CN114106168B

CN114106168B - 特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN114106168B
Application number: CN202111533949.4A
Authority: CN
Inventors: 王妍入; 张瑶; 季艳伟; 郭兵; 王建龙
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN114106168A

Abstract

本发明提供了特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用，属于分子生物学领域和免疫分析技术领域。所述纳米抗体具有依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。所述纳米抗体稳定性强、表达速度快、产量高、特异性好，与金黄色葡萄球菌没有交叉反应；使用所述纳米抗体建立的噬菌体介导的双纳米抗体夹心酶联免疫分析方法的检测灵敏度为5.08×10⁴CFU/mL；可以解决现有的检测方法特异性差、成本较高的问题，使噬菌体介导的双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法得到更广泛应用。

Description

特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域和免疫分析技术领域，具体涉及特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用。

背景技术

阪崎肠杆菌是一种重要的食源性病原体，于婴幼儿而言，容易引起败血症、脑膜炎等，并且会导致神经系统的后遗症甚至迅速死亡；于成年人而言，感染阪崎肠杆菌会引发脓血症、菌血症以及局部感染，它的感染会导致较高的发病率和死亡率。据统计，因阪崎肠杆菌感染而导致死亡的概率高达50％。奶粉是感染阪崎肠杆菌的主要渠道，多发于婴幼儿，由于奶粉等大多数食品生产过程繁琐，每个环节都可能发生微生物污染，所以需要在食品生产、加工、分配等所有环节中进行微生物的监测，确保食品安全性。

阪崎肠杆菌的检测方法主要有传统微生物检测方法、分子学检测方法和免疫学检测方法。传统的微生物检测方法准确性和特异性不高，容易导致结果假阳性和假阴性。分子学检测方法包括单一PCR检测、多重PCR检测、荧光定量PCR检测和LAMP等温核酸扩增。由于阪琦肠杆菌遗传的复杂性，普通的PCR鉴定也会存在一些假阳性，假阴性等问题，多重PCR检测方法可以大大降低单一PCR的假阳性或假阴性几率。LAMP等温核酸扩增检测方法的灵敏度很高，能达到9.1fg/μL，但由于其对检测成本、操作技术和引物设计的要求较高(需要设计添加4-6条引物)，增加了引物设计的难度，多对引物的设计还会增加引物二聚体产生的风险，容易出现假阳性，因此应用LAMP检测方法还具有极大的局限性。免疫学检测方法是基于抗原抗体的特异性反应对食品微生物进行鉴定，以阪崎肠杆菌的检测为例，制备阪崎肠杆菌的特异性抗体，通过抗体与抗原的特异性结合实现阪崎肠杆菌的检测。抗体作为免疫分析方法中的核心元件，对抗原的特异性识别以及检测方法的灵敏度起着关键作用。目前的阪崎肠杆菌免疫检测方法主要基于多克隆抗体和单克隆抗体，传统的抗体制备技术往往需要大量动物，制备周期长，产量低，成本高。所以需要建立一种比传统方法速度更快、更方便、更灵敏的检测方法。

纳米抗体作为一种缺乏轻链只含有重链的抗体，分子量只有17kDa左右，是常规抗体的十分之一，是目前已知的和抗原结合的最小单位。纳米抗体具有生产成本低、体积小、稳定性好、免疫原性弱、组织渗透性强、表达产量高、纯化简单等优势。而目前还未见有与抗阪崎肠杆菌的纳米抗体相关的报道。

发明内容

阪崎肠杆菌单克隆抗体或多克隆抗体均存在稳定性差、容易和金黄色葡萄球菌的表面蛋白结合的缺陷，本发明针对现有技术的缺陷和技术领域空白区提供了一种特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体，并将该纳米抗体应用于检测阪崎肠杆菌的试剂盒中。

为了实现上述目的，本发明提供的特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述纳米抗体还包括框架区FR1、FR2、FR3、FR4，四个框架区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4～SEQ ID No.7所示。

优选的，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

优选的，所述纳米抗体是采用噬菌体展示法从所述纳米抗体的基因文库中筛选获得。所述基因文库的容量为1×10⁷CFU/mL，插入率达100％。

本发明利用噬菌体展示方法从阪崎肠杆菌纳米抗体基因文库中筛选阪崎肠杆菌纳米抗体，主要流程是：利用辅助噬菌体构建成功的噬菌体展示纳米抗体，即将阪崎肠杆菌纳米抗体基因展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过吸附–洗脱的方法进行三到四轮淘选，筛选出与阪崎肠杆菌特异性结合的阳性孔，然后用阪崎肠杆菌作为抗原，采用间接ELISA法对筛选出的阳性孔培养液进行阳性克隆鉴定，选择灵敏度较高的克隆，再次扩增出噬菌体展示的阪崎肠杆菌纳米抗体。

