CN1942583A

CN1942583A - Hpv58l1在酵母中的最优化表达

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Publication number: CN1942583A
Application number: CNA2004800332355A
Authority: CN
Inventors: J·T·布赖恩; M·K·布朗洛夫; L·D·舒尔茨; 王心民; K·U·扬森
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2003-11-12
Filing date: 2004-11-10
Publication date: 2007-04-04
Anticipated expiration: 2024-11-10
Also published as: WO2005047315A2; FR15C0081I2; EP1687329B1; AR046835A1; NZ546697A; PT1687329E; IL175353A; EP1687329A2; HUS1500064I1; JP5616879B2; NO20062674L; DE602004024821D1; ES2340287T3; US7498036B2; FR15C0081I1; US20070036824A1; TW200519203A; WO2005047315A3; IS2741B; IL175353A0

Abstract

提供了编码HPV58 L1蛋白的合成DNA分子。具体而言，本发明提供了编码HPV58 L1蛋白的多核苷酸，其中为在酵母细胞中高水平表达，所述多核苷酸被密码子最优化。合成分子可以用于产生HPV58病毒样颗粒(VLPs)，和产生包含HPV58 VLPs的疫苗和药物组合物。本发明的疫苗通过中和抗体和细胞介导免疫，提供了抵抗乳头瘤病毒感染的有效免疫预防，并且也可用于存在的HPV感染的治疗。

Description

HPV 58 L1在酵母中的最优化表达

发明领域

本发明总的来说涉及人乳头瘤病毒(HPV)感染的预防和/或治疗。更具体而言，本发明涉及编码HPV58 L1蛋白的合成的多核苷酸，和包含所述多核苷酸的重组载体和宿主。本发明还涉及HPV58病毒样颗粒(VLPs)，其中VLPs通过在酵母细胞中表达重组HPV 58 L1或L1+L2而产生，和涉及它们在预防和治疗HPV感染的疫苗和药物组合物中的用途。

发明背景

有80种以上人乳头瘤病毒(HPV)，其中很多与各式各样的生物学表型相关，所述生物学表型为从良性增生性疣到恶性癌(综述参见McMurray等人，Int.J.Exp.Pathol.82(1)：15-33(2001))。HPV6和HPV11是与生殖器或呼吸粘膜的良性疣、非恶性尖锐湿疣和/或轻度发育不良相关的最普通类型。HPV16和HPV18是与子宫颈、阴道、女阴和肛管的原位和侵袭性癌最常相关的高风险类型。90％以上的子宫颈癌与HPV16、HPV18或较少流行的致癌类型HPV31、-33、-45、-52和-58的感染相关(Schiffman等人，J.Natl.Cancer Inst.85(12)：958-64(1993))。在90％以上子宫颈癌中检测到HPV DNA的观察结果提供了HPVs引起子宫颈癌的强大流行病学证据。

乳头瘤病毒是小(50-60nm)、无包膜、二十面体的DNA病毒，其编码最多八个早期和两个晚期基因。该病毒基因组的可读框(ORFs)命名为E1至E7，和L1和L2，其中“E”表示早期和“L”表示晚期。L1和L2编码病毒衣壳蛋白，而E基因与如病毒复制和细胞转化的功能相关。

L1蛋白是主要的衣壳蛋白并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要的衣壳蛋白。免疫学数据提示在病毒衣壳中，大多数L2蛋白位于L1蛋白内部。在不同乳头瘤病毒中，L1和L2蛋白都高度保守。

L1蛋白或L1和L2蛋白组合在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中的表达导致病毒样颗粒(VLPs)的自动装配(综述参见Schiller和Roden，in Papillomavirus Reviews：Current Researchon Papillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UK：Leeds MedicalInformation，pp 101-12(1996))。VLPs形态上类似于真的病毒体且在施用于动物或人后能够诱导高效价的中和抗体。因为VLPs不含有潜在地致癌病毒基因组，所以它们为活病毒在HPV疫苗开发中的用途提供了安全的备选方案(综述参见Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.19：67-74(2000))。由于这个原因，L1和L2基因已经被确定为HPV感染和疾病的预防和治疗性疫苗开发的免疫学靶。

与在成功转化的宿主生物中获得高表达水平的衣壳蛋白、限制纯化蛋白的生产相关的困难已阻碍了HPV疫苗开发和商业化。因此，尽管鉴定了编码HPV L1蛋白如HPV58 L1蛋白的野生型核苷酸序列，但是非常期望开发粗HPV L1蛋白的可容易更新来源，该蛋白利用在指定宿主细胞中表达被最优化的编码HPV58 L1的核苷酸序列。另外，产生具有天然蛋白的赋予免疫性性质的用于疫苗开发的大量HPV58L1 VLPs将有用处。

发明概述

本发明涉及引发或增强由HPV58 L1基因表达的蛋白产物的免疫性的组合物和方法。具体而言，本发明提供了编码HPV58 L1蛋白的多核苷酸，其中为在酵母细胞中高水平表达，多核苷酸已被密码子最优化。本发明进一步提供了HPV58病毒样颗粒(VLPs)，其中所述VLPs通过重组HPV58 L1或L1+L2在酵母细胞中表达而产生，并公开了HPV58 VLPs在预防和/或治疗HPV相关癌症的药物组合物和疫苗中的用途。

本发明涉及编码HPV58 L1蛋白的合成DNA分子。设计合成分子的密码子以使得使用酵母细胞优选的密码子。合成分子可以用作HPV58 L1蛋白的来源，它可以自动装配入VLPs。所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗。

本发明的示例性实施方案包括编码如SEQ ID NO：2所列的HPV58L1蛋白的合成核酸分子，所述核酸分子包含为在酵母细胞中高水平表达而最优化的密码子的核苷酸序列。在优选实施方案中，该核酸包含如SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列(在此命名为“58 L1 R序列”)。

还提供了含有贯穿本说明书公开的核酸分子的重组载体和重组宿主细胞，其可为原核和真核的。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。

本发明还涉及在重组宿主细胞中表达HPV58 L1蛋白的方法，其包括：(a)将包含编码HPV58 L1蛋白的核酸的载体导入酵母宿主细胞；和(b)在允许表达所述HPV58 L1蛋白的条件下培养该酵母宿主细胞。

本发明进一步涉及在重组宿主细胞中表达HPV58 L1蛋白的方法，其包括：(a)将包含编码HPV58 L1蛋白的核酸分子的载体导入酵母宿主细胞；其中为在酵母宿主细胞中最佳表达，该核酸分子被密码子最优化和；(b)在允许表达所述HPV58 L1蛋白的条件下培养该酵母宿主细胞。

在本发明这个方面的优选实施方案中，该核酸包含如SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

本发明还涉及酵母细胞中产生的HPV58病毒样颗粒(VLPs)，产生HPV58 VLPs的方法和使用HPV58 VLPs的方法。

在本发明的优选实施方案中，酵母选自：啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

本发明的另一方面是HPV58 VLP，其中VLP通过HPV58 L1或HPV58L1+L2在酵母细胞中重组表达产生。

本发明的又一个方面是HPV58 VLP，它包含由密码子最优化的HPV58 L1基因产生的HPV58 L1蛋白。在本发明这个方面的示例性实施方案中，该密码子最优化的HPV58 L1基因包含如SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

