CN1163604C

CN1163604C - 减毒水痘病毒冈株的基因62和利用基因62的减毒水痘活疫苗用病毒株的鉴定方法

Info

Publication number: CN1163604C
Application number: CNB998075876A
Authority: CN
Inventors: 五味康行; 郎; 今川忠; 明; 纳寿一郎; 一; 高桥理明; 山西弘一
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2004-08-25
Anticipated expiration: 2019-10-05
Also published as: EP1074624B1; DE69924718T2; DE69924718D1; EP1074624A1; JP4676063B2; KR20010043009A; WO2000050603A1; EP1074624A4; CN1306574A; CA2326699C; CA2326699A1

Abstract

本申请提供减毒水痘病毒冈株的基因62，序列1给出的碱基序列中至少包含以下(a)～(d)的碱基置换：(a)2110碱基A置换为G；(b)3100碱基A置换为G；(c)3818碱基T置换为C；(d)4006碱基A置换为G。另外本申请还提供通过利用基因62鉴别用作减毒水痘活疫苗的减毒水痘病毒冈株和其它容许用作减毒水痘活疫苗的病毒株的方法。

Description

减毒水痘病毒冈株的基因62和利用基因62的减毒水痘活疫苗用病毒株的鉴定方法

技术领域

本申请是涉及减毒水痘病毒冈株的基因62和利用基因62的减毒水痘活疫苗用病毒株(以下记为“减毒水痘病毒株”)的鉴定方法的申请。再说得详细些，本申请是有关能够将作为减毒水痘活疫苗的有效成分使用的减毒水痘病毒冈株和其它容许作为有效成分的减毒水痘病毒株与其它野生型水痘病毒冈株(以下，记为“强毒亲株”或“亲株”)或其它野生型水痘病毒区别开的基因62以及根据该基因62的碱基序列对减毒水痘病毒的鉴定方法等申请。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster virus：VZV。以下记为“水痘病毒”或“VZV”)是人水痘以及带状疱疹的致病性病毒。以来自该病毒的减毒株“减毒水痘病毒冈株”(特公昭53-41202号公报；Lancet 2：1288-1290，1974)的病毒作为唯一的种株制造活疫苗，在世界各国被广泛使用[Requirements for Varicella Vaccine(LiVe)Adopted 1984：WHO Technical Report Series，No.725，pp.102-124，1985]。

目前，该减毒活水痘疫苗的安全性以及有效性是通过控制被批准生产的水痘种病毒的传代次数(seed lot system)确保的。即，为了避免由于种病毒连续传代减毒病毒遗传特性发生变化，使得其病原性恢复带来的危险性，规定以种病毒批准时的传代数为0代，将由此开始的总传代数在10代以内的病毒可以用作疫苗。换言之，减毒活疫苗的质量管理以及质量保证依赖于各个疫苗制造者对seed lot system的遵守。

而对于健康儿童由于接种该减毒活水痘疫苗虽然没有呈现出临床反应，但在被接种者免疫功能出现损伤的情况中，偶尔会出现水痘和带状疱疹。然而这样的临床反应是由于接种疫苗引起的，还是由于野生型水痘病毒的自然感染引起的还不能确定。因此对作为减毒活水痘疫苗的种病毒的减毒水痘病毒冈株和其它的野生型VZV的差别的分析成了流行病学中的重要课题，已经提出了完成该课题的几种方法。即，自VZV基因组的构造被报道以来(Journal of GeneralViralogy，67：1759-1816，1986)，已报道了以下方法：根据VZV株间的DNA碱基序列的差异(Journal of Viralogy，59：660-668，1986)、限制酶Pst I位点的有无(Japanese Journal of ExperimentalMedicine，59：233-237，1989)进行判断、利用PCR(聚合酶链反应Polimerase chain reaction)的RFLP(限定片段长度多形性restriction fragment length polymorphism)进行判断(Journal ofGeneral Viralogy，66：1016-1020，1992)、通过上述限制酶Pst I位点的有无和PCR产物的RFLP的组合(Journal of ClinicalMicrobiology，33：658-660，1995)等进行判断。然而，这些方法无论哪一种单独使用其可信度都很低，所以正确区别减毒水痘病毒冈株和其它野生株是很困难的。

为了解决这个问题，本申请人就减毒水痘病毒冈株和其它水痘病毒株(例如，众所周知的野生株和由自然感染的水痘患者分离出的新鲜野生株等)进行广泛的基因解析，在确定能够区别两者的8个要素的同时，发现未知的水痘病毒只要都满足这8个要素，这些毒株就可以作为活水痘疫苗用的减毒水痘病毒冈株，已经申请了专利(WO97/43420号公报。以下记为在先申请发明)。

按照本申请人在先申请发明的方法，区别减毒水痘病毒冈株和其它水痘病毒株成为可能，但还不能区别减毒水痘病毒冈株和其亲株。而由于必须对8个指标都进行检查，所以在确定之前花费许多时间和手续也是个问题。

本申请的发明人就能够区别减毒水痘病毒冈株和其亲株的方法反复进行了研究，结果发现，通过检测水痘病毒的基因62的变异能够简便而且确实地区别减毒水痘病毒冈株和其亲株以及其它野生型水痘病毒株。

本申请的发明是根据这样的新的见解形成的发明，把提供减毒水痘病毒所特有的基因62作为课题。

另外，本发明也将提供上述基因62编码的蛋白质和其多肽，通过将它们作为抗原得到的抗体以及细胞毒T淋巴细胞(CTL：cytotoxic Tlymphocyte)、以及具有上述基因62的减毒水痘病毒株作为课题。

发明的公开

本申请提供以下各发明作为解决上述课题的发明。

(1)减毒水痘病毒冈株的基因62，序列1给出的碱基序列中，至少包含以下(a)～(d)碱基置换。

(a)2110碱基A置换为G；

(b)3100碱基A置换为G；

(c)3818碱基T置换为C；和

(d)4006碱基A置换为G；

(2)上述(1)的减毒水痘病毒冈株的基因62，它除了包含(a)～(d)的碱基置换外，至少还包含以下(e)～(g)中至少一个以上碱基置换。

(e)1251碱基A置换为G；

(f)2226碱基A置换为G；和

(g)3657碱基A置换为G；

(3)上述(2)的减毒水痘病毒冈株的基因62，它除了包含(a)～(d)的碱基置换、以及(e)～(g)中至少一个以上的碱基置换外，还包含以下(h)～(o)中至少一个以上的碱基置换。

