CN113583119A - 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒 - Google Patents

抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti‑SA Nb 56、应用及试剂盒。本发明提供的纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性强、产量高、能特异性识别金黄色葡萄球菌的优点，较常规单克隆抗体用途更广、特异性更强。本发明公布了这种纳米抗体及编码该纳米抗体的基因序列，生产该纳米抗体的方法以及应用了该抗体的试剂盒。通过应用该纳米抗体进行免疫检测，检测时叠加了金黄色葡萄球菌表面的Protein A与抗M13二抗Fc段结合而产生“双重显色”，表现出较高特异性，具有稳定性好、分子量小且可大规模生产等优点。

Description

抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb56、应用及试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，在环境中非常常见，可存活于多种食物中。金黄色葡萄球菌具有食源性和医源性病原体，可能导致肺炎、败血病、中毒性休克综合症和心包炎等多种严重的感染疾病，是几种主要的致病细菌之一。并且，金黄色葡萄球菌在合适的生长条件下会大量繁殖并产生具有催吐活性的肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)，这类毒素进入人体后会引发包括胃肠炎、呕吐、发汗、休克在内的多种症状，对人体造成严重损伤。
近年来，由金黄色葡萄球菌食物中毒引起的公共卫生事件层出不穷，据疾病控制和预防中心估计，每年约有24万种疾病与金黄色葡萄球菌相关。因此，开发出一种针对食物中金黄色葡萄球菌的高灵敏、快速简便、经济安全的检测方法对于保障公共卫生和食品安全具有重要意义。
免疫学检测方法是一种基于抗原抗体特异性反应来检测目标物的快速检测方法。其中，双抗夹心的免疫检测方法常用于食源性致病菌、毒素蛋白等体积或分子量较大的抗原，其检测金黄色葡萄球菌的原理是基于两个识别金黄色葡萄球菌表面不同位点的抗体，在金黄色葡萄球菌存在时形成夹心结构，再借助检测抗体上的标记物从而判读检测结果。该方法具有较高的灵敏度、并且检测时间短，为实时检测提供了可能，具有很好的前景。目前，识别金黄色葡萄球菌的特异性抗体多为传统的单克隆抗体，而单克隆抗体存在制备技术复杂、耗时长、成本高、不易加工改造等缺点，一定程度上限制了其在免疫学检测领域中的应用。而关于抗金黄色葡萄球菌纳米抗体的制备目前鲜有报道。
骆驼体内存在一种天然缺失轻链和第一重链恒定区、只由重链组成的抗体，其可变区的晶体结构直径和长度都处于纳米级水平，又被称为纳米抗体。纳米抗体的分子量约为15kDa，是迄今为止发现的最小抗体片段。相比于传统的单克隆抗体，纳米抗体具有以下优点：
1)纳米抗体的互补决定区3(CDR3)较长，能够形成凸环结构延伸进入抗原的凹槽中发挥作用，提高抗原特异性亲和能力；
2)纳米抗体具有较高的水溶性和良好的稳定性，在高压、高温、变性剂等条件下的稳定性相对较高，并且能够在保持功能性的前提下进行大规模高密度的表达；
3)纳米抗体的单域结构使其易于通过基因工程的手段在大肠杆菌中高效表达，并与其他分子偶联或进行基因工程改造。
目前针对金黄色葡萄球菌的纳米抗体鲜有报道，因此针对金黄色葡萄球菌高亲和力、高特异、低成本的纳米抗体的开发，有利于进一步提高金黄色葡萄球菌免疫学检测的灵敏度和特异性，以达到现场检测的要求。
发明内容
针对上述现有技术的不足与缺陷，本发明的目的在于，提供一种金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56、应用及试剂盒，解决现有技术中的抗体特异性差、检测方法成本高、操作复杂等技术问题。
为此，第一方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56，其互补决定区包括：SEQ ID NO：3所示的CDR1、SEQ ID NO：5所示的CDR2、以及SEQ ID NO：7所示的CDR3。
进一步，所述金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56还包含框架区，且所述框架区包括：SEQ ID NO：2所示的FR1，SEQ ID NO：4所示的FR2、SEQ ID NO：6所示的FR3、以及SEQID NO：8所示的FR4。
进一步，所述金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56包括由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供一种核酸分子，其编码本发明所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56。
进一步，所述核酸分子包含由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。
进一步，所述载体可选自下组中的一种：质粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或逆转录病毒。
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其表达本发明所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56，和/或含有本发明所述的核酸分子，和/或含有本发明所述的载体。
进一步，所述宿主细胞为原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在某实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明的第五方面，提供所述金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56的制备方法，其包括以下(a)或(b)：
(a)噬菌体扩增：通过生物扩增的方式，扩增展示有本发明所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56的噬菌体粒子；
