴리클로날 항체도 사용되고/되거나 생성될 수 있다. 폴리클로날 항체의 생성도 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Harlow, E., and Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)]에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 항체는 하나 또는 수개의 마커 또는 표지물을 가질 수 있다. 이러한 마커 또는 표지물은 항체를 검출하는데 유용할 수 있다. 바람직하게는, 마커 및 표지물은 아비딘, 스텝트아비딘, 바이오틴, 금, 효소, 예를 들어, HRP 및 플루오로세인을 포함하는 그룹 중에서 선택되고, 예를 들어, ELISA 방법에 사용된다. 이들 및 추가의 마커 및 방법이, 예를 들어, 문헌 [Harlow, E., and Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,(1988)]에 기재되어 있다.
압타머는 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 표적 분자, 예를 들어, 본원 발명에서는 FliD와 특이적으로 상호작용하는 D-핵산이다. 압타머의 제조 또는 선별은, 예를 들어, 유럽 특허 EP 0 533 838에 기재되어 있다. 기본적으로 하기 단계가 실현된다. 먼저, 핵산의 혼합물, 즉 잠재적 압타머가 제공되고 각각의 핵산은 통상적으로 수개, 바람직하게는 적어도 8개의 연속한 랜덤화된 뉴클레오타이드의 절편을 포함한다. 이어서, 이러한 혼합물은 표적 분자와 접촉되고 핵산(들)은, 예를 들어, 후보 혼합물과 비교하여 표적물에 대한 증가된 친화도에 기초하여 또는 이에 대한 보다 큰 힘으로 표적 분자에 결합한다. 이어서, 결합 핵산(들)은 혼합물의 나머지로부터 분리된다. 임의로, 이렇게 수득된 핵산(들)은, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 증폭된다. 이들 단계들을 수회 반복하여 마지막에 표적물에 대해 특이적으로 결합하는 핵산의 비율이 증가된 혼합물을 수득할 수 있으며 이로부터 최종적인 결합 핵산이 임의로 선별된다. 이러한 특이적으로 결합하는 핵산(들)을 압타머라 지칭한다. 압타머의 생성 또는 확인을 위한 방법의 임의의 단계에서 표준 기술을 이용하여 이의 서열을 측정하기 위해 각각의 핵산의 혼합물의 샘플을 취할 수 있다는 것이 분명하다. 본 발명의 범위 내에서 압타머는, 예를 들어, 압타머 생성에 대해 당업자에게 알려진 규명된 화학적 그룹을 도입함으로써 안정화될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 뉴클레오타이드의 슈가 모이어티의 2'-위치에 아미노 그룹을 도입하는 것일 수 있다.
표적 분자로서의 FliD에 결합하는, 더욱 특히 특이적으로 결합하는 스피겔머의 생성 또는 제조도 유사한 기준에 기초한다. 스피겔머의 제조는 국제 특허원 WO 98/08856에 기재되어 있다. 스피겔머는 L-핵산이며, 이는 이들이 압타머와 같은 D-뉴클레오타이드 보다는 L-뉴클레오타이드로 구성된다는 것을 의미한다. 스피겔머는 이들이 생물학적 시스템에서 매우 높은 안정성을 갖고, 압타머에 필적하게, 이들이 지시되는 표적 분자와 특이적으로 결합한다는 사실로 특징지어진다. 스피겔머를 생성하는 목적상, D-핵산의 이질 집단을 생성하고, 이러한 집단을 표적 분자의 광학적 대장체, 본 발명의 경우, 예를 들어, FliD의 천연 발생 L-에난티오머의 D-에난티오머와 접촉시킨다. 이어서, 표적 분자의 광학적 대장체와 상호작용하지 않는 D-핵산을 분리시킨다. 다른 한편에 있어서, 표적 분자의 광학적 대장체와 상호작용하는 D-핵산이 분리되고, 임의로 측정 및/또는 서열분석되고, 이어서 D-핵산으로부터 수득된 핵산 서열 정보에 기초하여 상응하는 L-핵산이 합성된다. 표적 분자의 광학적 대장체와 상호작용하는 상술된 D-핵산과 서열 측면에서 동일한 이들 L-핵산은 이의 광학적 대장체와 상호작용하기 보다는 천연 발생 표적 분자와 특이적으로 상호작용할 것이다. 압타머 생성 방법과 유사하게, 또한 다양한 단계를 수회 반복하고 이로써 표적 분자의 광학적 대장체와 특이적으로 상호작용하는 핵산을 농축시킬 수 있다.
피험체로부터의 샘플에서 FliD를 암호화하는 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 피험체에서 헬리코박터 감염, 보다 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 검출하는 본 발명의 방법의 실시형태에서, 상호작용제는 프라이머 및 프로브를 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 본원에 기재된 FliD의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 주어지는 한, 당업자의 기술 범위 내에서 이러한 프라이머 및 프로브가 디자인되고 제조된다 [참조: 예를 들어, Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998]. 이러한 상호작용제는 표지될 수 있다. 다양한 표지물 및 상호작용제에 표지물을 붙이는 방법이 당업자에게 알려져 있다. 일 실시형태에서, 표지물은 항체와 관련하여 상기 요약된 것과 동일하다.
FliD를 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편 및 상호작용제를 포함하는 상호작용 생성물은 당업자에 공지된, 예를 들어, 문헌 [ttspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998]에 기재된 수단으로 검출될 수 있다.
피험체로부터의 샘플에서 FliD를 암호화하는 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 피험체에서 헬리코박터 감염, 더욱 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 검출하기 위한 본 발명의 방법의 일 실시형태에서, FliD를 암호화하는 핵산은, 예를 들어, 문헌 [Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998]에 기재된 질량 분광 분석으로 검출된다.
피험체로부터의 샘플에서 FliD를 암호화하는 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 피험체에서 헬리코박터 감염, 더욱 바람직하게는 에이치. 필로리 감염을 검출하기 위한 본 발명의 방법의 일 실시형태에서, FliD를 암호화하는 핵산은, 예를 들어, 문헌 [Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998]에 기재된 다양한 형태의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 검출된다. 대안적으로, FliD를 암호화하는 핵산은, 예를 들어, 문헌 [Lottspeich F. and Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998]에 기재된 하이브리드화 검정에 의해 검출된다.
바이오마커와 관련된 본 발명의 양태에서, 본원에서 규명되는 바와 같은 FliD에 대한 면역 반응물, FliD 및 FliD를 암호화하는 핵산 각각은, 본원에서 규명되는 바와 같은 FliD에 대한 면역 반응물, FliD 및/또는 FliD를 암호화하는 핵산이 비치료 환자에서 조직학 및/또는 염증과 관련되기 때문에, 예측 (predictive) 바이오마커로서 작용한다는 것이 인식될 것이다.
당업자는 상기 제공된 기재가 제공되는 한, 본 발명의 키트의 특정한 디자인이 당업자의 일반적 기술 범위 내에 있다는 것을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 키트는 사용이 준비된 키트이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재되는 바와 같은 FliD의 검출을 위한 본원에 기재되는 바와 같은 상호작용제의 용도에 관한 것이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 샘플은 피험체로부터 직접적으로 수득되는 샘플, 또는 본 발명 및 특히 본 발명의 방법과 관련하여 사용하기 전 처리된 샘플이다.
본 발명의 다양한 양태의 일 실시형태 및 본 발명의 실시형태들에서, 피험체는 에이치. 필로리 감염을 앓는 것으로 추정되거나 앓는 것으로 의심되는 피험체이다.
일 실시형태에서, 헬리코박터 감염은 헬리코박터로의 감염 또는 헬리코박터를 갖는 추정되거나 의심되는 감염이다.
제1 화합물이 제2 화합물과 특이적으로 상호작용하거나 특이적으로 결합하는 본 발명의 임의의 양태의 일 실시형태에서, 제1 화합물과 제2 화합물 간의 상호작용 또는 결합은 1 μM 이하, 바람직하게는 0.25 μM 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 이하의 KD로 특징지어진다.
당업자는 FliD가 검출되는 실시형태에서 FliD가 전장 FliD 또는 FliD의 단편 또는 전장 FliD의 단편으로 존재할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본원에서 바람직하게 사용되는 전장 FliD는 병독성 인자로서 작용하는 헬리코박터에 의해 생성되는 FliD이다. 일 실시형태에서, 전장 FliD는 바람직하게는 헬리코박터에 의해 생성되는 FliD이다. 전장 FliD의 단편은 아미노산 서열이 전장 FliD의 아미노산 서열보다 짧은 단편이며 FliD의 단편은 여전히 병독성 인자로서 작용한다. FliD의 단편은 바람직하는 FliD, 바람직하게는 전장 FliD의 단편이며 단편은 당업자가 FliD 및 특히 전장 FliD의 단편이라는 것을 확인할 수 있고 FliD 및 특히 전장 FliD와 상이한 단백질 또는 폴리펩타이드의 단편을 배제시킬 수 있는 충분한 길이의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 전장 FliD는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
동일한 고려사항 및 정의가 동일하게 FliD를 암호화하는 핵산에 적용된다. 이에 따라, 당업자는 FliD를 암호화하는 핵산이 검출되는 실시형태에서 FliD를 암호화하는 핵산이 전장 FliD를 암호화하는 핵산 또는 FliD의 단편을 암호화하는 핵산 또는 전장 FliD의 단편을 암호화하는 핵산으로서 존재할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본원에서 바람직하게 사용되는 전장 FliD는 병독성 인자로서 작용하는 헬리코박터에 의해 생성되는 FliD이다. 일 실시형태에서, 잔장 FliD는 바람직하게는 헬리코박터에 의해 생성되는 FliD이다. 전장 FliD의 단편은 전장 FliD의 아미노산 서열보다 짧은 아미노산 서열의 단편이며 FliD의 단편은 여전히 병독성 인자로서 작용한다. FliD의 단편은 바람직하게는 FliD, 바람직하게는 전장 FliD의 단편이며 단편은 당업자가 FliD 및 특히 전장 FliD의 단편이라는 것을 확인할 수 있고 FliD 및 특히 전장 FliD와 상이한 단백질 또는 폴리펩타이드의 단편을 배제시킬 수 있는 충분한 길이의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 전장 FliD를 암호화하는 핵산은 서열번호 2에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
FliD를 암호화하는 핵산의 단편은 바람직하게는 FliD, 바람직하게는 전장 FliD를 암호화하는 핵산의 단편이며 핵산의 단편은 당업자가 FliD 및 특히 전장 FliD를 암호화하는 핵산의 단편이라는 것을 확인할 수 있고 FliD 및 특히 전장 FliD와 상이한 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 단편을 배제시킬 수 있는 충분한 길이의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
또한, 당업자는 본원에서 규명되는 바와 같은 FliD에 대한 면역 반응이 검출되는 본 발명의 방법의 실시형태에서, 본원에서 규명되는 바와 같은 FliD에 대한 면역 반응과 반응하는 FliD가 피험체를 감염시키는 또는 아마도 피험체를 감염시키는 헬리코박터 종에 의해 생성되는 FliD, 본원에서 규명되는 바와 같은 전장 FliD, 또는 본원에서 규명되는 바와 같은 FliD의 단편일 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, FliD의 단편은, 일 실시형태에서, FliD보다 짧은 아미노산을 갖는 FliD의 단편이고 단편은 본 발명의 방법의 상기 실시형태에서 본원에서 규명되는 FliD에 대한 면역 반응물과의 특이적 상호작용 또는 특이적 검출이 가능하게 사용될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 본 발명의 다양한 양태와 관련하여 및/또는 본 발명의 다양한 실시형태와 관련하여 사용되는 FliD를 암호화하는 핵산을 표적하는 프라이머는 하기를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 것이다: 서열번호 21에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 22에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 23에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 24에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 25에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 26에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 서열번호 27에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 28에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머. 바람직하게는, 프라이머는 하기의 적어도 2개의 프라이머의 조합이다:
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 21에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 22에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 21에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 24에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 21에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 26에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 21에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 28에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 23에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 22에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 23에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 24에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 23에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 26에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 23에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 28에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 25에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 22에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 25에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 24에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 25에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 26에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 25에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 28에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 27에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 22에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 27에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 24에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머;
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 27에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 26에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머; 또는
적어도 2개의 프라이머의 제1 프라이머가 서열번호 27에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 적어도 2개의 프라이머의 제2 프라이머가 서열번호 28에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머.
