CN1433430A - 肝炎病毒岗哨病毒ⅰ(svi) - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组新的称为SVI的病毒，提供分离的SVI病毒、来自SVI病毒的多核苷酸和蛋白、以及结合SVI病毒和SVI病毒蛋白的抗体。可以使用本发明的多核苷酸、蛋白以及抗体来检测SVI病毒或易感个体中SVI病毒的感染。另外，可以将本发明的多核苷酸插入到重组重组表达载体中以生产病毒蛋白。
Description
技术领域
本发明总的来说涉及肝炎病毒领域，更详细地说涉及一组新的肝炎病毒以及用于其检测与治疗的方法和组合物。
背景
严格定义的术语“肝炎”是指肝脏的炎症。各种各样的化学试剂、病毒因子以及生物学因子会诱发肝炎。然而，术语肝炎更通常指由病毒感染、尤其是嗜肝病毒感染引起的肝脏炎症。
可以将病毒性肝炎分成两大类别：急性的和慢性的。急性病毒性肝炎的特征在于黄疸、不适、恶心以及血液中肝酶升高。虽然病毒性肝炎的大多数病例自发地消除，但是，一部分急性肝炎受害者(一般约小于10％)形成暴发性坏死性肝炎，这是一种具有非常高的发病率与死亡率的疾病。有趣的是，许多急性肝炎病例是如此之轻微，以致于被忽略过去或将其作为“流感”消除。慢性肝炎引起更加重大的公共健康问题，且在美国是肝移植的最平常的原因。慢性肝炎的特征在于加重或“突发发作”，其症状类似急性肝炎的以及门静脉血压过高和导致肝衰竭的肝硬变(肝的瘢痕形成)。因为急性肝炎感染可以不引人注意地进行，所以许多慢性肝炎患者直到他们的疾病颇为发展后才被诊断出来；这样，则限制了治疗的。
有六个不同的病毒家族(family)叫做“肝炎病毒”(A、B、C、D、E和G，已发现F是人工产物)。在发达国家里，从公共卫生的观点来看，一般认为能建立慢性感染的那些肝炎病毒是最重要的病毒。在所述肝炎病毒中，只有乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是已知建立与慢性肝炎有关之慢性感染的已知肝炎病毒。然而，HBV和HCV不是造成所有输血性肝炎病例的原因。用术语“隐原性肝炎”和“非A-G”来表示不能归因于已知肝炎病毒的输血性肝炎。
先前称为“输血性肝炎”的乙型肝炎通过经皮途径、性途径、以及垂直途径传播。作为嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)一员的乙型肝炎病毒既可引起急性肝炎，又可引起慢性肝炎。已充分地鉴定了乙型肝炎病毒(HBV)的特征，且目前有各种各样的筛选和诊断分析。另外，在美国已构建了一种目前为大多数学龄儿童所需要的重组疫苗。
先前称为“非甲、非乙肝炎”的丙型肝炎主要通过经皮途径传播，尽管像HBV一样，性途径以及垂直途径也存在。仅有少数的急性丙型肝炎病毒(HCV)感染是临床上显而易见的；这是成问题的，因为这种病毒以非常高的比率建立慢性感染。在美国，这种配合使慢性HCV感染成为肝移植的主要原因。
用于所捐献血液的抗HBV和/或HCV抗体的检测筛选分析的出现，显著地减少了“输血性肝炎”的传播。然而，传染性血液捐赠的20-30％仍没有被检测出。相信不能检测出这些传染性样品主要是由于存在一种或更多种现在还没鉴定的肝炎病毒。
除了六种已知肝炎病毒外，新近也鉴定出了与肝炎有关的新病毒。由日本的一个研究小组最先鉴定出称为TTV的该病毒；他们用表现度差异分析(RAD)技术由该病毒鉴定出了基因组序列(Nishizawa等，1997，Biochem.Biophys.Res.Common，241(1)：92-97)。最初被认为是细小病毒科(parvoviridae)中一员的这种病毒是一种浮力密度大大低于细小病毒科之病毒的浮力密度的、相对小的病毒。已提出TTV为：由于病毒的环状单链DNA基因组而称为环病毒科(circinoviridae)的病毒科中与人相关的原型成员(Mushahwar等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(6)：3177-3182)。
近来，Diasorin，Inc.已宣布分离出了一种新的肝炎病毒。最初，在来自包括非甲/非戊或隐原性肝炎患者的肝炎患者的血液样品中，发现了称为SEN-V的该病毒。他们既没有公开SEN-V的多核苷酸序列，又没有公开分离SEN-V的方法。
因此，在本技术领域，不仅需要用于检测非甲/非庚肝炎的组合物和方法，而且需要用于预防非甲/非庚肝炎传染的组合物和方法。
发明概述
本发明提供：
1)包括分离的SVI病毒的组合物。分离的SVI病毒的实例包括：包含SEQ ID NO：1至EQ ID NO：5中的任一种的多核苷酸序列的分离的病毒。
2)分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：选择性地与SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：5中的任一种的核苷酸序列杂交的、分离的多核苷酸以及其互补物；编码一种分离的SVI蛋白或其片段的分离的多核苷酸及其互补物；其中，所述分离的多核苷酸与TTV毒株SANBAN和TUS01的基因组序列不同。所述分离的多核苷酸可以是一种反义多核苷酸。
3)包含一种分离的SVI蛋白或其片段的组合物；其中，所述分离的SVI蛋白或其片段在血清学上与TTV毒株SANBAN和TUS01的蛋白不同。
4)包含一种分离的SVI蛋白或其片段的疫苗组合物；其中所述分离的SVI蛋白或其片段在血清学上与TTV毒株SANBAN和TUS01的蛋白不同。所述疫苗组合物可包括一种药学可接受的赋形剂和/或一种佐剂。
5)包含一种编码一种SVI蛋白或其片段之分离的多核苷酸的表达载体；其中，所述的SVI蛋白或其片段在血清学上与TTV毒株SANBAN和TUS01的蛋白不同。
6)包含一种分离的多核苷酸的表达载体；其中，所述分离的多核苷酸的转录导致一种SVI反义多核苷酸的产生；其中所述SVI反义多核苷酸不是将与来自TTV毒株SANBAN和TUS01的RNA转录物形成双链体的反义多核苷酸。
7)与一种SVI病毒或其蛋白结合的分离的多克隆抗体和单克隆抗体，其中所述的抗体不与TTV毒株SANBAN和TUS01或其蛋白结合。
8)用于检测SVI病毒的方法，该方法包括使样品与一种与SVI病毒或其蛋白结合的抗体接触，其中所述的抗体不与TTV毒株SANBAN和TUS01或其蛋白结合；以及检测所述抗体与SVI病毒或其一种蛋白之复合物。
9)用于检测SVI病毒的方法，该方法包括使样品与一种选择性地同SVI多核苷酸杂交的探针多核苷酸接触，其中所述的探针不选择性地与TTV毒株SANBAN的多核苷酸或TTV毒株TUS01的多核苷酸杂交；以及检测所述探针与SVI多核苷酸杂交。
10)用于检测SVI病毒的方法，该方法包括使样品与一种选择性地和SVI多核苷酸杂交的第一引物多核苷酸及一种和SVI多核苷酸互补物杂交的第二引物多核苷酸相接触，从而进行引物延伸的DNA合成；以及检测所述合成产物。
附图简述
图1是用于克隆SVI核苷酸序列的步骤的图示叙述。
图2概括了对来自用人SVI阳性血清接种的黑猩猩X207之血清样品中的血清肝之酶以及SVI进行分析的结果。箭头显示接种的时间点。菱形表示ALT的水平，且正方形表示AST的水平。
图3概括了对来自一只用低滴度人SVI阳性血清接种的黑猩猩之血清中的SVI、以及对来自黑猩猩X207的SVI阳性血清接种的黑猩猩血清中的SVI进行分析的结果。箭头1显示用低滴度人阳性SVI血清的接种，且箭头2显示用来自黑猩猩X207之SVI阳性血清的接种。菱形表示原型SVI(HFV1)，且圆形表示SVI变异体。
发明的详细公开
我们发现并分离了与隐原性非甲-非庚肝炎有关的一种新的肝炎病毒，称之为岗哨病毒I(SVI)。原型病毒包括一个至少约2.6千碱基的单链DNA基因组。在SEQ ID NO：1中显示来自原型病毒的基因组序列。相应地，本发明提供分离的SVI。
我们也发现SVI易发生变异。因此，我们同样发现了具有趋异序列的SVI家族的成员。在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中显示了具有趋异序列的SVI家族成员的核苷酸序列。
SVI病毒的氨基酸序列和已知病毒序列的比较，揭示出与环病毒科的某些变异体的低水平的同源性。
在一个方面，本发明提供包含SVI病毒基因组及其片段的分离的多核苷酸。所述多核苷酸可以是DNA或RNA。也提供可供用于检测SVI感染和/或SVI病毒本身的分离的核苷酸探针或引物。同样可以将所述探针或引物用于鉴定与分离SVI新变异体的方法中。
本发明的另一方面提供不仅分离的SVI病毒蛋白和/或其片段，而且提供融合蛋白；所述融合蛋白包含与一种异源(非SVI)蛋白融合的SVI病毒蛋白或其片段。也包括至少包含两个SVI表位的嵌合多肽。在包含来自同一SVI蛋白的两个表位的本发明嵌合多肽中，在所述表位之间间插氨基酸基本上缺失，或用异源序列取代。另一方面，本发明嵌合多肽可包含来自不同SVI蛋白的两个表位，或包含来自至少两种SVI家族病毒的同源表位。
本发明提供重组表达构成物，所述构成物包含一种可操作地连接到在原核或真核宿主细胞中能启动之启动子上的来源于SVI病毒的可读框的多核苷酸序列。也提供包含所述表达构成物的表达载体及重组宿主细胞。
同样提供对SVI家族病毒之表位特异性的抗体。包括单克隆抗体和分离的多克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供用于为检测SVI感染和/或检测SVI病毒而进行分析的测定及用于进行测定的试剂盒。本发明的测定可以是使用本发明多肽或抗体的免疫测定，或是基于核酸的、用一种或更多种本发明多核苷酸而使用杂交或扩增技术的测定。
在另外一个方面，本发明提供用于预防和/或治疗SVI感染的疫苗。所述疫苗包括一种或更多种任选地与一种佐剂组合的、来源于SVI的多肽。一般性的技术
除非另有说明，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术；所述常规技术是在本领域技术范围内的。在下述文献中全面说明了这样的技术，所述文献例如《“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook等，1989)、“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑，1984)、“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编辑，1987)、“Methodsin Enzymology”(Academic Press，Inc.)、“Handbook of ExperimentalImmunology”(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)、“Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cell”(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)、“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等编辑，1987，和周期性更新材料)、“PCR：The Polymerase Chain Reaction”(Mullis等编辑，1994)、“Current Protocols in Immunology”(J.E Coligan等编辑，1991)以及“Immunochemistry in Practice”(Johnstone和Thorpe编辑，1996，Blackwell Science)。定义
