CN109678962B - 一种Cdk5纳米抗体和筛选方法 - Google Patents

一种Cdk5纳米抗体和筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种Cdk5纳米抗体和筛选方法，涉及生物工程技术领域，所述Cdk5纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的Cdk5纳米抗体检测活性为0.3125ug/ml，可作为Cdk5蛋白检测的科研性纳米抗体。

Description

一种Cdk5纳米抗体和筛选方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种Cdk5纳米抗体和筛选方法。
背景技术
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，单域抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体得优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性的屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单；同时纳米抗体的分子量小，结构简单，更有利于进行基因改造，纳米抗体人源化修饰等特性。
黑色素瘤是由黑色素细胞癌化形成的一种最具侵袭性的发生于皮肤部位的恶性癌症。细胞周期素依赖性激酶5(cyclindependentkinase 5；Cdk5)，属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonineproteinkinase)家属成员之一。Cdk5的作用与神经细胞的成熟和移动、中枢神经系统的正常发育有关，同时与感觉通路，例如痛觉信号机制有关。一旦Cdk5异常，将导致各种神经退行性疾病，例如阿兹罕默综合症。我们发现CDK5在小鼠黑色素瘤(B16)细胞中异常性高表达，Cdk5可以促进黑色素瘤细胞的生长和增殖，制备Cdk5纳米抗体，一方面可以成为利用分子成像技术研究Cdk5作用机制的示踪工具，另一方面可以作为抑制黑素瘤生长的小分子工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Cdk5纳米抗体，对Cdk5蛋白具有较好的灵敏度。
本发明提供了一种Cdk5纳米抗体，其特征在于，所述Cdk5纳米抗体具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的Cdk5纳米抗体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗，得到B16-Cdk5-VHH1；
所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为18～22μg/ml；
2)将所述步骤1)得到的B16-Cdk5-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为8～12μg/ml；
所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；
所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；
3)将所述步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同Cdk5蛋白的反应性，以确定所述菌株与Cdk5蛋白具有反应性；
所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；
所述第一离心的离心力为1700～1900g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将所述步骤4)与Cdk5蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列；
所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，根据蛋白分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定，蛋白分子量为15kDa的蛋白为Cdk5纳米抗体。
优选的，所述黑素瘤纳米抗体库的构建方法，包括以下步骤：
A.将Cdk5基因中的CDS区的基因与载体连接，得到表达载体；
B.将所述步骤A得到的表达载体转染黑色素瘤细胞、培养，得到培养细胞，提取所述培养细胞中的蛋白；
C.将所述步骤B得到的蛋白免疫动物后，提取动物血液中淋巴细胞总RNA，将所述淋巴细胞总RNA反转录为cDNA；
D.以所述步骤C得到的cDNA为模版，用Call001-F和Call002-R引物对进行第一PCR扩增，得到700bp扩增产物；
所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
所述Call002-R引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
E.以所述步骤D得到的700bp扩增产物为模版，用VHH2-F和VHH2-R引物对进行第二PCR扩增，得到VHH片段；
所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
F.将所述步骤E得到的VHH片段和pCANTAB5e分别经两次酶切后连接，得到连接产物；
G.将所述步骤F得到的连接产物与TG1电转化感受态细胞混合后进行电转化，得到黑素瘤纳米抗体库。
优选的，所述步骤3)培养的温度为25～35℃。
优选的，所述步骤4)感染的时间为25～35min。
优选的，所述步骤4)孵育的时间为50～70min。
优选的，所述步骤B转染的时间为50～60h。
优选的，所述步骤B培养使用的培养基为含有体积分数为8～12％FBS的DMEM高糖培养基。
优选的，所述步骤D第一PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min。
优选的，所述步骤E第二PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
本发明提供了一种Cdk5纳米抗体，对Cdk5蛋白具有较好的灵敏度。
本发明实施例的结果显示：本发明提供的Cdk5纳米抗体不仅能够特异性结合Cdk5蛋白，对该蛋白的灵敏度最低为0.3125ug/ml。
附图说明
图1为第一轮PCR-VHH凝胶电泳图；
图2为第二轮PCR-VHH电泳图；
图3为平板检测B16-VHH纳米文库库容结果；
图4为平板检测B16-VHH纳米文库丰度结果；
图5为PCR检测B16-VHH纳米文库插入率结果。
具体实施方式
本发明提供了一种Cdk5纳米抗体，其特征在于，所述Cdk5纳米抗体具有SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列。
在本发明中，所述纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，具体序列如下：
SCSSWSPGEAWCSLGGLDSPVQPLDLPSETMTAGSARLQERGPSGSQLLILVVVAHTMQTPRADSPSPETTPRTRCICKTAHLRTRPCITVREEERLIMAMTTGARGPRSPSPQRTTAKTPAP。
本发明还提供了上述技术方案所述的Cdk5纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗，得到B16-Cdk5-VHH1；
所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为18～22μg/ml；
2)将所述步骤1)得到的B16-Cdk5-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；
所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为8～12μg/ml；
所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；
所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；
3)将所述步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同Cdk5蛋白的反应性，以确定所述菌株与Cdk5蛋白具有反应性；
所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；
所述第一离心的离心力为7500～8500g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将所述步骤4)与Cdk5蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：
CTAGCTAGCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCG，其中，GCTAGC为NheI酶切位点。
所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
CGAGCTCTGGAGCTGGGGTCTTCGC，其中，GAGCTC为NheI酶切位点。
6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，根据蛋白分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定，蛋白分子量为15kDa的蛋白为Cdk5纳米抗体。
本发明将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗，得到B16-Cdk5-VHH1；所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为18～22μg/ml。
本发明对所述黑素瘤纳米抗体库没有特殊限定，采用常规使用的黑素瘤纳米库即可，在本发明实施例中，所述黑素瘤纳米抗体库的构建方法优选包括以下步骤：
A.将Cdk5基因中的CDS区的基因与载体连接，得到表达载体；
B.将所述步骤A得到的表达载体转染黑色素瘤细胞、培养，得到培养细胞，提取所述培养细胞中的蛋白；
C.将所述步骤B得到的蛋白免疫动物后，提取动物血液中淋巴细胞总RNA，将所述淋巴细胞总RNA反转录为cDNA；
D.以所述步骤C得到的cDNA为模版，用Call001-F和Call002-R引物对进行第一PCR扩增，得到700bp扩增产物；
所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
所述Call002-R引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。
E.以所述步骤D得到的700bp扩增产物为模版，用VHH2-F和VHH2-R引物对进行第二PCR扩增，得到VHH片段；
所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，具体序列如下：
TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG；
所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，具体序列如下：
AAACCGTTGGCCATAATGGCCTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGT。
F.将所述步骤E得到的VHH片段和pCANTAB5e分别经两次SfiI酶切后连接，得到连接产物；
G.将所述步骤F得到的连接产物与TG1电转化感受态细胞混合后进行电转化，得到黑素瘤纳米抗体库。
本发明优选将Cdk5基因中的CDS区的基因与载体连接，得到表达载体。
