BR112016003129B1 - Método para detectar infecção por h.pylori e uso de um kit compreendendo flid - Google Patents
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Abstract
método para a detecção de infecção h. pylori a presente invenção está relacionada com um método para a detecção de infecção por h. pylori num sujeito, em que o método compreende detectar numa amostra a partir do sujeito, de uma resposta imune contra flid, em que a resposta imune compreende um anticorpo anti-flid.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método para detectar infecção por Helicobacter, e mais particularmente, a infecção por H. pylori, o uso de uma resposta imune como um biomarcador, o uso de uma proteína de Helicobacter como um biomarcador, o uso de um ácido nucleico que codifica uma proteína de Helicobacter como um biomarcador, e um kit para utilização no método para detectar infecção por Helicobacter, mais particularmente, a infecção por H. pylori.
[002] O Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria Gram-negativa espiral microaerofílica, que coloniza, aproximadamente, metade da população mundial e é considerada um patógeno gástrico que infecta especificamente humanos (Michetti, et al., 1999). A maioria dos indivíduos infectados desenvolve gastrite crônica assintomática. No entanto, em alguns indivíduos, a infecção provoca gastrite crônica, úlcera péptica e atrofia, e desempenha um papel importante no desenvolvimento de linfoma do tecido linfóide associado à mucosa (MALT), adenocarcinoma gástrico e linfoma não-Hodgkin gástrico primário (Suganuma, et al. , 2001).
[003] A Organização Mundial de Saúde categorizou o H. pylori como um agente carcinogênico de classe I (Goto et al., 1999), tendo sido demonstrada uma evidência direta na carcinogênese em modelos animais (Honda, et al., 1998; T. Watanabe, et al., 1998). A erradicação do H. pylori pode prevenir o câncer gástrico em humanos (Uemura, et al., 2001). Estratégias de teste e tratamento têm sido consideradas em populações com alto risco de câncer gástrico (Yamaoka, et al., 1998). No entanto, essa abordagem é dificultada pela falta de sistemas de rastreamento eficazes e acessíveis, especialmente, em países de menor nível socioeconômico. Nestes países, apenas os testes sorológicos são aplicáveis, sendo que a maioria destes testes não possui bom desempenho ou não é bem validado. Existem vários marcadores individuais específicos, conhecidos e descritos, para a sorologia do H. pylori. Estes fatores têm sido aplicados em muitas abordagens diagnósticas, mas quase todos eles apresentam limitações significativas, o que os tornam inadequados para o diagnóstico de H. pylori. Por exemplo, a proteína associada à citotoxina (CagA) é uma proteína de H. pylori muito bem caracterizada. Esta proteína é codificada em cag-PAI (Ilha de Patogenicidade do gene associado à citotoxina) e é descrita como uma proteína oncogênica (Franco, et al., 2005; Murata-Kamiya, et al., 2007). Esta proteína também é um antígeno altamente imunogênico, o que a torna um marcador comumente utilizado em testes sorológicos. A positividade para CagA pode ser utilizada como um indicador de virulência para H. pylori, uma vez que os indivíduos infectados com as cepas CagA positivas possuem maior risco de desenvolver doenças gastroduodenais. No entanto, ela não é adequada como um único marcador, uma vez que apenas um subconjunto de cepas de H. pylori são CagA positivas. Além disso, a positividade para CagA não é um marcador de infecção ativa, uma vez que pacientes com H. pylori erradicado mantêm anticorpos contra CagA durante muitos anos (Fusconi, et al., 1999). Por isso, deve-se sempre combiná-la com outros antígenos adequados nos testes sorológicos para confirmar a positividade. Outra proteína bem caracterizada de H. pylori é a citotoxina vacuolizante (VacA). Já houve relatos que esta proteína induz a vacuolização nas células expostas aos sobrenadantes de H. pylori ou à proteína purificada (Cover & Blaser, 1992). O gene vacA codifica uma pró-toxina de 140 kDa, onde a sequência sinal amino-terminal e o fragmento carbóxi- terminal são clivados proteoliticamente durante a secreção, produzindo uma proteína ativa com uma massa molecular de 88 kDa que se agrega em hexâmeros e forma uma poro (Montecucco & de Bernard, 2003). Esta proteína é composta por duas regiões diferentes. Uma sequência sinal (s1a, s1b, s2) e uma região-média (ml, m2), ambas com elevadas variações alélicas que parecem regular a atividade citotóxica (Atherton, et al., 1995). A alta diversidade de VacA torna esta proteína inadequada para o teste sorológico.
[004] Outra proteína de H. pylori bem caracterizada, GroEL, pertence à família das chaperonas moleculares, as quais são necessárias para enovelamento adequado de muitas proteínas sob condições de estresse (Dunn, et al., 1992). Em diversos estudos, foi demonstrado que esta proteína é altamente conservada dentre as diferentes cepas de H. pylori, e que sua soropositividade foi muito mais elevada do que aquela para CagA em pacientes infectados (Macchia, et al., 1993;. Suerbaum, et al., 1994). Além disso, em estudos realizados pelos presentes inventores, observou-se que um estado sorológico positivo para GroEL foi frequentemente mais encontrado em pacientes alemães com câncer gástrico em comparação com controles pareados (dados não publicados). Além disso, sugere-se que os anticorpos contra GroEL possam persistir por mais tempo após a perda da infecção por H. pylori relacionada à doença. Assim, GroEL pode ser um marcador adequado de infecção atual ou passada, e pode ser útil para resolver a subestimação do risco de câncer gástrico relacionado ao H. pylori devido à eliminação da infecção (Gao et al., 2009).
[005] Portanto, o problema que fundamentou a presente invenção foi o de proporcionar um método para detectar infecção por H. pylori com alta sensibilidade e/ou alta especificidade. Outro problema que fundamentou a presente invenção foi o de proporcionar um teste que, em comparação com os testes do estado da arte, conduza a um número menor de resultados falsos negativos e menores de falsos positivos, especialmente, em abordagens baseadas em população. Outro problema que fundamentou a presente invenção foi o de proporcionar meios para a realização de tais métodos e tais testes, respectivamente. Outro problema que também fundamentou a presente invenção foi à disponibilização de um biomarcador para pacientes infectados por H. pylori, onde o biomarcador não apresenta, preferencialmente, qualquer reação cruzada com outras bactérias e quaisquer proteínas, peptídeos ou moléculas de ácidos nucleicos que codificam tais proteínas e peptídeos em particular.
[006] Estes e outros problemas que fundamentaram a presente invenção são resolvidos pelo objeto das reivindicações independentes anexas. As concretizações preferidas podem ser realizadas a partir das reivindicações dependentes anexas.
[007] Estes e outros problemas que fundamentaram a presente invenção também são resolvidos pelas seguintes concretizações.
[008] Concretização 1: Método para detectar infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente, uma infecção por H. pylori em um indivíduo, em que o método compreende detectar, em uma amostra de um indivíduo, uma resposta imune contra FliD.
[009] Concretização 2: Método, de acordo com a concretização 1, em que, se uma resposta imune contra FliD for detectada na amostra do indivíduo, o indivíduo está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, ou o indivíduo apresentou uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, no passado.
[0010] Concretização 3: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 2, em que, se nenhuma resposta imune contra FliD for detectada na amostra do indivíduo, o indivíduo não está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori.
[0011] Concretização 4: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 2, em que, se nenhuma resposta imune contra FliD for detectada na amostra do indivíduo, o indivíduo apresentou uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, no passado.
[0012] Concretização 5: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 4, em que a resposta imune contra FliD é uma resposta humoral contra FliD, de preferência, uma resposta humoral anti-FliD.
[0013] Concretização 6: Método, de acordo com a concretização 5, em que a resposta imune contra FliD é uma resposta humoral contra FliD, onde a resposta humoral contra FliD compreende, pelo menos, um anticorpo anti-FliD selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo IgG e um anticorpo IgA.
[0014] Concretização 7: Método, de acordo com a concretização 5, em que a resposta imune contra FliD é uma resposta humoral anti-FliD, onde a resposta humoral anti- FliD compreende, pelo menos, um anticorpo anti-FliD selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo IgG e um anticorpo IgA.
[0015] Concretização 8: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 7, em que o indivíduo está infectado com Helicobacter, de preferência, H. pylori, que expressa FliD.
[0016] Concretização 9: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 8, em que o indivíduo é diferente de um indivíduo que é imunossuprimido, de preferência, o indivíduo é diferente de um indivíduo que está sob terapia imunossupressora.
[0017] Concretização 10: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 9, em que o método compreende ainda detectar um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori.
[0018] Concretização 11: Método, de acordo com a concretização 10, em que o um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori, é/são selecionado(s) a partir do grupo que compreende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 e HtrA.
[0019] Concretização 12: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 11, em que o método compreende reagir a amostra com FliD ou um fragmento do mesmo.
[0020] Concretização 13: Método, de acordo com a concretização 13, em que o método compreende reagir a amostra com um FliD completo.
[0021] Concretização 14: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 12 a 13, em que a resposta imune contra FliD compreende, pelo menos, um de um composto humoral capaz de interagir com FliD e um composto celular capaz de interagir com FliD, em que o pelo menos um composto humoral e/ou composto celular interage com FliD, de preferência, o pelo menos um composto humoral e/ou composto celular que interage com FliD forma um produto de interação com FliD.
[0022] Concretização 15: Método, de acordo com a concretização 14, em que a resposta imune contra FliD é uma resposta humoral contra FliD, e onde a resposta humoral contra FliD forma um produto de interação com FliD.
[0023] Concretização 16: Método, de acordo com a concretização 14, em que a resposta imune contra FliD é uma resposta humoral anti-FliD, e onde a resposta anti-FliD forma um produto de interação com FliD.
[0024] Concretização 17: Método, de acordo com a concretização 14, em que a resposta imune contra FliD compreende, pelo menos, um anticorpo anti-FliD e onde o anticorpo anti-FliD forma um produto de interação com FliD.
[0025] Concretização 18: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 14 a 17, em que o produto de interação é detectado.
[0026] Concretização 19: Método, de acordo com a concretização 18, em que o produto de interação é diretamente detectado.
[0027] Concretização 20: Método, de acordo com a concretização 18, em que o produto de interação é indiretamente detectado.
[0028] Concretização 21: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 20, em que a detecção ocorre por meio de um teste de ELISA ou um imunoteste de linha.
[0029] Concretização 22: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 20, em que a detecção ocorre por meio de um teste de fluxo lateral.
[0030] Concretização 23: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 22, em que a amostra é selecionada a partir do grupo que compreende soro, plasma e sangue total.
[0031] Concretização 24: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 23, em que o indivíduo é um humano e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por H. pylori.
[0032] Concretização 25: Método, de acordo com a concretização 24, em que FliD que reage com a amostra é o FliD de H. pylori.
[0033] Concretização 26: Método, de acordo com a concretização 25, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1.
[0034] Concretização 27: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 23, em que o indivíduo é o porco e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por Helicobacter suis.
[0035] Concretização 28: Método, de acordo com a concretização 27, em que o FliD que reage com a amostra é o FliD de H. suis.
[0036] Concretização 29: Método, de acordo com a concretização 28, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 3.
[0037] Concretização 30: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 23, em que o indivíduo é o gato e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por Helicobacter felis. Preferencialmente, o gato é selecionado a partir do grupo que compreende o gato doméstico, o felino selvagem, pequenos felinos e grandes felinos.
[0038] Concretização 31: Método, de acordo com a concretização 30, em que o FliD que reage com a amostra é o FliD de H. felis.
[0039] Concretização 32: Método, de acordo com a concretização 31, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 5.
[0040] Concretização 33: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 32, em que a sensibilidade do método para detectar uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori em humano, é superior a 90% e/ou 97% ou inferior.
