BRPI0712716A2 - proteìna de fusão, composição, construção de ácido nucleico, vetor, célula transformada, preparação isolada de corpos de inclusão bacterialmente expressados, processo para produzir uma proteìna de fusão, e, métodos para matar seletivamente uma célula de tumor e para tratar uma célula de tumor que expressa mesotelina em sua superfìcie - Google Patents

proteìna de fusão, composição, construção de ácido nucleico, vetor, célula transformada, preparação isolada de corpos de inclusão bacterialmente expressados, processo para produzir uma proteìna de fusão, e, métodos para matar seletivamente uma célula de tumor e para tratar uma célula de tumor que expressa mesotelina em sua superfìcie Download PDF

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Abstract

PROTEìNA DE FUSãO, COMPOSIçãO, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR, CéLULA TRANSFORMADA, PREPARAçãO ISOLADA DE CORPOS DE INCLUSãO BACTERIALMENTE EXPRESSADOS, PROCESSO PARA PRODUZIR UMA PROTEìNA DE FUSãO, E, MéTODOS PARA MATAR SELETIVAMENTE UMA CéLULA DE TUMOR E PARA TRATAR UMA CéLULA DE TUMOR QUE EXPRESSA MESOTELINA EM SUA SUPERFìCIE. Esta invenção provê proteínas de fusão compreendendo aminoácidos consecutivos que, começando no término amino da proteína, correspondem a aminoácidos consecutivos presentes em (i) um peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) uma <225>-2 microglobulina humana, (iv) um segundo ligador de peptídeo, (v) uma cadeia HLA-A2 de uma molécula de MHC de classe I humana, (vi) um terceiro ligador de peptídeo, (vii) uma região variável de uma cadeia pesada de um fragmento scFv de um anticorpo, e (viii) uma região variável de uma cadeia leve deste fragmento scFv, em que os aminoácidos consecutivos que correspondem a (vii) e (viii) são ligados juntos diretamente por uma ligação peptídeo ou por aminoácidos consecutivos que correspondem a um quarto ligador de peptídeo, em que o anticorpo do qual o fragmento scFv é derivado especificamente liga a mesotelina. Esta intenção provê construções de ácido nucleico codificando os mesmos, processos para produzir os mesmos, composições e usos dos mesmos.

Description

"PROTEÍNA DE FUSÃO, COMPOSIÇÃO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA TRANSFORMADA, PREPARAÇÃO ISOLADA DE CORPOS DE INCLUSÃO BACTERIALMENTE EXPRESSADOS, PROCESSO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, E, MÉTODOS PARA MATAR SELETIVAMENTE UMA CÉLULA DE TUMOR E PARA TRATAR UMA CÉLULA DE TUMOR QUE EXPRESSA MESOTELINA EM SUA SUPERFÍCIE"
Antecedentes da Invenção
Em todo este pedido, algumas publicações são mencionadas. As citações completas para estes publicações podem ser encontradas imediatamente precedendo as reivindicações. As descrições destas publicações são aqui incorporadas por referência neste pedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual esta invenção pertence.
De acordo com uma teoria de vigilância imune atual, o sistema imune continuamente localiza e destrói as células transformadas. No entanto, algumas células escapam da resposta imune aparentemente eficaz e conseqüentemente se tornam tumores (1-4). A evasão do tumor da resposta imune é um fenômeno bem estabelecido demonstrado em numerosos estudos e é causada por uma ampla variedade de mecanismos sugeridos (1-4). Dentre estes mecanismos estão: a produção de citocinas supressivas, a perda de peptídeos imunodominantes, a resistência a mecanismos de morte (apoptose), e a perda de MHC de classe I (1-4). Um dos mecanismos de evasão mostrados como estando fortemente correlacionado com a progressão do tumor é a perda ou regulação negativa das moléculas de MHC de classe I. Este mecanismo de evasão é abundante na maior parte dos tumores e pode resultar em um número de diferentes mutações. Vários estudos revelaram pontos fracos na carga de MHC de classe I e via de apresentação incluindo perda de beta-2- microglobulina, mutações TAPl/ TAP2, mutações de LMP, perda de heterozigocidade nos genes MHC, e regulação negativa de alelos de MHC específicos.
As estratégias de imunoterapia de câncer atuais tipicamente empregam os dois braços do sistema imune: os sistemas humoral e celular.
No primeiro, injeção sistêmica de anticorpos monoclonais de alta afinidade (mAbs) dirigido contra os antígenos associados com o tumor na superfície da célula demonstraram atividade anti-tumor estatisticamente significante em experiências clínicas (5,6). Além disso, mAbs anti-tumor que transportam efetuadores como citocinas ou toxinas estão sendo atualmente avaliados em experiências clínicas (7). A segunda abordagem principal para imunoterapia de câncer específica emprega o braço celular do sistema imune, principalmente os linfócitos T citotóxicos CD8+. Duas estratégias principais estão sendo atualmente usadas para aumentar a eficácia anti-tumor do braço celular do sistema imune: (i) imunização ativa de pacientes com peptídeos conhecidos como sendo reconhecidos por linfócitos T, e (ii) terapias de transferência adotiva que permitem a seleção, ativação, e expansão de sub- populações de células T altamente reativas com potência anti-tumor melhorada. Na primeira abordagem, os peptídeos limitados a MHC derivados de antígenos de associados com tumor recentemente identificados (como gp100, o grupo MAGE, NY-ESO-1) são usados para vacinar os pacientes. Estes peptídeos derivados de antígenos específicos de tumor são altamente específicos devido a sua expressão exclusiva em tecidos específicos (8-11). A segunda estratégia, transferência de células adotivas, mostrou recentemente resultados impressivos em pacientes com melanoma metastático em que células T reativas para tumor altamente selecionadas contra diferentes antígenos de diferenciação auto-derivados super-expressados foram isolados, expandidos ex vivo e re-introduzidos nos pacientes. Nesta abordagem, uma re-população clonal persistente de células T, proliferação in vivo, atividade funcional, e tráfico de sítios de tumor foram demonstrados (12-14). Uma nova abordagem imunoterapêutica recentemente apresentada toma vantagem de duas áreas bem estabelecidas: (i) a eficácia conhecida de linfócitos T citotóxicos CD8+ na eliminação de células apresentando complexos MHC/peptídeo altamente imunogênicos e (ii) a marcação dos antígenos de superfície de células específicas de tumor via fragmentos recombinantes de anticorpos, principalmente fragmentos de Fc de cadeia única (scFvs). Esta abordagem usa uma proteína de fusão recombinante composta de duas entidades funcionalmente distintas: (i) uma molécula de MHC de classe I de cadeia única que transporta um tumor altamente imunogênico ou peptídeo derivado viral e (ii) um fragmento scFv de alta afinidade, específico de tumor (15).Vários grupos previamente demonstraram que um peptídeo MHC biotinilado multimerizado em estreptavidina ou complexos de peptídeo matriz monoméricos HLA-A2/ influenza (resfriado) copulados via conjugação química de anticorpos específicos de tumor podem induzir in vitro a Iise mediada por linfócitos T de células de tumor revestidas (16-20). No entanto, estas abordagem utilizam conjugação química e usam anticorpos completos ou fragmentos maiores, por exemplo fragmentos Fab. No entanto, produção e homogeneidade devido à estratégia de copulação assim como capacidade de penetração de tumor são limitados devido ao tamanho grande de tais moléculas. Lev et al descrevem uma fusão genética criada entre um HLA-A2 recombinante de cadeia única e scFvs específicos de tumor. Estas fusões foram mostradas como sendo funcionais in vitro e in vivo, sendo capazes de especificamente induzir Iise in vitro e in vivo mediada por linfócitos T de células de tumor revestidas com alvo (15). A estabilidade da nova molécula quimérica é altamente dependente da presença do peptídeo no sulco MHC. Assim, dissociação do peptídeo do domínio scHLA-A2 da molécula quimérica pode afetar sua estabilidade. Oved et al se dirigiram a este problema por construção de novas moléculas quiméricas em que o peptídeo é conectado à construção scHLA- A2/scFv via um ligador curto. Esta nova proteína de fusão foi testada para sua atividade bioquímica e biológica in vitro (21).
Existe uma necessidade amplamente reconhecida para uma nova proteína de fusão que possa manter sua atividade dual; ligar células alvo de tumor através da porção scFv assim como mediar citotoxicidade potente, eficaz e específica através do recrutamento de células T CD8+, cuja especificidade é governada pelo peptídeo limitado HLA-2 covalentemente ligado.
O braço de efetuador (CT) de célula T citotóxica CD8+ limitada por MHC de classe I da resposta imune adaptativa é melhor equipado para reconhecer as células de tumor como estranhas e iniciar a cascata de eventos resultando em destruição do tumor. No entanto, tumores desenvolveram estratégias sofisticadas para escapar dos mecanismos de efetuador imune, das quais a melhor estudada é a regulação negativa de moléculas de MHC de classe I que apresentam os antígenos reconhecidos por CTLs.
Para superar a limitação de abordagens anteriores e desenvolver novas abordagens para imunoterapia, uma molécula recombinante foi construída em que MHC de cadeia única é especificamente marcado para células de tumor através de sua fusão para fragmentos de anticorpo recombinantes específicos de câncer ou um ligando que liga a receptores expressados por células de tumor.
Sumário da Invenção
Esta invenção provê uma proteína de fusão compreendendo aminoácidos consecutivos que, começando no término amino da proteína, correspondem a aminoácidos consecutivos presentes em (i) um peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) uma β-2 microglobulina humana, (iv) um segundo ligador de peptídeo, (v) uma cadeia HLA-A2 de uma molécula de MHC de classe I humana, (vi) um terceiro ligador de peptídeo, (vii) uma região variável de uma cadeia pesada de um fragmento scFv de um anticorpo, e (viii) uma região variável de uma cadeia leve deste fragmento scFv, em que os aminoácidos consecutivos que correspondem a (vii) e (viii) são ligados juntos diretamente por uma ligação peptídeo ou por aminoácidos consecutivos que correspondem a um quarto ligador de peptídeo e o fragmento scFv é derivado de um anticorpo que especificamente liga a mesotelina.
Esta invenção também provê composições compreendendo a proteína de fusão e um veículo.
Esta invenção ainda provê a construção de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão compreendendo aminoácidos consecutivos que, começando no término amino da proteína, correspondem a aminoácidos consecutivos presentes em (i) um peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) uma β-2 microglobulina humana, (iv) um segundo ligador de peptídeo, (v) uma cadeia HLA-A2 de uma molécula de MHC de classe I humana, (vi) um terceiro ligador de peptídeo, (vii) uma região variável de uma cadeia pesada de um fragmento scFv de um anticorpo, e (viii) uma região variável de uma cadeia leve deste fragmento scFv, em que os aminoácidos consecutivos que correspondem a (vii) e (viii) são ligados juntos diretamente por uma ligação peptídeo ou por aminoácidos consecutivos que correspondem a um quarto ligador de peptídeo e o fragmento scFv é derivado de um anticorpo que especificamente liga a mesotelina.
Esta invenção ainda provê uma preparação isolada de corpos de inclusão bacterialmente expressados compreendendo acima de 30 porcento em peso de uma proteína de fusão de acordo com a invenção.
Esta invenção também provê um processo para produzir uma proteína de fusão compreendendo cultivar uma célula transformada compreendendo uma proteína de fusão, de modo que uma proteína de fusão é expressada, e recuperando uma proteína de fusão assim expressada.
Esta invenção ainda provê um método de seletivamente matar uma célula de tumor que compreende contatar a célula com uma proteína de fusão da invenção em uma quantidade eficaz para iniciar uma resposta imune mediada por CTL contra a célula de tumor de modo a assim matar a célula de tumor.
Finalmente, esta invenção ainda provê um método de tratar uma célula de tumor que expressa mesotelina em sua superfície, que compreende contatar a célula de tumor com uma proteína de fusão de acordo com a invenção em uma quantidade eficaz para iniciar uma resposta imune mediada por CTL contra a célula de tumor para assim tratar a célula de tumor.
Uma molécula exemplar da presente invenção, uma molécula de MHC de cadeia única, composta de β2 microglobulina fusionada nos domínios al, a2 e a3 de HLA-A2 via um ligador de peptídeo curto (15 aminoácidos) foi fusionado no scFv SSl que marca mesotelina. Para construir uma proteína de fusão com peptídeo covalentemente ligado a peptídeo de 9 aminoácidos derivado da proteína CMV pp65 NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4) foi fusionado ao N-término da proteína de fusão scHLA-A2/SSl (scFv) via um ligador de 20 aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). A proteína de fusão foi expressada em E. coli e moléculas funcionais foram produzidas por reduplicação in vitro na presença de CMV/scHLA- A2/SS1 (scFv). Os estudos de citometria de fluxo revelaram a capacidade para decorar células de tumor humano, negativas para HLA-A2, positivas para antígeno, em um modo que foi completamente dependendo da especificidade do fragmento de anticorpo de marcação.
Mais importante, o revestimento mediado por CMV/scHLA- A2/SS1 (scFv) de células de tumor de alvo as tornaram susceptíveis para uma lise mediada por CTL, específica de peptídeo CMV, limitada por HLA-A2 específica e eficiente. Estes resultados demonstraram que a marcação específica de antígeno de tumor guiada por anticorpo de complexos de MHC- peptídeo sobre as células de tumor pode tornar as mesmas susceptíveis a, e potenciar, a morte de CTL. Esta nova abordagem agora abre o caminho para o desenvolvimento de novas estratégias imunoterapêuticas com base em marcação de anticorpo de ligandos de MHC cognatos naturais e mecanismos citotóxicos com base em CTL.
Em conexão com a presente invenção, uma nova estratégia foi desenvolvida para re-marcar complexos MHC de classe I - peptídeo sobre a superfície de células de tumor em um modo que é independente da extensão de expressão de MHC de classe I pelas células de tumor alvo. Para isto, em uma forma de realização da presente invenção, uma molécula com dois braços foi empregada. Um braço, a porção de marcação, compreende fragmentos recombinantes específicos de tumor de anticorpos dirigidos para antígeno de diferenciação ou de tumor que foram usados durante muitos anos para marcar radioisótopos, toxinas ou fármacos para as células de câncer. O segundo braço efetuador é uma molécula de MHC de cadeia única (scMHC) composta de β2- microglobulina humana ligada aos três domínios extracelulares de cadeia pesada de HLA-A2 (24, 25 WO 01/72768). Por conexão dos genes codificando os dois braços em um gene recombinante único e expressando o gene, a nova molécula é expressada eficientemente em E. coli e produzida, por exemplo, por reduplicação in vitro na presença de peptídeos HLA-2- CMV. Esta abordagem, como aqui descrito, torna as células de tumor alvo suscetíveis à Iise por células T citotóxicas apesar de seu nível de expressão de MHC e assim podem ser empregadas como uma nova abordagem para potenciar a imunidade anti-tumor mediada por TL. Esta nova abordagem irá levar ao desenvolvimento de uma nova classe de agentes terapêuticos recombinantes capazes de matar e eliminar seletivamente as células de tumor usando ligados MHC cognatos naturais e mecanismos citotóxicos com base em CTL. Breve Descrição dos Desenhos Figuras 1A-B
Representação esquemática de scHLA-A2/SSl (scFv) e um peptídeo (CMV) /scHLA-A2/SSl (scFv) (Composto A).