在本发明中，所述Cdk5为细胞周期素依赖性激酶5。
在本发明中，所述载体优选为pCDNA3.1，本发明对所述连接的方法没有特殊限定，采用常规即可。
本发明优选将表达载体转染黑色素瘤细胞、培养，得到培养细胞、提取所述培养细胞中的蛋白。
在本发明中，所述转染的时间优选为50～60g，更优选为56h，本发明将表达载体转染黑素瘤细胞后，高表达的Cdk5能够加快黑素瘤细胞的增殖。
在本发明中，所述培养使用的培养基优选为含有体积分数为8～12％FBS的DMEM高糖培养基，更优选为含有体积分数为10％FBS的DMEM高糖培养基。本发明对提取所述培养细胞中的蛋白的方法没有特殊限定，采用常规提取蛋白的方法即可。
本发明优选将所述蛋白免疫动物后，提取动物血液中淋巴细胞总RNA，将所述淋巴细胞总RNA反转录为cDNA。
在本发明中，所述动物优选为羊驼。
本发明对所述免疫的方法没有特殊限定，采用常规免疫原免疫动物的方法即可。
本发明对所述提取动物血液中淋巴细胞总RNA的方法没有特殊限定，采用常规RNA提取的方法即可。
在本发明中，所述反转录优选包括：将5μg总RNA、1μl Random6 Primer、1μl Oligo(dT)18Primer、1μl dNTP Mix和7μl ddH2O混合后在65℃下处理5min，将得到的处理物在冰上静置5min，将所述静置物与4μl 5X PrimeScript II buffer、0.5μl RNase inhibiter、1μl Primer Scrip II Rtase和4.5μl ddH2O混合后，依次40℃处理40min和70℃处理15min，得到cDNA。
本发明以cDNA为模版，用Call001-F和Call002-R引物对进行第一PCR扩增，得到700bp扩增产物；
所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述Call002-R引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
所述Call002-R引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。
在本发明中，所述Call001-F引物对应羊驼抗体的Leader区，所述Call002-R引物对应于羊驼抗体的第二恒定区(CH2)，可分别对常规抗体(900bp)及重链抗体(700bp)的leader区及CH2区域进行扩增。本发明将扩增得到的700bp扩增产物进行第二扩增。
在本发明中，所述第一PCR扩增的体系优选每50μl包括：2μl cDNA、浓度为10umol/μl的Call001-F 1μl、浓度为10umol/ul的Call001-R 1μl、25μl Taq Green PCR Mix和21μlddH2O。
在本发明中，所述第一PCR扩增的程序优选包括：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min。
本发明以所述700bp扩增产物为模版，用VHH2-F和VHH2-R引物对进行第二PCR扩增，得到VHH片段；所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG；
所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
AAACCGTTGGCCATAATGGCCTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGT。
根据第一轮PCR产物的测序结果，在羊驼单域抗体(VHH结构域)的两端恒定区FR1、FR4区域分别设计第二轮扩增引物VHH2-F和VHH2-R，以扩增VHH序列。
本发明将得到的VHH片段和pCANTAB5e分别经两次SfiI酶切后连接，得到连接产物。
本发明对所述VHH片段和pCANTAB5e的酶切没有特殊限定，采用常规酶切的方法即可。在本发明中，经两次酶切后能够消除空载率。
在本发明中，所述连接使用的酶优选为T4连接酶。在本发明中，所述连接的体系优选每200μl包括：VHH片段1μg、pCANTAB5e载体3μg、T4DNA Ligase 10μl、10×Buffer 20μl，ddH2O补充至200μl。本发明对所述连接的条件没有特殊限定，采用常规连接条件即可。
本发明将所述连接产物与TG1电转化感受态细胞混合后进行电转化，得到黑素瘤纳米库。
在本发明中，所述电转化优选包括：所述电转化的电压优选为1.5～2.0KV，更优选为1.8KV；所述电转化的电阻优选为180～220Ω，更优选为200Ω；所述电转化的电容优选为20～30μF，更优选为25μF；所述电转化的时间优选为4～6ms，更优选为5ms。
本发明电转化后还包括：将得到的电转化物在37℃下孵育1h，将得到的孵育物在5000g下离心5min，将得到的沉淀加入SOC液体培养基后，得到黑素瘤纳米抗体库。
在本发明中，所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为18～22μg/ml，优选为10μg/ml。本发明对所述第一轮淘洗的方法没有特殊限定，采用本领域常规淘洗的方法即可。
本发明将得到的B16-Cdk5-VHH1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为8～12μg/ml；所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml；所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml。
在本发明中，所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为8～12μg/ml，优选为10μg/ml；所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml，优选为5μg/ml；所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为3～8μg/ml，优选为5μg/ml。本发明对所述第二轮淘洗、第三轮淘洗和第四轮淘洗的方法没有特殊限定，采用本领域常规淘洗的方法即可。
本发明将得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株。
在本发明中，所述噬菌体液与TG1菌液的体积比优选为1:4。在本发明中，所述TG1菌液的OD600值优选为0.4。在本发明中，所述培养的温度优选为25～35℃，更优选为30℃。
本发明将得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同Cdk5蛋白的反应性，以确定所述菌株与Cdk5蛋白具有反应性；所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；所述第一离心的离心力为1700～1900g，所述第二离心的离心力为2000～2100g。
在本发明中，所述菌株与KM13辅助噬菌体混合后优选以静置的方式进行感染，所述感染的时间优选为25～35min，优选为30min。
在本发明中，所述第一振荡的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述第二振荡的温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述第一离心的离心力优选为1700～1900g，更优选为所述第二离心的离心力为1800g；所述第二离心的离心力优选为2000～2100g，更优选为2020g。
本发明将与Cdk5蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明对质粒的提取没有特殊限定，采用常规提取质粒的方法即可。本发明对所述PCR扩增使用的体系和程序没有特殊限定，采用常规使用的体系和程序即可。在本发明中，所述所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物优选具有SEQID No.2所示的核苷酸序列，具体如下：
CTAGCTAGCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCG；
所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：
CGAGCTCTGGAGCTGGGGTCTTCGC。
本发明对所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接的方法没有特殊限定，采用本领域常规连接方法即可。
本发明将得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，根据蛋白分子量(15kDa左右)及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定，蛋白分子量为15kDa的蛋白为Cdk5纳米抗体。
本发明对所述重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌的转入方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导的诱导方法没有特殊限定，采用常规诱导方法即可。本发明对提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白的提取方法没有特殊限定，采用常规提取微生物中的蛋白的方法即可。本发明对所述SDS-PAGE鉴定的方法没有特殊限定，采用常规即可。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种Cdk5纳米抗体和筛选方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
细胞培养及抗原制备：研究发现B16细胞内高表达的Cdk5是黑色素瘤细胞增殖加快的重要因素之一。通过PCR技术将小鼠Cdk5基因的CDS区与pCDNA3.1真核表达载体相连，构建Cdk5真核表达载体，Lipofectamine 2000转染B16细胞，转染56h后用含10％FBS的DMEM高糖培养基培养B16细胞，PBS清洗细胞3次后收集到15ml离心管，3000g，4℃离心10min。弃上清，10ml的无菌生理盐水重悬沉淀，B16细胞破碎：-70℃和37℃反复冻融，冻融时间为15min/次，超生破碎30min，离心取上清。用BCA检测蛋白浓度。待作抗原。
免疫程序及鉴定：免疫之前采集10ml实验羊驼的促凝血液，分离血清，保存备用。将上一步骤制备的蛋白分装成4管，每管200μg，挑选体况良好的成年雄性羊驼，采取肩胛部皮下注射的方式进行免疫，免疫间隔为2周，共免疫4次，每次免疫的蛋白量为200μg，其中初次免疫使用完全弗氏佐剂(Sigama)，第二到第四次免疫使用不完全弗氏佐剂(Sigama)，第三次免疫后采集羊驼促凝血，分离血清ELISA检测免疫效果，ELISA按说明书进行，在此过程中，使用的二抗来源于llama。
淋巴细胞总RNA的提取和VHH模板cDNA的合成
按RNA提取试剂盒说明书提取RNA后，并按长链cDNA反转录试剂盒说明书合成VHH第一条链，反应体系如表1：
表1反应体系
Figure BDA0001953173730000091
Figure BDA0001953173730000101
反应体系瞬时涡旋，PCR仪按40℃、40min；70℃、15min；12℃保存的反应体系进行反转录。
第一轮PCR扩增VHH片段：纳米抗体免疫文库构建采用巢式PCR法，第一轮PCR扩增的引物Call001-F和Call002-R，其中Call001-F对应羊驼抗体的Leader区，Call002-R对应于羊驼抗体的第二恒定区(CH2)，可分别对常规抗体(900bp)及重链抗体(700bp)的leader区及CH2区域进行扩增，具体方法如下：
第一轮PCR引物见表2：
表2引物序列
Call001-F： SEQ ID No.4 GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
