CN1763203A - 一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用 Download PDF

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CN1763203A CN 200510044398 CN200510044398A CN1763203A CN 1763203 A CN1763203 A CN 1763203A CN 200510044398 CN200510044398 CN 200510044398 CN 200510044398 A CN200510044398 A CN 200510044398A CN 1763203 A CN1763203 A CN 1763203A
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Abstract

本发明公开了一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用，涉及基因工程技术、预防性疫苗和诊断试剂等领域。其中所述重组融合蛋白pp150/MDBP，即为人巨细胞病毒pp150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸和MDBP蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白；pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，融合蛋白全长264个氨基酸。该融合蛋白用于检测人巨细胞病毒抗体或抗原以及用于制备单抗、多抗和蛋白芯片，也可用于制备疫苗、ELISA检测试剂盒和其他相关产品。

Description

一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白，尤其涉及一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用，属基因工程技术、预防性疫苗和诊断试剂等技术领域。
背景技术
人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)感染是临床上常见的、严重危害人体健康的传染性疾病。可经过多种途径传播。正常人群感染HCMV后，并不呈现明显的临床症状，但是对于机体免疫能力低下的人群来说，原发感染、病毒潜伏感染后的复发可引起活动性感染，并可引发严重的甚至是致死性的疾病。对于器官移植、骨髓移植、免疫缺陷患者以及免疫抑制治疗的患者，HMCV感染是高发病率与致死率的重要原因。孕妇原发感染HCMV后容易导致胎儿畸形，可产生低体重儿、小头畸形、耳聋、视力损伤、智力低下等不同症状。最近研究表明，HCMV感染与人类动脉粥样硬化甚至是冠心病的发生有重大关系。有文献报道，与周围组织相比，不同的肿瘤细胞中HCMV具有较高的发生率，且HCMV感染可干扰细胞内和细胞外因子两种途径诱导的肿瘤细胞的凋亡，如他可以通过影响癌抑制基因p53、p73促进细胞生长信号的传递或者促进Ras/Raf/MEK/Erk-and PI-3K-的抗凋亡作用而促进导致肿瘤的发生。因此，如何准确、快速、特异性地监测HCMV的活动性感染从而及时给予患者相应的抗病毒治疗以及判断预后，成为临床上的关键。
与病毒提取的抗原组分相比，基因工程方法生产的重组抗原是血清学检测方法中提高准确率的最佳方式之一，且融合抗原的检测准确率要优于单一抗原；若应用于制备疫苗、单抗、多抗和蛋白芯片以及ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒，将具有巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
针对现有技术的不足和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法，以及所述重组人巨细胞病毒融合蛋白在制备其疫苗、单抗、多抗、蛋白芯片、ELISA检测试剂盒以及与人巨细胞病毒相关产品中的应用。
本发明的技术方案是：通过选择优势抗原片段中的抗原表位区域所编码的基因序列，经PCR(polymerase chain reacton，PCR)扩增及拼接，构建了表达融合蛋白pp150/MDBP的融合基因，利用原核表达载体pBV220使融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶性蛋白形式获得高效表达，并建立了一整套简便有效纯化基因重组人巨细胞病毒融合蛋白的工艺流程，有效提高了融合蛋白的表达量和得率，降低了基因重组融合蛋白的生产成本。
下面对本发明所述基因重组人巨细胞病毒融合蛋白的制备方法进行详细描述：
本发明涉及的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP，即人巨细胞病毒UL(unique long，UL)32基因片段编码的pp(phosphoprotein，pp)150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸以及UL57基因片段编码的MDBP(methylated DNA bindingprotein，MDBP)蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白；pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，融合蛋白全长264个氨基酸，其特征在于该融合蛋白C端64个氨基酸选自UL57基因片段编码的MDBP蛋白538至601氨基酸，编码该融合蛋白的基因序列为：
ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGG GAC
GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GAC AGC TCG GAT
GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GAC ATC ACG GAT ACC GAG
ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC
GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG
GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC
TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG
GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA
AAC ACC GTG TCC ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT
CTC GAG TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGA
GAC GTG AGC GGG 6GC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG GAT TCC
GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC TAT CGG CTC AAT
TAA
该融合蛋白氨基酸序列为：
Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala
                5                   10                  15                  20
Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser
                25                  30                  35                  40
Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val
                45                  50                  55                  60
Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu
                65                  70                  75                  80
Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile
                85                  90                  95                  100
Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe
                105                 110                 115                 120
Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro
                125                 130                 135                 140
Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His
                145                 150                 155                 160
Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser
                165                 170                 175                 180
Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu
                185                 190                 195                 200
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                205                 210                 215                 220
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                225                 230                 235                 240
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                245                 250                 255                 260
Tyr Arg Leu Asn
本发明所述的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP的制备方法，该融合蛋白是利用基因工程技术制备，具体方法如下：