本发明还提供了在动物中诱导免疫反应的方法，其包括给该动物施用HPV58病毒样颗粒。在优选实施方案中，HPV58 VLPs由密码子最优化的基因产生。

本发明的又一个方面是预防或治疗HPV相关的子宫颈癌的方法，其包括给哺乳动物施用包含HPV58 VLPs的疫苗。在本发明这个方面的优选实施方案中，HPV58 VLPs在酵母中产生。

本发明还涉及包含HPV58病毒样颗粒(VLPs)的疫苗，其中HPV58VLPs在酵母中产生。

在本发明这个方面的可供选择的实施方案中，疫苗进一步包含至少一个另外的HPV类型的VLPs。至少一个另外的HPV类型可以是感兴趣的任何HPV类型，包括本领域描述过或随后鉴定的任何HPV类型。在优选实施方案中，HPV类型是与临床表型如疣或子宫颈癌相关的类型。在进一步优选实施方案中，至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。

本发明还涉及包含HPV 58病毒样颗粒和药物可接受载体的药物组合物，其中HPV58 VLPs在酵母中产生。此外，本发明涉及包含HPV58VLPs和至少一个另外的HPV类型的VLPs的药物组合物。在优选实施方案中，至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。

如贯穿本说明书和附加权利要求使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文清楚地作出不同指示。

如贯穿本说明书和附加权利要求使用的，应用下列定义和缩写：

术语“启动子”是指DNA链上RNA聚合酶结合的识别位点。启动子与RNA聚合酶形成起始复合物以启动和驱动转录活动。该复合物可以被称为“增强子”或“上游激活序列”的激活序列或称为“沉默子”的抑制序列修饰。

术语“载体”是指通过它，DNA片段可以被导入宿主生物或宿主组织的一些工具。有各种类型的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌体和粘粒。

术语“盒”是指待从载体表达的核苷酸或基因序列，例如编码HPV58L1蛋白的核苷酸或基因序列。通常，该盒包含插入载体的基因序列，在一些实施方案中，该载体提供用于表达所述核苷酸或基因序列的调节序列。在其它实施方案中，该核苷酸或基因序列提供用于它表达的调节序列。在进一步的实施方案中，该载体提供一些调节序列，且所述核苷酸或基因序列提供其它的调节序列。例如，该载体可以提供用于转录所述核苷酸或基因序列的启动子，且所述核苷酸或基因序列提供转录终止序列。载体可以提供的调节序列包括但不限于增强子、转录终止序列、剪接受体和供体序列、内含子、核糖体结合序列和聚腺苷酸添加序列。

名称“58 L1野生型序列”和“58 L1 wt序列”是指在此公开为SEQ ID NO：3的HPV58 L1序列。尽管以前已经描述了HPV 58 L1野生型序列，但是从临床分离物获得的DNAs之间找到较小的序列变异并不罕见。因此，代表性的58 L1野生型序列分离自以前表明含有HPV 58 DNA的临床样品(参见实施例1)。58 L1野生型序列被用作参照序列来比较在此公开的密码子最优化的58 L1序列(参见图1)。

名称“HPV 58 L1 R”和“58 L1 R”是指示例的在此公开的合成HPV58 L1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其中该序列被重建，从而它包含为酵母细胞高水平表达而优选的密码子。

术语“有效量”意思是足够的疫苗组合物被导入以产生足够水平的多肽，从而产生免疫反应。本领域技术人员认识到这个水平可以变化。

“保守性氨基酸置换”是指一个氨基酸残基被另一个化学上类似的氨基酸残基取代。这种保守性置换的实例是：一个疏水性残基(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸)置换另一个；一个极性残基置换相同电荷的另一个极性残基(例如精氨酸置换赖氨酸；谷氨酸置换天冬氨酸)。

术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人。

“VLP”或“VLPs”是指病毒样颗粒或多种病毒样颗粒。

“合成的”是指产生了HPV58 L1基因，从而它含有不同于指定的天然存在的野生型HPV58 L1基因中存在的核苷酸序列(58 L1 wt，SEQID NO：3)的核苷酸序列。如上所述，在此提供了合成分子，它包含含有为酵母细胞表达而优选的密码子的核苷酸序列。在此提供的合成分子编码与野生型HPV58 L1基因(SEQ ID NO：2)相同的氨基酸序列。

附图简述

图1显示了比较本发明的合成HPV58 L1基因中改变的核苷酸(SEQ ID NO：1，显示为“58 L1 R”)(参见实施例2)的序列比对。参照序列是58 L1野生型序列(SEQ ID NO：3，显示为“58 L1 wt”；参见实施例1)。改变的核苷酸在它们的相应位置显示。括号内含有核苷酸号。58 L1重建序列中相同的核苷酸用点显示。

图2显示了重建合成的HPV 58 L1双链核酸和上面的单密码氨基酸序列。核苷酸号示于左侧。

图3显示了HPV 58 L1 wt和58 L1 R转录物的RNA印迹(参见实施例4)。用等量DIG标记的58L1 wt和58 L1 R DNA探针的混合物探测印迹。显示了每个泳道中电泳的总RNA的量。右方箭头指出预测大小的全长58 L1转录物。

图4显示了HPV 58 L1 wt(58)和58 L1 R(58R)蛋白的蛋白印迹。HPV 16 L1被包括作为参照(16)。10、5和2.5微克总酵母蛋白提取物被变性和应用于10％ SDS-PAGE凝胶。使用与58 L1和16 L1交叉反应的酵母吸收的抗trpE-HPV 31 L1山羊多克隆抗血清检测HPV58 L1蛋白。分子量标记在左方以kDa显示。

图5描绘了ELISA中捕获和检测的每微克总酵母蛋白的完整HPV58 L1 VLPs的量(ng)(参见实施例7)。包括了一式两份实施的两个实验结果。HPV 58 L1 wt(黑色和灰色方框)的VLP表达是36ng/μg总酵母蛋白。重建酵母密码子最优化的58 L1-HPV 58 L1 R(白色和阴影方框)的VLP表达为HPV 58 L1 wt表达的约2～3倍，在实验#2中达到95ng/μg总酵母蛋白。

图6显示了由在此描述的HPV 58 L1 R蛋白分子组成的HPV 58VLPs的代表性样品，如通过透射电子显微镜术可见的(参见实施例8)。那个条代表大约100nm。

发明详述

大多数子宫颈癌与特异致癌类型的人乳头瘤病毒(HPV)感染相关。本发明涉及引发或增强对由致癌HPV类型的基因表达的蛋白产物的免疫性的组合物和方法。具体而言，本发明提供了编码HPV58 L1的多核苷酸，其中为在酵母中高水平的表达，该多核苷酸已被密码子最优化。本发明还提供了HPV58病毒样颗粒(VLPs)，它在酵母中产生，并公开了所述多核苷酸和VLPs在预防和/或治疗HPV相关癌症的药物组合物和疫苗中的用途。