[0041] Concretização 34: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 33, em que a especificidade do método para detectar uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori em humano, é superior a 90% e/ou 99% ou inferior.
[0042] Concretização 35: Uso de uma resposta imune contra FliD em um indivíduo como um biomarcador.
[0043] Concretização 36: Uso, de acordo com a concretização 35, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter.
[0044] Concretização 37: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 35 a 36, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o humano, e o Helicobacter é o H. pylori.
[0045] Concretização 38: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 35 a 36, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o porco, e o Helicobacter é o H. suis.
[0046] Concretização 39: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 35 a 36, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o gato, e o Helicobacter é o H.felis.
[0047] Concretização 40: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 35 a 39, em que o biomarcador é um biomarcador preditivo.
[0048] Concretização 41: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 35 a 40, em que a resposta imune é uma resposta humoral contra FliD.
[0049] Concretização 42: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 35 a 41, em que a resposta imune é uma resposta de anticorpo anit-FliD contra FliD.
[0050] Concretização 43: Kit compreendendo FliD ou um fragmento do mesmo e, pelo menos, um outro componente.
[0051] Concretização 44: Kit, de acordo com a concretização 43, em que o pelo menos outro componente é selecionado a partir do grupo que compreende um tampão, uma fase sólida e um folheto de instruções.
[0052] Concretização 45: Kit, de acordo com qualquer uma das concretizações 43 a 44, em que FliD é o FliD completo.
[0053] Concretização 46: Kit, de acordo com qualquer uma das concretizações 43 a 44, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos, onde a sequência de aminoácidos é selecionada a partir do grupo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 3 e uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 5.
[0054] Concretização 47: Kit, de acordo com qualquer uma das concretizações 43 a 46, em que o kit é adequado para uso ou é para uso em um método para detectar infecção por Helicobacter em um indivíduo.
[0055] Concretização 48: Kit, de acordo com a concretização 47, em que o kit é adequado para uso ou é para uso em um método de qualquer uma das concretizações 1 a 34.
[0056] Concretização 49: Método para detectar infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente, uma infecção por H. pylori em um indivíduo, em que o método compreende detectar FliD em uma amostra do indivíduo.
[0057] Concretização 50: Método, de acordo com a concretização 49, em que, se FliD for detectado na amostra do indivíduo, o indivíduo está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, ou o indivíduo apresentou uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, no passado.
[0058] Concretização 51: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 50, em que, se nenhum FliD for detectado na amostra do indivíduo, o indivíduo não está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori.
[0059] Concretização 52: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 51, em que se nenhum FliD for detectado na amostra do indivíduo, o indivíduo apresentou uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, no passado.
[0060] Concretização 53: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 52, em que o indivíduo está infectado com Helicobacter, de preferência, o H. pylori, que expressa FliD.
[0061] Concretização 54: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 53, em que o método compreende ainda detectar um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori.
[0062] Concretização 55: Método, de acordo com a concretização 54, em que um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori, é/são selecionado(s) a partir do grupo que compreende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 e HtrA.
[0063] Concretização 56: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 55, em que FliD é um FliD completo ou um fragmento do mesmo.
[0064] Concretização 57: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 56, em que o método compreende reagir a amostra com um agente de interação, em que o agente de interação interage com FliD ou um fragmento do mesmo, preferencialmente, o agente de interação interage especificamente com FliD ou um fragmento do mesmo.
[0065] Concretização 58: Método, de acordo com a concretização 57, em que o agente de interação interage com FliD completo ou um fragmento de FliD.
[0066] Concretização 59: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 57 a 58, em que o agente de interação é selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um aptâmero e um spiegelmer.
[0067] Concretização 60: Método, de acordo com a concretização 59, em que o agente de interação é um anticorpo, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
[0068] Concretização 61: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 56 a 60, em que o agente de interação e o FliD presente na amostra formam um produto de interação.
[0069] Concretização 62: Método, de acordo com a concretização 61, em que o produto de interação é detectado.
[0070] Concretização 63: Método, de acordo com a concretização 62, em que o produto de interação é diretamente detectado.
[0071] Concretização 64: Método, de acordo com a concretização 62, em que o produto de interação é indiretamente detectado.
[0072] Concretização 65: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 64, em que a detecção ocorre por meio de um teste de ELISA ou um imunoteste de linha.
[0073] Concretização 66: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 63, em que a detecção ocorre por meio de um teste de fluxo lateral.
[0074] Concretização 67: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 56, em que FliD é detectado por meio de espectrometria de massa.
[0075] Concretização 68: Método, de acordo com a concretização 67, em que a espectrometria de massa é selecionada a partir do grupo que compreende LC-ESI-MS/MS, MALDI-MS, MS em tandem, TOF/TOF, TOF-MS, TOF-MS/MS, triplo quadrupolo MS, e triplo quadrupolo MS/MS.
[0076] Concretização 69: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 68, em que o indivíduo é um humano e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por H. pylori.
[0077] Concretização 70: Método, de acordo com a concretização 69, em que FliD é de H. pylori.
[0078] Concretização 71: Método, de acordo com a concretização 70, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1.
[0079] Concretização 72: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 68, em que o indivíduo é o porco e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por Helicobacter suis.
[0080] Concretização 73: Método, de acordo com a concretização 72, em que FliD é de H. suis.
[0081] Concretização 74: Método, de acordo com a concretização 73, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 3.
[0082] Concretização 75: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 68, em que o indivíduo é o gato e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por Helicobacter felis.
[0083] Concretização 76: Método, de acordo com a concretização 75, em que FliD é de H. felis.
[0084] Concretização 77: Método, de acordo com a concretização 76, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 5.
[0085] Concretização 78: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 77, em que a amostra é selecionada a partir do grupo que compreende fezes, soro, plasma e sangue total, de preferência, a amostra é de fezes.
[0086] Concretização 79: Uso de FliD como um biomarcador.
[0087] Concretização 80: Uso, de acordo com a concretização 79, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção de um indivíduo com Helicobacter.
[0088] Concretização 81: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 79 a 80, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o humano, e o Helicobacter é o H. pylori.
[0089] Concretização 82: Uso, de acordo com a concretização 81, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1
[0090] Concretização 83: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 80 a 81, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o porco e o Helicobacter é o H. suis.
[0091] Concretização 84: Uso, de acordo com a concretização 83, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3.
[0092] Concretização 85: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 80 a 81, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o gato e o Helicobacter é o H. felis.
[0093] Concretização 86: Uso, de acordo com a concretização 85, em que FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5.
[0094] Concretização 87: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 79 a 86, em que o biomarcador é um biomarcador preditivo.
[0095] Concretização 88: Kit compreendendo um agente de interação capaz de interagir com FliD, ou um fragmento do mesmo, e, pelo menos, um outro componente.
[0096] Concretização 89: Kit, de acordo com a concretização 88, em que o pelo menos outro componente é selecionado a partir do grupo que compreende um tampão, uma fase sólida e um folheto de instruções.
[0097] Concretização 90: Kit, de acordo com a concretização 89, em que o agente de interação é capaz de interagir especificamente com FliD ou um fragmento do mesmo.
[0098] Concretização 91: Kit, de acordo com a qualquer uma das concretizações 88 a 90, em que o agente de interação é selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um aptâmero e um spiegelmer.
[0099] Concretização 92: Kit, de acordo com qualquer uma das concretizações 88 a 91, em que o kit é adequado para uso ou é para uso em um método para detectar infecção por Helicobacter em um indivíduo.
[00100] Concretização 93: Kit, de acordo com a concretização 92, em que o kit é adequado para uso ou é para uso em um método de acordo com qualquer uma das concretizações 49 a 78.
[00101] Concretização 94: Método para detector infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente, uma infecção por H. pylori em um indivíduo, em que o método compreende detectar, em uma amostra do indivíduo, um ácido nucleico que codifica FliD.
[00102] Concretização 95: Método, de acordo com a concretização 94, em que o ácido nucleico é um ácido nucleico genômico que codifica FliD, de preferência, DNA.
[00103] Concretização 96: Método, de acordo com a concretização 94, em que o ácido nucleico é um RNAm que codifica FliD.
[00104] Concretização 97: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 96, em que, se um ácido nucleico que codifica FliD for detectado na amostra do indivíduo, o indivíduo está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, ou o indivíduo apresentou a uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, no passado.
[00105] Concretização 98: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 97, em que, se nenhum ácido nucleico que codifica FliD for detectado na amostra do indivíduo, o indivíduo não está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori.
[00106] Concretização 99: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 98, em que, se nenhum ácido nucleico que codifica FliD for detectado na amostra do indivíduo, o indivíduo apresentou uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, no passado.
[00107] Concretização 100: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 99, em que o indivíduo está infectado com Helicobacter, de preferência, H. pylori, que expressa FliD.
[00108] Concretização 101: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 100, em que o método compreende ainda detectar um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori, e/ou um ácido nucleico que codifica um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori.
[00109] Concretização 102: Método, de acordo com a concretização 101, em que o um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori, é/são selecionado(s) a partir do grupo que compreende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 e HtrA.
[00110] Concretização 103: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 102, em que FliD é um FliD completo ou um fragmento do mesmo.
[00111] Concretização 104: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 103, em que o método compreende reagir a amostra com um agente de interação, em que o agente de interação interage com um ácido nucleico que codifica FliD, de preferência, o agente de interação interage, especificamente, com um ácido nucleico que codifica FliD.
[00112] Concretização 105: Método, de acordo com a concretização 104, em que o agente de interação interage com um ácido nucleico que codifica para FliD completo ou um fragmento de FliD.
[00113] Concretização 106: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 104 a 105, em que o agente de interação é selecionado a partir do grupo que compreende um iniciador e uma sonda.
[00114] Concretização 107: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 104 a 106, em que o agente de interação e o ácido nucleico, que codifica FliD presente na amostra, formam um produto de interação.
[00115] Concretização 108: Método, de acordo com a concretização 107, em que o produto de interação é detectado.
[00116] Concretização 109: Método, de acordo com a concretização 108, em que o produto de interação é diretamente detectado.
[00117] Concretização 110: Método, de acordo com a concretização 108, em que o produto de interação é indiretamente detectado.
[00118] Concretização 111: O método de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 103, em que uma molécula de ácido nucleico que codifica FliD é detectado por meio de espectrometria de massa, PCR ou um teste de hibridização.
[00119] Concretização 112: Método, de acordo com a concretização 111, em que a espectrometria de massa é selecionada a partir do grupo que compreende LC-ESI-MS/MS, MALDI-MS, MS em tandem, TOF/TOF, TOF-MS, TOF-MS/MS, triplo quadrupolo MS, e triplo quadrupolo MS/MS.
[00120] Concretização 113: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 112, em que o indivíduo é um humano e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por H. pylori.
[00121] Concretização 114: Método, de acordo com a concretização 113, em que o ácido nucleico que codifica FliD é de H. pylori.
[00122] Concretização 115: Método, de acordo com a concretização 114, em que o ácido nucleico que codifica FliD compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 2.
[00123] Concretização 116: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 112, em que o indivíduo é o porco e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por Helicobacter suis.
[00124] Concretização 117: Método, de acordo com a concretização 116, em que o ácido nucleico que codifica FliD é de H. suis.
[00125] Concretização 118: Método, de acordo com a concretização 117, em que o ácido nucleico que codifica FliD compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 4.
[00126] Concretização 119: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 112, em que o indivíduo é um gato e a infecção pelo Helicobacter é a infecção por Helicobacter felis.
[00127] Concretização 120: Método, de acordo com a concretização 119, em que o ácido nucleico que codifica FliD é de H. felis.
[00128] Concretização 121: Método, de acordo com a concretização 120, em que o FliD compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 6.
