CN109021109A

CN109021109A - 一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法

Info

Publication number: CN109021109A
Application number: CN201810801037.2A
Authority: CN
Inventors: 朱建国; 王曼; 王婷婷; 王凤青; 张波
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明公开了一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv‑Fc及其制备方法。该融合抗体scFv‑Fc至少具有如SEQ ID No：1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No：2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽以及如SEQ ID No：3所示氨基酸序列的Fc片段。ELISA结果显示，该融合抗体能和金黄色葡萄球菌抗原特异性结合；在体外抑菌试验中，该融合抗体在24h内能完全抑制金黄色葡萄球菌的生长；且该融合抗体能介导奶牛外周血吞噬细胞发挥调理吞噬作用。该融合抗体在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。

Description

一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

奶牛乳腺炎是指奶牛乳腺组织的炎症，它是影响奶牛业发展，给乳品生产带来巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的病原菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌。由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎一方面主要采用抗生素治疗，但此治疗方法导致耐药菌株出现得越来越多，而且抗性奶对人类的健康也带来了一定的威胁；另一方面主要采用疫苗，目前有很多针对金黄色葡萄球菌活的或者灭活的菌体，分离的黏附素、毒素和多糖等毒力因子制作的疫苗出现，可能由于细菌抗原的变异使致病因子的结构发生了改变，这些疫苗的治疗效果均不理想。因为疫苗的作用机理是刺激机体产生抗体，所以抗体制剂也许能对其感染起到一定的预防和治疗的作用。

单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。IgG分子的Fc片段包含有铰链区(Hinge)，重链恒定区2(Heavy chain constantregion,CH2)和重链恒定区3(Heavy chain constant region,CH3)，铰链区和CH3区域可以维持IgG分子的稳定性，CH2区域在IgG Fc片段发挥功能方面有着重要作用。融合抗体scFv-Fc既能与抗原结合，又具有Fc片段介导的吞噬细胞的调理吞噬作用，且可以进行原核和真核表达并大规模工程化制备，显示了巨大的应用潜力，越来越受到人们的重视。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc，该融合抗体能够与金黄色葡萄球菌特异性结合，具有一定的抑菌活性，且能介导外周血吞噬细胞发挥调理吞噬作用，能够用于金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的诊断、预防和/或治疗。

一种抗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的融合抗体scFv-Fc，其至少具有如SEQ IDNo：1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No：2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，以及如SEQ ID No：3所示氨基酸序列的Fc片段。

上述中间连接肽为GGGGSGGGGSGGGGS。

上述融合抗体scFv-Fc具有如SEQ ID No：4所示的氨基酸序列。

本发明的再一目的是提供一种上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个淋巴细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因；

(2)利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体基因；

(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，构建重组质粒；

(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；

(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选四轮；

(6)采用phage ELISA,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，筛选阳性克隆；

(7)扩增牛IgG Fc片段，所扩增的Fc片段包含Hinge、CH2和CH3区域；

(8)将步骤(6)中筛选得到的阳性克隆scFv、Fc片段与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒转化Rosetta细胞后，进行诱导表达所得产物即获得所述牛源性抗金黄色葡萄球菌的融合抗体scFv-Fc。(按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行)

需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例)，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得,其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的方法准确获得。

本发明的再一目的是提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在用于制备介导外周血吞噬细胞对金黄色葡萄球菌吞噬作用药物中的应用。

本发明的再一目的是提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在用于制备奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。

本发明的再一目的是提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在用于制备奶牛乳腺炎的预防、治疗药物中的应用。

本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个淋巴细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体(scFv)基因，并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中构建牛源单链抗体初级文库，辅助噬菌体M13KO7拯救初级文库；用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原经过四轮的富集淘选后，采用phage ELISA方法筛选阳性克隆，将筛选得到的阳性克隆scFv、Fc片段与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒转化Rosetta细胞后，进行诱导表达所得产物即为牛源性抗金黄色葡萄球菌的融合抗体scFv-Fc。证明该融合抗体具有抗金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性和具有Fc片段介导的吞噬细胞的调理吞噬功能。

和现有技术相比，本发明的有益效果是：抗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的融合抗体scFv-Fc能与金黄色葡萄球菌特异性结合，该融合抗体scFv-Fc具有一定的体外抑菌活性，其24小时内完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，并具有Fc片段介导外周血吞噬细胞发挥的调理吞噬作用，能够用于奶牛乳腺炎的预防和治疗。

