KR0158435B1 - 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 - Google Patents
헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물Info
- Publication number
- KR0158435B1 KR0158435B1 KR1019960002105A KR19960002105A KR0158435B1 KR 0158435 B1 KR0158435 B1 KR 0158435B1 KR 1019960002105 A KR1019960002105 A KR 1019960002105A KR 19960002105 A KR19960002105 A KR 19960002105A KR 0158435 B1 KR0158435 B1 KR 0158435B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- omp22
- outer membrane
- membrane protein
- helicobacter pylori
- protein
- Prior art date
Links
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 title claims abstract description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 title claims abstract description 64
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 22
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 17
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 102100021941 Sorcin Human genes 0.000 description 3
- 101710089292 Sorcin Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 2
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 2
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000018556 stomach disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710109861 22 kDa outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl}-1H-benzimidazole Chemical compound N=1C2=CC(OC)=CC=C2NC=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000298 Elaeagnus multiflora Species 0.000 description 1
- 235000009245 Elaeagnus multiflora Nutrition 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 208000012895 Gastric disease Diseases 0.000 description 1
- 206010017886 Gastroduodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101710138460 Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101710178358 Peptidoglycan-associated lipoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 description 1
- 239000006781 columbia blood agar Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 231100000029 gastro-duodenal ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229960000381 omeprazole Drugs 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001187 pylorus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
본 발명은 헬리코박터 파이로리(Helicobcter pylori)에서 유래한 22kDa크기의 신규한 외막단백질(outer membrane protein, Omp22) 유전자, 그를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 재조합 외막단백질(Omp22)을 대량으로 제조하는 방법 및 전기 재조합 외막단백질의 용도에 관한 것이다. 상기에서 제조된 재조합 외막단백질(Omp22)은 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질(Omp22) 항체 및 헬로코박터 파이로리에 감염된 사람의 혈청에 의하여 자연형(native) 외막단백질(Omp22)과 동일한 정도로서 감지되므로, 재조합 외막단백질(Omp22)은 우수한 항원성을 유지하고 있음을 알 수 있었다, 아울러, 재조합 외막단백질(Omp22)을 항원으로 마우스에 근육주사하여 자연형 외막단백질(Omp22)과 동일한 정도로서 항체를 형성하는 면역원성이 있음을 확인하였다. 따라서, 상기의 재조합 외막단백질(Omp22)의 헬로코박터 파이로리에 대한 항원성 및 면역원성을 유지하고 있으므로, 헬리코박터 파이로리에 대한 진단시약 혹은 헬리코박터 파이로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있고, 헬리코박터 파이로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있다.
Description
제1(a)도는 22kDa 단백질이 헬리코박터 파이로리의 외막단백질임을 나타내는 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진이다.
제1(b)도는 제1(a)도의 SDS-PAGE 결과를 웨스턴 블롯분석(Western blot analysis)한 결과를 나타내는 사진이다.
제2(a)도는 외막단백질(Omp22) 유전자를 포함하는 재조합 클론의 세포파쇄액을 12% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제2(b)도는 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 1차 항체로 이용하여 제2(a)도의 SDS-PAGE 결과를 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타내는 사진이다.
제3도는 pOmp22 클론과 그의 서브클론(subclone) pHL 및 pBBR의 제한효소 지도를 나타낸다.
제4(a)도는 pOmp22, pHL 및 pBBR 클론의 세포파쇄액을 12% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제4(b)도는 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 1차 항체로 이용하여 제4(a)도의 SDS-PAGE 결과를 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타내는 사진이다.
제5도는 외막단백질(Omp22) 유전자의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
제6도는 발현벡터 pGEX-2T/omp22로 형질전환된 대장균 DH5α를 배양하고 IPTG(β-isopropylthiogalactoside)로 유도하여, GST-Omp22 융합 단백질의 발현을 나타내는 전기영동 사진이다.
제7(a)도는 트롬빈의 처리에 의하여 발현된 GST-Omp22 융합 단백질로부터 융합파트너인 GST가 완전히 절단됨을 나타내는 12% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제7(b)도는 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질(Omp22) 항체를 1차 항체로 이용하여 제7(a)도의 SDS-PAGE 결과를 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타내는 사진이다.
제7(c)도는 염소 항-GST 항체를 이용하여 제7(a)도의 SDS-PAGE 결과를 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타내는 사진이다.
제8(a)도는 정제된 GST-Omp22 융합 단백질 및 GST 단백질을 12% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
제8(b)도는 재조합 외막단백질(Omp22)을 항원으로 하고, 헬리코박터 파이로리 양성인 사람의 혈청을 1차 항체로 이용하여 스트립(Strip) 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 헬리코박터 파이로리(helicobacter pylori)의 외막단백질(outer me mbrane protein) 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 헬리코박터 파이로리에서 유래한 신규한 외막단백질(Omp22) 유전자, 그를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 항원성과 면역원성을 가진 재조합 외막단백질(Omp22)을 대량으로 제조하는 방법 및 헬리코박터 파이로리 감염의 진단용 또는 백신용으로 이용될 수 있는 전기 재조합 외막단백질의 용도에 관한 것이다.
1983년 웨렌(Warren)과 마샬(Marshall)이 십이지장궤양 환자의 위생검체에서 만곡형 간균을 최초로 분리 및 동정하고(참조: Warren, J.R. and marshall, B.J., Lancet, 1:1273-1275(1983)), 이 세균이 위염 및 소화성 궤양의 발병과 깊은 연관이 있음을 제안한 이후로 전 세계적으로 이와 관련된 수많은 연구가 활발히 수행되어 왔다. 전기 세균은 '헬리코박터 라이로리'로 명명되어졌으며, 그람 음성이고 미호기성으로 주로 사람의 위 유문부에 균집락을 형성한다. 헬리코박터 파이로리는 만성적으로 감염하여 B형 위염 및 위 십이지장궤양의 원인균으로 알려져 있으며, 위암발생의 일차적 요인이라는 역학적 증거가 속속 보고되고 있다(참조: Parsonnet J. et al., N. Eng. J. Med., 325:1127-1131(1991); Blaser, M.J., Gastroenterology, 102:720-727(1992)).
