CN108287244B - 热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用 - Google Patents

热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。本发明提供了热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测标志物的应用，经实验证实，以热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测的标志物，对幽门螺杆菌毒力型的检出率大幅提高，准确率可达98％以上，且该标志物其不受非毒力型幽门螺杆菌或其他病原菌的干扰，具有良好的特异性。

Description

热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。
背景技术
热休克蛋白是一种从细菌到哺乳动物中广泛存在的应激蛋白质。已有研究报导，幽门螺杆菌的热休克蛋白可能充当了胃粘膜慢性病发展和持续的启动因子。
幽门螺杆菌抗体分型是目前常用的分型方法，其对于幽门螺杆菌的毒力评价和指导临床治疗的价值得到了广泛认可，可以更加科学有效地服务于幽门螺杆菌相关疾病的精准治疗。现有的幽门螺杆菌分型方法主要是以CagA(细胞毒素)或VacA(空泡毒素)抗体存在与否判断所感染幽门螺杆菌的毒力水平，高毒力菌株往往同时表达这两种毒力蛋白，而低毒力(或者无毒力)菌株往往不表达上述毒力蛋白。但临床也发现非毒力型幽门螺杆菌感染者中也有不少发展成为幽门螺杆菌相关疾病，显示单单只以CagA或VacA作为Hp毒力型的指标是不完整的。
因此，进一步开发精准的幽门螺杆菌检测标志物是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用，其能够降低毒力型幽门螺杆菌感染的漏检率。
本发明提供了热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。
本发明中，所述热休克蛋白groEL的氨基酸序列如SEQ ID NO:l所示。
本发明所述检测为幽门螺杆菌的分型检测。
本发明试验表明，以热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测的标志物，能够实现对幽门螺杆菌毒力型的准确检测，其不受非毒力型幽门螺杆菌或其他病原菌的干扰，具有良好的特异性，且能够降低毒力型幽门螺杆菌的漏检率。
本发明还提供了一种幽门螺杆菌检测试剂盒，其包含热休克蛋白groEL的检测试剂。
本发明所述检测试剂为包被有热休克蛋白groEL的酶标板；所述热休克蛋白groEL的氨基酸序列如SEQ ID NO:l所示。
本发明中，包被有热休克蛋白groEL的酶标板的制备方法包括：
以幽门螺杆菌NCTC 11637为模板，以SEQ ID NO:2～3所示序列的引物进行扩增，获得groEL基因片段；
将所述groEL基因片段链接入载体pTrchis2C后，获得重组质粒；
所述重组质粒经扩增后转化入大肠杆菌Rosetta，经诱导表达、纯化，获得重组groEL蛋白；
将所述重组groEL蛋白与包被液混合后包被至酶标板，然后经洗涤、封闭、干燥制得包被有热休克蛋白groEL的酶标板。
所述载体pTrchis2C的链接位点为Xho I和Kpn I。
所述包被蛋白的浓度为1μg/ml，包被的量为100μl/well。
所述包被的条件为4℃包被过夜或37℃包被2h。
本发明提供的试剂盒中，还包括Elisa检测试剂。
本发明还提供了一种非诊断目的的幽门螺杆菌的分型检测方法，为将待测样品稀释后，与包被有热休克蛋白groEL的酶标板共同孵育，经洗涤、与二抗孵育后，进行显色，根据显色结果判断是否感染毒力型幽门螺杆菌。
所述判断为，以阴性血清的OD值的2.1倍为cut off值，高于cut off则为感染毒力型幽门螺杆菌，低于cut off则未感染毒力型幽门螺杆菌。
检测方法中，所述与包被有热休克蛋白groEL的酶标板共同孵育的温度为室温，时间为30min。所述室温优选18℃～30℃。
所述待测样品为血浆、组织重悬液或样品清洗液。
所述与二抗孵育的温度为室温，时间为30min。所述室温优选18℃～30℃。
所述二抗为兔抗人抗体。
所述显色的显色剂为TMB。
本发明提供了热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测标志物的应用，经实验证实，以热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测的标志物，对幽门螺杆菌毒力型的检出率大幅提高，准确率可达98％以上，且该标志物其不受非毒力型幽门螺杆菌或其他病原菌的干扰，具有良好的特异性。
附图说明
图1示groEL目的基因扩增出单一条带；
图2示质粒双酶切验证；
图3示蛋白诱导表达结果；
图4示蛋白纯化结果。
具体实施方式
本发明提供了热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1重组groEL蛋白的制备
一、groEL目的基因的获取：
1.groEL引物的设计：
groEL-F:cgcgctcgagggcaaaagaaatcaaat
groEL-R:tctggtacccatcatgccacccatggc
2.以菌株NCTC 11637为模板扩增groEL目的基因：
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001611654120000031
Figure BDA0001611654120000041
PCR反应参数：
Figure BDA0001611654120000042
PCR电泳产物图如图1。
结果分析：groEL目的基因扩增出单一条带，大小在1500bp～2000bp之间，符合目的基因groEL 1638bp的大小。
二、目的基因groEL与载体pTrchis2C的双酶切、连接和转化
1.目的基因groEL与载体pTrchis2C的双酶切
用XhoI和KpnI双酶切质粒载体pTrchis2C和目的基因groEL，反应体系如下：