术语“岗哨病毒I”和“SVI”是指在人类中可通过经皮肤暴露传播的且在血清学上与甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、庚型肝炎病毒(HGV)以及TTV变异体SANBAN和TUS01不同的病毒、病毒类型或病毒类别。SVI包括具有一个主要可读框(ORF)的基因组，所述可读框与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少大约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的总体氨基酸序列同源性，和/或与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸全序列同一性。另一方面，一种SVI变异体可以与SEQ ID NO：1的序列有至少大约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的总体核苷酸序列同一性，并编码一种ORF，该ORF与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的总体氨基酸序列同源性，和/或与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的总体氨基酸序列同一性。术语SVI也指原型SVI和天然出现的SVI变异体。
“SVI多肽”或“SVI蛋白”是由SVI病毒基因组的一种ORF编码的多肽或蛋白；该多肽或蛋白不是由一种已知病毒的ORF例如一种已知的环病毒科成员的ORF编码，所述环病毒科成员例如TTV变异体SANBAN和TUS01，它们的序列公众可由Genbank数据库得到，登记号分别为AB025946和AB017613。在显示于SEQ ID NO：6至SEQID NO：12中的氨基酸序列中显示了示范性的SVI多肽。SVI多肽最好是至少约8、10、12、15、20、25、30、40或50个氨基酸且少于约800、700、500、400、300、250、200、150、125或100个氨基酸。
“变异型SVI多肽”是这样一种多肽，所述多肽与SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：12中的任一相应氨基酸序列具有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同源性和/或与SEQ ID NO：6至SEQ IDNO：12中任一氨基酸序列的相应部分有至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。变异型SVI多肽最好是至少约8、10、12、15、20、25、30、40或50个氨基酸且少于约800、700、500、400、300、250、200、150、125或100个氨基酸。
“SVI多核苷酸”是一种与在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5的任一个中所示的的多核苷酸或其片段具有等同序列的多核苷酸或其互补物，或者是一种编码SVI多肽的多核苷酸或其互补物。在已知的任何序列中，特别是在环病毒科的已知变异体例如TTV变异体SANBAN和TUS01中，没有发现SVI的多核苷酸。SVI多核苷酸的长度最好是至少约15、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸且少于约2500、2000、1500、1250、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、150、125、100、75或50个核苷酸。所关注的多核苷酸的“互补物”是在中等或高度严格条件下能够运用Watson/Crick碱基配对而与所关注的多核苷酸杂交的多核苷酸。
“变异型SVI多核苷酸”是编码变异型SVI多肽的多核苷酸或其互补物；或者是选择性地与SVI多核苷酸或其互补物杂交的、但不属于SVI多核苷酸定义范围内的多核苷酸。在已知的任何序列中，特别是在环病毒科的已知变异体中，没有发现变异型SVI多核苷酸。变异型SVI多核苷酸的长度最好是至少约15、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸且少于约2500、2000、1500、1250、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、150、125、100、75或50个核苷酸。
“氨基酸序列同源性”和“氨基酸序列同一性”是指在比较两种序列时同源或相同的氨基酸的百分数。运用本技术领域已知的软件程序，可确定这种序列对比以及序列同源与序列同一性的百分数，所述软件程序例如在Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987)附录30的7.7.18节表7.7.1中描述的那些程序。对于序列对比，最好用默认参数。对本发明来说，所述序列对比程序为BLASTP，使用下面的默认参数：数据库(databases)＝non-redundant(非丰余生GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRE)，低复杂性过滤(low complexity filtering)＝ON，期望值(expect)＝10，矩阵(matrix)＝BLOSUM62(空位存在罚分(gap existence cost)11，每残基空位(gap per residue)1，λ0.85)且字串大小(word size)＝3。可引入空位或不引入空位进行序列对比，且优选引入空位进行序列对比。按下面的因特网网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST，可得到以上所述BLASTP安装启动和这些参数的细节。
“核苷酸序列同一性”是指在比较两种序列时相同核苷酸残基的百分数。运用本技术领域已知的软件程序，可确定这种序列对比以及序列同一性的百分数，所述软件程序例如在Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987)附录30的7.7.18节之表7.7.1中描述的那些程序。对于序列对比，最好用默认参数。对本发明来说，所述序列对比程序为BLASTN，使用下面的默认参数：数据库(databases)＝non-redundant(全部为非丰余性GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列)，低复杂性过滤(low complexity filtering)＝ON，期望值(expect)，矩阵(matrix)＝BLOSUM62，空位存在罚分(gap existencecost)＝5，空位延伸罚分(gap extension cost)＝2，不匹错配惩罚(mismatch penalty)＝-3，匹配奖分(match reward)＝1，且子串大小(wordsize)＝11。可引入空位或不引入空位地进行序列对比，且优选引入空位地进行序列对比。按下面的因特网网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST，可得到以上所述BLASTN安装启动和这些参数的细节。
“可选择性地杂交”到SVI多核苷酸序列上的多核苷酸是与SVI多核苷酸序列杂交而不与已知病毒的多核苷酸序列(例如来自环病毒科已知成员的序列)杂交的多核苷酸；或者是特异性地引发SVI多核苷酸序列扩增而不引发已知病毒的多核苷酸序列(例如来自环病毒科已知成员的序列)扩增的多核苷酸。可以在高度严格、中等严格或低严格(例如考虑到错配)的条件下，完成可选择性杂交多核苷酸的杂交。高度严格条件利用低于所预期杂交体的Tm 12-20℃的最终洗涤，而中等严格杂交和低严格杂交利用低于所述杂交体的Tm 21-30℃和31-40℃的最终洗涤条件。按照Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/N，可以得到长的多核苷酸的Tm，这里N＝研究中的可选择性杂交的多核苷酸的长度；而按照Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-600/N，可以得到长度大约从70个核苷酸至15个核苷酸的寡核苷酸的Tm；按照Tm＝2(A+T)+4(G+C)，可以得到≤14个核苷酸的短寡核苷酸的Tm。对于聚合酶链式反应(PCR)(例如50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3(在20℃)，1.5mMMgCl2，任选地含有0.01％的明胶)和水生栖热菌(T.aquaticus)DNA聚合酶，最好在标准条件下进行扩增的引发。
“分离的”病毒、病毒结构(例如壳体)、多核苷酸或多肽是至少已部分纯化的且去掉了在其正常环境中发现的污染成分的病毒、病毒结构(例如壳体)、多核苷酸或多肽。例如，分离的病毒是至少已部分纯化去掉血液、血清或组织蛋白的病毒。在分离的病毒多核苷酸的情况下，该多核苷酸至少是经部分纯化去掉病毒蛋白和/或其它病毒组分的，且可以另外从其正常环境中取出的核苷酸(例如，可以缺失掉正常位于该多核苷酸两侧的核苷酸序列)。
当用于本文时，当以这样一种方式共价连接所关注的序列和调节序列、以致将所关注的序列的表达或转录置于调节序列影响或控制下时；则说所关注的序列和调节序列是“可操作地连接的”。术语“可操作地连接的”表示多核苷酸元件按功能关系定向。可操作地连接的是指被连接的DNA序列通常是物理上邻近的，且在必需连接两种蛋白编码区时是邻近的，并在同一阅读框内。然而，由于增强子通常当与启动子分开几千碱基时起作用，而内含子序列可以具有可变的长度；所以，某些多核苷酸元件可以是可操作地连接的，但不是邻近的。如果希望将所关注的序列翻译成功能蛋白，那么如果诱导5’端调节序列中的启动子导致所关注的序列的转录，且如果在这两种DNA序列之间的连接性质：(1)不导致移码突变的引入，(2)不干扰启动子区指导所关注的序列转录的能力，(3)不干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白的能力；则说这两种DNA序列是可操作地连接的。因此，如果启动子区能够影响该DNA序列的转录，以致于可以将所产生的转录物翻译成所需蛋白或多肽；则该启动子区应该是可操作地连接所关注的序列。
当用于本文时，术语“抗体”是指具有特异性地结合特定抗原能力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的片段。对于免疫学学科领域的普通技术人员，抗体是众所周知的。当用于本文时，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，而且是指保留了抗原结合能力的抗体分子的片段。这样的片段也是本技术领域众所周知的，且经常既在体外、又在体外使用它们。尤其当用于本文时，术语“抗体”不仅指任何同种型(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)的完整免疫球蛋白分子，而且指众所周知的活性(即抗原结合)片段F(ab′)2、Fab、Fv、scFv、Fd、VH和VL。对于抗体片段，参见：例如 “Immunochemistry in Practice”(Johnstone和Thorpe编辑，1996，Blackwell Science)，第69页。所述术语的“抗体”还包括单链抗体、CDR移植抗体、双体分子(diabodies)、嵌合抗体、人源化抗体以及Fab表达文库。该术语也包括包含本发明抗体和另一种多肽或多肽之一部分(“融合”配偶体)的融合多肽。融合配偶体的实例包括生物学反应的调节物、淋巴因子、细胞因子以及细胞表面抗原。“抗体活性”是指抗体通过位于免疫球蛋白可变区内的抗原结合位点、优先于其它潜在抗原地结合特定抗原的能力。当用于本文时，术语“血清学上不同的”描述可借助于多肽、蛋白或病毒与其它这样种类的抗原的差异而用特定抗体免疫学地鉴定的与其它种类多肽、蛋白或病毒不同的多肽、蛋白或病毒。