본원에 인용되는 다양한 서열번호, 상기 서열번호에 의해 표시되는 화합물 및, 일부의 경우, 공개적으로 이용가능한 데이터뱅크에서 서열의 상응하는 등재의 표시가 하기 표 1에 요약되어 있다:
서열번호 1은 GenBank 등재 ACI27464.1에 상응하는 에이치. 필로리에 의해 발현되는 FliD의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 Genbank 등재 CP001173.1에 상응하는 에이치. 필로리에 의해 발현되는 FliD의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 3은 NCBI 참조 서열 WP_006563874.1에 상응하는 에이치. 수이스에 의해 발현되는 FliD의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 GenBank 등재 ADGY01000008.1에 상응하는 에이치. 수이스에 의해 발현되는 FliD의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 5는 NCBI 참조 서열 YP_004073770.1에 상응하는 에이치. 펠리스에 의해 발현되는 FliD의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 GenBank 등재 FQ670179.2에 상응하는 에이치. 펠리스에 의해 발현되는 FliD의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 7은 NCBI 참조 서열 YP_002266135.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 CagA의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 GenBank 등재 JQ318032.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 CagA의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 9는 NCBI 참조 서열 YP_002266461.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 VacA의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 NCBI 참조 서열 NC_011333.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 VacA의 핵산 서열 (cDNA)이다.
서열번호 11은 NCBI 참조 서열 YP_002265651.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 GroEL의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 NCBI 참조 서열 NC_011333.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 GroEL의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 13은 NCBI 참조 서열 NP_207029.1에 상응하는 에이치. 필로리 26695의 Hp0231의 아미노산 서열이다.
서열번호 14는 NCBI 참조 서열 NC_000915.1에 상응하는 에이치. 필로리 26695 의 Hp0231의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 15는 NCBI 참조 서열 NP_223657.1에 상응하는 에이치. 필로리 J99의 JHp0940의 아미노산 서열이다.
서열번호 16은 NCBI 참조 서열 NC_000921.1에 상응하는 에이치. 필로리 J99의 JHp0940의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 17은 NCBI 참조 서열 YP_002266040.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 HtrA의 아미노산 서열이다.
서열번호 18은 NCBI 참조 서열 NC_011333.1에 상응하는 에이치. 필로리 G27의 HtrA의 뉴클레오타이드 서열 (cDNA)이다.
서열번호 19는 에이치. 필로리로부터의 FliD 유전자의 클로닝에 사용되는 프라이머이다.
서열번호 20은 에이치. 필로리로부터의 FliD 유전자의 클로닝에 사용되는 프라이머이다.
서열번호 21은 실시예 9의 PCR1에 사용되는 전방 프라이머이다.
서열번호 22는 실시예 9의 PCR1에 사용되는 후방 프라이머이다.
서열번호 23은 실시예 9의 PCR2에 사용되는 전방 프라이머이다.
서열번호 24는 실시예 9의 PCR2에 사용되는 후방 프라이머이다.
서열번호 25는 실시예 9의 PCR3에 사용되는 전방 프라이머이다.
서열번호 26은 실시예 9의 PCR3에 사용되는 후방 프라이머이다.
서열번호 27은 실시예 9의 PCR4에 사용되는 전방 프라이머이다.
서열번호 28은 실시예 9의 PCR4에 사용되는 후방 프라이머이다.
뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열 및 특히 cDNA 서열인 경우, 슈가 모이어티가 데옥시리보뉴클레오타이드 보다는 리보뉴클레오타이드이라는 점에서만 이러한 DNA 서열 및 cDNA 서열과 상이한 RNA 서열도 본원에 기재된다는 것을 당업자를 이해할 것이다.
본 발명은 보호 범위를 제한하려는 것이 아닌 하기 도면 및 실시예에 의해 더욱 설명된다. 상기 도면 및 실시예로부터 추가의 특징, 실시형태 및 이점이 취해질 수 있다.
도 1은 조직학적으로 에이치. 필로리 양성으로 진단된 20명의 인간 환자로부터의 혈청 샘플에서 항-FliD 항체를 검출하기 위한 본 발명의 방법에 사용되는 라인 검정의 실시형태를 도시한다.
도 2는 인간 피험체로부터의 전혈 샘플과 같은 샘플에서 항-FliD 항체를 검출하기 위한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 측방 유동 검정의 실시형태를 도시하며, 도 2A는 검정의 개략적 디자인을 설명하며, 도 2B는 검정 결과를 도시한다.
도 3은 에이치. 필로리 박멸 후의 햇수 (years)의 함수로서 인간으로부터의 샘플에서 항-FliD 반응의 유병률을 나타내는 도표이다.
도 4는 2개의 잘 알려진 항원과 비교된 FliD에 대한 ROC 곡선을 도시한다.
도 5는 마우스 항-FliD 혈청 (Tig 또는 gGT에 대해서는 아님)을 사용하여 다양한 농도에서 FliD를 검출하는 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
도 6은 에이치. 필로리-양성으로 진단되었던 환자로부터의 대표적인 샘플에 존재하는 게놈 DNA의 검출을 위한 폴리머라제 연쇄 반응 1 (PCR1), 폴리머라제 연쇄 반응 2 (PCR2), 폴리머라제 연쇄 반응 3 (PCR3) 또는 폴리머라제 연쇄 반응 4 (PCR4)를 사용하는 일련의 서던 블롯을 도시한다.
도 7은 배양된 에이치. 필로리의 전체 단백질 용해물을 사용하여 수행된 대표적인 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다.
도 8은 FliD가 각각의 웨스턴 블롯 아래에 나타낸 미생물에 의해 발현되는지를 측정하기 위한 2개의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다.
실시예 1: 에이치. 필로리 FliD 유전자의 클로닝
모든 DNA 조작은 문헌 (Sambrook, et al., 1989)에 기재된 바와 같이 표준 조건 하에서 수행하였다. 간단히 설명하면, FliD 유전자를 템플레이트로서 에이치. 필로리 스트레인 J99로부터의 게놈 DNA를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 하기 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하였다: 5'- CAT ATG GCA ATA GGT TCA TTA A-3' (서열번호 19) 및 5'- CTC GAG ATT CTT TTT AGC CGC TGC-3' (서열번호 20). 이러한 접근을 이용하여, NdeI 부위를 전방 (forward) 프라이머의 5'-말단에 도입하고, XhoI 부위를 후방 (reverse) 프라이머의 5'-말단에 도입하였다. PCR 증폭 후, 생성물 (2058 bp)을 pTZ57R / T 클로닝 벡터 (InsTAclone™ PCR Cloning Kit, MBI Fermentas, Lithuania)에 결합하였다. 이어서, 삽입물을 PCR 및 서열분석을 통해 확인하고, NdeI 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 PET-28a(+) 발현 벡터 (Qiagen, USA)로 클로닝하였다.
실시예 2: 재조합 FliD의 발현, 정제 및 인식
이. 콜리 BL21 (Qiagen, USA) 컴피턴트 세포를 pET-28a(+)-fliD로 형질전환하고 항생제 (카나마이신, 50μg /ml)을 갖는 LB 브로쓰에 접종하였다. 0.6의 광학 밀도 (OD600)에서 1 mmol/L 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 4시간 후, 세포를 수거하고, 전체 용해물의 단백질 분석을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 수행하였다. 가용성 히스티딘-태깅된 단백질을 친화성 크로마토그래피 (HisTrap crude, GE Healthcare)를 사용하여 정제하였다. 제2의 폴리싱 단계로서 및 버퍼 교환을 위해, 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 75, GE Helthcare)를 수행하였다. 관련 분획물을 수집하고 10 kDa의 컷 오프를 갖는 원심분리 필터 디바이스 (Millipore)로 농축시키고 -80℃에서 저장하였다. 정제된 재조합 단백질을 항-His 태그-HRP 항체 및 마우스 항-에이치. 필로리-HRP 항체 (Pierce, Rockford, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 평가하고, ECL 시스템 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)으로 검출하였다.
에이치. 필로리 스트레인 J99 DNA로부터의 FLiD 유전자의 증폭은 서열분석에 의해 확인된 2.05 kb의 단일 PCR 생성물을 나타내었으며 (자료 제시되지 않음), 발현 벡터 pET-28a(+)에 결합시켰다. 이. 콜리 발현 스트레인 BL21 DE3로의 형질전환 및 IPTG로의 유도 후, 시판되는 폴리클로날 항-에이치. 필로리 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 선명한 단일 밴드를 관측할 수 있었다. 단백질을 90% 초과의 순도로 재료 및 방법에서 기재된 바와 같이 정제하고 (자료 제시되지 않음), 다시 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (자료 제시되지 않음).
실시예 3: rFliD 특이적 항체의 생산 및 정제
성숙한 화이트 뉴질랜드 토끼를 약간 변형된 Hay 등의 프로토콜 (Hay, et al., 2002)에 따라 정제된 단백질로 면역화시켰다. 간단히, 250 μg의 정제된 재조합 단백질 (0.5 ml)을 동일한 용적 (0.5 ml)의 프로인트 완전 애주번트와 함께 i.m. 주사하여 면역화를 수행하였다. 리콜 면역화를 위해, 4, 6, 8 및 10주 후 동일한 용적 (0.5 ml)의 프로인트 불완전 애주번트에 제조된 125 μg의 정제된 단백질로 토끼를 부스팅하였다. 음성 대조군으로서, 혈청 샘플을 면역화 전에 취하였다. 마지막으로, 마지막 면역화 후 2주에 혈액을 수집하고 혈청을 분리시켰다. 폴리클로날 IgG 항체를 제조자의 프로토콜 (Pharmacia, 1988)에 따라 제조된 rFliD 컨쥬게이트된 컬럼을 사용하여 세파로스-4B 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 에이치. 필로리 (J99)의 FliD 발현을 50 μg/ml의 단백질 농도로 초음파 상등액을 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다. rFliD 단백질에 대해 생성된 토끼 폴리클로날 IgG 항체를 제1 항체 (1:5000 희석)로 사용하고, 토끼 IgG에 대한 HRP-표지된 양 항체 (Avicenna Research Institute, Tehran, Iran)를 제2 항체 (1:3000 희석)로 사용하였으며, ECL 시스템을 검출에 사용하였다 (Chen, et al., 2001).
또한, 재조합 FliD의 항원성을 시험하고 이를 천연 단백질과 비교하기 위해서, 토끼 폴리클로날 항혈청을 생성하였다. 항체 역가는 제3 면역화 후 이미 측정되었으며, 제4 부스팅 후 높은 수준에 도달하였는데, 이는 FliD에 대한 우수한 면역원성을 입증한다. 토끼 항혈청은 정제된 rFliD 및 에이치. 필로리 용해물 중의 FliD를 인식할 수 있었다 (자료 제시되지 않음).
실시예 4: ELISA의 개발
ELISA 플레이트를 PBS 중 1 μg/ml 농도의 100 μl의 rFliD 단백질로 코팅하고, 4℃에서 밤새 항온처리 하였다. 코팅된 웰을 37℃에서 2시간 동안 2.5% 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma)을 포함하는 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 차단하였다. 본 연구에 사용된 모든 에이치. 필로리 양성 및 음성 혈청학적 샘플을 제1 항체로서 환자 혈청의 최적 희석물 (1:100 희석), 제2 항체로서 HRP-컨쥬게이트된 항-인간 IgG (Promega, Mannheim, Germany) (1:100 희석) 및 기질로서 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘)을 사용하여 FliD에 대한 항체에 대해 스크리닝하였다. 또한, 웰을 각각의 혈청에 대한 대조군으로서 코팅하지 않은 상태로 두었다. 환자의 혈청 샘플에 대한 ELISA의 결과는, OD450 값이 음성 혈청 샘플의 평균 + 3 SD을 초과하는 경우, 양성으로 간주하였다 (Chen, et al., 2001).