附图说明

图1：牛外周血淋巴细胞扩增VH，VL和scFv；泳道M，Marker 2000；泳道1，VH；泳道2，VL；泳道3，scFv(VL-Linker-VH)。

图2：牛外周血淋巴细胞扩增IgG Fc(Hinge+CH2+CH3)；泳道M，Marker 2000；泳道N，阴性对照；泳道1-3，Fc片段。

图3：牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的氨基酸序列。

图4：牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的纯化；泳道M，蛋白Marker；泳道1，100mM咪唑洗脱蛋白；泳道2，150mM咪唑洗脱蛋白。

图5：牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc体外抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923

图6：牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的调理吞噬作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细介绍。

实施例1牛源噬菌体单链抗体文库的构建

1：采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。将抗凝血提取外周核淋巴细胞，用Trizol法(TRIZOL Reagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligo primer，根据反转录试剂盒(cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。

2：根据已发表文献的牛抗体编码基因可变区序列(Madhuri Kotia,2010Molecular Immunology；2011，Vaccine)的FR区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VH F和VH R用于扩增VH区；VL F和VL R用于扩增VL区。其中，VLF、VH R分别含有Sfi I和Not I酶切位点；VH F、VL R含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小

3：VH和VL基因的扩增以cDNA为模版，VH F、VH R为引物扩增VH基因；VL F、VL R为引物扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH₂O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作)。

4：scFv基因的获得通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VH和VL基因连接为scFv基因，并加入Sfi I和Not I酶切位点。

5：初级文库的构建根据常规分子克隆方法(参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，scFv基因和pCANTAB5E载体分别经Sfi I和Not I双酶切后，将scFv基因插入pCANTAB5E载体，构建重组表达质粒，并将其电转化TG1感受态细胞，转化50次，合并所有电转化培养液，取一小部分系列稀释后涂布于YT-AG固体培养板，30℃过夜培养计算库容量(挑取克隆进行菌落PCR和质粒双酶切验证，测序验证库的多样性)；通过菌落PCR计算阳性率，得到实际的库容量。将剩余的细菌培养液通过辅助噬菌体M13KO7拯救后建立初级文库。

实施例2抗金黄色葡萄球菌单链抗体的筛选

1：富集淘选制备金黄色葡萄球菌(ATCC25923)全菌抗原，4℃包被过夜；用含4％脱脂奶粉的PBS封闭96孔板37℃孵育2h；向96孔板中加入上述步骤中制备好的单链抗体噬菌体抗体库，37℃孵育2h，用PBST和PBS各洗10次，洗掉未结合的游离噬菌体；每孔加入100μl0.2mol/L Gly-Hcl缓冲液(pH＝2.2)洗脱特异性结合的噬菌体，加入50μl 1mol/L Tris-Hcl(PH＝9.1)中和洗脱液；将剩余部分洗脱液感染大肠杆菌TG1后，重复上述步骤。如此重复3-5轮，在第一轮过后，要增加洗涤的严谨性，洗脱前用PBST洗脱20次后用PBS洗涤20次。

2：phage ELISA筛选从第四轮中随机取96个克隆，用M13K07拯救后制备重组噬菌体。金黄色葡萄球菌(ATCC25923)全菌抗原用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH＝9.6)于4℃包被过夜，4％脱脂奶粉溶液封闭1h后用PBST(0.1％Tween20，以下同)洗涤3次；加入上述制备好的噬菌体单链抗体，37℃反应2h，PBST和PBS各洗涤6次；加入HRP-antiM13抗体100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST和PBS各洗涤6次；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设辅助噬菌体M13K07为阴性对照。ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性。(参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》)。

实施例3牛IgG Fc片段的扩增

以牛外周血淋巴细胞提取的RNA作为模板，根据已发表文献(Symons DBA，Molecular Immunology,1989)设计引物扩增牛IgG Fc片段。引物如下：F：5′-TTGCGGCCGCCGATCCCACATGCAAACCATC-3′,NotI；R：5′-CCCTCGAGTTTACCCGCAGACTTAGAGG-3′，XhoI。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH₂O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，62℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作)。

实施例4牛源融合抗体scFv-Fc的表达和纯化

将实施例2中筛选到的阳性克隆提取质粒后采用NcoI和NotI内切酶双酶切，将实施例3中扩增得到的牛IgG Fc基因采用NotI和XhoI内切酶双酶切，两者与经过NcoI和XhoI酶切后的pET-28a(+)载体连接构建重组质粒后转化Rosetta细胞后进行诱导表达，然后采用Ni-NTA亲和层析方法纯化牛源融合抗体scFv-Fc。

