CN114106167B - 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用 - Google Patents

特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114106167B
CN114106167B CN202111407056.5A CN202111407056A CN114106167B CN 114106167 B CN114106167 B CN 114106167B CN 202111407056 A CN202111407056 A CN 202111407056A CN 114106167 B CN114106167 B CN 114106167B
Authority
CN
China
Prior art keywords
listeria monocytogenes
amino acid
acid sequence
nanobody
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111407056.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114106167A (zh
Inventor
王妍入
魏娟
王悦琦
季艳伟
郭兵
王建龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN202111407056.5A priority Critical patent/CN114106167B/zh
Publication of CN114106167A publication Critical patent/CN114106167A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114106167B publication Critical patent/CN114106167B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1296—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Listeria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:8所示，同时还提供了含有该纳米抗体核苷酸序列的载体和宿主细胞。本发明制备的单增李斯特菌纳米抗体表达产量高，生产成本相对较低，利于后续抗体的工业化生产且制备过程避免了传统抗体制备过程中动物的牺牲；本发明建立的检测单增李斯特菌的双纳米抗体ELISA分析方法减少了传统抗体的使用，灵敏度为3.55×105CFU/mL，可用于即食蔬菜、乳制品等的检测中，具有实际应用价值。

Description

特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其 应用
技术领域
本发明属于基因工程抗体技术领域，特别涉及特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用。
背景技术
单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌，LM)，广泛分布于自然环境中，能在冷藏温度下长时间存活，可以污染几乎所有种类的食物。它可以侵入性感染人类和动物，导致严重的李斯特菌病。因此，建立一种可靠的单增李斯特菌的检测方法相当重要。
目前已经建立了许多快速检测单增李斯特菌的方法，但在实际应用中其灵敏度和特异性仍有待提高。分子生物学技术，特别是聚合酶链反应(PCR)，具有较高的敏感性和特异性；然而，PCR技术必须由训练有素的技术人员进行，并且需要精密的仪器。目前基于抗原抗体特异性反应的免疫分析技术操作简便、特异性强，已广泛应用于单增李斯特菌的检测中。
近年来，抗体制备技术发展迅速，从传统的多克隆抗体和单克隆抗体发展到新的基因工程抗体。基因工程抗体相较于传统抗体而言，具有独特优势，其生产过程免于动物的牺牲，符合动物福利的趋势，且可以实现短周期内的大量生产，成本较低，对单增李斯特菌的低成本、大规模检测有重要应用价值。纳米抗体(又称为单域重链抗体，VHH抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)作为一种新型基因工程抗体，是采用分子生物学手段，获得的存在于骆驼、鲨鱼等动物体内的天然重链抗体可变区片段。纳米抗体不仅拥有上述基因工程抗体的优势，而且分子量小，渗透性强，应用前景广阔。
目前关于单增李斯特菌检测的技术中，中国发明专利CN201310430861.9和CN201310430970.0公布了两种针对单增李斯特菌的单域重链抗体L5-78和L5-79，但所报道的基于此单域重链抗体的免疫检测方法仍需与传统单克隆抗体联用，没有充分利用单域重链抗体即纳米抗体的优势。而且，已公布的两种单域重链抗体淘选自未经免疫的天然抗体噬菌体展示文库，天然抗体噬菌体展示文库靶标富集度低，故特异性有限，淘选难度大；想要淘得特异性良好的抗体需要构建库容量足够高的文库，技术要求高。Aiping Liu等报道了一种基于定向单链Fv抗体片段(scFv)和多克隆抗体检测单增李斯特菌的夹心酶联免疫方法。相同的，此方法仍需与传统多克隆抗体联用。而且从scFv文库中获取抗单增李斯特菌抗体的随机性大、难度高；并且未公布此单链Fv抗体片段的氨基酸序列。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供特异性强、多样性好的免疫双峰驼单增李斯特菌纳米抗体文库，进而获得能特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，以此降低对文库库容量的高要求；本发明提供的纳米抗体具备良好识别、结合能力，还提供含有该抗体基因序列的载体、宿主细胞，以及利用该纳米抗体的单增李斯特菌夹心ELISA分析方法，应用在单增李斯特菌的检测技术中，具体通过以下技术实现。