실시예 5: FliD 라인 검정의 개발
니트로셀룰로스에 고정된 재조합 에이치. 필로리 단백질에 기초한 라인 면역검정을 제조하였다. ELISA와는 대조적으로, 시험 원칙은 상이한 단일 항원의 별도의 적용을 통해 에이치. 필로리의 다양한 항원에 대한 특이적 항체의 확인을 가능하게 한다.
rFliD를 다른 고도로 정제된 재조합 에이치. 필로리 항원 (CagA, VacA, GroEL, UreA (우레아제 A), HcpC (시스테인 농축 단백질 C) (Mittel et al., 2003) 및 gGT (감마 글루타밀 트랜스퍼라제)와 함께 니트로셀룰로스 막 스트립 상에 고정시켰다. rFliD에 대한 적합한 라인 조건은 20개의 규명된 에이치. 필로리 조직학적 양성 샘플 및 20개의 규명된 에이치. 필로리 조직학적 음성 샘플을 포함하는 이전에 보고된 연구 집단으로부터의 표준 혈청 샘플의 선정과 함께 경험적으로 결정되었다. 최적 항원 농도 및 계면활성제, 디티오트레이톨 및 NaCl과 같은 첨가제의 이상적 선택은 라이닝 및 스크리닝의 반복 주기에 의해 각각의 항원에 대해 조정되었다. 항원 에피토프의 최상의 제시 및 막에 대한 최적 결합을 위한 조건 (완벽한 밴드 출현 및 음성 및 양성 샘플의 최상의 구분으로 관측가능)을 제1 로트의 이상적 산물 사양을 위해 선택하였다. 대조군 밴드를 항온처리 대조군으로서 토끼 항-인간 IgG/IgM/IgA 항체 및 컨쥬게이트 대조군 및 각각의 항원 밴드의 반응성 평가를 가능하게 하는 컷 오프 대조군으로서 인간 IgG, IgM 또는 IgA 항체를 포함하는 스트립의 상부 말단에 부가하였다.
밴드 강도의 스캐닝 및 밀도계측 분석 후, 각각의 밴드에 대한 비율을 계산하기 위해서 내부 참조로서 대조군을 사용하였다. 통상적으로, 컷 오프 대조군 밴드는 20 내지 30 사이로 스코어링되고, 강한 양성 밴드는 600 포인트 이하로 스코어링될 수 있다. 각각의 스트립의 개별적 대조군 보다 큰 모든 밴드 스코어링은 양성으로 간주된다 (비율 > 1).
각각의 라인 검정이 도 1에 도시된다.
실시예 6: 에이치. 필로리의 진단을 위한 측방 유동 검정의 프로토타입 (prototype)
상기 규명된 재료를 사용하여, 측방 유동 검정의 디자인과 관련된 본원에 기재된 원칙에 기초하여 측방 유동 검정을 개발하였다.
이러한 측방 유동 검정의 프로토타입이 도 2에 도시되며, 도 2A는 검정의 개략적 디자인을 설명하며, 도 2B는 검정을 이용한 인간으로부터 수득된 샘플의 분석 결과를 도시하며, 여기서 항-FliD 항체가 검출되었다.
도 2A로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 검정은 항-hIgG 코팅된 금 나노입자를 사용하였다. rFliD 및 재조합 CagA는 항원으로 존재하였다. hIgG도 또한 대조군으로서 고정되었다. 다공성 구조물이 니트로셀룰로스에 의해 형성되었다. 대조군 밴드는 시스템이 적절히 작동된다는 것을 나타내었다. FliD 밴드는 환자가 활성 또는 새로이 처리된 감염을 가졌다는 것을 나타내었다. CagA 밴드는, 활성 감염 (+FliD q밴드)의 경우, 이러한 감염이 치료되어야 한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 인간으로부터의 샘플의 분석
총 618명의 인간 환자 (308명의 남자, 310명의 여자)를 연구 명부에 올렸다. 연구 목적을 설명한 후, 임의의 치료를 시작하기 전에, 각각의 환자로부터 고지에 입각한 동의를 얻고 내시경 검사시에 채혈하였다. 혈청을 분리시키고 -20℃에서 저장하였다. 감염의 진단은 골드 스탠다드로서 (as gold standard) 조직병리학에 기초하였다. 조직병리학 결과가 양성인 경우, 환자는 에이치. 필로리 양성을 간주되었다. 모든 환자는 FliD 라인 검정에 의해 스크리닝되었으며, 246개 혈청의 서브세트를 상기 기재된 FliD ELISA 및 상기 기재된 라인 검정으로 시험하였다.
표 2는 상기 FliD ELISA를 사용하는 결과를 나타낸다. 보다 구체적으로, 표 2는 에이치. 필로리 음성 및 양성 인간 환자를 비교하는 ELISA에서의 FliD 혈청학적 반응을 나타낸다.
조직학 합계
음성 양성
ELISA
 음성 73 8 81
양성 3 162 165
합계 76 170 246
표 3은 아그룹의 환자 그룹에 대해 상기 라인 검정을 이용한 결과를 나타낸다. 보다 구체적으로, 표 3은 에이치. 필로리 음성 및 양성 환자를 비교하는 라인 검정에서의 FliD 혈청학적 반응을 나타낸다.
조직학 합계
음성 양성
ELISA
 음성 76 14 90
양성 0 156 156
합계 76 170 246
FliD ELISA를 이용하여, 170개의 양성 보고 샘플 중에서 165개의 양성 샘플을 검출하였으며, 음성으로 보고된 76개의 샘플 중에서 73개는 ELISA에 의해 음성으로 재확인되었다 (표 2). 종합하면, 에이치. 필로리 감염의 ELISA 기반 진단에서 FliD의 적용은 96%의 특이성 및 97%의 민감성을 갖는다. 흥미롭게도, ELISA 음성이었던 5개의 경우도 컷 오프 (1.2 내지 2.2 범위의 비율) 바로 위였던 라인 블롯에서 낮지만 가까스로 양성인 스코어를 가졌다. 또한, 이들 중 하나는 라인 블롯에 의해 에이치. 필로리 음성으로 평가되었으며, 다른 4개는, 수개의 다른 항원과 반응하는, 라인 블롯 양성이었다 (자료 제시되지 않음). 단지 하나의 샘플만이 두 시험 모두에서 음성이었다는 것에 주목하는 것이 중요하다.
618명의 인간 환자 (이중 일부는 ELISA에 의해 스크리닝되었다)의 전체 그룹을 FliD에 대한 항체 반응에 대해 라인 검정을 이용하여 분석하였다. 조직병리학에서 양성을 평가된 318명의 환자 중 310명이 라인 검정에 의해 양성으로 평가되는 97.4%의 고민감도이고, 상기 라인 검정은 99%의 특이성에 도달한다 (표 2). 차이가 나는 결과를 보인 환자로부터의 결과를 주의깊게 검사하였다. 8개의 혈청은 라인 검정에서 FliD에 대해 음성이었으나, 다른 항원과는 반응성을 나타내었으며, 이는 확실히 FliD가 항원으로 인식되지 않았다는 것을 나타낸다. 이들 8개의 샘플 중에서 하나는 FliD 밴드에 대해 전혀 반응성이 없었다. 7개는 가까스로 컷 오프 (0.6 내지 0.96의 비율) 아래인 약한 반응성을 가졌으며, 이들 중 4개는 일반적으로 모든 다른 인식 항원에 대해 약한 반응성을 가졌다 (제시되지 않음). FilD가 "거짓 양성" 결과를 제공한 3개의 샘플 모두는 다른 밴드와도 반응성을 나타내었다. FliD를 포함하는 이들 밴드 모두는 비교적 약하지만 분명히 컷 오프 보다 높았다.
상기 샘플로부터 항-FliD 항체 반응의 유병률을 박멸 햇수의 함수로서 측정하였다. 그 결과가 도 3에 나타나 있다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 에이치. 필로리를 박멸한 지 16 내지 20년 후, 항-FliD 항체 반응의 유병률이 여전히 약 25%이다.
상기 샘플로부터 수신자 조작 특성 (receiver operating characteristics: ROC) 곡선을 FliD, CagA 및 UreA에 대해 작성하였다. 그 결과가 도 4에 도시된다. 상기 도 4로부터 FliD가 에이치. 필로리 감염의 검출에 사용된 종래 기술의 2개의 항원에 비해 유리하다는 것이 분명하다.
실시예 8: FliD 서열의 생물정보 분석
생물정보 기술을 이용하여, 에이치. 필로리 G27 스트레인의 FliD 단백질을 다른 유기체, 주로 원핵생물과 광범위하게 비교하였다. 이 분석은 200개의 에이치. 필로리 스트레인들 간에 97% 초과의 상동성을 보인다.
그 결과가 표 4에 나타나 있다.
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실시예 9: 에이치. 필로리에서 FliD의 존재 및 발현
샘플
사람 환자로부터의 81개의 에이치. 필로리 분리물을 연구 명부에 올렸다. 샘플은 선별 플레이트 상에서의 통상의 세균 배양에 의해 양성으로 진단되었다. 이러한 시험에서, 세균을 36시간 동안 미호기성 조건 (10% CO2, 5% O2, 8.5% N2, 및 37℃) 하에서 윌킨스-찰그렌 (Wilkins-Chalgren) 혈액 아가 플레이트 상에서 성장시켰으며, 옥시다제, 카탈라제 및 우레아제에 대한 양성을 생화학 시험으로 확인하였다. 배양된 세균의 일부를 DNA 분리에 사용하고, 나머지를 웨스턴 블롯 분석을 위한 단백질 용해물 제조에 적용하였다.
폴리클로날 마우스 항- FliD 혈청
3마리의 C57BL6 마우스를 PBS 중에 재현탁된 30 μg의 재조합 에이치. 필로리 FliD (항원) 및 10 μg의 CT (콜레라 독소) (애주번트)로 3회 (매주) 면역화시켰다. 마지막으로 면역화 부스팅한 지 1주 후, 마우스로부터 채혈하고 혈청을 푸울링하였다. 푸울링된 혈청의 항원성 및 특이성을 웨스턴 블롯 분석으로 시험하였다.
웨스턴 블롯 분석
검정에 대한 최적 조건을 확립하기 위해서, 상이한 농도의 재조합 FliD 단백질 및 동일한 조건 하에서 제조 및 정제된 다른 재조합 대조군 단백질 [Tig (Trigger 인자 (Tomb et al., 1997)) 및 gGT]을 8% SDS 겔에 적용하였다. 니트로셀룰로스 막 (Whatman/GE Healthcare, Freiburg, Germany) 상에 단백질을 블로팅한 후, 막을 실온에서 1시간 동안 5% 탈지 우유에서 차단하고, 1차 항체로서 항-혈청의 상이한 희석물과 함께 밤새 항온처리하였다. 막을 HRP-표지된 항-마우스 IgG와 함께 항온처리한 후, ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약을 첨가함으로써 밴드를 검출할 수 있었다.
그 결과가 도 5에 도시되며, 도시된 SDS 겔의 우측에 각각의 레인에 적용된 항원 및 이의 농도가 표시된다. 마우스 항 혈청의 최적 희석물 (1:2000)이 사용되었다.