实施例5牛源融合抗体scFv-Fc的体外抑菌作用研究

将上述得到的融合抗体scFv-Fc(100μg/ml)与10⁶cfu/mL的金黄色葡萄球菌在LB培养基内共同孵育，生理盐水和青霉素分别作为阴性对照和阳性对照组，每6h测一次OD600直至阴性对照组菌液浓度不再变化。结果显示24h后，融合抗体scFv-Fc处理组与青霉素处理组菌液一直透亮，OD600值约为0.06；而生理盐水处理组菌液浑浊度明显增加，OD600值约为1.01。

实施例6牛源融合抗体scFv-Fc的调理吞噬作用研究

1：从泌乳中期正常奶牛外周血中采用Percoll分离液，按照密度梯度离心法分离吞噬细胞；

2：10⁸CFU/mL金黄色葡萄球菌溶解在含5％FBS的RPMI培养基中，与牛源融合抗体scFv-Fc 37℃体外共同孵育1h(调理)，生理盐水和牛源scFv分别作为空白对照和阴性对照；

3：调理后的金黄色葡萄球菌与吞噬细胞(溶解在含5％FBS的RPMI培养基中)按照10：1的比例混合，37℃体外共同孵育1h，使吞噬细胞杀灭细菌；

4：建立标准曲线，用含5％FBS的RPMI培养基分别按照0％、30％、60％和90％的比例稀释2步骤中调理后的菌液；

5：分别取上述3步骤中和4步骤中按照不同比例稀释的调理后菌液100μL，与0.2％的皂素37℃体外作用10min使皂素充分裂解剩余的吞噬细胞；

6：在每管中分别加入100μL 2mg/mL的MTT试剂，37℃体外作用1h，使活菌充分转化为一种蓝紫色的物质；

7：3000×g离心10min，沉淀用DMSO悬浮，37℃作用30min；

8：酶标仪测定OD₅₆₀读值；

结果显示：与生理盐水处理的空白对照和scFv处理的阴性对照相比，牛源融合抗体scFv-Fc可以介导外周血吞噬细胞发挥调理吞噬作用，并在10-100μg/ml的浓度范围内呈剂量依赖性。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc及其制备方法

<141> 2018-07-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Ala Arg Tyr

20 25 30

Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Gly Leu Arg Thr Ile

35 40 45

Ile Tyr Asp Thr Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Val

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Thr Gly Asp Tyr Ser Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Ile Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Arg Glu Ala Gly Pro Ile Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Ser

20 25 30

Ala Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Arg Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Thr Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Asn Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Thr Val Arg Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Lys Asn Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Ser Pro Val Asp Ala Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser

115 120

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Glu

1 5 10 15

Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp

50 55 60

Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp

85 90 95

Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro

100 105 110

Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr

165 170 175

Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys

225 230

<210> 4

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Ala Arg Tyr

20 25 30

Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Gly Leu Arg Thr Ile

35 40 45

Ile Tyr Asp Thr Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Val

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Thr Gly Asp Tyr Ser Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Ile Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

115 120 125

Leu Arg Glu Ala Gly Pro Ile Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Ser Ala Val Gly

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Arg Ala Leu Glu Trp Val Gly Ala Ile

165 170 175

Asp Thr Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Asn Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Val Arg

195 200 205

Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Lys Asn Gly

210 215 220

Gly Tyr Gly Tyr Gly Ser Pro Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly Leu Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Ala Ala Ala Asp Pro Thr Cys Lys Pro

245 250 255

Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro

290 295 300

Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala

305 310 315 320

Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe

340 345 350

Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr

355 360 365

Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu

370 375 380

Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln

420 425 430

Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp

435 440 445

Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Thr Cys Val Val Met His

450 455 460

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala

465 470 475 480

Gly Lys

Claims

1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc，其特征在于，其至少具有如SEQ IDNo：1所示氨基酸序列的轻链可变区；如SEQ ID No：2所示氨基酸序列的重链可变区；如SEQID No：3所示氨基酸序列的Fc片段。

2.根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc，其特征在于：位于重链可变区和轻链可变区之间的中间连接肽为GGGGSGGGGSGGGGS。

3.根据权力要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc，其特征在于：所述的融合抗体具有如SEQ ID No：4所示的氨基酸序列。

4.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个淋巴细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因VH和轻链可变区VL基因；

(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选四轮；

(7)扩增牛IgG Fc片段，所扩增的Fc片段包含Hinge、CH2和CH3区域；

(8)将步骤(6)中筛选到的阳性scFv克隆、Fc片段与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒转化Rosetta细胞后，进行诱导表达所得产物即获得所述牛源性抗金黄色葡萄球菌的融合抗体scFv-Fc。

5.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在制备介导外周血吞噬细胞对金黄色葡萄球菌吞噬作用药物中的应用。

6.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在制备治疗奶牛乳腺炎药物、或奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。

7.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌融合抗体scFv-Fc在制备在用于制备奶牛乳腺炎的预防、治疗药物中的应用。