特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体的氨基酸序列包括氨基酸序列框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及氨基酸序列互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
氨基酸序列框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列框架区FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；氨基酸序列框架区FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；氨基酸序列框架区FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
氨基酸序列互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；氨基酸序列互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；氨基酸序列互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
优选地，上述特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选地，编码上述纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。可以根据所提供的核苷酸序列通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽，这些表达系统包括细菌，酵母菌，真菌，动物细胞，植物细胞等。
优选地，所述纳米抗体采用噬菌体展示方法从所述纳米抗体的基因文库中筛选。文库库容量约为1×107CFU/mL，文库插入率达100％。
噬菌体展示方法从单增李斯特菌纳米抗体基因文库中筛选单增李斯特菌纳米抗体，主要流程是：辅助噬菌体拯救构建成功的单增李斯特菌纳米抗体基因文库为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过吸附–洗脱的方法进行淘选，筛选出与单增李斯特菌特异性结合的阳性孔，然后用单增李斯特菌作为抗原，采用间接ELISA法对筛选出的阳性孔培养液进行鉴定，选择灵敏度较高的克隆，再次救援扩增出噬菌体展示的单增李斯特菌纳米抗体。
优选地，所述纳米抗体的基因文库的构建方法包括以下步骤：
S1、提取经单增李斯特菌抗原免疫后的双峰驼血液淋巴细胞中的RNA，反转录得到cDNA；
S2、以所得cDNA为模板，设计特异性引物，经巢式PCR特异性扩增出双峰驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因；
S3、Fast Digest Sfi I酶作用pCombSS-his载体，得到含有Sfi I粘性末端的长度分别为3400bp和1600bp的两个片段，回收纯化3400bp片段；
S4、Fast Digest Sfi I酶作用所得的VHH基因使其拥有Sfi I粘性末端，用T4 DNA连接酶将所得3400bp片段与含有Sfi I粘性末端的VHH基因连接，所得连接产物转化入感受态细胞中，即得到所述纳米抗体的基因文库。
本发明建立了特异性强和多样性好的免疫双峰驼单增李斯特菌纳米抗体基因文库，利于淘选获得强特异性的纳米抗体，降低了对文库高库容量的要求，采用噬菌体展示方法从单增李斯特菌纳米抗体基因文库中筛选上述单增李斯特菌纳米抗体，本发明提供的纳米抗体，特异性好、稳定性强、表达产量高，可以实现短周期内的大量生产，成本较低，利于后续抗体的工业化生产且制备过程避免了传统抗体制备过程中动物的牺牲。
本发明建立的检测单增李斯特菌的双纳米抗体ELISA分析方法减少了传统抗体的使用，检测结果较好，解决现有的检测方法特异性差、成本较高的问题。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体上含有上述编码纳米抗体的核苷酸序列。载体能在辅助噬菌体的辅助下将上述单增李斯特菌纳米抗体基因救援为展示在噬菌体衣壳蛋白表面的形式。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有上述的重组载体。宿主细胞能通过代谢表达出上述单增李斯特菌纳米抗体。
本发明还提供了上述纳米抗体的应用方法，即特异识别单增李斯特菌的检测试剂盒，含有上述特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，或含有上述的重组载体，或含有上述的宿主细胞。
例如，利用上述纳米抗体为检测试剂，建立了一种双纳米抗体的单增李斯特菌夹心ELISA分析方法，选取单增李斯特菌纳米抗体作为捕获抗体，噬菌体展示纳米抗体作为检测抗体进行双抗体夹心酶联免疫分析法检测单增李斯特菌。该试剂盒检测灵敏度为3.55×105CFU/mL，建立的检测单增李斯特菌的双纳米抗体ELISA分析方法减少了传统抗体的使用，可用于即食蔬菜、乳制品等的检测中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明制备了一种特异性识别单增李斯特菌的纳米抗体和含有该抗体基因序列的载体、宿主细胞；制备的抗单增李斯特菌纳米抗体，可以实现短周期内的大量生产，成本较低，稳定性强。
