KR100211286B1

KR100211286B1 - 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물

Info

Publication number: KR100211286B1
Application number: KR1019970026601A
Authority: KR
Inventors: 김장성; 장지훈; 염정선; 정수일
Original assignee: 허영섭; 재단법인목암생명공학연구소
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 1999-08-02
Also published as: KR19990002874A

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 76kDa 외막단백질(FliD) 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 헬리코박터 파이프로리에서 유래한 신규한 외막단백질(FliD) 유전자, 그를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 항원성과 면역원성을 가진 재조합 외막단백질(FliD)을 대량으로 제조하는 방법 및 헬리코박터 파이로리 감염의 백신용으로 이용될 수 있는 전기 재조합 외막단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제조된 재조합 외막단백질(FliD)은 자연형 외막단백질(vative FliD)과 동일한 정도의 항원성 및 면역원성을 유지하고 있으므로, 헬리코박터 파이로리 감염으로 인한 질환의 예방 및 치료를 위한 백신의 유효성분으로 이용될 수 있고, 헬리코박터 파리로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있다.

Description

헬리코박터 파리로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물

본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 외막단백질(FliD) 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 헬리코박터 파이로리에서 유래한 신규한 76kDa 외막단백질(FliD)의 유전자, 그를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 항원성과 면역원성을 가진 재조합 외막단백질(FliD)을 대량으로 제조하는 방법 및 헬리코박터 파이로리 감염의 백신용으로 이용될 수 있는 전기 재조합 외막단백질의 용도에 관한 것이다.

헬리코박터 파이로리는 만곡형, 그람음성 세균으로 1983년 워렌(Warren)과 aktif(Marshall)에 의해 위염 환자의 위 생검체에서 처음으로 분리 및 동정된 후, 전 서계 연구자들의 연구대상이 되어 왔다(참조: Warren, J.R and Marshall, B.J., Lancet, 1:1273-1275(1983)).

헬리코박터 파이로리는 코흐(Koch)의 가설을 만족시키는 병원균으로 인체에 감염하여 위 유문분에서 군집락을 형성하여, B형 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 원인균이고, 최근 위암의 발병과도 밀접한 연관을 갖는다는 역학적 연구결과들이 보고되고 있다(참조: Parsonnet, J. et al., N. Eng. J. Med., 325:1127-1131(1991); Blaster M.J., Gastroenterology, 102:720-727(1992)).

헬리코박터 파이로리의 전파경로나 발병기전에 관해서는 아직도 많은 연구가 진행되어야 하겠지만, 현재까지의 연구결과에 의하면 유라아제(urease), 편모(flagella), 정착단백질(adhesion), 액포형성 세포독소(vacuolating cytotoxin, VacA) 등이 헬리코박터 파이로리의 감염 및 발병과정에 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고 되고 있다(참조: Eaton, K.A. et al., Infect. Immun., 57:1119-1125(1989); Wadstrom, T. et al., Aliment. Pharmacol. Ther., 10(Suppl 1):17-28(1996); Telford, J.L. et al., J. Exp. Med., 179:1653-1658(1994)).

헬리코박터 파이로리에 감염된 궤양 환자의 경우, 항생제 투여에 의해 헬리코박터 파이로리를 제거하는 방법은 위산 제거에 중점을 둔 종래의 궤양 치료법에 비해 그 치료 효과가 월등할 뿐만 아니라, 궤양의 재발이 현저히 감소하는 장점을 가진다. 이러한 사실은 궤양의 발병과 헬리코박터 파이로리의 감염 사이에 밀접한 연관이 있음을 시사한다.

현재, 비쓰무쓰 서브시트레이트(bismuth subcitrate), 메트로니다졸(metronidazole) 및 테트라사이클린(tetraccyclin)의 3가지 항생제를 함께 투약하거나(triple therapy), 오메프라졸(omeprazole)과 두 가지의 항생제를 투약하는 항생제 치료법들에 의해 약 20

내지 90

정도의 치료효과를 보이고 있다.