Call002-R： SEQ ID No.5 GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
以合成的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，反转录产物分成30个反应，每个PCR反应体系为50ul，反应所用试剂为康为世纪的2xTap酶，反应体系见表3：
表3反应体系
Figure BDA0001953173730000102
Figure BDA0001953173730000111
PCR扩增反应程序见表4：
表4扩增程序
Figure BDA0001953173730000112
琼脂糖凝胶电泳分析第一轮PCR反应产物主要包含大小为900bp和700bp的两种扩增产物，紫外灯下切胶回收700bp的核酸，胶回收试剂盒(康为世纪)回收纯化700bp的核酸片段，1ul胶回收产物与pMD19-T simple载体相连，反应体系见表5：
表5反应体系
pMD19-T simple 1μl
胶回收产物 1μl
Solution I 5μl
Water Up to 10ul
总体积 10μl
瞬时涡旋反应体系，4℃反应过夜，热激连接产物与DH5α感受态细胞混匀，冰上孵育25min，42℃精确热激90s，冰上孵育4min，加入400ul的LB培养基37℃、200rpm孵育40min，50ul转化后的菌液均匀的涂布到含有氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基表面，培养板倒置，37℃过夜培养。次日挑取20个单克隆菌落接种到5ml含有AMP抗性的LB液体培养基过夜培养后测定其碱基序列。VectorNTI软件分析测序结果，设计建库用的第二轮PCR引物VHH2-F和VHH2-R。
第二轮PCR扩增VHH：以第一轮PCR产生的700bp的回收片段为模板，以测序设计的引物VHH2-F和VHH2-R进行VHH片段扩增。50μl的反应体系，共做24个PCR反应，具体反应体系见表6：
表6反应体系
胶回收产物80ug/ul 6μl
VHH2-F(10umol/ul) 2μl
VHH2-R(10umol/ul) 2μl
Taq Green PCR Mix 25μl
Water 15μl
总体积 50μl
PCR扩增反应条件见表7：
表7扩增程序
Figure BDA0001953173730000121
Figure BDA0001953173730000131
取2ul二轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物为单一条带。二轮VHH-PCR产物可直接使用核酸纯化试剂盒说明书进行纯化。
VHH片段及载体酶切纯化：摇菌质粒小提含有pCANTAB5e质粒的大肠杆菌。抽取10ul的质粒进行质粒测序，检测所用质粒质量，有无突变碱基等。VHH片段及质粒pCANTAB5e进行二轮酶切，反应所用酶为SfiI(Thermo)，酶切体系见表8：
表8酶切体系
Figure BDA0001953173730000132
VHH片段及pCANTAB5e载体进行2轮酶切以消除空载率，第一轮VHH和载体都做20个反应的酶切，反应条件：50℃水浴酶切1h。PCR产物纯化试剂盒纯化VHH体系；载体酶切体系先进行琼脂糖纯化，然后采用胶回收试剂盒纯化。一轮酶切后的纯化产物按照上面的酶切体系再度50℃水浴、酶切1h，两种产物再度纯化。
酶切产物连接及纯化：两轮酶切纯化后的VHH片段和载体pCANTAB5e进行连接，连接采用T4连接酶(Thermo)，反应体系见表9：
表9连接体系
Figure BDA0001953173730000133
Figure BDA0001953173730000141
反应体系瞬时涡旋，4℃反应过夜。次日按说明书进行连接产物的纯化。
黑素瘤纳米抗体库(B16-Cdk5纳米抗体文库)的构建及特性鉴定：将纯化后的pCANTAB5e-VHH连接产物(总体积100ul)加入刚制备的新鲜TG1电转化感受态细胞，吹打混匀，冰浴10min；在电压1.8KV，电阻200Ω，电容25μF，时间5ms的条件下，在电转仪中进行转化后，将电转杯中点击后的TG1细胞转移至50ml无菌离心管中，37℃振荡孵育1h；孵育过的菌液5000g离心5min，弃净上清，重新加入8ml新鲜的SOC培养基重悬沉淀；取100μl菌液梯度稀释后涂布到16个2×YTAG的固体培养板(90mm)测定库容，每个梯度两个平板，共做8个梯度平板，剩余菌液涂布到30个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，25℃静置培养箱培养过夜；次日待培养板菌落长好后，39个150mm的平板中每个平板加入5ml的2×YT液体培养基清洗菌落收集清洗液；5000g、4℃、离心12min，加入含15％甘油的2×YT液体培养基90ml重悬沉淀，分管密封后即为制备的初级文库菌，命名为B16-Cdk5-VHH，即为黑素瘤纳米抗体库，取100μl初级文库菌用于测定文库丰度，其余分装冻存于-70℃。
文库库容的测定：100ul电转后的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-8；每个稀释度各取100ul涂布2个2×YTAG固体培养板，25℃培养过夜；次日对梯度板的菌落进行统计，计算库容。
文库丰度的测定：取100ul初级文库菌液进行梯度稀释，稀释度从10-4～10-10；每个稀释度各取100ul菌液涂布2个2×YTAG固体培养板，25℃培养过夜；次日对梯度板的菌落进行统计，计算文库丰度。
文库VHH片段插入率及插入多样性的测定：待文库库容大小测定后，从测定库容的固体培养板中随机挑取50个单克隆菌落接种于1ml 2×YTAG培养基，37℃振荡培养过夜；次日，对50个克隆进行菌液PCR鉴定，并将剩余的菌液送测序公司进行测序；分析PCR鉴定结果及测序结果，计算VHH片段的插入率及插入的多样性。
实验结果：
1.ELISA法检测免疫效果
空白孔和阴性孔中都添加10-1稀释的血清，根据ELISA数据结果发现：未免血清中不含Cdk5细胞蛋白的抗体，而免疫后的全血清中的阳性反应十分强烈，在稀释10-2后仍然具有阳性反应，而免疫后分离的纳米抗体在稀释到10-2后同样具有阳性反应，但是阳性率低于全血清，结果说明免疫B16蛋白后，羊驼体内不光产生了针对B16蛋白的纳米抗体，同时也产生了抗B16蛋白的传统抗体。免疫效果可用于后续文库构建。实验结果如下表10。
表10 ELISA法检测免疫效果
未免血清 0.038 0.066 0.313 0.193 0.097
免疫血清 0.052 0.081 2.521 1.936 1.012
纯化血清 0.040 0.079 1.982 1.213 0.876
2.淋巴细胞分离及VHH片段扩增
细胞计数仪检测分离得到的羊驼免疫后淋巴细胞为3.6×107个，将淋巴细胞分成10管，每管添加1ml的TRIzol，按步骤提取细胞总RNA，两步法反转录合成长片段cDNA，Call001和Calloo2引物扩增VHH的leader区到FR2区域片段，凝胶电泳检测条带，由下图1发现，一轮PCR引物可以扩增传统抗体(900bp)和重链抗体(700bp)的VHH片段。
一轮PCR产物连接pMD19T载体后，挑选20个单克隆菌斑进行测序分析，Vector NTI软件(Vector NTI 11.5.1)对测序结果进行分析比对，设计二轮PCR引物VHH2-F和VHH2-R二次体外扩增Cdk5-VHH片段。二轮PCR扩增体系同上一轮PCR扩增体系，琼脂糖凝胶电泳检测二轮PCR产物电泳图如下图2所示：二轮PCR产物大小为400bp左右，条带单一，大小与预期相符。
3.黑素瘤纳米抗体库(B16-Cdk5-VHH噬菌体文库)构建
梯度稀释法检测B16-VHH纳米抗体文库库容：10-7稀释平板上有18个单克隆菌落，800×18×107＝1.44×1011个(图3)，文库的丰度为465×10×108＝4.65×1011个/ml(图4)。50个菌液PCR样品中仅有1个样品片段长度与VHH片段不符(图5)，49个测序样品1个克隆测序失败，软件分析48个样品序列的相似性发现48个插入片段均不相同，测序合格的样品序列NCBI分析发现其都是VHH序列，因此可计算文库VHH片段的插入率为96％。软件转化48个样品序列对应的氨基酸序列，分析其结构，可见黑素瘤纳米抗体库(B16-Cdk5-VHH)分为分区明显的恒定区及可变区域。黑素瘤纳米抗体库中的氨基酸序列如下：
SEQ ID No.12：
ESGGGLVQPGGSLTLSCVASGFTLNGHAIGWFRQAPGKEREGVACLSNSGGSTLYAESVKGRFAISKDNDKDMMYLRMNSLRPDDTATYYCVADVLRQACRLDVTYPFRGKGTQVTVSS；
SEQ ID No.13：
ESGGGVVQPGGSLRLSCAVSGSIDSFFYMAWHRQVPGKRRESVASISTSGVISYQDFVKGRFTISRDNAKNTIYLQMTNLKPEDTAVYYCLGSSDIDHWGKGILVTVSA；
SEQ ID No.14：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGRFKIYRMDWYRRVEGGQRELVASISDGYNTDYADFVKGRFTISRYNAGNTLPLQMNNLEVDDTAVYYCHADERESDTVIKSHWGQGTQVTVSP；
SEQ ID No.15：
ESGGGLVQPGGSLRLSCDETSSRTLDYYKIGWFRQAPGKEREGVSCTESNNGSTTYADSVKGRFTVSRDIAENKVYLQMKNLKPEDTGIYYCGADLEVFRRCSFVSNEYDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.16：
ESGGGDMQPGEALRLSCAASGFTFANYAMSWYRQAPGKERELLITIKTIRSHTNYSHTVKDRFTASRDNAKNTVSLRINDLKPEDTAVYYCNTDPPLPNYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.17：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFANYIMGWYRQAPGEQRELVATITNGGITAYADSVKGRFTVSRDNVRNTVNLQMNSLEPEDTAVYYCYANIILMGELDSGLHDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.18：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYAMNWVRQAPGKGLEWVASIHRNGEPTYYRDSVKGRFTISRDNVKNQLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGDIVIASYILDTWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No.19：
ESGGDSVQPGGSLRLSCAASGFTFSTNPMNWVRQAPGKGLEWIAAIHSGGNRTSYATSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAIYYCAQDPAGLSRGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.20：
ESGGGLVQAGGSLRLSCVASGFIFARYIMNWFRQAPGKEYEFVIGPSGDSTRYADSVKGRFTISRDNAKNTVYPQMNSLEPEDTAVYYCNAAATPEGYWGKGTQVTVSS；
SEQ ID No.21：
ESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFDFSTYAMSWYRQAPGKEREVVAAITANADTSNYAHSVEGRFTISRDNAKNTVWLQMNLLEPEDTAVYYCNAGTSYYYTTEHDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.22：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAAPASWVRQAPGKGLEWVSSIYTDSSDTYYADSVKGRFTISTDNAKNTLYLQMDSLRPEDTDYRLL；
SEQ ID No.23：
ESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTLAYYSVEWSRLAPGKEREEVSCIGPSGDSTNYGDSVKGRFTISRDNAKSTVFLQMDNLSPEDTAIYYCRRSAGSSCSGPFGSYGLGAQVTVTS；
SEQ ID No.24：
ESGGRLVQPGKSLKLSCVVSGGTLDNYGIGWFRQTPGKEREGVACISGPRGRTTYANSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLNSEDTGIYYCRSHCGDPKFGSWGQGTQVAVSS；
SEQ ID No.25：
ESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFALEYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISWSGLGDGSGLRDGSTAYLDSVKGRFTISRDNTKSTVHLHMNSLKPEDTAIYFCAARITAVRGMCLMNDRWFEHWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.26：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMDWVRQAPGKGLEWVSDINSGGGSTRYADSVTGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYFCARDRGEYSDHEDYDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.27：
ESGGGLVQPGGSLNLSCVASGITFSSYGMSWHRQAPGKERELVAAITSLETGTAYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKLDDTGVYYCRARTRENVYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.28：
ESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSNCSMAWFRQAPGKEYEFVATISSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYPQMNSLEPEDTAVYYCNAAATPEDYWGKGTLVTVSS；
SEQ ID No.29：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKSTKRYSMGWYRQPPGKLVATIGTDGGATYYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNKVEPGDTAVYICAADLWGSAGVWTPEGEYDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.30：
ESGGGLVQPGGSLSLSCAVSGRVSAISAMGWYRQAPEKQRELVATITSGGDTNYATPVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAETWGLYNDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.31：
ESGGGLVQPGSSLTLSCTHSGLTEDHYAIGWFRQAPGETPEALACEGTRDTRTKIAEFVQGRFSGSRDAAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCALDYRSRCELWARYDVRGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.32：
ESGGGEVQPGGSLRLSCVASGFAFSNYKMSWYRQTPGEERELVASINRLGDTQYSDSVKGRFAISRDDSRNVMYLQMNSLKFEDTAVYYCNAESEFVNYEFWGQGIRVTVSL；
SEQ ID No.33：
ESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGISFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSGIKSTGGSTYYSDSVKGRFTMSRDNAKNTWHLQMNSLKPEDSGVYYCRVDRVYPQCVFSGGSWGPGTQVTVST；
SEQ ID No.34：
ESGGGLVQAGASLRLSCAASGSTFSINAMGWYRQPPGKQRELVAAITSGGGYTDYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAESYGSDSIVWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.35：
ESGGGLVQPGGSLRLSCTASGGTFDYYHIGWFRQAPGKEREEISCISSNSRQTNYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNNLKPEDTGVYYCAGDLWGDCSTPDPKYDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.36：
ESGGGLVQPGGSLRLSCTTSRFSLDYHDIGWFRQAPGKEREGITCVSRNGRSTKYVDSVKGRFTISRDKNTVYLQMNSLKPEDTGIYFCAAEHTGLETCDLTRYTYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.37：
ESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFSIYAMGWYRQAPGKQREFVANVTFDGSVNYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTALYYCARALTRDQWSYGNMDYWGKGALITVSS；
SEQ ID No.38：
ESGGGWVQPGESLRLSCVATGSEFRLFAMAWYRQAPGKEREQVATTTLRDSILYADTVKDRFKISRDNGMNTVYLQMNNLKPEDTGIYYCNAWDQGLGGREYDYWGQGTQVIVSS；
SEQ ID No.39：
ESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFKRFAMNWFRQAPGKEREFVAGISTGGDTTNYADSVKGRFAISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAKDSPSRRVGYRGTLSPMDYWGKGTLVTVSS；
SEQ ID No.40：
ESGGDLVHAGESLRLSCAASGSIFAFYSMGWYRQAPGKQRELVAEEVSGGITNYADVVKGRFTISRDNAKKTLALEMNNLKPEDTATYYCMWNMTSGVYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.41：
ESGGGSVQPGGSLRLSCQASGFTFSKYRMRWYRQTPGDEREMIAEVTASGAYKNYADSVKGRFTIFRDNTKALVDLQMNSLKPEDTGVYFCNAPGCVGSVCYGKDYWGQGTQVTVSQGTQVTVSS；
SEQ ID No.42：
ESGGGSVEPGSILRLSCEASGSRFREYSLAWFRQAPGKGREWLSCIRPADSMTYYSDSVRGRFTISRVNANNTMYLQMSNLEPEDTGVYYCAARHISYCPRQASAFEFWGQGTQVTVSP；
SEQ ID No.43：
ESGGGPVQPGGSLRLSCSASTSGTIFSIREMGWYRQAPGKEREGLSCDRDTEPTKTYYIDAVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNDLKPEDTAVYYCNAVGDEGATFWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.44：
ESGGGSVQPGGSLTLSCVVSGDDFSFYAMAWYRQAPGNQQRELVASVSRYDTTNYANSVKGRFTISRDNAKSTVYLQMNKLKPEDTAVYYCKPQPGNIPWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.45：
ESGGGQVQPGGSLRLSCAASGPGFDDSGLGWFRQRPGKAREAISCISSRSTYIHYADSVKGRFTIHRDNAKPEFLLQMDRLNPEDTGIYYCAEDSTDGETCEPGDFRSWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.46：
ESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFGLDALAIGWFRQAPGKEREGVSCISRMDDSTNYADSVKGRFTASRDFAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGVGGYYCVPNEYDYWGQGTQVIVSS；
SEQ ID No.47：
ESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFSLDYYNIGWFRWAPGKERRLVSCIRVSDGSAYYADSVKGRFTISGDSAKNTVYLQMGSLTPEDTAVYYCAAGTDPCGTDYRDELPGRGTQVTVSS；
SEQ ID No.48：
ESGGGLVQPGSSLTLSCQYSGLTEDHYAIAWFRQAPGETPEALACEGTRDTRTKIADFVRGRFTGSGDAAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCALDYRSRCELWARYDVRGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.49：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFTFSAMGWYRQAPGKQRELVARRTSTGGTNYADSVKGRFTISRDSAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNSRGQWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.50：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIHFSFYRMSWYRQAPGKLRELVAVITSGGMTNYADSVKGRFTVSKDSAKNTFYLQMNSLKPEETAVYYCNVAQYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.51：