当用于本文时，术语“包括(comprising)”及其同词源术语的按其包括在内的意思使用，即，等同于术语“包括(including)”及其相应的同词源术语。分离的SVI病毒
分离的SVI最好由来源于SVI感染的个体的血浆或血清制备。尤其在制备性规模以及免疫分离方面，可以用本领域已知的、包括但不限于等密度梯度离心的任何技术，从血浆或血清中分离出SVI病毒。可以用本技术领域已知的、将形成在1.20g/ml至1.40g/ml范围内之梯度的任何形成梯度之化合物，来进行等密度梯度离心；蔗糖和氯化铯(CsCl)是优选的形成梯度的化合物。在一个合适的离心管中，于形成梯度的化合物(所述化合物可以是预先形成的梯度形式、或是均相的，随形成梯度的化合物而定)上，“铺上”含有SVI的血浆或血清；然后，将其离心至平衡。通过收集该梯度的合适密度之级分，可以回收分离的SVI病毒。例如，当形成梯度的化合物为CsCl时，收集1.33-1.35g/cm3的级分。免疫分离技术利用与本技术领域已知的、任何合适的分离介质结合的SVI病毒之特异性抗体。优选的分离介质包括固体塑性基质(例如在用于淘选方面)、层析介质(例如免疫亲和层析)以及磁性颗粒(例如免疫磁性分离)。将抗SVI的抗体缀合到分离介质上，所述介质被暴露于含有SVI病毒的材料。除去未结合的材料，且从免疫分离基质上洗掉残留的未结合材料；然后，一般通过用一种pH变化的洗脱缓冲液、或具有高盐浓度的洗脱缓冲液，洗脱所述结合的SVI病毒。
另一方面，用体外培养方法，可制备分离的SVI病毒。分离的SVI多核苷酸
用任一种本技术领域已知的方法，例如，通过从病毒粒子直接分离病毒DNA，通过直接分离作为SVI生活周期一部分的、转录的病毒RNA，通过使用杂交方法(即鉴定由病毒DNA、或包含病毒的血浆或血清制备的DNA文库中的病毒DNA)，通过使用扩增方法(即病毒DNA、包含病毒DNA的文库、或由血浆或血清分离的DNA之聚合酶链式反应)，或通过直接合成，可制备分离的SVI多核苷酸。可以运用在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中所示的多核苷酸序列，来设计用于杂交方法和扩增方法的探针或引物，以及来选择用于合成的序列。
通过抽提分离出的病毒粒子，可制备分离的基因组多核苷酸。可以使分离出的病毒粒子经受本技术领域已知的、DNA抽提的任何操作，例如盐酸鈲抽提；任选地继之以进一步的纯化操作和/或浓缩操作，例如琼脂糖凝胶纯化，苯酚/氯仿抽提，或在有盐情况下的乙醇沉淀。
DNA文库的制备是本技术领域众所周知的。用本领域通常使用的技术，可以把从病毒粒子、或包含病毒的血浆或血清分离出的DNA克隆到方便的文库载体中。虽然通常也使用粘粒文库和质粒文库，但最常将用基于λ噬菌体的文库载体来构建所述文库。通过感染大肠杆菌宿主细胞的“菌苔”，将基于噬菌体的文库铺平板；而粘粒文库和质粒文库一般被转化到铺平板的细胞中。在铺平板之后，把来自所述文库的DNA转移到筛选滤膜上；并用SVI多核苷酸探针来筛选。虽然通过使用结合所标记探针且作用于生色底物或者可检测底物的修饰酶(例如碱性磷酸酶或荧光素酶)，可检测其它修饰的探针(例如地高辛配基或生物素标记的)；但最好典型地通过掺入一种放射性核苷酸(例如32P)来修饰所述的探针，以致于能检测杂交。通过一“轮”或更多“轮”纯化(例如，用逐渐更加纯化的克隆，来重复铺平板和筛选步骤)，来纯化与SVI多核苷酸探针杂交的克隆；这一点在本技术领域是众所周知的。通过从筛选步骤里分离的克隆中收获DNA，可制备SVI病毒DNA；且任选地通过限制性核酸内切酶消化而进一步从所述文库载体DNA中分离SVI病毒DNA。另一方面，对于使用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增SVI病毒DNA，可以将通过筛选分离的克隆DNA用作底物。可以根据SVI病毒DNA来设计PCR引物，或者更方便地，可设计杂交到该文库载体中位于插入文库DNA之位点两侧的DNA序列上的PCR引物；对于本领域技术熟练人员，这一点将是显而易见的。
由含有SVI病毒DNA的样品通过扩增，也可以分离SVI病毒的多核苷酸。根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中所示的序列，可设计用于扩增的引物；且优选设计用于扩增的引物，以致扩增SVI DNA，而不扩增来自TTV或TTV变异体的病毒DNA。另外，正如本技术领域众所周知的，选择引物序列以使分子内任何二级结构减至最小；所述二级结构大大地抑制扩增，甚至可以阻止扩增。用于聚合酶链式反应扩增的方案是本技术领域众所周知的，用于其它扩增方法例如连接酶链式反应的方案也是众所周知的。扩增后，可以通过大小选择(例如凝胶电泳)或化学抽提(例如苯酚/氯仿抽提)来进一步纯化所述SVIDNA，和/或通过在有盐情况下的乙醇沉淀，来浓缩SVI DNA。
也可以化学合成SVI多核苷酸；尽管合成的SVI多核苷酸最好是长度小于约50-60个核苷酸，因为当链长增加时，多核苷酸合成的产率下降。用于合成多核苷酸的方法是本技术领域众所周知的，通常涉及将核苷酸(或修饰的核苷酸)反复地添加到合成的多核苷酸的生长端。各种各样的不同系统在本技术领域中是可得到的，且把特定方法及化学的选择交给本领域的专业人员。
SVI多核苷酸有各种各样的用途，所述用途包括：SVI病毒的检测(这在诊断SVI感染方面是有用的)，SVI多肽的生产，基于SVI的表达/转导载体的构建，以及作为反义寡核苷酸或用于反义SVI载体的构建。
反义SVI多核苷酸是能够选择性地杂交到由SVI基因组产生的mRNA分子区段上的SVI多核苷酸。反义SVI多核苷酸可以是任何大小的SVI多核苷酸，但最好是长度小于约200个核苷酸。在SVI感染的细胞中，反义SVI多核苷酸阻止SVI蛋白的表达和/或SVI病毒的复制。因此，可以用反义SVI多核苷酸来治疗SVI的感染和/或改善SVI感染的症状，包括SVI病毒血症的减弱。
如果化学合成SVI反义多核苷酸，则最好合成作为经修饰的寡核苷酸的SVI反义多核苷酸，以增加对核酸酶的抗性。可以合成在5’末端和3’末端包含亚磷酰胺(phosphoroamidites)的经修饰的寡核苷酸(Dagle等，1990，Nucl.Acids Res.18：4751-4757)，以引入在第4,469,863号美国专利中公开的膦酸乙酯类似物或膦酸甲酯类似物，引入硫代磷酸酯(Stein等，1988，Nucl.Acids Res.16：3209-3221)或2’-O-甲基核糖核苷酸(Inove等，1987，Nucl.Acids Res.15：6131)，或作为复合RNA-DNA类似物的嵌合寡核苷酸(Inove等，1987，FEBS Lett.215：327)。
可以将SVI反义多核苷酸传递到用作为“裸DNA”的SVI病毒感染的个体中，通常通过非肠道的注射，优选通过静脉内注射或引入到门静脉中，利用天然发生的寡核苷酸的吸收。另一方面，可以借助于载体，例如一种病毒载体，将SVI反义多核苷酸引入到靶细胞中。该载体包括一个可操作地连接到一段多核苷酸序列上的、在宿主细胞中且最好在用SVI病毒感染的宿主细胞中可操作的启动子，所述多核苷酸的转录导致SVI反义多核苷酸的产生。优选的病毒载体包括但不限于：本技术领域已知的腺伴随病毒载体。优选静脉内给予由病毒载体传递的SVI反义多核苷酸，且最好给予到门静脉。分离的SVI多肽
SVI蛋白可包括一个来自SVI病毒的完整ORF、一种或更多种来自SVI病毒的融合蛋白、来自SVI病毒的单个蛋白、或其片段。也包括在同一蛋白内包含两个或更多个SVI蛋白片段的“嵌合蛋白”。嵌合蛋白中的SVI蛋白片段可以来自同一SVI蛋白、或来自不同的SVI蛋白。在所述SVI蛋白片段来自同一SVI蛋白时，正常分开所述片段的氨基酸序列基本上缺失或用一种不相关的“间隔区”序列取代。本发明包括的另一种嵌合蛋白是一种包含来自至少两种不同SVI病毒的至少一种表位之同源变异体的“超表位”嵌合蛋白。例如在筛选分析中，可以使用超表位嵌合蛋白，从而在属类上检测SVI病毒的感染。
用本技术领域已知的任一方法，可制备SVI多肽；所述方法包括：从分离的病毒粒子纯化、重组生产以及化学合成。因为由天然来源分离出大量病毒粒子的相对困难和SVI病毒家族中的变异性，因而重组生产和/或化学合成是用于生产的优选方法。
蛋白的重组生产是本技术领域众所周知的。通常，将编码本发明蛋白的多核苷酸序列克隆到一种“表达构成物”中，将其引入到一种合适的宿主细胞中。在适合于表达该蛋白的条件下，培养所述的宿主细胞；并收集重组蛋白。虽然表达构成物通常将包含在宿主细胞中可操作的启动子/操纵基因或启动子/增强子、以及一种允许选择包含该标记的细胞的选择性标记，但所述表达构成物的确切细节将依赖于所需宿主和该表达构成物的性质而变化；对于本领域技术熟练人员，这一点将是显而易见的。优选所述启动子/操纵基因或启动子/增强子是“可控制的”，在这点上，培养条件的变化将导致所述SVI蛋白(或SVI蛋白的融合蛋白)的表达。
应该注意：为了重组生产，可以使SVI肽加入到“融合蛋白”中。融合蛋白包含一种连接到一种融合配偶体上的所关注蛋白(例如SVI蛋白)，且任选地在所关注蛋白和融合配偶体之间包括一个特异性切割位点，从而使这两部分能分开。虽然也考虑了在编码区序列内加入作为“插入片段”的所述关注蛋白的融合蛋白，但该融合配偶体可以在该蛋白的氨基末端或羧基末端。作为筛选工具，包含一种SVI蛋白插入片段的融合蛋白可能特别有用的，例如，当引入到“噬菌体展示”系统时(例如在将该SVI蛋白序列插入到λ噬菌体外壳蛋白中的情况下)。
有用的融合配偶体包括便于融合蛋白的简易纯化的蛋白(例如谷胱甘肽-S-转移酶、寡聚组氨酸和某些来源于myc癌基因的序列)、增加融合蛋白的溶解度的蛋白(例如大肠杆菌的DsbA，公开于第5,629,172号美国专利)、或形成一种使所述蛋白结合到底物上的“接头”的蛋白(例如，可以用具有一个末端赖氨酸的聚甘氨酸将一种c37蛋白连接到底物上供免疫分析之用)。
通常，通过使用合适的限制性内切酶，将编码本发明一种蛋白的多核苷酸插入到一种合适的重组DNA表达载体中，而产生表达构成物。限制性核酸内切酶的位点可以是天然存在的或已用本技术领域已知的任一方法引入的合成位点；所述方法例如定点诱变、PCR或将接头/连接物连接到该多核苷酸上。另一方面，该多核苷酸可以是一段被设计成含有合适的限制性酶位点和/或对于预期宿主细胞优化密码子选择的合成序列。待使用的亲代表达载体的限制性核酸内切酶切割图谱将决定所用的特定核酸内切酶。进行限制性位点的选择，以便使编码序列和控制序列正确地定向，从而完成正确的符合读框的阅读及所述蛋白的表达。
可以将所述多核苷酸插入到任一合适的表达载体中。可以得到若干形式的表达载体，包括但不限于：质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)以及病毒载体。通常，表达载体会包含一个至少在繁殖该载体的生物中且常常也在重组宿主细胞中有活性的自主复制位点。该表达载体一般也会包含在转化细胞中能够提供表型选择的标记序列，例如，诸如抗生素抗性基因(例如bla、tetR、neoR或hygR)或补充辅源营养(例如trp或DHFR)的基因之类的正选择标记和/或诸如单纯疱疹病毒1胸苷激酶之类的负选择标记。该表达载体同样会包括起始与终止转录和翻译的必需序列(例如，启动子、Shine-Dalgarno序列、核糖体结合位点、转录终止位点)，并可以任选地包含调节转录的序列(例如，SV40增强子或lac阻抑物)，且在必需时，同样可包含指导加工的序列，例如内含子或聚腺苷酸化位点。