그러나, 이러한 항생체 치료법은 사용한 항생제에 내성을 갖는 헬리코박터 파이로리에 감염된 경우에는 치료가 불가능하며, 일단 치료가 된 후에 재발 빛 재감염까지를 방지할 수 없고, 다량의 약물을 장기간 복용해야 하는 번거로움 등의 문제점을 가지고 있다. 그러므로, 헬리코박터 파이로리에 의한 감염과 그에 따른 위장 질환의 예방과 치료를 위하여, 보다 근본적인 방법이 절실히 요구되었다.

이에, 몇몇 연구자들은 전기 문제점을 극복할 수 있는 보다 이상적인 방법이 면역요법이라는 점에 착안하여, 경구용 백신(oral vaccine)으로 헬리코박터 파이로리의 감염에 의한 질환을 예방 또는 치료하고자 하였다. 그 결과, 현재까지 여러 동물 모델을 이용한 방어 시험으로 경구면역에 의해 숙주를 헬리코박터 파이로리의 감염으로 부터 방어할 수 있는 효과를 인정받은 백신 항원은 유라아제 및 그의 A, B 서브유니트(UreA, UreB), 열충격단백질(heat shock protein)의 A 서브 유니트(HspA), 액포형성 세포독소(VacA)등이 보고되어 있다(참조: Michetti, P. et al., Gastroenterology, 107:1002-1011(1994); Ferrero, R. L. et al., Infect. Immun., 62:4981-4989(1994); Lee, C.K. et al., J. Infect. Dis., 172:161-172(1995); Marchetti, M. et al., Science, 267:1655-1658(1995); Ferrero, R.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6499-6503(1995)). 이들 백신 항원들은 헬리코박터 파이로리의 표면에 위치하면서, 헬리코박터 파이로리의 모든 균주(strain)에서 발현되고, 이들 균주 상호간의 변이가 없다는 공통점을 지니고 있다.

한편, 그람음성 세균의 경우, 많은 표면단백질들은 외막(outer membrane)에 존재하고 있는데, 외막은 그람음성 세균의 중요한 구조물일 뿐 아니라 어떤 분자가 균체로 들어가고 어떤 분자가 균체로부터 분비되어 나갈지, 또한 어떻게 세균이 외부환경과 상호작용할지 등을 결정하는 기능적으로 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 중에는 전기의 백신항원으로서의 요건을 만족하는 항원단백질이 상당수 존재하기란 것은 쉽게 유추할 수 있다.

이러한 사실에 착안하여, 본 발명자들은 헬리코박터 파이로리에 특이한 외막단백질 중 백신 항원으로서 적합한 단백질을 찾고자 노력한 결과, 항원성 및 면역원성을 지닌 Omp22라는 신규한 외막단백질 항원을 발견하였다(참조 : 대한민국 특허출원 제 96-2105호). 이 외막단백질 Omp22는 주로 외막의 구조를 유지하는 단백질로서, 균체의 표면에 위치하고, 높은 항원성과 면역원성을 나타내므로 백신 항원으로서의 기능을 충분히 발휘할 수 있을 것으로 예상된다.

이에, 본 발명자들은 외막단백질 Omp22와 같이 균체의 표면에 위치하여 높은 항원성과 면역원성을 유지하는 또 다른 외막단백질을 찾아내고자 예의 연구노력한 결과, 헬리코박터 파이로리의 병원성 요인인 운동성 유지에 중요한 역할을 하는 동시에, 항원성 및 면역원성을 지닌 신규의 외막단백질(FliD)을 발견하고 이를 'FliD'라 명명 하였다. 이 외막단백질을 재조합 미생물을 이용하여 대량으로 제조할 수 있었고, 이 재조합 단백질이 자연형과 동일한 항원성과 면역원성을 유지항 백신 항원으로서의 요건을 갖추고 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 헬리코박터 파이로리에서 유래한 신규한 외막 단백질(FliD)의 유전자 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 외막단백질(FliD)의 유전자를 포함하는 발현벡터 및 그로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 형질전환된 미생물로부터 대량생산된 외막단백질(FliD)을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 전기 재조합 미생물로부터 대량생산된 외막단백질(FliD)의 용도, 즉 헬리코박터 파이로리 백신으로서의 용도를 제공하는 것이다 .