ESGGGLVQPGGSLRLSCVASRSIFSIYAMGWFRQAPGKQRELVASINNRAMTNYGDFVKGRFTISRDNAKNTLYLEMNDLKPEDTALYFCTTGSQYNEGDDRGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.52：
ESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTLDYYVIGWFRQAPGKEREGVSCINGRGGYTNYADSVKGRFTISRDSTTDTVYLQMNSLGPEDTAIYYCAANFAHDGSCTVVVGYDYWGLGTQVTVSS；
SEQ ID No.53：
ESGGGLVNTGGSLRLSCVASGIAASTSTIAWFRQAPGKGREWTCSIYEDSSTYCSDSVKDRFTVSRDDAKNTVYLQMSGLLTEDTGVYDCAIPDKFVRGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.54：
RAYECSHGGSLRLSCAASAFNLDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYSASSNTFYADSVKGRFTISTGNAENTLYLQMNSLKPEDTAIYYCAATIYEARGLRFLGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.55：
ESGGGLVQPGGSLRLSCKASGFIFSNYAMSWYRQAPGQERVLVAAITSRGGATNYASSVEGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLNAEDTAVYICNARAGAGVTVGPDQYNYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.56：
ESGGGLVQPGGSLTLSCANMQYTLDYYAVAWFRQSPGKGREAVACISSTDETTAYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNKVEPGDTAVYICAADLWGSCGVWTPEGEYDYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.57：
ESGGGLVQAGDSLTLSCIASGTTFSINTMAWYRQAPGNQRELVATIGTDGTTTYADPVKGRFTISRDNDKSTMYLQSNSLKSEDTAVYYCNQGYYASSRYYAMAYWGKGTLVIVSS；
SEQ ID No.58：
ESGGGLVQAGGSLRLSCAASGNIDSINHMGWYRQAPGKERELVATISGSGNTYYTDSVKGRFSISRDNVQNLLYLQMNSLKPDDTAMYYCAGCSGYVCLPDGYNYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID No.59：
ESGGGVVQPGGSLKLPCTASGSNLDFHDVGWFRQVPGKEREGVGCISYRGKITVYADSVKGRFTVFRDDAKTTVFLQMNVLKPEDSAIYFCAAAPRRLFQNCELGTAYDYWGQGTQVTVSS。
以上均说明黑素瘤纳米抗体库(B16-Cdk5-VHH)是一个特性很好的免疫文库，适合用于特异性纳米抗体的筛选。
实施例2
将实施例1制备的黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗，得到B16-Cdk5-VHH1，分装冻存于-70℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以Cdk5蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
(1)将500μl实施例1制备的黑素瘤纳米抗体库接种于100ml2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μlKM13辅助噬菌体，37℃静置感染30分钟，而后振荡培养30分钟；
3)4000×g离心10分钟，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10分钟，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴70分钟；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2分钟，彻底吸尽上清；
6)使用2.6ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10分钟；
7)回收上清，命名为ZJ-B16-Cdk5-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.6mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的Cdk5-VHH1)，待用。
包被蛋白处理：
(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
(2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
(3)在免疫管中加入2ml上述步骤(7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
(4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
(5)将洗脱的噬菌体(命名为XT-B16-Cdk5-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)
(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
(7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
(8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-Cdk5-VHH1，分装冻存于-70℃。
测定拯救噬菌体滴度：ZJ-B16-Cdk5-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算ZJ-B16-Cdk5-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算XT-B16-Cdk5-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：Cdk5蛋白包被浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体M13-Cdk5的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-1～10-6、10-8～10-11；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD600为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取192个单克隆菌株共接种2块96孔深孔培养板，每孔中均含200μl 2×YTAG培养基，培养板分别标记为E-1、E-2，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取20μl菌液接种于180μl 2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板振荡培养1h后，在每孔中加入20μl KM13(60μlKM13+12ml2*YTAG)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μl 2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同Cdk5蛋白的反应性，具体方法如下：使用Cdk5蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13Antibody，稀释度1:10000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5-15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性孔号。
通过间接ELISA方法检测192个单克隆对应的噬菌体上清同Cdk5蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了20个单克隆，这些单克隆均同Cdk5蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱。将20个单克隆的培养菌液送测序公司测序。
Cdk5纳米抗体活性和亲和性
原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5ml 2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。之后设计用于原核表达的引物，并在引物的5’端和3'端分别引入BamHⅠ和SalI酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体VHH序列，并通过上述酶切位点将其连接入pQE30原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的Cdk5特异性鉴定。
原核表达的引物：
(SEQ ID No.8)F:GTGAGGATCCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCG；
(SEQ ID No.9)R:TCTGAGTCGACTGGAGCTGGGGTCTTCGC。
筛选步骤如下
将重组质粒和pBAD18空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：
将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。
(吸取10μl甘油菌接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养过夜；)
第二天吸取50μl菌液接种5mlAmp抗性的LB培养基，各接种2管，37℃振荡培养至OD600为0.6；
在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度0.4mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；
同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。
1.2.3.5纳米抗体的SDS-PAGE鉴定
将对纳米抗体的表达进行SDS-PAGE鉴定，具体方法为：
吸取1ml菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；
弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；
用20μl PBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。
具有抗Cdk5中和活性的纳米抗体的筛选：分别将筛选出的N.1、N.2和N.3的纳米抗体对应甘油菌株接种于5ml Amp抗性的LB培养基，37℃振荡培养10h后转接到500ml Amp抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时加入IPTG(终浓度0.4mM)诱导表达，15℃振荡培养过夜。次日，对上述3株纳米抗体进行纯化。