(h)162碱基T置换为C；

(i)225碱基T置换为C；

(j)523碱基T置换为C；

(k)1565碱基T置换为C；

(l)1763碱基T置换为C；

(m)2652碱基T置换为C；

(n)4052碱基T置换为C；和

(o)4193碱基T置换为C；

(4)编码上述(1)至(3)中任一个基因62的DNA片段、由含有碱基置换部分的10个以上碱基对的序列构成的DNA片段。

(5)上述(1)的减毒水痘病毒冈株的基因62编码的蛋白质，序列1给出的氨基酸序列中，至少包含以下(A)～(D)的氨基酸置换。

(A)628氨基酸残基Ser置换为Gly；

(B)958氨基酸残基Arg置换为Gly；

(C)1197氨基酸残基Val置换为Ala；和

(D)1260氨基酸残基Ile置换为Val；

(6)上述(5)的蛋白质，它除了包含(A)～(D)的氨基酸置换外，至少还包含以下(E)～(H)中的至少一个以上的氨基酸置换。

(E)99氨基酸残基Met置换为Thr；

(F)446氨基酸残基Leu置换为Pro；

(G)512氨基酸残基Val置换为Ala；和

(H)1275氨基酸残基Leu置换为Ser；

(7)上述(5)或(6)蛋白质的一部分，由含有其中氨基酸置换部分的5个以上氨基酸残基的序列构成的多肽。

(8)通过用上述(5)或(6)蛋白质、或上述(7)的多肽作为抗原获得的抗体或CTL。

(9)减毒水痘病毒株，其中病毒基因组的基因62是上述(1)至(3)中的任一个基因62。

(10)减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒株的鉴定方法，其特征是：选择含有与上述(1)至(3)中的任一个基因62的碱基置换相同的碱基置换的水痘病毒。

(11)减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒株的鉴定方法，其特征是：选择含有上述(4)的DNA片段杂交的基因组的水痘病毒。

(12)减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒株的鉴定方法，其特征是：选择产生上述(8)的抗体或CTL识别的抗原的水痘病毒。

(13)减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒株的鉴定方法，其特征是：在序列1的碱基序列中至少从第2107碱基到第2229碱基的DNA序列被限制酶Nae I以及BssHII切断，选择该DNA序列被切割为2或3个片段的水痘病毒。

(14)上述(13)的鉴定方法中，DNA序列是分别以由序列2的碱基序列构成的寡核苷酸和序列3的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物，以水痘病毒的基因62为模板，通过PCR法制备的。

(15)通过由上述(10)至(14)中任一个方法鉴定的减毒水痘病毒株。

(16)以上述(9)或(15)的减毒水痘病毒株作为种病毒的减毒活水痘疫苗。

附图的简单说明

图1的上面是表示水痘病毒基因62构成的模式图，下面是从减毒水痘病毒冈株基因62得到的9个克隆和强毒亲株的基因62的序列分析结果的归纳。

图2是表示对应下面的各个水痘病毒基因62 PCR产物的RFLP分析的结果的琼脂糖凝胶电泳图。带1：减毒水痘病毒冈株；带2：强毒亲株；带3：河口株；带4-8：野生型水痘病毒；带9-13：野生型带状疱疹病毒。而两侧带是大小标准带。

图3是减毒水痘病毒冈株和其强毒亲株的各个基因62产物(IE62)激活VZV各个基因启动子的试验结果。A是表示编码IE4的基因4的启动子活性与效应质粒量的关系图。CV1细胞被一定量(0.25μg)的pCAT-IE4和不同量的pVac-G62(□)或pPar-G62(●)共转染。以下分别表示，B：编码IE62的基因62；C：编码DNA聚合酶的基因28；D：编码主要DNA结合蛋白(major DNA binding protein：MDBP)的基因29；E：编码糖蛋白C(glycoprotein C：gC)的基因14；F：编码gE的基因68的各个启动子活性与效应质粒量的关系图。

实施发明的最佳方式

水痘病毒的基因62是具有转染功能(使转录反式激活的功能)的基因，是位于水痘病毒基因组全序列(Journal of General Viralogy，67：1759-1816，1986)中的碱基105142-109242区域内的基因。该基因62就象图1上面所示那样，由于从转录起始部位开始沿箭头所指方向进行转录，水痘病毒基因组全序列的碱基109242-105142成了“+”链。因此序列1的第一个碱基“A”对应于该“+”链的5’末端碱基(基因组全序列的第109242碱基)。在以下的说明中，有时碱基号被当作基因组全序列的碱基号，但由于该基因组全序列中基因62的序列是“-”链，所以与序列1所示的碱基互补。

本发明的减毒水痘病毒冈株的基因62是在序列1的碱基序列中，包含表1所示(a)～(d)的碱基置换的基因。另外，该减毒水痘病毒冈株的基因62是除了包含上述(a)-(d)的碱基置换外，而且还包含表1(e)～(g)中的至少一个以上的碱基置换的基因，甚至还包含表1(h)～(o)中的至少一个以上的碱基置换的基因。

另外本发明的减毒水痘病毒的蛋白质是上述基因62编码的蛋白质，是在序列1的氨基酸序列中，包含表1所示(A)～(D)的氨基酸置换的蛋白质。而该蛋白质是除了包含上述(A)～(D)的氨基酸置换外，还包含表1所示(E)～(H)中至少一个以上的氨基酸置换的蛋白质。

表1

碱基置换氨基酸置换

(a)2110 A-G (A)661 Ser-Gly

(b)3100 A-G (8)958 Arg-Gly

(c)3818 T-C (C)1197 Val-Ala

(d)4006 A-G (D)1260 Ile-Val

(e)1251 A-G

(f)2226 A-G

(g)3657 A-6

(h)162 T-C

(i)225 T-C

(j)523 T-C (E)99 Met-Thr

(k)1565 T-C (F)446 Leu-Pro

(l)1763 T-C (G)512 Val-Ala

(m)2652 T-C

(n)4052 T-C (H)1275 Leu-Ser

(o)4193 T-C

人们也认为带有造成这样氨基酸置换的碱基置换的基因62的水痘病毒冈株由于反式激活功能缺损或减弱使病毒粒子形成所必需蛋白质的表达整体降低，其结果使之毒性降低了。

这样的减毒水痘病毒冈株基因62，例如可以利用常规的方法从从众所周知的减毒水痘病毒冈株(BIKEN Lot-65：(财)阪大微生物病研究会，或ATCC VR-795)分离。这样的减毒水痘病毒冈株基因62也可以从经后面记载的方法鉴定的减毒水痘病毒中分离出。

本发明的DNA片段是对上述基因62进行编码的DNA片段，是含有碱基置换部分的10个以上碱基对的DNA片段。该DNA片段可以通过适当的限制酶切割减毒水痘病毒冈株或利用本发明的方法新鉴定的减毒水痘病毒株的基因组DNA等方法得到。该DNA片段例如可以用作为区别减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒株与强毒亲株或其它的野生型病毒株的DNA探针等。