에이치. 필로리 게놈에서 FliD ORF 존재의 PCR 분석
서열번호 2에 대한 FliD의 DNA 서열에 기초하여 4개의 PCR을 디자인하였다. 표 5에 나타난 바와 같은 각각의 프라이머 쌍의 특이성을 유전자 뱅크의 모든 세균 뉴클레오타이드 서열에 대한 블라스트 분석으로 확인하였다. PCR을 양성 대조군으로서 에이치. 필로리 및 음성 대조군으로서 10개의 다른 미생물의 게놈 DNA를 사용하여 확립하였다. PCR을 GoTaq 폴리머라제 매스터 믹스 (Promega), 56℃의 어닐링 온도 및 30초 연장 시간을 사용하여 수행하였다.
PCR 분석에 사용된 프라이머
전방 프라이머 후방 프라이머 앰플리콘의 길이 (bp)
PPCR1 AGC TCA TTA GGG CTT GGC AG
(서열번호 21)		 GCT CGC GCT CAA CGC ATC
(서열번호 22)		 246
PPCR2 ATC ACG GAC GCT ACC AAT GG
(서열번호 23)		 AGG GAC TTC ATG CAT GCT CC
(서열번호 24)		 288
PPCR3 CAC AGA CGC TAT CAT TCA AGC
(서열번호 25)		 CCC GCT GAT CAC ATC ATT GAC
(서열번호 26)		 300
PPCR4 CGC TAA CCT CAT AGA TGG AGG
(서열번호 27)		 TAA GCG GCA AAG CGC TCC G
(서열번호 28)		 150
결과
FliD의 ORF는 모든 에이치. 필로리 환자 분리물 (환자 생검으로부터 분리된 배양된 세균)에 존재한다. FliD의 OFR의 존재는 이러한 검정에 사용된 모든 4개의 PCR에 의해 확인될 수 있었다. 81개의 에이치. 필로리 샘플로부터의 분리된 DNA에 의해 수행된 PCR1, PCR2 및 PCR3는 전체적으로 양성이었다. 반면, PCR4는 79개의 샘플에 대해 양성이었다 (도 6). 검정의 특이성은 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) (ATCC 27813), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca) (ATCC 700324), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) (ATCC 90028), 엔트로코쿠스 패칼리스 (Entrococcus faecalis) (ATCC 29292), 스트렙. 그룹 A (Strep. Group A) (ATCC 19615), 에스. 티피무륨 (S. thyphimurium) (ATCC 13311), 에스. 아우레우스 (S. aureus) (ATCC 25923), 에스. 에피더미디스 (S. epidermidis) (ATCC 18228), 에이치. 인플루엔재 (H. influensae) (ATCC 49247) 및 이. 콜리 (E. coli) (ATCC 25922)로부터 분리된 DNA를 적용함으로써 확인되었다.
환자의 생검으로부터 분리된 배양된 에이치. 필로리로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 수행된 대표적인 PCR 분석 결과를 도시하는 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, FliD의 ORF (개방 판독 프레임)는 거의 모든 에이치. 필로리 분리물에서 제시된다. 따라서, PCR 결과는 게놈 DNA에서 FliD의 존재를 확인한다. 도 6에서, 레인 위의 숫자는 내부 샘플 번호를 나타낸다.
에이치. 필로리-양성으로 진단된 환자로부터의 샘플에서 FliD 단백질의 검출에 대해, FliD 단백질이 샘플의 97.5%에서 검출가능하다. 웨스턴 블롯 분석을 이용하여, FliD 단백질이 81개의 에이치. 필로리 단백질 용해물 중 79개에서 검출가능한 것으로 입증될 수 있었다. 그 결과가 도 7에 도시된다. 도 7에서 레인 위의 숫자는 내부 샘플 번호를 나타낸다.
다른 미생물로부터의 단백질 용해물을 웨스턴 블롯 분석으로 분석시, 검정의 특이성을 음성 결과를 통해 확인하였다. 이의 결과가 도 8에 도시된다. 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 스트렙트아비딘 태그를 갖는 재조합 FliD (2개의 웨스턴 블롯 모두의 레인 2) 및 스트렙트아비딘 태그를 갖지 않는 재조합 FliD (2개의 웨스턴 블롯 모두의 레인 3)을 제외하고, 피. 아에루기노사 (ATCC 27813) (좌측 웨스턴 블롯, 레인 4), 클렙시엘라 옥시토카 (ATCC 700324) (좌측 웨스턴 블롯, 레인 5), 칸디다 알비칸스 (ATCC 90024) (좌측 웨스턴 블롯, 레인 6), 엔테로코쿠스 패칼리스 (ATCC 29292) (좌측 웨스턴 블롯, 레인 7), 스트렙토코쿠스 그룹 A (ATCC 19615) (좌측 웨스턴 블롯, 레인 8), 에스. 티피무륨 (ATCC 13311) (우측 웨스턴 블롯, 레인 4), 에스. 아우레우스 (ATCC 25923) (우측 웨스턴 블롯, 레인 5), 에스. 에피더미디스 (ATCC 18228) (우측 웨스턴 블롯, 레인 6), 에이치. 인플루엔재 (ATCC 49247) (우측 웨스턴 블롯, 레인 7), 및 이. 콜리 (ATCC 25922) (우측 웨스턴 블롯, 레인 8)로부터의 단백질 용해물.
본 명세서에서, 종래 기술에 대한 다양한 문서들이 언급되며, 이의 완전한 참조가 하기와 같으며, 참조로 삽입된다.
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본 명세서, 서열 목록, 청구범위 및/또는 도면에 기재된 본 발명의 특징은 개별적으로 및 조합하여 본 발명을 다양한 형태로 실현하기 위한 소재일 수 있다.
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Gly Asp Val Ala Gln Ser Ile Thr Asp Ala 145 150 155 160 Thr Asn Gly Glu Val Met Gly Ile Val Met Lys Thr Gly Gly Asn Asp 165 170 175 Pro Tyr Gln Leu Met Val Asn Thr Lys Asn Thr Gly Glu Asp Asn Arg 180 185 190 Ile Tyr Phe Gly Ser His Leu Gln Ser Thr Leu Thr Asn Lys Asn Ala 195 200 205 Leu Ser Leu Gly Val Asp Gly Ser Gly Lys Ser Glu Val Ser Leu Asn 210 215 220 Leu Lys Gly Ala Asp Gly Asn Thr His Glu Val Pro Ile Met Leu Glu 225 230 235 240 Leu Pro Glu Ser Ala Ser Ile Lys Gln Lys Asn Thr Ala Ile Gln Lys 245 250 255 Ala Ile Glu Gln Ala Leu Glu Asn Asp Pro Asn Phe Lys Asp Leu Ile 260 265 270 Ala Asn Gly Asp Ile Ser Ile Asp Thr Leu His Gly Gly Glu Ser Leu 275 280 285 Ile Ile Asn Asp Arg Arg Gly Gly Asn Ile Glu Ile Lys Gly Ser Lys 290 295 300 Ala Lys Glu Leu Gly Phe Leu Gln Thr Thr Thr Gln Glu Ser Asp Leu 305 310 315 320 Leu Lys Ser Ser Arg Thr Ile Lys Glu Gly Lys Leu Glu Gly Val Ile 325 330 335 Ser Leu Asn Gly Gln Lys Leu Asp Leu Lys Ala Leu Thr Lys Glu Gly 340 345 350 Asn Thr Ser Glu Glu Asn Thr Asp Ala Ile Ile Gln Ala Ile Asn Ala 355 360 365 Lys Glu Gly Leu Ser Ala Phe Lys Asn Ala Glu Gly Lys Leu Val Ile 370 375 380 Asn Ser Lys Thr Gly Met Leu Thr Ile Lys Gly Glu Asp Ala Leu Gly 385 390 395 400 Lys Ala Ser Leu Lys Asp Leu Gly Leu Asn Ala Gly Met Val Gln Ser 405 410 415 Tyr Glu Ala Ser Gln Asp Thr Leu Phe Met Ser Lys Asn Leu Gln Lys 420 425 430 Ala Ser Asp Ser Gln Phe Thr Tyr Asn Gly Val Ser Ile Thr Arg Pro 435 440 445 Thr Asn Glu Val Asn Asp Val Ile Asn Gly Val Asn Ile Thr Leu Glu 450 455 460 Gln Thr Thr Glu Pro Asn Lys Pro Ala Ile Ile Ser Val Ser Arg Asp 465 470 475 480 Asn Gln Ala Ile Ile Asp Ser Leu Lys Glu Phe Val Lys Ala Tyr Asn 485 490 495 Glu Leu Ile Pro Lys Leu Asp Glu Asp Thr Arg Tyr Asp Ala Asp Thr 500 505 510 Lys Ile Ala Gly Ile Phe Asn Gly Val Gly Asp Ile Arg Thr Ile Arg 515 520 525 Ser Ser Leu Asn Asn Val Phe Ser Tyr Ser Val His Thr Asp Asn Gly 530 535 540 Val Glu Ser Leu Met Lys Tyr Gly Leu Ser Leu Asp Asp Lys Gly Val 545 550 555 560 Met Ser Leu Asp Glu Ala Lys Leu Ser Ser Thr Leu Asn Ser Asn Pro 565 570 575 Lys Ala Thr Gln Asp Phe Phe Tyr Gly Ser Asp Ser Lys Asp Met Gly 580 585 590 Gly Arg Glu Ile His Gln Glu Gly Ile Phe Ser Lys Phe Asn Gln Val 595 600 605 Ile Ala Asn Leu Ile Asp Gly Gly Asn Ala Lys Leu Lys Ile Tyr Glu 610 615 620 Asp Ser Leu Asp Arg Asp Ala Lys Ser Leu Thr Lys Asp Lys Glu Asn 625 630 635 640 Ala Gln Glu Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Asn Ile Met Ala Glu Arg Phe 645 650 655 Ala Ala Tyr Asp Ser Gln Ile Ser Lys Ala Asn Gln Lys Phe Asn Ser 660 665 670 Val Gln Met Met Ile Asp Gln Ala Ala Ala Lys Lys Asn 675 680 685 <210> 2 <211> 2058 <212> DNA <213> H. pylori <220> <221> misc_feature <223> H. pylori strain G27 <400> 2 atggcaatag gttcattaag ctcattaggg cttggcagta aggttttgaa ttacgatgtg 60 attgacaagc ttaaggacgc cgatgaaaaa gcgttaatcg cccccttaga caagaaaatg 120 gagcaaaatg ttgaaaagca aaaagccctt gtagaaatta aaacgctcct ttcatctcta 180 aaaggcccgg ttaaaacgct ttcggattat tccacttata tcagccgaaa aagcaatgtt 240 acaggcgatg cgttgagtgc gagtgtgggg 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agcgctttgc ggcttatgac 1980 agccaaatct ctaaagccaa tcaaaaattc aattccgtgc aaatgatgat cgatcaagcg 2040 gcggctaaaa agaattaa 2058 <210> 3 <211> 689 <212> PRT <213> H. suis <400> 3 Met Ala Ile Gly Lys Leu Ser Ser Leu Gly Ile Gly Ser Lys Val Leu 1 5 10 15 Asn Tyr Asp Val Ile Asp Lys Leu Lys Ser Ala Asp Glu Lys Thr Met 20 25 30 Val Ala Pro Ile Asp Arg Lys Met Glu Val Asn Leu Glu Lys Gln Lys 35 40 45 Ala Leu Val Glu Ile Lys Thr Leu Leu Ala Asn Leu Lys Ala Pro Val 50 55 60 Ser Ala Leu Thr Asp Tyr Ser Thr Tyr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Val 65 70 75 80 Ser Ser Gly Ala Leu Lys Ala Ser Val Ser Pro Gly Ile Pro Val Gln 85 90 95 Asp Ile Lys Val Glu Val Glu Asp Leu Ala Gln Gly Asp Ile Asn Glu 100 105 110 Val Gly Thr His Phe Arg Asp Arg Asp Asp Ala Phe Ser Gln Ala Asn 115 120 125 Thr Lys Leu His Phe Tyr Thr Asn Asn Lys Asn Tyr Thr Val Asn Ile 130 135 140 Lys Ala Gly Met Ser Val Gly Asp Val Ala Gln Ala Ile Thr Asp Ala 145 150 155 160 Thr Gly Gly Glu Val Met Gly Ile Val Met Lys Thr Gly Gly Asp Lys 165 170 175 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acagtcaata ttaaggctgg tatgagtgta ggcgatgtcg cccaagccat tacagatgct 480 acggggggcg aggtgatggg gattgtgatg aaaaccgggg gggataaacc ctatcagtta 540 atgattaata ctaaaaaccc cggggctaat aaccgcttgt attttggctc tagtgttatt 600 tctactcttg ctagtgatgc gcctattaat ttagccatag ggggcactac tgcagatggg 660 aaaagtacag aagatgattt ttttattaaa gttaaagatg ataagggcga agtggttaaa 720 atccctatta gtcttaatct tgataaggct tctgtgcaag ataaaaataa agccctgcaa 780 acagctatta aaaaagccct agaggataat gcacaaacca aagacctagt agatagcgga 840 cagatcaata tcggtttgat taatgatggc aaatctttag tacttaacga tcaaagaggg 900 ttagaagttg aagttggggg agctaaagca gctgaactag gttttgttaa aactaaatca 960 gatcaagaag atttactcaa aggcacagca gggattgcat ccggtcaaat caagggcact 