한국인의 위 질환환자를 대상으로 한 헬리코박터 파이로리에 대한 감염현황 조사에 의하면, 균보유율은 약 80%이고, 만성위염의 경우 86.5%, 십이지장환자의 경우 100%가 헬리코박터 파이로리에 감염되어 있는 것으로 보고되고 있다(참조: 이 광호 등, 대한미생물학회지, 25:475-490(1990)). 특히, 호주를 비롯한 구미지역에 거주하고 있는 위 질환환자에서의 감염율은 활동성 위염의 경우 64.95%, 위궤양의 경우 35.86%, 십이지장궤양의 경우 75 내지 100% 수준으로 보고되고 있는데, 위 질환환자에 있어서의 감염율은 국내외가 비슷하다.
그러나, 정상인의 경우 외국의 보고에 따르면 20대에 약 20%, 50대에 50% 정도가 헬리코박터 파이로리에 감염되는 것으로 알려져 있으나, 한국에서는 1세 이후부터 감염이 시작되어 5 내지 6세에는 50%로 선진국의 50대에서 나타나는 감염율을 보이고, 8세가 되면 80%, 20대 이후에는 90%이상이 헬리코박터 파이로리에 감염되어 92%라는 높은 보균율을 나타내고 있다(참조: 이 광호 등, 대한미생물학회지, 25:475-490(1990)). 따라서, 한국인에서 발생하는 대부분의 위질환은 소아나 성인의 구분없이 헬리코박터 파이로리와 관련이 있으며, 특히 아동기의 감염은 한국인에서 나타나는 높은 위암 발생율과도 관련이 있는 것으로 추축된다.
한편, 1994년 2월 미국 국립보건연구소(National Institute of Health)에서는 궤양은 감영성 질환이며, 그 치료를 위해서는 항생제 투여등에 의한 감염원의 제거가 선행되어야 한다고 발표하였다. 현재, 십이지장궤양의 치료를 위하여, 두 가지 종류의 항생제를 비스무스염(bismuthsalt)이나 오메프라졸(Omeprazole)과 함께 투약하면, 잠정적으로는 20 내지 90% 정도로 헬리코박터 파이로리가 제거되며, 위염증세의 완화와 십이지장궤양의 재발을 감소시킨다. 이와 같은 항생제 치료법은 한달여에 걸쳐 하루 수회 복용하여야 하는 불편이 있으며, 실험실적 조건(in vitro)에서는 헬리코박터 파이로리가 항생제에 민감함(susceptible)에도 불구하고, 생체내 조건(in vivo)에서는 그다지 효과적이지 못하고, 재감염을 방지할 수도 없다는 문제점이 있었다. 또한, 장기적으로 볼 때, 항생제에 내성을 갖는 헬리코박터 파이로리가 나타나게 되고, 이 헬리코박터 파이로리에 감염되면, 그의 제거는 매우 어렵다. 그러므로, 헬리코박터 파이로리에 의한 감염과 그에 따른 위장 질환의 예방과 치료를 위하여, 보다 근본적인 방법이 절실히 요구되었다.
이에, 본 발명자들은 전기 문제점을 극복할 수 있는 보다 이상적인 방법이 면역요법이라는 점에 착안하여, 경구용 백신(oral vaccine)으로 헬리코박터 파이로리에 따른 질환을 예방하고 치료하고자 하였다. 이러한 백신의 제조에는 항원성 및 면역원성을 가진 단백질의 다량 제공이 우선되어야 하므로, 본 발명자들은 헬리코박터 파이로리에 특이한 항원을 찾고자 노력한 결과, 항원성 및 면역원성을 지닌 외막단백질(Omp22)의 존재를 새롭게 확인하였으며, 이를 재조합 미생물을 이용하여 대량제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 헬리코박터 파이로리에서 유래한 신규한 외막단백질(Omp22)의 유전자 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 외막단백질(Omp22)의 유전자를 포함하는 발현벡터 및 그로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 형질전환된 미생물로 부터 재조합 외막단백질(Omp22)을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 전기 재조합 미생물로 부터 대량생산된 외막단백질(Omp22)의 용도, 즉, 헬리코박터 파이로리 감염의 진단시약 또는 백신으로서의 용도를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 전술한 진단시약 또는 백신을 개발하기 위하여 헬리코박터 파이로리에 특이한 항원을 탐색하는 과정에서, 신규한 약 22kDa 외막단백질(Omp22)의 존재를 확인하였다. 또한, 그의 유전자를 클로닝하기 위하여, 헬리코박터 파이로리의 DNA 라이브러리를 제조하고, 그로 부터 외막단백질(Omp22)을 발현하는 재조합 클론을 스크리닝하였다.
이렇게 클로닝된 외막단백질(Omp22) 유전자의 염기서열을 결정한 결과, 외막단백질(Omp22)의 유전자는 540bp 크기의 개방해독틀(open reading frame: ORF)을 가지고 있으며, 그로 부터 발현되는 외막단백질(Omp22)은 35개의 아미노산으로 이루어진 선도서열(leader sequence)을 포함하는 179개의 아미노산으로 구성된 단백질임을 알 수 있었다. 본 발명의 아미노산 서열에 있어서, '기능적으로 동등한'이란 외막단백질(Omp22)의 아미노산 서열중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, THr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 염기서열에 있어서, '기능적 등가물'이라 함은 외막단백질(Omp22) 유전자의 염기서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.