而本发明的蛋白质可以通过使上述的基因62在诸如大肠杆菌或酵母等微生物中表达获得。即将含有上述基因62编码区的DNA片段插入到含有在微生物中可能复制的起点、启动子、核糖体结合部位、DNA序列克隆部位、终止子等的表达载体，并连接，作成表达载体，用该表达载体转化宿主细胞后，如果培养得到的转化体，在微生物中就可以大量生产基因62编码的蛋白质。或者，以与其它蛋白质融合的融合蛋白形式使其表达。将得到的融合蛋白用适当的蛋白酶切，也可以只获得目的蛋白部分。

这些蛋白质可以用作制作例如抗体或CTL的抗原。

本发明的多肽是在上述蛋白质的氨基酸序列中含有其氨基酸置换部分的5个以上氨基酸残基的序列。这些多肽也可以用作制作抗体或CTL的抗原。

本发明的抗体是以上述蛋白质本身、或其部分肽段作为抗原，通过众所周知的方法可以获得多克隆抗体或单克隆抗体。而本发明的CTL也以上述蛋白质本身、或其部分肽段作为抗原，通过众所周知的方法可以获得。这些抗体和CTL可以用在新分离的减毒水痘病毒株的鉴定方法中。

本发明的减毒水痘病毒株是其基因62具有与上述的减毒水痘病毒冈株基因62同样的碱基置换的水痘病毒株，是容许作为减毒活疫苗用的病毒株。这样的新的减毒水痘病毒株可以通过选择带有含有上述碱基置换的基因62的水痘病毒来鉴定。具体来说，例如通过使用上述的DNA片段或抗体或CTL的方法从野生型水痘病毒株中进行鉴别。

或者利用本申请提供的方法，即用在序列1的碱基序列中至少是从第2107碱基到第2229碱基的DNA序列用限制酶NaeI和BssHII切，选择该片段被切成2段或3段的水痘病毒的方法来鉴定。象上述那样，减毒水痘病毒冈株的基因62是第2110碱基A被置换成了G的产物。而有时第2226碱基A被置换为G。其结果，通过第2110碱基A-G的置换，在序列1的2107-2112碱基序列中形成了限制酶NaeI识别部位(GCCGGC)，而通过第2226碱基A-G的置换在序列1的2224-2229序列形成了BssHII的识别部位(GCGCGC)。因此至少序列1的2107-2229碱基用上述两种限制酶切，如果该DNA序列是来自减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒，应当被切成2段或3段。而来自野生型水痘病毒或减毒水痘病毒冈株的强毒亲株的DNA序列由于没有上述那样的碱基置换，用上述两种限制酶切没有用，仍然是一个片段。而用限制酶切断的DNA序列，例如可以通过分别以由序列2构成的寡核苷酸和序列3的碱基序列构成的寡核苷酸为引物，以作为鉴定对象的水痘病毒基因62为模板的PCR法制备。

本发明的减毒活水痘疫苗是通过使用经上述方法鉴定的新的减毒水痘病毒株作为种病毒制造的疫苗。这样的活疫苗可以用减毒水痘病毒冈株作种病毒与已有的减毒活水痘疫苗一样地制备。

实施例

以下给出实施例进一步详细而且具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的例子。

实施例1

确定了减毒水痘病毒冈株的基因62和其强毒亲株的基因62的碱基序列。减毒水痘病毒冈株(活疫苗株)使用BIKEN Lot-65[(财)阪大微生物病研究会]。强毒亲株(野生型水痘病毒冈株)使用通过MRC-5细胞传代增殖的细胞株。

具体来说，按照在先申请的发明(WO97/43420公报)中实施例1记载的方法，从减毒水痘病毒冈株和强毒亲株提取DNA，使用根据Dumas株碱基序列(J.Gen.Virol.，67：1759-1816，1986)设计的引物通过PCR法对各个基因进行扩增。基因62的全长用3组引物(表2所示的有意义引物G62N1、G62N2、G62N3和反意义引物G62R1、G62R2、G62R3)，扩增出3个都重叠的片段。而各个有意义引物在其5’末端处连接着M13正向(-38)序列(G62N1-3的1-19碱基)。而反意义引物在其5’末端处连接着M13反向序列(G62R1-3的1-20碱基)。

表2

引物序列基因组位置

G62N 5′-CCGAGCTCGAATT/CTAGATTCATAAAAACCGTTCCGC-3′ 105103-105139

xbaI切割部位

G62N1 5′-TTTCCCAGTCACGACGTTGTTCATAAAAACCGTTCCGC-3′ 105121-105139

G62N2 5′-TTTCCCAGTCACGACGTTGCAGGCACAACCGGTTACTCAG-3′ 106455-106475

G62N3 5′-TTTCCCAGTCACGACGTTGTTTGGTCTTACGAATCCTCGG-3′ 107844-107864

G62R 5′-ACCTGATCAGAATTCTGCA/GAGCGGTCTCTCCTTAAACGC-3′ 109381-109362

PstI切割部位

G62R1 5′-GGATAACAATTTCACACAGGTTCTGATCATCTACGATCCG-3′ 106600-106581

G62R2 5′-GGATAACAATTTCACACAGGCAAATTCGGATGATTCGGAC-3′ 107950-107931

G62R3 5′-GGATAACAATTTCACACAGGAGCGGTCTCTCCTTAAACGC-3′ 109381-109362

PCR反应液使用各个脱氧核苷三磷酸200mM、各个引物0.3μM、极微量的模板DNA、含有2.5U的ExTaq(宝酒造公司制造)的50μL的ExTaq缓冲液。当使用序列3和8的引物时，在上述组成中加入6％DMSO。使用PCR自动化装置(美国Perkin-Elmer公司制造)进行扩增，共进行30循环，每一循环为：变性(94℃：1分钟)、退火(55℃：1.5分钟)、延伸(72℃：2分钟)。

然后利用PCR纯化试剂盒(德国QIAGEN GmbH公司制造)对PCR扩增产物和引物进行分离，使用测序试剂盒(英国Amersham公司制造)确定序列，用DNA测序仪Model 4000L(美国U-COR公司制造)进行分析。而在确定序列时，使用荧光色素IRO-40标记的M13 向引物或反向引物。

减毒水痘病毒冈株和强毒亲株的基因4、14、61的序列也通过同样的方法进行确定。

其结果，就基因4、14、61在减毒水痘病毒冈株和强毒亲株之间没有看出碱基序列之间的差别。另外就象表3所示的那样，就基因62来说，减毒水痘病毒冈株与强毒亲株之间有15处碱基不同。这些碱基置换是T-C或A-G，8处碱基置换是由于在单一一个碱基位置可掺杂两类碱基造成的，导致编码不同的氨基酸残基(表3中的R)。而减毒水痘病毒冈株和强毒亲株与Dumas株的基因62之间有9处碱基不同。