[00129] Concretização 122: Método, de acordo com qualquer uma das concretizações 94 a 121, em que a amostra é selecionada a partir do grupo que compreende fezes, soro, plasma e sangue total, de preferência, a amostra é de fezes.
[00130] Concretização 123: Uso de um ácido nucleico que codifica FliD como um biomarcador.
[00131] Concretização 124: Uso, de acordo com a concretização 123, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção de um indivíduo com Helicobacter.
[00132] Concretização 125: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 123 a 124, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é um humano e o Helicobacter é o H. pylori.
[00133] Concretização 126: Uso, de acordo com a concretização 125, em que o ácido nucleico que codifica FliD compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 2.
[00134] Concretização 127: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 124 a 125, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o porco e o Helicobacter é o H. suis.
[00135] Concretização 128: Uso, de acordo com a concretização 127, em que o ácido nucleico que codifica FliD compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 4.
[00136] Concretização 129: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 124 a 125, em que o biomarcador é um biomarcador para infecção do indivíduo com Helicobacter, em que o indivíduo é o gato e o Helicobacter é o H. felis.
[00137] Concretização 130: Uso, de acordo com a concretização 129, em que o ácido nucleico que codifica FliD compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 6.
[00138] Concretização 131: Uso, de acordo com qualquer uma das concretizações 123 a 130, em que o biomarcador é um biomarcador preditivo.
[00139] Concretização 132: Kit compreendendo um agente de interação capaz de interagir com um ácido nucleico que codifica FliD, ou um fragmento do mesmo, e, pelo menos, um outro componente.
[00140] Concretização 133: Kit, de acordo com a concretização 132, em que o pelo menos outro componente é selecionado a partir do grupo que compreende um tampão, uma fase sólida e um folheto de instruções.
[00141] Concretização 134: Kit, de acordo com a concretização 133, em que o agente de interação é capaz de interagir especificamente com FliD ou um fragmento do mesmo
[00142] Concretização 135: Kit, de acordo com qualquer uma das concretizações 132 a 134, em que o agente de interação é selecionado a partir do grupo que compreende um iniciador e uma sonda.
[00143] Concretização 136: Kit, de acordo com qualquer uma das concretizações 132 a 135, em que o kit é adequado para uso ou é para uso em um método para detectar infecção por Helicobacter em um indivíduo.
[00144] Concretização 137: Kit, de acordo com a concretização 136, em que o kit é adequado para uso ou é para uso em um método de qualquer uma das concretizações 94 a 122.
[00145] Os presentes inventores descobriram,surpreendentemente, que FliD, que é uma proteína também referida como “homólogo da proteína 2 gancho associada”, é um marcador para a infecção por Helicobacter e H. pylori,em particular. Os presentes inventores também descobriram, surpreendentemente, que FliD e/ou uma resposta imune contra FliD pode ser vantajosamente utilizada como um marcador de análise sorológica e, consequentemente, em qualquer outro método e teste, respectivamente, que se baseie ou faça uso de uma amostra de um indivíduo a ser testado para a infecção por Helicobacter e H. pylori, em particular, segundo o qual a amostra é, preferencialmente, selecionada a partir do grupo que compreende uma amostra de soro, uma amostra de plasma, uma amostra de sangue e uma amostra de fezes. Finalmente, os presentes inventores verificaram, surpreendentemente, que a infecção de um indivíduo com Helicobacter e H. pylori, em particular, pode ser detectada baseada na presença de FliD e/ou de um ácido nucleico que codifica FliD, em que FliD e/ou o ácido nucleico que codifica FliD é utilizado como o único marcador. Em outras palavras, de acordo com a presente invenção, uma infecção de um indivíduo por Helicobacter e H. pylori, em particular, pode ser diagnosticada somente com base, respectivamente, na presença de FliD e/ou de um ácido nucleico que o codifica. O mesmo também é verdade para uma resposta imune contra FliD desenvolvida por um indivíduo infectado com Helicobacter e H. pylori, em particular: De acordo com a presente invenção, uma infecção de um indivíduo por Helicobacter e H. pylori, em particular, pode ser diagnosticada e baseada apenas, respectivamente, com base em uma resposta imune contra FliD, onde a resposta imune contra FliD foi gerada pelo indivíduo. Outra vantagem da presente invenção é que a resposta imune contra FliD, bem como FliD, pode ser determinada em uma amostra que é tipicamente obtida por meio de métodos não invasivos, o que contraria muitos métodos de detecção do estado da arte, onde a amostra deve ser retirada por um método invasivo, tal como uma biópsia.
[00146] Um técnico no assunto reconhecerá que a presente invenção pode, em princípio, ser aplicada à detecção de qualquer infecção de um indivíduo com Helicobacter, desde que o referido Helicobacter codifique e/ou expresse FliD. Um técnico no assunto também reconhecerá que, tipicamente, uma espécie distinta de um indivíduo, tal como, por exemplo, um humano, será infectado por uma espécie distinta de Helicobacter. No caso de o indivíduo ser o homem, a espécie de Helicobacter é o H. pylori. No caso de o indivíduo ser o porco, as espécies de Helicobacter serão H. suis. No caso de o indivíduo ser o gato, incluindo grandes felinos, a espécie de Helicobacter é o H. felis. O presente relatório descritivo refere-se, particularmente, à detecção de H. pylori em humanos. Tal referência a H. pylori e humanos, no entanto, é feita exclusivamente por razões de clareza e, dado ao exposto, qualquer concretização referente à H. pylori e humanos, se aplica igualmente a qualquer outro Helicobacter que expresse FliD, ou um homólogo do mesmo, e qualquer outra espécie do indivíduo. De preferência, as outras espécies do indivíduo são quaisquer mamíferos que sofram ou possam sofrer de uma infecção por Helicobacter e uma espécie homóloga ao H. pylori, em que tal Helicobacter e espécies homólogas ao H. pylori expressam FliD ou um homólogo do mesmo.
[00147] Um técnico no assunto também reconhecerá que, para cada uma das espécies de Helicobacter, normalmente existem várias cepas. A sequência de aminoácidos e a sequência de ácido nucleico de FliD de tais cepas de espécies de Helicobacter normalmente mostram uma identidade muito elevada em termos de sequência de aminoácidos. Mais especificamente, a análise de bioinformática revelou que a sequência de aminoácidos de FliD está presente e é altamente conservada em todas as (> 200) cepas de H. pylori.
[00148] FliD tem uma homologia de 97% em cerca de 200 cepas de H. pylori que foram analisadas pelos presentes inventores. Curiosamente, com exceção de algumas outras espécies de Helicobacter não-pylori com homologia parcial, não há nenhum outro organismo conhecido com uma homologia genômica ou proteômica significativa para FliD de H. pylori. A comparação da proteína FliD de H. pylori mostra a elevada conservação de FliD nas espécies de Helicobacter, ao mesmo tempo que é distinta da maioria das outras bactérias, bem como, de organismos eucariotas. Esta análise, em conjunto com a previsão de alta antigenicidade desta proteína, fornece fundamentação para ausência real de reação cruzada.
[00149] Além disso, FliD é expresso por realmente todas as cepas que infectam ou que são capazes de infectar um indivíduo. Isto explica por que, de acordo com a presente invenção, FliD é um marcador para, realmente, cada cepa de H. pylori e, respectivamente, cada uma das cepas das espécies de Helicobacter que infectam as respectivas espécies de indivíduos. Em outras palavras, quase todos os pacientes positivos para H. pylori apresentam uma resposta imune contra FliD.
[00150] A proteína FliD de H. pylori é um element essencial para a montagem do flagelo funcional e uma cepa mutante para FliD é completamente imóvel. A flagelina desempenha um papel central na motilidade bacteriana e é necessária para a colonização e persistência da infecção por H. pylori (Eaton et al., 1996). A motilidade do H.pylori é um fator de virulência na patogênese da lesão da mucosa gástrica (S. Watanabe, et al., 1997). O gene FliD de H. pylori codifica uma proteína de 76 kDa (Kim, et al., 1999). O operon de FliD do H. pylori consiste nos genes FlaG, FliD e FliS, na ordem indicada, que estão sob o controle de uma promotor Sigma (28)dependente. Uma entrada para FliD de H. pylori pode ser encontrada nos bancos de dados UniProtKB/Swiss-Prot como P96786.4, que fornece, entre outros, a sequência de aminoácidos e de mutações para FliD de acordo com o encontrado em várias cepas de H. pylori.
[00151] O método da invenção para detectar infecção por Helicobacter em um indivíduo, de preferência, uma infecção por H. pylori em um indivíduo, pode também ser caracterizado de tal modo que compreenda a etapa de determinar se uma amostra do indivíduo contém uma resposta imune contra FliD, FliD, ou um ácido nucleico que codifica FliD. Se a amostra do indivíduo contiver uma resposta humoral contra FliD, FliD ou um ácido nucleico que codifica FliD, o indivíduo está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, uma infecção por H. pylori, ou apresentou uma infecção por Helicobacter no passado, de preferência, um infecção por H. pylori no passado.
[00152] Os métodos da invenção para detector infecção por Helicobacter em um indivíduo, de preferência, uma infecção por H. pylori em um indivíduo, podem ser aplicados igualmente a um indivíduo em que não se sabe se está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, infecção por H. pylori, ou se tal indivíduo apresentou uma infecção por Helicobacter, de preferência, infecção por H. pylori. Desta forma, a presente invenção está relacionada, sob outro aspecto, a métodos para determinar se um indivíduo está sofrendo uma infecção por Helicobacter, de preferência, infecção por H. pylori, ou apresentou uma infecção por Helicobacter, de preferência, infecção por H. pylori, no passado.
[00153] Como utilizada preferencialmente aqui, a expressão “no passado” refere-se a um momento no tempo que é anterior ao momento em que uma amostra foi ou é retirada de um indivíduo, em que tal amostra é uma amostra utilizada em conjunto com os diferentes aspectos e/ou as várias concretizações da presente invenção e, em particular, na detecção de H. pylori e/ou de infecção por H. pylori em um indivíduo, e no diagnóstico de H. pylori e/ou de infecção por H. pylori em um indivíduo.
[00154] Em conjunto com os vários aspectos da presente invenção e os vários métodos da presente invenção em particular, um técnico no assunto reconhecerá que a resposta imune e a resposta humoral anti-FliD gerada pelo indivíduo infectado por Helicobacter e H. pylori, em particular, persiste durante alguns anos. A prevalência de tal resposta humoral anti-FliD é, normalmente, cerca de 50% após 1 a 5 anos após a erradicação do H. pylori, cerca de 50% após 6 a 10 anos após a erradicação do H. pylori, cerca de 25% após 11 a 15 anos depois erradicação do H. pylori e cerca de 25% após 16 a 20 anos após a erradicação do H. pylori. Em virtude disso, um indivíduo que é diagnosticado como positivo para H. pylori pode ser um indivíduo que está, na verdade, sofrendo uma infecção por H. pylori no momento em que a amostra foi coletada, ou um indivíduo que apresentou uma infecção por H. pylori no passado e que ainda permanece com a resposta imune anti-FliD.
[00155] Uma vez que a resposta imune contra FliD é uma resposta humoral contra FliD e, mais especificamente, uma resposta humoral anti-FliD, os anticorpos anti-FliD são tipicamente IgG ou IgA. Esta especificidade de classe pode ser usada para a detecção dos anticorpos anti-FliD usando, como anticorpos de detecção ou captura de anticorpos, anticorpos anti-IgG e/ou anti-IgA. Na concretização em que o indivíduo é um humano, os anticorpos de detecção e os anticorpos de captura são, de preferência, IgG anti-humano e/ou IgA anti-humano.