Figure BDA0001611654120000043
2.目的基因groEL与载体pTrchis2C的连接体系如表1：
表1目的基因groEL与载体pTrchis2C的连接体系
Figure BDA0001611654120000044
Figure BDA0001611654120000051
22℃连接10min。
3.将groEL/pTrchis2C和pTrchis2C自连分别转化DH5α感受态。
三、重组质粒的挑选验证：
1.在groEL/pTrchis2C DH5α挑选单菌落，摇菌，抽质粒，双酶切验证(图2)
结果分析：groEL/pTrchis2C经XhoI和KpnI双酶切后，产生线性载体和插入基因，插入基因大小在1500bp～2000bp之间，符合插入片段大小。
四、目的蛋白的诱导表达、纯化
1.将groEL/pTrchis2C转化表达菌Rosetta感受态细胞
2.诱导表达：挑取单个groEL/pTrchis2C Rosetta菌落摇菌，待OD600＝0.5时，加入100mM IPTG,使其终浓度为1mM，诱导表达，电泳检测(图3)：
结果分析：groEL/pTrchis2C Rosetta经诱导，在65kDa左右出现明显的诱导条带。
3.纯化：经超声破碎后，用Ni-NTA对超声上清纯化，纯化结果如图4。结果分析：groEL蛋白的纯化效果不错，是所需要的目的条带。
实施例2酶标板的制备
1、稀释重组groEL蛋白至1μg/ml作为包被液，100μL/well，放入铝箔袋中4℃过夜包被(37℃包被2h效果一样)。
2、甩去包被液，拍干。
3、用洗涤液洗涤三次，每次浸泡1min，300μL/well，甩去洗涤液，拍干。
4、封闭：封闭液200μl/well，37℃封闭1h，甩去封闭液，拍干，洗涤三次方法同上。
5、37℃烘干1～2h。
6、将烘干的酶标板和干燥剂放入铝箔袋4℃封存备用。
实施例3ELISA检测幽门螺杆菌
1、待测样品：
样品1：将确认不含groEL抗体的阴性血清分别用样本稀释液稀释100倍，并在稀释的阴性血清里分别加入大肠杆菌、变性杆菌、空肠弯曲菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、白色假丝酵母。
样品2：将确认含有groEL抗体的8个强阳性血清分别用样本稀释液稀释100倍，并在稀释的强阳性血清里分别加入幽门螺杆菌标准菌株11637、大肠杆菌、变性杆菌、空肠弯曲菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、白色假丝酵母。
将培养好的菌液测OD600，用1ml 100倍稀释的血清将菌液的OD600调为0.2(OD600＝0.1时每毫升菌液的CFU为1*107)，计算方法为：C1*V1＝C2*V2，(C1＝测OD600，测V1＝V取，C2＝0.2,V2＝0.2)，算V取＝0.2*1/测OD600,V取即收集的菌液量，离心去上清，用无菌水洗涤，离心去上清，再用血清重悬，作为待测样本。
2、检测方法
2.1、样本孵育：待测样品用样本稀释液100倍稀释后，分别加入酶标板100μl/well，以双蒸水作为空白对照。每个样品重复12次，室温孵育30min。
2.2、孵育后用洗涤液洗涤五次，每次浸泡30s，300μl/well，甩去洗涤液，拍干。
2.3、兔抗人抗体孵育：100μl/well，室温30min。
2.4、洗涤五次，方法同上。
2.5、TMB底物孵育：100μl/well，室温15min。
2.6、终止反应：添加终止液0.5M H2SO4终止反应，100μl/well。
2.7、检测：酶标仪450nm单波长检查。
根据检测结果，以不含有抗体的阴性血清的OD值平均值的2.1倍为cutoff值，高于cut off则为感染毒力型幽门螺杆菌，低于cut off则未感染毒力型幽门螺杆菌。
结果如表2：
表2：检测结果
Figure BDA0001611654120000071
根据检测结果，groEL蛋白对毒力型幽门螺杆菌的检测具有良好的特异性，而对非毒力型幽门螺杆菌或其他病原菌并未见非特异性检测结果的产生，准确率可达100％。
实施例4ELISA检测幽门螺杆菌
1、待测样品：
临床血清共计500份
2、检测方法：
分别以groEL蛋白作为标志物，以及以CagA作为标志物对待测样品进行检测，检测方法采用ELISA法。根据检测结果，以不含有抗体的阴性血清的OD值的2.1倍为cut off值，高于cut off则为感染毒力型幽门螺杆菌，低于cutoff则未感染毒力型幽门螺杆菌。
结果如表3：
表3标志物检测结果
Figure BDA0001611654120000081
检测中发现，有289例样本两种标志物皆鉴定为毒力型幽门螺杆菌感染阳性，而186例皆被鉴定为阴性血清。以groEL鉴定为阳性的血清中，有19份被CagA鉴定为阴性，而以CagA为标志物的鉴定为阳性的样品中，有3份被groEL鉴定为阴性。对鉴定效果不一致的样品，对病人进行溯源病史的验证。结果表明，以CagA为标志物，漏检了19例阳性样品，而以groEL为标志物则漏检了3份。说明groEL蛋白对毒力型幽门螺杆菌的检测具有良好的准确性，能够降低毒力型幽门螺杆菌感染的漏检率。
实施例5ELISA检测幽门螺杆菌
1、待测样品：
毒力型幽门螺杆菌污染的餐具(将确认含有groEL抗体的强阳性血清100μL，滴至餐盘，放置12h后，进行检测)
2、检测方法：
将餐盘表面以10mL双蒸水冲洗，收集洗涤后的液体，充分混匀，取100μL作为待测样品，以groEL蛋白作为标志物，采用ELISA法进行检测。检测重复10次。以干净的双蒸水作为对照。根据检测结果，以阴性血清的OD值的2.1倍为cut off值，高于cut off则为感染毒力型幽门螺杆菌，低于cut off则未感染毒力型幽门螺杆菌
检测结果表明，10次检测皆表现为阳性，对照显示阴性，说明本发明提供的标志物还可以用作餐具等其他样品的检测。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市伯劳特生物制品有限公司
<120> 热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用