将本发明的多核苷酸以正确的定向及与表达载体的转录控制序列和翻译控制序列的正确关系，插入到表达载体中，从而提供由于启动子的转录和由于核糖体结合位点的翻译；在所述蛋白待被表达的宿主细胞中，它们两者应该是在起作用的。所述转录控制序列最好是诱导型的(即通过改变培养条件，可调节它们；所述转录控制序列例如大肠杆菌的乳糖操纵子或用于哺乳动物细胞的金属硫蛋白启动子)。这样的一种表达载体的实例是在Belagaje等的5,304,493号美国专利中描述的质粒。用限制酶NdeI和BamHI，可以从质粒pRB182中除去在该参考文献中描述的编码A-C-B胰岛素原的基因。可以在NdeI/BamHI限制性片段盒上，将编码本发明蛋白的基因插入到该质粒骨架中。
对于本发明蛋白的重组表达，微生物宿主一般是优选的；且可以使用通常所用的任何微生物宿主，包括例如W3110(原养型的，ATCC27325号)的大肠杆菌、枯草杆菌、以及诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)之类的肠细菌科之其它细菌和不同的假单胞菌属之菌种。另一方面，可以使用真核的宿主细胞；所述真核的宿主细胞不仅包括酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，而且包括高等真核生物，例如非酵母的真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞(例如Sf9)和哺乳动物细胞(例如COS、CHO)。
用本技术领域已知的任何合适的方法，将完成的表达构成物引入到重组的宿主细胞中；所述方法例如CaCl2转染、Ca2PO4转染、病毒转导、脂质介导的转染、电穿孔、基因枪转染等等。在引入表达构成物后，为了通常在根据表达构成物的存在进行选择的合适的条件下培养重组的宿主细胞(例如，对具有包含bla的表达构成物的细菌宿主，在存在氨苄青霉素的情况下进行培养)；或者，根据所述蛋白的表达而可以用任何合适的方法来选择重组的宿主细胞(例如，荧光激活细胞分类术，FACS；使用一种SVI蛋白特异性的抗体)。
在选择与合适的分离步骤之后(例如反复划线和有限稀释的克隆)，使用本领域已知的任何合适的技术，以生产规模培养重组的宿主细胞(所述生产规模对于微生物宿主细胞而言可以从500ml的摇瓶到数百升级的发酵罐，或者，对于哺乳动物宿主细胞而言可以从T25烧瓶直到数百升级的生物反应器；这取决于所述专业人员的要求)。如果在表达载体中的启动子/增强子是诱导型的，则在培养物达到适当的细胞密度后，根据特定的构成物适宜地诱导所述蛋白的表达(例如，通过添加一种诱导物，或通过让一种阻抑物从该培养基中被除去)；否则，使所述细胞生长，直到它们达到供收获的适当密度为止。本发明重组蛋白的收获将取决于重组的宿主细胞、表达构成物以及编码本发明蛋白的多核苷酸的确切性质；对于本领域技术熟练人员，这一点将是显而易见的。至于产生分泌蛋白的表达构成物，一般通过从培养容器中除去培养基而回收该蛋白；而产生细胞内蛋白累积的表达构成物，通常需要回收及裂解所述的细胞，从而释放出表达的所述蛋白。
用高水平细菌表达系统表达的蛋白以微粒或包含体形式特性地聚集，所述微粒或包含体包含高水平的超量表达的该蛋白。溶解该蛋白聚集物，从而提供所需蛋白产物的进一步纯化与分离；例如，使用例如盐酸鈲的强变性溶液，或许结合还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)。在“重折叠”反应后，回收呈活性形式的所述溶解的蛋白；在所述“重折叠”反应中，通常涉及减少变性剂浓度和添加氧化剂。一般认为适用于蛋白重折叠的方案是本技术领域众所周知的，且被公开于例如4,511,502号、4,511,503号和4,512,922号的美国专利中。
运用本技术领域众所周知的方法合成化学，也可以方便地生产短的(例如少于约20个氨基酸残基)SVI蛋白。因为在肽长度长时收率下降，所以对于生产大约15个氨基酸残基或更短的肽，合成是一种优选的方法。
在用于预防SVI感染和/或治疗SVI感染的疫苗中，可以使用SVI多肽。在SVI疫苗中，可以使用任一SVI多肽或SVI多肽的组合。包含来自单一SVI蛋白的多个表位的嵌合多肽，是一种供疫苗制剂之用的优选的SVI蛋白；在所述嵌合多肽中，正常分开所述表位的氨基酸被缺失掉。供疫苗之用的另一种优选的SVI蛋白是包含融合在单一蛋白中的来自多种SVI病毒的同源表位的超表位蛋白。
按照本技术领域已知的方法配制SVI疫苗。该疫苗最好是一种用于非肠道给予的液体制剂。可以配制包含本技术领域已知的药用赋形剂的疫苗，所述药用赋形剂例如生理学上及药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂、填充剂、渗压剂等等，在USP(UNTTED STATES PHARMACOPEIA，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，MD，1995)中可找到它们。
也可以用佐剂配制基于SVI蛋白的疫苗。供基于SVI蛋白的疫苗之用的佐剂包括化学佐剂、细胞因子佐剂以及诸如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂之类的水包油型乳状液；所述化学佐剂例如氢氧化铝(尤其是氢氧化铝凝胶)、明矾、鱼精蛋白、磷酸铝和磷酸钙，所述细胞因子佐剂包括白细胞介素(IL)1β、肿瘤坏死因子(TNF)α以及例如在5,980,911号美国专利中描述的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
优选非肠道地传递SVI疫苗，更优选通过经皮给予而将其传递。优选的给予途径不仅包括肌内注射和皮下注射，而且包括经皮的气动给予(例如无针注射)。可以以单独一剂的方式给予该疫苗，或可按照多次给予，来给予该疫苗。在指定多次给予时，优选间隔至少一天、一周或一个月给予它们。SVI抗体
运用分离的病毒粒子和/或由本发明提供的SVI病毒蛋白，可制备针对SVI的抗体。不仅可以制备分离的多克隆抗体，而且可制备单克隆抗体。
最好通过注射一种免疫原性形式的“SVI免疫原”(例如分离的SVI病毒粒子、SVI蛋白、连接到载体上的SVI寡肽或SVI融合蛋白)到动物体内，来制备针对SVI蛋白的分离的多克隆抗体；所述动物最好是一种哺乳动物，例如一种啮齿类动物(例如小鼠、大鼠或兔)、山羊、奶牛或马。最常用的是，第一次在油/水乳状液完全佐剂例如弗氏完全佐剂情况下注射SVI免疫原；该完全佐剂包含一种非特异性的免疫系统激活剂，从而改善对所注射免疫原的免疫应答。一般用不完全佐剂(例如在一种水/油乳状液中的非特异性免疫刺激物)进行后面的注射。另一方面，可以引入吸附到一种固体基质上的、或作为一种纯溶液的SVI免疫原。收获血清；并运用方便的任何测定，最常用一个简单的免疫测定例如使用SVI免疫原作为靶以及用种特异性的抗免疫球蛋白第二抗体的ELISA(酶联免疫吸附测定)，来测定血清中特异性抗体的存在。
用若干不同的技术，可制备本发明的单克隆抗体。至于杂交瘤技术，读者一般可参阅Harrow与Lane(1988)的4,491,632号、4,472,500号和4,444,887号美国专利以及Methods in Enzymology，73B：3(1981)。传统的单克隆抗体技术涉及从一种在前一段落中描述的、已被免疫的动物(一般为小鼠)体内回收的产生抗体之细胞的无限增殖化与克隆。例如，通过与一种非生产性骨髓瘤融合、用EB(Epstein Barr)病毒感染或者用癌基因DNA转化，可以使所述细胞无限增殖化。克隆并培养经处理的细胞，且挑选产生所需特异性之抗体的克隆。用一些技术，例如运用在免疫测定中作为检测试剂的免疫抗原，用培养基上清液进行特异性测定。然后，从大体积的培养上清液中，或从用所述克隆注射的、经适当处理过的宿主动物的腹水中，可纯化出来自所选定克隆的一批单克隆抗体。
用于获得单克隆抗体的其它方法涉及使免疫活性细胞或病毒粒子与本发明的蛋白接触。在这方面，“免疫活性”是指：没有进一步的基因重排，所述细胞或粒子已表达或能够表达对该抗原特异性的抗体；且可以通过该抗原的呈递，将其从细胞混合物中选择出来。可以由免疫过的哺乳动物供体收获免疫活性真核细胞；或者，可从未免疫的供体中收获真核细胞，并在有免疫原和免疫刺激性生长因子情况下，通过于培养而体外预刺激它们。在导致特异性克隆增殖而非特异性克隆不增殖的培养条件下，通过接触免疫原，可选择所需特异性的细胞。可以构建免疫活性噬菌体，从而在其表面表达免疫球蛋白可变区区段。参见：Marks等，New Engl.J.Med.335：730，1996；94/13804号、92/01047号、90/02809号国际专利申请；以及McGuinness等，Nature Biotechnol.14：1149，1996。例如，根据吸附到相连至固相的SVI免疫原上，而可选择出所需特异性的噬菌体；然后，在大肠杆菌中可将其扩增。
可以用传统生物化学分离技术的组合，可以从血清、细胞上清液、裂解液或腹水中纯化抗体；所述生物化学分离技术例如硫酸铵沉淀、在弱阴离子交换树脂例如DEAE上的离子交换层析、羟基磷灰石层析以及凝胶过滤层析。也可以单独地、或结合传统生物化学分离技术一起地使用特异性的亲和技术，例如使用SVI免疫原作为亲和部分的亲和层析，来分离本发明的抗体。
最好是不仅在所获抗体与SVI病毒蛋白反应的能力方面，而且在与同样存在于诊断样品中的潜在交叉反应物的低交叉反应性方面，筛选或纯化所获抗体。必要时，可以使用所述交叉反应物或来自对SVI感染呈阴性的个体之血清的抗原制剂，从多克隆抗血清中吸附出不需要的活性。
通过制备片段和测定抗体结合的能力，可对特定抗体结合的表位制作图谱。例如，制备覆盖该免疫原完整序列的、且重叠8个氨基酸残基的12个氨基酸的顺序肽。通过F-Moc化学，可以用来自Genosys的SPOTSTM试剂盒，按照制造商的说明书，在尼龙膜支持物上制备所述肽。然后，用所述抗体覆盖所制备的膜，洗涤它们，并用β-半乳糖缀合的抗人IgG覆盖这些膜。通过添加底物X-gal，来显现该试验结果。阳性染色指示由所述抗体识别的抗原片段。然后，可以用该片段来获得识别所关注表位的其它抗体。在一种标准的免疫测定中，识别同一表位的两种抗体将竞争结合。
为了检测和/或鉴定SVI病毒，可使用本发明的抗体；且在分离病毒粒子和/或病毒蛋白方面，本发明的抗体也可以是有用的。SVI的检测
在用于检测SVI病毒感染和检测SVI病毒本身的方法与试剂盒中，可以使用本发明的多核苷酸、蛋白及抗体。根据测定的所需用途，可以设计各种各样形式的使用本发明多核苷酸、蛋白和/或抗体的测定。
为了检测SVI病毒基因组DNA，可以使用本发明的多核苷酸。在血液样品中检测出SVI基因组DNA则表明：该样品污染有SVI病毒，且该样品的来源感染了SVI。用于检测核苷酸的各种各样的不同分析是已知的，尽管所有这样的分析通常需要一个使引物或探针杂交到样品中的DNA上的杂交步骤。