[00156] Em conjunto com os vários aspectos da presente invenção e os vários métodos da presente invenção, em particular, os métodos podem, em uma concretização, compreender ainda detectar um ou mais antígenos de Helicobacter ou um ácido nucleico que codifica tais antígenos de Helicobacter. Em uma concretização, estes antígenos de Helicobacter são antígenos de H. pylori. Em outra concretização, os antígenos são selecionados a partir do grupo que compreende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 e HtrA, os quais são todos conhecidos no estado da arte, e descritos, por exemplo, em Yakoob J et al. (Yakoob J et al., Gut and Liver, Vol. 4, No. 3, Setembro de 2010, pp. 345-350), Sabarth N et al. (Sabarth N et al., Infection and Immunity, Novembro de 2002, p. 6.499-6.503), Gao L. et al.. (Gao L. et al, Cancer Res 2009; 69: (15), 1 de Agosto,2009, p 6164-6170), Yamaoka Y (Yamaoka Y, J Med Microbiol Maio de 2008; 57 (PT5):. 545-553), Miehlke S et al. (Miehlke S et al., Int J. Cancer: 87, 322-327 (2000)), e Atherton JC et al. (Atherton JC et al., Current Microbiology, Vol. 39 (1999), pp 211-218). Uma sequência de aminoácidos de CagA é aqui divulgada como SEQ ID NO: 7, uma sequência de nucleotídeos de CagA é aqui divulgada como SEQ ID NO: 8, uma sequência de aminoácidos de VacA é aqui divulgada como SEQ ID NO: 9, uma sequência de nucleotídeos de VacA é aqui divulgada como SEQ ID NO: 10, uma sequência de aminoácidos de GroEL é aqui divulgada como SEQ ID NO: 11, uma sequência de nucleotídeos de GroEL é aqui divulgada como SEQ ID NO: 12, uma sequência de aminoácidos de Hp0231 é aqui divulgada como SEQ ID NO: 13, uma sequência de nucleotídeos de Hp0231 é aqui divulgada como SEQ ID NO: 14, uma sequência de aminoácidos de JHp0940 é aqui divulgada como SEQ ID NO: 15, uma sequência de nucleotídeos de JHp0940 é aqui divulgada como SEQ ID NO: 16, uma sequência de aminoácidos de HtrA é aqui divulgada como SEQ ID NO: 17, e uma sequência de nucleotídeos de HtrA é aqui divulgada como SEQ ID NO: 18.
[00157] Em uma concretização do método da invenção, em que a infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente, uma infecção por H. pylori, em um indivíduo é detectada através da detecção, em uma amostra do indivíduo, de uma resposta imune contra FliD e, em particular, um anticorpo anti-FliD na amostra, a amostra e FliD reagem. Em uma concretização, a amostra é adicionada a FliD. De um modo preferido, FliD está ligado a uma fase sólida em tal método. Também está contemplado na presente invenção que FliD é adicionado à amostra. Preferencialmente, FliD é adicionado como uma solução, mais preferivelmente, como uma solução aquosa, tal como uma solução tamponada. Em uma concretização preferida, FliD reage com a amostra, onde FliD está ligado a uma fase sólida. Um técnico no assunto reconhecerá que FliD e a amostra reagem sob condições tais que, se a amostra contiver uma resposta imune contra FliD e anticorpos anti-FliD, em particular, um produto de interação é formado. Preferencialmente, tais produtos de interação são um complexo de FliD e um anticorpo anti-FliD contido na amostra.
[00158] O produto de interação assim formado pode ser detectado direta ou indiretamente. Na concretização em que o produto de interação é detectado diretamente, o FliD que reagiu com a amostra contém um marcador que permite a detecção de FliD, particularmente, quando interage com um anticorpo anti-FliD. Os marcadores deste tipo são conhecidos pelos técnicos no assunto e englobam marcadores radioativos, marcadores fluorescentes, corantes, nanopartículas, como o ouro, e enzimas, tais como a peroxidase de rábano. Outros marcadores são aqueles descritos aqui em conjunto com a marcação de anticorpos. Na concretização em que o produto de interação é detectado indiretamente, o produto de interação reage, subsequentemente, com um agente de detecção, onde o agente de detecção se liga especificamente ao produto de interação. Tal agente de detecção pode ser um anticorpo, preferivelmente, um anticorpo anti-IgG ou um anticorpo anti-IgA. O agente de detecção em si compreende, normalmente, um marcador que permite a detecção do agente de detecção, preferencialmente, quando o agente de detecção se liga especificamente ao produto de interação.
[00159] Em concretizações preferidas dos métodos da invenção, o produto de interação é detectado por meio de um teste imunoenzimático (ELISA) ou um radioimunoteste que são conhecidos por um técnico no assunto (F. Lottspeich e Zorbas H (eds.) , Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998). O ELISA pode ser um teste de ELISA indireto, ELISA sanduíche, ELISA competitivo ou ELISA não- competitivo.
[00160] Em outras concretizações preferidas dos métodos da invenção, o produto de interação é detectado por meio de um teste de fluxo lateral, que é também conhecido como teste imunocromatográfico de fluxo lateral que é descrito, por exemplo, no documento US 6.485.982. Este teste de fluxo lateral é, em uma concretização, utilizado em qualquer método da invenção, onde tanto um anticorpo anti-FliD é e, respectivamente, os anticorpos anti-FliD são detectados em uma amostra de um indivíduo. O teste de fluxo lateral será descrito com fins ilustrativos para a concretização do método da invenção, em que são detectados anticorpos anti-FliD em uma amostra de um indivíduo, em que o indivíduo é o humano.
[00161] A tecnologia baseia-se em uma série de leitos capilares, tais como pedaços de papel poroso ou polimérico. Cada um destes componentes tem a capacidade de transporte de fluidos, por exemplo, soro, plasma ou sangue, precipitadamente. O filtro (pad) de amostra atua como uma esponja e retém o excesso de fluido da amostra. Quando o filtro da amostra fica saturado, o fluido se move para o filtro do conjugado, onde as nanopartículas, de preferência, as nanopartículas de ouro, conjugadas com anticorpo anti- humano estão localizadas. Quando o fluido de amostra migra para este elemento, ele dissolve as partículas e, em uma reação combinada, a mistura de amostra e conjugado flui através da estrutura porosa. Desta forma, o anticorpo imobilizado sobre a superfície das nanopartículas, liga-se a IgG humana existente na amostra durante a migração através da próxima matriz capilar. Neste elemento, que é normalmente uma membrana hidrofóbica, como a nitrocelulose, os antígenos, bem como um controle (IgG humana, por exemplo) são imobilizados como linhas de teste ou de controle. Uma vez que a IgG humana, que está agora ligada às partículas de conjugado, atinge estas linhas, o antígeno imobilizado sobre a membrana irá capturar o complexo anticorpo especificamente. Depois de um tempo, mais e mais partículas se acumulam em um local do antígeno e uma faixa colorida detectável simplesmente aparece. Em uma concretização, existe apenas um antígeno, ou seja, FliD. Em outra concretização, existem, além de FliD, um ou mais antígenos. Preferencialmente, os um ou mais antígenos é/são selecionado(s) a partir do grupo que compreende CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 e HtrA.
[00162] Em outras concretizações alternativas preferidas dos métodos da invenção, o produto de interação é detectado por meio de um teste de linha. Tal teste de linha compreende, normalmente, uma pluralidade de tiras. Nas referidas tiras, FliD ou o agente de interação recombinante altamente purificado, que é capaz de interagir com FliD, é fixado sobre as tiras. Estas tiras são produzidas, preferencialmente, de uma membrana de nitrocelulose. As tiras são incubadas com a amostra, preferencialmente, com uma amostra de soro ou plasma diluído, e os anticorpos anti-FliD se ligam a FliD. No caso FliD é imobilizado para a detecção de anticorpos anti-FliD na amostra, ou FliD se liga aos anticorpos anti-FliD, no caso os anticorpos anti-FliD são imobilizados para a detecção de FliD na amostra sobre as tiras de teste. Em uma segunda etapa, as tiras são incubadas com anticorpos anti- imunoglobulina humana (IgG e IgA), os quais são acoplados à peroxidase de rábano. Especificamente, os anticorpos ligados são detectados por meio de uma reação de coloração catalisada pela peroxidase. Se uma reação antígeno- anticorpo ocorreu formando um produto de interação, uma faixa escura aparece na faixa no ponto correspondente. Em uma concretização, as bandas de controle, localizadas na extremidade superior das tiras de teste, são as seguintes: a) A banda de controle da reação, sob o número da tira, deve apresentar uma reação para cada amostra. b) As faixas de controle do conjugado (IgG, IgA) são utilizadas para verificar a classe de anticorpo detectada. Se, por exemplo, a tira de teste para a detecção de anticorpos IgG for usada, o conjugado de IgG irá mostrar uma banda clara. c) “Linha de corte do controle”: A intensidade desta banda permite a avaliação da reatividade das bandas de antígenos individuais.
[00163] Um teste tendo este tipo de delineamento, com antígenos diferentes de FliD, está, basicamente, disponível por Mikrogen GmbH, Neuried, Alemanha, como “recomLine Helicobacter IgG” ou “recomLine Helicobacter IgA” (Ref: http://www.mikrogen.de/uploads/tx oemikrogentables/dokumente/GARLHP00lEN.pdf).
[00164] Em uma concretização do método da invenção para detectar infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente, uma infecção por H. pylori, em um indivíduo, em que o método compreende detectar FliD, em uma amostra do indivíduo, FliD é detectado por meio de espectrometria de massa que é descrita, por exemplo, em F. Lottspeich e Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998.
[00165] Nestas concretizações dos métodos da invenção, em que FliD é detectado em uma amostra do indivíduo, o agente de interação que forma, em conjunto com FliD, o produto de interação, é preferencialmente um selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo, um aptâmero e um spiegelmer. A geração de tal agente de interação faz parte do conhecimento de um técnico no assunto.
[00166] A geração de um anticorpo de ligação, mais particularmente, um que se liga especificamente a FliD, é conhecida por um técnico no assunto e é descrita, por exemplo, em Harlow, E., e Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Preferencialmente, os anticorpos monoclonais podem ser utilizados em conjunto com a presente invenção, os quais podem ser fabricados de acordo com o protocolo de Cesar e Milstein e outros desenvolvimentos com base no mesmo. Os anticorpos, conforme utilizados aqui, incluem, mas não estão limitados a, os anticorpos completos, fragmentos de anticorpos ou seus derivados, tais como fragmentos Fab, fragmentos Fc e anticorpos de cadeia simples, desde que estes sejam adequados e capazes de se ligarem a FliD. Além dos anticorpos monoclonais, os anticorpos policlonais também podem ser usados e/ou gerados. A geração de anticorpos policlonais também é conhecida por um técnico no assunto e é descrita, por exemplo, em Harlow, E., e Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, (1988).
[00167] Os anticorpos que podem ser utilizados, de acordo com a presente invenção, podem ter um ou vários marcadores. Tais marcadores podem ser úteis para a detecção do anticorpo. De preferência, os marcadores são selecionados a partir do grupo que compreende a avidina, estreptavidina, biotina, ouro, enzimas como HRP e fluoresceína, utilizados, por exemplo, nos métodos de ELISA. Estes e outros marcadores, bem como os métodos são descritos, por exemplo, em Harlow, E., e Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, (1988).