(b)蛋白重组表达：在适于表达本发明所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SANb 56的条件下，培养本发明所述的宿主细胞，然后从培养产物中分离纯化所述金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56。
本发明的第六方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56。
本发明的第七方面，提供本发明所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56、和/或所述的核酸分子、和/或所述的载体和/或所述的宿主细胞在以下(c)和/或(d)方面的用途：
(c)金黄色葡萄球菌的免疫检测；
(d)制备用于金黄色葡萄球菌免疫检测的产品。
进一步，所述金黄色葡萄球菌的免疫检测为非诊断目的。
进一步，所述产品为试剂盒。
本发明与现有技术相比，至少具有以下有益的技术效果：
(1)本发明提供的纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性强、产量高、能特异性识别金黄色葡萄球菌的优点，较常规单克隆抗体用途更广，特异性更强。
(2)本发明提供的纳米抗体具有高特异性，稳定性好、分子量小且可大规模生产的优点。
(3)本发明运用噬菌体展示技术将抗SA纳米抗体展示在M13KO7噬菌体表面，待SA与纳米抗体特异性结合后，通过HRP标记抗M13噬菌体二抗催化底物显色来判读检测结果。在这里，我们创新性地利用SA表面存在的金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal ProteinA，SPA)可以强烈结合哺乳动物产生的所有免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)上结晶片段(crystalline fragment，Fc)的性质，在原有显色的基础上叠加了SPA与HRP标记抗M13噬菌体二抗上Fc端结合而催化的底物显色，使最终的显色呈现为“双重显色”的结果，在一定程度上提高了检测的灵敏度。
(4)本发明提供的纳米抗体可适用于包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的所有免疫学分析检测类型。可广泛用于无生命的物体上的病原检测、食品安全检测等非诊断用途。例如，以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测；当然，也可以将纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以蛋白质的形式进行免疫学检测分析。
(5)本发明提供的纳米抗体可解决现有检测方法成本高、操作复杂、特异性差的问题，具有广阔的应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为淘选阳性克隆直接ELISA鉴定结果，其中克隆Anti-SA Nb 56的OD450值为阴性对照的三倍以上；
图2为纳米抗体Anti-SA Nb 56的SDS-PAGE图；
图3为以噬菌体展示纳米抗体Anti-SA Nb 56建立的间接ELISA标准曲线，线性关系为R2＝0.99，最低检测限为3.44×103CFU/mL；
图4为纳米抗体Anti-SA Nb 56的特异性分析结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
除非另外指明，本文的实施例采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸的序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，例如，卡巴特(Kabat)编号方案，乔西亚(Chothia)编号方案，或卡巴特和乔西亚的组合，和ImMunoGenTics(IMGT)编号。
如本文所用，术语“框架区”或“FR”指插入CDR间的氨基酸序列，抗体的轻链可变区和重链可变区各具有四个FR，相应地，轻链可变结构域可因此表示为：(LFR1)-(LCDR1)-(LFR2)-(LCDR2)-(LFR3)-(LCDR3)-(LFR4)，重链可变结构域可因此表示为：(HFR1)-(HCDR1)-(HFR2)-(HCDR2)-(HFR3)-(HCDR3)-(HFR4)。
如本文所用，术语“纳米抗体”或“VHH”仅由一个重链可变区组成，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常可通过先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建得到仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。纳米抗体由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端其结构可表示为：(FR1)-(CDR1)-(FR2)-(CDR2)-(FR3)-(CDR3)-(FR4)。
本发明采用金黄色葡萄球菌免疫阿拉善双峰驼，从经免疫的双峰驼的外周血淋巴细胞中提取其RNA，特异性扩增骆驼单链抗体可变区基因，从而构建纳米抗体基因库，分析其库容量及多样性。通过用噬菌体展示技术，从纳米抗体库中筛选能与靶分子金黄色葡萄球菌特异性结合的纳米抗体，构建纳米抗体Anti-SA Nb 56表达载体，对其进行原核表达。采用淘选得到的噬菌体展示纳米抗体建立ELISA检测法。本发明制备的纳米抗体作为一种新型的基因工程抗体，由于其独特的结构特征，抗原识别能力强，可用于快速、准确的金黄色葡萄球菌检测。
本发明采用金黄色葡萄球菌免疫双峰驼，然后利用该双峰驼外周血淋巴细胞建立了针对金黄色葡萄球菌的噬菌体展示纳米抗体文库。随后试验中将金黄色葡萄球菌吸附在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体文库，从而获得了针对了一种金黄色葡萄球菌的特异性纳米抗体Anti-SA Nb 56，其具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。
