CN1791675A - 表达病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合体的病毒载体 - Google Patents
表达病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合体的病毒载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1791675A CN1791675A CNA2004800137297A CN200480013729A CN1791675A CN 1791675 A CN1791675 A CN 1791675A CN A2004800137297 A CNA2004800137297 A CN A2004800137297A CN 200480013729 A CN200480013729 A CN 200480013729A CN 1791675 A CN1791675 A CN 1791675A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- nucleic acid
- vlp
- structural domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6075—Viral proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10023—Virus like particles [VLP]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了病毒样颗粒(VLP),其包含i)含有目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物,和ii)禽类嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。通过将一个或多个POIs导入L多肽,所述POI将与L一起转运至主要由S多肽构成的颗粒结构中。本发明进一步提供了用于生产重组病毒样颗粒的方法。
Description
发明背景
发明领域
本发明通常涉及用于递送目的多肽至受试者的病毒样颗粒(VLPs)和编码其的核酸分子。特别地,本发明利用禽类嗜肝DNA病毒颗粒的特性产生稳定的重组VLPs,VLPs用于向受者递送目的多肽。所述目的多肽可包含一种或多种能引起免疫应答的抗原。包含所述目的多肽的VLPs用于将抗原递送至受试者的免疫系统或用于抗原决定部位呈递以在体外测定中检测抗体。本发明扩展至用于产生、生产、递送和监控本发明VLPs的质粒、细胞、试剂盒和方法。
现有技术描述
在本说明书中由著者参考的文献的详细目录汇集于说明书的结束部分。
此处对于现有技术的引用(包括任何一个或多个现有技术文献)并不被认为承认或暗示所述现有技术是本领域状态的一部分。
嗜肝DNA病毒是有包膜DNA病毒家族。哺乳动物嗜肝DNA病毒例如B型肝炎病毒的装配非常复杂,并且成熟的病毒体是通过预先形成的细胞质核心颗粒与在宿主内质网(ER)膜上预先装配的表面蛋白的相互作用形成的。在与包膜蛋白的合适部分相互作用后,核壳与超过1000倍空的亚病毒颗(SVPs)一起出芽进入ER的腔中并在中间体前高尔基体区室中完成装配(由Nassal,M.的综述,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,214:297-337,1996)。
在许多研究中,缺少核壳的病毒样颗粒(VLPs)已被证明是很有前景的候选疫苗,因为其:(i)是非感染性的并因此对生产和应用是安全的,(ii)因为其提供抗原决定部位呈递的必需空间结构因此比亚单位疫苗更具免疫原性,和(iii)引起体液、细胞介导的和重要的粘膜免疫(Krueger等人,Biol.Chem.380:275-276,1999)。
近来成功的VLP疫苗的例子(目前正在临床实验中)是重组的乳头瘤病毒主要衣壳蛋白(L1)VLP,所述衣壳蛋白通过诱导强中和抗体应答预防感染(Frazer,Virus Research,89:271-274,2002)。
B型肝炎病毒(HBV)亚病毒颗粒(HBsAg-S)已被看作产生重组VLPs的候选者。几个研究已考察了适合插入外源抗原决定部位的结构域(Bruss等人,EMBO J.13:2273-2279,1994.,1994;Delpeyroux等人,J.Mol.Biol.195:343-350,1987),所述结构域包括preS结构域的N端融合(Prange等人,J.Gen.Virol.76:2131-2140,1995)。
最近,携带E2包膜蛋白C型肝炎病毒(HCB)高变区1的小的35个氨基酸的插入物的颗粒已成功地引起了抗体反应(Netter等人,J.Virol.75:2130-2141,2001),所述插入物插入至位于第二亲水环上的暴露的“a”决定簇。特别地,当颗粒在哺乳动物细胞体统中产生时存在着颗粒稳定性和所述HBsAg的‘a’决定簇的免疫反应性丢失所能容忍的插入片段大小的限制(Prange等,1995,同上述;Bruss等人,J.Virol.65:3813-3820,1991)。
近来通过在酵母中表达登革热病毒/HBsAg融合体已经克服了具有巨大融合物的颗粒的不稳定性(Bisht等人,J.Biotechnology.99:97-110,2002)。
然而,在所有这些情况下,为了装配嵌合颗粒,重组S蛋白必须与野生型S亚单位一起装配。这些扩展的S链给包入至由所述HBsAg(包括L)形成的紧密的包膜网络中带来困难,因此它们的数目是受限的,并且对外源抗原决定部位产生的免疫应答较低。
因此,需要改进的有效地整合目的多肽的VLPs。
发明概述
在整个本发明书和以下的权利要求中,除非上下文有另外要求,单词“包括”和变体“包含”及“含有”将被理解为表示包括所述的实体或步骤或成组的实体或步骤,但不排除任何其它的实体或步骤或成组的实体或步骤。
通过序列标识号(SEQ ID NO:)表示核苷酸和氨基酸序列。SEQID Nos:在数字上对应序列标志<400>1、<400>2等。表1提供了序列标志概述。在权利要求之后提供了序列表。
鸭B型肝炎病毒(DHBV)和其它禽类嗜肝DNA病毒的包膜蛋白由两种蛋白即大包膜蛋白(L)和小包膜蛋白(S)构成,包膜蛋白通过来自单个preS/S开放阅读框的不同框内翻译起始位点产生。L和S多肽具有共同的C端跨膜区或S结构域,而L具有大约160个氨基酸的包含受体结合区域的N端延伸(或preS结构域)。所述S多肽是主要的病毒包膜组成部分,其决定包膜的曲率并且甚至在核壳不存在的情况下可驱动颗粒分泌。相反地L多肽只能在与S共装配时被转运出去。
DHBV包膜蛋白的装配和其涉及进入宿主细胞与由嗜肝DNA病毒采用的独特的拓扑学转换紧密相关,其中L蛋白的大N端preS结构域是在翻译后被转运跨越ER膜的。该过程是受调控的,这样通常只有大约50%的分子具有转运的N末端并且成熟的颗粒含有混合的内部/外部拓扑结构,包括部分转运的或中间体形式。
本发明部分根据下列惊人的发现:DHBV的L多肽的大部分区域对于L转运和颗粒装配是无关紧要的,包括在S结构中与颗粒装配所必需的S多肽的区域具有相同氨基酸序列的区域。因此,L多肽在其颗粒结合上比S多肽更加灵活并因此可进行更广泛的操作。
因此本发明提供了主要包含小包膜(S)多肽或其功能衍生物或同源物的病毒样颗粒(VLPs)。此外,并且根据本发明,其包含含有目的多肽(POI)和至少大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽。因为L多肽在VLP装配期间不被排除并且因为其可在不会显著地影响颗粒稳定性的情况下被广泛地应用于运载异源多肽,本发明的VLP在递送目的多肽至受试者方面尤其有用。此外,由于抗原性POI的抗原决定部位被有效地展现于VLP中,所述VLPs可用于检测抗体的测定中。
本发明对DHBV进行特别的描述,但是本发明也扩展至来自其它具有L和S包膜多肽蛋白的病毒的L和S多肽,其中L不会从颗粒装配中被排除。例如,也涉及来自其它禽类嗜肝DNA病毒的L和S多肽,包括例如但不限于苍鹭(HHBV)、雪雁(SGHBV)和与DHBV表现相似亚颗粒形态学即具有L和S包膜蛋白的嗜肝DNA病毒。在所有嗜肝DNA病毒中L和S多肽的S结构域高度保守,例如在TM1和TM2之间的区域表现出高达70%的氨基酸相似性。
本发明提供了病毒样颗粒(VLP),其包含i)包含目的多肽和至少禽类嗜肝DNA病毒的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的多肽,和ii)禽类嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
本发明进一步提供病毒样颗粒(VLP),其包括i)包含目的多肽(POI)和至少DHBV的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽,和ii)DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
通过将一个或多个POIs引入L多肽,所述POI与L一起被转运入主要由S多肽构成的颗粒结构中。
尽管提供了几个L多肽颗粒结合部分的例子,但根据此处提供的教导,产生更小或更大的L多肽部分和确定其与目的异源(或内源)蛋白一起是否能在VLP内结合成颗粒在本领域普通技术人员的技术范围之内。因此,本发明绝不受限于作为示例的构建体。
本发明的病毒样颗粒用于疫苗组合物以提高有效的免疫应答。在特定的实施方案中,所述病毒样颗粒具有有利地被抗原呈递细胞例如树突细胞吸收的合适大小。例如,DHBV VLPs显著大于哺乳动物的HBVVLPs。
使用包含编码与S多肽分开地或一起的重组L多肽的核酸分子的表达质粒制备本发明的重组VLPs。表达质粒以便利地适合于在酵母、杆状病毒或禽类或哺乳动物的表达系统中表达的形式存在。包含编码本发明重组L多肽的的核酸分子的质粒也可用于将核酸构建体直接递送至受试者的细胞中。
可选择地,提供试剂盒以帮助本发明融合蛋白的重组生产。
本发明进一步提供了用于产生重组病毒样颗粒和包含来自禽类嗜肝DNA病毒或其它非L排除病毒的L和S多肽的病毒样颗粒的组合物以用作疫苗或抗原资源的方法,其中所述L多肽包含一个或多个来源于一个或多个异源来源的目的抗原。
附图概述
图1是用于产生pCDL-E2.465的克隆策略的概述。
图2A是DHBV的大(L)和小(S)包膜蛋白的概述。L和S由来自单个开放阅读框的差异翻译产生,这样L蛋白由161个氨基酸的preS结构域和167个氨基酸的C端S结构域构成,其包含S蛋白。通过方框表示三个跨膜结构域(TM)。
图2B表示HCV E2胞外域(从氨基酸384至465)的82个氨基酸部分插入L的pres结构域的位置,产生E2.465/L嵌合包膜蛋白。
图2C提供显示所述E2.465/L嵌合体被运送穿过ER的Western印迹的结果。用于蛋白酶保护分析的ER微粒体制备自用pCDL-E2.465和pCI-S(小S蛋白表达质粒)转染的LMH细胞。如上面各泳道标示的,在去垢剂NP-40存在或不存在的情况下用胰蛋白酶降解所述微粒体样品或不作处理。通过SDS-PAGE和用可同时检测E2.465/L和S蛋白的单克隆抗S抗体进行Western印迹杂交分析E2.465/L链的蛋白酶保护。E2.465/L免受胰蛋白酶降解(中间的泳道)表示转运至ER腔中。
图2D提供了显示E2.465/L嵌合体被装配成颗粒的Western印迹的结果。通过冷冻-解冻细胞3次、离心以获取胞质部分并通过从20%蔗糖至70%蔗糖的梯度在38,000r.p.m(SW41 rotor Beckman)下沉降颗粒来从用pCDL-E2.465和pCI-S转染的禽类肝细胞瘤(LMH)细胞中分离细胞内颗粒。在SDS-PAGE和通过Western印迹杂交分析包膜蛋白之前用甲酵沉淀20-70%蔗糖界面上的颗粒级分。
图2E模仿L蛋白在ER(描述为微粒体囊)上的膜定位,表示翻译后转运至赋予E2.465/L杂合链免受胰蛋白酶降解的保护作用的微粒体腔内。在颗粒装配过程中,被装配的包膜蛋白通过ER膜的内叶面从ER出芽至ER腔内。颗粒通过细胞囊泡运出途径从细胞运出,使得可以分离来自细胞质(如D中显示)和细胞外区室的颗粒。如颗粒的草图所表示的,转运至ER腔的包膜蛋白结构域最终被暴露于所述装配颗粒的外侧。
图3是表示DHBV的基因组核苷酸序列的说明。
图4提供DHBV的L和S多肽的氨基酸序列。起始位点用下划线标记而终止位点以星号(*)标记。
图5A是DHBV L和DHBV S蛋白的概述。
图5B至5H是DHBV L嵌合体的概述。用方框标记的TM1-3表示跨膜结构域。沿着DHBV L长度方向的数字代表相对于DHBV L序列的氨基酸位置。V表示TM1内的缺失。
图6A和6B是表示用pSigLΔTM1-E2.661(A)或pCDLΔTM1-MSP2(B)转染的LMH细胞的膜部分的Western印迹结果的概述。MV标记(40-120kDa)用于表示嵌合体L蛋白的大小。
图7A和7B是表示来自蔗糖分级梯度级分的Western印迹的概述,所述Western印迹显示D1/S(A)和在酵母中产生的嵌合L VLPs、DLΔTM1-E2.465/S(B)和DLΔTM1-HpreS(C)具有相同的颗粒密度。将产生于酵母的通过20%蔗糖至70%蔗糖梯度的VLPs进一步在20-70%蔗糖分级梯度中在38,000rpm下进行沉降5小时。将从梯度中(号码2-11)收集的级分在SDS-PAGE上跑胶并用抗DHBV S结构域的单克隆抗体进行Western印迹杂交。
图8是表示DHBV L蛋白的Western印迹的概述,其中用经酵母产生的DL/S VLPs免疫过的一只大鼠的顺序释放的血检测所述蛋白。Pre表示免疫前所取的血,并且编号1-5表示在第3,6,9和13周获得的大鼠血清。
表1
SEQ ID NO. | 序列 |
SEQ ID NO:1 | 用于产生L融合蛋白的引物 |
SEQ ID NO:2 | 用于产生L融合蛋白的引物 |
SEQ ID NO:3 | 用于产生L融合蛋白的引物 |
SEQ ID NO:4 | 用于产生L融合蛋白的引物 |
SEQ ID NO:5 | DHBV的全基因组核苷酸序列 |
SEQ ID NO:6 | 编码DHBV L多肽的核苷酸序列 |
SEQ ID NO:7 | DHBV L多肽的氨基酸序列 |
SEQ ID NO:8 | 编码DHBV L多肽的S结构域的核苷酸序列 |
SEQ ID NO:9 | DHBV L多肽的S结构域的氨基酸序列 |
SEQ ID NO:10 | 编码DHBV L多肽的preS结构域的核苷酸序列 |
SEQ ID NO:11 | DHBV L多肽的preS结构域的氨基酸序列 |
SEQ ID NO:12 | 编码DHBV S多肽的核苷酸序列 |
SEQ ID NO:13 | DHBV S多肽的氨基酸序列 |
发明详述
本发明是部分基于下列发现:DHBV的L多肽可被显著地修饰但仍保持在病毒样颗粒装配的过程中与DHBV的S多肽结合的能力。
此处建议使用L多肽或其功能性衍生物或同源物递送目的多肽或肽至受试者。特别地,建议使用L多肽递送作为病毒样颗粒部分的目的抗原至受试者的免疫系统。
在广泛的实施方案中本发明提供了包含融合(嵌合)多肽的病毒样颗粒(VLP),所述融合多肽包含目的多肽(POI)和大包膜(L)多肽的颗粒结合部分。