用分离的SVI基因组序列的确定部分作为基础，可以或者通过切除或者通过合成，制备大约八个或更多个核苷酸的、与所述SVI基因组杂交的寡聚体。用于SVI多核苷酸的天然探针或衍生探针为允许通过杂交而检测特有病毒序列的长度。通常，探针长度的最小限度为6个至8个核苷酸，优选至少10至12个核苷酸的序列，且可以最优选至少约20个核苷酸的那些序列。根据所需的测定效用(例如所有SVI病毒的检测对一种SVI病毒类型的检测)，所述探针可以基于SVI基因组序列的一个区域；该区域在SVI病毒之中是保守的，或在SVI病毒中间是高度趋异的。可运用包括自动化寡核苷酸合成法的常规、标准方法，来制备这些探针。虽然最好从不同于已知TT病毒的区域中选择探针，但SVI基因组的任何独有部分的互补物都将是令人满意的。通常，在探针方面理想的是完全互补；尽管当增加该片段的长度时，完全互补可能是不必要的。
通常，处理待分析的试验样品，例如血液或血清，以便提取包含于其中的核酸。一般将核酸样品吸附到用于所述分析(有或没有初步的大小分离，例如通过凝胶电泳)的固体支持物(例如硝化纤维素)上，尽管也可以使用溶液相形式的分析，例如在4,868,105号美国专利中描述的分析。
根据所述分析的形式和检测系统，可以对所述探针进行或者不进行直接标记或另外修饰，以允许根据标记的结合进行随后的检测。合适的标记以及使标记连接到探针上的方法是本技术领域已知的，且包括但不限于：通过切口平移或激酶标记(kinasing)引入的放射性标记，允许后面之标记结合的修饰例如生物素化，以及可以直接结合到探针上或经过修饰探针而结合的荧光标记与化学发光标记。
在基本的核酸杂交分析中，在适当严格性的杂交条件与洗涤条件下，使样品的单链核酸和所述探针接触，并检测所产生的双链体。严格性的控制是本技术领域众所周知的，且取决于例如盐浓度、探针长度、甲酰胺浓度、温度等等的变量。最好是在严格条件下进行杂交及洗涤。按照用于所述分析的标记/检测系统的要求，进行结合探针的检测。例如，在该探针被放射性标记时，通过放射自显影检测结合的探针。在修饰该探针以允许后面的探针结合(例如，通过共价连接生物素或地高辛配基到该探针上，或者通过添加聚腺苷酸尾到该探针上)时，将一种标记连接到修饰结合部分(例如，链霉亲和素连接一种可检测的酶例如碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白或荧光素酶，或者一种荧光标记或其它标记结合到抗地高辛配基的抗体上)。通常用荧光计来完成荧光探针的检测，而可以用一台发光计或一张照相底片来检测发光标记。可以使用放大来自所述分析之信号的分支DNA技术及其它方法(Urdea等，1989，Clin.Chem.35(8)：1571-1575；第5,849,481号美国专利)。
其它分析使用探针作为扩增样品中SVI基因组DNA的引物。可使用例如聚合酶链式反应、连接酶链式反应、Q-β复制酶、NASBA(Compton，1991，Nature 350(6313)：91-92)等的方法，来产生存在于一种样品中的部分或全部SVI基因组DNA的大量拷贝。在这样的分析中的检测通常是检测预期大小的扩增产物，一般是通过凝胶电泳和目测存在的任何带。
也可以用本发明的抗体检测样品中病毒蛋白的存在，来检测出SVI病毒。为了检测SVI病毒或病毒蛋白，可以结合本发明抗体使用本技术领域已知的各种各样免疫分析形式中的任一种。
在其大多数的基本类型中，用于检测样品中的SVI病毒或SVI病毒蛋白的免疫分析，检测SVI蛋白与本发明抗体的复合体。至少需要一种本发明的抗体，虽然优选的免疫分析形式需要至少两种本发明的抗体。
许多分析形式要求将样品或来自该样品的SVI蛋白固定在一种固体支持物上。可以用本技术领域已知的各种各样的方法来完成连接；最常是吸附到蛋白结合的表面上(例如一种聚苯乙烯板或硝化纤维素或PVA膜)或结合到一种与基片结合的抗体上。在“夹层”免疫测定中使用这第二种排列；且对于SVI病毒蛋白的检测，则优选这第二种排列。
在固定该样品(或该样品中的SVI蛋白)到所述基片上后，使检测抗体与该样品接触，并检测该检测抗体的存在。由于用染料或着色颗粒修饰该检测抗体，因而该检测抗体本身可以是可检测的；可以这样的修饰该检测抗体，以致一种检测试剂将结合到该检测抗体上，或者可以用作用于显色底物的酶来修饰该检测抗体。
当然，检测该检测抗体的确切细节将取决于所使用的检测系统。例如，靠简单检查、光学显微镜术或比色法(对于用着色颗粒例如胶乳珠或胶态金属修饰的抗体)、放射分析(对于用放射性化合物修饰的抗体)或荧光测定或表面荧光显微镜术(对于用荧光染料标记的抗体)，可以检测可直接检测的检测抗体。一般通过在一种包含一种底物的溶液中保温所述的试验样品，所述底物通过所述酶的加工就成为可检测的底物(例如在所述酶加工后所述底物变色或变为发荧光或化学发光)；以及用一种合适的方法(例如用于显色底物的比色法，用于荧光底物的荧光测定法等等)检测任何经加工的底物，来检测已经修饰以包括酶的检测抗体。可以修饰其它的检测抗体而为“间接”检测创造条件；在这方面，结合到所述经修饰的检测抗体上的第二种试剂允许检测结合的检测抗体。修饰所述第二种试剂，使得它是可检测的(或当用染料或着色颗粒时直接检测，或当用一种酶与可检测底物时间接检测)。
实施例实施例1：SVI病毒DNA的分离
运用一种由Lititsyn等描述的表现度差异分析(RAD)法(1993，Science 259：946-951)的改良法，分离包含SVI基因组DNA的DNA克隆。这种方法利用一种“驱动者”DNA源来富集对“试验者”DNA源独有序列的扩增物。
将来自称为H035的隐原性肝炎患者的血清用作“试验者”DNA源。通过蛋白酶K消化，继之以苯酚与氯仿抽提而提取DNA。在37℃，用10个单位的Sau3A I消化从100μl H035血清分离的DNA达3小时，而至完成。通过在65℃保温20分钟而使该酶失活。
通过将T4 DNA连接酶缓冲液(具有ATP，来自New EnglandBiolabs)中的1nmol的各种寡核苷酸接头与经消化的DNA混合，通过在55℃保温2分钟来变性该混合物，通过在大约1小时期间将该混合物逐渐冷却至10-15℃而使所述接头退火，然后，添加800单位的T4DNA连接酶(New England Biolabs)并在12-16℃保温过夜；而把所述接头R-Bgl-24(5’-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3’)和R-Bgl-12(5’-GATCTGCGGTGA-3’)连接到所述经消化的DNA上。
通过扩增该连接产物的一部分而制备试验者扩增子。将该连接产物的一部分与PCR缓冲液、dNTPs以及另外的250pmol R-Bgl-24寡核苷酸混合，并用矿物油将其覆盖。通过在72℃保温该混合物3分钟而‘释放’所述的R-Bgl-12寡核苷酸。通过添加7.5单位的AMPLITAQTaq DNA聚合酶(PE Biosystems)以及于72℃保温另外的5分钟，而补平突出端。通过操作该混合物，经由20个于95℃1分钟以及在72℃3分钟的循环，继之以最后的于72℃10分钟的延伸步骤，产生试验者扩增子。然后，用苯酚/氯仿抽提该产物，并用乙酸钠和异丙醇将其沉淀。通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干；并用TE(tris-EDTA)缓冲液重新悬浮它。通过基本上如同上述的Sau3A I消化而除去R-Bgl-24接头，继之以在65℃使该酶失活。在存在糖原的情况下，用乙酸钠和乙醇将所述消化产物沉淀。通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干；并用TE重悬浮它。然后，在1×TAE中进行琼脂糖凝胶电泳，将所述产物分离；并把对应于150-1500个核苷酸的凝胶部分切割出来。用QIAGENQiaex II凝胶提取试剂盒，按照制造商的说明书，从该凝胶中纯化经消化的试验者扩增子。基本上按照为R-Bgl接头而描述的，将2μg的试验者扩增子与J-Bgl-24接头和J-Bgl-12接头(相应各为5’-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3’、5’-GATCTGTTCATG-3’)连接。
除了在第二次Sau3A I消化后不添加新的接头外，基本上按照为试验者扩增子而描述的，由提取自汇集血清的DNA制备驱动者扩增子；所述汇集血清即从10个健康的血液供体汇集来的血清。
以100∶1的质量比，混合驱动者扩增子和试验者扩增子；用苯酚/氯仿抽提它们，并用乙酸钠和乙醇将其沉淀。通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干；并用4μlEEx3缓冲液(30mM EPPS，pH8.0，3mM EDTA)重新悬浮它。混合物用矿物油覆盖，通过在98℃变性5分钟而进行杂交，添加1μl的5M NaCl，于98℃保温另外的2分钟，然后在65℃保温20小时。
在选择性地仅扩增双链试验者DNA的条件下，扩增试验者/驱动者杂交混合物。除了在70℃进行延伸循环外，基本上如同为扩增J-Bgl的连接试验者DNA而做的那样，扩增该杂交混合物的一部分达10个循环。收集所述扩增的产物，用苯酚/氯仿/异戊醇抽提它，然后，用乙酸钠和异丙醇将其沉淀。通过离心收集该沉淀，在除去上清液后，将其风干；并用TE重新悬浮它。通过在30℃用绿豆核酸酶(New EnglandBioLabs)消化30分钟，除去单链的DNA；继之以在98℃热灭活该酶达5分钟。在存在追加的J-Bgl-24寡核苷酸的情况下，重新扩增所述消化产物达15个循环。
收集所述扩增的产物，用苯酚/氯仿/异戊醇抽提它，用乙酸钠和异丙醇将其沉淀；通过离心收集该沉淀，用70％的乙醇洗涤它，在除去上清液后，将其风干；并用TE重新悬浮它，从而形成第一种差异产物(the First Difference Product)(DP1)。
通过用Sau3A I消化DP1，并基本上按照为了把R-Bgl接头换成J-Bgl接头而描述的，用N-Bgl(N-Bgl-12和N-Bgl-24，相应各为5’-GATCTTCCCTCG-3’、5’-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3’)接头取代J-Bgl接头；以1∶800的质量比，使N-接头DP1与驱动者扩增子杂交；且除了在72℃进行扩增期间的延伸外，按照对DP1而描述的，进行扩增/消化/扩增；从而产生第二种差异产物(the Second DifferenceProduct)(DP2)。
通过用Sau3A I消化DP2，并用J-Bgl接头取代N-Bgl接头；再加上继之以按4×105∶1的驱动者∶试验者的质量比，与驱动者扩增子杂交；且按照对DP1而描述的，进行扩增/消化/扩增；从而产生第三种差异产物(the Third Difference Product)(DP3)
在三轮扣除杂交和选择性扩增之后，在凝胶电泳后当与最初试验者扩增子的‘成片’电泳图谱比较时，看到了清楚的带。用QIAGEN凝胶提取试剂盒(目录号：28704)，按照制造商的说明书，从各条带中分离出DNA；然后，将该DNA连接到TA质粒(In Vitrogen Cat.K2000-01)中。然后将所产生的质粒库转化到大肠杆菌中，并将大肠杆菌铺平板。选择来自每个文库的30个菌落，并用PE Biosciences PCR测序试剂盒，按照制造商的说明书将其测序。在DNA和蛋白质水平上，对照GenBank数据库比较序列。将显示与所述数据库没有显著同源性的克隆分为“未知”类。使用根据每种“未知”序列设计的引物，通过PCR，对每种“未知物”在人类基因组DNA中的存在进行研究。对任何存在于人类基因组DNA中的序列，则中止分析。选择一种称为“克隆37”的、314个核苷酸的未知物，供进一步特性鉴定。通过人类基因组DNA的DNA印迹，进一步证实克隆37的非人类起源。