(1)通过计算机分析HCMV磷蛋白150(phosphoprotein 150，pp150)的全部氨基酸序列，筛选出pp150蛋白内的强抗原表位，即从第495氨基酸至691氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下：
筛选的HCMV pp150蛋白强抗原表位的197个氨基酸序列：
Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala Trp
                5                   10                  15                  20
Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser Asp
                25                  30                  35                  40
Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val Asp
                45                  50                  55                  60
Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu Gln
                65                  70                  75                  80
Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile Leu
                85                  90                  95                  100
Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe Ala
                105                 110                 115                 120
Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro Gly
                125                 130                 135                 140
Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His Leu
                145                 150                 155                 160
Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser Thr
                165                 170                 175                 180
Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser
                185                 190                 195
筛选的ppl50蛋白抗原表位的DNA序列：
CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGG
GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GAC
AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GAC
ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAA
CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTC
ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCG
GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGG
GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTG
GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC ACC
ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为：
上游引物P1：5’CAG GAATTCATGCTCGTCTCCCCGCAGGTGAC 3’
下游引物P2：5’CAA CTCGAGAGACGCTGTTTGTGTCACCGC 3’
其中，上游引物含有ECoRI酶切位点、起始密码子ATG及部分目的基因序列；下游引物含有XhoI的酶切位点和部分目的基因序列，可扩增包含591bp目的基因在内的DNA片段；
(2)通过计算机分析HCMV  甲基化DNA结合蛋白(methylated DNA bindingprotein，MDBP)的全部氨基酸序列，筛选出MDBP蛋白内的强抗原表位，即从第538氨基酸至601氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下：
筛选的HCMV MDBP蛋白强抗原表位的64个氨基酸序列：
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                5                   10                  15                  20
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                25                  30                  35                  40
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                45                  50                  55                  60
Tyr Arg Leu Asn
筛选的MDBP蛋白抗原表位的DNA序列：
TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGA
GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG
GAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC
TAT CGG CTC AAT TAA
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为：
上游引物P1：5’CAA CTCGAGTTGGACGGCAAAGGTGAC 3’
下游引物P2：5’CGC GGATCCATTGAGCCGATAGGTACGGT 3’
其中，上游引物含有XhoI酶切位点及部分目的基因序列；下游引物含有BamHI的酶切位点、部分目的基因序列和TAA终止密码子，可扩增包含目的基因在内的192bp的DNA片段。
取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以纯化的HCMV DNA为模板，分别用相应引物P1、P2以扩增条件为：95℃30秒、59℃40秒、72℃55秒，32个循环PCR扩增HCMV PP150蛋白抗原表位的基因片段；以扩增条件为95℃30秒、56℃40秒、72℃45秒，32个循环PCR扩增HCMV MDBP蛋白抗原表位的基因片段；然后分别经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段。
表达融合蛋白重组质粒的构建：
将上述PCR扩增、纯化回收的基因片段分别转化pMD18-T克隆载体，分别构建出相应的pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，质粒经酶切、PCR扩增验证正确后，pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体均用XhoI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pMD18-T-UL32克隆载体和编码HCMV MDBP蛋白、带有XhoI和BamHI粘性末端酶切位点的基因片段，二者在T4DNA连接酶的作用下，构建出含有PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段的pMD18-T-UL32-UL57融合基因克隆载体，并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，经双酶切和PCR扩增验证后，该融合基因克隆载体与pBV220表达载体分别用ECoRI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pBV220表达载体和融合基因，并在T4DNA连接酶的作用下，将PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段构成的融合基因串联插入到表达载体pBV220内的ECoRI和BamHI位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白。
重组质粒的筛选与鉴定：
将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，挑取转化子，碱变性法提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切及DNA序列分析，筛选出含PP150蛋白基因和MDBP蛋白基因串连片段的重组质粒，PP150蛋白的基因在串连基因的5’端，MDBP蛋白的基因在串连基因的3’端，两者之间由XhoI酶切位点(下划线部分)连接，序列如下：
ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG
TGG GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC
GAC AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG
GAC ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC A AA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC
GAG CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC
ATC CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC
TTC GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG
CCC GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT
CAC CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG
TCC ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT  CTC