所述病毒样颗粒主要由小包膜(S)多肽构成。
因此,本发明进一步提供了VLP,所述VLP包含i)含有目的多肽(POI)和至少大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽,和ii)禽类嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
更特别地,本发明进一步提供了VLP,其包括i)包含目的多肽(POI)和至少DHBV的大包膜(L)多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽,和ii)DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
优选地至少部分所述POI暴露于所述病毒样颗粒的表面。
术语“病毒样颗粒”在其最广义上用于表示颗粒或三维蛋白质结构,其象有包膜病毒的亚病毒颗粒一样通过脂双层内的包膜多肽自组配或折叠形成颗粒。本发明的病毒样颗粒可以是重组或合成的,或可包含合成或重组成分的组合。
除非上下文清楚地指出,否则此处涉及的单数形式例如“a”、“an”或“the”包括复数方面。因此,例如“a polypeptide of interest”包括单个多肽以及二个或多个这样的多肽。
此处涉及的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不应当受任何特定长度的限制。因此,所述术语包括蛋白质、寡肽、肽和抗原决定部位。所述术语不排除多肽的修饰,例如肉豆蔻基化、糖基化、磷酸化、加上N端信号序列等。包括在此定义范围内的是,例如含有一个或多个氨基酸(例如包括,非天然氨基酸例如在表面2中所给出的氨基酸)类似物的多肽或具有取代连接的多肽。
此处涉及的类似物包括但不限于对侧链的修饰、在肽、多肽或蛋白质合成过程中整合入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交联剂和对蛋白质分子或其类似物施以构象限制的其它方法。
本发明涉及的侧链修饰的例子包括氨基官能团的修饰,例如通过与醛反应然后用NaBH4还原进行的还原烷基化、用甲基乙酰亚胺酸酯进行乙酰亚胺化、用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基官能团三硝基苄化、用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐酰化氨基官能团,和用吡哆醛-5-磷酸接着用NaBH4还原来吡哆醛化赖氨酸。
精氨酸残基的胍基官能团可通过与反应物例如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物进行修饰。
羧基官能团可通过碳二亚胺活化来修饰,碳二亚胺活化是通过形成O-酰基异脲然后衍生化为例如相应的酰胺来进行的。
巯基官能团可通过某些方法进行修饰,所述方法为例如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧基甲基化、过甲酸氧化成磺基丙氨酰、与其它硫醇化合物形成混合二硫化物、与顺丁烯二酰亚胺、顺丁烯二酐或其它取代顺丁烯二酰亚胺反应、使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、氯苯汞、2-氯汞-4-硝基酚和其它汞化物形成汞衍生物;在碱性pH下用氰酸进行甲氨酰化;十六烷基化半胱氨酸残基。
色氨酸残基可通过例如用N-溴琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄溴或sulphenyl halide烷基化吲哚环来进行修饰。另一方面,酪氨酸残基可通过用四硝基甲烷形成3-硝基酪氨酸衍生物来进行改变。
组氨酸残基咪唑环的修饰可通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用二乙基焦碳酸盐进行N-乙酯基化。
在肽合成过程中整合入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D型同分异构体。此处涉及的非天然氨基酸的目录显示于表2。
表2
非常规氨基酸代码
非常规氨基酸 | 代码 | 非常规氨基酸 | 代码 |
α-氨基丁酸α-氨基-α-甲基丁酸氨基环丙烷-羧酸盐氨基异丁酸氨基正龙脑基-羧酸盐环己基丙氨酸环戊基丙氨酸D-丙氨酸D-精氨酸D-天冬氨酸D-半胱氨酸D-谷氨酰胺D-谷氨酸D-组氨酸D-异亮氨酸D-亮氨酸D-赖氨酸D-甲硫氨酸D-鸟氨酸D-苯丙氨酸D-脯氨酸D-丝氨酸D-苏氨酸D-色氨酸D-酪氨酸D-缬氨酸D-α-甲基丙氨酸D-α-甲基精氨酸D-α-甲基天冬酰胺D-α-甲基天冬氨酸D-α-甲基半胱氨酸D-α-甲基谷氨酰胺 | AbuMgabuCproAibNorbChexaCpenDalDargDaspDcysDglnDgluDhisDileDleuDlysDmetDornDpheDproDserDthrDtrpDtyrDvalDmalaDmargDmasnDmaspDmcysDmgln | L-N-甲基丙氨酸L-N-甲基精氨酸L-N-甲基天冬酰胺L-N-甲基天冬氨酸L-N-甲基半胱氨酸L-N-甲基谷氨酰胺L-N-甲基谷氨酸L-N 甲基组氨酸L-N-甲基异亮氨酸L-N-甲基亮氨酸L-N-甲基赖氨酸L-N-甲基甲硫氨酸L-N-甲基正亮氨酸L-N-甲基正缬氨酸L-N-甲基鸟氨酸L-N-甲基苯丙氨酸L-N-甲基脯氨酸L-N-甲基丝氨酸L-N-甲基苏氨酸L-N-甲基色氨酸L-N-甲基酪氨酸L-N-甲基缬氨酸L-N-甲基乙基甘氨酸L-N-甲基叔丁基甘氨酸L-正亮氨酸L-正缬氨酸α-甲基-氨基异丁酸α-甲基-γ-氨基丁酸α-甲基环己基丙氨酸α-甲基环戊基丙氨酸α-甲基-α-萘基丙氨酸α-甲基青霉胺N-(4-氨基丁基)甘氨酸N-(2-氨基乙基)甘氨酸 | NmalaNmargNmasnNmaspNmcysNmglnNmgluNmhisNmileNmleuNmlysNmmetNmnleNmnvaNmornNmpheNmproNmserNmthrNmtrpNmtyrNmvalNmetgNmtbugNleNvaMaibMgabuMchexaMcpenManapMpenNgluNaeg |
D-α-甲基组氨酸D-α-甲基异亮氨酸D-α-甲基亮氨酸D-α-甲基赖氨酸D-α-甲基甲硫氨酸D-α-甲基鸟氨酸D-α-甲基苯丙氨酸D-α-甲基脯氨酸D-α-甲基丝氨酸D-α-甲基苏氨酸D-α-甲基色氨酸D-α-甲基酪氨酸D-α-甲基缬氨酸D-N-甲基丙氨酸D-N-甲基精氨酸D-N-甲基天冬酰胺D-N-甲基天冬氨酸D-N-甲基半胱氨酸D-N-甲基谷氨酰胺D-N-甲基谷氨酸D-N-甲基组氨酸D-N-甲基异亮氨酸D-N-甲基亮氨酸D-N-甲基赖氨酸N-甲基环己基丙氨酸D-N-甲基鸟氨酸N-甲基甘氨酸N-甲基氨基异丁酸N-(1-甲基丙基)甘氨酸N-(2-甲基丙基)甘氨酸D-N-甲基色氨酸D-N-甲基酪氨酸D-N-甲基缬氨酸γ-氨基丁酸L-叔丁基甘氨酸L-乙基甘氨酸L-高苯丙氨酸L-α-甲基精氨酸L-α-甲基天冬氨酸 | DmhisDmileDmleuDmlysDmmetDmornDmpheDmproDmserDmthrDmtrpDmtyDmvalDnmalaDnmargDnmasnDnmaspDnmcysDnmglnDnmgluDnmhisDnmileDnmleuDnmlysNmchexaDnmornNalaNmaibNileNleuDnmtrpDnmtyrDnmvalGabuTbugEtgHpheMargMasp | N-(3-氨基丙基)甘氨酸N-氨基-α-甲基丁酸α-萘基丙氨酸N-苯甲基甘氨酸N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸N-(2-羧基乙基)甘氨酸N-(羧基甲基)甘氨酸N-环丁基甘氨酸N-环庚基甘氨酸N-环己基甘氨酸N-环癸基甘氨酸N-环十二烷基甘氨酸N-环辛基甘氨酸N-环丙基甘氨酸N-环十一烷基甘氨酸N-(2,2-二苯基乙基)甘氨酸N-(3,3-二苯基丙基)甘氨酸N-(3-胍基丙基)甘氨酸N-(1-羟基乙基)甘氨酸N-(羟基乙基))甘氨酸N-(咪唑基乙基))甘氨酸N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸N-甲基-γ-氨基丁酸D-N-甲基甲硫氨酸N-甲基环戊基丙氨酸D-N-甲基苯丙氨酸D-N-甲基脯氨酸D-N-甲基丝氨酸D-N-甲基苏氨酸N-(1-甲基乙基)甘氨酸N-甲基萘基丙氨酸N-甲基青霉胺N-(对羟基苯基)甘氨酸N-(硫代甲基)甘氨酸青霉胺L-α-甲基丙氨酸L-α-甲基天冬酰胺L-α-甲基-叔丁基甘氨酸 | NornNmaabuAnapNpheNglnNasnNgluNaspNcbutNchepNchexNcdecNcdodNcoctNcproNcundNbhmNbheNargNthrNserNhisNhtrpNmgabuDnmmetNmcpenDnmpheDnmproDnmserDnmthrNvalNmanapNmpenNhtyrNcysPenMalaMasnMtbug |
L-α-甲基半胱氨酸L-α-甲基谷氨酰胺L-α-甲基组氨酸L-α-甲基异亮氨酸L-α-甲基亮氨酸L-α-甲基甲硫氨酸L-α-甲基正缬氨酸L-α-甲基苯丙氨酸L-α-甲基丝氨酸L-α-甲基色氨酸L-α-甲基缬氨酸N-(N-(2,2-二苯基乙基 | McysMglnMhisMileMleuMmetMnvaMpheMserMtrpMvalNnbhm | L-甲基乙基甘氨酸L-α-甲基谷氨酸L-α-甲基高苯丙氨酸N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸L-α-甲基赖氨酸L-α-甲基正亮氨酸L-α-甲基鸟氨酸L-α-甲基脯氨酸L-α-甲基苏氨酸L-α-甲基酪氨酸L-N-甲基高苯丙氨酸N-(N-(3,3-二苯基丙基) | MetgMgluMhpheNmetMlysMnleMornMproMthrMtyrNmhpheNnbhe |
氨基甲酰甲基)甘氨酸氨基甲酰甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2,2-二苯基-Nmbc乙基氨基)环丙烷 |
例如,可使用交联剂稳定3D构象,使用同源双功能交联剂例如具有(CH2)n(n=1至n=6)间隔子官能团的双功能亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯和异双功能试剂,所述异双功能试剂通常含有氨基反应性部分例如N-羟基琥珀酰亚胺和另外的基团特异性反应性部分例如马来酸亚胺或二硫部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。此外,通过例如整合入Cα和Nα-甲基氨基酸和在氨基酸的Cα和Cβ原子之间引入双键可限制肽的构象。
术语“融合多肽”或“嵌合多肽”或“杂合多肽”可交互使用,表示包含两个或更多个相连的作为同一表达产物中的部分表达的或通过合成方式产生的多肽、蛋白质或肽。融合多肽可包含两个或多个L和POI多肽和间隔区域,例如连接体或间隔子区域。特别地,允许或直接地或间接地有助于表面拓朴学或在颗粒中增加目的多肽对蛋白酶的抗性的区域是想要的,例如N端信号序列。信号序列的例子是前催乳激素,然而,正如本领域技术人员所理解的,还有许多其它合适的信号序列。间隔子区域的例子是跨膜结构域。可选择的或此外,可包括促进胞质拓扑学的区域。可通过蛋白酶保护测定或通过确定与抗体的相互作用来估测病毒颗粒中的多肽拓扑学,所述相互作用由L多肽、S多肽、目的多肽或由这些多肽的融合产生的抗原决定部位决定。因此,“融合多肽”中的术语“融合”不是“病毒融合”的意思。
术语“目的多肽”是指任何有利地作为病毒样颗粒的部分被递送至受试者的多肽。例如,涉及促进和/或介导特定生物化学或生理学反应的两个或多个多肽或多肽的基质可以病毒颗粒的形式被递送至受试者。所涉及的特定反应是对抗原的免疫应答。因此所述术语包括任何目的抗原性多肽。抗原性多肽可与免疫强化多肽例如本领域技术人员所熟知的细胞因子共表达。本发明的多肽和肽(POIs)可进一步与作为靶向和/或标记分子的分子在L中表达或合成,所述靶向和/或标记分子是例如,但不限于,帮助靶向和/或标记特定细胞例如树突细胞或其它抗原呈递细胞的分子。
此处所使用的“受试者”是指动物,优选地是哺乳动物和更优选地是可从本发明的病毒颗粒的施用中获益的人。对从此处描述的分子中获益的动物类型没有限制。无论是人或非人动物的患者都可称作个体、受试者、动物、宿主或受者。本发明的分子和方法应用于人医学、兽医学以及通常地于驯养或野生动物的饲养中。为方便,“动物”包括禽类物种例如家禽禽类、鸟类饲养场的鸟类或猎禽。
所述优选的动物是人或其它灵长类、家畜动物、实验室测试动物、陪伴动物或捕获的野生动物。
实验室测试动物的例子包括鸭子、雪雁、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿动物例如大鼠和小鼠提供了方便的测试系统或动物模型。家畜动物包括绵羊、母牛、猪、山羊、马和驴。也涉及非哺乳动物例如鸟类品种,斑马鱼和两栖类动物。
术语“抗原”或“抗原性多肽”广义上包括能在受试者中诱导免疫应答的多肽。所述抗原性多肽可包括单个抗原决定区域到多个包括重复抗原决定部位区域的抗原决定部位区域。尽管涉及来自传染性因子的抗原例如病毒、细菌、真菌、原生动物、吸虫、线虫、朊病毒等以及肿瘤相关的抗原,所述抗原性多肽可来自单个或多个来源。许多因子和肿瘤相关蛋白的抗原性区域在本领域是众所周知的。抗原是例如来自寄生虫、细菌、病毒、癌症的抗原和此处描述的包括来自肝炎的E2多肽、来自疟原虫(P.falciparum)的MSP2多肽和来自麻疹的H蛋白的抗原。
正如本领域技术人员所熟知的,预防性或治疗性疫苗的有效免疫通常会引起强烈的CTL和T辅助细胞应答以及强烈的体液应答。
所述目的抗原性多肽可包含来自一个或多个来自不同生物体、物种或亚种的多肽的抗原决定部位区域。例如,可对病毒和细菌或多个病毒或多个细菌的感染同时进行接种疫苗。
短语“颗粒结合部分”是指,对所有L多肽而言,用来将L多肽整合至病毒样颗粒中所需的L多肽的部分。例如,L的S结构域的TM1区域对于L与所述颗粒的缔合不是必需的因此可从此处使用的L多肽中略去。事实上,如此处所提到的,L多肽的TM1下游序列(或TM2和5’半胱氨酸环的下游)足以满足颗粒结合。类似地,L的preS结构域不是将L装配入颗粒中所需要的。缺少TM1的L的S结构域是L的颗粒结合部分的例子。很明显,根据本发明许多不同的颗粒结合部分是可获得的。该部分的特征是可变的,并且可使用本领公开的和此处提到的方法根据经验进行确定。
尽管L的最小功能性部分在一些应用中是有利的,但本发明提供了间插有POI的全长L多肽或其中将POI附加在末端的全长L多肽。优选地所述POI被引入至L的表面暴露部分。
术语“来源于”是指特定的组分或组分群来自于所描述的来源,但不一定需要从所述特定的来源直接获得。
术语“分离的”包括指VLPs已经过至少一个纯化步骤,方便地以在样品中纯物质的%来描述。优选的形式包括在样品中VLP物质具有至少50%的纯度、更优选地至少60%、更优选地至少70%、更优选地至少大约80%、更优选地至少大约90%。
本发明的一个有利方面是VLPs可以大体上一致的大小产生。