외막단백질(Omp22)을 대량생산하여 항원으로 사용하기 위하여, GST(glutat hione S-transferase)를 융합파트너(fusion partner)로 갖는 pGEX-2T 벡터에 상기에서 클로닝된 외막단백질(Omp22) 유전자를 삽입하고 재조합 발현벡터 pGEX-2T/omp22를 제조한 다음, 그 발현벡터로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 이렇게 형질전환된 대장균 DH5α를 배양하여 외막단백질(Omp22)의 발현을 유도하고, 그를 수득하여 재조합 외막단백질(Omp22)을 제조하였다.
상기에서 제조된 재조합 외막단백질(Omp22) 은 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체 및 헬리코박터 파이로리에 감염된 사람의 혈청에 의하여 자연형(native) 외막단백질(Omp22)과 동일한 정도로서 감지되므로, 재조합 외막단백질(Omp22)은 우수한 항원성을 유지하고 있음을 알 수 있었다. 아울러, 재조합 외막단백질(Omp22)을 항원으로 마우스에 근육주사하여 자연형 외막단백질(Omp22)과 동일한 정도로서 항체를 형성하는 면역원성이 있음을 확인하였다.
따라서, 상기의 재조합 외막단백질(Omp22)은 헬리코박터 파이로리에 대한 항원성 및 면역원성을 유지하고 있으므로, 헬리코박터 파이로리에 대한 진단시약 혹은 헬리코박터 파이로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있고, 헬리코박터 파이로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1: 헬리코박터 파이로리에서 유래한 신규한 항원성 단백질의 발견]
헬리코박터 파이로리의 항원성 단백질을 분석하기 위하여, 우선, 표준균주(ATCC 43504, 43579, 43629) 및 한국인 십이지장 궤양환자로부터 분리된 헬리코박터 파이로리 분리주(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)를 혈액한천선택배지(selective blood agar plate; 22g/L의 콜럼비아 블러드 아가 베이스(columbia blood agar base), 20g/L의 트립틱소이 아가(tryptic soy agar), 7%(v/v)의 면양혈액, 10㎍/㎖의 뱅코마이신(vancomycin), 300units/㎖의 콜리스틴(colistin) 및 2.5㎍/㎖의 엠포테리신 비(amphotericin B)로 구성된 배지)에 각각 도말하여 37℃, 10% CO2상태에서 48 내지 72시간 동안 배양하였다.
그런 다음, 각 균주를 수득하고 초음파 파쇄기(Branson sonifier, Model B-30, USA)로 파쇄한 다음, 10,000 내지 12,000rpm에서 10 내지 20분간 원침하고, 상층액을 수득하여 단백질 정량하였다. 이때, 단백질은 비시에이 단백질 정량키트(BCA protein assay kit, Pierce, USA)를 이용하여 정량하였다. 각 단백질 시료 50㎍을 10% SDS-PAGE하고 쿠마시 브릴리언트블루(Coomassie brilliant blue R-250)로 염색한 결과, 65kDa, 60kDa, 57kDa, 46kDa, 29kDa 및 22kDa 정도의 최소한 6가지의 주 단백질(major protein)이 존재하였다.
이를 웨스턴 블롯 분석하여 항원성 단백질을 확인하였다. 이때, 1차 항체로는 스프라크-돌리(Spraque-Dawley) 랫트에 헬리코박터 파이로리(ATCC 43504)의 생균체를 피하주사하여 얻은 항혈청을 1/500로 희석하여 사용하였고, 2차 항체로는 랫트의 1gG에 대한 염소 항체에 HRP(horse-raddish peroxidase)를 결합시키고, 이를 1/2000로 희석하여 사용하였다. 그 결과, 57kDa, 29kDa, 22kDa 및 19kDa 크기의 항원성이 높은 단백질 밴드들이 ATCC 표준균주 및 한국 분리주(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)에서 공통적으로 관찰되었다.
상기 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 상에 나타나는 단백질의 크기를 비교하여 볼 때, 57kDa 밴드는 HSP(heat shock protein), 29kDa 밴드는 유라아제 A 서브유닛(urease A subunit), 19kDa 밴드는 리프프로테인 A(lipoprotein A)로 추정되나, 22kDa 크기의 항원성 단백질은 아직 보고된 바가 없으므로, 그에 관한 하기와 같은 실험을 계속 수행하였다.
[실시예 2: 22kDa 항원성 단백질의 세포내 위치]
상기 실시예 1에서 확인한 22kDa 항원성 단백질의 성질을 규명하고, 그의 정제를 위하여 먼저 헬리코박터 파이로리에서의 존재 위치를 알아보고자 하였다.
한국 분리주(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP) 균체를 수득하고, 10mM Tris·Cl(pH 7.4) 완충용액으로 2번 세척한 다음, 초음파 파쇄하고, 10,000 rpm에서 10분간 원침하여 상층액을 수딕하였다. 이 상층액을 4℃에서 1시간 동안 100,000xg로 원침하고, 침강물 Ⅰ(crude membrane protein)을 수득한 다음, 7mM E DTA을 포함한 1% 소디움 라우릴 사코신(sodium lauryl sarkosine) 완충용액(pH 8.0)에 현탁하고, 37℃에서 30분간 교반하였다. 이어, 4℃에서 1시간 동안 100,000 xg로 원침하고, 침강물Ⅱ(outer membrane protein)을 수득한 다음, 10mM 트리스 완충용액(pH 7.4)에 현탁하였다.