构建一个文库，以分离较大的、包括克隆37序列的DNA。通过蛋白酶K消化以及苯酚/氯仿抽提，来分离DNA；用NcoI和BspH1切割该DNA，并将其连接到文库载体中。分离了来自原型SVI病毒以及几种变异体的基因组DNA，在SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中显示了它们的序列。
正如在图1中显示的，使用得自用含有原始SVI的样品感染的黑猩猩(参见下面的实施例3)的较高滴度的原材料，获得了较高保真度的序列。设计出与原始序列同源的引物，并用Pfu DNA聚合酶，使用该引物，克隆出对应于所述原始序列的片段。在DNA和蛋白水平上的、通过与GenBank数据库比较的这些序列的分析，表明了同已知的环病毒序列的某些同源性。通过设计同已知序列中具有环病毒保守区域的区域配对的PCR引物，向左和向右延伸该基因组序列。最后，证明了该基因组是环状的，且通过以这样一种方式设计引物对，以致每种引物从左端和右端向外前进；从而确定闭合该环的序列。通过这样的一种PCR反应而产生的片段，可能是环状基因组的产物。获得这样的片段，并将其测序，以使所述的基因组序列完整。
高保真度序列和变异体序列二者的计算机分析都确定在类似位置存在可读框的，且与于人环病毒分离物SANBAN和TUS01中发现的可读框有着有限的同源性。有两个这样的可读框存在于SVI及其变异体中，称为ORF1(SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：10)和ORF2(SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12)。本文以SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：10列出的序列分别对应于称为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5的多核苷酸序列的ORF1序列。本文称为SEQ ID NO：11的肽序列详述了称为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的ORF2序列。此外，本文称为SEQ ID NO：12的肽序列详述了称为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5的多核苷酸序列的ORF2序列。实施例2：SVI病毒粒子的物理特性鉴定
通过密度梯度超速离心，将SVI阳性血清分级分离，以确定SVI病毒粒子的浮力密度。
在连续的蔗糖密度梯度(20-65％的蔗糖，w/w)的表面上，铺上掺入HBV作为标记的SVI阳性血清样品200μl。在6℃，用一个BeckmanSW41Ti转头以39,000rpm离心该样品15小时。借助于连接到聚硅氧烷管上的玻璃毛细管，通过从离心管底抽吸，而收集级分(500μl)。
运用两轮的PCR扩增，分析各级分的SVI。第一轮使用引物37.2和引物37.3(相应各为5’-CTCGACCTGGAAAGTCCAGTC-3’、5’-TGCAAAGCAACAGACATGGAC-3’)，且第二轮使用引物37.4和引物37.5(相应各为5’-TTCCTTGCCCTTGGAGGTCTG-3’、5’-TAGACAGCGTCGCGACTTAC-3’)。同样，运用两轮的PCR，即用引物HBV1和HBV4(相应各为5’-CATCTTCTTRTTGGTCTTCTGG-3’、5’-CAAGGCAGGATAGCCACATTGTG-3’)的第一轮，加HBV3(5’-CCTATGGGAGTGGGCCTCAG-3’)和HBV4；来分析各级分的HBV。在对应于1.23-1.24g/cm3的级分中发现了SVI病毒。
也测定了SVI在CsCl梯度中的浮力密度。在均相的CsCl溶液(密度，1.308g/cm3)的表面上，铺上掺入HBV作为标记的SVI阳性血清样品200μl。在6℃，用一个Beckman SW41Ti转头以33,000rpm离心该样品70小时。收集级分，并如同对蔗糖梯度实验而描述的那样，分析所述的级分。在对应于1.33-1.35g/cm3的级分中，发现了SVI病毒。
也对用吐温(Tween)处理过的样品进行了浮力密度分析。浮力密度未改变。实施例3：SVI感染的流行
对于SVI的存在，通过PCR，分析了不止1500份的血清样品。将所述样品分成：(a)“超正常”血液供体(正常血液值，无肝炎病毒标志，且≥5次献血不牵涉输血相关的事件)；(b)“正常”血液供体(符合献血标准)，来自意大利和英国；(c)“不合格的”血液供体(在现行标准中不适合于献血的健康个体)；(d)“肝炎”患者，分成隐原性、急性、慢性HBV、慢性HCV、及慢性HBV加HCV或HBV加HDV；以及(e)“输血”受体，细分成地中海贫血症患者和血友病患者，所述血友病患者包括仅仅接受重组凝血因子的血友病者。
使用在实施例2中描述的引物37.2、引物37.3、引物37.4和引物37.5，通过进行抽提自血清样品的DNA的PCR扩增，来分析样品。在表1中显示了结果。
表1
组别 样品 阳性
超正常 100 5(5％)
正常 253 21(12％)
意大利 153 6(4％)
英国 100 15(15％)
不合格 222 28(13％)
肝炎 390 102(26％)
隐原性 99 26(26％)
急性 35 13(37％)
慢性HBV 79 27(34％)
慢性HCV 98 20(20％)
慢性HBV/HCV/HDV 79 16(20％)
输血 167 108(65％)
地中海贫血症 82 61(74％)
血友病 85 47(55％)
重组因子 13 2(15％)
所述结果表明：SVI在肝炎阳性个体中间大流行，且在接受血液制品的个体中是非常高的。实施例4：黑猩猩中的SVI的感染与传播
评价了SVI的传染性。将来自包括来自患者H035的血清(即SVI阳性血清)的一个血清库的样品静脉内注射到黑猩猩(称为X207)体内。在给予所述SVI阳性血清之前，这只动物对所有已知肝炎病毒的检测结果都是阴性的。以一周一次为度，从这只动物获得血清样品；且如实施例2中描述的使用引物37.2、引物37.3、引物37.4和引物37.5通过PCR，来测定SVI病毒的存在。也测定血清中肝酶(ALT、AST)，并使用区分原型SVI与该病毒的已知变异体(例如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：5)的引物，通过PCR，来测定某些样品的SVI变异体。接种后7周，首次检测出原型SVI，且在接种后5周，检测出变异体1。正如在图2中所表示的，至所分析的最后时间点的第16周，在血清样品中既检测出原型SVI，又检测出SVI的变异体(分别为16周、15周)。这些数据表明：SVI是一种能在非人类的灵长目动物中传染且扩增的感染性因子。然而，不清楚在用SVI阳性血清接种后ALT的增加是否是由于SVI病毒所造成的；因为过后发现该血清库被HCV污染了。
用来自五个肝炎患者的、相信没有SVI病毒的血清库接种称为X323的第二只黑猩猩，尽管更大范围的化验查明包括在该库中的一个供体显示出低滴度的SVI。同样，在接种之前，已预先检查出这只动物对所有已知的肝炎病毒是呈阴性的。一周一次从这只动物获得血清样品，且如实施例2中描述的，使用引物37.2、引物37.3、引物37.4和引物37.5通过PCR，来测定原型SVI和SVI的变异体；也测定血清中的肝酶(ALT、AST)。在ALT或AST方面，没观测到显著的变化，但正如在图3中显示的，在第一次接种后12-14周开始，既检测出原型SVI，又检测出SVI的变异体。
第一次接种后17周，还用来自动物X207的第8-14周的混合血清接种动物X323。PCR检查表明：在第二次接种后，SVI病毒血症在动物X323体内持续至少16周。另外，用从得自接种后第11至18周的肝脏活组织检查样品中提取的DNA，通过PCR，也检测到原型SVI病毒；以及在来自接种后第4至18周的白细胞中，通过PCR，检测到原型SVI病毒。
总之，我们已证明，SVI病毒能够在非人类的灵长目动物中感染与传播，且在非人类的灵长目动物之间可传播SVI感染。这些数据也暗示，SVI可能能够在非人类的灵长目动物中建立慢性感染。实施例5：SVI病毒在人类中的传播
评价了SVI病毒在人类中的传播性。从Mainz的Hitzler博士那得到来自接受输血之人的输血前与输血后的血清对以及供者血液。如实施例2中描述的，使用引物37.2、引物37.3、引物37.4和引物37.5，通过PCR，针对SVI靶序列而测定所有的样品。
在所筛选的206组血清样品中间，鉴定出八位在输血前SVI检查呈阴性且已接受了SVI阳性血的接受输血者。根据用临床报告支持的调查以及始于输血后两周、其后以两周之间隔达至少两个月的标准血液化学分析，跟踪这八位病人。在这八位接受输血者中，六位变成为SVI阳性的：一位早在输血后的3-4周便成为SVI阳性，四位在输血后15-16周的时间点仍然是SVI阳性的，而一位在输血后17-18周的时间点还是SVI阳性的；这结果暗示，SVI病毒可在人类中建立慢性感染。在表2中概括了这些数据。注意：仅在那些由“-”或“+”指示的时间点进行SVI的PCR分析。
表2
患者 输血后周数
1/2 3/4 5/6 7/8 9/10 11/12 13/14 15/16 17/18KR11708 -KR11723 -KR11680 - + +KR11745 +KR13124 + + +KR13355 + + +KR13440 + + +KR16328 + + +
通过引用，将整个说明书所引用的专利、专利申请以及出版物全部结合到本文中。
已经通过直接描述和实施例详述了本发明。对于本领域技术熟练人员，本发明的同等物及修改将是显而易见的；且包括在本发明的范围内。
序列表<110>罗赫诊断器材股份有限公司(Roche Diagnostics GmbH)<120>肝炎岗哨病毒I<130>RDID 0069<160>12<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>3847<212>DNA<213>病毒<220><221>未确定<222>(221)..(221)<223>该核苷酸是T或C<220><221>未确定<222>(2240)..(2240)<223>该核苷酸是C或G。<220><221>未确定<222>(236)..(236)<223>该核苷酸是T或C。<220><221>未确定<222>(260)..(260)<223>该核苷酸是A或T。<220><221>未确定<222>(3844)..(3844)<223>该核苷酸是A或T。