优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体上含有如SEQ ID No.9所示的基因的核苷酸序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组载体。

本发明最后还提供了所述特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体、编码所述纳米抗体的基因、包含所述基因核苷酸序列的重组载体、包含所述重组载体的宿主细胞在特异性识别阪崎肠杆菌的检测试剂盒中的应用。

本发明利用上述纳米抗体为检测试剂，建立了一种噬菌体介导的双纳米抗体的阪崎肠杆菌夹心ELISA分析方法，选取阪崎肠杆菌纳米抗体作为捕获抗体，噬菌体展示的阪崎肠杆菌纳米抗体作为检测抗体进行噬菌体介导的双抗体夹心酶联免疫分析法检测阪崎肠杆菌；检测灵敏度为5.08×10⁴CFU/mL，可应用于各种乳制品及其他食品的检测中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明克服了单克隆抗体及多克隆抗体存在稳定性差、容易和金黄色葡萄球菌的表面蛋白结合的缺陷，提供了一种能够特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体。所述纳米抗体由于具有较小的分子量，能识别大分子抗原识别不到的位点，对阪崎肠杆菌具有较强的特异性结合能力，与金黄色葡萄球菌没有交叉反应；

(2)所述纳米抗体的制备过程可重复性好、稳定性好、表达速度快、产量高；

(3)将本发明制备的纳米抗体应用于检测阪崎肠杆菌的试剂盒中，检测灵敏度为5.08×10⁴CFU/mL；可以解决现有的检测方法特异性差、成本较高的问题，使噬菌体介导的双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法得到更广泛应用；

(4)本发明尽可能地避免了传统抗体的使用，减少了动物的牺牲，符合动物福利的趋势。

附图说明

图1为本发明实施例第一轮PCR扩增VHH基因电泳鉴定图；

图2为本发明实施例第二轮PCR扩增VHH基因电泳鉴定图；

图3为本发明实施例VHH与载体连接基因电泳鉴定图；

图4为本发明实施例淘选的阳性克隆鉴定ELISA结果；

图5为本发明实施例中抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的SDS-PAGE电泳图；

图6为本发明实施例中抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的热稳定性分析；

图7为本发明实施例中抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的特异性分析；

图8为本发明实施例中抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2检测阪崎肠杆菌的标准曲线。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

本发明所使用的一些术语具有如下含义：

转化：指基因工程中将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种手段。

纳米抗体：又称为单域重链抗体，VHH抗体(variable domain of heavy chain ofheavy-chain antibody)，是指天然缺失轻链的重链抗体的可变区片段，分子量只有常规抗体的十分之一。

噬菌体展示抗体：在辅助噬菌体的救援下，表达展示在噬菌体衣壳蛋白上的目标抗体。

本发明实施例中所使用的各种试剂和仪器来源如下表1：

表1本发明实施例中主要试剂和仪器采购来源

弗式完全佐剂、弗式不完全佐剂、牛血清白蛋白(BSA)	美国sigama公司
		辅助噬菌体M13KO7	美国Invitrogen公司
胰蛋白胨、酵母提取物	英国Oxoid公司
		Ex taq DNA聚合酶、FastDigest Sfi1、T4 DNA连接酶	宝日医生物技术(北京)有限公司
RNA提取试剂盒	宝日医生物技术(北京)有限公司
		琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒	天根生化科技(北京)有限公司
Anti-phage M13抗体(HRP)	北京义翘神州科技股份有限公司
		Anti-HA tag抗体(HRP)	艾博抗(上海)贸易有限公司
吐温-20、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)	北京索莱宝科技有限公司
		脱脂奶粉	上海BBI生命科学有限公司
3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)	上海阿拉丁生化科技股份有限公司
		电转化杯(间隙0.1cm)	美国Bio-Rad公司

本发明实施例中所使用的各种菌种的采购来源见表2：

表2本发明实施例所使用的各种菌种的采购来源

本发明中所使用的培养基、缓冲液及其他主要试剂的配制方法如下：

SB液体培养基：分别称取3g胰蛋白胨、2g酵母提取物、1g 3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)溶于100mL蒸馏水中，高温高压蒸汽灭菌。