本发明所提及的纳米抗体包括框架区(FR1～FR4)分别为SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8，互补决定区分别为(CDR1～CDR3)分别选自SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。
本发明还涉及编码该纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：9。
本发明提及的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，通过宿主细胞以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。
本发明还涉及所述的纳米抗体在免疫学检测中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
本发明所述的纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。
本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和力、特异性和稳定性等)更好的突变体。
实施例1：驼源纳米抗体噬菌体展示文库的构建
1)双峰驼的免疫
以金黄色葡萄球菌作为免疫原采用皮下多点注射方式免疫成年雄性阿拉善双峰驼，共进行五轮免疫。第一次免疫将灭活后的金黄色葡萄球菌菌液与等体积的弗式完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)充分混匀并乳化后进行注射。往后每隔两周加强免疫一次，采用弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)与等体积的免疫原乳化后进行注射。第五次加强免疫后第七天，采取双峰驼外周血，用于构建纳米抗体噬菌体展示文库。
2)淋巴细胞的分离
最后一次免疫后第7天，用一次性塑料血袋(含抗凝剂)采集200mL外周血，使用前用等体积的PBS稀释血液样品。将Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液平衡至室温，吸取15mL加入
Figure BDA0003151963730000071
淋巴细胞分离管(带多孔隔板)，用水平转子离心机1000×g室温离心30s，使淋巴细胞分离液刚好位于筛网以下。将稀释好的血液样品平衡至室温后加入淋巴细胞分离管，30mL/支，用水平转子离心机1000×g室温离心10min，离心机制动加速度调为0。离心后红细胞位于淋巴细胞分离管底部，最上层为血浆，血浆与白色透明淋巴细胞分离液之间的一层环装乳白色物质即为淋巴细胞，用滴管小心移去上层血浆，直到距离细胞层5mm。用滴管收集淋巴细胞至另一干净的50mL离心管中，加入至少10倍体积的冰浴的PBS，颠倒混匀后，250×g，4℃离心10min。弃去上清，用45mL冰浴的PBS重悬细胞，250×g，4℃离心10min，用同样方法再洗涤细胞两次。最后一次离心后，用10mL冰浴的PBS重悬细胞，用血细胞计数板进行计数，计数后分装于1.5mL离心管中，1×107个细胞/支，250×g、4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀直接用于RNA提取，或-80℃保存备用。
3)淋巴细胞RNA的提取
在离心管中加入1mL Trizol试剂，用移液器吹打离心管底部的淋巴细胞团块，把其打散；
向上述裂解液中加入1/5体积氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15s，室温静置5min。4℃，12000×g离心10～15min。小心吸取上层水相至新离心管中，加入1/2体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10min。4℃，12000×g离心10min。小心弃去上清，加入等体积75％乙醇。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。4℃，7500×g离心5min，弃上清。室温放置空气干燥10min。加入100μL无RNase水溶解RNA，待完全溶解后，取少量检测，其余溶液-70℃保存。测定总RNA的OD260及OD260/OD280，确定总RNA的浓度和质量。
4)cDNA的合成和VHH基因的扩增
以步骤3)得到的总RNA为模板，采用反转录PCR经两步反应合成cDNA，具体步骤如下：按照反转录PCR体系1(见表1)配制反应体系，65℃反应5min后立即冰浴；在第一步反应液中加入按照反转录PCR体系2(见表2)配制反应体系中，反应条件42℃30min，50℃60min，70℃15min；PCR产物-20℃冻存备用。
表1反转录PCR体系1
Figure BDA0003151963730000081
表2反转录PCR体系2
Figure BDA0003151963730000082
根据双峰驼VHH上下游序列，用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，并送公司合成引物，序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
VHH-FOR：
5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’
VHH-REV：
5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCWGGGT-3’
第一轮PCR：
以cDNA为模板，利用引物CALL001和引物CALL002进行第一轮PCR扩增，反应体系为PCR体系3，详见表3：
表3第一轮PCR体系3
Figure BDA0003151963730000091
反应条件：95℃、5min，95℃、30s；55℃、30s，72℃、45s；30个循环；72℃、10min。4℃保存。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切去700bp附近的目的条带，用割胶回收试剂盒按照说明书操作步骤回收PCR产物，测定回收产物的浓度用于下一步实验。