Cdk5纳米抗体的亲和性：用5ug/ml得Cdk5包被ELISA板；经BSA封闭后将纯化稀释后的Cdk5纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释到5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.3125ug/ml，进行ELISA鉴定。
结果：
ELISA筛选结果
通过间接ELISA方法检测192个单克隆对应的噬菌体上清同Cdk5蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了20个单克隆，这些单克隆均同Cdk5蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱(表11)。将20个单克隆的培养菌液送测序公司测序。
表11 Cdk5单克隆ELISA筛选结果
Figure BDA0001953173730000241
Figure BDA0001953173730000251
经ELISA筛选后，选择阳性最强的三个克隆进行测序，经测序并预测的氨基酸序列为：
N.1.(SEQ OD No.1)氨基酸序列：
SCSSWSPGEAWCSLGGLDSPVQPLDLPSETMTAGSARLQERGPSGSQLLILVVVAHTMQTPRADSPSPETTPRTRCICKTAHLRTRPCITVREEERLIMAMTTGARGPRSPSPQRTTAKTPAP；
N.2.(SEQ OD No.10)氨基酸序列：
SCSSWSPVEAWCSLGGLDSPVQARDSLMVMIPAGSARPQARSVRGSHVAQVILTHTIQTPRADSPCPETNPRTRYICKTPNLRTQASITVRRIMSLFSRLQRRCVSICCLTTQAGGPRSSSRQRTTAKTPAP；
N.3.(SEQ OD No.11)氨基酸序列：
SCSSWSPAEAWCSPGGLDSPVQPRDSLWIHMPAGSARPQGRSVRGSHVLVLVVVVQAMQTPRADSPSPETTPSTRCICKTANLRTQLSITVQPILITLLLFRLCVPQGQMTTGARGRRSPSPQRTTAKTPAP。
Cdk5纳米抗体亲和性检测：
将上述三个克隆进行表达后，亲和性检测结果为：Cdk5纳米抗体N.1对Cdk5蛋白的灵敏度为0.3125ug/ml；Cdk5纳米抗体N.3对Cdk5蛋白的灵敏度为0.625ug/ml；Cdk5纳米抗体N.2对Cdk5蛋白的灵敏度不如N.1和N.3，只有5ug/ml。
由以上实施例可知，本发明提供的Cdk5纳米抗体能够特异性结合Cdk5蛋白，对该蛋白的灵敏度为0.3125ug/ml。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种Cdk5纳米抗体和筛选方法
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Cys Ser Ser Trp Ser Pro Gly Glu Ala Trp Cys Ser Leu Gly Gly
1 5 10 15
Leu Asp Ser Pro Val Gln Pro Leu Asp Leu Pro Ser Glu Thr Met Thr
20 25 30
Ala Gly Ser Ala Arg Leu Gln Glu Arg Gly Pro Ser Gly Ser Gln Leu
35 40 45
Leu Ile Leu Val Val Val Ala His Thr Met Gln Thr Pro Arg Ala Asp
50 55 60
Ser Pro Ser Pro Glu Thr Thr Pro Arg Thr Arg Cys Ile Cys Lys Thr
65 70 75 80
Ala His Leu Arg Thr Arg Pro Cys Ile Thr Val Arg Glu Glu Glu Arg
85 90 95
Leu Ile Met Ala Met Thr Thr Gly Ala Arg Gly Pro Arg Ser Pro Ser
100 105 110
Pro Gln Arg Thr Thr Ala Lys Thr Pro Ala Pro
115 120
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagctagca gttgcagctc gtggagtccg 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgagctctgg agctggggtc ttcgc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcctggctg ctcttctaca agg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttctattac taggcccagc cggccagktg cagctcgtgg agtcnggngg 50
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaccgttgg ccataatggc ctggagctgg ggtcttcgct gtggt 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgaggatcc agttgcagct cgtggagtcc g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctgagtcga ctggagctgg ggtcttcgc 29
<210> 10
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ser Cys Ser Ser Trp Ser Pro Val Glu Ala Trp Cys Ser Leu Gly Gly
1 5 10 15
Leu Asp Ser Pro Val Gln Ala Arg Asp Ser Leu Met Val Met Ile Pro
20 25 30
Ala Gly Ser Ala Arg Pro Gln Ala Arg Ser Val Arg Gly Ser His Val
35 40 45
Ala Gln Val Ile Leu Thr His Thr Ile Gln Thr Pro Arg Ala Asp Ser
50 55 60
Pro Cys Pro Glu Thr Asn Pro Arg Thr Arg Tyr Ile Cys Lys Thr Pro
65 70 75 80
Asn Leu Arg Thr Gln Ala Ser Ile Thr Val Arg Arg Ile Met Ser Leu
85 90 95
Phe Ser Arg Leu Gln Arg Arg Cys Val Ser Ile Cys Cys Leu Thr Thr
100 105 110
Gln Ala Gly Gly Pro Arg Ser Ser Ser Arg Gln Arg Thr Thr Ala Lys
115 120 125
Thr Pro Ala Pro
130
<210> 11
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ser Cys Ser Ser Trp Ser Pro Ala Glu Ala Trp Cys Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Leu Asp Ser Pro Val Gln Pro Arg Asp Ser Leu Trp Ile His Met Pro
20 25 30
Ala Gly Ser Ala Arg Pro Gln Gly Arg Ser Val Arg Gly Ser His Val
35 40 45
Leu Val Leu Val Val Val Val Gln Ala Met Gln Thr Pro Arg Ala Asp
50 55 60
Ser Pro Ser Pro Glu Thr Thr Pro Ser Thr Arg Cys Ile Cys Lys Thr
65 70 75 80
Ala Asn Leu Arg Thr Gln Leu Ser Ile Thr Val Gln Pro Ile Leu Ile
85 90 95
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Leu Cys Val Pro Gln Gly Gln Met Thr Thr
100 105 110
Gly Ala Arg Gly Arg Arg Ser Pro Ser Pro Gln Arg Thr Thr Ala Lys
115 120 125
Thr Pro Ala Pro
130
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asn Gly His Ala Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Cys Leu Ser Asn
35 40 45
Ser Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Asn Asp Lys Asp Met Met Tyr Leu Arg Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Ala Asp Val Leu
85 90 95
Arg Gln Ala Cys Arg Leu Asp Val Thr Tyr Pro Phe Arg Gly Lys Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Val Ser Gly Ser Ile Asp Ser Phe Phe Tyr Met Ala Trp His
20 25 30
Arg Gln Val Pro Gly Lys Arg Arg Glu Ser Val Ala Ser Ile Ser Thr
35 40 45
Ser Gly Val Ile Ser Tyr Gln Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Thr Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Ser Asp Ile
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Asp His Trp Gly Lys Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ala
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<210> 14
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Val Ser Gly Gly Arg Phe Lys Ile Tyr Arg Met Asp Trp Tyr
20 25 30
Arg Arg Val Glu Gly Gly Gln Arg Glu Leu Val Ala Ser Ile Ser Asp
35 40 45
Gly Tyr Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Tyr Asn Ala Gly Asn Thr Leu Pro Leu Gln Met Asn Asn Leu
65 70 75 80
Glu Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala Asp Glu Arg Glu
85 90 95
Ser Asp Thr Val Ile Lys Ser His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Pro