已经报道了野生型HPV58 L1核苷酸序列(Genbank登记号#NC_001443，参见Kirii等人.Virology 185(1)：424-427(1991))。本发明提供了编码HPV58 L1蛋白的合成DNA分子。本发明的合成分子包含密码子序列，其中为高水平表达，至少一些密码子已经被改变而使用酵母细胞优选的密码子。合成分子可以用作HPV58 L1蛋白表达的编码序列，它可以自动装配入VLPs。所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗，以通过中和抗体和细胞介导免疫提供抗乳头瘤病毒感染的有效免疫预防。这种基于VLP的疫苗还可用于已建立的HPV感染的治疗。

HPV VLPs在酵母细胞中的表达提供了节省成本的和易于适应在发酵罐中大规模生长的优点。另外，酵母基因组可以轻易地被改变以确保生长和表达潜力增加的重组体、转化酵母的选择。然而，许多HPV L1蛋白，包括HPV58 L1在酵母细胞中以低于商业上按比例扩大所希望的水平表达。

因此，本发明涉及为在酵母细胞环境中高水平表达而被“最优化”的HPV58 L1基因序列。

四个可能的核苷酸碱基的“三联体”密码子可存在60个以上的变异形式。因为这些密码子为仅20个不同的氨基酸(以及转录起始和终止)提供了信息，所以一些氨基酸可以由一个以上密码子编码，即被称为密码子丰余性的现象。由于未完全理解的原因，可替换的密码子不是均匀存在于不同类型细胞的内源DNA中的。实际上，在某些类型细胞中，对于某些密码子，似乎存在可变自然等级制或“偏爱”。作为一个实例，氨基酸亮氨酸用六个DNA密码子中的任何一个来指定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG。微生物基因组密码子使用频率的全面分析揭示了大肠杆菌(E.coli)内源DNA最通常含有CTG指定酪氨酸的密码子，而酵母和粘菌的DNA最通常包括TTA指定亮氨酸的密码子。考虑到这个等级，普遍认为由大肠杆菌宿主获得富含亮氨酸多肽的高水平表达的可能性将在某种程度上取决于密码子使用的频率。例如，很可能富含TTA密码子的基因将在大肠杆菌中低表达，而富含CTG的基因或许将在这个宿主中高表达。类似地，在酵母宿主细胞中表达富含亮氨酸的多肽的优选密码子将是TTA。

密码子偏爱现象对重组DNA技术的含义是显然的，并且该现象可以用来解释获得外源基因在成功转化的宿主生物中的高表达水平的很多早先失败-较不“优选的”密码子可能重复存在于插入的基因中和用于表达的宿主细胞机器可能未有效运作。这个现象提示已设计包括计划的宿主细胞优选密码子的合成基因提供了用于实施重组蛋白表达的外来遗传材料的最佳形式。因此，本发明的一个方面是为在酵母细胞中高水平表达而被密码子最优化的HPV58 L1基因。在本发明的优选实施方案中，已经发现编码相同蛋白序列的可替换密码子的使用可以消除对酵母细胞表达HPV58 L1蛋白的约束因素。

根据本发明，HPV58 L1基因片段转变为具有相同翻译序列，但具有Sharp和Cowe(Synonymous Codon Usage in Saccharomycescerevisiae.Yeast 7：657-678(1991))描述的可替换密码子使用的序列，该文献在此引入作为参考。该方法通常由下列组成，鉴定通常与高表达酵母基因不相关的野生型序列中的密码子并用在酵母细胞中高表达的最佳密码子取代它们。然后检查该新基因序列中通过这些密码子取代而产生的非期望序列(例如“ATTTA”序列、内含子剪接识别位点的非故意产生物、不需要的限制性内切酶位点、高GC含量、酵母识别的转录终止信号的存在等等)。用编码相同氨基酸的不同密码子置换存在的密码子来消除非期望序列。然后检测合成基因片段提高的表达。

将如上所述方法用来产生HPV58 L1的合成基因片段，从而产生包含为高水平表达而最优化的密码子的基因。虽然上述方法提供了我们的设计用于HPV疫苗的密码子最优化基因的方法概要，但是本领域技术人员理解类似的疫苗功效或基因表达增加可以通过方法中的小变化或通过该序列中的小变异而实现。

因此，本发明涉及包含编码HPV58 L1蛋白或HPV58 L1蛋白的生物学活性片段或突变形式的核苷酸序列的合成多核苷酸，该多核苷酸序列包含为在酵母宿主细胞中表达而最优化的密码子。所述突变形式的HPV58 L1蛋白包括但不限于保守性氨基酸置换、氨基末端截短、羧基末端截短、缺失或添加。任何这种生物学活性片段和/或突变体将编码至少基本上模拟SEQ ID NO：2所列HPV58 L1蛋白的免疫学性能的蛋白或蛋白片段。本发明的合成多核苷酸编码表达功能性HPV58L1蛋白的mRNA分子，从而在治疗或预防性HPV疫苗开发中有用。

本发明的一个方面是编码SEQ ID NO：2所列的HPV58 L1蛋白的密码子最优化的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO：1所列的的核苷酸序列。

本发明还涉及含有贯穿本说明书公开的核酸分子的重组载体和重组宿主细胞，其可为原核和真核的。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞是酵母宿主细胞。

通过在此描述的方法构建的合成HPV58 DNA或其片段可以通过分子克隆入含有合适启动子和其它适当转录调节元件的表达载体，并转移到原核或真核宿主细胞产生重组HPV58 L1而被重组表达。Sambrook等人.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人，Green Pub.Associates and Wiley-Interscience，New York(1988)；YeastGenetics：A Laboratory Course Manual，Rose等人，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1990))充分描述了这种操作的技术，它们的全部内容在此被引入作为参考。

因此，本发明涉及在重组宿主细胞中表达HPV58 L1蛋白的方法，其包括：(a)将包含编码HPV58 L1蛋白的核酸的载体导入酵母宿主细胞；和(b)在允许表达所述HPV58 L1蛋白的条件下培养该酵母宿主细胞。

本发明进一步涉及在重组宿主细胞中表达HPV58 L1蛋白的方法，其包括：(a)将包含编码HPV58 L1蛋白的核酸的载体导入酵母宿主细胞；其中为在酵母宿主细胞中最佳表达，该核酸分子被密码子最优化和；(b)在允许表达所述HPV58 L1蛋白的条件下培养该酵母宿主细胞。

本发明进一步涉及在重组宿主细胞中表达HPV58 L1蛋白的方法，其包括：(a)将包含SEQ ID NO：1所列的核酸的载体导入酵母宿主细胞；和(b)在允许表达所述HPV58 L1蛋白的条件下培养该酵母宿主细胞。