在本发明的另一方面,涉及分离的病毒样颗粒(VLP),其包含i)包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜(L)多肽的部分S结构域或其功能性衍生物或同源物的融合多肽;和ii)禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物,其中至少部分所述POI暴露于病毒样颗粒的表面。
根据要求,可方便地使用信号序列以实现特定POI/L多肽在一些表达系统中的表达。如此处所描述的,强信号序列的存在也可用于增强在VLP表面表达的POI量。
示例性L部分是DHBV S结构域的氨基酸24至167部分或,更优选地至少是TM2(包括TM1和TM2之间的5’半胱氨酸环)和DHBV的L多肽的下游序列。
在本发明的一个特定实施方案中,所述目的多肽位于L多肽的S结构域氨基酸序列或除去TM1结构域的S结构域的氨基末端。在另一个实施方案中,所述POI位于L多肽的pre-S结构域或L多肽的N末端。
通过向L的pre-S结构域或L的S结构域的N端或缺少TM1的S结构域的N端引入一个或多个POIs,所述POI与L一起被转运至主要由S多肽构成的颗粒结构中。这有利于每个VLP含有高拷贝数量的POI。
在一个实施方案中本发明的病毒样颗粒用于疫苗组合物中以提高有效的免疫应答。特别地,所述病毒样颗粒具有有利地被抗原呈递细胞例如树突细胞吸收的合适大小。特别地,对于哺乳动物嗜肝DNA病毒颗粒,这些颗粒通常大约为20纳米,而禽类嗜肝DNA病毒是多晶的并且直径通常在35和60纳米之间。有效的免疫应答是能够在受试者中减少靶抗原数量和可以预防感染或疾病状况发展(预防性疫苗)或可治疗当前的感染或疾病状况(治疗性接种)的应答。
在不受限于任何特定理论的情况下,本发明的VLPs能够刺激体液和/或细胞介导的免疫应答。异源抗原被靶向至加工和呈递MHC I类和II类抗原的合适途径,并且被靶向至引起特别是T细胞应答的树突细胞。
在另一方面,优选的L多肽包含或由基本上如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所列氨基酸序列,或与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9具有至少50%相似性的氨基酸序列构成。
甚至更优选地,所述%相似性超过60%同一性、更优选地70%同一性、然而更优选地至少大约80%、而更优选地大约90-95%的同一性。
优选的L多肽来源于禽类嗜肝DNA病毒,例如但不限于DHBV。重要的是,应用于本发明的嗜肝DNA病毒或包膜多肽不会从VLP装配中排除L。
本发明L多肽的功能性衍生物包括亲本分子的片段或部分,其保持L多肽与由S多肽形成的颗粒结合的能力,或至少其中这种能力没有明显丢失。
本发明的S多肽的功能性衍生物保留了S多肽形成病毒样颗粒的能力,或至少这种能力没有明显丢失。
明显丢失表示L颗粒与S以低于大约1∶1或优选地低于1∶2,甚至更优选地低于1∶3,而更优选地低于1∶4的比例被装配入颗粒中。
优选的S多肽来源于禽类嗜肝DNA病毒,例如但不限于DHBV,或包含或由基本上由SEQ ID NO:13所列氨基酸序列构成。
术语“功能性衍生物”也扩展至具有一个或多个氨基酸突变或修饰的多肽。突变可来自氨基酸的添加、插入、缺失或替代。替代优选地是下列组内的保守氨基酸替代:甘氨酸和丙氨酸;缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺;丝氨酸和苏氨酸;赖氨酸和精氨酸;以及苯丙氨酸和酪氨酸。修饰可包括添加增强病毒装配或稳定的侧翼序列。
优选地,衍生物与所述亲本分子的全部或部分具有至少60%的氨基酸相似性,或更优选地至少80%,或最优选地90%或更大的相似性。
因此,在另一个实施方案中,本发明提供了包含融合多肽的VLP,所述融合多肽包含POI和L多肽的颗粒结合部分,其中所述L多肽包含基本如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或与其具有至少大约50%相似性的氨基酸序列,或其功能性衍生物或同源物。
在另一个实施方案中,本发明提供了包含融合多肽的VLP,所述融合多肽包含POI和L多肽的颗粒结合部分,其中所述L多肽由基本如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的核苷酸序列或能够在中等严紧条件下与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
使用本领域技术人员熟知的技术例如此处描述或提及或Sambrook等人总结的技术,在体外或体内装配本发明的VLPs。特别地,产生用来表达一种或多种如此处描述的重组包膜蛋白的表达质粒。
因此,在另一方面,本发明提供了用于装配包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的VLP的分离的或重组的多肽。
在相关方面,本发明提供了当在细胞中表达时能够装配入VLP的重组多肽,所述多肽包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物。
优选地,所述L的颗粒结合部分至少包括L的S结构域或除去TM1结构域的L的S结构域或其功能性衍生物。
更优选地,POI位于L的pre-S结构域、或L的S结构域的氨基末端侧、或除去TM1结构域的L的S结构域。
根据本发明的这个方面,所述L多肽包含基本如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少50%相似性的氨基酸序列。
如此处所描述的,L多肽的颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少50%相似性的氨基酸序列的其功能性衍生物构成。
禽类嗜肝DNA病毒表现相当高的序列同一性并且因此考虑具有高于70%相似性或同一性的序列。
本发明扩展至L多肽或其颗粒结合部分在制备VLP中的应用,所述L多肽或其颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8具有至少大约50%相似性的核苷酸序列或能够在中等严紧杂交条件下与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的互补形式杂交的连续核苷酸序列编码。
在本发明进一步方面,所述L多肽进一步包含信号序列。这样的序列在增强POI在VLP的表面表达上特别有用。
优选的L多肽是DHBV L多肽或其功能性衍生物。
而在另一方面,本发明提供了包含编码适合用于生产重组VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子,其中所述核酸分子编码POI和L多肽的颗粒结合部分,并且其中编码L多肽的颗粒结合部分的核苷酸序列包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的序列或能够在低严紧杂交条件下与其或与其互补形式杂交的连续核苷酸序列,或其功能性衍生物或同源物。
而在另一方面,本发明提供了包含编码适合用于生产重组VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子,其中所述核酸分子编码POI和L多肽的颗粒结合部分,并且其中编码L多肽颗粒结合部分的核酸编码SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或与其具有至少大约50%相似性的氨基酸序列或其功能性衍生物或同源物。
在另一方面,本发明提供了包含编码适合用于生产重组VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子,其中所述核酸分子编码POI和L多肽的颗粒结合部分,并且其中编码L多肽颗粒结合部分的核酸编码SEQID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列。
另外本发明的另一方面提供了用于制备重组VLP的重组核酸分子,所述核酸分子包含编码至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含一个或多个适合于接受第二个编码一个或多个目的多肽的克隆位点,其中所述目的多肽作为与所述L多肽形成的融合多肽被表达。本发明的表达载体也可以方便地表达其它包膜蛋白例如L或,优选地,S多肽。因此可常规地使用双向或双顺反子启动子以表达来自相同载体的重组L以及S多肽。此外,使用信号序列以增强POI的表达(包括表面表达)。明确包括含有本发明重组核酸分子的细胞和试剂盒。
因此本发明提供了将POI递送至受试者或细胞的方法,其包括在包含来自禽嗜肝病毒例如DHBV的L多肽或其功能性衍生物或同源物的VLP中表达POI以使至少部分POI在VLP的表面表达。在一个方面,所述VLP在体外表达系统中产生。在另一方面,所述VLP在体内产生。当POI是抗原性多肽时,优选的细胞是免疫系统的细胞例如抗原呈递细胞。
特别地提供了本发明的所有或部分核酸分子的互补形式。
本领域技术人员很容易地认识到,术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式或混合的聚合物、有义链和反义链,并且可以是化学或生化修饰的或可包含非天然的或衍生核苷酸碱基。这类修饰包括,例如,标记、甲基化、用类似物(例如吗啉环)替代一个或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电荷连接(例如,甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)、带电荷连接(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(例如多肽)、插入物(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和被修饰的连接(例如α-异头核酸等)。被包括的还有模仿多核苷酸通过氢键和其它化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。这类分子在本领域是已知的并且包括,例如,用肽键替换分子主链中的磷酸键的分子。
此处所用的术语“相似性”包括在核苷酸和氨基酸水平上进行比较的序列之间的精确同一性。当在核苷酸水平上存在非同一性时,“相似性”包括导致不同氨基酸的序列差异,但所述不同氨基酸彼此之间在结构、功能、生物化学和/或构象水平上是相关的。
当在氨基酸水平上存在非同一性时,“相似性”包括相互之间在结构、功能、生物化学和/或构象水平上相关的氨基酸。在特定的优选的实施方案中,在同一性水平上而非相似性上进行核苷酸和序列比较。
用于描述两个或多个多核苷酸或多肽之间相互关系的术语包括“参照序列”、“比较窗口”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“基本相似”、和“基本同一”。“参照序列”长度至少为9-12个但通常是15-18和通常至少21-25或更多,例如30个单体单位,包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可各自包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即只是完整的多核苷酸序列的一部分)和(2)两个多核苷酸之间有差异的序列,因此通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以确定和比较局部区域的序列相似性来进行两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较。“比较窗口”是指被用于与参照序列比较的通常12个连续残基的概念片段。当与参照序列(不包含加入或缺失)比较以最优化两个序列的比对时,比较窗口可包含大约20%或更少的加入或缺失(即缺口)。可通过计算机化的算法工具(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA)或通过目测进行用于比对比较窗口的最优化序列比对,通过任何被选择的各种方法产生最佳比对(即导致在比较窗口上最高的百分比同源性)。也可以参考BLAST程序集,例如由Altschul等人于Nucleic AcidResearch,25:3389-3402,1997中公开的。在Ausubel等人(同上)的Unit 19.3中可找到序列分析的详细讨论。
此处所用的术语“序列相似性”和“序列同一性”是指在比较窗口上基于核苷酸与核苷酸或基于氨基酸与氨基酸的序列同一或者功能或结构相似的程度。因此,例如,“序列同一性百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳排列的序列,确定在两个序列上出现相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Iys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以获得匹配位置数目,用匹配位置数目除以比较窗口中的总位置数目(即,窗口大小),并将所述结果乘以100产生序列同一性百分比来计算的。为了本发明的目的,“序列同一性”可理解成表示通过DNASIS计算机程序(用于Windows的2.5版,获自Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Franci sco,California,USA)使用如在伴随软件的参考手册中所使用的标准默认值计算的“匹配百分比”。与此类似的说明也适用于序列相似性。可认为保守氨基酸的变换提供了相似性序列但非同一性序列。
特别优选的核酸分子编码L多肽的颗粒结合部分并包含基本上如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的连续核苷酸序列或具有与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:8至少大约50%相似性的核苷酸序列。优选地,相似性%与编码L多肽颗粒结合部分的序列相关。
此外,本发明涉及编码L多肽颗粒结合部分的核酸分子,其包含基本上如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的核苷酸序列或能够在中等严紧条件下与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或其互补形式杂交的核苷酸序列。
本发明核酸分子的功能性衍生物包括其片段或具有一个或多个核苷酸突变或修饰的序列。
突变包括一个或多个核苷酸缺失、插入或替代。可选择地或此外,可通过加入序列或部分以增强功能例如增强的稳定性或活性或引入新的活性来修饰衍生物。例如,修饰可包括加入促融合(fusagenic)剂以增强膜通透性、影响转录前或转录后修饰事件的修饰、或产生包含标记、标签和其它用于鉴别、纯化等的修饰的融合蛋白。
所述核酸分子的功能性衍生物保持亲本分子编码具有S多肽颗粒装配功能或L多肽颗粒结合功能的多肽的能力。
所述核酸分子的片段可包括具有亲本功能的其部分或一个或多个其小部分。