GAG TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA
CGA GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT
GGG GAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT
ACC TAT CGG CTC AAT TAA
构建的重组质粒表达PP150蛋白的197个氨基酸与MDBP蛋白的64个氨基酸的融合蛋白，该融合蛋白氨基酸序列为：
Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala
                5                   10                  15                  20
Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser
                25                  30                  35                  40
Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val
                45                  50                  55                  60
Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu
                65                  70                  75                  80
Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile
                85                  90                  95                  100
Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe
                105                 110                 115                 120
Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Ash Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro
                125                 130                 135                 140
Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His
                145                 150                 155                 160
Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser
                165                 170                 175                 180
Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu
                185                 190                 195                 200
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                205                 210                 215                 220
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                225                 230                 235                 240
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                245                 250                 255                 260
Tyr Arg Leu Asn
表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种到含有氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，30℃振荡培养4～8小时，然后迅速升温至42℃诱导4小时，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测筛选并用Western Blotting验证，获得表达融合蛋白的工程菌，表达的融合蛋白的相对分子量约为27000，以可溶性形式存在，表达量约占菌体蛋白总量的25％。
表达融合蛋白的纯化：
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心，收集菌体，冰浴超声破碎细菌，再离心收集上清，收集后的上清先经Sephacryl S200进行初步纯化，接收目的蛋白峰，然后将接收的目的蛋白峰上DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱，用10、50、100、500mmol/L梯度浓度的NaCl溶液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰，该峰含有表达的融合蛋白；
将上一步DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰加入终浓度为1.5mol/L的硫酸铵，然后上Phenyl Sepharose FastFlow疏水柱层析纯化，接收目的蛋白峰，此即为纯化的融合蛋白。
利用本发明方法制备的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白即HCMV pp150/MDBP融合蛋白，抗原性强、特异性好，与病毒提取的抗原组分相比，本发明方法生产的重组抗原在人巨细胞病毒检测的应用中准确率明显提高，且融合抗原的检测准确率要优于单一抗原；具有应用方便、成本低、多抗体同时检测等优点，这为在制备其疫苗、单抗、多抗、蛋白芯片、ELISA检测试剂盒以及与人巨细胞病毒相关产品中的应用奠定了基础，同时，本发明建立了一整套简便有效纯化基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP的工艺流程，可有效提高融合蛋白的表达量和得率，并且大大降低了基因重组融合蛋白的生产成本，具有巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1人巨细胞病毒UL32基因片段扩增结果
图2pMD18-T-UL32克隆载体的构建
图3人巨细胞病毒UL57基因片段扩增结果
图4pMD18-T-UL57克隆载体的构建
图5pMD18-T-UL32-UL57克隆载体双酶切图谱
图6pMD18-T-UL32-UL57克隆载体的构建
图7pBV220-UL32-UL57表达载体的构建
图8pBV220-UL32-UL57表达载体正向测序图谱
图9pBV220-UL32-UL57表达载体反向测序图谱
图10pBV220-UL32-UL57表达载体双酶切图谱
图11工程菌经诱导后融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳图
图12BL21工程菌表达融合蛋白的Western blot分析结果
图13融合蛋白经DEAE纯化后SDS-PAGE电泳效果图
图14融合蛋白经HIC纯化后SDS-PAGE电泳效果图
图15融合蛋白pp150/MDBP浓度与吸光度的线性回归曲线图
图16：重组融合蛋白pp150/MDBP制备的蛋白芯片用于检测HCMV IgG抗体
其中：1阳性对照，2-4三个重组融合蛋白pp150/MDBP的重复，5阴性对照
A：血清原液的杂交结果，B：血清1∶10稀释。
具体实施方式
下面结合实施例对发明的内容作进一步阐述：
1.融合蛋白表达基因的扩增
1.1人巨细胞病毒pp150基因UL32基因片段的克隆
筛选的pp150蛋白抗原表位的DNA序列是：
CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGG
GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GAC
AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GAC
ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAA
CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTC
ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCG
GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGG
GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTG
GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC ACC
ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为：
上游引物P1：5’CAG GAATTCATGCTCGTCTCCCCGCAGGTGAC 3’
下游引物P2：5’CAA CTCGAGAGACGCTGTTTGTGTCACCGC 3’
其中，上游引物含有ECoRI酶切位点、起始密码子ATG；下游引物含有XhoI的酶切位点。
取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以提取纯化的人巨细胞病毒AD169株的DNA为模板，用引物P1、P2以扩增条件为：95℃30秒、59℃40秒、72℃55秒，32个循环PCR扩增HCMV UL32目的基因片段，然后经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段。HCMV UL32基因片段的PCR扩增结果见图1，克隆载体的构建图谱见图2。
1.2人巨细胞病毒MDBP基因UL57基因片段的克隆
筛选的MDBP蛋白抗原表位的DNA序列是：
TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGA
GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG
GAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC
TAT CGG CTC AAT TAA
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为：
上游引物P1：5’CAA CTCGAGTTGGACGGCAAAGGTGAC 3’
下游引物P2：5’CGC GGATCCATTGAGCCGATAGGTACGGT 3’
其中，上游引物含有XhoI酶切位点；下游引物含有BamHI的酶切位点以及终止密码子TAA。