第二轮PCR：以第一轮PCR胶回收产物(700bp附近的条带)为模板，用引物VHH-FOR和VHH-REV扩增VHH基因片段，反应体系为4：详见表4；反应条件：98℃、10s，55℃、15s，72℃、30s；72℃、10min，30个循环。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带(400bp附近)，用胶回收试剂盒按照说明书操作步骤回收PCR产物，测定回收产物的浓度用于下一步实验。
表4第二轮PCR体系4
Figure BDA0003151963730000092
Figure BDA0003151963730000101
5)文库的构建和鉴定：
载体和插入片段的酶切反应
按照表5的酶切体系，Sfi I 50℃过夜酶切pHEN I噬菌粒载体和VHH片段。
表5 Sfi I酶切反应体系
Figure BDA0003151963730000102
琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，采用DNA纯化试剂盒纯化回收酶切产物。
6)载体和插入片段的连接
按表6的连接体系进行连接反应，并设置阴性对照(NC)。
表6连接反应体系
Figure BDA0003151963730000103
16℃反应12h；加入5μL 3M乙酸钠(pH5.2)后，再加入125μL的冷无水乙醇，-20℃放置1h。4℃，10000×g离心15min，弃上清；70％的冷乙醇清洗沉淀；4℃，10000×g离心5min，弃上清；真空干燥后，20μL无菌水重悬沉淀，定量并-20℃冻存备用。
7)连接产物的电转化
取5μL连接产物加至80μL感受态细胞E.coli TG1中，充分混匀，冰上放置1min。转入0.1cm的电击杯中电击转化(电压为1.8kV)，立即向电击杯中加入900μL LB培养基，37℃、160rpm培养1h。将菌液涂布于LB-AG平板，37℃倒置培养过夜。
8)初始文库的救援
接种超过10倍库容量的细胞于100mL 2×YT/amp/2％葡萄糖液体培养基中，培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体(20:l感染复数)，37℃，静置15min后，220rpm培养45min；4℃，1000×g离心10min；弃上清，加入100mL新鲜的2×YT/amp/kana培养基重悬沉淀，30℃培养过夜；4℃，10000×g离心10min，取上清；加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，4℃静置3h；4℃，10000×g离心15min，弃上清，沉淀用1mL PBS重悬；取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。
实施例2：纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
1)纳米抗体的亲和淘选：首先，用PBS(pH7.4)将SA稀释至终浓度108CFU/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0.1％Tween-20(v/v))洗涤5次后，加入5％BSA-PBS(或5％OVA-PBS)37℃封闭1h。然后用PBST洗涤6次，每孔加入100μL驼源单域重链抗体库(滴度约2.0×1011CFU)，37℃孵育2h。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M，pH2.2)洗脱8min后，立即用15μL Tris-HCl(1M，pH9.1)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染25mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
在第二、第三和第四轮的淘选过程中，包被的金黄色葡萄球菌浓度分别为107CFU/mL，106CFU/mL和105CFU/mL，加入噬菌体孵育后用PBST洗涤次数分别为12次，15次和18次，其余步骤同上。
2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮和第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取192个克隆，进行噬菌体的扩增，采用酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：首先，用PBS(pH7.4)将SA稀释至108CFU/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100μL噬菌体扩增液(2.0×1011cfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1h；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1h；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan FC)测定450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆，共得到55株阳性克隆，分别为Anti-SA Nb 7、Anti-SA Nb 9、Anti-SA Nb 13、Anti-SA Nb 16、Anti-SA Nb 21、Anti-SA Nb 34、Anti-SA Nb 45、Anti-SA Nb50、Anti-SA Nb 56、Anti-SA Nb 68、Anti-SA Nb 72、Anti-SA Nb 76、Anti-SA Nb 81、Anti-SA Nb 86、Anti-SA Nb 87、Anti-SA Nb 100、Anti-SA Nb 101、Anti-SA Nb 109、Anti-SA Nb 110、Anti-SA Nb 112、Anti-SA Nb 113、Anti-SA Nb 115、Anti-SA Nb 116、Anti-SA Nb 117、Anti-SA Nb 122、Anti-SA Nb 124、Anti-SA Nb 126、Anti-SA Nb 127、Anti-SA Nb 128、Anti-SA Nb 129、Anti-SA Nb 131、Anti-SA Nb 133、Anti-SA Nb 137、Anti-SA Nb 138、Anti-SA Nb 139、Anti-SA Nb 142、Anti-SA Nb 148、Anti-SA Nb 152、Anti-SA Nb 156、Anti-SA Nb 157、Anti-SA Nb 158、Anti-SA Nb 159、Anti-SA Nb 161、Anti-SA Nb 163、Anti-SA Nb 165、Anti-SA Nb 167、Anti-SA Nb 169、Anti-SA Nb 171、Anti-SA Nb 172、Anti-SA Nb 173、Anti-SA Nb 174、Anti-SA Nb 175、Anti-SA Nb 180、Anti-SA Nb 182、Anti-SA Nb 190(见附图1所示)。