1020 attaatttta atgggcaagc cattaattta ggggctatca ccgcaacggg caattctagc 1080 gatgctaacg ctcaagccat cgttaaagcc attaatggca ttcaagggtt gcacgcttct 1140 ttaggcacgg acgggaaatt aatccttaat agtgaaagcg gcgagttgcg tataaccggt 1200 gtgggggccg atggtaaagc ggctgtaaat agtttaggtt tgtctgaggg cttaagccaa 1260 tcctatgcta aattacacga tctctttgcc tttaaaaaac tacaaagtgc ctctgatgct 1320 agatttactt acaatggtgc gacaatcacc cgccctacaa atgaggtaaa cgatgtgatt 1380 aacggtgtat ctttgagttt attagccaaa actgagccgg gtaaaccagc cattattagc 1440 attacccgcg acagtaaggc cattgttgat catgttaaag aatttgtcaa agcctataat 1500 gcattaatcc ctaaactaga tgaaacaacc cgttacgatc cagatactaa aattgccggc 1560 gtgtttaatg gcgtggggga tatccgcaca attcgctctt caattaataa tgccattgct 1620 tttacaatca caacggctaa aggtgtggat agtctcatga agtatgggat tacacttgat 1680 gagcatggaa agatgagctt agatgagagc agactcacaa acgcgcttaa tgccgatcca 1740 caagccgctc aagatttctt ctatggtggc gatattaaaa gtatgggggg taaggagatt 1800 caccaagacg ggatttttat caagttagat aaagttttgc aaggtttggt cgatggtggt 1860 aacgcgaggt tgaagttata cgaggattct ttagatcaag acgctaaaaa tttgagaaga 1920 gataaggaga atgcaatgga gatgcttaaa acccgttatg acatgatggc agaacgcttt 1980 gcagcttatg atgagcgtat ttctaaggcg aataaatcct ttgatgcggt gcagatgatg 2040 atcgatcaag cagccgccaa aaagaattaa 2070 <210> 5 <211> 684 <212> PRT <213> H. felis <400> 5 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tagtgtcatc 600 tcccatttga gcaatgatgc gaccattaat ttagaagcca agagcgagac aaagcctgag 660 gatgattttt ttatcaaagt gcatgacgaa caaaatgtga tagaaattcc tatcgctctc 720 aagttgcagg gctctattga gagtaaaaac gcggctctgc gtgcagccat ccaaaaagcc 780 ttagaggata atcccgctac aaaatcttta gcagacaatg ggcagttaaa tgtgggggtc 840 atcaatgagg gtaaatcttt ggtgatcaat gataaacgag gtttgagcgt agaggtaggg 900 ggggctaagg cgcgcgaact aggtttcatc caagataaat cccaagctga gggtgattta 960 ctaaaagccc tcaccgcccc gcaatctggc aagatcaaag gcattattag tctgaatgga 1020 caaaacattg acatgggggc gatcacagct gaacataatt ctagtcaaga caacgctaac 1080 gctctgatta aagctgtcaa tggcattgca ggtttgagcg cgtctgtggg cgcggatggg 1140 aagttagtgc tcaatagtgc cagcgggcaa ttacgcttaa ccggagctaa tgcagagggt 1200 aaaaaggctc tcaaagattt aggcctctca gaggggttta gccgctctta tgctaatgct 1260 caagaactct tttctgttaa aaacttacag agtgctagcg atgctaaatt tacctacaat 1320 ggggctagta tcacgcgccc taccaatgaa gttaatgatg taattaatgg cgtgtcttta 1380 agtttgctag gcacaacaga gccgggcaag ggggctgttg tgagcatcac acgagatgac 1440 aaggcgatca tcgataatgt caaagagttt gtcaaagcct ataatgagtt gatgccaaaa 1500 ttagatgaga ccacccgtta cgatccggac acaagaattg ccgggatctt taatggagtg 1560 agcgatatcc gcactatccg ctcttcactt atcagtgcag ttacttttac aatcactaat 1620 agcaagggcg tggctagctt gatgaagtat gggatcatgc tagatgacca tggcaagatg 1680 agtttagacg aaagccgtct tgctagcgca atcaacgccg atccgcaagg cacccaagac 1740 ttcttttatg gaagcgatgt gaagagtatg gggggcaagg aaacccacca agatggaatc 1800 tttgagcgcg tggataaagt tttggctaat ttggtcgatg gtggtcatgc gcgtttgaag 1860 ctctatgaag actctctaga tcaagatgcc aaaagcctca aaaaagataa agagaacgct 1920 atggagttat taaaaacccg ctatgacatc atggcagagc gttttgctgc ctatgacgag 1980 cagatttcta aggctaaccg atcatttaac gctgtgcaga tgatgatcga tcaagctgct 2040 gctaagaaaa actaa 2055 <210> 7 <211> 1230 <212> PRT <213> H. pylori <220> <221> MISC_FEATURE <223> H. pylori strain G27 <400> 7 Met Thr Asn Glu Thr Ile Asn Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Ala Phe 1 5 10 15 Asn Pro Gln Gln Phe Ile Asn Asn Leu Gln Val Ala Phe Leu Lys Val 20 25 30 Asp Asn Ala 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taagcttgat aacgctgtcg 120 cttcatttga tcctgatcaa aaaccaatcg ttgataagaa cgatagggat aacaggcaag 180 cttttgatgg aatctcgcaa ttaagggaag aatactccaa taaagcgatc aaaaatccta 240 ccaaaaagaa tcagtatttt tcagacttta tcaataagag caatgattta atcaacaaag 300 acaatctcat tgatgtggaa tcttccacaa agagctttca gaaatttggg gatcagcgtt 360 accgaatttt cacaagttgg gtgtcccatc aaaacgatcc gtctaaaatc aacacccgat 420 cgatccgaaa ttttatggaa aatatcatac aaccccctat ccatgatgac aaagaaaaag 480 cagagttttt gaaatctgcc aaacaatctt ttgcaggaat tatcataggg aatcaaatcc 540 gaacggatca aaagttcatg ggcgtgtttg atgaatcctt gaaagaaagg caagaagcag 600 aaaaaaatgg agagcctact ggtggggatt ggttggatat ttttttatca tttatatttg 660 acaaaaaaca atcttctgat gtcaaagaag caatcaatca agaaccagtt cctcatgtcc 720 agccagatat agccactact accaccgaca tacaaggctt accgcctgaa tctagggatt 780 tgcttgatga aaggggtaat ttttctaaat tcactcttgg cgatatggaa atgttagatg 840 ttgagggtgt cgctgacatt gatcctaatt acaagttcaa tcaattattg attcacaata 900 acgctctgtc ttctgtgtta atggggagtc ataatggcat agaacctgaa aaagtttcat 960 tattgtatgc gggcaatggt ggttttggag ccaagcacga ttggaacgcc accgttggtt 1020 ataaagacca acaaggtaac aatgtggcta caataattaa tgtgcatatg aaaaacggca 1080 gtggcttagt catagcaggt ggtgagaaag ggattaacaa ccctagtttt tatctctaca 1140 aagaagacca actcacaggc tcacaacgag cattgagtca agaagagatc cgaaacaaaa 1200 tagatttcat ggaatttctt gcacaaaaca atgctaaatt agacaacttg agcgagaaag 1260 agaaagaaaa attccgaaat gagattaagg atttccaaaa agactctaag gcttatttag 1320 acgccctagg gaatgatcgt attgcctttg tttctaaaaa agacccaaaa cattcagctt 1380 taattactga gtttggtaag ggggatttga gctacactct caaagattat gggaaaaaag 1440 cagataaagc tttagatagg gagaaaaatg tcactcttca aggtaaccta aaacatgatg 1500 gcgtgatgtt tgttgattat tctaatttca aatacaccaa cgcctccaag aatcccaata 1560 agggtgtagg cgttacgaat ggcgtttccc atttagacgc aggctttagc aaggtagctg 1620 tctttaattt gcctgattta aataatctcg ctatcactag tttcgtaagg cggaacttag 1680 aggataaact aattgctaaa ggattgaccc cacaagaagc taataagctt atcaaagatt 1740 ttttgagcag caacaaagaa ttggttggaa aagctttaaa cttcaataaa gctgtagctg 1800 acgctaaaaa cacaggcaac tatgacgagg tgaaaaaagc tcagaaagat cttgaaaaat 1860 ctctaaggaa acgagagcat ttagagaaag aagtagagaa aaaattggag agcaaaagcg 1920 gcaacaaaaa taaaatggaa gcaaaagctc aagctaacag ccaaaaagat gagatttttg 1980 cgttgatcaa taaagaggct aatagagacg caagagcaat cacttacgct caaaatctta 2040 aaggcatcaa aagggaattg tctgataaac ttgaaaatat caacaagaat ttgaaagact 2100 ttagtaaatc ttttgatgaa ttcaaaaatg gcaaaaataa ggatttcagc aaggcagaag 2160 aaacgctaaa agcccttaaa ggctcggtga aagatttagg tatcaatccg gaatggattt 2220 caaaagttga aaaccttaat gcagctttga atgacttcaa aaatggcaaa aataaggatt 2280 tcagcaaggt aacgcaagca aaaagcgacc ttgaaaattc cgttaaagat gtgatcatca 2340 atcaaaagat aacggataaa gttgatgatc tcaatcaagc ggtatcagtg gctaaagcaa 2400 cgggtgattt cagtagggta gggcaagcgt tagccgatct caaaaatttc tcaaaggagc 2460 aattggctca acaaactcaa aaaaatgaaa gtttcaatgt tggaaaaaaa tctgaaatat 2520 atcaatccgt taagaatggt gtgaacggaa ccctagtcgg taatgggtta tctcaagcag 2580 aagccacaac tctttctaaa aacttttcgg acatcaagaa agagttgaat gcaaaacttt 2640 ttggaaattt caataacaat aacaataatg ggctcaaaaa cagcacagaa cccatttatg 2700 ctaaagttaa taaaaagaaa acaggacaag tagctagccc tgaagaaccc atttatgctc 2760 aagttgctaa aaaggtaaat gcaaaaattg accaactcaa tcaagcagca agtggtttcg 2820 gtggtgtagg gcaagcagcg ggcttccctt tgaaaaggca tgataaagtt gatgatctca 2880 gtaaggtagg gcgatcggtt agccctgaac ccatttatgc tacaattgat gatctcggcg 2940 gacctttccc tttgaaaagg catgataaag ttgatgatct cagtaaggta gggcgatcgg 3000 ttagccctga acccatttat gctacaattg atgatctcgg cggacctttc cctttgaaaa 3060 ggcatgataa agttgatgat ctcagtaagg tagggctttc aagggagcaa caattgaaac 3120 agaagattga caagttcgat caagcggtat cagaagctaa agtaggttat tttggcaatc 3180 tagagcaaac gatagacaag ctcaaagatt ctgcaaaata caataccatg aatctatggg 3240 ctgaaagtgc aaaaaaagtg cctgctagtt tgtcagcgaa attggacaat tacgctacta 3300 acagccacac acgcattaat agcaatatcc aaaatggagc aatcaatgaa aaagcgaccg 3360 gtatgctaac gcaaaaaaac cctgagtggc tcaagctcgt gaatgataag atcgttgcac 3420 ataatgtggg aagcgttcct ttgtcagagt atgataaaat tggcttcaac cagaagaata 3480 tgaaagatta ttctgattcg ttcaagtttt ccaccaagtt gaacaatgct gtaaaagaca 3540 ttaagtctgg ctttacgcaa tttttagcca atgcattttc tacaggatat tactgcttgg 3600 cgggggaaaa tgcggagcat ggaatcaaaa atgttaatac aaaaggtggt ttccaaaaat 3660 cttaaaggat taaggaatac caaaaacgca aaaaccgccc cttgctaaaa gcagggggtt 3720 ttttaa 