(2)本发明建立的基于双纳米抗体的单增李斯特菌夹心ELISA分析方法充分利用了纳米抗体的优势，尽可能地避免了传统抗体的使用，减少了动物的牺牲，符合动物福利的趋势。
附图说明
图1为免疫双峰驼单增李斯特菌纳米抗体库部分核苷酸编码氨基酸序列图(图中短横线代表Bioedit软件为了比较序列相似度所自动补充的空位置)；
图2为巢式PCR第一步产物的电泳鉴定图；
图3为巢式PCR第二步产物的电泳鉴定图；
图4为载体酶切产物的电泳鉴定图；
图5为抗单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的SDS-PAGE电泳图；
图6为鉴定阳性克隆的ELISA结果图；
图7为抗噬菌体展示纳米抗体的特异性分析图；
图8为抗单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3检测单增李斯特菌的标准曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所叙述的一些术语具有如下含义：
转化：尤指基因工程中将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种手段。
纳米抗体：又称为单域重链抗体，VHH抗体(variable domain of heavy chain ofheavy-chain antibody)，是指天然缺失轻链的重链抗体的可变区片段，分子量只有常规抗体的十分之一。
噬菌体展示抗体：在辅助噬菌体的救援下，表达展示在噬菌体衣壳蛋白上的目标抗体。
实施例
1、免疫双峰驼单增李斯特菌纳米抗体文库的构建
通过提取经单增李斯特菌抗原免疫后的双峰驼血液淋巴细胞中的RNA；反转录得到cDNA；以所得cDNA为模板，设计特异性引物，经巢式PCR特异性扩增出双峰驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因。Fast Digest Sfi I酶作用pCombSS-his载体，得到含有Sfi I粘性末端的长度分别为3400bp和1600bp的两个片段，回收纯化3400bp片段；再用此酶作用所得的VHH基因，使其拥有Sfi I粘性末端。用T4 DNA连接酶将所得3400bp片段与含有Sfi I粘性末端的VHH基因连接。所得连接产物转化入感受态细胞中，即得到基因文库。文库库容量约为1×107CFU/mL，文库插入率达100％，文库所含部分核酸序列如附图1所示。
具体步骤如下：
(1)免疫双峰驼：
将等体积灭活的单增李斯特菌悬液(108CFU/mL)与弗氏完全佐剂充分乳化后皮下注射一只身体健康的3岁雄性双峰驼，此为初次免疫，之后的免疫将弗氏完全佐剂改为弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫1次，共免疫5次。每次免疫后1周，收集骆驼血液以检测血清中的抗体效价。
(2)提取血液中的mRNA：
第五次免疫后，取骆驼外周血，低速离心分离淋巴细胞后，按照RNA提取试剂盒的操作步骤提取总RNA。
(3)反转录获得cDNA：
以获得的总RNA为模板进行反转录，合成cDNA。
(4)纳米抗体基因片段的扩增：
以合成的cDNA为模板，CALL001和CALL002为引物，进行两轮PCR扩增。
反应体系如下：
PrimeSTARHS(PreMix) 25μL
10mMF引物 lμL
10mMR引物 lμL
cDNA模板 2μL
ddH2O 21μL
其中，巢式PCR第一步扩增程序为：98℃2min；98℃10s，60℃5s，72℃l min，扩增25个循环；72℃5min；第二步扩增反应次数为30次。
第一步PCR其正向引物CALL001(见SEQ ID NO:10)为：
5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’
反向引物CALL002(见SEQ ID NO:11)为：
5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’
第二步PCR其正向引物CAM-FOR(见SEQ ID NO:12)为：
5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGRGGAGG-3’
反向引物CAM-BACK(见SEQ ID NO:13)为：
5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCAGGGT-3’
一轮PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收试剂盒纯化回收700bp大小的DNA片段，具体的电泳鉴定图见附图2，其中M孔道表示DL2000的DNA marker，1孔道为一轮PCR产物；以回收后的700bp大小的DNA片段为模板，CAM-FOR和CAM-BACK为引物，进行第二轮PCR扩增后获得片段大小为400bp的DNA片段。具体的电泳鉴定图见附图3，其中图a中M孔道表示DL2000的DNA marker，1和2孔道均为二轮PCR产物。
(5)载体的构建：
Fast Digest Sfi I酶作用pCombSS-his载体，得到含有Sfi I粘性末端的长度分别为3400bp和1600bp的两个片段，其中
酶切反应体系如下：
pCombSS-his质粒 2μL
SfiI酶 lμL
10×Buffer 2μL
ddH2O 15μL
酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用PCR纯化试剂盒纯化回收3400bp大小的载体片段。载体酶切产物如附图4所示。
再将上述巢式PCR方法扩增获得的VHH基因经Fast Digest Sfi I酶处理，处理体系同上。
将Fast Digest Sfi I酶处理的VHH基因和3400bp大小的载体片段按照如下体系连接成环。体系如下：
3400bp的载体片段 1.4μg