Figura 1A ilustra o C = término do scHLA-A2 fusionado ao N- término de SSl (scFv) via um ligador de 4 aminoácidos. Figura IB ilustra que o peptídeo CMV pp65, isto é NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4) foi fusionado no N-término do scHLA-A2/SSl (scFv) via um ligador de 20 aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). Figura 2
Seqüência de ácido nucleico codificando Composto A (SEQ
ID NO:1) Figuras 3A-B
Expressão e purificação de Composto A.
Figura 3A mostra a análise de SDS/PAGE de corpos de inclusão isolados.
Figura 3B mostra a análise de SDS/PAGE de composto A após a purificação em cromatografia de troca iônica.
Figura 4
Ligação de composto A a mesotelina recombinante.
Mesotelina foi imobilizada em imuno-placas e ligação dependente da dose de Composto A foi monitorada por mAb W6 de conformação sensível (33,34).
Figuras 5A-D
Ligação de composto A a células expressando mesotelina.
Figura 5A-B demonstra a análise de citometria de fluxo da ligação de Composto A a células A431K5 negativas para HLA-A2 e positivas para mesotelina e células A431 negativas para HLA-A2 e negativas para mesotelina. Figura 5A mostra ligação de Kl mAb (31,32) a células A431K5, e Figura 5B mostra ausência de ligação das Kl mAb a células A431. Figura 5C mostra a ligação de composto A a células A431K5, e Figura 5D mostra ausência de ligação de Composto A a células A431.
A ligação foi monitorada usando anticorpo BB7.2 específico de anti-HLA-A2 (35) e um anticorpo secundário rotulado FITC.
Figuras 6A-B
Potenciação de Iise mediada por CTL de células de tumor negativas para HLA-A2 por Composto A. Na Figura 6A, as células A431K5 transfectadas por mesotelina e as células A431 parentais negativas para mesotelina foram incubadas com Composto A (10 μg) e CTLs específicos para CMV em um teste de liberação de metionina [S35]. Figura 6B demonstra a atividade dependente de dose de Composto A quando as células A431K5 transfectadas por mesotelina e as células A431 parentais negativas para mesotelina foram incubadas com concentrações diferentes de Composto A e CTLs específicos para CMV em um teste de liberação de metionina [S35].
Figura 7
Representação esquemática de pep/scHLA-A2/SSl (scFv) (Composto B). No Composto Β, o peptídeo NLVPMVATV foi fusionado ao N-término de scHLA-A2/SSl (scFv) via um ligador de 15 aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8).
Figura 8
Seqüência de ácido nucleico codificando Composto B (SEQ ID NO: 22).
Figuras 9A-B
Expressão e purificação de Composto B.
Figura 9A mostra análise de SDS/PAGE de corpos de inclusão isolados. Figura 9B mostra análise de SDS/PAGE de Composto B após purificação em cromatografia de troca iônica.
Figuras 10A-F Ligação de Composto B a células expressando mesotelina.
Figuras 10A-F demonstram a análise de citometria de fluxo da ligação de Composto B a células A431K5 negativas para HLA-A2 e positivas para mesotelina e células A431 negativas para HLA-A2 e negativas para mesotelina. Figura IOA mostra ligação de K1 mAb a células A431K5, e Figura IOB mostra falta de ligação de K1 mAb a células A431 (B). Figura 10C mostra a ligação de composto B a células A431K5, e Figura 10D mostra falta de ligação de Composto B a células A431. Figura 10E mostra comparação entre a ligação de Composto A e Composto B a células A431K5, e Figura 10F mostra falta de ligação de Composto A e Composto B a células A431. A ligação foi monitorada usando anticorpo BB7.2 específico de anti-HLA-A2 e um anticorpo secundário rotulado FITC.
Figuras IIA-B
Potenciação de lise mediada por CTL-de células de tumor negativas para HLA-A2 por Composto B.
Na Figura 11A, células A431K5 transfectadas por mesotelina e as células A431 parentais negativas para mesotelina foram incubadas com Composto B (10 μg) e CTLs específicos para CMV- em um [S35] teste de liberação de metionina. Figura 1IB demonstra a atividade dependente de dose de composto B, quando células A431K5 transfectadas com mesotelina e as células A431 parentais negativas para mesotelina foram incubadas com concentrações diferentes de Composto A e CTLs específicos para CMV em um teste de liberação de metionina [S35].
Figura 12
Potenciação de Iise mediada por CTL de células de tumor negativas para HLA-A2 por Composto B e Composto A. As células A431K5 transfectadas por Mesotelina e as células A431 parentais negativas para mesotelina foram incubadas com concentrações diferentes de Composto B ou Composto A e com CTLs específicos para CMV em um teste de liberação de metionina[S35]. A figura mostra resultados de incubação de Composto A com células A431K5, incubação de Composto B com células A431K5, incubação de Composto A com células A431, e incubação de Composto B com células A431.
Figuras 13Λ-Β
Representação esquemática de scHLA-A2/SSl (scFv) e M1cov/scHLA-
A2/SS1 (scFv).
Figura 13A mostra C-térmica do scHLA-A2 fusionado ao Ν- término de scFv via ligador de 4 aminoácidos. Figura 13B mostra peptídeo Ml58-66 fusionado ao N-término do scHLA-A2/SSl (scFv) via um ligador de 15 aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8). Figura 14
Seqüência de ácido nucleico codificando a proteína de fusão M1 -cov/scHLA-A2/SSl (scFv) (SEQ ID NO:23). Figuras 15 A-B
Expressão e purificação da proteína de fusão Ml-cov/scHLA-
A2/SS1 (scFv).
Figura 15A mostra a análise de SDS/PAGE de corpos de inclusão isolados. Figura 15B mostra a análise de SDS/PAGE de proteína de fusão Ml-cov/scHLA- A2/SS1 (scFv) após purificação em cromatografia de troca iônica. Em
Figura 16
Ligação da proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv) para Mesotelina recombinante. Mesotelina foi imobilizada sobre placas imuno e ligação dependente de dose de Ml-cov/scHL-A-A2/SSl (scFv) foi monitorada por mAb sensível à conformação (W6).
Figuras 17A-D
Ligação de proteína de fusão Ml-cov/scHI_A-A2/SSl (scFv) a células expressando Mesotelina. Figuras 17A-D mostram análise de citometria de fluxo de ligação de Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv) para células A431K5 positivas para mesotelina negativas para HLA- A2- e células A431 negativas para mesotelina e negativas para HLA-A2. Figura 17A mostra ligação de Kl mAb a células A431K5, e Figura 17B mostra ausência de ligação de Kl mAb para células A431. Figura 17C mostra ligação de proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv) para células A431K5, e Figura 17D mostra ausência de ligação de proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv) a células A431. A ligação foi monitorada usando anticorpo BB7.2 específico anti-HYLA_A2 e um anticorpo secundário rotulado FITC. Figura 18
Potenciação de Iise mediada por CTL de células de tumor negativas para HLA-A2 por proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv). células A431K5 transfectadas por mesotelina e células A431 parentais negativas para mesotelina foram incubadas com concentração diferente de M1 -cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) e com CTLs limitados em HLA-A2 específicos para Ml em um teste de liberação de metionina [S].
Descrição Detalhada da Invenção
Esta invenção provê uma proteína de fusão compreendendo aminoácidos consecutivos que, começando no término amino da proteína, correspondem aminoácidos consecutivos presentes em (i) um peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) uma β-2 microglobulina humana, (iv) um segundo ligador de peptídeo, (v) uma cadeia HLA-A2 de uma molécula de MHC de classe I humana, (vi) um terceiro ligador de peptídeo, (vii) uma região variável de uma cadeia pesada de um fragmento scFv de um anticorpo, e (viii) uma região variável de uma cadeia leve deste fragmento scFv, em que os aminoácidos consecutivos que correspondem a (vii) e (viii) são ligados juntos diretamente por uma ligação peptídeo ou por aminoácidos consecutivos que correspondem a um quarto ligador de peptídeo e o fragmento scFv é derivado de um anticorpo que especificamente liga a mesotelina. Em uma forma de realização, o primeiro ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). Em outra forma de realização, o segundo ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8). Em outra forma de realização, o terceiro ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido ASGG (SEQ ID NO: 10). Em outra forma de realização, o quarto ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido GVGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19). Em outra forma de realização, o peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano tem a seqüência de aminoácido NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4).
Como usado aqui, "primeiro ligador de peptídeo", "segundo ligador de peptídeo" e "quarto ligador de peptídeo" referem-se a peptídeos compostos de um peptídeo monomérico cuja seqüência de aminoácido é GXGGS (SEQ ID NO: 20) ou um multímero do mesmo, em que X pode ser qualquer aminoácido. Estes ligadores de peptídeos podem ser um multímero de 2-10 deste peptídeo monomérico. Em qualquer tal multímero, cada peptídeo monomérico pode ser igual ou diferente de outro peptídeo monomérico no multímero dependendo da identidade de aminoácido X. Em uma forma de realização, X no peptídeo monomérico é o aminoácido valina (V). Em outra forma de realização, X no peptídeo monomérico é o aminoácido glicina. (G). Em formas de realização atualmente preferidas, o ligador de peptídeo compreende um multímero de três ou quatro peptídeo monoméricos, particularmente um multímero de três peptídeos monoméricos em que o X o mais N-terminal é o aminoácido V, e o segundo e terceiro X são o aminoácido G.
Em uma forma de realização, a seqüência dos aminoácidos consecutivos correspondendo a (vii), seguido pelo quarto ligador de peptídeo, seguido por (viii) é especificada em SEQ ID NO: 12. Em outra forma de realização, os aminoácidos consecutivos de uma proteína de fusão, Composto A, têm uma seqüência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 2.
Esta invenção também provê uma composição compreendendo uma proteína de fusão de acordo com a invenção e um veículo. Em uma forma de realização, a proteína de fusão está presente na composição em uma quantidade terapeuticamente eficaz e o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.
Esta invenção também provê uma construção de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão compreendendo aminoácidos consecutivos que, começando no término amino da proteína, correspondem a aminoácidos consecutivos presentes em (i) um peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) uma β-2 microglobulina humana, (iv) um segundo ligador de peptídeo, (v) uma cadeia HL.A-A2 de uma molécula de MHC de classe humana, (vi) um terceiro ligador de peptídeo, (vii) uma região variável de uma cadeia pesada de um fragmento scFv de um anticorpo, e (viii) uma região variável de uma cadeia leve deste fragmento de scFv, em que os aminoácidos consecutivos que correspondem a (vii) e (viii) estão ligados juntos diretamente por uma ligação peptídeo ou por aminoácidos consecutivos que correspondem a um quarto ligador de peptídeo e o fragmento scFv é derivado de um anticorpo que especificamente liga a mesotelina. Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico tem a seqüência de ácido nucleico especificada em SEQ ID NO:1.
Esta invenção também provê um vetor compreendendo a construção de ácido nucleico da invenção. Exemplos destes vetores são plasmídeos, vírus, fagos e semelhantes.
Esta invenção ainda provê um vetor de expressão compreendendo a construção de ácido nucleico da invenção e um promotor ligado operativamente à mesma.
Esta invenção também provê uma célula transformada compreendendo um vetor de acordo com a invenção. A célula transformada pode ser uma célula eucariótica, por exemplo uma selecionada dentre o grupo consistindo de uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de levedura, e uma célula de protozoário. Alternativamente, a célula transformada pode ser uma célula bacteriana.
Esta invenção provê uma preparação isolada de corpos de inclusão expressados bacterialmente, compreendendo acima de 30 porcento em peso de uma proteína de fusão de acordo com a invenção.
Esta invenção também provê um processo para produzir uma proteína de fusão compreendendo cultivar a célula transformada da invenção de modo que uma proteína de fusão é expressada, e recuperando uma proteína de fusão assim expressada. Em uma forma de realização, a recuperação de uma proteína de fusão compreende submeter a proteína de fusão expressada a cromatografia de exclusão de tamanho. Em outra forma de realização, a proteína de fusão é expressada em corpos de inclusão. Em uma forma de realização, o processo ainda compreende tratar os corpos de inclusão de modo a separar e a reduplicar a proteína de fusão e assim produzir uma proteína de fusão em uma forma ativa. Em outra forma de realização, o tratamento dos corpos de inclusão para separar a proteína de fusão do mesmo compreende contatar os corpos de inclusão com um agente desnaturante.
Como usado aqui, uma "forma ativa" de uma proteína de fusão significa uma conformação tri- dimensional de uma proteína de fusão que permite à proteína de fusão ligar especificamente a mesotelina quando a mesotelina está presente sobre a superfície de uma célula de tumor..
Esta invenção também provê um método de seletivamente matar uma célula de tumor, que compreende contatar a célula com uma proteína de fusão da invenção em uma quantidade eficaz para iniciar uma resposta imune mediada por CTL contra a célula de tumor para assim matar a célula de tumor. Em uma forma de realização, a célula de tumor está em um paciente e o contato é efetuado por administração de uma proteína de fusão ao paciente.
Esta invenção ainda provê um método de tratar uma célula de tumor que expressa mesotelina em sua superfície, que compreende contatar a célula de tumor com uma proteína de fusão de acordo com a invenção em uma quantidade eficaz para iniciar a resposta imune mediada por CTL contra a célula de tumor para assim tratar a célula de tumor. Em uma forma de realização, a célula de tumor está presente em um tumor sólido. Em outra forma de realização, o tumor sólido é um tumor associado com câncer ovariano, pulmão, pancreático ou cabeça/pescoço, ou mesotelioma.
A presente invenção provê (i) novas proteínas de fusão; (ii) processos de preparar as mesmas (iii) construção de ácido nucleicos codificando as mesmas, e (iv) métodos de usar as mesmas para matar seletivamente as células, particularmente células de câncer.
Os princípios e operação da presente invenção podem ser melhor entendidos com referência às figuras e descrição especificada aqui abaixo.
Será entendido que a invenção não é limitada em sua aplicação aos detalhes especificados na descrição ou como exemplificados. A invenção engloba outras formas de realização e é capaz de ser praticada ou realizada em vários modos. Também, deve-se entender que a fraseologia e terminologia empregadas aqui é para o fim de descrição e não devem ser considerados como limitativos.