[00168] Os aptâmeros são os D-ácidos nucleicos que são cadeia simples ou de cadeia dupla e que interagem especificamente com uma molécula-alvo, tal como, na presente invenção, FliD. A produção ou a seleção de aptâmeros é descrita, por exemplo, na patente europeia EP 0 533 838. Basicamente, as seguintes etapas são realizadas. Em primeiro lugar, uma mistura de ácidos nucleicos, por exemplo, aptâmeros potenciais, é fornecida onde quer que cada ácido nucleico compreenda, normalmente, um segmento de várias, de preferência, pelo menos, oito nucleotídeos randomizados subsequentes. Esta mistura é, subsequentemente, colocada contato com a molécula alvo onde ocorre a ligação entre o(s) ácido(s) nucleico(s) e a molécula alvo, tal como baseada em uma maior afinidade em direção ao alvo ou com uma maior força entre os mesmos, em comparação com a mistura candidata. O(s) ácido(s) nucleico(s) é/são subsequentemente separado(s) do restante da mistura. Opcionalmente, o(s) ácido(s) nucleico(s), assim obtido(s), é/são amplificado(s) utilizando, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase. Estas etapas podem ser repetidas várias vezes, originando, ao fim, uma mistura com uma maior proporção de ácidos nucleicos que se ligam especificamente ao alvo a partir do qual o ácido nucleico de ligação final é, portanto, opcionalmente selecionado. Estes ácidos nucleicos que se ligam especificamente são referidos como aptâmeros. É óbvio que, em qualquer fase do processo para a geração ou identificação dos aptâmeros, amostras da mistura de ácidos nucleicos individuais podem ser feitas para determinar a sequência dos mesmos utilizando-se técnicas convencionais. Está contemplado na presente invenção que os aptâmeros podem ser estabilizados, tais como, por exemplo, através da introdução de grupos químicos definidos que são conhecidos pelos técnicos no assunto de geração de aptâmeros. Tal modificação pode, por exemplo, residir na introdução de um grupo amino na posição 2' da porção açúcar dos nucleotídeos.
[00169] A geração ou produção de spiegelmers que se ligam e, mais particularmente, que se ligam, especificamente, a uma molécula FliD como uma molécula alvo baseia-se em um princípio semelhante. A produção de spiegelmers é descrito no Pedido de Patente Internacional WO 98/08856. Spiegelmers são L-ácidos nucleicos, o que significa que eles são compostos por L-nucleotídeos em vez de D-nucleotídeos, como são os aptâmeros. Spiegelmers são caracterizados pelo fato de terem uma estabilidade muito elevada em sistemas biológicos e, comparáveis aos aptâmeros, interagem especificamente com a molécula alvo a qual são dirigidos. Com o intuito de produzir os spiegelmers, uma população heterogênea de D-ácidos nucleicos é criada e esta população é colocada em contato com o antípoda óptico da molécula alvo, no presente caso, por exemplo, com o D- enantiômero do L-enantiômero de FliD de ocorrência natural. Subsequentemente, são separados os D-ácidos nucleicos que não interagem com o antípoda óptico da molécula alvo. No entanto, os D-ácidos nucleicos que interagem com o antípoda óptico da molécula alvo são separados, determinados e/ou sequenciados, opcionalmente, e, subsequentemente, os L- ácidos nucleicos correspondentes são sintetizados com base na informação da sequência de ácido nucleico obtida a partir dos D-ácidos nucleicos. Estes L-ácidos nucleicos que são idênticos, em termos de sequência, aos D-ácidos nucleicos acima mencionados que interagem com o antípoda óptico da molécula alvo, interagirão, especificamente, com a molécula alvo de ocorrência natural, em vez de seu antípoda óptico. Similar ao método de geração de aptâmeros, também é possível repetir diversas vezes as várias etapas, enriquecendo, assim, esses ácidos nucleicos que interagem, especificamente, com o antípoda óptico da molécula alvo.
[00170] Nas concretizações do método da invenção para detectar infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente, uma infecção por H. pylori em um indivíduo, o método compreende detectar, em uma amostra do indivíduo, um ácido nucleico que codifica FliD, o agente de interação é selecionado a partir do grupo que compreende um iniciador e uma sonda. Tendo em conta as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos de FliD descritos aqui, faz parte do conhecimento de um técnico no assunto desenhar e preparar tais iniciadores e sondas (vide, por exemplo, Lottspeich e Zorbas H F. (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1998). Tal agente de interação pode ser marcado. Os vários marcadores e as maneiras de como marcar o agente de interação fazem parte do conhecimento de um técnico no assunto. Em uma concretização, os marcadores são os mesmos, conforme descritos acima, em ligação com os anticorpos.
[00171] O produto de interação que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica FliD ou um fragmento do mesmo, e um agente de interação podem ser detectados pelos meios conhecidos por um técnico no assunto e descritos, por exemplo, em F. Lottspeich e Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998.
[00172] Em uma concretização do método da invenção para detectar infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente uma infecção por H. pylori em um indivíduo, o método compreende detectar, em uma amostra do indivíduo, um ácido nucleico que codifica FliD, o ácido nucleico que codifica FliD é detectado por meio de espectrometria de massa que é descrita, por exemplo, em F. Lottspeich e Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998.
[00173] Em uma concretização do método da invenção para detectar infecção por Helicobacter, e mais preferencialmente, uma infecção por H. pylori em um indivíduo, o método compreende detectar, em uma amostra do indivíduo, um ácido nucleico que codifica FliD, o ácido nucleico que codifica FliD é detectado por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), em suas diversas formas, que são descritas, por exemplo, em Lottspeich e Zorbas HF. (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998. Alternativamente, o ácido nucleico que codifica FliD é detectado por um teste de hibridização, como, por exemplo, descrito em F. Lottspeich e Zorbas H (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998.
[00174] Nesses aspectos da invenção que estão relacionados ao biomarcador, reconhece-se que cada resposta imune contra FliD, conforme definida aqui, FliD e um ácido nucleico que codifica FliD agem como um biomarcador preditivo à medida que a presença da referida resposta imune contra FliD, conforme definida aqui, FliD e/ou ácido nucleico que codifica FliD estiver correlacionada com a histologia e a inflamação em pacientes não tratados.
[00175] Um técnico no assunto reconhecerá que, dada a divulgação proporcionada aqui, o desenho particular do kit da presente invenção está dentro das competências comuns de um técnico no assunto. Em uma concretização, o kit é um kit pronto-para-uso.
[00176] Em outro aspecto da presente invenção, a presente invenção está relacionada ao uso dos agentes de interação revelados aqui para a detecção de FliD, conforme divulgado aqui.
[00177] Como utilizada preferencialmente aqui, uma amostra é uma amostra obtida imediatamente de um ou do indivíduo, ou de uma amostra que tenha sido processada antes de ser utilizada em conjunto com a invenção e, particularmente, com os métodos da invenção.
[00178] Em uma concretização dos vários aspectos e concretizações da invenção, o indivíduo é um indivíduo que se supõe sofrer, ou se suspeita de estar sofrendo, de uma infecção por H. pylori.
[00179] Em uma concretização, a infecção por Helicobacter é a infecção por Helicobacter ou uma infecção por Helicobacter conhecida ou suspeita.
[00180] Em uma concretização de qualquer aspecto da presente invenção, em que um primeiro composto interage especificamente com ou liga-se especificamente a um segundo composto, a interação ou a ligação entre o referido primeiro composto e o referido segundo composto é caracterizada por um Kd de 1 μM, ou menos,preferencialmente, um Kd de 0,25 μM ou menos, e mais preferencialmente, um Kd de 0,1 ou menos.
[00181] Será entendido por um técnico no assunto que,nesta concretização, onde FliD é detectado, FliD pode estar presente na forma de FLiD completo ou um fragmento de FliD ou um fragmento de FliD completo. Como utilizado preferencialmente aqui, um FliD completo é um FliD produzido por Helicobacter, o qual é ativo como um fator de virulência. Em uma concretização, um FliD completo é, preferencialmente, um FliD produzido por Helicobacter. Um fragmento de FliD completo é um fragmento, cuja sequência de aminoácidos é mais curta do que a sequência de aminoácidos de FliD completo, através da qual o fragmento de FliD ainda continua ativo como um fator de virulência. Um fragmento de FliD é, preferencialmente, um fragmento de FliD, preferencialmente, de um FliD completo, em que o fragmento possui uma sequência de aminoácidos que é suficientemente longa de forma a permitir que um técnico no assunto identifique o fragmento como sendo um fragmento de FliD e FliD completo, em particular, e exclua que o fragmento é um fragmento de uma proteína ou polipeptídeo diferente de FliD e FliD completo, em particular. Em uma concretização preferida, o FliD completo compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: l.
[00182] As mesmas considerações e definições aplicam-se igualmente a um ácido nucleico que codifica FliD.De acordo com isto, um técnico no assunto entenderá que, naquelas concretizações em que um ácido nucleico que codifica FliD for detectado, um ácido nucleico que codifica FliD pode estar presente quer como um ácido nucleico que codifica um FliD completo ou um ácido nucleico que codifica o fragmento de FliD ou um ácido nucleico que codifica o fragmento de FliD completo. Como utilizado preferencialmente aqui, um FliD completo é um FliD produzido por Helicobacter, o qual é ativo como um fator de virulência. Em uma concretização, um FliD completo é, preferivelmente, um FliD produzido por Helicobacter. Um fragmento de FliD completo é um fragmento, cuja sequência de aminoácidos é mais curta do que a sequência de aminoácidos de FliD completo, através da qual o fragmento de FliD ainda continua ativo como um fator de virulência. Um fragmento de FliD é, preferencialmente, um fragmento de FliD, preferencialmente, de FliD completo, em que o fragmento possui uma sequência de aminoácidos que é suficientemente longa de forma a permitir que um técnico no assunto identifique o fragmento como sendo um fragmento de FliD e FliD completo, em particular, e exclua que o fragmento é um fragmento de uma proteína ou polipeptídeo diferente de FliD e FliD completo, em particular. Em uma concretização preferida, o ácido nucleico que codifica um FliD completo compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 2.
[00183] Um fragmento de um ácido nucleico que codifica FliD é, preferencialmente, um fragmento de um ácido nucleico que codifica FliD, preferencialmente, FliD completo, em que o fragmento possui uma sequência de aminoácidos que é suficientemente longa de forma a permitir que um técnico no assunto identifique o fragmento como sendo um fragmento de um ácido nucleico que codifica FliD e FliD completo, em particular, e exclua que o fragmento de ácido nucleico é um fragmento de um ácido nucleico que codifica uma proteína ou polipeptídeo diferente de FliD e FliD completo, em particular.
[00184] Um técnico no assunto também entenderá que, naquelas concretizações dos métodos da invenção, onde uma resposta imune contra FliD, conforme definida aqui, é detectada, o FliD que reage com a resposta imune contra FliD, conforme definida aqui, pode ser o FliD que é produzido pelas espécies de Helicobacter que infectam o indivíduo ou que presumivelmente infectam o indivíduo, pode ser um FliD completo, conforme definido aqui, ou pode ser um fragmento de FliD, conforme definido aqui. Além disso, um fragmento de FliD é, em uma concretização, um fragmento de FliD tendo uma sequência de aminoácidos mais curta do que FliD, em que o fragmento pode ser utilizado nas referidas concretizações dos métodos da invenção, enquanto permite a interação específica com ou a detecção específica da resposta imune contra FliD, conforme definida aqui.
[00185] Em conjunto com a presente invenção, um iniciador específico para um ácido nucleico que codifica FliD, conforme utilizado em conjunto com os vários aspectos da presente invenção e/ou em conjunto com as diversas concretizações da presente invenção, é um iniciador escolhido a partir do grupo que consiste em um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 21, um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 22, um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 23, um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 24, um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 25, um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 26, um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 27 e um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 28. Preferencialmente, o iniciador é uma combinação de, pelo menos, dois iniciadores, através dos quais pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 22; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 24; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 26; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 28; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 22; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 24; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 26; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 28; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 22; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, e um segundo iniciador dos, é um iniciador que compreende de acordo com SEQ ID NO: 24; pelo menos, dois iniciadores uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 25, e um segundo iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 26; um primeiro iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 25, e um segundo iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 28; um primeiro iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 27, e um segundo iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 22; um primeiro iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 27, e um segundo iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 24; um primeiro iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 27, e um segundo iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 26; ou um primeiro iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 27, e um segundo iniciador dos, pelo menos, dois iniciadores é um iniciador que compreende uma sequência de nucleotídeos, de acordo com SEQ ID NO: 28.