제1(a)도는 외막단백질(FliD) 유전자를 포함하는 재조합 클론의 세포파쇄액을 10

SDS-PAGE 한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

제1(b)도는 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 1차 항체로 이용하여 제1(a)도의 SDS-PAGE 결과를 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타내는 사진이다.

제2도는 pFliD 클론의 제한효소 지도를 나타낸다.

제3도는 외막단백질(FliD) 유전자의 염기서열 및 그로 부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸다.

제4도는 발현벡터 pET-15b/FliD로 형질전환된 대장균 BL2(DE3)를 배양하고 IPTG(β-isopropylthiogalactoside)로 유도하며, His-Tag/FliD 융합 단백질의 발현을 나타내는 전기영동 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 경구용 헬리코박터 파이로리 백신의 항원으로 사용할 수 있는 단백질을 탐색하고자, 헬리코박터 파이로리의 DNA 라이브러리를 제조하고, 이를 헬리코박터 파이로리의 외막단백질에 대한 토끼의 항혈청으로 스크리닝한 결과, 약 76kDa의 신규한 외막단백질(FliD)의 존재를 확인하였고, 그를 발현하는 재조합 클론을 얻었다.

이렇게 클로닝된 외막단백질(FliD) 유전자의 염기서열을 결정한 결과, 2058bp의 개방해독틀(open reading frame: ORF)을 가지고 있으며, 그로부터 발현되는 외막단백질(FliD)는 685개의 아미노산으로 구성된 단백질임을 알 수 있었다. 본 발명의 아미노산 서열에 있어서, '기능적으로 동등한'이란 외막단백질(FliD)의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr 과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 염기서열에 있어서, '기능적 등가물'이라 함은 외막단백질(FliD) 유전자의 염기서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.

외막단백질(FliD)을 대량생산하여 백신의 항원으로 사용하기 위하여, 히스티딘 태그(His-Tag)에 원하는 유전자를 융합시켜 발현할 수 있는 pET-15b 벡터(Novagen, USA)에 상기에서 클로닝된 외막단백질(FliD) 유전자를 삽입하고, 재조합 발현벡터 pET-15b/FliD를 제조한 다음, 그 발현벡터로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켰다. 이렇게 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 배양하여 외막단백질(FliD)의 발현을 유도하고, 그를 수득하여 재조합 외막단백질(FliD)을 제조하였다.

상기에서, 제조된 재조합 외막단백질(FliD)은 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막 단백질 항체에 의하여 자연형 외막단백질(native FliD)과 동일한 정도로 감지되므로, 재조합 외막단백질(FliD)은 우수한 항원성을 유지하고 있음을 알 수 있다. 아울러, 재조합 외막단백질(FliD)을 항원으로 토끼에 피하면역한 결과, 자연형 외막단백질(native FliD)과 동일한 상당량의 항체를 생성하는 면역원성이 있음을 확인하였다.

따라서, 상기의 재조합 외막단백질(FliD)은 헬리코박터 파이로리에 대한 항원성과 면역원성을 유지하고 있으므로, 헬리코박터 파이로리 감염으로 인한 질환의 예방 및 치료를 위한 백신의 유효성분으로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[외막단백질(FliD) 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석]

헬리코박터 파이로리의 외막단백질 중에서 백신 항원으로 사용할 수 있는 새로운 항원 단백질을 찾고자, 헬리코박터 파이로리의 DNA 라이브러리를 헬리코박터 파이로리의 외막단백질에 대한 토끼의 항혈청으로 스크리닝한 결과, 약 76kDa의 분자량을 갖는 외막단백질 FliD를 발견하였고, 그 유전자를 클로닝하였다.