VHH基因 495ng
10×Buffer 20μL
T4ligase 10μL
ddH2O 补足至200μL
16℃反应16h，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收连接产物，-20℃保存待用。
(6)连接产物的电转化
将E.coli ER2738感受态细胞置于冰上融化，向50μL感受态细胞中加入3μL上述连接产物，轻轻混匀后迅速转移到预冷的电转杯中，放在Bio-rad电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8kV，600Ω，10μF，电转化后立即在电转化杯中加入1mL预热的SOC液体培养基，吹打后转移至一干净的灭菌摇菌管中。如上所述，进行十次电转，将十次电转后的菌液混合，37℃缓慢振摇复苏1h。
将复苏后的菌液全部转入200mL SB培养基中，于37℃，250rpm振摇至OD600值为0.5时，加入1mL辅助噬菌体M13KO7(滴度为1×1011pfu)，37℃静置1h后，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并振摇过夜。次日，将过夜菌于4℃，10000rpm离心15min，将上清转移至无菌离心管中，加入1/5体积的PEG/NaCl，于冰上静置2h后，4℃，12000rpm离心30min，用10mL无菌的0.5％，BSA的PBS缓冲液重悬沉淀，溶解沉淀得到扩增后的噬菌体展示单增李斯特菌纳米抗体文库。
2、单增李斯特菌纳米抗体的淘选与鉴定
采用四轮“淘选-洗脱-扩增”固相淘选的方法，针对单增李斯特菌进行淘选，具体操作方法如下：
(1)包被：将浓度为108CFU/mL的单增李斯特菌悬液100μL/孔包被在酶标板，4℃过夜；
(2)洗涤：PBST洗涤酶标板三次，然后甩干；
(3)封闭：加入300μL/孔封闭液，37℃孵育2h；
(4)洗涤：同(2)；
(5)结合：向包被有封闭剂的孔中加入100μL/孔的扩增文库，37℃孵育2h；
(6)弃去噬菌体溶液，使用300μL/孔的0.05％PBST手动洗板10次；
(7)洗脱：加入100μL/孔的pH 2.2的Gly-HCl洗脱液，室温静置15min；
(8)中和：用移液器反复吹打几次后，将溶液收集至1.5m L离心管中，立即加入Tris-HCl中和液至溶液pH达到7。中和后的洗脱液立即用于下一轮扩增，取出10μL测滴度。
其中第一轮淘选不必去除非特异性吸附；2-4轮淘选分别改用3％BSA、2％OVA和3％脱脂奶粉作为封闭剂以去除非特异性吸附。
第四轮淘选结束后，取10μL噬菌体测定滴度，次日，在平板上随机挑取48个克隆，摇菌加入辅助噬菌体救援后获得扩增的噬菌体上清，采用间接ELISA进行阳性克隆鉴定。
鉴定的具体步骤如下：
(1)包被：将浓度为108CFU/mL的单增李斯特菌悬液100μL/孔包被在酶标板，4℃过夜；作为阴性对照，将无菌PBS相同地包被在酶标板中；
(2)洗涤：PBST洗涤酶标板三次，然后甩干；
(3)封闭：加入300μL/孔封闭液，37℃孵育2h；
(4)洗涤：同(2)；
(5)结合：向包被有封闭剂的孔中加入100μL/孔的扩增噬菌体上清，37℃孵育2h；
(6)弃去噬菌体溶液，使用300μL/孔的0.05％PBST手动洗板6次；
(7)加抗M13酶标二抗，100μL/孔，37℃反应1h；
(8)洗涤：PBST洗涤酶标板六次，然后甩干；
(9)显色：加TMB显色液100μL/孔，37℃下显色15min；
(10)终止：加2M浓硫酸终止液50μL/孔终止反应；
(11)测定：用酶标仪检测OD 450nm值，其中酶标板孔中加入菌悬液的值被称为阳性值，加入无菌PBS的OD值被称为阴性值，选取阳性值/阴性值不小于2的孔作为阳性噬菌体，鉴定所得阳性噬菌体结果如附图6所示。
将阳性噬菌体质粒送往测序公司测序，用Bioedit软件对测序结果进行分析，并确定抗体序列的框架区和互补决定区，可以确定该抗体的四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4和三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。
其中，单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列框架区FR1的氨基酸序列如SEQID NO:1所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列框架区FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列框架区FR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列框架区FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQID NO:5所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:6所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQID NO:7所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
3、单增李斯特菌纳米抗体的制备
以噬菌体扩增的方式制备噬菌体展示单增李斯特菌纳米抗体LM-P3。
具体操作步骤如下：将转有阳性质粒LM-Nb3的E.coli ER2738感受态细胞划线于氨苄琼脂培养平板上，挑取单菌落于37℃下200rpm震荡培养12h。将过夜菌按1:100比例活化至至OD600值为0.6左右时，加入1mL辅助噬菌体M13KO7(感染复数为20：1)，37℃静置30min，37℃下250rpm过夜培养；次日，离心收集上清，加入1/5体积PEG-NaCl溶液，颠倒混合均匀后沉淀噬菌体；离心收集沉淀，得到噬菌体展示的纳米抗体。