3726 <210> 9 <211> 1294 <212> PRT <213> H. pylori <220> <221> MISC_FEATURE <223> H. pylori strain G27 <400> 9 Met Glu Ile Gln Gln Thr His Arg Lys Met Asn Arg Pro Leu Val Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Ala Gly Ala Leu Ile Ser Ala Ile Pro Gln Glu Ser His 20 25 30 Ala Ala Phe Phe Thr Thr Val Ile Ile Pro Ala Ile Val Gly Gly Ile 35 40 45 Ala Thr Gly Thr Ala Val Gly Thr Val Ser Gly Leu Leu Ser Trp Gly 50 55 60 Leu Lys Gln Ala Glu Glu Ala Asn Lys Asn Pro Asp Lys Pro Asp Lys 65 70 75 80 Val Trp Arg Ile Gln Ala Gly Lys Gly Phe Asn Glu Phe Pro Asn Lys 85 90 95 Glu Tyr Asp Leu Tyr Lys Ser Leu Leu Ser Ser Lys Ile Asp Gly Gly 100 105 110 Trp Asp Trp Gly Asn Ala Ala Arg His Tyr Trp Val Lys Gly Gly Gln 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Lys Pro Ser Val Gly Val Ser Tyr Asn His Leu Gly 1160 1165 1170 Ser Thr Asn Phe Lys Ser Ser Ser Asn Gln Val Ala Leu Lys Asn 1175 1180 1185 Gly Ser Ser Ser Gln His Leu Phe Asn Ala Asn Ala Asn Val Glu 1190 1195 1200 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Tyr Met Asn Ala 1205 1210 1215 Gly Val Leu Gln Glu Phe Ala Arg Phe Gly Ser Asn Asn Ala Ala 1220 1225 1230 Ser Leu Asn Thr Phe Lys Val Asn Thr Ala Arg Asn Pro Leu Asn 1235 1240 1245 Thr His Ala Arg Val Met Met Gly Gly Glu Leu Gln Leu Ala Lys 1250 1255 1260 Glu Val Phe Leu Asn Leu Gly Val Val Tyr Leu His Asn Leu Ile 1265 1270 1275 Ser Asn Ile Gly His Phe Ala Ser Asn Leu Gly Met Arg Tyr Ser 1280 1285 1290 Phe <210> 10 <211> 3885 <212> DNA <213> H. pylori <220> <221> misc_feature <223> H. pylori strain G27 <400> 10 atggaaatac aacaaacaca ccgcaaaatg aatcgccctt tagtttctct cgttttagca 60 ggagcgttaa ttagcgccat accgcaagaa agtcatgccg cctttttcac gaccgtgatc 120 attccagcca ttgttggggg tatcgccaca ggcaccgctg taggaacggt ctcagggctt 180 cttagctggg ggctcaaaca agccgaagaa gcgaataaaa acccggacaa acccgataaa 240 gtttggcgca ttcaagcagg aaaaggcttt aatgaattcc ctaacaagga atacgactta 300 tacaaatccc ttttatccag taagattgat ggaggttggg actgggggaa cgccgctagg 360 cattattggg tcaaaggcgg gcaatggaac aagcttgaag tggatatgaa agacgctgta 420 gggacttata aactatcagg gcttagaaac tttactggtg gggatttaga tgtcaatatg 480 caaaaagcca ctttacgctt gggccaattc aatggcaatt ctttcacaag ctataaggat 540 gcggctgatc gcaccacgag ggtgaatttc aacgctaaaa atatctcaat tgataatttt 600 gtagaaatca ataatcgtgt gggttctgga gccgggagga aagccagctc tacggttttg 660 actttgcaag cttcagaagg gatcactagc gataaaaacg ctgaaatttc tctttatgat 720 ggcgccacgc tcaatttggc ttcaagcagc gttaaattaa tgggtaatgt gtggatgggc 780 cgtttgcaat acgtgggagc gtatttggcc ccttcataca gcacgataaa cacttcaaaa 840 gtaacagggg aagtgaattt taaccacctc actgttggcg ataaaaacgc cgctcaagcg 900 ggcattatcg ctagcaacaa gactcatatt ggcacactgg atttgtggca aagcgccggg 960 ttaaacatta tcgctcctcc cgaaggtggc tataaggata aacctaataa taccccttct 1020 caaagtggca ctaaaaacga caaaaatgaa agcgctaaaa acgacaaaca agagagcagt 1080 caaaataata gtaacactca ggtcattaac ccacccaata gcacgcaaaa aacagaaatt 1140 caacccacgc aagtcattga tgggcctttt gcgggcggca aagacacggt tgtcaatatc 1200 aaccgcatca acactaacgc tgatggcacg attagagtgg gagggtttaa agcttctctt 1260 accaccaatg cggctcattt gcatatcggc aaaggcggtg tcaatctgtc caatcaagcg 1320 agcgggcgca cccttttagt ggaaaatcta accgggaata tcaccgttga tgggccttta 1380 agagtgaata atcaagtggg tggctatgct ttggcaggat caagcgcgaa ttttgaattt 1440 aaggctggtg tggatactaa aaacggcaca gccactttca ataacgatat tagcctggga 1500 agatttgtga atttaaaggt ggatgctcat acagctaatt ttaaaggtat tgatacgggt 1560 aatggtggtt tcaacacctt agattttagt ggtgttacag acaaagtcaa tatcaacaag 1620 ctcatcacgg cttccactaa tgtggccgtt aaaaacttca acattaatga attgattgtt 1680 aaaaccaatg ggataagtgt gggggaatac actcatttta gcgaagatat aggcagtcaa 1740 tcgcgcatca ataccgtgcg tttggaaact ggcactaggt caatcttttc tgggggtgtc 1800 aaatttaaaa gcggcgaaaa attggttata gatgagtttt actatagccc ttggaattat 1860 tttgacgcta ggaatgttaa aaatgttgaa atcaccagaa aattcgcttc ttcaacccca 1920 gaaaaccctt ggggcacatc aaaacttatg tttaataatc taaccctggg tcaaaatgcg 1980 gtcatggact atagtcaatt ttcaaattta accatccaag gggattttat caacaatcaa 2040 ggcactatca actatctggt ccgaggcggg aaagtggcaa ccttaagcgt aggcaatgca 2100 gcagctatga tgtttaataa tgatatagac agcgcgaccg gattttacaa accgctcatc 2160 aagattaaca gtgctcaaga tctcattaaa aatacagagc atgttttatt gaaagcgaaa 2220 atcattggtt atggtaatgt ttctacaggt accaatagca ttagtaatgt taatctagaa 2280 gagcaattca aagagcgcct agccctttat aacaacaata accgcatgga tacttgtgtg 2340 gtgcgaaata ctgatgacat taaagcatgc ggtatggcta tcggcaatca aagcatggtg 2400 aataaccctg acaattacaa gtatcttatc ggtaaggcat ggaaaaatat aggcatcagt 2460 aaaacggcta acggctctaa aatttcggtg tattatttag gcaattctac gcctactgag 2520 aatggtggca ataccaccaa cttacccacc aacaccacta ataatgcgcg ttctgctaac 2580 tacgccctcg tgaagaacgc tcctttcgct cacagtgcca ctcctaattt agtcgctatc 2640 aatcagcatg attttggcac tattgaaagc gtgtttgaat tggctaaccg ctctaaagat 2700 attgacacgc tttatactca ttcaggcgtg caaggtaggg atctcttaca aaccttattg 2760 attgatagcc atgatgcggg ttatgccaga caaatgattg ataacacaag caccggtgaa 2820 atcaccaaac aattgaatgc ggccactgac gctttaaaca acatagccag tttagagcat 2880 aaaaccagcg gcttgcaaac tttgagcttg agtaatgcga tgattttaaa ttctcgttta 2940 gtcaatctct ccaggaagca caccaaccat attgactcgt tcgctcaacg cttacaagct 3000 ttaaaaggcc aaagattcgc ttctttagag agcgcggcag aagtgttgta tcaatttgcc 3060 cctaaatatg aaaaacctac caatgtttgg gctaacgcta ttgggggagc gagcttgaat 3120 aatggcggca acgcttcatt gtatggcaca agtgccggtg tagacgctta ccttaatggg 3180 gaagtggaag ccattgtggg cgggtttgga agctatggtt atagctcttt tagtaatcgt 3240 gcgaactctc ttaactctgg ggctaataac gctaattttg gcgtgtatag ccgtattttt 3300 gctaaccagc atgaatttga ttttgaagct caaggggcgc tagggagtga tcaatcaagc 3360 ttgaatttca aaagtgctct actgcaagat ttgaatcaaa gctatcatta tttagcctat 3420 agcgctgcaa caagagcgag ctatggttat gactttgcgt ttttcaggaa cgctttagtg 3480 ttaaaaccaa gcgtgggcgt gagctataac catttaggtt caaccaactt taaaagcagc 3540 agcaatcaag tggctttgaa aaatggctct agcagtcagc atctattcaa cgctaacgct 3600 aatgtggaag cgcgctatta ttatggggac acttcatact tctatatgaa cgctggagtt 3660 ttacaagagt tcgctcgctt tggatctaat aacgccgcgt ctttaaacac ctttaaagtg 3720 aataccgctc gcaacccttt aaatacccat gccagagtga tgatgggtgg ggaattgcaa 3780 ttagctaaag aagtgttttt gaatttgggc gttgtttatt tgcacaattt gatttccaat 3840 ataggccatt tcgcttccaa tttaggaatg aggtatagtt tctaa 3885 <210> 11 <211> 546 <212> PRT <213> H. pylori <220> <221> MISC_FEATURE <223> H. pylori strain G27 <400> 11 Met Ala Lys Glu Ile Lys Phe Ser Asp Ser Ala Arg Asn Leu Leu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Val Arg Gln Leu His Asp Ala Val Lys Val Thr Met Gly Pro 20 25 30 Arg Gly Arg Asn Val Leu Ile Gln Lys Ser Tyr Gly Ala Pro Ser Ile 35 40 45 Thr Lys Asp Gly Val Ser Val Ala Lys Glu Ile Glu Leu Ser Cys Pro 50 55 60 Val Ala Asn Met Gly Ala Gln Leu Val Lys Glu Val Ala Ser Lys Thr 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Tyr 85 90 95 Ser Ile Phe Lys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Thr Ala Gly Ala Asn Pro 100 105 110 Ile Glu Val Lys Arg Gly Met Asp Lys Ala Ala Glu Ala Ile Ile Asn 115 120 125 Glu Leu Lys Lys Ala Ser Lys Lys Val Gly Gly Lys Glu Glu Ile Thr 130 135 140 Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asp His Asn Ile Gly Lys Leu 145 150 155 160 Ile Ala Asp Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asp Gly Val Ile Thr Val 165 170 175 Glu Glu Ala Lys Gly Ile Glu Asp Glu Leu Asp Val Val Glu Gly Met 180 185 190 Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Val Thr Asn Ala Glu 195 200 205 Lys Met Thr Ala Gln Leu Asp Asn Ala Tyr Ile Leu Leu Thr Asp Lys 210 215 220 Lys Ile Ser Ser Met Lys Asp Ile Leu Pro Leu Leu Glu Lys Thr Met 225 230 235 240 Lys Glu Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Ile Glu Gly Glu 245 250 255 Ala Leu Thr Thr Leu Val Val Asn Lys Leu Arg Gly Val Leu Asn Ile 260 265 270 Ala Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Glu Met Leu 275 280 285 