[실시예 1-1]

[헬리코박터 파이로리의 DNA 라이브러리 제조]

헬리코박터 파이로리 분리주(helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)에서 염색체 DNA를 분리하고, 제한효소 Hae Ⅲ(Boehringer Mannheim Biochemica, Germany)로 부분절단하였다. 그런 다음, 크기가 3kb 이상인 DNA 절편을 DEAE 막(membrane)(Schleicher Schuell, Germany)을 이용하여 전기용출(electroelution) 방법으로 분리하였다. 이어, 1단위(unit)의 T4 DNA 연결효소를 이용하여 분리한 DNA 절편의 양 끝에 EcoRI 어//터(adapter)(Stratagene, USA)를 부착시키고, 그 말단을 10단위의 폴리뉴클로오티드 키나제(polynucleotide kinase; Boehringer Mannheim Biochemica, Germany)를 이용하여 인산화(kination)시킨 다음, Sephacryl S-400 컬럼(Stratagene, USA)를 이용하여 DNA 절편만을 수득하였다. 이렇게 수득한 DNA 절편과 제한효소 EcoRI으로 절다된 Lambda ZAP Ⅱ 벡터(stratagene, USA)를 T4 DNA 연결효소를 이용하여 4

에서 16시간 반응하여 서로 연결시켰다. 그런 다음, Gigapack Ⅱ packaging extracts kit(Stratagene, USA)를 이용하여 파아지(phage) 상태로 패키징(packaging)하여 1.25×10⁶개의 재조합 파아지를 얻었다(2.5×10⁶PFU/㎖).

전기 재조합 파아지와 대장균(E. coli) XL1 Blue MRF' 세포를 NZY 배지(0.5

NaCl, 0.2

MgSO₄7H₂O, 0.5효모추출물, 1

NZ 아민 및 1.5

아가로 구성된 배지)에서 함께 배양한 다음, SM 완충용액(1L당 5.8g NaCl, 2g MgSO₄7H₂O, 50㎖ 1M Tris Cl(pH 7.5) 및 5㎖ 2

젤라틴을 함유한 용액)으로 파아지 현탁액(phage suspension)을 수거하는 방법을 통하여 2.5×10¹⁰PFU/㎖로 재조합 파아지를 증폭하였다. 이어, DMSO(dimethly sulfoxide)를 첨가하여 최종농도 7

가 되도록 하고, -70

에 보관하였다.

상기에서 증폭된 재조합 파아지 현탁액에 ExAssit 헬퍼(helper) 파아지(Stratagene, USA)를 첨가하여 대장균 XL1 Blue MRF' 세포와 함게 2XYT 배지(1

NaCl, 1

효모추출물 및 1.6

박토트립톤으로 구성된 배지)에서 배양한 다음, 세균을 제거하고 상층액에 있는 파아지를 다시 대장균 SOLR 세포에 감염시켜 배양하는 생체내 절단 (in vivo excision)방법으로, 파아지 상태의 DNA 라이브러리를 pBluescript Sk(-)파아지미드(phagemid)를 갖는 콜로니 형태로 전환하였다. 24개의 클론을 임으로 선택하여 각각의 플라스미드 DNA 를 분리하고, 이를 제한효소 EcoRI으로 절단한 결과, 각 클론은 3 내지 10kb 크기의 다양한 DNA 삽입체를 포함하고 있음을 확인하였다. 따라서, 상기에서 제조된 재조합 파아지가 헬리코박터 파이로리의 전체 게놈(genome)을 대표할 수 있음을 알 수 있었다.

[실시예 1-2]

[DNA 라이브러리 스크리닝]

우선, 하기에서 기술되는 DNA 라이브러리 스크리닝 및 웨스턴 블롯 분석에 이용될 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 제조하기 위하여, 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)의 외막단백질을 함유한 세포 파쇄액의 분획(참조: 대한민국 특허출원 제96-2105호)140㎍을 토끼에 0, 1, 4 주의 간격으로 3회에 걸쳐 근육 주사하고, 10일 후에 채혈하여 항-헬리코박터 파이로리 외막 단백질 항체를 제조하였다. 라이브러리 스크리닝 시에 기존에 밝혀진 유라아제 및 외막단백질(Omp22)을 발현하는 클론이 선택되는 것을 방지하고자, 상기에 제조한 토끼 항혈청 200㎕당 정제한 유라아제 및 재조합 외막단백질 Omp22를 각각 20㎍씩 혼합하고, 4

에서 1시간 방치한 다음, 에펜도르프 원심분리기에서 12,000rpm으로 10분간 원침하고, 상층액을 수득하여 하기의 스크리닝에 사용하였다.