本发明核酸序列的功能性同源物包括来自不同物种(通过共同的系统发生行为发生关系的物种)的直向同源基因序列同时也包括来自其它物种的作为趋同进化的结果与本发明核酸序列相似的基因序列,其中所述同源物是在功能和结构上与本发明核酸序列相关的,因此容易通过基于杂交的方法或通过与公开的基因组数据库进行序列比较来进行鉴定和/或分离。例如,大约20个禽类嗜肝DNA病毒的核苷酸序列是公共可获得的(Triyatni等人,J.Gen.Virol,82:373-378,2001)。
如本领域所熟知的,可在利用不同严紧杂交条件的测定中估计核酸水平上的相似性,例如如Ausubel等人(同上)所描述的。
此处提及的严紧杂交条件优选地是指允许在基本相似的分子间进行选择性杂交或退火的条件。满足该标准的杂交溶液的杂交温度组成和离子强度可根据大量已被很好表征的因素例如长度、互补程度和GC含量进行变化。对于更长的序列,通常可能计算在各种条件下的双螺旋核酸序列的预期熔解点。杂交可针对完整的或具有能充分提供其编码的多肽的特性和功能性的最小长度的部分本发明多核苷酸。
低严紧杂交条件包括从至少大约0至至少大约15%v/v甲酰胺和从至少大约1M至至少大约2M的盐(用于杂交),和至少大约1M至至少大约2M的盐(用于洗涤条件)。通常,低严紧是从大约25-30℃至大约42℃。可改变温度并且用更高的温度取代甲酰胺和/或给出其它的严紧条件。
中等严紧包括从至少大约16%v/v至至少大约30%v/v甲酰胺和从至少大约0.5M至至少大约0.9M的盐(用于杂交),和至少大约0.5M至至少大约0.9M的盐(用于洗涤条件)。高严紧包括从至少大约31%v/v至至少大约50%v/v甲酰胺和从至少大约0.01M至至少大约0.15M的盐(用于杂交),和至少大约0.01M至至少大约0.15M的盐(用于洗涤条件)。通常在Tm=69.3+0.41(G+C%)下进行洗涤。然而,随着错配碱基对数目每增加1%,双螺旋DNA的Tm就下降1℃(Bonner等人,1974)。甲酰胺在这些杂交条件下是可选的。因此,如下确定特别优选的严紧水平:低严紧是6×SSC缓冲液,0.1%w/v SDS,温度于25-42℃下;中等严紧是2×SSC缓冲液,0.1%w/v SDS,温度在从20℃至65℃范围内;高严紧是0.1×SSC缓冲液,0.1%w/vSDS,温度至少在65℃以上。
可将适合用于制备重组VLPs的本发明的重组核酸分子导入有助于VLP产生的载体中。
载体优选地含有克隆位点并且能在确定的宿主细胞中自我复制。可选择地,所述载体可整合入基因组中并且与其被导入的染色体一起复制。载体通常也包括选择标记。
可选择的标记的例子包括赋予对化合物例如抗生素抗性的基因、赋予在选择的底物上生长的能力的基因、编码产生可检测信号例如发光的蛋白的基因。大量的这类标记是公开和可获得的,包括,例如抗生素抗性基因例如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性基因(hyg)。可选择标记也包括赋予在某种培养基底物上生长的能力的基因,例如tk基因(胸苷激酶)或赋予在HAT培养基(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)上生长的能力的hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶);和允许在MAX培养基(霉酚酸、腺嘌呤和黄嘌呤)上生长的细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖转移酶)。其它用于哺乳动物细胞的选择标记和携带各种选择标记的质粒描述于Sambrook等人的MolecularCloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour,New York,USA,1990中。
选择标记可依赖于其自身启动子进行表达并且标记基因可不必来自人基因组(例如原核标记基因可用于人细胞中)。然而,优选地用已知在受体细胞中发挥功能的转录机器取代原来的启动子。可获得的大量用于这种目的转录起始区域,包括,例如,金属硫蛋白启动子、胸苷激酶启动子、β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、SV40启动子和人细胞巨化病毒启动子。广泛使用的例子是具有在SV40早期启动子控制下的细菌新霉素磷酸转移酶基因并且赋予哺乳动物细胞抗G18(与新霉素相关的抗生素)抗性的pSV2-neo质粒。可使用许多其它变化以增强选择标记在动物细胞中的表达,例如加上poly(A)序列和加上合成的翻译起始序列。组成型或诱导型启动子都可使用。
用于制备重组VLP的重组核酸分子优选地以有助于导入编码POI的核酸分子和颗粒装配的试剂盒形式存在。
本发明的另一方面提供了包含编码POI和至少DHBV的L肽颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列的表达载体,其中所述POI可以作为与所述L多肽形成的融合多肽进行表达。
本发明的另一方面提供了包含编码POI和至少DHBV的L肽的S结构域的部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列的表达载体,其中所述POI在L多肽氨基酸序列的S结构域或其功能性衍生物或同源物之中或N末端进行表达。
优选地,所述POI在L多肽的S结构域的N末端上或多肽的pre-S结构域内表达。
如本领域技术人员所理解的,本发明的核酸分子可进行进一步修饰以确保其适合于在一系列细胞内的表达、体外选择、适合用于在其中克隆各种POIs。这类技术和策略对本领技术人员来说是熟知的并且可方便地参考Ausbel等人编著的short protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,第5版,2002和/或Sambrook等人(同上)。
为确保表达,编码POI和L多肽成分的核苷酸序列可有效地连接至一个或多个表达控制序列上。优选地两个或多个这样的核苷酸序列在同一阅读框内。
在一个实施方案中表达载体被方便地整合入宿主细胞的基因组中并在宿主细胞启动子的驱动下表达。
本发明也提供了被转化或被转染或包含核酸分子的微生物或宿主细胞,所述核酸分子包含编码POI和至少DHBV的L肽颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列。酵母细胞是特别方便的宿主细胞。有利地使用原核或真核宿主细胞。通常原核细胞包括大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属物种而真核细胞包括酵母、真菌、哺乳动物和昆虫细胞。
本发明进一步提供了用作疫苗的包含来源于DHBV L和S多肽的病毒样颗粒的组合物,其中L多肽包含一个或多个目的抗原。
本发明也涉及包含以与DHBV的L多肽颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合蛋白表达的目的抗原和DHBV S多肽的疫苗,其中S多肽和抗原-L多肽可被装配入VLP中,与合适的药物可接受的稀释剂和载体混合。所述疫苗可在使用前冻干和可进一步与合适的佐剂混合。因此所述疫苗可以试剂盒的形式存在。
“药物可接受的”载体或稀释剂是指由不是生物学上或其它方面不想要的物质构成的药物学载体,即在不导致任何或明显不利的反应的情况下可与所选择活性试剂一起给受试者施用的物质。载体可包括赋形剂和其它添加物例如稀释剂、去垢剂、着色剂、增湿或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
可在药物组合物中配制本发明的VLPs和多肽核酸分子,所述药物组合物根据常规药物配方技术制备而来。参见,例如,Remington′sPharmaceutical Sciences,第18版(1990,Mack Publishing,Company,Easton,PA,U.S.A.)。所述组合物可包含活性试剂或活性试剂的药物可接受盐。除了其中一种活性物质外,这些组合物还可包括药物可接受赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其它本领域熟知的物质。这些物质应当是无毒的并且不应当干扰活性成份的功效。所述载体可根据想要施用的制剂的形式采取广泛的形式,例如局部、静脉内、口内、鞘内、神经弓上(epineural)或肠胃外施用。
对于口内施用,可将化合物配制成固体或液体的制剂例如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、粉剂、悬浮剂或乳剂。以口服剂量形式制备组合物时,在口服液体制剂(例如,悬浮剂、酏剂和溶液)的情况下可使用任何常用的药物介质,例如,水、乙二醇、油、醇、增味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等;或在口服固体制剂(例如,粉末、胶囊和片剂)的情况下可用载体例如淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。因为其容易施用,所以片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式,其中明显地使用了固体药物载体。如果想要,通过标准技术可对片剂进行糖包衣或肠包衣。可将活性试剂装入胶囊以使其稳定地通过胃肠道但同时允许穿过血脑屏障。参见例如,国际专利公开号WO96/11698。
对于肠胃外施用,可将所述化合物溶解在药物载体中并以溶液或悬浮液施用。合适载体的例子是水、盐水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇、或来源于动物、植物或合成的油。载体也可包含其它成分,例如,防腐剂、悬浮剂、增溶剂、缓冲剂等。当对化合物进行鞘内施用时,也可将其溶解在脑脊髓液中。
所述活性试剂优选地以治疗有效剂量施用。实际施用量和速度以及施用时程将依赖于被治疗状况的本质和严重度。治疗处方(例如剂量、时间的决定等)在医生或专家的责任范围内并且通常要考虑接受治疗的疾病、个体患者的状况、递送的位置、施用的方法和其它对医生来说熟知的因素。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中可查到技术和方案的例子。
可选择地,通过使用靶向系统例如抗体或细胞特异性配体或特异性核酸分子,靶向治疗术可用于将所述活性试剂更精确地递送至某种类型的细胞中。有许多原因使得靶向技术成为想要的,例如,当活性试剂自身是抗原性的或如果其不能进入靶细胞时。
与直接施用这些药剂相反,也可在靶细胞中产生其,例如在病毒载体中例如下面描述的病毒载体,或在基于细胞的递送系统中,例如描述于美国专利号5,550,050和国际专利公开号WO92/19195、WO94/25503、WO95/01203、WO95/05452、WO96/02286、WO96/02646、WO96/40871、WO96/40959和WO97/12635。所述载体可被靶向靶细胞。基于细胞的递送系统被设计用来移植至患者身体中想要的靶位置并且包含靶试剂的编码序列。可选择地,所述试剂可以前体形式施用,并通过产生于或靶向至被治疗的细胞的激活剂转化成活性形式。参见,例如,欧洲专利申请号0 425 731A和国际专利公开号WO90/07936。
或者疫苗组合物可包含编码重组VLPs的核酸分子。
本领域已知的基因转移系统可用于遗传操作的实践中。这些包括病毒和非病毒转移方法。许多病毒已用作转移载体或用作制备基因转移载体的基础,包括乳头多瘤空泡病毒(例如SV40,Madzak等人,J.Gen.Virol.73:1533-1536,1992)、腺病毒(Berkner,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:39-66,1992;Berkner等人,BioTechniques 6,616-629,1988;Gorziglia和Kapikian,J.Virol.66:4407-4412,1992;Quantin等人,Proc.Natl.Acad. Sci.USA89:2581-2584,1992;Rosenfeld等人,Cell 68:143-155,1992;Wilkinson等人,Nucleic Acids Res.20:2233-2239,1992;Stratford-Perricaudet等人,Hum.Gene Ther.1:241-256,1990:Schneider等人,Nature Genetics 18:180-183,1998)、牛痘病毒(Moss,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:25-38,1992;Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11341-11348,1996)、腺伴随病毒(Muzyczka,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:97-129,1992;Ohi等人,Gene 89:279-282,1990;Russell和Hirata,NatureGenetics 18:323-328,1998)、包括HSV和EBV的疱疹病毒(Margolskee,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:67-95,1992;Johnson等人,J.Virol.66:2952-2965,1992;Fink等人,Hum.GeneTher.3:11-19,1992;Breakefield和Geller,Mol.Neurobiol.1:339-371,1987;Freese等人,Biochem.Pharmacol.40:2189-2199,1990;Fink等人,Ann.Rev.Neurosci.19:265-287,1996)、慢病毒(Naldini等人,Science 272:263-267,1996)、辛德比斯和Semliki Forest病毒(Berglund等人,Biotechnology 11:916-920,1993)和禽类逆转录病毒(Bandyopadhyay和Temin,Mol.Cell.Biol.4:749-754,1984;Petropoulos等人,J.Viol.66:3391-3397,1992),鼠科动物[Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:1-24,1992;Miller等人,Mol.Cell.Biol.5:431-437,1985;Sorge等人,Mol.Cell.Biol.4:1730-1737,1984;Mann和Baltimore,J.Virol.54:401-407,1985;Miller等人,J.Virol.62:4337-4345,1988]和人[Shimada等人,J.Clin.Invest.88:1043-1047,1991;Helseth等人,J.Virol.64:2416-2420,1990;Page等人,J.Virol.64:5270-5276,1990;Buchschacher和Panganiban,J.Virol.66:2731-2739,1982]来源。