实施例3：纳米抗体编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将Anti-SA Nb 56克隆进行DNA测序，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9。根据DNA测序结果及密码子表可获得纳米抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
SEQ ID NO：1的序列为(其中下划线分别示出了CDR1、CDR2、CDR3)：
ESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTSTSAWMGWFRQAPGKEREGLTCIYTTGGATVYADSVKGRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAGQITYKSCIYLLRLGTYNSYGQGTQVTVS
实施例4：Anti-SA Nb 56纳米抗体的大量制备
(1)以噬菌体扩增的方式进行制备
将展示有阳性纳米抗体的噬菌体加入至20mL接种有E.coli TG1的培养物中，37℃、220rpm振荡培养6h。将培养物转入另一离心管中，4℃、10000×g离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜的离心管中，加入1/5体积的PEG/NaCl，4℃静置120min后，4℃、10000×g离心10min，弃上清；再加入少量PBS清洗噬菌体。4℃，10000×g离心10min，弃上清，加入1mLPBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。
(2)以蛋白表达的形式进行制备
提取Anti-SA Nb 56克隆的质粒，将重组表达载体转入E.coli Top10’。从转化平板上挑一单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB/Amp/2％葡萄糖培养基中，37℃，220r/min振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入0.1mM的IPTG，30℃，220r/min振荡培养8～12h；将培养物于4℃，8000×g，离心20min收集菌体沉淀。重悬细胞于5mL预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000×g离心20min取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的纳米抗体Anti-SA Nb 56(如图2所示)。纳米抗体蛋白的分子量在17KDa左右。
实施例5：标准曲线的建立
采用间接ELISA的方法进行灵敏度的鉴定，具体方法为：用PBS(pH7.4)将SA分别稀释至100000000、20000000、4000000、800000、160000、32000、6400CFU/mL，4℃包被过夜；第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤5次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1h；加入100μL的噬菌体展示纳米抗体Anti-SA Nb 56，37℃孵育1h；加入1:8000稀释HRP标记的抗M13二抗100μL，37℃孵育1h；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min，测定OD450，绘制标准曲线(如图3所示)，线性关系为R2＝0.99，最低检测限为3.44×103CFU/mL，表现出较好的灵敏度。
实施例6：特异性鉴定
采用ELISA的方法进行阳性纳米抗体的特异性鉴定，具体方法为：用PBS(pH7.4)将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌分别稀释至108CFU/mL，按100μL/孔加入酶标板中，4℃包被过夜；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1h；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入100μL噬菌体展示纳米抗体Anti-SA Nb56，37℃孵育1h；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤6次后，加入100μL HRP标记的抗M13二抗，37℃孵育1h；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min，加入50μL 2M H2SO4终止液终止反应后，测定OD450。结果见图4，噬菌体展示纳米抗体Anti-SA Nb 56与大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌均无交叉反应，表明纳米抗体Anti-SA Nb 56表现出较好的特异性；噬菌体展示纳米抗体Anti-SA Nb 56与金黄色葡萄球菌阴性对照(仅将步骤中的噬菌体展示纳米抗体换为PBS)的OD450较高，说明抗M13二抗与金黄色葡萄球菌表面的Protein A发生结合，达到了预期的“双重显色”效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
<160> 13