本发明的合成基因可以装配入包含设计提供HPV58 L1蛋白在宿主细胞中有效表达的序列的表达盒。该盒优选含有合成基因，相关的转录和翻译控制序列与其可操作地连接，如启动子和终止序列。在优选实施方案中，启动子是啤酒糖酵母GAL1启动子，尽管本领域技术人员将认识到可以使用很多其它已知的酵母启动子如GALl0、GAL7、ADH1、TDH3或PGK启动子中的任何一种，或使用其它真核基因启动子。优选的转录终止子是啤酒糖酵母ADH1终止子，尽管也可以使用其它已知的转录终止子。特别优选GAL1启动子-ADH1终止子的组合。

本发明进一步提供了包含SEQ ID NO：2所列的氨基酸序列的分离和纯化的HPV 58 L1多肽。

本发明的另一方面是通过HPV58 L1或L1+L2基因在酵母细胞中重组表达产生的HPV58病毒样颗粒(VLP)、产生HPV58 VLPs的方法和使用HPV58 VLPs的方法。当人和动物乳头瘤病毒的主要衣壳蛋白L1在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中表达时，VLPs可以自动装配(综述参见Schiller和Roden，in Papillomavirus Reviews：Current Research on Papillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UK：Leeds Medical Information，pp 101-12(1996))。形态学不清楚的HPV VLPs还可以通过L1和L2衣壳蛋白的组合表达而产生。VLPs由L1的72个五邻体组成，为T＝7的二十面体结构(Baker等人，Biophys.J.60(6)：1445-56(1991))。

VLPs形态学上类似于真的病毒体且在施用于动物后能够诱导高效价的中和抗体。用VLPs免疫兔(Breitburd等人，J.Virol.69(6)：3959-63(1995))和狗(Suzich等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25)：11553-57(1995))表明诱导中和抗体和保护免受实验性乳头瘤病毒感染。然而，因为VLPs不含有潜在的致癌病毒基因组并且当从单个基因表达时可以自动装配，所以它们为活病毒在HPV疫苗开发中的用途提供了安全的备选方案(综述参见Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.19：67-74(2000))。

因此，本发明涉及包含HPV58的重组L1蛋白或重组LI+L2蛋白的病毒样颗粒，其中重组蛋白在酵母细胞中表达。

如上所述，在本发明的优选实施方案中，HPV58 VLPs在酵母中产生。在进一步优选实施方案中，酵母选自：啤酒糖酵母、多形汉逊氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。

本发明的另一方面是HPV58 VLP，它包含由密码子最优化的HPV58L1基因产生的HPV58 L1蛋白。在本发明这个方面的优选实施方案中，该密码子最优化的HPV58 L1基因包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

本发明的又一个方面是产生HPV58 VLPs的方法，其包含：(a)用编码HPV58 L1蛋白或HPV58 L1+L2蛋白的重组DNA分子转化酵母；(b)在允许表达重组DNA分子的条件下培养转化的酵母，以产生重组HPV58蛋白；和(c)分离重组HPV58蛋白以产生HPV58 VLPs。

在本发明这个方面的优选实施方案中，用密码子最优化的HPV58L1基因转化酵母以产生HPV58 VLPs。在特别优选实施方案中，该密码子最优化的HPV58 L1基因包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

本发明的又一个方面是预防和/或治疗HPV相关的子宫颈癌的方法，其包括给哺乳动物施用包含HPV58 VLPs的疫苗。在本发明这个方面的优选实施方案中，HPV58 VLPs在酵母中产生。

本发明还涉及包含HPV58病毒样颗粒(VLPs)的疫苗。

在本发明这个方面的可供选择的实施方案中，疫苗进一步包含至少一个另外的HPV类型的VLPs。在优选实施方案中，至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。

在本发明这个方面的优选实施方案中，疫苗进一步包含HPV16VLPs。

在本发明另一个优选实施方案中，疫苗进一步包含HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。

在本发明又一个优选实施方案中，疫苗进一步包含HPV16 VLPs、HPV11 VLPs、HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。

本发明还涉及包含HPV 58病毒样颗粒的药物组合物。此外，本发明涉及包含HPV58 VLPs和至少一个另外的HPV类型的VLPs的药物组合物。在优选实施方案中，至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。

本发明的疫苗组合物可以以允许以最小的潜在毒性最佳抑制HPV58感染的适当剂量单独使用。另外，可能期望其它试剂的共同施用或顺序施用。

引入疫苗受体的病毒样颗粒量将取决于表达的基因产物的免疫原性。通常，将大约10μg至100μg，和优选大约20μg至60μg VLPs的免疫学或预防有效剂量直接施用于肌肉组织。也预期皮下注射、皮内导入、通过皮肤印膜和其它施用模式如腹膜内、静脉内或吸入递送。也预期可以提供加强接种。肠胃外施用，如静脉内、肌内、皮下或用佐剂如明矾或Merck铝佐剂与本发明疫苗的肠胃外导入同时或在本发明疫苗肠胃外导入之后的其它施用方法，也是有益的。

为描述和公开可以关于本发明使用的方法和材料的目的，将在此提及的所有出版物都引入作为参考。在此什么也不被认为是承认本发明无权依靠在先发明而早于这种公开内容。

已经参照附图描述了本发明的优选实施方案，应当理解本发明不限于那些确切的实施方案，而且本领域技术人员在其中可以实行各种改变和修改，而不背离附加权利要求所限定的本发明的范围或精神。

下列实施例阐明但不限制本发明。

实施例1

代表性的HPV 58 L1序列的测定

以前已经描述了HPV 58 L1序列(Genbank登记号#NC_001443)。然而从临床分离物获得的DNAs之间找到较小的序列变化并不罕见。为测定代表性的HPV58 L1野生型序列，从以前表明含有HPV58 DNA的三个临床样品分离DNA。以聚合酶链反应(PCR)扩增HPV 58 L1序列，其中使用Taq DNA聚合酶和下列引物： HPV 58 L1 F 5′-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT-3’(SEQ ID NO：4)和 58 3′ 11 BglII 5’-GAGATCTGTGTAAGTACCACAACAATTA-3’(SEQ ID NO：5)。将扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳并通过溴化乙锭染色显现。切割～1500bp L1条带并使用Geneclean Spin试剂盒(Q-Bio Gene，Carlsbad，CA)纯化DNA。然后将DNA连接至TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。用连接混合物转化TOP10F′大肠杆菌并铺平板在含氨苄青霉素加IPTG和X-gal的LB琼脂上进行蓝/白菌落选择。倒置平板并在37℃培养16小时。白色菌落在含氨苄青霉素的LB培养基中于37℃振荡培养16小时。实施小量制备以提取质粒DNA。