非病毒基因转移方法在本领域是已知的,例如包括磷酸钙共沉淀的化学技术、机械技术例如显微注射、通过脂质体的膜融合介导的转移和直接的DNA吸收和受体介导的DNA转移。使用脂质体递送可将病毒介导的基因转移与体内直接的基因转移组合起来,可用于指导所述病毒载体至特定的细胞中。可选择地,可将逆转录病毒载体生产型细胞系注射入特定的组织中。生产型细胞的注入可提供持续的载体颗粒来源。
在将生物学和物理学基因转移方法相结合的方法中,将任何大小的质粒DNA与特异性针对腺病毒六邻体蛋白的多聚赖氨酸缀合的抗体组合,所得的复合物就结合至腺病毒载体上。然后将所述三分子复合物用于感染细胞。所述腺病毒载体允许内体在偶联的DNA被破坏之前能够有效地结合、内化和降解。对于其它用于基于腺病毒的载体的递送技术,参见美国专利号5,691,198。
已显示脂质体/DNA复合体能够介导体内直接基因转移。尽管在标准脂质体制剂时,基因转移过程是非特异性的,但是已经报道了例如直接原位施用之后,在肿瘤处存在局部的体内吸收和表达。
用于产生本发明的病毒颗粒的一般方法对技术人员来说是熟知的。
本发明提供了制备重组VLP的方法,所述方法包括:
i)将编码目的多肽的核酸分子克隆入包含DHBV的L多肽颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的表达载体中;
ii)在允许蛋白质表达和用DHBV的S多肽或其功能性衍生物或同源物装配颗粒的条件下用步骤i)的重组表达载体感染或转染合适的细胞;
iii)从所述细胞中回收所述病毒样颗粒。
例如,用L/POI和S表达质粒转化酵母细胞。优选地,由酵母启动子驱动表达并且在酵母细胞例如糖酵母(Saccharomyces)株系中表达。
本发明的另一方面涉及针对本发明的融合多肽的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的并且用于其生产的技术是众所周知的。特异性识别本发明的融合多肽的决定簇的抗体是特别优选的。
通过进一步非限定性的实施例对本发明进行进一步地描述。
实施例1
通过融合PCR用HCV E2的胞外域的N末端82个氨基酸替代DHBVpreS的氨基酸44-125
质粒pCDL-E2.465编码由DHVB L氨基酸1-4、HCV E2氨基酸384-465、DHBV L氨基酸126-328构成(从N至C端)的嵌合L蛋白。其表示82个氨基酸的目的蛋白插入。如Ho等人的Gene,77:51,1989中所描述的使用融合PCR(交叠延伸PCR)。在头两轮使用pfu酶进行的PCR反应中,交叠引物各自与和pCDL-w.t.的正链或HCV构建体的负链互补的外侧引物配对。使用Qiagen min elute试剂盒纯化来自各反应的PCR产物(153bp,来自以pCDL为模板;和272bp,以HCV为模板),并且将两个纯化的产物用作模板,用于使用所述外侧引物进行的融合PCR中。纯化578bp的融合PCR产物并用Xmal(在HCV引物序列的nt 1743上切割)和Aat II(在DHBV L的nt 831上切割)进行降解。在DHBV preS编码序列中携带单一Xmal和Aat II位点的质粒pMDL-w.t.用作载体。将降解的PCR片段和被切割载体的大片段从琼脂糖凝胶中切割出来并用Prep-a-gene试剂盒(Bio-Rad)进行纯化。用已连接的质粒转化感受态细胞(DH5α细胞),并从氨苄青霉素板上选择转化体。
使用也存在于HCV E2胞外域序列(Bsa 1)上的限制性位点通过限制性内切酶降解纯化的DNA来检测阳性克隆。
将含有E2插入物的pMDL-E2的Sal1/Xho 1片段亚克隆入pCDL-w.t.(具有CMV启动子的DHBV L表达质粒),其中使用了相同的单一限制性位点(见图1)。再次使用Bsa 1降解以确定在pCDL-E2.465中存在E2插入物。也通过测序确定pCDL-E2.465克隆(测序覆盖preS-E2-preS和部分S至核苷酸1581的区域)。
外部引物P8045’GGGCAACATCCAGCAAAATCAATGG3’(SEQ ID NO:1 DHBV nt 804-828)P-17195’GCTGCGGAATGGCTAAAA GGGCCCCCGACC3’(SEQ ID NO:2 HCV nt 1719-1749,插入了Xmal RE位点,以下划线显示)交叠的嵌合引物(普通字体=DHBVperS;粗体=HCV E2)P1492(参见E2序列 起始处的nt)CCAACACTAGATCAC GAAACCCACGTCACCGGGG(SEQ ID NO:3)P-1492GGTTGTGATCTAGTG CTTTGGGTGCAGTGGCCCC(SEQ ID NO:4)模板:pCDL-wt(DHBV L表达质粒);p90/HCV FL-longpU |
实施例2
CDL-E2在禽类肝细胞瘤(LMH)细胞中的表达和分析
使用硫酸葡聚糖方法(Grgacic等人,J.Gen.Virol.79:2743,1998)用pCDL-E2.465和pCI-S(Gazina等人,Virology 242:266,1998)各5μg共转染禽类肝细胞瘤细胞系LMH。转染后第3天收集培养基用于估计被运出的颗粒,并且对细胞进行处理以获得胞质部分并估计细胞内颗粒形成或分离微粒体用于蛋白酶保护分析或分离膜部分用于估计蛋白表达(Grgacic,J.Gen.Virol.83:1635,2002)。
实施例3
细胞内和细胞外颗粒的分离
(i)细胞外颗粒:转染后第3天收集来自被转染的LMH细胞的培养基并通过在2,000rpm下离心5分钟除去未粘附细胞。
(ii)细胞内颗粒:用PBS洗涤细胞单层2次并通过将细胞刮入1ml PBS中进行收集。冷冻/解冻收集的细胞3次,在解冻时进行强烈的震荡。通过在Eppendorf离心机中在10,000rpm下离心1分钟获得胞质部分(上清液)。该方法已经在本实验室中用于从被转染的细胞中释放能够感染原代鸭肝细胞的DHBV颗粒。
将净化过的培养基或胞质部分中的颗粒用PBS稀释至6ml并在SW40转子(Beckman)中在38,000rpm下通过3ml 20%蔗糖和2ml 70%蔗糖缓冲垫沉淀3小时。从底部收集在20-70%界面上的部分,在-20℃下用甲醇沉淀16小时,然后在13%SDS-PAGE分离并进行Western印迹杂交。
如图2D中显示的,Western印迹显示E2.465/L嵌合体被装配入颗粒中。通过冷冻-解冻细胞3次,离心以获得用于在38,000r.p.m(SW41 rotor Beckman)下通过从20%蔗糖和70%蔗糖缓冲垫沉降颗粒的胞质部分来从用pCDL-E2.465和pCI-S感染的禽类肝细胞瘤(LMH)细胞中分离细胞内颗粒。在SDS-PAGE和用Western印迹杂交分析包膜蛋白前用甲醇沉淀位于20-70%蔗糖界面的颗粒部分。
实施例4
蛋白酶保护分析
根据改进过的Prange和Streeck的EMBO J.14:247,1995中的方法制备微粒体。在冷的Tris-缓冲盐溶液(TBS:50mM Tris-HCl;pH7.5;150mM NaCl)中洗涤被感染的LMH细胞(两个30mm直径的孔)。
用0.4ml 0.1X TBS在冰上温育各孔中的单层细胞10分钟,然后通过刮取收集细胞,通过26G针头抽吸5次汇集和分散细胞。将匀浆用5XTBS调整至1XTBS并在2,500rpm下于4℃离心20分钟以除去未破裂细胞和细胞核。取出上清液并放置一旁,同时将沉淀在300μl TBS中重新分散并如前所述进行离心。
将上清液汇集并铺展在2.7ml 250mM溶于TBS中的蔗糖上并于SW-60转子中(Beckman)在38,000rpm下于4℃离心30分钟。用TBS洗涤微粒体沉淀一次并在65μl TBS中重新悬浮。
为进行胰蛋白酶保护分析,将微粒体制备物分成3份20μl等份。留一个样品不作处理而将剩下的两个用25μg/ml的胰蛋白酶(TPCK处理的;Worthington Biochem.Corp.NJ.USA)在0.5%NP-40存在或不存在的情况下在冰上处理1小时。
实施例5
Western印迹分析
通过SDS-PAGE(13%丙烯酰胺)分离蛋白质并使用Trans-Blot SD半干转移室(Biorad)转移至硝酸纤维素膜上(Schleicher和Schull)。用加有0.3%Tween 20(PBST)的溶于PBS的3%脱脂牛奶封闭膜1小时。用单克隆抗S(7C.12)(Pugh等人,J.Virol.69:4814,1995)在1%脱脂牛奶中对膜检测1小时;PBST,然后用PBST洗涤并用山羊抗小鼠Ig:辣根过氧化物酶(Amersham)在1%脱脂牛奶PBST中进行检测。在最终于PBST(3×10分钟)中洗涤后通过增强的化学发光(ECL)(Amersham)显示蛋白条带。
如图2C中所显示的,Western印迹显示E2.465/L嵌合体被转运穿过ER。从用pCDL-E2.465和pCI-S(S蛋白表达质粒)转染的LMH细胞中制备用于蛋白酶保护分析的ER微粒体。如上面各泳道所标示的,在去垢剂NP-40存在或不存在的情况下用胰蛋白酶消化微粒体样品,或不作处理。通过SDS-PAGE和用单克隆抗S抗体进行Western印迹杂交对E2.465/L链的蛋白酶保护进行分析,所述抗体可同时检测E2.465/L和S蛋白。保护E2.465/L免受胰蛋白酶降解(中间泳道)表示转运至ER腔中。
实施例6
构建策略性选择的嵌合体DHBV VLPs以确定其作为潜在疫苗递送载体的运载能力
将受体结合区域以及pres的C末端暴露于DHBV亚病毒颗粒表面。这些两侧接有跨膜S结构域的暴露区域据信可通过肉豆蔻化信号锚定在N末端以进一步被稳定。插入至preS的该区域的HCV E2胞外域被类似地暴露和稳定。用相同或更大的外源序列替代preS序列或可选择地通过融合PCR将其按读码框融合至L的S结构域的N端。
为帮助转运嵌合L多肽,也使用了具有信号序列(例如融合至N末端的可导致L共翻译转运的前催乳激素信号序列)的L构建体。这些SigL链可与S亚单位一起装配并以颗粒被运出。通过蛋白酶保护测定和通过免疫沉淀对装配的颗粒的拓扑学进行抗体作图来监控嵌合的preS结构域的转运。通过蔗糖梯度沉降纯化颗粒并通过用于VLP形成的EM/免疫金标记进行分析。进行脉冲追踪代谢标记以估计保持在装配的颗粒中的重组链相对于S的比例(对于野生型DHBV大约为1∶4)。
实施例7
具有在L中缺失TM1的E2.465/L嵌合体的构建和分析
pCDLΔTM1-E2.465编码由DHBV L氨基酸1-45、HCV E2氨基酸384-465、具有在跨膜结构域1上缺失18个氨基酸(氨基酸168-186)的DHBV L氨基酸126-328构成(从N至C端)的嵌合L蛋白(参见图5B)。其表示82个氨基酸的目的蛋白插入。
通过将pMDLΔTM1-E2.465的Sal1/BstEII片段(包含preS/E2和S结构域序列)克隆入pCDL-w.t.来构建pCDLΔTM1-E2.465。用Bsa 1进行限制性内切酶降解来确定插入物的转移。如实施例2,3和4中所描述的在LMH细胞中进行pCDLΔTM1-E2.465的表达和分析。作为蛋白和作为装配的颗粒表达的E2.465/LΔTM1嵌合体比用pCDL-E2.465质粒观察到的颗粒多。如果需要,具有TM1缺失的构建体可用于所有嵌合DHBV VLPs。
实施例8
具有N末端信号序列(前催乳激素)的E2.465/LΔTM1的构建
pSigLΔTM1-E2.465编码由前催乳激素信号序列氨基酸1-26、DHBV L氨基酸2-45、HCV E2氨基酸384-465、具有在跨膜结构域1上缺失18个氨基酸(氨基酸168-186)的DHBV L氨基酸126-328(从N至C端)构成的嵌合型L蛋白(参见图5D)。其代表82个氨基酸的目的蛋白插入。
融合至DHBV L的N末端的信号序列导致L蛋白被共翻译转运穿过ER膜,这样又导致L蛋白糖基化(Swaymeye和Schaller,J.Virol.,71:9434,1997;Gazina等人,(同上))。
首先,进行连续的亚克隆:首先将pMDLΔTM1-E2.465的AatII/Kpn 1片段克隆入pMDSigLΔTM1-E2.465中,然后将后者的Sal1/BstEII片段克隆入pCDSigLA,从而构建pCDSigLΔTM1-E2.465。将来自含有E2.465序列的pCDSigLΔTM1-E2.465的PpuMul/BstEII片段克隆入PPL-L中的相同位置,在DHBV L的N末端编码前催乳激素信号序列(Gazina等人,(同上))。所得到的质粒被命名为pSigLΔTM1-E2.465。当如在实施例2中观察时,pSigLΔTM1-E2.465以与PPL-L蛋白相似的水平表达嵌合L-E2.465蛋白。
实施例9
包含HCV E2的完整胞外域的E2.661/L嵌合体的构建和分析
pSigLΔTM1-E2.661编码由前催乳激素信号序列氨基酸1-26、DHBV L氨基酸2-45、HCV E2氨基酸384-661、DHBV L氨基酸168-328构成(从N至C端)的嵌合型L蛋白(参见图5E)。其代表278个氨基酸的目的蛋白插入。
E2.661/L嵌合体将HCV E2的氨基酸384-661即278个氨基酸的E2胞外域整合入DHBV L的preS结构域中。通过使用针位起始位置(nt1490)上(如果是HCV E2的情况)的序列的引物和覆盖位于E2的胞外域末端nt 2321并包含Kpn 1限制性内切酶位点的反向引物进行PCR来构建E2.661/L。用Nae 1(E2的nt 1517)和Kpn 1降解所述PCR产物并将其插入pCDLΔTM1-E2.465的相同位置以构建pCDLΔTM1-E2.661。通过三向连接下列片段:包含E2序列的pCDLΔTM1-E2.661的Narl/BstE II片段、包含前催乳激素序列和部分E2的pSigLΔTM1-E2.465的Bg1 II/Nar 1片段和提供剩余载体序列的PPL-L的Bg1 II/BstE II片段,来将PPL信号序列整合入该构建体中。如实施例2中所描述的在LMH细胞中展示所得构建体pSigLΔTM1-E2.661的表达(参见图6A)。
实施例10
HBVpreS/L和HBVpreS/LΔ嵌合体的构建和分析
pCDL-HBVpreS编码由HBVpreS氨基酸1-163、DHBV L氨基酸162-328构成(从N至C端)的嵌合L蛋白。pCDLΔ-HBVpreS编码由HBV preS氨基酸1-163、具有在跨膜结构域1缺失18个氨基酸(氨基酸168-186)的DHBV L氨基酸162-328构成(从N至C端)的嵌合型L蛋白(参见图5F至5G)。这些构建体代表163个氨基酸的目的蛋白插入。
通过对来自编码各自L蛋白的质粒进行PCR,扩增编码HBV(ayw株系)的preS结构域(氨基酸1-163)和DHBV的S结构域的基因组序列,然后用融合PCR连接。HBV preS引物在HBSV preS起始位置上游引入了Sal 1限制性位点。使用位于DHBV引物上游的DHBV序列的Sal 1和BstEII限制性位点降解所述融合PCR产物并将其连接入pCDL-w.t.的相同位置以构建pCDL-HBVpreS质粒。然后,将与DHBVpreS无序列同源性的HBV preS序列(Sprengel等人,J. Med.Virol.15:323,1985)直接融合至这些构建体中的DHBV L的S结构域。