<170> PatentIn Version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Thr Ser Ala Trp Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Leu Thr Cys Ile Tyr Thr
35 40 45
Thr Gly Gly Ala Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gln Ile
85 90 95
Thr Tyr Lys Ser Cys Ile Tyr Leu Leu Arg Leu Gly Thr Tyr Asn Ser
100 105 110
Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(20)
<223> FR1
<400> 2
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> CDR1
<400> 3
Gly Tyr Thr Ser Thr Ser Ala Trp Met Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(16)
<223> FR2
<400> 4
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Leu Thr Cys Ile
1 5 10 15
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> CDR2
<400> 5
Tyr Thr Thr Gly Gly Ala Thr Val Tyr Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(37)
<223> FR3
<400> 6
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
1 5 10 15
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met
20 25 30
Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(20)
<223> CDR3
<400> 7
Gly Gln Ile Thr Tyr Lys Ser Cys Ile Tyr Leu Leu Arg Leu Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Tyr
20
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(9)
<223> FR4
<400> 8
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
1 5
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagtctggag gaggctcggt gcaggctgga gggtctctga gactctcctg cgcagcctct 60
ggatacacca gcactagcgc atggatgggt tggttccgcc aggctccagg gaaggagcgc 120
gaggggctca catgtattta tactactggt ggtgccactg tctatgccga ctccgtaaag 180
ggacgattca ccgtctcccg cgacaacgcc aagaacacgg tgtatctgca aatgaacagc 240
ctgaaacctg aggacactgc catgtattac tgtgcggcgg gccagataac atacaagtcc 300
tgtatttact tactacgact agggacatat aactcctacg gccaggggac ccaggtcacc 360
gtctcc 366
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catgccatga ctgtggccca ggcggccgag tctggrggag g 41
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catgccatga ctcgcggccg gcctggccgg agacggtgac cwgggt 46

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56，其特征在于，其互补决定区包括：SEQID NO：3所示的CDR1、SEQ ID NO：5所示的CDR2、以及SEQ ID NO：7所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56还包含框架区，且所述框架区包括：SEQ ID NO：2所示的FR1，SEQ ID NO：4所示的FR2、SEQ ID NO：6所示的FR3、以及SEQ ID NO：8所示的FR4。
3.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56，其特征在于，包括由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
4.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其包含由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，其包含权利要求4或5所述的核酸分子；
优选地，所述载体可选自下组中的一种：质粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或逆转录病毒。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其表达权利要求1-3任一项所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56，和/或含有权利要求4或5所述的核酸分子，和/或含有权利要求6所述的载体；