115
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Asp Glu Thr Ser Ser Arg Thr Leu Asp Tyr Tyr Lys Ile Gly Trp
20 25 30
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Thr Glu
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Ser Asn Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Val Ser Arg Asp Ile Ala Glu Asn Lys Val Tyr Leu Gln Met Lys
65 70 75 80
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Leu
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Glu Val Phe Arg Arg Cys Ser Phe Val Ser Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Ser Gly Gly Gly Asp Met Gln Pro Gly Glu Ala Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Tyr Ala Met Ser Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Ile Thr Ile Lys Thr
35 40 45
Ile Arg Ser His Thr Asn Tyr Ser His Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr
50 55 60
Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Arg Ile Asn Asp
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Asp Pro Pro
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Leu Pro Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Asn Tyr Ile Met Gly Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Asn
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Val Asn Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala Asn Ile Ile Leu
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Met Gly Glu Leu Asp Ser Gly Leu His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile His Arg
35 40 45
Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Gln Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Ile
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Val Ile Ala Ser Tyr Ile Leu Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Ser Gly Gly Asp Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asn Pro Met Asn Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Ala Ile His Ser
35 40 45
Gly Gly Asn Arg Thr Ser Tyr Ala Thr Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln Asp Pro Ala
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Gly Leu Ser Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ala Arg Tyr Ile Met Asn Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Tyr Glu Phe Val Ile Gly Pro Ser Gly
35 40 45
Asp Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
50 55 60
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Pro Gln Met Asn Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Ala Ala Thr Pro Glu
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Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr Ala Met Ser Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala Ala Ile Thr Ala
35 40 45
Asn Ala Asp Thr Ser Asn Tyr Ala His Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Trp Leu Gln Met Asn Leu
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Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Gly Thr Ser
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Thr Thr Glu His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ala Pro Ala Ser Trp Val Arg
20 25 30
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Thr Asp
35 40 45
Ser Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Thr Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu
65 70 75 80
Arg Pro Glu Asp Thr Asp Tyr Arg Leu Leu
85 90
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Tyr Tyr Ser Val Glu Trp Ser
20 25 30
Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ser Cys Ile Gly Pro
35 40 45
Ser Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Phe Leu Gln Met Asp Asn
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Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Arg Arg Ser Ala Gly
85 90 95
Ser Ser Cys Ser Gly Pro Phe Gly Ser Tyr Gly Leu Gly Ala Gln Val
100 105 110
Thr Val Thr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Lys Leu Ser
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Cys Val Val Ser Gly Gly Thr Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Cys Ile Ser Gly
35 40 45
Pro Arg Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
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Leu Asn Ser Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Arg Ser His Cys Gly
85 90 95
Asp Pro Lys Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Ala Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 25
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ala Leu Glu Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Trp
35 40 45
Ser Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gly Leu Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr
50 55 60
Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys
65 70 75 80
Ser Thr Val His Leu His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Ile Tyr Phe Cys Ala Ala Arg Ile Thr Ala Val Arg Gly Met Cys Leu
100 105 110
Met Asn Asp Arg Trp Phe Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
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Val Ser Ser
130
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<400> 26
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1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Asp Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asp Ile Asn Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Thr Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Gly