以蛋白表达的方式制备可溶性的单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3
提取阳性噬菌体LM-P3质粒，热击转化至表达菌株TOP10F′中。次日，挑取平板上的单克隆进行扩大培养。当OD600＝0.6时，加入IPTG诱导表达，次日，离心收集菌体沉淀，加入细胞裂解液，使细胞裂解，收集可溶性蛋白，经过镍柱纯化，SDS-PAGE电泳鉴定可溶性蛋白的分子量大小及纯度。结果见附图5，图5中孔道M是蛋白质marker，孔道1是单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3。利用超微量分光光度计测量纳米抗体浓度，通过计算可得该纳米抗体的产量约为10mg/L培养基。
其中热击转化的具体步骤是：
(1)制备Top10F’感受态细胞。挑取Top10F’单菌落于5mL LB培养基中，37℃、250rpm培养过夜；取1mL过夜菌液转移至100mL LB培养基中，37℃、250rpm恒温培养至溶液OD600达到0.4-0.6；将菌液置于冰上冷却后，转移至预冷的离心管中，4℃、3000g离心10min；弃掉上清，用10mL预冷的CaCl2溶液重悬菌体，重复上述步骤一次，随后用3mL预冷的含有甘油的CaCl2溶液再次重悬菌体；分装为50μL/管至预冷的1.5mL离心管中，立即放入液氮中冷冻后置于-80℃超低温冰箱中储存待用。
(2)转化阳性克隆噬菌体质粒LM-Nb3。从保菌平板上挑取阳性噬菌体克隆于1mLSB培养基中，加入0.5μL氨苄青霉素(100mg/mL)，37℃、250rpm震荡培养过夜。按照质粒提取试剂盒的操作说明提取质粒，并测定其浓度。取出三管50μL的Top10F’感受态细胞于冰上融化，加入50ng阳性噬菌体质粒于一管50μL感受态细胞中，取1ng pComb3X加入至一管感受态细胞中，作为阳性对照，取1μL dd H2O加入至一管感受态细胞中，作为阴性对照；用移液器将质粒与感受态细胞充分混匀，于冰上静置5min；随后放置于水浴锅中，42℃水浴90s，取出后立即于冰上静置2min；加至1mL预热的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养1h；用PBS将菌液进行梯度稀释，将每一梯度的菌液于LB-AMP平板上均匀涂布，37℃静置过夜。
4、单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的特异性分析
利用噬菌体ELISA分析法验证单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3的特异性，是以一种单增李斯特菌ATCC 19115和7种常见非单增李斯特菌的食源性致病菌，包括金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、阪崎克罗诺杆菌和福氏志贺氏菌为检测物，测定噬菌体展示纳米抗体LM-Nb3与之结合能力的大小。
(1)包被：将浓度为108CFU/mL的各种菌悬液100μL/孔包被在酶标板，4℃过夜；
(2)洗涤：PBST洗涤酶标板三次，然后甩干；
(3)封闭：加入300μL/孔封闭液，37℃孵育2h；
(4)洗涤：同(2)；
(5)样品孵育：100μL/孔加入浓度为108PFU/mL的噬菌体展示纳米抗体LM-Nb3，37℃下孵育1h；
(6)洗涤：同(2)；
(7)加抗M13酶标二抗，100μL/孔，37℃反应1h；
(8)洗涤：PBST洗涤酶标板六次，然后甩干；
(9)显色：加TMB显色液100μL/孔，37℃下显色15min；
(10)终止：加2M浓硫酸终止液50μL/孔终止反应；
(11)测定：用酶标仪检测OD 450nm值，所得结果如附图7所示。
5、建立检测单增李斯特菌的双纳米抗体夹心ELISA分析方法
利用棋盘法筛选配对合适的纳米抗体对，最后选取单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3作为捕获抗体，噬菌体展示纳米抗体LM-P3作为检测抗体进行双抗体夹心酶联免疫分析法检测单增李斯特菌。具体步骤如下：
(1)包被：将浓度为2.5μg/mL的单增李斯特菌纳米抗体LM-Nb3(100μL/孔)包被酶标板，4℃过夜；
(2)洗涤：PBST洗涤酶标板三次，然后甩干；
(3)封闭：加入300μL/孔封闭液，37℃孵育2h；
(4)洗涤：同(2)；
(5)样品孵育：用PBS溶液将单增李斯特菌梯度稀释后，100μL/孔加入酶标板各孔中，同时以PBS溶液作为空白对照，于37℃下孵育1h；
(6)洗涤：同(2)；
(7)加噬菌体展示抗体(1×1010PFU/mL),100μL/孔，37℃反应1h；
(8)洗涤：同(2)；
(9)加抗M13酶标二抗，100μL/孔，37℃反应1h；
(10)洗涤：PBST洗涤酶标板六次，然后甩干；
(11)显色：加TMB显色液100μL/孔，37℃下显色15min；
(12)终止：加2M浓硫酸终止液50μL/孔终止反应；
(13)测定：用酶标仪检测OD 450nm值，绘制标准曲线，所得标准曲线如附图8所示。计算该方法的检出限LOD值为3.55×105CFU/mL。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Asn Cys Glu Leu Val Ser Thr Ile
1 5 10 15
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Arg Asn Thr Met Tyr
1 5 10 15
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Leu Glu Gly Val
35