[00186] As várias SEQ ID NOs: às quais se referem aqui, o composto representado pela referida SEQ ID NO:, os organismos a partir dos quais as referidas sequências foram retiradas e, em alguns casos, uma indicação da entrada correspondente da sequência em bancos de dados publicamente disponíveis estão resumidos na Tabela 1, a seguir:Tabela 1:
[00187] SEQ ID NO: l é a sequência de aminoácidos de FliD expressa por H. pylori, que corresponde à entrada ACI27464.1 no GenBank.
[00188] SEQ ID NO: 2 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de FliD expressa por H. pylori, que corresponde à entrada CP001173.1 no GenBank.
[00189] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos de FliD expressa por H. suis que corresponde à Sequência de Referência NCBI WP_006563874.1.
[00190] SEQ ID NO: 4 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de FliD expressa por H. suis que corresponde à entrada ADGY01000008.1 no GenBank.
[00191] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos de FliD expressa por H. felis que corresponde à Sequência de Referência NCBI YP_004073770.1.
[00192] SEQ ID NO: 6 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de FliD expressa por H. felis, que corresponde à entrada FQ670179.2 no GenBank.
[00193] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos de CagA de H. pylori G27 que corresponde à Sequência de Referência NCBI YP 002266135.1.
[00194] SEQ ID NO: 8 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de CagA de H. pylori G27, que corresponde à entrada JQ318032.1 no GenBank.
[00195] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos de VacA de H. pylori G27, que corresponde à Sequência de Referência NCBI YP_002266461.1.
[00196] SEQ ID NO: 10 é a sequência de ácido nucleico (cDNA) de VacA de H. pylori G27, que corresponde à Sequência de Referência NCBI NC_011333.1.
[00197] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos de GroEL de H. pylori G27, que corresponde à Sequência de Referência NCBI YP_002265651.1.
[00198] SEQ ID NO: 12 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de GroEL de H. pylori G27, que corresponde à Sequência de Referência NCBI NC_011333.1.
[00199] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos de Hp0231 de H. pylori 26695, que corresponde à sequência de referência NCBI NP_207029.1.
[00200] SEQ ID NO: 14 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de Hp0231 de H. pylori 26695, que corresponde à Sequência de Referência NCBI NC_000915.1.
[00201] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos de JHp0940 de H. pylori J99, que corresponde à Sequência de Referência NCBI NP_223657.1.
[00202] SEQ ID NO: 16 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de JHp0940 de H. pylori J99, que corresponde à Sequência de Referência NCBI NC_000921.1.
[00203] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos de HtrA de H. pylori G27, que corresponde à Sequência de Referência NCBI YP 002266040.1.
[00204] SEQ ID NO: 18 é a sequência de nucleotídeos (cDNA) de HtrA de H. pylori G27, que corresponde à Sequência de Referência NCBI NC_011333.1.
[00205] SEQ ID NO: 19 é um iniciador utilizado para clonagem do gene FliD de H. pylori.
[00206] SEQ ID NO: 20 é um iniciador utilizado para clonagem do gene FliD de H. pylori.
[00207] SEQ ID NO: 21 é um iniciador direto utilizado na PCR1 do Exemplo 9.
[00208] SEQ ID NO: 22 é um iniciador reverse utilizado no PCR1 do Exemplo 9.
[00209] SEQ ID NO: 23 é um iniciador direto utilizado na PCR2 do Exemplo 9.
[00210] SEQ ID NO: 24 é um iniciador reverse utilizado no Exemplo 9 de PCR2.
[00211] SEQ ID NO: 25 é um iniciador direto utilizado na PCR3 do Exemplo 9.
[00212] SEQ ID NO: 26 é um iniciador reverse utilizado no PCR3 do Exemplo 9.
[00213] SEQ ID NO: 27 é um iniciador direto utilizado no PCR4 do Exemplo 9.
[00214] SEQ ID NO: 28 é um iniciador reverse utilizado no PCR4 do Exemplo 9.
[00215] Um técnico no assunto entenderá que, no caso de a sequência de nucleotídeos ser uma sequência de DNA e uma sequência de cDNA, em particular, também será divulgada aqui uma sequência de RNA que difere de tal sequência de DNA e sequência de cDNA apenas quando tal porção açúcar for um ribonucleotídeo, em vez de um desoxirribonucleotídeo.
[00216] A presente invenção é ilustrada agora pelas seguintes figuras e exemplos que não se destinam a limitar o escopo de proteção. A partir das referidas figuras e exemplos, novas características, concretizações e vantagens podem ser assumidas, em que a FIG. 1 mostra uma concretização de um teste de linha utilizado nos métodos da invenção para a detecção de anticorpos anti-FliD na amostra de soro de 20 pacientes humanos histologicamente diagnosticados como positivos para Helicobacter pylori; a FIG. 2 mostra uma concretização de um teste de fluxo lateral, que pode ser utilizado nos métodos da presente invenção para detectar anticorpos anti-FliD em uma amostra, tal como uma amostra de sangue total de um indivíduo humano, sendo que a Fig. 2A ilustra o desenho esquemático do teste, e a Fig. 2B representa um resultado do teste; a FIG. 3 é um diagrama indicando a prevalência de uma resposta anti-FliD em amostras de humanos em função dos anos após a erradicação de H. pylori; a FIG. 4 mostra as curvas ROC para FliD quando comparado com dois antígenos conhecidos; a FIG. 5 mostra o resultado de uma análise de Western blot detectando FliD em várias concentrações utilizando o soro anti-FliD de camundongo, exceto Tig ou gGT; a FIG. 6 mostra uma série de Southern blots, utilizando a reação em cadeia da polimerase 1 (PCR1), reação em cadeia da polimerase 2 (PCR2), a reação em cadeia da polimerase 3 (PCR3) ou a reação em cadeia da polimerase 4 (PCR4) para a detecção do DNA genômico presente em amostras representativas de pacientes que foram diagnosticados como positivos para H. pylori; a FIG. 7 mostra o resultado de uma análise de Western blot representativa realizada utilizando-se lisados de proteína total da cultura de H. pylori; e a FIG. 8 mostra o resultado de duas análises de Western blot para determinar se FliD foi expresso pelos micro-organismos indicados abaixo de cada um dos Western blots.
[00217] Todas o manipulações de DNA foram realizadas de acordo com as condições padrão descritas por Sambrook et al. (Sambrook, et al., 1989). Resumidamente, o gene FliD foi amplificado por PCR utilizando-se o DNA genômico da cepa J99 de H. pylori como molde. Os seguintes oligonucleotídeos foram utilizados como iniciadores: 5'-CAT ATG GCA ATA GGT TCA TTA A-3'(SEQ ID NO: 19) e 5'-CTC GAG ATT CTT TTT AGC CGC TGC-3' (SEQ ID NO: 20). Utilizando esta abordagem, um sítio Ndel foi introduzido na extremidade 5' dos iniciadores diretos e um sítio Xhol na extremidade 5' dos iniciadores reversos. Após a amplificação por PCR, o produto (2058 pb) foi ligado ao vetor de clonagem pTZ57R/T (InsTAclone™ PCR Cloning Kit, MBI Fermentas, Lituânia).Subsequentemente, a inserção foi confirmada através de PCR e sequenciamento, e foi clonado em um vetor de expressão pET-28a(+) (Qiagen, EUA) utilizando as enzimas de restrição Ndel e Xhol.
[00218] As células competentes de E. coli BL21 (Qiagen, EUA) foram transformadas com pET-28a(+)-FliD e inoculadas em meio LB com antibiótico (canamicina, 50 μg/mL). A expressão foi induzida pela adição de 1 mmol/L de isopropil e-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma densidade óptica (OD6OO) de 0,6. Após 4 horas, as células foram coletadas e a análise de proteína do lisado total foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). As proteínas solúveis com tag de histidina foram purificadas utilizando-se a cromatografia de afinidade (HisTrap Crude, GE Healthcare). Como uma segunda etapa de polimento e para a troca de tampão, a cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 75, GE Helthcare) foi realizada. As frações relevantes foram coletadas e concentradas com um dispositivo de filtração para centrífuga (Millipore), com um corte de 10 kDa, e armazenadas a -80°C. A proteína recombinante purificada foi avaliada por Western blot utilizando-se um anticorpo anti-His Tag-HRP, bem como um anticorpo murino anti-H. pylori-HRP (Pierce, Rockford, EUA), e detectada pelo sistema ECL (GE Healthcare, Uppsala, Suécia).
[00219] A amplificação do gene FliD do DNA da cepa J99 de H. pylori revelou um único produto de PCR de 2,05 kb (dados não mostrados), o qual foi confirmado pelo sequenciamento e ligação ao vetor de expressão pET-28a(+). Após a transformação na cepa de expressão BL21 DE3 de E. coli, e indução com IPTG, uma banda única transparente pode ser observada no Western blot utilizando-se um antissoro policlonal anti-H. pylori comercial. A proteína foi purificada, conforme descrito em Materiais e Métodos, com > 90% de pureza (dados não mostrados) e confirmada, novamente, por Western blot (dados não mostrados).
[00220] Um coelho branco adulto da Nova Zelândia foi imunizado com a proteína purificada de acordo com o protocolo de Hay et al. com pequenas modificações (Hay et al., 2002). Em resumo, a imunização foi realizada pela injeção i.m. de 250 μg de proteína recombinante purificada (0,5 mL) com o mesmo volume (0,5 mL) de adjuvante completo de Freund. Para as reimunizações (recall immunizations), o coelho teve um reforço com 125 μg de proteína purificada, preparada no mesmo volume (0,5 mL) de adjuvante incompleto de Freund, 4, 6, 8 e 10 semanas depois. Como controle negativo, uma amostra de soro foi coletada antes da imunização. Finalmente, duas semanas após a última imunização, o sangue foi coletado e os soros separados. O anticorpo IgG policlonal foi purificado por cromatografia de afinidade com Sefarose-4B utilizando-se colunas conjugadas a rFliD preparadas de acordo com o protocolo do fabricante (Pharmacia, 1988). A expressão de FliD de H. pylori (J99) foi detectada por Western blot utilizando-se sobrenadante de ultrassons, na concentração proteica de 50 μg/mL. O anticorpo IgG policlonal de coelho criado contra a proteína rFliD foi utilizado como primeiro anticorpo (diluição 1:5000), o anticorpo de ovelha marcado com HRP contra IgG de coelho (Avicenna Research Institute, Teerã, Irã) como o segundo anticorpo (diluição 1:3000), e sistema ECL, foram utilizados para a detecção (Chen, et al., 2001).
[00221] Além disso, para testar a antigenicidade do FliD recombinante e compará-lo com a proteína nativa, o antissoro policlonal de coelho foi produzido. Os títulos de anticorpo já foram determinados após a terceira imunização e atingiram níveis elevados após o quarto reforço, confirmando a boa imunogenicidade de FliD. O antissoro de coelho foi capaz de reconhecer o rFliD purificado e FliD em lisados de H. pylori (dados não mostrados).