실시예 1-1에서 제조한 헬리코박터 파이로리의 DNA 라이브러리로부터 외막단백질 FliD의 유전자를 포함하는 클론을 스크리닝하기 위하여, 재조합 파아지(bacteriophage stock solution)을 대장균 XL1 Blue MRF' 세포와 함께 NZY 배지에서 플라크(plaque) 지름이 1 내지 2㎜가 될 때까지 배양하고, 플라크를 니트로셀룰로스필터로 전이하였다. 그런 다음, 그 필터에 1차 항체로 상기에서 제조한 토끼항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 1/2,000으로 희석하여 반응시키고, HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 항-토끼 IgG 염소항체를 1/2,000으로 희석한 2차 항체를 반응시켰다. 이어, DAB(3,3' -diaminobenzidine)와 0.03

H₂O₂용액으로 발생반응을 유도하였다. 상기와 같은 방법으로 1.5×10⁵개의 플라크를 3회 반복하여 스크리닝한 결과, 11개의 양성반응을 나타내는 단일 플라크를 분리할 수 있었다. 각 클론을 실시예 1-1에서와 동일한 생체내 절단방법으로 pBluescript SK(-) 파아지미드를 포하하는 콜로니 형태로 전환한 다음, 배양하여 발현되는 단백질은 10

SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 분석하였다(참조: 제1(a)도 및 1(b)도).

제1(a)도 및 제1(b)도에서 , 제1레인은 205kDa, 116kDa, 97kDa, 84kDa, 66kDa, 55kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa 및 20kDa의 표준분자량 머커; 제2레인 내지 12레인은 재조합 클론 1번 재지 11번의 세포파쇄액; 제13레인은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)의 세포파쇄액을 각각 나타낸다. 제1(a) 및 1(b)도에서 보듯이, 재조합 클론 1번과 3번을 제외한 9개의 클론들이 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체로 감지되는 76kDa 크기의 재조합 단백질(화살표)을 발현하고 있음을 알 수 있었다.

FliD 단백질을 발현하는 각 클론의 플라스미드 DNA 를 분리하고, 이를 제한효소 EcoRI 으로 전달하여 DNA 삽입체의 크기를 비교한 결과, 3.4 내지 5kb로 다양하였으며, 이중 약 3.4kb의 가장 작은 DNA 삽입체를 포함하는 클론을 'pFliD'라 명명하고 후술하는 실험에 이용하였다.

[실시예 1-3]

[pFliD 클론의 서브클로닝 및 염기서열 분석]

발현된 외막단백질 FliD의 분자량이 약 76kDa인 점을 감안하면, FliD의 개방해독틀은 3.4kb DNA 삽입체 전방에 걸쳐 조재하고 있을 것으로 유추되었다. 따라서, 3.4 kb DNA 삽입체 전체의 염기서열을 해독하기로 하였다. 염기서열 분석을 용이하게 하기 위하여, 3.4kb DNA 삽입체를 좀 더 작은 크기의 절편으로 나누어 서브크로닝하기로 하였다. 여러 가지 제한효소를 이용하여 pFliD의 제한효소 지도(restriction map)를 작성하였다(참조: 제2도). 제2도에서 보듯이, 3.4 kb DNA 삽입체에는 5개의 HindⅢ 절단부위와 2개의 BamHI 절단부위가 존재함을 알 수 있었다. 제2도의 0.96 kb EcoRI/HindⅢ 절편, 1.1kb의 HindⅢ 절편, 0.4 및 0.8 kb의 HindⅡ절편을 각각 pBluescript SK(-) 및 pBluscript SK(+)에 서브클로닝하였다. 각 서브클론에서 (+)와 (-) 사슬(strand)을 VCS M13 헬퍼 파아지(Stratagene, USA)를 이용하여 단일사슬의 DNA로 분리하고, 디에옥시법으로(참조:Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467(1977)) 각 서브클론의 염기서열을 결정하였다.