<400>1agggttggcg tgtaacccgg aagtcaatcc tcccacatgg cctgtcacgt gactgctacg 60tcacggccgc cattttagtt cacaaaatgg cggacttcct tcctcttttt taaaaattaa 120ccgtcggcgg cgctaccggc gcgcgccctg cgcccccccc ccctcgatgc gcgcggggcc 180cccccccact gccgcccccc ggcccccccc ccgaagtacg ncactaacca cgtgantccc 240acaggccaat cagagtctan gtcgtgcact tcctgggcat ggtctacgtc ctaatataag 300taagtgcact tccgaatggc tgagttttcc acgcccgtcc gcagcggtag caccacggaa 360ggtgatcccc gcgtcccgag ggcgggtgcc ggaggtgagt ttacacaccg cagtcaaggg 420gcaattcggg ctcgggactg gccgggctat gggcaaggct cttagggtca tcgctcttaa 480aaatgttttt tggcaggcct tacagaaaaa agaaaagggc gctgctactg tctgagctgc 540cagattcaaa gaagaaacca cctggtgata tgacctggcg ccccccagta cacaatgccg 600ccggcatcga taggcagttc tttgaagcct gctttcgatg ccacagtagt tgctgcggct 660gcggcaattt tattaatcat cttaatgtac tggctactcg ctatggcttt actggggggc 720cggcgccgcc aggtggtcct cggccggcgc cccaagtgag gcccgcgctt cccgcgccgg 780agcccgacgc cccgggcgct gagccgctac catggcgtgg agctggtggt ggcaacgatg 840gaggcgccgc ggctggaaac ccaggcgccg ccgctggaga cgcctacgat ggagaagacc 900tcgacgccct gttcgccgcc gtcgccgaag acgcagagta aggagacgga ggtgggggaa 960aagacggggg cgacgcagac ggtacacccg tagacgaaag agacgcatta agcccaaaaa 1020ctttaaaaac aaactagtac tgactcagtg gcacccctct gtagtgagac gctgctttat 1080caggggcata gtccccattc taatatgcgg gcacacaaaa tggaacagta actacgccct 1140acatagcgag gactacacag aagagggccg ctaccctcac ggagggtccc tctcgaccac 1200tacgtggtct ctaaaggtgc tgtacgacga gtacctgaag caccacaact tctggggcta 1260cccaaacacc cagctagacc tggccagata caggggctgc agcttcacct tctacagaca 1320caaaaagact gactttatag tatggtggaa cagaaagcct ccctttaaac tcaacaagct 1380gagctgcccg tccttccacc caggcatgct catgcaacag aaacacaagg tgctcatccc 1440tagctttgac actaaacccg ggggcagagc taaaattaga gtcaaaataa agccccccac 1500tcttttagag gacaagtggt acactcagca agacttgtgt ccggtaaacc tggcgcaagt 1560tgtggttact gcggctgact ttcaacatcc gttctgctca ccacaaacga acactccaac 1620cacaacgttc caagtgttga aagacattta ttacaacact atgagcatct ctgagccccc 1680agaggcctat actaatgtta ataaaccctc tgagagtaaa ttgtttagca agtactcaga 1740agaactagaa aaaatattat attcaacggg ctcctactgg aactcttttc actccatgga 1800gtaccttaat ccaggcataa cagatacgta caacaataaa atatttaact ctcagcccaa 1860ctcactaata tcttggctgt caacaaaagg cagcaacaac tttcaaactg gaaacagcac 1920ccagtttggc cacaacagct acaacccaaa tgatagtaac attaaatcag ccaggagtgc 1980atactggact gccctaaaca aacctaataa ccttgctgtt aacatagcac aggcaaaggc 2040agagagattc gagtaccacc taggctggta ttctcccata ctactaagca accacagaag 2100caacttaaac tttgccaggg cctaccaaga cgttacttac aaccctaact gtgacagagg 2160tgtaaagaac aaaatatggg ttcagcctct cactaaaccc accacagagt tcgatgaaaa 2220gagatgcaag tgtgtggtan agaacctgcc cctgtgggcg gccttctact gctaccacaa 2280ctttgtagaa gaggagctag gcatttcttc tgagatctac aacgcctgta tagtctgtgt 2340acagtgccct tatacgtctc cccccatgta tgacaagaaa aacccaaata aggggtacgt 2400gttctatgac gccctgtttg gaaacggaaa gaccccagac ggacgcggac aggtagacgt 2460gttctggcag cagcggtggt acccccgcat ggcctgccaa gtgcaagtca tgcacgacat 2520taccatgacc ggaccgttct cctaccacga cgaactagtg agtacacaac tgactgccaa 2580gtacaaattt gacttcatgt ggggtggaaa catgatctcc tcacagatca tcaagaaccc 2640ctgcaaagac acagacatgg acaccaccta tcccagtaga cagcgtcgcg acttacaaat 2700tgttgaccca cactccatgg ggccctcctt cgcgttccac acgtgggact acagacgcgg 2760actgtttggt aaagatgcta tcgacagagt gtcaaaacaa caagacgatg ctccagacta 2820tcctaaccca tacaaaaagc ctagatattt tcccccaaca gacagggcag accttcaagg 2880gcaagaagaa gactggactt tccaggtcga gaagcgaggg gtcgtcgtca gaagagagcg 2940atcaagaagc ccaagaagag gaggtactcc agttccagcc aggacagcag ctccagcaac 3000tccacctgca gctcgcgcag cagcagcaga tcgggcagca gctccgattc ctgttccaac 3060aaatgctcaa aacccaggcc aatctgcacc taaacccata tacatacacc cagctataaa 3120cagggtgttc atgtttgaac cccagggtcc caggcctata actaccagag aggggtggga 3180ggacgagtac agcactgccg gcatctgggg caggcccgtc cgcaccttct acacagacac 3240ccccttctac cccgaggttc ccaaaatgcc tcctcagttt catgtatctt tcaaactcgg 3300ctggaaataa aaatacaagg cctttcactg ttcacttgtc ggtgtctacc tcttaaggtc 3360actaagcact ccgagcgcca gcgaggagtg cgaccccttc ccctggtgca acgccctcgg 3420cggccgcgcg ctacgccttc ggctgcgcgc ggcacctcgg acccccgctc gtgctgacac 3480gcttgcgcgt gtcagaccac ttcgggctcg cgggggtcgg aaattttgct aaacagactc 3540cgagttgcca ttggacactg tagccgtgaa tcagtaacga aagtgagtgg ggccagactt 3600cgccataagg cctttatctt ctcgccattt gtccgtcggg aggggtcgct ccaaacgcgg 3660accccgtttt cagcccttcc ggactacaaa atgggccatt ttagtgacgt aacagctgcc 3720attttaagta aggcggaagc agctccacta tacaaaatgg cggcggagca cttccggctt 3780gcccaaaatg gcggtcaacc tcttccgggt caaaggtgag cagctacgtc ataagtcacg 3840tggnggg 3847<210>2<211>3844<212>DNA<213>病毒<400>2agggttggcg tgtaacccgg aagtcaatcc tcccacatgg cctgtcacgt gactgctacg 60tcacggccgc cattttagtt cacaaaatgg cggacttcct tcctcttttt taaaaattaa 120ccgtcggcgg cgctaccggc gcgcgccctg cgcccccccc ccctcgatgc gcgcggggcc 180cccccccact gccgcccccc ggcccccccc ccgaagtacg ycactaacca cgtgaytccc 240acaggccaat cagagtctaw gtcgtgcact tcctgggcat ggtctacgtc ctaatataag 300taagtgcact tccgaatggc tgagttttcc acgcccgtcc gcagcggtag caccacggaa 360ggtgatcccc gcgtcccgag ggcgggtgcc ggaggtgagt ttacacaccg cagtcaaggg 420gcaattcggg ctcgggactg gccgggctat gggcaaggct cttagggtca tcgctcttaa 480aaatgttttt tggcaggcct tacagaaaaa agaaaagggc gctgctactg tctgagctgc 540cagattcaaa gaagaaacca cctggtgata tgacctggcg ccccccagta cacaatgccg 600ccggcatcga taggcagttc tttgaagcct gctttcgatg ccacagtagt tgctgcggct 660gcggcaattt tattaatcat cttaatgtac tggctactcg ctatggcttt actggggggc 720cggcgccgcc aggtggtcct cggccggcgc cccaagtgag gcccgcgctt cccgcgccgg 780agcccgacgc cccgggcgct gagccgctac catggcgtgg agctggtggt ggcaacgatg 840gaggcgccgc ggctggaaac ccaggcgccg ccgctggaga