[00222] As placas de ELISA foram revestidas com 100 μL de proteína rFliD a uma concentração de 1 (μg/mL em PBS e incubadas durante a noite a 4°C. Os poços revestidos foram bloqueados com solução tampão fosfato (PBS) contendo 2,5% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma) durante duas horas a 37°C. Todas as amostras sorológicas positivas e negativas para H. pylori utilizadas neste estudo foram analisadas quanto à presença de anticorpos contra FliD através da diluição ótima dos soros dos pacientes (diluição de 1:100) como o primeiro anticorpo, anti-IgG humana conjugado a HRP (Promega, Mannheim, Alemanha) (diluição de 1:100) como anticorpo secundário, e TMB (3,3',5,5'-tetra- metil-benzidina) como um substrato. Além disso, os poços sem revestimento foram os controles para cada soro. O resultado do ELISA para a amostra de soro de um paciente foi considerado positivo se o seu valor de OD450 fosse superior à média + 3 DP das amostras de soro negativas (Chen, et al., 2001).
[00223] Um imunoteste de linha baseado em proteínas H. pylori recombinantes imobilizadas em nitrocelulose foi preparado. Ao contrário do ELISA, o princípio do teste permite a identificação de anticorpos específicos contra vários antígenos de H. pylori através da aplicação separada de diferentes antígenos individuais.
[00224] O rFliD foi imobilizado em tiras de membrane de nitrocelulose em conjunto com outros antígenos recombinantes de H. pylori altamente purificados (CagA, VacA, GroEL, UreA (urease A), HcpC (proteína C rica em cisteína) (Mittel et al., 2003) e gGT (gama glutamil transferase). As condições de linha apropriadas para rFliD foram determinadas empiricamente com uma seleção de amostras de soro padrão a partir de uma população de estudo descrita anteriormente, a qual compreende 20 amostras definidas como histologicamente positivas para H. pylori e 20 amostras definidas como histologicamente negativas para H. pylori. A concentração de antígeno ideal e a escolha ideal de aditivos como detergente, ditiotreitol, e NaCl foram ajustadas para cada antígeno por meio de ciclos repetitivos de revestimento e rastreamento. As condições com melhor apresentação de epítopos de antígenos e melhor ligação à membrana, apresentadas pela aparência de banda perfeita e melhor discriminação entre amostras negativas e positivas, foram selecionadas como especificações ideais de produto dos primeiros lotes. As bandas de controle foram adicionadas na extremidade superior da tira, que compreende os anticorpos de coelho IgG/IgM/IgA anti-humano, como controles de incubação e os anticorpos humanos IgG, IgM ou IgA como controle do conjugado, bem como um linha de corte de controle que permite a avaliação da reatividade das bandas de antígenos individuais.
[00225] Após a digitalização e análise densitométrica das intensidades de banda, o controle foi utilizado como referência interna para calcular as razões para cada banda. Normalmente, as bandas controle de corte são pontuadas entre 20 e 30, enquanto as bandas positivas fortes podem marcar até 600 pontos. Cada banda com pontuação acima do controle individual de cada tira é considerada positiva (razão > 1).
[00226] O respectivo teste de linha está ilustrado na Fig. 1
[00227] Utilizando os materiais acima definidos, um teste de fluxo lateral, foi desenvolvido baseado nos princípios descritos aqui, que estão relacionados com o delineamento de um teste de fluxo lateral.
[00228] O protótipo de tal teste de fluxo lateral está representado na Fig. 2, em que a Fig. 2A ilustra o desenho esquemático do teste, e a Fig. 2B apresenta o resultado de uma análise de uma amostra obtida de um humano utilizando o teste, no qual os anticorpos anti-FliD foram detectados.
[00229] Conforme pode ser observado na Fig. 2A, o teste utilizou nanopartículas anti-hIgG revestidas de ouro. O rFliD, bem como CagA recombinante, estavam presentes como antígenos. A hIgG também foi imobilizada servindo como um controle. A estrutura porosa foi formada por nitrocelulose. A banda de controle indicou que o sistema funciona adequadamente. A banda de FliD indicou que o paciente apresentou uma infecção ativa ou recentemente tratada. A banda de CagA, em caso de infecção ativa (banda FliD+), indica que esta infecção deve ser tratada.
[00230] Um total de seiscentos e dezoito (618) pacientes humanos (308 homens, 310 mulheres) foi incluído no estudo. Depois de receber uma explicação do objetivo do estudo, o consentimento informado de cada doente foi obtido e uma amostra de sangue foi coletada no momento da endoscopia, antes de qualquer terapia ter sido iniciada. Os soros foram separados e armazenados a -20°C. O diagnóstico de infecção baseou-se na histopatologia como padrão ouro. Os pacientes foram considerados positivos para H. pylori quando os resultados do exame histopatológico foram positivos. Todos os pacientes foram examinados pelo teste de linha para FliD, e um subconjunto de 246 soros foi testado para a dosagem de FliD por ELISA, conforme descrito acima, e pelo teste de linha, conforme descrito acima.
[00231] A Tabela 2 mostra os resultados da utilização do referido ELISA para FliD. Mais especificamente, a Tabela 2 mostra a resposta sorológica para FliD, por meio do ELISA, na comparação entre pacientes negativos e positivos para H. pylori.
[00232] A Tabela 3 mostra os resultados da utilização do teste de linha para um subgrupo do grupo de pacientes. Mais especificamente, a Tabela 3 mostra a resposta sorológica para FliD no teste de linha na comparação entre pacientes negativos e positivos.
[00233] Utilizando o ELISA para FliD, dentre as 170 amostras positivas relatadas, 165 amostras positivas foram detectadas, enquanto que, dentre as 76 amostras relatadas como negativas, 73 foram reconfirmadas como negativas através do ELISA (Tabela 2). Em relação aos dados, a aplicação de FliD no diagnóstico da infecção por H. pylori baseado em ELISA tem uma especificidade de 96% e uma sensibilidade de 97%. Curiosamente, os cinco casos que foram ELISA negativo também tiveram pontuações positivas baixas, porém raras, no blot de linha, as quais estavam um pouco acima da linha de corte (razões entre 1,2 e 2,2). Um destes também foi considerado como negativo para H. pylori através do blot de linha, enquanto os outros quatro foram positivos para o blot de linha, e reagiram com vários outros antígenos (dados não mostrados). É importante notar que apenas uma amostra foi negativa em ambos os testes.
[00234] Todo o grupo de 618 pacientes humanos (parte dos quais tinha sido rastreada por ELISA) foi analisado utilizando-se o teste de linha para análise da resposta humoral contra FliD. O teste de linha alcançou uma alta sensibilidade de 97,4% em 310 de 318 pacientes avaliados como positivos na histopatologia, enquanto que o teste de linha alcançou uma especificidade de 99% (Tabela 2). Os resultados dos pacientes, em que foram encontrados resultados discrepantes, foram cuidadosamente examinados. 8 soros foram negativos para FliD no teste de linha, mas mostraram reatividade com outros antígenos, indicando que aqui, de fato, FliD não foi reconhecido como antígeno. Dentro destas 8 amostras, uma definitivamente não apresentou reatividade contra a banda de FliD. Sete tiveram uma reatividade fraca, a qual estava um pouco abaixo da linha de corte (razões entre 0,6 e 0,95), e quatro destas tiveram reatividade fraca contra todos os outros antígenos reconhecidos em geral (não mostrado). Todas as três amostras em que FliD deu resultado “falso positivo” mostraram reatividade com outras bandas também. Todas essas bandas, incluindo FliD, foram relativamente fracas, mas estavam claramente acima da linha de corte.
[00235] A partir das referidas amostras, a prevalência de uma resposta humoral anti-FliD foi determinada em função dos anos após a erradicação. O resultado é mostrado na Fig. 3. Como pode ser observado a partir da Fig. 3, ainda há uma prevalência de uma resposta humoral anti-FliD de cerca de 25% depois de 16 a 20 anos após a erradicação de H. pylori.
[00236] A partir das referidas amostras, as curvas de Característica de Operação do Receptor (ROC) foram preparadas para FliD, CagA e UreA. O resultado é mostrado na Fig. 4. A partir da referida Fig. 4, é evidente que FliD é vantajoso em relação aos dois antígenos do estado da arte utilizados na detecção de infecção por H. pylori.
[00237] Utilizando as ferramentas de bioinformática, a proteína FliD da cepa H. pylori G27 foi amplamente comparada com outros organismos, principalmente, os procariontes. Esta análise mostra mais de 97% de homologia entre mais de 200 cepas de H. pylori.
[00238] Os resultados são mostrados na Tabela 4.
[00239] 81 isolados de H. pylori de pacientes humanos foram incluídos no estudo. As amostras foram diagnosticadas como positivas através de cultura bacteriana convencional em placas seletivas. Em tais testes, as bactérias foram crescidas em placas de ágar-sangue Wilkins- Chalgren, sob condições microaeróbicas (10% de CO2, 5% de O2, 8,5% de N2, e 37°C) durante 36 horas, e a positividade para a oxidase, catalase e urease foi confirmada por testes bioquímicos. Uma parte das bactérias cultivadas foi utilizada para o isolamento de DNA e o restante foi destinado para a preparação de lisado de proteína para análise de Western blot.
[00240] Três camundongos C57BL6 foram imunizados 3 vezes (por semana) com 30 μg de FliD de H. pylori recombinante como antígeno e 10 μg de CT (toxina colérica), como adjuvante, ressuspensos em PBS. Uma semana após a última imunização de reforço, o sangue dos camundongos foi coletado e os soros, combinados. A antigenicidade e a especificidade dos soros combinados foram testadas em uma análise de Western blot.
[00241] A fim de estabelecer as condições ótimas de teste, diferentes concentrações de proteína FliD recombinante, bem como de outras proteínas de controle recombinantes (Tig (fator disparador (Tomb et al., 1997)) e gGT), geradas e purificadas nas mesmas condições, foram aplicadas em 8% de gel SDS. Após a transferência das proteínas na membrana de nitrocelulose (Whatman/GE Healthcare, Freiburg, Alemanha), as membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% durante 1 h à temperatura ambiente, e incubadas durante a noite com diferentes diluições dos antissoros como anticorpos primários. Após a incubação das membranas com IgG anti- camundongo marcado com HRP, as bandas foram detectadas através da adição de reagentes de detecção de ECL em Western Blotting.
[00242] Os resultados são mostrados na Fig. 5, onde, no lado direito do gel de SDS descrito, o antígeno e a sua quantidade aplicada nas linhas individuais estão indicados.Uma diluição ótima (1:2000) de antissoro de camundongo foi utilizada.
[00243] Quatro PCR foram desenhadas com base na sequência de DNA do FliD como a SEQ ID NO: 2. Especificidade de cada par de iniciadores, conforme indicado na Tabela 5, foi confirmada pela análise do blast contra todas as sequências nucleotídicas bacterianas do GenBank. As PCRs foram estabelecidas utilizando-se o DNA de H. pylori como controle positivo, e o DNA genômico de 10 outros microrganismos, como controles negativos. As PCRs foram realizadas utilizando-se um GoTaq polimerase master mix (Promega), uma temperatura de anelamento de 56°C e 30 segundos de tempo de extensão.Tabela 5: Iniciadores utilizados para a análise de PCR.
[00244] A ORF do FliD encontra-se em todos isolados de H. pylori de pacientes (bactérias cultivadas isoladas de biópsias de pacientes). A Presença da ORF do FliD pôde ser confirmada por todas as quatro reações de PCR utilizadas para este teste. As PCR1, PCR2 e PCR3, realizadas com DNA isolado de 81 amostras de H. pylori, foram todas positivas. Enquanto que a PCR4 foi positiva para 79 amostras (Fig. 6). A especificidade do teste foi confirmada pela aplicação do DNA isolado de P. aeruginosa (ATCC 27813), Klebsiella oxytoca (ATCC 700324), Candida albicans (ATCC 90028), Entrococcus faecalis (ATCC 29292), Strep. Grupo A (ATCC 19615), S. thyphimurium (ATCC 13311), S. aureus (ATCC 25923), S. epidermidis (ATCC 18228), H.influensae (ATCC 49247) e E. coli (ATCC 25922).