Lys Asp Ile Ala Val Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Leu 290 295 300 Gly Leu Ser Leu Glu Asn Ala Glu Val Glu Phe Leu Gly Lys Ala Gly 305 310 315 320 Arg Ile Val Ile Asp Lys Asp Asn Thr Thr Ile Val Asp Gly Lys Gly 325 330 335 His Ser Asp Asp Val Lys Asp Arg Val Ala Gln Ile Lys Thr Gln Ile 340 345 350 Ala Ser Thr Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu 355 360 365 Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala Ser 370 375 380 Glu Val Glu Met Lys Glu Lys Lys Asp Arg Val Asp Asp Ala Leu Ser 385 390 395 400 Ala Thr Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ile Gly Gly Gly Ala 405 410 415 Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Lys Val His Leu Asn Leu His Asp Asp 420 425 430 Glu Lys Val Gly Tyr Glu Ile Ile Met Arg Ala Ile Lys Ala Pro Leu 435 440 445 Ala Gln Ile Ala Ile Asn Ala Gly Tyr Asp Gly Gly Val Val Val Asn 450 455 460 Glu Val Glu Lys His Glu Gly His Phe Gly Phe Asn Ala Ser Asn Gly 465 470 475 480 Lys Tyr Val Asp Met Phe Lys Glu Gly Ile Ile Asp Pro Leu Lys Val 485 490 495 Glu Arg Ile Ala Leu Gln Asn Ala Val Ser Val Ser Ser Leu Leu Leu 500 505 510 Thr Thr Glu Ala Thr Val His Glu Ile Lys Glu Glu Lys Ala Ala Pro 515 520 525 Ala Met Pro Asp Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly 530 535 540 Met Met 545 <210> 12 <211> 1641 <212> DNA <213> H. pylori <220> <221> misc_feature <223> H. pylori strain G27 <400> 12 atggcaaaag aaatcaaatt ttcagatagt gcaagaaacc ttttatttga aggcgtgaga 60 caactccatg atgctgtcaa agtaaccatg gggccaagag gcaggaatgt gttgattcaa 120 aaaagctatg gcgctccaag catcaccaaa gatggcgtga gcgtggctaa agagattgaa 180 ttaagttgcc cggtggctaa catgggcgct caactcgtta aagaggtagc gagcaaaacc 240 gctgatgctg ccggcgatgg cacgaccaca gcgaccgtgc tggcttatag catttttaaa 300 gaaggtttga ggaatatcac ggctggggct aaccctattg aagtgaaacg aggcatggat 360 aaagccgctg aagcgatcat caatgagctt aaaaaagcga gcaaaaaagt aggcggtaaa 420 gaagaaatca cccaagtagc gaccatttct gccaactccg atcacaatat cgggaaactc 480 atcgctgacg ctatggaaaa agtgggtaaa gatggcgtga tcactgttga agaggctaag 540 ggcattgaag acgaattaga tgtcgtagaa ggcatgcaat ttgatagagg ctatctctcc 600 ccttattttg taacgaacgc tgagaaaatg accgctcaat tggataacgc ttacatcctt 660 ttaacggata aaaaaatctc tagcatgaaa gacatcctcc cgctattgga aaaaaccatg 720 aaagagggca aaccgctttt aatcatcgct gaagacattg agggcgaagc tttaacgact 780 ctagtggtga ataaattaag aggcgtgttg aatatcgcag cggttaaagc tccaggcttt 840 ggggacagga gaaaagaaat gctcaaagac atcgctgttt taaccggcgg tcaagtcatt 900 agcgaagaat tgggcttgag tctagaaaac gctgaagtgg agtttttagg caaagccgga 960 aggattgtga ttgacaaaga caacaccacg atcgtagatg gcaaaggcca tagcgatgat 1020 gttaaagaca gagtcgcgca aatcaaaacc caaattgcaa gcacgacaag cgattatgac 1080 aaagaaaaat tgcaagaaag gttggccaaa ctctctggcg gtgtggctgt gattaaagtg 1140 ggcgctgcga gtgaagtgga aatgaaagag aaaaaagacc gggtggatga cgcgttgagc 1200 gcgactaaag cggcggttga agaaggcatt gtgattggcg gcggtgcggc tcttattcgc 1260 gcggctcaaa aagtgcattt gaatttacac gatgatgaaa aagtgggcta tgaaatcatc 1320 atgcgcgcca ttaaagcccc attagctcaa atcgctatca atgccggtta tgatggcggt 1380 gtggtcgtga atgaagtaga aaaacacgaa gggcattttg gttttaacgc tagcaatggc 1440 aagtatgtgg acatgtttaa agaaggcatt attgacccct taaaagtaga aaggatcgct 1500 ttgcaaaatg cggtttcggt ttcaagcctg cttttaacca cagaagccac cgtgcatgaa 1560 atcaaagaag aaaaagcggc cccggcaatg cctgatatgg gtggcatggg cggtatggga 1620 ggcatgggcg gcatgatgta a 1641 <210> 13 <211> 265 <212> PRT <213> H. pylori <220> <221> MISC_FEATURE <223> H. pylori 26695 <400> 13 Met Ile Leu Arg Ala Ser Val Leu Ser Ala Leu Leu Leu Val Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ala Ala Pro Lys His Ser Val Ser Ala Asn Asp Lys Arg Met Gln 20 25 30 Asp Asn Leu Val Ser Val Ile Glu Lys Gln Thr Asn Lys Lys Val Arg 35 40 45 Ile Leu Glu Ile Lys Pro Leu Lys Ser Ser Gln Asp Leu Lys Met Val 50 55 60 Val Ile Glu Asp Pro Asp Thr Lys Tyr Asn Ile Pro Leu Val Val Ser 65 70 75 80 Lys Asp Gly Asn Leu Ile Ile Gly Leu Ser Asn Ile Phe Phe Ser Asn 85 90 95 Lys Ser Asp Asp Val Gln Leu Val Ala Glu Thr Asn Gln Lys Val Gln 100 105 110 Ala Leu Asn Ala Thr Gln Gln Asn Ser Ala Lys Leu Asn Ala Ile Phe 115 120 125 Asn Glu Ile Pro Ala Asp Tyr Ala Ile Glu Leu Pro Ser Thr Asn Ala 130 135 140 Ala Asn Lys Asp Lys Ile Leu Tyr Ile Val Ser Asp Pro Met Cys Pro 145 150 155 160 His Cys Gln Lys Glu Leu Thr Lys Leu Arg Asp His Leu Lys Glu Asn 165 170 175 Thr Val Arg Met Val Val Val Gly Trp Leu Gly Val Asn Ser Ala Lys 180 185 190 Lys Ala Ala Leu Ile Gln Glu Glu Met Ala Lys Ala Arg Ala Arg Gly 195 200 205 Ala Ser Val Glu Asp Lys Ile Ser Ile Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Thr 210 215 220 Gln Tyr Asp Ile Asn Ala Gln Lys Glu Pro Glu Asp Leu Arg Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Asn Thr Thr Lys Lys Ile Phe Glu Ser Gly Val Ile Lys Gly 245 250 255 Val Pro Phe Leu Tyr His Tyr Lys Ala 260 265 <210> 14 <211> 798 <212> DNA <213> H. pylori <220> <221> misc_feature <223> H. pylori 26695 <400> 14 atgatattaa gagcgagtgt gttgagcgcg ttacttcttg taggcttagg ggcagcccct 60 aaacattcag tttcagctaa tgacaaacgg atgcaggata atttagtgag cgtgattgaa 120 aaacagacca ataaaaaggt gcgtatttta gaaatcaaac ctttaaaatc tagccaggat 180 ttaaaaatgg tcgttattga agatccggac actaaataca atatcccgct tgtggtgagt 240 aaggatggta atttaatcat agggcttagc aacatattct ttagcaataa aagcgatgat 300 gtgcaattag ttgcagaaac caatcaaaaa gttcaagctc ttaacgccac ccaacaaaat 360 agcgcgaaat tgaacgctat ttttaatgaa ataccggctg attatgcgat agagttgccc 420 tctactaacg ctgcaaataa ggataaaatc ctttatattg tctctgatcc catgtgccca 480 cattgccaaa aagagctcac taaacttagg gatcatttaa aagaaaacac cgtgagaatg 540 gtcgtggtgg ggtggcttgg ggtcaattca gctaaaaaag cggctttaat ccaagaagaa 600 atggcgaaag ctagggctag gggagcgagc gtggaagata agatctctat tcttgaaaag 660 atttattcca cccaatacga tattaacgct caaaaagagc ctgaagattt acgcactaaa 720 gtggaaaata ccactaaaaa gatttttgaa tctggcgtga ttaagggtgt gcctttctta 780 taccattata aggcatga 798 <210> 15 <211> 325 <212> PRT <213> H. pylori <220> <221> MISC_FEATURE <223> H. pylori J99 <400> 15 Met Pro Thr Ile Asp Phe Thr Phe Cys Glu Ile Asn Pro Lys Lys Gly 1 5 10 15 Phe Gly Gly Ala Asn Gly Asn Lys Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Asn Glu 20 25 30 Leu Tyr Met Val Lys Phe Pro Pro Lys Pro Ser Thr His Lys Glu Met 35 40 45 Ser Tyr Thr Asn Gly Cys Phe Ser Glu Tyr Val Ala Cys His Ile Val 50 55 60 Asn Ser Leu Gly Leu Lys Val Gln Glu Thr Leu Leu Gly Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Asn Lys Ile Val Val Ala Cys Lys Asp Phe Thr Thr His Gln Tyr Glu 85 90 95 Leu Val Asp Phe Leu Ser Leu Lys Asn Thr Met Ile Glu Leu Glu Lys 100 105 110 Ser Gly Lys Asp Thr Asn Leu Asn Asp Val Leu Tyr Ala Ile Asp Asn 115 120 125 Gln His Phe Ile Glu Pro Lys Val Leu Lys Cys Phe Phe Trp Asp Met 130 135 140 Phe Val Ala Asp Thr Leu Leu Gly Asn Phe Asp Arg His Asn Gly Asn 145 150 155 160 Trp Gly Phe Leu Arg Ala Ser Asn Ser Lys Glu Tyr Gln Ile Ala Pro 165 170 175 Ile Phe Asp Cys Gly Ser Cys Leu Tyr Pro Gln Ala Asp Asp Val Val 180 185 190 Cys Gln Lys Val Leu Ser Asn Ile Asp Glu Leu Asn Ala Arg Ile Tyr 195 200 205 Asn Phe Pro Gln Ser Ile Leu Lys Asp Asp Asn Asp Lys Lys Ile Asn 210 215 220 Tyr Tyr Asp Phe Leu Thr Gln Thr Asn Asn Lys Asp Cys Leu Asp Ala 225 230 235 240 Leu Leu Arg Ile Tyr Pro Arg Ile Asp Met Asn Lys Ile His Ser Ile 245 250 255 Ile Asp Asn Thr Pro Phe Met Ser Glu Ile His Lys Glu Phe Leu His 260 265 270 Thr Met Leu Asp Glu Arg Lys Ser Lys Ile Ile Asp Val Ala His Thr 275 280 285 Arg Ala Ile Glu Leu Ser Leu Gln His Lys Gln Ala His Ser Asn Pro 290 295 300 Tyr Asp Asn Ala Asp Asp Leu Asp Asn Ser Asn Glu Tyr Thr Pro Thr 305 310 315 320 Pro Lys Arg Arg Arg 325 <210> 16 <211> 978 <212> DNA <213> H. pylori <220> <221> misc_feature <223> H. pylori J99 <400> 16 atgccaacca ttgattttac tttttgtgag attaacccta aaaaaggttt tgggggagca 60 aatggaaata aaattagctt attttataat aatgaactct