이와 같이 결정된 염기서열을 바탕으로 새로운 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성한 후, 단일사슬의 DNA로 분리한 pFliD를 이용하여 각 서브클론들 간의 연결부위(junction)의 염기서열을 결정하였고, 총 3391bp의 염기서열을 결정하였다(참조:제3도). 제3도에서 SD는 샤인-달가농 서열(Shine-Dalgarno ribosomal binding sequence)을 나타내고, 밑줄친 아미노산 서열은 하기와 같은 N-말단 아미노산 서열분석으로 확인된 서열을 나타낸다. 제3도에서 보듯이, 854번 위치에서 ATG로 시작되는 2058bp의 개방해독틀(ORF)이 존재함을 알 수 있었다 .

한편, 전기에서 발견한 개방해독틀에 의하여 실제로 FliD 단백질이 발현되는가를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 N-말단의 아미노산 분석을 실시하였다. 즉, pFliD 클론의 세포파쇄액을 10

SDS-PAGE로 분리하고, 이를 PVDE(polyvinylidine difluoride)막으로 전이한 다음, 발현된 FliD 단백질에 해당하는 밴드를 절단하여 수득하고 이를 Procise Sequencer(Applied Biosystem, USA)를 이용한 N-말단의 아미노산서열 분석에 이용하였다.

그 결과, Ala-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Ser-Lys-Val-Leu의 아미노산 서열을 얻었으며, 이는 해독된 FliD의 2번에서 16번 아미노산 서열과 완전히 일치하였다(참조: 제3도). N-말단의 1번 아미노산이 개방해독틀에 의해 번역된 제1번 아미노산인 메티오닌(methionine)과 달리 알라닌(alanine) 잔기로부터 시작되는 이유는 FliD가 발현되면서 세포내의 메티오닌 아미노펩티다아제(methionine aminopeptidase)의 작용에 의해 N-말단의 메티오닌 전기가 절단된 결과라 추축된다. 따라서, 전기에서 발견한 개방해독틀에 의하여 FliD 단백질의 발현이 유도되고, FliD 단백질은 N-말단의 메티오닌 전기를 포함하여 총 685개의 아미노산으로 구성된 단백질임을 알 수 있다. 제3도에서 나타낸 아미노산 서열을 이용하여 FliD 단백질의 분자량을 추정한 결과 74,040 달톤(dalton)으로 추정되어, SDS-PAGE 상에서 추정한 분자량과 유사한 결과를 얻었다.

이렇게 결정된 FliD 유전작의 염기서열 및 그로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열의 상동성을 미국의 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 제공하는 BLAST 프로그램으로 비교, 분석한 결과, FliD 유전자의 염기서열은 지금까지 보고된 적이 없는 신규한 것임을 알 수 있었고, 그로부터 번역되는 아미노산 서열은 헬리코박터 속에서는 보고된 바가 없었다. 하지만, FliD의 아미노산 서열은 제노라브두스 네마토필루스(Xenorhabdus rematophilus), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 비브리오 파라헤몰리티크스(Vibrio parahaemolyticus), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 세균이 편모에 존재하는 후크연관단백질 2(hook-associated protein 2, HAP-2)와 비교적 높은 상동성을 보여, FliD 단백질은 헬리코박터 파이로리의 후크연관단백질 2(HAP-2)일 것으로 추정되었다. 후크연관단백질은 3종류로 분류되는데(HAP-1, HAP-2 및 HAP-3), HAP-1과 HAP-3은 후크와 편모의 필라멘트 사이의 연결부위(hook-filament junction)에 존재하여 둘 사이를 연결시켜 주는 역할을 수행하는 것으로 알려졌다. 반면에, HAP-2는 필라멘트의 말단에 위치하면서 세균내에서 합성된 플라젤린(flagellin)단백질이 필라멘트 말단에서부터 중합(polymerization)되는 것을 유도한다고 알려져 있다(참조:Ikeda, T. et al., J. Bacteriol., 169:1168-1173(1987)). 따라서, FliD 단백질은 편모에의한 운동성 유지에 필수불가결한 요소라 추정된다. 운동성이 없는 헬리코박터 파이로리는 무균 신생자돈 모델(gnotobiotic poglet model)을 이용한 실험에서 감염력을 상실한다는 사실이 보고(참조 : Eaton, K.A. et al., Infect. Immun., 64:2445-2448(1996))된 바, 백신 항원력으로서의 FliD의 중요성이 새롭게 인식되었다.