PBS缓冲液：分别称取14.1g Na₂HPO₄·12H₂O，2g KH₂PO₄，80g NaCl，2g KCl溶于1L超纯水中，用盐酸调节pH值至7.4，稀释10倍后于室温储存。

3％脱脂奶粉：称取3g脱脂奶粉，溶于100mL PBS缓冲液中，现用现配。

柠檬酸缓冲液：分别称取1.87g柠檬酸，3.68gNa₂HPO₄·12H₂O，溶于180mL蒸馏水中，充分混匀后定容至200mL，4℃储存。

TMB溶液：称取0.1g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，溶于50mL无水乙醇中，4℃避光保存。

TMB底物显色液：取9.5mL柠檬酸缓冲液，500μL TMB溶液以及3.2μL 3v/v％的双氧水溶液充分混匀，现用现配。

PBST缓冲液：取PBS缓冲液于1L容量瓶中定容，加入500μL吐温-20，超声10min混匀，置于常温保存待用。

PEG-NaCl溶液：分别称取250g PEG-8000和146.1g NaCl，溶解至900mL蒸馏水中，用蒸馏水定容至1L，高温高压蒸汽灭菌，趁热摇匀溶液，并于室温储存。

Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris base，溶解于90mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至8.5，定容至100mL，即可得到1mol/L的Tris-HCl缓冲液，高温高压蒸汽灭菌后分装为1mL/管，置于4℃储存。

实施例

1、抗阪崎肠杆菌噬菌体展示纳米抗体文库的构建

1.1骆驼的免疫：

选取一只身体健康的、未经免疫任何抗原的骆驼，将1mL浓度为10⁸CFU/mL的阪崎肠杆菌灭活全菌、0.1mL 2mg/mL的脂多糖、0.1mL 2mg/mL的鞭毛蛋白和0.1mL2mg/mL的超声破碎全蛋白四种抗原混合均匀后与1.3mL弗式完全佐剂混合，用得到的乳化混合物对双峰驼进行初免，之后的免疫采用弗氏不完全佐剂对抗原乳化，每隔两周加强免疫1次，共免疫5次。每次免疫后一周收集骆驼血液，检测血清中的抗体效价。

1.2血液总RNA的提取：

第五次免疫后，取骆驼外周血，按照RNA提取试剂盒的操作步骤提取总RNA。

1.3反转录获得cDNA：

以获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物进行反转录，合成cDNA第一链，获得cDNA文库。

1.4纳米抗体(VHH)基因片段的扩增：

以合成的cDNA为模板，CALL001和CALL002为引物，进行第一轮PCR扩增。

反应体系如下：

10×Ex taq Buffer，5μL；

50mM MgSO₄，2μL；

10mM dNTP，1μL；

10mM CALL001引物，1μL；

10mM CALL002引物，1μL；

Ex taq DNA聚合酶，0.1μL；

cDNA模板，2μL；

ddH₂O补至总体系，50μL；

将上述反应体系涡旋混匀，进行第一轮PCR扩增反应，PCR条件为：

94℃预变性2min，随后按照94℃30s，55℃30s，72℃1min的条件进行20次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。

第一轮PCR扩增VHH的正向引物CALL001(见SEQ ID No.10)为：

5’-gtcctggctgctcttctacaagg-3’；

反向引物CALL002(见SEQ ID No.11)为：

5’-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3’；

PCR产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收700bp大小的DNA片段，为第一轮PCR扩增VHH基因，具体的电泳鉴定图见图1，电泳鉴定平行测定两次。图1中M孔道表示DL2000的DNA marker，1孔道表示第一轮PCR扩增VHH基因产物第一次电泳鉴定结果；2孔道表示第一轮PCR扩增VHH基因产物第二次电泳鉴定结果；3孔道表示空白对照的结果；空白对照为将PCR体系中cDNA模板用等体积无酶水代替所得到的产物。