为证明质粒中L1基因的存在，实施限制性内切核酸酶消化。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色观察限制片段。对含有来自三个临床分离物每一个的克隆L1插入片段的质粒进行DNA测序。为了产生进行随后最优化的参照序列，将来自每一克隆的核苷酸和翻译的氨基酸序列与公开的HPV 58 L1序列相比。三个临床分离物的序列分析揭示没有序列与Genbank序列相同。pCR2.1HPV 58L1克隆#4被选为代表性的58 L1序列并且在此可互换地被称为“58 L1野生型序列”或“58 wt序列”(SEQ ID NO：3，参见图1)。58 L1 wt序列含有五个点突变：两个导致氨基酸改变和三个沉默点突变。导致关于GenbankHPV 58 L1序列的氨基酸改变的点突变位于核苷酸第372位(A-＞T)，其导致第124位氨基酸由亮氨酸变为苯丙氨酸，和核苷酸第897位(A-＞G)，其导致第299位氨基酸由异亮氨酸变为甲硫氨酸。三个沉默点突变位于核苷酸第774位(A-＞G)、第792位(T-＞C)和第999位(G-＞A)。

使用Taq聚合酶及其下列引物，PCR扩增58 L1野生型序列，所述引物添加了BamHI突出端： 5′58 BamHI 5’-GGGATCCCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3’(SEQ ID NO：6)和3′ Bam 58 5’-GGGATCCGTGTAAGTACCACAACAATTA-3’(SEQ ID NO：7)。通过琼脂糖凝胶电泳，随后通过溴化乙锭染色使产生的PCR产物显现。切割～1500bp条带并使用Geneclean试剂盒纯化DNA。然后将PCR产物连接至pCR2.1并用连接混合物转化TOP10F′细胞。选择白色菌落并在含氨苄青霉素的LB培养基中于37℃振荡培养16小时。实施小量制备以提取质粒DNA。为了使HPV 58 L1基因从载体序列释放，进行BamHI限制性内切核酸酶消化。使消化的DNA进行琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色进行观察。使用Geneclean试剂盒纯化L1条带并连接至去磷酸化的、BamHI消化的pGAL110。用连接混合物转化DH5α大肠杆菌细胞。为了筛选正确方向的HPV 58 L1插入片段，PCR扩增来自菌落的质粒DNA。进行DNA测序来证实插入片段的序列和方向。选择单个克隆并命名为pGAL110-HPV 58L1 #10。制备所选克隆的Maxiprep DNA。通过用蜗牛酶进行原生质球形成(spheroplasting)使啤酒糖酵母细胞成为感受态并用pGAL110-HPV 58L1 #1转化。将酵母转化混合物铺平板在Leu(-)山梨糖醇琼脂平板上Leu(-)山梨糖醇顶层琼脂中并在30℃倒置培养3-5天。挑取菌落并在Leu(-)山梨糖醇琼脂平板上划线进行分离。分离的菌落随后在旋转管培养中含1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5X Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中于30℃生长以诱导58 L1转录和蛋白表达。

实施例2

酵母密码子最优化

已经描述了酵母优选的密码子(Sharp，Paul M和Cowe，Elizabeth.Synonymous Codon Usage in Saccharomycescerevisiae YEAST 7：657-678(1991))。HPV 58 L1 wt蛋白的表达可检测到，然而为获得增加的表达，利用优选酵母密码子重建HPV 58L1基因。包含酵母最优化密码子序列的重建58 L1序列与58 L1 wt序列相比含有404个核苷酸改变。所得序列在此称作“58 L1 R”(R＝重建，参见图1)。58 L1 R翻译的氨基酸序列没有改变。HPV 58 L1 R的核苷酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸(SEQ ID NO：2)序列在图2中显示。所述重建序列提供了增加的HPV 58 L1表达，这是用于疫苗开发的超过野生型的显著进步(参见实施例4)。

用于产生最优化基因的策略是设计跨越基因的长重叠有义和反义寡聚体，用酵母优选密码子序列置换核苷酸，而保持氨基酸序列。这些寡聚体在使用Pfu聚合酶的PCR反应中用来代替模板DNA。设计另外的扩增引物并用于从模板寡聚体扩增重建序列。

扩增的最佳条件是片段特异性的，然而，大多数使用类似95℃2分钟(变性)，随后为35个循环的95℃1分钟(变性)、55℃1分钟(退火)、72℃3.5分钟(延伸)，之后为72℃10分钟最终延伸和4℃保存的程序。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切除适当大小的条带并凝胶纯化DNA。然后将扩增片段用作模板以装配1497nt的重建HPV 58L1基因。

重建之后，凝胶纯化1497nt条带并连接至pCR-Blunt载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。连接后，用连接混合物转化TOP10细胞。使菌落在含卡那霉素的LB中生长并用小量制备技术从菌落中提取质粒DNA。对质粒DNA进行测序以证实期望的58 L1重建改变。为向两端添加BamHI突出端，用下列引物从pCR-Blunt-58 L1 R再扩增58 L1 R(重建)： 5′Bam 58重建5’-GGATCCCACAAAACAAAATGTCTGTCTGGAGACC-3’(SEQ ID NO：8)和 3′Bam 58重建5’-GGATCCTTACTTCTTGACCTTC-3’(SEQ ID NO：9)。

使用Geneclean试剂盒凝胶纯化扩增的L1产物并克隆入pCR2.1(Invitrogen)。用pCR2.1质粒转化Top10F′细胞。使白色菌落在含氨苄青霉素的LB培养基中于37℃振荡培养16小时。实施小量制备以提取质粒DNA。为了使HPV 58 L1基因从载体序列释放，进行BamHI限制性内切核酸酶消化。使消化的DNA进行琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色进行观察。使用Geneclean试剂盒纯化L1条带并连接至去磷酸化的、BamHI消化的pGAL110。用连接混合物转化DH5α大肠杆菌细胞。

通过PCR筛选产生的菌落中正确方向的HPV 58 L1插入片段。制备Maxiprep DNA。通过限制酶切消化谱和DNA测序证实序列和方向。将选择的克隆命名为pGAL110-HPV 58L1R #17。通过原生质球形成使啤酒糖酵母细胞成为感受态并用pGAL110-HPV 58L1R #1转化。将酵母转化混合物铺平板在Leu(-)山梨糖醇琼脂平板上Leu(-)山梨糖醇顶层琼脂中并在30℃倒置培养3-5天。挑取菌落并在Leu(-)山梨糖醇琼脂平板上划线进行克隆分离。分离的菌落随后在旋转管培养中含1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5X Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中于30℃生长以诱导L1转录和蛋白表达。48小时后，沉淀相当于OD₆₀₀＝10量的培养体积的细胞，除去上清液和冷冻沉淀并保存在-70℃。

实施例3

RNA制备

在冰上解冻由半乳糖诱导而诱导表达HPV 58 L1或HPV 58 L1 R的转化酵母细胞的细胞沉淀，悬浮在0.8ml Trizol试剂(LifeTechnologies，Gibco BRL)中并在室温下温育5分钟。向小瓶中添加五分之一体积的氯仿。然后用力振荡15秒以混合并在室温下温育3分钟。以13k rpms离心5分钟后，收集上层相并转移到新的小瓶。添加0.4ml异丙醇并在室温下温育10分钟。为沉淀RNA，以13k rpms离心10分钟。倾析上清液，用75％EtOH洗涤RNA沉淀并重复离心。倾析上清液和允许RNA沉淀风干15分钟，随后是悬浮于无RNA酶的水中。实施分光光度测定法，以使用当A_260/280是1.7-2.0时，A₂₆₀读数为1＝40μg/ml的RNA的假定来确定样品中RNA浓度。