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Glu Tyr Ser Asp His Glu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<400> 27
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Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp His
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Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Thr Ser
35 40 45
Leu Glu Thr Gly Thr Ala Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
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Leu Lys Leu Asp Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Arg Ala Arg Thr Arg
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Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Tyr Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Val Val Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ser Ser Ala Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Lys Ser
35 40 45
Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Tyr Ala Met Gly Trp Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val His Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ala Phe Tyr Ser Met Gly Trp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Gln Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Arg Met Arg Trp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro Gly Ser Ile Leu Arg Leu Ser
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Cys Glu Ala Ser Gly Ser Arg Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp Leu Ser Cys Ile Arg Pro
35 40 45
Ala Asp Ser Met Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
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Thr Gln Val Thr Val Ser Pro
115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ser Ala Ser Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Ile Arg Glu Met Gly
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100 105 110
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115
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser
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Cys Val Val Ser Gly Asp Asp Phe Ser Phe Tyr Ala Met Ala Trp Tyr
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Ser Gly Gly Gly Gln Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Ala Ala Ser Gly Pro Gly Phe Asp Asp Ser Gly Leu Gly Trp Phe
20 25 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
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<212> PRT
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<400> 50
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Cys Ala Ala Ser Gly Ile His Phe Ser Phe Tyr Arg Met Ser Trp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
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<400> 52
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Asn Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Val Ala Ser Gly Ile Ala Ala Ser Thr Ser Thr Ile Ala Trp Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
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Thr Gly Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
65 70 75 80
Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Ile Tyr Glu Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Arg Phe Leu Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 55
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Val Leu Val Ala Ala Ile Thr Ser
35 40 45
Arg Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Ser Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asn Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Asn Ala Arg Ala Gly
85 90 95
Ala Gly Val Thr Val Gly Pro Asp Gln Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Asn Met Gln Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Val Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Arg Glu Ala Val Ala Cys Ile Ser Ser
35 40 45
Thr Asp Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Lys
65 70 75 80
Val Glu Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Ala Ala Asp Leu Trp
85 90 95
Gly Ser Cys Gly Val Trp Thr Pro Glu Gly Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ile Ala Ser Gly Thr Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Ala Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Gly Thr
35 40 45
Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Asp Lys Ser Thr Met Tyr Leu Gln Ser Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Gln Gly Tyr Tyr Ala
85 90 95
Ser Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val
100 105 110
Ile Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Asp Ser Ile Asn His Met Gly Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Val Gln Asn Leu Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Gly Cys Ser Gly Tyr
85 90 95
Val Cys Leu Pro Asp Gly Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Pro
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asn Leu Asp Phe His Asp Val Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Gly Cys Ile Ser Tyr
35 40 45
Arg Gly Lys Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Val Phe Arg Asp Asp Ala Lys Thr Thr Val Phe Leu Gln Met Asn Val
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala Ala Pro Arg
85 90 95
Arg Leu Phe Gln Asn Cys Glu Leu Gly Thr Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (1)

1.一种Cdk5纳米抗体，其特征在于，所述Cdk5纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
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