以第一轮PCR扩增VHH基因产物为模板，CAM-FOR和CAM-BACK为引物，进行第二轮PCR扩增。

反应体系如下：

10×Ex taq Buffer，5μL；

50mM MgSO₄，2μL；

10mM dNTP，1μL；

10mM CAM-FOR引物，1μL；

10mM CAM-BACK引物，1μL；

Ex taq DNA聚合酶，0.1μL；

cDNA模板，2μL；

ddH₂O补至总体系，50μL；

将上述反应体系涡旋混匀，进行第二轮PCR扩增反应，PCR条件为：

第二轮PCR扩增VHH的正向引物CAM-FOR(见SEQ ID No.12)为：

CAM-FOR：5’-ggcccaggcggccgagtctggrggagg-3’；

反向引物CAM-BACK(见SEQ ID No.13)为：

CAM-BACK：5’-ggccggcctggccggagacggtgaccagggt-3’；

PCR产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用普通DNA产物纯化试剂盒纯化回收400bp大小的DNA片段，即为VHH片段，具体的电泳图见图2，电泳鉴定平行测定两次。图2中M孔道表示DL2000 DNA marker，1孔道表示第二轮PCR扩增VHH基因产物第一次电泳鉴定结果；2孔道表示第二轮PCR扩增VHH基因产物第二次电泳鉴定结果。

1.5载体的构建

酶切处理pComb3x-ss载体，按照如下体系配制反应液：

pComb3x-ss载体，1μL；

FastDigest Sfi1，2μL；

10×Buffer G，2μL；

ddH₂O补至总体系，20μL；

酶切处理VHH，按照如下体系配制反应液：

PCR reaction mixture，10μL；

10×Buffer G，2μL；

FastDigest Sfi1，2μL；

ddH₂O补至总体系，30μL；

酶切产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收3400bp大小的载体片段。

VHH基因与双酶切处理的pComb3x-ss载体的连接，按照如下体系进行In-Fusion连接：

酶切后的pComb3x-ss载体，140ng；

VHH基因，49.5ng；

10×buffer，2μL；

T4 DNA连接酶，1μL；

ddH₂O补至总体系，20μL；

上述反应体系在16℃过夜反应16h，连接产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用普通DNA产物纯化试剂盒进行回收，置于-20℃保存待用。电泳鉴定图见图3，图3中M孔道表示DL5000 DNA marker；1孔道表示pComb3x-ss载体；2孔道表示酶切后的pComb3x-ss载体；3孔道表示pComb3x-ss载体自连的产物(不加插入片段，其他与正常连接体系相同)；4孔道表示VHH基因与双酶切处理的pComb3x-ss载体连接的产物。

1.6连接产物的电转化

将E.coli ER2738感受态细胞置于冰上融化，做十组电转化。每组加入3μL连接产物到50μL ER2738感受态细胞中，轻轻混匀后迅速转移到预冷的电转杯中，放在Bio-rad电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8kV，200Ω，25μF。电转化后立即在电转化杯中加入1mL 37℃预热的SOC液体培养基，吹打后转移至一干净的灭菌的1.5mL摇菌管中。将十组电转化后的菌液混合，于37℃缓慢振摇复苏1h。

1.7抗阪崎肠杆菌噬菌体展示纳米抗体文库的构建

将复苏后的菌液全部转入200mL SB培养基中，于37℃和250rpm离心速度下振摇至OD₆₀₀值为0.5时，加入1mL滴度为1×10¹¹pfu的辅助噬菌体M13KO7，于37℃静置1h后，加入卡那霉素至卡那霉素的终浓度为70μg/mL，并振摇过夜。次日，将过夜菌于4℃和10000rpm速度下离心15min，将上清转移至无菌的离心瓶中，加入上清液1/5体积的PEG/NaCl溶液，于冰上静置5-6h后，在4℃和10000rpm速度下离心30min，用10mL无菌的含0.5m/v％BSA的PBS缓冲液重悬沉淀，溶解沉淀得到扩增后的抗阪崎肠杆菌噬菌体展示纳米抗体文库。

2、抗阪崎肠杆菌纳米抗体的淘选与鉴定

2.1抗阪崎肠杆菌纳米抗体的淘选：

以10⁸CFU/mL灭活的阪崎肠杆菌为包被原，按100μL/孔包被在酶标板上，于4℃包被过夜，用PBST缓冲液洗板3次；按300μL/孔加入3％脱脂奶粉，于37℃封闭1h，用PBST缓冲液洗涤酶标板3次；按100μL/孔加入噬菌体展示纳米抗体文库，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗涤酶标板6次；按100μL/孔加入甘氨酸溶液(pH＝2.2)洗脱，然后立即加入Tris-HCl缓冲液中和洗脱的噬菌体。取10μL洗脱的噬菌体测定滴度，剩余的用于侵染培养至对数期的ER2738菌株进行扩增，扩增后的噬菌体立即用于后续淘选。共进行4轮淘选，后续三轮淘选过程与第一轮淘选过程相同。第四轮淘选结束后，取10μL噬菌体测定滴度，次日，在平板上随机挑取50个克隆进行噬菌体扩增，扩增的噬菌体采用间接ELISA进行阳性克隆鉴定。