优选地，所述宿主细胞为原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.权利要求1-3任一项所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56的制备方法，其包括以下(a)或(b)：
(a)噬菌体扩增：通过生物扩增的方式，扩增展示有权利要求1-3任一项所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56的噬菌体粒子；
(b)蛋白重组表达：在适于表达权利要求1-3任一项所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，然后从培养产物中分离纯化所述金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56。
9.一种试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-3任一项所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56。
10.权利要求1-3任一项所述的金黄色葡萄球菌纳米抗体Anti-SA Nb 56、和/或权利要求4或5所述的核酸分子、和/或权利要求6所述的载体、和/或权利要求7所述的宿主细胞在以下(c)和/或(d)方面的用途：
(c)金黄色葡萄球菌的免疫检测；
(d)制备用于金黄色葡萄球菌免疫检测试的产品。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115925913A (zh) * 2022-08-26 2023-04-07 西北农林科技大学 特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素b、c的纳米抗体bc16及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109021109A (zh) * 2018-07-20 2018-12-18 上海交通大学 一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法
CN110526966A (zh) * 2019-08-19 2019-12-03 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b6、应用及试剂盒
CN110526967A (zh) * 2019-08-19 2019-12-03 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体a13、应用及试剂盒
CN110563839A (zh) * 2019-08-19 2019-12-13 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b1、应用及试剂盒
US20200109190A1 (en) * 2018-10-09 2020-04-09 Medimmune, Llc Antibodies directed against staphylococcus aureus leukotoxins
CN112028994A (zh) * 2020-07-30 2020-12-04 北京三安新特生物科技有限公司 抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的抗体、检测试纸及试剂盒
CN112500482A (zh) * 2020-11-20 2021-03-16 南开大学 一种金葡特异性纳米抗体及其双抗夹心elisa方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109021109A (zh) * 2018-07-20 2018-12-18 上海交通大学 一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法
US20200109190A1 (en) * 2018-10-09 2020-04-09 Medimmune, Llc Antibodies directed against staphylococcus aureus leukotoxins
CN110526966A (zh) * 2019-08-19 2019-12-03 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b6、应用及试剂盒
CN110526967A (zh) * 2019-08-19 2019-12-03 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体a13、应用及试剂盒
CN110563839A (zh) * 2019-08-19 2019-12-13 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b1、应用及试剂盒
CN112028994A (zh) * 2020-07-30 2020-12-04 北京三安新特生物科技有限公司 抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的抗体、检测试纸及试剂盒
CN112500482A (zh) * 2020-11-20 2021-03-16 南开大学 一种金葡特异性纳米抗体及其双抗夹心elisa方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115925913A (zh) * 2022-08-26 2023-04-07 西北农林科技大学 特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素b、c的纳米抗体bc16及其应用
CN115925913B (zh) * 2022-08-26 2023-08-11 西北农林科技大学 特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素b、c的纳米抗体bc16及其应用

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