[00245] Como pode ser observado pela Fig. 6, os resultados de uma análise de PCR representativa realizada utilizando DNA genômico isolado de H. pylori cultivado obtido de biópsias de pacientes, demonstram que a ORF (quadro de leitura aberto) de FliD encontra-se em quase todos os isolados de H. pylori. Assim, os resultados de PCR confirmam a presença da FliD no DNA genômico. Na Fig. 6, os números acima das linhas indicam o número interno da amostra.
[00246] Quanto à detecção da proteína FliD em amostras de pacientes que foram diagnosticados como positivos para H. pylori, a proteína FliD é detectável em 97,5% das amostras. Usando a análise de Western blot, poderia ser demonstrado que a expressão da proteína FliD é detectável em 79 de 81 lisados de proteína de H. pylori. Os resultados são mostrados na Fig. 7. Na Fig. 7, os números acima das linhas indicam o número interno da amostra.
[00247] A especificidade do teste foi confirmada através dos resultados negativos quando os lisados de proteína de outros microrganismos foram analisados pela análise de Western blot. Os resultados dos mesmos estão indicados na Fig. 8. Como pode ser observado a partir da Fig. 8, além de FliD recombinante com tag de estreptavidina (linhas 2 de ambos Western blots) e sem tag de estreptavidina (linhas 3 de ambos os Western blots), os lisados de proteína de P. aeruginosa (ATCC 27813) (Western blot à esquerda, linha 4), Klebsiella oxytoca ( ATCC 700324) (Western blot à esquerda, linha 5), Candida albicans (ATCC 90024) (Western blot à esquerda, linha 6), Enterococcus faecalis (ATCC 29292) (Western blot à esquerda, linha 7), Streptococcus Grupo A (ATCC 19615) (Western blot à esquerda, linha 8), S. typhimurium (ATCC 13311) (Western blot à direita, linha 4), S. aureus (ATCC 25923) (Western blot à direita, linha 5), S. epidermidis (ATCC 18228) (Western blot à direita, linha 6), H. influensae (ATCC 49247) (Western blot à direita, linha 7), e E. coli (ATCC 25922) (Western blot à direita, linha 8).
[00248] No presente relatório descritivo são referidos vários documentos do estado da arte, cuja referência completa a seguir é incorporada aqui por referência.
[00249] Arnold, I. C., Hitzler, I., & Muller, A. (2012). The Immunomodulatory Properties of Helicobacter pylori Confer Protection Against Allergic and Chronic Inflammatory Disorders. Front Cell Infect Microbiol, 2, 10.
[00250] Atherton, J. C., Cao, P., Peek, R. M., Jr., Tummuru, M. K., Blaser, M. J., & Cover, T. L. (1995). Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J Biol Chem, 270(30), 17771-17777.
[00251] Chen, Y., Wang, J., & Shi, L. (2001). [In vitro study of the biological activities and immunogenicity of recombinant adhesin of Heliobacter pylori rHpaA]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 81(5), 276-279.
[00252] Cover, T. L., & Blaser, M. J. (1992).Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori. J Biol Chem, 267(15), 10570-10575.
[00253] Dunn, B. E., Roop, R. M., 2nd, Sung, C. C., Sharma, S. A., Perez-Perez, G. I., & Blaser, M. J. (1992).Identification and purification of a cpn60 heat shock protein homolog from Helicobacter pylori. Infect Immun, 60(5), 1946-1951.
[00254] Eaton, K. A., Suerbaum, S., Josenhans, C., & Krakowka, S. (1996). Colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori deficient in two flagellin genes. Infect Immun, 64(7), 2445-2448.
[00255] Franco, A. T., Israel, D. A., Washington, M.K., Krishna, U., Fox, J. G., Rogers, A. B., et al. (2005). Activation of beta-catenin by carcinogenic Helicobacter pylori. Proc Natl Acad Sei U S A,102(30), 10646-10651.
[00256] Fusconi, M., Vaira, D., Menegatti, M.,Farinelli, S., Figura, N., Holton, J., et al. (1999). Anti- CagA reactivity in Helicobacter pylori-negative subjects: a comparison of three different methods. Dig Dis Sei, 44(8), 1691-1695.
[00257] Gao, L., Michel, A., Weck, M. N., Arndt, V., Pawlita, M., & Brenner, H. (2009). Helicobacter pylori infection and gastric cancer risk: evaluation of 15 H.pylori proteins determined by novel multiplex sorology. Cancer Res, 69(15), 6164-6170.
[00258] Goto, T., Nishizono, A., Fujioka, T., Ikewaki, J., Mifune, K., & Nasu, M. (1999). Local secretory immunoglobulin A and postimmunization gastritis correlate with protection against Helicobacter pylori infection after oral vaccination of mice. Infect Immun, 67(5), 2531-2539.
[00259] Hay, F. C., Westwood, O. M. R., Nelson, P.N., & Hudson, L. (2002). Practical immunology: Wiley- Blackwell.
[00260] Honda, S., Fujioka, T., Tokieda, M., Satoh, R., Nishizono, A., & Nasu, M. (1998). Development of Helicobacter pylori-induced gastric carcinoma in Mongolian gerbils. Cancer Res, 58(19), 4255-4259.
[00261] Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., & Yum, J. S. (1999). Molecular cloning and characterization of the Helicobacter pylori FliD gene, an essential factor in flagellar structure and motility. J Bacteriol, 181(22), 6969-6976.
[00262] Mittel P. R. E., Luethy L., Reinhardt C., Joller H. (2003). Detection of high titers of antibody against Helicobacter cysteine-rich proteins A, B, C, and E in Helicobacter pylori-infected individuals. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10:542- 545.
[00263] Macchia, G., Massone, A., Burroni, D., Covacci, A., Censini, S., & Rappuoli, R. (1993). The Hsp60 protein of Helicobacter pylori: structure and immune response in patients with gastroduodenal diseases. Mol Microbiol, 9(3), 645-652.
[00264] Michetti, P., Kreiss, C., Kotloff, K. L., Porta, N., Blanco, J. L., Bachmann, D., et al. (1999). Oral immunization with urease and Escherichia coli heat-labile enterotoxin is safe and immunogenic in Helicobacter pylori- infected adults. Gastroenterology, 116(4), 804-812.
[00265] Montecucco, C., & de Bernard, M. (2003). Molecular and cellular mechanisms of action of the vacuolating cytotoxin (VacA) and neutrophil-activating protein (HP-NAP) virulence factors of Helicobacter pylori. Microbes Infect, 5(8), 715-721.
[00266] Murata-Kamiya, N., Kurashima, Y., Teishikata, Y., Yamahashi, Y., Saito, Y., Higashi, H., et al. (2007). Helicobacter pylori CagA interacts with E-cadherin and deregulates the beta- catenin signal that promotes intestinal transdifferentiation in gastric epithelial cells. Oncogene, 26(32), 4617-4626.
[00267] Oertli, M., Sundquist, M., Hitzler, I.,Engler, D. B., Arnold, I. C., Reuter, S., et al. (2012). DC-derived IL- 18 drives Treg differentiation, murine Helicobacter pylori-specific immune tolerance, and asthma protection. J Clin Invest, 122(3), 1082-1096.
[00268] Opazo, P., Muller, I., Rollan, A.,Valenzuela, P., Yudelevich, A., Garcia-de la Guarda, R., et al. (1999). Sorological response to Helicobacter pylori recombinant antigens in Chilean infected patients with duodenal ulcer, non-ulcer dyspepsia and gastric cancer. APMIS, 107(12), 1069-1078.
[00269] Pharmacia. (1988). Affinity chromatography LKB Biotechnology Uppsala, Sweden. Sambrook, J., Fritsch, E., & Maniatis, T. (1989). Moleculer Cloning: A Laboratory Manuel, Book 1: New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[00270] Suerbaum, S., Thiberge, J. M., Kansau, I.,Ferrero, R. L., & Labigne, A. (1994). Helicobacter pylori hspA-hspB heat-shock gene cluster: nucleotide sequence, expression, putative function and immunogenicity. Mol Microbiol, 14(5), 959-974.
[00271] Sugaem uma, M., Kurusu, M., Okabe, S., Sueoka, N., Yoshida, M., Wakatsuki, Y., et al. (2001). Helicobacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori. Cancer Res, 61(17), 63566359.
[00272] Tomb J. F., et al. 1997. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori.Nature, 7; 388(6642):539-47.
[00273] Uemura, N., Okamoto, S., Yamamoto, S.,Matsumura, N., Yamaguchi, S., Yamakido, M., et al. (2001). Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. N Engl J Med, 345(11), 784- 789.
[00274] Urita, Y., Hike, K., Torii, N., Kikuchi, Y.,Kurakata, H., Kanda, E., et al. (2004). Comparison of serum IgA and IgG antibodies for detecting Helicobacter pylori infection. Intern Med, 43(7), 548-552.
[00275] Watanabe, S., Takagi, A., Tada, U., Kabir, A.M., Koga, Y., Kamiya, S., et al. (1997). Cytotoxicity and motility of Helicobacter pylori. J Clin Gastroenterol, 25 Suppl 1, S169-171.
[00276] Watanabe, T., Tada, M., Nagai, H., Sasaki, S., & Nakao, M. (1998). Helicobacter pylori infection induces gastric cancer in mongolian gerbils.Gastroenterology, 115(3), 642-648.
[00277] Yamaoka, Y., Kodama, T., Kita, M., Imanishi, J., Kashima, K., & Graham, D. Y. (1998). Relationship of vacA genotypes of Helicobacter pylori to cagA status,cytotoxin production, and clinical outcome. Helicobacter, 3(4), 241-253.
[00278] Yan, J., Liang, S. H., Mao, Y. F., Li, L. W., & Li, S. P. (2003). Construction of expression systems for flaA and flaB genes of Helicobacter pylori and determination of immunoreactivity and antigenicity of recombinant proteins. World J Gastroenterol, 9(10), 22402250.
[00279] Yan, J., & Mao, Y. F. (2004). Construction of a prokaryotic expression system of vacA gene and detection of vacA gene, VacA protein in Helicobacter pylori isolates and ant-VacA antibody in patients' sera. World J Gastroenterol, 10(7), 985-990.
[00280] As características da presente invenção descritas no relatório descritivo, na listagem de sequências, nas reivindicações e/ou nos desenhos podem, tanto separadamente quanto em qualquer combinação dos mesmos, ser material para concretizar a invenção em suas diversas formas.
Claims (6)
1. Método para detectar infecção por H. pylori em um indivíduo caracterizado pelo fato de que o método compreende detectar em uma amostra de um indivíduo, uma resposta imune contra o FliD (SEQ ID NO: 1), em que a resposta imune compreende um anticorpo anti-FliD, e em que o método compreende reagir a amostra com FliD.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo anti-FliD ser um anticorpo IgG e/ou um anticorpo IgA.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a detecção ocorrer por meio de ELISA, um teste de fluxo lateral ou um teste de linha.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender ainda detectar um ou mais antígenos de Helicobacter, de preferência, de H. pylori, em que o um ou mais antígenos é/são selecionado(s) a partir do grupo consistindo em CagA, VacA, GroEL, Hp 0231, JHp 0940 e HtrA.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de a amostra ser selecionada a partir do grupo que consiste em soro sanguíneo, plasma sanguíneo, sangue total e fezes.
6. Uso de um kit compreendendo FliD e, pelo menos, um outro componente, caracterizado por ser um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e em que pelo menos um outro componente é selecionado a partir do grupo que consiste em um tampão, uma fase sólida e um folheto de instruções.
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