[실시예 2]

[재조합 FliD 단백질의 발현 및 그의 항원성 확인]

외막단백질 FliD 헬리코박터 파이로리 균체에 매우 수량 존재하므로, FliD 단백질을 대량 생산하여 백신 항원으로 사용하기 위하여, His-tag을 융합파트너로 갖는 pET-15b 벡터에 FliD 유전자를 클로닝하고, 발현된 제조합 단백질의 항원성과 면역원성을 관찰하였다 .

[실시예 2-1]

[재조합 FliD 유전자의 클로닝]

FliD 유전자를 클로닝하기 위하여, N-말단의 메티오닌이 시작되는 염기서열 854번 위치에서 시작하고 말단에 제한효소 NdeI 절단부위를 포함하는 fliD/NNdeI 및 염기서열 2894번에서 시작하여 종결코돈을 포함하고 말단에 제한효소 BamHI 절단부위를 포함하는 fliD/CBamHI의 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다.

pFilD 플라스미드를 주형으로 하고, 전기 프라이머들을 이용하여 FliD의 개방해독틀 전체를 포함하고 5' 및 3' 말단에 각각 제한효소 NdeI, BamHI 절단부위(상기 서열에서 밑줄로 표시한 부분)를 포함하는 2076bp의 DNA 절편을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reactioin, PCR)으로 증폭하였다. 이때, PCR은 변성(denaturation, 94

에서 1분), 결합(annealing, 50

에서 1분) 및 합성(extension, 72

에서 1분 30초)의 조건에서 35회 수행하였다.

증폭한 DNA 절편을 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 절단하여 접착밀단(cohesive end)화 하고, pET-15b(Novagen, USA)의 NdeI/BamHI 절단부위에 삽입하여 발현벡터 pET-15b/FliD를 제조하고, 그 발현벡터로 대장균 BL2(DE3)를 형성전환시켰다. 이렇게 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 대장균(Escherichia coli) pET/FliD라 명명하고, 1997년 5월 19일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 8799P로 기탁되었다.

[실시예 2-2]

[재조합 FliD 단백질의 발현 및 정제]

재조합 FliD 단백질을 발현하기 위하여, 상기에서 형질전환된 대장균을 0.4mM IPTG(β-isopropylthiogalactoside) 첨가하에서 37

의 온도조건으로 3 내지 4시간 배양하였다. 그런 다음, 배양액을 원침하여 균체를 수득한 후 이를 초음파 파쇄하였다. 원심분리하여 수득한 초음파 파쇄액의 상측액을 pET His-Tag 시스템(Novagen, USA)하에서 금속친화성 크로마토그래피(metal-affinity chromatography)하여, 76kDa의 His-Tag/FliD 융합단백질을 정제하였다(참조:제4도).