从以上结果可以看出，减毒水痘病毒冈株和强毒亲株可以通过它们各自的基因62序列的差异来区别。

表3

基因组位置疫苗株亲株 Dumas株

105169 R(noncodirg) A(noncoding) A

105310 R(Ser/Leu) A(Leu) A

105356 C(Val) T(Ile) T

105451 G G A

105512 C C A

105544 G(Ala) A(Ala) A

105705 C(Ala) T(Ala) T

106262 C(Gly) T(Arg) T

106710 R(Ala) A(Ala) A

107136 C(Ala) T(Ala) T

107165 T T C

107252 C(Gly) T(Ser) T

107303 C C T

107599 R(Ala/Val) A(Val) A

107607 A A C

107715 C C T

107797 R(Pro/Leu) A(Leu) A

108111 C(Pro) T(Pro) T

108747 G G A

108838 R(Thr/Met) A(Met) A

108951 A A G

109044 G G C

109137 R(silent) A(silent) A

109200 R(silent) A(silent) A

实施例2

利用PCR法对减毒水痘病毒冈株的基因62和其强毒亲株的基因62的各自全长序列进行扩增，克隆。

作为引物可以使用表1的G62N和G62R的寡核苷酸，反应液中加入6％DMSO，利用PCR法(除了延伸反应为6分钟外，其它条件与实施例1相同)对基因62的全长进行扩增。

引物由于分别含有限制酶Xba I和Pst I识别部位，纯化的PCR产物用这些限制酶切后，克隆于用同样的酶预先切的pUC19中。然后将重组的质粒导入E.coli JM109中，就减毒水痘病毒冈株和强毒亲株的基因62从各个转化体中提取9个质粒，确定插入的序列。

结果就象图1所示的那样。图1表明，减毒水痘病毒冈株的9个克隆的每个克隆的15处碱基中有多个碱基都与强毒亲株不同。特别是所有克隆中的第1251、2110、2226、3100、3667、3818和4008 7处碱基都与亲株的同一位置的碱基不同。另外强毒亲株的9个克隆，包括上述15处碱基在内，序列都相同。

实施例3

利用RFLP对各种水痘病毒的基因62的部分序列进行分析。

减毒水痘病毒冈株和强毒亲株与实施例1中使用的一样。另外作为水痘病毒野生株，使用河口株以及从未接种疫苗的5例水痘患者和5例带状疱疹患者的水泡液中分离出的10个新鲜野生型病毒株检测样品。而从河口株和患者分离出的野生型水痘病毒株通过人HEL细胞或MRC-5细胞传2-3代后，再使用。

各个水痘病毒的基因62通过以序列2和序列3的寡核苷酸为引物的PCR法进行扩增。序列2的寡核苷酸是对应于水痘病毒基因62(序列1)的1846-1863碱基的反向引物，而序列3的寡核苷酸是对应于2609-2620碱基的正向引物。PCR条件除了延伸时间为1分钟外，其它与实施例1一样。将得到的PCR产物3μL用4U的NaeI(宝酒造公司制造)于37℃下切1.5小时，然后再用4U的BssHII(宝酒造公司制造)于50℃下切1.5小时。酶切后的DNA片段走4％琼脂糖凝胶(NuSieve 3：1.FMC BioProducts公司制造)电泳，经溴乙锭染色后进行分析。

结果如图2所示。图2表明，来自减毒水痘病毒冈株的基因62的PCR产物(带1)被NaeI和BssHII切成3个片段(402bp、264bp、116bp)。而来自从强毒亲株和患者分离出的新鲜野生型病毒株的PCR产物(带2-带3)没有被这些限制酶切断，仍然是一个片段。

从以上结果可以确认，至少是从水痘病毒基因62的第2107碱基到2229碱基为止的DNA片段可被限制酶NaeI和BssHII切，经鉴定，带有可被切成2个或3个片段的DNDA序列的水痘病毒可作为减毒水痘病毒冈株或容许作为减毒水痘病毒的病毒株。

实施例4

为了分析基因62表达产物中8处氨基酸变异和其反式激活活性之间的关系，在对报告质粒和效应质粒进行共转染的细胞进行CAT分析，其中报告质粒含有VZV的各个基因的启动子序列和氯霉素转移酶(CAT)基因，而效应质粒含有减毒水痘表达冈株或强毒亲株的基因62。

1.材料和方法

1.1质粒

构建含有从基因4、14、28、29、62和68的各个启动子区起始密码上游的大约750碱基序列的报告质粒pIE4-CAT、pgC-CAT、pPol-CAT、pMDBP-CAT、pIE62-CAT、pgE-CAT。各个启动子区的序列可以通过利用5’端含有NheI或BglII位点的引物的PCR法从减毒冈株基因组进行扩增。PCR条件除了延伸时间为1分钟外，其它与实施例1一样。扩增产物用NheI和BglII切，插入到pCAT3-基本质粒(Basic plasmid)(美国Promega公司制造)的CAT基因的上游，并进行连接。

效应质粒pPar-G62用强毒亲株的基因62的克隆构建。另外从减毒冈株的基因62获得的9个克隆中选择图1的克隆9(含有13个碱基置换和8个氨基酸置换的克隆)，构建效应质粒pVac-G62。

1.2.转染

将CV1细胞于35mm塑料皿中以10⁵细胞/dish的比例进行培养，通过利用了SuperFect(QIAGEN GmbH)的脂(质)转染法使各个质粒共转染CV1细胞。在共转染的各个反应液中含有0.25μg的报告质粒和不同量(0-1μg)的效应质粒。而在共转染中，通过添加载体pUC19，可将DNA的总量保持在2.5μg。所有实验(对于各个DNA共转染)都至少重复3次。

1.3.CAT分析

共转染44小时后，测定细胞总蛋白和CAT量。将细胞用磷酸缓冲生理盐水洗3次，用溶解缓冲液(德国Boehringer Mannheim公司制造)溶解。各个提取物的CAT浓度通过CAT ELISA试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司制造)确定，相对于通过Bio-Rad蛋白质试剂(美国Bio-Rad公司制造)确定的蛋白质质量进行标准化。

2.结果

进行试验的VZV基因的所有启动子都几乎没有显示出背景活性。即、在没有对效应质粒进行共转染时，几乎没有观察到CAT的表达。

来自减毒冈株的基因4启动子通过强毒亲株和减毒冈株的各个基因62表达产物(IE62)反向激活(图3A)。但当效应质粒的量低时，强毒亲株的IE62表现出比减毒冈株的IE62更强的转录活性。即当效应质粒的量最低(0.25μg)时，强毒亲株IE62的转录活性是减毒冈株IE62的7.8倍。随着效应质粒量的增加，两者活性之间的差距变小。

另外从对报告质粒pCAT-IE62进行转染的细胞几乎没有检测出CAT活性(图3B)。

另外含有VZV基因28和29的各个启动子区的pCAT-Pol和pCAT-MDBP(图3C和D)以及含有基因68的启动子序列的pCAT-gE(图3E)被强毒亲株和减毒冈株的IE62激活。这些CAT活性与效应质粒量的依赖曲线类似于pCAT-IE4，而强毒亲株IE62比减毒冈株IE62表现出更强的活性。特别是当效应质粒量为最低时，强毒亲株IE62的活性分别为减毒冈株的7.6倍、5.6倍和1.8倍。然而在对含有基因14的启动子区的pCAT-gC进行转染的细胞中，检测不出CAT活性(图3F)。

从以上结果可以看出，VZV基因62的表达产物(IE62)激活前早期基因4(ORF4)、早期基因28(DNA聚合酶：Pol)和基因29(主要DNA结合蛋白：MDBP)、和后期的基因68(糖蛋白E：gE)的启动子。而更重要的是减毒冈株IE62的转录活性往往比强毒亲株IE62更低。即在减毒冈株的基因62中的变异影响病毒复制，这可使VZV减毒。

工业实用性

利用本申请的发明可以简便而且正确地区别减毒水痘病毒冈株或容许作为减毒水痘病毒的水痘病毒株和其它的野生型水痘病毒和减毒水痘病毒的强毒亲株。另外利用本申请的发明可以大量制造活疫苗用的减毒水痘病毒抗原。利用这些发明疫苗制造和疫苗接种的安全性以及有效性可以通过更可靠的方式获得。

序列表

<110>财团法人阪大微生物病研究会

<120>减毒水痘病毒冈株的基因62和利用基因62的减毒水痘活疫苗用病毒

株的鉴定方法

<140>PCT/JP99/05476

<141>1999-10-05

<150>JP11-48964

<151>1999-02-25

<160>3

<210>1

<211>4226

<212>DNA

<213>水痘带状疱疹病毒

<220>

<221>CDS

<222>229..4158

<400>1

ATACTATGGT CCATGAACTT CCCGCCTCGA GTCTCGTCCA ATCACTACAT CGTCTTATCA 60

TTAAGAATAT TTACACGGTG ACGACACGGG GAGGAAATAT GCGGTCGAGG GGGGGGCACA 120

ACACGTTTTA AGTACTGTTG GAACTCCCTC ACCAACCGCA ATCGCAATCC TTTGAAGGCT 180

GCGAGAGCGT TTGGAAAACT CGGGTACGTC TAAATTCACC CCAGTGCG ATG GAT 234

Met Asp

1

ACG CCG CCG ATG CAG CGC TCT ACA CCC CAA CGC GCG GGG TCG CCT GAT 282

Thr Pro Pro Met Gln Arg Ser Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser Pro Asp

5 10 15

ACT TTG GAG TTA ATG GAC CTG TTG GAC GCG GCC GCC GCG GCC GCC GAA 330

Thr Leu Glu Leu Met Asp Leu Leu Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu

20 25 30

CAC AGG GCC CGG GTG GTC ACC TCG AGT CAG CCT GAC GAT CTA CTA TTT 378

His Arg Ala Arg Val Val Thr Ser Ser Gln Pro Asp Asp Leu Leu Phe

35 40 45 50

GGA GAG AAC GGG GTC ATG GTG GGA CGG GAA CAT GAG ATC GTT TCA ATT 426

Gly Glu Asn Gly Val Met Val Gly Arg Glu His Glu Ile Val Ser Ile

55 60 65

CCC TCC GTA TCG GGA CTT CAA CCA GAA CCC AGA ACG GAA GAT GTT GGC 474

Pro Ser Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Pro Arg Thr Glu Asp Val Gly

70 75 80

GAA GAG CTA ACA CAA GAC GAC TAC GTA TGC GAG GAC GGT CAG GAT CTA 521

Glu Glu Leu Thr Gln Asp Asp Tyr Val Cys Glu Asp Gly Gln Asp Leu

85 90 95

ATG GGC TCG CCT GTA ATC CCG CTG GCC GAG GTC TTC CAC ACC CGA TTC 570

Met Gly Ser Pro Val Ile Pro Leu Ala Glu Val Phe His Thr Arg Phe

100 105 110

TCG GAG GCC GGC GCG CGA GAA CCA ACA GGA GCC GAT CGC TCC CTC GAG 618

Ser Glu Ala Gly Ala Arg Glu Pro Thr Gly Ala Asp Arg Ser Leu Glu

115 120 125 130

ACA GTC TCT CTC GGA ACG AAG CTT GCT AGG TCT CCA AAA CCA CCG ATG 666

Thr Val Ser Leu Gly Thr Lys Leu Ala Arg Ser Pro Lys Pro Pro Met

135 140 145

AAC GAT GGG GAA ACG GGC AGA GGT ACG ACC CCT CCG TTC CCG CAG GCC 714

Asn Asp Gly Glu Thr Gly Arg Gly Thr Thr Pro Pro Phe Pro Gln Ala

150 155 160

TTC TCC CCT GTA TCC CCC GCG TCT CCT GTT GGA GAC GCC GCC GGG AAC 762

Phe Ser Pro Val Ser Pro Ala Ser Pro Val Gly Asp Ala Ala Gly Asn

165 170 175

GAT CAA CGG GAA GAC CAG CGG TCT ATA CCC CGA CAA ACG ACG AGA GGA 810

Asp Gln Arg Glu Asp Gln Arg Ser Ile Pro Arg Gln Thr Thr Arg Gly

180 185 190

AAT TCA CCA GGT TTG CCG TCG GTG GTC CAT CGA GAC AGA CAA ACT CAG 858

Asn Ser Pro Gly Leu Pro Ser Val Val His Arg Asp Arg Gln Thr Gln

195 200 205 210

TCC ATC TCG GGT AAA AAG CCG GGC GAT GAG CAA GCG GGT CAT GCG CAT 906

Ser Ile Ser Gly Lys Lys Pro Gly Asp Glu Gln Ala Gly His Ala His

215 220 225

GCA TCG GGG GAC GGA GTA GTT CTC CAG AAA ACT CAA CGG CCC GCT CAG 954

Ala Ser Gly Asp Gly Val Val Leu Gln Lys Thr Gln Arg Pro Ala Gln

230 235 240

GGA AAG AGC CCG AAG AAA AAG ACT TTG AAG GTT AAG GTC CCA CTC CCG 1002

Gly Lys Ser Pro Lys Lys Lys Thr Leu Lys Val Lys Val Pro Leu Pro

245 250 255

GCG CGG AAA CCC GGT GGA CCT GTA CCC GGC CCG GTT GAG CAA TTG TAC 1050

Ala Arg Lys Pro Gly Gly Pro Val Pro Gly Pro Val Glu Gln Leu Tyr

260 265 270

CAC GTC CTT TCG GAC AGC GTT CCC GCT AAG GGG GCA AAG GCG GAC CTG 1098

His Val Leu Ser Asp Ser Val Pro Ala Lys Gly Ala Lys Ala Asp Leu

275 280 285 290

CCG TTT GAG ACC GAT GAT ACC CGC CCA AGG AAA CAT GAT GCC CGG GGT 1146

Pro Phe Glu Thr Asp Asp Thr Arg Pro Arg Lys His Asp Ala Arg Gly

295 300 305

ATA ACA CCT CGG GTC GCT GGA CGT TCG TCG GGG GGC AAA CCT AGA GCG 1194

Ile Thr Pro Arg Val Pro Gly Arg Ser Ser Gly Gly Lys Pro Arg Ala

310 315 320

TTT TTG GCC CTG CCG GGA AGA TCC CAC GCA CCA GAC CCG ATT GAG GAT 1242

Phe Leu Ala Leu Pro Gly Arg Ser His Ala Pro Asp Pro Ile Glu Asp

325 330 335

GAC AGC CCA GTG GAG AAA AAG CCA AAG AGT CGT GAG TTT GTT TCG TCT 1290

Asp Ser Pro Val Glu Lys Lys Pro Lys Ser Arg Glu Phe Val Ser Ser

340 345 350

TCA TCC TCT TCC TCG TCG TGG GGA TCG TCA TCG GAG GAT GAA GAC GAT 1338

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Trp Gly Ser Ser Ser Glu Asp Glu Asp Asp

355 360 365 370

GAA CCC CGG CGC GTT TCG GTG GGA AGT GAA ACT ACA GGC AGC AGG TCC 1386

Glu Pro Arg Arg Val Ser Val Gly Ser Glu Thr Thr Gly Ser Arg Ser

375 380 385

GGA CGC GAA CAC GCC CCT TCC CCG TCA AAT TCG GAT GAT TCG GAC TCA 1434

Gly Arg Glu His Ala Pro Ser Pro Ser Asn Ser Asp Asp Ser Asp Ser

390 395 400

AAT GAT GGT GGG TCG ACG AAA CAA AAT ATC CAA CCG GGA TAT CGA TCC 1482

Asn Asp Gly Gly Ser Thr Lys Gln Asn Ile Gln Pro Gly Tyr Arg Ser

405 410 415

ATC AGC GGT CCC GAT CCG AGG ATT CGT AAG ACC AAA CGT CTT GCG GGG 1530

Ile Ser Gly Pro Asp Pro Arg Ile Arg Lys Thr Lys Arg Leu Ala Gly

420 425 430

GAA CCG GGG CGC CAG AGA CAG AAA TCA TTT TCC CTG CCG CGA TCC AGA 1578

Glu Pro Gly Arg Gln Arg Gln Lys Ser Phe Ser Leu Pro Arg Ser Arg

435 440 445 450

ACC CCG ATA ATT CCC CCG GTG TCG GGG CCG CTC ATG ATG CCC GAC GGA 1626

Thr Pro Ile Ile Pro Pro Val Ser Gly Pro Leu Met Met Pro Asp Gly

455 460 465

AGC CCT TGG CCC GGA TCG GCG CCC CTC CCA TCC AAC AGG GTG CGG TTT 1674

Ser Pro Trp Pro Gly Ser Ala Pro Leu Pro Ser Asn Arg Val Arg Phe

470 475 480

GGA CCG TCC GGG GAG ACC AGA GAG GGT CAC TGG GAG GAT GAG GCT GTG 1722

Gly Pro Ser Gly Glu Thr Arg Glu Gly His Trp Glu Asp Glu Ala Val

485 490 495

AGA GCG GCG CGG GCT CGT TAC GAG GCC TCA ACT GAA CCC GTG CCG CTT 1770

Arg Ala Ala Arg Ala Arg Tyr Glu Ala Ser Thr Glu Pro Val Pro Leu

500 505 510

TAC GTG CCG GAG TTG GGA GAT CCG GCT AGA CAG TAG CGC GCG CTG ATT 1818

Tyr Val Pro Glu Leu Gly Asp Pro Ala Arg Gln Tyr Arg Ala Leu Ile

515 520 525 530

AAC CTG ATC TAC TGT CCA GAC AGA GAC CCT ATA GCA TGG CTC CAG AAC 1866

Asn Leu Ile Tyr Cys Pro Asp Arg Asp Pro Ile Ala Trp Leu Gln Asn

535 540 545

CCC AAG CTG ACC GGT GTC AAC TCG GCC CTG AAC CAG TTC TAC CAA AAG 1914

Pro Lys Leu Thr Gly Val Asn Ser Ala Leu Asn Gln Phe Tyr Gln Lys

550 555 560

GTG TTG CCA CCG GGA CGG GCG GGT ACC GCC GTT ACG GGG AGC GTA GCG 1962

Leu Leu Pro Pro Gly Arg Ala Gly Thr Ala Val Thr Gly Ser Val Ala

565 570 575

TCT CCC GTT CCG CAT GTA GGC GAA GCC ATG GCC ACG GGG GAG GCC CTC 2010

Ser Pro Val Pro His Val Gly Glu Ala Met Ala Thr Gly Glu Ala Leu

580 585 590

TGG GCT CTC CCC CAC GCG GCC GCG GCC GTG GCT ATG AGC CGT CGG TAC 2058

Trp Ala Leu Pro His Ala Ala Ala Ala Val Ala Met Ser Arg Arg Tyr

595 600 605 610

GAC CGG GCC CAA AAA CAC TTT ATC CTA CAG AGT CTC CGC AGA GCC TTT 2106

Asp Arg Ala Gln Lys His Phe Ile Leu Gln Ser Leu Arg Arg Ala Phe

615 620 625

GCC AGC ATG GCA TAC CCC GAG GCA ACG GGC TCC AGT CCG GCG GCG CGG 2154

Ala Ser Met Ala Tyr Pro Glu Ala Thr Gly Ser Ser Pro Ala Ala Arg

630 635 640

ATC TCC CGC GGT CAC CCT TCT CCA ACA ACC CCG GCC ACA CAG ACT CCC 2202

Ile Ser Arg Gly His Pro Ser Pro Thr Thr Pro Ala Thr Gln Thr Pro

645 650 655

GAC CCT CAG CCG TCG GCC GCC GCA CGC TCT CTT TCT GTG TGT CCA CCG 2250

Asp Pro Gln Pro Ser Ala Ala Ala Arg Ser Leu Ser Val Cys Pro Pro

660 665 670

GAT GAT CGT TTA CGA ACT CCG CGC AAG CGC AAG TCC CAG CCA GTC GAG 2298

Asp Asp Arg Leu Arg Thr Pro Arg Lys Arg Lys Ser Gln Pro Val Glu

675 680 685 690

AGC AGA AGC CTC CTC GAC AAG ATT AGG GAG ACA CCC GTC GCG GAC GCC 2346

Ser Arg Ser Leu Leu Asp Lys Ile Arg Glu Thr Pro Val Ala Asp Ala

695 700 705

CGG GTT GCA GAC GAT CAT GTG GTT TCC AAG GCC AAG AGG CGG GTA TCC 2394

Arg Val Ala Asp Asp His Val Val Ser Lys Ala Lys Arg Arg Val Ser

710 715 720

GAG CGG GTG ACC ATC ACG TCG GGG GGT GTG GTG GAT CCC CCG GCC GTA 2442

Glu Pro Val Thr Ile Thr Sar Gly Pro Val Val Asp Pro Pro Ala Val

725 730 735

ATA ACG ATG CCA CTT GAC GGA CCG GCC CCA AAC GGG GGA TTT CGG CGT 2490

Ile Thr Met Pro Leu Asp Gly Pro Ala Pro Asn Gly Gly Phe Arg Arg

740 745 750

ATT CCC CGG GGG GCC CTG CAT ACC CCG GTC CCG TCG GAC CAG GCT CGC 2538

Ile Pro Arg Gly Ala Leu His Thr Pro Val Pro Ser Asp Gln Ala Arg

755 760 765 770

AAG GCG TAC TGT ACC CCC GAA ACC ATC GCC CGT CTG GTC GAC GAC CCA 2586

Lys Ala Tyr Cys Thr Pro Glu Thr Ile Ala Arg Leu Val Asp Asp Pro

775 780 785

TTG TTT CCC ACG GCC TGG CGC CCT GCG CTA AGC TTT GAT CCC GGC GCC 2634

Leu Phe Pro Thr Ala Trp Arg Pro Ala Leu Ser Phe Asp Pro Gly Ala

790 795 800

TTG GCG GAA ATC GCC GCT CGG CGT CCG GGC GGA GGA GAC CGA CGG TTT 2682

Leu Ala Glu Ile Ala Ala Arg Arg Pro Gly Gly Gly Asp Arg Arg Phe

805 810 815

GGT CCA CCC AGC GGA GTG GAG GCG CTG CGA CGG AGG TGC GCC TGG ATG 2730

Gly Pro Pro Ser Gly Val Glu Ala Leu Arg Arg Arg Cys Ala Trp Met

820 825 830

CGG GAG ATC CCA GAC CCG GAG GAT GTG AGG CTT CTG ATC ATC TAC GAT 2778

Arg Gln Ile Pro Asp Pro Glu Asp Val Arg Leu Leu Ile Ile Tyr Asp

835 840 845 850

CCG TTG CCC GGA GAG GAC ATC AAC GGC CCC CTC GAG AGC ACC CTC GCG 2826

Pro Leu Pro Gly Glu Asp Ile Asn Gly Pro Leu Glu Ser Thr Leu Ala

855 860 865

ACA GAT CCG GGA CCG TCA TGG AGT CCA TCC CGA GGG GGA CTG TCT GTG 2874

Thr Asp Pro Gly Pro Ser Trp Ser Pro Ser Arg Gly Gly Leu Ser Val

870 875 880

GTC CTG GCA GCC CTG AGT AAC CGG TTG TGC CTG CCG AGC ACT CAT GCC 2922

Val Leu Ala Ala Leu Ser Asn Arg Leu Cys Leu Pro Ser Thr His Ala

885 890 895

TGG GCC GGG AAC TGG ACC GGC CCG CCG GAC GTG TCG GCT TTG AAC GCC 2970

Trp Ala Gly Asn Trp Thr Gly Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Asn Ala

900 905 910

CGG GGC GTT TTA TTA CTG TCG ACC CGA GAC CTG GCC TTT GCC GGG GCC 3018

Arg Gly Val Leu Leu Leu Ser Thr Arg Asp Leu Ala Phe Ala Gly Ala

915 920 925 930

GTC GAG TAT CTA GGC TCG CGG TTG GCC TCT GCC CGG CGC CGG TTG CTG 3066

Val Glu Tyr Leu Gly Ser Arg Leu Ala Ser Ala Arg Arg Arg Leu Leu

925 940 945

GTG TTG GAC GCG GTG GCC CTC GAG AGG TGG CCC AGG GAT GGA CCC GCT 3114

Val Leu Asp Ala Val Ala Leu Glu Arg Trp Pro Arg Asp Gly Pro Ala

950 955 960

TTG TCT CAG TAT CAC GTG TAC GTC CGG GCC CCG GCG CGA CCG GAC GCC 3162

Leu Ser Gln Tyr His Val Tyr Val Arg Ala Pro Ala Arg Pro Asp Ala

965 970 975

CAG GCC GTC GTC CGA TGG CCA GAC TCG GCG GTC ACA GAA GGA CTC GCC 3210

Gln Ala Val Va Arg Trp Pro Asp Ser Ala Val Thr Glu Gly Leu Ala

980 985 990

CGG GCC GTG TTT GCA TCG TCG CGC ACC TTT GGG CCA GCG AGT TTT GCT 3258

Arg Ala Val Phe Ala Ser Ser Arg Thr Phe Gly Pro Ala Ser Phe Ala

995 1000 1005 1010

CGT ATC GAG ACT GCG TTT GCC AAC CTG TAC CCG GGC GAA CAA CCC CTG 3306

Arg Ile Glu Thr Ala Phe Ala Asn Leu Tyr Pro Gly Glu Gln Pro Leu

1015 1020 1025

TGT TTG TGC CGC GGT GGG AAC GTC GCA TAC ACC GTG TGT ACC CGC GCG 3354

Cys Leu Cys Arg Gly Gly Asn Val Ala Tyr Thr Val Cys Thr Arg Ala

1030 1035 1040

GGC CCC AAG ACC CGC GTC CCC CTG TCG CCC CGT GAA TAC CGG CAG TAC 3402

Gly Pro Lys Thr Arg Val Pro Leu Ser Pro Arg Glu Tyr Arg Gln Tyr

1045 1050 1055

GTG CTG CCG GGT TTT GAC GGT TGC AAG GAC CTC GCG CGA CAG TCT CGG 3450

Val Leu Pro Gly Phe Asp Gly Cys Lys Asp Leu Ala Arg Gln Ser Arg

1060 1065 1070

GGT CTG GGG CTC GGG GCA GCC GAC TTT GTG GAC GAG GCG GCA CAT AGC 3498

Gly Leu Gly Leu Gly Ala Ala Asp Phe Val Asp Glu Ala Ala His Ser

1075 1080 1085 1090

CAC CGC GCA GCA AAC CGA TGG GGC CTG GGT GCC GCG CTT CGA CCC GTC 3546

His Arg Ala Ala Asn Arg Trp Gly Leu Gly Ala Ala Leu Arg Pro Val

1095 1100 1105

TTC CTT CCC GAG GGA CGG AGA CCG GGG GCC GCC GGG CCG GAG GCC GGC 3594

Phe Leu Pro Glu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Ala Gly Pro Glu Ala Gly

1110 1115 1120

GAC GTA CCC ACC TGG GCG AGG GTG TTT TGC CGC CAC GCC CTG CTG GAA 3642

Asp Val Pro Thr Trp Ala Arg Val Phe Cys Arg His Ala Leu Leu Glu

1125 1130 1135

CCC GAC CCT GCC GCA GAA CCA CTC GTG CTT CCA CCC GTG GCC GGT CGG 3690

Pro Asp Pro Ala Ala Glu Pro Leu Val Leu Pro Pro Val Ala Gly Arg

1140 1145 1150

TCG GTG GCG CTG TAT GCG TCG GCG GAC GAG GCT CGG AAT GCC CTC CCC 3738

Ser Val Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Asp Glu Ala Arg Asn Ala Leu Pro

1155 1160 1165 1170

CCG ATT CCC AGA GTA ATG TGG CCG CCC GGT TTT GGG GCC GCG GAG ACG 3786

Pro Ile Pro Arg Val Met Trp Pro Pro Gly Phe Gly Ala Ala Glu Thr

1175 1180 1185

GTG TTG GAG GGG AGC GAC GGA ACA CGG TTC GTG TTC GGA CAC CAC GGG 3834

Val Leu Glu Gly Ser Asp Gly Thr Arg Phe Val Phe Gly His His Gly

1190 1195 1200

GGC TCG GAA CGG CCG GCA GAA ACC CAG GCG GGG CGA CAG CGG CGC ACC 3882

Gly Ser Glu Arg Pro Ala Glu Thr Gln Ala Gly Arg Gln Arg Arg Thr

1205 1210 1215

GCA GAC GAC AGA GAA CAC GCT TTG GAG CCG GAC GAT TGG GAG GTG GGG 3930

Ala Asp Asp Arg Glu His Ala Leu Glu Pro Asp Asp Trp Glu Val Gly

1220 1225 1230

TGT GAA GAC GCG TGG GAC AGC GAG GAG GGG GGC GGG GAC GAC GGG GAC 3978

Cys Glu Asp Ala Trp Asp Ser Glu Glu Gly Gly Gly Asp Asp Gly Asp

1235 1240 1245 1250

GCA CCG GGG TCA TCC TTT GGG GTG AGC ATC GTG TCG GTG GCC CCG GGT 4026

Ala Pro Gly Ser Ser Phe Gly Val Ser Ile Val Ser Val Ala Pro Gly

1255 1260 1265

GTG CTG CGA GAC CGC CGG GTG GGC TTG CGC CCG GCG GTC AAG GTG GAG 4074

Val Leu Arg Asp Arg Arg Val Gly Leu Arg Pro Ala Val Lys Val Glu

1270 1275 1280

CTG TTG TCC TCG TCC TCG TCC TCC GAG GAC GAG GAC GAT GTG TGG GGA 4122

Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Glu Asp Asp Val Trp Gly

1285 1290 1295

GGG CGC GGG GGG AGG AGC CCC CCG CAG AGT CGG GGG TGACGGAGTC 4168

Gly Arg Gly Gly Arg Ser Pro Pro Gln Ser Arg Gly

1300 1305 1310

CCCTCCTTTT CTCGTGAGCG CCACTGGCGC GCGGACTGTT TGTTGTTTGT TAATAAAA 4226

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成序列

<400>2

GATCAAAGCT TAGCGCAG 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成序列

<400>3

CCTATAGCAT GGCTCCAG 18

Claims

1.减毒水痘病毒冈株的基因62，序列1给出的碱基序列中，包含以下(a)～(d)的碱基置换：

(a)2110碱基A置换为G；

(b)3100碱基A置换为G；

(c)3818碱基T置换为C；和

(d)4006碱基A置换为G。

2.权利要求1的减毒水痘病毒冈株的基因62，它除了包含(a)～(d)碱基置换外，还包含以下(e)～(g)中的碱基置换：

(e)1251碱基A置换为G；

(f)2226碱基A置换为G；和

(g)3657碱基A置换为G。

3.权利要求2的减毒水痘病毒冈株的基因62，它除了包含(a)～(d)碱基置换、以及(e)～(g)中的碱基置换外，还包含以下(h)～(o)中的至少一个以上的碱基置换：

(h)162碱基T置换为C；

(i)225碱基T置换为C；

(j)523碱基T置换为C；

(k)1565碱基T置换为C；

(l)1763碱基T置换为C；

(m)2652碱基T置换为C；

(n)4052碱基T置换为C；和

(o)4193碱基T置换为C。

4.权利要求1的的减毒水痘病毒冈株的基因62编码的蛋白质，序列1给出的氨基酸序列中包含以下(A)～(D)的氨基酸置换：

(A)628氨基酸残基Ser置换为Gly；

(B)958氨基酸残基Arg置换为Gly；

(C)1197氨基酸残基Val置换为Ala；和

(D)1260氨基酸残基Ile置换为Val。

5.权利要求4的蛋白质，它除了包含(A)～(D)的氨基酸置换外，至少还包含以下(E)～(H)中的氨基酸置换。

(E)99氨基酸残基Met置换为Thr；

(F)446氨基酸残基Leu置换为Pro；

(G)512氨基酸残基Val置换为Ala；和

(H)1275氨基酸残基Leu置换为Ser。

6.减毒水痘病毒株，其中病毒基因组的基因62是权利要求1至3中的任一个基因62。

7.减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒株的鉴定方法，其包括：测序所述水痘病毒的基因62并选择含有与权利要求1至3中的任一个的基因62的碱基置换相同的碱基置换的水痘病毒。

8.减毒水痘病毒冈株或减毒水痘病毒株的鉴定方法，其特征是：选择在序列1的碱基序列中至少从第2107碱基到第2229碱基的DNA序列被限制酶Nae I以及BssHII切断，该DNA序列被切割为2或3个片段的水痘病毒。

9.权利要求8的鉴定方法中，DNA序列是分别以由序列2的碱基序列构成的寡核苷酸和序列3的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物，以水痘病毒的基因62为模板，通过PCR法制备的。

10.通过由权利要求7至9中任一个方法鉴定的减毒水痘病毒株。

11.以权利要求6或10的减毒水痘病毒株作为种病毒的减毒活水痘疫苗。