取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以提取纯化的人巨细胞病毒AD169株的DNA为模板，用引物P1、P2以扩增条件为95℃ 30秒、56℃ 40秒、72℃ 45秒，32个循环PCR扩增HCMV UL57目的基因片段，然后经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段。
HCMV UL57基因片段的PCR扩增结果见图3，克隆载体的构建图谱见图4。
2.pMD18-T-UL32-UL57克隆载体的构建
2.1将含有HCMV UL32基因的克隆载体质粒溶液按下列反应体系进行反应
成份                                体积(μl)
pMD18-T-UL32                        20
XhoI(10U/ml)                        1.5
BamH I(15U/ml)                      1
10×K buffer                        3
dH2O(sterilized)                   4.5
总体积                              30
37℃条件下酶切3h，反应完毕，取反应样品30μl，加3.3μl  10×Loading buffer，混合均匀，行1.5％DNA琼脂糖凝胶电泳，回收线性克隆载体。
2.2将含有HCMV UL57目的基因的克隆载体质粒溶液按下列反应体系进行反应
成份                            体积(μl)
pMD18-T-UL57                    20
XhoI(10U/ml)                    1.5
BamH I(15U/ml)                  1
10×K buffer                    3
dH2O(sterilized)               4.5
总体积                          30
37℃条件下酶切3h，反应完毕，取反应样品30μl，加3.3μl  10×Loading buffer，混合均匀，行1.5％DNA琼脂糖凝胶电泳，当观察样品在泳道上行出单一条带时，停止电泳，回收目的基因。
2.3含HCMV UL32目的基因的克隆质粒线性载体与HCMV UL57目的基因的连接
将回收的含HCMV UL32目的基因的克隆质粒线性载体与HCMV UL57按摩尔数之比3∶1混合均匀，按下列比例建立反应体系进行反应，16℃条件下，过夜连接。
成份                            体积(μl)
HCMV-UL57                       10
linear pMD18-T-UL32(vector)                        0.5
10×Ligase Buffer                                  2
T4 DNA Ligase                                      0.5
dH2O(sterilized)                                  7
总体积                                             20
2.4细菌转化及阳性克隆的筛选
无菌取新鲜的E.coli DH5a感受态细菌300μl，加入质粒载体pMD18-T-UL32-UL57 10μl(60ng)，冰浴2-3min，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec，冰浴2～3min，无菌条件下加入无抗生素的LB液体培养基700μl，37℃培养45min，1000g离心5min，去除部分液体，保留100μl，重悬菌体，全部铺于LB平板(含Amp 100μg/ml)上，37℃平放培养20min后再倒置培养过夜，于次日晨，观察培养板菌落形成情况，分别挑选生长状态良好的白色单菌落接种到5ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃、200-250rpm过夜培养，小量提取质粒1.5％琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定后，用含20％的甘油LB培养液，-70℃保存菌种。克隆载体融合基因片段的双酶切结果见图5，融合基因的克隆载体的构建图谱见图6。
3.pBV220-UL32-UL57表达载体的构建
3.1融合基因的制备
以制备好的含有融合基因的克隆载体pMD18-T-UL32-UL57进行双酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳及胶回收等步骤，制备融合基因。
酶切反应体系为：
成份                                     体积(μl)
pMD18-T-UL32-UL57                        20
EcoRI(15U/ml)                            3
BamH I(15U/ml)                           3
10×K buffer                             4
dH2O(sterilized)                        10
总体积                                   40
3.2线性化表达质粒pBV220的制备
将表达质粒pBV220，按下列组分建立如下酶切反应体系
成份                                体积(μl)
pBV220 expression vector            20
EcoRI(15U/ml)                       2
BamHI(15U/ml)                       2
10×K buffer                        4
dH2O(sterilized)                   12
总体积                                       40
总反应体积40μl，37℃消化3h，酶切完毕后，取酶切反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收空质粒表达载体。
3.3表达质粒pBV220与HCMV UL32-UL57目的基因的连接
将回收的HCMV UL32-UL57目的基因与表达质粒空载体pBV220按摩尔数之比3∶1混合均匀，建立连接反应体系(see Table 6-8)，16℃，过夜连接。
成份                                         体积(μl)
HCMV UL32-UL57                               10
linear pBV220 vector                         1
10×Ligase Buffer                            2
T4 DNA Ligase                                0.4
dH2O(sterilized)                            6.6
总体积                                       20
3.4带有HCMV UL32-UL57目的基因的表达载体pBV220的转化及阳性克隆的筛选
无菌取新鲜的BL21感受态细菌200μl，加入连接产物10μl，冰浴2-3min，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec，冰浴2～3min，无菌条件下加入无抗生素的LB液体培养基800μl，37℃、150转/min培养45min，3000g离心1min，去除部分液体，保留100μl，重悬菌体，全部铺于LB(含100μg/ml Amp)平板上，37℃平放培养20min，然后倒置培养过夜。
用提取后的质粒溶液建立如下酶切反应体系
       成份                              体积(μl)
    pBV220-UL32-UL57                     10
    BamHI(15U/ml)                        1
    EcoR I(15U/ml)                       1
    10×K buffer                         2
    dH2O(sterilized)                    6
    总体积                               20
总反应体积20μl，37℃消化3h，取酶切产物进行1.5％琼脂糖电泳，分析结果并拍照。得到表达质粒载体pBV220-UL32-UL57(见图7)。融合基因表达载体构建的正反向测序结果见图8-9。表达载体的双酶切结果见图10。
4.融合蛋白pp150/MDBP生产菌的选择与构建
4.1宿主菌：大肠杆菌BL21
4.2质粒pBV220-UL32-UL57的转化
无菌取新鲜的BL21感受态细菌200μL，加入连接产物10μl，冰浴2-3min，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec，冰浴2-3min，无菌条件下加入无抗生素的LB液体培养基800μl，37℃、150转/min培养45min，3000g离心1min，去除部分液体，保留溶液约100μl，重悬菌体，全部铺于LB(含100μg/ml Amp)平板上，37℃平放培养20min，然后倒置培养过夜。
5.pBV220-UL32-UL57转化菌的筛选
从新鲜转化平板上挑取转化菌落，分别接种于含有氨苄青霉素100μg/mL的选择培养基的试管中，30℃振荡培养过夜，分别离心收集菌体，用碱裂解法，将菌体悬浮，氢氧化钠裂解，醋酸钠中和，离心所得上清液，分别用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，离心回收质粒DNA，回收的质粒DNA分别溶解于TE后，用EcoRI和BamHI双酶切，琼脂糖电泳，筛选出含800bp左右片段样品。
将筛选所得的携有重组质粒的菌样，分别接种于含有氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基中，30℃振荡培养过夜，然后按1∶100比例接种于LB培养基中，30℃培养4小时后，42℃继续培养4小时，离心收集菌体。
部分菌体用SDS-PAGE电泳检查全菌蛋白，在27KD处有明显表达条带，经检测目的蛋白条带占全菌总蛋白的25％左右(见图11)，该菌体经上样缓冲液处理后，进行Westernblot分析，发现为单一条带，进一步证明所表达蛋白即为预期的融合蛋白(见图12)。
DNA序列分析：
挑取上述表达目的蛋白的转化子，碱变性法提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切及DNA序列分析测定，质粒内的PP150蛋白基因和MDBP蛋白基因片段的DNA序列完整，与设计的人巨细胞病毒UL32基因片段和人巨细胞病毒UL57基因片段的DNA序列一致，其序列如下：
ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG
TGG GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC
GAC AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG
GAC ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG
CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC
CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC
GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC
GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC
CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC
ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT  CTC GAG
TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGA
GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG
GAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC
TAT CGG CTC AAT TAA
构建的重组质粒表达PP150蛋白的197个氨基酸与MDBP蛋白的64个氨基酸的融合蛋白，该融合蛋白氨基酸序列为：
Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala
                5                   10                  15                  20
Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser
                25                  30                  35                  40
Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val
                45                  50                  55                  60
Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu
                65                  70                  75                  80
Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile
                85                  90                  95                  100
Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe
                105                 110                 115                 120
Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro
                125                 130                 135                 140
Gly Asp Met Ash Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His
                145                 150                 155                 160
Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser
                165                 170                 175                 180
Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu
                185                 190                 195                 200
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                205                 210                 215                 220
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                225                 230                 235                 240
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                245                 250                 255                 260
Tyr Arg Leu Asn
以上结果说明，构建的人巨细胞病毒融合基因表达载体的生产菌是一个可以高效表达融合蛋白pp150/MDBP的系统，具有工业化生产的价值。
6.融合蛋白的表达及纯化
将工程菌单菌落挑入5ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，30℃培养过夜，次日转至800ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，30℃培养至其进入对数生长期，快速升温至42℃，诱导表达4小时，离心收集菌体。
离心收集的菌体经TE缓冲液洗涤后，冰浴超声破碎，10000g离心10分钟得上清液，收集后的上清液先经Sephacryl S200进行初步纯化，接收目的蛋白峰，然后将接收的目的蛋白峰上DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱，用10、50、100、500mmol/L梯度浓度的NaCl溶液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰，该峰含有表达的融合蛋白；将DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰加入终浓度为1.5mol/L的硫酸铵，然后上Phenyl Sepharose FastFlow疏水柱层析纯化，接收目的蛋白峰，加入常规稳定保护剂甘露醇或海藻糖，过滤除菌后保存备用，此即为纯化的融合蛋白。(图13-14)。
7.融合蛋白的应用
7.1ELISA方法检测血清抗HCMV IgG抗体
实验步骤如下：
7.1.1包被：用包被液稀释基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP，使其终浓度分别为10、2、0.4、0.2μg/ml后包被酶联板，每孔加入各相应浓度融合蛋白溶液100μl，其中，每板留3个空白孔，各加入包被液100μl，用封口膜封板，4℃过夜。
7.1.2温育：取过夜的包被板置于37℃温箱中温育1小时。
洗板：用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.1.3封闭：各孔分别加入PBST-BSA1％封闭液100μl，封口后放入37℃恒温箱中，温育1小时。
7.1.4洗板：用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.1.5加阳性血清：除阴性对照孔加入100μl PBST-BSA 1％之外，其余每孔分别加入100μl用PBST-BSA 1％稀释的HCMV IgG阳性血清(按1∶40比例稀释)，用封口膜封口后，将酶标板置于37℃温箱中温育1小时。
7.1.6洗板：用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.1.7加二抗：羊抗人IgG-HRP按1∶3000的比例用PBST-BSA 1％稀释完毕后，各孔分别加入该稀释液100μl，封口膜封口后37℃温育1小时。
7.7.8洗板：用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.7.9加底物：各孔分别加入底物显色液TMB 100μl，然后将酶标板置于暗处放置20分钟，显色。
7.7.10加终止液：显色完成后，各孔分别加入2M H2SO4100μl终止反应。
7.1.11酶标仪读数：加入终止液终止反应后，15分钟内用450nm波长测定其光吸收值。
结果：
将纯化后的融合蛋白pp150/MDBP按梯度稀释后，与阳性血清及阴性对照一起包被酶标板，反应完毕后分别测定其A450光吸收值，结果见表1。
表1：pp150/MDBP融合蛋白对ELISA检测结果(X±SD)
  组别   阴性对照   全病毒抗原对照   融合蛋白pp150/MDBP不同浓度
  浓度(μg/ml)A450(n＝3)   -0.068±0.002   -3.515±0.103 104.23±0.119 22.977±0.085 0.42.028±0.051 0.21.612±0.136
以重组融合蛋白的蛋白浓度C(μg/ml)为自变量，以相应的A450光吸收值作为因变量，进行线性回归处理，得线性回归方程为：A＝0.2362C+1.9683，r＝0.9415线性关系图谱见附图15，表明融合蛋白的浓度与吸光度值呈较好的线性关系。
7.2人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP用于制备蛋白芯片法检测HCMV IgG抗体具体实验步骤如下：
7.2.1将氨基化玻片置于2.5％戊二醛PBS试液中，浸泡2h后，用PBS冲洗3遍。
7.2.2点样：将融合蛋白抗原及阳性对照点于醛基玻片上，室温放置24h。
7.2.3温育：将点好融合蛋白抗原及阳性对照的玻片置于37℃恒温箱中，温育2h，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。
7.2.4封闭：将玻片置于含1％BSA的PBST封闭液中，封闭1h，然后用PBST洗3次，每次10秒，蒸馏水冲洗玻片，以硼氰化钠还原5min，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。
7.2.5抗原抗体反应：将HCMV IgG阳性血清加至阵列上，37℃温育2h，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。冲洗完毕的玻片置于离心机中，800rpm离心3min。
7.2.6与二抗结合：将2.5μL cy3-抗人IgG(用PBST按1∶30比例稀释而成)加至阵列上，37℃温育30min，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。冲洗完毕的玻片置于离心机中，800rpm离心3min。
7.2.7扫描：采用ScanArray4000激光聚焦扫描仪进行扫描，扫描分辨率为10μm。
结果：
重组融合蛋白pp150/MDBP用于阳性HCMVIgG抗体检测的扫描结果见图16，其中：
1.阳性对照，2-4三个重组融合蛋白pp150/MDBP的重复，5.阴性对照；表明融合蛋白可以用于制备蛋白芯片用于HCMV IgG的检测。
                        序列表
<110>山东省医药生物技术研究中心
<120>一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用
<141>2005-8-8
<160>2
<210>1
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)…(264)
<223>一种新型的重组蛋白，即人巨细胞病毒pp150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸和MDBP蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白。pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，全长264个氨基酸。
<400>1
Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala
                5                   10                  15                  20
Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser
                25                  30                  35                  40
Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val
                45                  50                  55                  60
Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu
                65                  70                  75                  80
Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile
                85                  90                  95                  100
Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe
                105                 110                 115                 120
Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro
                125                 130                 135                 140
Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His
                145                 150                 155                 160
Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Ash Thr Val Ser
                165                 170                 175                 180
Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu
                185                 190                 195                 200
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                205                 210                 215                 220
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                225                 230                 235                 240
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                245                 250                 255                 260
Tyr Arg Leu Asn
<210>2
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>cds
<222>(1)…(795)
<220>
<221>mis-feature
<222>(1)…(3)
<223>合成pp150N端多肽基因时增加的起始密码子
<220>
<221>mis-feature
<222>(4)…(594)
<223>克隆的pp150N端多肽基因的基因序列
<220>
<221>mis-feature
<222>(595)…(600)
<223>连接pp150N端多肽基因的基因序列与MDBP基因片段的Xho I的酶切位点
<220>
<221>mis-feature
<222>(600)…(792)
<223>MDBP基因片段的64个氨基酸的基因序列
<400>2
atg ctc gtc tcc ccg cag gtg acc aag gcc agc ccg gga agg gtc cgt cgg gac agc gcg 60
Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala
1               5                   10                  15                  20
tgg gac gtg agg ccg ctc acg gag acc aga ggg gat ctt ttc tcg ggc gac gag gat tcc 120
Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser
                25                  30                  35                  40
gac agc tcg gat ggc tat ccc ccc aac cgt caa gat ccg cgt ttc acc gac acg ctg gtg 180
Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val
                45                  50                  55                  60
gac atc acg gat acc gag acg agc gcc aaa ccg ccc gtc acc acc gcg tac aag ttc gag 240
Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu
                65                  70                  75                  80
caa ccg acg ttg acg ttc ggc gcc gga gtt aac gtt cct gct ggc gcc ggc gct gcc atc 300
Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile
                85                  90                  95                  100
ctc acg ccg acg cct gtc aat cct tcc acg gcc ccc gct ccg gcc ccg aca cct acc ttc 360
Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe
                105                 110                 115                 120
gcg ggt acc caa acc ccg gtc aac ggt aac tcg ccc tgg gct ccg acg gcg ccg ttg ccc 420
Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro
                125                 130                 135                 140
ggg gat atg aac ccc gcc aac tgg ccg cgc gaa cgc gcg tgg gcc ctc aag aat cct cac 480
Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His
                145                 150                 155                 160
ctg gct tac aat ccc ttc agg atg cct acg act tcc acg gct tct caa aac acc gtg tcc 540
Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser
                165                 170                 175                 180
acc acc cct cgg agg ccg tcg act cca cgc gcc gcg gtg aca caa aca gcg tct ctc gag 600
Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu
                185                 190                 195                 200
ttg gac ggc aaa ggt gac gac ggg gtt ccg ggc ggc ggt gct ggc ggg ggt ggt gga cga 660
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                205                 210                 215                 220
gac gtg agc ggg ggc ccg agc gac ggt ctg ggt ggc ggt cgt ggt ggt ggg ggt ggt ggg 720
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                225                 230                 235                 240
gat tcc ggg gga atg atg ggg cgc ggc ggt cgc atg ttg ggc gct agc gtg gac cgt acc 780
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                245                 250                 255                 260
tat cgg ctc aat taa
Tyr Arg Leu Asn
atgctcgtct ccccgcaggt gaccaaggcc agcccgggaa gggtccgtcg ggacagcgcg   60
tgggacgtga ggccgctcac ggagaccaga ggggatcttt tctcgggcga cgaggattcc  120
gacagctcgg atggctatcc ccccaaccgt caagatccgc gtttcaccga cacgctggtg  180
gacatcacgg ataccgagac gagcgccaaa ccgcccgtca ccaccgcgta caagttcgag  240
caaccgacgt tgacgttcgg cgccggagtt aacgttcctg ctggcgccgg cgctgccatc  300
ctcacgccga cgcctgtcaa tccttccacg gcccccgctc cggccccgac acctaccttc  360
gcgggtaccc aaaccccggt caacggtaac tcgccctggg ctccgacggc gccgttgccc  420
ggggatatga accccgccaa ctggccgcgc gaacgcgcgt gggccctcaa gaatcctcac  480
ctggcttaca atcccttcag gatgcctacg acttccacgg cttctcaaaa caccgtgtcc  540
accacccctc ggaggccgtc gactccacgc gccgcggtga cacaaacagc gtctctcgag  600
ttggacggca aaggtgacga cggggttccg ggcggcggtg ctggcggggg tggtggacga  660
gacgtgagcg ggggcccgag cgacggtctg ggtggcggtc gtggtggtgg gggtggtggg  720
gattccgggg gaatgatggg gcgcggcggt cgcatgttgg gcgctagcgt ggaccgtacc  780
tatcggctca attaa

Claims (3)

1.一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP，即人巨细胞病毒UL32基因片段编码的pp150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸以及UL57基因片段编码的MDBP蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白；pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，融合蛋白全长264个氨基酸，其特征在于该融合蛋白C端64个氨基酸选自UL57基因片段编码的MDBP蛋白538至601氨基酸，编码该融合蛋白的基因序列为：
ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGG GAC
GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GAC AGC TCG GAT
GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GAC ATC ACG GAT ACC GAG
ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC
GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG
GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC
TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG
GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA
AAC ACC GTG TCC ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT
CTC GAG TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGA
GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG GAT TCC
GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC TAT CGG CTC AAT
TAA
该融合蛋白氨基酸序列为：
Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala
                5                   10                  15                  20
Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser
                25                  30                  35                  40
Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val
                45                  50                  55                  60
Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu
                65                  70                  75                  80
Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile
                85                  90                  95                  100
Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe
                105                 110                 115                 120
Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro
                125                 130                 135                 140
Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His
                145                 150                 155                 160
Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser
                165                 170                 175                 180
Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu
                185                 190                 195                 200
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                205                 210                 215                 220
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                225                 230                 235                 240
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                245                 250                 255                 260
Tyr Arg Leu Asn
2.权利要求1所述的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP的制备方法，该融合蛋白是利用基因工程技术制备，具体方法如下：
(1)通过计算机分析HCMV磷蛋白150(phosphoprotein 150，pp150)的全部氨基酸序列，筛选出pp150蛋白内的强抗原表位，即从第495氨基酸至691氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下：
筛选的HCMV pp150蛋白强抗原表位的197个氨基酸序列：
Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala Trp
                 5                  10                  15                   20
Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser Asp
                25                  30                  35                   40
Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val Asp
                45                  50                  55                   60
Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu Gln
                65                  70                  75                   80
Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile Leu
                85                  90                  95                  100
Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe Ala
                105                 110                 115                 120
Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro Gly
                125                 130                 135                 140
Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His Leu
                145                 150                 155                 160
Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser Thr
                165                 170                 175                 180
Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser
                185                 190                 195
筛选的pp150蛋白抗原表位的DNA序列：
CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGG
GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GAC
AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GAC
ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAA
CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTC
ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCG
GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGG
GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTG
GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC ACC
ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为：
上游引物P1：5’CAG GAATTCATGCTCGTCTCCCCGCAGGTGAC 3’
下游引物P2：5’CAA CTCGAGAGACGCTGTTTGTGTCACCGC 3’
其中，上游引物含有EcoRI酶切位点、起始密码子ATG及部分目的基因序列；下游引物含有XhoI的酶切位点和部分目的基因序列，可扩增包含591bp目的基因在内的DNA片段；
(2)通过计算机分析HCMV甲基化DNA结合蛋白(methylated DNA bindingprotein，MDBP)的全部氨基酸序列，筛选出MDBP蛋白内的强抗原表位，即从第538氨基酸至601氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下：
筛选的HCMV MDBP蛋白强抗原表位的64个氨基酸序列：
Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg
                5                   10                  15                  20
Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
                 25                 30                  35                  40
Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr
                 45                 50                  55                  60
Tyr Arg Leu Asn
筛选的MDBP蛋白抗原表位的DNA序列：
TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGA
GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG
GAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC
TAT CGG CTC AAT TAA
在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为：
上游引物P1：5’CAA CTCGAGTTGGACGGCAAAGGTGAC 3’
下游引物P2：5’CGC GGATCCATTGAGCCGATAGGTACGGT 3’
其中，上游引物含有XhoI酶切位点及部分目的基因序列；下游引物含有BamHI的酶切位点、部分目的基因序列和TAA终止密码子，可扩增包含目的基因在内的192bp的DNA片段；
取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以纯化的HCMV DNA为模板，分别用相应引物P1、P2以扩增条件为：95℃ 30秒、59℃ 40秒、72℃ 55秒，32个循环PCR扩增HCMV PP150蛋白抗原表位的基因片段；以扩增条件为95℃ 30秒、56℃ 40秒、72℃ 45秒，32个循环PCR扩增HCMV MDBP蛋白抗原表位的基因片段；然后分别经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段；
表达融合蛋白重组质粒的构建：
将上述PCR扩增、纯化回收的基因片段分别转化pMD18-T克隆载体，分别构建出相应的pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，质粒经酶切、PCR扩增验证正确后，pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体均用XhoI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pMD18-T-UL32克隆载体和编码HCMV MDBP蛋白、带有XhoI和BamHI粘性末端酶切位点的基因片段，二者在T4 DNA连接酶的作用下，构建出含有PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段的pMD18-T-UL32-UL57融合基因克隆载体，并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，经双酶切和PCR扩增验证后，该融合基因克隆载体与pBV220表达载体分别用ECoRI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pBV220表达载体和融合基因，并在T4 DNA连接酶的作用下，将PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段构成的融合基因串联插入到表达载体pBV220内的ECoRI和BamHI位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白；
重组质粒的筛选与鉴定：
将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，挑取转化子，碱变性法提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切及DNA序列分析，筛选出含PP150蛋白基因和MDBP蛋白基因串连片段的重组质粒，PP150蛋白的基因在串连基因的5’端，MDBP蛋白的基因在串连基因的3’端，两者之间由下划线所示的XhoI酶切位点连接，序列如下：
ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG
TGG GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC
GAC AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG
GAC ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG
CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC
CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC
GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC
GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC
CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC
ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT CTC GAG
TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGA
GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG
GAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC
TAT CGG CTC AAT TAA
构建的重组质粒表达PP150蛋白的197个氨基酸与MDBP蛋白的64个氨基酸的融合蛋白，即权利要求1内所示的融合蛋白；
表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种到含有氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，30℃振荡培养4～8小时，然后迅速升温至42℃诱导4小时，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测筛选并用Western Blotting验证，获得表达融合蛋白的工程菌，表达的融合蛋白的相对分子量约为27000，以可溶性形式存在，表达量约占菌体蛋白总量的25％；
表达融合蛋白的纯化：
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心，收集菌体，冰浴超声破碎细菌，再离心收集上清，收集后的上清先经Sephacryl S200进行初步纯化，接收目的蛋白峰，然后将接收的目的蛋白峰上DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱，用10、50、100、500mmol/L梯度浓度的NaCl溶液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰，该峰含有表达的融合蛋白；
将上一步DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰加入终浓度为1.5mol/L的硫酸铵，然后上Phenyl Sepharose FastFlow疏水柱层析纯化，接收目的蛋白峰，此即为纯化的融合蛋白。
3.权利要求1或2所述的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP在制备其疫苗、单抗、多抗、蛋白芯片、ELISA检测试剂盒以及与人巨细胞病毒相关产品中的应用。
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