实施例4

RNA印迹分析

浇铸1.1％琼脂糖甲醛凝胶。将5和10微克RNA与变性缓冲液组合(终浓度：6％甲醛、50％甲酰胺和0.1x MOPS)并加热到65℃10分钟。添加十分之一体积凝胶加样缓冲液并将样品加到凝胶上。以75伏特在1x MOPS缓冲液中电泳～3小时。凝胶在10x SSC中洗涤60分钟。

通过在10x SSC中毛细管作用超过16小时，将RNA转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。然后使用Stratagene UV Stratalinker自动交联功能(Stratagene，LaJolla，CA)，通过交联将RNA固定到尼龙膜上。固定后，使尼龙膜风干。

将Roche DIG High Prime DNA标记和检测试剂盒I(Hoffmann-LaRoche Ltd.，Basel，瑞士)用于用DIG标记58 L1 wt和58 L1 R DNA序列，以用作探针混合物来检测RNA印迹上的58 L1 wt和58 L1 R转录物。使用抗DIG碱性磷酸酶缀合的抗体按照制造商的推荐进行预杂交、杂交和免疫显影。简言之，印迹在37℃温和振荡中预杂交30分钟。通过加热至95℃5分钟使探针混合物变性并在冰上猝灭。向杂交液中添加探针混合物并应用于膜上，在44.6℃温和振荡中进行4小时。然后除去杂交液并在含0.1％SDS的2x SSC中室温下洗涤2次5分钟，随后在65℃用0.5x SSC和0.1％SDS另外洗涤。然后封闭印迹30分钟并以1∶5000稀度应用抗DIG碱性磷酸酶缀合的抗体30分钟。洗涤印迹并通过碱性磷酸酶缀合的抗DIG结合抗体的NBT/BCIP底物检测确定探针结合的RNA的存在。

表达58 L1 wt的酵母的初步分析提示有功能性的HPV 58 L1全长转录和翻译；然而如果用酵母优选密码子序列重建该序列，则表达水平可能增加。重建58 L1序列被工程改造以删除任何可能的转录提前终止位点以确保稳固的转录。58 L1 R转录物的RNA印迹分析揭示与对58 L1 wt所见到的结果相比全长转录物的量增加(图3)。

实施例5

HPV 58 L1蛋白表达

在冰上解冻相当于OD₆₀₀＝10量的细胞的半乳糖诱导培养物的冷冻酵母细胞沉淀，并悬浮于含2mM PMSF的300μl PC缓冲液中(100mMNa₂HPO₄和0.5M NaCl，pH 7.0)。以～0.5g/管的浓度添加酸洗涤的0.5mm玻璃珠。使管在4℃涡旋5分钟的3个循环，其中有1分钟的中断。添加7.5μl 20％TritonX100并在4℃重复涡旋步骤5分钟。将管置于冰上15分钟，随后在4℃离心10分钟。将上清液转移到无菌微量离心管(microfuge tube)中，标记为总酵母蛋白提取物、标注日期并保存在-70℃。

实施例6

蛋白印迹分析

通过蛋白印迹分析每个58 L1构建体的二十个分离的酵母菌落的总酵母蛋白提取物，以证实半乳糖诱导后58 L1蛋白的表达。

将代表性的58 L1 wt和58 L1 R分离物的10、5和2.5微克总酵母蛋白提取物与SDS-PAGE加样缓冲液组合并加热到95℃10分钟。包括大约55kD的16 L1蛋白作为阳性对照，连同无HPV L1的总酵母蛋白提取物作为阴性对照(数据未显示)。

将蛋白加样到10％SDS-PAGE凝胶上并在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳。蛋白分离后，将蛋白从凝胶蛋白印迹转移至硝化纤维素上，并在1x稀释缓冲液(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)中室温摇动封闭印迹1小时。将印迹洗涤三次并在室温下与酵母吸收的山羊抗trpE-HPV 31 L1血清温育16小时，该血清与HPV 16和HPV 58 L1蛋白交叉反应。然后洗涤印迹三次，并与1∶2500稀度的抗山羊-HRP缀合的抗体温育1小时。将印迹再次洗涤三次，并应用NBT/BCIP检测底物(Kirkegaard and PerryLaboratories)。免疫活性蛋白检测为印迹上的紫色条带。

在所有情况下，58 L1蛋白检测为硝化纤维素上相当于大约55kD的清楚免疫活性条带(图4)。58 L1 R条带的强度好象大于对58 L1 wt所见到的，提示通过酵母密码子最优化实现了58 L1表达提高。

实施例7

ELISA测定

为证明58 L1 VLP表达，通过ELISA分析一部分58 L1 wt和58L1 R总酵母蛋白提取物。用各种方法使表达HPV 58 L1和HPV 58 L1R的酵母细胞生长，包括旋转管培养、摇瓶和发酵罐。裂解酵母细胞并制备蛋白提取物以确定每微克总蛋白产生的HPV 58 L1病毒样颗粒(VLPs)的量。夹心ELISA被设计用于证明HPV 58 L1 VLP表达。

将G蛋白纯化的H582C3.F7(F7)单克隆抗体(mAb)用来结合酵母蛋白提取物中的完整58 L1 VLPs。F7特异性识别HPV 58 L1 VLP构象表位。未结合的蛋白被洗掉，并将另一个HPV 58 L1 VLP构象特异性mAb H586E11.F4(F4)用作检测抗体。真正的构象正确的58 L1 VLPs发生结合，且通过使用抗小鼠IgG2b HRP缀合的抗体和TMB底物来促进检测。

具体而言，将F7用来于4℃包被Immulon 4 HBX 96孔平板的底部过夜。用PBS和0.05％ Tween 20洗涤平板三次，随后用封闭液(PBS+0.05％Tween 20+1％BSA)封闭。将平板洗涤三次并将抗原(在封闭液中稀释至12.5μg/ml的总酵母细胞裂解物)一式两份用于A行。纯化的HPV 58 L1 VLPs的参照标准物以12.5μg/ml总酵母蛋白中为206ng/ml应用于A行3和4列。然后将参照和试验样品沿着每列连续稀释两倍。室温下三小时后，通过吸出除去过量抗原并洗涤平板3次。在封闭液中稀释F4构象特异性mAb并将其应用于每个孔，室温下进行一小时。洗涤平板三次并在封闭液中稀释抗小鼠IgG2b HRP-缀合的抗体，并在室温下应用1小时。洗涤平板并将TMB(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)应用5分钟以检测HRP缀合的抗体复合物。通过添加2M H₂SO₄终止检测反应。在450nm波长读平板并通过与参照标准物相比以ng VLP/μg总蛋白测定HPV 58 L1 VLP的浓度。

图5显示了来自两个分开实验的，从表达HPV 58 L1 wt和HPV 58L1 R的酵母中检测到的VLPs的量/μg总蛋白的比较。酵母密码子最优化使HPV 58 L1 VLP表达水平增加了～2-3倍。

实施例8

透射电子显微镜术

为证明58 L1蛋白确实自动装配形成五邻体L1壳粒，后者接着自动装配入病毒样颗粒，使部分纯化的58 L1 R蛋白提取物进行透射电子显微镜术(EM)。

使酵母在小规模发酵下生长并沉淀。使产生的沉淀进行纯化处理。通过免疫印迹分析沉淀和澄清酵母提取物以证明L1蛋白表达和通过纯化步骤的保留。然后使澄清酵母提取物在45％蔗糖垫层上进行离心，并将产生的沉淀悬浮于缓冲液中以通过透射EM进行分析。

产生的代表性58 L1 R VLPs图像在图6中显示。这种粗样品中的球状颗粒的直径范围从30至60nm，一些颗粒显示规则排列的壳粒。

序列表

<110>Merck & Co.，Inc.