<130> S18P0101
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1641
<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 1
atggcaaaag aaatcaaatt ttcagatagc gcgagaaacc ttttatttga aggcgtgaga 60
caactccatg acgctgttaa agtaaccatg gggccaagag gcaggaacgt gttgatccaa 120
aaaagctatg gcgctccaag catcactaaa gatggcgtga gcgtggctaa agagattgaa 180
ttaagttgcc cggtagctaa catgggcgct caactcgtta aagaagtagc gagcaaaacc 240
gctgatgctg ccggcgatgg cacgaccaca gcgaccgtgc tggcttatag catttttaaa 300
gaaggtttga ggaacatcac ggctggggct aaccctattg aagtgaaacg aggcatggat 360
aaagccgctg aagccattat taatgagctt aaaaaagcga gcaaaaaagt gggcggtaaa 420
gaagaaatca cccaagtggc gaccatttct gcaaactccg atcacaatat cgggaaactc 480
atcgctgacg ctatggaaaa agtgggtaaa gacggcgtga tcaccgttga agaagctaag 540
ggcattgaag atgaactaga tgttgtagaa ggcatgcaat ttgatagagg ctacctctcc 600
ccttattttg taacaaacgc tgagaaaatg accgctcaat tggataacgc ttacatcctt 660
ttaacggata aaaaaatctc tagcatgaaa gacattctcc cgctactaga aaaaaccatg 720
aaagagggca aaccgctttt aatcatcgct gaagacattg agggcgaagc tttaacgact 780
ctagtggtga ataaattaag aggcgtgttg aatatcgcag cggttaaagc tccaggcttt 840
ggggacagaa gaaaagaaat gctcaaagac atcgctattt taaccggcgg tcaagttatt 900
agcgaagaat tgggcttgag tctagaaaac gctgaagtgg agtttttagg caaagccgga 960
aggattgtga ttgacaaaga caacaccacg atcgtagatg gcaaaggcca tagccatgat 1020
gtcaaagaca gagtcgcgca aatcaaaacc caaattgcaa gcacgacaag cgattatgac 1080
aaagaaaaat tgcaagaaag gttggctaaa ctctctggcg gtgtggctgt gattaaagtg 1140
ggcgctgcga gtgaagtgga aatgaaagag aaaaaagacc gggttgatga tgcgttgagc 1200
gcgactaaag cggctgttga agaaggtatt gtgattggcg gcggtgcggc tctcattcgc 1260
gcggctcaaa aagtgcattt gaatttgcac gatgatgaaa aagtgggcta tgaaatcatc 1320
atgcgcgcca ttaaagcccc attagctcaa atcgctatca atgccggtta tgatggcggt 1380
gtggtcgtga atgaagtaga aaaacacgaa gggcattttg gttttaacgc tagcaatggc 1440
aagtatgtgg atatgtttaa agaaggcatt attgacccct taaaagtaga aaggatcgct 1500
ttacaaaatg cggtttcggt ttcaagcctg cttttaacca cagaagccac cgtgcatgaa 1560
atcaaagaag aaaaagcggc cccagcaatg cctgatatgg gtggcatggg cggtatggga 1620
ggcatgggtg gcatgatgta a 1641
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcgctcgag ggcaaaagaa atcaaat 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctggtaccc atcatgccac ccatggc 27

Claims (4)

1.热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌分型检测的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述热休克蛋白groEL的核苷酸序列如SEQID NO:l所示。
3.一种非诊断目的的幽门螺杆菌的分型检测方法，其特征在于，将待测样品稀释后，与包被有热休克蛋白groEL的酶标板共同孵育，经洗涤、与二抗孵育后，进行显色，根据显色结果判断是否感染毒力型幽门螺杆菌。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述判断为，以阴性血清的OD值的2.1倍为cut off值，高于cut off则为感染毒力型幽门螺杆菌，低于cut off则未感染毒力型幽门螺杆菌。
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