상기와 같이 분류된 침강물 Ⅰ과 Ⅱ의 각 현탁액을 10% SDS-PAGE하고 (참조: 제1(a)도), 실시예 1에서 사용한 랫트 항-헬리코박터 파이로리 항체를 1차 항체로 이용하여 웨스턴 블롯 분석하였다(참조: 제1(b)도). 제1(a) 및 1(b)도에서, 제1레인은 250kDa, 98kDa, 64kDa, 50kDa, 36kDa 및 30kDa의 표준분자량 마커; 제2레인은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)의 세포파쇄액; 제3 및 4레인은 상기에서 제조한 침강물 Ⅰ 및 Ⅱ의 현탁액을 각각 나타내고; 화살표는 22kDa 크기의 항원성 단백질을 나타낸다. 제1(a) 및 1(b)도에서 보듯이, 22kDa 단백질은 외막부의 침강물 II에서 강하게 감지됨을 알 수 있었다. 따라서, 22kDa 크기의 단백질은 외막을 이루는 구조 단백질임을 알수 있었고, 이를 'Omp22'로 명명하였다. 또한, SDS-PAGE 상에서는 22kDa 단백질 밴드가 육안으로 확인되지 않으나, 웨스턴 블롯분석 상에서는 뚜렷이 확인되므로, 단백질 Omp22는 균체내에 소량 존재하나 매우 항원성이 높음을 알 수 있었다.
[실시예 3: Omp22 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석]
Omp22 단백질은 헬리코박터 파이로리 균체내에 매우 소량 존재하므로 그 정제에 앞서 Omp22 유전자를 클로닝하여 재조합 단백질로 대량발현하기로 하였다.
[실시예 3-1: 헬리코박터 파이로리의 DNA 라이브러리 제조]
헬리코박터 파이로리 분리주(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)에서 염색체 DNA를 분리하고, 제한효소 Hae Ⅲ(Boehringer Mannheim BIochemica, Germany)로 부분절단하였다. 그런 다음, 크기가 3kb 이상인 DNA 절편을 DEAE 막(membrane)(Schleicher Schuell, Germany)을 이용하여 전기용출(electroelution) 방법으로 분리하였다. 이어, 1 단위(unit)의 T4DNA 연결효소를 이용하여 분리한 DNA 절편의 양 끝에 EcoR1 어뎁터(adapter)(Stratagene, USA)를 부착시키고, 그 말단을 10 단위의 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; Boehringer Ma nnheim BIochemica, Germany)를 이용하여 인산화(kination)시킨 다음, Sephac ryl S-400 컬럼(Stratagene, USA)을 이용하여 DNA 절편만을 수득하였다. 이렇게 수득한 DNA 절편과 제한효소 EcoR1으로 절단된 Lambda ZAP Ⅱ 벡터(Stratagene, USA)를 T4DNA 연결효소를 이용하여 4℃에서 16시간 동안 반응하여 서로 연결시켰다. 그런 다음, Gigapack Ⅱ packaging extracts kit(Stratagene, USA)를 이용하여 파아지(phage) 상태로 패키징(packaging)하여 1.25×106개의 재조합 파아지를 얻었다(1.25×106PFU/㎖).
전기 재조합 파아지와 대장균(E. coli) XL1 Blue MRF' 세포를 NZY 배지(0.5% NaCl, 0.2% MgSO4·7H2O, 0.5% 효모추출물, 1% NZ 아민 및 1.5%아가로 구성된 배지)에서 함께 배양한 다음, SM 완충용액(1L당 5.8g NaCl, 2g MgSO4·7H2O, 50㎖ 1M Tris·Cl(pH 7.5) 및 5㎖ 2% 젤라틴을 함유한 용액)으로 파아지 현탁액(phage suspension)을 수거하는 방법을 통하여 2.5×1010PFU/㎖로 재조합 파아지를 증폭하였다. 이어, DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 최종농도 7%가 되도록 하고, -70℃에 보관하였다.
상기에서 증폭된 재조합 파아지 현탁액에 ExAssit 헬퍼(helper) 파아지(Stratagene, USA)를 첨가하여 대장균 XL1 Blue MRF' 세포와 함께 2XYT배지(1% NaCl, 1% 효모추출물 및 1.6% 박토트립톤으로 구성된 배지)에서 배양한 다음, 세균을 제거하고 상층액에 있는 파아지를 다시 대장균 SOLR 세포에 감염시켜 배양하는 생체내 절단(in vivo excision) 방법으로, 파아지 상태의 DNA 라이브러리를 pBluescript SK(-) 파아지미드(phagemid)를 갖는 콜로니 형태로 전환하였다. 24개의 클론을 임의로 선택하여 각각의 플라스미드 DNA를 분리하고, 이를 제한효소 EcoRI으로 절단한 결과, 각 클론은 3 내지 10kb 크기의 다양한 DNA 삽입체를 포함하고 있음을 확인하였다. 따라서, 상기에서 제조된 재조합 파아지가 헬리코박터 파이로리의 전체 게놈(genome)을 대표할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 3-2: DNA 라이브러리 스크리닝]
우선, 하기에서 기술되는 DNA 라이브러리 스크리닝 및 웨스턴 블롯 분석에 이용될 토끼 항-헬리콥가터 파이로리 외막단백질 항체를 제조하기 위하여, 실시예 2에서 준비한 헬리코박터 파이로리 분리주(Helicobacter pylori MBRI5, KCTC 0217BP)의 침강물 Ⅱ 현탁액 140㎍을 토끼에 0, 1, 4주의 간격으로 3회에 걸쳐 근육주사하고, 10일 후에 채혈하여 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 제조하였다.