<120>HPV 58 L1在酵母中的最优化表达

<130>21561PCT

<150>60/519,211

<151>2003-11-12

<160>10

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1497

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV58 L1-R

<400>1

atgtccgtct ggagaccatc cgaagctacc gtctacttgc caccagttcc agtctccaag 60

gtcgtctcca ctgacgaata cgtctctaga acctctatct actactacgc tggttcctct 120

agattgttgg ctgttggtaa cccatacttc tccatcaagt ctccaaacaa caacaagaag 180

gtcttggttc caaaggtctc tggtttgcaa tacagagtct tcagagtcag attgccagac 240

ccaaacaagt tcggtttccc agacacttcc ttctacaacc cagacactca aagattggtc 300

tgggcttgtg tcggtttgga aatcggtaga ggtcaaccat tgggtgttgg tgtctctggt 360

cacccatact tcaacaagtt cgacgacacc gaaacctcca acagataccc agctcaacca 420

ggttctgaca acagagaatg tttgtccatg gactacaagc aaacccaatt gtgtttgatc 480

ggttgtaagc caccaactgg tgaacactgg ggtaagggtg ttgcttgtaa caacaacgct 540

gctgctaccg actgtccacc attggaattg ttcaactcca tcatcgaaga cggtgacatg 600

gtcgacactg gtttcggttg tatggacttc ggtaccttgc aagctaacaa gtccgacgtt 660

ccaatcgaca tctgtaactc cacctgtaag tacccagact acttgaagat ggcttctgaa 720

ccatacggtg actccttgtt cttcttcttg agaagagaac aaatgttcgt cagacacttc 780

ttcaacagag ctggtaagtt gggtgaagct gttccagacg acttgtacat caagggttct 840

ggtaacaccg ctgtcatcca atcctctgct ttcttcccaa ctccatctgg ttccatggtc 900

acctctgaat ctcaattgtt caacaagcca tactggttgc aaagagctca aggtcacaac 960

aacggtatct gttggggtaa ccaattgttc gtcactgtcg tcgacaccac tagatccact 1020

aacatgacct tgtgtaccga agtcaccaag gaaggtacct acaagaacga caacttcaag 1080

gaatacgtca gacacgtcga ggaatacgac ttgcaattcg tcttccaatt gtgtaagatc 1140

accttgactg ctgaaatcat gacctacatc cacaccatgg actctaacat cttggaagac 1200

tggcaattcg gtttgactcc accaccatct gcttccttgc aagacaccta cagattcgtc 1260

acctctcaag ctatcacctg tcaaaagact gctccaccaa aggaaaagga agacccattg 1320

aacaagtaca ccttctggga agtcaacttg aaggaaaagt tctctgctga cttggaccaa 1380

ttcccattgg gtagaaagtt cttgttgcaa tctggtttga aggctaagcc aagattgaag 1440

agatctgctc caaccactag agctccatcc accaagagaa agaaggtcaa gaagtaa 1497

<210>2

<211>498

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒类型58

<400>2

Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val

1 5 10 15

Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser

20 25 30

Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly Asn Pro

35 40 45

Tyr Phe Ser Ile Lys Ser Pro Asn Asn Asn Lys Lys Val Leu Val Pro

50 55 60

Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp

65 70 75 80

Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr

85 90 95

Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln

100 105 110

Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly His Pro Tyr Phe Asn Lys Phe Asp

115 120 125

Asp Thr Glu Thr Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Gln Pro Gly Ser Asp Asn

130 135 140

Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile

145 150 155 160

Gly Cys Lys Pro Pro Thr Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Val Ala Cys

165 170 175

Asn Asn Asn Ala Ala Ala Thr Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Phe Asn

180 185 190

Ser Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met

195 200 205

Asp Phe Gly Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile

210 215 220

Cys Asn Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Ser Glu

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe

245 250 255

Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Lys Leu Gly Glu Ala Val Pro

260 265 270

Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Asn Thr Ala Val Ile Gln Ser

275 280 285

Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Glu Ser

290 295 300

Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn

305 310 315 320

Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Thr Glu Val Thr Lys Glu Gly

340 345 350

Thr Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Val Arg His Val Glu Glu

355 360 365

Tyr Asp Leu Gln Phe Val Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala

370 375 380

Glu Ile Met Thr Tyr Ile His Thr Met Asp Ser Asn Ile Leu Glu Asp

385 390 395 400

Trp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gln Asp Thr

405 410 415

Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Thr Ala Pro

420 425 430

Pro Lys Glu Lys Glu Asp Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val

435 440 445

Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly

450 455 460

Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys

465 470 475 480

Arg Ser Ala Pro Thr Thr Arg Ala Pro Ser Thr Lys Arg Lys Lys Val

485 490 495

Lys Lys

<210>3

<211>1497

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒类型58

<400>3

atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gtgtacctgc ctcctgtgcc tgtgtctaag 60