2.2抗阪崎肠杆菌纳米抗体的鉴定：

通过间接ELISA对淘选的噬菌体展示纳米抗体进行阳性克隆鉴定，具体操作为：

(1)以10⁸CFU/mL灭活的阪崎肠杆菌为包被原，按照100μL/孔包被在酶标板上，在4℃下包被过夜，然后用PBST缓冲液洗涤酶标板3次，甩干；

(2)按300μL/孔加入3％脱脂奶粉，于37℃封闭1h，用PBST缓冲液洗涤酶标板3次，甩干；

(3)按100μL/孔加入噬菌体展示纳米抗体文库，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗涤酶标板6次，甩干；

(4)按100μL/孔加入Anti-phage M13抗体(HRP)，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗涤酶标板6次；

(5)按100μL/孔加入TMB底物显色液，于37℃下孵育15min；

(6)按50μL/孔加入2mol/L H₂SO₄终止反应。

(7)将酶标板置于酶标仪中读取450nm处各孔的OD值，结果如图4所示。计算P/N值，P/N值≥2.1的孔作为阳性孔进行测序分析，其中，P为阳性孔的OD值，N为空白对照组的OD值；空白对照组为用PBS缓冲液代替灭活阪崎肠杆菌包被酶标板。

通过间接ELISA筛选得到了能够和阪崎肠杆菌结合的阳性克隆，用Bioedit软件对测序结果进行分析，登录IMGT网站(www.http://www.imgt.org/)，对阳性克隆的基因序列进行分析，确定抗体序列的框架区和互补决定区。

3、抗阪崎肠杆菌纳米抗体的制备

3.1以噬菌体扩增的方式制备噬菌体展示的纳米抗体phage1

挑选E.coli ER2738感受态细胞于100mL SB培养液中，于37℃下以250rpm的速度震荡培养至OD₆₀₀为0.6；加入10μL淘选得到的噬菌体展示纳米抗体phage1；加入1mL辅助噬菌体M13KO7(感染复数为20:1)，37℃静置30min，于37℃下以250rpm的速度震荡培养过夜；次日，离心收集上清液，加入上清液1/5体积的PEG/NaCl溶液，颠倒混合均匀后沉淀噬菌体；离心收集沉淀，得到噬菌体展示的纳米抗体，留10μL用于滴度测定。

3.2以蛋白表达的方式制备可溶性的纳米抗体Es-Nb2

提取噬菌体展示纳米抗体phage2的质粒，热击转化至表达菌株TOP10F′中；次日，挑取平板上的单克隆进行扩大培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，于28℃和220rpm的速度下诱导表达10小时；次日，离心收集菌体沉淀，加入细胞裂解液，裂解细胞，收集可溶性蛋白，经过镍柱纯化，SDS-PAGE电泳鉴定对纳米抗体进行鉴定，结果见图5。图5中M孔道表示protein marker；1孔道表示抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2。用Nanodrop测纳米抗体浓度，通过计算可得该纳米抗体的产量为8.3mg每升培养基。

将纯化后的抗体送至西安热默尔生物科技有限公司进行测序，结果如下：

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的框架区FR2的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的框架区FR3的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的框架区FR4的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；

抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

4、抗阪崎肠杆菌纳米抗体热稳定性分析

以10⁸CFU/mL灭活的阪崎肠杆菌为包被原，按照100μL/孔包被在酶标板上，4℃下包被过夜，用的PBST缓冲液洗板3次；按300μL/孔加入3％脱脂奶粉，于37℃封闭1h，用PBST缓冲液洗板3次；按100μL/孔的量加入分别在20℃、37℃、40℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃下处理5min的纳米抗体溶液，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板6次；按100μL/孔加入Anti-HA tag抗体(HRP)，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板6次；按100μL/孔加入TMB底物显色液，孵育15min；最后按50μL/孔加入2mol/LH₂SO₄终止反应，将酶标板置于酶标仪中，读取各孔在450nm处的OD值以比较不同温度处理对纳米抗体活性的影响，结果如图6所示。从图6中可以看出，纳米抗体在20～95℃条件下仍能保持较好的和抗原结合的能力，证明纳米抗体有很好的热稳定性。