通过三向连接下列片段:包含HBV preS序列的pCDL-HBV pres的Sal1/Kpnl片段、包含DTM1区域的pCDLΔTM1的Kpn1/BstEII片段和提供剩余载体序列的pCDL-w.t.的Sal 1/BstEII片段,来构建pCDLΔ-HBVpreS。
如实施例2,3和4中所描述的在LMH细胞中进行pCDL-HBVpreS和pCDLΔ-HBVpreS的表达和分析。
实施例11
疟原虫(P.falciparum)MSP2/LΔTM1嵌合体的构建和分析
pCDLΔTM1-MSP2编码由DHBV L氨基酸1-30、疟原虫MSP2氨基酸20-249、在跨膜结构域1中缺失18个氨基酸(氨基酸168-186)的DHBV L氨基酸126-328构成(从N至C末端)的嵌合L蛋白(参见图5H)。该构建体代表230个氨基酸的目的蛋白插入。
通过融合PCR克隆疟疾病原体Plamodium falciparum(分离株NF54克隆3D7)MSP2基因。使用两套引物产生用于融合的各自的模板。第一套包括含有pCDLΔTM1的Sal I限制性酶切位点的正向引物和与MSP2的前27bp交叠的反向引物,第二套由与DHBV L交叠的正向引物和将XmaI限制性酶切位点整合入MSP2的反向引物构成。然后通过融合PCR将各模板连接,通过Sal I和XmaI限制性酶切并连接入载体中。将连接的插入物-载体转化入大肠杆菌DH5α中,产生嵌合载体pCDLΔTM1-MSP2。如实施例2中所描述的在LMH细胞中展现所得构建体的表达(参见图6B)。
实施例12
在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产DHBV VLP
为了扩大用于免疫接种研究的重组DHBV VLPs和嵌合DHBV VLPs的生产,使用了酵母可诱导表达系统。通过使用针对DHBV L(nt 801)起始位置上游序列(始于nt 762)和包含Sac 1限制性酶切位点的引物以及覆盖核苷酸1910和包含Eco RI限制性位点的反向引物进行PCR,将编码大包膜蛋白的DHBV DNA克隆入pYES2载体(Invitrogen)中。降解PCR产物并插入至载体多克隆位点中的SacI和Eco RI限制性位点。所述pYES2载体携带用于在大肠杆菌中进行克隆选择的氨苄青霉素抗性基因。通过限制性酶降解确定含有DHBV L基因的克隆(pYES-DL)并且选择一个用于转化酵母株系INVSc1。
使用用于DHBV S基因表达的酵母表达质粒pMB-DS(Klingmüller和Schaller,J.Virology,67:7414,1993)与pYES-DL一起共转化INVSc1株系。所述pYEs2携带用于在酵母中选择转化体的URA 3基因而pMB-DS携带LEU2选择标记。所用的INVSC-1株系在缺少亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸和色氨酸的培养基中不能生长。因此共转化体因能在缺少亮氨酸和尿嘧啶的培养基上生长而被选择。根据厂商(INVITROGEN)的说明书对感受态INVSc-1细胞进行转化。两种质粒都具有GAL1启动子,所述启动子可通过半乳糖在酵母中诱导高水平可诱导的蛋白质表达和通过葡萄糖抑制表达。将转化体在含有2%葡萄糖但不含尿嘧啶和亮氨酸(SC-UL)的酵母合成drop-out培养基上培养2天,然后通过用2%半乳糖取代葡萄糖诱导蛋白表达并在YEP(1%酵母提取物;2%蛋白胨)培养基上进一步培养24-48小时。
使用酸洗过的玻璃珠和进行强烈震荡,然后离心来提取酵母细胞中的蛋白,用Western印迹杂交检测DHBV L和S蛋白的表达。如实施例5中所描述,用抗S单克隆抗体进行Western印迹杂交来分析上清液。选择最大量地表达L和S蛋白的转化体(DL/S)并作为甘油贮藏物贮存。
为分析DHBV VLP产量:提取50ml DL/S酵母培养物并将上清液加载至70%蔗糖缓冲垫上的20%蔗糖中并在38,000rpm下在SW41转子(Beckman)中离心3小时。然后将在20-70%界面的部分加载至20-70%蔗糖分级梯度中并在38,000rpm(Grgacic和Schaller,J.Virol.74:5116,2000)下离心5小时。从梯度的底部收集级分并通过Western印迹杂交进行分析。来源于血清的DHBV亚病毒颗粒沉降在大约30%蔗糖中(峰级分7和8)来源于酵母的DHBV VLPs类似地显示大部分沉降在30%蔗糖(参见图7A)。
通过Monash Micro Imaging Facility对来源于酵母的颗粒进行透射电子显微镜观察。用于TEM的颗粒是用蔗糖梯度纯化的并在醋酸铀进行负染之前通过使用Vivaspin 20脱盐和浓缩设备(Vivascience)用磷酸缓冲盐溶液进一步置换缓冲液。来源于血清的DHBV亚病毒颗粒和来源于酵母的DL/S颗粒的比较显示类似的颗粒形态学和大小(大约40-60nm)。
对pYES-DL构建体进行改变,以包括跨膜结构域1中的缺失和在跨膜结构域1中的缺失存在和不存在的情况下加入前催乳激素信号序列。通过使用相同的限制性酶切位点将含有TM1缺失区域的pMDLΔTM1的Aat II/Bst EII片段亚克隆入pYES-DL中以构建pYES-DLΔTM1。通过使用相同的限制性酶切位点将含有信号序列的PPL-L的Sac1/Bst EII片段亚克隆入pYES-DL中以构建pYES-SigL。通过使用相同的限制性酶切位点将含TM1缺失区域的pMDLΔTM1的Aat II/BST Eii片段亚克隆入pYES-SigL中以构建pYESSigLΔTM1。如上所述在酵母中进行VLP生产和分析。DLΔTM1/S、SigL/S和SigLΔTM1/S VLPs在蔗糖分级梯度中显示具有与DL/S颗粒相同的沉降特征。
实施例13
在啤酒糖酵母中生产嵌合DHBV VLPs
pYES-DL-E2.465和pYES-DLΔTM1-E2.465是通过将包含来自pMDLΔTM1-E2.465的AatII/Xmal片段(对于前者)和AatII/Bst EII片段(对于后者)中的序列的E2亚克隆入pYES-DL上的相同位置进行构建的。如实施例11中所描述的,用pYES-DL-E2.465和pMB-DS或pYES-DLΔTM1-E2.465和pMB-DS共转化INVSc-1细胞以在酵母中分析和生产嵌合颗粒。DLΔTM1-E2.465VLPs显示在蔗糖分级梯度中具有与DL/S颗粒相同的沉降特性(参见图7B)和在TEM下具有与DL/S颗粒相似的形态学。
通过使用针对HBVpreS起始位点(nt 4138)的上游序列(始于nt 4091)和包含Sac 1限制性酶切位点的引物和覆盖DHBV序列中的1910核苷酸并包含Eco R1限制性位点的反向引物进行PCR来构建pYES-DLΔTM1-HpreS。将所述PCR产物降解并插入PYES载体的多克隆位点上的Sac 1和EcoR1位点。如实施例11中所述,在酵母中进行嵌合颗粒的生产和分析。DLΔTM1-HpreS VLPs显示在蔗糖分级梯度中具有与DL/S颗粒相同的沉降特性(参见图7C)和在TEM下具有与DL/S颗粒相似的形态学。
实施例14
分析产生于酵母的DHBV VLPs的免疫原性
将DL/S VLPs用于免疫大鼠。DL/S VLPs生产:提取100ml DL/S酵母培养物,将上清液放入两份70%蔗糖缓冲垫上的20%蔗糖中并于SW41转子(Beckman)中在38,000rpm下离心3小时。通过SDS-PAGE和通过对标准蛋白进行Coomassie Brilliant Blue蛋白染色来检查沉淀的VLPs部分以估计VLP蛋白的量。将总共200μl含大约10μg剂量的DL/S通过肌内注射入大鼠。将大鼠分成三组,每组6只大鼠,各组在不加入佐剂或加入明矾或Titremax的情况下接受DL/S VLPs。在进行免疫接种和随后的免疫增强后第三周对大鼠进行放血。通过DHBV L/S的Western印迹杂交对大鼠血清的分析显示在佐剂不存在的情况下对DHBV L蛋白具有很强和快速的免疫反应性,而对DHBV S蛋白具有极小或没有反应(参见图8)。
本领域技术人员认识到此处描述的发明除了已专门描述过的变化和修饰外还可能有其它的变化和修饰。应当理解本发明包括所有这样的变化和修饰。本发明也包括所有在本说明中单个地或集体地涉及或指出的步骤、特征、组合物和化合物,以及由任何两个或多个所述步骤或特征的任意和全部组合。
参考文献:
Altschul et al,Nucleic Acid Research,25:3389-3402,1997.
Ausbel et al,Eds short protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,5th Edition,2002.
Bandyopadhyay and Temin,Mol.Cell.Biol.4:749-754,1984.
Berglund et al,Biotechnologyll:916-920,1993.
Berkner et al.,Bio Techniques 6:616-629,1988.
Berkner,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:39-66,1992.
Bisht,H.,D.A.Chugh,M.Raje,S.Swaminathan,and N.Khanna.J.Biotechnology.99:97-110,2002.
Bonner et al,Functional organisation of the mammalian genome CSHSQB,38:308-10,1974.
Breakefield and Geller,Mol.Neurobiol.1:339-371,1987.
Bruss,V.,and D.Ganem.J.Virol.65:3813-3820,1991.
Bruss et al,EMBO J.,13:2273-2279,1994.
Buchschacher and Panganiban,J.Virol.66:273l-2739,1982.
Delpeyroux,F.,N.Chenciner,A.Lim,M.Lambert,Y.Malpiece,and R.E.Streek.J.Mol.Biol.195:343-350,1987.
Fink et al.,Ann.Rev.Neurosci 19:265-287,1996.
Fink et al.,Hum.Gene Ther.3:1l-19,1992.
Frazer,I.Virus Research.89:271-274,2002.
Freese et al.,Biochem.Pharmacol.40:2189-2199,1990.
Gazina et al,Virology 242:266,1998.
Gorziglia and Kapikian,J.Virol.66:4407-4412,1992.
Grgacic et al,J.Gen.Virol.79:2743,1998.
Grgacic,J.Gen.Virol.83:1635,2002.
Grgacic and Schaller,J.Virol.,74:5116,2000.
Helseth et al.,J.Virol.64:2416-2420,1990.
Ho et al,Gene,77:51,1989.
Johnson et al.,J.Virol.66:2952-2965,1992.
Klingmuller,U.,and H.Schaller.J.Virol.67:7414-7422,1993.
Krueger,D.H.,R.Ulrich,and W.H.Gerlich.Biol.Chem.380:275-276,1998.
Lenhoff,R.,and J.Summers.J.Virol.68:4565-4571,1994.
Madzak et al.,J.Gen.Virol.73:1533-1536,1992.
Mann and Baltimore,J.Virol.54:401-407,1985.
Margolskee,Curr.Top.,Microbiol.Immunol.158:67-95,1992.
Miller et al,J.Virol.62:4337-4345,1988.
Miller et al.,Mol.Cell.Biol.5:431-437,1985.
Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:1-24,1992.
Moss,Curt.Top.Microbiol.Immunol.158:25-38,1992.
Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11341-11348,1996.
Muzyczka,Curr.Top.Microbiol Immunol.158:97-129,1992.
Naldini et al.,Science 272:263-267,1996.
Nassal,M.Curr.Top.Microbiol.Immunol. 214:297-337,1996.
Netter,H.J.,T.B.MacNaughton,W.-P.Woo,R.Tindle,and E.J.Gowans.J.Virol.75:2130-2141,2001.
Ohi et al.,Gene 89:279-282,1990.
Page et al.,J.Virol.64:5270-5276,1990.
Petropoulos et al.,J.Viol.66:3391-3397,1992.
Pugh et al,J.Virol.69:4814,1995.
Prange,R.,M.Werr,M.Birkner,R.Hilfrich,and R.E.Streeck.J.Gen.Virol.76:2131-2140,1995.
Prange and Streeck,EMBO J.14:247,1995.
Quantin et al,Proc Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584,1992.
Rosenfeld et al.,Cell 68:143-155,1992.
Russell and Hirata,Nature Genetics 18:323-328,1998.
Sambrook et al.″Molecular Cloning:A Laboratory Manual″Cold Spring HarborLaboratory,3rd Edition,2001.
Schneider et al.,Nature Genetics 18:180-183,1998.
Shimada et al.,J.Clin.Invest.88:1043-1047,1991.
Sorge et al.,Mol.Cell.Biol.4:1730-1737,1984.
Sprengel et al.,J.Med.Virol.,15:323,1985.
Stratford-Perricaudet et al.,Hum.Gene Ther.1:241-256,1990.
Swaymeye and Schaller,J.Virol.l.71:9434,1997.
Triyatni et al,J.Gen.Virol,82:373-378,2001.
Wilkinson et al.,Nucleic Acids Res.20:2233-2239,1992.