acatggtcaa attcccccct 120 aagccttcta cacataaaga aatgtcctat accaatggtt gttttagtga atatgtagca 180 tgtcatatag tcaatagctt aggcttaaag gttcaagaaa cattgctagg cacttataaa 240 aataaaatcg tggttgcttg taaagatttt accacccatc aatacgagct tgtagatttt 300 ctaagtctaa aaaatactat gattgaatta gaaaaatcag gcaaagacac taatttgaat 360 gatgtgcttt atgccataga taaccagcat tttattgagc caaaagtttt aaaatgtttc 420 ttttgggata tgtttgtagc agatacattg ctaggtaatt ttgataggca taatggtaat 480 tgggggttct taagagcctc aaattcaaaa gaatatcaaa tagctcccat ttttgattgt 540 ggctcttgtc tataccccca agctgatgat gtggtatgcc aaaaagtttt aagtaatatt 600 gatgaactca atgcaaggat ttataatttc ccccaatcta tcttaaaaga tgacaacgat 660 aaaaaaatta actactatga tttcttaact caaaccaata ataaagattg ccttgatgca 720 ctacttagga tatacccacg catagatatg aataaaatcc attcaattat tgataacaca 780 ccctttatga gcgaaataca caaagaattt ttacatacaa tgcttgatga aagaaaatca 840 aagattatag atgtagcaca cactagagct attgagttat ccttacaaca caaacaagct 900 cactcaaacc cttatgacaa cgcagatgat ttagacaatt ccaatgaata cacccccaca 960 cctaagcgta gacgataa 978 <210> 17 <211> 476 <212> PRT <213> H. pylori <220> <221> MISC_FEATURE <223> H. pylori strain G27 <400> 17 Met Met Lys Lys Thr Leu Phe Ile Ser Leu Ala Leu Ala Leu Ser Leu 1 5 10 15 Asn Ala Gly Asn Ile Gln Ile Gln Asn Met Pro Lys Val Lys Glu Arg 20 25 30 Val Ser Val Pro Ser Lys Asp Asp Thr Ile Tyr Ser Tyr His Asp Ser 35 40 45 Ile Lys Asp Ser Ile Lys Ala Val Val Asn Ile Ser Thr Glu Lys Lys 50 55 60 Ile Lys Asn Asn Phe Ile Gly Gly Gly Val Phe Asn Asp Pro Phe Phe 65 70 75 80 Gln Gln Phe Phe Gly Asp Leu Gly Gly Met Ile Pro Lys Glu Arg Met 85 90 95 Glu Arg Ala Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile Ser Lys Asp Gly Tyr Ile 100 105 110 Val Thr Asn Asn His Val Ile Asp Gly Ala Asp Lys Ile Lys Val Thr 115 120 125 Ile Pro Gly Ser Asn Lys Glu Tyr Ser Ala Thr Leu Val Gly Thr Asp 130 135 140 Ser Glu Ser Asp Leu Ala Val Ile Arg Ile Thr Lys Asp Asn Leu Pro 145 150 155 160 Thr Ile Lys Phe Ser Asp Ser Asn Asp Ile Ser Val Gly Asp Leu Val 165 170 175 Phe Ala Ile Gly Asn Pro Phe Gly Val Gly Glu Ser Val Thr Gln Gly 180 185 190 Ile Val Ser Ala Leu Asn Lys Ser Gly Ile Gly Ile Asn Ser Tyr Glu 195 200 205 Asn Phe Ile Gln Thr Asp Ala Ser Ile Asn Pro Gly Asn Ser Gly Gly 210 215 220 Ala Leu Ile Asp Ser Arg Gly Gly Leu Val Gly Ile Asn Thr Ala Ile 225 230 235 240 Ile Ser Lys Thr Gly Gly Asn His Gly Ile Gly Phe Ala Ile Pro Ser 245 250 255 Asn Met Val Lys Asp Ile Val Thr Gln Leu Ile Lys Thr Gly Lys Ile 260 265 270 Glu Arg Gly Tyr Leu Gly Val Gly Leu Gln Asp Leu Ser Gly Asp Leu 275 280 285 Gln Asn Ser Tyr Asp Asn Lys Glu Gly Ala Val Val Ile Ser Val Glu 290 295 300 Lys Asp Ser Pro Ala Lys Lys Val Gly Ile Leu Val Trp Asp Leu Ile 305 310 315 320 Thr Glu Val Asn Gly Lys Lys Val Lys Asn Thr Asn Glu Leu Arg Asn 325 330 335 Leu Ile Gly Ser Met Leu Pro Asn Gln Arg Val Thr Leu Lys Val Ile 340 345 350 Arg Asp Lys Lys Glu Arg Thr Phe Thr Leu Thr Leu Ala Glu Arg Lys 355 360 365 Asn Pro Asn Lys Lys Glu Thr Ile Ser Ala Gln Asn Gly Ala Gln Gly 370 375 380 Gln Leu Asn Gly Leu Gln Val Glu Asp Leu Thr Gln Lys Thr Lys Arg 385 390 395 400 Ser Met Arg Leu Ser Asp Asp Val Gln Gly Val Leu Val Ser Gln Val 405 410 415 Asn Glu Asn Ser Pro Ala Glu Gln Ala Gly Phe Arg Gln Gly Asn Ile 420 425 430 Ile Thr Lys Ile Glu Glu Ile Glu Val Lys Ser Val Ala Asp Phe Asn 435 440 445 His Ala Leu Glu Lys Tyr Lys Gly Lys Pro Lys Arg Phe Leu Val Leu 450 455 460 Asp Leu Asn Gln Gly Tyr Arg Ile Ile Leu Val Lys 465 470 475 <210> 18 <211> 1431 <212> DNA <213> H. pylori <220> <221> misc_feature <223> H. pylori G27 <400> 18 atgatgaaaa aaaccctttt tatctctttg gctttagcgt taagcttgaa tgcgggcaat 60 atccaaatcc aaaacatgcc caaagttaaa gagcgagtga gtgtcccctc taaagacgat 120 acgatctatt cttaccacga ttctattaag gattcgatta aagcggtggt gaatatctct 180 actgaaaaga agattaaaaa caattttata ggtggcggtg tgtttaatga cccctttttc 240 caacaatttt ttggggattt gggcggcatg atccctaaag aaagaatgga aagggcttta 300 ggcagcggcg taatcatttc taaagatggc tatattgtaa ctaacaacca tgtgattgat 360 ggtgcggata agattaaagt taccattcca gggagcaata aagagtattc cgctacttta 420 gtaggcaccg attctgaaag cgatttagcc gtgattcgca tcactaaaga caatctgccc 480 accatcaaat tctctgattc taacgatatt tcagtgggcg atttggtttt tgcgattggt 540 aacccttttg gcgtgggtga aagcgttact caaggcattg tttcagcgct caataaaagc 600 gggattggga tcaacagcta tgaaaatttc attcaaacag acgcttccat caatcctgga 660 aattccggcg gcgctttaat tgatagccgt ggagggttag tggggatcaa taccgccatt 720 atctctaaaa ccgggggcaa ccacggcatt ggctttgcca tcccttctaa catggttaaa 780 gatattgtaa cccaactcat caaaaccggt aagattgaaa gaggttactt gggcgtgggc 840 ttgcaagatt tgagcggcga tttgcaaaat tcttatgaca ataaagaagg ggcggtagtc 900 attagcgtag aaaaagactc tccggctaaa aaagtaggga ttttggtgtg ggatttgatc 960 actgaagtca atgggaaaaa ggttaaaaac acgaatgagt taagaaatct aatcggctcc 1020 atgctaccca atcaaagagt aaccttaaaa gtcattagag acaaaaaaga acgcactttc 1080 accctcactc ttgctgaaag gaaaaaccct aacaaaaaag aaaccatttc tgctcaaaac 1140 ggcgcgcaag gccaattgaa cgggcttcaa gtagaagatt taacccaaaa aaccaaaagg 1200 tctatgcgtt tgagcgatga tgttcaaggg gttttagtct ctcaagtgaa tgaaaattcc 1260 ccagcagagc aagctggctt taggcaaggc aatatcatca caaaaattga agagattgaa 1320 gtgaaaagcg ttgcggattt taaccatgct ttagaaaagt ataaaggcaa acccaaacga 1380 ttcttagttt tagatttgaa tcaaggttat aggatcattt tggtgaaatg a 1431 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 19 catatggcaa taggttcatt aa 22 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 20 ctcgagattc tttttagccg ctgc 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 21 agctcattag ggcttggcag 20 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 22 gctcgcgctc aacgcatc 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 23 atcacggacg ctaccaatgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 24 agggacttca tgcatgctcc 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 25 cacagacgct atcattcaag c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 26 cccgctgatc acatcattga c 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 27 cgctaacctc atagatggag g 21 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 28 taagcggcaa agcgctccg 19

Claims (15)

  1. 피험체로부터의 샘플에서 항-FliD 항체를 포함하는 FliD에 대한 면역 반응물을 검출하는 것을 포함하여, 상기 피험체에서 헬리코박터 필로리 (에이치. 필로리) 감염을 검출하는 방법.
  2. 제2항에 있어서,
    상기 항-FliD 항체가 IgG 항체 및/또는 IgA 항체인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 검출이 ELISA, 측방 유동 검정 또는 라인 검정에 의해 일어나는, 방법.
  4. 피험체에서 항-FliD 항체를 포함하는 FliD에 대한 면역 반응물의 에이치. 필로리로의 피험체 감염에 대한 바이오마커로서의 용도.
  5. FliD 또는 이의 단편 및 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는 키트의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에서의 용도.
  6. 피험체로부터의 샘플에서 FliD 또는 이의 단편을 검출하는 것을 포함하여, 상기 피험체에서 에이치. 필로리 감염을 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 검출이 ELISA, 라인 면역검정, 측방 유동 검정 또는 질량 분광 분석에 의해 일어나는, 방법.
  8. FliD의 에이치. 필로리로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커로서의 용도.
  9. FliD 또는 이의 단편과 상호작용할 수 있는 상호작용제 및 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는 키트의 제6항 또는 제7항에 따른 방법에서의 용도.
  10. 피험체로부터의 샘플에서 FliD를 암호화하는 핵산 또는 이의 단편을 검출하는 것을 포함하여, 상기 피험체에서 에이치. 필로리 감염을 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    FliD를 암호화하는 상기 핵산 분자가 질량 분광 분석, 하이브리드화 검정 또는 PCR에 의해 검출되는, 방법.
  12. FliD를 암호화하는 핵산의 에이치. 필로리로의 피험체의 감염에 대한 바이오마커로서의 용도.
  13. FliD를 암호화하는 핵산 또는 이의 단편과 상호작용할 수 있는 상호작용제 및 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는 키트의 제10항 또는 제11항의 방법에서의 용도.
  14. 제1항 내지 제3항, 제6항, 제7항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 및 HtrA를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 헬리코박터, 바람직하게는 에이치. 필로리의 하나 이상의 항원을 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제3항, 제6항, 제7항, 제10항, 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 혈청, 혈액 혈장, 전혈 및 분변으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
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