gttgtaagca ctgatgaata tgtgtcacgc acaagcattt attattatgc tggcagttcc 120

agacttttgg ctgttggcaa tccatatttt tccatcaaaa gtcccaataa caataaaaaa 180

gtattagttc ccaaggtatc aggcttacag tatagggtct ttagggtgcg tttacctgat 240

cccaataaat ttggttttcc tgatacatct ttttataacc ctgatacaca acgtttggtc 300

tgggcatgtg taggccttga aataggtagg ggacagccat tgggtgttgg cgtaagtggt 360

catccttatt tcaataaatt tgatgacact gaaaccagta acagatatcc cgcacagcca 420

gggtctgata acagggaatg cttatctatg gattataaac aaacacaatt atgtttaatt 480

ggctgtaaac ctcccactgg tgagcattgg ggtaaaggtg ttgcctgtaa caataatgca 540

gctgctactg attgtcctcc attggaactt tttaattcta ttattgagga tggtgacatg 600

gtagatacag ggtttggatg catggacttt ggtacattgc aggctaataa aagtgatgtg 660

cctattgata tttgtaacag tacatgcaaa tatccagatt atttaaaaat ggccagtgaa 720

ccttatgggg atagtttgtt cttttttctt agacgtgagc agatgtttgt taggcacttt 780

tttaataggg ccggaaaact tggcgaggct gtcccggatg acctttatat taaagggtcc 840

ggtaatactg cagttatcca aagtagtgca ttttttccaa ctcctagtgg ctctatggtt 900

acctcagaat cacaattatt taataagcct tattggctac agcgtgcaca aggtcataac 960

aatggcattt gctggggcaa tcagttattt gttaccgtag ttgataccac tcgtagcact 1020

aatatgacat tatgcactga agtaactaag gaaggtacat ataaaaatga taattttaag 1080

gaatatgtac gtcatgttga agaatatgac ttacagtttg tttttcagct ttgcaaaatt 1140

acactaactg cagagataat gacatatata catactatgg attccaatat tttggaggac 1200

tggcaatttg gtttaacacc tcctccgtct gccagtttac aggacacata tagatttgtt 1260

acctcccagg ctattacttg ccaaaaaaca gcacccccta aagaaaagga agatccatta 1320

aataaatata ctttttggga ggttaactta aaggaaaagt tttctgcaga tctagatcag 1380

tttcctttgg gacgaaagtt tttattacaa tcaggcctta aagcaaagcc cagactaaaa 1440

cgttcggccc ctactacccg tgcaccatcc accaaacgca aaaaggttaa aaaataa 1497

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

atgtccgtgt ggcggcctag t 21

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

gagatctgtg taagtaccac aacaatta 28

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

gggatcccac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

gggatccgtg taagtaccac aacaatta 28

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34

<210>10

<211>1497

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HPV 58 L1反义

<400>10

tacaggcaga cctctggtag gcttcgatgg cagatgaacg gtggtcaagg tcagaggttc 60

cagcagaggt gactgcttat gcagagatct tggagataga tgatgatgcg accaaggaga 120

tctaacaacc gacaaccatt gggtatgaag aggtagttca gaggtttgtt gttgttcttc 180

cagaaccaag gtttccagag accaaacgtt atgtctcaga agtctcagtc taacggtctg 240

ggtttgttca agccaaaggg tctgtgaagg aagatgttgg gtctgtgagt ttctaaccag 300

acccgaacac agccaaacct ttagccatct ccagttggta acccacaacc acagagacca 360

gtgggtatga agttgttcaa gctgctgtgg ctttggaggt tgtctatggg tcgagttggt 420

ccaagactgt tgtctcttac aaacaggtac ctgatgttcg tttgggttaa cacaaactag 480

ccaacattcg gtggttgacc acttgtgacc ccattcccac aacgaacatt gttgttgcga 540

cgacgatggc tgacaggtgg taaccttaac aagttgaggt agtagcttct gccactgtac 600

cagctgtgac caaagccaac atacctgaag ccatggaacg ttcgattgtt caggctgcaa 660

ggttagctgt agacattgag gtggacattc atgggtctga tgaacttcta ccgaagactt 720

ggtatgccac tgaggaacaa gaagaagaac tcttctcttg tttacaagca gtctgtgaag 780

aagttgtctc gaccattcaa cccacttcga caaggtctgc tgaacatgta gttcccaaga 840

ccattgtggc gacagtaggt taggagacga aagaagggtt gaggtagacc aaggtaccag 900

tggagactta gagttaacaa gttgttcggt atgaccaacg tttctcgagt tccagtgttg 960

ttgccataga caaccccatt ggttaacaag cagtgacagc agctgtggtg atctaggtga 1020

ttgtactgga acacatggct tcagtggttc cttccatgga tgttcttgct gttgaagttc 1080

cttatgcagt ctgtgcagct ccttatgctg aacgttaagc agaaggttaa cacattctag 1140

tggaactgac gactttagta ctggatgtag gtgtggtacc tgagattgta gaaccttctg 1200

accgttaagc caaactgagg tggtggtaga cgaaggaacg ttctgtggat gtctaagcag 1260

tggagagttc gatagtggac agttttctga cgaggtggtt tccttttcct tctgggtaac 1320

ttgttcatgt ggaagaccct tcagttgaac ttccttttca agagacgact gaacctggtt 1380

aagggtaacc catctttcaa gaacaacgtt agaccaaact tccgattcgg ttctaacttc 1440

tctagacgag gttggtgatc tcgaggtagg tggttctctt tcttccagtt cttcatt 1497

Claims

1.一种核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2所列的HPV58 L1蛋白的核苷酸序列，为在酵母细胞中高水平表达，该核酸序列被密码子最优化。

2.包含权利要求1的核酸分子的载体。

3.包含权利要求2的载体的宿主细胞。

4.权利要求3的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母细胞。

5.权利要求4的宿主细胞，其中该酵母细胞选自：啤酒糖酵母、多形汉逊氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。

6.权利要求5的宿主细胞，其中该宿主细胞是啤酒糖酵母。

7.权利要求1的核酸分子，其中该核苷酸的序列包含SEQ IDNO：1所列的核苷酸序列。

8.包含权利要求7的核酸分子的载体。

9.包含权利要求8的载体的宿主细胞。

10.包含HPV58的重组L1蛋白或重组L1+L2蛋白的病毒样颗粒(VLPs)，其中该重组L1蛋白或重组L1+L2蛋白在酵母中产生。

11.权利要求10的VLPs，其中该重组L1蛋白或重组L1+L2蛋白由密码子最优化的HPV58 L1核酸分子编码。

12.权利要求11的VLPs，其中该密码子最优化的核酸分子包含SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列。

13.一种产生权利要求11的VLPs的方法，其包括：

(a)用编码HPV58 L1蛋白或HPV58 L1+L2蛋白的密码子最优

化的DNA分子转化酵母；

(b)在允许表达密码子最优化的DNA分子的条件下培养转化的酵母，以产生重组乳头瘤病毒蛋白；和

(c)分离重组乳头瘤病毒蛋白以产生权利要求11的VLPs。

14.包含权利要求11的VLPs的疫苗。

15.包含权利要求11的VLPs的药物组合物。

16.一种预防HPV感染的方法，其包括给哺乳动物施用权利要求14的疫苗。

17.一种在动物中诱导免疫反应的方法，其包括给该动物施用权利要求11的VLPs。

18.权利要求11的病毒样颗粒，其中酵母选自：啤酒糖酵母、多形汉逊氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。

19.权利要求18的病毒样颗粒，其中该酵母是啤酒糖酵母。

20.权利要求14的疫苗，进一步包括至少一个另外的HPV类型的VLPs。

21.权利要求20的疫苗，其中该至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。

22.权利要求21的疫苗，其中该至少一个HPV类型包括HPV 16。

23.权利要求22的疫苗，进一步包含HPV18 VLPs。

24.权利要求23的疫苗，进一步包含HPV6 VLPs和HPV11 VLPs。

25.权利要求24的疫苗，进一步包含HPV31 VLPs。

26.权利要求23的疫苗，进一步包含HPV31 VLPs。

27.权利要求25的疫苗，进一步包含HPV45 VLPs。

28.权利要求26的疫苗，进一步包含HPV45 VLPs。

29.一种分离和纯化的HPV 58 L1多肽，其包含SEQ ID NO：2所列的氨基酸序列。