5、抗阪崎肠杆菌纳米抗体的特异性分析

利用噬菌体介导的双纳米抗体夹心方法，以阪崎肠杆菌和9种其他食源性致病菌为分析物，测定纳米抗体Es-Nb2与这10种食源性致病菌的结合能力。

以10μg/mL的抗阪崎肠杆菌纳米抗体为包被原，按照100μL/孔包被在酶标板上，于4℃包被过夜，用PBST缓冲液洗板3次；按300μL/孔加入3％脱脂奶粉，于37℃封闭1h，用PBST缓冲液洗板3次；按100μL/孔加入10⁸CFU/mL灭活的阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、化脓性球菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、福式志贺氏菌、哈达尔沙门氏菌，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板6次；按100μL/孔加入噬菌体展示的纳米抗体，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板10次；按100μL/孔加入Anti-phage M13抗体(HRP)，于37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板6次；按100μL/孔加入TMB底物显色液，孵育15min；按50μL/孔加入2mol/LH₂SO₄溶液终止反应，将酶标板置于酶标仪中，读取各孔在450nm处的OD值以判断纳米抗体的特异性，测定结果如图7所示。从图7中可以看出，纳米抗体Es-Nb2对其他食源性致病菌均不结合，与阪崎肠杆菌结合能力强。

6、建立噬菌体介导的双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法

根据筛选配对，选取抗阪崎肠杆菌纳米抗体Es-Nb2作为捕获抗体，噬菌体展示的纳米抗体phage1作为检测抗体进行双抗体夹心的酶联免疫分析法检测阪崎肠杆菌。

以10μg/mL的抗阪崎肠杆菌Es-Nb2为捕获抗体，按100μL/孔包被在酶标板上，于4℃包被过夜，用PBST缓冲液洗板3次；按300μL/孔加入3％脱脂奶粉，37℃封闭1h，用PBST缓冲液洗板3次；按100μL/孔加入梯度稀释的10⁴～10⁸CFU/mL灭活的阪崎肠杆菌，37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板6次；按100μL/孔加入噬菌体展示的纳米抗体phage1，37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板10次；按100μL/孔加入Anti-phage M13抗体(HRP)，37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板6次；按100μL/孔加入TMB底物显色液，孵育15min；按50μL/孔加入2mol/LH₂SO₄终止反应，将酶标板置于酶标仪中，读取各孔在450nm处的OD值以绘制标准曲线，标准曲线如图8所示。从图8中可以看出，该方法的检出限为5.08×10⁴CFU/mL。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Tyr Thr Asp Gly Tyr Tyr Cys Met Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Arg Phe Leu Val Gly Leu Gly Arg Cys Pro Gly Gly Asn Glu Tyr

1 5 10 15

Asn Phe

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala

20

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

1 5 10

<210> 6

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Lys Asn

1 5 10 15

Thr Leu Phe Leu Gln Met His Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Glu Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Gly Tyr Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met His Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Arg Phe Leu Val Gly Leu Gly Arg Cys Pro Gly Gly Asn

100 105 110

Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgcagc tcgtggagtc tggaggaggc tcggtggagg ctggagggtc tctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggata caccgacggt tactactgca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgagtg ggtcgcggct atttatactg gtggtggtac cacagcctat 180

gccgactccg tgaaggaccg attcaccatc tcccatgaca acgccaagaa tacgctgttt 240

ctgcaaatgc acggcctgaa acctgaggac actgccctgt actactgtgc ggccgatagg 300

ttcctagtag ggttgggtag gtgccccggt ggaaatgagt ataatttctg gggccagggg 360

accctggtca ccgtctcc 378

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcccaggcg gccgagtctg grggagg 27

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggccggcctg gccggagacg gtgaccaggg t 31

Claims

1.特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQID No.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括框架区FR1、FR2、FR3、FR4，四个框架区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4～SEQ ID No.7所示。

3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示。

4.一种编码权利要求3所述的纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体上含有权利要求4所述的基因的核苷酸序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞内含有权利要求5所述的重组载体。

7.权利要求1～3任一项所述的纳米抗体，或权利要求4所述的基因，或权利要求5所述的载体，或权利要求6所述的宿主细胞在制备特异性识别阪崎肠杆菌的检测试剂盒中的应用。