cgcctacgat ggagaagacc 900tcgacgccct gttcgccgcc gtcgccgaag acgcagagta aggagacgga 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1800atacttaaac cccaatatca cagacactta caaccaaaaa atctttaatt ctcatacaac 1860actaataaat tggctgtcaa ctaaaggcag tgataagttt caaactggta acagcaccca 1920gtttggttac aacagctaca acccaaatga tagtaacatt aaatcagcca ggagtgcata 1980ctggactgcc ctaaacaaac ctaataacct tgctgttaac atagcacagg caaaggcaga 2040gagattcgag taccacctag gctggtattc tcccatacta ctaagcaacc acagaagcaa 2100cttaaacttt gccagggcct accaagacgt tacttacaac cctaactgtg acagaggtgt 2160aaagaacaaa atatgggttc agcctctcac taaacccacc acagagttcg atgaaaagag 2220atgcaagtgt gtggtasaga acctgcccct gtgggcggcc ttctactgct accacaactt 2280tgtagaagag gagctaggca tttcttctga gatctacaac gcctgtatag tctgtgtaca 2340gtgcccttat acgtctcccc ccatgtatga caagaaaaac ccaaataagg ggtacgtgtt 2400ctatgacgcc ctgtttggaa acggaaagac cccagacgga cgcggacagg tagacgtgtt 2460ctggcagcag cggtggtacc cccgcatggc ctgccaagtg caagtcatgc acgacattac 2520catgaccgga ccgttctcct accacgacga actagtgagt acacaactga ctgccaagta 2580caaatttgac ttcatgtggg gtggaaacat gatctcctca cagatcatca agaacccctg 2640caaagacaca gacatggaca ccacctatcc cagtagacag cgtcgcgact tacaaattgt 2700tgacccacac tccatggggc cctccttcgc gttccacacg tgggactaca gacgcggact 2760gtttggtaaa gatgctatcg acagagtgtc aaaacaacaa gacgatgctc cagactatcc 2820taacccatac aaaaagccta gatattttcc cccaacagac agggcagacc ttcaagggca 2880agaagaagac tggactttcc aggtcgagaa gcgaggggtc gtcgtcagaa gagagcgatc 2940aagaagccca agaagaggag gtactccagt tccagccagg acagcagctc cagcaactcc 3000acctgcagct cgcgcagcag cagcagatcg ggcagcagct ccgattcctg ttccaacaaa 3060tgctcaaaac ccaggccaat ctgcacctaa acccatatac atacacccag ctataaacag 3120ggtgttcatg tttgaacccc agggtcccag gcctataact accagagagg ggtgggagga 3180cgagtacagc actgccggca tctggggcag gcccgtccgc accttctaca cagacacccc 3240cttctacccc gaggttccca aaatgcctcc tcagtttcat gtatctttca aactcggctg 3300gaaataaaaa tacaaggcct ttcactgttc acttgtcggt gtctacctct taaggtcact 3360aagcactccg agcgccagcg aggagtgcga ccccttcccc tggtgcaacg ccctcggcgg 3420ccgcgcgcta cgccttcggc tgcgcgcggc acctcggacc cccgctcgtg ctgacacgct 3480tgcgcgtgtc agaccacttc gggctcgcgg gggtcggaaa ttttgctaaa cagactccga 3540gttgccattg gacactgtag ccgtgaatca gtaacgaaag tgagtggggc cagacttcgc 3600cataaggcct ttatcttctc gccatttgtc cgtcgggagg ggtcgctcca aacgcggacc 3660ccgttttcag cccttccgga ctacaaaatg ggccatttta gtgacgtaac agctgccatt 3720ttaagtaagg cggaagcagc tccactatac aaaatggcgg cggagcactt ccggcttgcc 3780caaaatggcg gtcaacctct tccgggtcaa aggtgagcag ctacgtcata agtcacgtgg 3840wggg 3844<210>3<211>2499<212>DNA<213>病毒<400>3cgccactaac cacgtgactc ccacaggcca atcagagtct atgtcgtgca cttcctgggc 60atggtctacg tcctaatata agtaagtgca cttccgaatg gctgagtttt ccacgcccgt 120ccgcagcggt agcaccacgg aaggtgatcc ccgcgtcccg agggcgggtg ccggaggtga 180gtttacacac cgcagtcaag gggcaattcg ggctcgggac tggccgggct atgggcaagg 240ctcttagggt catcgctctt aaaaatgttt tttggcaggc cttacagaaa aaagaaaagg 300gcgctgctac tgtctgagct gccagattca aagaagaaac cacctggtga tatgacctgg 360cgccccccag tacacaatgc cgccggcatc gataggcagt tctttgaagc ctgctttcga 420tgccacgctg gttgctgtgg gtgcggcagt tttattaatc atcttaatgt attggctgct 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100 105 110
Claims (18)
1.一种组合物，所述组合物包括分离的SVI病毒。
2.权利要求1的组合物，其中所述分离的SVI病毒包括SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：5中任一种的多核苷酸序列。
3.一种选自下述的分离的多核苷酸：
可选择性地与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中任一种的核苷酸序列杂交的分离的多核苷酸；
可选择性地与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5中任一种的核苷酸序列杂交的分离的多核苷酸的互补物；
编码一种分离的SVI蛋白或其片段的分离的多核苷酸；以及
编码一种分离的SVI蛋白或其片段的分离的多核苷酸的互补物；
其中，所述分离的多核苷酸的核苷酸序列与TTV毒株SANBAN和TUS01的基因组序列不同。
4.权利要求3的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸是一种反义多核苷酸。
5.一种组合物，所述组合物包括：
分离的SVI蛋白或其片段；其中所述分离的SVI蛋白或其片段在血清学上与TTV毒株SANBAN和TUS01的蛋白不同。
6.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：
一种分离的SVI蛋白或其片段；其中所述分离的SVI蛋白或其片段在血清学上与TTV毒株SANBAN和TUS01的蛋白不同；以及
一种药学可接受的赋形剂。
7.权利要求6的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包括一种佐剂。
8.一种表达载体，所述表达载体包括编码一种SVI蛋白或其片段的分离的多核苷酸；其中所述SVI蛋白或其片段在血清学上与TTV毒株SANBAN和TUS01的蛋白不同。
9.一种表达载体，所述表达载体包括一种分离的多核苷酸；其中，所述分离的多核苷酸的转录导致一种SVI反义多核苷酸的产生；其中所述SVI反义多核苷酸不是将与来自TTV毒株SANBAN和TUS01的RNA转录物形成双链体的反义多核苷酸。
10.一种与SVI病毒或其蛋白结合的分离的多克隆抗体，其中所述抗体不与TTV毒株SANBAN和TUS01或其蛋白结合。
11.一种与SVI病毒或其蛋白结合的单克隆抗体，其中所述抗体不与TTV毒株SANBAN和TUS01或其蛋白结合。
12.一种检测SVI病毒的方法，所述方法包括：
使样品与一种与SVI病毒或其蛋白结合的抗体接触，其中所述抗体不与TTV毒株SANBAN和TUS01或其蛋白结合；以及
检测所述抗体与SVI病毒或其蛋白的复合物。
13.一种用于检测SVI病毒的方法，所述方法包括：
使样品与一种选择性地同SVI多核苷酸杂交的探针多核苷酸接触，其中所述探针不会选择性地与TTV毒株SANBAN的多核苷酸或TTV毒株TUS01的多核苷酸杂交；以及
检测所述探针与SVI多核苷酸的杂交。
14.一种与SVI病毒结合的抗体；其中，所述病毒的基因组包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5中的任何一种。
15.权利要求14的抗体，其中所述抗体为一种单克隆抗体。
16.权利要求14的抗体，其中所述抗体为一种分离的多克隆抗体。
17.一种检测SVI病毒的方法，所述方法包括：
使样品与一种与病毒或其蛋白结合的抗体接触；其中，所述病毒的基因组包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4以及SEQ ID NO：5中的任何一种；以及
检测所述抗体与SVI病毒或其蛋白的复合物。
18.一种用于检测SVI病毒的方法，所述方法包括：
使样品与一种选择性地和靶多核苷酸杂交的探针多核苷酸接触，其中，所述靶多核苷酸是病毒基因组的一部分，且所述病毒基因组包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5中的任何一种；以及
检测所述探针与所述靶的杂交。
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