序列表
<110>Hepgenics Pty Ltd
<120>表达病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合体的病毒载体
<130>12437050/EJH
<150>AU 2003901876
<151>2003-04-17
<160>13
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>鸭
<400>1
gggcaacatc cagcaaaatc aatgg 25
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>2
gctgcggaat ggctaaaagg gcccccgacc 30
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人
<400>3
ccaacactag atcacgaaac ccacgtcacc gggg 34
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人
<400>4
ggttgtgatc tagtgctttg ggtgcagtgg cccc 34
<210>5
<211>3021
<212>DNA
<213>鸭
<400>5
catgctcatt tgaaagctta tgcaaaaatt aacgaggaat cactggatag ggctaggaga 60
ttgctttggt ggcattacaa ctgtttactg tggggagaag ctcaagttac taactatatt 120
tctcgtttgc gtacttggtt gtcaactcct gagaaatata gaggtagaga tgccccgacc 180
attgaagcaa tcactagacc aatccaggtg gctcagggag gcagaaaaac aactacgggt 240
actagaaaac ctcgtggact cgaacctaga agaagaaaag ttaaaaccac agttgtctat 300
gggagaagac gttcaaagtc ccgggaaagg agagccccta caccccaacg tgcgggctcc 360
cctctcccac gtagttcgag cagccaccat agatctccct cgcctaggaa ataaattacc 420
tgctaggcat cacttaggta aattgtcagg actatatcaa atgaagggct gtacttttaa 480
cccagaatgg aaagtaccag atatttcgga tactcatttt aatttagatg tagttaatga 540
gtgcccttcc cgaaattgga aatatttgac tccagccaaa ttctggccca agagcatttc 600
ctactttcct gtccaggtag gggttaaacc aaagtatcct gacaatgtga tgcaacatga 660
atcaatagta ggtaaatatt taaccaggct ctatgaagca ggaatccttt ataagcggat 720
atctaaacat ttggtcacat ttaaaggtca gccttataat tgggaacagc aacaccttgt 780
caatcaacat cacatttatg atggggcaac atccagcaaa atcaatggac gtcagacgga 840
tagaaggagg agaaatactg ttaaaccaac ttgccggaag gatgatccca aaagggactt 900
tgacatggtc aggcaagttt ccaacactag atcacgtgtt agaccatgtg caaacaatgg 960
aggagataaa caccctccag aatcagggag cttggcctgc tggggcggga aggagagtag 1020
gattatcaaa tccgactcct caagagattc ctcagcccca gtggactccc gaggaagacc 1080
aaaaagcacg cgaagctttt cgccgttatc aagaagaaag accaccggaa accaccacca 1140
ttcctccgtc ttcccctcct cagtggaagc tacaacccgg ggacgatcca ctcctgggaa 1200
atcagtctct cctcgagact catccgctat accagtcaga accagcggtg ccagtgataa 1260
aaactccccc cttgaagaag aaaatgtctg gtaccttcgg gggaatacta gctggcctaa 1320
tcggattact ggtaagcttt ttcttgttga taaaaattct agaaatactg aggaggctag 1380
attggtggtg gatttctctc agttctccaa agggaaaaat gcaatgcgct ttccaagata 1440
ctggagccca aatctctcca cattacgtag gatcttgccc gtggggatgc ccaggatttc 1500
tttggaccta tctcaggctt tttatcatct tcctcttaat cctgctagta gcagcaggct 1560
tgctgtatct gacggacaac gggtctacta ttttaggaaa gctccaatgg gcgtcggtct 1620
cagccctttt ctcctccatc tcttcactac tgccctcgga tccgaaatct ctcgtcgctt 1680
taacgtttgg actttcactt atatggatga cttcctcctc tgccacccaa acgctcgtca 1740
ccttaacgca attagccacg ctgtctgctc ttttttacaa gagttaggaa taagaataaa 1800
ctttgacaaa accacgcctt ctccggtgaa tgaaataaga ttcctcggtt accagattga 1860
tgaaaatttc atgaagattg aagaaagcag atggaaagaa ttaaggactg taatcaagaa 1920
aataaaagta ggagaatggt atgactggaa atgtattcaa agatttgtgg ggcatttgaa 1980
ttttgttttg ccttttacta aaggtaatat tgaaatgtta aaaccaatgt atgctgctat 2040
tactaaccaa gtaaacttta gcttctcttc atcctatagg actttgttat ataaactaac 2100
aatgggtgtg tgtaaattaa gaataaagcc aaagtcctct gtacctttgc cacgtgtagc 2160
tacagatgct accccaacac atggcgcaat atcccatatc accggcggga gcgcagtgtt 2220
tgctttttca aaggtcagag atatacatgt tcaggaacta ttgatgtctt gtttagccaa 2280
gataatgatt aaaccacgtt gtctcttatc tgattcaact tttgtttgcc ataagcgtta 2340
tcagacgtta ccatggcatt ttgctatgtt ggccaaacaa ttgctcaaac cgatacaatt 2400
gtactttgtc ccgagcaaat ataatcctgc tgacggccca tccaggcaca aacctcctga 2460
ttggacggct tttccataca cccctctctc gaaagcaata tatattccac ataggctatg 2520
tggaacttaa gaattacacc cctctccttc ggagctgctt gccaaggtat ctttacgtct 2580
acattgctgt tgtcgtgtgt gactgtacct ttggtatgta ccattgttta tgattcttgc 2640
ttatatatgg atatcaatgc ttctagagcc ttagccaatg tgtatgatct accagatgat 2700
ttctttccaa aaatagatga tcttgttaga gatgctaaag acgctttaga gccttattgg 2760
aaatcagatt caataaagaa acatgttttg attgcaactc actttgtgga tctcattgaa 2820
gacttctggc agactacaca gggcatgcat gaaatagccg aatcattaag agctgttata 2880
cctcccacta ctactcctgt tccaccgggt tatcttattc agcacgagga agctgaagag 2940
atacctttgg gagatttatt taaacaccaa gaagaaagga tagtaagttt ccaacccgac 3000
tatccgatta cggctagaat t 3021
<210>6
<211>984
<212>DNA
<213>鸭
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(984)
<400>6
atg ggg caa cat cca gca aaa tca atg gac gtc aga cgg ata gaa gga 48
Met Gly Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly
1 5 10 15
gga gaa ata ctg tta aac caa ctt gcc gga agg atg atc cca aaa ggg 96
Gly Glu Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly
20 25 30
act ttg aca tgg tca ggc aag ttt cca aca cta gat cac gtg tta gac 144
Thr Leu Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp
35 40 45
cat gtg caa aca atg gag gag ata aac acc ctc cag aat cag gga gct 192
His Val Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala
50 55 60
tgg cct gct ggg gcg gga agg aga gta gga tta tca aat ccg act cct 240
Trp Pro Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro
65 70 75 80
caa gag att cct cag ccc cag tgg act ccc gag gaa gac caa aaa gca 288
Gln Glu Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala
85 90 95
cgc gaa gct ttt cgc cgt tat caa gaa gaa aga cca ccg gaa acc acc 336
Arg Glu Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr
100 105 110
acc att cct ccg tct tcc cct cct cag tgg aag cta caa ccc ggg gac 384
Thr Ile Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp
115 120 125
gat cca ctc ctg gga aat cag tct ctc ctc gag act cat ccg cta tac 432
Asp Pro Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr
130 135 140
cag tca gaa cca gcg gtg cca gtg ata aaa act ccc ccc ttg aag aag 480
Gln Ser Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys
145 150 155 160
aaa atg tct ggt acc ttc ggg gga ata cta gct ggc cta atc gga tta 528
Lys Met Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu
165 170 175
ctg gta agc ttt ttc ttg ttg ata aaa att cta gaa ata ctg agg agg 576
Leu Val Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg
180 185 190
cta gat tgg tgg tgg att tct ctc agt tct cca aag gga aaa atg caa 624
Leu Asp Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln
195 200 205
tgc gct ttc caa gat act gga gcc caa atc tct cca cat tac gta gga 672
Cys Ala Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly
210 215 220
tct tgc ccg tgg gga tgc cca gga ttt ctt tgg acc tat ctc agg ctt 720
Ser Cys Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu
225 230 235 240
ttt atc atc ttc ctc tta atc ctg cta gta gca gca ggc ttg ctg tat 768
Phe Ile Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr
245 250 255
ctg acg gac aac ggg tct act att tta gga aag ctc caa tgg gcg tcg 816
Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser
260 265 270
gtc tca gcc ctt ttc tcc tcc atc tct tca cta ctg ccc tcg gat ccg 864
Val Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro
275 280 285
aaa tct ctc gtc gct tta acg ttt gga ctt tca ctt ata tgg atg act 912
Lys Ser Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr
290 295 300
tcc tcc tct gcc acc caa acg ctc gtc acc tta acg caa tta gcc acg 960
Ser Ser Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr
305 310 315 320
ctg tct gct ctt ttt tac aag agt 984
Leu Ser Ala Leu Phe Tyr Lys Ser
325
<210>7
<211>328
<212>PRT
<213>鸭
<400>7
Met Gly Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly
1 5 10 15
Gly Glu Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly
20 25 30
Thr Leu Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp
35 40 45
His Val Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala
50 55 60
Trp Pro Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro
65 70 75 80
Gln Glu Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala
85 90 95
Arg Glu Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr
100 105 110
Thr Ile Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp
115 120 125
Asp Pro Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr
130 135 140
Gln Ser Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Met Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu
165 170 175
Leu Val Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg
180 185 190
Leu Asp Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln
195 200 205
Cys Ala Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly
210 215 220
Ser Cys Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu
225 230 235 240
Phe Ile Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr
245 250 255
Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser
260 265 270
Val Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro
275 280 285
Lys Ser Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr
290 295 300
Ser Ser Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr
305 310 315 320
Leu Ser Ala Leu Phe Tyr Lys Ser
325
<210>8
<211>501
<212>DNA
<213>鸭
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(501)
<400>8
atg tct ggt acc ttc ggg gga ata cta gct ggc cta atc gga tta ctg 48
Met Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Leu
1 5 10 15
gta agc ttt ttc ttg ttg ata aaa att cta gaa ata ctg agg agg cta 96
Val Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Leu
20 25 30
gat tgg tgg tgg att tct ctc agt tct cca aag gga aaa atg caa tgc 144
Asp Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln Cys
35 40 45
gct ttc caa gat act gga gcc caa atc tct cca cat tac gta gga tct 192
Ala Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly Ser
50 55 60
tgc ccg tgg gga tgc cca gga ttt ctt tgg acc tat ctc agg ctt ttt 240
Cys Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu Phe
65 70 75 80
atc atc ttc ctc tta atc ctg cta gta gca gca ggc ttg ctg tat ctg 288
Ile Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr Leu
85 90 95
acg gac aac ggg tct act att tta gga aag ctc caa tgg gcg tcg gtc 336
Thr Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser Val
100 105 110
tca gcc ctt ttc tcc tcc atc tct tca cta ctg ccc tcg gat ccg aaa 384
Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro Lys
115 120 125
tct ctc gtc gct tta acg ttt gga ctt tca ctt ata tgg atg act tcc 432
Ser Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr Ser
130 135 140
tcc tct gcc acc caa acg ctc gtc acc tta acg caa tta gcc acg ctg 480
Ser Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr Leu
145 150 155 160
tct gct ctt ttt tac aag agt 501
Ser Ala Leu Phe Tyr Lys Ser
165
<210>9
<211>167
<212>PRT
<213>鸭
<400>9
Met Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Leu
20 25 30
Asp Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln Cys
35 40 45
Ala Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly Ser
50 55 60
Cys Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr Leu
85 90 95
Thr Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser Val
100 105 110
Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro Lys
115 120 125
Ser Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr Ser
130 135 140
Ser Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr Leu
145 150 155 160
Ser Ala Leu Phe Tyr Lys Ser
165
<210>10
<211>483
<212>DNA
<213>鸭
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(483)
<400>10
atg ggg caa cat cca gca aaa tca atg gac gtc aga cgg ata gaa gga 48
Met Gly Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly
1 5 10 15
gga gaa ata ctg tta aac caa ctt gcc gga agg atg atc cca aaa ggg 96
Gly Glu Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly
20 25 30
act ttg aca tgg tca ggc aag ttt cca aca cta gat cac gtg tta gac 144
Thr Leu Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp
35 40 45
cat gtg caa aca atg gag gag ata aac acc ctc cag aat cag gga gct 192
His Val Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala
50 55 60
tgg cct gct ggg gcg gga agg aga gta gga tta tca aat ccg act cct 240
Trp Pro Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro
65 70 75 80
caa gag att cct cag ccc cag tgg act ccc gag gaa gac caa aaa gca 288
Gln Glu Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala
85 90 95
cgc gaa gct ttt cgc cgt tat caa gaa gaa aga cca ccg gaa acc acc 336
Arg Glu Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr
100 105 110
acc att cct ccg tct tcc cct cct cag tgg aag cta caa ccc ggg gac 384
Thr Ile Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp
115 120 125
gat cca ctc ctg gga aat cag tct ctc ctc gag act cat ccg cta tac 432
Asp Pro Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr
130 135 140
cag tca gaa cca gcg gtg cca gtg ata aaa act ccc ccc ttg aag aag 480
Gln Ser Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys
145 150 155 160
aaa 483
Lys
<210>11
<211>161
<212>PRT
<213>鸭
<400>11
Met Gly Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly
1 5 10 15
Gly Glu Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly
20 25 30
Thr Leu Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp
35 40 45
His Val Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala
50 55 60
Trp Pro Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro
65 70 75 80
Gln Glu Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala
85 90 95
Arg Glu Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr
100 105 110
Thr Ile Pro Pro Ser Ser Pro Pro Gln Trp Lys Leu Gln Pro Gly Asp
115 120 125
Asp Pro Leu Leu Gly Asn Gln Ser Leu Leu Glu Thr His Pro Leu Tyr
130 135 140
Gln Ser Glu Pro Ala Val Pro Val Ile Lys Thr Pro Pro Leu Lys Lys
145 150 155 160
Lys
<210>12
<211>501
<212>DNA
<213>鸭
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(501)
<400>12
atg tct ggt acc ttc ggg gga ata cta gct ggc cta atc gga tta ctg 48
Met Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Leu
1 5 10 15
gta agc ttt ttc ttg ttg ata aaa att cta gaa ata ctg agg agg cta 96
Val Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Leu
20 25 30
gat tgg tgg tgg att tct ctc agt tct cca aag gga aaa atg caa tgc 144
Asp Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln Cys
35 40 45
gct ttc caa gat act gga gcc caa atc tct cca cat tac gta gga tct 192
Ala Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly Ser
50 55 60
tgc ccg tgg gga tgc cca gga ttt ctt tgg acc tat ctc agg ctt ttt 240
Cys Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu Phe
65 70 75 80
atc atc ttc ctc tta atc ctg cta gta gca gca ggc ttg ctg tat ctg 288
Ile Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr Leu
85 90 95
acg gac aac ggg tct act att tta gga aag ctc caa tgg gcg tcg gtc 336
Thr Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser Val
100 105 110
tca gcc ctt ttc tcc tcc atc tct tca cta ctg ccc tcg gat ccg aaa 384
Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro Lys
115 120 125