실시예 3-1에서 제조한 헬리코박터 파이로리의 DNA 라이브러리로부터 Omp22 유전자를 포함하는 클론을 스크리닝하기 위하여, 재조합 파아지(bacteriophage stock solution)를 대장균 XL1 Blue MRF' 세포와 함께 NZY 배지에서 플라크(plaque) 지름이 1 내지 2㎜가 될 때까지 배양하고, 플라크를 니트로셀룰로스 필터로 전이하였다. 그런 다음, 그 필터에 1차 항체로 상기에서 제조한 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질(Omp22) 항체를 1/2000로 희석하여 반응시키고, HRP가 결합된 토끼 1gG에 대한 염소 항체를 1/2000으로 희석한 2차 항체를 반응시켰다. 이어, DAB(d iaminobenzidine)와 0.03% H2O2용액으로 발색반응을 유도하였다. 상기와 같은 방법으로 1.6×104개의 플라크를 3회 반복하여 스크리닝한 결과, 13개의 양성반응을 나타내는 단일 플라크들을 분리할 수 있었다. 각 클론을 실시예 3-1에서와 동일한 생체내 절단방법으로 pBluescript SK(-) 파아지미드를 포함하는 콜로니 형태로 전환한 다음, 배양하여 발현되는 단백질을 12% SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 분석하였다(참조: 제2(a) 및 2(b)도).
제2(a) 및 2(b)도에서, 제1레인은 205kDa, 116kDa, 97kDa, 84kDa, 66kDa, 55kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa 및 20kDa의 표준분자량 마커; 제2레인은 대장균 SOLR의 세포파쇄액; 제3레인은 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori MBR I5, KCTC 0217BP)의 세포파쇄액; 제4레인 내지 11레인은 재조합 클론 1번 내지 8번의 세포파쇄액; 제12 및 13레인은 250kDa, 98kDa, 64kDa, 50kDa, 36kDa, 30kDa 및 16kDa의 표준분자량 마커; 및, 제14레인 내지 18레인은 재조합 클론 9번 내지 13번의 세포파쇄액을 각각 나타낸다. 제2(a) 및 2(b)도에서 보듯이, 재조합 클론 4, 5, 7, 10, 14, 16, 17 및 18번의 8개 클론들이 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체로 감지되는 22kDa 크기의 재조합 단백질(화살표)을 발현하고 있음을 알 수 있었다. 이때, 발현되는 Omp22 단백질은 헬리코박터 파이로리에서와 마찬가지로 대장균의 외막으로 전이되는 것이 관찰되었다. 그러므로, 재조합 대장균으로 부터의 외막단백질(Omp22) 수득은 실시예 2에서와 동일한 방법으로 침강물 Ⅱ를 제조함으로써 행된다.
Omp22 단백질을 발현하는 각 클론의 플라스미드 DNA를 분리하고 이를 제한효소 EcoRI으로 절단하여 DNA 삽입체의 크기를 비교한 결과, 3.5 내지 6kb로 다양하였으며, 이 중 약 3.5kb의 가장 작은 DNA 삽입체를 포함하는 클론을 'pOmp22'라 명명하고 후술하는 실험에 이용하였다.
[실시예 3-3: pOmp22 클론의 서브클로닝]
여러 가지 제한효소를 이용하여 pOmp22의 제한효소 지도(restriction map)를 작성하였다(참조: 제3도). 제3도에서, E는 EcoRI, B는 Bgl Ⅱ 및 H는 Hind Ⅲ의 제한효소 절단부위를 각각 나타내고, 괄호안의 숫자는 pBluescript 벡터(빗줄친 박스로 표시)에 삽입된 헬리코박터 파이로리 DNA 절편의 크기를 나타낸다. 제3도에서 보듯이, pOmp22에는 2개의 Hind Ⅲ와 Bgl Ⅱ 절단부위가 있음을 알 수 있었다.
하기에서 Omp22 유전자의 염기서열을 결정하기 위하여, 먼저, Omp22 유전자를 포함하면서 보다 작은 크기의 DNA 삽입체를 갖는 클론을 얻고자 상기 제한효소 지도를 참조하여 pOmp22 클론을 서브클로닝하였다. 즉, pOmp22를 제한효소 Hind Ⅲ로 절단하여 약 2.1kb의 DNA 삽입체를 제거하고 남은 1.4kb의 DNA삽입체를 포함한 클론을 얻었는데, 이를 'pHL'이라 명명하였다. 또한, 제한효소 BamH Ⅰ 및 Bgl Ⅱ로 절단하여 1.5kb의 DNA 삽입체를 제거하고 남은 2.1kb의 DNA 삽입체를 포함한 클론을 얻었는데, 이를 'pBBR'이라 명명하였다.
상기 pOmp22, pHL 및 pBBR을 각각 포함하고 있는 대장균 XL1 Blue MRF'를 배양하여 발현되는 단백질을 12% SDS-PAGE와 웨스턴 블롯분석한 결과, pOmp22와 pHL 클론에서 22kDa 크기의 재조합 단백질이 감지되었다(참조: 제4(a 및 4(b)). 이때, 웨스턴 블롯은 제2(b)도에서와 동일하게 수행하였다. 제4(a)및 4(b)에서, 제1레인은 250kDa, 98kDa, 64kDa, 50kDa, 36kDa, 30kDa 및 16kDa의 표준분자량 마커; 제2레인은 대장균 XL1 Blue MRF'의 세포파쇄액; 제3레인은 pOmp22 클론의 세포파쇄액; 제4레인은 pHL 클론의 세포파쇄액; 제5레인은 pBBR 클론의 세포파쇄액; 및, 제6레인은 205kDa, 116kDa, 97kDa, 84kDa, 66kDa, 55kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa 및 20kDa의 표준분자량 마커를 각각 나타낸다.