A progressão do tumor é com freqüência associada com a secreção de fatores imune-supressivos e/ou a regulação negativa de funções de apresentação de antígeno MHC de classe I (2). Mesmo quando uma resposta de CTL específica é demonstrada em pacientes, esta resposta é baixa porque a população CTL anti-tumor é rara, muito não freqüente, e em alguns casos os CLTS não são funcionais ou anérgicos (26). Além disso, é bem estabelecido que o número de complexos MHC- peptídeo na superfície das células de tumor que apresentam um peptídeo associado com tumor particular é baixo (27). O progresso signiflcante para o desenvolvimento de vacinas que podem estimular uma resposta imune contra tumores tem envolvido a identificação dos antígenos de proteína associados com um dado tipo de tumor e mapeamento de epítopos de antígenos de tumor para motivos de ligação restringidos a MHC de classe I e classe II foram identificados e estão sendo atualmente usados em vários programas de vacinação (14, 11, 8). As moléculas de MHC de classe I apresentando os peptídeos apropriados são necessárias para prover os sinais específicos para reconhecimento e morte por CTLs. No entanto, o mecanismo principal de escape de tumor é a perda, regulação negativa ou alteração de perfis de HLA que podem tornar a célula alvo não responsiva a Iise de CTL, mesmo se a célula expressar o antígeno de tumor apropriado.
A presente invenção provê uma nova abordagem para superar este problema. Enquanto se reduz a presente invenção à prática, a marcação específica de tumor de complexos de MHC de classe I -peptídeo em células de tumor foi mostrada como sendo uma estratégia eficaz e eficiente para tornar as células negativas para HLA- A2 suscetíveis à Iise por CTLs limitados em HLA-A2 relevantes. Esta nova estratégia de redirecionar CTLs contra as células de tumor toma vantagem do uso de fragmento de anticorpo recombinante anti- mesotelina e ligando de CMV que podem localizar em células malignas que expressam um tumor com um grau relativamente elevado de especificidade.
O fragmento de marcação de anticorpo anti - mesotelina e ligando CMV são fusionados a uma molécula HLA-A2 de cadeia única que pode ser duplicada de modo eficiente e funcional. Os resultados aqui apresentados provêem uma demonstração clara da utilidade da abordagem da presente invenção para recrutar CTLs ativos para a morte de célula de tumor via anticorpo específico para câncer ou ligando guiado marcando os complexos scMHC- peptídeo. Estes resultados pavimentam a via para o desenvolvimento de nova abordagem imuno terapêutica com base em respostas imunes celulares de ocorrência natural que são redirecionadas contra as células de tumor.
Será notado que a proteína de fusão da presente invenção ou porções da mesma pode ser preparada por vários modos, incluindo síntese de proteína em fase sólida. NO entanto, na forma de realização preferida da invenção, pelo menos porções principais das moléculas, por exemplo o domínio scHLA-A2 (com ou sem o peptídeo CMV) e o domínio scFV são gerados por tradução de uma construção de ácido nucleico respectiva ou construções codificando a molécula.
Assim, uma a três matrizes de leitura aberta são requeridas para sintetizar as moléculas da figura IB via tradução. Estas matrizes de leitura aberta podem residir em uma única, duas ou três moléculas de ácido nucléico. Assim por exemplo, uma construção de ácido nucleico única pode transportar uma duas ou todas as três matrizes de leitura aberta. Uma a três seqüências regulatórias cis-atuantes podem ser usadas para controlar a expressão de uma a três matrizes de leitura aberta. Por exemplo, uma única seqüência regulatória cis-atuante pode controlar a expressão de uma, duas ou três, matrizes de leitura aberta em um modo de tipo cistrone. Na alternativa, três seqüências regulatórias cis-atuantes independentes podem ser usadas para controlar a expressão das três matrizes de leitura aberta. Outras combinações são também visadas.
As matrizes de leitura aberta e as seqüências regulatórias cis- atuantes podem ser transportadas por uma a três moléculas de ácido nucléico. Por exemplo, cada matriz de leitura aberta e sua seqüência regulatória eis- atuante são transportadas por uma molécula de ácido nucleico diferente, ou todas as matrizes de leitura aberta e suas seqüências regulatórias cis-atuantes associadas são transportadas por uma única molécula de ácido nucléico. Outras combinações são também visadas.
A expressão da proteína de fusão pode ser efetuada por transformação/transfecção e/ou co-transformação/co- transfecção de uma célula única ou uma pluralidade de células com qualquer uma das moléculas de ácido nucléico, servindo como vetores de transformação/transfecção (por exemplo, como plasmídeos, fagos, fagemídeos ou vírus).
Será notado que uma proteína de fusão cuja seqüência de aminoácido é especificada em SEQ ID NO: 2 e inclui o aminoácido N- terminal metionina, representa do mesmo modo uma proteína de fusão como expressada em uma célula bacteriana. Dependendo da célula bacteriana específica empregada par expressar a proteína de fusão, a metionina N- terminal pode ser clivada e removida. Conseqüentemente, é contemplado que as proteínas de fusão de acordo com esta invenção engloba ambas as com, como as sem, uma metionina N-terminal. Em geral, quando uma proteína de fusão de acordo com a invenção é expressada em uma célula eucariótica, ela iria falta a metionina N-terminal. Assim, deve ser apreciado que a seqüência de aminoácido de proteínas de fusão expressadas de acordo com a invenção pode incluir ou não incluir esta metionina N-terminal dependendo do tipo de células em que as proteínas são expressadas.
Sempre e onde que é usado, o peptídeo ligador é selecionado dentre uma seqüência de aminoácido que é inerentemente flexível, de modo que os polipeptídeos conectados assim independentemente e nativamente duplicam após a expressão dos mesmos, assim facilitando a formação de um complexo p2M/HLA humano de cadeia única (sc), funcional ou ativo, marcação de anticorpo ou completo de antígeno limitado em -CMV p2M/HLA humano. Qualquer uma das construções de ácido nucleico descritas aqui compreende pelo menos uma seqüência regulatória cis-atuante ligada operativamente aos polinucleotídeos de codificação aqui. Preferivelmente, a seqüência regulatória cis-atuante é funcional em bactérias. Alternativamente, a seqüência regulatória cis-atuante é funcional em levedura. Ainda alternativamente, a seqüência regulatória cis-atuante é funcional em é funcional em células de animais. Ainda alternativamente, a seqüência regulatória cis-atuante é funcional em células de plantas.
A seqüência regulatória cis-atuante pode incluir uma seqüência de promotor e seqüências de melhorador translacional ou transcripcional adicionais todas das mesmas servindo para facilitar a expressão dos polinucleotídeos quando introduzidos em uma célula hospedeira. Os exemplos específicos de promotores são descritos abaixo em contexto de vários sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos e na seção de exemplo que se segue.
Será notado que uma única seqüência regulatória cis-atuante pode ser usada em uma construção de ácido nucleico para dirigir a transcrição de um único transcrito que inclui uma ou mais matrizes de leitura aberta. No último caso, um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) pode ser usado de modo a permitir a tradução da seqüência de ácido nucleico internamente posicionada.
Sempre que a co-expressão de polipeptídeos independentes em uma célula única for escolhida, a construção ou construções empregadas devem ser configuradas de modo que os níveis de expressão dos polipeptídeos independentes são otimizados, de modo a obter proporções maiores de produto final.
Preferivelmente, um promotor (sendo um exemplo de uma seqüência regulatória cis-atuante) utilizado pela construção(ões) de ácido nucleico da presente invenção é um promotor constitutivo forte como que níveis elevados de expressão são atingidos para os polinucleotídeos após a transformação da célula hospedeira.
Será notado que níveis elevados de expressão também podem ser efetuados por transformação da célula hospedeira com um número de cópias elevado de construção (ões) de ácido nucleico, ou por utilização de seqüências cis-atuantes que estabilizam o transcrito resultante e como tal diminuem a degradação ou viragem de tal transcrito.
Como usado aqui, a expressão "célula transformada" descreve uma célula em que uma seqüência de ácido nucleico exógena é introduzida para assim alterar geneticamente de modo estável ou transiente a célula hospedeira. Pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na técnica, alguns do quais são descritos em detalhes abaixo no contexto com exemplos específicos de células hospedeiras.
A célula transformada hospedeira pode ser uma célula procariótica, como por exemplo, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de levedura, e uma célula de protozoário, ou alternativamente, a célula pode ser uma célula bacteriana.
Quando utilizada para expressão de célula hospedeira procariótica, a construção (ões) de acordo com a presente invenção podem ser um vetor bidirecional, que pode propagar tanto em E. coli (em que a construção kp um marcador selecionável apropriado e origem de replicação) e pode ser compatível para expressão em células hospedeiras eucarióticas. A construção (ões) de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode(m) ser por exemplo um plasmídeo um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.
Os sistemas de expressão de mamíferos apropriados incluem, mas não são limitados a pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pZeoSV2 (+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, que são disponíveis de Invitrogen™ Corporation (Carlsbad, CA USA), pCI que é disponível de Promega™ Corporation (Madison WI USA), pBK-RSV e pBK- CMV que são disponíveis de Stratagene" (La Jolla, CA USA), pTRES que é disponível de Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA USA), e seus derivados.
As culturas de células de insetos também podem ser usadas para expressar as seqüências de ácido nucleico da presente invenção. Os sistemas de expressão de insetos apropriados incluem, mas não são limitados a sistema de expressão de baculovírus e seus derivados que são comercialmente disponíveis de numerosos fornecedores como maxBac™ (Invitrogen™ Corporation, Carlsbad, CA USA) BacPak™ (Clontech(R) Laboratories, Inc. Mountain View, CA USA), ou Bac-to-Bac™ (Invitrogen™/Gibco(R), Carlsbad, CA USA).
A expressão das seqüências de ácido nucleico da presente invenção também pode ser afetada em células de plantas. Como usado aqui, a expressão "célula de planta" pode fazer referência a protoplastos de plantas, células de uma cultura de tecido de planta, células de tecidos derivados de plantas ou células de plantas completas.
Existem vários métodos de introdução de construções de ácido nucleico em células de plantas. Estes métodos baseiam-se em ou integração estável da construção de ácido nucleico ou uma porção da mesma no genoma da célula da planta, ou em expressão transiente de construção de ácido nucleico em cujo caso estas seqüências não são estavelmente integradas no genoma da célula da planta.
Existem dois métodos principais de efetuar a integração genômica estável de seqüências de ácido nucleico exógenas como as incluídas dentro da construção de ácido nucleico da presente invenção em genomas de células de plantas:
(i) transferência mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Geneties of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.
(ii) absorção de DNA direta: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para a absorção direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072- 1074. DNA uptake induced by brief electric shock of plant cells: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. DNA injection into plant cells ou tissues by particle bombardment, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; ou pela incubação direta de DNA com pólen germinante, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83:715-719.
O sistema de Agrobacterium inclui o uso de vetores de plasmídeo que contém segmentos de DNA definidos que integram no DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação do tecido de planta variam dependendo da espécie de planta e o sistema de distribuição de Agrobacterium. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento de disco de folha, ver, por exemplo, Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar empregada o sistema de distribuição de Agrobacterium em combinação com infiltração a vácuo. O sistema de Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas estavelmente transformadas.
Existem vários métodos de transferência de DNA direta em células de plantas. Em eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um campo elétrico forte. Em micro-injeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células usando micropipetas muito pequenas.
No bombardeio de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis como cristais de sulfato de magnésio, partículas de tungstênio ou partículas de ouro, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de plantas. A transferência de DNA direta também pode ser usada para transformar transientemente células de plantas.
Em qualquer caso, promotores de plantas apropriados que podem ser usados para expressão de células de plantas das primeira e segunda seqüências de ácido nucleico incluem, mas não são limitados ao promotor CaMV 35S, promotor de ubiquitina, e outros promotores fortes que podem expressar as seqüências de ácido nucleico em um modo constitutivo ou específico de tecido.
Os vírus de plantas também podem ser usados como vetores de transformação. Os vírus que foram mostrados como úteis para a transformação de células hospedeiras de plantas incluem CaV, TMV e BV. A transformação de plantas usando vírus de plantas é descrita em Pat. U.S. No. 4.855.237 (BGV), EP- A 67,553 (TMV), Pedido publicado japonês No. 63- 14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas em WO 87/06261.
A construção de vírus de RNA de plantas para a introdução e expressão de seqüências de ácido nucleico exógenas não virais em plantas é demonstrada pelas referências acima assim como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; e Takamatsu et al. FEBS Letters (1990)269:73-76.
Quando o vírus é um vírus de DNA, as construções podem ser feitas no próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiro clonado em um plasmídeo bacteriano para facilidade de construção de vetor viral desejado com as seqüências de ácido nucleico descritas acima. O vírus pode ser então excisado do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem de replicação bacteriana pode ser fixada ao DNA viral., que é então replicado pelas bactérias. A transcrição e a tradução deste DNA irá produzir a proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídeo. O plasmídeo é então usado para fazer todas as construções. O vírus de RNA é então produzido por transcrição da seqüência viral do plasmídeo e tradução dos genes virais para produzir a proteína (s) de revestimento que encapsida o RNA viral.
A construção de vírus de RNA de planta para a introdução e expressão em plantas de seqüências de ácido nucleico exógenos não virais como os incluídos na construção da presente invenção é demonstrada pelas referências acima assim como patente US 5 316 931.
As células de levedura também podem ser usadas como células hospedeiras pela presente invenção. Exemplos numerosos de vetores de expressão de levedura apropriados para expressão das seqüências de ácido nucleico da presente invenção em levedura são bem conhecidos na técnica e são comercialmente disponíveis. Estes vetores são geralmente introduzidos em uma célula hospedeira de levedura via métodos de transformação química ou eletroporação bem conhecidos na técnica. Os sistemas comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, os sistemas de expressão pYES™ (Invitrogen™ Corporation, Carlsbad CA, USA) ou o YEX™ (Clontech* Laboratories, Mountain View, CA USA).
Será notado que quando expressada em sistemas de expressão eucarióticos como os descritos acima, a construção de ácido nucleico preferivelmente inclui uma seqüência codificando peptídeo de sinal como os polipeptídeos produzidos das primeira e segunda seqüências de ácido nucleico são dirigidas via o peptídeo de sinal fixado em vias de secreção. Por exemplo, em células hospedeiras de mamíferos, insetos e levedura, os polipeptídeos expressados podem ser secretados para o meio de crescimento, enquanto em sistemas de expressão de plantas, os polipeptídeos podem ser secretados no apoplasto, ou dirigidos em um organelo subcelular.
Um hospedeiro bacteriano pode ser transformado com a seqüência de ácido nucleico via métodos de transformação bem conhecidos, incluindo por exemplo transformação química (por exemplo CaCl2) ou eletroporação.
Numerosos exemplos de sistemas de expressão bacterianos que podem ser usados para expressar as seqüências de ácido nucleico da presente invenção são bem conhecidos na técnica. Os sistemas de expressão bacterianos comercialmente disponíveis incluem, mas não são limitados a sistema de expressão pET™ (Novagen(R), EMB Biosciences, San Diego, CA USA), sistema de expressão pSE™ (Invitrogen™ Corporation, Carlsbad CA, USA) ou o sistema de expressão pGEX™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ USA).
Como é ainda descrito na seção de Detalhes Experimentais que se seguem, a expressão bacteriana é particularmente vantajosa porque os polipeptídeos expressados formam corpos de inclusão substancialmente puros prontamente levando à recuperação e purificação do polipeptídeo expressado.
Assim, esta invenção provê uma preparação de corpos de inclusão expressados bacterianos, que são compostos de acima de 30%, preferivelmente acima de 50%, mais preferivelmente acima de 75%», o mais preferivelmente acima de 90 % em peso de proteína de fusão ou uma mistura de proteínas de fusão da presente invenção. O isolamento destes corpos de inclusão e a purificação da(s) proteína (s) de fusão a partir dos mesmos são descritos em detalhes na seção de Detalhes Experimentais que se segue. A expressão bacteriana da(s) proteína (s) de fusão pode prover quantidades elevadas de formas puras e ativas de proteínas de fusão.
Como é ainda descrito na seção de Detalhes Experimentais que segue, as proteínas de fusão expressadas formam corpos de inclusão substancialmente puros que são prontamente isolados por técnicas de fracionamento bem conhecidas na técnica e purificadas via por exemplo etapas de desnaturação - renaturação.
As proteínas de fusão da invenção podem ser renaturadas e reduplicadas na presença de um peptídeo limitado a MHC, que é ou ligado a, co-expressado com ou misturado com outros polipeptídeos da invenção e sendo capaz de ligar o polipeptídeo de MHC de classe I de cadeia única. Com é ainda descrito na seção de exemplos, isto permite gerar um complexo peptídeo antigênico - MHC de classe I substancialmente puro que pode ser ainda purificado via cromatografia de exclusão de tamanho.
Será notado que o peptídeo CMV usado para a reduplicação pode ser co-expressado junto com (com um peptídeo independente) ou ser fusionado à cadeia scHLA-A2 da molécula MHC de classe I nas bactérias. Em tal caso, a proteína de fusão expressada e peptídeo co-formam corpos de inclusão que podem ser isolados e usados para formação de complexo peptídeo antigênico - MHC de classe I.
A seguinte seção provê exemplos específicos para cada um dos vários aspectos da invenção aqui descrita. Estes exemplos não devem ser considerados como limitando em qualquer modo, como a invenção pode ser praticada em modos similares, ainda um pouco diferentes. Estes exemplos, no entanto, ensinam a um versado na técnica como praticar várias alternativas e formas de realização da invenção.
Em geral, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos de laboratório usados na presente invenção incluem técnicas de DNA moleculares, bioquímicas, microbiológicas e recombinantes. Estas técnicas são completamente explicada na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias como especificado em patentes US Nos. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells- A Manual of Basic Technique" por Freshney, wiley-Liss, Ν. Y. (1994),3a. ed.; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" (8a. ed), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994),- Mishell e Shiigi (eds), " Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman e Co., New York (1980); imunotestes disponíveis são extensivamente descritos na literatura científica e de patentes, ver por exemplo, patentes US Nos. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Aeademic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Aeademic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification e Charaeterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos sendo incorporados aqui por referência como se completamente especificados. Outras referências gerais são providas em todo este documento.
Os procedimentos aqui são bem conhecidos na técnica, como se acredita, e são providos para a conveniência do leitor. Toda a informação aqui contida é incorporada aqui por referência. Detalhes Experimentais Materiais e Métodos: Clonagem de Composto A
O SCHLA-A2/SS1 (scFv) foi construído como previamente descrito por ligação do C-término de scHLA-A2 ao N-término do SSl scFv via um ligador curto ASGG (SEQ ID NO: 4) (15). Para construir o scHLA- A2/SS1 (scFv) com peptídeo covalentemente ligado limitado em MHC, o peptídeo limitado em MHC foi fusionado com o ligador de peptídeo GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6) no N-término da molécula de scHLA- A2/SS1 (scFv) por uma reação de extensão de sobreposição PCR com os iniciadores: 5 ' M1-5 'GGAAGCGTTGGCGCATATGGGCATTCTGGGCTTCGTGTTTACC CTGGGCGGAGGAGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGG ATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3 ' (SEQ ID NO: 13) e 3'VLscSSl- 5'GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGTS ' (SEQ ID NO: 14). No iniciador 5'M1, uma mutação silente foi inserida na seqüência do ligador, esta mudança na seqüência cria um sítio de restrição BamH1.
Os produtos de PCR foram subclonados em vetor de clonagem detA (pGEM-T Easy Vector, Promega™ Corporation, Madison, WI USA) e subseqüentemente em um vetor de expressão à base do promotor T7 (PRB) usando os sítios de restrição Ndel e EcoRL
Para gerar o Composto A, Ml/scHLA-A2/SSl (scFv) foi usado como um gabarito para ligação com iniciador dsDNA. O Ml/scHLA-A2/SSl (scPv) (em plasmídeo PRB) foi digerido com Ndel e BamHI, e a fração do plasmídeo foi ligada ao iniciador dsDNA contendo a seqüência de peptídeo CMY e a extensão da seqüência de ligador 5 ' CMVcovLL (cassete): 5 ' TATGAACCTGGTGCCGATGGTCGCGACCGT TGGAGGTGGCGGTTCTGGCGGAGGAG-3 ' (SEQ ID NO: 15) e 3 ' CMVcovLL (cassete): 5' GATC CTCCTCCGCCAGAACCGCCACCTCCAACGGTCGCGACCATCGGCA CCAGGTTCA 3' (SEQ ID NO: 16). O anelamento dos iniciadores (5' CMVcovLL (cassete) e 3 ' CMVcovLL (cassete)) foi realizado por incubação dos iniciadores a 950C por 2 min seguido por 1 hora de incubação em temperatura ambiente. O produto de ligação foi transformado em DH5a de E- coli para amplificação do plasmídeo. O plasmídeo foi purificado por kit QIAGEN® miniprep (Qiagen*, Inc., Valencia, CA USA) e as amostras foram colocadas para análise de seqüência.
Reduplicação da expressão e purificação de composto A
Composto A foi expressado em células LB21 (λΟΕ3) de E-coli (Novagen*, Madison, WI USA) como corpos de inclusão. A construção de Composto A foi transformada em células de E-coli por choque térmico, células foram colocadas em placas LBAMP e incubadas durante a noite a 37°C. Colônias foram transferidas para meio rico (super caldo) suplementado com glicose, MgSO4, AMP e sais. As células foram cultivadas a DO=2 (600 nm) a 37°C, induzidas com IPTG (concentração final ImM) e incubadas por mais 3h a 37°C.
Corpos de inclusão foram purificados do grânulo de células por ruptura das células com 0,2 mg/ml de lisozima seguido pela adição de 2,5% Triton® X-100 (Octilfenolpoli [etilenoglicol éter] x, Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) e 0,5M NaCl. Os grânulos dos corpos de inclusão foram coletados por centrifugação (13,000 rpm, 60 min a 4°C) e lavados três vezes com 50 mM tampão Tris r pH 7,4 contendo 20 mM EDTA. Os corpos de inclusão isolados e purificados foram solubilizados em 6M Guanidina HCl pH 7,4, seguido por redução com 65- mM DTE. Os corpos de inclusão solubilizados e reduzidos foram reduplicados por uma diluição de 1:100 em um sistema de tampão redox- embaralhamento, contendo 0,1-M Tris, Ο,ΟΟΙΜ EDTA, 0,5-M 5 Arginina, e 0,09-mM Glutationa oxidada, pH 9, e incubação a 10 0C durante 24 h. Após ter sido reduplicada a proteína foi dialisada contra 150-mM Uréia, 20-mM Tris, pH 8, seguido por purificação do Composto A solúvel por cromatografia de troca iônica em uma coluna Q- Sepharose ® (7,5 mm I.D 60 cm) (Sigma- Aldrich, Inc., St. Louis, 0 MO USA), aplicando um gradiente de sal (NaCl). As frações de pico contendo Composto A foram então submetidas a uma troca de tampão com PB S.
Clonagem de Composto B
O scHLA-A2/SS1 (scFv) foi construído como previamente 20 descrito por ligação do C-término de scHLA-A2 ao N-término do SSl scFv via um ligador curto ASGG (SEQ ID NO: 15). Para construir o SCHLA- A2/SS1 (scFv) com peptídeo covalentemente ligado limitado em MHC, o peptídeo limitado em MHC e o ligador de peptídeo GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8) foram fusionados no N -término da molécula scHLA- 25 A2/SS1 (scFv) por uma reação de extensão de sobreposição de PCR com os iniciadores 5' -Nde-209B2M: 5 ' GGAAGCGTTGGCGCATAT GATCAT GGACCAGGTTCCGTTCTCTGTTGGCGAGGAGGGTCCGGTGGCGGA GGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3 ' (SEQ ID NO: 17) e o 3'VLscSSl- 5' GCAGTAAGG AATTCTCAT TATTTTATTTCCAACTTTGT3 ' (SEQ ID NO: 18). A molécula 209cov/scHLA-A2/SSl (scFv) foi usada como um gabarito para a construção de Composto B. Nesta molécula, o peptídeo CMV NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4) foi introduzido na seqüência 209cov/scHLA- A2/SS1 (scFv) (trocando o 209 peptídeo) por reação PCR usando os iniciadores 5 ' GGAAGCGTTGGCGCATATGGTCGATCCAGCGTACTCCAAAG 3' (SEQ ID NO: 17) e o 3'VLscSS15'
GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTAT TTCCAACTTTGT 3' (SEQ ID NO: 18).
Os protocolos de expressão e purificação de Composto B foram idênticos aos protocolos de expressão e purificação de Composto A.
Todos os métodos usados para analisar as propriedades bioquímicas e biológicas de composto B foram idênticos aos métodos usados para analisar a atividade de Composto A.
Construção de Ml-COV/acHLA-A2/SSl (scFv)
Para construir a proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv) o peptídeo MI 58-66 foi fusionado no N-término de proteína de fusão scHLA-A2/SSl (scFv) através de um ligador curto de 15 aminoácidos por reação PCR de sobreposição com o iniciador de ligador 5'M1: 5 ' GG AAGCGTTGGCGCATATGGGCATTCTGGGCTTCGTGTTT ACCCTG GGCGGAGGAGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATC GATCCAGCGTACTCCAAAGS ' (SEQ ID NO: 13) e o 3'VLscSSl- S1GCAGTAAGGAATTCTCAT TATTTTATTTCCAACTTTGT3 ' (SEQ ID NO: 14). O plasmídeo PRB foi usado como um gabarito contendo a seqüência scHLA -A2/SS1 (scFv). Os protocolos de expressão e purificação de proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFV) foram idênticos aos protocolos de expressão e purificação de Composto A. Todos os métodos usados para analisar as propriedades bioquímicas e biológicas da proteína de fusão M1- cov/scHLA-A2/SS 1 (scFv) foram idênticos aos métodos usados para analisar a atividade de Composto A.
Citometria de fluxo
As células foram incubadas com Composto A (60 min a 4°C em ΙΟΟμΙ, 10 μΒ/πιΙ), lavadas e incubadas com anti-HLA-A2 MAb BB7.2 (60 min a 4°C, 10 μΐ/ml). As células foram lavadas e incubadas com FITC anti- camundongo (60 min a 4°C, 10 μΐ/ml) que serviram como um anticorpo secundário. As células foram subseqüentemente lavadas e analisadas por um citômetro de fluxo de calibre FACS (Becton-Dickinson, San Jose, CA USA).
Teste imunossorvente ligado a enzima
Imunoplacas (Falcon®, Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ USA) foram revestidas com 10 μ§/ηι1 de mesotelina recombinante produzida bacterialmente purificada (0/N a 4 0C). As placas foram bloqueadas com PBS contendo 2% leite desnatado e então incubadas com várias concentrações de Composto A (60 min a RT) e lavadas três vezes com PBS.
A ligação foi detectada usando o anticorpo dependente anti-HLA- conformacional W6/32 (60 min, RT, 1 μg/ml), as placas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com IgG-peroxidase anti -camundongo (60 min, RT, 1 μg/ml). A reação foi desenvolvida usando TMB (DAKO) e terminada pela adição de 50μ1 H2SO4 2N. O anticorpo anti-mesotelina (Kl) foi usado como um controle positivo. As imunoplacas foram analisadas por uma leitora ELISA usando filtro de 450 nm (Anthos 2001™, Anthos Labtech, Salzburg, Áustria).
Testes de citotoxicidade
A citotoxicidade foi determinada por testes de liberação de S35- metionina. As células alvo foram cultivadas em placas de cultura em RPMI 10% FCS livres de metionina durante 2 h, seguido por incubação durante a noite com 15 μCi/ml de S35metionina (NEN). As células alvo foram coletadas por tripsinização e lavadas duas vezes com 40 ml RPMI 10% FCS. As células alvo foram colocadas em placas de 96 cavidades (5 10^3 células por cavidade) em RMPI+10% FCS e incubadas durante a noite a 37°C, 5% CO2.
As células alvo foram incubadas com concentrações diferentes de proteínas de fusão de Composto A durante 2 h, células CTL efetuadoras foram adicionadas em relações diferentes de alvo: efetuador e as placas foram incubadas durante 8-12 h a 37°C, 5% CO2. Após a incubação, S35-metionina liberadas das células alvo foi medida em uma amostra de 25 μl do sobrenadante de cultura. Todos os testes foram realizados em triplicata, a lise foi calculada diretamente: ([liberação experimental - liberação espontânea] / [liberação máxima - liberação espontânea]) ·100, A liberação espontânea foi medida como a S35 metionina liberada das células alvo na ausência de células efetuadas, e a liberação máxima foi medida como a S -metionina liberada das células alvo lisadas por 0,05M NaOH.
Linhagens de células
As células A431 e A431K5 (carcinoma epidermóide) foram mantidas em meio RPMI contendo 10% FCS, L-glutamina e penicilina/estreptomicina. A linhagem de células A431K5 é uma linhagem de células A431 de carcinoma epidermóide humano transfectado estavelmente com Mesotelina, as células transfectadas foram mantidas com 700 μg/ml G418 (Gibco-BRL*, Invitrogen™ Inc., Carlsbad, CA USA).
CTL' s com especificidade para epítopo CMV pp65 (NLVPMVATV) foram gentilmente oferecidos pelo Dr Ditmar Zehn (Charitee, Berlin). Os CTL's foram expandidos por incubação com PBMCs pulsados com peptídeo, radiados (4000rad) de um doador positivo para HLA- A2 saudável e foram mantidas em meio AIMV + 8.9% FCS +50 μΜ-2- mercaptoetanol + penicilina/estreptomicina 1 · 10^5 U/L. Resultados
Construção de Composto A
Uma construção codificando uma molécula de MHC de cadeia única composta de gene β2 microglobulina fusionado a a1, a2 e a3 do gene HLA-Α2 via um ligador de peptídeo curto (15 aminoácidos) foi fusionado no scFv SSl que marca mesotelina (Figura IA). Esta construção foi analisada em detalhes para a atividade bioquímica e biológica e verificou-se ser funcional in-vitro e in-vivo (15). Para construir uma proteína de fusão com peptídeo covalentemente ligado, um peptídeo de 9 aminoácidos derivado da proteína CMV pp65 (NLVPMVATV) (SEQ ID NO: 4) foi fusionado no N-término da proteína de fusão scHLA-A2/SSl (scFv) via ligador de 20 aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6) (Figura IB). Composto A foi construído em duas etapas: Primeiro uma proteína de fusão covalente chamada Ml/scHLA-A2/SSl (scFv) foi construída por PCR de extensão sobreposição. Nesta construção, o peptídeo Ml 58-66 de influenza GILGFVFTL (SEQ ID NO: 21) e um ligador de 15 aminoácidos foram fusionados no N-término da proteína de fusão scHLA-A2/SSl (scFv). Nesta construção, um sítio de restrição novo, singular, (BamHI) foi inserido na seqüência de ligador por uma mutação silente. Na segunda etapa, o plasmídeo PRB contendo a seqüência completa Ml/scHLA-A2/SSl (scFv) foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e BamHI. Esta digestão produziu dois fragmentos. Um fragmento contém o peptídeo e parte da seqüência de ligador, e segundo fragmento contém o plasmídeo, parte do ligador e a seqüência SCHLA-A2/SS1 (scFv). O fragmento que contém o plasmídeo, parte do ligador e a seqüência scHLA-A2/SSl (scFv) foi então ligado ao iniciador dsDNA que codifica a seqüência de peptídeo CMV pp65 e uma extensão da seqüência do ligador (Figura 1B). O novo plasmídeo foi transformado em células DH5a de E. coli, e colônias positivas foram enviadas para o seqüenciamento de DNA (Figura 2).
Expressão e purificação de Composto A
Composto A foi expressado em células BL21 de E. coli e, quando da indução com isopropil β-D-tiogalactosídeo, grandes quantidades de proteína recombinante acumulada nos corpos de inclusão intracelulares. A análise SDS/PAGE de corpos de inclusão isolados e purificados revelou que o Composto A com o tamanho correto constituía 80-90% da massa total dos corpos de inclusão (Figura 3A). Os corpos de inclusão solubilizados e isolados foram reduzidos e reduplicados in-vitro em um tampão redox- embaralhamento. As proteínas de fusão monoméricas solúveis (Composto A) foram purificadas por cromatografia de troca iônica em Q-sepharose A análise SDS/PAGE de Composto A revelou uma molécula monomérica altamente purificada com o tamanho esperado de 72 KDa (Figura 3B).
Atividade biológica do Composto A
ELISA
Para testar a capacidade de ligação de Composto A purificado para seu antígeno alvo, a mesotelina recombinante foi imobilizada em imunoplacas. A ligação de composto A foi monitorada por uso de mAb W6/32 sensível à conformação, este anticorpo reconhece as moléculas MHC que são duplicadas corretamente com um peptídeo em suo sulco. Como mostrado na figura 4, a ligação de composto A a mesotelina recombinante foi dependente da dose. Isto sugere que os dois domínios funcionais de composto A, o domínio scFv (SSl) e o domínio peptídeo / scHLA-A2 foram duplicados corretamente. Além disso, o domínio scFv (SSl) de proteína de fusão está em forma ativa e pode especificamente ligar mesotelina. Análise de citometria de fluxo (FACS)
Para testar a capacidade de ligação de composto A a linhagens de células expressando mesotelina, a análise FACS foi realizada. Como um modelo, as células alvo que são negativas para HLA-A2 foram usadas, assim a reatividade de um mAB anti-HLA-A2 pode ser usada para medir a ligação de Composto A em células que expressam mesotelina em sua superfície. Este modelo de células negativas para HLA-A2, positivas para mesotelina, representa o caso extremo em que as células de tumor perdem sua expressão de HLA. Assim, para a análise FACS, as células A431K5 negativas para HLA-Α2 foram usadas, que são células A431 de carcinoma epidermóide humano que foram transfectadas estavelmente com mesotelina. As células A431 parentais de carcinoma epidermóide humano que são negativas para mesotelina e negativas para HLA-A2 foram usadas como controle negativo. A ligação de Composto A para as células alvo foi monitorada com anti-HLA-A2 mAb BB7.2 como um anticorpo primário seguido por um anticorpo secundário rotulado FITC. Um anti-mAb Kl de mesotelina foi usado para testar os níveis de expressão de mesotelina. Como mostrado na Figura 5A, células A431K5 expressam níveis elevados de mesotelina, enquanto as células A431 parentais não expressam o antígeno alvo. As linhagens de células A431 e A431K5 foram também testadas para a expressão de HLA-A2 usando anticorpo específico para HLA-A2 (BB7.2), e ambas as linhagens de células HLA-A2 negativas. No entanto, quando as células A431K5 foram pré- incubadas com Composto A, elas foram positivamente coloridas com o anticorpo BB7.2 específico para HLA-A2 (Figura 5B). As células A413 negativas para antígeno não foram afetadas. A ligação específica de Composto A para células A431K5 mas não para as células A431 ainda indica que a ligação é exclusivamente dependente da interação do domínio scFv de marcação da fusão com mesotelina e que uma proteína de fusão pode ligar seu antígeno alvo como expressado nativamente sobre a superfície das células.
Teste de citotoxicidade
Para testar a capacidade de Composto A para mediar a morte de células negativas para HLA-A2- positivas para mesotelina por CTLs específicos para CMV pp65 limitado em HLA-A2- NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4), teste de liberação de metionina S35 foi realizado usando células A431K5 negativas para HLA-A2- transfectadas com mesotelina, e as células parentais A431 negativas para HLA-A2 negativas para mesotelina. Para determinar o potencial de morte de CTLs específicos para CMV, o teste de citotoxicidade foi realizado usando células JY positivas para HLA-A2 que foram radio-rotuladas com MetS35 e carregadas com o peptídeo CMV NLVPMVATV. A morte específica média das células JY pelos CTLs específicos para CMV foi de 47% com uma relação Ε: T de 10:1 (dados não mostrados). Como mostrado na Figura 6a, Composto A eficazmente mediou a morte das células A431K5 (positivas para mesotelina negativas para HLA- A2-). A morte específica pode alcançar 66% em comparação com as células JY carregadas com peptídeo. Assim, a morte com uma proteína de fusão foi ainda mais eficiente comparada com células apresentando antígeno pulsado por peptídeo que representam as marcações ótimas. No entanto, quando as células A431K5 alvo foram incubadas com os CTLs específicos para CMV sozinha sem uma pré- incubação com Composto A ou quando as células alvo foram células A431 negativas para mesotelina com ou sem pré-incubação com Composto A, nenhuma atividade citotóxica foi observada. A seguir, uma experiência de titulação foi realizada para determinar a potência de Composto A, Como mostrado na Figura 6b, a morte de células A431K5 positivas para mesotelina foi dependente da dose com um IC50 de 0,5-1 μg/ml.
Estes resultados indicam que a morte de células A431K5 positivas para mesotelina negativas para HLA- A2 foi específica e controlada pelo reconhecimento de mesotelina pelo domínio de marcação de Composto A (scFv/SSl) e a especificidade de CTLs de CMV para o domínio peptí deo/scHL A-A2.
Atividade biológica de Composto B
Análise de citometria de fluxo (FACS)
Para testar a capacidade de ligação de Composto B para linhagens de células expressando mesotelina, uma análise de citometria de fluxo foi usada. Como um modelo, as células alvo que são negativas para HLA-A2 foram usadas, assim a reatividade do mAb anti-HLA-A2 irá indicar a ligação de Composto B ao antígeno de superfície de célula. As células A431K5 que são células A431 de carcinoma epidermóide humano foram estavelmente transfectadas com mesotelina e são negativas para HLA-A2. Como controles, as células A431 parentais de carcinoma epidermóide humano foram usadas que são negativas para mesotelina e negativas para HLA-A2. A ligação de Composto B para as células alvo foi monitorada por mAb BB7.2 anti-HLA-A2 como um anticorpo primário seguido por um anticorpo secundário rotulado com FITC. Para testar os níveis de expressão de mesotelina e como um controle positivo, um mAb K1 anti- mesotelina comercial foi usado. Como mostrado na Figura 10A-B, células A431K5 expressam níveis altos de mesotelina, enquanto as células parentais A431 não expressam mesotelina. As linhagens de células A431 e A431K5 foram também testadas por sua expressão de HLA-A2 usando anticorpo específico para HLA-A2 (BB7.2), ambas as linhagens de células foram negativas para HLA-A2. No entanto, quando as células 431K5 foram pré-incubadas com Composto B, elas foram positivamente coloridas com o anticorpo BB7.2 específico para HLA-A2 enquanto as células A431 de controle não foram coloridas (Figura 10 C-D). A ligação específica de Composto B a células A431K5 mas não a células A431 indica que a ligação é exclusivamente dependente da interação do domínio scFv de marcação com mesotelina.
Para analisar a ligação de Composto B em comparação com a fusão de Composto A, uma análise FACS foi realizada usando ambas as moléculas em condições e concentrações similares. Como mostrado nas Figuras IOE-F somente as células A431K5 positivas para mesotelina foram positivamente coloridas com Ab específico para HLA-A2 quando pré- incubado com ambas as proteínas de fusão, no entanto, o composto A demonstrou uma melhor ligação.
Teste de citotoxicidade
Para testar a capacidade de Composto B de mediar a morte de células negativas para HLA-A2 e positivas para mesotelina por CTLs específicos para CMV limitados em HLA-A2- CMV NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4), o teste de liberação de metionina S3S-usando células A431K5 negativas para HLA-A2- transfectadas com mesotelina foi realizado, e as células parentais A431 negativas para HLA-A2 negativas para mesotelina. Para determinar o potencial de morte dos CTLs específicos para CMV, teste de citotoxicidade foi realizado usando células JY positivas para HLA-A2 que foram radio-rotuladas com MetS e carregadas com o peptídeo CMV NLVPMVATV. A morte específica média das células JY pelos CTLs específicos para CMV foi em torno de 45-50% usando uma relação E:T de 10:1 (dados não mostrados). Como mostrado na Figura HA, Composto B eficazmente mediou a morte das células A431K5 (positivas para mesotelina- negativas para HLA-A2), esta morte específica foi de 66% em comparação com as células JY carregadas com peptídeo (-150% comparado com células JY). No entanto, quando as células alvos A431K5 foram incubadas os CTLs específicos para CMV- apenas sem uma pré-incubação com Composto B ou quando as células alvo eram negativas para mesotelina (células A431), com ou sem pré-incubação com Composto B, nenhuma atividade citotóxica foi observada. Os experimentos de titulação que determinaram a potência de uma proteína de fusão, mostrados na Figura HB, indicam que a morte de células A431K5 positivas para mesotelina células foi dependente da dose. Para comparar a atividade citotóxica de Composto B e Composto A, proteínas de fusão, que diferem em comprimento dos peptídeos usados para covalentemente fixar o peptídeo antigênico para a β-2 microglobulina, um - Teste de liberação de metionina - S35 foi realizado usando condições similares para ambas proteínas de fusão. Como mostrado na Figura 12, ambas as moléculas mediaram de modo eficiência e específica a morte de células A431K5, mas não células A431. Quando concentrações relativamente elevadas de proteínas de fusão (Composto B e Composto A) foram usadas, a atividade de morte de ambas as moléculas foi similar. No entanto, quando baixas concentrações of proteínas de fusão foram usadas, a atividade citotóxica de Composto A foi superior provavelmente devido a uma melhor estabilidade e posicionamento do peptídeo CMV no sulco de ligação MHC peptídeo devido a um ligador mais longo.
M1-COV/SCHLA-A2/SS1
A proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv) foi construída por reação de PCR de extensão de sobreposição em que o peptídeo M1 58-66 Influenza e um ligador de 15 aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS foram fusionados no N-término da proteína de fusão SCHLA-A2/SS1 (scFv) (Figura 13). O produto PCR foi ligado ao vetor de clonagem TA- (p-GEM, Promega), transformado em células DH5a de E- coli. As colônias positivas foram selecionadas e o inserto foi isolado usando EcoRI e Ndel. O inserto foi ligado ao vetor de expressão PRB e transformado em células DH5a de E. coli. Colônias positivas foram enviadas para seqüenciamento de DNA (Figura 14).
Expressão e purificação de Composto B
A proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) foi expressada em células BL21 de E. coli e, quando da indução com isopropil β- D-tiogalactosídeo, grandes quantidades de proteína recombinante acumulada nos corpos de inclusão intracelulares. A análise SDS/PAGE de corpos de inclusão isolados e purificados revelou que a proteína de fusão M1- cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) com o tamanho correto constituía 80-90% da massa total dos corpos de inclusão (Figura 15A). Os corpos de inclusão solubilizados e isolados foram reduzidos e reduplicados in-vitro em um tampão redox- embaralhamento. As proteínas de fusão monoméricas solúveis (Ml-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv)) foram purificadas por cromatografia de troca iônica em Q-sepharose ®. A análise SDS/PAGE de proteínas de fusão M1- cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) revelou uma molécula monomérica altamente purificada com o tamanho esperado de 72 KDa (Figura 15B). ELISA Para testar a capacidade de ligação de proteína de fusão M1- cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) purificada para seu antígeno alvo, a mesotelina recombinante foi imobilizada em imunoplacas. A ligação de proteína de fusão M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv)foi monitorada por uso de mAb W6/32 sensível à conformação, este anticorpo reconhece as moléculas MHC que são duplicadas corretamente com um peptídeo em suo sulco. Como mostrado na figura 16, a ligação de proteína de fusão M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) a mesotelina recombinante foi dependente da dose. Isto sugere que os dois domínios funcionais de M1-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv), o domínio scFv (SSl) e o domínio M1- cov/scHLA-A2 foram duplicados corretamente. Além disso, o domínio scFv (SS1) de proteína de fusão está em forma ativa e pode especificamente ligar mesotelina.
Análise de citometria de fluxo (FACS)
Para testar a capacidade de ligação de proteína de fusão M1- cov/scHLA-A2/SSl (scFv) a linhagens de células expressando mesotelina, a análise FACS foi realizada. Como um modelo, as células alvo que são negativas para HLA-A2 foram usadas, e o mAb anti-HLA-A2 foi usado para monitorar a ligação de ligação de proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SSl (scFv) ao antígeno de superfície de célula. Para a análise FACS, as células A431K5 transfectadas com mesotelina foram usadas. A ligação de ligação de proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) para as células alvo foi monitorada com anti-HLA-A2 mAb BB7.2 como um anticorpo primário seguido por um anticorpo secundário rotulado FITC. Para testar os níveis de expressão de mesotelina e como controle positivo, um mAb K1 anti- mesotelina comercial foi usado. Como mostrado na figura 17A-B, as células A431K5 expressam níveis elevados de mesotelina, enquanto as células parentais A431 não expressam mesotelina. As linhagens de células A431 e A431K5 também foram testadas para sua expressão de HLA-A2 usando anticorpo específico para HLA-A2 (BB7.2), ambas as linhagens de células eram negativas para HLA-A2. No entanto, quando as células A431K5 mas não as células A431 foram pré-incubadas com proteínas de fusão M1- cov/scHLA-A2/SS1 (scFv), elas foram positivamente coloridas com o anticorpo BB7.2 específico para HLA-A2 (figura 17C-D). Esta ligação específica de proteína de fusão Ml-cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) para células A431K5 e não para as células A431 indica que a ligação é exclusivamente dependente da interação do domínio de marcação (scFv (SSl)) com mesotelina.
Teste de citotoxicidade
Para testar a capacidade de proteína de fusão M1-cov/scHLA-
A2/SS1 (scFv) mediar a morte de células negativas para HLA-A2- positivas para mesotelina por CTLs específicos para Ml58-66 limitados em HLA-A2, teste de liberação de metionina - S usando células A431K5 negativas para HLA-A2- transfectadas com mesotelina foi realizado. Como mostrado na
Figura 18, proteína de fusão M1- cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) não mediou a lise de células A431K5 (positivas para mesotelina negativas para HLA-A2). No entanto, o SCHLA-A2/SS1 (scFv) contendo o peptídeo Ml58-66 em suo sulco mediou a morte de células alvos positivas para mesotelina pelos CTLs específicos para Ml58-66 e limitados em HLA-A2.
Discussão:
Este estudo demonstra a capacidade de marcar peptídeo covalentemente ligado / scMHC/ proteína de fusão scFv em células de tumor pode tornar as células negativas para HLA-A2 susceptíveis à Iise pelos CTLS limitados em HLA-A2 relevantes. Como previamente mostrado por Lev et al. e Oved et al. (15, 21), esta estratégia tem duas vantagens principais. Primeiro, ela toma vantagem do uso de fragmentos de Ab recombinantes que podem localizar sobre estas células malignas que expressam um marcador de tumor, geralmente associado com o fenótipo transformado (com receptores de fator de crescimento e/ou antígeno de diferenciação), com um grau relativamente elevado de especificidade. Segundo, esta estratégia tem a capacidade de recrutar uma população particular de células T citotóxicas altamente reativas específicas para um epítopo de peptídeo pré-selecionado, altamente antigênico, no complexo MHC-peptídeo marcado, como epítopos de células T específicas virais. Esta abordagem de plataforma gera moléculas múltiplas com muitos fragmentos de scFv específicos de tumor que marcam vários antígenos específicos de tumor, combinados com a capacidade de marcar muitos tipos de complexos MHC- peptídeo carregando peptídeo pré- selecionados, únicos e altamente antigênicos derivados de epítopos de células T de tumor, virais ou bacterianos. Estes exemplos apresentam uma estratégia em outra etapa por fusão do peptídeo de 9 aminoácidos ligado por um ligador curto (20AA) para a proteína de fusão scHLA-A2/scFv previamente relatada (15AA), e assim, estabilizando o peptídeo no sulco de MHC prolongando a estabilidade geral das proteínas de fusão. Um modelo para esta nova geração de proteínas de fusão, a presente invenção refere-se à construção de uma proteína de fusão em que o CMV pp65 derivado (NLVPMVATV) fusionado no N-término da molécula scHLA-A2/SSl (scFv) e suas características bioquímicas e biológicas. Foi mostrado que os dois domínios da nova proteína de fusão podem reduplicar in vitro para formar moléculas corretamente duplicadas com o peptídeo dentro do sulco FILA-A2 e um domínio de marcação ativo (scFv) pode especificamente ligar a seu antígeno alvo. Além disso, esta proteína de fusão mediou com sucesso a Iise de células de tumor negativas para HLA-A2 positivas para mesotelina por CTLs limitados em HLA-A2.
A progressão do tumor é com freqüência associada com a secreção de fatores imune-supressivos e/ou a regulação negativa de funções de apresentação de antígeno MHC de classe I (2). Mesmo quando uma resposta de CTL específica é demonstrada em pacientes, esta resposta é baixa porque a população CTL anti-tumor é rara, muito não freqüente, e em alguns casos os CLTS não são funcionais ou anérgicos (26). Além disso, é bem estabelecido que o número de complexos MHC- peptídeo na superfície das células de tumor que apresentam um peptídeo associado com tumor particular é baixo (27). Como mostrado aqui, uma nova estratégia superou estes problemas. Primeiro, as células de tumor são revestidas com os complexos MHC- peptídeo independente de sua expressão de MHC endógeno. Segundo, o uso de antígenos específicos para tumor que fazem geralmente parte do fenótipo do tumor (como receptores de fator de crescimento e antígenos de diferenciação) evitam a regulação negativa destes antígenos e prolongam a eficiência do tratamento. Terceiro e mais importante, o domínio do efetuador da proteína de fusão, o complexo MHC- peptídeo pode recrutar populações específicas de CTLs dependendo do peptídeo abrigando o sulco de MHC.
Será notado que alguns aspectos da invenção, que são, para clareza, descritos no contexto de formas de realização separadas, também podem ser providos em combinação com uma forma de realização única. Inversamente, vários aspectos da invenção que são, por exemplo, descritos no contexto de uma forma de realização única, também podem ser providos separadamente ou em uma sub-combinação apropriada. Apesar da invenção ter sido descrita em conjunto com formas de realização específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para o versado na técnica. Conseqüentemente, pretende-se englobar todas estas alternativas, modificações e variações que estão dentro do espírito e amplo escopo das reivindicações. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório são aqui incorporados em sua totalidade por referência no relatório, na mesma extensão com se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Além disso, citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser construída como uma admissão de que esta referência está disponível como técnica anterior à presente invenção.
Referências Citadas
I. Gilboa. E. How tumors escape immune destruction and what we can do about it. Câncer Immunol. Immunother. 48, 382-385 (1999).
2. Seliger, B., Maeurer, M. J., & Ferrone, S. Antigen- processing machinery breakdown and tumor growth. Immunol. Today 21, 455-464 (2000).
3. Garcia-Lora, A., Algarra9I., & Garrido5F. MHC class I antigens, immune surveillance, and tumor immune escape. J. Cell Physiol 195, 346-355 (2003).
4. Garrido, F. & Algarra, I. MHC antigens and tumor escape from immune surveillance. Adv. Câncer Res. 83, 117-158 (2001).
5. McLaughlin, P. et al. Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four- dose treatment program. J. Clin. Oncol. 16, 2825-2833 (1998).
6. Cobleigh, M.A. et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2- overexpressing metastatic breast câncer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. J. Clin. Oncol. 17, 2639-2648 (1999).
7. Pastan, I. & Kreitman,R. J. immunotoxins in câncer therapy. Curr. Opin. Investig. Drugs 3, 1089-1091 (2002).
8. Boon, T. Sc van der, B.P. Human tumor antigens recognized by T- lymphocytes. J. Exp. Med. 183, 725-729 (1996).
9. Esche,C, Shurin,M.R., & Lotze,M.T. The use of dendritic cells for câncer vaccination. Curr. Opin. MoI. Ther. 1, 72-81 (1999).
10. Offringa, R., van der Burg, S.H., Ossendorp, F., Toes, R. E., & Melief,C.J. Design and evaluation of antigen-specific vaccination strategies against câncer. Curr. Opin. Immunol. 12, 576-582 (2000).
11. Wang, E., Phan,G.Q., & Marincola, F.M. T-cell- directed câncer vaccines: the melanoma model. Expert. Opin. Biol. Ther. 1, 277-290 (2001). 12. Dudley, Μ. Ε. et ai. Câncer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854 (2002).
13. Dudley, M.E. & Rosenberg, S.A. Adoptive-eell- transfer therapy for the treatment of patients with câncer. Nat. Rev. Câncer 3, 666-675 (2003).
14. Rosenberg, S.A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411, 380-384 (2001).
15. Lev, A. et al. Tumor-specific Ab-mediated targeting of MHC-peptide complexes induces regression of human tumor xenografts in vivo. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 101, 9051-9056 (2004).
16. Donda, A. et al. In vivo targeting of an anti-tumor antibody coupled to antigenic MHC class I complexes induces specific growth inhibition and regression of established syngeneic tumor grafts. Câncer immun. 3,11 (2003).
17. Ogg, G.S. et al. Sensitization of tumour cells to lysis by virus-specific CTL using antibody-targeted MHC class I/peptide complexes. Br. J. Câncer 82, 1058-1062 (2000).
18. Robert, B., Guillaume, P., Luescher, I., Romero, P., & Mach,J.P. Antibody-conjugated MHC class I tetramers can target tumor cells for specific lysis by T-lymphocytes. Eur. J. Immunol. 30, 3165-3170 (2000).
19. Robert, B. et al. Redirecting anti-viral CTL against câncer cells by surface targeting of monomeric MHC class I- viral peptide conj ugated to antibody fragments. Câncer Immun. 1, 2 (2001).
20. Savage, P. et al. Anti-viral cytotoxic T-cells inhibit the growth of câncer cells with antibody targeted HLA class I/peptide complexes in SCID mice. Int. J. Câncer 98, 561-566 (2002).
21. Oved, K., Lev,A., Noy,R., Segai, D., & Reiter,Y. Antibody-mediated targeting of human single-chain class I MHC with covalently linked peptides induces effícient killing of tumor cells by tumor or viral- specific cytotoxic T- lymphocytes. Câncer Immunol. Immunother. 54, 867-879 (2005). 22. Chang, Κ. & Pastan, I. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding a protein detected by the Kl antibody from an ovarian carcinoma (OVCAR-3) cell line. Int. J. Câncer 57, 90-97 (1994).
23. Chang, K. & Pastan,I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc.
Natl. Acad. Sei. U. S. A 93, 136-140 (1996).
24. Chang, K. & Pastan, I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 93, 136-140 (1996).
25. Hassan, R., Bera, T., & Pastan.I. Mesothelin: a new target for immunotherapy. Clin. Câncer Res. 10, 3937-3942 (2004).
26. Lee, Ρ. P. et al. Characterization of circulating T- cells specific for tumor- associated antigens in melanoma patients. Nat. Med. 5, 677-685 (1999).
27. Christinck, E.R., Luscher,M.A., Barber, B. H., & Williams, D. B. Peptide binding to class I MHC on living cells and quantitation of complexes required for CTL lysis. Nature 352, 67-70 (1991).
28. Jain, R. K. Transport of molecules, particles, and cells in solid tumors. Annu. Rev. Biomed. Eng 1, 241-263 (1999).
29. Bromley, S. K. et al. The immunological synapse.Annu. Rev. Immunol. 19,375-396(2001).
30. Lanzavecchia, A., Lezzi,G., & Viola,A. From TCR engagement to T-cell activation: a kinetic view of T-cell behavior. Cell 96, 1-4 (1999).
31. Chang, K., Pastan, I. & Willingham, M. C. Isolation and characterization of a monoclonal antibody, K1, reactive with ovarian cancers and normal mesothelium. Int. J. Câncer 50, 373-381 (1992).
32. Chang, K., Pai, L. H., Batra, J. K., Pastan, I. & Willingham, M. C. Characterization of the antigen (CAKl) recognized by monoclonal antibody K1 present on ovarian cancers and normal mesothelium. Câncer Res. 52, 181-186(1992). 33. Parham, P., Barnstable, C. J. & Bodmer, W. F. Use of a monoclonal antibody (W6/32) in structural studies of HLA-A, B, C, antigens. J. Immunol. 123, 342-349 (1979).
34. Shields, M. J. & Ribaudo, R. K. Mapping of the monoclonal antibody W6/32: sensitivity to the amino terminus of beta2-microglobulin. Tissue Antigens 51, 567-570 (1998).
35. Parham, P. & Brodsky, F. M. Partial purification and some properties of BB7.2. A cytotoxic monoclonal antibody with specificity for HLA-A2 and a variant of HLA-A28. Hum. Immunol. 3, 277-299 (1981). LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110» Teva Pharinaceutical industries, Ltd. Teva Pharnaceutlcals USA, Inc.
Techniwi Research and Development Foundation Ltd.
<120> Proteínas de fusão, usos das mesmas e processos para produzir as mesmas
<130> 76322-PCT/OW/YC
<150> US 60/801,798
<151> 2006-05-19
<160> 23
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1 <211> 1995 <212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> Proteína de fusão do composto A <400> 1
atgaacctgg tgccgatggt cgcgaccgtt ggaggtggcg gttctggcgg aggaggatcc 60
ggtggcggag gttcaggagg tggtggatcg atccagcgta cteeaaagat tcaggtttac 120
tcacgtcate cagcagagaa tggaaagtca aatttcctga attgctatgt grcrgggttt 180
catccatccg acattgaagr tgacttactg aagaatggag agagaattga aaaagtggag 240
catteagact tgtcttttte gaaggactgg tetttctatc tcttgtacta cactgaattc 300
aeccceactg aaaaagatga gtatgcctgc cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc 360
aagatagtta agtgggatcg cgacatgggt ggcggtggaa gcggcggtgg aggctctggt 420
ggaggtggca gcggctctca ctccatgagg tatttcttca catccgtgtc ccggcccggc 480
cgcggggage ccegctteat cgcagtggge tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 540
gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcge cgtggataga gcaggagggt 600
ccggagtatt gggacgggga gacacggaaa gtgaaggccc actcacagac tcaccgagtg 660
gacctgggga ccctgegcgg ctactaeaae cagagcgagg eeggttctca caecgtecag 720
aggatgtatg gctgcgacgt ggggteggac tggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 780
gegtaegaeg geaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 840
gacatggcag ctcagaecae caagcacaag tgggaggcgg cccatgtagc ggagcagttg 900
agagcetacc tggagggcac gtgcgtggag xggctccgca gatacctgga gaacgggaag 960
gagacgctgc agcgeaegga cgcccceaaa acgcacatga ctcaccacgc tgtetctgac 1020
catgaagcca ccctgaggtg ctgggecctg agcttctaec ctgcggagat cacaetgaec 1080
tggcagcggg atggggagga ccagaeccag gacacggagc tcgtggagac aaggcctgca 1140
ggggatggaa ccttceagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaca ggagcagaga 1200
tacacetgec atgtgcagca tgagggtttg cccaagcccc tcaccctgag atgggagget 1260
tccQaaciatc aaotacaact ocaocaatct oaoectaaoc taoaaaaacc taacaettca 1320 gtgaagatat cctgcaagge ttctggttac tcattcactg gctacaccat gaactgggtg 1380 aagcagagcc atggaaagag ccttgagtgg attggactta ttactcctta caatggtgct 1440 tctagctaca accagaagtt caggggcaag gccacattaa ctgtagacaa gtcatccagc 1500 acagcctaca tggacctcct cagtetgaea tctgaagact ctgcagtcta tttctgtgca 1560 agggggggtt acgacgggag qggttttgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1620 tcctcaggtg taggcggttc aggeggeggt ggctctggcg Stggcggatc ggacatcgag 1680 ctcactcagt ctecagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacctgc 1740 agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc 1800 aaaagaxgga tttatgacac atccaaactg gcttctggag tcccaggtcg cttcagtggc 1860 agtgggtctg gaaactctta ctctctcaca atcagcagcg tggaggctga agatgatgca 1920 acttattact gccagcagtg gagtaagcac cctctcacgt tcggtgctgg gacaaagttg 1980 gaaataaaat aatga 1995
<210> 2
<Ζ11> 663 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Proteína de fusão do composto A <400> 2
Met As η Leu vai Pro Met vai Ala Thr vai Gly Cly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser ile Glri 20 25 30
Arg Thr Pro Lys lie Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly 35 40 45
Lys ser Asri Phe Leu Asn Cys Tyr vai Ser Gly Phe Hls Pro Ser Asp 50 55 50
Ile Glu vai Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg ile Glu Lys vai Glu 65 70 75 80
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp ser Phe Tyr Lmi Leu Tyr BS 90 95 130 135 140
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr ser vai ser Arg Pro Gly 145 150 155 160
Arg Gly Glu pro Arg Phe lie Ala vai Gly Tyr vai Asp Asp Thr Gln 165 170 175
Phe vai Arg Phe Asp ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 180 185 190
Ala Pro Trp Ile Glu Glri Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 195 200 205
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg vai Asp Leu Gly Thr 210 215 220
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln ser Glu Ala Gly Ser His Thr vai Gln 225 230 235 240
Arg Met Tyr Gly Cys asd vai Gly ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 245 250 255
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr il« Ala Leu Lys Glu 260 265 270
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Wet Ala Ala Gln Thr Thr Lys 275 280 285
His Lys Trp Glu Ala Ala Nis vai Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 2θ0 295 300
Glu Gly Thr cys vai Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 30S 310 315 320
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His Hls 325 330 335
Ala vai Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 340 345 350
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 355 360 365
Thr Gln Asp Thr Glu Leu vai Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 370 375 380
Phe Gln Lys Trp Ala Ala vai vai vai Pro ser Gly Gln Glu Gln Arg 385 390 395 400
Tvr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 405 410 415 Arg Trp Glu Ala Ser Gly Gly Gln vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 420 425 430
Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala ser vai Lys lie ser Cys Lys Ala Ser 435 440 445
Gly Tyr ser Phe Thr Gly Tyr Ttir Met Asn Trp vai Lys Gln ser His 450 45S 460
Glv Lys Ser Leu Glu Trp lie Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asri Gly Ala 465 470 475 480
ser ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp 48 S 490 495
Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr ser Glu 500 505 510
Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly 51S 520 525
Phe ASp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr vai Thr vai ser ser Gly vai 530 535 540
Gly Gly Ser Gly Gly Glg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu
Leu Thr Gln ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys vai 565 570 575
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser ser ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr 580 585 590
Gln Gln Lys ser Gly Thr ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr as ρ Thr ser 595 600 605
Lys Lew Ala ser Gly vai Pro Gly Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly 610 615 620
Asn ser Tyr Ser Leu Thr lie ser Ser vai Glu Ala Glu Asp Asp Ala 625 630 635 640
Thr Tyr Tyr eys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr Phe Gly Ala 645 650 655
Gly Thr Lys Leu Glu Sle Lys 660
<210> 3 <211> 27
<212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Peptideo CMV
<400> 3
aacctggtgc cgatggtcgc gaccgtt
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Peptideo CMV
<400> 4
Asn Leu Val Pro Het Val Ala Thr vai 1 5
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Ligador de peptídeo 20-aa
<400> 5
ggaggtggcg gttctggegg aggaggatcc ggtggcggag gttcaggagg cggtggatcg 60
<210> 6 <211> 20 <212> PRT
Seqüência artificial
<220>
<223> Ligador de peptídeo 20-aa <400> 6
Gty Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
Gly Gly Gly ser 20
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Ligadior de peptídeo 15-aa <400> 7
ggtggcggtg gáagcggcgg tggaggctct ggtggaggtg gcagc
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Sequencia artificial <220> <223> Ligadordepeptideo 15-aa
<400> 8
Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15
<;210> 9
<211> 12
<212> OMA
<213> Seqüência artificial «220»
<223» Ligadoi de peptídeo 4-aa
<40Q> 9
gcttccggag gt 12
<210> 10 <211> 4
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <22Q>
<22 3> Ligador de peptídeo 4-aa
<400> 10
Ala ser Gly Gly 1
<210» 11 <211> /26 <212> DMA
Seqüência artificial
<220>
<223> SS1 <400> 11
caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc etggcgctte agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac ISO aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatecag cacagcctac 240 atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 300 tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 gtaggcggtt caggcggcgg tggctctggc ggtggcggat cggacatcga gctcactcag 420 tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 480 tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg S40 atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcctaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 600 ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattae 660 tgccagcagt ggagtaagca ccctctcacg ttcggtgctg ggacaaagtt ggaaataaaa 720 taatga
<210> 12
<211> 240
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> SS1
<400> 12
Gln vai Gln Leu GTn Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser vai Lys ile ser Cys Lys Ala ser Giy Tyr ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Thr Met aso Trp vai Lys Gln Ser His Gly Lys ser Leu Gly Trp Ile 35 40 45
Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Ara Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala TVr 65 70 75 »0
Met Asp Leu Leu ser Leu Thr Ser Glu Asp ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp ϊΐβ Glu teu Thr Gln ser Fro Ala lie 130 135 140
Met ser Ala ser Pro Gly Glu Lys vai Thr Met Thr cys ser Ala ser 145 150 155 160
ser ser vai ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys ser Gly Thr ser 165 170 175
Pro Lys Arg Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 180 185 190
Gly Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr ser Leu Thr ile 195 200 205
Ser Ser vai Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr cys Gln Gln Trp 210 215 220 Ser Lys His Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Tbr Lys Leu Glu Πβ lyj 225 250 235 240
<210> 15 <211> 109 <212> DMA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador de PCR <400> 13
ggaagcgttg gcgeatatgg gcattctggg cttcgtgttt accctgggcg gaggaggatc cggtggcgga. ggttcaggag gcggtggatc gatccagcgt actceaaag
<210> 14
<211> 38
<212> OWA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> IniciadordePCR
<400> 14
gcagtaagga attctcacta ttttatttcc aactttgt
<210> 15
<211> 56
<212> OHA
<213> Seqüência artificial <220>
<Z23> Iniciador de PCR
<400> 15
tatgaaectg gtgccgatgg tcgcgaccgt tggaggtggc ggttctggcg gaggag
<2l0> 16
<.213> 58
<212> E)NA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador de PCR
<400> 16
gatcctccte cgccagaacc gccacctcca acggtegega ccatcggcac caggttca
<210> 17 <211> 108 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> InitiadordePCR <400s> 17
ggaagcgttg gcgcatatga tcatggacca ggttccgttc tctgttggcg aggagggtcc ggtggcggag gttcaggagg cggtggatcg atccagcgta ctccaaag
<210> 18 <211> 38
<212> ONA
Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciaidiir de PCR
<400> 18
gcagtaagga attctcatta ttttatttxc aactttgt 38
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<2Z3> ligador de peptídeo
<400> 19
Gly VaT Cly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<22ü>
<223> monômero ligador de peptídeo <220>
<221> MISC-FEATURE
<223> x = qualquer aminoácido
<220>
<223> misc_feature
<222> C2)-(2>
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente
<400> 20
Gly xaa Gly Gly Ser
1 S
<210> 21
<21i> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Ligador de peptídeo
<400> 21
Gly Ile Leu Gly PHe vai Phe Thr Leu
1 5
<210> 22
<211> 1980
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> <223> Proteína de fusão do composto B <400> 22
atgaacctgg tgccgatggt cgcgaccgtt ggcggaggag gatccggtgg cggaggttca 60
ggaggcggtg gatcgaterca gcgtactcca aagattcagg tttactcacg tcatccagca 120
gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg ggtttcatcc atccgacatt 180
gaagttgact tactgaagaa tggagagaga attgaaaaag tggagcattc agacttgtct 240
ttttcgaagg actggtcttt ctatctcttg tactaeactg aattcacccc cactgaaaaa 300
gatgagtatg cctgccgtgt gaaccatgtg actttgtcac agcccaagat agttaagtgg 360
gatcgcgaca tgggtggcgg tggaagcggc ggtggaggct ctggtggagg tggcagcggc 420
tctcactcca tgaggtattt cttcacatcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc 480
t-ccatcgcag tgggctacgt ggacgacacg cagttcgtgc ggttcgacag cgacgccgcg 540
agccagagga tggagccgcg ggcgccgtgg atagagcagg agggtccgga gtatrtgggac 600
ggggagacac ggaaagtgaa ggcccactca cagactcacc gagtggacrt ggggaccctg 660
cgcggctact aeaaccagag cgagçccggt tctcacaccg tccagaggat gtatggctgc 720
gacgtggggt cggactggcg cttcctccgc gggtaccacc agtacgcgta cgacggcaag 780
gattacatcg ccctgaaaga ggacctgcgc tcttggaccg cggcggacat ggcagctca® 840
accaccaagc acaagtggga ggcggcccat gtagcggagc agttgagagc ctacctggag 900
ggeacgtgcg tggagtggct ccgcagatac ctggagaacg ggaaggagac gctgcagcgc 960
acggacgccc ccaaaacgca catgactcac cacgctgtct ctgaccatga agccaccctg 1020
aggtgctggg ccctgagctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca gcgggatggg 1080
gaggaccaga cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga rggaaccttc 1140
cagaagtggg cggctgtggt ggtgccttct ggacaggagc agagatacac ctgccatgtg 1200
cagcatgagg gtttgcccaa gcccctcacc ctgagatggg aggcttccgg aggtcaggta 1260
caactgcagc agtctgggcc tgagctggag aagcctggcg cttcagtgaa gatatcctgc 1320
aaggcttctg gttactcatt cactggctac accatgaact gggtgaagta gagccatgga 1380
aagagccttg agtggattgg acttattact ccttacaatg gtgcttctag ctacaaccag 1440
aagttcaggg gcaaggccac attaactgta gacaagtcat ccagcacagc ctacatggac 1500
ctcctcagtc tgacatctga agacrctgca gtctatttct gtgcaagggg gggttacgac 1560
gggaggggtt ttgactattg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtgtaggc 1620
ggctcaggcg gcggtggctc tggcggtggc ggatcggaca tcgagctcac tcagtctcca 1680
gcaatcatgt etgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt 1740
gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag tcaggeacct cccccaaaag atggatttat 1800
gacacatcca aactggcttc tggagtccca ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggaaac 1860
xcttactctc tcacaatcag cagcgtggag gctgaagatg atgcaactta ttactgccag 1920
cagtggagta agcaccctct cacgttcggt gctgggacaa agttggaaat aaaataatga 1980 <210> 23 <211> 1980 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Proteína de fusão Mlcov/SCHLA-A2/SSl (scFv) <400> 23
atgggcattc tgggcttcgt gtttaccctg ggcggaggag gatecggtgg cggaggttca 60
ggaggcggtg gatcgatcca gcgtactcca aagattcagg tttactcacg tcatccagca 120
gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg ggtttcatce atccgacatt 180
gaagttgact tactgaagaa tggagagaga attgaaaaag tggagcartc agacttgtct 240
ttttegaagg actggtcttt ctatctcttg tactacactg aattcacccc cactgaaaaa 300
gatgagtarg cctgccgtgt gaaccatgtg actttgtcac agcccaagat agttaagtgg 360
gatcgcgaca tgggtggegg tggaagcggc ggrtggaggct ctggtggagg tggcagcggc 420
tctcactcca tgaggtattt cttcacatcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagceccgc 480
ttcatcgcag tgggctacgt ggacgacacg cagttegtgc ggttcgacag cgacgccgcg S40
agccagagga tggagccgcg ggcgccgtgg atagagcagg agggtccgga gtattgggac 600
ggggagacat ggaaagtgaa ggcccactca cagactcacc gagtggacct ggggaccctg 660
cgcggctact acaaccagag cgaggccggt tctcacaccg tccagaggat gtatggctgc 720
gacgtggggt cggactggcg cttcctccgc gggtaccacc agtacgcgta cgacggcaag 780
gattacatcg ccctgaaaga ggacctgcgc tcttggaccg cggcggacát ggcagctcag 840
accaccaagc acaagtggga ggeggcccat gtagcggagc agttgagagc ctacctggag 900
ggcacgtgcg tggagtggct ccgcagatac ctggagaacg ggaaggagac gctgcagcgc 960
acggacgccc ccaaaaegca catgactcac cacgctgtct ctgaccatga agccaccctg 1020
aggtgctggg ccctgagctt ctaccctgcg gaaatcacac tgacctggca gcgggatggg 1080
gaggaccaga cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 1140
cagaagtggg cggctgtggt ggtgccttct ggacaggagc agagatacac ctgccatgtg 1200
cagcatgagg gtttgcccaa gcccctcacc ctgagatggg aggcttccgg aggtcaggta 1260
caactgcagc agtctgggcc tgagctggag aagcctggcg cttcagtgaa gatatcctgc 1320
aaggcttctg gttactcatt cactggctac accatgaact gggtgaagca gagccatgga 1380
aagagccttg agtggattgg acttattact ccttacaatg gtgcttctag ctacaaccag 1440
aagttcaggg gcaaggccac attaactgta gacaagtcat ccagcacagc ctacatggac 1S00
ctcctcagtc tgacatctga agactctgca gtctatttct gtgcaagggg gggttacgac 1S60
gggaggggtt ttgaccactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcetc aggtgtaggc 1620
ggttcaggcg gcggtggctc tggcggtggc ggatcggaca tcgagctcac tcagtctcca 1680
gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt 1740
gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag atggatttat 1800 gacacatcca aactggctte tggagtccca ggtegettca gtggcagtrgg gtctggaaac Ι86Ο tcttactctc tcacaatcag cagcgtggag gctgaagatg atgcaactta ttactgccag 1920 cagtggagta agcaccctct cacgttcggt gctgggacaa agttggaaat aaaataatga 1980

Claims (29)

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender aminoácidos consecutivos que, começando no término amino da proteína, correspondem a aminoácidos consecutivos presentes em (i) um peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) uma β-2 microglobulina humana, (iv) um segundo ligador de peptídeo, (v) uma cadeia HLA-A2 de uma molécula de MHC de classe I humana, (vi) um terceiro ligador de peptídeo, (vii) uma região variável de uma cadeia pesada de um fragmento scFv de um anticorpo, e (viii) uma região variável de uma cadeia leve deste fragmento scFv, em que os aminoácidos consecutivos que correspondem a (vii) e (viii) são ligados juntos diretamente por uma ligação peptídeo ou por aminoácidos consecutivos que correspondem a um quarto ligador de peptídeo e o fragmento scFv é derivado de um anticorpo que especificamente liga a mesotelina.
2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6).
3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8).
4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o terceiro ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido ASGG (SEQ ID NO: 10).
5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o quarto ligador de peptídeo tem a seqüência de aminoácido GVGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19).
6. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano tem a seqüência de aminoácido NLVPMVATV (SEQ ID NO: 4).
7. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a seqüência dos aminoácidos consecutivos correspondendo a (vii), seguido pelo quarto ligador de peptídeo, seguido por (viii) é especificada em SEQ ID NO: 12.
8. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os aminoácidos consecutivos tem a seqüência de aminoácido especificada em SEQ ID NO: 2.
9. Composição, caracterizada pelo fato de compreender a proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1-8 e um veículo.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9 caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão está presente na composição em uma quantidade terapeuticamente eficaz e o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.
11. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de codificar uma proteína de fusão compreendendo aminoácidos consecutivos que, começando no término amino da proteína, correspondem a aminoácidos consecutivos presentes em (i) um peptídeo limitado a MHC de citomegalovírus humano, (ii) um primeiro ligador de peptídeo, (iii) uma β-2 microglobulina humana, (iv) um segundo ligador de peptídeo, (v) uma cadeia HLA-A2 de uma molécula de MHC de classe I humana, (vi) um terceiro ligador de peptídeo, (vii) uma região variável de uma cadeia pesada de um fragmento scFv de um anticorpo, e (viii) uma região variável de uma cadeia leve deste fragmento scFv, em que os aminoácidos consecutivos que correspondem a (vii) e (viii) são ligados juntos diretamente por uma ligação peptídeo ou por aminoácidos consecutivos que correspondem a um quarto ligador de peptídeo e o fragmento scFv é derivado de um anticorpo que especificamente liga a mesotelina.
12. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11 caracterizada pelo fato de ter a seqüência de ácido nucleico como especificada em SEQ ID NO: 1.
13. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 11 ou 12.
14. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de compreender a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 11 ou 12 e um promotor ligado operativamente à mesma.
15. Célula transformada caracterizada pelo fato de compreender o vetor como definido na reivindicação 14.
16. Célula transformada de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica selecionada dentre o grupo consistindo de uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de levedura, e uma célula de protozoário.
17. Célula transformada de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula bacteriana.
18. Preparação isolada de corpos de inclusão bacterialmente expressados caracterizada pelo fato de compreender acima de 30 porcento em peso de uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1-8.
19. Processo para produzir uma proteína de fusão caracterizado pelo fato de compreender cultivar a célula transformada como definida na reivindicação 15 ou 16, de modo que uma proteína de fusão é expressada, e recuperar uma proteína de fusão assim expressada.
20. Processo para produzir uma proteína de fusão caracterizado pelo fato de compreender cultivar a célula transformada como definida na reivindicação 17 de modo que uma proteína de fusão é expressada, e recuperar uma proteína de fusão assim expressada.
21. Processo de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a recuperação de uma proteína de fusão compreende submeter a proteína de fusão expressada a cromatografia de exclusão de tamanho.
22. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão é expressada em corpos de inclusão.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ainda compreender tratar os corpos de inclusão de modo a separar e reduplicar a proteína de fusão e assim produzir uma proteína de fusão em uma forma biologicamente ativa.
24. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o tratamento dos corpos de inclusão para separar uma proteína de fusão dos mesmos compreende contatar os corpos de inclusão com um agente desnaturante.
25. Método para matar seletivamente uma célula de tumor, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a célula com uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 -8 em uma quantidade eficaz para iniciar uma resposta imune mediada por CLT contra a célula de tumor de modo a assim matar a célula de tumor.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a célula de tumor está em um paciente e o contato é efetuado por administração da proteína de fusão ao paciente.
27. Método para tratar uma célula de tumor que expressa mesotelina em sua superfície, caracterizado pelo fato de compreender contatar a célula de tumor com uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1-8 em uma quantidade eficaz para iniciar uma resposta imune mediada por CTL contra a célula de tumor de modo a assim tratar a célula de tumor.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a célula de tumor está presente em um tumor sólido.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o tumor sólido está associado com câncer ovariano, pulmão, pancreático ou cabeça/pescoço, ou mesotelioma.
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Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
IL151860A0 (en) * 2000-03-27 2003-04-10 Technion Res & Dev Foundation Single chain class i major histocompatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
US8022190B2 (en) 2001-06-19 2011-09-20 Technion Research & Development Foundation Ltd. Immuno-molecules containing viral proteins, compositions thereof and methods of using
MX2008014722A (es) * 2006-05-19 2011-04-15 Teva Pharma Proteinas de fusion, usos de las mismas y procesos para producir las mismas.
GB0700133D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Humabs Llc Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
US7947274B2 (en) 2007-01-04 2011-05-24 Humabs, LLC. Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
EP2155782A2 (en) 2007-03-26 2010-02-24 Dako Denmark A/S Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases
EP2167537A2 (en) 2007-07-03 2010-03-31 Dako Denmark A/S Compiled methods for analysing and sorting samples
EP2197908A2 (en) 2007-09-27 2010-06-23 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
CN101939410A (zh) 2007-12-11 2011-01-05 斯克利普斯研究院 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达
US10968269B1 (en) 2008-02-28 2021-04-06 Agilent Technologies, Inc. MHC multimers in borrelia diagnostics and disease
AU2009272284C1 (en) 2008-07-16 2014-05-15 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof
US10722562B2 (en) 2008-07-23 2020-07-28 Immudex Aps Combinatorial analysis and repair
GB0817244D0 (en) 2008-09-20 2008-10-29 Univ Cardiff Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells
WO2010037402A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
US8609383B2 (en) 2008-12-10 2013-12-17 The Scripps Research Institute Production of carrier-peptide conjugates using chemically reactive unnatural amino acids
ES2659406T3 (es) 2010-05-06 2018-03-15 Novartis Ag Composiciones y procedimientos de uso para anticuerpos terapéuticos contra la proteína 6 relacionada con las lipoproteínas de baja densidad (LRP6)
AU2011249782B2 (en) 2010-05-06 2014-10-02 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein - related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
MX345519B (es) 2010-12-20 2017-02-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-mesotelina e inmunoconjugados.
HUE035281T2 (en) 2011-01-14 2018-05-02 Univ California Therapeutic antibodies to ROR-1 protein and methods of their use
US9499605B2 (en) 2011-03-03 2016-11-22 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
EP3138581B1 (en) * 2011-03-17 2019-01-02 The University of Birmingham Re-directed immunotherapy
CN110229235A (zh) * 2011-06-22 2019-09-13 霍夫曼-拉罗奇有限公司 利用包含mhc i类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除靶细胞
EP2756521A4 (en) 2011-09-16 2015-04-22 Univ Pennsylvania RNA-MANIPULATED T-CELLS FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP2773669B1 (en) 2011-11-04 2018-03-28 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
WO2013184790A1 (en) * 2012-06-05 2013-12-12 Eaton Corporation Interchangeable flow restricting orifice for clamshell coupler
IN2015DN01115A (pt) 2012-07-13 2015-06-26 Zymeworks Inc
RU2015125639A (ru) * 2012-11-30 2017-01-10 Роше Гликарт Аг Удаление раковых клеток с помощью циркулирующих вирус-специфических цитотоксических т-клеток с использованием направленных против раковых клеток многофункциональных белков, содержащих молекулу гкгс класса i
EP2931949B1 (en) 2012-12-11 2019-09-18 Albert Einstein College of Medicine Methods for high throughput receptor/ligand identification
KR20150097688A (ko) 2012-12-21 2015-08-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 디술피드-연결 다가 ｍｈｃ 클래스 ｉ 포함 다관능 단백질
CN106132428B (zh) * 2014-01-21 2021-08-06 阿尔伯特爱因斯坦医学院 用于快速和全面t细胞免疫监测的细胞平台
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
US10457716B2 (en) * 2014-08-06 2019-10-29 University Of Notre Dame Du Lac Protein folding and methods of using same
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
IL262606B2 (en) 2016-05-18 2023-04-01 Albert Einstein College Medicine Inc pd-l1 variant polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of using them
CA3019005A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
IL297617B2 (en) 2016-12-22 2023-11-01 Cue Biopharma Inc Multimeric polypeptides modulate T cells and methods for their use
CN107663239A (zh) * 2016-12-28 2018-02-06 天津天锐生物科技有限公司 一种识别hla‑a2/nlvpmvatv的单域抗体
WO2018129474A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
JP2020514375A (ja) 2017-03-15 2020-05-21 キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド 免疫応答を調節するための方法
EP3737689A4 (en) 2018-01-09 2021-12-01 Cue Biopharma, Inc. MULTIMERIC T CELL-MODULATING POLYPEPTIDES AND METHOD OF USING THEREOF
WO2019162937A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Technion Research & Development Foundation Limited Immunotherapeutic composition for the treatment of cancer
JP2021527419A (ja) * 2018-06-20 2021-10-14 ダンマークス テクニスク ユニバーシテットＤａｎｍａｒｋｓ Ｔｅｋｎｉｓｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ 免疫細胞操作用の安定化されたｍｈｃ分子を有するスカフォールド
WO2020056152A1 (en) * 2018-09-12 2020-03-19 Chang Liu Single chain constructs
JP2022534846A (ja) * 2019-05-29 2022-08-04 キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド 多量体ｔ細胞調節性ポリペプチド及びその使用方法
IL296209A (en) 2020-05-12 2022-11-01 Cue Biopharma Inc Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of using them
WO2023126544A1 (en) * 2022-01-03 2023-07-06 Aarhus Universitet Proteinaceous compound for generating specific cytotoxic t-cell effect

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) * 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) * 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) * 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) * 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) * 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US6416738B1 (en) * 1973-12-07 2002-07-09 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
JPS6054684A (ja) * 1983-09-05 1985-03-29 Teijin Ltd 新規ｄνａ及びハイブリツドｄνａ
IL82104A0 (en) 1986-04-08 1987-10-30 Usa Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus genes and method for producing htlb-iii envelope proteins
GB8608850D0 (en) 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
US5591829A (en) * 1987-05-29 1997-01-07 Matsushita; Shuzo Antibodies modified with toxic substance
US5194425A (en) * 1988-06-23 1993-03-16 Anergen, Inc. Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5468481A (en) * 1988-06-23 1995-11-21 Amergen, Inc. MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5260422A (en) * 1988-06-23 1993-11-09 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
DE3825615A1 (de) 1988-07-28 1990-02-01 Behringwerke Ag Antigenkonstrukte von "major histocompatibility complex" klasse i antigenen mit spezifischen traegermolekuelen, ihre herstellung und verwendung
US6291160B1 (en) * 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US6153408A (en) * 1991-11-15 2000-11-28 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US6011146A (en) * 1991-11-15 2000-01-04 Institut Pasteur Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US20030129191A1 (en) * 1992-12-23 2003-07-10 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
US5837477A (en) * 1993-01-15 1998-11-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services T cell receptor ligands and methods of using same
US5695928A (en) * 1993-12-10 1997-12-09 Novartis Corporation Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction
US5820866A (en) * 1994-03-04 1998-10-13 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for T cell regulation
DK0776339T4 (da) 1994-07-29 2010-05-25 Sunol Molecular Corp MHC-komplekser og anvendelser deraf
GB9415492D0 (en) * 1994-08-01 1994-09-21 Celltech Ltd Biological products
US5635363A (en) * 1995-02-28 1997-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells
WO1997024446A2 (en) 1995-12-29 1997-07-10 Chiron Corporation Gene delivery vehicle-targeting ligands
US5869270A (en) 1996-01-31 1999-02-09 Sunol Molecular Corporation Single chain MHC complexes and uses thereof
CA2250166A1 (en) * 1996-03-28 1997-10-02 The Johns Hopkins University Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins
US6140113A (en) * 1996-03-28 2000-10-31 The Johns Hopkins University Polynucleotides encoding molecular complexes which modify immune responses
US6211342B1 (en) * 1996-07-18 2001-04-03 Children's Hospital Medical Center Multivalent MHC complex peptide fusion protein complex for stimulating specific T cell function
US6562345B1 (en) * 1996-11-12 2003-05-13 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
US6248564B1 (en) * 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
DE69840600D1 (de) 1997-09-16 2009-04-09 Univ Oregon Health & Science Rekombinante mhc-moleküle welche nützlich sind für die manipulation von antigen-spezifischen t-zellen
US6232445B1 (en) * 1997-10-29 2001-05-15 Sunol Molecular Corporation Soluble MHC complexes and methods of use thereof
IL135775A0 (en) * 1997-12-01 2001-05-20 Us Gov Health & Human Serv Antibodies and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin
GB2339782A (en) 1998-06-05 2000-02-09 Philip Michael Savage Chimeric protein complexes comprising HLA class I antigens
US6342221B1 (en) * 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF
US6680209B1 (en) * 1999-12-06 2004-01-20 Biosite, Incorporated Human antibodies as diagnostic reagents
US20040191260A1 (en) * 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
IL151860A0 (en) 2000-03-27 2003-04-10 Technion Res & Dev Foundation Single chain class i major histocompatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
JP2003530836A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ユニバーシティー オブ ロチェスター 標的化ワクチン送達システム
AU2001271273A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Ludwig Institute For Cancer Research Multicomponent conjugates which bind to target molecules and stimulate cell lysis
GB0026812D0 (en) 2000-11-02 2000-12-20 Isis Innovation Cancer therapy
US20030017134A1 (en) * 2001-06-19 2003-01-23 Technion Research And Development Foundation Ltd. Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer
US8022190B2 (en) * 2001-06-19 2011-09-20 Technion Research & Development Foundation Ltd. Immuno-molecules containing viral proteins, compositions thereof and methods of using
GB0115071D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Avidex Ltd Substances
US7362707B2 (en) * 2001-07-23 2008-04-22 Acme Packet, Inc. System and method for determining flow quality statistics for real-time transport protocol data flows
US6992176B2 (en) * 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
EP1485075A4 (en) * 2002-02-20 2006-04-26 Dyax Corp MHC-PEPTIDE COMPLEX BINDING LIGANDS
US7632866B2 (en) * 2002-10-21 2009-12-15 Ramot At Tel Aviv University Derivatives of N-phenylanthranilic acid and 2-benzimidazolone as potassium channel and/or neuron activity modulators
MX2008014722A (es) 2006-05-19 2011-04-15 Teva Pharma Proteinas de fusion, usos de las mismas y procesos para producir las mismas.

Also Published As

Publication number Publication date
CN101448951A (zh) 2009-06-03
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EA200870555A1 (ru) 2009-04-28

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