제4도에서, 제1레인은 116kDa, 85kDa, 56kDa, 39kDa, 27kDa 및 20kDa의 표준 분자량 마커; 제 2레인은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)의 세포파쇄액; 제3레인은 0.4mM IPTG 첨가하에서 배양한 pET-15b 벡터 함유 대장균 BL21(DE3)의 세포파쇄액; 제4레인은 0.4 mM IPTG 첨가하에서 배양한 pET-15b/FliD 함유 대장균 BL21(DE3)의 세포파쇄액; 제5 및 6레인은 pET-15b/FliD를 포함한 대장균 BL21(DE3)의 세포파쇄액을 원심분리하고 수득한 상등액 및 침전물을 각각 나타내고; 및, 제7레인은 친화성 크로마토그래피로 정제한 His-Tag/FliD 융합단백질을 나타낸다. 제4도에서 보듯이, 제4, 5, 6 및 7레인에서 76kDa의 His-Tag/FliD 융합단백질이 발현됨을 확인할 수 있었고, 금속 친화성 칼럼으로 전기 융합단백질을 정제할 수 있음을 알 수 있었다.

[실시예 2-3]

[제조합 FliD 단백질의 항원성 확인]

융합된 FliD 재조합 단백질이 항원성을 유지하고 있는지 알아보기 위하여, 실시예 1-2에서 제조한 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 이용하여, 제4도의 SDS-PAGE 결과를 웨스턴 블롯하였다. 그 결과, 재조합 FliD 단백질은 토끼-항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체에 의해 자연형과 동등한 정도로 감지되어 항원성이 잘 유지되고 있음을 알 수 있었다.

[실시예 2-4]

[재조합 FliD 단백질의 면역원성 확인]

융합된 FliD 재조합 단백질이 항체를 생성할 수 있는 면역원성을 유지하고 있는지 알아보기 위하여, 200㎍의 재조합 FliD 단백질을 토기에 0, 1, 4주의 간격으로 3회에 걸쳐 피하면역하고, 10일 후에 채혈하여 항-헬리코박터 파이로리 재조합 FliD에 대한 항체를 제조하였다. 이 항체로 웨스턴 블롯 분석을 실시한 결과, 자연형 FliD 단백질, pFliD 클론에서 발현되는 FliD 단백질, His-Tag/FliD 융합단백질이 모두 감지됨을 알 수 있었다. 따라서, FliD 재조합 단백질은 자연형과 동등한 정도의 면역원성을 유지하고 있으므로, 헬리코박터 파이로리의 감염 예방과 치료에 유효한 백신 제조에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 헬리코박터 파이로리에서 유래한 76kDA 크기의 신규한 외막단백질(FliD)유전자, 그를 포함하는 발현벡터, 전기발현벡터를 이용하여 재조합 외막단백질(FliD)을 대량으로 제조하는 방법을 제공한다. 이렇게 제조된 재조합 외막단백질(FliD)은 자연형 외막단백질(native FliD)과 동일한 정도의 항원성 및 면역원성을 유지하고 있으며, 이를 헬리코박터 파이로리 감염으로 인한 질환의 예방 및 치료를 위한 백신의 유효성분으로 이용될 수 있고, 헬리코박터 파이로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있다.

Claims

헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)에서 수득한 하기와 같은 염기서열을 가지는 외막단백질(FliD)유전자 및 그의 기능적 등가물:
제1항의 유전자로부터 번역되어 하기와 같은 아미노산 서열 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 외막단백질(FliD):
제2항에 있어서, 헬리코박터 파이로리에 대한 항원성과 면역원성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 외막단백질(FliD).
제1항의 외막단백질(FliD) 유전자를 포함하고 있는 발현벡터.
제1항의 외막단백질(FliD) 유전자를 포함하며, 히스티딘-태그(His-Tag)를 융합파트너(fusion partner)로 갖는 발현벡터 pET-15b/FliD.
제5항의 발현벡터 pET-15b/FliD로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) pET/FliD(KCTC 8799P).
제6항의 형질전환된 미생물을 배양하여 외막단백질(FliD)의 발현을 유도하고 이를 수득하는 공정을 포함하는 재조합 외막단백질(FliD)의 제조방법.
제6항의 형질전환된 미생물을 배양하여 발현유도 과정을 수행하고, 발현된 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합 외막단백질(FliD).
제2항의 외막단백질(FliD)을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터 파이로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백식.