[실시예 3-4: Omp22 유전자의 염기서열 분석]
pHL 클론의 삽입체 DNA를 각각 pBluescript SK(+)와 (-) 벡터에 클로닝한 다음, (+)와 (-) 사슬(strand)을 vcs M13 헬퍼 파아지(Stratagene, USA)를 이용하여 단일사슬의 DNA로 분리하고, 디데옥시법으로(참조: Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463-5467(1977)) 그의 염기서열을 결정하였다(참조: 제5도). 제5도에서, SD는 샤인-달라노서열(Shine-Dalgarno ribosomal binding sequenc e)을 나타내고, 밑줄친 아미노산 서열은 하기와 같은 N-말단 아미노산 서열분석으로 확인된 서열을 나타낸다. 제5도에서 보듯이, 574번 위치에서 ATG로 시작되는 540bp 크기의 개방해독틀(ORF)이 존재하고, 562번 위치에 SD와 547, 530번 위치에 보존된 -10, -35 프로모터 서열이 존재함을 알 수 있었다.
한편, pOmp22 클론에서 발현되는 Omp22 단백질을 부분 정제하여 그의 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다(참조: 표 1).
상기 표 1의 결과에 의하면, Omp22 단백질의 성숙된 형태(mature form)는 염기서열 679번 위치에서 시작됨을 알 수 있었다. 따라서, Omp22 단백질은 35개의 아미노산으로 이루어진 선도서열(leader sequence)을 포함하는 179개의 아미노산으로 구성된 단백질로 발현됨을 알 수 있었다.
이렇게 결정된 Omp22 유전자의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열의 상동성을 Blast 프로그램(NCBI, USA)으로 조사한 결과, Omp22 유전자의 염기서열은 지금까지 보고된 적이 없는 신규한 것임을 알 수 있었고, 그로 부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열은 헬리코박터 속에서는 보고된 바가 없으며, 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)의 펩티도글리칸 결합 리포프로테인(peptidoglycan-associated lipoprotein), 보데텔라 아비움(Bodetella avium)의 21kDa 외막단백질 OmpA, 파스테렐라 말토시다(Pasteurella multocida)의 외막단백질 등과 같은 외막의 구조를 이루는 단백질과 비교적 높은 상동성을 나타내었다.
[실시예 4: 재조합 Omp22 단백질의 발현 및 그의 항원성 확인]
Omp22 단백질을 대량생산하여 항원으로 사용하기 위하여, GST를 융합파트너로 갖는 pGEX-2T 벡터에 Omp22 유전자를 클로닝하고, 발현된 재조합 단백질의 항원성을 관찰하였다.
[실시예 4-1: 재조합 Omp22 유전자의 클로닝]
Omp22 유전자를 클로닝하기 위하여, Omp22 유전자에서 성숙단백질이 시작되는 염기서열 679번 위치와, 1093번 위치에서 시작하여 종결 코돈을 포함하는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다. 또한, 프라이머들은 말단에 각각 제한효소 BamHI과 EcoRI 절단부위를 포함하도록 다음과 같이 29mer 및 28mer로 합성하였다:
5'-CGGGATCCGCGGTTCAAAGTGCGCCTGTT-3'
5'-GGAATTCTTACTTCACTAATTTGACATC-3'
상기 실시예 3-3에서 제조된 pHL 클론의 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 전기 프라이머들을 이용하여 선도서열을 제외한 성숙 단백질 부분인 435bp의 DNA 절편을 PCR법으로 증폭하였다. 이때, PCR은 변성(denaturation, 94℃, 1분), 결합(annealing, 45℃, 1분) 및 합성(polymerization, 72℃, 1분)의 조건에서 30회 수행하였다.
증폭한 DNA 절편을 제한효소 BamHI 및 EcoRI으로 절단하여 접착말단(cohesive end)화 하고, pGEX-2T 벡터(Pharmacia, Sweden)의 BamHI, EcoRI 절단부위에 삽입하여 발현벡터 pGEX-2T/omp22를 제조하고, 그 발현벡터로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 이렇게 형질전환된 대장균 DH5α를 대장균(Escherichia coli) EGST-Omp22라 명명하고, 1996년 1월 19일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0228BP로 기탁되었다.
[실시예 4-2: 재조합 Omp22 단백질의 발현 및 정제]
재조합 Omp22 단백질을 발현시키기 위하여, 상기에서 형질전환된 대장균을 0.5mM IPTG 첨가하에서 37℃의 온도조건으로 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배양한 세포들을 초음파 파쇄하고, 원심분리하여 수득한 상층액을 글루타티온(glutathione) 세파로스 4B 친화성 컬럼(glutathione Sepharose 4B affinity column, Pharmac ia, Sweden)에 주입하여 48kDa의 GST-Omp22 융합 단백질을 정제하였다(참조: 제6도).