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Gln Val Thr Val Ser Gly Gln Ala Gly Gln
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Ser Asp Met Gly Trp
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Asp Val Trp Ser Tyr Ala Lys Arg Glu Ser Leu Gly Val Cys Asn
1 5 10 15
Tyr Trp Gly Gln Gly
20
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Asn Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Arg Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Leu Glu Gly Val Gly Asp Val Trp Ser Tyr Ala Lys Arg Glu Ser Leu
100 105 110
Gly Val Cys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly
115 120 125
Gln Ala Gly Gln
130
<210> 9
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacag tctctggatt tacttttgat ggttctgaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaata actgcgagtt ggtctcaact attagtggtg atggtagcac gtactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaggaacac gatgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgct agagggggtc 300
ggcgacgtct ggtcttatgc gaagagggaa tctttaggtg tttgcaacta ctggggccag 360
gggacccagg tcaccgtctc cggccaggcc ggccag 396
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catgccatga ctgtggccca ggcggcccag gtgcagctcg tggagtctgg rggagg 56
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catgccatga ctcgcggccg gcctggccgg agacggtgac cagggt 46

Claims (6)

1.特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括氨基酸序列框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及氨基酸序列互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
氨基酸序列框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列框架区FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；氨基酸序列框架区FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；氨基酸序列框架区FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
氨基酸序列互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；氨基酸序列互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；氨基酸序列互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
2.根据权利要求1所述的特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.一种用于编码权利要求2所述的特异识别单增李斯特菌的纳米抗体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体上含有权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞内含有权利要求4所述的重组载体。
6.一种特异识别单增李斯特菌的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的特异识别单增李斯特菌的纳米抗体，或含有权利要求4所述的重组载体，或含有权利要求5所述的宿主细胞。。
CN202111407056.5A 2021-11-24 2021-11-24 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用 Active CN114106167B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111407056.5A CN114106167B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111407056.5A CN114106167B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114106167A CN114106167A (zh) 2022-03-01