tct ctc gtc gct tta acg ttt gga ctt tca ctt ata tgg atg act tcc 432
Ser Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr Ser
130 135 140
tcc tct gcc acc caa acg ctc gtc acc tta acg caa tta gcc acg ctg 480
Ser Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr Leu
145 150 155 160
tct gct ctt ttt tac aag agt 501
Ser Ala Leu Phe Tyr Lys Ser
165
<210>13
<211>167
<212>PRT
<213>鸭
<400>13
Met Ser Gly Thr Phe Gly Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Gly Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Phe Phe Leu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Leu
20 25 30
Asp Trp Trp Trp Ile Ser Leu Ser Ser Pro Lys Gly Lys Met Gln Cys
35 40 45
Ala Phe Gln Asp Thr Gly Ala Gln Ile Ser Pro His Tyr Val Gly Ser
50 55 60
Cys Pro Trp Gly Cys Pro Gly Phe Leu Trp Thr Tyr Leu Arg Leu Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Leu Ile Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Tyr Leu
85 90 95
Thr Asp Asn Gly Ser Thr Ile Leu Gly Lys Leu Gln Trp Ala Ser Val
100 105 110
Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Pro Ser Asp Pro Lys
115 120 125
Ser Leu Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Ser Leu Ile Trp Met Thr Ser
130 135 140
Ser Ser Ala Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu Thr Gln Leu Ala Thr Leu
145 150 155 160
Ser Ala Leu Phe Tyr Lys Ser
165
Claims (46)
1.病毒样颗粒(VLP),其包含含有目的多肽(POI)和至少大包膜多肽(L)的颗粒结合部分的融合多肽。
2.病毒样颗粒(VLP),其包含i)含有目的多肽(POI)和大包膜多肽(L)的颗粒结合部分的融合多肽和ii)小包膜(S)多肽。
3.权利要求1或2的VLP,所述VLP包含含有目的多肽(POI)和禽类嗜肝DNA病毒例如鸭B型肝炎病毒(DHBV)的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽。
4.权利要求2或3的VLP,所述VLP包含i)含有目的多肽(POI)和禽类嗜肝DNA病毒例如鸭B型肝炎病毒(DHBV)的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽和ii)禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
5.权利要求1或2的VLP,其中所述L的颗粒结合部分至少包括L的S结构域或除去TM1结构域的L的S结构域或其功能性衍生物或同源物。
6.权利要求1或2的VLP,其中所述POI位于L的pre-S结构域或位于L的S结构域、或除去TM1结构域的L的S结构域的氨基末端。
7.权利要求1或2的VLP,其中所述L多肽包含基本上如SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或其功能性衍生物,或包含具有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9至少50%相似性的氨基酸序列。
8.权利要求1或2的VLP,其中所述L多肽的颗粒结合部分包含基本上如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或包含具有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9至少50%相似性的氨基酸序列的其功能性衍生物。
9.权利要求1或2的VLP,其中所述L多肽的颗粒结合部分包含或基本由SEQ ID NO:9的氨基酸24至107或与其具有至少50%相似性的氨基酸序列构成。
10.权利要求1-9任一项的VLP,其中所述L多肽是DHBV L多肽或其功能性衍生物。
11.权利要求1或2的VLP,其中所述L多肽或其颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列序列或与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有至少大约50%相似性的核苷酸序列或在中等严紧杂交条件下能与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的互补形式杂交的连续核苷酸序列编码。
12.权利要求1或2的VLP,其中所述L多肽进一步包含信号序列。
13.用于VLP装配的分离或重组的多肽,其包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物。
14.当在细胞中表达时能够装配入VLP的重组多肽,其包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物。
15.权利要求13或14的多肽,其中所述L的颗粒结合部分至少包含L的S结构域或除去TM1结构域的L的S结构域或其功能性衍生物。
16.权利要求13或14的多肽,其中所述POI位于L的pre-S结构域或位于L的S结构域、或除去TM1结构域的L的S结构域的氨基末端。
17.权利要求13或14的重组或分离多肽,其中所述L多肽包含基本上如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或其功能性衍生物或包含具有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9至少50%相似性的氨基酸序列。
18.权利要求13或14的重组或分离多肽,其中所述L多肽的颗粒结合部分由基本上如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少50%相似性的氨基酸序列的其功能性衍生物构成。
19.权利要求13或14的重组或分离多肽,其中所述L多肽的颗粒结合部分包含或基本由SEQ ID NO:9的氨基酸24至107或与其具有至少50%相似性的氨基酸序列构成。
20.权利要求13或14的重组或分离多肽,其中所述L多肽或其颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的核苷酸序列或具有与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8至少大约50%相似性的核苷酸序列或在中等严紧杂交条件下能与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的互补形式杂交的连续核苷酸序列编码。
21.权利要求13或14的重组或分离多肽,其中所述L多肽进一步包含信号序列。
22.权利要求13或14的重组或分离多肽,其中所述L多肽是DHBV L多肽或其功能性衍生物。
23.用于制备VLP的重组核酸分子,所述核酸分子包含编码目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的连续核苷酸序列。
24.用于制备VLP的重组核酸分子,所述核酸分子包含编码i)包含目的多肽(POI)和至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽,和ii)禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物的连续核苷酸序列。
25.权利要求23或24的核酸分子,其中所述L的颗粒结合部分至少包括L的S结构域或除去TM1的L的S结构域或其功能性衍生物。
26.权利要求23或24的核酸分子,其中所述POI位于L的pre-S结构域或位于L的S结构域、或除去TM1结构域的L的S结构域的氨基末端。
27.权利要求23或24的核酸分子,所述核酸分子编码包含基本上如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或包含具有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9至少50%相似性的氨基酸序列的L多肽。
28.权利要求27的核酸分子,所述核酸分子编码基本由SEQ IDNO:9的氨基酸24至107或与SEQ ID NO:9具有至少50%相似性的氨基酸序列构成的L多肽的颗粒结合部分。
29.权利要求23或24的核酸分子,其中所述L多肽或其颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的核苷酸序列或具有与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8至少大约50%相似性的核苷酸序列或在中等严紧杂交条件下能与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的互补形式杂交的连续核苷酸序列编码。
30.权利要求23或24的核酸分子,其中所述L多肽进一步包含信号序列。
31.权利要求23或24的核酸分子,其中所述L多肽是DHBV L多肽或其功能性衍生物。
32.用于制备VLP的重组核酸分子,所述核酸分子编码禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物,并包含一个或多个适合用于接受编码目的多肽(POI)的核酸分子的克隆位点,其中所述POI与所述L多肽一起表达。
33.用于制备VLP的重组核酸分子,所述核酸分子编码至少禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物,和ii)禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物,并包含一个或多个适合用于接受编码目的多肽(POI)的核酸分子的克隆位点,其中所述POI与所述L多肽一起表达。
34.权利要求32或33的核酸分子,其中所述L的颗粒结合部分至少包含L的S结构域或除去TM1结构域的L的S结构域或其功能性衍生物。
35.权利要求32或33的核酸分子,其中所述POI位于L的pre-S结构域或位于L的S结构域、或除去TM1结构域的L的S结构域的氨基末端。
36.权利要求32或33的核酸分子,所述核酸分子编码包含基本上如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所列的氨基酸序列或包含具有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9至少50%相似性的氨基酸序列的L多肽。
37.权利要求36的核酸分子,所述核酸分子编码基本由SEQ IDNO:9的氨基酸24至107或具有与SEQ ID NO:9至少50%相似性的氨基酸序列构成的L多肽的颗粒结合部分。
38.权利要求32或33的核酸分子,其中所述L多肽或其颗粒结合部分由基本如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列的核苷酸序列或具有与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8至少大约50%相似性的核苷酸序列或在中等严紧杂交条件下能与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的互补形式杂交的连续核苷酸序列编码。
39.权利要求32或33的核酸分子,其中所述L多肽进一步包含信号序列。
40.权利要求32或33的核酸分子,其中所述L多肽是DHBV L多肽或其功能性衍生物。
41.分离的和/或重组的细胞,所述细胞包含权利要求23至31中任一项的核酸分子或表达权利要求13至22中任一项的多肽或权利要求1至12中任一项的VLP。
42.权利要求41的细胞,其中所述细胞是真核细胞,优选地是酵母、禽类或哺乳动物的细胞。
43.递送POI至受试者或细胞的方法,其包括在含有来自禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽或其功能性衍生物或同源物的VLP中表达所述POI,以使至少部分POI在VLP的表面表达,并给受试者或细胞施用所述VLP。
44.权利要求43的方法,其中在体外表达系统例如酵母、禽类或哺乳动物表达系统中制备所述VLP。
45.权利要求43的方法,其中,在施用权利要求23至31中任一项的核酸分子后在受试者的细胞中体内制备所述VLP。
46.用于制备重组VLP的方法,所述方法包括:
i)将编码目的多肽的核酸分子克隆入包含禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的颗粒结合部分或其功能性衍生物或同源物的表达载体中;
ii)将步骤i)的重组表达载体导入合适的细胞中和培养在允许蛋白表达和用禽类嗜肝DNA病毒例如DHBV的S多肽或其功能性衍生物或同源物装配颗粒的条件下;和
iii)从所述细胞中回收所述病毒样颗粒。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2003901876 | 2003-04-17 | ||
AU2003901876A AU2003901876A0 (en) | 2003-04-17 | 2003-04-17 | Viral vector |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1791675A true CN1791675A (zh) | 2006-06-21 |
Family
ID=31500913
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2004800137297A Pending CN1791675A (zh) | 2003-04-17 | 2004-04-16 | 表达病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合体的病毒载体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7678374B2 (zh) |
EP (1) | EP1620558B1 (zh) |
CN (1) | CN1791675A (zh) |
AU (1) | AU2003901876A0 (zh) |
WO (1) | WO2004092387A1 (zh) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102414313A (zh) * | 2009-05-01 | 2012-04-11 | 雷德生物科技股份公司 | 多基因载体编码的重组病毒样颗粒 |
CN106132428A (zh) * | 2014-01-21 | 2016-11-16 | 阿尔伯特·爱因斯坦医学院股份有限公司 | 用于快速和全面t细胞免疫监测的细胞平台 |
CN110325202A (zh) * | 2016-10-31 | 2019-10-11 | 佐治亚州立大学研究基金会公司 | 乙型肝炎病毒pre-S蛋白的病毒样颗粒 |
CN110612118A (zh) * | 2017-06-05 | 2019-12-24 | 比科尔公司 | 用于引起针对hbv的免疫应答的病毒样粒子 |
US10927158B2 (en) | 2016-12-22 | 2021-02-23 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US10927161B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-02-23 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
US11226339B2 (en) | 2012-12-11 | 2022-01-18 | Albert Einstein College Of Medicine | Methods for high throughput receptor:ligand identification |
US11339201B2 (en) | 2016-05-18 | 2022-05-24 | Albert Einstein College Of Medicine | Variant PD-L1 polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of use thereof |
US11505591B2 (en) | 2016-05-18 | 2022-11-22 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11702461B2 (en) | 2018-01-09 | 2023-07-18 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides comprising reduced-affinity immunomodulatory polypeptides |
US11851471B2 (en) | 2017-01-09 | 2023-12-26 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11878062B2 (en) | 2020-05-12 | 2024-01-23 | Cue Biopharma, Inc. | Multimeric T-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030190740A1 (en) | 1998-10-13 | 2003-10-09 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use |
US20100120092A1 (en) * | 2006-08-30 | 2010-05-13 | Hepgenics Pty Ltd. | Recombinant proteins and virus like particles comprising l and s polypeptides of avian hepadnaviridae and methods, nucleic acid constructs, vectors and host cells for producing same |
US9005631B2 (en) * | 2008-08-04 | 2015-04-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Membrane proximal region of HIV gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AUPQ912000A0 (en) * | 2000-07-31 | 2000-08-24 | Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health, The | Improved virus like particles |
US8029803B2 (en) * | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
-
2003
- 2003-04-17 AU AU2003901876A patent/AU2003901876A0/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-04-16 EP EP04727789.2A patent/EP1620558B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-16 CN CNA2004800137297A patent/CN1791675A/zh active Pending
- 2004-04-16 WO PCT/AU2004/000511 patent/WO2004092387A1/en active Application Filing
- 2004-04-16 US US10/553,683 patent/US7678374B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102414313B (zh) * | 2009-05-01 | 2014-04-02 | 雷德生物科技股份公司 | 多基因载体编码的重组病毒样颗粒 |
CN102414313A (zh) * | 2009-05-01 | 2012-04-11 | 雷德生物科技股份公司 | 多基因载体编码的重组病毒样颗粒 |
US11226339B2 (en) | 2012-12-11 | 2022-01-18 | Albert Einstein College Of Medicine | Methods for high throughput receptor:ligand identification |
CN106132428A (zh) * | 2014-01-21 | 2016-11-16 | 阿尔伯特·爱因斯坦医学院股份有限公司 | 用于快速和全面t细胞免疫监测的细胞平台 |
CN106132428B (zh) * | 2014-01-21 | 2021-08-06 | 阿尔伯特爱因斯坦医学院 | 用于快速和全面t细胞免疫监测的细胞平台 |
US11505591B2 (en) | 2016-05-18 | 2022-11-22 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11339201B2 (en) | 2016-05-18 | 2022-05-24 | Albert Einstein College Of Medicine | Variant PD-L1 polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of use thereof |
CN110325202A (zh) * | 2016-10-31 | 2019-10-11 | 佐治亚州立大学研究基金会公司 | 乙型肝炎病毒pre-S蛋白的病毒样颗粒 |
CN110325202B (zh) * | 2016-10-31 | 2023-10-31 | 佐治亚州立大学研究基金会公司 | 乙型肝炎病毒pre-S蛋白的病毒样颗粒 |
US11851467B2 (en) | 2016-12-22 | 2023-12-26 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11739133B2 (en) | 2016-12-22 | 2023-08-29 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11987610B2 (en) | 2016-12-22 | 2024-05-21 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11370821B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-06-28 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11377478B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-07-05 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11401314B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-08-02 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11905320B2 (en) | 2016-12-22 | 2024-02-20 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11505588B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-11-22 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11117945B2 (en) | 2016-12-22 | 2021-09-14 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11530248B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-12-20 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US10927158B2 (en) | 2016-12-22 | 2021-02-23 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11708400B2 (en) | 2016-12-22 | 2023-07-25 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11851471B2 (en) | 2017-01-09 | 2023-12-26 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
US11767355B2 (en) | 2017-03-15 | 2023-09-26 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
US10927161B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-02-23 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
US11479595B2 (en) | 2017-03-15 | 2022-10-25 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
US11958893B2 (en) | 2017-03-15 | 2024-04-16 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
US11104712B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-08-31 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
US11993641B2 (en) | 2017-03-15 | 2024-05-28 | Cue Biopharma, Inc. | Methods for modulating an immune response |
CN110612118A (zh) * | 2017-06-05 | 2019-12-24 | 比科尔公司 | 用于引起针对hbv的免疫应答的病毒样粒子 |
CN110612118B (zh) * | 2017-06-05 | 2024-02-13 | 比科尔公司 | 用于引起针对hbv的免疫应答的病毒样粒子 |
US11702461B2 (en) | 2018-01-09 | 2023-07-18 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides comprising reduced-affinity immunomodulatory polypeptides |
US11878062B2 (en) | 2020-05-12 | 2024-01-23 | Cue Biopharma, Inc. | Multimeric T-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2004092387A1 (en) | 2004-10-28 |
EP1620558A4 (en) | 2007-05-02 |
AU2003901876A0 (en) | 2003-05-08 |
US20070099262A1 (en) | 2007-05-03 |
EP1620558B1 (en) | 2016-07-06 |
EP1620558A1 (en) | 2006-02-01 |
US7678374B2 (en) | 2010-03-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1205995C (zh) | 具有增强药物动力特性的杂合肽 | |
CN1193791C (zh) | 抗原的有序分子呈递,制备及使用的方法 | |
CN1791675A (zh) | 表达病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合体的病毒载体 | |
CN1913920A (zh) | 流感免疫原和疫苗 | |
CN101080239A (zh) | 作为慢性肝炎治疗性疫苗的稳定化HBc嵌合体颗粒 | |
CN1934131A (zh) | Hpv52 l1在酵母中的优化表达 | |
CN1119459A (zh) | 肿瘤疫苗的制备方法 | |
CN1252840A (zh) | 甲胎蛋白表达细胞的腺病毒载体及其使用方法 | |
CN101035897A (zh) | 用于预防和治疗hiv感染的疫苗 | |
CN1859923A (zh) | Hpv 45 l1在酵母中的优化表达 | |
CN1833022A (zh) | 包含HCV的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的组合物,包括相应核酸序列的表达载体及它们的治疗应用 | |
CN101039953A (zh) | 治疗和诊断剂 | |
CN1160465C (zh) | 其中areA、pepC和/或pepE基因已被灭活的真菌 | |
CN1639324A (zh) | 对核苷类似物具有改变的敏感性的病毒变体及其应用 | |
CN1351663A (zh) | 病毒变体 | |
CN1458936A (zh) | 来自Tat、Rev和Nef保守区的HIV肽以及它们作为例如疫苗组分的应用 | |
CN1934248A (zh) | Hbv变异体的检测和应用 | |
CN1632124A (zh) | 编码h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用 | |
CN1874787A (zh) | 预防/治疗hbv感染和hbv介导疾病的组合物 | |
CN1255540C (zh) | 一株疫苗诱导的乙型肝炎病毒株及其应用 | |
CN101039955A (zh) | 与sars冠状病毒刺突蛋白相关的核酸、多肽、表达方法和免疫原性组合物 | |
CN1570115A (zh) | 优化的sars冠状病毒刺突蛋白基因 | |
CN100344331C (zh) | 用于预防或治疗丙型肝炎的靶向小干扰rna制剂及其制备方法 | |
CN1268392C (zh) | 预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的重组蛋白疫苗及其用途 | |
CN1433430A (zh) | 肝炎病毒岗哨病毒ⅰ(svi) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20060621 |