제6도에서, 제1레인은 205kDa, 116kDa, 97kDa, 84kDa, 66kDa, 55kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa 및 20kDa의 표준분자량 마커; 제2레인은 pGEX-2T 벡터를 포함한 대장균 DH5α의 세포파쇄액; 제 3레인은 pGEX-2T/omp22를 포함한 대장균 DH5α의 세포파쇄액; 제4레인은 0.5mM IPTG 첨가하에서 배양한 pGEX-2T 벡터 함유 대장균 DH5α의 세포파쇄액; 제5레인은 0.5mM IPTG 첨가하에서 배양한 pGEX-2T/omp22 함유 대장균 DH5α의 세포파쇄액; 재6 및 10레인은 250kDa, 98kDa, 64kDa, 50kDa, 36kDa, 30kDa 및 16kDa의 표준분자량 마커; 제7 및 8레인은 pGEX -2T/omp22를 포함한 대장균 DH5α의 세포파쇄액을 원심분리하고 수득한 상등액 및 침전물을 각각 나타내고; 및, 제9레인은 글루타티온 세파로스 4B 친화성 크로마토그래피하여 정제한 GST-Omp22 융합 단백질을 나타낸다. 제6도에서 보듯이, 제3, 5, 7, 8, 및 9레인에서 48kDa의 GST-Omp22 융합 단백질이 발현됨을 확인할 수 있었고, 글루타티온 세파로스 4B 친화성 컬럼으로 전기 융합 단백질을 정제할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 4-3: 재조합 Omp22 단백질의 항원성 확인]
융합된 Omp22 재조합 단백질이 항원성을 유지하고 있는지 알아보기 위하여, 실시예 3-2에서 제조한 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체를 이용하여 웨스턴 블롯분석하였다. 즉, 150mM NaCl 및 2.5mM CaCl를 함유한 50mM Tris-Cl(pH 8.0)에 트롬빈 1 단위당 100㎍의 재조합 단백질을 첨가하고 12시간 동안 반응시켜, 융합 파트너인 GST 부분을 절단하고 발현된 Omp22 재조합 단백질만을 얻었다. 이어, 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체와 염소 항-GST 항체(Pharmacia, Sweden)로 웨스턴 블롯분석하였다(참조: 제7(a), 7(b) 및 7(c)도).
제7(a)도는 SDS-PAGE 결과, 제7(b)도는 토끼 항-헬리코박터 파이로리 외막단백질 항체로 웨스턴 블롯 분석한 결과, 제7(c)도는 염소 항-GST 항체로 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다. 제7(a), 7(b) 및 7(c)도에서, 제1레인은 250kDa, 98kDa, 64kDa, 50kDa, 36kDa, 30kDa 및 16kDa의 표준분자량 마커; 제2레인은 트롬빈으로 절단하기 전의 융합단백질; 제3 내지 6레인은 트롬빈으로 1, 2, 3, 12 시간 절단한 융합단백질을 각각 나타낸다. 제7(a), 7(b) 및 7(c)도에서 보듯이, 트롬빈의 12시간 처리로 융합된 GST 부분이 완전히 절단되었음을 알 수 있었고, 재조합 Omp22 단백질이 자연형(native) Omp22 단백질과 동일한 항원성을 유지함을 알 수 있었다.
Omp22 재조합 단백질의 항원성을 헬리코박터 파이로리에 감염된 사람의 혈청을 이용하여 재확인하기 위하여, 재조합 Omp22 단백질을 항원으로 하고, 헬리코박터 파이로리 양성인 사람의 혈청을 1/300으로 희석하고 이를 1차 항체로 이용하여 스트립(Strip) 웨스턴 블롯을 수행하였다. 제8(a)도는 12% SDS-PAGE 결과이고, 제8(b)도는 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타낸다. 제8(a)도에서, 제1레인은 250kDa, 98kDa, 64kDa, 50kDa, 36kDa, 30kDa 및 16kDa의 표준분자량 마커; 제2레인은 정제된 GS T; 제3레인은 정제된 GST-Omp22 융합 단백질; 및, 제4레인은 205kDa, 116kDa, 97kDa, 84kDa, 66kDa, 55kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa 및 20kDa의 표준분자량 마커를 각각 나타낸다. 제8(b)도에서, 제1 및 2레인은 정제된 GST 및 정제된 GST-Omp22 융합 단백질을 각각 이용하여 웨스턴 블롯분석한 결과를 나타내며; a, b, c, d 및 e는 헬리코박터 파이로리 양성인 5명을 나타낸다.
제8(b)도에서 보듯이, 세포파쇄액을 항원으로 사용한 경우와 마찬가지로, 재조합 Omp22 단백질이 헬리코박터 파이로리 양성인 사람(5명)의 혈청 모두에서 감지되었다. 따라서, Omp22 재조합 단백질은 헬리코박터 파이로리에의 감염여부 판단에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 4-4: 재조합 Omp22 단백질의 면역원성 확인]
융합된 Omp22 재조합 단백질이 항체를 형성하는 면역원성을 유지하고 있는지 알아보기 위하여, 100㎍의 재조합 Omp22 단백질을 Balb/c 마우스에 0, 1, 4 주의 간격으로 3회에 걸쳐 근육주사하고, 10일 후에 채혈하여 항 헬리코박터 파이로리 재조합 Omp22에 대한 항체를 제조하였다. 이 항체로 웨스턴 블롯분석을 실시한 결과, 자연형 Omp22 단백질, pOmp22 클론에서 발현되는 Omp22 단백질, GST-Omp22 융합 단백질이 모두 감지됨을 알 수 있었다. 따라서, Omp22 재조합 단백질은 헬리코박터 파이로리의 감염 예방과 치료에 유효한 백신제조에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 헬리코박터 파이로리에서 유래한 22kDa크기의 신규한 외막단백질(Omp22) 유전자, 그를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 재조합 외막단백질(Omp22)을 대량으로 제조하는 방법을 제공한다. 이렇게 제조된 재조합 외막단백질(Omp22)은 자연형 외막단백질(Omp22)과 동일한 정도의 항원성 및 면역원성을 유지하고 있으므로, 헬리코박터 파이로리에 대한 진단시약 혹은 헬리코박터 파이로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있고, 헬리코박터 파이로리에 대한 항체 생성에도 이용될 수 있다.