CN114106167B true CN114106167B (zh) 2023-06-27

Family

ID=80372598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111407056.5A Active CN114106167B (zh) 2021-11-24 2021-11-24 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114106167B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112707963A (zh) * 2021-01-26 2021-04-27 西北农林科技大学 广谱识别沙门氏菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
CN113461814A (zh) * 2021-06-28 2021-10-01 西北农林科技大学 特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112707963A (zh) * 2021-01-26 2021-04-27 西北农林科技大学 广谱识别沙门氏菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
CN113461814A (zh) * 2021-06-28 2021-10-01 西北农林科技大学 特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114106167A (zh) 2022-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Abbady et al. Evaluation of a nanobody phage display library constructed from a Brucella-immunised camel
CN110003335B (zh) Cd47单域抗体、核酸及试剂盒
CN109336979B (zh) 一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用
CN108101970B (zh) 基于抗独特型纳米抗体的Cry1Ab毒素模拟抗原及其应用
CN109970858B (zh) Cd22单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
CN113105549B (zh) 抗ceacam5纳米抗体
CN110526968B (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b7、应用及试剂盒
CN112707963A (zh) 广谱识别沙门氏菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
CN110526966B (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b6、应用及试剂盒
CN110563839A (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b1、应用及试剂盒
CN110577594B (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体a21、应用及试剂盒
CN108864281B (zh) 一种抗肠炎沙门氏菌的纳米抗体及其应用
CN114106167B (zh) 特异识别单增李斯特菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
CN113461814B (zh) 特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
CN113583119B (zh) 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
CN114106168B (zh) 特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用
CN110003334B (zh) 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒
CN112574301B (zh) 一种抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体及应用
CN111499734B (zh) 一种抗鸭圆环病毒的单链抗体及其制备方法和应用
CN116987194B (zh) 人st2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用
CN115057927B (zh) 一种花生过敏原Ara h1特异性纳米抗体及其应用
CN114409792B (zh) 抗EphB4纳米抗体
CN114085289B (zh) 一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用
CN114044819A (zh) 全羊源单克隆抗体的高通量制备方法
CN118271434A (zh) 一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant