CN106132428B - 用于快速和全面t细胞免疫监测的细胞平台 - Google Patents

用于快速和全面t细胞免疫监测的细胞平台 Download PDF

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Abstract

用于T细胞表位库的高效和系统性鉴定的方法及系统。

Description

用于快速和全面T细胞免疫监测的细胞平台
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年1月21日提交的美国临时申请No.61/929,651(其内容在此通过引用并入)的权益。
政府支助的声明
本发明是在由国立卫生研究院的NIGMS授予的基金号3U54GM094662-02和5U01GM094665-02下由政府支助进行的。政府具有本发明的某些权利。
发明背景
在整个本申请中，在方括号内提及各种出版物。这些参考文献的完整引文可见于本说明书的末尾。本文中提及的这些出版物和所有专利、专利申请出版物和书的公开内容在此通过引用整体并入本申请，以更全面地描述本发明所属的领域。
在过去十年中在用于鉴定与临床上重要的疾病状态和对治疗的差异反应相关的分子标签的基因组学[13-15]和蛋白质组学技术[16-19]的开发和应用中已取得显著增长。这些进展有望用于个性化诊断[20]。作为一个例子，自适应生物技术利用T细胞受体(TCR)β链高变区的高通量测序，以为研究者提供样品内的TCR库的全面分析[21]。该风险投资资助的努力目前是有偿服务企业，生物标志物发现的预计市场深度达3亿美元。高通量技术的迅速进展一直伴随着生物制剂(例如，单克隆抗体、治疗性蛋白和肽)的逐步临床开发[22-25]，并且已彻底改变了免疫源性疾病的治疗。例如，与主要通过抗体反应加强免疫的常规疫苗不同，Genocea Biosciences正在开发基于生物制剂的新型疫苗，其集中于产生针对细胞内病原体的强劲的T细胞应答。同样地，Apitope(一个欧洲的生物技术公司)正在开发用于治疗其中T细胞起着关键致病作用的自身免疫性疾病的治疗肽。Aptiope最近与Merck-Serono联手持续开发它们的旗舰级MS肽治疗剂。寻求监测、增强或改变T细胞免疫的努力将在很大程度上取决于鉴定临床相关T细胞表位的能力。
在包括CD8介导的适应性免疫应答的分子事件的核心的是T细胞受体(TCR)与由主要组织相容性复合物(MHC)分子非共价地呈递的小肽抗原(被称为T细胞表位)的接合。这代表了免疫系统的靶向机制并且是T细胞激活和效应子功能的必要分子相互作用。在T-细胞发育过程，基因组编辑过程导致独特的TCR在每一个免疫细胞上的表达，估计的深度超过300万个独特的序列[1]，并且解释了T细胞可对其响应的抗原的巨大多样性。然而，T细胞表位在历史上一直很难研究，因为每一个TCR需要在定制试剂(例如，四聚体)的特异性以及开发方面的个别表征以用于进一步研究。在临床上，该挑战是伴随着这样的事实，即免疫应答通常涉及许多T细胞特异性，例如靶向多个病毒抗原以实现单一病原体应答的病毒清除。因此，系统地鉴定针对给定的疾病状态的表位的整个系综的能力代表了针对感染性疾病、自身免疫和癌症的诊断剂和潜在的高度靶向治疗剂的开发的独特机会。
存在许多用于表位发现的实验方法，所述方法包括表达[3,4]和合成肽文库[5,6]、位置扫描文库[7]、pMHC微阵列[8]的筛选，以及天然存在的表位[9-11]的质谱鉴定。Marrack和Kappler将杆状病毒感染的昆虫细胞策略开发为共价结合于潜在肽模拟表位的文库的I类MHC分子的展示平台[4]。模拟表位与未知肽表位相异在于序列，但它们仍然被特定的CD8T细胞受体识别。然而，通常具有挑战性的是将所鉴定的模拟表位连接至天然表位。此外，杆状病毒展示系统需要5-10轮费时的细胞分选、病毒产生、扩增和再感染来解析模拟表位，再加上对纯化和四聚化同源TCR的要求。在部分解决这些问题后，Newell等利用与流式细胞术和质谱法(称为质量细胞术)组合的MHC四聚体的重同位素标记来以惊人的灵敏度直接从人血样品筛选一小组pMHC四聚体组合，尽管这技术目前仅限于每次检测约100个这样的组合[12]。这些方法的每一种方法都已为T细胞表位贡献了有价值的见解；然而，这些方法速度慢，劳动强度大，并且需要高度用户技能。
本发明解决了该对于用于T细胞表位库的高效系统性鉴定的新的改进的技术的需要。
发明简述
本发明提供了由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：
前导寡核苷酸序列，邻接有
编码8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码荧光蛋白的寡核苷酸序列，邻接有
编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链跨膜结构域的寡核苷酸序列。
本发明还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。
还提供了重组核酸，其以5’至3’顺序包含：
编码前导寡核苷酸序列的序列，邻接有
编码8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。
还提供了鉴定T细胞的方法，所述方法包括：将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞接触，每一个细胞表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白，邻接有第四接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞在允许T细胞与所述8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽缀合的条件下，在其细胞当中表达至少两种不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞形成缀合物的T细胞；
从所述回收的T细胞回收DNA；
对所述回收的DNA进行测序；
鉴定在所述DNA中编码的所述8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。
还提供了由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：
前导寡核苷酸序列，邻接有
编码8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链跨膜结构域的寡核苷酸序列。
还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含:
8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。
提供了重组核酸，其以5’至3’顺序包含：
编码前导寡核苷酸序列的序列，邻接有
编码8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。
还提供了鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞接触，每一个细胞表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞在允许T细胞与8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽缀合的条件下，在其细胞当中表达至少两种不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞形成缀合物的T细胞；
从所述回收的T细胞回收DNA；
对所述回收的DNA进行测序；
鉴定在所述DNA中编码的所述8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。
还提供了由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含:
前导寡核苷酸序列，邻接有
编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码荧光蛋白或编码免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有
编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
5至20个氨基酸的肽，
邻接有第一接头肽序列，
邻接有β2微球蛋白序列，
邻接有第二接头肽序列，
邻接有主要组织相容性复合物重链序列，
邻接有第三接头肽序列，
邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，
邻接有第四接头肽序列，
邻接有哺乳动物跨膜结构域。
还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
5至20个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
哺乳动物跨膜结构域。
还提供了多个分离的悬浮-适应细胞或多个表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述多个包括至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽。
提供了由如本文所述的分离的悬浮-适应细胞产生的(i)病毒样颗粒或(ii)病毒，所述病毒样颗粒或病毒经由具有通过哺乳动物跨膜结构域附接于其的表达产物的细胞膜部分物理缔合，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
5至20个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
哺乳动物跨膜结构域，邻接有
病毒包装序列。
还提供了多种所述病毒样颗粒或所述病毒。
还提供了以5’至3’顺序包含以下序列的重组核酸：
编码前导寡核苷酸序列的序列，邻接有
编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头肽序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有
编码第四接头肽序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
还提供了由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：
编码第一B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与人天然B2M肽序列同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的第二肽序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第三氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码与MHC重链同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第四氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第五接头的的寡核苷酸序列，
邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，所述表达产物包含重组多肽构建体，所述重组多肽构建体包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域。
还提供了由包含异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转导或用包含异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：
编码第一B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与人天然B2M肽序列同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的第二肽序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第三氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码与MHC重链同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列,
邻接有编码第四氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列,
邻接有编码第五接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列，邻接有编码病毒包装序列的寡核苷酸。
由权利要求46的细胞产生的(i)病毒样颗粒或(ii)病毒，所述病毒样颗粒或病毒经由具有通过哺乳动物跨膜结构域附接于其的表达产物的细胞膜部分物理缔合，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
重组多肽构建体，其包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域，邻接有病毒包装序列。
还提供了重组核酸，所述重组核酸以5’至3’顺序包含：编码第一B2M前导序列人寡核苷酸序列，邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与人天然B2M肽序列同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的第二肽序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第三氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码与MHC重链同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第四氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第五接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分接触，每一个细胞或膜结合部分表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含5至20个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域，邻接有第四接头肽序列，邻接有哺乳动物跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或膜结合部分在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在所述细胞或膜结合部分当中表达至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞或膜结合部分形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA；
对所述回收的DNA进行测序；
鉴定在所述DNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。
鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞或其膜结合部分接触，每一个所述细胞或膜结合部分表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或其膜结合部分在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在所述细胞或部分当中表达至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞或膜结合部分形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA；
对所述回收的DNA进行测序；
鉴定在所述DNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。
鉴定T细胞表位的方法包括将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞或与此类细胞的膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒接触，所述细胞或膜结合部分表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含5至20个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域，邻接有第四接头肽序列，邻接有哺乳动物跨膜结构域，邻接有病毒包装序列，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或与所述细胞的膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒，在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在所述细胞或病毒样颗粒或病毒当中表达至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收与所述多个的悬浮-适应细胞、病毒样颗粒或病毒形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA或从所述病毒样颗粒或病毒回收RNA；
对所述回收的DNA或RNA进行测序；
鉴定在所述DNA或RNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。
鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞或与此类细胞的膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒接触，每一个细胞或病毒样颗粒或病毒表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，
其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞、病毒样颗粒或病毒在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在其细胞当中表达至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞、病毒样颗粒或病毒缔合的膜部分形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA或从所述病毒样颗粒或病毒回收RNA；
对所述回收的DNA或RNA进行测序；
鉴定在所述DNA或RNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。
附图简述
图1.用于CD8+T细胞表位的高通量鉴定的“epiCELL”免疫监测平台的一般概述。将sc-pMHC载体的文库混合，并一同转染进入悬浮适应HEK293细胞，从而产生所述epiCELL库。将所述混合的表达文库与患者来源的外周T细胞混合，并使其形成缀合物，通过磁力分离或更常规的流式细胞分选法回收所述缀合物。磁珠(如果使用的话)可来自任何商业来源，包括来自Life technologies的
Figure BDA0001109207000000171
CD8和来自Miltenyi的CD8微珠(MACS)。例如，超顺磁珠粒偶联有抗-人CD8抗体，所述抗体使得能够容易地直接从任何样品，包括全血、骨骼、血沉棕黄层、单核细胞(MNC)和组织消化物分离或耗尽人CD8+T细胞。使用通用引物通过PCR扩增来自富集的库成员的表位序列，将所述表位序列经历下一代深度测序以鉴定通过捕获方法富集的表位。
图2.膜锚定的I类sc-pMHC构建体的设计。构建体利用随后紧接候选表位(标记为肽)，通过接头区域(对于第一、第二和第三接头的每一个，为4个重复的GGGGS，以及任选地对于荧光蛋白与HC TM之间的第四接头，为2个重复的GGGGS)进一步偶联于天然B2M分子、人HLA-A02:01和表面暴露的mCherry表达代理的天然人B2M前导序列。整个构建体通过天然I类重链跨膜结构域(HC TM)保持在膜中。通常引用(标记的正向、反向)用于在T细胞攻击后扩增独特的27个核苷酸的序列(9聚体肽)以直接鉴定疾病相关表位。
图3.MHC对照的表面表达确认。在我们的sc-pMHC epiCELL平台中展示的连接于4个独立的病毒病原体的4个已知的致HLA-A02限制型表位的表达确认。待检测的构建体是CMV pp65蛋白质残基495-504[CMV]、流感基质蛋白58-66[FLU],]、HTLV Tax 11-19[HTLV]和HIV gag p17 76-84[HIV]。通过荧光激活细胞分选(FACS)分析确认构建体的表面表达，从而监测mCherry代理表达和抗-mCherry表面表达。值得注意的是，在该图产生后，另外的(第5)对照表位被鉴定，并被添加至编码EBV BMLF1残基259-267[EBV]的测试组。EBV的表面表达谱反映了对于另外4个对照观察到的表面表达谱(数据未显示)。
图4.确认MHC对照的正确折叠和表位呈递。此处，使用W6/32抗-MHC-I类mAb显示I类HLA:B2M复合物的质膜表面染色，图解1)I类MHC的内源表达(标记为亲代的)，2)通过靶向天然人B2M的5’UTR的shRNA的慢病毒递送产生的～95％的敲低(敲低)，和3)在添加我们的sc-p构建体(Rescue)后I类MHC表达的拯救。值得注意的是，所述构建体不含5’UTR，从而对shRNA下调产生免疫。所使用的mAb W6/32要求MHC和B2M被正确折叠并且被膜定位以用于结合。
图5.用于在HEK细胞进行TCR表达和膜定位的构建体。为了允许TCR的表达，使用慢病毒共转导技术，其中一个慢病毒构建体具有被各种病毒2A肽连接的完全CD3基因盒(顶部)。所使用的2A“自裂解”肽来源于口蹄疫苗病毒(F2A)、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)(T2A)和马鼻炎A病毒(E2A)。所述第二构建体(底部)具有通过病毒猪捷申病毒-1(P2A)肽连接的TCRα和β链以允许每一条链的化学计量表达，因为该肽在哺乳动物细胞中显示最高的“裂解”效率[2]。mCerulean(蓝色)表达代理在β链跨膜区段之后。
图6.在HEK细胞原理论证研究中活性异二聚体TCR对照构建体的表面表达使用上述HLA分子的5个同源TCR(TCR RA14[结合CMV肽]、JM22[FLU]、AS01[EBV]、A06[HTLV]和1803[HIV])。通过针对表面抗-CD3(FITC标记的，x-轴)的FACS分析和表面MHC五聚体染色(藻红蛋白[PE]，y-轴)确认的表面表达和活性T细胞复合物形成。将未转导的细胞用作阴性对照(CNTRL)。
图7.用于epiCELL平台的初始确认的阵列细胞-细胞FACS分析。单个地表达5种TCR(RA14、JM22、AS01、1803、A06)以互补5种同源sc-pMHC epiCELLS(CMV、FLU、EBV、HIV、HTLV)。细胞质mCherry(CYTO)和表面表达的mCherry(无MHC、STALK)用作阴性对照。来自单个和混合群体的FACS分析的直方图明确地显示,只有当表达同源MHC:TCR对的细胞都存在时，代表特定细胞间相互作用的信号才显著增强(多至100倍，A06:HTLV相互作用)，并且与常规五聚体攻击相关(图6)。阳性相互作用以红色箭头标记。
图8.epiCELL平台的结果。将两个epiCELL构建体(CMV和FLU)混合，用单独的具有TCR的HEK细胞(JM22)进行攻击，并基于形成的缀合物进行分选(使用mCherry表面表达代理来跟踪epiCELL以及将mCerulean用作TCR表达代理)。(当将使用磁力分享时，荧光蛋白不是构建体的所需部分，但有助于手工或较低通量的方法)。提取来自每一个库的基因组DNA，并使用靶向围绕所述表位的侧翼区的通用引物将其经历～30个周期的PCR。显示(顶部)预分选的epiCELL混合物(标记为Pre)和JM22攻击的组的所得的PCR条带。将这些扩增子进行文库制备，随后在illumina MiSeq平台上进行下一代测序。分析测序文件并容易地鉴定表位。对于每一个表位，计数观察到的表位序列的绝对数目上，并将其标准化为通过我们的QC滤波器的所有观察到的NGS读数的百分比，标记代表CMV和FLU的致病表位(底部)。
图9.将五个epiCELL构建体(CMV、FLU、EBV、HIV、HTLV)汇集，用单独的具有TCR的HEK细胞(R14、JM22、AS01、A06)进行攻击，并基于形成的缀合物进行分选(使用mCherry表面表达代理跟踪epiCELL，以及将mCerulean用作TCR表达代理)。提取来自每一个库的基因组DNA并使用靶向围绕所述表位的侧翼区的通用引物将其经历～30个周期的PCR。显示了(顶部)预分选的epiCELL库(标记为Pre)和TCR攻击的组的所得的PCR条带的生物分析仪输出。将这些扩增子进行文库制备，随后在illumina MiSeq平台上进行下一代测序。分析测序文件并容易地鉴定表位。在预分选的群体(文库)中鉴定的表位在16-23％的范围内(数据未显示)。对于每一个TCR攻击的数据集组，计数观察到的表位序列的绝对数目并将其标准化为通过我们的QC滤波器的所有观察到的NGS的百分比，并将其用于计算Z-评分。
图10A-10B.用于epiCELL的示例性替代表面表达构建体及其衍生物，例如viratope。所述变体利用随后紧接候选表位(标记为肽)，通过接头L1进一步偶联于B2M分子的天然人B2M前导序列。10A:A(1)类似于通过在C端最末端上添加病毒包装信号的“常规的”基于epiCELL的呈递(例如，GP41env残基706-713，等，标记为VP)。为了允许双价展示，已使用基于Fc融合物的构建体A(2)，所述构建体再次以VP包装信号结尾。在该情况下，将用于常规抗体的表位(例如，FLAG、MYC等)置于接头L4中以允许进行表面检测。最后，为了增强epiCELL筛选平台的模块性/灵活性，使用基于synTac的表达构建体。synTac将MHC构建体分裂成各自的重链和轻链并将肽和蛋白质与各种末端融合(例如，构建体A(3)和图10B中示意性显示的)。所有组分在于真核细胞(例如，HEK、CHO)内的产生过程中缔合和自组装。单个的链通过二硫桥(以红线显示的)共价系连。所有构建体通过天然I类重链跨膜结构域(TM)保持在膜中。
图11A-11B：来自viratope颗粒的RT-PCR和下一代GEN测序。通过裂解从每一个viratope库提取基因组RNA，并将其经历一轮反转录(RT，在42℃进行20分钟)，随后使用靶向围绕所述表位的侧翼区的通用引物进行～30个周期的PCR。所得的PCR条带示于图11A中。值得注意的是，只有在初始RT步骤存在的情况下观察到PCR条带(泳道1)，当RT被省略时PCR条带不存在(泳道2)，这支持了来源于epiCELLS的有复制能力的逆转录病毒的产生。将这些扩增子进行下一代测序(NGS)并容易地鉴定表位(图11B)。
图12A-B：Viratope：用于检测抗原特异性T细胞群体的利用肽-HLA-A*0201Fc融合蛋白假型化的慢病毒颗粒。将由连接于β-2微球蛋白的肽表位、HLA-A*0201和人IgG1Fc组成的单一链构建体(图10A，第2个)替代第三代慢病毒转染系统的包膜组分。构建体还含有用于通过第二抗体进行检测的FLAG表位(被置于L4接头区中)。于HLA-A*0201背景中呈递的肽表位为来自人巨细胞病毒(CMV)的NLVPMVATV肽表位或来自流感病毒(FLU)的GILGFVFTL肽表位。将收获的慢病毒浓缩并应用于先前用特异性或无关T细胞受体(TCR)转染的HEK细胞。从细胞洗涤过量的慢病毒，并通过缀合有PE的抗-FLAG抗体检测剩余的细胞结合的慢病毒。利用同源但非不相关的表位假型化的慢病毒以可与通过特异性肽-MHC五聚体进行的染色相比较的方式结合于各自的表达同源TCR的HEK细胞。
发明详述
提供了分离的悬浮-适应细胞，其中由异源核酸转导或用异源核酸转染所述细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含以下序列：
前导寡核苷酸序列，邻接有
编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码荧光蛋白或编码免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有
编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
在所述细胞以及本文论述的包含免疫球蛋白Fc结构域的另外的细胞和构建体的实施方案中，所述免疫球蛋白Fc可具有
人Ig Fc，优选人IgG1Fc的序列。在另一个实施方案中，此类免疫球蛋白Fc结构域可具有鼠IgG2a Fc的序列。值得注意的是，当表达各自包含免疫球蛋白Fc结构域的构建体时，自发双价融合可发生。因此，所论述的转导或转染的细胞、表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分以及如本文所述的病毒样颗粒和病毒可显示所表达的免疫球蛋白Fc结构域的双价融合。
在本文所述的编码的或表达的5至20个氨基酸的肽的实施方案中，所述肽的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸之一。在实施方案中，所述肽的长度为8个、9个、10个、11个或12个氨基酸。在实施方案中，所述肽为九聚体(即长度为9个氨基酸)。可按需预选所述序列。
在所述细胞以及本文所论述的包含哺乳动物跨膜结构域的另外的细胞和构建体的实施方案中，所述跨膜结构域具有哺乳动物跨膜结构域的序列，但非获自哺乳动物本身，例如其为经工程化具有与哺乳动物跨膜结构域蛋白质序列同一或相似的序列的序列。在实施方案中，所述序列与哺乳动物MHC跨膜序列相同。在实施方案中，所述序列与主要组织相容性复合物重链跨膜结构域相同。在实施方案中，所述序列与I类主要组织相容性复合物重链跨膜结构域相同。MHC Iα3序列在本领域中是已知的。在实施方案中，所述序列与人I类主要组织相容性复合物重链跨膜结构域相同。如本文中所用，关于两个核苷酸序列的“邻接有”意指所述第一序列经由例如磷酸二酯键与所述第二序列连续。如本文中所用的，关于肽/寡肽序列的“邻接有”意指所述第一序列经由例如肽键与所述第二序列连续。
任何核酸编码的荧光蛋白可用于本文所述的发明。此类蛋白在本领域中是公知的。非限定性实例包括GFP、RFP、YFP、mFRUIT、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed-单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。
悬浮-适应细胞是能够在悬浮培养物存活或增殖的细胞。异源核酸是相对于已将其转染或转导进其中的细胞是异源的核酸，所述异源核酸作为整体在转染或转导之前非天然存在于所述细胞中。
接头序列是本领域中已知的短肽序列，包括短的重复肽序列。它们通常不干扰它们连接的结构域或区域的其它编码的肽功能或对所述肽功能具有最小的功能性影响。例如，对于一个或多个接头，接头可以是4个重复的GGGGS。如本文所述的接头，除了如本文中提及的自裂解接头的明确例外以外，是稳定的，因为它们不是自裂解的。关于提及的例外，所述自裂解接头，此类接头的非限制性实例为病毒P2A肽，所述肽在哺乳动物细胞中显示良好的自裂解效率。
在所述分离的悬浮-适应细胞的实施方案中，由异源核酸转导或用异源核酸转染细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：
前导寡核苷酸序列，邻接有
编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有
编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
在所述分离的悬浮-适应细胞的实施方案中，由异源核酸转导或用异源核酸转染所述细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：
前导寡核苷酸序列，邻接有
编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码荧光蛋白的寡核苷酸序列，邻接有
编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
5至20个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
哺乳动物跨膜结构域。
在实施方案中，提供了表达所述细胞的表达产物的膜结合部分。在实施方案中，所述膜结合部分是微囊泡或外来体。
在实施方案中，所述细胞表达包含免疫球蛋白Fc结构域的序列的表达产物。
本发明还提供了如所描述的细胞，或膜结合部分，除其中将其接头诸如第四接头额外地连接于作为表面表达的代理的荧光蛋白(诸如，例如，mCherry)或针对已知抗体的表位(例如，FLAG、MYC)外。在实施方案中，如所描述的细胞的接头或膜结合部分不包含此类荧光蛋白或表位，并且只为接头(例如如在本文中其它地方所描述的)。
在所述分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分的实施方案中，所述细胞表达包含荧光蛋白的表达产物。
在所述分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分的实施方案中，所述细胞表达包含免疫球蛋白Fc结构域的表达产物。
在所述分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分的实施方案中，所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。
在实施方案中，所述异源核酸还包含相对于编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列在3’的编码病毒包装序列的寡核苷酸。
在所述分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分的实施方案中，所述表达产物还包含相对于哺乳动物跨膜结构域在C末端的病毒包装序列。
在所述转导的细胞、本文所述的编码病毒包装序列的重组核酸或异源核酸的实施方案中，相关核酸在实施方案中可以是RNA序列。在实施方案中，所述病毒包装序列是逆转录病毒的病毒包装序列。
在实施方案中，提供了表达如本文所述的细胞的表达产物的膜结合部分，其为病毒样颗粒。
在如本文所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分的实施方案中，所述β2微球蛋白具有与人β2微球蛋白相同的序列。
在如本文所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分的实施方案中，所述主要组织相容性复合物重链序列具有与人HLA-A序列相同的序列。
在如本文所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分的实施方案中，所述跨膜结构域具有与人主要组织相容性复合物I重链跨膜结构域相同的序列。
还提供了多个如本文所述的分离的悬浮-适应细胞。还提供了多个表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述多个包括至少两个不同编码的5至20个氨基酸的肽。
在所述多个的实施方案中，所述多个包括至少100个不同编码的5至20个氨基酸的肽。
还提供了如所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，或所述多个分离的悬浮-适应细胞或膜结合部分，其中所述编码的肽是九聚体或多个九聚体。在实施方案中，所述编码的5-20个氨基酸的肽被呈递在所述细胞的细胞外表面上。
还提供了如所述的表达所述表达产物的分离的悬浮-适应细胞的膜结合部分。
还提供了如所述的分离的悬浮-适应细胞。
在所述分离的悬浮-适应细胞的实施方案中，所述异源核酸编码所述病毒包装序列，并且由包含所述异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转导或用包含所述异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转染所述细胞。
还提供了由如本文所述的转导或转染的细胞产生的(i)病毒样颗粒或(ii)病毒，所述病毒样颗粒或病毒经由具有通过哺乳动物跨膜结构域附接于其的表达产物的细胞膜部分缔合，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
5至20个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
哺乳动物跨膜结构域，邻接有
病毒包装序列。
在所述(i)病毒样颗粒或(ii)病毒的实施方案中，使用逆转录病毒转染系统转染所述细胞。在所述(i)病毒样颗粒或(ii)病毒的实施方案中，使用慢病毒转染系统实现所述转染。
在所述(i)病毒样颗粒或(ii)病毒的实施方案中，所述逆转录病毒转染系统包含在其中具有编码以下序列的寡核苷酸序列或多个序列(替代编码一个或多个包膜蛋白的寡核苷酸序列或多个序列)的包装质粒：5至20个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
哺乳动物跨膜结构域。
还提供了分离的病毒，所述病毒已从如本文所述的细胞出芽。出芽病毒随其携带所述细胞的膜的一部分或与所述膜的该部分缔合，这样就与本文所述的表达的膜定位的构建体缔合。
还提供了已从如本文所述的细胞出芽的分离的病毒样颗粒。出芽的病毒样颗粒随其携带所述细胞的膜的一部分，或与所述膜的该部分缔合，这样就与本文所述的表达的膜定位的构建体缔合。
在实施方案中，所述病毒是逆转录病毒。在实施方案中，所述病毒是慢病毒。在实施方案中，所述逆转录病毒是重组体。
还提供了多种如本文所述的分离的病毒。在实施方案中，所述多种包括差异在于其编码的5至20个氨基酸的肽的病毒。
还提供了多种如本文所述的分离的病毒样颗粒。在实施方案中，所述多种分离的病毒样颗粒包含相异在于其编码的5至20个氨基酸的肽的病毒样颗粒。
在所述病毒的实施方案中，所述表达的重组多肽包含荧光蛋白。在所述病毒的实施方案中，所述表达的重组多肽包含免疫球蛋白Fc结构域。在所述病毒样颗粒的实施方案中，所述表达的重组多肽包含荧光蛋白。在所述病毒样颗粒的实施方案中，所述表达的重组多肽包含免疫球蛋白Fc结构域。
还提供了重组核酸，其以5’至3’顺序包含：
编码前导寡核苷酸序列的序列，邻接有
编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有
编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有
编码主要组织相容性复合物重链序列的的寡核苷酸序列，邻接有
编码第三接头肽序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有
编码第四接头肽序列的寡核苷酸序列，邻接有
编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
在实施方案中，所述重组核酸包含编码荧光蛋白的寡核苷酸序列。在实施方案中，所述重组核酸包含编码免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列。在实施方案中，所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。在实施方案中，所述哺乳动物跨膜结构域具有与哺乳动物HLA-A*0201结构域相同的序列。在实施方案中，所述HLA-A*0201是人。
在实施方案中，所述重组核酸还包含相对于编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列在3’的编码病毒包装序列寡核苷酸。在实施方案中，所述重组核酸是载体。在实施方案中，所述重组核酸是病毒载体。在实施方案中，所述重组核酸是逆转录病毒载体。在实施方案中，所述重组核酸是慢病毒载体。在实施方案中，所述重组核酸是质粒。
在所述重组核酸或所述分离的悬浮-适应细胞的实施方案中，所述异源或重组核酸包括cDNA。
还提供了由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含:
编码第一B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与人天然B2M肽序列同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的第二肽序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第三氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码与MHC重链同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第四氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第五接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
在实施方案中，所述预选的第二肽序列是免疫系统效应分子。在实施方案中，所述预选的第二肽序列是可检测的表位。在非限制性实例中，所述可检测表位是FLAG表位或MYC表位。在实施方案中，所述预选的第二肽序列是荧光蛋白，如本文中所述。在实施方案中，所述预选的第二肽序列可以是靶向例如细胞表面聚糖或其它翻译后修饰(例如，硫酸化)的天然存在的或合成的亲和试剂。实例包括，但不限于，TNF/TNFR家庭的成员(OX40L、ICOSL、FASL、LTA、LTB TRAIL、CD 153、TNFSF9、RANKL、TWEAK、TNFSF13、TNFSF13b、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、CD40LG、CD70)或针对TNF/TNFR家族成员的亲和试剂；免疫球蛋白超家族的成员(VISTA、PD1、PD-L1、PDL2、B71、B72、CTLA4、CD28、TIM3、CD4、CD8、CD19、T细胞受体链、ICOS、ICOS配体、HHLA2、嗜乳脂蛋白、BTLA、B7-H3、B7-H4、CD3、CD79a、CD79b、IgSF、CAMS，包括CD2、CD58、CD48、CD150、CD229、CD244、ICAM-1)、白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR))、凝集素超家族成员、选择素、细胞因子/趋化因子和细胞因子/趋化因子受体、生长因子和生长因子受体)、粘连分子(整合素、纤连蛋白、钙粘蛋白)，或多跨完整膜蛋白的胞外结构域，或针对免疫球蛋白超家族的亲和试剂以及所列的基因产物。另外，这些基因的活性同源物/直系同源物，包括但不限于，病毒序列(例如，CMV、EBV)、细菌序列、真菌序列、真核病原体(例如，血吸虫、疟原虫、巴贝斯虫、艾美耳球虫、泰勒虫、弓形虫、内阿米巴、利什曼原虫和锥虫)和哺乳动物来源的编码区。在实施方案中，所述预选的第二肽序列可以是T细胞刺激性结构域或可以是T细胞抑制性结构域。在一个实施例中，所述预选的第二肽序列可以是细胞表面蛋白的胞外结构域。
还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合的部分，所述表达产物包含，
重组多肽构建体，其包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域。在实施方案中，所述预选的第二肽序列以及所述其它组分是如本文中其它地方引述的。
还提供了由包含异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转导或用包含异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含:
编码第一B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与人天然B2M肽序列同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的第二肽序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第三氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码与MHC重链同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第四氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第五接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列，邻接有编码病毒包装序列的寡核苷酸。病毒包装序列或信号在本领域中是已知的并且也在本文中进行了描述。在实施方案中，所述第三氨基酸接头在表达后自裂解。自裂解接头在本文中进行了描述，诸如病毒P2A肽。
还提供了(i)由本细胞产生的病毒样颗粒或(ii)病毒，所述病毒样颗粒或病毒经由具有通过哺乳动物跨膜结构域附接于其的表达产物的细胞膜部分缔合，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
重组肽构建体，其包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域，邻接有病毒包装序列。在所述(i)病毒样颗粒或(ii)病毒的实施方案中，所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。在实施方案中，所述异源核酸还包含相对于编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列在3’编码病毒包装序列的寡核苷酸。在所述(i)病毒样颗粒或(ii)病毒的实施方案中，所述预选的第二肽是T细胞调节结构域、抗体表位、荧光蛋白、核酸结合蛋白或共调节蛋白。
还提供了以5’至3’顺序包含以下序列的重组核酸：
编码第一B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与人天然B2M肽序列同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码预选的第二肽序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第三氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码第二B2M前导序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码与MHC重链同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第四氨基酸接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，
邻接有编码第五接头的寡核苷酸序列，
邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。
在所述重组核酸的实施方案中，所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。在所述重组核酸的实施方案中，所述重组核酸还包含相对于编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列在3’的编码病毒包装序列的寡核苷酸。
还提供了鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞或表达所表达产物的此类细胞的膜结合部分接触，每一个细胞或膜结合部分表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含5至20个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域，邻接有第四接头肽序列，邻接有哺乳动物跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或膜结合部分在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在所述细胞或膜结合部分当中表达至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞或膜结合部分形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA；
对所述回收的DNA进行测序；
鉴定在所述DNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，
以从而鉴定T细胞表位。
在于本文所述的方法中回收T细胞的实施方案中，回收所述缀合物。
还提供了鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞，或其膜结合部分接触，每一个所述细胞或其膜结合部分表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，
其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或其膜结合部分在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在所述细胞或部分当中表达至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞或膜结合部分形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA；
对所述回收的DNA进行测序；
鉴定在所述DNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。
在所述方法的实施方案中，通过流式细胞术回收已形成缀合物的T细胞。在所述方法的实施方案中，通过荧光激活细胞分选回收已形成缀合物的T细胞。
在所述方法的实施方案中，所述方法包括在测序之前扩增所述回收的DNA。在所述方法的实施方案中，使用一种或多种通用引物实现所述扩增。在所述方法的实施方案中，所述通用引物的一种或多种针对所述异源核酸的序列的一部分，但不与编码所述细胞的天然β2微球蛋白序列的核酸互补。
在所述方法的实施方案中，所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。在所述方法的实施方案中，所述T细胞包含获自受试者的外周T细胞。在所述方法的实施方案中，所述受试者是人。
在所述方法的实施方案中，所述方法还包括在于所述回收的DNA中，相对于它们在所述多个分离的悬浮-适应细胞的DNA中的存在被富集的DNA中鉴定编码的任何所述5-20氨基酸的肽，以从而鉴定一个或多个免疫显性T细胞表位。
在所述方法的实施方案中，所述方法还包括将所述T细胞缀合物的水平与作为表达重组工程化的T细胞受体(TCR)的对照细胞的对照的水平相比较，并且其中超过对照的水平表示免疫显性表位。
在所述方法的实施方案中，所述分离的悬浮-适应细胞是哺乳动物细胞。在实施方案中，所述分离的悬浮-适应细胞是HEK细胞。
在所述方法的实施方案中，使用所述分离的悬浮-适应细胞。在所述方法的实施方案中，使用表达悬浮-适应细胞的表达产物的细胞的分离的膜结合部分。
还提供了鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括：
将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞或与此类细胞的膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒接触，所述细胞或膜结合部分表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含5至20个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域，邻接有第四接头肽序列，邻接有哺乳动物跨膜结构域，邻接有病毒包装序列，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或与所述细胞的膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在所述细胞或病毒样颗粒或病毒当中表达至少两种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收已与所述多个的悬浮-适应细胞、病毒样颗粒或病毒形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA或从所述病毒样颗粒或病毒回收RNA；
对所述回收的DNA或RNA进行测序；
鉴定在所述DNA或RNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，
以从而鉴定T细胞表位。
还提供了鉴定T细胞表位的方法，所述方法包括：
将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞或与此类细胞的膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒接触，每一个所述细胞、病毒样颗粒或病毒表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，
其中(i)通过一个或多于一个二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞、病毒样颗粒或病毒在允许T细胞与所述5至20个氨基酸的肽缀合的条件下在其细胞当中表达至少2种不同编码的5至20个氨基酸的肽；
回收已与悬浮-适应细胞、与膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA或从所述病毒样颗粒或病毒回收RNA；
对所述回收的DNA或RNA进行测序；
鉴定在所述DNA或RNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，
以从而鉴定T细胞表位。
在实施方案中，与所述细胞的膜部分缔合的病毒样颗粒或病毒已从此类细胞出芽。
在所述方法的实施方案中，通过流式细胞术回收已形成缀合物的T细胞。在所述方法的实施方案中，所述T细胞缀合物通过FACS或第二抗体染色法回收。在实施方案中，所述第二抗体针对预选的第二肽序列。
在实施方案中，所述方法包括在测序之前扩增所述回收的DNA或RNA。在实施方案中，使用一种或多种通用引物实现所述扩增。
在实施方案中，通过(i)将已形成缀合物的T细胞与具有附接于其外表面上的针对T细胞表面标志分子的抗体或抗体片段的磁珠接触,和(ii)对所述珠粒施加磁场以回收所述磁珠来回收已形成缀合物的T细胞。
在实施方案中，所述T细胞表面标志分子是CD8分子。
在所述方法的实施方案中，所述悬浮-适应细胞或其膜部分表达荧光蛋白，并通过基于所述荧光蛋白的荧光的荧光激活细胞分选来回收已形成缀合物的T细胞。
在所述方法的实施方案中，所述病毒样颗粒或病毒通过基于第二抗体的系统来回收，其中所述第二抗体针对所述表达的构建体中的表位。此类表位的非限制性实例包括FLAG和MYC表位。
在本发明的实施方案中，分离的悬浮-适应细胞、所述β2微球蛋白具有与人β2微球蛋白相同的序列。在所述分离的悬浮-适应细胞的实施方案中，所述组织相容性复合物重链序列具有与人HLA-A序列相同的序列。在所述分离的悬浮-适应细胞的实施方案中，所述组织相容性复合物重链跨膜结构域具有与人主要组织相容性复合物I重链跨膜结构域相同的序列。
在所述发明的实施方案中，所述多个可包括至少100个不同编码的5-20个氨基酸的肽。在实施方案中，所述肽是8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。在实施方案中，所述多个包括至少1000个不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。在实施方案中，所述多个包括至少10,000个不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。在实施方案中，所述多个包括至少100,000个不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。在实施方案中，所述多个包括至少1x 106个不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。在实施方案中，所述多个包括至少1x 107个不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。在实施方案中，所述多个包括至少1x 108个不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。
在所述分离的悬浮-适应细胞或所述多个分离的悬浮-适应细胞的实施方案中，所述编码的肽是九聚体(长度为9个氨基酸)。
在所述发明的实施方案中，所述编码的肽呈现在细胞的细胞外表面上。
在实施方案中，所述重组核酸是载体。在实施方案中，所述载体是病毒载体。在实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。
在所述分离的悬浮-适应细胞，所述多个分离的悬浮-适应细胞，或所述重组核酸的实施方案中，所述核酸包含DNA。
在实施方案中，所述通用引物的一种或多种针对所述异源核酸的序列的一部分，但不与编码所述细胞的天然β2微球蛋白序列的核酸互补。
在实施方案中，所述T细胞包含获自受试者的外周T细胞。
在本文中的方法的实施方案中，所述受试者是人。
在实施方案中，所述方法包括将获得的结果与表达重组工程化的TCR的对照细胞的结果相比较。在实施方案中，所述表达重组工程化的TCR的对照细胞是HEK细胞。
在所述细胞的实施方案中，所述β2微球蛋白具有与人β2微球蛋白相同的序列。在实施方案中，所述组织相容性复合物重链序列具有与人HLA-A序列相同的序列。在实施方案中，所述组织相容性复合物重链跨膜结构域具有与人主要组织相容性复合物I重链跨膜结构域相同的序列。
提供了多个所述分离的悬浮-适应细胞，其中所述多个包括至少两个不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽。
在同基因细胞系(每细胞单个整合)的背景中，实际限制等于所使用的文库的复杂度。换句话说，基于反应中的细胞的数目-例如106-108个进行缩放。
在本发明的实施方案中，可除去所述β2微球蛋白与所述主要组织相容性复合物重链之间的接头，从而产生两个单独的产物。这些将在细胞中天然地组装。
在实施方案中，所述核酸包含以下序列：
atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggcc(n)xggtggaggtggttctggaggaggcggttcgggcggaggtggtagtatccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtattatactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccacgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgggatcgagacatgggaggcggaggatctggtggtggaggttctggtggtgggggatctggctctcactccatgaggtatttcttcacatccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatcgcagtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggagggtccggagtattgggacggggagacacggaaagtgaaggcccactcacagactcaccgagtggacctggggaccctgcgcggcgcctacaaccagagcgaggccggttctcacaccgtccagaggatgtatggctgcgacgtggggtcggactggcgcttcctccgcgggtaccaccagtacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaaagaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatggcagctcagaccaccaagcacaagtgggaggcggcccatgtggcggagcagttgagagcctacctggagggcacgtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcacggacgcccccaaaacgcatatgactcaccacgctgtctctgaccatgaagccaccctgaggtgctgggccctgagcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatggggaggaccagacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcggctgtggtggtgccttctggacaggagcagagatacacctgccatgtgcagcatgagggtttgcccaagcccctcaccctgagatgggagccgggtggaggcggatctggcggcggaggatctggaggaggtggatctgggggcggtggtagtggcctgaatgacatctttgaagcccagaaaatcgaatggcacgaaatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctccaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagacaatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagggtggaggtggttctggaggaggcggttcgagcagccagccgaccattccgattgtgggcattattgcgggcctggtgctgtttggcgcggtgattaccggcgcggtggtggcggcggtgatgtggcgtcgtaaaagcagcgatcgtaaagattataaagatgatgatgataaataatag(SEQ ID NO：1)，
其中(n)x是8个、9个、10个、11个或12个编码氨基酸的核苷酸序列，x分别是24个、27个、30个、33个或36个核苷酸。在实施方案中，所述24个、27个、30个、33个或36个核苷酸分别由8个、9个、10个、11个或12个密码子或等同物组成。
在实施方案中，对于慢病毒递送，所述重组核酸多达～3000nt。在实施方案中，对于质粒递送所述重组核酸多达～10,000nt。
在实施方案中，所述核酸编码以下序列，或所述表达产物包含以下序列：
MSRSVALAVLALLSLSGLEAX(n)GGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGLNDIFEAQKIEWHEMVSKGHEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKGGGGSGGGGSSSQPTIPIVGIIAGLVLFGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKDYKDDDK(SEQ ID NO：2)，其中X(n)是8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽序列。(n)可以是8个、9个、10个、11个或12个或其范围或子范围之任一。
前导序列包括可被哺乳动物细胞加工的任何信号肽。此类序列在本领域中是公知的。
可用于本发明的荧光蛋白包括GFP、RFP、YFP、mFRUIT。可使用任何核酸可编码的荧光蛋白例如mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed-单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、GFP。
示例性非限制性B2M前导序列是MSRSVALAVLALLSLSGLEA(SEQ ID NO：3)。
示例性非限制性B2M序列是
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID NO：4)。
示例性非限制性MHC重链序列是
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ ID NO：5)。
示例性非限制性免疫球蛋白Fc结构域序列是
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：6)。
示例性非限制性病毒包装(VP)序列(信号)是NRVRQGYS(SEQ ID NO：7)。在一个实施方案中，所述病毒包装序列的长度是8至20个氨基酸。在一个实施方案中，所述病毒包装序列的长度是8个氨基酸。
在一个实施方案中，所述非裂解接头的长度各自独立地是5至40个氨基酸。在一个实施方案中，所述非裂解接头的长度各自独立地是5至30个氨基酸。在一个实施方案中，所述非裂解接头的长度各自独立地是5至20个氨基酸。在一个实施方案中，所述非裂解接头的长度各自是20个氨基酸。
如本文所用，具有“相同的序列”意指与参照的序列具有95％或更大的序列相似性而不阻止所述参照序列的已建立的或已知的功能。在实施方案中，具有相同的序列意指具有与所述参照的序列完全相同的序列。
除非在本文中另有所指或根据上下文另外明确地显示出矛盾，否则本文所述的各种要素的所有组合在本发明的范围内。
根据以下实验详述，本发明将得到更好地理解。然而，本领域技术人员将容易地理解，所论述的具体方法和结果只是本发明的说明性示例，这在此后的权利要求中将进行更全面地描述。
实验详述
本文中描述了用于优选使用高度灵敏的和大规模并行的下一代测序作为读出，从患者样品呈递候选T细胞表位(“epiCELL”)以进行高通量T细胞表位作图(免疫监测)的新型哺乳动物细胞展示平台。
所述方法以使用新型膜锚定的单链肽MHC(sc-pMHC)哺乳动物细胞展示平台来允许大量T细胞表位在例如HEK细胞的表面上的I类MHC的背景中呈递为中心。用来自例如健康的、被感染的、治愈的和经免疫的患者的T细胞攻击这些表达库，以例如在非限定性实例A-C类病原体中鉴定与疾病、治疗和中和直接相关的那些表位。可将从病原体鉴定的免疫显性标签组装成用作快速便携式工具(直接从全血进行检测)的病原体表位集合。
优选策略利用在哺乳动物细胞的表面上展示的并用患者/组群特异性外周T细胞攻击的sc-pMHC构建体的文库，来直接鉴定疾病相关表位。如图1中所示，可将sc-pMHC载体的文库混合，并一同转染(或在例如慢病毒库的情况下转导)进入悬浮-适应细胞诸如HEK293细胞，从而产生epiCELL库。
实施例1
将epiCELL库与患者来源的外周T细胞(使用标准方[26]从全血样品纯化的)混合，并使其通过TCR与它们的同源sc-pMHC配体(由所述epiCELL库表达的)的特异性接合来形成缀合物。随后通过例如用于多个患者样品的并行处理的磁力分离，或用于单个样品的更常规的流式细胞分选法回收缀合物。通过PCR(使用通用引物)扩增来自所富集的库成员的序列，并将其经历下一代深度测序以鉴定通过捕获方法富集的表位。这些富集的表位直接鉴定免疫显性T细胞表位。如果需要，可通过体外方法(例如，细胞因子ELISpot、FACS)[27]进行进一步的随后确认。所述策略允许从单个患者样品快速鉴定所有疾病相关免疫显性表位。值得注意的是，可通过使用编入索引的衔接子例如
Figure BDA0001109207000000461
使该方法复用，以大大增加通量和降低成本(例如，可在NGS流动池的单个泳道上运行多个患者样品)。
构建体：膜锚定的I类sc-pMHC分子的一个总体设计示于图2中。简言之，该构建体利用天然人B2M前导序列(后面紧接候选表位(标记为肽))来使得能够进行质膜定位。一旦在ER中，所述前导序列就被完全除去，并使得所述肽能够呈现在MHC结合口袋中。通过接头区(对于每一个接头，4个重复的GGGGS(SEQ ID NO:8))将该肽进一步偶联于天然B2M分子、人HLA-A02:01等位基因和表面暴露的mCherry表达代理。整个构建体通过天然I类重链跨膜结构域(HC TM)保持在膜中。抗原肽与MHC I类分子的共价键联被良好地建立，并且在体外和体内一直是高度有效的[28-30]。该策略消除了与不期望的T细胞结合/激活相关的困难，所述不期望的T细胞结合/激活产生自非共价肽复合物，尤其是为弱结合的那些复合物的交换(交叉呈递)。另外，该模拟化设计易于进行高通量分子生物学操作(例如，克隆/测序)以产生(和随后查询)编码在给定的MHC等位基因的背景内的不同肽序列的大文库。该平台利用单链构建的“通用”性质。在本范例中，文库之中维一的差异是编码9聚体本身(例如，所述表位)的27个核苷酸的序列。该独特的序列可用“通用引物”(在图2中标记为正向/反向)进行扩增，以及通过深度测序和在T细胞攻击后随后的翻译来容易地鉴定[31-34]。值得注意的是，已从天然B2M核苷酸序列修改掉形成用于“通用”引物退火的共有区的核苷酸序列，以避免来自内源B2M库(即来自HEK细胞的B2M)的本底扩增。
MHC对照。我们组内的初始可行性研究利用连接于5个独立的病毒病原体的5个已知的致病HLA-A02限制型表位(巨细胞病毒pp65蛋白残基495-504[此后称为CMV]、流感基质蛋白58-66[FLU]、EB病毒BMLF1 259-267[EBV]、人类嗜T淋巴细胞病毒Tax 11-19[HTLV]和HIV gag p 17 76-84[HIV])。通过携带具有通过天然人I类重链跨膜结构域锚定至膜的表面mCherry表达代理的sc-pMHC构建体(如图2中说明的)的病毒的慢病毒转导产生HEK293稳定细胞系。通过监测mCherry代理表达和抗-mCherry表面表达(图3中举例说明了其中的4个)的荧光激活细胞分选(FACS)分析确认我们的构建体的表面表达，所述表面表达支持所述构建体表达并且被正确地靶向质膜。值得注意的是，随后添加所述EBV对照肽以产生该图，然而EBV的表面表达谱反映了对于另外4个对照观察到的那些表面表达谱(数据未显示)。
在该系统中，mCherry的表面呈递是所述MHC构建体的正确折叠的指标，因为未折叠的蛋白质更常见地被捕获/保留在ER/高尔基体中[35]，然而，对MHC折叠的直接评估当然是想要的。由于HEK293细胞天然地表达HLA和B2M分子，因此针对表面B2M或HLA直接染色以监测正确的折叠具有挑战性。为了确保单链膜锚定的MHC设计导致正确折叠的材料，将靶向天然人B2M(pGIPZ克隆VA282[目录号RHS4430-101098345]，由Einstein shRNA核心设施提供的敲低细胞)的5’非翻译区(UTR)的shRNA发夹用于下调HEK细胞内的B2M和表面MHC的内源性表达(B2M被选择用于下调，因为无论MHC同种型如何，其是MHC折叠/定位所必需的)。该实现不含5'UTR，以促进整合的构建体持续表达。如图4中所示，使用shRNA策略有效地下调大于95％的天然HLA，如通过利用构象依赖性抗I类MHC抗体(所使用的mAb W6/32要求MHC和B2M均被正确折叠来进行结合[36]。值得注意的是，所述前导肽的正确加工和表位呈递是MHC稳定性/折叠的要求)的表面染色所监测的。在用来自文库(CMV)的代表性构建体转导后，MHC表面表达得以恢复。总之，这表明所述构建体被正确定位(如通过抗-mCherry监测的)以及被良好折叠(如通过抗-HLA监测的，图4)。
TCR对照。鉴于悬浮适应HEK细胞系在本实验室内的广泛使用，HEK细胞被天然地选择作为用于产生对照TCR品系的表达宿主。HEK 293细胞不内源性地表达TCR基因，它们也不能表达无修饰的TCR构建体(如通过我们自已[数据未显示]和其他人[37]观察到的)。所述TCR是作为与不变的CD3链分子的复合物的部分表达的二硫键连接的膜锚定的异二聚体(α/β链)。所述CD3链，与TCR一起，形成称为T细胞受体复合物的物质。完整复合物是正确表达和质膜定位所需的。为了允许对照TCR表达，使用慢病毒共转导技术，其中一个慢病毒构建体具有通过各种病毒2A“自裂解”肽[37]连接的完整CD3基因盒(图5，顶部)，并且第二病毒构建体具有通过单个病毒P2A肽连接(以允许化学计量表达)的TCRα和β链，因为P2A肽在哺乳动物细胞中显示最高的“裂解”效率[2]。所述mCerulean(蓝色)表达代理在β链跨膜区段之后(图5，底部分)。原理论证研究使用上述HLA分子的5个同源TCR(TCR RA14[结合CMV肽]、JM22[FLU]、AS01[EBV]、A06[HTLV]和1803[HIV])。通过抗-TCR以及抗-CD3抗体染色(数据未显示)确认所述构建体的表面表达，并且通过同源MHC五聚体染色确认活性T细胞复合物形成(图6，五聚体购自ProImmune)。将未转导的细胞用作阴性对照。
epiCELL筛选平台。虽然常规基于MHC四聚体(或更近以来五聚体)的呈递提供了相对于单一蛋白质的增强的亲合力，但预期所述蛋白质在真核细胞质膜上的表达为检测较弱的pMHC:TCR相互作用提供了更大的抗原密度，显著更高的亲合力和扩展的动力学范围。单独地表达所述5个TCR以互补所述5个同源sc-pMHC epiCELLS。细胞质mCherry(标记为CYTO)和表面表达的mCherry(无MHC，标记为STALK)用作阴性对照。单独或混合的群体的流式细胞术分析明确地表明，只有当表达同源MHC:TCR对的细胞都存在时，代表特定细胞间相互作用的信号才显著增强(多至100倍，A06:HTLV相互作用)(图7)。随后将两个epiCELL(CMV和FLU)汇集，用单独的具有TCR的HEK细胞(仅JM22)进行攻击，随后基于形成的缀合物进行分选。提取来自每一个库的基因组DNA，使用靶向围绕所述表位的侧翼区的通用引物，将其经历～30个周期的PCR(图2，上)。所得的PCR条带示于图8(顶部)中，将这些扩增子用于文库制备(例如，复用的TruSeq索引的衔接子的添加)，随后进行(illumina MiSeq)下一代测序(NGS)。在Einstein Epigenomics核心设施进行文库制备和测序。分析来自NGS运行的所得的FASTQ文件，并容易地鉴定表位(图8，底部)。对于每一个表位，计算观察到的表位序列的绝对值，将其标准化为通过我们的QC滤波器的所有观察到的NGS读数的百分比。值得注意的是，CMV和FLU被选择用于初始筛选，因为这些是实验室中首先验证的构建体。
在另外的实例中，可观察针对代表EBV BMLF1蛋白的所有重叠9聚体(～400个epiCELLS的库)的穷尽筛选，以鉴定来自EBV感染的患者的免疫显性标签(选择该靶，因为～95％的>35岁的成人维持EBV反应性外周T细胞)。
可将epiCELL平台室用于确定与人疾病相关的生物学相关T细胞表位的完整组装。可将用于表位作图的基于下一代测序(NGS)的epiCELL平台与较大的“组合”文库组合以允许至针对选择的TCR的模拟表位筛选的扩展，以鉴定具有改变的亲和力/动力学的粘合剂，和进一步扩展至以接近全面覆盖的灵敏度同时观测单个患者样品内的所有免疫反应性。肽抗原表位(和模拟表位)的鉴定是鉴定、分离和调节参与保护性和病理性免疫应答的I类MHC限制的T细胞中的重要的第一步骤。值得注意的是，所述方法可被容易地扩展/改进成II类(CD4+T细胞)反应性的类似穷尽观测。
实施例2
在本实验中，单独地转导用于所有5个具有MHC的epiCELLS的慢病毒(CMV、FLU、EBV、HIV、HTLV)，等比例地混合细胞，单独地用4个具有同源TCR的细胞(RA14、JM22、AS01、A06)进行攻击，并基于形成的缀合物进行分选。提取来自每一个库的基因组DNA，使用靶向围绕所述表位的侧翼区的通用引物将其经历～30个周期的PCR。所得的PCR条带示于图9(顶部)中，将这些扩增子用于文库制备(例如，复用的
Figure BDA0001109207000000501
索引的衔接子的添加)，随后进行(Illumina MiSeq)下一代测序(NGS)。在Albert Einstein College of Medicine表观基因组学核心设施进行文库制备和测序。分析来自NGS运行的所得的FASTQ文件，并容易地鉴定表位(图9，底部)。于预先分选的群体内鉴定的表位(文库)在16-23％的范围内(数据未显示)。对于每一个TCR攻击的数据集组，计数观察到的表位序列的绝对值，并将其标准化为通过QC滤波器的所有观察到的NGS读数的百分比，以及使用获自预分选的库的平均值和标准偏差参数，将其用于计算Z-评分。这些结果突出显示了所述epiCELL平台的效用，并且通过甚至使用未优化的结合/洗涤方案，显示了所述筛选的稳健性。
实施例3
epiCELL的效用可被扩展来不仅包括单链构建体(具有和不具有通过Fc融合的双价呈递)，而且还包括断裂构建体(synTacs)，以允许在epiCELL的背景内局部呈递多个蛋白质或肽片段。此外，含有来源于epiCELL库的片段的小的质膜(例如，微囊泡、外来体、病毒样颗粒[VLP]和逆转录病毒[例如，慢病毒等])的使用已允许用于筛选的反应体积大大减小(这些基于病毒颗粒的方法在本文中有时称为“viratope”)。用来自健康的、感染的、治愈的和经免疫的患者的T细胞攻击这些表达库(epiCELLS或viratope)，以鉴定与疾病、疾病的诊断、治疗、中和以及疾病进展的监测和治疗反应直接相关的那些表位。
示例性变体继续利用与后面紧接候选肽表位的天然人B2M前导序列相同的序列，所述肽表位通过接头L1共价连接于所述B2M分子(图10A中举例说明的)。然而，所述3个新的构建体相异在于它们的总体构造和共价组织。第一变体(参见图10A.(1))与常规基于epiCELL的呈递类似，但在C端最末端上添加了病毒包装信号(例如，GP41包膜蛋白残基706-713等，标记为VP)。VP序列的存在在常规基于epiCELL的筛选的背景中没有影响，但当从epiCELL库出芽时确实允许包装入病毒样颗粒(VLP)或逆转录病毒(例如，慢病毒)。为了增加表面表达的构建体的局部效价，使用基于Fc-融合物的构建体(图10A.(2)，例如人IgGlFc、鼠IgG2a Fc等)，再次地以VP序列结尾以允许病毒包装。由于已从该变体除去表面表达的代理(即，mCherry)，因此用于常规抗体的表位(例如，FLAG、MYC等)已被置于接头L4中来允许通过抗体染色检测质膜定位。这些目前描述的构建体(A.1和A.2)已利用单链构建，这样在为了筛选目的通过替代性蛋白质连接扩展系统的能力方面受到限制。为了通过包含额外的蛋白质或肽连接增强epiCELL筛选平台的模块性/灵活性，利用也在本实验室中开发的基于synTac的表达构建体。简言之，synTac的基本策略将MHC构建体断裂成各自的重链和轻链，肽和蛋白质融合于各种末端(图10A.(3))并且示意性示于图(10B)中。该构建导致所述肽表位至轻链(B2M)的N末端的共价融合，随后将所述轻链的羧基末端延伸至我们的MOD效应分子，图10B。在该情形下，将重链(HLA-分子)融合于Fc区。所有组分在真核细胞(例如，HEK、CHO)内在产生过程中缔合并自我组装。值得注意的是，所述两条链通过二硫键(以红线显示的)共价系连。该案例中的MOD可以是进行筛选所需的任何蛋白质、肽或其它化学实体。实例是用于第二染色的抗体表位(FLAG、MYC等)、用于直接荧光检测的荧光蛋白(GFP、mFruit等)、核酸结合蛋白或共调节的蛋白。所有构建体通过天然I类重链跨膜结构域(TM，尽管这可以是任何人、鼠或其它动物的TM结构域)被定位至质膜。将通用引物用于在T细胞攻击后扩增在目前的构建体中发现的独特的27个核苷酸的序列(9聚体肽)，以直接鉴定疾病相关表位。然而，具有从(但不限于)5个氨基酸变化至20个氨基酸的长度的肽是候选表位。
扩展用于慢病毒展示的epiCELL筛选平台：Viratope。在完全组合筛选的背景中(例如，当所述肽序列被完全随机化时)，当使用常规epiCELL时，确保完全文库覆盖(即，109个表位)的体积可从10毫升变化至100毫升。该要求主要因用于epiCELL展示的HEK细胞的相对大的尺寸，加上在高浓度下(例如，在大于1000万个/ml的浓度下)的差的细胞活力而导致的。通过利用包装质粒(称为辅助质粒)连同包膜蛋白(VSV-G等)的转染从HEK细胞常规地产生逆转录病毒(例如，慢病毒)，所述包装质粒含有特定的病毒编码的基因。值得注意的是，从这些细胞出芽的逆转录病毒颗粒在极端浓度(大于10亿/mL)下是稳定的。为了利用减小的反应体积和增强的稳定性，我们在我们的表面展示的MHC构建体内利用病毒包装信号(VP)以在利用单独的辅助质粒(无包膜质粒的添加)转染epiCELL库后包装进病毒颗粒中，从而有效地利用肽MHC假型化出芽的慢病毒。具体地，用由连接于β-2微球蛋白(B2M)的肽表位、HLA-A*0201和人IgG1Fc组成的单链构建体(图10A.(2))替代第三代慢病毒转染系统的包膜组分。所述构建体还含有用于通过第二抗体检测的FLAG表位标签(置于L4接头区中)。在HLA-A*0201的背景中呈递的肽表位是来自人巨细胞病毒(CMV)的NLVPMVATV(SEQ ID NO:9)肽表位或来自流感病毒(FLU)的GILGFVFTL(SEQ ID NO:10)肽表位。通过超速离心将收获的慢病毒浓缩100倍，并于4℃下贮存。提取来自每一个viratope库的基因组RNA(与DNA相反)并将其经历一轮逆转录(RT)，随后使用靶向围绕所述表位的侧翼区的通用引物进行～30轮PCR。所得的PCR条带示于图11A中。值得注意的是，只有在初始RT步骤存在的情况下(泳道1)才观察到PCR条带，当省略逆转录酶时(泳道2)所述PCR条带不存在，这表明有复制能力的(例如，加载RNA的)逆转录病毒的产生。将这些扩增子用于文库制备(例如，复用的TruSeq索引的衔接子的添加)，随后进行(illumina MiSeq)下一代测序(NGS)以确保所述方法与epiCELL筛选的相容性。在Einstein Epigenomics核心设施进行文库制备和测序。分析来自NGS运行的所得FASTQ文件，并容易地鉴定表位(图11B)。与先前的epiCELL结合实验类似，随后将viratope用于先前用特异性的或无关的T细胞受体(TCR)转染转染的HEK细胞。从细胞洗掉过量的viratope颗粒，通过缀合有PE的抗-FLAG抗体检测剩余的细胞结合的慢病毒。利用同源的但非无关的表位假型化的Viratope以可与利用特异性肽-MHC五聚体的染色相比较的方式结合于它们各自的表达TCR的HEK细胞(图12)，从而显示来源于epiCELL库的viratope颗粒用于表位筛选的特异性和一般效用。
可将用于表位作图的目前基于下一代测序(NGS)的epiCELL/viratope平台与较大的“组合”文库组合以允许至针对选择的TCR的模拟表位筛选的扩展，以鉴定具有改变的亲和力/动力学的粘合剂，和进一步扩展至以接近全面覆盖的灵敏度同时观测单个患者样品内的所有免疫反应性。肽抗原表位(和模拟表位)的鉴定在鉴定、分离和调节参与保护性和病理性免疫应答的I类MHC限制的T细胞中是重要的。上述方法可被容易地扩展成II类(CD4+T细胞)反应性的类似观测。
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Claims (14)

1.一种(i)慢病毒样颗粒或(ii)慢病毒，所述慢病毒样颗粒或慢病毒经由与所述慢病毒样颗粒或慢病毒缔合的哺乳动物细胞膜部分和表达产物的哺乳动物跨膜结构域与表达产物物理缔合，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
5至20个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
I类主要组织相容性复合物(MHC)重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
所述哺乳动物跨膜结构域，邻接有
包括GP41包膜蛋白残基706-713的慢病毒包装序列。
2.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒或慢病毒，其中所述哺乳动物跨膜结构域是I类MHC重链跨膜结构域。
3.多个根据权利要求1或2所述的分离的慢病毒或分离的慢病毒样颗粒。
4.根据权利要求3所述的多个分离的慢病毒或分离的慢病毒样颗粒，其中所述多个分离的慢病毒或分离的慢病毒样颗粒包含至少100个不同编码的5至20个氨基酸的肽。
5.一种表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应哺乳动物细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中表达产物按N末端至C末端的顺序包含：
5至20个氨基酸的肽，邻接有
第一接头肽序列，邻接有
β2微球蛋白序列，邻接有
第二接头肽序列，邻接有
I类主要组织相容性复合物重链序列，邻接有
第三接头肽序列，邻接有
荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有
第四接头肽序列，邻接有
哺乳动物跨膜结构域，邻接有
包括GP41包膜蛋白残基706-713的慢病毒包装序列；
其中所述膜结合部分包含所述表达产物。
6.根据权利要求5所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述膜结合部分为微囊泡或外来体。
7.根据权利要求5至6中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述细胞表达包含所述免疫球蛋白Fc结构域的序列的表达产物。
8.根据权利要求5至6中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述细胞表达包含所述荧光蛋白的表达产物。
9.根据前述权利要求5至6中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。
10.多个根据权利要求5至6中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或膜结合部分包括至少两个不同编码的5至20个氨基酸的肽，其中一个或多个所述编码的肽被呈递在所述细胞的细胞外表面上。
11.根据权利要求10所述的多个分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞或膜结合部分包括至少100个不同编码的5至20个氨基酸的肽。
12.一种鉴定T细胞表位的非诊断性方法，所述方法包括：
将T细胞与包含至少两个细胞的多个根据权利要求5至11中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分接触，或者与跟此类细胞的膜部分缔合的根据权利要求1至3中任一项所述的慢病毒样颗粒或慢病毒接触；
回收已与悬浮-适应细胞或膜结合部分形成缀合物的T细胞；
从所述悬浮-适应细胞回收DNA；
对所述回收的DNA进行测序；以及
鉴定在所述DNA中编码的所述5至20个氨基酸的肽，
以从而鉴定T细胞表位。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述T细胞包含获自受试者的外周T细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
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