Claims (11)
- 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)로부터 유래한 하기와 같은 염기서열을 가지는 외막단백질(Omp22) 유전자 및 그의 기능적 등가물:
- 제1항의 유전자로부터 번역되는 하기와 같은 아미노산 서열 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 외막단백질(Omp22):
- 제2항에 있어서, 헬리코박터 파이로리에 대한 항원성과 면역원성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 외막단백질(Omp22).
- 제1항의 외막단백질(Omp22) 유전자를 포함하고 있는 발현벡터.
- 제1항의 외막단백질(Omp22) 유전자를 포함하며, GST (glutathione S-transferase)를 융합파트너(fusion partner)로 갖는 발현벡터 pGEX-2T/omp22.
- 제5항의 발현벡터 pGEX-2T/omp22로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) EGST -Omp22(KCTC 0228BP).
- 제6항의 형질전환된 미생물을 배양하여 외막단백질(Omp22)의 발현을 유도하고 이를 수득하는 공정을 포함하는 재조합 외막단백질(Omp22)의 제조방법.
- 제6항의 형질전환된 미생물을 배양하여 발현유도 과정을 수행하고, 발현된 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 재조합 외막단백질(Omp22).
- 제2항의 외막단백질(Omp22)을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터 파이로리 진단시약.
- 제2항의 외막단백질(Omp22)을 포유동물 세포에 주입하여 항체를 유도하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 헬리포박터 파이로리에 대한 항체.
- 제2항의 외막단백질(Omp22)을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터 파이로리 관련 질환의 예방 또는 치료용 백신.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019960002105A KR0158435B1 (ko) | 1996-01-30 | 1996-01-30 | 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 |
| PCT/KR1996/000154 WO1997028264A1 (en) | 1996-01-30 | 1996-09-06 | A novel gene encoding an outer membrane protein of helicobacter pylori and a recombinant microorganism expressing the same |
| AU69464/96A AU6946496A (en) | 1996-01-30 | 1996-09-06 | A novel gene encoding an outer membrane protein of helicobacter pylori and a recombinant microorganism expressing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019960002105A KR0158435B1 (ko) | 1996-01-30 | 1996-01-30 | 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR970059279A KR970059279A (ko) | 1997-08-12 |
| KR0158435B1 true KR0158435B1 (ko) | 1998-11-16 |
Family
ID=19450381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019960002105A KR0158435B1 (ko) | 1996-01-30 | 1996-01-30 | 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR0158435B1 (ko) |
| AU (1) | AU6946496A (ko) |
| WO (1) | WO1997028264A1 (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19847628C2 (de) * | 1998-10-15 | 2000-10-19 | Chiron Behring Gmbh & Co | Helicobacter pylori-Impfstoff |
| FR2803302B1 (fr) * | 2000-01-04 | 2004-12-10 | Pf Medicament | Procede de preparation d'un polypeptide soluble en solvant aqueux en absence de detergent |
| US6316205B1 (en) | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
-
1996
- 1996-01-30 KR KR1019960002105A patent/KR0158435B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-09-06 WO PCT/KR1996/000154 patent/WO1997028264A1/en active Application Filing
- 1996-09-06 AU AU69464/96A patent/AU6946496A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6946496A (en) | 1997-08-22 |
| KR970059279A (ko) | 1997-08-12 |
| WO1997028264A1 (en) | 1997-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TW570925B (en) | Bacterial antigens and vaccine compositions | |
| JP4276670B2 (ja) | 微生物蛋白質と、この蛋白質を産生する微生物と、該蛋白質のワクチンおよび結核検出での利用 | |
| Hewinson et al. | Molecular characterization of MPT83: a seroreactive antigen of Mycobacterium tuberculosis with homology to MPT70 | |
| JP2907552B2 (ja) | ヘモフィルス外膜タンパク質 | |
| US7179448B2 (en) | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi | |
| EA001789B1 (ru) | Выделенные, по существу очищенные, поверхностные антигены белковой природы neisseria meningitidis и neisseria gonorrhoeae, их фрагменты и последовательности днк | |
| US6221363B1 (en) | Vaccine for the prevention of lyme disease | |
| EP1300156A2 (en) | Otitis media vaccine | |
| NO332229B1 (no) | Proteiner som omfatter konserverte regioner av Neissinia menigitidis overflateantigen NhhA, farmasoytisk sammensetning inneholdende disse, antistoff, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, fremgangsmater og anvendelse knyttet til proteinene | |
| ZA200007255B (en) | Vaccine. | |
| WO2003091437A1 (en) | Chimeric camp factors for vaccination against streptococcus infection | |
| US7902349B2 (en) | Nucleic acids encoding protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly) | |
| EP0500736B1 (en) | Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia | |
| US8372405B2 (en) | Proteins with improved solubility and methods for producing and using same | |
| KR0158435B1 (ko) | 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 | |
| US20040091901A1 (en) | Immunogenic Mycoplasma hyopneumoniae polypeptides | |
| Power et al. | Biochemical and antigenic properties of the Campylobacter flagellar hook protein | |
| ZA200604492B (en) | Protein NMB0928 and use thereof in pharmaceutical formulations | |
| KR100211286B1 (ko) | 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 | |
| RU2102081C1 (ru) | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi | |
| KR100220895B1 (ko) | 헬리코박터 파이로리의 외막단백질 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 | |
| KR20080081198A (ko) | 단백질 ｎｍａ0939를 포함하는 약학적 조성물 | |
| KR20060123759A (ko) | 단백질 ｎｍｂ1125 및 약학적 제제에서의 이들의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20080617 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |